BRPI0607002B1 - Conjugado aptâmero/polietileno glico terapêutico útil no tratamento de desordens relacionadas a complemento, composição e uso do referido conjugado - Google Patents

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Abstract

aptâmeros terapêuticos úteis no tratamento de desordens relacionadas a complemento. a presente invenção proporciona ácidos nucléicos terapêuticos e métodos para o uso dos referidos ácidos nucléicos terapêuticos no tratamento das desordens relacionadas a complemento.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção se refere em geral ao campo de ácidos nucléicos e mais particularmente a aptâmeros capazes de se ligar a proteína C5 do sistema de complemento, útil como terapêutico e em diagnóstico de desordens cardíacas relacionadas a complemento, inflamatória, e auto-imunes, danos de perfusão isquêmica e/ou outras doenças ou desordens nas quais a ativação de complemento mediada a C5 esteve implicada. A presente invenção adicionalmente se refere a materiais e métodos para a administração de aptâmeros capazes de ligação à proteína C5 do sistema de complemento.
Antecedentes da Invenção
[002] Os aptâmeros são moléculas de ácido nucléico dotadas de uma afinidade de ligação específica à moléculas através de interações diferentes do pareamento de base Watson-Crick clássico.
[003] Aptâmeros, tais como peptídeos gerados por “apresentação em fagos” ou anticorpos monoclonais (“MAbs”), são capazes de se ligar especificamente a alvos selecionados e modular a atividade alvo, por exemplo, através dos aptâmeros de ligação se pode bloquear a função de habilidade de alvo. Criados por um processo de seleção in vitro a partir de grupos de oligonucleotídeos de seqüência aleatória, os aptâmeros foram gerados para cerca de 100 proteínas incluindo fatores de crescimento, fatores de transcrição, enzimas, imunoglobulinas, e receptores. Um aptâmero típico é de 10 kDa - 15 kDa de tamanho (30 - 45 nucleotídeos), liga seu alvo com afinidade sub-nanomolar, e distingue entre alvos proximamente relacionados (por exemplo, os aptâmeros tipicamente não irão se ligar a outras proteínas da mesma família genética). Uma série de estudos estruturais mostrou que os aptâmeros são capazes de usar o mesmo tipo de interações de ligação (por exemplo, ligação a hidrogênio, complementaridade eletrostática, contatos hidrófobos, exclusão estérica) que direciona a afinidade e a especificidade em complexos anticorpo- antígeno.
[004] Os aptâmeros apresentam um número de características desejáveis para uso como terapêuticos e diagnósticos incluindo alta especificidade e afinidade, eficácia biológica, e excelentes propriedades farmacocinéticas. Ademais, os mesmos oferecem vantagens competitivas com relação aos anticorpos e outras biologias protéicas, como por exemplo: 1) Velocidade e controle. Os aptâmeros são produzidos por um processo inteiramente in vitro, o que permite a rápida geração de protótipos iniciais, incluindo protótipos terapêuticos. A seleção in vitro permite que a especificidade e a afinidade do aptâmero seja altamente controlada e permite a geração de protótipos, incluindo protótipos tanto contra alvos tóxicos como não imunogênicos. 2) Toxicidade e Imunogenicidade. Os aptâmeros enquanto classe demonstraram pouca ou nenhuma toxicidade ou imunogenicidade. Em dosagens crônicas em ratos ou marmotas com altos níveis de aptâmero (10 mg/kg por dia por 90 dias), não foi observada toxicidade por qualquer medição clinica, celular ou bioquímica. Enquanto a eficácia de muitos anticorpos monoclonais é severamente limitada pela resposta imune aos próprios anticorpos, é extremamente difícil se suscitar anticorpos em aptâmeros mais provavelmente pelo fato de que os aptâmeros não podem ser apresentados pelas células T por meio de MHC e a resposta imune em geral é treinada de modo a não reconhecer fragmentos de ácido nucléico. 3) Administração. Embora s maior parte dos terapêuticos de anticorpos aprovados sejam administrados por meio de infusão intravenosa (tipicamente em 2 - 4 horas), os aptâmeros podem ser administrados por injeção subcutânea (a biodisponibilidade do aptâmero por administração subcutânea é > 80% em estudos realizados em macacos (Tucker et al, J. Chromatography B. 732: 203 - 212, 1999)). A referida diferença ocorre principalmente em virtude da solubilidade comparativamente baixa e portanto, de grandes volumes necessários para a maior parte dos MAbs terapêuticos. Com uma boa solubilidade (> 150 mg/mL) e comparativamente baixo peso molecular (aptâmero: 10 kDa - 50 kDa; anticorpo: 150 kDa), uma dosagem semanal do aptâmero pode ser enviada por injeção em um volume inferior a 0,5 mL. Ademais, o pequeno tamanho dos aptâmeros permite que os mesmos penetrem em áreas de restrições conformativas que não permite que anticorpos ou fragmentos de anticorpos penetrem, apresentando assim uma outra vantagem para os terapêuticos com base em aptâmero ou profilaxia. 4) Escalabilidade e custo. Os aptâmeros terapêuticos são quimicamente sintetizados e consequentemente podem ser prontamente escalados como necessário para ir de encontro à demanda de produção. Considerando que as dificuldades da produção em escala estão atualmente limitando a disponibilidade de algumas biologias, e o custo de capital de uma instalação de produção de proteínas em grande escala é enorme, um único sintetizador de oligonucleotídeo em grande escala pode produzir cerca de 100 kg/ano e necessita de um investimento inicial relativamente modesto. O custo atual de bens para a síntese do aptâmero em escala de quilograma é estimado em $500/grama, comparável àquela para anticorpos altamente otimizados. É esperado que o contínuo aprimoramento no desenvolvimento de processos reduza os custos de bens a < $100/grama em cinco anos. 5) Estabilidade. Os aptâmeros terapêuticos são quimicamente robustos. Os mesmos são intrinsecamente adaptados para reganhar atividade em seguida de exposição a fatores tais como calor e desnaturantes e podem ser armazenados por períodos extensos (> 1 ano) a temperatura ambiente como pós-liofilizados.
O Sistema de Complemento
[005] O sistema complemento compreende um conjunto de pelo menos 20 proteínas de plasma e proteínas de membrana que atuam juntas em um sistema de cascata regulada para atacar as formas extracelulares dos patógenos (por exemplo, bactérias). O sistema complemento inclui duas cascatas de ativação enzimáticas distintas, os trajetos clássicos e alternativos (Figura 1), e um trajeto não enzimático, conhecido como o trajeto de ataque de membrana.
[006] A primeira cascata enzimaticamente ativada, conhecida como o trajeto clássico, compreende diversos componentes C1, C4, C2, C3 e C5 (relacionados pela ordem no trajeto). A iniciação do trajeto clássico do sistema complemento ocorre em seguida da ligação e da ativação do primeiro componente complemento (C1) por ambos os ativadores imune e não imune. C1 compreende um complexo de componentes dependente de cálcio C1q, C1r e C1s, e é ativado através da ligação do componente C1q. C1q contém seis subunidades idênticas e cada subunidade compreende três cadeias (as cadeias A, B e C). Cada cadeia apresenta uma região de cabeça globular que é conectada a um prolongamento do tipo colágeno. A ligação e a ativação de C1q por complexos de antígeno-anticorpo ocorrem através da região de grupo de cabeça C1q. Numerosos ativadores C1q de não anticorpos incluindo proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, se ligam e ativam C1q através de um campo distinto na região caule semelhante a colágeno. O complexo C1qrs então catalisa a ativação dos componentes complementos C4 e C2, formando um complexo C4bC2a que funciona como uma C3 convertase.
[007] A segunda cascata enzimaticamente ativada, conhecida como o trajeto alternativo, é uma via rápida independente de anticorpo para a ativação e amplificação do sistema complemento. O trajeto alternativo compreende diversos componentes, C3, Fator B, e Fator D (relacionado em ordem de trajeto). A ativação do trajeto alternativo ocorre quando C3b, uma clivagem proteolítica de C3, é ligada a um agente de ativação de superfície tal como uma bactéria. O fator B é então ligado a C3b para gerar mais C3b, produzindo deposição extensa dos complexos C3b-Ba na superfície de ativação.
[008] Assim, tanto o trajeto de complemento clássico como o alternativo produzem C3 convertases que dividem o fator C3 em C3a e C3b. Neste ponto, ambas as C3 convertases adicionalmente se agrupam em C5 convertases (C4b2a3b 2 C3b3bBb). Os referidos complexos subsequentemente clivam o componente complemento C5 em dois componentes: o polipeptídeo C5a (9 kDa) e o polipeptídeo C5b (170 kDa). O polipeptídeo C5a se liga a um receptor acoplado a proteína G de 7 transmembranas, que esteve originalmente associado a leucócitos e é agora conhecido estar expresso em uma variedade de tecidos incluindo hepatócitos e neurônios. A molécula C5a é o componente quimiotáctico principal no sistema complemento humano e pode engatilhar uma variedade de respostas biológicas incluindo quimiotaxia de leucócitos, contração da musculatura lisa, ativação dos trajetos de transdução de sinal intracelular, adesão neutrófilo-endotelial, citocina e liberação de mediador de lipídeo e formação de oxidante.
[009] O fragmento C5b maior se liga sequencialmente aos últimos componentes da cascata complemento, C6, C7, C8 e C9 para formar o complexo de ataque de membrana C5b-9 (“MAC”). O MAC C5b-9 pode lisar diretamente eritrócitos, e em maiores quantidades é lítico para leucócitos e danoso a tecidos tais como músculo, epitélio e células endoteliais. Em quantidade sublíticas, o MAC pode estimular a regulação para mais das moléculas de adesão, aumentar o cálcio intracelular e liberar citocina. Ainda, o MAC C5b-9 pode estimular células tais como as células endoteliais e plaquetas sem provocar a lise celular. Os efeitos não líticos de C5a e MAC C5b-9 são algumas vezes relativamente similares.
[0010] Embora o sistema complemento exerça um papel importante na manutenção da saúde, o mesmo tem o potencial de ocasionar ou contribuir para a doença. Por exemplo, o sistema complemento esteve implicado em efeitos colaterais relacionados a cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (“CABG”), numerosas doenças e/ou condições renais, reumatológicas, neurológicas, dermatológicas, hematológicas, vascular/pulmonar, alergia, infecções, e doenças de biocompatibilidade/choque e retinopatia diabética. O sistema complemento não é necessariamente o único causa do estado mórbido, mas o mesmo pode ser um de uma série de fatores que contribuem para a patogênese.
[0011] Em Fitch et al, Circ. 100:2499 - 506 (1999), os efeitos do fragmento de anticorpo de cadeia simples anti-C5 Pexelizumab em pacientes que se submeteram a cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (“CPB”) foram testados. Pacientes individuais receberam Pexelizumab em uma dose de bolus único de 10 minutos logo antes de CPB a 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg e 2,0 mg/kg. Amostras de sangue foram removidas e testadas para a atividade de complemento em pré-dose, 5 minutos após a dose, após 5 minutos a 28°C, após o início do reaquecimento, após 5 minutos a 37°C, e cerca de 7 dias após CPB. A análise farmacodinâmica demonstrou a inibição significativa dependente de dose da atividade hemolítica de complemento por cerca de 14 horas a uma dose de 2 mg/kg, e a geração de subprodutos de complemento pró-inflamatório (sC5b-9) foi efetivamente inibida em um modo dependente de dose. Como mencionado anteriormente, entretanto, a terapêutica de anticorpo apresenta determinadas limitações.
[0012] Assim, seria benéfico ter novos inibidores de sistema complemento para uso como terapêuticos e diagnósticos no tratamento das desordens relacionadas a complemento.
Breve Descrição dos Desenhos
[0013] A Figura 1 é uma ilustração mostrando os trajetos clássico e alternativo do sistema complemento.
[0014] A Figura 2 é uma representação esquemática do processo de seleção de aptâmero in vitro (SELEX™) a partir de grupos de oligonucleotídeos de seqüência aleatória.
[0015] A Figura 3A é uma ilustração mostrando a seqüência de nucleotídeo e estrutura secundária de um aptâmero anti-C5 (SEQ ID NO: 1), na qual os resíduos são resíduos ou 2’-flúor pirimidina ou resíduos 2’-OMe pirimidina, e os resíduos indicados por uma seta (->) representam resíduos que devem conter uma modificação 2’-flúor.
[0016] A Figura 3B é uma ilustração mostrando a seqüência de nucleotídeo e uma estrutura secundária do aptâmero anti-C5 ARC 330 (SEQ ID NO: 2), na qual os resíduos circulados são resíduos 2’-H, os resíduos pirimidina são 2’-flúor substituídos, e a maior parte dos resíduos purina são 2’-OMe substituídos, exceto para os três resíduos 2’-OH purina mostrado delineado.
[0017] A Figura 3C é uma ilustração que mostra a seqüência de nucleotídeo e uma estrutura secundária do aptâmero anti-C5 ARC 186 (SEQ ID NO: 4), na qual todos os 21 resíduos pirimidina apresentam modificações 2’-flúor e a maior parte das purinas (14 resíduos) apresentam modificações 2’-OMe, exceto pelos três resíduos de purina 2’-OH mostrados delineados.
[0018] A Figura 4 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3- bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida).
[0019] A Figura 5 é uma ilustração de um PEG ramificado de 40 kD (1,3- bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida) fixada à extremidade 5’ de um aptâmero.
[0020] A Figura 6 é uma ilustração que mostra as diversas estratégias para a síntese de conjugados de PEG-ácido nucléico de alto peso molecular.
[0021] A Figura 7A é um gráfico que compara a inibição dependente de dose da hemólise por aptâmeros anti-C5 peguilados (ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), e ARC 187 (SEQ ID NO: 5)), em um aptâmero anti-C5 não peguilado (ARC 186 (SEQ ID NO: 4)); a Figura 7B é uma tabela de valores de IC50 dos aptâmeros usados no teste de hemólise ilustrado na Figura 7A; a Figura 7C é um gráfico que compara a inibição dependente de dose da hemólise pelos aptâmeros anti-C5 peguilados ARC 187 (SEQ ID NO: 5), ARC 1537 (SEQ ID NO: 65), ARC 1730 (SEQ ID NO: (66), e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67); a Figura 7D é uma tabela dos valores de IC50 dos aptâmeros usados no teste de hemólise ilustrado na Figura 7C.
[0022] A Figura 8 é um gráfico do percentual de inibição de hemólise pelo aptâmero anti-C5 ARC 658 (SEQ ID NO: 62), do complemento de soro de cinomolgus versus complemento de soro humano.
[0023] A Figura 9 é um gráfico que ilustra a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) à proteína purificada C5 tanto a 37°C como a temperatura ambiente (23°C) em seguida de incubação por 15 minutos.
[0024] A Figura 10 é um outro gráfico ilustrando a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) à proteína C5 purificada tanto a 37°C como a temperatura ambiente (23°C) em seguida de incubação de 4 horas.
[0025] A Figura 11 é um gráfico mostrando o decurso de tempo de dissociação do complexo C5*ARC 186 a 23°C.
[0026] A Figura 12 é um gráfico mostrando o decurso de tempo de equilíbrio na formação do complexo C5*ARC 186 a 23°C.
[0027] A Figura 13 é um gráfico ilustrando a ligação de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) à proteína C5 versus os componentes a montante e a jusante na cascata de complemento.
[0028] A Figura 14 é um gráfico ilustrando o percentual de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) radiomarcado que se ligou a C5 na presença do competidor não marcado ARC 186 (SEQ ID NO: 4), ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5).
[0029] A Figura 15 é um gráfico ilustrando a quantidade de proteína complemento C5b produzida nas amostras de sangue incubadas por 5 horas a 25°C e 37°C na presença de concentrações variáveis do aptâmero ARC 186 (SEQ ID NO: 4).
[0030] A Figura 16 é um gráfico ilustrando o percentual da inibição de complemento por ARC 187 (SEQ ID NO: 5) na presença de zimosan em soro humano não diluído, sangue humano total citratado ou soro de cinomolgus.
[0031] A Figura 17 é um gráfico mostrando ARC 658 (SEQ ID NO: 62) inibe completamente a ativação de complemento (C5a) no modelo de alça de tubo descrito no Exemplo ID.
[0032] A Figura 18 é um gráfico ilustrando as constantes de dissociação para a rodada 10 dos grupos de seleção de C5. As constantes de dissociação (Kds) foram estimadas ao se ajustar os dados à equação: limite de fração de RNA = amplitude*Kd/(Kd + [C5]). "ARC 520" (SEQ ID NO: 70) se refere ao grupo dRmY não selecionado e o "+" indica a presença do competidor (0,1 mg/mL RNAt, 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão).
[0033] A Figura 19 é um gráfico ilustrando as curvas de constante de dissociação de clone de C5. As constantes de dissociação (Kas) foram estimadas ao se ajustar os dados da equação: limite de fração de RNA = amplitude*Kd/(Kd + [C5]).
[0034] A Figura 20 é um gráfico ilustrando uma curva de IC50 que ilustra o efeito inibitório da atividade de hemólise das concentrações variáveis do clone de aptâmero anti-C5 ARC 913 (SEQ ID NO: 75) em comparação a ARC 186 (SEQ ID NO: 4).
[0035] A Figura 21 é uma ilustração ilustrando a estrutura de ARC 187 (SEQ ID NO: 5).
[0036] A Figura 22 é uma ilustração ilustrando a estrutura de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67).
[0037] A Figura 23 é uma tabela delineando a configuração experimental do primeiro estudo em coração aspergido isolado.
[0038] A Figura 24 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a plasma humano (A) com os traçados de pressão LVP de um coração isolado exposto à solução de aptâmero de controle (B).
[0039] A Figura 25 é um gráfico que compara os traçados de pressão para a pressão intraventricular no ventrículo esquerdo (LV) de um coração isolado exposto a soluções de equivalentes molares de 10X e 50X de aptâmero/C5 (onde se assumiu uma concentração de aproximadamente 500 nM para C5 em plasma humano não diluído normal).
[0040] A Figura 26 é um gráfico que compara as mudanças na freqüência cardíaca em batimentos por minuto (bpm) em corações isolados de ratos após exposição a plasma humano e diversas soluções de plasma/aptâmero.
[0041] A Figura 27 é um gráfico que compara as mudanças no peso do coração em corações isolados de ratos antes e após a exposição a plasma humano contendo proporção molar 0 - IX ARC 186 (SEQ ID NO: 4) (corações enfraquecidos), ou proporção molar 10-50X (corações protegidos com aptâmero C5).
[0042] A Figura 28 é um gráfico que compara a produção de C5a relativa em plasma humano, contendo concentrações variáveis de aptâmero, em seguida de perfusão através de corações isolados de ratos. As concentrações de C5a relativas são traçadas como unidades de absorção (Abs), onde leituras mais elevadas refletem a presença de níveis mais elevados de C5a.
[0043] A Figura 29 é um gráfico que compara a produção de C5b-9 solúvel em plasma humano contendo concentrações variáveis de aptâmero, em seguida de perfusão através de corações isolados de ratos.
[0044] A Figura 30 é um gráfico mostrando o efeito de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) na clivagem C3 em efluente de coração de rato.
[0045] A Figura 31 é uma tabela mostrando os resultados de coloração imunohistoquímica para o estudo de coração de rato aspergido isolado.
[0046] A Figura 32 é uma tabela mostrando a proporção molar de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) necessária, em soro de humano ou primata, para proteger o coração contra danos mediados a C5b.
[0047] A Figura 33 é um gráfico mostrando um gráfico log-linear do percentual restante do comprimento total de ARC 186 como uma função do tempo de incubação tanto em plasma de rato como de macaco cinomolgus.
[0048] A Figura 34 é uma tabela mostrando a configuração experimental do estudo farmacocinético conduzido em ratos Sprague-Dawley como descrito no Exemplo 5.
[0049] A Figura 35 é uma tabela mostrando a concentração plasmática média de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) versus tempo em ratos Sprague-Dawley.
[0050] A Figura 36 é um gráfico ilustrando a concentração plasmática média de ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) com relação ao tempo em seguida da administração intravenosa do aptâmero em ratos.
[0051] A Figura 37 é uma tabela mostrando a análise não compartimentalizada da concentração versus os dados de tempo ilustrados em A nas Figuras 35 e 36.
[0052] A Figura 38A é uma tabela mostrando a configuração para o estudo farmacocinético de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em ratos; A Figura 38B é um gráfico ilustrando o perfil farmacocinético de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) e ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em ratos CD-I após a administração de um único bolus IV; A Figura 38C é uma tabela mostrando a análise não compartimentalizada da concentração versos os dados de tempo ilustrados em A na Figura 38B.
[0053] A Figura 39 é uma tabela mostrando a detecção dos aptâmeros relacionados no tecido cardíaco de rato em seguida da administração intravenosa.
[0054] A Figura 40 é uma tabela mostrando a configuração experimental do estudo animal 1, descrito no exemplo 5E.
[0055] A Figura 41 é uma tabela mostrando a concentração de plasma de aptâmero versus o tempo em seguida da administração de bolus intravenoso do aptâmero a macacos cinomolgus.
[0056] A Figura 42 é uma tabela relacionando os parâmetros farmacocinéticos para ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62) e ARC 187 (SEQ ID NO: 5) administrados por via intravenosa em macacos cinomolgus no estudo 1.
[0057] As Figuras 43 (a) e 43 (c) são gráficos ilustrando as concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a com relação ao tempo em seguida da administração intravenosa dos aptâmeros anti-C5 ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) a macacos cinomolgus; As Figuras 43 (b) e 43 (d) são gráficos ilustrando as concentrações plasmáticas de sC5b-9 e C5a com relação à concentração dos aptâmeros anti-C5, ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5).
[0058] A Figura 44 é uma tabela mostrando a configuração experimental do estudo 2, descrito no Exemplo 5F.
[0059] A Figura 45 é um gráfico mostrando a concentração plasmática medida de aptâmero em diversos pontos em seguida da administração intravenosa de ARC 658 (SEQ ID NO: 62), ou ARC 187 (SEQ ID NO: 5) em macacos cinomolgus.
[0060] A Figura 46 é uma tabela mostrando as duas análises comportamentais da concentração versus dados de tempo em seguida da administração intravenosa do bolus de aptâmero em macacos cinomolgus.
[0061] A Figura 47 é um gráfico ilustrando a concentração de C5b-9 versus a concentração de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zimosan em plasma de cinomolgus.
[0062] A Figura 48 é um gráfico ilustrando a concentração de C5a versus a concentração de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 658 (SEQ ID NO: 62) na presença de zimosan em plasma de cinomolgus.
[0063] A Figura 49 é uma tabela que resume o estudo PK-PD de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administração por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus.
[0064] A Figura 50 é uma tabela que resume os parâmetros farmacocinéticos para ARC 187 (SEQ ID NO: 5) em macacos cinomolgus após a administração de bolus IV.
[0065] A Figura 51 é um gráfico ilustrando os perfis farmacocinéticos calculado e atual medidos de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) durante e após a administração por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus.
[0066] A Figura 52 é um gráfico mostrando que os níveis plasmáticos de ARC 187 ativo (SEQ ID NO: 5) permaneceram constantes durante e após a administração por infusão de bolus IV plus em macacos cinomolgus.
[0067] A Figura 53 é uma tabela mostrando as necessidades de dosagem humana prevista para os aptâmeros anti-C5 em cirurgia CABG.
[0068] A Figura 54 é um gráfico ilustrando que ARC 187 (SEQ ID NO: 5) relativamente não apresentou efeito in vitro na coagulação conforme medido pelo tempo de protrombina (PT) e pelo tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT).
[0069] A Figura 55 é uma tabela que resume os efeitos in vitro de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) em uma atividade de anticoagulação da heparina, e atividade de pró- coagulação da protamina.
[0070] A Figura 56 é um gráfico mostrando que a ARC 187 (SEQ ID NO: 5) não efetua a reversão da anticoagulação da heparina in vivo.
[0071] A Figura 57 é um gráfico mostrando que tanto a heparina como a protamina não apresentavam efeito na função anti-complemento em ARC 187 (SEQ ID NO: 5), medida pela inibição da ativação de complemento de zimosan.
[0072] A Figura 58 é um gráfico ilustrando o percentual de inibição da hemólise de eritrócito de ovelha na presença de soro humano como uma função da concentração de aptâmeros anti-C5 ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC 672 (SEQ ID NO: 63).
[0073] A Figura 59A é um gráfico ilustrando o percentual de inibição da hemólise na presença de soros de humano, macaco cinomolgus e soro de rato por ARC 1905 (SEQ ID NO: 67); A Figura 59B é uma tabela que resume os valores médios de IC50 para a inibição de ativação de complemento em soro de seres humanos, macaco cinomolgus, e de rato por ARC 1905, um aptâmero anti-C5 ou ARC 127, um aptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controle negativo).
[0074] A Figura 60 é um gráfico ilustrando o valor de IC50 para a inibição de ARC 186 radiomarcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função da concentração do competidor não marcado ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou ARC 672 (SEQ ID NO: 63) (eixo horizontal), em um teste de ligação de competição.
[0075] A Figura 61 é um gráfico ilustrando o valor de IC50 para a inibição do ARC 186 radiomarcado (SEQ ID NO: 4) (eixo vertical) como uma função da concentração do competidor não marcado ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) (eixo horizontal) a 37°C e 25°C em um teste de ligação de competição.
[0076] A Figura 62 é um gráfico ilustrando as curvas padrão para ser humano C5a (hC5a) e macaco cinomolgus C5a (hC5a eq).
[0077] A Figura 63 é uma tabela que resume os valores de IC50, IC90 e IC99 para a inibição de ativação de C5 em soro de humanos e macaco cinomolgus por ARC 1905 (SEQ ID NO: 67), como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan.
[0078] A Figura 64 é um gráfico que ilustra o percentual de inibição da geração de C5a como uma função da concentração de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) em soros de humano e macaco cinomolgus como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan.
[0079] A Figura 65 é um gráfico ilustrando o efeito de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) na geração de C3a em soro de humano ou macaco cinomolgus, como medido no teste de ativação de complemento induzido a zimosan.
[0080] A Figura 66 é uma tabela que resume os valores médios de IC50, IC90 e IC99 para a inibição de ARC 1905 da ativação do complemento (SEQ ID NO: 67) em soro de seres humanos provenientes de cinco doadores, como medido em um modelo de alça de tubo de ativação de complemento.
[0081] A Figura 67 é um gráfico ilustrando o percentual de inibição de geração de C5a e C3a como uma função da concentração de ARC 1905, um aptâmero anti-C5, ou ARC 127, um aptâmero irrelevante que não se liga a C5 (controle negativo) em um modelo de alça de tubo de ativação de complemento.
Sumário da Invenção
[0082] A presente invenção proporciona materiais e métodos para o tratamento, prevenção e melhora de doenças relacionadas a complemento. Em uma modalidade, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de acordo com ARC 186 (SEQ ID NO: 4) conjugada a uma fração PEG é proporcionado. Em modalidades particulares, o referido conjugado de aptâmero ARC 186/PEG compreende substancialmente a mesma afinidade de ligação por proteína complemento C5 como um aptâmero que consiste da seqüência de acordo com SEQ ID NO: 4 mas desprovida da fração PEG. Substancialmente a mesma afinidade de ligação como usada aqui significa não mais de cerca de 2 a dez vezes de diferença, preferivelmente não mais de 2 a cinco vezes de diferença em constantes de dissociação como medido pela análise de dot blot. Em algumas modalidades as constantes de dissociação são medidas pela competição da análise de dot blot como descrito no Exemplo 1A abaixo. Em algumas modalidades, a fração polietileno glicol compreende um peso molecular superior a 10 kDA, em particular um peso de 20 kDA, e mais particularmente 30 kDA, e mais particularmente 40 kDA. Em algumas modalidades, a fração PEG é conjugada à extremidade 5’ de ARC 186 (SEQ ID NO: 4). Em algumas modalidades o conjugado aptâmero/PEG compreende uma meia vida, preferentemente uma meia vida terminal em um modelo de dois compartimentos como determinado pelo método descrito no exemplo 5E abaixo, ou de pelo menos 15 horas, preferivelmente pelo menos 24 horas, de forma mais preferida pelo menos 48 horas em primatas. Em algumas modalidades, o conjugado aptâmero/PEG compreende uma meia vida, preferivelmente uma meia vida terminal de um modelo de dois compartimentos, de pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 15 horas em ratos. Em algumas modalidades, o conjugado PEG à extremidade 5’ de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) é um PEG de 40 kDA. Em particular modalidades de PEG de 40 kDA é um PEG ramificado. Em algumas modalidades o PEG de 40 kDA ramificado é l,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida). Em outras modalidades o PEG de 40 kDA ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil- 1-carbamoila.
[0083] Em modalidades onde o PEG de 40 kDA ramificado é l,3- bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida), um aptâmero dotado de uma estrutura determinada abaixo é proporcionada:
Figure img0001
Onde, ~~~~ indica um ligante Aptâmero= fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), Onde fC e fU = nucleotídeos 2’-flúor, e mG e mA = nucleotídeos 2’-OMe e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida.
[0084] Em outras modalidades onde o PEG de 40 kDA ramificado é 2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoila, um aptâmero dotado da estrutura determinada abaixo é proporcionado:
Figure img0002
Onde, ~~~~ indica um ligante Aptâmero= fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), Onde fC e fU = nucleotídeos 2’-flúor, e mG e mA = nucleotídeos 2’-OMe e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida.
[0085] Em algumas modalidades deste aspecto da invenção, o ligante é um ligante alquila. Em modalidades particulares, o ligante alquila compreende de 2 a 18 grupos CH2 consecutivos. Em modalidades preferidas, o ligante alquila compreende de 2 a 12 grupos CH2 consecutivos. Em modalidades particularmente preferidas o ligante alquila compreende de 3 a 6 grupos CH2 consecutivos.
[0086] Em uma modalidade particular um aptâmero, ARC 187 (SEQ ID NO: 5), dotado da estrutura abaixo determinada é proporcionado:
Figure img0003
Onde o aptâmero= fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), Onde fC e fU = nucleotídeos 2’-flúor, e mG e mA = nucleotídeos 2’-OMe e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida.
[0087] Em uma outra modalidade de um aptâmero, ARC 1905 (SEQ ID NO: 67), dotado da estrutura abaixo determinada é proporcionado:
Figure img0004
Onde o aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), Onde fC e fU = nucleotídeos 2’-flúor, e mG e mA = nucleotídeos 2’-OMe e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida.
[0088] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou um sal da mesma é proporcionada. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem de proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Neste aspecto da invenção uma composição farmacêutica de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) para uso no tratamento, prevenção ou melhora de doenças in vivo é proporcionada. Ainda, neste aspecto da invenção, ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) para uso na preparação da composição farmacêutica são proporcionados.
[0089] Em outro aspecto da invenção, métodos de tratamento são proporcionados. Em uma modalidade, o método da invenção compreende tratar, prevenir ou melhorar uma doença mediada por proteína complemento C5, e/ou os derivados da mesma C5a e C5b-9, o método incluindo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) ou um sal das mesmas a um vertebrado. Em algumas modalidades, o método compreende administrar a composição farmacêutica da presente invenção a um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano.
[0090] Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquêmicas agudas (infarto do miocárdio, derrame, danos por isquemia/reperfusão). Doenças inflamatórias agudas (doenças infecciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante agudo/hiper- agudo); doenças crônicas inflamatórias e/ou imuno mediadas (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE), rejeição a transplante subagudo/crônico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstâncias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a cirurgia CABG, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiper-aguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crônica a transplante. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas a cirurgia CABG. Em uma modalidade particular, a doença a ser tratada é dano miocárdico relacionado a cirurgia de CABG.
[0091] Em algumas modalidades, o método da invenção inclui a administração da composição farmacêutica que compreende ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de aptâmeros ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .75 a cerca de 5 vezes, de .75 a cerca de 3 vezes, e de 1.5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena, enquanto em outras modalidades a composição de aptâmero é administrada para alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção compreendendo ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μM, cerca de 4 μM, cerca de 3 μM, cerca de 2 μM, cerca de 1,5 μM, cerca de 1 μM ou cerca de 500 nM.
[0092] Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas modalidades a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão contínua.
[0093] Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia CABG, em particular, danos miocárdios relacionados a cirurgia CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de 48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particular do presente aspecto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero de cerca de duas vezes a concentração da proteína complemento endógena é alcançada pela administração de um bolus intravenoso de cerca de .75 a 1,25, preferivelmente cerca de 1 mg de aptâmero por kg do paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero onde mg não inclui o peso do PEG conjugado. Em algumas modalidades, algumas doses mais baixas serão infundidas em um coeficiente selecionado a partir da faixa de 0,001 mg/kg/min a 0,005 mg/kg/min onde mg não inclui o peso de PEG conjugado. Em uma modalidade particular, a dose mais baixa será infundida em um coeficiente de cerca de 0,0013 mg/kg/min. É ainda outra modalidade do presente aspecto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma meia vida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de bolus intravenoso.
[0094] Em um outro aspecto da presente invenção, métodos diagnósticos são proporcionados. Em uma modalidade, o método de diagnóstico compreende colocar em contato ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) com uma composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variação da mesma, e detectar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a proteína complemento ou uma variante são vertebrados, em particular mamíferos e mais particularmente seres humanos. A presente invenção proporciona uma composição de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) ou ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) para uso como diagnóstico in vivo ou in vitro.
[0095] Em um outro aspecto da invenção, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: ARC 330 (SEQ ID NO: 2) e ARC 188-189, ARC 250, ARC 296-297, ARC 331-334, ARC 411-440, ARC 457-459, ARC 473, ARC 522-525, ARC 532, ARC 543-544, ARC 550-554, ARC 657-658, ARC 672, ARC 706, ARC 1537, ARC 1730, (SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66) é proporcionado. Em uma outra modalidade, qualquer um de ARC 330 (SEQ ID NO: 2) e ARC 188-189, ARC 250, ARC 296-297, ARC 331-334, ARC 411-440, ARC 457-459, ARC 473, ARC 522-525, ARC 532, ARC 543-544, ARC 550-554, ARC 657-658, ARC 672, ARC 706, ARC 1537, ARC 1730, (SEQ ID NOS: 6 a SEQ NO: 66) para uso na preparação de uma composição farmacêutica é proporcionado. No referido aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem da proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0096] Em uma modalidade particular, um aptâmero que compreende a seqüência de nucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1 é proporcionado. Em uma modalidade particular, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 é proporcionada. Em algumas modalidades, onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende substancialmente a mesma afinidade de ligação para a proteína complemento C5 como um aptâmero que consiste na seqüência de acordo com a SEQ ID NO: 4 mas desprovida da fração PEG.
