ES2259800T3 - Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico. - Google Patents

Procedimientos de uso de ligandos de acido nucleico.

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ES2259800T3
ES2259800T3 ES97200035T ES97200035T ES2259800T3 ES 2259800 T3 ES2259800 T3 ES 2259800T3 ES 97200035 T ES97200035 T ES 97200035T ES 97200035 T ES97200035 T ES 97200035T ES 2259800 T3 ES2259800 T3 ES 2259800T3
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nucleic acid
protein
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English (en)
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Larry Gold
Craig Tuerk
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Gilead Sciences Inc
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Abstract

UN ACIDO NUCLEICO QUE OCURRE DE FORMA NO NATURAL QUE TIENE UNA AFINIDAD DE UNION ESPECIFICA O FUNCION CATALITICA PARA UNA MOLECULA DIANA, DICHA MOLECULA DIANA SIENDO DIFERENTE A UN POLINUCLEOTIDO QUE SE UNE A DICHO ACIDO NUCLEICO A TRAVES DE UN MECANISMO QUE DEPENDE PREDOMINANTEMENTE DE UN EMPAREJAMIENTO DE BASE DE WATSON/CRICK O UNION DE TRIPLE HELICE Y DICHO ACIDO NUCLEICO NO SIENDO UN ACIDO CONOCIDO DE UNION A UNA PROTEINA DIANA DE UNION A ACIDO NUCLEICO QUE OCURRE DE FORMA NATURAL.

Description

Procedimientos de uso de ligandos de ácido nucleico.
Este trabajo ha sido financiado por el Gobierno de los Estados Unidos a través de ayudas del National institutes of Health. El gobierno de los Estados Unidos posee ciertos derechos sobre esta invención.
Campo de la invención
Describimos aquí una nueva clase de ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que se unen de forma específica a una molécula objetivo deseada. Se presenta un procedimiento para seleccionar un ligando de ácido nucleico que se una de forma específica a cualquier molécula objetivo deseada. El procedimiento se denomina SELEX, un acrónimo del término inglés Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment (Evolución Sistemática de Ligandos mediante Enriquecimiento Exponencial). El procedimiento de la invención (SELEX) es útil para aislar un ligando de ácido nucleico para una molécula objetivo deseada. Los ácidos nucleicos producto de la invención son útiles para cualquier propósito en el que se incluya una reacción de unión, por ejemplo, en procedimientos de ensayos, diagnóstico, separación celular (cell sorting), como inhibidores de la función de la molécula objetivo, como sondas, como agentes secuestrantes y similares. Además, los ácidos nucleicos producto de esta invención pueden presentar actividad catalítica. Entre las moléculas objetivo se incluyen polímeros naturales y sintéticos, incluyendo proteínas, polisacáridos, glicoproteínas, hormonas, receptores y superficies celulares, y moléculas pequeñas como fármacos, metabolitos, cofactores, análogos de estado de transición y toxinas.
Antecedentes de la invención
La mayor parte de las proteínas o moléculas pequeñas no son conocidas por unirse de forma específica a ácidos nucleicos. La excepción son las proteínas reguladoras como las represoras, polimerasas, activadoras y similares, cuya función, en una célula viva, es realizar la transferencia de información genética codificada en los ácidos nucleicos hasta las estructuras celulares, así como realizar la replicación del material genético. Además, también existen moléculas pequeñas como GTP que se unen a los intrones de ARN.
El proceso de la vida ha evolucionado para limitar la función de los ácidos nucleicos a un papel fundamentalmente informativo. El Dogma Central, postulado por Crick, tanto en su forma original como en su forma ampliada, propone que los ácidos nucleicos (tanto ARN como ADN) pueden servir como plantillas para la síntesis de otros ácidos nucleicos a través de procesos replicativos que "leen" la información de un ácido nucleico plantilla para así generar ácidos nucleicos complementarios. Todos los paradigmas experimentales en genética y expresión génica dependen de estas propiedades de los ácidos nucleicos: en esencia, los ácidos nucleicos de cadena doble son informativamente redundantes debido al concepto químico de pares de bases y a que los procesos replicativos son capaces de usar este apareamiento de bases de forma relativamente libre de errores.
Los componentes individuales de las proteínas, los veinte aminoácidos naturales, presentan actividades y diferencias químicas suficientes para proporcionar una enorme variedad de actividades tanto para la unión como para la catálisis. Sin embargo, se cree que los ácidos nucleicos tienen menos posibilidades químicas que las proteínas, aunque tienen un papel informativo que permite que la información genética pase de un virus a otro, de una célula a otra y de un organismo a otro. En este contexto, los componentes de los ácidos nucleicos, los nucleótidos, deben poseer únicamente pares de superficies que permitan la redundancia informativa dentro de un par de bases de Watson-Crick. Los componentes de los ácidos nucleicos necesitan no poseer suficientes actividades y diferencias químicas para un amplio rango de uniones o catálisis.
Sin embargo, algunos ácidos nucleicos encontrados en la naturaleza participan en uniones con determinadas moléculas objetivo, e incluso se han descrito algunos ejemplos de catálisis. El rango de actividades de este tipo es escaso en comparación con el caso de las proteínas y, de forma más específica, con el de los anticuerpos. Por ejemplo, en los casos en que los ácidos nucleicos son conocidos por unirse con alta afinidad y especificidad a algunas proteínas objetivo, la unión depende de las secuencias exactas de nucleótidos que comprenden el ligando de ADN o ARN. Así, las secuencias cortas de ADN de cadena doble son conocidas por unirse a proteínas objetivo que inhiben o activan la trascripción en procariotas y eucariotas. Otras secuencias cortas de ADN de cadena doble son conocidas por unirse a endonucleasas de restricción, proteínas objetivo que se pueden seleccionar con alta afinidad y especificidad. Otras secuencias cortas de ADN sirven como centrómeros y telómeros en los cromosomas, presumiblemente creando ligandos para la unión de proteínas específicas que participan en la mecánica de los cromosomas. Así, el ADN de cadena doble posee una conocida capacidad para unirse en los rincones y grietas de aquellas proteínas objetivo cuyas funciones vayan dirigidas a la unión al ADN. El ADN de cadena simple también se puede unir con alta afinidad y especificidad a algunas proteínas, aunque el número de ejemplos existente en la literatura es bastante menor. De los ejemplos conocidos de proteínas unidas a ADN de cadena doble, ha sido posible describir las interacciones de uniones que involucran a varios motivos de proteínas que proyectan cadenas laterales de aminoácidos en la ranura principal de la forma B del ADN de cadena doble, permitiendo la inspección de la secuencia que permite la especificidad.
El ARN de cadena doble sirve ocasionalmente como ligando de ciertas proteínas, por ejemplo, la endonucleasa ARNasa III de la E. Coli. Existen más ejemplos conocidos de proteínas objetivo que se unen a ligandos de ARN de cadena simple, aunque en dichos casos el ARN de cadena simple forma, a menudo, un complejo tridimensional que incluye regiones locales de doble ramificación intramolecular. Las amino-acil ARNt sintetasas se unen firmemente a moléculas de ARNt con alta especificidad. Una pequeña región de los genomas de los virus de ARN se une firmemente y con alta especificidad a las cubiertas proteicas del virus. Una pequeña secuencia de ARN se une a la ADN polimerasa codificada por un gen del bacteriófago T4, de nuevo con alta afinidad y especificidad. Así pues, es posible encontrar ligandos de ARN y ADN, tanto con cadena doble como simple, que sirvan como socio de unión para proteínas objetivo específicas. Las proteínas de unión a ADN más conocidas se unen de forma específica a ADN de cadena doble, mientras que la mayoría de proteínas de unión a ARN reconocen ARN de cadena simple. Esta desviación estadística encontrada en la bibliografía refleja, sin duda, la presencia de una predisposición estadística de la biosfera al uso de ADN como genoma de cadena doble y de ARN como entidad de cadena simple en muchos de los papeles que desempeña el ARN, además de servir como genoma. Químicamente, no existe ninguna razón poderosa para menospreciar el ADN de cadena simple como un socio perfectamente capaz de interaccionar de forma específica con proteínas.
También se ha descrito que el ARN y el ADN se unen a moléculas objetivo más pequeñas. El ADN de cadena doble se une a varios antibióticos, como el actinomicina D. Un ARN de cadena simple específico se une al antibiótico tiostreptona; secuencias y estructuras especificas de ARN se unen probablemente a otros antibióticos, especialmente a aquellos cuya función sea inactivar los ribosomas en un organismo objetivo. Una familia de secuencias evolucionadas de ARN se unen con especificidad y una moderada afinidad a nucleótidos y nucleósidos (Bass, B. y Cech, T. (1984) Nature 308: 820-826), así como a uno de los veinte aminoácidos (Yarus, M. (1988) Science 240:1751-1758). En la actualidad, también se conocen ARN catalíticos, aunque estas moléculas actúan en un estrecho rango de posibilidades químicas, que están estrechamente relacionadas con las reacciones de transferencia de fosfodiéster y con la hidrólisis de ácidos nucleicos.
Aparte de estos ejemplos conocidos, la gran mayoría de las proteínas y otros componentes celulares no están diseñados para unirse a ácidos nucleicos bajo condiciones fisiológicas y, como puede observarse, dicha unión es no-específica. O bien la capacidad de los ácidos nucleicos para unirse a otros compuestos se limita a los relativamente pocos ejemplos enumerados supra, o bien el repertorio químico de ácidos nucleicos para uniones específicas se evita (selectivamente en contra) en las estructuras que existen de forma natural. La presente invención se fundamenta en la creencia de los inventores de que los ácidos nucleicos, como compuestos químicos, pueden formar virtualmente un sinfín de formas, tamaños y configuraciones, y son capaces de dar lugar a un repertorio de uniones y funciones catalíticas mucho más amplio que el que aparece en los sistemas biológicos.
Las interacciones químicas han sido exploradas en ciertos casos conocidos de uniones proteína-ácido nucleico. Por ejemplo, el tamaño y la secuencia del sitio de unión a ARN de la cubierta proteica del bacteriófago R17 han sido identificados por Uhlenbeck y colaboradores. La secuencia mínima del sitio de unión al ARN natural (21 bases de longitud) para la cubierta proteica de R17 fue determinada a partir de un proceso en el que fragmentos marcados de ARNm de tamaño variable se sometían a ensayos de unión sobre filtro de nitrocelulosa en los que los complejos proteína-fragmentos de ARN permanecían adheridos al filtro (Carey et al. (1983) Biochemistry 22:2601). Se crearon in vitro un cierto número de variantes de la secuencia mínima del sitio de unión de la cubierta proteica de R17 con el fin de determinar las contribuciones de los ácidos nucleicos individuales a la unión con la proteína (Uhlenbeck et al. (1983) J. Biomol. Structure Dynamics 1:539 y Romaniuk et al. (1987) Biochemistry 26:1563). Se observó que el mantenimiento de la estructura de bucle en horquilla del sitio de unión era esencial para la unión de la proteína pero, además, que las sustituciones de nucleótidos en la mayoría de los residuos de cadena simple del sitio de unión, incluyendo el nucleótido protuberante del brazo de la horquilla, afectaban de forma significativa a la unión. En estudios similares, se examinó la unión de la cubierta proteica de bacteriófago Qb a su operador translacional (Witherell y Uhlenbeck (1989) Biochemistry 28:71). El sitio de unión al ARN de la cubierta proteica de Qb resultó ser similar al del R17 en tamaño y en la estructura secundaria prevista, en tanto que comprende unas 20 bases con una estructura de horquilla de 8 pares de bases que incluye un nucleótido protuberante y un bucle de 3 bases. En contraste con el sitio de unión de la cubierta proteica de R17, sólo uno de los residuos de cadena simple del bucle es esencial para la unión y no es necesaria la presencia del nucleótido protuberante. Las interacciones de unión proteína-ARN involucradas en la regulación translacional muestran una especificidad significativa.
Los ácidos nucleicos son conocidos por formar estructuras secundarias y terciarias en disolución. Las formas de cadena doble del ADN incluyen la llamada forma de doble hélice B, z-ADN y giros de superhélice (Rich, A. et al. (1984) Ann. Rev. Biochem. 53:791-846). El ARN de cadena simple forma regiones localizadas de estructura secundaria como los bucles en horquilla y las estructuras de pseudonudo (Schimmel, P. (1989) Cell 58:9-12). Sin embargo, son escasos los datos relativos a los efectos de los nucleótidos desapareados del bucle en la estabilidad de la estructura del bucle, en la cinética de formación y desnaturalización, en la termodinámica y son prácticamente inexistentes los datos sobre las estructuras terciarias y formas tridimensionales, así como de la cinética y termodinámica del plegamiento terciario en los ácidos nucleicos (Tuerk, C. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:1364-1368).
En la replicación del ARN del bacteriófago Qb se describió un tipo de evolución in vitro. Mills, D.R. et al. (1967) 45 Proc. Natl. Acad. Sci USA 58:217-224; Levinsohn, R. y Spiegleman, S. (1968) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:866-872; Levisohn, R. y Spiegelman S. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:805-811; Saffhill, R. et al. (1970) J. Mol. Biol. 51: 531-539; Kacian, D.L. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:3038-3042; Mills, D.R. et al. (1973) Science 180: 916-927. El ARN del fago sirve como un ARN mensajero policistrónico que dirige la traducción de las proteínas específicas del fago y también como una plantilla para su propia replicación catalizada por la ARN replicasa de Qb. Esta ARN replicasa resultó ser altamente específica para sus propias plantillas de ARN. Durante el transcurso de los ciclos de replicación in vitro se aislaron pequeñas variantes de ARN que también fueron replicadas por la replicasa de Qb Pequeñas alteraciones en las condiciones bajo las que se realizaron los ciclos de replicación dieron como resultado la acumulación de diferentes ARN, presumiblemente debido a que su replicación estaba favorecida bajo las condiciones alteradas. En estos experimentos, el ARN seleccionado debía estar unido de forma eficaz por la replicasa para que se iniciara la replicación y debía servir como una plantilla cinéticamente favorecida durante la elongación del ARN. Kramer et al. (1974) J. Mol. Biol. 89:719 describieron el aislamiento de una plantilla de ARN mutante de la replicasa Qb, cuya replicación resultó ser más resistente a la inhibición por bromuro de etidio que la plantilla natural. Se sugería que este mutante no estaba presente en la población inicial de ARN, sino que fue generado por la mutación secuencial durante los ciclos de replicación in vitro con replicasa Qb. La única fuente de variación existente durante la selección era el error intrínseco producido durante la elongación por la replicasa Qb. En estos estudios, lo que se denominaba "selección" se producía por amplificación preferencial de uno o más del limitado número de variantes espontáneas de una secuencia de ARN inicialmente homogénea. No hubo selección de un resultado deseado, sólo del que era intrínseco al modo de acción de la replicasa Qb.
Joyce y Robertson (Joyce (1989) en ARN: Catalysis. Splicing, Evolution, Belfort y Shub (eds.), Elsevier, Amsterdam pp. 83-87; y Robertson y Joyce (1990) Nature 344:467) describieron un procedimiento para identificar ARN que cortaba ADN de cadena simple de forma específica. La selección para la actividad catalítica se basó en la capacidad del ribozima para catalizar el corte de un ARNmc o ADN de un sustrato en una posición específica y para transferir el extremo 3' del sustrato al extremo 3' del ribozima. El producto de la reacción deseada se seleccionó utilizando un cebador de oligodesoxinucleótido que sólo se podía unir al producto completado a través de la unión formada por la reacción catalítica y que permitía realizar de forma selectiva la transcripción inversa de la secuencia del ribozima. Las secuencias catalíticas seleccionadas se amplificaron mediante la conexión del promotor de la ARN polimerasa de T7 al extremo 3' del ADNc, seguido de la transcripción al ARN. El procedimiento se utilizó para identificar, entre un pequeño número de variantes de ribozima, la variante que resultaba más reactiva para la liberación de un sustrato seleccionado. Sólo se podía probar un rango limitado de variantes, ya que la variación dependía de los cambios individuales de nucleótido que se producían durante la amplificación.