[0097] Em algumas modalidades onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma meia vida, preferivelmente uma meia vida terminal em um modelo de dois compartimentos como determinado no Exemplo 5E abaixo, de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 30 horas em primatas. Em algumas modalidades, onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero compreende uma meia vida, preferivelmente uma meia vida terminal em um modelo de dois compartimentos, de pelo menos 1 e uma metade, preferentemente pelo menos sete horas em ratos.
[0098] Em algumas modalidades do presente aspecto da invenção, onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, o aptâmero é sintetizado com um ligante 5’ como a seguir: H2N~~~~5’ aptâmero 3’, onde ~~~~ denota o ligante. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante alquila como a seguir: H2N-(CH2)—5’Aptâmero 3’ onde n = 2 a 18, preferivelmente n = 2 - 12, mais preferentemente n = 3 a 6, e de forma ainda mais preferida n = 6, e onde o aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), Onde fC e fU = nucleotídeos 2’-flúor, e mG e mA = nucleotídeos 2’-OMe e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma deóxi timidina invertida. O aptâmero modificado a amina resultante pode ser conjugado em uma fração PEG selecionada a partir do grupo que consiste em um PEG de 10 kDa, PEG de 20 kDa, PEG de 30 kDa, e PEG linear de 40kDa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 ou um sal da mesma é proporcionada. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Com relação a este aspecto da invenção, uma composição farmacêutica para uso no tratamento, prevenção ou melhora de uma doença, in vivo, compreendendo um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 é proporcionado.
[0099] Em uma outra modalidade, um método de tratar, prevenir ou melhorar uma doença mediada pela proteína complemento C5 é proporcionado, compreendendo administrar uma composição farmacêutica que compreende um aptâmero ou sal do mesmo, onde o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66 a um vertebrado. Em algumas modalidades deste aspecto da presente invenção, o método compreende a administração da composição farmacêutica da invenção a um mamífero, preferivelmente um ser humano.
[00100] Em algumas modalidades, a as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquêmicas agudas (infarto do miocárdio, derrame, danos por isquemia/reperfusão); doenças inflamatórias agudas (doenças infecciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante agudo/hiper- agudo); doenças crônicas inflamatórias e/ou imuno mediadas (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE), rejeição a transplante subagudo/crônico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstancias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a cirurgia CABG, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiper-aguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crônica a transplante. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas a cirurgia CABG. Em uma modalidade particular, a doença a ser tratada é dano miocárdico relacionado a cirurgia de CABG.
[00101] Em algumas modalidades, o método da invenção inclui a administração da composição farmacêutica que compreende um aptâmero dotado da seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, a um paciente para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de aptâmeros são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .75 a cerca de 5 vezes, de .75 a cerca de 3 vezes, e de 1.5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena, enquanto em outras modalidades a composição de aptâmero é administrada para alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μM, cerca de 4 μM, cerca de 3 μM, cerca de 2 μM, cerca de 1,5 μM, cerca de 1 μM ou cerca de 500 nM.
[00102] Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas modalidades a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão contínua.
[00103] Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia CABG, em particular, danos miocárdios relacionados a cirurgia CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de 48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particular do presente aspecto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero, por exemplo, de cerca de duas vezes a concentração da proteína complemento endógena em algumas modalidades, é alcançada pela administração de um bolus intravenoso ao paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero. Ainda em outras modalidades da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma meia vida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de bolus intravenoso.
[00104] Em um outro aspecto da invenção, métodos diagnósticos são proporcionados. Em uma modalidade, método diagnóstico compreende colocar em contato uma composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variante da mesma com um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, em particular a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, e SEQ ID NO: 64 a SEQ ID NO: 66, e detectar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades a proteína complemento ou a variante é de um vertebrado, particularmente um mamífero, e mais particularmente um ser humano. A presente invenção proporciona uma composição de aptâmero dotada de um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, para uso como um diagnóstico in vitro ou in vivo. Na presente invenção, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 6 a SEQ NO: 66, para uso na preparação de uma composição farmacêutica é proporcionado.
[00105] Em um outro aspecto da invenção, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo que é 80% idêntica a qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Em algumas modalidades, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo de que é 80% idêntica a uma região única de qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Em uma outra modalidade, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo que é 90% idêntica a qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 75 to 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Em uma modalidade particular, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo de que é 90% idêntica a uma região única de qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83, e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Ainda em uma outra modalidade, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de 40 nucleotídeos idênticos contíguos a 40 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Em uma outra modalidade, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de 30 nucleotídeos idênticos contíguos a 30 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Ainda em uma outra modalidade, um aptâmero que se liga especificamente a proteína complemento C5 compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de 10 nucleotídeos idênticos contíguos a 10 nucleotídeos contíguos incluídos em qualquer uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado. Em uma modalidade preferida, um aptâmero compreendendo uma seqüência de nucleotídeo de acordo com qualquer uma das seqüências de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionado.
[00106] Em algumas modalidades, os aptâmeros do presente aspecto da invenção descritos imediatamente acima podem adicionalmente compreender uma modificação química selecionada a partir do grupo que consiste em: uma substituição química em uma posição de açúcar; uma substituição química em uma posição fosfato; e uma substituição química em uma posição de base de uma seqüência de nucleotídeo. Em algumas modalidades, a modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em: incorporação de um nucleotídeo modificado; cobertura de 3’, conjugação a um composto não imunogênico de alto peso molecular; conjugação a um composto lipófilo; e modificação da estrutura de fosfato.
[00107] Em modalidades preferidas do presente aspecto da invenção, o aptâmero modula uma função de uma proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em modalidades particularmente preferidas, o aptâmero inibe a função da proteína complemento C5 ou uma variante da mesma, preferivelmente in vivo, e ainda mais preferivelmente in vivo em seres humanos. Em uma modalidade do presente aspecto da invenção, a função modulada, preferivelmente inibida, pelo aptâmero é a clivagem da proteína complemento C5.
[00108] Em algumas modalidades do outro aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que bloqueia a clivagem da proteína complemento C5 in vivo ou um sal da mesma e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00109] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo 80% idêntica, preferivelmente 90% idêntica a uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal da mesma é proporcionada. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo 80% idêntica, preferivelmente 90% idêntica a uma única região de uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal da mesma é proporcionada. Em outras modalidades, uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero dotado de 40, 30 ou 10 nucleotídeos contíguos idênticos a 40, 30 ou 10 nucleotídeos, respectivamente, a uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 é proporcionada. A composição farmacêutica da presente invenção pode compreender um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. No referido aspecto da presente invenção uma composição farmacêutica é proporcionada para uso no tratamento, prevenção ou melhora da doença in vivo, onde a composição farmacêutica compreende um aptâmero dotado de uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 ou um sal do mesmo. No referido aspecto, um aptâmero dotado de uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em: SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98 para uso na preparação de uma composição farmacêutica é proporcionado. No referido aspecto, a invenção proporciona uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um aptâmero que inibe a clivagem de proteína complemento C5 in vivo ou um sal do mesmo e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[00110] Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são doenças isquêmicas agudas (infarto do miocárdio, derrame, danos por isquemia/reperfusão); doenças inflamatórias agudas (doenças infecciosas, septicemia, choque, rejeição a transplante agudo/hiper- agudo); doenças crônicas inflamatórias e/ou imuno mediadas (alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE), rejeição a transplante subagudo/crônico, glomerulonefrite e outras doenças renais). Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas incluem a ativação de complemento associada com diálise ou circunstâncias nas quais o sangue é passado sobre e/ou através de um tubo sintético e/ou material estranho. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são selecionadas a partir do grupo que consiste em dano miocárdico relativo à cirurgia CABG, dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão e dano miocárdico relacionado a reestenose, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a cirurgia CABG, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas a intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiper-aguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, e rejeição crônica a transplante. Em algumas modalidades, as doenças mediadas a proteína complemento C5, C5a e/ou C5b-9 a serem tratadas são complicações relacionadas a cirurgia CABG. Em uma modalidade particular, a doença a ser tratada é dano miocárdico relacionado a cirurgia de CABG.
[00111] Em algumas modalidades, o método da invenção inclui a administração da composição farmacêutica que compreende um aptâmero dotado da seqüência de nucleotídeo selecionada a a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 3 a 4, SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, a um paciente para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .5 a 10 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas de aptâmeros são administradas para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero que é de cerca de .75 a cerca de 5 vezes, de .75 a cerca de 3 vezes, e de 1.5 a cerca de 2 vezes aquela da proteína complemento C5 endógena, enquanto em outras modalidades a composição de aptâmero é administrada para alcançar uma concentração equivalente àquela da proteína de complemento endógena. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada para alcançar uma concentração plasmática de aptâmero de cerca de 5 μM, cerca de 4 μM, cerca de 3 μM, cerca de 2 μM, cerca de 1,5 μM, cerca de 1 μM ou cerca de 500 nM.
[00112] Qualquer combinação de via, duração e coeficiente de administração pode ser usada que seja suficiente para alcançar as concentrações plasmáticas de aptâmero da presente invenção. Em algumas modalidades a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada como um bolus e/ou por infusão contínua.
[00113] Em modalidades particulares de tratar, prevenir e/ou melhorar as complicações relacionadas à cirurgia CABG, em particular, danos miocárdios relacionados a cirurgia CABG, o método da invenção compreende a administração da composição farmacêutica antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas, em algumas modalidades cerca de 48 horas ou em algumas modalidades cerca de 72 horas. Em uma modalidade particular do presente aspecto da invenção, a concentração plasmática de aptâmero, por exemplo, de cerca de duas vezes a concentração da proteína complemento endógena em algumas modalidades, é alcançada pela administração de um bolus intravenoso ao paciente a ser tratado antes, simultaneamente ou após a infusão intravenosa de uma dose mais baixa de aptâmero. É ainda outra modalidade do presente aspecto da invenção, onde o aptâmero/conjugado compreende uma meia vida suficientemente longa, a composição farmacêutica de aptâmero pode ser administrada uma ou duas vezes ao dia como uma dose de bolus intravenoso.
[00114] Em uma outra modalidade, um método diagnóstico é proporcionado, o método compreendendo colocar em contato a composição suspeita de compreender a proteína complemento C5 ou uma variação da mesma com um aptâmero que compreende a seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, e detectar a presença ou a ausência de proteína complemento C5 ou uma variante da mesma. Em algumas modalidades, a proteína complemento ou uma variante são vertebrados, em particular mamíferos e mais particularmente seres humanos. A presente invenção proporciona uma composição de aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 75 a 81, SEQ ID NO: 83 e SEQ ID NOS: 88 a 98, para uso como diagnóstico in vivo ou in vitro.
[00115] Em algumas modalidades, o aptâmero compreende uma seqüência de nucleotídeo que consiste essencialmente de uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69 é proporcionado. Em algumas modalidades, um aptâmero que compreende uma seqüência de nucleotídeo que consiste em uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo que consiste de SEQ ID NO: 68 e SEQ ID NO: 69 é proporcionado. Em algumas modalidades do referido aspecto da invenção, os aptâmeros podem ser usados em um método diagnóstico.
Descrição Detalhada da Invenção
[00116] Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são determinados na descrição abaixo. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Outras características, objetivos, e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição. Na especificação, formas singulares também incluem plurais a não ser que claramente indicado o contrário no contexto. A não ser que definido de outra forma, todos os temos técnicos e científicos usados aqui apresentam o mesmo significado comumente entendido por aqueles versados na técnica ao qual pertence a presente invenção. Em caso de conflito, a presente Especificação irá controlar.
O método SELEX™
[00117] Um método adequado para a geração de um aptâmero é o processo intitulado "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment" (“SELEX™”) em geral ilustrado na Figura 2. O processo SELEX™ é um método para a evolução in vitro de moléculas de ácido nucléico com elevada especificidade de ligação a moléculas alvo e é descrito, por exemplo, no pedido de patente U.S. No. 07/536.428, depositado em 11 de Junho de 1990, agora abandonado, patente U.S. No. 5.475.096 intitulada "Nucleic Acid Ligands", e patente U.S. No. 5.270.163 (ver também WO 91/19813) intitulada "Nucleic Acid Ligands". Ada ligante de ácido nucléico identificado por SELEX™, isto é, cada aptâmero, é um ligante específico de um composto ou molécula alvo determinado. O processo SELEX™ baseia-se na percepção única de que os ácidos nucléicos apresentam capacidade suficiente de formação de uma variedade de estruturas bi e tridimensional e suficiente versatilidade química disponível dentro de seus monômeros para agir como ligantes (isto é, formar pares de ligação específica) com de fato qualquer composto químico, seja monomérico ou polimérico. Moléculas de qualquer tamanho e composição podem servir como alvos.
[00118] SELEX™ se baseia como um ponto de partida sobre uma grande biblioteca ou grupo de oligonucleotídeos de uma única fita compreendendo seqüências aleatórias. Os oligonucleotídeos podem ser DNA, RNA ou híbridos de DNA/RNA modificados ou não modificados. Em alguns exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos 100% ou parcialmente aleatórios. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma seqüência fixa e/ou conservada incorporada na seqüência aleatória. Em outros exemplos, o grupo compreende oligonucleotídeos aleatórios ou parcialmente aleatórios contendo pelo menos uma seqüência fixa e/ou conservada na sua extremidade 5’ e 3’ que pode compreender uma seqüência compartilhada tal como campos de hibridização para primers PCR, seqüências promotoras para RNA polimerases (por exemplo, T3, T4, T7 e SP6), campos de restrição, ou seqüências homopoliméricas tais como traços poli A ou poli T, núcleos catalíticos, campos para a ligação seletiva à colunas de afinidade, e outras seqüências para facilitar a clonagem e/ou o sequenciamento de um nucleotídeo de interesse. As seqüências conservadas são seqüências, diferentes das seqüências fixas anteriormente descritas, compartilhadas por um número de aptâmeros que se ligam ao mesmo alvo.
[00119] Os oligonucleotídeos dos grupos preferivelmente incluem uma porção de seqüência aleatória assim como seqüências fixas necessárias para a amplificação eficiente. Tipicamente, os oligonucleotídeos do grupo de partida contêm seqüências terminais 5’ e 3’ que margeiam a região interna de 30 - 50 nucleotídeos aleatórios. Os nucleotídeos aleatórios podem ser produzidos em uma série de maneiras incluindo a síntese química e a seleção de tamanho a partir de ácidos nucléicos celulares aleatoriamente clivados. A variação de seqüência em ácidos nucléicos de teste pode também ser introduzida ou aumentada por mutagênese antes ou durante das iterações de seleção amplificação.
[00120] A porção de seqüência aleatória do oligonucleotídeo pode ser de qualquer comprimento e pode compreender ribonucleotídeos e/ou deoxiribonucleotídeos e pode incluir nucleotídeos modificados ou não naturais ou nucleotídeos análogos. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.958.691; Patente U.S. No. 5.660.985; Patente U.S. No. 5.958.691; Patente U.S. No. 5.698.687; Patente U.S. No. 5.817.635; Patente U.S. No. 5.672.695, e Publicação PCT WO 92/07065. Os oligonucleotídeos aleatórios podem ser sintetizados a partir dos nucleotídeos ligados a fosfodiéster usando técnicas de síntese de oligonucleotídeo de fase sólida, bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Froehler et al, Nucl. Acid Res. 14:5399 - 5467 (1986) e Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575 - 5578 (1986). Os oligonucleotídeos aleatórios podem também ser sintetizados usando métodos de fase de solução tais como os métodos de síntese de triéster. Ver, por exemplo, Sood et al, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978). A síntese típica realizada em equipamento de síntese de DNA automatizado produziu 1014-1016 moléculas individuais, um número suficiente para a maior parte dos experimentos com SELEX™. Regiões suficientemente grandes no desenho de seqüências aumentam a probabilidade de cada molécula sintetizada em representar uma seqüência única.
[00121] A biblioteca de partida de oligonucleotídeos pode ser gerada por síntese química automatizada em um sintetizador de DNA. Para sintetizar seqüências aleatórias, misturas de todos os quatro nucleotídeos são adicionadas a cada etapa de adição de nucleotídeo durante o processo de síntese, permitindo a incorporação aleatória de nucleotídeos. Como determinado acima, em uma modalidade, os oligonucleotídeos aleatórios compreendem seqüências inteiramente aleatórias; entretanto, em outras modalidades, os oligonucleotídeos aleatórios podem compreender trechos de seqüências não aleatórias ou parcialmente aleatórias. As seqüências parcialmente aleatórias podem ser criadas ao se adicionar quatro nucleotídeos em proporções molares diferentes em cada etapa de adição.
[00122] A biblioteca de partida de oligonucleotídeos pode ser ou de RNA ou de DNA. Nos casos onde a biblioteca de RNA deve ser usada como a biblioteca de partida a mesma é tipicamente gerada pela transcrição da biblioteca de DNA in vitro usando polimerase RNA T7 ou polimerases RNA T7 modificadas e purificadas. A biblioteca de RNA ou DNA é então misturada com um alvo sob condições favoráveis para a ligação e submetidas a iterações em etapas de ligação, divisão e amplificação, usando o mesmo esquema de seleção geral, para alcançar de fato qualquer critério de afinidade e seletividade de ligação desejados. Mais especificamente, partindo com uma mistura que contém o grupo de partida dos ácidos nucléicos, o método SELEX™ inclui etapas de: (a) colocar em contato a mistura com o alvo sob condições favoráveis de ligação; (b) dividir os ácidos nucléicos não ligados a partir dos ácidos nucléicos que se ligaram especificamente a moléculas alvo; (c) dissociar os complexos de ácido nucléico-alvo; (d) amplificar os ácidos nucléicos dissociados a partir dos complexos de ácido nucléico-alvo para produzir uma mistura enriquecida de ligante de ácidos nucléicos; e (e) reiterar as etapas de ligação, divisão, dissociação e amplificação através de tantos ciclos quanto desejados para produzir ligantes de ácido nucléico de alta afinidade altamente específicos à molécula alvo. Nos casos onde aptâmeros de RNA são selecionados, o método SELEX™ adicionalmente compreende as etapas de: (i) reverter a transcrição dos ácidos nucléicos dissociados a partir dos complexos de ácido nucléico-alvo antes da amplificação na etapa (d); e (ii) transcrever os ácidos nucléicos amplificados a partir da etapa (d) antes de reiniciar o processo.
[00123] Dentro da mistura de ácido nucléico que contém um grande número de seqüências e estruturas possíveis, há uma grande variedade de afinidades de ligação para um determinado alvo. Uma mistura de ácido nucléico que compreende, por exemplo, 20 segmentos aleatórios de nucleotídeo podem ser dotados de 420 possibilidades candidatas. Aqueles com maiores constantes de afinidade para o alvo são mais propensos a se ligar ao alvo. Após a divisão, dissociação e amplificação, uma segunda mistura de ácido nucléico é gerada, enriquecida para os candidatos de maior afinidade de ligação. Vias adicionais de seleção progressivamente favorecem os melhores ligantes até que a mistura de ácido nucléico resultante seja predominantemente composta apenas de uma ou de poucas seqüências. As referidas podem então ser clonadas, seqüenciadas e individualmente testadas quanto a afinidade de ligação como ligantes puros ou aptâmeros.
[00124] Ciclos de seleção e de amplificação são repetidos até que os objetivos desejados sejam alcançados. Em um caso mais geral, a seleção/amplificação é continuada até que nenhum aprimoramento significativo na resistência de ligação seja alcançado na repetição do ciclo. O método é tipicamente usado para amostrar aproximadamente 1014 diferentes espécies de ácidos nucléicos mas podem ser usado para amostrar tanto quanto 1018 espécies diferentes de ácidos nucléicos. Em geral, moléculas de aptâmero de ácido nucléico são selecionadas em um procedimento de 5 ciclos a 20 ciclos. Em uma modalidade, a heterogeneidade é introduzida apenas em estágios de seleção iniciais e não ocorrem através do processo de replicação.
[00125] Em uma modalidade de SELEX™, o processo de seleção é tão eficiente no isolamento dos referidos ligantes de ácido nucléico que se ligam mais fortemente ao alvo selecionado, que apenas um ciclo de seleção e amplificação é necessário. Uma referida seleção eficiente pode ocorrer, por exemplo, em processos do tipo cromatográfico onde a habilidade do ácido nucléico de se associar com alvos ligados a uma coluna, opera de tal forma que a coluna é suficientemente capaz de permitir a separação e o isolamento de ligantes de ácidos nucléicos de mais alta afinidade.
[00126] Em muitos casos, não é necessariamente desejável se realizar as etapas iterativas de SELEX™ até que um único ligante de ácido nucléico seja identificado. A solução ligante de ácido nucléico específica a alvo pode incluir uma família de estruturas de ácido ou motivos que apresentam um número de seqüências conservadas e um número de seqüências que podem ser substituídas ou adicionadas sem afetar de forma significativa a afinidade dos ligantes de ácido nucléico ao alvo. Ao se terminar o processo de SELEX™ antes da conclusão, é possível se determinar a seqüência de um número de membros da família de solução de ligante de ácido nucléico.
[00127] Uma variedade de estruturas primárias, secundárias e terciárias de ácido nucléico é conhecida. As estruturas ou motivos que estão mais comumente envolvidas nas interações to tipo não-Watson-Crick são referidas como alças de hairpin, abaulamentos simétricos e assimétricos, pseudo-nós e uma miríade de combinações das mesmas. Quase todos os casos conhecidos dos referidos motivos sugerem que os mesmos podem ser formados em uma seqüência de ácido nucléico de mais de 30 nucleotídeos. Por esta razão, é com freqüência preferido que os procedimentos SELEX™ com segmentos aleatórios contíguos sejam iniciados com as seqüências de ácidos nucléicos contendo um segmento aleatório entre cerca de 20 a cerca de 50 nucleotídeos e em algumas modalidades de cerca de 30 a cerca de 40 nucleotídeos. Em um exemplo, seqüência de 5’-fixa:aleatória:3’-fixa compreende uma seqüência aleatória de cerca de 30 a cerca de 50 nucleotídeos.
[00128] O método SELEX™ de núcleo foi modificado para alcançar um número de objetivos específicos. Por exemplo, a patente U.S. No. 5.707.796 descreve o uso de SELEX™ junto com eletroforese de gel para selecionar moléculas de ácido nucléico com características estruturais específicas, tais como DNA dobrado. A patente U.S. No. 5.763.177 descreve métodos com base em SELEX™ para a seleção de grupos fotoreativos contendo ligantes de ácido nucléico capazes de se ligar e/ou fotoreticular a e/ou fotoinativar uma molécula alvo. A patente U.S. No. 5.567.588 e a patente U.S. No. 5.861.124, descrevem métodos com base em SELEX™ que alcançam uma divisão altamente eficiente entre os oligonucleotídeos dotados de alta e baixa afinidade para a molécula alvo. A patente U.S. No. 5.496.938 descreve métodos para a obtenção de ligantes de ácido nucléico aprimorados após o processo SELEX™ ter sido realizado. A patente U.S. No. 5.705.337 descreve métodos para ligar covalentemente um ligante ao seu alvo.
[00129] SELEX™ pode também ser usado para se obter ligantes de ácido nucléico que se ligam a mais de um campo na molécula alvo, e para se obter ligantes de ácido nucléico que incluem espécies de ácido não nucleico que se ligam a campos específicos no alvo. SELEX™ proporciona meios para o isolamento e a identificação de ligantes de ácido nucléico que se ligam a qualquer alvo desejável, incluindo biomoléculas grandes e pequenas tais como as proteínas de ligação - ácido nucléico e proteínas não conhecidas por ligação a ácidos nucléicos como parte da função biológica das mesmas assim como co- fatores e outras pequenas moléculas. Pro exemplo, a patente U.S. No. 5.580.737 descreve seqüências de ácido nucléico identificadas através de SELEX™ que são capazes de se ligar com alta afinidade à cafeína e ao análogo proximamente relacionado, teofilina.
[00130] Contra-SELEX™ é um método de aprimorar a especificidade dos ligantes de ácido nucléico a uma molécula alvo ao eliminar as seqüências de ligante de ácido nucléico com reatividade cruzada a uma ou mais moléculas não alvo. Contra-SELEX™ é compreendido das etapas de: (a) preparar uma mistura candidata de ácidos nucléicos; (b) colocar em contato a mistura com o alvo onde os ácidos nucléicos dotados de maior afinidade ao alvo com relação à mistura candidata pode ser dividida a partir do restante da mistura candidata; (c) dividir os ácidos nucléicos de maior afinidade a partir do restante da mistura candidata; (d) dissociar os ácidos nucléicos de maior afinidade do alvo; (e) colocar em contato os ácidos nucléicos de maior afinidade com uma ou mais moléculas alvo de modo que os ligantes de ácido nucléico com afinidade específica para a(s) molécula(s) não alvo sejam removidos; (f) amplificar os ácidos nucléicos com afinidade específica apenas à molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucléicos enriquecida para a seqüência de ácido nucléico com uma afinidade relativamente mais alta e especificidade para ligação à molécula alvo. Como descrito acima para SELEX™, os ciclos de seleção e amplificação são repetidos como necessário até que o objetivo desejado seja alcançado.
[00131] Um problema potencial encontrado no uso de ácidos nucléicos como vacinas terapêuticas é que os oligonucleotídeos em sua forma de fosfodiéster podem ser rapidamente degradados nos fluidos corporais por enzimas intracelulares e extracelulares tais como as endonucleases e exonucleases antes do efeito desejado se manifestar. O método SELEX™ engloba assim a identificação de ligantes de ácido nucléico de alta afinidade contendo nucleotídeos modificados que conferem características aprimoradas no ligante, tais como características de estabilidade in vivo aprimorada ou de envio aprimorada. Exemplos das referidas modificações incluem as substituições químicas nas posições de ribose e/ou fosfato e/ou de base. Os ligantes de ácido nucléico identificados por SELEX™ contendo os nucleotídeos modificados são descritos, por exemplo, na patente U.S. No. 5.660.985, que descreve derivados de nucleotídeo contendo oligonucleotídeos quimicamente modificados na posição 2’ de ribose, posição 5 de pirimidinas, e posição 8 de purinas; a patente U.S. No. 5.576.703, que descreve oligonucleotídeos contendo diversas pirimidinas 2’-modificadas, e a patente U.S. No. 5.580.737 que descreve ligantes de ácido nucléico altamente específicos contendo um ou mais nucleotídeos modificados com substituintes 2’-amino (2’-NH2), 2’-fluoro (2’-F), e/ou 2’-OMe (2’- OMe).
[00132] Modificações dos ligantes de ácido nucléico contempladas na presente invenção incluem, mas não são limitadas àquelas que proporcionam outros grupos químicos que incorporam carga adicional, polarizabilidade, hidrofobicidade, ligação a hidrogênio, interação eletrostática, e capacidade de fluxo às bases dos ligantes de ácido nucléico ou ao ligante de ácido nucléico como um todo. Modificações que geram populações de oligonucleotídeo que são resistentes a nucleases podem também incluir uma ou mais ligações de internucleotídeo substitutas, açúcares alterados, bases alteradas, ou combinações dos mesmos. As referidas modificações incluem, mas não são limitados a, modificações de açúcar na posição 2’, modificações de pirimidina na posição 5’, modificações de purina na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodo- uracila; modificações de estrutura, modificações de fosforotioato ou alquil fosfato, metilações, e combinações de pareamento de base não usuais tais como isobases isocitidina e isoguanidina. Modificações podem também incluir modificações 3’ e 5’ tais como cobertura.
[00133] Em uma modalidade, os oligonucleotídeos são proporcionados nos quais o grupo P(O)O é substituível por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), P(O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR\CO ou CH2 (“formacetal”) ou 3’-amina (-NH-CH2-CH2-), onde cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituída ou não substituída. Os grupos de ligação podem ser fixados a nucleotídeos adjacentes através de uma ligação -O-, -N-, ou -S-. Não é necessário que todas as ligações no oligonucleotídeo sejam idênticas. Como usado aqui, o termo fosforotioato engloba um ou mais átomos de oxigênio não ponte em uma ligação fosfodiéster substituída por um ou mais átomos de enxofre.
[00134] Em modalidades adicionais, os oligonucleotídeos compreendem grupos de açúcar modificados, por exemplo, um ou mais grupos hidroxila é substituído com halogênio, grupos alifáticos, ou funcionalizados como éteres ou aminas. Em uma modalidade, a posição 2’, do resíduo furanose é substituída por qualquer um do grupo OMe, O-alquila, O-alila, S-alquila, S-alila, ou halo. Métodos de síntese de açúcares 2’-modificados são descritos, por exemplo, em Sproat, et al, Nucl. Acid Res. 19:733 - 738 (1991); Cotten, et al, Nucl. Acid Res. 19:2629 - 2635 (1991); e Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138 - 5145 (1973). Outras modificações são conhecidas daqueles versados na técnica. As referidas modificações podem ser modificações do processo pré-SELEX™ ou modificações do processo pós-SELEX™ (modificações dos ligantes não modificados anteriormente identificados) ou podem ser produzidas por incorporação no processo SELEX™.
[00135] As modificações do processo pré-SELEX™ ou aquelas produzidas pela incorporação no processo SELEX™ produzem ligantes de ácido nucléico tanto com especificidade para o alvo SELEX™ dos mesmos como estabilidade aprimorada, por exemplo, estabilidade in vivo. As modificações do processo pós-SELEX™ produzidas nos ligantes de ácido nucléico pode resultar em estabilidade aprimorada, por exemplo, estabilidade in vivo, sem afetar adversamente a capacidade de ligação do ligante de ácido nucléico.
[00136] O método SELEX™ engloba a combinação de oligonucleotídeos selecionados com outros oligonucleotídeos selecionados e unidades funcionais não oligonucleotídeo como descrito na patente U.S. No. 5.637.459 e na patente U.S. No. 5.683.867. O método SELEX™ adicionalmente engloba a combinação de ligantes de ácido nucléico selecionados com compostos de alto peso molecular lipófilos e não imunogênicos em um complexo diagnóstico ou terapêutico, como descrito, por exemplo, na patente U.S. No. 6.011.020, patente U.S. No. 6.051.698 e na Publicação PCT No. WO 98/18480. As referidas patentes e pedidos ensinam a combinação de uma estrutura ampla de formatos e de outras propriedades, com as propriedades de amplificação e de replicação de oligonucleotídeos com as propriedades desejáveis de outras moléculas.
[00137] A identificação dos ligantes de ácido nucléico em peptídeos pequenos e flexíveis por meio do método SELEX™ também foi explorada. Os pequenos peptídeos apresentam estruturas flexíveis e em geral existem em solução em um equilíbrio de múltiplos conformadores, e assim foi inicialmente pensado que as afinidades de ligação podem ser limitadas pela entropia de conformação perdida com a ligação a um peptídeo flexível. Entretanto, a possibilidade de identificação de ligantes de ácido nucléico a pequenos peptídeos em solução foi demonstrada na patente U.S. No. 5.648.214. Na referida patente, os ligantes de ácido nucléico de alta afinidade a RNA à substância P, um peptídeo de amino ácido, foram identificados.
[00138] Os aptâmeros com especificidade e afinidade de ligação ao(s) alvo(s) da presente invenção são tipicamente selecionados pelo processo SELEX™ como aqui descrito. Como parte do processo SELEX™, as seqüências selecionadas para ligar o alvo são então opcionalmente minimizadas para determinar a seqüência mínima dotada de uma afinidade de ligação desejada. As seqüências selecionadas e/ou seqüências minimizadas são opcionalmente otimizadas ao se realizar mutagênese aleatória ou direcionada da seqüência para aumentar a afinidade de ligação ou alternativamente para determinar quais posições na seqüência são essenciais para a atividade de ligação.
[00139] Adicionalmente, seleções podem ser realizadas com seqüências que incorporam nucleotídeos modificados para estabilizar as moléculas de aptâmero contra a degradação in vivo. SELEX™ de 2’-modificado
[00140] De modo a que um aptâmero seja adequado para uso como um terapêutico, o mesmo é preferivelmente econômico de sintetizar, seguro e estável in vivo. Aptâmeros de RNA do tipo selvagem e DNA são tipicamente não estáveis in vivo em virtude da susceptibilidade dos mesmos à degradação por nucleases. A resistência à degradação por nuclease pode ser grandemente aumentada pela incorporação de um grupo de modificação na posição 2’.
[00141] Grupos flúor e amino foram incorporados com sucesso em bibliotecas de oligonucleotídeo a partir das quais os aptâmeros foram selecionados subsequentemente. Entretanto, as referidas modificações aumentam grandemente o custo da síntese do aptâmero resultante, e pode introduzir preocupações de segurança em alguns casos pelo fato da possibilidade de que os nucleotídeos modificados podem ser reciclados em DNA hospedeiro por degradação de oligonucleotídeos modificados e uso subseqüente de nucleotídeos como substratos para a síntese de DNA.
[00142] Os aptâmeros que contêm nucleotídeos 2’-OMe (“2’-OMe”) como proporcionado em algumas modalidades aqui, superam muitos dos referidos inconvenientes. Os oligonucleotídeos contendo os nucleotídeos 2’-OMe são abundantes em sistemas biológicos, polimerases naturais não aceitam NTPs 2’- O-metila como substratos sob condições fisiológicas, assim, não há preocupação de segurança com relação à reciclagem dos nucleotídeos 2’-OMe no DNA hospedeiro. O método SELEX™ usado para gerar os aptâmeros 2’-modificados é descrito, por exemplo, no pedido de patente provisório No. 60/430.761, depositado em 3 de Dezembro de 2002, pedido de patente provisório de No. de série 60/487.474, depositado em 15 de Julho de 2003, Pedido de patente provisório de No. de série 60/517.039, depositado em 4 de Novembro de 2003, Pedido de patente U.S. No. 10/729.581, depositado em 3 de Dezembro de 2003, e Pedido de patente U.S. No. 10/873.856, depositado em 21 de Julho de 2004, intitulado “Method for in vitro Selection of 2’-OMe Substituted Nucleic Acids”, cada um dos quais se encontram aqui incorporadas por referência em suas totalidades.