Oliphant et al (Molecular and Cellular Biology, July 1989, 2944-2949) describen un procedimiento para definir las propiedades del reconocimiento secuencial de las proteínas de unión al ADN de cadena doble mediante la selección de los sitios de unión de alta afinidad en secuencias aleatorias de ADN. En particular, estudiaron la proteína del activador transcripcional GCN4 de levaduras.
Thiesen y Bach (Nucleic Acids Research, Vol. 18, No. 11, 3203-3209) describen un procedimiento denominado "Target Detection Assay" (TDA, ensayo de detección de objetivo) que permite determinar los sitios de unión al ADN para supuestas proteínas de unión a ADN de cadena doble.
Las primeras aproximaciones sólo mostraron y sugirieron un limitado rango de funciones químicas para los ácidos nucleicos en sus interacciones con otras sustancias: como objetivos para ligandos de proteínas evolucionados para unirse a determinadas secuencias específicas de oligonucleótidos; más recientemente, como catalizadores con un rango limitado de actividades. Los experimentos de "selección" previos se han limitado a un estrecho margen de variantes de una función previamente descrita. Ahora, por primera vez, se entenderá que los ácidos nucleicos son capaces de realizar un amplio rango de funciones y aquí se revela la metodología para poner en obra dicha capacidad.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere exclusivamente a un procedimiento que comprende la unión específica in vitro de un ligando de ácido nucleico a una molécula objetivo, según se define en las reivindicaciones adjuntas. También se refiere a la utilización de un ligando de ácido nucleico según se define en las reivindicaciones. La presente patente también describe una clase de productos que son moléculas de ácidos nucleicos, cada una con una secuencia única, cada una de las cuales tiene la propiedad de unirse de forma específica a un compuesto o molécula objetivo deseada. Cada compuesto descrito es un ligando específico de una molécula objetivo determinada. La invención se basa en la percepción única de que los ácidos nucleicos poseen capacidad suficiente para formar una variedad de estructuras bi- y tridimensionales y suficiente versatilidad química disponible en sus monómeros para actuar como ligandos (formando pares de unión específicos) con prácticamente cualquier compuesto químico, tanto monomérico como polimérico. Como objetivos se pueden emplear moléculas de cualquier tamaño. Muy comúnmente, y ventajosamente, para aplicaciones terapéuticas, la unión tiene lugar en solución acuosa en condiciones de salinidad, temperatura y pH cercanas a los límites fisiológicos aceptables.
También se describe un procedimiento que puede aplicarse de forma general para generar un ligando de ácido nucleico para cualquier objetivo deseado. El procedimiento incluye la selección de una mezcla de candidatos e iteraciones paulatinas de mejora estructural, utilizando el mismo tema de selección general, para conseguir virtualmente cualquier criterio deseado de afinidad y selectividad de unión. Partiendo de una mezcla de ácidos nucleicos, que comprenda ventajosamente un segmento de secuencia aleatorizada, el procedimiento, al que nos referiremos aquí como SELEX, incluye los pasos de contacto entre la mezcla y el objetivo bajo condiciones favorables para la unión, la separación de los ácidos nucleicos no unidos de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a una molécula objetivo, disociación de los pares ácido nucleico-objetivo, amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los pares ácido nucleico-objetivo para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligandos, y, finalmente, repetición de los pasos de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee.
Aunque no está ligado a una teoría de preparación, SELEX se basa en la creencia de los inventores de que, en una mezcla de ácidos nucleicos que contenga un gran número de secuencias y estructuras posibles, existe un amplio rango de afinidades de unión para un objetivo dado. Una mezcla de ácidos nucleicos que contenga, por ejemplo, un segmento de 20 nucleótidos aleatorizados puede contener 4^{20} posibles candidatos. Aquellos que tengan las mayores constantes de afinidad por el objetivo tienen más posibilidades de unirse. Tras la separación, disociación y amplificación, se genera una segunda mezcla de ácidos nucleicos, enriquecida con los candidatos con mayor afinidad de unión. Rondas adicionales de selección favorecen de forma progresiva la selección de los mejores ligandos hasta que la mezcla de ácidos nucleicos resultante está compuesta, predominantemente, por una sola o por unas pocas secuencias. A continuación, esta mezcla se puede clonar, secuenciar y su afinidad de unión como ligandos puros se puede probar de forma individual.
Los ciclos de selección y amplificación se repiten hasta alcanzar el objetivo deseado. En el caso más general, la selección/amplificación continua hasta que no se obtiene una mejora significativa de la fuerza de unión con la repetición de un ciclo. El procedimiento iterativo de selección/amplificación es suficientemente sensible para permitir el aislamiento de una única variante de secuencia en una mezcla que contenga al menos 65.000 variantes de secuencia. El procedimiento es capaz, incluso, de aislar un pequeño número de secuencias con alta afinidad en una mezcla que contenga 10^{14} secuencias. El procedimiento podría, en principio, utilizarse para muestrear hasta unas 10^{18} especies de ácidos nucleicos diferentes. Los ácidos nucleicos de la mezcla de prueba incluyen ventajosamente una porción de secuencia aleatorizada, así como secuencias conservadas necesarias para una amplificación eficaz. Las variantes de secuencias de ácidos nucleicos pueden producirse de diversas formas, incluyendo la síntesis de secuencias aleatorizadas de ácidos nucleicos y la selección por tamaño de ácidos nucleicos celulares cortados de forma aleatoria. La porción de secuencia variable puede contener completa o parcialmente la secuencia aleatoria; puede también contener subporciones de la secuencia conservada incorporada a la secuencia aleatorizada. La variación de secuencia en los ácidos nucleicos de prueba se puede introducir o incrementar mediante mutagénesis antes o durante las iteraciones de selección/amplificación.
En un ejemplo descrito, el proceso de selección es tan eficaz en cuanto al aislamiento de dichos ligandos de ácido nucleico que se unen firmemente al objetivo seleccionado, que sólo se requiere un ciclo de selección y amplificación. Una selección tan eficaz puede ocurrir, por ejemplo, en un proceso de tipo cromatográfico en el que la capacidad de los ácidos nucleicos para asociarse a los objetivos unidos a una columna funciona de forma tal que la columna es perfectamente capaz de permitir la separación y aislamiento de los ligandos de ácido nucleico de mayor afinidad.
En muchos casos, no es necesariamente deseable realizar los pasos iterativos de SELEX hasta haber identificado un único ligando de ácido nucleico. La solución de ligando de ácido nucleico específico del objetivo puede incluir una familia de estructuras o motivos de ácidos nucleicos que presenten un cierto número de secuencias conservadas y un cierto número de secuencias que puedan ser sustituidas o añadidas sin afectar de forma significativa a la afinidad de los ligandos de ácido nucleico por el objetivo. Al finalizar el proceso SELEX previamente a la conclusión, es posible determinar la secuencia de un número de miembros de la familia de la solución de ligandos de ácido nucleico, que permitirá la determinación de una descripción completa de la solución de ligandos de ácido nucleico.
Una vez resuelta mediante SELEX la descripción de la familia de ligandos de ácido nucleico, en algunos casos puede ser deseable realizar una serie adicional de SELEX modificada a partir de la información recibida durante el experimento SELEX. En una realización, la segunda serie de SELEX fijará aquellas regiones conservadas de la familia de ligandos de ácido nucleico mientras las demás posiciones de la estructura del ligando se aleatorizarán. En una realización alternativa, la secuencia del miembro más representativo de la familia de ligandos de ácido nucleico se puede utilizar como base de un proceso SELEX en donde el conjunto original de secuencias de ácidos nucleicos no esté completamente aleatorizado, sino que contenga desviaciones hacia el siguiente ligando conocido. A través de estos procedimientos se puede optimizar el proceso SELEX para llegar a obtener los ligandos de ácido nucleico más ventajosos.
Es conocido que existe una gran variedad de estructuras primarias, secundarias y terciarias de ácidos nucleicos. Las estructuras o motivos que se han mostrado implicadas más comúnmente en interacciones del tipo no-Watson-Crick se denominan bucles en horquilla, protuberancias simétricas o asimétricas, pseudonudos y una miríada de combinaciones de los mismos. Casi todos los casos conocidos de estos motivos sugieren que se pueden formar en una secuencia de ácidos nucleicos de no más de 30 nucleótidos. Por este motivo, resulta ventajoso que los procesos SELEX con segmentos aleatorios contiguos se inicien con secuencias de ácidos nucleicos que contengan segmentos aleatorizados de entre 20 y 50 nucleótidos, aproximadamente. En otro aspecto, la invención incluye una mezcla de candidatos que comprende ácidos nucleicos, es decir, ácidos nucleicos que comprenden un segmento conservado de nucleótidos y un segmento aleatorizado de nucleótidos. Ventajosamente, el llamado segmento aleatorizado es una cadena contigua de al menos unos 15 nucleótidos, más ventajosamente de al menos unos 25 nucleótidos y en las realizaciones más ventajosas de entre 25 y 40 nucleótidos. Esta invención incluye una mezcla de candidatos de la solución inicial que contenga al menos unos 10^{9} ácidos nucleicos, ventajosamente de al menos unos 10^{14} ácidos nucleicos. En particular, esta invención incluye soluciones que contengan una mezcla de entre 10^{9} y 10^{18} secuencias de ácidos nucleicos aproximadamente, que presenten una secuencia aleatorizada contigua de al menos unos 15 nucleótidos de longitud. En la realización ventajosa, la sección aleatorizada de las secuencias está flanqueada por secuencias fijas o conservadas, especialmente por aquellas que facilitan la amplificación de los ligandos. En el caso de un objetivo polimérico, como una proteína, la afinidad del ligando puede incrementarse aplicando SELEX a una mezcla de candidatos que comprenda una primera secuencia seleccionada y una segunda secuencia aleatoria. La secuencia del primer ligando seleccionado asociado por unión al objetivo, o de sus subporciones, puede introducirse en la porción aleatorizada de los ácidos nucleicos de una segunda mezcla de prueba. El proceso SELEX se repite con una segunda mezcla de prueba para aislar un segundo ligando de ácido nucleico, proporcionando dos secuencias seleccionadas para unirse al objetivo, que presenta una mayor fuerza de unión o mayor especificidad de unión en comparación con el primer ligando de ácido nucleico aislado. La secuencia del segundo ligando de ácido nucleico asociado por unión al objetivo puede entonces introducirse en la porción variable de los ácidos nucleicos de una tercera mezcla de prueba que, tras varios ciclos de SELEX, produce un tercer ligando de ácido nucleico. Estos procesos pueden repetirse hasta conseguirse el ligando de ácido nucleico con la fuerza de unión deseada o con la especificidad de unión deseada para la molécula objetivo. El proceso de selección y combinación iterativas de elementos de la secuencia de ácidos nucleicos que se unen a una molécula objetivo seleccionada se denomina aquí "andante", un término que implica la unión optimizada a otras áreas accesibles de la superficie o hendidura de la macromolécula objetivo, empezando por un primer dominio de unión. Al incrementar el área de contacto de unión entre el ligando y el objetivo se puede incrementar la constante de afinidad de la reacción de unión. Estos procesos andantes son particularmente útiles en el aislamiento de anticuerpos de ácido nucleico que son altamente específicos para unirse a una molécula objetivo en particular.
Una variante del proceso andante utiliza un ligando no ácido nucleico denominado "de anclaje" que se une a la molécula objetivo como primer dominio de unión. (Ver la Figura 9.) En principio, esta molécula de anclaje puede ser cualquier molécula que no sea un ácido nucleico, que se una a la molécula objetivo y que puede estar unida de forma covalente directa o indirectamente a un ácido nucleico. Cuando la molécula objetivo es una enzima, por ejemplo, la molécula de anclaje puede ser un inhibidor o un sustrato de dicha enzima. El anclaje también puede ser un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo específico para el objetivo. La molécula de anclaje se une de forma covalente a un oligómero de ácido nucleico de secuencia conocida para producir una molécula puente. El oligómero está ventajosamente comprendido por un mínimo de unas 3 a 10 bases. Se prepara entonces una mezcla de prueba de ácidos nucleicos candidatos que incluya una porción aleatorizada y una secuencia complementaria a la secuencia conocida de la molécula puente. La molécula puente forma un complejo con la molécula objetivo. Se aplica entonces SELEX a los ácidos nucleicos seleccionados que se unirán al complejo de la molécula puente y a la molécula objetivo. Se aislan los ligandos de ácido nucleico que se unen al complejo. Pueden aplicarse, entonces, procesos andantes como los descritos anteriormente para obtener ligandos de ácido nucleico con una mayor fuerza de unión o una mayor especificidad de unión al complejo. Los procesos andantes podrían utilizar las selecciones para la unión al complejo o al objetivo mismo. Este procedimiento es particularmente útil en el aislamiento de ligandos de ácido nucleico que se unen en un sitio particular de la molécula objetivo. La secuencia complementaria de la mezcla de prueba actúa garantizando el aislamiento de secuencias de ácidos nucleicos que se unan a la molécula objetivo en el sitio de unión de la molécula puente o cerca de él. Si la molécula puente deriva de un inhibidor de la molécula objetivo, es muy probable que este procedimiento genere un ligando de ácido nucleico que inhiba la función de la molécula objetivo. Es particularmente útil, por ejemplo, en el aislamiento de ácidos nucleicos que activan o inhiben la función de una proteína. La combinación de ligando y objetivo puede tener una nueva o mejorada función.
Los ligandos de ácido nucleico aquí descritos pueden contener una gran variedad de componentes de ligando. Como se ha descrito anteriormente, se puede considerar que los ligandos de ácido nucleico derivados de los procesos andantes tienen más de un componente de ligando de ácido nucleico. En esta invención también se describen anticuerpos de ácido nucleico que están construidos en base de los resultados obtenidos por SELEX, no siendo idénticos a los ligandos de ácido nucleico identificados por SELEX. Por ejemplo, puede construirse un anticuerpo de ácido nucleico en el que una amplia variedad de estructuras idénticas de ligando forman parte de un ácido nucleico único. En otra realización, SELEX permite identificar más de una familia de ligandos de ácido nucleico para un objetivo dado. En ese caso, se puede construir un único anticuerpo de ácido nucleico que contenga una amplia variedad de estructuras diferentes de ligando. Los experimentos de SELEX también se pueden llevar a cabo con estructuras fijas idénticas o diferentes de ligandos que se unan a través de regiones aleatorias de nucleótido y/o regiones de distancia variable entre las estructuras de ligando fijas para identificar los mejores anticuerpos de ácido nucleico.
Los procedimientos SELEX pueden combinarse fácilmente con cribados, selecciones o ensayos para determinar el efecto de la unión de un ligando de ácido nucleico en la función de la molécula objetivo. De manera específica, los cribados para la inhibición o activación de la actividad de una enzima se pueden combinar con los procedimientos SELEX.