[00143] A presente invenção inclui aptâmeros que se ligam e modulam a função da proteína complemento C5 que contém nucleotídeos modificados (por exemplo, nucleotídeos que apresentam uma modificação na posição 2’) para produzir um oligonucleotídeo mais estável do que o oligonucleotídeo não modificado em relação à degradação enzimática e química assim como degradação térmica e física. Embora haja diversos exemplos de aptâmeros que contêm 2’-OMe na literatura (ver, por exemplo, Green et al., Current Biology 2, 683 - 695, 1995) os referidos foram gerados pela seleção in vitro das bibliotecas de transcrições modificadas nas quais os resíduos C e U foram 2’-flúor (2’-F) substituídos e os resíduos A e G foram 2’-OH. Uma vez que as seqüências funcionais foram identificadas e então cada resíduo A e G foi testado quanto a tolerância à substituição 2’-OMe, e o aptâmero foi resintetizado dotado de todos os resíduos A e G que toleraram a substituição 2/-OMe como os resíduos 2’- OMe. A maior parte dos resíduos A e G dos aptâmeros gerados no modo de duas etapas toleraram a substituição com os resíduos 2’-OMe, embora em média, aproximadamente 205 não o fizeram. Consequentemente, os aptâmeros gerados usando o presente método tendem a conter de dois a quatro resíduos 2’-OH, e a estabilidade e os custos de síntese são comprometidos em conseqüência disto. Ao se incorporar os nucleotídeos modificados na reação de transcrição que gera os oligonucleotídeos estabilizados usados nos grupos de oligonucleotídeo a partir dos quais os aptâmeros são selecionados e enriquecidos por meio de SELEX™ (e/ou de suas variações e aprimoramentos, incluindo aqueles aqui descritos); os métodos da presente invenção eliminam a necessidade de estabilização dos oligonucleotídeos de aptâmero selecionados (por exemplo, por re-síntese dos oligonucleotídeos de aptâmero com nucleotídeos modificados).
[00144] Em uma modalidade, a presente invenção proporciona aptâmeros que compreendem combinações de modificações de 2’-OH, 2’-F, 2’-deóxi, e 2’-OMe dos nucleotídeos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona aptâmeros que compreendem combinações de modificações de 2’-OH, 2’-F, 2’-deóxi, 2’-OMe, 2’-NH2 e 2’-metóxietila dos nucleotídeos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP. Em uma outra modalidade, a presente invenção proporciona aptâmeros que compreendem 56 combinações de modificações de 2’-OH, 2’-F, 2’-deóxi, 2’-OMe, 2’-NH2 e 2’-metóxietila dos nucleotídeos ATP, GTP, CTP, TTP, e UTP.
[00145] Os aptâmeros 2’-modificados da presente invenção são criados usando polimerases modificadas, por exemplo, uma polimerase T7 modificada, dotada de um coeficiente de incorporação de nucleotídeos modificados dotados de substituintes volumosos na posição furanose 2’ que é mais alta do que aquela das polimerases do tipo selvagem. Por exemplo, uma polimerase T7 mutante simples (Y639F) na qual o resíduo de tirosina na posição 639 foi mudado em fenilalanina prontamente utiliza trifosfatos nucleotídeos 2’-deóxi, 2’-amino- e 2’-flúor- (NTPs) como substratos e foi amplamente usado para sintetizar RNAs modificados para uma variedade de aplicações. Entretanto, a referida polimerase T7 mutante, ao que consta, não pode prontamente utilizar (isto é, incorporar) NTPs com substituintes 2’ volumosos tais como os substituintes 2’-OMe ou 2’-azido (2’-Na). Para a incorporação de substituintes 2’ volumosos, um mutante de polimerase T7 duplo (Y639F/H784A) dotado de uma histidina na posição 784 mudada em um resíduo de alanina para a mutação Y639F foi descrito e foi usado em circunst6ancias limitadas para incorporar NTPs de piridina modificados. Ver, Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138. Uma única polimerase T7 mutante (H784A) dotada de uma histidina na posição 784 mudada em um resíduo de alanina também foi descrita. Padilla et al, Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138. Em ambas as polimerases Y639F/H784A mutante dupla e H784A mutante simples, a mudança em um resíduo de amino ácido menor tal como alanina permite a incorporação de substratos de nucleotídeos mais volumosos, por exemplo, os nucleotídeos substituídos 2’-O metila.
[00146] Em geral, foi observado que sob as condições aqui descritas, o mutante simples Y693F pode ser usado para a incorporação de todos os NTPs substituídos a 2’-OMe exceto pelo GTP e o mutante duplo Y639F/H784A pode ser usado para a incorporação de todos os NTPs substituídos a 2’-OMe incluindo GTP. É esperado que as propriedades de processos de mutantes simples H784A similares a Y639F e mutantes Y639F/H784A quando usado sob as condições aqui descritas.
[00147] Os oligonucleotídeos 2’-modificados podem ser nucleotídeos inteiramente sintetizados ou modificados, ou com um subconjunto de nucleotídeos modificados. As modificações podem ser as mesmas ou diferentes. Todos os nucleotídeos podem ser modificados, e todos podem conter a mesma modificação. Todos os nucleotídeos podem ser modificados, mas podem conter modificações diferentes, por exemplo, todos os nucleotídeos contendo a mesma base podem ser dotados de um tipo de modificação, enquanto os nucleotídeos contendo outras bases podem ser dotados de diferentes tipos de modificação. Todos os nucleotídeos purina podem ser dotados de um tipo de modificação (ou não são modificados), enquanto todos os nucleotídeos pirimidina apresentam outro tipo de modificação (ou não são modificados). Desta forma, as transcrições, ou grupos de transcrições são gerados usando qualquer combinação de modificações, incluindo, por exemplo, ribonucleotídeos (2’-OH), deoxiribonucleotídeos (2’-deóxi), 2’-F, e nucleotídeos 2’-0Me. Uma mistura de transcrição contendo 2’-OMe C e U e T-OH A e G é referida como uma mistura “rRmY” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “rRmY”. Uma mistura de transcrição contendo deóxi A e G e 2’-OMe U e C é referida como uma mistura “dRmY” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “dRmY”. Uma mistura de transcrição contendo 2’-OMe A, C, e U, e 2’-OH G é referida como uma mistura “rGmH” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “rGmH”. Uma mistura de transcrição alternada contendo 2’-OMe A, C, U e G e 2’-OMe A, U e C e 2’-F G é referida como uma “mistura alternada” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros de “mistura alternada”. Uma mistura de transcrição contendo 2’-OMe A, U, C, e G, onde cerca de 10% de G’s são ribonucleotídeos, é referida como uma mistura “r/mGmH” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “r/mGmH”. Uma mistura de transcrição contendo 2’-0Me A, U, e C, e 2’-F G é referida como uma mistura “fGmH” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “fGmH”. Uma mistura de transcrição contendo 2’-OMe A, U, e C, e deóxi G é referida como uma mistura “dGmH” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “dGmH”. Uma mistura de transcrição contendo A, e 2’- 0Me C, G e U é referida como uma mistura “dAmB” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “dAmB”, e a mistura de transcrição contendo todos os nucleotídeos 2’-OH é referida como uma mistura “rN” e os aptâmeros selecionados a partir da mesma são referidos como aptâmeros “rN” ou “rRrY”. Um aptâmero “mRmY” é um contendo todos os nucleotídeos 2’-OMe e é em geral derivado a partir de um oligonucleotídeo r/mGmH pela substituição pós SELEX, quando possível, de qualquer 2’-OH Gs com 2’-OMe Gs.
[00148] Uma modalidade preferida inclui qualquer combinação de nucleotídeos 2’-OH, 2’-deóxi e 2’-OMe. Uma modalidade mais preferida inclui qualquer combinação de nucleotídeos 2’-deóxi e 2’-OMe. E uma modalidade ainda mais preferida é com qualquer combinação de nucleotídeos 2’-deóxi e 2’-OMe nos quais as pirimidinas são 2’-OMe (tal como dRmY, mRmY ou dGmH).
[00149] A incorporação de nucleotídeos modificados em aptâmeros da presente invenção é realizada antes (pré-) do processo de seleção (por exemplo, um processo de modificação pré-SELEX™). Opcionalmente, os aptâmeros da presente invenção nos quais os nucleotídeos modificados foram incorporados pelo processo de modificação pré-SELEX™ podem ser adicionalmente modificados pelo processo de modificação pré-SELEX™ (isto é, um processo de modificação pós-SELEX™ após o processo de modificação pré-SELEX™). As modificações do processo pré-SELEX™ produzem ligantes de ácido nucléico modificados com especificidade para alto SELEX™ e ainda com estabilidade aprimorada in vivo. As modificações do processo pós-SELEX™, isto é, modificações de (por exemplo, truncagem, deleção, substituição ou modificações de nucleotídeo adicional dos ligantes anteriormente identificados dotados de nucleotídeos incorporados pelo processo de modificação pré-SELEX™) podem resultar em um aprimoramento adicional da estabilidade in vivo sem afetar adversamente a capacidade de ligação do ligante de ácido nucléico dotado de nucleotídeos incorporados pelo processo de modificação pré- SELEX™.
[00150] Para gerar grupos de transcrição de RNA 2’-modificados (por exemplo, 2’-OMe) em condições sob as quais a polimerase aceita os NYPs 2’- modificados, a polimerase preferida é um mutante duplo Y693F/H784A ou o mutante simples Y693F. Outras polimerases em particular aquelas que exibem alta tolerância para os substituintes-2’ volumosos, podem ainda ser usadas na presente invenção. As referidas polimerases podem ser classificadas quanto a capacidade das mesmas em testar sua capacidade em incorporar nucleotídeos modificados sob condições de transcrição aqui descritas.
[00151] Uma série de fatores foi determinada ser importante para as condições de transcrição úteis nos métodos aqui descritos. Por exemplo, aumentos nos rendimentos de transcrição modificados são observados quando a seqüência líder é incorporada na extremidade 5’ de uma seqüência fixa na extremidade 5’ do molde de transcrição de DNA, de modo que pelo menos cerca dos 6 primeiros resíduos da transcrição resultante são todos purinas.
[00152] Outro fator importante na obtenção de transcrições que incorporam os nucleotídeos modificados é a presença ou concentração de 2’-OH GTP. A transcrição pode ser dividida em duas fases: a primeira fase é a iniciação, durante a qual um NTP é adicionado à extremidade 3’-hidroxila de GTP (ou outra guanosina substituída) para produzir um dinucleotídeo que é então estendido sobre 10 - 12 nucleotídeos; a segunda fase é o alongamento, durante o qual a transcrição prossegue ad9iante da adição do primeiro dos 10 - 12 nucleotídeos. Foi observado que pequenas quantidades de 2’-OH GTP adicionadas à mistura de transcrição contendo um excesso de 2’-OMe e 2’-OH GTP, e um excesso de 2’-OMe GTP over 2’-OH GTP permite a incorporação principalmente de 2’-OMe GTP.
[00153] Outro fator importante na incorporação de nucleotídeos substituídos a 2’-OMe em transcritos é o uso tanto de magnésio como de manganês divalente na mistura de transcrição. Combinações diferentes de concentrações de cloreto de magnésio e de cloreto de manganês foram observadas afetar os rendimentos dos transcritos 2’-OMe, a concentração ideal do cloreto de magnésio e de manganês sendo dependente da concentração na mistura de reação de transcrição de NTPs, que formam complexos com os íons de metal divalentes. Para se obter os melhores rendimentos dos transcritos 2’-OMe substituídos (isto é, todos A, C e U e cerca de 90% de nucleotídeos G), concentrações de aproximadamente 5 mM de cloreto de magnésio e 1,5 mM de cloreto de manganês são preferidos quando cada NTP estiver presente a uma concentração de 0,5 mM. Quando a concentração de cada NTP for 1,0 mM, as concentrações de aproximadamente 6,5 mM de cloreto de magnésio e 2,0 mM de cloreto de manganês são preferidas. Em qualquer caso, os desvios das referidas concentrações de cerca de duas vezes ainda proporcionam quantidades significativas dos transcritos modificados.
[00154] A transcrição inicial com GMP ou guanosina é também importante. O referido efeito resulta da especificidade da polimerase para o nucleotídeo de iniciação. Como resultado, o nucleotídeo 5’-terminal de qualquer transcrito gerado desta forma é provável ser 2’-OH G. A concentração preferida de GMP (ou guanosina) é de 0,5 mM e mesmo mais preferivelmente 1 mM. Foi também observado que ao se incluir PEG, preferivelmente PEG-8000, na reação de transcrição é útil se maximizar a incorporação de nucleotídeos modificados.
[00155] Para a máxima incorporação de 2’-OMe ATP (100%), UTP (100%), CTP (100%) e GTP (~90%) ("r/mGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 5 mM (6,5 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 1,0 mM), MnCl2 1,5 mM (2,0 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 1,0 mM), 2’-0Me NTP (cada) 500 uM (mais preferivelmente, 1,0 mM), 2’-OH GTP 30 uM, 2’-OH GMP 500 μ.M, pH 7,5, 15 unidades de RNA polimerase Y639F/H784AT7/mL, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento. Como usado aqui, uma unidade de polimerase de RNA T7 mutante Y639F/H784A (ou qualquer outra polimerase RNA T7 mutante aqui especificada) é definida como a quantidade de enzima necessária para incorporar 1 nmole NTPs de 2’-OMe em transcritos sob as condições r/mGmH. Como usado aqui, uma unidade de pirofosfatase inorgânica é definida como a quantidade de enzima que irá liberar 1,0 mole de ortofosfato inorgânico por minuto a um pH 7,2 e 25°C.
[00156] Para a incorporação máxima (100%) de 2’-OMe ATP, UTP e CTP ("rGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 5 mM (9,6 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 2,0 mM), MnCl2 1,5 mM (2,9 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 2,0 mM), 2’-0Me NTP (cada) 500 uM (mais preferivelmente, 2,0 mM), pH 7,5, 15 unidades/mL de polimerase RNA Y639F T7, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
[00157] Para a incorporação máxima (100%) de 2’-OMe UTP e CTP (“rRmY”) em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 5 mM (9,6 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 2,0 mM), MnCl2 1,5 mM (2,9 mM onde a concentração de cada 2’-OMe NTP é 2,0 mM), 2’-0Me NTP (cada) 500 μM (mais preferivelmente, 2,0 mM), pH 7,5, 15 unidades/mL de polimerase RNA Y639F/H784A T7, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
[00158] Para a incorporação máxima (100%) de deóxi ATP e GTP e 2’- OMe UTP e CTP (“dRmY”) em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2’-OMe NTP (cada) 200 mM, pH 7,5, 15 unidades/mL de polimerase RNA Y639F T7, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
[00159] Para a incorporação máxima (100%) de 2’-OMe ATP, UTP e CTP e 2’F GTP ("fGmH") em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2’-0Me NTP (cada) 2,0 mM, pH 7,5, 15 unidades/mL de polimerase RNA Y639F T7, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
[00160] Para a incorporação máxima (100%) de deóxi ATP e 2’-OMe UTP, GTP e CTP (“dAmB”) em transcritos, as condições a seguir são as preferidas: tampão HEPES 200 mM, DTT 40 mM, espermina 2 mM, espermidina 2 mM, PEG-8000 10% (peso/volume), Triton X-100 0,01% (peso/volume), MgCl2 9,6 mM, MnCl2 2,9 mM, 2’- OMe NTP (cada) 200 mM, pH 7,5, 15 unidades/mL de polimerase RNA Y639F T7, 5 unidades/mL de pirofosfatase inorgânica, e toda a seqüência líder de purina de pelo menos 8 nucleotídeos de comprimento.
[00161] Para cada uma das (a) transcrições acima, é preferivelmente realizada a uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 50°C, preferivelmente de cerca de 30°C a cerca de 45°C, e de forma mais preferida em cerca de 37°C por um período de pelo menos duas horas e (b) 50 nM – 300 nM de um molde de transcrição de DNA de dupla fita é usado (molde de 200 nM é usado na rodada 1 para aumentar a diversidade (molde de 300 nM é usado nas transcrições em dRmY)), e para as rodadas subseqüentes, aproximadamente 50 nM, uma diluição de 1/10 de uma reação PCR otimizada, usando as condições aqui descritas é usada). Os moldes de transcrição de DNA preferidos são descritos abaixo (onde ARC 254 e ARC 256 transcrevem sob todas as condições 2’-OMe e ARC 255 transcreve sob as condições rRmY). ARC 254 (SEQ ID NO: 99): 5’-CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNKNNNNN NNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’ ARC 255 (SEQ ID NO: 100): 5’-CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’ ARC 256 (SEQ ID NO: 101): 5’-CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
[00162] Sob as condições de transcrição de rN da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-OH adenosina trifosfatos (ATP), 2’-OH guanosina trifosfatos (GTP), 2’-OH citidina trifosfatos (CTP), e 2’-OH uridina trifosfatos (UTP). Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição de rN da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-OH adenosina, 2’-OH guanosina, 2’-OH citidina, e 2’-OH uridina. Em uma modalidade preferida de transcrição de rN, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OH uridina. Em uma modalidade mais preferida da transcrição de rN, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OH uridina. Em uma modalidade ainda mais preferida de transcrição de rN, os oligonucleotídeos modificados da presente invenção compreendem uma seqüência onde pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OH uridina.
[00163] Sob as condições de transcrição de rRmY da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-OH adenosina trifosfatos, 2’-OH guanosina trifosfatos, 2’-OH citidina trifosfatos, e 2’-OMe uridina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição rRmY da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-OH adenosina, 2’-OH guanosina, 2’-OH citidina, e 2’-OMe uridina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreende uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OH adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OH citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina.
[00164] Sob as condições de transcrição de dRmY da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-deóxi adenosina trifosfatos, 2’-deóxi guanosina trifosfatos, 2’-O-metil citidina trifosfatos, e 2’-O-metil uridina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição dRmY da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-deóxi adenosina, 2’- deóxi guanosina, 2’-O-metil citidina, e 2’-O-metil uridina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-deóxi guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-O-metil citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-O-metil uridina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-deóxi guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-O-metil citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-O-metil uridina. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-deóxi guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-O-metil citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-O-metil uridina.
[00165] Sob as condições de transcrição de rGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-OH guanosina trifosfatos, 2’-OMe citidina trifosfatos, 2’-OMe uridina trifosfatos, e 2’-OMe adenosina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição rGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-OH guanosina, 2’-OMe citidina, 2’-OMe uridina e 2’-OMe adenosina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina.
[00166] Sob as condições de transcrição de r/mGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-OMe adenosina trifosfatos, 2’-OMe citidina trifosfatos, 2’-OMe guanosina trifosfatos, 2’-OMe uridina trifosfatos, e 2’-OH guanosina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição r/mGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-OMe adenosina, 2’-OMe citidina, 2’-OMe guanosina e 2’-OMe uridina, onde a população de nucleotídeos de guanosina apresenta uma máxima de cerca de 10% de 2’-OH guanosina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados r/mGmH resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OMe guanosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e mais do que cerca de 10% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e não mais de cerca de 10% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, e não mais de cerca de 10% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OH guanosina.
[00167] Sob as condições de transcrição de fGmH da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-OMe adenosina trifosfatos, 2’-OMe uridina trifosfatos, 2’-F citidina trifosfatos, e 2’-OH guanosina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as condições de transcrição fGmH da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-OMe adenosina, 2’-OMe uridina, 2’-OMe citidina, e 2’-F guanosina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-F guanosina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-F guanosina. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-OMe adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-F guanosina.
[00168] Sob as condições de transcrição de dAmB da presente invenção, a mistura de reação de transcrição compreende 2’-deóxi adenosina trifosfatos, 2’-OMe citidina trifosfatos, 2’-OMe guanosina trifosfatos e 2’-OMe uridina trifosfatos. Os oligonucleotídeos modificados produzidos usando as misturas de transcrição dAmB da presente invenção compreendem substancialmente todas as 2’-deóxi adenosina, 2’-OMe citidina, 2’-OMe guanosina, e 2’-OMe uridina. Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OMe guanosina, e pelo menos 80% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina. Em uma modalidade mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes compreendem uma seqüência onde pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OMe guanosina, e pelo menos 90% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina. Em uma modalidade ainda mais preferida, os oligonucleotídeos modificados resultantes da presente invenção compreendem uma seqüência onde 100% de todos os nucleotídeos de adenosina são 2’-deóxi adenosina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de citidina são 2’-OMe citidina, pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de guanosina são 2’-OMe guanosina, e pelo menos 100% de todos os nucleotídeos de uridina são 2’-OMe uridina.
[00169] Em cada caso, os produtos de transcrição podem então ser usados como a biblioteca no processo SELEX™ para identificar os aptâmeros e/ou determinar o motivo conservado de seqüências que apresentam especificidade de ligação a um determinado alvo. As seqüências resultantes já são estabilizadas, eliminando esta etapa do processo para surgir como uma seqüência de aptâmero estabilizada e proporcionando um aptâmero altamente mais estabilizado em resultado. Outra vantagem do processo SELEX™ 2’-OMe é que as seqüências resultantes são propensas a serem dotadas de menos nucleotídeos 2’-OMe na seqüência, possivelmente nenhum. Na medida em que os nucleotídeos 2’-OH permanecem, os mesmos podem ser removidos ao se realizar modificações pós-SELEX™.
[00170] Como descrito abaixo, rendimentos mais baixos mas ainda úteis de transcritos que incorporam amplamente os nucleotídeos 2’-substituídos podem ser obtidos sob condições diferentes das condições otimizadas acima descritas. Por exemplo, as variações das condições de transcrição acima incluem:
[00171] A concentração de tampão HEPES pode variar de 0 a 1 M. A presente invenção contempla também o uso de outros agentes de tamponamento dotados de uma pKa entre 5 e 10 incluindo, por exemplo, Tris(hidróximetil)aminometano.
[00172] A concentração de DTT pode variar de 0 a 400 nM. Os métodos da presente invenção proporcionam também o uso de outros agentes de redução incluindo, por exemplo, mercaptoetanol.
[00173] A concentração de espermidina e/ou espermina pode variar de 0 mM a 20 mM.
[00174] A concentração de PEG-8000 pode variar de 0 a 5% (peso em volume). Os métodos da presente invenção ainda proporcionam o uso de polímero hidrófilo incluindo, por exemplo, outro PEG de peso molecular ou outros polialquileno glicóis.
[00175] A concentração de Triton X-100 pode variar de 0 a 0,1% (peso em volume). Os métodos da presente invenção proporcionam ainda o uso de detergentes não iônicos incluindo, por exemplo, outros detergentes diferentes dos detergentes Triton-X.
[00176] A concentração de MgCl2 pode variar de 0,5 mM a 50 mM. A concentração de MnCl2 pode variar de 0,15 mM a 15 mM. Tanto MgCl como MnCl devem estar presentes dentro das faixas descritas e na modalidade preferida estão presentes em cerca de uma proporção de 10 para 3 de MgCl/MnCl, preferivelmente a proporção é de cerca de 3-5:1, de forma ainda mais preferida, a proporção é de 3-4:1.
[00177] A concentração de NTP 2’-OMe (cada NTP) pode variar de 5 μM a 5 mM.
[00178] A concentração de GTP 2’-OH pode variar de 0 μM a 5 μM.
[00179] O pH pode variar de pH 6 a pH 9. Os métodos da presente invenção podem ser praticados dentro da faixa de atividade de pH da maior parte das polimerases que incorporam os nucleotídeos modificados. Ademais, os métodos da presente invenção proporcionam o uso opcional de agentes quelantes na condição de reação de transcrição incluindo, por exemplo, EDTA, EGTA, e DTT.
[00180] Os aptâmeros selecionados dotados da maior afinidade e ligação específica como demonstrado por testes biológicos são descritos nos exemplos abaixo são terapêuticos adequados para tratar as condições nas quais a proteína complemento C5 está envolvida em patogênese. Aptâmeros com Afinidade de Ligação à Proteína C5 do Sistema Complemento
[00181] Embora o sistema complemento desempenhe um papel importante na manutenção da saúde, o mesmo é dotado do potencial de ocasionar ou contribuir para doença. Assim, é desejável se desenvolver inibidores de sistema complemento para uso terapêutico. É particularmente desejável se desenvolver inibidores de proteína complemento C5 pelo fato de que a mesma é um complemento tanto das vias clássica como da alternativa das cascatas de ativação de complemento (Matis and Rollins (1995) Nature Medicine 1(8): 83 9 - 842). Assim, a inibição de C5 pode evitar os danos mediados a complemento ocasionados por qualquer uma das vias. Algumas das proteínas do sistema complemento, tal como Clq e C3, são importantes nos mecanismos de defesa normais contra os microorganismos e na depuração de componentes imunes e de tecido danificado; entretanto, C5 é relativamente pouco importante para as referidas funções. Assim, a função de C5 pode ser iniciada por períodos de tempo curtos ou longos sem comprometer o papel de proteção do sistema complemento.
[00182] Um inibidor terapêutico de C5 é também desejável pelo fato de que a inibição da clivagem de C5 evita a geração de duas atividades complemento potencialmente danosas. Primeiro, a inibição da geração de C5 a partir da clivagem de C5 elimina as atividades principais quimiotácticas e vasoativas. Segundo, a inibição da geração de C5b a partir da clivagem de C5 bloqueia o complexo citolítico de ataque de membrana C5b-9 (“MAC”). A inibição de clivagem de C5 bloqueia os efeitos tanto de C5a como de C5b em leucócitos e em tecidos tais como as células endoteliais (Ward (1996) Am. J. Pathol. 149:1079).
[00183] Tanto C5a como MAC estiveram implicadas em inflamação aguda e crônica associadas à doença humana, e o papel das mesmas nos estados mórbidos foi confirmado em modelos animais. C5 é necessário para dano vascular pulmonar dependente de complemento e de neutrófilo (Ward (1997) J. Lab. Clin. Med. 129:400; Mulligan et al, (1998) J. Clin. Invest. 98:503), e está associado com ativação plaquetária e de neutrófilo em choque e em danos por queimadura (Schmid et al, (1997) Shock 8:119). MAC media danos musculares em miastenia gravis autoimune aguda (Biesecker e Gomez (1989) J. Immunol. 142:2654), rejeicao de orgão em transplante (Baldwin et al, (1995) Transplantation 59:797; Brauer et al, (1995) Transplantation 59:288; Takahashi et al, (1997) Immunol. Res. 16:273), e danos renais em glomerulonefrite autoimmune (Biesecker (1981) J. Exp. Med. 39:1779; Nangaku (1997) Kidney Int. 52:1570). Both C5a and the MAC are implicated in acute myocardial ischemia (Homeister e Lucchesi (1994) Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34:17), danos do SNC agudo (Bednar et al, (1997) J. Neurosurg. 86:139) e crônico (Morgan (1997) Exp. Clin. Immunogenet. 14:19), ativação de leucócito durante circulação extracorporeal (Sun et al, (1995) Nucleic Acids Res. 23:2909; Spycher andNydegger (1995) Infusionsther. Transfusionsmed. 22:36) e em danos a tecidos associados à doenças autoimunes incluindo artrite e lupus (Wang et al, (1996) Immunology 93:8563).
[00184] A ativação de complemento esteve também implicada em retinopatia diabética, e pode compor ou iniciar danos da vasculatura retinal (Zhang et al, (2002) Diabetes 51:3499). A ativação complementar constitutiva de baixo nível normalmente ocorre no olho não diabético, evidenciado pela presença de MAC e de proteína reguladora de complemento nos olhos de ratos não diabéticos, indicando que a desregulação do complemento ocorre em pacientes diabéticos (Sohn et al., (2000) IOVS 41:3492). Além disso, a deposição de C5b-9 foi detectada em vasos retinais de doadores humanos diabéticos onde a ausência de doadores humanos não diabéticos (Zhang et al.), a expressão reduzida de CD55 e de CD59 é mostrada em retinas diabéticas (Zhang et al.), e CD59 glicolado está presente em urina de pacientes diabéticos, mas não em pacientes não diabéticos (Acosta et al, (2002) PNAS 97, 5450 - 5455). Ademais, o sistema complemento e vascular é conhecido por ser ativado em diabetes do tipo I. Ver, por exemplo, Hansen, T.K. et al, Diabetes, 53: 1570 - 1576 (2004). C5a ativa as células endoteliais por meio da interação com sistemas imune e de complemento. Ver, por exemplo, Albrecht, E.A. et al, Am J Pathology, 164: 849 - 859 (2004). O sistema vascular é ativado em doenças oculares que incluem retinopatia diabética. Ver, por exemplo, Gert, V.B. et al, Invest Opthalmol Vis Sci, 43: 1104 - 1108 (2002). O sistema complemento é também ativado na retinopatia diabética. Ver, por exemplo, Gert, V.B. et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 43: 1104 - 1108 (2002) e Badouin, C et al., Am. J. Opthalmol., 105:383 - 388 (1988).
[00185] Em algumas modalidades, os materiais da presente invenção compreendem uma série de aptâmeros de ácido nucléico de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 60 nucleotídeos de comprimento os quais se ligam especificamente a proteína complemento C5 e que funcionalmente modulam, por exemplo, bloqueiam a atividade de proteína complemento C5 in vivo e/ou em testes com base em célula.
[00186] Os aptâmeros que são capazes de se ligar especificamente e modular a proteína complemento C5 são aqui determinados. Os referidos aptâmeros proporcionam baixa toxicidade, segurança e modalidade de tratamento eficaz, melhora e/ou prevenção de uma variedade de doenças ou desordens relacionadas a complemento, incluindo, por exemplo, desordens cardíacas relacionadas a complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas à cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (CABG), ativação de neutrófilo e leucócito sistêmico, maior risco de infarto do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas a intervenção coronariana percutânea), danos de reperfusão por isquemia (por exemplo, infarto do miocárdio, derrame, ulcerações produzidas por frio), desordens inflamatórias relacionadas a complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e desordens autoimunes relacionadas a complemento (por exemplo, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE)). Outras indicações para as quais a inibição de C5 é desejável incluem, por exemplo, inflamação de pulmão, (Mulligan et al. (1998) J. Clin. Invest. 98:503), ativação extracorpórea de complemento (Rinder et al. (1995) J. Clin. Invest. 96:1564), ativação de complemento ativada a anticorpo (Biesecker et al. (1989) J. Immunol. 142:2654), glomerulonefrite e outras doenças renais, indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados a C5, por exemplo, retinopatia diabética, e hemoglobinúria noturna paroxística. Os referidos aptâmeros podem também ser usados em diagnósticos.
[00187] Os referidos aptâmeros podem incluir modificações como aqui descritas incluindo, por exemplo, a conjugação a compostos lipófilos ou de alto peso molecular (por exemplo, PEG), a incorporação de fração de cobertura, a incorporação de nucleotídeos modificados, e modificações da estrutura de fosfato.
[00188] Em uma outra modalidade da invenção, um aptâmero isolado de ocorrência não natural que se liga à proteína complemento C5 é proporcionado. Em algumas modalidades, o aptâmero isolado de ocorrência não natural apresenta uma constante de dissociação (“Kd”) para a proteína complemento C5, de menos de 100 μM, menos de 1 μM, menos de 500 nM, menos de 100 nM, menos de 50 nM, menos de 1 nM, menos de 500 pM, menos de 100 pM, menos de 50 pM. Em algumas modalidades da invenção a constante de dissociação é determinada por titulação de dot blot como descrito no exemplo 1 abaixo.