En ejemplos más específicos, el procedimiento SELEX ofrece un medio rápido de aislamiento e identificación de ligandos de ácido nucleico que se unen a proteínas, incluyendo tanto proteínas que se unen a ácidos nucleicos como proteínas no conocidas por unirse a ácidos nucleicos como parte de su función biológica. Las proteínas que se unen a ácidos nucleicos incluyen, entre muchas otras, las polimerasas y transcriptasas inversas. Los procedimientos también se pueden aplicar con facilidad a proteínas que se unen a nucleótidos, nucleósidos, cofactores de nucleótidos y moléculas estructuralmente relacionadas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de, y/o medir la cantidad de, una molécula objetivo en una muestra, y dicho procedimiento utiliza un ligando de ácido nucleico que se puede aislar mediante los procedimientos que aquí se describen. La detección de la molécula objetivo se realiza mediante su unión a un ligando de ácido nucleico específico para dicha molécula objetivo. El ligando de ácido nucleico se puede marcar, por ejemplo, mediante radiación para permitir una detección cualitativa o cuantitativa. El procedimiento de detección es particularmente útil para moléculas objetivo que sean proteínas. El procedimiento es aún más útil en la detección de proteínas que no son conocidas por unirse a ácidos nucleicos como parte de su función biológica. Así, los ligandos de ácido nucleico de la presente invención se pueden emplear en diagnóstico de forma similar a los diagnósticos convencionales basados en anticuerpos. Una ventaja de los ligandos de ácido nucleico sobre los anticuerpos convencionales en dicho procedimiento de detección y diagnóstico es el hecho de que los ácidos nucleicos son capaces de amplificarse in vitro con facilidad, por ejemplo, utilizando procedimientos de amplificación por PCR o similares. Otra ventaja es que todo el proceso SELEX se lleva a cabo in vitro y no se precisa el uso de pruebas de inmunidad en animales. Además, la afinidad de unión de los ligandos de ácido nucleico se puede adaptar a las necesidades del usuario.
Los ligandos de ácido nucleico de moléculas objetivo pequeñas son útiles como reactivos en ensayos de diagnóstico y tienen usos terapéuticos como agentes secuestrantes, vehículos de entrega de medicamentos y modificadores de la acción hormonal. Los ácidos nucleicos catalíticos son productos seleccionables de esta invención. Por ejemplo, los ácidos nucleicos catalíticos se pueden seleccionar para la unión a análogos del estado de transición en una reacción catalizada por una enzima.
Y aún en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para modificar la función de una molécula objetivo utilizando ligandos de ácido nucleico que pueden aislarse mediante SELEX. Los ligandos de ácido nucleico que se unen a una molécula objetivo son cribados para poder seleccionar aquellos que modifican de forma específica la función de la molécula objetivo, por ejemplo, para seleccionar inhibidores o activadores de la función de la molécula objetivo. Una cantidad del ligando de ácido nucleico seleccionado que sea efectiva para modificar la función del objetivo se combina con la molécula objetivo para conseguir la modificación funcional deseada. Este procedimiento es particularmente aplicable a moléculas objetivo que sean proteínas. Una aplicación particularmente útil de este procedimiento es la de inhibir la función de proteínas, por ejemplo, para inhibir la unión de un receptor a un efector o para inhibir la catálisis de enzimas. En este caso, una cantidad de molécula del ácido nucleico seleccionado que sea efectiva para inhibir la proteína objetivo se combina con la proteína objetivo para conseguir la inhibición deseada.
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención es el de proporcionar un procedimiento que incluya la unión específica in vitro de un ligando de ácido nucleico a una molécula objetivo, en lugar de que se produzca la unión entre los ácidos nucleicos; en donde, cuando la molécula objetivo sea una proteína, será una proteína la que no se unirá a los ácidos nucleicos como parte de su función biológica y en donde el ligando de ácido nucleico habrá sido identificado mediante un proceso que comprende los pasos de:
(a) puesta en contacto de una mezcla de ácidos nucleicos con el objetivo bajo condiciones favorables de unión;
(b) separación de los ácidos nucleicos no unidos y de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a moléculas objetivo;
(c) disociación de los pares ácido nucleico-objetivo;
(d) amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los pares ácido nucleico-objetivo para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando;
(e) repetición de los pasos de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee,
para obtener el(los) ligando(s) que se unan de forma específica a la molécula objetivo.
En otro aspecto de la presente invención está la provisión del uso de un ligando de ácido nucleico para la fabricación de un agente terapéutico o de diagnóstico para un proceso terapéutico o de diagnóstico que involucre la unión específica in vivo del ligando a una molécula objetivo, en lugar de que se produzca la unión entre los ácidos nucleicos; en donde, cuando la molécula objetivo sea una proteína, será una proteína la que no se unirá a los ácidos nucleicos como parte de su función biológica, y en donde el ligando de ácido nucleico habrá sido identificado mediante un proceso que comprende los pasos de:
(a) puesta en contacto de una mezcla de ácidos nucleicos con el objetivo bajo condiciones favorables de unión;
(b) separación de los ácidos nucleicos no unidos y de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a moléculas objetivo;
(c) disociación de los pares ácido nucleico-objetivo;
(d) amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los pares ácido nucleico-objetivo para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando;
(e) repetición de los pasos de unión, separación, disociación y amplificación durante tantos ciclos como se desee,
para obtener el(los) ligando(s) que se unan de forma específica a la molécula objetivo.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama de la secuencia ribonucleótida de una porción del ARN mensajero del gen 43 que codifica la ADN polimerasa del bacteriófago T4. Se muestra la secuencia en la región conocida por unirse a gp43. Las letras mayúsculas en negrita indican la extensión de la información necesaria para la unión de gp43. El bucle de ocho pares de bases fue reemplazado por una secuencia aleatorizada para obtener una población candidata para SELEX.
La Figura 2 es un diagrama esquemático del proceso SELEX, usando como ejemplo la selección de variantes de secuencia de bucles de ARN que se unen a la ADN polimerasa de T4 (gp43). Se preparó una plantilla de ADN para la preparación de una mezcla de prueba de ARN, como se indica en el paso (a), mediante la ligación de los oligómeros 3, 4 y 5, cuyas secuencias se suministran en la Tabla 1 infra. Mediante la hibridación con los oligómeros 1 y 2 que presentan secuencias complementarias (suministradas en la Tabla 1) que puentean los oligómeros 3 y 4 y 4 y 5, respectivamente, se garantizó una ligación apropiada en el paso (a). La plantilla resultante de 110 bases de longitud se purificó por gel, se hibridó al oligómero 1 y se utilizó en las reacciones de transcripción in vitro (Miligan et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:8783-8798) para producir una mezcla inicial de ARN que contenía secuencias aleatorizadas del bucle de 8 bases, paso (b).
Los transcritos resultantes fueron purificados por gel y sometidos a selección con filtros de nitrocelulosa para su unión a gp43 (paso (c)), según se describe en el Ejemplo 1. Los ARN seleccionados fueron amplificados en un proceso de tres pasos: (d) se hicieron copias de ADNc de los ARN seleccionados mediante síntesis con transcriptasa inversa utilizando el oligómero 5 (Tabla 1) como cebador; (e) los ADNc fueron amplificados utilizando la ADN polimerasa Taq para prolongar la cadena del oligómero 1 (Tabla 1), que lleva secuencias esenciales del promotor T7, y oligómero 5 (Tabla 1) como se describe en Innis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436; y (f) los productos de amplificación de ADN de cadena doble fueron transcritos in vitro. Los ARN resultantes de la separación y amplificación se utilizaron en la siguiente ronda de selección.
La Figura 3 es una composición de autoradiografías de reacciones de secuenciación discontinua por electroforesis de los transcritos in vitro derivados de SELEX para la unión de variantes de bucle de ARN al gp43. La figura muestra el cambio en los componentes de la secuencia del bucle como una función del número de ciclos de selección (para 2, 3 y 4 ciclos) en las condiciones de selección del experimento B en el que la concentración de gp43 era de 3 x 10^{-8} M y la concentración de ARN era de 3 x 10^{-5} M aprox. en todos los ciclos de selección. La secuenciación se llevó a cabo como se describe en Gauss et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 206:24-34.
La Figura 4 es una composición de autoradiografías de una serie de secuencias de ARN de los ARN seleccionados en la cuarta ronda de amplificación de SELEX para la unión de variantes de bucle de ARN a gp43 utilizando diferentes condiciones de unión. En el experimento A, la concentración de gp43 era de 3 x 10^{-8} M y la concentración de ARN era de 3 x 10^{-7} M aprox. En el experimento B, la concentración de gp43 era de 3 x 10^{-8} M y la de ARN era de 3 x 10^{-5} M aprox. En el experimento C, la de gp43 era de 3 x 10^{-7} M y la de ARN era de 3 x 10^{-5} M aprox.
La Figura 5 es una composición de autoradiografías de tres geles de secuenciación para las variantes de bucle seleccionadas para unirse a gp43 bajo las condiciones de selección del experimento B (ver el Ejemplo 1). El gel de secuenciación de la izquierda es la secuenciación discontinua de los ARN seleccionados tras la cuarta ronda de selección/amplificación. Los geles de secuenciación central y derecho son geles de secuenciación de ADN de cadena doble de dos aislados clonales derivados de los ARN seleccionados. La serie de ARN seleccionada se compone de dos variantes mayoritarias, una de las cuales era la secuencia de tipo natural (gel de secuenciación central), y una secuencia nueva (gel de la derecha).
La Figura 6 es una gráfica del porcentaje de ARN unido a gp43 en función de la concentración de gp43 para diferentes variantes de secuencia de bucle de ARN seleccionadas y para ARN con una secuencia de bucle aleatorizada. La unión de la secuencia de bucle del tipo natural AAUAACUC se indica con círculos vacíos, línea continua; la secuencia de bucle de la variante mayoritaria AGCAACCU como "x", línea de puntos; la secuencia de bucle de la variante minoritaria AAUAACUU como cuadrados vacíos, línea continua; la secuencia de bucle de la variante minoritaria AAUGACUC como cruces, línea de puntos; la secuencia de bucle de la variante minoritaria AGCGACCU como círculos llenos, línea de puntos; y la unión de la mezcla aleatorizada (NNNNNNNN) de secuencias de bucle como círculos vacíos, línea de puntos.
La Figura 7 es un resumen gráfico de los resultados obtenidos tras cuatro rondas de SELEX para seleccionar un nuevo ARN que se una a gp43 entre una población candidata aleatorizada en el bucle de ocho pares de bases. SELEX no produjo el esperado consenso "aparente" de la serie de secuencias mostradas en la Figura 4, pero en cambio proporcionó el tipo natural y una única variante mayoritaria en proporciones casi iguales y tres mutantes únicos. Las frecuencias de cada especie de los veinte clones aislados se muestran junto con las constantes de afinidad aproximadas (Kd) para cada una, según se deriva de los ensayos de unión al filtro mostrados en la Figura 6.
La Figura 8 es una serie de diagramas que muestran la síntesis de ligandos de ácido nucleico candidatos utilizando la enzima transferasa terminal (TDT) y ADN polimerasa (ADN pol). Se proporciona una secuencia de cebador 5' o del ligando primario con una cola de secuencia aleatorizada mediante incubación con transferasa terminal en presencia de los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dNTP). El homopolímero de cola del segmento aleatorizado, utilizando la misma enzima en presencia de un único desoxinucleótido trifosfato (por ejemplo, dCTP) proporciona un sitio de hibridación para el cebador 3' con cola poli-G. Tras la hibridación, la molécula de cadena doble se completa por la acción de la ADN polimerasa. La mezcla puede amplificarse aún más, si se desea, mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
La Figura 9 es un diagrama que muestra un proceso que utiliza SELEX para seleccionar un gran ligando de ácido nucleico con dos interacciones de unión con una proteína objetivo espacialmente separadas. El proceso se denomina "andante", ya que incluye dos pasos, siendo el segundo una prolongación del primero. La parte superior de la figura representa un objetivo ("proteína de interés") con un ligando de ácido nucleico unido y seleccionado en una primera ronda de SELEX ("ligando primario evolucionado") unido a la proteína en un primer sitio de unión. Una reacción catalizada por transferasa terminal aumenta la longitud del ligando primario evolucionado y genera un nuevo conjunto de secuencias aleatorizadas candidatas que presentan una región conservada que contiene el ligando primario. En la parte inferior de la figura se representa el resultado de la segunda ronda de SELEX basada en la unión mejorada que resulta de la interacción del ligando secundario en el sitio de unión secundario de la proteína. Los términos "primario" y "secundario" son términos puramente operativos que no implican que uno tenga mayor afinidad que el otro.
Las Figuras 10 y 11 son diagramas de un proceso de selección utilizando SELEX en dos pasos. En la Figura 10, se aplica SELEX para seleccionar ligandos que se unan a sitios de unión secundarios en un objetivo que forma un complejo con un oligonucleótido puente conectado a un "binder" específico, por ejemplo, un inhibidor de la proteína objetivo. El oligonucleótido puente actúa como guía para favorecer la selección de ligandos que se unan a sitios de unión secundarios accesibles. En la Figura 11, se aplica un segundo SELEX para producir ligandos evolucionados que se unan a las posiciones secundarias originalmente seleccionadas y al dominio primario del objetivo. Los ácidos nucleicos así evolucionados se unirán muy firmemente y ellos mismos podrán actuar como inhibidores de la proteína objetivo o competir con inhibidores de sustratos de la molécula objetivo.
La Figura 12 muestra la secuencia y la localización de los oligómeros utilizados para construir la mezcla de candidatos utilizada en el Ejemplo 2. La línea superior muestra las secuencias de oligómeros 1b y 2b de izquierda a derecha respectivamente (ver Tabla 2 infra). La segunda línea muestra, de izquierda a derecha, las secuencias de oligómeros 3b, 4b y 5b (Tabla 2). La ligación apropiada de los oligómeros se garantizó mediante hibridación con los oligómeros 1b y 2b, cuyas secuencias son complementarias. La plantilla ligada resultante se purificó por gel, se hibridó al oligómero 1b y se utilizó en una reacción de transcripción in vitro (Miligan et al. (1987)) para producir una mezcla de candidatos de ARN, mostrada en la última línea de la figura, marcada como "transcrito in vitro." La mezcla de candidatos contenía, como se muestra, un segmento aleatorizado de 32 nucleótidos.
La Figura 13 muestra una secuencia hipotética de ARN que contiene una variedad de estructuras secundarias que se sabe que adopta el ARN . Entre ellas se incluyen: A bucles en horquilla, B protuberancias, C protuberancias asimétricas y D pseudonudos.
La Figura 14 muestra los ensayos de unión sobre filtro de nitrocelulosa para determinar la afinidad del ligando por HIV-RT. Se muestra el porcentaje del ARN de entrada que se une al filtro de nitrocelulosa con diferentes concentraciones de HIV-RT.
La Figura 15 muestra los ensayos adicionales de unión sobre filtro de nitrocelulosa para determinar la afinidad del ligando por HIV-RT.
La Figura 16 muestra la determinación del entorno de información para los ligandos 1.1 y 1.3a de HIV-1 RT a) determinación de la secuencia vecina de 3'. Los ARN fueron marcados en el extremo 5', sometidos a hidrólisis alcalina parcial y a selección con filtros de nitrocelulosa, separados en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 8% y autoradiografiados. Aproximadamente 90 picomoles de ARN marcado y 80 picomoles de HIV-1 RT se mezclaron en 0,5, 2,5 y 5 ml de tampón y se incubaron durante 5 minutos a 37ºC antes de lavar la mezcla a través del filtro de nitrocelulosa. Los ARN filtrados se muestran a las concentraciones finales de HIV-1 RT utilizadas en cada experimento. También se muestran los productos de una digestión parcial de ARNasa T1 que permite la identificación del entorno de información de la secuencia vecina, como se muestra mediante flechas b) determinación de la secuencia vecina de 5'. La secuencia vecina de 5' se determinó en a) bajo las mismas condiciones enumeradas anteriormente.