[00189] Em uma outra modalidade, o aptâmero da presente invenção modula a função da proteína complemento C5. Em uma outra modalidade, o aptâmero da presente invenção inibe a função de C5 enquanto em outra modalidade o aptâmero estimula a função de C5. Uma variante da proteína complemento C5 como usado aqui engloba as variantes que realizam essencialmente a mesma função que a função da proteína complemento C5. Uma variante da proteína complemento C5 preferivelmente compreende substancialmente a mesma estrutura e em algumas modalidades compreende 80% de identidade de seqüência, mais preferivelmente 90% de identidade de seqüência, e de forma ainda mais preferida 95% de identidade de seqüência com a seqüência de amino ácido da proteína complemento C5 que compreende a seqüência de amino ácido abaixo (SEQ ID NO: 102) (citada em Haviland et al., J. Immunol. 1991 Jan l;146(l):362-8). 1 mgllgilcfl iflgktwgqe qtyvisapki frvgaseniv iqvygyteaf datisiksyp 61 dkkfsyssgh vhlssenkfq nsailtiqpk qlpggqnpvs yvylevvskh fskskrmpit 121 ydngflfiht dkpvytpdqs vkvrvyslnd dlkpakretv ltfidpegse vdmveeidhi 181 giisfpdfki psnprygmwt ikakykedfs ttgtayfevk eyvlphfsvs iepeynfigy 241 knfknfeiti karyfynkw teadvyitfg iredlkddqk emmqtamqnt mlingiaqvt 301 fdsetavkel syysledlnn kylyiavtvi estggfseea eipgikyvls pyklnlvatp 361 lflkpgipyp ikvqvkdsld qlvggvpvtl naqtidvnqe tsdldpsksv trvddgvasf 421 vlnlpsgvtv lefnvktdap dlpeenqare gyraiayssl sqsylyidwt dnhkallvge 481 hlniivtpks pyidkithyn ylilskgkii hfgtrekfsd asyqsinipv tqnmvpssrl 541 lvyyivtgeq taelvsdsvw lnieekcgnq lqvhlspdad ayspgqtvsl nmatgmdswv 601 alaavdsavy gvqrgakkpl ervfqfleks dlgcgagggl nnanvfhlag ltfltnanad 661 dsqendepck eilrprrtlq kkieeiaaky khsvvkkccy dgacvnndet ceqraarisl 721 gprcikafte ccvvasqlra nishkdmqlg rlhmktllpv skpeirsyfp eswlwevhlv 781 prrkqlqfal pdslttweiq gvgisntgic vadtvkakvf kdvflemnip ysvvrgeqiq 841 lkgtvynyrt sgmqfcvkms avegictses pvidhqgtks skcvrqkveg ssshlvtftv 901 lpleiglhni nfsletwfgk eilvktlrw pegvkresys gvtldprgiy gtisrrkefp 961 yripldlvpk teikr±lsvk gllvgeilsa vlsqeginil thlpkgsaea elmsvvpvfy 1021 vfhyletgnh wnifhsdpli ekqklkkklk egmlsimsyr nadysysvwk ggsastwlta 1081 falrvlgqvn kyveqnqnsi cnsllwlven yqldngsfke nsqyqpiklq gtlpvearen 1141 slyltaftvi girkafdicp Ivkidtalik adnfllentl paqstftlai sayalslgdk 1201 thpqfrsivs alkrealvkg nppiyrfwkd nlqhkdssvp ntgtarmvet tayalltsln 1261 lkdinyvnpv ikwlseeqry gggfystqdt inaiegltey sllvkqlrls mdidvsykhk 1321 galhnykmtd knflgrpvev llnddlivst gfgsglatvh vttvvhktst seevcsfylk 1381 idtqdieash yrgygnsdyk rivacasykp sreesssgss havmdislpt gisaneedlk 1441 alvegvdqlf tdyqikdghv ilqlnsipss dflcvrfrif elfevgflsp atftvyeyhr 1501 pdkqctmfys tsnikiqkvc egaackcvea dcgqmqeeld Itisaetrkq tackpeiaya 1561 ykvsitsitv envfvkykat lldiyktgea vaekdseitf ikkvtctnae Ivkgrqylim 1621 gkealqikyn fsfryiypld sltwieywpr dttcsscqaf lanldefaed iflngc
[00190] Em algumas modalidades da invenção, a identidade da seqüência das variantes alvo é determinada usando BLAST como descrito abaixo. Os termos “identidade de seqüência” no contexto de duas ou mais seqüências de ácido nucléico ou proteína, se refere a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas ou apresentam um percentual especificado de resíduos de amino ácido ou nucleotídeos que são os mesmos, quando comparados e alinhados para a correspondência máxima, como medido usando um dos algoritmos de comparação de seqüência a seguir ou por inspeção visual. Para a comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência atua como uma seqüência de referência à qual as seqüências de teste são comparadas. Quando se um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de teste e de referência são fornecidas a um computador, coordenadas subseqüentes são designadas se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo de seqüência são designados. O algoritmo de comparação de seqüência então calcula o percentual da identidade da seqüência para a(s) seqüência(s) de teste com relação à seqüência de referência, com base nos parâmetros designados do programa. O alinhamento ótimo das seqüências para a comparação pode ser conduzido, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, JMol. Biol. 48: 443 (1970), pela peqeuisa por métodos de similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), por implementações computadorizadas dos refridos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ou por inspeção visual (ver em geral, Ausubel et al., infra).
[00191] Um exemplo de um algoritmo que é adequado para determinar o percentual de identidade de seqüência é o algoritmo usado na ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (daqui adiante, “BLAST”), ver, por exemplo, Altschul et al., J Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990) e Altschul et al, Nucleic Acids Res., 15: 3389 - 3402 (1997). O software para a análise do desempenho de BLAST é oferecido pelo National Center for Biotechnology Information (daqui adiante “NCBI”). Os parâmetros de partida usados na determinação da identidade de seqüência usando o software oferecido pela NCBI, por exemplo, BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) e BLASTP (para as seqüências de amino ácido) são descritos em McGinnis et al, Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004).
[00192] Em uma outra modalidade da presente invenção, o aptâmero apresenta substancialmente a mesma habilidade de se ligar à proteína complemento C5 como aquela de um aptâmero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOS: 12, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98 é proporcionado. Em uma outra modalidade da presente invenção, o aptâmero apresenta substancialmente a mesma estrutura e a habilidade de se ligar a proteína complemento C5 como aquela do aptâmero que compreende qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-2, 5-67, 75-81. Em uma outra modalidade da presente invenção, os aptâmeros apresentam uma seqüência, incluindo quaisquer modificações químicas de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOS: 2, 5-67, 75-81, 83 ou 88-98. Em uma outra modalidade, os aptâmeros da presente invenção são usados como um ingrediente ativo nas composições farmacêuticas. Em uma outra modalidade, os aptâmeros ou composições que compreende os aptâmeros da presente invenção são usados para tratar uma variedade de doenças ou desordens relacionadas a complemento incluindo qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste em: desordens cardíacas relacionadas a complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas à cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (CABG) tal como sangramento no pós-operatório, ativação de neutrófilo e leucócito sistêmico, maior risco de infarto do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas a intervenção coronariana percutânea), danos de reperfusão por isquemia (por exemplo, infarto do miocárdio, derrame, ulcerações produzidas por frio), desordens inflamatórias relacionadas a complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e desordens autoimunes relacionadas a complemento (por exemplo, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE), inflamação de pulmão, ativação extracorpórea de complemento, ativação de complemento ativada a anticorpo e indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados a complemento, tais como, retinopatia diabética.
[00193] Em uma modalidade, os aptâmeros C5 da presente invenção incluem uma mistura de nucleotídeos 2’-flúor modificados, nucleotídeos 2’-OMe modificados (“2’-OMe”) e resíduos 2’-OH purina. Uma seqüência genérica descritiva (SEQ ID NO: 1) para o aptâmero anti-C5 modificado é mostrada na tabela 1, e a estrutura é mostrada na Figura 3 A. A grande maioria de purinas (A e G) foram modificadas em 2’-OMe, excluindo apenas dois resíduos G que permaneceram 2’-OH (resíduos mostrados delineados). Os resíduos circulados representam um subconjunto de pirimidinas que pode ser simultaneamente modificado em 2’H sem alterar substancialmente a atividade anti-C5 do aptâmero (ver, ARC 330 na Tabela 1 abaixo (SEQ ID NO: 2, Figura 3B)). Os resíduos sublinhados mostrados na Figura 3 A representam resíduos de pirimidina que podem conter ou uma modificação 2’-flúor ou uma 2’-H (mas não 2’-OMe), enquanto que os resíduos em caixas representam pirimidina que podem conter uma modificação 2’-flúor ou uma 2’-OMe (mas não 2’-H). O resíduo indicado com uma seta (->) deve conter uma modificação 2’-flúor. Sem a modificação 2’-flúor no resíduo indicado pela seta (->), a atividade hemolítica resultante do aptâmero resultante é substancialmente reduzida. Em uma modalidade preferida, um aptâmero anti-C5 da presente invenção compreende uma seqüência de nucleotídeo de acordo com SEQ ID NO: 1.
[00194] Um exemplo de um aptâmero anti-C5 de acordo com a presente invenção é ARC 186 (SEQ ID NO: 4) que é mostrado na Figura 3C e descrito na patente U.S. No. de série 6.395.888, a qual se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade. Todos os 21 resíduos de pirimidina de ARC 186 apresentam modificações 2’-flúor. A maior parte das purinas (14 resíduos) apresenta modificações 2’-OMe, exceto por três resíduos purina 2’-OH (mostrado em delineado na Figura 3C). Os aptâmeros anti-C5 da presente invenção podem ainda incluir diferentes misturas de modificações 2’-flúor e 2’-H. Por exemplo, outro aptâmero anti-C5 da presente invenção é o ARC 330 (SEQ ID NO: 2) mostrado na Figura 3B. O ARC 330 (SEQ ID NO: 2) contém sete modificações 2’-H (resíduos circulados na Figura 3B), 14 resíduos de pirimidina com modificações 2’-flúor, 14 resíduos de purina com modificações 2’-OMe, e três resíduos purina 2’-OH (mostrados em delineado na Figura 3B).
[00195] Outras combinações de aptâmeros contendo uma mistura de modificações 2’-flúor, modificações 2’-OMe, resíduos 2’-OH e conjugação a compostos de alto peso molecular não imunogênicos (por exemplo, PEG) de tamanho variável, cada um dos quais foi derivado de ARC 186 (SEQ ID NO: 4), são descritos na tabela 1 abaixo. A invenção compreende aptâmeros como descritos na tabela 1 abaixo. A invenção ainda compreende aptâmeros como descritos abaixo mas desprovidos da cobertura 3’ (por exemplo, cobertura deóxitimidina invertida) e/ou os aptâmeros indicados abaixo podem compreender uma cobertura 3’ (por exemplo dT invertida) onde a cobertura 3’ não é indicada.
[00196] A não ser que indicado o contrário, as seqüências de nucleotídeo na tabela 1 abaixo são listadas na direção de 5’ para 3’. Para cada uma das seqüências individuais na tabela 1, todas as modificações purina 2’-OMe ou pirimidina são indicadas por um “m” precedendo o nucleotídeo correspondente; todas as modificações pirimidina 2’-flúor são indicadas por um “f” precedendo o nucleotídeo correspondente; todas as modificações purina ou deóxi pirimidina são indicadas por um “d” precedendo o nucleotídeo correspondente’e qualquer purina ou pirimidina que apareça sem “m”, “f”, ou “d” precedendo o nucleotídeo indica um resíduo 2’-OH. Ademais, “3T” indica uma timidina deóxi invertida, “NH” indica um grupo de polietileno glicol dotado do peso molecular indicado, e “biotina” indica um aptâmero dotado de biotina conjugada à extremidade 5’. Tabela 1 SEQ ID NO: 1 XlX2fCfCrGfCX3X4fUX5X6X7X8X9X10X11rXl2Xl3Xl4X15X16X17X18Xl9X20X2lX22X23 fUfUX24X25X26X27X28fCX29 Onde: X1=fC ou mC X2=rG ougy X3=rG ou mG X4=rG ou mG X5=fC ou dC X6=fU ou dT X7=fC ou dC X8=rA ou mA X9=rG ou mG X10=rG ou mG X11= fC ou dC X12=fC ou mC X13=fU ou mU X14=rG ou mG X15=rA ou mA X16=rG ou mG X17=fU ou dT X18=fC ou dC X19=fU ou dT X20=rG ou mG X21=rA ou mA X22=rG ou mG X23=fU oudT X24=rA ou mA X25=fC ou dC X26=fC ou dC X27=fU ou dT X28=rG ou mG X29=rG ou mG ARC330 (SEQ ID NO: 2) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGinGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmA mGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC185 (SEQ ID NO: 3) GAfCGAfUGfCGGfUfCfUfCAfUGfCGfUfCGAGfUGfUGAGfUfUfUAfCfCfUfU fCGfUfC ARC186 (SEQ ID NO: 4) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGrnAmGfUfCfUmGmA mGfUfUfUAfCfCfUmGfCm G-3T ARC187 (SEQ ID NO: 5) 40KDa PEG-- NH- (CmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmA mGfUfUfUAfCfCfUmGfCm G-3T Onde o PEG de 40 kDa ramificado é, (3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’- butamida) ARC189 (SEQ ID NO: 7) AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUffUmGmAmG fUfUfUAfCfCfUmGf CmG ARC250 (SEQ ID NO: 8) GGfCGfCfCGfCGGfUfCfUfCAGGfCGfCfUGAGfUfCfUGAGfUfUfAfCfCfUGfCG ARC296 (SEQ ID NO: 9) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAdCdCfUmGfCmG-3T ARC297 (SEQ ID NO: 10) mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAdCdCfUmGmCmG-3T ARC331 (SEQ ID NO: 11) dCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGdCmG ARC332 (SEQ ID NO: 12) dCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC333 (SEQ ID NO: 13) fCmGdCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmG fUfUfUUAfCfCfUmGfCrnG ARC334 (SEQ ID NO: 14) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf Uf JfUAfCfCfUmGdCmG ARC411 (SEQ ID NO: 15) fCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCm G ARC412 (SEQ ID NO: 16) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGmCmG ARC413 (SEQ ID NO: 17) mCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC414 (SEQ ID NO: 18) mCmGmCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUEUAfCfCfUmGmCmG ARC415 (SEQ ED NO: 19) fCmGfCdCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC416 (SEQ ID NO: 20) fCmGfCfCGdCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfU mGfCmG ARC417 (SEQ ID NO: 21) fCmGfCdCGdCmGmGfUdCTdCmAmOmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGrAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC418 (SEQ ID NO: 22) fCmGfCfCGfCmGmGtUdCTdCmAmGmGdCGdCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC419 (SEQ ID NO: 23) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGICTmGmAmGTdCTmGmAmGfU fUfUAfCfCfUmGfCmG ARC420 (SEQ ID NO: 24) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGdCTmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC421 (SEQ ID NO: 25) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGnGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGTf UfUAfCfCfUmGfCmG ARC422 (SEQ ID NO: 26) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UTfUAfCfCfUmOfCmG ARC423 (SEQ ID NO: 27) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUTAfCfCfUmGfCmG ARC424 (SEQ ID NO: 28) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGT TTAfCfCfUmGfCmG ARC425 (SEQ ID NO: 29) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCTmGfCmG ARC426 (SEQ ID NO: 30) fCmGfCfCGfCmGnGmUdCTdCmAmCmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAdCdCfUmGfCmG ARC427 (SEQ ID NO: 31) fCmGfCmCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC428 (SEQ ID NO: 32) fCmGfCfCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCm G ARC429 (SEQ ID NO: 33) fCmGfCmCGmCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmGfCm G ARC430 (SEQ ID NO: 34) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCfUmGmAmGfUdCfUmGmA mGfUfUfUAfCfCfUmGfC mG ARC431 (SEQ [D NO: 35) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGfCmUmGnAmGfUdCfUmGmAm GfU fUfUAfCfCfUmGfCm ARC432 (SEQ ID NO: 36) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCfUdCmAmGmGdCGmCmUmGmArnGfUdCfUmGmA mGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC433 (SEQ ID NO: 37) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmOdCOfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGm UfUfUAfCfCfUmOfCmG ARC434 (SEQ ID NO: 38) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UmUfUAfCfCfUmGmG ARC435 (SEQ ID NO: 39) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUmUAfCfCfUmGfCmG ARC436 (SEQ ID NO: 40) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGm UmUmUAfCfCUmGfCmG ARC437 (SEQ ID NO: 41) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCmUmGfCmG ARC438 (SEQ ID NO: 42) fCmGfCfCdGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC439 (SEQ ID NO: 43) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCdGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC440 (SEQ ID NO: 44) fCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAmGf UfUfUdAfCfCfUtnGfCmG ARC457 (SEQ ID NO: 45) mGfCmGfffCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmAfCmGmC ARC458 (SEQ ID NO: 46) mGmGmGfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmCmCmC ARC459 (SEQ ID NO: 47) mGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmC ARC473 (SEQ ID NO: 48) mGmGmAfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUm GmAmGfUfUfUA fCfC fUmGfCmGfUfCfU-3T ARC522 (SEQ ID NO: 49) mGmGfCmCfCfCGfCmGmGfJdCTdCmAmGnGdCGmCmUmGmAmGTdCTmG mAmGTfUfUAdCdCTmGfCmGmCmC ARC523 (SEQ ID NO: 50) mGmGmCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGmCrUmGmAmGTdCTm GmAmGTTTAdCdCTmGdCmGmCmC ARC524 (SEQ ID NO: 51) mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCTdCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGTdCT mGmAmGTTTAdCdCTmGdCmGmCmC ARC525 (SEQ ID NO: 52) mGmGmCmGdCdCGdCmGmGTdCmUmCmAmGmGdCGmCmUmGmAmGm UmCmUmGmAmGTTTmAdCdCTmGdCmGmCmC ARC532 (SEQ ID NO: 53) Biotina- AGfCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmGfCmG ARC543 (SEQ [D NO: 54) mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUdCTdCmAmGmGdCGfCfUmGmAmGTdCTmG mAmGfUtUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC ARC544 (SEQ ID NO: 55) mGmGfCmGfCfCGfCmGmGfUmCmUmCmAmCmGmCGfCfUmGmAmGmUm CmUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmGmCmC ARC550 (SEQ ID NO: 56) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUmAfCfCfUmGfC mG-3T ARC551 (SEQ ID NO: 57) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmQmAmGfUfCfUmGmAm GfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC552 (SEQ ID NO: 58) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGT fUfUACfCfUmGfCmG-3T ARC553 (SEQ ID NO: 59) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAm GfUfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T ARC554 (SEQ ID NO: 60) fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGmCmUmGmAmGfUfCfUmGmAm GTfUfUmAfCfCfUmGfCmG-3T ARC 657 (SEQ ID NO: 61) 20 kDa PEG-NH- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC 658 (SEQ ID NO: 62) 30 kDa PEG-NH- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmArnGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC 672 (SEQ ID NO: 63) NH2- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC706 (SEQ ID NO: 64) 10 kDa PEG-N H- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC1537 (SEQ ID NO: 65) 40kDa PEG-NH- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGf UfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T ARC1730 (SEQ ID NO: 66) PEG20K-NH- fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGrAmGfUfCfUmGmAmGfUf UfUAfCfCfUmGfCmG-NH-PEG20K ARC1905 (SEQ ID NO: 67) 40K PEG-NH- - fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGnAmGfUfCfUmGmAmGfU fUfUAfCfCfUmGfCmG-3T Onde o PEG de 40 kDa ramificado é, (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1- carbamoil ARC243 (SEQ ID NO: 68) GGfCGAfUfUAfCfUGGGAfCGGAfCfUfCGfCGAfUGfUGAGfCfACGAfCGAfCfUf CGfCfC ARC244 (SEQ ID NO: 69) GGfCfUfUfCfUGAAGAfUfUAfUfUfUfCGfCGAfUGfUGAAfCfUfCAG AfCfCfCfC
[00197] Outros aptâmeros da presente invenção que se ligam a proteína complemento C5 são descritos abaixo no Exemplo 3.
[00198] Em algumas modalidades os aptâmeros terapêuticos da presente invenção apresentam grande afinidade e especificidade a seus alvos e ainda reduzem os efeitos colaterais prejudiciais das substituições de nucleotídeos que ocorrem não naturalmente se os aptâmeros terapêuticos se fracionarem no corpo dos pacientes ou sujeitos. Em algumas modalidades, as composições terapêuticas contendo os aptâmeros terapêuticos da presente invenção são livres ou apresentam uma quantidade reduzida de nucleotídeos fluorados.
[00199] Os aptâmeros da presente invenção podem ser sintetizados usando quaisquer sínteses de nucleotídeos conhecidas na técnica incluindo a síntese de nucleotídeo de fase sólida bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Froehler et al, Nucl. Acid Res. 14:5399 - 5467 (1986) e Froehler et al, Tet. Lett. 27:5575 - 5578 (1986)) e métodos de solução de fase tais como os métodos de síntese de triéster (ver, por exemplo, Sood et al, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) e Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978)).
Composições Farmacêuticas
[00200] A presente invenção inclui também composições que contêm moléculas de aptâmero que se ligam a proteína complemento C5. Em algumas modalidades, as composições são adequadas para uso interno e incluem uma quantidade eficaz de um composto farmacologicamente ativo da invenção, isolado ou em combinação, com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos são especialmente úteis em que os mesmos apresentam toxicidade muito baixa se houver alguma.
[00201] As composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir uma patologia, tal como uma doença ou desordem, ou aliviar os sintomas das referidas doenças ou desordens em um paciente. Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar ou prevenir as patologias associadas a desordens cardíacas relacionadas a complemento (por exemplo, danos miocárdicos; complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas à cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (CABG) tal como sangramento no pós-operatório, ativação de neutrófilo e leucócito sistêmico, maior risco de infarto do miocárdio, e maior disfunção cognitiva; reestenose, e complicações de complemento mediadas a C5 relacionadas a intervenção coronariana percutânea), danos de reperfusão por isquemia (por exemplo, infarto do miocárdio, derrame, ulcerações produzidas por frio), desordens inflamatórias relacionadas a complemento (por exemplo, asma, artrite, septicemia, e rejeição após transplante de órgão), e desordens autoimunes relacionadas a complemento (por exemplo, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE ou lupus), inflamação de pulmão, ativação extracorpórea de complemento, ativação de complemento ativada a anticorpo e indicações oculares tais como danos a tecido ocular mediados a complemento, tais como, retinopatia diabética. As composições da presente invenção úteis para a administração a um sujeito que sofre, ou está predisposto a uma doença ou desordem que está relacionada ou derivada a partir de proteína complemento C5 à qual os aptâmeros da presente invenção se ligam especificamente.
[00202] As composições da presente invenção podem ser usadas em um método para o tratamento de um paciente ou sujeito dotado de uma patologia. Os métodos da presente invenção envolvem a administração ao paciente ou sujeito de um aptâmero ou uma composição que compreende aptâmeros que se ligam a uma proteína complemento C5, de modo que a ligação do aptâmero a uma proteína complemento C5 altera a sua função biológica, desta forma tratando a patologia.
[00203] O paciente ou sujeito dotado de uma patologia, isto é, o paciente ou sujeito tratado pelos métodos da presente invenção pode ser um vertebrado, mais particularmente um mamífero, ou mais particularmente um ser humano.
[00204] Na prática, os aptâmeros ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, são administrados em quantidades as quais serão suficientes para exercer a sua atividade biológica desejada, por exemplo, inibição da ligação do alvo aptâmero ao seu receptor, evitando a clivagem de uma proteína alvo.
[00205] Um aspecto da presente invenção compreende uma composição de aptâmero da presente invenção em combinação com outros tratamentos para as desordens mediadas a complemento C5. a composição de aptâmero da presente invenção pode conter, por exemplo, mais de um aptâmero. Em alguns exemplos, uma composição de aptâmero da invenção, contendo um ou mais compostos da invenção é administrada em combinação com outra composição útil tal como um agente antiinflamatório, um imunosupressor, um agente antiviral, ou semelhante.
[00206] Ademais, os compostos da presente invenção podem ser administrados em combinação com um agente citotóxico, citostático ou quimioterápico tal como um agente alquilante, antimetabólito, inibidor mitótico ou antibiótico citotóxico, como descrito acima. Em geral, as formas de dosagem atualmente oferecidas dos agentes terapêuticos conhecidos para uso nas referidas combinações serão adequados.
[00207] “Terapia de combinação” (ou “co-terapia”) inclui a administração de uma composição de aptâmero da presente invenção e pelo menos um segundo agente como parte de um regime de tratamento específico pretendido proporcionar o efeito benéfico a partir da co-ação dos referidos agentes terapêuticos. O efeito benéfico da combinação inclui, mas não é limitado a, co-ação farmacocinética ou farmacodinâmica resultante da combinação de agentes terapêuticos. A administração dos referidos agentes terapêuticos tipicamente em combinação é realizada por um período de tempo definido (em geral, minutos, horas, dias ou semanas, dependendo da combinação selecionada).
[00208] A “terapia de combinação” pode, mas em geral não, engloba a administração de dois ou mais agentes terapêuticos como parte de regimes de monoterapia separados que incidental e arbitrariamente resultam nas combinações da presente invenção. A “terapia de combinação” pretende englobar a administração dos referidos agentes terapêuticos em um modo seqüencial, ou seja, onde cada agente terapêutico é administrado em um momento diferente, assim como a administração dos referidos agentes terapêuticos, ou pelo menos dois dos agentes terapêuticos, em um modo substancialmente simultâneo. A administração substancialmente simultânea pode ser realizada, por exemplo, ao se administrar ao sujeito uma única cápsula dotada de uma proporção fixa de cada agente terapêutico ou em múltiplas cápsulas simples para cada um dos agentes terapêuticos.
[00209] A administração seqüencial ou substancialmente simultânea de cada agente terapêutico pode ser efetuada por qualquer via apropriada incluindo, mas não são limitados a, vias tópicas, vias orais, vias intravenosas, vias intramusculares, e absorção direta através de tecidos de membrana mucosa. Por exemplo, o primeiro agente terapêutico da combinação selecionada pode ser administrado por injeção e ainda outros agentes terapêuticos da combinação podem ser administrados por via tópica.
[00210] Alternativamente, por exemplo, todos os agentes terapêuticos podem ser administrados tipicamente ou todos os agentes terapêuticos podem ser administrados por injeção. A seqüência na qual os agentes terapêuticos são administrados não é fundamental a não ser que indicado o contrário. A “terapia de combinação” pode ainda englobar a administração dos agentes terapêuticos como acima descrito em combinação adicional com outros ingredientes biologicamente ativos. Onde a terapia de combinação adicionalmente compreende um tratamento não droga, o tratamento não droga pode ser conduzido em qualquer ocasião desejável, desde que o efeito benéfico da co-ação de combinação de agentes terapêuticos e tratamento de não droga seja alcançado. Por exemplo, em casos apropriados, o efeito benéfico é ainda alcançado quando o tratamento não droga é temporariamente removido da administração dos agentes terapêuticos, talvez por dias ou mesmo semanas.
[00211] As composições terapêuticas ou farmacológicas da presente invenção em geral compreenderão uma quantidade eficaz do(s) componente(s) ativo(s) de terapia, dissolvido ou disperso em um meio farmaceuticamente aceitável. O meio ou veículo farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de retardo de absorção e semelhante. O uso do referido meio e agentes de substâncias farmacêuticas ativas é bem conhecido na técnica. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições terapêuticas da presente invenção.
[00212] A preparação das composições farmacêuticas ou farmacológicas será conhecida daqueles versados na técnica na luz da presente descrição. Tipicamente, as referidas composições podem ser preparadas como injetáveis, seja como soluções líquidas ou suspensões; formas sólidas adequadas para soluções, ou suspensões em líquido antes de injeção; como tabletes ou outros sólidos para administração oral; como cápsulas de liberação de tempo; ou em qualquer outra forma atualmente usada, incluindo gotas oculares, loções, pomadas, inalantes e semelhantes. O uso de formulações estéreis, tais como enxágües com base em salina, por cirurgiões, médicos e profissionais de cuidados da saúde para tratar áreas particulares no campo cirúrgico podem ser particularmente úteis. As composições podem também ser enviadas por micro dispositivos, micropartículas ou esponjas.
[00213] De acordo com a formulação, os terapêuticos serão administrados de uma forma compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade que seja farmacologicamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima, mas cápsulas de liberação de drogas e similares podem também ser empregadas.
[00214] No referido contexto, a quantidade de ingrediente ativo e o volume da composição a ser administrada depende do animal hospedeiro a ser tratado. Quantidades precisas de composto ativo necessárias para a administração dependem do julgamento do técnico e são peculiares a cada indivíduo.
[00215] Um volume mínimo de uma composição necessária para dispersar os compostos ativos é tipicamente utilizado. Regimes adequados para a administração são também variáveis, mas podem ser tipificados ao se administrar inicialmente os compostos e monitorar os resultados e então ministrando doses adicionais controladas em intervalos adicionais.
[00216] Por exemplo, par a administração oral na forma de tablete ou cápsula (por exemplo, cápsula de gelatina), o componente de droga ativo pode ser combinado com um veículo oral, farmaceuticamente aceitável, não tóxico e inerte tal como etanol, glicerol, água e semelhante. Ademais, quando desejado ou necessário, ligantes, lubrificantes, agentes desintegrantes e agentes colorantes adequados podem também ser incorporados na mistura. Os ligantes adequados incluem amido, silicato de alumínio magnésio, pasta de amido, gelatina, celulose de metila, carbóximetil celulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona, açúcares naturais tais como glicose ou β lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas tais como acácia, tragacanto, ou alginato de sódio, polietileno glicol, ceras e semelhante. Os lubrificantes usados nas referidas formas de dosagem incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietileno glicol e semelhante. Os desintegradores incluem, sem limitação, amido, celulose de metila, agar, bentonita, amidos de goma xantano, agar, ácido algínico ou os sais do mesmo, ou misturas efervescentes, e semelhante. Os diluentes incluem, por exemplo, lactose, dextrose, sucrose, manitol, sorbitol e celulose e/ou glicina.
[00217] As composições injetáveis são preferivelmente soluções aquosas isotônicas ou suspensões, e supositórios são preferidos com vantagem a partir das emulsões graxas ou suspensões. As composições podem ser esterilizadas e/ou conter adjuvantes, tais como conservantes, estabilizantes, umectantes ou agentes emulsificantes, promotores de solução, sais para regular pressão osmótica e/ou tampões. Ademais, os mesmos podem ainda conter outras substâncias terapêuticas valiosas. As composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou de revestimento convencionais, respectivamente, e tipicamente contêm cerca de 0,1% a 75%, preferivelmente cerca de 1% a 50% do ingrediente ativo.
[00218] Os compostos da presente invenção podem também ser administrados nas referidas formas de dosagem oral como tabletes ou cápsulas de liberação controlada e sustentada, pílulas, pós, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões.
[00219] Líquidos, em particular as composições injetáveis podem, por exemplo, ser preparadas por dissolução, dispersão, etc. O composto ativo é dissolvido ou misturado com um solvente farmaceuticamente puro tal como, por exemplo, água, solução salina, dextrose aquosa, glicerol, etanol, e semelhante, para deste modo formar a solução ou suspensão injetável. Ademais, formas sólidas adequadas para a dissolução em líquido antes da injeção podem ser formuladas.
[00220] Os compostos da presente invenção podem ser administrados na forma intravenosa (tanto em bolus como por infusão), intraperitonial, subcutânea ou intramuscular, todas as quais utilizando as formas bem conhecidas daqueles versados na técnica farmacêutica. Os injetáveis podem ser preparados de formas convencionais, seja em soluções líquidas ou em suspensões.
[00221] A administração injetável parenteral é em geral usada para as injeções e infusões subcutâneas, intramuscular ou intravenosa. Adicionalmente, uma abordagem para a administração parenteral emprega a implantação de sistemas de liberação lenta ou de liberação sustentada, que garante que um nível constante de dosagem seja mantido, de acordo com a patente U.S. No. 3.710.795, a qual se encontra aqui incorporada por referência.
[00222] Ainda, os compostos preferidos para a presente invenção podem ser administrados na forma intranasal por uso tópico de veículos, intranasais, inalantes ou por meio de vias transdérmicas, usando as referidas formas de adesivos de pele transdérmicos bem conhecidos daqueles versados na técnica. Para ser administrada na forma de um sistema de envio transdérmico, a administração de dosagem, evidentemente, será contínuo em vez de intermitente através do regime de dosagem. Outras preparações tópicas preferidas incluem cremes, ungüentos, loções, sprays aerosol e géis, onde a concentração do ingrediente ativo será tipicamente na faixa de 0,01% a 15% peso em peso ou peso em volume.
[00223] Para composições sólidas, os excipientes incluem graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, talco, celulose, glicose, sucrose, carbonato de magnésio, e semelhante podem ser usados. O composto ativo acima definido pode também ser formulado como supositórios usando, por exemplo, polialquileno glicóis, por exemplo, propileno glicol, como o veículo. Em algumas modalidades, supositórios são preparados com vantagem a partir de emulsões graxas ou suspensões.
[00224] Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de envio lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículas multilamelares. Os lipossomas podem ser formados a partir de uma variedade de fosfolipídeos, contendo colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas. Em algumas modalidades, uma película de componentes lipídicos é hidratada com uma solução aquosa de droga para formar uma camada lipídica que encapsula a droga, como descrito na patente U.S. No. 5.262.564. Por exemplo, as moléculas de aptâmero aqui descritas podem ser proporcionadas como um complexo com um composto lipófilo ou não imunogênico, composto de alto peso molecular construído usando os métodos conhecidos na técnica. Um exemplo dos complexos de ácido nucléico associado é proporcionado na patente U.S. No. 6.011.020.
[00225] Os compostos da presente invenção podem também ser acoplados a polímeros solúveis como veículos de droga direcionáveis. Os referidos polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, poliidróxipropil- metacrilamida-fenol, poliidróxietilaspanamidafenol, ou polietileneóxidepolilisina substituída com resíduos de palmitoil. Ademais, os compostos da presente invenção podem ser acoplados à classe de polímeros biodegradáveis úteis em alcançar a liberação controlada da droga, por exemplo, ácido poliláctico, poliepsilon caprolactona, ácido poliidróxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidiidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de bloco reticulados ou anfipáticos de hidrogéis.
[00226] Se desejado, a composição farmacêutica a ser administrada pode também conter quantidades menores de substâncias não tóxicas auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, e outras substâncias tais como, por exemplo, acetato de sódio, e oleato de trietanolamina.
[00227] O regime de dosagem que utiliza os aptâmeros é selecionado de acordo com uma variedade de fatores que incluem o tipo, a espécie, a idade, o peso, o sexo e a condição médica do paciente; a gravidade da condição a ser tratadas; a via de administração. A função renal e hepática do paciente; e o aptâmero particular ou sal do mesmo empregado. Um médico ou veterinário versado na técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade eficaz da droga necessária para evitar, combater ou interromper o progresso da condição.
[00228] As dosagens orais da presente invenção, quando usadas para os efeitos indicados, estarão na faixa de cerca de 0,05 mg/dia a 7500 mg/dia oralmente. As composições são preferivelmente proporcionadas na forma de tabletes marcados contendo 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100,0, 250,0, 500,0 e 1000,0 mg do ingrediente ativo. Os compostos da presente invenção podem ser administrados em uma dose diária única, ou a dose diária total pode ser administrada em doses divididas de duas, três ou quatro vezes ao dia.
[00229] As dosagens infundidas, dosagens intranasais e as dosagens transdérmicas estarão variando entre 0,05 mg/dia a 7500 mg/dia. As dosagens subcutâneas, intravenosas e intraperineais estarão variando entre 0,05 mg/dia a 3800 mg/dia.
[00230] Níveis plasmáticos eficazes dos compostos da presente invenção variam de 0,002 mg/mL a 50 mg/mL.
Modulação da farmacocinética e biodistribuição dos aptâmeros terapêuticos
[00231] É importante que as propriedades farmacocinéticas para todos os terapêuticos com base em oligonucleotídeo, incluindo aptâmeros, sejam confeccionados de modo a corresponder à aplicação farmacêutica desejada. Embora os aptâmeros direcionados contra os alvos extracelulares não sofram de dificuldades associadas ao envio intracelular (como é o caso com os terapêuticos com base em RNAi e antisentido), os referidos aptâmeros devem ainda ser capazes de serem distribuídos a órgãos e tecidos alvo, e permanecer no corpo (não modificado) por um período de tempo consistente com o regime de dosagem desejado.
[00232] Assim, a presente invenção proporciona materiais e métodos para afetar as farmacocinéticas das composições de aptâmeros, e em particular, a habilidade de sintonizar as farmacocinéticas de aptâmero. A capacidade de sintonia (isto é, a capacidade de modular) as farmacocinéticas de aptâmero é alcançada através da conjugação de frações de modificação (por exemplo, polímeros PEG) ao aptâmero e/ou a incorporação de nucleotídeos modificados (por exemplo, 2’-flúor ou 2’-OMe) para alterar a composição química do ácido nucléico. A habilidade de modular a farmacocinética do aptâmero é usada no aprimoramento das aplicações terapêuticas existentes, ou alternativamente, no desenvolvimento de novas aplicações terapêuticas. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, por exemplo, em anti-neoplásticas ou instalações de cuidados intensivos onde pode ser desejado uma rápida depuração ou desligamento de droga, é desejável se reduzir o tempo de estadia dos aptâmeros na circulação. Alternativamente, em outras aplicações terapêuticas, por exemplo, terapias de manutenção, onde a circulação sistêmica de um terapêutico é desejada, pode ser desejável se aumentar os tempos de estadia dos aptâmeros na circulação.
[00233] Ademais, a capacidade de modulação da farmacocinética de um aptâmero é usada para modificar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico em um sujeito. Por exemplo, em algumas aplicações terapêuticas, pode ser desejável se alterar a biodistribuição de um aptâmero terapêutico em um esforço de se alcançar um tipo particular de tecido ou um órgão específico (ou um conjunto de órgãos). Nas referidas aplicações, o aptâmero terapêutico preferivelmente se acumula em um tecido ou órgão(s) específico. Em outras aplicações terapêuticas, pode ser desejável se alcançar tecidos que exibam um marcador celular ou um sintoma associado a uma determinada doença, dano celular ou outra patologia anormal, de modo que o aptâmero terapêutico preferivelmente se acumule no tecido afetado. Por exemplo, como descrito no pedido de patente co-pendente provisório de número de série 60/550790, depositado em 5 de março de 2004, e intitulado “Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics)”, a peguilação de um aptâmero terapêutico (por exemplo, peguilação com um polímero PEG de 20 kDa) é usada para alcançar tecidos inflamados, de modo que o aptâmero terapêutico peguilado preferivelmente se acumula no tecido inflamado.
[00234] Para se determinar os perfis de farmacocinética e biodistribuição dos aptâmeros terapêuticos (por exemplo, aptâmeros conjugados ou aptâmeros dotados de químicas alternadas, tais como nucleotídeos modificados) uma variedade de parâmetros são modificados. Os referidos parâmetros incluem, por exemplo, a meia vida (tA), a depuração plasmática (Cl), o volume de distribuição (Vss), a área sob a curva de concentração-tempo (AUC), a concentração máxima observada de soro ou plasma (Cmax), e o tempo médio de estadia (MRT) de uma composição de aptâmero. Como usado aqui, o termo “AUC” se refere a área sob o gráfico de concentração plasmática do aptâmero terapêutico com relação ao tempo após a administração de aptâmero. O valor AUC é usado para estimar a biodisponibilidade (isto é, o percentual de aptâmero terapêutico administrado na circulação após a administração do aptâmero) e/ou a depuração total (Cl) (isto é, o coeficiente no qual o aptâmero terapêutico é removido da circulação) de um aptâmero terapêutico determinado. O volume de distribuição se refere à concentração plasmática de um aptâmero terapêutico com relação à quantidade de aptâmero presente no corpo. Quanto maior o VSS, mais aptâmero é encontrado fora do plasma (isto é, maior o extravasamento).
[00235] A presente invenção proporciona materiais e métodos para modular, de modo controlado, as farmacocinéticas e a biodistribuição das composições de aptâmero estabilizadas in vivo por conjugação de um aptâmero a uma fração de modulação tal como uma pequena molécula, peptídeo, ou grupo polímero terminal, ou pela incorporação de nucleotídeos modificados no aptâmero. Como aqui descrito, a conjugação de uma fração modificada e/ou alterar nucleotídeos da composição química se altera os aspectos fundamentais do tempo de estadia na circulação e distribuição aos tecidos.
[00236] Além da depuração realizada pelas nucleases, os oligonucleotídeos terapêuticos são submetidos a eliminação por meio de filtragem renal. Como tal, o oligonucleotídeo resistente a nuclease administrado por via intravenosa tipicamente exibe uma meia vida in vivo de < 10 minutos, a não ser que a filtragem possa ser bloqueada. Isto pode ser realizado seja pela facilitação da rápida distribuição fora da corrente sanguínea e dentro dos tecidos ou pelo aumento do peso molecular aparente do oligonucleotídeo acima do corte de tamanho eficaz para o glomérulo. A conjugação de pequenos terapêuticos a um polímero PEG (peguilação), abaixo descrita, pode aumentar dramaticamente o tempo de estadia dos aptâmeros na circulação, desta forma aumentando a freqüência de dosagem e aumentando a eficácia contra os alvos vasculares.
[00237] Os aptâmeros podem ser conjugados a uma variedade de frações modificadoras, tais como polímeros de alto peso molecular, por exemplo, peptídeos PEG, por exemplo, Tat (um fragmento de 13 amino ácidos da proteína Tat do HIV (Vives, et al. (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant (uma seqüenciar de 16 amino ácidos derivada da terceira hélice da proteína homeótica da Drosophila antennapedia (Pietersz, et al. (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) e Arg7 (um peptídeo de permeação celular, curto e positivamente carregado composto de poliarginina (Arg7) (Rothbard, et al. (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J et al. (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); e moléculas pequenas, por exemplo, compostos lipófilos tais como colesterol. Dentre os diversos conjugados aqui descritos, as propriedades in vivo dos aptâmeros são alternadas mais profundamente por formação de complexos com os grupos PEG. Por exemplo, a formação de complexos com um aptâmero terapêutico modificado 2’-F e 2’-OMe com um polímero PEG de 20 kDa impede a filtragem renal e promove a distribuição tanto de tecidos saudáveis como de inflamados. Ademais, o conjugado de polímero PEG de 20 kDa - aptâmero provou ser quase tão eficaz quanto o polímero PEG de 40 kDa na prevenção da filtragem renal de aptâmeros. Embora um efeito da peguilação seja na depuração de aptâmero, a exposição sistêmica prolongada proporcionada pela presença da fração 20 kDa também facilitou a distribuição dos aptâmeros nos tecidos, em particular aqueles de órgãos altamente infundidos e aqueles no campo da inflamação. O conjugado aptâmero - polímero PEG de 20 kDa direciona a distribuição de aptâmero ao campo da inflamação, de modo que o aptâmero peguilado preferivelmente se acumula no tecido inflamado. Em alguns casos, o conjugado aptâmero - polímero PEG de 20 kDa é capaz de acessar o interior das células, tais como por exemplo, as células renais.
[00238] Em geral, os efeitos nas farmacocinéticas do aptâmero e na distribuição no tecido produzidos pelas frações de modificação de alto peso molecular, incluindo colesterol e peptídeos de permeação celular, são menos pronunciados do que aqueles produzidas em resultado de peguilação ou modificação de nucleotídeos (por exemplo, uma composição química alternada). Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é sugerido que as associações mediadas a colesterol com lipoproteínas plasmáticas, postuladas ocorrer no caso de um conjugado antisentido, são evitados no contexto particular da estrutura dobrada conjugada de colesterol - aptâmero, e/ou se refere ao aspecto da natureza lipófila do grupo colesterol. Da mesma forma que o colesterol, a presença de uma marcação de peptídeo Tat promove a depuração do aptâmero da corrente sanguínea, com níveis comparativamente altos de conjugado aparecendo nos rins em 48 horas. Outros peptídeos (por exemplo, Ant, Arg7) que foram reportados na técnica por mediar a passagem de macromoléculas através das membranas celulares in vitro, não aparecem para promover a depuração de aptâmero na circulação. Entretanto, da mesma forma que Tat, o conjugado Ant se acumula significativamente nos rins com relação a outros parâmetros. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é possível que a apresentação desfavorável das frações de modificação de peptídeo Ant e Arg7 no contexto dos aptâmeros dobrados tridimensionalmente in vivo, prejudiquem a capacidade dos referidos peptídeos de influencias as propriedades de transporte do aptâmero.
[00239] Os nucleotídeos modificados podem também ser usados para modular a depuração plasmática dos aptâmeros. Por exemplo, um aptâmero não conjugado que incorpora tanto as químicas de estabilização 2’-F e 2’-OMe, que são típicas da geração de aptâmeros atuais na medida em que os mesmos exibem um alto grau de estabilidade de nuclease in vitro e in vivo, exibe rápida perda a partir do plasma (isto é, rápida depuração plasmática) e uma rápida distribuição nos tecidos, principalmente nos rins, quando em comparação ao aptâmero não modificado.
Ácidos Nucléicos PEG derivados
[00240] Como acima descrito, a derivação de ácidos nucléicos com polímeros não imunogênicos de alto peso molecular apresenta o potencial de alterar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas dos ácidos nucléicos tornando-os mais agentes terapêuticos mais eficazes. Mudanças favoráveis na atividade podem incluir maior resistência à degradação por nucleases, reduzida filtragem através dos rins, reduzida exposição ao sistema imune, e distribuição alterada do terapêutico através do corpo.
[00241] As composições de aptâmero da presente invenção podem ser derivadas com frações de polialquileno glicol (“PAG”). Exemplos de ácidos nucléicos PAG derivados são encontrados no pedido de patente U.S. No. de série 10/718.833, depositado em 21 de novembro de 2003, o qual se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade. Polímeros típicos usados na presente invenção incluem poli(etileno glicol) (“PEG”), também conhecido como poli(óxido etileno) (“PEO”) e polipropileno glicol (incluindo poli isopropileno glicol). Ademais, copolímeros de bloco ou aleatórios de diferentes óxidos de alquileno (por exemplo, óxido de etileno e óxido de propileno) podem ser usados em diversas aplicações. Em sua forma mais comum, um polialquileno glicol, tal como PEG, é um polímero linear terminado em cada extremidade com grupos hidroxila: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O) n-CBkCHk-OH. O referido polímero, alfa-, ômega-diidroxilpoli(etileno glicol), pode também ser representado como HO-PEG-OH, onde é entendido que o símbolo — PEG- representa a unidade estrutural a seguir: -CHbCEbCHCBbCEbO) n-CH2CH2- onde n tipicamente varia de cerca de 4 a cerca de 10.000.
[00242] Como mostrado, a molécula PEG é difuncional e é algumas vezes referida como “PEG diol”. As porções terminais da molécula PEG são frações hidroxila relativamente não reativas, os grupos -OH, que podem ser ativados, ou convertidos em frações funcionais, para a fixação do PEG a outros compostos como campos reativos no composto. Os referidos PEG dióis ativados são referidos aqui como PEGs bi-ativados. Por exemplo, as frações terminais de PEG diol foram funcionalizadas como éster carbonato ativo para a reação seletiva com frações amino pela substituição das frações hidroxila relativamente não reativas, -OH, com as frações éster succinimidila ativas a partir da N-hidróxi succinimida.
[00243] Em muitas aplicações, é desejável se cobrir a molécula PEG em uma extremidade com uma fração essencialmente não reativa de modo que a molécula PEG seja monofuncional (ou monoativada). No caso de terapêuticos de proteína que em geral exibem múltiplos campos de reação para os PEGs ativados, os PEGs ativados bi- funcionais levam a uma extensa reticulação, produzindo agregados pobremente funcionais. Para se gerar PGs monoativados, uma fração hidroxila na terminação na terminação da molécula PEG diol tipicamente é substituída com uma fração de extremidade metóxi não reativa, -OCH3. A outra, uma terminação não coberta da molécula PEG, tipicamente é convertida em uma fração de extremidade reativa que pode ser ativada para a fixação ao campo reativo na superfície ou uma molécula tal como uma proteína.
[00244] PÁGS são polímeros que tipicamente apresentam as propriedades de solubilidade em água e em muitos solventes orgânicos, faltam de toxicidade, e faltam de imunogenicidade. Um uso de PAG é de se ligar covalentemente ao polímero em moléculas insolúveis para produzir a molécula PAG resultante “conjugada” solúvel. Por exemplo, foi observado que a droga insolúvel em água paclitaxel, quando acoplada a PEG, se torna solúvel em água. Greenwald, et al, J. Org. Chem., 60:331 - 336 (1995). Os conjugados PAG são com freqüência usados não só para aumentar a solubilidade e a estabilidade mas também para prolongar a meia vida das moléculas na circulação sanguínea.
[00245] Os compostos polialquilados da presente invenção são tipicamente entre 5 kDa e 80 kDa de tamanho, entretanto, qualquer tamanho pode ser usado, a escolha dependendo do aptâmero e da aplicação. Outros compostos PAG da presente invenção estão entre 10 kD e 80 kD de tamanho. Ainda outros compostos PAG da presente invenção estão entre 10 kD e 60 kD de tamanho. Por exemplo, um polímero PAG pode ser de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho. Os referidos polímeros podem ser lineares ou ramificados.
[00246] Diferente dos terapêuticos protéicos biologicamente expressos, os terapêuticos de ácido nucléico são tipicamente quimicamente sintetizados a partir de nucleotídeos de monômero ativados. Os conjugados PEG - ácido nucléico podem ser preparados ao se incorporar o PEG usando a mesma síntese iterativa de monômero. Por exemplo, os PEGs ativados por conversão a uma forma fosforoamidita pode ser incorporado na síntese de oligonucleotídeo de fase sólida. Alternativamente, a síntese de oligonucleotídeo pode ser completada com a incorporação específica de campo de um campo de fixação PEG reativo. Mais comumente, isto foi realizado pela adição de uma amina de fase primária na terminação 5’ (incorporada usando uma fosforoamidita modificada na etapa de acoplamento da síntese de fase sólida). Usando a referida abordagem, um PEG reativo (por exemplo, um que é ativado de modo que irá reagir e formar uma ligação com uma amina) é combinado com o oligonucleotídeo purificado e a reação de acoplamento é realizada em solução. Em algumas modalidades, os polímeros são moléculas PEG ramificadas. Ainda em ouras modalidades, os polímeros são PEG ramificado de 40 kDa, ver, por exemplo, (l,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida) ilustrado na Figura 4. em algumas modalidades, o PEG ramificado de 40 kDa (l,3- bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2-(4’-butamida) é fixado na extremidade 5’ do aptâmero como ilustrado na Figura 5.
[00247] A habilidade da conjugação PEG em alterar a biodistribuição de um terapêutico está relacionada a uma série de fatores incluindo o tamanho do aptâmero (por exemplo, como medido em termos de raio hidrodinâmico) do conjugado. Conjugados maiores (> 10 kDa) são conhecidos para bloquear de modo mais eficaz a filtragem por meio do rim e de consequentemente aumentar a meia vida de pequenas macromoléculas no soro (por exemplo, peptídeos, oligonucleotídeos antisentido). A habilidade de conjugados PEG bloquear a filtragem foi mostrada aumentar com o tamanho do PEG até aproximadamente 50 kDa (aumentos adicionais apresentam efeito benéfico mínimo na medida em que a meia vida se torna definida pelo metabolismo mediado a macrófago em vez de pela eliminação pelos rins).
[00248] A produção de PEGs de alto peso molecular (> 10 kDa) pode ser difícil, ineficaz, e anti-econômica. Como uma via na direção da síntese de conjugados de PEG de alto peso molecular - ácido nucléico, o trabalho anterior esteve focalizado na geração de PEGs ativados de maior peso molecular. Um método de gerar as referidas moléculas envolve a formação de PEG ativado ramificado nas quais dois ou mais PEGs são fixados ao núcleo central portando o grupo ativado. As porções terminais das referidas moléculas PEG de maior peso molecular, isto é, frações hidroxila (-OH) relativamente não reativas, podem ser ativadas, ou convertidas em frações funcionais, para a fixação de um ou mais dos PEGs a outros compostos em campos reativos no composto. PEGs ativados ramificados apresentam mais de duas terminações, e nos casos onde as duas ou mais terminações foram ativadas, as referidas moléculas PEG de maior peso molecular ativadas são referidas aqui como, PEGs multi ativados. Em alguns casos, nem todas as ramificações na molécula PEG ramificada são ativadas. Em casos onde quaisquer duas terminações na molécula PEG ramificada são ativadas, as referidas moléculas PEG são referidas como PEGs bi-ativados. Em alguns casos onde apenas duas terminações na molécula PEG ramificada é ativada, as referidas moléculas PEG são referidas como momoativadas. Como um exemplo da referida abordagem, a PEG ativada preparada pela fixação de dois PEGs monometóxi a um núcleo de lisina é subsequentemente ativado para reação foi descrita. (Harris et al, Nature, vol.2: 214 - 221, 2003).
[00249] A presente invenção proporciona outra via econômica de síntese de conjugados PEG de alto peso molecular - ácido nucléico (preferivelmente, aptâmero) incluindo ácidos nucléicos peguilados aumentados. A presente invenção engloba também os oligonucleotídeos multiméricos ligados a PEG, por exemplo, aptâmeros dimerizados. A presente invenção também se refere a composições de alto peso molecular onde a fração de estabilização de PEG é um ligante que separa as diferentes porções de um aptâmero, por exemplo, o PEG é conjugado dentro de uma única seqüência de aptâmero, de modo que a disposição linear da composição de aptâmero de alto peso molecular, por exemplo, é ácido nucléico - PEG - ácido nucléico (- PEG - ácido nucléico)n onde n é superior ou igual a 1.
[00250] As composições de alto peso molecular da presente invenção incluem aquelas dotadas de um peso molecular de pelo menos 10 kD. As composições tipicamente apresentam um peso molecular entre 10 kD e 80 kD de tamanho. As composições de alto peso molecular da presente invenção são de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, ou 80 kD de tamanho.
[00251] A fração de estabilização é uma molécula, ou uma porção de molécula, que aprimora as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas das composições de aptâmero de alto peso molecular da presente invenção. Em alguns casos, a fração de estabilização é uma molécula ou porção de molécula que traz dois ou mais aptâmeros, ou domínios de aptâmeros, nas proximidades, ou proporciona redução da liberdade rotacional das composições de aptâmero de alto peso molecular da presente invenção. Uma fração de estabilização pode ser polialquileno glicol, tal como polietileno glicol, que pode ser linear ou ramificado, um homopolímero ou um heteropolímero. Outras frações de estabilização incluem polímeros tais como ácidos peptídeo nucléicos (PNA). Os oligonucleotídeos podem também ser frações de estabilização; os referidos oligonucleotídeos podem incluir nucleotídeos modificados, e/ou ligações modificadas, tais como fosforotioatos. Uma fração de estabilização pode ser uma parte integral de uma composição de aptâmero, isto é, a mesma é covalentemente ligada ao aptâmero.
[00252] As composições da presente invenção podem incluir composições de aptâmero de alto peso molecular nas quais duas ou mais frações de ácido nucléico são covalentemente conjugadas a pelo menos uma fração de polialquileno glicol. As frações de polialquileno glicol servem como frações de estabilização. Nas composições onde uma fração de polialquileno glicol é covalentemente ligada em qualquer uma das extremidades a um aptâmero, de modo que o polialquileno glicol se une às frações de ácido nucléico junto em uma molécula, o polialquileno glicol é dito ser uma fração de ligação. Nas referidas composições, a estrutura primária da molécula covalente inclui a disposição linear de ácido nucléico - PAG - ácido nucléico. Um exemplo é a composição dotada de uma estrutura primária de ácido nucléico - PEG - ácido nucléico. Outro exemplo é uma disposição linear de ácido nucléico - PEG - ácido nucléico - PEG - ácido nucléico.
[00253] Para produzir o conjugado ácido nucléico - PEG - ácido nucléico, o ácido nucléico é originalmente sintetizado de modo que o mesmo apóia um único campo reativo (por exemplo, é mono-ativado). Em uma modalidade preferida, o referido campo reativo é um grupo amino introduzido na terminação-5’ pela adição de uma fosforoamidita modificada como a ultima etapa na síntese de fase sólida do oligonucleotídeo. Em seguida da desproteção e da purificação do oligonucleotídeo modificado, o mesmo é reconstituído em alta concentração em uma solução que minimiza a hidrolise espontânea de PEG ativado. Em uma modalidade preferida, a concentração do oligonucleotídeo é de 1 mM e a solução reconstituída contém 200 mM de tampão NaHCO3-, pH 8,3. A síntese do conjugado é iniciada pela lenta adição em etapas de PEG bifuncional altamente purificado. Em uma modalidade preferida, o PEG diol é ativado em ambas as extremidades (biativado) pela derivação com propionato de succinimidila. Em seguida da reação, o conjugado EPG - ácido nucléico é purificado por eletroforese de gel ou cromatografia líquida para separar espécies completas, parciais, e não conjugadas. As múltiplas moléculas PAG concatenadas (por exemplo, como os copolímeros de bloco ou aleatórios) ou cadeias PAG menores podem ser ligadas para alcançar os diversos comprimentos (ou pesos moleculares). Ligantes não PAG podem ser usados entre as cadeias PAG de comprimentos variáveis.
[00254] 2’-OMe, 2’-flúor e outras modificações de nucleotídeos modificados estabilizam o aptâmero contra nucleases e aumentam a sua meia vida in vivo. A cobertura 3’-3’-dT também aumenta a resistência a exonuclease. Ver, por exemplo, as patentes U.S. Nos. 5.674.685; 5.668.264; 6.207.816; e 6.229.002, cada uma das quais se encontra aqui incorporada por referência em sua totalidade.
Derivação PAG de um ácido nucléico reativo
[00255] Os conjugados PAG - ácido nucléico - PAG de alto peso molecular podem ser preparados pela reação de um PEG monofuncional ativado com um ácido nucléico contendo mais de um campo reativo. Em uma modalidade, o ácido nucléico é bireativo, ou biativado, e contém dois campos reativos: um grupo 5’-amino e um grupo 3’-amino introduzido no oligonucleotídeo através da síntese de fosforoamidita, por exemplo, 3’-5’-dipeguilação como ilustrado na Figura 6. Em modalidades alternativas, os campos reativos podem ser introduzidos em posições internas, usando, por exemplo, a posição-5 de pirimidinas, a posição-8 de purinas, ou a posição-2 de ribose como campos para a fixação de aminas primárias. Nas referidas modalidades, o ácido nucléico pode ser dotado de diversos campos ativados ou reativos e é dito ser multiplado ativado. Em seguida da síntese e da purificação, o oligonucleotídeo modificado é combinado com PEG monoativado sob condições que promovem a reação de seleção com os campos reativos de oligonucleotídeo e ainda minimizam a hidrólise espontânea. Na modalidade preferida PEG-monometóxi é ativado com propionato de succinimidila e a reação acoplada é realizada em pH 8,3. Para direcionar a síntese de PEG bi-substituído, o excesso estequiométrico de PEG é proporcionado ao oligonucleotídeo. Em seguida da reação, o conjugado PEG - ácido nucléico é purificado por eletroforese de gel ou cromatografia líquida para separar espécies completas, parciais e não conjugadas.
[00256] Os domínios de ligação podem ainda ser dotados de uma ou mais frações de polialquileno glicol fixadas à mesma. Os referidos PÁGS podem ser de comprimentos variáveis e podem ser usados em combinações apropriadas para alcançar o peso molecular desejado da composição.
[00257] O efeito de um ligante particular pode ser influenciado tanto pela composição química como pelo comprimento. Um ligante que for muito longo, muito curto, ou que forme interações estéricas desfavoráveis e/ou iônicas com o alvo pode impedir a formação do complexo entre o aptâmero e o alvo. Um ligante, que é mais longo que o necessário para expandir a distancia entre os ácidos nucléicos, pode reduzir a estabilidade da ligação ao reduzir a concentração eficaz do ligante. Assim é com freqüência necessário se otimizar as composições ligantes e os comprimentos de modo a maximizar a afinidade de um aptâmero ao alvo.
[00258] Todas as publicações e documentos de patente aqui citados são incorporados aqui por referência como se cada publicação e documento fosse específica e individualmente indicado estar aqui incorporado por referência. A citação das publicações e dos documentos de patente não tem a intenção de ser admitida ser pertinente à técnica anterior, nem constitui qualquer admissão com relação ao conteúdo ou datas das mesmas. A presente invenção agora tendo sida descrita apenas no sentido de descrição escrita, aqueles versados na técnica reconhecerão que a invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição e os exemplos abaixo a seguir são com o objetivo apenas de ilustração e não limitam as reivindicações que se seguem.
Exemplo 1 Atividade antiaptâmero -C5 nas vias clássicas e de complemento alternativas Exemplo 1A: Ensaio de Hemólise
[00259] O teste CH50 mede a capacidade do sistema complemento em uma amostra de teste de soro de lisar 50% das células em uma suspensão padronizada de eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo. Uma solução de soro humano a 0,2% foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL) na presença ou ausência de diversos aptâmeros anti-C5. O ensaio foi realizado de acordo com o kit protocolo em salina tamponada a veronal contendo cálcio, magnésio e 1% de gelatina (tampão complemento GVB”””) e incubada por 30 minutos a 37°C. Após a incubação, as amostras foram configuradas para granular os eritrócitos intactos. A densidade ótica a 412 nm (OD412) do sobrenadante foi lida para quantificar a liberação da hemoglobina solúvel que foi proporcional à extensão da hemólise (Green et al, (1995) Chem. Biol. 2:683 - 95). Para e verificar que os aptâmeros bloquearam a ativação de C5, alguns sobrenadantes de hemólise foram analisados quanto a presença de C5 e de C5b-9 por ELISA (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA) em seguida dos protocolos dos kits de ELISA.
[00260] A adição de um aptâmero anti-C5 não peguilado (ARC 186) (SEQ ID NO: 4) à mistura de reação inibiu a hemólise em uma forma dependente de dose, como mostrado no gráfico da Figura 7A, com uma IC50 de 0,5 ± 0,1 nM, (ver Figura 7B), um valor que é consistente com a kD determinada por filtragem de nitrocelulose. Em concentrações de aptâmeros muito elevadas (> 10 nM), a extensão da hemólise foi essencialmente indistinguível a partir do fundo (sem soro adicionado), indicando que (ARC 186) (SEQ ID NO: 4) foi capaz de bloquear completamente a atividade do complemento. A conjugação do aptâmero (ARC 186) (SEQ ID NO: 4) com grupos 20 kDa (ARC 657; SEQ ID NO: 657, SEQ ID NO: 61), 30 kDa (ARC 658; SEQ ID NO: 62), 40 kDa (l,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-2- (4’-butamida) ramificado (ARC 187; SEQ ID NO: 5), 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoil) ramificado (ARC 1905; SEQ ID NO: 67), linear 40 kDa (ARC 1537; SEQ ID NO: 65), e linear 2x20 kDa (ARC 1730; SEQ ID NO: 66) PEG apresentou pouco efeito na atividade inibitória de aptâmero no ensaio de hemólise CH50 (Figura 7A - Figura 7D).
[00261] Em um estudo adicional, a atividade inibitória do aptâmero anti-C5 peguilado AR1905 (40 kDa ramificado (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1- carbamoil); SEQ ID NO: 67) foi comparada ao seu precursor não peguilado, ARC 672 (SEQ ID NO 63) que contém um terminal 5’-amina, no teste de hemólise CH50 acima descrito. Uma solução de soro humano (Innovative Research, Southfield, MI) foi misturada com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL) na presença ou ausência de diversas concentrações de ARC 1905 e ARC 627 respectivamente de modo que a concentração final do soro em cada teste foi de 0,1% e o teste foi rodado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. As reações de hemólise foram incubadas por 1 hora a 37°C com agitação para garantir que as células permaneceram em suspensão. NO final da incubação, as células intactas foram granuladas por centrifugação (2.000 rpm, 2 minutos, a temperatura ambiente), 200 μL de sobrenadante foram transferidos a uma placa de polistireno de fundo arredondado (VWR, cat#62409-003). A densidade ótica a 415 nm (OD 415) do sobrenadante foi lida para quantificar a liberação da hemoglobina solúvel. O percentual de inibição de cada concentração de aptâmero foi calculado usando uma equação % polegada = 100-100 X (A amostra — A sem soro) / (A sem aptâmero — A sem soro), onde A amostra é a absorção da amostra em concentrações variáveis de aptâmero, A sem soro é a absorção em virtude da hemólise de fundo na ausência de soro (100% de controle de inibição) e A sem aptâmero é a absorção em virtude da atividade complemento basal na ausência do aptâmero (0% de inibição de controle). Os valores de IC50 foram determinados a partir do gráfico de % de inibição com relação [inibidor] usando a equação % polegada = (% polegada)máxima x [inibidor]n / (IC50” + [inibidor]n) + fundo. Os valores de IC90 e de IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as equações IC90 = IC50 x [90/(100-90]l/n e IC90 = IC50 x [99/(100-99]l/n. Os valores de IC50 para ARC 1905 e ARC 627 no presente estudo paralelo foram 0,648 +/- 0,0521 e 0,913 +/- 0,0679 respectivamente (ver também Figura 58) adicionalmente confirmando que a peguilação apresentou pouco, se algum, efeito na função de aptâmero.
[00262] A análise ELISA da hemólise do sobrenadante indicou que a referida inibição funcional esteve correlacionada com o bloqueio da liberação de C5a. Assim, os dados de hemólise mostraram que ARC 186 (SEQ ID NO: 4), e seus conjugados peguilados, são inibidores de complemento altamente potentes que funcionam para bloquear a ativação catalisada a convertase de C5.
[00263] Os testes de hemólise com material não peguilado indicaram que o aptâmero anti-C5 não sofreu reação cruzada com C5 a partir de uma série de espécies não primatas, incluindo ratos, porco da guiné, cães e porcos. Entretanto, a atividade inibitória significativa foi observada em triagens de soro de primatas, incluindo o soro do macaco cinomolgus, macaco rhesus e chipanzé. A eficácia in vitro do aptâmero anti-C5 foi adicionalmente investigada em soro de cinomolgus usando ARC 658 (SEQ ID NO: 62), o análogo de 30 kDa-PEG de ARC 186 (SEQ ID NO: 4). Em uma comparação lado a lado (n = 3), ARC 658 inibiu a atividade de complemento humano com uma IC50 de 0,21 nM ± 0,0 nM e uma atividade de complemento de cinomolgus com uma IC50 de 1,7 ± 0,4 nM (Figura 8). Assim ARC 658 (SEQ ID NO: 62) é 8 ± 3 vezes menos potente em soro de cinomolgus em comparação ao humano pela referida medição.
[00264] Em um estudo relacionado, os efeitos do aptâmero anti-C5 peguilado ramificado de 40 kDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoil), ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) no trajeto clássico de ativação de complemento como testado pela hemólise de eritrócito de ovelha foi investigado na presença de humanos (Innovative Research, Southfield, MI), macaco cinomolgus (Bioreclamation, Hicksville, NY), ou soro de rato (Bioreclamation, Hicksville, NY). Os referidos testes foram realizados em soro altamente diluído, 0,1% para humanos e macaco cinomolgus, e 0,3% para ratos, sob as mesmas condições que as utilizadas para comparar os efeitos inibitórios de ARC 1905 contra ARC 672 na hemólise de eritrócitos de ovelhas como descrito diretamente acima. Em uma comparação lado a lado, a inibição completa (90% - 99%) da atividade de complemento in vitro foi alcançada com ARC 1905 tanto em soro de seres humano como em de macacos cinomolgus enquanto que ARC 1905 exibiu pouca ou nenhuma atividade inibitória específica na amostra de complemento de rato (Figura 59A). De forma similar a ARC 658, ARC 1905 foi aproximadamente 10 vezes menos potente contra a atividade de complemento de macaco cinomolgus sob as condições de teste, como refletido nos valores de IC90 e de IC99 reportados na Figura 59B.
[00265] Testes de ligação de filtro de nitrocelulose. Os aptâmeros individuais foram 32P-marcados na extremidade 5’ pela incubação com y-32P-ATP e polinucleotídeo quinase (New England Biolabs, Beverly, MA). O aptâmero radiomarcado foi purificado de ATP livre por filtragem de gel seguido de eletroforese de gel de poliacrilamida. Para se medir a afinidade de aptâmero anti- C5, o aptâmero radiomarcado (< 10 pM) foi incubado com crescentes concentrações (0,05 nM - 100 nM) de proteína C5 purificada (Quidel, San diego, CA) em solução salina tamponada a fosfato contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C) e 37°C, por 15 minutos e 4 horas de intervalos de tempo. As reações de ligação foram analisadas por filtragem de nitrocelulose usando múltiplas filtragens a vácuo, 96 cavidades, dot-blot Minifold I (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Um meio de filtragem de três camadas foi utilizado, consistindo (de cima para baixo) de nitrocelulose Protran (Schleicher & Schuell), náilon Hybond-P (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e papel blot GB002 gel (Schleicher & Schuell). A camada de nitrocelulose, que seletivamente liga proteína sobre o ácido nucléico, preferivelmente reteve o aptâmero anti-C5 no complexo com a proteína ligante, enquanto o aptâmero anti-C5 que não formou complexo passou através da nitrocelulose e aderiu ao náilon. Em seguida da filtragem, as camadas de filtro foram separadas, secas e expostas a uma tela de fósforo (Amersham Biosciences) e quantificadas usando um sistema de imagem blot Storm 860 Phosphorimager® (Amersham Biosciences).