La Figura 17 muestra la inhibición del HIV-1 RT por el ligando 1.1 de ARN. Se realizaron una serie de diluciones de factor tres de la mezcla de candidatos de ARN 32 N y del ligando 1.1 de ARN con concentraciones finales de reacción que variaban desde 10 micromolar hasta 4.6 nanomolar y fueron premezcladas con HIV-RT e incubadas durante 5 minutos a 37ºC en 6 \muL de KOAc 200 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,7, ditiotreitol 10 mM, Mg(OAc)_{2} 6 mM y NTPS 0.4 mM. En un tubo diferente se mezclaron una plantilla de ARN (transcrita de un producto de PCR de un T7-1 obtenido por U.S. Biochemical Corp. utilizando los oligómeros 7 y 9) y el oligómero 9 marcado y la mezcla se calentó a 95ºC durante un minuto y se enfrió en hielo durante 15 minutos en Tris-HCl 10 mM, pH 7, EDTA 0.1 mM. Se añadieron 4 \mul de esta plantilla a cada 6 \mul de mezcla enzima-inhibidor para iniciar la reacción que se incubó durante 5 minutos más a 37ºC y posteriormente se detuvo la reacción. La concentración final de HIV-1 RT era de 16 nanomolar, la de la plantilla de ARN de 13 nanomolar y la del cebador marcado de 150 nanomolar para todas las reacciones. Se muestran los productos de prolongación para cada reacción.
La Figura 18 muestra una comparación de la inhibición de HIV-1 RT por el ligando 1.1 con respecto a los efectos en MMLV RT y AMV RT. Los experimentos de realizaron de forma similar a los de la Figura 17, excepto porque las disoluciones de factor 5 del inhibidor se prepararon, como se muestra, con las concentraciones resultantes. Las concentraciones de cada RT fueron normalizadas con respecto a la de HIV-RT mediante diluciones y comparación de la intensidad de banda del gel con azul Coomassie y tinción plateada, ensayos de concentración de proteína por bioradiación y ensayos de actividad.
La Figura 19 muestra las secuencias consenso de las horquillas seleccionadas que representan la solución del ligando de la cubierta proteica de R-17. La representación de los nucleótidos para cada posición se indica en los recuadros. La columna titulada "protuberancia" representa el número de clones con un nucleótido de hélice extra en uno o ambos lados del brazo entre los correspondientes pares de bases de la cadena. La columna titulada "final" representa el número de clones cuyas horquillas acaban en el par de bases previo.
La Figura 20 muestra la curva de unión de ARN 30N global para la bradiquinina. El análisis se realizó utilizando columnas de centrifugado; KOAc 10 mM, DEM 10 mM, pH 7.5; concentración de ARN de 1,5 x 10^{-8} M.
La Figura 21 muestra las plantillas utilizadas en la generación de mezclas de candidatos que están enriquecidas en ciertos motivos estructurales. La plantilla A se designa para el enriquecimiento en bucles en horquilla de la mezcla de candidatos. La plantilla B se designa para el enriquecimiento en pseudonudos de la mezcla de candidatos.
La Figura 22 es un diagrama esquemático de las disposiciones brazo-bucle para los Motivos I y II de la solución de ligando para la proteína Rev de HIV. Las líneas de puntos en los brazos 1 y 2 entre los bucles 1 y 3 indican los pares de bases potenciales.
La Figura 23 muestra las estructuras secundarias plegadas de los subdominios del ligando Rev de los aislados 6a, 1a y 8 para mostrar los motivos I, II y III, respectivamente. También se muestra el plegamiento previsto del ARN RRE de tipo natural para poder así realizar la comparación.
La Figura 24 es una gráfica del porcentaje del recuento de unidades de entrada unidas al filtro de nitrocelulosa con varias concentraciones de proteína Rev de HIV. También se muestran las curvas de unión de una población inicial 32N (#) y de la población obtenida tras 10 rondas (P) y de la secuencia RRE de tipo natural transcrita a partir de la plantilla compuesta de los oligómeros 8 y 9 (W).
La Figura 25 es una comparación de los ligandos Rev del Motivo I(a). Los parámetros son los mismos que en la Figura 24. También se incluye la curva de unión de la construcción "consenso" (c).
La Figura 26 es una comparación de los ligandos Rev del Motivo I(b). Los parámetros son los mismos que en la Figura 24.
La Figura 27 es una comparación de los ligandos Rev del Motivo II. Los parámetros son los mismos que en la Figura 24.
La Figura 28 es una comparación de los ligandos Rev del Motivo III. Los parámetros son los mismos que en la Figura 24.
La Figura 29 muestra la solución de ligandos de ácido nucleico consenso para la proteína Rev de HIV denominada Motivo I.
La Figura 30 muestra la solución de ligandos de ácido nucleico consenso para la proteína Rev de HIV denominada Motivo II.
La Figura 31 es una representación esquemática de un pseudonudo. El pseudonudo está formado por dos brazos y tres bucles, a los que aquí nos referimos como cadenas S1 y S2 y bucles 1, 2 y 3.
Descripción detallada de la invención
Los siguientes términos se utilizan aquí de acuerdo con las definiciones.
Ácido nucleico se refiere tanto ADN como ARN, de cadena simple o doble y cualquier modificación química de ellos, con la única condición de que la modificación química no interfiera en la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados. Estas modificaciones incluyen, aunque no están limitadas a, modificaciones en las aminas exocíclicas de la citosina, sustitución del 5-bromo-uracilo, modificaciones del esqueleto, metilaciones, combinaciones inusuales de pares de bases y similares.
Ligando se refiere a un ácido nucleico que se une a otra molécula (objetivo). En una población de ácidos nucleicos candidatos, un ligando es aquel que se une con una mayor afinidad que la de la población global. En una mezcla de candidatos puede existir más de un ligando para un objetivo dado. Los ligandos pueden diferir entre ellos en sus afinidades de unión por la molécula objetivo.
Mezcla de candidatos es una mezcla de ácidos nucleicos de secuencias diferentes, de la que se seleccionará el ligando deseado. La fuente de una mezcla de candidatos pueden ser ácidos nucleicos de la forma natural o fragmentos de éstos, ácidos nucleicos sintetizados químicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimáticamente o ácidos nucleicos obtenidos mediante una combinación de técnicas avanzadas.
Molécula objetivo se refiere a cualquier compuesto de interés para el cual se busca un ligando. Una molécula objetivo puede ser una proteína, péptido, carbohidrato, polisacárido, glicoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, sustrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, medicamento, colorante, nutriente, factor de crecimiento, etc., sin limitación.
Separación se refiere a cualquier proceso mediante el cual los ligandos unidos a las moléculas objetivo, aquí denominados pares ligando-objetivo, puedan ser separados de los ácidos nucleicos no unidos a moléculas objetivo. La separación se puede conseguir mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Los pares ácido nucleico-proteína pueden unirse a filtros de nitrocelulosa mientras que los ácidos nucleicos no unidos no lo hacen. Para la separación se pueden utilizar columnas que retengan de forma específica los pares ligando-objetivo (o que retengan de forma específica un ligando unido formando un complejo con un objetivo adjunto). También se puede utilizar la separación líquido-líquido, así como el retraso de filtración en gel y la centrifugación por gradiente de densidad. La elección del procedimiento de separación dependerá de las propiedades del objetivo y de los pares ligando-objetivo, y se puede realizar de acuerdo con los principios y propiedades conocidos por los expertos en la técnica.
Amplificación se refiere a cualquier proceso o combinación de pasos de procesos que incrementa la cantidad o el número de copias de una molécula o clase de moléculas. La amplificación de moléculas de ARN de los ejemplos revelados se realizó mediante una secuencia de tres reacciones: la obtención de copias de ADNc de los ARN seleccionados, el uso de la reacción en cadena de la polimerasa para incrementar el número de copias de cada ADNc y la transcripción de las copias de ADNc para obtener moléculas de ARN que tengan las mismas secuencias que los ARN seleccionados. Cualquier reacción o combinación de reacciones conocida en la técnica puede ser apropiada, incluyendo la replicación directa de ADN, la amplificación directa de ARN y similares, como será reconocido por los expertos en la técnica. El procedimiento de amplificación debe ser tal que las proporciones de la mezcla amplificada sean esencialmente representativas de las proporciones de las diferentes secuencias en la mezcla inicial.
Unión específica es un término que se define para cada caso en particular. En el contexto de una determinada interacción entre un ligando y un objetivo dados, se observa una interacción de unión del ligando y del objetivo con mayor afinidad que la interacción medida entre el objetivo y la mezcla de ligandos candidatos. Para poder comparar las afinidades de unión, las condiciones de ambas reacciones de unión deben ser las mismas y deben ser comparables a las condiciones que se pretenden utilizar. Para que las comparaciones sean más precisas, se realizarán medidas que reflejen la interacción entre el ligando como un todo y el objetivo como un todo. Los ligandos de ácido nucleico de la invención se pueden seleccionar para que sean tan específicos como sea necesario, ya sea mediante el establecimiento de las condiciones de selección que demanda el requisito de especificidad durante SELEX, como mediante la adaptación y modificación del ligando a través de una modificación "andante" y de otras modificaciones que utilicen interacciones de SELEX.
Aleatorizado es un término utilizado para describir un segmento de un ácido nucleico que contiene, en principio, cualquier secuencia posible por encima de una determinada longitud. Las secuencias aleatorizadas tendrán diferentes longitudes, según se desee, variando desde ocho hasta más de 100 nucleótidos. Las reacciones químicas o enzimáticas mediante las cuales se producen los segmentos de secuencias aleatorias pueden no producir secuencias matemáticamente aleatorias debido a la posible existencia de desviaciones desconocidas o a las preferencias del nucleótido. El término "aleatorizado" se utiliza en lugar de "aleatorio" para reflejar la posibilidad de que existan este tipo de desviaciones de la idealidad. En las técnicas actualmente conocidas, por ejemplo la síntesis química secuencial, no es conocido que se produzcan grandes desviaciones. Para segmentos cortos de 20 o menos nucleótidos, todas las desviaciones menores que pudieran existir tendrían consecuencias insignificantes. Cuanto mayor sea la secuencia de una síntesis única, mayor será el efecto de cualquier desviación.
Una desviación se puede introducir en una secuencia aleatoria de forma deliberada, por ejemplo, alterando las proporciones molares de los trifosfatos de nucleósido (o desoxinucleósido) precursores de la reacción de síntesis. Puede ser deseable introducir deliberadamente una desviación, por ejemplo, para aproximar las proporciones de las bases individuales en un organismo dado, o para influir en la estructura secundaria.
SELEXION se refiere al análisis matemático y a la simulación por ordenador utilizados para demostrar la poderosa capacidad de SELEX para identificar ligandos de ácido nucleico y para predecir qué variaciones del proceso SELEX tendrían un mayor impacto en la optimización del proceso. SELEXION es un acrónimo de Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment with Integrated Optimization by Nonlinear analysis (Evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial con optimización integrada por análisis no-lineal).
Anticuerpos de ácido nucleico es un término utilizado para referirse a una clase de ligandos de ácido nucleico que comprende estructuras o motivos discretos de ácido nucleico que se unen de forma selectiva a moléculas objetivo. Los anticuerpos de ácido nucleico pueden estar formados por ARN o ADN de cadena doble o simple. Los anticuerpos de ácido nucleico se sintetizan, y en una realización ventajosa se construyen, en base a una solución o soluciones de ligandos generados para un objetivo dado mediante el proceso SELEX.. En muchos casos, los anticuerpos de ácido nucleico de la presente invención no se producen de forma natural en la naturaleza, mientras que en otras situaciones pueden presentar una similitud significativa con una secuencia de ácidos nucleicos naturales.
Los anticuerpos de ácido nucleico de la presente invención incluyen todos los ácidos nucleicos que presenten una afinidad de unión específica para un objetivo, aunque no se incluyen los casos en los que el objetivo sea un polinucleótido que se une al ácido nucleico a través de un mecanismo que dependa fundamentalmente de un apareamiento de bases de Watson/Crick o de agentes de triple hélice (ver Riordan, M. et al. (1991) Nature 350:442-443); hay que tener en cuenta, no obstante, que cuando el anticuerpo de ácido nucleico es un ADN de cadena doble, el objetivo no es una proteína natural cuya función fisiológica dependa de la unión específica al ADN de cadena doble.
Motivos de ARN es un término que se utiliza generalmente para describir la estructura secundaria o terciaria de las moléculas de ARN. La secuencia primaria de un ARN es una cadena específica de nucleótidos (A, C, G o U) en una dimensión. La secuencia primaria no proporciona información en una primera impresión, como lo hace la configuración tridimensional del ARN, aunque es la secuencia primaria la que dicta la configuración tridimensional. En algunos casos, la solución de ligandos obtenida después de llevar a cabo SELEX para un objetivo dado puede estar mejor representada como una secuencia primaria. Aunque la información conformacional perteneciente a dicha solución de ligando no siempre se puede comprobar en base a los resultados obtenidos por SELEX, la representación de una solución de ligando como una secuencia primaria no debe ser interpretada como la negación de la existencia de una estructura terciaria integral.
La estructura secundaria de un motivo de ARN se representa mediante el contacto en dos dimensiones entre nucleótidos específicos. Los motivos de estructura secundaria más fácilmente reconocidos comprenden los pares de bases de Watson/Crick A:U y C:G. Se han reconocido pares de bases no-Watson/Crick, a menudo con menor estabilidad, e incluyen los pares G:U, A:C, G:A y U:U (los pares de bases se muestran una vez: en las moléculas de ARN, el par de bases X:Y por convención representa una secuencia en la que X es 5' a Y, aunque el par de bases Y:X también está permitido.) En la Figura 13 se muestra un conjunto de estructuras secundarias, unidas por regiones de cadena simple; la nomenclatura convencional para las estructuras secundarias incluye los bucles en horquilla, los bucles en horquilla protuberante asimétricos, los bucles en horquilla simétricos y los pseudonudos.
Cuando los nucleótidos que están separados en la secuencia primaria y que no son capaces de interaccionar a través de pares de bases Watson/Crick y de no-Watson/Crick están interaccionando, estas interacciones (que a menudo se representan en dos dimensiones) también forman parte de la estructura secundaria.
La estructura tridimensional de un motivo de ARN es simplemente la descripción en el espacio de sus átomos del motivo de ARN. El ARN de cadena doble, con sus bases completamente apareadas a través de apareamientos de Watson/Crick, presenta una estructura regular en tres dimensiones, aunque las posiciones exactas para todos los átomos del esqueleto helicoidal podrían depender de la secuencia exacta de bases del ARN. Existe una vasta bibliografía relativa a las estructuras secundarias de motivos de ARN y se cree que dichas estructuras secundarias que contienen pares de bases de Watson/Crick forman a menudo hélices de cadena doble en forma A.
Partiendo de las hélices en forma A, la estructura tridimensional se puede ampliar a los otros motivos en tres dimensiones. Los pares de bases no-Watson/Crick, bucles en horquilla, protuberancias y pseudonudos son estructuras construidas dentro de y sobre hélices. La construcción de estos motivos adicionales se describe de forma más detallada en el texto.
La estructura real de un ARN incluye todos los átomos de nucleótido de la molécula en tres dimensiones. Una estructura totalmente resuelta incluiría también las uniones con el agua y con átomos inorgánicos, aunque un investigador consigue raramente dicha resolución. Las estructuras tridimensionales de ARN resueltas incluirán todos los elementos de las estructuras secundarias (representados como estructuras tridimensionales) y las posiciones fijas de los átomos de nucleótidos no restringidas por los elementos de la estructura secundaria; debido al apilamiento de bases y a otras fuerzas, los extensos dominios de cadena simple pueden tener estructuras fijas.
Las secuencias primarias de ARN limitan las posibles estructuras tridimensionales, al igual que lo hacen las estructuras secundarias fijas. Las estructuras tridimensionales de un ARN están limitadas por los contactos específicos entre átomos en dos dimensiones, y están aún más limitadas por las minimizaciones de energía, la capacidad de una molécula para girar todos los enlaces alrededor de los cuales puede girar libremente de forma que la molécula resultante sea más estable que otros confórmeros que tengan la misma secuencia primaria y secundaria y la misma estructura.
Más importante aún, las moléculas de ARN presentan estructuras tridimensionales que comprenden una colección de motivos de ARN, incluyendo cualquier número de los motivos mostrados en la Figura 13.
Por lo tanto, los motivos de ARN incluyen todos las maneras en las que se pueden describir, en términos generales, los grupos más estables de conformaciones que puedan formar un compuesto de ácido nucleico. Para un objetivo dado, la solución de ligando y el anticuerpo de ácido nucleico pueden ser uno de los motivos de ARN aquí descritos o algunas combinaciones de diversos motivos de ARN.
Las soluciones de ligando se definen como la estructura tridimensional mantenida en común o como una familia que define los componentes conservados identificados por SELEX. Por ejemplo, los ligandos identificados para un objetivo particular pueden contener una secuencia primaria en común (NNNCGNAANUCGN'N'N), que se puede representar como una horquilla en dos dimensiones mediante:
1
La estructura tridimensional sería así insensible a la secuencia exacta de tres de los cinco pares de bases y de dos de los cinco nucleótidos del bucle, y sería un ligando apropiado para su uso posterior en todas o en la mayoría de las versiones de la secuencia/estructura. Así, las soluciones de ligandos deben representar una colección potencialmente grande de secuencias/estructuras apropiadas, cada una de ellas identificada por la descripción de familia que es inclusiva para todas las soluciones de secuencia/estructura exactas. En esta definición también se contempla que las soluciones de ligando necesarias no incluyan únicamente miembros con una equivalencia numérica exacta entre los diferentes componentes de un motivo de ARN. Algunos ligandos pueden tener bucles, por ejemplo, de cinco nucleótidos, mientras que otros ligandos para el mismo objetivo pueden contener un número menor o mayor de nucleótidos en el bucle equivalente y seguir siendo incluidos en la descripción de la solución de ligando.
Aunque la solución de ligandos derivada del proceso SELEX puede incluir un número relativamente grande de miembros potenciales, las soluciones de ligandos son específicas del objetivo y, en su mayoría, cada miembro de la familia de la solución de ligandos se puede utilizar como un anticuerpo de ácido nucleico para el objetivo. La selección de un miembro específico de una familia de soluciones de ligandos para ser utilizada como un anticuerpo de ácido nucleico que se puede fabricar como se describe en el texto y que puede estar influenciado por un cierto número de consideraciones prácticas que serían obvias para un experto en la técnica.
El procedimiento de la presente invención ha sido desarrollado en conexión con investigaciones sobre regulación translacional en la infección del bacteriófago T4. La autorregulación de la síntesis de ciertas proteínas virales, como la ADN polimerasa del bacteriófago T4 (gp43), implica la unión de la proteína a su propio mensaje, bloqueando su traducción. El procedimiento SELEX se utilizó para elucidar los requisitos de secuencia y estructura del sitio de unión del ARN gp43. SELEX permitió la selección rápida de las secuencias de unión ventajosas entre una población de secuencias de ácido nucleico aleatorias. Aunque como ejemplo se usa el aislamiento y la identificación de secuencias de ácido nucleico que se unen a proteínas conocidas por unirse a ARN, el procedimiento de la presente invención es aplicable en general a la selección de un ácido nucleico capaz de unirse a cualquier proteína dada. El procedimiento es aplicable a la selección de ácidos nucleicos que se unen a proteínas que no se unen (o no sean conocidas por unirse) a ácidos nucleicos como parte de su actividad natural o función biológica. El procedimiento SELEX no requiere el conocimiento de la estructura o secuencia de un sitio de unión ni el conocimiento de la estructura o secuencia de la proteína objetivo. El procedimiento no depende de la proteína objetivo purificada para las selecciones. En general, la aplicación de SELEX producirá un enriquecimiento en ligandos del objetivo más abundante. En el caso de una mezcla de ligandos, se dispone de técnicas para el aislamiento del ligando de un objetivo dado. Por ejemplo, se puede utilizar otro ligando (por ejemplo, un sustrato, inhibidor o anticuerpo) del objetivo deseado para que compita de forma específica en la unión al objetivo, de tal forma que el ligando de ácido nucleico deseado puede separarse de los ligandos de otros objetivos.
En la realización ventajosa, los ligandos derivados de SELEX comprenden secuencias de ARN de cadena simple. Un elemento crítico de esta invención es el hecho de que los actuales inventores sean capaces de sacar conclusiones sobre el ARN que sean contrarias a las comúnmente mantenidas en el campo, y que usen estas conclusiones para adaptar el proceso SELEX con el fin de conseguir anticuerpos de ácido nucleico derivados de soluciones de ligando.
En un principio, el ARN se consideraba un buen mensajero de información entre las secuencias de ADN, que son las secuencias de los genes y las proteínas que se encuentran en las enzimas y en otras proteínas. Desde los momentos posteriores a la descripción por parte de Watson y Crick de la estructura del ADN y de la conexión entre la secuencia del ADN y la secuencia de proteína, el procedimiento por el que se sintentizaban las proteínas se convirtió en el tema central de investigación de muchos bioquímicos experimentalistas. Con el tiempo, el ARN mensajero (ARNm) se reveló como el intermedio químico entre los genes y las proteínas. La mayoría de las especies de ARN presentes en los organismos son ARNm y, por lo tanto, el ARN continua considerándose como una molécula de información. El ARN desempeña su papel como molécula de información mayoritariamente a través de la secuencia primaria de nucleótidos, de la misma forma que el ADN desempeña su función como el material de los genes a través de la secuencia primaria de nucleótidos: así pues, la información de los ácidos nucleicos se puede representar en una dimensión.
A medida que la bioquímica comenzó a estudiar la expresión de los genes, se fueron descubrieron varias moléculas de ARN en el interior de las células con un papel que no era informativo. Se descubrió que los ribosomas eran las entidades sobre las cuales los ARNm se traducen en proteínas, y se descubrió que los ribosomas contenían ARN esencial (ARN ribosómico o ARNr). Durante muchos años, los ARNr fueron considerados como estructurales, una clase de entramado sobre la que se "colgaban" los componentes proteínicos del ribosoma para permitir que los componentes proteínicos del ribosoma realizaran la acción sintética de las proteínas del ribosoma. Además, se postularon e identificaron una gran clase de ARN, los ARN de transferencia (ARNt). Los ARNt son los adaptadores químicamente bifuncionales que reconocen codones en el ARNm y que contienen los aminoácidos que se condensan en la proteína. De forma más importante, aunque en 1974 se determinó la estructura de un ARNt mediante análisis de rayos X, se siguió considerando durante toda una década que los ARN eran fundamentalmente cadenas en una dimensión . Los ARNr ocuparon una extraña posición en la comunidad investigadora. Durante un largo periodo, casi nadie se apercibió del motivo de las profundas semejanzas de los ARNr de varias especies ni de la verdadera capacidad química de las moléculas de ARN. Varios investigadores postularon que el ARN podía haber desempeñado alguna vez un papel enzimático en lugar de informativo, pero estos postulados nunca se realizaron con la intención de predecir las actuales funciones del ARN.
El trabajo de Tom Cech sobre ribozimas, una nueva clase de moléculas de ARN, amplió el punto de vista de la capacidad funcional del ARN. Los intrones del grupo I son capaces de unirse de forma autocatalítica, de lo que se deduce que existe al menos una cierta catálisis en el rango de funciones del ARN. En este rango de catálisis se encuentra la actividad del componente de ARN de la ARNasa P, una actividad descubierta por Altman y Pace. Cech y Altman recibieron el Premio Nóbel de Química por su trabajo, que cambió de forma fundamental las limitaciones existentes de las moléculas de ARN a papeles informativos. Gracias a los trabajos de Cech y Altman, algunos creen ahora que los ARNr son el centro catalítico del ribosoma y ya no se considera que sean meramente estructurales.
Una premisa central de esta invención es que las moléculas de ARN siguen siendo menospreciadas por la comunidad investigadora en lo que respecta a su capacidad de unión y a otras capacidades. Mientras los ribozimas han hecho que aumente de forma remarcable el número de investigaciones destinadas a las funciones del ARN, la presente aplicación contempla que las posibles formas de las moléculas de ARN (y probablemente también de las de ADN) representan una oportunidad para el uso de SELEX para encontrar ARN que presente, virtualmente, cualquier función de unión. Se contempla, además, que el rango de funciones catalíticas posibles para los ARN es más amplia que la visión convencional, aunque no necesariamente tan amplia como el de las proteínas.
Las formas tridimensionales de algunos ARN se conocen directamente a partir de difracción de rayos X o por metodologías de RMN. Los datos que existen es este momento son escasos. Se han resuelto las estructuras de cuatro ARNt, así como las de tres moléculas de ARN más pequeñas: dos horquillas pequeñas y un pseudonudo pequeño. Los distintos ARNt, aunque relacionados, tienen elementos de estructura única: por ejemplo, las bases del anticodón del elongador de ARNt se disponen hacia el disolvente, mientras que las bases del anticodón de un iniciador de ARNt apuntan de forma más alejada del disolvente. Algunas de estas diferencias se pueden encontrar en las fuerzas de empaquetamiento de la red cristalina, pero otras son, sin duda, el resultado de la minimización energética idiosincrásica de diferentes secuencias de cadena simple en las estructuras secundarias y terciarias homólogas.
Las variaciones de secuencia son muy amplias. Si un bucle de cadena simple de una horquilla de ARN contiene ocho nucleótidos, el "espacio" de secuencia saturado comprende 65.536 secuencias diferentes. Aunque no está ligado a la teoría de esta afirmación, los inventores de esta invención creen que cada miembro de este conjunto tendrá, gracias a la minimización de energía, una estructura más estable, y que todas estas estructuras presentarán superficies químicas sutilmente distintas para el disolvente o para interacciones potenciales con moléculas objetivo como proteínas. Así, cuando las 65.536 secuencias con un motivo estructural específico fueron probadas frente a la ADN polimerasa del bacteriófago T4, dos secuencias del conjunto se unieron mejor que las otras. Esto sugiere que los aspectos estructurales de estas dos secuencias son especiales para dicho objetivo, y que las 65.534 secuencias restantes no son tan adecuadas para unirse al objetivo. Es casi seguro que entre estas 65.536 secuencias existen otros miembros individuales o conjuntos que podrían ser más adecuados para interaccionar con otros objetivos.
Un concepto clave en esta descripción de estructuras de ARN es que cada secuencia encontrará su estructura más estable, aunque los ARN se dibujan a menudo de forma tal que sugieren la existencia de una espiral aleatoria o de un elemento desestructurado y flexible. Los homopolímeros de ARN, incapaces de formar pares de bases de Watson/
Crick, se presentan a menudo en estructuras no aleatorias que se atribuyen a la ganancia de energía de apilamiento debido a la fijación de las posiciones de las bases adyacentes unas sobre otras. Las secuencias que incluyan claramente los cuatro nucleótidos pueden tener regiones locales de estructura fija e, incluso sin pares de bases de Watson/Crick, una secuencia no uniforme puede presentar más estructuras de las previstas inicialmente. El caso de las estructuras fijas en bucles de ARN es incluso más llamativo. Los bucles del anticodón de ARNt presentan una estructura, y forman, presumiblemente, las dos secuencias seleccionadas que mejor se unen a la ADN polimerasa de T4.
Las cadenas antiparalelas de la secuencia complementaria de ARN generan hélices de forma A, de las que salen y a las que retornan las secuencias de bucle. Incluso si las secuencias de bucle no presentan una gran capacidad de interacción, la minimización de la energía constituye una optimización de estructura energéticamente libre (es decir, no existen energías manifiestas de activación que bloqueen la minimización de energía de una secuencia de bucle). Un punto inicial cinéticamente probable para la optimización puede ser el par de bases que cierra el bucle de un brazo de ARN, que presenta una superficie plana sobre la cual se puede producir el apilamiento óptimo de los nucleótidos y las bases del bucle. En principio, los bucles de ARN son equivalentes a los bucles de proteína conectados de forma antiparalela a hélices alfa o cadenas beta. Aunque estos bucles de proteína se denominan frecuentemente espirales aleatorias, ni son espirales ni son aleatorias. Estos bucles se denominan estructuras "omega", reflejando que el bucle sale y retorna a posiciones relativamente cercanas entre sí (Ver Leszczynski, J. y Rose, G. et al. (1986) Science 234:849-855); estas posiciones de una proteína son conceptualmente equivalentes al par de bases que cierra el bucle de una horquilla de ARN.
Numerosas estructuras omega se han resuelto por difracción de rayos X y dichas estructuras son idiosincrásicas. Cada estructura es claramente el resultado de una minimización de energía única realizada sobre un bucle con los extremos cerrados el uno sobre el otro. Tanto en proteínas como en ARN, estos bucles minimizarán la energía sin utilizar la información del resto de la estructura excepto, en una primera aproximación, la del par de aminoácidos o par de bases que cierra el bucle. En los bucles omega de proteínas y en los bucles en horquilla de ARN, todos los enlaces con rotación libre participarán en el intento de minimizar la energía libre. Parece que el ARN responderá mejor a la electrostática que las proteínas, mientras que las proteínas tendrán muchos más grados de libertad que los ARN. Así, los cálculos de las estructuras de ARN a través de la minimización energética generarán, muy probablemente, estructuras precisas en solución que serán comparables a las de los cálculos para proteínas.
Las regiones de cadena simple de los ARN y de las proteínas pueden mantenerse de forma que amplíen la posible estructura. Es decir, si un bucle de cadena simple sale y retorna a una estructura de proteína de cadenas paralelas de hélice alfa o cadena beta, los puntos de salida y retorno están más alejados uno de otro que los de las estructuras omega. Por tanto, la distancia que abarca la cadena simple de péptido puede variar en función de las longitudes de la hélice alfa paralela o de la cadena beta.
Para aquellas estructuras de proteína en las que la cadena simple descanse sobre una estructura secundaria fija de proteína, la minimización energética resultante podría, en principio, permitir interacciones entre el dominio de cadena simple y la estructura subyacente. Es probable que las cadenas laterales de aminoácidos, que pueden formar puentes salinos en las estructuras secundarias, puedan hacer lo mismo en cadenas simple extendidas que se encuentren en la parte superior de estructuras secundarias regulares. Así, las estructuras exactas de dichas regiones de la proteína serán nuevamente idiosincrásicas y mucho más dependientes de la secuencia. En este caso, la dependencia de la secuencia incluirá tanto a la cadena simple como a la secuencia subyacente de la estructura secundaria.
De forma interesante, una estructura de ARN conocida como pseudonudo es análoga a estos motivos de proteína extendidos y puede servir para mostrar cadenas simples ampliadas de ARN dispuestas hacia el disolvente o hacia moléculas objetivo cuyas bases están dispuestas de forma idiosincrásica hacia el disolvente/objetivo o hacia una estructura secundaria de ARN subyacente. Los pseudonudos tienen, al igual que los motivos de proteínas basados en bucles entre cadenas paralelas, la capacidad de alterar la longitud de la cadena simple y la secuencia de la hélice sobre la que descansan.