[00266] Como mostrado na Figura 9 e na Figura 10, crescentes concentrações de C5 aumentam a proporção de ARC 186 capturado na membrana de nitrocelulose. A dependência do ARC 186 ligado nas concentrações crescentes de C5 é bem descrita pelo modelo de ligação de campo único (C5 + ARC 186 <-> C5.ARC 186; % de ligação = Cmax / (1 + KD /[C5]); Cmax é o percentual de ligação máximo em saturação de [C5]; kD é a constante de dissociação. As curvas de ligação de ARC 186 em duas temperaturas em seguida de incubação a 15 minutos ou a 4 horas são mostradas nas Figuras 9 e 10, respectivamente. Em seguida, uma incubação de 15 minutos, as curvas de ligação de ARC 186 em 23°C e 37°C são essencialmente indistinguíveis em erro, se encaixando em valores KD de 0,5 nM - 0,6 nM (Figura 9). As diferenças entre as curvas de ligação a 23°C e 37°C se tornaram mais pronunciadas quando o tempo de incubação é estendido. Em seguida de uma incubação de 4 horas (Figura 10), a KD observada a 23° reduziu para 0,08 nM ± 0,01 nM, embora a KD observada a 37°C permaneceu inalterada (0,06 nM ± 0,01 nM).
[00267] Para demonstrar a base para a necessidade de longa incubação a temperatura ambiente, a afinidade a esta temperatura foi adicionalmente explorada por meio da utilização de métodos cinéticos. O coeficiente de reação reversa descrevendo a dissociação de C5*ARC 186 é vrev = k-l[C5*ARC 186], onde vrev é o coeficiente (unidades de M min-1) e k-l é a constante do coeficiente de dissociação de primeira ordem (unidades de min-1). O coeficiente da reação a seguir descrevendo a formação do complexo C5*ARC 186 é Vfor = kl[C5][ARC 186], onde Vfor é o coeficiente (unidades de M min-1) e kl é a constante de coeficiente de associação de segunda ordem (unidades de M min-1). Os dados foram analisados usando a suposição de pseudo primeira ordem, onde a concentração de um reagente (C5 neste caso) é mantida em um vasto excesso em relação ao outro [C5]>> [ARC 186], e assim permanece essencialmente inalterado no decurso da reação. Sob as referidas condições, a reação a seguir é descrita pela equação de coeficiente para um processo de primeira ordem, Vfor = kl’[ARC 186], onde kl’ = kl[C5].
[00268] Para se analisar C5*ARC 186, ARC 186 radiomarcado (< 10 pM) foi pré-equilibrado cm 5 nM de proteína C5 em solução salina tamponada a fosfato contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C). A reação de dissociação foi iniciada pela adição de um ARC 186 não marcado (1 μM), que atua como uma armadilha para o C5 livre, e interrompida pela filtragem por nitrocelulose separando o ARC 186 radiomarcado ligado do livre. O decurso de tempo da dissociação de ARC 186 foi obtido ao se variar a duração entre o inicio da reação de dissociação e a filtragem. O decurso de tempo de dissociação, observado como a redução no percentual de ARC 186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose (igual ao percentual ligado a C5) é bem descrito pela queda uni-exponencial onde o % de ARC 186 ligado = 100 x e-klt (ver Figura 11). Os valores da constante de coeficiente de dissociação, k-l, determinados pelo presente método são 0,013 min-1 ± 0,02 min-1, correspondendo à meia-vida t1/2= 1n2 / kl) de 53 min ± 8 min.
[00269] Para se analisar a reação de associação, a constante de coeficiente de equilíbrio (keq) para a formação de C5*ARC 186 foi medida na presença de concentrações variáveis de proteína C5 (1 nM - 5 nM). A formação de complexo foi iniciada ao se misturar junto a proteína C5 e ARC 186 radiomarcado em PBS contendo 1 mM de MgCl2 a temperatura ambiente (23°C), e interrompida por fracionamento de filtragem por nitrocelulose. Como descrito para as reações de dissociação, o decurso de tempo da formação de complexo foi obtido ao se variar a duração entre o início da reação e a filtragem. O decurso de tempo de equilíbrio, observado como um aumento no percentual de ARC 186 radiomarcado capturado no filtro de nitrocelulose, é bem descrito pela queda uni-exponencial onde o % de ARC 186 ligado = 100 x (1 - e-klt). O decurso de equilíbrio para 1 nM, 2 nM e 4 nM de C5 é exibido na Figura 12. Como esperado, o valor de keq aumenta linearmente com [C5] (keg (1 nM) = 0,19 min-1 ± 0,02 min-1; keq (2 nM) = 0,39 min-1 ± 0,03 min-1; keq (3 nM) = 0,59 min-1 ± 0,05 min-1; keq (4 nM) = 0,77 min-1 ± 0,06 min-1; keq (5 nM) = 0,88 min-1 ± 0,06 min-1). Sob as condições do experimento, a relação entre keq, kl e k-l é keq = kl[C5] + k-l. Assim,uma estimativa de kl é derivada da inclinação de um gráfico de keq com relação a [C5] (ver inserção na Figura 12), neste caso 0,18 ± 0,01 nM-1min-1.
[00270] Os referidos dados indicam que sob as condições de baixa concentração de C5 (por exemplo, 0,1 nM), uma incubação extensa é necessária de modo a que a mistura de C5 e ARC 186 radiomarcado alcance o equilíbrio. Sob as referidas condições, keq = (0,18 ± 0,01 nM-1min-1) (0,1 nM) + 0,013 min-1 = 0,03 min- 1, correspondendo à meia vida de 22 minutos. Assim, uma incubação de aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente (~ 5 meia vidas) é necessária para completar (> 95%) de equilíbrio. Um tempo curto de incubação (por exemplo, 15 minutos) irá subestimar de forma significativa a afinidade atual do complexo, como mostrado acima pela diferença nas afinidades observadas por uma incubação de 15 minutos (KD = 0,5 nM) com relação a uma incubação de 4 horas (KD = 0,08 nM). Uma estimativa alternativa de KD de temperatura ambiente pode ser calculada para dados cinéticos de acordo com a relação KD = k-l / kl. Neste caso, a KD calculada é 0,07 nM ± 0,01 nM, que é completamente consistente com a KD determinada acima pelos métodos termodinâmicos.
[00271] A especificidade de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) para C5 foi também avaliada em testes de filtragem de nitrocelulose em comparação com o componente complemento tanto a montante como a jusante a partir de C5 na cascata de complemento. As proteínas humanas purificadas e os complexos protéicos foram adquiridos da Complement Technologies (Tyler, TX) incluindo: Clq (cat. # A099.18; 2.3 μM), C3 (cat. # A113c.8; 27 μM), C5 (cat. # A120.14; 5.4 μM), C5a des Arg (cat. # A145.6; 60 μM), sC5b-9 (cat. # A127.6; 1 μM), fator B (cat. #A135.12; 11 μM) e fator H (cat. # A137.13P; 6.8 μM). As reações de ligação foram estabelecidas ao se realizar diluições em série de proteína em PBS mais 1 mM de MgCl2, 0,02 mg/mL de BSA e 0,002 mg/mL de RNAt, incubando por 1 - 4 horas a 25°C ou 37°C, e então aplicadas ao aparelho de filtragem de nitrocelulose como acima descrito. As constantes de dissociação KD foram determinadas a partir de gráficos de semi-log de % de ligação de nitrocelulose com relação a [C5] com uma adaptação dos dados da equação: % de ligação de nitrocelulose = amplitude X[C5]/(KD +[C5]).
[00272] Os resultados ilustrados na Figura 13 mostram que o aptâmero essencialmente não reconhece C5a (KD >> 3 μM), embora o mesmo exiba uma fraca afinidade para C5b-9 (KD > 0,2 μM), presumivelmente em virtude das interações com o componente C5b. Outros componentes complementos exibem afinidade de moderada a fraca para o aptâmero. O C3 não ativado essencialmente não se liga ao aptâmero, entretanto, o fator H (KD ~ 100 nM) e, a uma extensão muito menor, Clq (KD > 0,3 μM) se liga. Juntos, os dados indicam que ARC 186 (SEQ ID NO: 4) se liga com alta afinidade à C5 humana, principalmente por meio do reconhecimento do domínio C5b. Assim, ARC 186 e seus derivados peguilados, por exemplo, ARC 1905 não devem interferir com a geração de C3b, que é importante para a opsonização bacteriana, ou com o controle inato de ativação C por fatores regulatórios.
[00273] A conjugação de aptâmeros com frações PEG de alto peso molecular introduz a possibilidade de impedimento estérico levando a afinidade reduzida. Os aptâmeros modificados a PEG não são prontamente avaliados quanto à ligação direta por testes de filtragem por nitrocelulose em virtude da tendência dos referidos aptâmeros se aderirem à nitrocelulose mesmo na ausência de proteína alvo. Entretanto, as afinidades relativas dos referidos aptâmeros pode ser avaliada a partir de sua habilidade comparativa em competir com o aptâmero não peguilado radiomarcado (< 10 pM) para a ligação ao alvo como medido por filtragem de nitrocelulose conhecida como o teste de ligação competitiva, implementado a 37°C. Na medida em que a concentração de competidores frios (isto é, não radiomarcados) aumenta, o percentual de aptâmero radiomarcado ligado à proteína alvo diminui. Como mostrado na Figura 14, maiores concentrações de ARC 186 (SEQ ID NO: 4) ou aptâmero peguilado (ARC 657 (SEQ ID NO: 61), ARC 658 (SEQ ID NO: 62), e ARC 187 (SEQ ID NO: 5)) (0.05 nM - 1000 nM) prontamente competem com o ARC 186 (SEQ ID NO: 4) radiomarcado para a ligação na presença de 2 nM de proteína C5. Ademais, as curvas de titulação para todos os quatro aptâmeros quase se sobrepõem, indicando que a conjugação PEG em caso de ARC 657, ARC 658 e ARC 187 apresenta pouco ou nenhum efeito na afinidade do aptâmero para C5.
[00274] Em um estudo similar, o efeito da conjugação PEG na ligação a C5 foi testado por comparação de ARC 672 (ARC 186 com uma amina 5’-terminal; SEQ ID NO 63) com ARC 1905 (ARC 627 conjugada com uma (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])- propil-1-carbamoila ramificado de 40 kDa) PEG) usando o teste de ligação competitiva. 10 μM estoque de cada aptâmero foram preparados em PBS mais 1 mM MgCl2, 0,01 mg/mL BSA, 0,002 mg/mL RNAt, e diluído em série para gerar uma série de amostra 10X cobrindo uma faixa > 100 vezes da concentração de aptâmero. Alíquotas de 12 μL de cada amostra foram então adicionadas em uma placa de 96 cavidades de 96 μL de ARC 186 32P-radiomarcado para gerar uma solução de 1,1X de marcação e competidor frio. 90 μL de solução marcadora/competidora foi então adicionado a 10 μL de 10X proteína C5 para iniciar as reações. A concentração final de ARC 186 marcado em cada reação foi mantida constante. As reações de ligação foram equilibradas por 15 min - 30 min a 37°C, e então filtradas sobre um aparelho de filtro de nitrocelulose acima descrito. Para os objetivos de análise de dados, os aptâmeros competidores frios foram tratados como inibidores competitivos para a interação de ARC 186/C5; o percentual de inibição foi calculado pela normalização dos dados para controlar as reações desprovidas de competidor (0% de controle de inibição). Os valores de IC50 foram determinados a partir dos gráficos de semi-log do % de inibição com relação a [ARC 672] ou [ARC 1905] por uma adaptação dos dados à equação: % de inibição = amplitude x [competidor]n/IC50n + [competidor]n).
[00275] Como mostrado na Figura 60, a adição de um PEG ramificado de 40 KDa (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propil-1-carbamoil) apresenta pouco ou nenhum efeito na afinidade de aptâmero como medido pela ligação competitiva. Os valores KD de 46 ± / -0,149 nM e 0,71 ± / -0,130 nM foram aproximados para ARC 672 e ARC 1905 respectivamente por sua intercepção-y da linha de encaixe a IC50 com relação aos dados C5 na Figura 60. Ambos os valores são próximos ao KD determinado para ARC 186 a 37°C.
[00276] A dependência de temperatura da interação entre ARC 1905 e C5 foi também estimada pelo teste de competição. A ARC 1905 foi diluída em série para gerar séries de amostras 10X como descritas acima. As reações de ligação foram equilibradas por 1 hora - 4 horas a 25°C ou 37°C, e então filtradas em um aparelho de filtro de nitrocelulose. O percentual de inibição foi calculado para normalizar os dados para as reações de controle que são desprovidos de competidor (0% de controle de inibição) ou desprovidos de proteína C5 (100% de controle de inibição). Os valores IC50 foram determinados a partir dos gráficos de semi-log de % de inibição com relação a [ARC 672] ou [ARC 1905] por uma adequação dos dados da equação: % de inibição = amplitude x [competidor]n/IC50n + [competidor]n). Como mostrado na Figura 61, o ARC 1905 se liga a C5 com alta afinidade tanto a 25°C como a 37°C. Os valores KD de 0,15 ± 0,048 nM e 0,69 ± 0,148 nM foram obtidos a 25°C e a 37°C, respectivamente, a partir da intercepção-y de IC50 com relação aos dados C5. Ambos os valores são consistentes com os valores KD determinados para a interação ARC 185/C5 acima descrita.
Exemplo 1B: Teste de Sangue Total
[00277] O efeito do aptâmero anti-C5 no trajeto alternativo do sistema complemento foi analisado usando o teste de sangue total a seguir. Na ausência de um anticoagulante, o sangue foi obtido a partir de voluntários humanos normais. Alíquotas de sangue (não contendo anticoagulante) foram incubadas com concentrações crescentes de ARC 196 (SEQ ID NO: 4) por 5 horas a temperatura ambiente ou 37°C. As amostras foram centrifugadas para isolar o soro e a presença de C5b no soro foi detectada por sC5b-9 ELISA (C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA). Como mostrado na Figura 15, a atividade anticomplemento, como refletida na produção de C5b-9, entre as amostras incubadas em diferentes temperaturas divergiu em 3 μM. Os dados de temperatura ambiente indicaram que a concentração do aptâmero necessitou de uma inibição quantitativa estão na faixa de 3 μM - 6 μM, enquanto que a concentração reportada de C5 é de aproximadamente 400 nM. Os referidos resultados sugerem que mais que 10 x de excesso molar de aptâmero anti-C5 (Ar186; SEQ ID NO: 4) podem ser necessários para a completa inibição da atividade C5.
Exemplo 1C: Ativação de complemento por zimosan
[00278] Zimosan é um componente polissacarídeo da parede celular da levedura, e um ativador potente da cascata de complemento alternativa. A adição de zimosan às amostras ex vivo de sangue, plasma ou soro resulta no acúmulo de produtos de ativação de complemento, incluindo C5a e a versão solúvel de C5b-9 (sC5b-9). As amostras do soro humano não diluído (Center for Blood Research, Boston, MA), sangue humano total citratado (Center for Blood Research, Boston, MA) ou soro de cinomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) foram aumentados com concentrações crescentes de ARC 658 (SEQ ID NO: 62), o análogo de 30K PEG de ARC 186 (SEQ ID NO: 4). Para ativar o complemento, zimosan (Sigma, St. Louis, MO) em uma suspensão 10X foi adicionado às amostras a uma concentração final de 5 mg/mL. Em seguida de uma incubação de 15 minutos a 37°C, as partículas de zimosan foram removidas por centrifugação e a extensão da ativação complemento foi determinada por C5a e/ou sC5b- 9 ELISA (kit C5b-9 ELISA, Quidel, San Diego, CA; kit C5a ELISA, BD Biosciences, San Diego, CA).
[00279] Na ausência do aptâmero, o tratamento com zimosan ativa -50% do soro ou do sangue total C5, em comparação a -1% de ativação na amostra não tratada. A adição do aptâmero anti-C5 de cerca de 50 nM (-10% de concentração de C5 no sangue) possui pouco efeito na formação de sC5b-9. entretanto, a titulação adicional de C5 com concentrações crescentes de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) inibiu a ativação de C5 em uma maneira dependente de dose como visto na Figura 16. No soro humano ou sangue total, a inibição quantitativa (-99%) foi observada a 0,8 μM - 1 μM ARC 658 (SEQ ID NO: 62), correspondendo a -2 equivalentes molares do aptâmero para C5. Concentrações mais elevadas do aptâmero foram necessárias para alcançar a inibição comparável no soro de cinomolgus. Neste caso, 99% de inibição foi alcançada apenas na presença de 10 μM de aptâmero, ou ~20 equivalentes molares do aptâmero para C5.
[00280] Em um estudo similar, os efeitos inibitórios de ARC 1905 (((2,3- bis(mPEG-[20 kDa])-propil-l-carbamoil) ramificado de 40 KDa, a versão peguilada de ARC 186) foi testada em amostras de seres humanos e de maço cinomolgus usando zimosan para ativar o complemento por meio do trajeto alternativo como a seguir. Zimosan A da Saccharomyces cerevisiae foi fornecido pela Sigma-Aldrich, Inc. (cat. no. Z4250-1G, St. Louis, MO). O zimosan A foi fornecido como um pó e foi resuspenso em PBS de Dulbecco (Gibco, Carlsbad, CA, cat. no. 14190-144) para produzir uma suspensão de 50 mg/mL. Soro humano normal congelado (cat. No. IPLA-SER) foi adquirido da Innovative Research (Southfield, MI). soro de macaco cinomolgus congelado (cat. No. CYNSRM) foi adquirido da Bioreclamation (Hicksville, NY). Frascos de soro de 5 mL - 10 mL proporcionados pelo fornecedor foram descongelados a 37°C, separados em alíquotas de (-1 mL) e armazenados a -20°C. As alíquotas foram removidas logo antes do uso por incubação a 37°C e armazenados em gelo durante os experimentos. A concentração final do soro em cada teste foi de - 100%. Um estoque de 20 μM de ARC 1905 foi preparado em salina 0,9% e diluído em série para gerar uma série de amostras 10x cobrindo uma faixa de -90- vezes de concentrações de aptâmeros. Uma amostra sem aptâmero (só de salina) foi também incluída como um controle negativo (0% de inibição).
[00281] 90 μL de soro foi pipetado em cavidades de uma placa PCR de 96 cavidades (VWR, cat. no. 1442-9596). 10 μL de amostra de aptâmero foi diluída diretamente no soro a temperatura ambiente e misturado. 8 μL de 50 mg/mL de zimosan foi pipetada em cavidades de uma placa PCR de 96 cavidades separada. Ambas as placas foram simultaneamente pré-incubadas a 37°C por 15 minutos. Imediatamente em seguida da pré-incubação, 80 μL da mistura de soro/aptâmero foi adicionada diretamente a 8 μL de zimosan e misturada, produzindo uma concentração final de zimosan de 5 mg/mL. A placa de reação foi selada e incubada por 15 minutos a 37°C. No final da incubação, a reação foi rapidamente resfriada ao se pipetar 8 μL de 0,5 M de EDTA em cavidades e misturados. A zimosan foi granulado por centrifugação (3700 rpm, 5 min, a temperatura ambiente) e ~80 μL do sobrenadante resfriado foi transferido a uma nova placa PCR de 96 cavidades e selado. O sobrenadante foi rapidamente congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -20°C. Para controlar a ativação de fundo independente de zimosan, amostras de soro foram preparadas e tratadas exatamente como acima descrito, exceto que 8 μL de salina foi adicionado em vez de zimosan.
[00282] A extensão da ativação de C5 foi determinada a partir dos níveis relativos de C5a gerados em cada amostra ativada a zimosan, como medido por C5a ELISA (ALPCO Diagnostics, Windham, NH, cat. no. EIA-3327) seguindo o protocolo do kit C5a ELISA. O kit C5a ELISA inclui reagentes específicos humanos e é formatado para a análise de C5a humano (hC5a) nas amostras de plasma ou de soro. Foi, no entanto, necessário se caracterizar a resposta de ELISA à C5a do macaco cinomolgus usando padrões de concentração de cinomolgus. Para se preparar um conjunto de padrões habituais, alíquotas de 0,5 mL de soro de seres humanos e de macaco cinomolgus foram incubadas com 5 mg/mL de zimosan por 15 minutos a 37°C, rapidamente resfriada com 12,5 μL de 0,5 M EDTA e centrifugado para remover o zimosan. A concentração de C5a na amostra de soro humano ativada a zimosan foi determinada ser aproximadamente 2 ng/mL de hC5a em comparação ao plasma padrão hC5a proporcionado com o kit. A concentração de C5a na amostra de macaco cinomolgus, expressa em equivalentes de C5a humano (hC5a eq.), foi determinada ser aproximadamente 0,6 μg/mL de hC5a eq. Séries de padrões que cobrem uma faixa de 0,4 ng/mL - 400 ng/mL de hC5a ou 0,12 ng/mL - 120 ng/mL de hC5a eq., foram preparadas por diluição em soro de rato (que não interfere com ELISA). Os padrões foram pré-tratados com um reagente de precipitação de proteína como direcionado no protocolo do kit ELISA e aplicado sem diluição adicional na placa ELISA. A placa ELISA foi lida em uma absorção máxima de 450 nm (A450) usando uma leitora de placa de absorção VersaMax UV/vis (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). A A450 variou com uma concentração de C5a a partir de um nível baixo de 0,1 - 0,2 de C5a baixo, formando um platô em aproximadamente 3,5 de C5a alto. Para o objetivo de quantificar C5a nas amostras de teste, os limites superior e inferior da quantificação foram, respectivamente 25 ng/mL e 0,78 ng/mL de hC5a para humano e 15 ng/mL e 0,94 ng/mL de hC5a eq. para macaco cinomolgus. A450 com relação ng/mL de hC5a ou hC5a eq. foi traçado como mostrado na Figura 62, e uma curva padrão foi obtida a partir de uma adaptação de 4-parâmetros aos dados usando a equação y = ((A - D)/(l + (x/C)B)) + D.
[00283] Logo antes da análise de C5a, as amostras de teste (incluindo apenas salina e nenhum controle de zimosan) foram pré-tratadas com um reagente de precipitação de proteína como direcionado no protocolo do kit ELISA, e então diluídas em série em 0,9% de salina. Os níveis de C5a nas amostras de teste não diluídas (incluindo algumas de controles não zimosan) tipicamente excederam o limite superior de quantificação (ULOQ). Portanto, as diluições de 1/5, 1/50 e 1/250 foram testadas para acomodar a faixa completa das concentrações de C5a na amostra de teste. Os níveis de C5a forma quantificados por comparação com a curva padrão apropriada (humano ou macaco cinomolgus) e corrigidas para diluição. O % de inibição em cada concentração de aptâmero foi calculada usando a equação: % inh. = 100-100 x (C5aamostra - C5asem simozan) / (C5aapenas salina - C5asem zimosan). Os valores de IC50 foram determinados a partir de um gráfico de % de inibição com relação a [ARC 1905] usando a equação %inh. = (% inh.)máximo X [ARC 1905]” / (IC50” + [ARC 1905]”) + fundo. Os valores de IC90 e IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as equações IC90 = IC5O x [90/(100-90]t/n e IC99 = IC50 x [99/(100-99] t/n.
[00284] A extensão da ativação C3 (a etapa no trajeto de complemento comum logo a montante de C5) foi determinada a partir dos níveis relativos de C3a gerado em cada amostra ativada a zimosan, como medido por C3a ELISA (Becton- Dickinson OptiEIA C3a ELISA kit, cat. no. 550499, Franklin Lakes, NJ) seguindo o protocolo do kit C3a ELISA.
[00285] Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controles de apenas salina e sem zimosan) foram diluídas em série em 0,9% de salina. O ELISA C3a é mais sensível do que para C5a; portanto, diluições de 1/500, 1/5000 e 1/25.000 foram necessárias para acomodar a ampla faixa de concentrações de C3a. Kits padrões, derivados de soro humano foram usados em vez dos padrões habituais preparados para a análise de C5a. Uma vez que os níveis de C3a não variaram grandemente, os padrões específicos humanos proporcionaram uma indicação suficiente de seus níveis relativos.
[00286] Os dados gerados a partir de ELISAs tanto de C5a como de C3a, foram analisados usando Microsoft Excel, e valores médios de percentual de inibição foram traçados usando Kaleidagraph (v. 3.51, Synergy Software). Os valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinados usando o plug-in XLfit 4.1 para Excel. Os efeitos comparativos de ARC 1905 na ativação de complemento de humano e macaco cinomolgus, como medido pela referida abordagem, são resumidos na Figura 63 e Figura 64. Como pode ser observado a partir das referidas Figuras, a inibição completa da ativação de C5 por meio do trajeto alternativo é alcançável in vitro com ARC 1905 tanto nos soros de humano como no de macaco cinomolgus. No soro humano, a concentração de ARC 1905 necessitou de 90% de inibição de ativação de C5 em uma amostra não diluída foi de 442 ± 23 nM, aproximadamente equivalentes à concentração molar média de C5. Entretanto, o ARC 1905 foi de 4 a 6 vezes menos potente contra a atividade complemento de macaco cinomolgus sob as condições do teste, como refletido nos valores de IC90 e IC99.
[00287] Os efeitos da ativação de ARC 1905 C3, como medido pelos níveis de C3a, são resumidos na Figura 65. O fundamento lógico para direcionar especificamente a extremidade final do trajeto de complemento é de bloquear as funções pró-inflamatórias de C5a e o complexo de ataque de membrana (MAC) sem comprometer as funções de luta de patógeno dos fatores a montante que culminam na geração de C3a e C3b. Os dados na Figura 65 demonstram que ARC 1905, cerca de 2 μM, não inibe a geração de C3a e indica que a ativação de complemento a montante não sofre impacto negativo pela ARC 1905. O bloqueio essencialmente completo do trajeto alternativo da ativação de C5 foi alcançado tanto nas amostras de soro de humano como na de macaco cinomolgus usando ARC 1905. O ARC 1905 foi aproximadamente da ordem de magnitude menos potente na inibição da ativação de C5 em macaco cinomolgus do que na ativação de C5 em seres humanos sob as condições de teste. Embora não se tenha a intenção de estar ligados a uma teoria, o efeito inibitório de ARC 1905 na ativação de complemento é específico para C5 uma vez que a ativação de C3 não foi inibida.
Exemplo 1 D: Modelo de alça de tubo da ativação de complemento
[00288] Para se testar a habilidade do aptâmero anti-C5 em bloquear a ativação de complemento induzida por exposição de materiais estranhos, como observado em circuito de desvio cardiopulmonar, foi utilizado o modelo de alça de tubo descrito por Nilsson e colegas (Gong et al, (1996) Journal of Clinical Immunology 16, 222-9; Nilsson et al, (1998) Blood 92, 1661-7). Tubos médico/cirúrgicos Tygon S- 50-HL (1/4” de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. ((Lima, OH), cat. # 00542) foi cortado em comprimentos de aproximadamente 300 mm (aproximadamente 9 mL de volume) e preenchido com 5 mL de sangue de doador humano contendo 0,4 unidades/mL de heparina (Celsus) e concentrações variáveis de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) (0 μM - 5 μM). Cada comprimento do tubo Tygon foi fechado em alça com seções curtas (~50 mm) de um tubo de ligação de silicone não cirúrgico (3/8” de diâmetro interno) (United States Plastic Corp. (formulation R-3603, cat. # 00271) como descrito em Gong et al. As alças de tubo foram giradas por 1 hora em aproximadamente 30 rpm em um banho de 37°C. os conteúdos da alça foram então vertidos em tubos cônicos de polipropileno contendo EDTA (10 mM de concentração final) para resfriar a ativação do complemento. O plasma pobre em plaquetas foi isolado por centrifugação e analisado quanto a C5a e C3a por ELISA (C3a ELISAkit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA).
[00289] A ativação de complemento total na ausência do aptâmero foi pequena em comparação ao teste de zimosan. Tipicamente, os níveis de C5a aumentaram em aproximadamente 6 ng/mL após 1 hora de incubação, correspondendo à ativação de < 1% do C5 disponível. No entanto, o referido aumento foi reproduzível e inibido por titulação com ARC 658 (SEQ ID NO: 62). Como mostrado na Figura 17, 300 nM - 400 nM de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) foram suficientes para alcançar 99% de inibição de ativação de C5, um nível que é aproximadamente equivalente ou relativamente menos do que a concentração molar de C5 no sangue. Embora não seja desejado estar ligado a qualquer teoria, embora menos aptâmero seja necessário para se obter 99% de inibição de ativação de C5 no presente modelo do que no modelo de zimosan, a referida observação pode refletir as diferenças substanciais no estímulo de complemento - ativação usado nos dois testes. A geração de C3a foi também monitorada como um controle para se verificar que ARC 658 (SEQ ID NO: 62) não bloqueou as etapas de ativação mais precocemente do que C5 na cascata de complemento. Os níveis de C3a aumentaram aproximadamente 4.000 ng/mL após 1 hora de incubação, correspondendo à ativação em torno de 10% do C3 disponível. Diferente da geração de C5a, pouca inibição dependente de dose da geração de C3a foi observada com a titulação com ARC 658 (SEQ ID NO: 62) demonstrando que ARC 658 (SEQ ID NO: 62) bloqueia especificamente a clivagem de C5.
[00290] O estudo de modelo de alça de tubo foi repetido com o aptâmero anti-C5 ARC 1905 (SEQ ID NO: 67). O ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) foi diluído em série em 0,9% de salina para gerar séries de amostras 20X cobrindo uma faixa de 10 vezes a das concentrações de aptâmero (10 nM - 1000 nM final no teste). As amostrar contendo aptâmero irrelevante (ARC 127) foram incubadas para controlar os efeitos não específicos do oligonucleotídeo. Uma amostra não aptâmero (apenas salina) foi também incluída como controle negativo. Amostras de um único doador de sangue foram retiradas por métodos de flebotomia padrão a partir de voluntários internos. Sangue total foi obtido a partir de 5 doadores separados diretamente em uma seringa de 60 mL (Becton-Dickinson, (Franklin Lakes, NJ), cat. # 309653) e imediatamente cotados em bivalirudina (20 μM final) (Prospec-Tany Technogene Ltd., (Israel), lot # 105BIV01) +/- aptâmero. O anticoagulante bivalirudina, um inibidor direto de trombina, foi usado em vez de heparina que interfere com a ativação de complemento.
[00291] O modelo de alça de tubo foi realizado essencialmente como descrito imediatamente acima. Seções de ~300 mm de tubo (diâmetro de 1/4”, volume ~9 mL) foram preenchidos com 5 mL de amostras de sangue/aptâmero/bivalirudina imediatamente após o sangue ter sido coletado do doador. Os tubos foram então firmemente fixados em alças com seções curtas (~ 50 mm) de tubo de ligação de silicone, produzindo um volume de gás de ~4 mL. As alças de tubo foram giradas verticalmente em 32 rpm durante a incubação a 37°C em um banho de água por 1 hora. Após incubação, todos os 5 mL de amostra foram transferidos a um tubo cônico de 15 mL (Corning, (Corning, NY), cat. # 430766) contendo 100 μL de 0,5 M EDTA, proporcionando uma concentração final de EDTA de 10 mM. 1 mL de sobrenadante plasmático foi coletado a partir de cada uma das amostras resfriadas em seguida da centrifugação (Eppendorf Centrifuge 5804) a 4°C (3,300 rpm, 20 minutos). Os sobrenadantes foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e armazenados a -20°C. para o controle da ativação de fundo, uma amostra pré- CPB foi preparada ao se adicionar 5 mL de sangue fresco diretamente ao tubo cônico de 15 mL em gelo contendo 100 μL de 0,5 M de EDTA. A referida amostra foi processada para plasma e armazenada como acima descrito.
[00292] A extensão de ativação de C5 foi determinada a partir dos níveis relativos de C5a gerados em cada amostra ativada, como medido pelo ELISA C5a como descrito imediatamente acima. O ELISA C5a foi realizado em amostras de plasma não diluídas de acordo com o protocolo do kit ELISA e os níveis de amostra de C5a foram quantificados por comparação com os padrões de C5a proporcionados pelo fabricante. O percentual de inibição da geração de C5a em cada concentração de aptâmero foi calculado usando a equação: %inh. = 100-100 x (C5aamostra - C5apre CPB) / (C5aapenas salina - C5apre CPB). Os valores de IC50 foram determinados a partir de um gráfico de % de inibição com relação a [ARC 1905] usando a equação %inh. = (% inh.)máximo X [ARC 1905]” / (IC50” + [ARC 1905]”) + fundo. Os valores de IC90 e IC99 foram calculados a partir dos valores de IC50 usando as equações IC90 = IC5O x [90/(100-90]t/n e IC99 = IC50 x [99/(100-99] t/n.
[00293] A extensão de ativação de C# foi determinada a partir dos níveis relativos de C3a gerado em cada amostra ativada, como medido por ELISA C3a imediatamente descrito acima. Logo antes da análise de C3a, amostras (incluindo os controles de apenas salina e pré-CPB) foram diluídas em série em 0,9% de salina. O ELISA C3a é mais sensível do que para C5a; portanto, uma diluição de 1/5000 foi necessária para acomodar a faixa de concentrações de C3a. Os níveis de amostra de C3a foram quantificados em comparação aos kits padrões, e o % de inibição foi calculado como descrito para C5a. Os dados foram analisados usando Microsoft Excel, e valores médios de percentual de inibição foram traçados usando Kaleidagraph (v. 3.51, Synergy Software). Os valores de IC50, IC90 e IC99 foram determinados usando o plug-in XLfit 4.1 para Excel.
[00294] Os efeitos médios de ARC 1905 e do aptâmero irrelevante, ARC 127, na ativação de complemento em cinco doadores são resumidos na Figura 66. Como mostrado na Figura 67 o bloqueio completo da ativação de C5, como refletido na geração de C5a, foi alcançado com < 500 nM de ARC 1905, embora o aptâmero relevante não tenha apresentado efeito inibitório em cerca de 1 μM. Os valores médios de IC50, IC90 e IC99 do sangue total médio foram de 119 ± 28.6 nM, 268 ± 39.2 nM e 694 ± 241 nM, respectivamente (Figura 66). Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, é razoável se assumir que ARC 1905 seja excluído do volume sanguíneo celular, que compreende aproximadamente 45% do total. Os valores de IC50, IC90 e IC99, ajustados para refletir a inibição de C5 no plasma, portanto, foram de 216 ± 52.0 nM, 487 ± 71 nM e 1261 ± 438 nM. Os referidos valores são consistentes com os parâmetros calculados para a inibição de ARC 1905 da ativação de complemento induzida a zimosan no soro sugerindo que os componentes do sangue celular não interferem de forma significativa com a atividade anti-C5 de ARC 1905. A geração de C3a não foi inibida por ARC 1905 ou pelo aptâmero irrelevante em até 1 μM. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, isto sugere que o ARC 1905 nem inibe a reação de convertase de C3, nem bloqueia outras etapas que contribuem para a ativação de cascata alternativa tal como o conjunto de deposição de C3 e convertase.