Así, de forma exactamente igual a como sucede en los motivos de proteínas, y mediante covariación con secuencias de la estructura secundaria subyacente, es posible mostrar nucleótidos de cadena simple y bases dispuestas hacia el disolvente o hacia la estructura subyacente, alterando así la electrostática y los grupos químicos funcionales que están interaccionando con los objetivos. Es importante notar que estas variaciones de estructura son posteriores a las minimizaciones de energía, pero sólo se conoce una estructura de pseudonudo, aunque de baja resolución. No obstante, el valor de esta Invención proviene del reconocimiento de que la forma y las visualizaciones funcionales posibles de los pseudonudos son casi infinitas en cualidades únicas.
Tanto los bucles en horquilla como los dominios de cadena simple de los pseudonudos se construyen sobre hélices de ARN antiparalelas. Las hélices de ARN pueden contener irregularidades, llamadas protuberancias. Las protuberancias pueden existir en una cadena de la hélice o en ambas, y proporcionarán propiedades estructurales idiosincrásicas útiles para el reconocimiento de la molécula objetivo. De forma adicional, las irregularidades de las hélices pueden generar conexiones angulares entre las hélices regulares.
Una gran protuberancia (ver Figura 13) en una cadena de ARN puede ser comparable a los bucles en horquilla, excepto porque el par de bases que cierra el bucle es substituido por los dos pares de bases que flanquean la protuberancia.
Las protuberancias asimétricas (ver Figura 13) pueden generar una estructura irregular y elongada que se estabiliza mediante contactos entre nucleótidos a través de la protuberancia. Estos contactos pueden incluir interacciones de Watson/Crick o muchas otras disposiciones estabilizadoras, incluyendo otros enlaces de hidrógeno y apilamiento de bases.
Finalmente, cuando se observan formas o motivos fijos de ARN, resulta instructivo considerar que existen diferencias sustanciales entre el ARN y las proteínas. Aunque se cree que las proteínas han desplazado al ARN durante la evolución, debido a que sus actividades se realizan actualmente de forma casi completa por proteínas y péptidos, incluyendo la catálisis y el reconocimiento altamente específico, se cree que las propiedades químicas de las proteínas son más útiles que las del ARN para la construcción de formas variables y para las actividades. El razonamiento estándar incluye la existencia de 20 aminoácidos frente a sólo cuatro nucleótidos, las cualidades fuertemente iónicas de la lisina, arginina, ácido aspártico y ácido glutámico que no tienen su equivalente en las bases de ARN, la neutralidad relativa del esqueleto de péptidos en comparación con el fuertemente negativo esqueleto de azúcar-fosfato de los ácidos nucleicos, la existencia de la histidina con un pK cercano a la neutralidad, el hecho que las cadenas laterales de los aminoácidos se disponen hacia el disolvente en las hélices alfa y en las cadenas beta, y las regulares estructuras secundarias de las proteínas. En los ácidos nucleicos de cadena doble, incluyendo el ARN, los pares de bases se disponen unos frente a otros y utilizan mucha de la información química presente a nivel monodimensional. Así, desde todos los puntos de vista admitidos en la actualidad como contribuyentes a la diversidad de forma y función, se cree que las proteínas son químicamente muy superiores a los ácidos nucleicos, incluyendo el ARN. Durante la evolución, las proteínas han sido escogidas para realizar el reconocimiento y la catálisis en detrimento del ARN, lo cual apoya el actual y ampliamente sostenido punto de vista.
Contrariamente, y como parte central de esta Invención, el amplio número de secuencias y formas posibles para el ARN permite concebir, en especial con secuencias nunca probadas durante la historia de la evolución, todas las funciones y afinidades de unión deseadas, incluso a pesar de que ARN esté formado por sólo cuatro nucleótidos e incluso a pesar de que el esqueleto de un ARN esté tan altamente cargado. Así pues, los motivos de ARN descritos anteriormente, con especificaciones de secuencia apropiadas, producirán aquellas funciones químicas necesarias para proporcionar un unión firme y específica para la mayoría de los objetivos. Se puede sugerir que el ARN es tan versátil como el sistema inmunológico. Es decir, mientras el sistema inmunológico se ajusta perfectamente a cualquier objetivo deseado, el ARN ofrece estas mismas oportunidades. El procedimiento aquí descrito permite utilizar 10^{18} secuencias, y por tanto intentar crear un amplio número de estructuras tales que cualquier ventaja intrínseca que puedan tener las proteínas o, de forma más específica, los anticuerpos, sobre el ARN queden compensadas por la amplitud del "conjunto" de posibilidades de donde se escogerán los ligandos de ARN. Además, con el uso de nucleótidos modificados, puede utilizarse un ARN que presente intrínsicamente más variación química que los ARN naturales.
El procedimiento SELEX conlleva la combinación de una selección de ligandos de ácido nucleico que se unan a una molécula objetivo, por ejemplo una proteína, con amplificación de dichos ácidos nucleicos seleccionados. La repetición de los pasos de selección/amplificación permite seleccionar uno o un pequeño número de ácidos nucleicos que se unan más firmemente al objetivo entre un conjunto que contiene un gran número de ácidos nucleicos.
El proceso de repetición de los ciclos de selección/amplificación continúa hasta que se alcanza el objetivo seleccionado. Por ejemplo, la repetición de los ciclos puede continuarse hasta que se consigue el nivel deseado de unión de los ácidos nucleicos en la mezcla de prueba o hasta que se obtiene un número mínimo de componentes de ácido nucleico de la mezcla (en el último caso, hasta que queda una única especie en la mezcla de prueba). En muchos casos, será deseable continuar con la repetición de los ciclos hasta que no se consiga una mejora en la unión. Puede darse el caso de que ciertas mezclas de prueba de ácidos nucleicos muestren una mejora limitada en la capacidad de unión sobre los niveles de fondo durante los ciclos de selección/amplificación. En dichos casos, se debe incrementar la variación de la secuencia en la mezcla de prueba, incluyendo más posibles variantes de secuencia, o se debe incrementar la longitud de la región aleatorizada de la secuencia hasta que se consiga mejorar la capacidad de unión. También se pueden utilizar protocolos de anclaje y/o técnicas andantes.
De manera específica, el procedimiento precisa la preparación inicial de una mezcla de prueba de ácidos nucleicos candidatos. Los ácidos nucleicos de prueba individuales pueden contener una región aleatorizada flanqueada por secuencias conservadas en todos los ácidos nucleicos de la mezcla. Las regiones conservadas se incluyen para facilitar la amplificación o selección de ácidos nucleicos. Debido a la numerosas secuencias conocidas en la técnica, la elección de la secuencia es algo que pueden realizar los expertos en la técnica, teniendo en cuenta el procedimiento deseado de amplificación. La región aleatorizada puede presentar una secuencia parcial o totalmente aleatorizada. De forma alternativa, esta porción del ácido nucleico puede contener subporciones que estén aleatorizadas, además de subporciones que se mantengan constantes en todas las especies de ácido nucleico de la mezcla. Por ejemplo, regiones de secuencia conocidas por unirse, o seleccionadas para unirse, a la proteína objetivo se pueden integrar con regiones aleatorizadas para así conseguir una mejora en la unión o en la especificidad de unión. La variabilidad de la secuencia en la mezcla de prueba también se puede introducir o aumentar mediante la generación de mutaciones en los ácidos nucleicos de la mezcla de prueba durante el proceso de selección/amplificación. En principio, los ácidos nucleicos utilizados en la mezcla de prueba pueden tener cualquier longitud, siempre y cuando puedan ser amplificados. El procedimiento de la presente invención se utiliza de la forma más práctica para seleccionar entre un gran número de variantes de secuencia. Así, se contempla que el presente procedimiento se empleará ventajosamente para evaluar la capacidad de unión de secuencias de ácido nucleico con una longitud que abarque desde cuatro bases hasta cualquier tamaño realizable.
La porción aleatorizada de los ácidos nucleicos en la mezcla de prueba se puede obtener de varias formas. Por ejemplo, la aleatorización completa o parcial de la secuencia se puede conseguir fácilmente mediante la síntesis química directa de ácidos nucleicos (o de porciones de ellos) o mediante la síntesis de una plantilla a partir de la cual se puedan preparar los ácidos nucleicos (o porciones de ellos) mediante el uso de las enzimas apropiadas. La adición final, catalizada por transferasa terminal en presencia de concentraciones no limitadas de los cuatro nucleótidos trifosfato, puede añadir una secuencia aleatorizada a un segmento. La variabilidad en la secuencia de prueba de los ácidos nucleicos también se puede conseguir utilizando fragmentos de tamaño seleccionado de preparaciones de ácidos nucleicos grandes y naturales parcialmente digeridos (o de algún modo cortados) como sucede en las preparaciones de ADN genómico o preparaciones de ARN celular. En aquellos casos en que se utilice una secuencia aleatorizada, no es necesario (o posible para segmentos aleatorizados largos) que la muestra de prueba contenga todas las variantes de secuencia posibles. En general, será ventajoso que la muestra de prueba contenga el máximo número de variantes de secuencia posibles siempre que resulte práctico para la selección, con el fin de garantizar la identificación de un número máximo de secuencias de unión potenciales. Una secuencia aleatorizada de 30 nucleótidos contendrá teóricamente 10^{18} secuencias candidatas diferentes. Por una cuestión práctica, es conveniente probar únicamente aprox. 10^{18} candidatos en una única selección. Las consideraciones practicas incluyen el número de plantillas de la columna de síntesis de ADN y la solubilidad del ARN y del objetivo en la solución. (Por supuesto, no existe un límite teórico para el número de secuencias en la mezcla de candidatos.) Por lo tanto, las mezclas de candidatos que poseen segmentos aleatorizados con longitud superior a 30 contienen demasiadas secuencias posibles para que todas puedan ser convenientemente probadas en una selección. No es necesario probar todas las secuencias posibles de una mezcla de candidatos para seleccionar un ligando de ácido nucleico de la invención. Es esencial para el procedimiento que los ácidos nucleicos de la mezcla de prueba puedan ser amplificados. Así, resulta ventajoso que las regiones conservadas utilizadas en los ácidos nucleicos de prueba no contengan secuencias que interfieran en el proceso de amplificación.
Los distintos motivos de ARN descritos anteriormente se pueden definir casi siempre con un polinucleótido que contiene unos 30 nucleótidos. Debido a las restricciones físicas del proceso SELEX, una mezcla aleatorizada que contenga unos 30 nucleótidos es también el segmento aleatorizado contiguo más largo que se puede utilizar, siempre que se puedan probar 25 de las variantes potenciales. Por tanto, una realización ventajosa de esta invención, cuando se utiliza una mezcla de candidatos con una región aleatorizada contigua, es utilizar una secuencia aleatorizada de al menos 15 nucleótidos y que contenga al menos unos 10^{9} ácidos nucleicos, y en la realización más ventajosa que contenga al menos 25 nucleótidos.
Esta invención incluye mezclas de candidatos que contienen todas las variaciones posibles de un segmento aleatorizado contiguo de al menos 15 nucleótidos. Cada miembro individual de la mezcla de candidatos también puede comprender 30 secuencias fijas flanqueando al segmento aleatorizado para facilitar el proceso de amplificación de las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas.
Las mezclas de candidatos también se pueden preparar conteniendo tanto secuencias aleatorizadas como secuencias fijas, en donde las secuencias fijas tengan otra función además de la de facilitar el proceso de amplificación. En una realización de la invención, se pueden seleccionar las secuencias fijas de una mezcla de candidatos para aumentar el porcentaje de ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos que posee un determinado motivo de ácido nucleico o estructura terciaria. Por ejemplo, la incorporación de los nucleótidos fijos apropiados permitirá incrementar el porcentaje de pseudonudos o bucles en horquilla en una mezcla de candidatos. Una mezcla de candidatos que haya sido preparada incluyendo secuencias fijas que aumenten el porcentaje de un determinado motivo estructural de ácido nucleico es, por lo tanto, una parte de esta invención. Un experto en la técnica será capaz de construir dicha mezcla de candidatos, sin experimentación indebida, mediante una inspección rutinaria de una variedad de anticuerpos nucleicos como los aquí descritos. Los Ejemplos 2 y 8 describen más adelante ejemplos de mezclas de candidatos diseñadas para maximizar los motivos de ARN ventajosos.
Las mezclas de candidatos que contengan varias secuencias fijas o que utilicen una secuencia parcialmente aleatorizada también se puede utilizar tras la obtención mediante SELEX de una solución de ligando o una solución de ligando parcial. Un nuevo proceso SELEX puede entonces iniciarse con una mezcla de candidatos conociendo la información de la solución de ligando.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un ejemplo de procedimiento empleado para amplificar ácidos nucleicos. Se han encontrado descripciones de procedimientos PCR, por ejemplo, en Saiki et al. (1985) Science 230:1350-1354; Saiki et al. (1986) Nature 324:163-166; Scharf et al. (1986) Science 233:1076-1078; Innis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9436-9440; y en las Patentes USA 4.683.195 (Mullis et al.) y 4.683.202 (Mullis et al.). En su forma básica, la amplificación PCR implica repetidos ciclos de replicación de un ADN de cadena simple deseado (o ADNc copia de un ARN) utilizando cebadores específicos de oligonucleótidos complementarios a los extremos 3' y 5' del ADNmc, prolongación del cebador con una ADN polimerasa y desnaturalización del ADN. Los productos generados mediante prolongación de un cebador sirven como plantillas en la prolongación del otro cebador. Un procedimiento relacionado de amplificación descrito en la aplicación PCT publicada WO 89/01050 (Burg et al.) requiere la presencia o introducción secuencia arriba de una secuencia promotora que hay que amplificar, para obtener un intermedio de cadena doble. A continuación, se generan múltiples copias de ARN del promotor de cadena doble que contiene el intermedio utilizando la ARN polimerasa. Las copias de ARN resultantes se tratan con transcriptasa inversa para generar un nuevo promotor de cadena doble que contiene los intermedios que se pueden entonces someter a otra ronda de amplificación con ARN polimerasa. Entre los procedimientos alternativos de amplificación se incluyen, entre otros, la clonación de copias seleccionadas de ADN o ADNc de ARN seleccionados en un vector apropiado y la introducción de dicho vector en un organismo huésped en donde el vector y el ADN clonado se repliquen y amplifiquen (Guatelli, J.C. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:1874). En general, en el procedimiento de la presente invención se puede utilizar cualquier medio que permita una amplificación fiable y eficaz de las secuencias de ácido nucleico seleccionadas. Sólo es necesario que la representación proporcional de las secuencias tras la amplificación refleje, al menos de forma somera, las proporciones relativas de las secuencias que existían en la mezcla antes de la amplificación.
Los procedimientos específicos para amplificar ARN aquí descritos se basan en Innis et al. (1988) supra. Las moléculas de ARN y las moléculas objetivo de la mezcla de prueba se diseñaron para proporcionar, tras la amplificación y la PCR, secuencias del promotor esencial de T7 en sus porciones 5'. Las copias de ADNc de longitud total de las moléculas de ARN seleccionadas se realizaron utilizando transcriptasa inversa cebada con un oligómero complementario a las secuencias 3' de los ARN seleccionados. Los ADNc resultantes se amplificaron mediante prolongación de la cadena con ADN polimerasa Taq, proporcionando las secuencias del promotor de T7 en los ADN seleccionados. Los productos de cadena doble de este proceso de amplificación se transcribieron in vitro. Los transcritos se utilizaron en el siguiente ciclo de selección/amplificación. El procedimiento puede incluir, de forma opcional, pasos apropiados de purificación de ácidos nucleicos.