Exemplo 2 Seleções e Seqüências De Novo Seleção de C5 com grupo dRmY
[00295] Duas seleções foram realizadas para identificar os aptâmeros dRmY para proteína C5 de comprimento total humana. A proteína C5 (Quidel Corporation, San Diego, CA ou Advanced Research Technologies, San Diego, CA) foi usada na forma de comprimento total (“FL”) e na forma parcialmente tripsinizada (“TP”) e ambas as seleções foram seleções diretas contra os alvos de proteína que foram imobilizados em uma placa hidrófoba. Ambas as seleções produziram grupos significativamente enriquecidos para ligação de C5 de comprimento total com relação ao grupo não selecionado simples. Todas as seqüências mostradas no presente exemplo são mostradas de 5’ a 3’.
Preparação do grupo: um modelo de DNA com seqüência
[00296] TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN( 30)GGTCG ATCGATCGATCATCGATG (ARC 520; SEQ ID NO: 70) foi sintetizada usando um sintetizador de DNA ABI EXPEDITE™, e desprotegida por métodos padrão. Os modelos foram amplificados com primer 5’
[00297] TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 71) e primer 3’ CATCGATGATCGATCGATCGACC (SEQ ID NO: 72) e então usados como o modelo para a transcrição in vitro com polimerase de T7 RNA simples. As transcrições foram usadas usando 200 mM HEPES, 40 mM DTT, 2 mM espermidina, 0,01% Triton X-100, 10% PEG-8000, 9,5 mM MgCl2, 2,9 mM MnCl2, 2 mM NTPs, 2 mM GMP, 2 mM de espermina, 0,01 unidades μL de pirofosfatase inorgânica, e polimerase Y639F simples de mutante T7.
[00298] Seleção: na rodada 1, uma etapa de seleção positiva foi conduzida em colunas de ligação de filtro de nitrocelulose. Em suma, 1 x 1015 moléculas (0,5 nmoles) de RNA agrupado foram incubadas em 100 μL de tampão de ligação (IX DPBS) com 3 μM de C5 de comprimento total ou 2,6 μM de C5 parcialmente tripsinizada por 1 hora a temperatura ambiente. Complexos de RNA:proteína e moléculas de RNA livres foram separadas usando 0,45 μm de colunas de centrifugação de nitrocelulose oferecida pela Schleicher & Schuell (Keene, NH). As colunas foram pré-lavadas com 1 mL de IX DPBS, e então as soluções contendo RNA:proteína foram adicionadas às colunas e centrifugadas em uma centrifuga a 1500 g por 2 minutos. Três lavagens com 1 mL de tampão foram realizadas para remover ligações não específicas a partir dos filtros, então os complexos de RNA:proteína fixados aos filtros foram eluídos duas vezes com lavagens de 200 μL de tampão de elução (7 M de uréia, 100 mM de acetato de sódio, 3 mM de EDTA, pré-aquecido a 95°C). O RNA eluído foi transcrito em reverso com o sistema ThermoScript RT-PCR™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante, usando primer 3’ descrito acima SEQ ID NO: 72, seguido de amplificação de PCR (20 mM Tris pH 8,4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0,5 μM primers SEQ ID NO: 71 e SEQ ID NO: 72, 0,5 mM cada dNTP, 0,05 unidades/μL de Taq polimerase (New England Biolabs, Beverly, MA)). Os modelos PCR foram purificados usando colunas Centricep (Princeton Separations, Princeton, NJ) e usados para transcrever o próximo grupo de rodadas.
[00299] Em rodadas subseqüentes de seleção, a separação de RNA ligado e livre foi realizada em placas hidrófobas Nunc Maxisorp (Nunc, Rochester, NY). A rodada foi iniciada ao se imobilizar 20 pmoles tanto de C5 de comprimento total como C5 tripsinizada à superfície d aplaca por 1 hora a temperatura ambiente em 100 μL de 1X DPBS. O sobrenadante foi então removido e as cavidades foram lavadas 4 vezes cm 120 μL de tampão de lavagem (IX DPBS). As cavidades de proteína foram então bloqueadas com um tampão IX DPBS contendo 0,1 mg/mL de RNAt de levedura e 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão como competidores. A concentração do grupo usada foi sempre pelo menos um excesso de cinco vezes a da concentração de proteína. O grupo de RNA foi também incubado por 1 hora a temperatura ambiente em cavidades vazias para remover quaisquer seqüências de ligação plásticas, e então incubadas em uma cavidade bloqueada sem proteína para remover do grupo quaisquer seqüências de ligação do competidor antes da etapa de seleção positiva. O RNA do grupo foi então incubado por 1 hora a temperatura ambiente e o RNA ligado ao C5 imobilizado foi reverso transcrito diretamente na placa de seleção pela adição de RT mix (primer 3’, SEQ ID NO: 72 e Thermoscript RT, Invitrogen) seguido de incubação a 65°C por 1 hora. O DNAc resultante foi usado como o modelo para PCR PCR (Taq polymerase, New England Biolabs). O DNA modelo de grupo amplificado foi dessalinizado com coluna Centrisep (Princeton Separations) de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante e usado para programar a transcrição do RNA de grupo para a próxima rodada de seleção. O grupo transcrito foi purificado por gel em gel de poliacrilamida a 10% a cada rodada.
[00300] O progresso da seleção foi monitorado usando um teste de ligação de filtro sanduíche (dot blot). O grupo RNA 5’-32P-marcado (concentração de traço) foi incubado com C5, IX DPBS plus 0,1 mg/mL RNAt e 0,1 mg/mL de DNA de esperma de salmão, por 30 minutos a temperatura ambiente, e então aplicado a um sanduíche de filtro de nitrocelulose e náilon em um aparelho dot blot (Schleicher e Schuell). O percentual de RNA em grupo ligado à nitrocelulose foi calculado e monitorado aproximadamente a cada 3 rodadas com uma tela de ponto único (+/- 300 nM C5). As medições do grupo Kd foram realizadas usando uma titulação de proteína e de um aparelho de dot blot como acima descrito.
[00301] Dados de Seleção: ambas as seleções foram enriquecidas após 10 rodadas sobre o grupo simples. Ver Figura 18. Na rodada 10, o grupo Kd foi de aproximadamente 115 nM para o comprimento total e de 150 nM para a seleção tripsinizada, mas a extensão da ligação foi de apenas cerca de 10% no platô em ambos. Os grupos R10 foram clonados usando o kit de clonado TOPOTA (Invitrogen) e seqüenciados.
[00302] Informação de Seqüência: 45 clones a partir de cada grupo foram seqüenciados. O grupo de R10 de comprimento total foi dominado por um único clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) que constitui 24% do grupo, 2 conjuntos de duplicatas e seqüências simples constituíram o restante. O grupo R10 tripsinizado conteve 8 copias da mesma seqüência ARC 913 (SEQ ID NO: 75), mas o grupo foi dominado por outra seqüência (AMX221.A7; 46%). O clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) era dotado de uma Kd de cerca de 140 nM e a extensão da ligação foi a 20%. Ver Figura 19.
[00303] A seqüência individual relacionada na tabela 5 é relacionada na direção de 5’ para 3’, e representa a seqüência de ribonucleotídeo do aptâmero que foi selecionado sob as condições proporcionadas de dRmY SELEX™. Nas modalidades da presente invenção derivadas a partir da referida seleção (e como refletida na listagem de seqüências) as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e C) são 2’-OMe. A seqüência relacionada na tabela 5 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3’- invertido). A seqüência única do aptâmero abaixo se inicia no nucleotídeo 23, imediatamente em seguida da seqüência fixa GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 73), e vai até que encontra a seqüência de ácido nucléico 3’ fixa GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG (SEQ ID NO: 74). Tabela 5: Seqüência de nucleotídeo do aptâmero C5 dRmY ARC 913 (SEQ ID NO: 75) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUA CGCAGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
[00304] Teste de hemólise: o efeito de ARC 913 (SEQ ID NO: 75) no trajeto clássico do sistema complemento foi analisado usando o teste de hemólise anteriormente descrito, comparado tanto ao ARC 186 (SEQ ID NO: 4) (aptâmero anti- C5, controle positivo) e o grupo dRmY não selecionado (controle negativo). No teste de inibição hemolítica, uma solução de 0,2% de soro humano total foi misturado com eritrócitos de ovelha revestidos de anticorpo (Diamedix EZ Complement CH50 Test, Diamedix Corporation, Miami, FL) na presença de ARC 913 (SEQ ID NO: 75) titulado. O teste foi realizado em salina tamponada a veronal contendo cálcio, magnésio e gelatina a 1% (GVB++ de tampão complemento) e incubado por 1 hora a 25°C. Após a incubação as amostras foram centrifugadas. A densidade ótica a 415 nm (DO 415) do sobrenadante foi lida. A inibição da atividade de hemólise é expressa como o % de atividade de hemólise em comparação ao controle. Ver Figura 20. A IC50 do aptâmero foi calculada ser cerca de 30 nM.
Exemplo 3 Composição e otimização de seqüência Exemplo 3A: Minimização de ARC 913:
[00305] Seis construtores com base em ARC 913 (SEQ ID NO: 75) foram transcritos, purificados a gel, e testados em dot blots para a ligação a C5. a ARC 954 foi similar ao clone parente com uma Kd de 130 nM e extensão de ligação a 20%, enquanto ARC 874 (SEQ ID NO: 76) foi o único outro clone que se ligou a C5 com a Kd de 1 mi-M.
[00306] As seqüências individuais relacionadas na tabela 6 são relacionadas na direção de 5’ a 3’ e foram derivadas a partir dos aptâmeros que foram selecionadas sob as condições proporcionadas de dRmY SELEX. Nas modalidades da invenção derivadas a partir da presente seleção (e como refletido na listagem de seqüência) as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e G) são 2’-OMe. Cada uma das seqüências relacionadas na tabela 6 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3’-invertido). Tabela 6. Seqüências de nucleotídeos de clones de ARC 913 minimizados. ARC 874 (SEQ ID NO: 76) CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG ARC 875 (SEQ ID NO: 77) CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG ARC 876 (SEQ ID NO: 78) GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC ARC 877 (SEQ ID NO: 79) GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC ARC 878 (SEQ ID NO: 80) GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC ARC 954 (SEQ ID NO: 81) CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAU CG
Exemplo 3B: Otimização de ARC 913: Re-seleção aditivada
[00307] De modo a tanto otimizar o clone ARC 913 (SEQ ID NO: 75) para a afinidade de ligação a C5 como para determinar os elementos chave, uma re-seleção aditivada foi conduzida. As re-seleções aditivadas são usadas para explorar as necessidades de seqüência dentro de um clone ativo ou “minimer”. As seleções são realizadas com um grupo sintético degenerado que foi projetado com base em uma seqüência única. O nível de degeneração em geral varia de 70% a 85% de nucleotídeo do tipo selvagem. Em geral, as mutações neutras são observadas mas em alguns casos de mudanças de seqüência pode resultar em aprimoramentos com relação a afinidade. A informação de seqüência compósita pode então ser usada para identificar o motivo de ligação mínimo e ajudar nos esforços de otimização.
Preparação do grupo: Seqüência do modelo
[00308] taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTA CGA CTAGCATCGATG (SEQ ID NO: 82) se baseou em ARC 913 (SEQ ID NO: 75) e foi sintetizada com cada resíduo originando a partir da região aleatória aditivada a um nível de 15%, isto é, em cada posição )”N”), o resíduo apresenta uma chance de 85% de ser o nucleotídeo encontrado na seqüência de tipo selvagem CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG (SEQ ID NO: 83) e 15% de chance de ser um dos outros três nucleotídeos.
[00309] O modelo e o grupo de RNA para a re-seleção aditivada foram preparados essencialmente como acima descrito. Os modelos foram aplificados com os primers taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC (SEQ ID NO: 84) e CATCGATGCTAGTCGTAAC (SEQ ID NO: 85). As duas seleções foram realizadas com C5 de comprimento total, uma seleção usando uma concentração mais elevada de sal na etapa de lavagem. O protocolo de seleção foi realizado como acima descrito, com duas exceções: 1) rodada 1 foi realizada em placas hidrófobas (assim como todas as etapas subseqüentes) com apenas uma etapa positiva; e 2) não foi usado nenhum competidor durante a seleção. A concentração de C5 e a concentração do grupo de RNA foi mantida constante a 200 nM e 1 μM, respectivamente.
Dados de re-seleção aditivada
[00310] Tanto a seleção normal como a com alto teor de sal foram enriquecidas após 5 rodadas sobre o grupo simples. Na rodada 5 o grupo Kd foi de aproximadamente 165 nM para a seleção de alto teor de sal e de 175 nM para a seleção normal de sal. A extensão de ligação foi de cerca de 20% no platô em ambas. Os grupos R4 foram clonados usando o kit de clonagem TOPO TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), e 48 clones de cada grupo foram seqüenciados. 12 clones de cada grupo foram transcritos e testados em um teste de dot blot de ponto único a 500 nM de C5. As constantes de dissociação (KdS) foram mais uma vez medidas usando o teste de dot blot anteriormente descrito. KdS foi estimado para os 11 melhores clones identificados na tela de ponto único, ao se adaptar os dados da equação: fração de RNA ligado = amplitude*Kd/(Kd + [C5]). Os clones com os três melhores IQs foram SEQ ID NO: 91 (73 nM), SEQ ID NO: 96 (84 nM) e SEQ ID NO: 95 (92 nM). As seqüências para os referidos 11 clones estão relacionadas abaixo na tabela 7.
[00311] As seqüências relacionadas na tabela 7 são relacionadas na direção de 5’ para 3’ e representam as seqüências de nucleotídeos do aptâmero que foram selecionadas sob as condições proporcionadas por dRmY SELEX™. Nas modalidades da invenção derivadas a partir da presente seleção (e como refletido na listagem de seqüências), as seqüências correspondentes compreendendo as combinações dRmY dos resíduos, como indicado no texto, onde as purinas (A e G) são deóxi e as pirimidinas (U e C) são 2’-OMe. Cada uma das seqüências listadas na tabela 7 pode ou não conter cobertura (por exemplo, um dT 3’-invertido). As seqüências únicas de cada aptâmero abaixo se iniciam no nucleotídeo 23, imediatamente em seguida da seqüência 5’ fixa GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC (SEQ ID NO: 86), e vai até encontrar a seqüência de ácido nucléico 3’ fixa GUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 87). Tabela 7. Seqüências de Nucleotídeos de Clones a partir de Re-seleção Aditivada (SEQ ID NO: 88) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACG CAGGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 89) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACG CAGGUGUCGAUCUGUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 90) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAAAUACG CAGGGCUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGA UG (SEQ ID NO: 91) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCCCAGGCAUAUAUACG CAGGGAUUGAUCCGUUACGACUAGCAUCGA UG (SEQ ID NO: 92) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCGCAGGCAUACAUACG CAGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 93) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGUUGUGGCACAGCCAACCCUACG CACGGAUCGCCCGGUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 94) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACG CAGGUCGAUCGGUUACGACUA (SEQ ID NO: 95) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUAGGUUCGCACUGUCAUACAUACAC ACGGGCAAUCGGUUACGACUAGCAUCGAU G (SEQ ID NO: 96) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCNCAGGCAUANAUACG CACGGGUCGAUCGGUUACGACUAGCAU (SEQ ID NO: 97) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUUCUCUGCCACAAGCAUACCUUCGC GGGGUUCUAUUGGUUACGACUAGCAUCGAUG (SEQ ID NO: 98) GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUAUAUACG CAGGGUCGAUCCGUUACGACUAGCAUCGAUG
Exemplo 3C: Modificação PEG ramificado de 40 kDa do ARC 186
[00312] O oligonucleotídeo 5’NH2- FCmGfCfCGfCmGmGmfUfCfUfCmAmGmGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfU fUAfCfCfUmGfCmG-3T-3’ (ARC 672, SEQ ID NO: 63) foi sintetizado em um sintetizador de DNA Expedite (ABI, Foster City, CA), de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante usando o padrão comercialmente oferecido RNA 2’-OMe e RNA 2’-F e fosforoamiditas de RNA protegidos por TBDMS (Glen Research, Sterling, VA) e um suporte CPG de deóxitimidina invertida. A função amina terminal foi fixada com o modificador 5’-amino, 6- (Trifluoroacetilamino) hexil-(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)-fosforamidita,C6-TFA (Glen Research, Sterling, VA). Após a desproteção, os oligonucleotídeos foram purificados por cromatografia de troca de íon em Super Q 5PW (30) resina (Tosoh Biosciences) e precipitados com etanol.
[00313] O aptâmero modificado a amina foi conjugado em diferentes frações PEG pós-sinteticamente. O aptâmero foi dissolvido em uma solução de água/DMSO (1:1) a uma concentração entre 1,5 mM e 3 mM. Tampão carbonato de sódio, pH 8,5 foi adicionado a uma concentração final de 100 mM, e o oligo foi reagido durante a noite com um excesso molar de 1,7 do reagente PEG desejado (por exemplo, éster carbonato de p-nitrofenila ARC 1905 40 kDa Sunbright GL2- 400NP [NOF Corp, Japan], ou éster mPEG2-NHS ARC 187 de 40 kDa [Nektar, Huntsville AL]) dissolvido em um volume igual de acetonitrila. Os produtos resultantes foram purificados por cromatografia de troca de íon em Super Q 5PW (30) resin (Tosoh Biosciences), e dessalinizados usando cromatografia de fase reversa realizada em resina Amberchrom CG300-S (Rohm and Haas), e liofilizados. A estrutura de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) é mostrada na Figura 21 enquanto a estrutura de ARC 1905 (SEQ ID NO: 67) é mostrada na Figura 22.
Exemplo 4 Modelo de Coração Isolado com Perfusão Exemplo 4A: Prova de Princípio com ARC 186
[00314] A concentração média do componente complemento C5 no plasma humano é de aproximadamente 500 nM. Com a exposição de corações de ratos isolados a perfusão com tampão Krebs Heinseleit a 6% de plasma humano, a cascata de complemento humana é ativada, levando à clivagem de C5 em C5a e C5b. O componente C5b subsequentemente forma um complexo com os componentes complemento C6, C7, C8 e C9 também conhecidos como o “complexo de ataque à membrana” (“MAC” ou C5b-9) que danifica os vasos sanguíneos cardíacos e os miócitos cardíacos, levando assim à disfunção miocárdica (pressão diastólica final aumentada, arritmias) e assistolia (Evans et. al., Molecular Immunology, 32, 1183 - 1195 (1995)). Antes, os anticorpos de cadeia monoclonal e simples que bloqueiam a clivagem de C5 humana (Pexelizumab ou uma versão de cadeia simples de Pexelizumab scFv) foram testados no presente modelo e mostraram exibir danos e disfunção miocárdicos (Evans et al., 1995).
[00315] O referido modelo foi usado para estabelecer o aptâmero de bloqueio de C5 ARC 186 (SEQ ID NO: 4), como o Pexeluzimab, inibiu o dano de complemento mediado a C5 humano nos corações isolados de ratos com perfusão. Camundongos C57 Bl/6 foram adquiridos da Charles River Laboratories, (Wilmington, MA). Em suma. Em seguida da indução de anestesia profunda, cada coração de camundongo foi removido e montado em uma agulha cega inserido na aorta, através da qual o coração foi continuamente infundido com tampão Krebs Heinseleit. O transdutor de pressão (Mouse Specifics, Boston, MA) foi inserido no ventrículo esquerdo permitindo o movimento contínuo dos batimentos cardíacos e a pressão intraventricular. Após um período de 15 minutos de equilíbrio durante o qual as medições de linha basal foram obtidas, os corações foram subsequentemente infundidos com tampão e 6% de plasma humano ± aptâmero em diversas concentrações (ver Figura 23). Durante os referidos estudos e como descrito em Evans et al., foi demonstrado que os corações que foram infundidos com tampão Krebs Heinseleit + 6% de plasma humano, experimentaram falha dentro de 5 minutos de adição de plasma ao infusado, enquanto que os corações que foram continuamente infundidos só com tampão continuaram a bater por mais duas horas. Consequentemente, a duração de cada experiência foi arbitrariamente definida como 15 minutos. O delineamento do presente estudo com ARC 186 é apresentado na Figura 23.
[00316] A pressão intraventricular foi monitorada e registrada continuamente resultando em um traçado de onda de pressão (Figuras 24 e 25). O ponto de desvio mais baixo representa o final da pressão diastólica (“EPD”) e o ponto de desvio mais elevado representa a pressão sistólica (“SP”). As ondas de pressão basal aparecem à esquerda da linha preta vertical marcada “0” mostrada em cada traçado. Como anteriormente publicado (Evans et al., 1995), os corações infundidos com 6% de plasma humano experimentaram um rápido aumento na pressão diastólica final ventricular esquerda, por ultimo, culminando em assistolia (parada cardíaca) dentro de 5 minutos (Figura 24). Quando o aptâmero irrelevante foi adicionado ao plasma humano em um excesso molar de 50 vezes, EDP aumentada e a assistolia foram também observados (Figura 24).
[00317] Quando ARC 186 foi adicionado ao sistema em equivalente molar, houve também um aumento precipitado na EDP, culminando e assistolia (Figura 25). Em todos os três grupos de corações que experimentaram danos mediados a complemento, maior EDP e assistolia, o coração ficou visivelmente edemaciado e túrgido no final da experiência. Quando ARC 186 foi adicionado ao plasma em um excesso molar de 10 vezes a 50 vezes (Figura 25), as ondas de pressão ventricular permaneceram normais e não foi observado assistolia. Ademais, o edema e turgidez anteriormente descritos não foram aparentes nos referidos grupos.
[00318] Durante cada experimento, a freqüência cardíaca para o grupo durante cada intervalo foi traçada em gráficos. Como mostrado na Figura 26, os corações infundidos sem aptâmero ou com aptâmeros irrelevantes desenvolveram assistolia rapidamente, em geral dentro de 5 minutos. ARC 186 adicionado ao sistema em equivalência molar retardou relativamente a instalação da assistolia. Os corações neste grupo acabaram, entretanto por falhar. ARC 186 adicionado ao plasma em um excesso molar de 10 vezes ou de 50 vezes preservou a freqüência cardíaca pela duração de cada experimento.
[00319] O aumento percentual no peso do coração sobre a linha basal foi calculado para uma amostra representativa de falhas cardíacas (no aptâmero ou um excesso molar de 50 vezes do aptâmero irrelevante) e comparado aos corações protegidos com ARC 186 (excesso molar de 10 vezes e de 50 vezes de ARC 186). Como mostrado na Figura 27, os corações protegidos com ARC 186 ganharam significativamente menos peso do que os corações que falharam nos grupos de controle.
[00320] Em virtude do ARC 186 inibir a C5 mas não a clivagem de C3, os produtos de clivagem de C3 (C3a) nas não os produtos de clivagem de C5 (C5a ou C5b) devem ser encontrados no efluente que flui a partir dos corações isolados protegidos por ARC 186. Para se mostrar diretamente que ARC 186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano, níveis relativos de proteínas complemento C5a e C5b (produtos de clivagem de C5) e C3a (um produto de clivagem de C3) foram medidos em um efluente de tampão a partir de diversos grupos dos kits ELISA comercialmente oferecidos (kit ELISA C5b-9, Quidel, San Diego, CA; kit ELISA C5a e C3a, BD Biosciences, San Diego, CA). O ARC 186 inibiu a clivagem de C5 de plasma humano e a produção de C5a (Figura 28) e C5b-9 (Figura 29) em uma maneira dependente de dose. De forma diferente, o ARC 186 não apresentou efeito na clivagem de C3 humano em C3a e C3b (Figura 30) adicionalmente demonstrando que a especificidade para C5 da molécula.
[00321] Uma vez gerados, os fragmentos C3b e C5b de complemento são depositados localmente em tecidos nas vizinhanças do campo de ativação de complemento. Em seguida da conclusão das experiências, os corações de camundongos foram congelados em meio OCT (Sakura Finetelc, Torrance, CA), seccionados e então corados usando imunohistoquímica padrão para a presença de C3b humano (clone H11, Chemicon, Temecula, CA), C5b-9 humano (clone aE11, DAKO, Carpinteria, CA). Ou o controle IgG de camundongo (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Os resultados do estudo são apresentados na Figura 31.
[00322] Como descrito no presente estudo, o aptâmero de bloqueio de C5 ARC 186 foi testado em um modelo in vivo de danos a tecidos mediados a complemento de componente C5 que usa corações isolados de ratos infundidos com tampão Krebs Heinseleit e 6% de plasma humano heparinizado, com base no modelo descrito em um estudo anteriormente publicado que testou os efeitos do anticorpo anti-C5, Pexeluzimab no sistema complemento (Evans, Molecular Immunol 32:1183, (1995). Usando este modelo, foi demonstrado que o aptâmero de bloqueio de C5 (a) inibiu a clivagem de C5 de plasma humano (mas não de C3), (b) inibiu a deposição de C5b humano (mas não de C3b) em tecido cardíaco de rato e (c) inibiu a disfunção miocárdica mediada a C5b-9 humano em concentrações clinicamente relevantes (5 μM, um excesso molar de 10 vezes do aptâmero vs. C5). Os referidos dados mostram que quando a cascata de complemento humana é ativada de modo fisiologicamente relevante, os aptâmeros de bloqueio de C5 são capazes de inibir a clivagem de C5 plasmático e evitar os danos e a disfunção miocárdica.
Exemplo 4B: Eficácia do Aptâmero Peguilado
[00323] Os materiais e métodos usados no presente estudo foram exatamente os mesmos descritos no Exemplo 4B acima. O desenho experimental e os resultados são apresentados na Figura 32. A primeira metade do experimento usou plasma humano heparinizado (Center for Blood Research, Harvard Medical School, Boston, MA) como a fonte de complemento e a segunda metade usou plasma de macaco cinomolgus heparinizado (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) como a fonte de complemento. Um aptâmero peguilado (ARC 658; SEQ ID NO:62) foi adicionado ao sistema em proporções molares crescentes. Embora todos os traçados de pressão ventricular relevante tenham sido coletados, a tabela relaciona a presença ou a ausência de um aumento na pressão diastólica final (EDP), se ou não ocorreu assistolia e o tempo até que o coração falhou (definido como a presença de um EDP elevada e assistolia).
[00324] Durante os experimentos com plasma humano, a dose ideal de ARC 658 (SEQ ID NO: 62) foi determinada ser a equivalência molar (500 nM) enquanto que durante os experimentos com plasma de primata não humano, um excesso molar de 50 vezes (25 μM) foi necessário para proteger o coração de danos mediados a C5b (ver Figura 32).
[00325] Os referidos dados são consistentes com a diferença de afinidade do aptâmero anti-C5 para o C5 de humano com relação ao de primata não humano indicada pelos dados in vitro. Embora não se pretenda estar ligado a uma teoria, durante nosso estudo subseqüente com PK/PD de macaco cinomolgus descrito no exemplo 5, adicionalmente foi demonstrado que um excesso molar de 30 vezes do aptâmero foi necessário para inibir a clivagem de C5 plasmático mediada a zimozan, adicionalmente suportando a noção de que o aptâmero se liga ao C5 de primata com menor afinidade do que ao C5 humano.
[00326] Coletivamente, os referidos estudos indicam que ambos os aptâmeros ARC 186 (SEQ ID NO: 4) e em maior extensão ARC 658 (SEQ ID NO: 62) são eficazes no modelo de coração de rato isolado infundido. O referido modelo demonstra também que significativamente mais ARC 658 (SEQ ID NO: 62) teve que ser usado para inibir o dano cardíaco mediado a C5 em plasma de macaco cinomolgus (excesso molar de 30+), em comparação com o dano cardíaco mediado a C5 humano (equivalente molar), adicionalmente suportando os dados in vitro que indicaram que o aptâmero apresentava afinidade mais baixa para o C5 de primata. Finalmente, os referidos dados indicaram que os macacos cinomolgus precisam ser dosados além de um excesso molar de 30 vezes de modo a demonstrar in vivo o bloqueio de C5 durante os estudos de PK/PD.
Exemplo 5 Metabolismo de Droga & Farmacocinética de Aptâmeros anti-C5 em Animais
[00327] Nos Exemplos 5A - 5G, todo dado de concentração baseado em massa se refere apenas ao peso molecular da porção de oligonucleotídeo do aptâmero, não é relativo à massa conferida pela conjugação PEG.
Exemplo 5A: Estabilidade metabólica do Inibidor de C5 ARC 186 em plasma de primatas e de ratos
[00328] O oligonucleotídeo não-peguilado precursor dos aptâmeros (isto é, ARC 186; SEQ. ID. NO: 4) foi testado em plasma de rato e de macaco cinomolgus (Charles River Labs, Wilmington, MA) de modo a avaliar sua estabilidade, padrão cinético, e trajetos de degradação. O teste foi realizado usando a extremidade 5’ radiomarcada (32P) do aptâmero incubado a 37°C em 95% plasma misto (citratado) no decorrer de 50 h. A certos intervalos selecionados, frações de plasma contendo aptâmero foram retiradas, imediatamente rapidamente congeladas em nitrogênio líquido, e armazenadas a - 80°C. A detecção e a análise do aptâmero e seus metabólitos em plasma foram obtidos usando extração de líquido-líquido (fenol-clorofórmio) seguida por eletroforese de gel (em um gel de poliacrilamida desnaturante a 10%) e auto- radiografia de alta resolução.
[00329] A Figura 33 mostra um gráfico log-linear do percentual restante do comprimento total do aptâmero como uma função do tempo de incubação tanto em plasma de rato como de macaco cinomolgus. O perfil de degradação em ambas as espécies parece ser essencialmente monofásico, com uma proporção constante de k ~ 0,002 hr-1.
Exemplo 5B: Farmacocinética de ARC 657, ARC 658 e ARC 187 na subseqüente administração intravenosa em ratos.
[00330] Para avaliar o perfil farmacocinético de ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61), ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5), e para estimar a dosagem e a sua freqüência necessária a primatas e humanos, o estudo da farmacocinética foi conduzido em ratos Sprague-Dawley cateterizados (Charles River Labs, Wilmington, MA). Aptâmeros foram formulados para injeção a 10 mg/mL (peso oligo) em solução salina padrão filtrada e esterilizada (0,2 μm) em um frasco de dosagem pré-esterilizado em condições assépticas. A via de administração usada para o estudo em ratos foi a de bolus intravenoso pela via de veia da cauda em uma dose de 10 mg/kg. Os grupos de estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram retiradas várias amostras de sangue pré-dosagem a intervalos selecionados no decorrer de 48 horas. O projeto do estudo está esboçado na Figura 34. Amostras de sangue foram obtidas através de implante cirúrgico de cateter na veia jugular, transferidas diretamente para tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão, e colocadas em gelo até o processamento para obtenção de plasma.
[00331] O plasma foi colhido por centrifugação dos tubos sangue-EDTA a 5000 rpm por 5 minutos e o plasma sobrenadante foi transferido para um novo tubo pré- rotulado. As amostras de plasma foram estocadas a -80°C até o momento da análise. A análise das amostras de plasma para ARC 187 foi obtida através do uso de material de análise homogêneo utilizando a adição direta de frações de plasma ao material de análise contendo o reagente fluorescente detector de ácido nucléico comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR). Depois de um breve período de incubação (5 min) à temperatura ambiente, protegido da luz, as lâminas do material de análise foram lidas por um leitor de lâmina fluorescente (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O sinal fluorescente de cada fonte era proporcional à concentração do aptâmero na fonte, e amostras das concentrações foram calculadas pela interpolação dos valores de fluorescência a partir de uma curva padrão de concentração de fluorescência (valores médios de curvas duplicadas ou triplicadas). As médias das concentrações de plasma foram obtidas a cada momento dos três animais em cada grupo. A concentração de plasma versus dados de tempo foi submetida à análise não-compartimentada (NCA) usando o software de modelagem industrial padrão de farmacocinética WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Estimativas foram obtidas para os seguintes parâmetros primários de farmacocinética: concentração máxima de plasma, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; meia-vida terminal, t1/2 ; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estável, Vss.
[00332] As médias da concentração de plasma versus dados de tempo são mostradas na Figura 35 e are assinalado na Figura 36. A concentração versus dados de tempo foi submetida a análise não-compartimentada (NCA) usando WinNonLin™ v.4.0. A referida análise forneceu os valores apresentados na Figura 37.
[00333] Como antecipado, o aptâmero 40 kDa ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) apresentou a meia-vida mais longa e o aptâmero 20 kDa, ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61), a mais curta. O Vss observado relativo ao volume de plasma conhecido (-40 mL/kg) sugeriu um grau moderado de ligação/sequestração do ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) para proteínas e/ou matriz de tecido no espaço extra vascular. Assumindo a necessidade de manter um excesso molar de 5 vezes do aptâmero, os resultados desse estudo sugerem que ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) fornece uma vantagem significativa em termos da freqüência de dosagem e da quantidade total de aptâmero necessário para manter os níveis de plasma desejados.
[00334] Estudos prévios (dados não mostrados) em roedores e primatas com aptâmeros de composição similar têm mostrado uma proporcionalidade/linearidade das doses que estão acima de 30 mg/kg, então não está previsto que este nível de dosagem irá resultar em um comportamento farmacocinético não-linear.