En general, en el procedimiento de la presente invención se puede utilizar cualquier protocolo que permita la selección de ácidos nucleicos en base a su capacidad para unirse de forma específica a otra molécula, por ejemplo, una proteína o, en el caso más general, cualquier molécula objetivo. Sólo es necesario que la selección separe los ácidos nucleicos sean capaces de ser amplificados. Por ejemplo, una selección por unión a filtro, como la descrita en el Ejemplo 1, en la que una mezcla de prueba de los ácidos nucleicos es incubada con una proteína objetivo, la mezcla ácido nucleico/proteína es entonces filtrada a través de un filtro de nitrocelulosa y lavada con el tampón apropiado para eliminar los ácidos nucleicos libres. Los complejos proteína/ácido nucleico permanecen, a menudo, unidos al filtro. Las concentraciones relativas de proteína y ácido nucleico prueba en la mezcla incubada influye en la fuerza de unión por la que ha sido seleccionada. Cuando el ácido nucleico se encuentra en exceso, se produce una competencia por los sitios de unión accesibles y se seleccionan aquellos ácidos nucleicos que se unen más firmemente. Contrariamente, cuando se utiliza un exceso de proteína, cabe esperar que se seleccionará cualquier ácido nucleico que se una a la proteína. Las concentraciones relativas de proteína con respecto al ácido nucleico utilizadas para conseguir la selección deseada dependerán del tipo de proteína, de la fuerza de la interacción de unión y del nivel de cualquier unión de fondo que se encuentre presente. Las concentraciones relativas necesarias para conseguir el resultado de la selección deseado se pueden determinar fácilmente de forma empírica sin necesidad de experimentación indebida. De forma similar, puede ser necesario optimizar el proceso de lavado del filtro para minimizar las uniones de fondo. Una vez más, esta optimización de los procesos de lavado del filtro se encuentra dentro de las técnicas de uso del experto ordinario.
Los inventores de la presente invención han utilizado una evaluación matemática de SELEX, a la que se refieren como SELEXION. El Anexo A de esta aplicación incluye una breve revisión del análisis matemático utilizado para obtener generalizaciones relativas a SELEX derivadas de SELEXION.
Las generalizaciones obtenidas a partir de SELEXION son las siguientes: 1) La probabilidad de recuperar el ARN que presenta una unión más firme en cada ronda de SELEX aumenta con el número de moléculas presente, con su unión ventajosa respecto al global del conjunto de ARN, y con la cantidad total de proteína utilizada. A pesar de que no siempre resulta intuitivamente evidente saber por adelantado cómo maximizar la diferencia de unión, la probabilidad de recuperar el ARN con una unión más firme se puede incrementar maximizando el número de moléculas de ARN y el número de moléculas objetivo muestreadas; 2) las concentraciones ideales de ácido nucleico y proteína a usar en varias rondas de SELEX dependen de distintos factores. Los parámetros experimentales sugeridos por SELEXION son análogos a los utilizados en los Ejemplos aquí mostrados. Por ejemplo, cuando la afinidad relativa de la solución del ligando final no es conocida, algo que sucederá de forma casi inevitable cuando se lleve a cabo SELEX, es ventajoso que las concentraciones de la mezcla de candidatos de proteína y ácido nucleico se seleccionen de forma tal que proporcionen la unión entre el 3 y el 7 por ciento aproximadamente del total de ácidos nucleicos con la proteína objetivo. Utilizando este criterio, cabe esperar que se conseguirá un enriquecimiento entre diez y veinte veces superior en ligandos de alta afinidad en cada ronda de SELEX.
Las condiciones experimentales utilizadas para seleccionar los ligandos de ácido nucleico para varios objetivos en la realización ventajosa se seleccionarán de manera tal que se reproduzca el entorno que encontraría el objetivo in vivo. El Ejemplo 10 siguiente indica cómo afectará el cambio en las condiciones de selección a la solución de ligando recibida para un objetivo en particular. Aunque la solución de ligando para NGF presentaba similitudes significativas bajo condiciones de alta y baja salinidad, se observaron ciertas diferencias. Las condiciones ajustables que se pueden alterar para reproducir con mayor precisión el entorno in vivo del objetivo incluyen, pero no están limitadas a, la fuerza iónica total, la concentración de cationes bivalentes y el pH de la solución. Un experto en la técnica sería capaz de seleccionar fácilmente las condiciones apropiadas de separación basándose en el conocimiento del objetivo
dado.
Para poder proceder al paso de amplificación, los ácidos nucleicos seleccionados se deben liberar del objetivo tras la separación. Este proceso se debe realizar sin que se produzca degradación química de los ácidos nucleicos seleccionados y se deben generar ácidos nucleicos amplificables. En una realización específica, las moléculas de ARN seleccionadas fueron eluídas de los filtros de nitrocelulosa utilizando una solución recién preparada que contenía 200 \mul de urea 7 M, citrato sódico 20 mM (pH 5,0), una solución 1 mM en EDTA combinada con 500 \mul de fenol (equilibrado con acetato sódico 0,1 M, pH 5,2). Se ha utilizado con éxito una solución de 200 \mul de urea 7 M con 500 \mul de fenol. A continuación, se extrajo con éter la solución eluída del ARN seleccionado, se precipitó en etanol y el precipitado se resuspendió en agua. Para la elución del ARN seleccionado de los filtros se pueden utilizar un cierto número de diferentes condiciones tampón. Por ejemplo, se pueden utilizar sin limitación agentes acuosos no detergentes desnaturalizantes de proteínas conocidos en la técnica, como el cloruro de guanidinio, el tiocianato de guanidinio, etc. La solución específica utilizada para la elución de los ácidos nucleicos del filtro puede ser seleccionada de forma rutinaria por un experto en la técnica.
En la técnica se dispone de protocolos de separación alternativos para separar los ácidos nucleicos unidos a los objetivos, particularmente proteínas. Por ejemplo, la unión y la separación se pueden llevar a cabo mediante el paso de la mezcla de prueba de ácidos nucleicos a través de una columna que contenga la molécula objetivo unida a un material de soporte sólido. Aquellos ácidos nucleicos que se unan al objetivo quedarán retenidos en la columna, mientras que los ácidos nucleicos no unidos se podrán extraer de la columna mediante lavado.
Durante esta aplicación, el proceso SELEX se ha definido como un proceso iterativo en el que se repiten los pasos de selección y amplificación hasta que se consigue la selectividad deseada. En una realización de la invención, el proceso de selección puede ser suficientemente efectivo como para proporcionar una solución de ligando tras un único paso de separación. Por ejemplo, en teoría, una columna que contenga el objetivo y a través de la cual se introduzca la mezcla candidata, bajo las condiciones apropiadas y con una columna suficientemente larga, debe ser capaz de separar los ácidos nucleicos en base a su afinidad por el objetivo de forma suficiente para obtener una solución de ligando. Si se llega al punto de que el paso original de selección es suficientemente selectivo como para proporcionar una solución de ligando tras un único paso, semejante proceso también será incluido en el alcance de esta invención.
En una realización, SELEX se realiza de forma iterativa hasta que en la mezcla candidata posterior a la amplificación quede un único ligando de ácido nucleico o un número discreto de ellos. En dichos casos, la solución de ligando se representará como una única secuencia de ácido nucleico y no incluirá una familia de secuencias que presenten afinidades de unión comparables a las del objetivo.
En una realización alternativa de la invención, las iteraciones de SELEX finalizan en el momento en que la mezcla de candidatos se ha enriquecido en ligandos de ácido nucleico de mayor afinidad de unión, pero todavía contiene un número relativamente grande de secuencias distintas. Este momento puede ser determinado por un experto en la técnica mediante el análisis periódico de secuencias no aleatorias de la mezcla global de candidatos o mediante ensayos de afinidad global por el objetivo.
En ese momento, se termina SELEX, y se preparan y secuencian los clones. Por supuesto, el número de clones que se pueden secuenciar es casi ilimitado. Sin embargo, como se observa en los Ejemplos siguientes, una vez secuenciados entre 20 y 50 clones suele ser posible la detección de las secuencias más predominantes y la definición de las características de la solución de ligando. En un ejemplo hipotético, tras clonar 30 secuencias se observará que 6 secuencias son idénticas, mientras que ciertas porciones de secuencia de 20 de las secuencias restantes están muy relacionadas con secuencias incluidas en la secuencia "ganadora". Aunque la secuencia más predominante se pueda considerar como una solución de ligando para el objetivo, a menudo es más apropiado construir o describir una solución de ligando que consista en una familia de secuencias que incluya las características comunes de muchas de las secuencias clonadas.
En un ejemplo adicional, una solución de ligando que se representa como una familia de secuencias que poseen un cierto número de características de definición (por ejemplo, cuando la solución de ligando es AAGUNN
GUNNCNNNN, en donde N puede ser aparentemente cualquiera de los cuatro nucleótidos) se puede utilizar para iniciar un proceso SELEX adicional. En esta realización, la mezcla de candidatos se compondría de nucleótidos parcialmente fijos y parcialmente aleatorios, con los nucleótidos fijos siendo seleccionados en base a la solución de ligando obtenida en el proceso SELEX inicial. De esta forma, si existe una única secuencia de nucleótidos que se una más firmemente que los otros miembros de la familia de solución de ligandos, será rápidamente identificada.
En una realización alternativa, también se utiliza un segundo experimento SELEX basado en la solución de ligandos obtenida en un proceso SELEX. En esta realización se utiliza la única secuencia más predominante (por ejemplo, AAGUCCGUAACACAC) para pasar información al segundo proceso SELEX. En este segundo proceso SELEX, la mezcla de candidatos se prepara para proporcionar secuencias basadas en la selección ganadora, mientras se garantiza que existirá la suficiente aleatoriedad en cada una de las secuencias. Esta mezcla de candidatos se puede generar utilizando materias primas de nucleótidos que presenten desviaciones en lugar de estar aleatorizadas. Por ejemplo, la solución A contiene un 75% de A y un 25% de U, C y G. Aunque el sintetizador de ácidos nucleicos se configura para proporcionar el nucleótido predominante, la presencia de los otros nucleótidos en la solución A producirá secuencias de ácido nucleico que son predominantes en A pero que también producirán variaciones en esta posición. De nuevo, esta segunda ronda de SELEX, realizada a partir de la información obtenida de los resultados del proceso SELEX inicial, maximizará las probabilidades de obtener la mejor solución de ligando para un objetivo determinado. De nuevo, se debe aclarar que la solución de ligando puede estar formada por un único ligando de ácido nucleico ventajoso, o puede estar formada por una familia de secuencias estructuralmente relacionadas con afinidades de unión esencialmente similares.
En la práctica, de forma ocasional puede resultar ventajoso que el proceso SELEX no se lleve a cabo hasta que se haya obtenido una única secuencia. El proceso SELEX contiene diversos puntos de desviación que pueden afectar a la predominancia de ciertas secuencias en una mezcla de candidatos tras realizar varias rondas de SELEX que no están relacionadas con la afinidad de unión de dicha secuencia por el objetivo. Por ejemplo, una desviación para o contra ciertas secuencias puede tener lugar durante la producción de ADNc a partir de ARN recuperado tras la fase de selección o durante el proceso de amplificación. Los efectos de dichas desviaciones impredecibles se puede minimizar deteniendo SELEX antes de que llegue a predominar una sola o un pequeño número de secuencias en la mezcla de reacción.
Como se ha afirmado anteriormente, la variación de la secuencia en la mezcla de prueba de ácidos nucleicos se puede conseguir o incrementar mediante mutación. Por ejemplo, se ha descrito un proceso para la mutación eficaz de secuencias de ácido nucleico durante la amplificación PCR (Leung et al. 1989). De manera opcional, este procedimiento o los procedimientos funcionalmente equivalentes se pueden combinar en la presente invención con procesos de amplificación.
De forma alternativa, se pueden incorporar procedimientos convencionales de mutagénesis de ADN al proceso de amplificación de ácidos nucleicos. Los procesos de mutagénesis aplicables incluyen, entre otros, la mutagénesis químicamente inducida y la mutagénesis dirigida por el sitio de oligonucleótidos.
La presente invención también se puede ampliar para utilizar capacidades adicionales interesantes de los ácidos nucleicos y para utilizar la forma en la que se conoce, o se determinará posteriormente, que interaccionan con objetivos como las proteínas. Por ejemplo, se puede utilizar una metodología SELEX para rastrear ligandos que formen aductos de Michael con proteínas. Las pirimidinas, cuando se encuentran en la posición correcta en una proteína, normalmente adyacentes a una cisteína crítica u otro nucleófilo, pueden reaccionar con dicho nucleófilo para formar un aducto de Michael. El mecanismo de formación de los aductos de Michael implica un ataque nucleofílico en la posición 6 de la base de pirimidina para crear un intermedio de transición (aunque lentamente reversible), que en realidad es una 5,6-dihidropirimidina. Es posible probar la presencia de este tipo de intermedios mediante la observación del sitio de unión entre un ARN y una proteína objetivo, incluso después de la desnaturalización de la proteína con cualquier desnaturalizante apropiado. Es decir, se busca una interacción covalente que se mantenga cuando se haya destruido la posición de unión del objetivo. Sin embargo, los aductos de Michael suelen ser reversibles, y algunas veces de forma tan rápida que un fallo en la identificación de los aductos de Michael en esta prueba no es indicativo de la no presencia de un aducto en algún momento anterior.
SELEX se puede realizar de forma tal que se aproveche la formación de los aductos de Michael para obtener sustratos de muy alta afinidad, cercanos al suicidio, para una enzima o para otra proteína objetivo. Imaginemos que tras la unión entre una mezcla aleatorizada de ARN y el objetivo, previamente a la separación sobre un filtro o por otros medios, el objetivo se desnaturaliza. La separación posterior, seguida de la inversión del aducto de Michael y de la síntesis del ADNc en el ARN obtenido, seguido del resto de los ciclos de SELEX, enriquecerá la mezcla en ARN que se unan al objetivo antes de realizar la desnaturalización pero que continuarán unidos de forma covalente hasta que el aducto de Michael sea revertido por el científico. Este ligando, in vivo, tendría la propiedad de inhibir de forma permanente la proteína objetivo. La proteína ARNt-uracil metil transferasa (RUMT) se une al ARNt sustrato a través de un aducto de Michael. Cuando la RUMT se expresa a altos niveles en E. Coli, la enzima se encuentra unida de forma predominantemente covalente al ARN, sugiriendo firmemente que a través de SELEX se pueden encontrar inhibidores casi irreversibles.
El procedimiento de la presente invención presenta múltiples aplicaciones. El procedimiento se puede utilizar, por ejemplo, para ayudar en la identificación y caracterización de cualquier sitio de unión de proteína para ADN o ARN. Dichos sitios de unión intervienen en la regulación transcripcional o translacional de la expresión génica, por ejemplo, como sitios de unión para activadores o represores transcripcionales, complejos de transcripción en sitios promotores, proteínas accesorias de replicación y ADN polimerasas en o cerca de los orígenes de replicación y ribosomas, y represores translacionales en sitios de unión de ribosomas. La información secuencial de estos sitios de unión se puede utilizar para aislar e identificar regiones reguladoras, ahorrándose la necesidad de realizar procedimientos más laboriosos de caracterización de estas regiones. Las regiones reguladoras de ADN aisladas se pueden utilizar, por ejemplo, en construcciones heterólogas para alterar de forma selectiva la expresión génica.