Exemplo 5C: Farmacocinética de ARC 187 e ARC 1905 e camundongos após administração intravenosa
[00335] Para avaliar o perfil farmacocinético do oligonucleotídeo da medula óssea ARC 186 (SEQ. ID. NO: 4) conjugado com um PEG de 40 kDa ramificado diferente daquele do ARC 187 (SEQ. ID. NO:5), o estudo farmacocinético foi conduzido em fêmeas de camundongos CD-I (obtidos de Charles River Labs, Wilmington, MA). Aptâmeros foram formulados para injeção a 2,5 mg/mL (peso oligo) em solução salina padrão filtrada e esterilizada (0,2 μm) em um frasco de dosagem pré-esterilizado em condições assépticas. A via de administração usada para o estudo em ratos foi a de bolus intravenoso pela via de veia da cauda em uma dose de 10 mg/kg. Os grupos de estudo consistiram em 3 animais por grupo, dos quais foram retiradas várias amostras de sangue pré-dosagem (isto é, o grupo de controle não medicado) a intervalos selecionados no decorrer de 72 horas. O projeto do estudo está esboçado na Figura 38A.
[00336] Amostras de sangue foram obtidas por punção cardíaca, transferidas diretamente para tubos revestidos com EDTA, misturadas por inversão, e colocadas em gelo até o processamento para obtenção de plasma. O plasma foi colhido por centrifugação dos tubos sangue-EDTA a 5000 rpm por 5 minutos e o plasma sobrenadante foi transferido para um novo tubo pré-rotulado. As amostras de plasma foram estocadas a -80°C até o momento da análise. A análise das amostras de plasma para ARC 187 foi obtida através do uso de material de análise homogêneo utilizando a adição direta de frações de plasma ao material de análise contendo o reagente fluorescente detector de ácido nucléico comercialmente disponível Oligreen™ (Molecular Probes, Eugene, OR). Depois de um breve período de incubação (5 min) à temperatura ambiente, protegido da luz, as lâminas do material de análise foram lidas por um leitor de lâmina fluorescente (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O sinal fluorescente de cada fonte era proporcional à concentração do aptâmero na fonte, e amostras das concentrações foram calculadas pela interpolação dos valores de fluorescência a partir de uma curva padrão de concentração de fluorescência (valores médios de curvas duplicadas ou triplicadas). As médias das concentrações de plasma foram obtidas a cada momento dos três animais em cada grupo. A concentração de plasma versus dados de tempo foi submetida a análise não-compartimentada (NCA) usando o software de modelagem industrial padrão de farmacocinética WinNonLin ™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA). Estimativas foram obtidas para os seguintes parâmetros primários de farmacocinética: concentração máxima de plasma, Cmax; área sob a curva de concentração-tempo, AUC; meia-vida terminal, t1/2; depuração terminal, Cl; e volume de distribuição em estado estável, Vss. A concentração de plasma média versus aos dados de tempo são desenhados em um gráfico na Figura 38B.
[00337] A concentração versus dados de tempo foi submetida à análise não- compartimentada (NCA) usando WinNonLin™ v.4.0. A referida análise revelou os valores apresentados na Figura 38C. Como antecipado, os PEGs de 40 kDa de ambos os fornecedores apresentaram farmacocinética equivalente em camundongos.
[00338] As mesmas amostras de plasma para ARC 187 e 1905 usadas para a análise oligreen, descrita logo acima, foram analisadas usando uma validação com líquido de cromatografia de alta performance (HPLC) e material de análise com detecção UV.
[00339] A média dos valores da concentração de plasma para ARC 187 e ARC 1905 foi calculada usando Microsoft Excel 2003. Quando os valores da concentração de plasma estavam abaixo do limite mínimo de detecção do material de análise bioanalítico na pré-dosagem (tempo 0), o valor zero foi determinado. Os valores abaixo do limite mínimo de detecção obtidos a partir de amostras colhidas no período pós-dosagem foram omitidos da média de cálculo da concentração de plasma. Os dados da média da concentração de plasma foram usados em um modelo independente de análise FK usando WinNonlin, versão 5.1 (Pharsight Corporation, Mountainview, CA). A área sob a curva de concentração de plasma- tempo (AUCo-last) foi estimada usando a regra trapezoidal. Para efeito de cálculo, qualquer valor que estivesse abaixo do limite mínimo de detecção no material analisado, com exceção das amostras de pré-dosagem, foi excluído dos cálculos para estimativas de parâmetros FK. A aparente meia-vida terminal foi calculada usando a fórmula ti/2, = 0,693/Àz onde Àz constante proporcional de eliminação estimada a partir da regressão da inclinação final da curva de concentração versus tempo. Pelo menos três valores de concentração de plasma depois do pico da concentração na fase terminal foram usados para determinar Àz e o coeficiente de determinação (r2) precisava ser > 0,85.
[00340] Em geral, a análise de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) confirma a análise oligreen descrita logo acima, mostrando que ARC 1905 e ARC 187 foi reconhecido como sendo bioeqüivalente baseado em comparações das estimativas das médias dos parâmetros Cmax, AUCo-iast e AUCo-~. Diferenças nos valores AUCo-iast e AUCo-~ para ARC 1905 relativas ao ARC 187 (como medidas por HPLC) estavam bem dentro dos valores aceitáveis do critério de bioequivalência de ± 2o%.
Exemplo 5D: Estudo de captação de tecidos sobre os Inibidores de C5s ARC 657, ARC 658 e ARC 187 em seguida da administração de bolus intravenoso em ratos
[oo341] As fêmeas CD-I de camundongos foram obtidas de Charles River Labs (Wilmington, MA). A formulação de ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61), ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) para injeção estava em solução salina a 5 mg/mL. As formulações das dosagens foram esterilizadas e filtradas (0,2 μm), postas em frascos esterilizados de dosagem sob condições assépticas e os animais receberam um bolus intravenoso por via da veia da cauda em uma dose de 25 mg/kg. O estudo consistiu em grupo de 3 animais para cada quatro instantes, t = pré-dosagem, 3, 6, 12 horas. Em seguida à exsangüinação, a vasculatura de cada animal foi irrigada extensivamente (V ~ 30 mL) com solução salina para remover quaisquer resquícios de sangue ainda na vasculatura. Os tecidos (coração, fígado, rim) foram colhidos, pesados, e depois homogeneizados a 50% p/v em solução salina padrão, e armazenada a -80°C até o momento da análise.
[00342] A análise de tecidos para ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61), ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62), e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) foi realizada usando o método do tipo ELISA baseado em hibridização. Neste estudo, uma sonda de captura biotinilada foi pré-imobilizada nas cavidades de microplacas de 96-cavidades em uma solução de ligação com concentração de 125 nM por 3 horas. As cavidades da placa foram lavadas 5 vezes com PBS 1x. As placas foram então bloqueadas com SuperBlock 1x em TBS na proporção de 150 μl/cavidade (Pierce Chemical, Rockford, IL). As placas foram lavadas novamente, cobertas, e armazenadas a 4°C até serem usadas. Em tubos separados, a(s) amostra(s) foi (foram) recozidas em um tampão contendo uma sonda de detecção marcada com FAM (5’- fluorescina) a 200 nM a 90°C por 10 minutos, depois resfriadas em gelo. Os modelos-padrão de concentração e amostras de controle de plasma/tecido também foram pré-cozidos com soluções de sonda de detecção e depois pipetados nas cavidades das placas de cultura contendo sonda de captura de biotina imobilizada, e recozidos a 45°C por 2,5 h. As placas foram então lavadas novamente, e preenchidas com 100 μL/cavidade de uma solução contendo PBS 1x com 1 μg/mL de anticorpo monoclonal anti-fluorescente conjugado com peroxidase de rábano silvestre (anti-FITC MAb-HRP, Molecular Probes, Eugene, OR) em PBS 1x, e incubadas por aproximadamente 1 hora. As placas foram lavadas novamente como descrito acima. As cavidades das placas de cultura foram então preenchidas com 100 μL de uma solução contendo um substrato fluorogênico HRP (QuantaBlu, Pierce Chemical, Rockford, IL), e incubados por 20 minutos- 30 minutos protegidos da luz. Depois de 45 minutos de incubação, foram adicionados 100 μL/cavidade de uma solução imobilizante para temperar a reação de precipitação fluorescente. As placas tiveram sua leitura imediatamente feita em fluorímetro de placa (SpectraMax Gemini XS, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) com excitação de 325 nm e emissão detectada a 420 nm. Cada cavidade teve sua leitura feita por 10 vezes. Todos os três aptâmeros eram detectáveis no tecido do coração nos três momentos selecionados (Figura 39).
Exemplo 5E: Estudo 1 de farmacocinética e farmacodinâmica dos Inibidores de C5 ARC 657 ARC 658 e ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa
[00343] A formulação de ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61), ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) para injeção foi feita em solução salina padrão a 10 mg/mL e as formulações de dosagem foram filtradas e esterilizadas (0,2 μm) em frascos de dosagem pré-esterilizados sob condições assépticas. A via de administração usada para o estudo com macacos foi a de bolus intravenoso via um cateter cirurgicamente implantado na veia femoral em uma dose de 30 mg/kg (aproximadamente 50 vezes o excesso molar). O projeto do estudo está esboçado na Figura 40. As amostras de sangue foram obtidas a partir dos cateteres das veias femorais, transferidas diretamente para tubos revestidos de citrato de sódio, misturadas por inversão, e colocadas no gelo até que fossem centrifugadas para separar o plasma (3000 rpm por 5 minutos). O plasma foi então dividido em frações de 250 μL que foram estocadas a -80°C e uma fração de cada amostra foi avaliada para medir a concentração de aptâmero usando o método Oligreen™ baseado fluorescência previamente descrito na seção sobre FK de ratos logo acima.
[00344] A concentração de plasma primária com relação aos dados de tempo está apresentada na forma de tabela na Figura 41. Como antecipado, aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) persistiram no plasma pelo período mais longo de tempo enquanto que os aptâmeros PEG de 20 kDa ARC 657 (SEQ. ID. NO: 61) persistiram pelo período de tempo mais curto. A inspeção dos dados mostrados na Figura 41 sugeriu que os dados seriam melhor adequados por modelos bi- compartimentados. Portanto, as estimativas de parâmetros farmacocinéticos relatados na Figura 42 são derivados de uma modelo bi-compartimentados o software de modelagem de farmacocinética padrão da indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).
[00345] Como mostrado na Figura 42, todos os aptâmeros são dotados de um valor Cmax similar, entre 23 μM e 30 μM, indicando que a dose de aptâmero (30 mg/kg) era suficiente para atingir a 50 vezes o excesso molar de aptâmero de plasma com relação a concentração de C5. Embora os referidos valores sejam diferentes por 10.000 no peso molecular, ARC 657 (PEG de 20 kDa) (SEQ. ID. NO: 61) e ARC 658 (PEG de 30 kDa), (SEQ. ID. NO: 62) é dotada de valores (AUC), t1/2(α) e t1/2 (β) de exposições similares. Em contrapartida, ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) teve uma exposição significativamente maior dos valores (AUC), uma t1/2 (α) prolongada e uma t1/2 (β) ligeiramente mais longa do que as outras moléculas.
[00346] As alíquotas adicionais das amostras de plasma coletadas durante os estudo de farmacocinética foram subsequentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 em primatas. O estudo de ativação por zimosan foi executado como descrito acima para determinar a quantidade se C5b-9 e C5a de primata gerados respectivamente. Os dados foram assinalados de várias formas diferentes incluindo a concentração de C5b-9 com relação a amostragem de tempo (Figura 43a), concentração C5b-9 com relação a concentração de aptâmero (Figura 43b), concentração de C5a com relação a amostragem de tempo (Figura 43c), e concentração de C5a com relação a concentração de aptâmero (Figura 43d).
[00347] O aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) inibiu a clivagem de C5 de primata (concentração de C5b-9 e de C5a) pelo período de tempo mais longo (Figuras 43 a e 43c). Quando os dados de C5b-9 e C5a foram assinalados com relação a concentração de aptâmero, isso indicou que o aptâmero bloqueador da concentração de C5 tinha que exceder 30 vezes o excesso molar, independente do tamanho das moléculas PEG, de modo que a clivagem de C5 seja completamente inibida (Figuras 43b e 43d).
[00348] Em resumo, os dados de PK/PD relativos ao estudo do macaco cinomolgus demonstraram que (a) como antecipado, pelo menos um 30 vezes o excesso molar do aptâmero (cerca de 15 μM de concentração de aptâmero no plasma) é necessário para inibir a clivagem de C5 in vivo nos macacos cinomolgus, independente do tamanho do grupo PEG, (b) os aptâmeros de bloqueio de C5 não causaram evidente toxidade nesta espécie, e (c) quando os animais receberam dosagens de níveis relativamente altos (50 vezes o excesso molar), os níveis de aptâmero no plasma estavam bem dentro do espectro apropriado para o estudo durante o período de amostragem para permitir o cálculo dos parâmetros de farmacocinética.
Exemplo 5F: Estudo 2 de farmacocinética e farmacodinâmica dos Inibidores de C5 ARC 658 e ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa
[00349] O estudo 2 foi similar em seu projeto ao estudo 1 descrito acima, com as exceções a seguir: a) apenas dois compostos foram avaliados (ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5); b) o número de animais foi aumentado para quatro por grupo; e c) a amostra de plasma do minuto 1 foi descartada e substituída por uma amostra da hora 144 para garantir que o cálculo da meia-vida terminal estava baseado em mais momentos de dados. A reformulação e a dosagem desses dois aptâmeros, amostras de sangue e técnicas para isolamento do plasma foram idênticas às usadas pelos métodos descritos acima no estudo 1. A descrição do estudo 2 está resumida na Figura 44.
[00350] Após o estudo 2 ter sido completado, as alíquotas de plasma foram analisadas conforme descrito no estudo 1 para determinar a) a concentração do aptâmero no plasma em diversos momentos após a administração intravenoso e b) a eficácia do bloqueio de C5.
[00351] A concentração de aptâmero no plasma foi assinalada em função do tempo (Figura 45) e os dados primários para ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) foram apresentados em forma de tabela nas Figuras 39 e 40, respectivamente. O aptâmero PEG de 40 kDa ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) persistiu no plasma pelo período de tempo mais longo. A inspeção da Figura 45 indicou que os dados seriam mais bem adequados por modelos bi- compartimentados. Portanto, as estimativas de parâmetros farmacocinéticos relatados na Figura 46 são derivados de uma modelo bi-compartimentados o software de modelagem de farmacocinética padrão da indústria WinNonLin™ v.4.0 (Pharsight Corp., Mountain View, CA).
[00352] Comparando os parâmetros farmacocinéticos gerados durante os estudos 1 e 2 de FK/FD acima, os dados para ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) foram similares com exceção da medida de t1/2(α) de ARC 187. Apesar de não pretender estar restrita a nenhuma teoria, a discrepância nas medidas de t1/2(α) para o ARC 187 entre os dois estudos se dá provavelmente graças ao tamanho reduzido das amostras no estudo piloto.
[00353] Como demonstrado na Figura 46, os valores Cmax foram semelhantes para ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) e ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5). Em contrapartida, a exposição da droga (AUC) estava significantemente maior em animais tratados com ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5). Ainda, ARC 187 prolongou os valores t1/2(α) e t1/2(β) comparado a ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62). Esses dados, juntos dos dados gerados durante o estudo PK/PD 1 indicaram que os aptâmeros ARC 187 de bloqueio de C5 podiam proporcionar os mais efetivos bloqueios in vivo de C5 para uma dose específica.
[00354] As alíquotas adicionais de plasma coletadas durante o estudo de farmacocinética foram subseqüentemente analisadas in vitro para determinar a eficácia do bloqueio de C5 em primatas. Como antes, a ativação do material de análise por zimosan foi executada para determinar a quantidade de C5b-9 e C5a de primata, respectivamente, gerada. Os dados foram assinalados como concentração de C5b-9 com relação a concentração de aptâmero (Figura 47) e concentração de C5a com relação a concentração de aptâmero (Figura 48). Como previamente demonstrado durante o estudo 1 de PK/PD, a concentração de aptâmero de bloqueio de C5 deve exceder 30 vezes o excesso molar (do aptâmero para a concentração de C5 no plasma), ou aproximadamente 15 μM, independente do tamanho da molécula PEG, de modo a inibir completamente a clivagem de C5 em primatas (Figuras 41 e 42).
[00355] Através da inspeção dos dados nas tabelas das Figuras 39 e 40, torna-se aparente que após um bolus I.V. de 30 mg/kg, ARC 658 (SEQ. ID. NO: 62) permanecia acima de 15 μM por aproximadamente 4 horas enquanto que ARC 187 permanecia acima de 15 μM por aproximadamente 8 horas. Deste modo, administrada uma dose similar da droga, o aptâmero ARC 187 de 40 K provê eficácia clínica por aproximadamente duas vezes mais que o aptâmero ARC 658 de 30K (SEQ. ID. NO: 62).
[00356] Em resumo, o macaco cinomolgus deve ser tratado com pelo menos 30 vezes o excesso molar de aptâmero vs C5 no plasma de modo a bloquear a conversão de C5 in vivo. Os referidos dados são consistentes com os estudos prévios in vitro (hemólise) e ex-vivo (coração de rato isolado infundido) que sugeriram que os aptâmeros de ligação de C5 possuem uma baixa afinidade para C5 primata em comparação ao C5 humano. Foi demonstrado que os aptâmeros de bloqueio de C5 podem ser facilmente administrados como um bolus intravenoso e uma dose de até 30 mg/kg, o que equivale a aproximadamente 50 vezes o excesso molar de aptâmero vs concentração de C5.
Exemplo 5G: ARC 1905 em macaco cinomolgus logo apos a administração de bolus IV
[00357] A farmacodinâmica do ARC 1905 Inibidor de C5 foi avaliada no macaco cinomolgus logo após administração intravenosa. A formulação de ARC 1905 para injeção estava em solução salina padrão a 7,5 mg/mL e as formulações de dosagem foram filtradas e esterilizadas (0,2 μm) em frascos de dosagem pré- esterilizados sob condições assépticas. Os macaco cinomolgus (n = 4) receberam uma dosagem em 0 (solução salina de controle) ou 30 mg/kg via administração de bolus intravenoso. As amostras de sangue foram obtidas de uma veia periférica ou pelo acesso arterial e as amostras de sangue (0,5 mL) foram transferidas para tubos de dipotássio (K2) EDTA, colocados no gelo úmido, e centrifugados no prazo de 30 minutos da coleta a aproximadamente 4°C.
[00358] As amostras de plasma foram analisadas in vitro para determinar a eficácia de ARC 1905 no bloqueio de C5 de primatas. O exame de zimosan previamente descrito em relação a ARC 1905 no Exemplo 1C foi usado para determinar a quantidade de C5a de primata gerado. O decréscimo dos valores pós-zimosan de C5a em 0,5 e 2 horas depois da dosagem indica que ARC 1905 inibiu a clivagem de C5 in vivo no macaco cinomolgus de maneira similar a ARC 187 quando dosados a aproximadamente na mesma concentração e na mesma via de administração como medido in vitro usando o teste de ativação de zimosan.
Exemplo 5H: Farmacocinética e farmacodinâmica do inibidor de C5 ARC 187 no macaco cinomolgus logo após administração e infusão de bolus IV
[00359] A farmacocinética (PK) e farmacodinâmica (PD) dos perfis de ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) também foram avaliadas em macacos cinomolgus depois da carga de bolus intravenoso seguido imediatamente pelo início infusão de intravenosa. O projeto deste estudo é mostrado na Figura 49.
[00360] A carga da dosagem do bolus e a proporção da infusão necessária para obter o estado-alvo da concentração de plasma de 1 μM foram calculados usando os parâmetros de farmacocinética derivados do estudo apenas no bolus I.V. listado na Figura 50.
[00361] Um total de três macacos cinomolgus recebeu a administração de bolus IV de ARC 187 a 1 mg/kg, seguido imediatamente pelo início infusão de intravenosa na proporção de 0,0013 mg/kg/minuto por um período de 48 horas. Amostras de sangue total foram coletadas de 0 hora a 192 horas pós-tratamento, colocadas em gelo úmido, processadas para plasma, e depois estocadas a -80°C. A concentração de ARC 187 nas amostras de plasma foi determinada usando tanto o teste de fluorescência de ácido nucléico (descrito no Exemplo 5B) quanto um teste de validação GLP usando cromatografia líquida (HPLC). O material de teste do método HPLC para a determinação de ARC 187 no plasma de macacos foi validado por ClinTrials Bio-Research (Montreal, Canada). A validação do estudo estava de acordo com as regras do Good Laboratory Practice (GLP) da United States Food e Drug Administration (FDA) (21 CFR §58). O teste HPLC foi validade em relação a: seletividade, linearidade, limite mínimo de detecção (LLOQ), transferência, precisão e exatidão do teste, estabilidade da solução estocada, estabilidade média da injeção, estabilidade da matriz de médio prazo, estabilidade de degelo, estabilidade da matriz a longo prazo e integridade da diluição. O espectro dinâmico linear da concentração do teste foi determinado como sendo de 0,080 a 50,0 μM.
[00362] O perfil medido de PK de ARC 187 sob as referidas condições se combinou bem com o perfil calculado que foi gerado usando apenas os parâmetros de PK do bolus IV (veja a Figura 51). A concentração de plasma que constituía o alvo de 1 μM foi estabelecida em < 5 min pós-dosagem e mantida por toda a duração da infusão. Depois da infusão ser cessada, o aptâmero mostrou uma depuração terminal da meia- vida, t1/2 (β) ~ 40-60 h.
[00363] As atividades de farmacodinâmica de ARC 187 (SEQ. ID. NO: 5) no macaco cinomolgus foram avaliadas ex-vivo usando amostras de plasma coletadas durante o estudo de PK no teste de ativação por zimosan previamente descrito com a modificação de as amostras de plasma de cinomolgus foram diluídas 10 vezes em plasma 10% humano e depois tratadas com 5 mg/mL de zimosan. A ativação de C5, como refletido pelo surgimento de produtos da clivagem de C5, foi medida por ELISA específico para C5a humano (C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA). A concentração de ARC 187 ativo em cada amostra era então quantificada por comparação com uma curva padrão derivada dos testes de zimosan usando amostras preparadas com níveis conhecidos de ARC 187 (veja Figura 52). Esse estudo indica que ARC 187 mantém sua atividade anti-complemento durante e mesmo logo após a infusão, a níveis substancialmente consistentes com os perfis de farmacocinética descritos acima.
Exemplo 5I: Prognóstico dos requisitos para dosagem em humanos
[00364] Os requisitos para a dosagem em humanos para prevenção, melhora, ou tratamento das complicações relacionadas à cirurgia cardiovascular, estão baseados nas suposições a seguir: primeiro, pacientes de cirurgias cardiovasculares receberão a administração de uma única dose de bolus intravenoso do aptâmero anti-C5 antes de iniciada a cirurgia, seguida por infusão contínua para estabilizar e manter um estado estável da concentração de plasma em 1,5 μM por 24 horas - 48 horas depois da cirurgia cardiovascular. A dose do bolus e as estimativas da proporção de infusão estão baseadas em cálculos usando os parâmetros farmacocinéticos derivados dos estudos previamente descritos de apenas bolus IV e de bolus mais infusão em macacos cinomolgus. A dose estimada de bolus de ARC 187 é de 1 mg/kg, e a proporção da infusão associada é de 0,0013 mg/kg/minuto. Para este regime de bolus mais infusão por 48 horas, o requisito total de droga antecipado é de 0,4 g para ARC 187, onde massa se refere apenas ao peso do oligonucleotídeo (veja a coluna 7 na tabela da Figura 53). A coluna 2 da tabela mostrada na Figura 53 se refere ao peso do grupo PEG conjugado com a porção de oligonucleotídeo de ARC 187, a coluna 3 se refere ao peso molecular da porção de oligonucleotídeo de ARC 187 (e será o mesmo para todos os aptâmeros aqui contidos que compreendem ARC 186 (SEQ. ID. NO: 4) como sua seqüência de oligonucleotídeo), a coluna 4 se refere ao peso molecular de PEG de 40 kDA conjugado a ARC 186 (SEQ. ID. NO: 4) pela via química da amina reativa como descrito no Exemplo 3C acima, a coluna 5 se refere a fase α de meia-vida de ARC 187 em modelos bi-compartimentados, e a coluna 6 se refere a fase β de meia-vida de ARC 187 em modelos bi-compartimentados.
Exemplo 6 Aptâmeros anti-C5 e Interação Heparina/Protamina
[00365] Uma aplicação antecipada do aptâmero anti-C5 é como um profilático para a prevenção ou migração dos efeitos laterais inflamatórios associados à cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronária (CABG). Altas concentrações de heparina anticoagulante (3 unidades/mL - 5 unidades/mL ou 1 μM - 2 μM) são tipicamente administradas por bomba de desvio; reversão do efeito de heparina após o procedimento, e restauração da hemostase normal, é alcançada pela administração do concentrações similarmente altas de protamina (~5 μM). Considerando os perigos potenciais dos pacientes com relação a qualquer interferência na eficácia de qualquer uma das referidas drogas, foi necessário se demonstrar que os aptâmeros anti-C5 (1) não alteram as atividades de qualquer uma das drogas e (2) não exibem efeitos inerentes na hemostase que possa complicar o tratamento de anticoagulação do paciente.
[00366] A heparina é um polissacarídeo sulfatado com uma carga líquida negativa e uma massa molecular média de aproximadamente 15 kDa que exerce um efeito inibitório em uma série de proteases na cascata de coagulação ao promover interações com a antitrombina. A protamina, um polipeptídeo de com carga altamente positiva, é capaz de bloquear a atividade da heparina por meio de uma interação pobremente caracterizada que é de natureza pelo menos parcialmente eletrostática. O núcleo funcional de ARC 187 (SEQ ID NO: 5), da mesma forma que a hepatina, é altamente aniônica. Assim, é concebível que ARC 187 possa se ligar não especificamente aos campos de ligação de heparina ou protamina e interferir com as atividades das referidas moléculas. Os estudos a seguir investigaram as propriedades anticoagulantes inerentes (isto é, como heparina) do ARC 187, os efeitos de ARC 187 na função da heparina, os efeitos de ARC 187 na neutralização de heparina por protamina, e os efeitos da protamina nas propriedades de inibição de complemento do ARC 187.
Exemplo 6A: Efeitos in vitro de ARC 187 na coagulação
[00367] Os efeitos inerentes de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) na capacidade de coagulacoa plasmática foram investigados usando os testes clínicos padrão dos braços intrínsecos e extrínsecos da cascata de coagulação, o tempo de protrombina (PT) e o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), respectivamente. Como mostrado na Figura 54, a titulação de plasma humano citratado com concentrações bem em excesso das doses projetadas (cerca de 20 μM) resultou em nenhuma alteração em PT, e apenas em relativa elevação na aPTT.
[00368] Para se avaliar os efeitos in vitro de ARC 187 nas funções de heparina e protamina, o sangue de 3 indivíduos foi obtido em 4 unidades/mL - 5 unidades/mL de heparina, as doses associadas aos níveis de heparina usados na cirurgia de CABG. A capacidade de coagulação das referidas amostras foi avaliada usando o tempo de coágulo ativado (ACT), um teste de coagulação de sangue total rotineiramente utilizado para monitorar a atividade de heparina durante cirurgia. Nas referidas concentrações de heparina, na ausência de outros aditivos, o ACT foi significativamente prolongado a partir do valor de linha basal de ~ 150 segundos a ~ 500 segundos na presença de 4 U/mL de heparina, ou ~ 800 na presença de 5 U/mL de heparina. A adição de 10 μM de ARC 187 às referidas amostras apresentou pouco efeito no tempo de coagulação, demonstrando que ARC 187 não interfere com a atividade anticoagulante da heparina.
[00369] O efeito anticoagulante de heparina foi prontamente neutralizado por titulação com protamina de cerca de 6 μM - 8 μM (4 U/mL de heparina) ou 12 μM (5 U/mL de heparina). Os valores ACT na presença de heparina e as concentrações neutralizantes de protamina foram essencialmente indistinguíveis a partir da linha basal. Uma vez que o núcleo do ácido nucléico de ARC 187 (12 kDa) é de peso molecular mais elevado do que o da protamina (5 kDa), deve ser esperado que as concentrações equimolares de ARC 187 adicionadas à protamina sejam suficientes para completamente reverter a atividade neutralizante da protamina. Entretanto, a pré-incubação da protamina com concentrações aproximadamente equivalentes de ARC 187 apresentou pouco efeito na ACT. As amostras de sangue contendo as concentrações neutralizantes de protamina exibiram valores de ACT similares na presença ou na ausência de 10 μM de ARC 187, indicando que a ARC 187 apresentou apenas um ligeiro se algum efeito na atividade pró-coagulante da protamina. Os referidos resultados são resumidos na Figura 55.
Exemplo 6B: Efeitos in vivo de ARC 187 na coagulação
[00370] As interações entre a função da heparina e da protamina durante a administração concorrente do aptâmero anti-C5 ARC 187 (SEQ ID NO: 5), em doses clínicas de heparina e doses clínicas/subclínicas/superclínicas de protamina foram investigadas para determinar se a presença de concentrações plasmáticas subclínicas/superclínicas de ARC 187 poderiam interferir com a reversão da anticoagulação da heparina pela protamina. Os resultados do estudo são resumidos na Figura 56. Em suma, os valores de ACT da linha basal não foram afetados por 10 μM (isto é, um excesso molar de 10 vezes da dose clínica) de ARC 187 em todas as doses de heparina testadas. De forma similar, a extensão da anticoagulação pela heparina não foi afetada por 10 μM de ARC 187. Na ausência de ARC 187, a eficácia mínima da dose de protamina foi de ~ 30% (dose clínica é de 100%). Ademais, a reversão da anticoagulação de heparina por 30% de protamina não foi afetada pelo excesso molar de 10 vezes na dose clínica (isto é, 10 μM) de ARC 187. Assim, o uso de ARC 187 para a inibição de complemento em um cenário clínico (por exemplo, CABG) não deve ser afetada pelo uso conjunto de heparina e protamina em doses típicas.
Exemplo 6C: Efeito da Heparina e Protamina na função anti-complemento do ARC 187
[00371] Os efeitos da heparina e da protamina na atividade anti- complemento de ARC 187 (SEQ ID NO: 5) foram examinados nas amostras de sangue total citratadas ativadas com zimosan, como descrito no exemplo 1. Logo antes da ativação de zimosan, ARC 187 foi titulado em amostras de sangue citratado tratado sob quatro condições: 1) sem tratamento (sem heparina ou protamina); 2) 4 U/mL de heparina; 3) 6 μM de protamina; 4) 4 U/mL de heparina + 6 μM de protamina. Em seguida da ativação com zimosan, a ativação de C5 foi quantificada por medição de ELISA de sC5b-9 no plasma (kit C5b-9 ELISA, Quidel, San Diego, CA). Para cada condição, os resultados, expressos como o percentual de inibição de ativação de C5 com relação a concentração de ARC 187, foram indistinguíveis dentro do erro (ver Figura 57). Em todos os casos a inibição completa foi alcançada com 1 μM - 2 μM de ARC 187. Assim, a heparina e protamina, em separado ou combinadas em concentrações relevantes ao uso das mesmas em cirurgia de CABG, não parece afetar a atividade anticoagulante de ARC 187.
[00372] A presente invenção tendo agora sido descrita apenas como uma descrição escrita e exemplos, aqueles versados na técnica reconhecerão que a presente invenção pode ser praticada em uma variedade de modalidades e que a descrição e exemplos acima são apenas com o objetivo de ilustração e não de limitação das reivindicações a seguir.

Claims (11)

1. Conjugado aptâmero/polietileno glicol (PEG) ou um sal do mesmo, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado aptâmero/PEG tem a estrutura apresentada abaixo:
Figure img0005
em que indica um ligante, em que Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), em que fC e fU = 2’-flúor nucleotídeos, e mG e mA = 2’-OMe nucleotídeos e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma timidina deóxi invertida.
2. Conjugado aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado aptâmero/PEG tem a estrutura apresentada abaixo:
Figure img0006
em que Aptâmero = fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfU AfCfCfUmGfCmG-3T (SEQ ID NO: 4), em que fC e fU = 2’-flúor nucleotídeos, e mG e mA = 2’-OMe nucleotídeos e todos os outros nucleotídeos são 2’-OH e 3T indica uma timidina deóxi invertida.
3. Conjugado aptâmero/PEG de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante é ligante alquila que compreende 6 grupos CH2 consecutivos, um ligante alquila compreendendo entre 2 a 18 grupos CH2 consecutivos, um ligante alquila compreendendo entre 2 a 12 grupos CH2 consecutivos, ou um ligante alquila compreendendo entre 3 a 6 grupos CH2 consecutivos.
4. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do conjugado aptâmero/PEG como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 ou um sal do mesmo e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
5. Uso do conjugado aptâmero/PEG como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar, prevenir ou melhorar uma doença mediada por proteína complementar C5, C5a, e/ou C5b-9 em um mamífero.
6. Uso de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero é um ser humano.
7. Uso de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem é infarto do miocárdio, derrame, danos por isquemia/reperfusão, doença infecciosa, septicemia, choque, alergia, asma, artrite reumatóide, e outras doenças reumatológicas, esclerose múltipla e outros doenças neurológicas, psoríase e outras doenças dermatológicas, miastenia gravis, lupus eritematoso sistêmico (SLE), glomerulonefrite e outras doenças renais, dano miocárdico relativo à cirurgia de enxerto de desvio de artéria coronariana (CABG), dano miocárdico relacionado a angioplastia de balão, dano miocárdico relacionado à reestenose, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas à cirurgia de CABG, complicações mediadas a proteína complemento relacionadas à intervenção coronária percutânea, hemoglobinúria noturna paroxístico, rejeição aguda a transplante, rejeição hiper-aguda a transplante, rejeição subaguda a transplante, ou rejeição crônica a transplante
8. Uso de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a desordem a ser tratada é uma doença isquêmica aguda, doença inflamatória aguda, doença inflamatória crônica ou doença imuno-mediada.
9. Uso de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado aptâmero/PEG é formulado para ser administrado antes da cirurgia e continuar a administração pelo menos 24 horas.
10. Uso de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o conjugado aptâmero/PEG é formulado para ser administrado intravenosamente.
11. Uso do conjugado aptâmero/PEG como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é como um diagnóstico in vitro.
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