Un aspecto importante e inesperado de la presente invención es que los procedimientos aquí descritos se pueden emplear para identificar, aislar o producir moléculas de ácido nucleico que se unirán de forma específica a cualquier molécula objetivo deseada. Así, los procedimientos presentes se pueden utilizar para producir ácidos nucleicos específicos que se unan a un objetivo en particular. En muchos sentidos, dicho ligando de ácido nucleico se asemeja funcionalmente a un anticuerpo. Mediante los procedimientos de la presente invención se pueden aislar ligandos de ácido nucleico que presenten funciones de unión similares a las de los anticuerpos. Dichos ligandos de ácido nucleico se designan aquí como anticuerpos de ácido nucleico y se utilizan generalmente en aplicaciones en las que han encontrado aplicación los anticuerpos policlonales o monoclonales. En general, los anticuerpos de ácido nucleico pueden ser sustituidos por anticuerpos en cualquier aplicación in vitro o in vivo. Sólo es necesario que el ácido nucleico sea sustancialmente resistente a la degradación bajo las condiciones en las que se utilice el anticuerpo de ácido nucleico. Las aplicaciones de anticuerpos de ácido nucleico incluyen la detección específica, cualitativa o cuantitativa, de moléculas objetivo de cualquier procedencia; la purificación de moléculas objetivo basándose en su unión específica al ácido nucleico; y varios procedimientos terapéuticos que se basan de forma específica en la dirección específica de una toxina u otro agente terapéutico hacia un sitio objetivo específico.
Las moléculas objetivos son ventajosamente proteínas, pero también pueden incluir, entre otros, carbohidratos, peptidoglicanos y una variedad de moléculas pequeñas. Como en los anticuerpos proteináceos convencionales, los anticuerpos de ácido nucleico se pueden utilizar para estructuras biológicas objetivo, como las superficies celulares o los virus, mediante interacción específica con una molécula que sea una parte integral de dicha estructura biológica. Los anticuerpos de ácido nucleico son ventajosos en cuanto a que no están limitados por su propia tolerancia, como sucede con los anticuerpos convencionales. Además, los anticuerpos de ácido nucleico no requieren el uso de cultivos celulares o animales para su síntesis o producción, ya que SELEX es un proceso completamente in vitro. Como es bien conocido, los ácidos nucleicos se pueden unir a secuencias de ácido nucleico complementarias. Esta propiedad de los ácidos nucleicos ha sido utilizada de forma extensiva para la detección, cuantificación y aislamiento de moléculas de ácido nucleico. Así, los procedimientos de la presente invención no están destinados a abarcar estas bien conocidas capacidades de unión entre ácidos nucleicos. De forma específica, los procedimientos de la presente invención relacionados con el uso de anticuerpos de ácido nucleico no están destinados a abarcar estas bien conocidas capacidades de unión entre moléculas de ácido nucleico. Un cierto número de proteínas son conocidas por funcionar mediante uniones a secuencias nucleicas, como las proteínas reguladoras que se unen a secuencias de ácido nucleico del operador. La conocida capacidad de ciertas proteínas para unirse a ácidos nucleicos en sus sitios naturales, por ejemplo, ha sido utilizada en la detección, cuantificación, aislamiento y purificación de dichas proteínas. Los procedimientos de la presente invención relacionados con el uso de anticuerpos de ácido nucleico no están destinados a abarcar la conocida afinidad de unión entre proteínas que se unen a ácidos nucleicos y secuencias de ácidos nucleico conocidas por unirse a las proteínas. No obstante, utilizando SELEX se pueden desarrollar secuencias nuevas y no formadas de manera natural que se unan a las mismas proteínas de unión a ácido nucleico. Debe notarse que SELEX permite una determinación muy rápida de las secuencias de ácido nucleico que se unirán a una proteína y, por lo tanto, se puede utilizar para determinar la estructura de secuencias desconocidas de operador y de sitios de unión cuyas secuencias pueden entonces utilizarse en aplicaciones como las aquí descritas. Se cree que la presente invención es la primera revelación del uso general de moléculas de ácido nucleico para la detección, cuantificación, aislamiento y purificación de proteínas que no son conocidas por unirse a ácidos nucleicos. Como se discutirá más adelante, ciertos anticuerpos de ácido nucleico aislables mediante SELEX también se pueden utilizar para influir en la función, por ejemplo, inhibiendo, mejorando o activando la función de moléculas o estructuras objetivo específicas. De forma específica, los anticuerpos de ácido nucleico se pueden utilizar para inhibir, mejorar o activar la función de proteínas.
Las proteínas que tienen una conocida capacidad para unirse a ácidos nucleicos (como son las ADN polimerasas, otras replicasas, y proteínas que reconocen sitios en el ARN pero no se involucran en acciones catalíticas adicionales) producen, mediante SELEX, ligandos de ARN de alta afinidad que se unen al sitio activo de la proteína objetivo. Así, en el caso de la transcriptasa inversa de HIV-1, el ligando de ARN resultante (denominado 1.1 en el Ejemplo 2) bloquea la síntesis de ADNc en presencia de un ADN cebador, una plantilla de ARN y los cuatros desoxinucleótidos trifosfatos.
La teoría de los inventores acerca de las estructuras de ARN sugiere que casi todas las proteínas servirán como un objetivo para SELEX. Los experimentos iniciales sobre proteínas que se unen a moléculas diferentes de los ácidos nucleicos se llevaron a cabo con tres proteínas que no se creía que interaccionaran con ácidos nucleicos en general o con ARN en particular. Las tres proteínas eran el activador tisular de plasminógeno (tPA), el factor de crecimiento nervioso (NGF), y el dominio extracelular del receptor del factor de crecimiento (gfR-Xtra). Todas estas proteínas fueron probadas para averiguar si retenían ARN aleatorizados mezclados en un filtro de nitrocelulosa. El tPA y NGF mostraron afinidad por ARN aleatorizado, con Kd justo por debajo del nivel \muM. La gfR-Xtra no se unió con una afinidad medible, sugiriendo que, si existe un anticuerpo de ARN para esta proteína, éste debe unirse en un sitio que no tenga afinidad por la mayoría de los otros ARN.
El tPA y el NGF fueron sometidos al procedimiento SELEX utilizando ARN con 30 posiciones aleatorizadas. Tanto tPA como NGF proporcionaron soluciones de ligando en el procedimiento SELEX, sugiriendo que algunos sitios de cada proteína se habían unido a las secuencias ganadoras de forma más firme que el sitio (u otro sitio) por el que se unen otros ARN. Las secuencias ganadoras son diferentes para las dos proteínas.
Dado que tPA y NGF funcionaron de forma muy satisfactoria en el procedimiento SELEX, se probó una colección aleatoria de proteínas y péptidos para averiguar si presentaban alguna afinidad por ARN. Se dedujo que si una proteína presentaba alguna afinidad por ARN, el procedimiento SELEX rendiría, como promedio, secuencias de mayor afinidad que contactarían con la misma región del objetivo que proporciona la afinidad baja y generalizada. Se probaron un conjunto de proteínas y péptidos para averiguar si los ARN aleatorizados (que contenían 40 posiciones aleatorizadas) quedaban retenidos en los filtros de nitrocelulosa. Aproximadamente dos tercios de las proteínas probadas se unían a ARN, y una pequeña cantidad de proteínas se unía a ARN muy firmemente. Ver el Ejemplo 9.
Las proteínas que no se unen a ARN en los filtros de nitrocelulosa pueden no hacerlo por razones triviales que no tengan nada que ver con la probabilidad de conseguir anticuerpos de ARN. Un ejemplo es la bradiquinina, que no genera ninguna unión a los filtros de nitrocelulosa y que, por lo tanto, producirá un fallo en el experimento anterior. Se preparó una bradiquinina unida a una matriz sólida a través del extremo amino del péptido, y se observó que el ARN aleatorizado se unía firmemente a la matriz (ver el Ejemplo 7). Así, en los experimentos iniciales se observa que dos péptidos cortos, bradiquinina y bombesina, se unen a ARN aleatorizados de forma bastante firme. Cualquier ligando con alta afinidad por ARN obtenido a través de SELEX con estos péptidos objetivo podría ser un antagonista de estos péptidos activos y podría utilizarse con fines terapéuticos. Es difícil imaginar un ARN de cerca de 30 nucleótidos unido un péptido muy pequeño sin que se produzca la inactivación de dicho péptido para virtualmente cualquier actividad.
Como se describe posteriormente en los Ejemplos 4, 7, 9 y 10, se observó que las proteínas no conocidas en la naturaleza por interaccionar con ácidos nucleicos se unían a una mezcla aleatoria de ácidos nucleicos en un grado no despreciable. Además, se ha demostrado que, mediante SELEX, se puede obtener una solución de ligando para las proteínas que se unían a las mezclas de ARN de forma no específica. Por lo tanto, se trata de un cribado potencialmente valioso, antes de la realización de SELEX, para determinar si un objetivo dado muestra algún tipo de unión con una mezcla aleatoria de ácidos nucleicos.
Un segundo aspecto importante e inesperado de la presente invención es que los procedimientos aquí descritos se pueden utilizar para identificar, aislar o producir moléculas de ácido nucleico que se unirán de forma específica a una molécula objetivo en particular y que afectarán a la función con dicha molécula. En este aspecto, las moléculas objetivo son ventajosamente proteínas, pero también pueden incluir, entre otros, carbohidratos y diversas moléculas pequeñas sobre las cuales se pueda conseguir la unión específica de ácidos nucleicos. Los ligandos de ácidos nucleico que se unen a moléculas pequeñas pueden influir en su función mediante su secuestro o evitando que interaccionen con sus ligandos naturales. Por ejemplo, la actividad de una enzima puede verse afectada por un ligando de ácido nucleico que se una al sustrato de la enzima. Los ligandos de ácido nucleico de moléculas pequeñas, por ejemplo anticuerpos de ácido nucleico, son particularmente útiles como reactivos para pruebas diagnósticas (u otros ensayos cuantitativos). Por ejemplo, la presencia de sustancias controladas, metabolitos enlazados o cantidades anormales de metabolitos normales se puede detectar y medir utilizando los ligandos de ácido nucleico de la invención. Un ligando de ácido nucleico que presente actividad catalítica puede influir en la función de una molécula pequeña mediante la catálisis de un cambio químico en el objetivo. El rango de posibles actividades catalíticas es al menos tan amplio como el que muestran las proteínas. La estrategia de selección de un ligando para un análogo de estado de transición de una reacción deseada es un procedimiento que permite seleccionar ligandos de ácido nucleico catalíticos.
Se cree que la presente descripción revela por primera vez el uso general de las moléculas de ácido nucleico para afectar, inhibir o aumentar la función de la proteína. Los procedimientos de selección por unión de la presente invención se pueden combinar con procedimientos de selección secundaria o cribado para modificar la función de la molécula objetivo de unión a los ácidos nucleicos seleccionados. La gran población de variantes de secuencias de ácido nucleico que se pueden probar con SELEX aumenta la probabilidad de encontrar secuencias de ácido nucleico que tengan la capacidad de unión deseada y la función de modificar la actividad de la molécula objetivo. Los procedimientos de la presente invención son útiles para seleccionar ligandos de ácido nucleico que puedan afectar de forma selectiva a la función de cualquier proteína objetivo, incluyendo las proteínas que se unen a ácidos nucleicos como parte de su actividad biológica natural y aquellas que no son conocidas por unirse a ácidos nucleicos como parte de su función biológica. Los procedimientos aquí descritos se pueden emplear para aislar o producir ligandos de ácido nucleico que se unan a, y modifiquen la función de, cualquier proteína que se una a un ácido nucleico, ya sea ADN o ARN, ya sea de cadena simple o doble; un nucleósido o nucleótido incluyendo aquellos que presentan bases de purina o pirimidina o bases derivadas de ellas, incluyendo de forma específica aquellas que presentan bases de adenina, timina, guanina, uracilo, citosina e hipoxantina y derivados, particularmente derivados metilados; y nucleótidos de coenzimas incluyendo entre otros nucleótidos de nicotinamida, dinucleótidos de flavina-adenina y coenzima A. Se contempla que el procedimiento de la presente invención se pueda utilizar para identificar, aislar o producir moléculas de ácido nucleico que afectarán a la actividad catalítica de las enzimas objetivo, por ejemplo inhibiendo la catálisis o modificando la unión al sustrato, que afectarán a la función de los receptores de proteínas, por ejemplo, inhibiendo la unión a receptores o modificando la especificidad de la unión a receptores; que afectarán a la formación de multímeros de proteína, por ejemplo, rompiendo la estructura cuaternaria de las subunidades de proteína; y que modificarán las propiedades
de transporte de la proteína, por ejemplo, interrumpiendo el transporte de moléculas pequeñas o iones por las proteínas.
El proceso SELEX se define aquí como la selección y amplificación iterativas de una mezcla de candidatos de secuencias de ácido nucleico que se repiten hasta que se obtiene una solución de ligando. Un siguiente paso en el proceso es la producción de anticuerpos de ácido nucleico para un objetivo dado. Incluso cuando la solución de ligando derivada de un proceso dado es una secuencia única, se debe sintetizar el anticuerpo de ácido nucleico que contiene únicamente la solución de ligando. Por ejemplo, un experimento SELEX puede proporcionar una solución ventajosa de ligando único que consiste en sólo 20 de las 30 secuencias de nucleótidos aleatorizados utilizadas en la mezcla de candidatos SELEX. El anticuerpo de ácido nucleico terapéuticamente valioso no contendría, ventajosamente, los nucleótidos no críticos o las secuencias fijas necesarias para el paso de amplificación de SELEX. Una vez determinada la estructura deseada del anticuerpo de ácido nucleico en base a la solución de ligando, se llevará a cabo la síntesis real del anticuerpo de ácido nucleico de acuerdo con una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica
El anticuerpo de ácido nucleico también se puede construir en base a una solución de ligando para un objetivo dado que consiste en una familia de secuencias. En este caso, la experimentación de rutina mostrará que una secuencia dada es ventajosa debido a circunstancias no relacionadas con la afinidad relativa de la solución de ligando por el objetivo. Dichas consideraciones serían obvias para un experto en la técnica.
En una realización alternativa de la presente invención, el anticuerpo de ácido nucleico puede comprender una pluralidad de ligandos específicos de ciertos objetivos, de los que más de uno pueden ser ligandos idénticos. Ventajosamente, comprende al menos dos ligandos distintos específicos de un objetivo. Puede contener una pluralidad de ligandos de ácido nucleico para el mismo objetivo. Por ejemplo, SELEX puede identificar dos soluciones de ligando discretas. Dado que las dos soluciones de ligando se pueden unir al objetivo en diferentes lugares, el anticuerpo de ácido nucleico puede contener, ventajosamente, ambas soluciones de ligando. En otra realización, el anticuerpo de ácido nucleico puede contener más de una solución de ligando único. Estos anticuerpos de ácido nucleico multivalentes presentarán una mayor afinidad de unión por el objetivo que no es accesible para un anticuerpo de ácido nucleico equivalente que presente un solo ligando.
Además, el anticuerpo de ácido nucleico también puede comprender un elemento diferente a un ácido nucleico, especialmente un ligando específico de un objetivo. Así, puede contener otros elementos, que 1) añadirán afinidad independiente por el objetivo al anticuerpo de ácido nucleico; 2) aumentarán de forma dependiente la afinidad del ligando de ácido nucleico por el objetivo; 3) dirigirán o ubicarán el anticuerpo de ácido nucleico en la posición in vivo apropiada en donde se desee realizar el tratamiento; o 4) utilizarán la especificidad del ligando de ácido nucleico por el objetivo para realizar alguna reacción adicional en dicha posición.
Los procedimientos aquí descritos son útiles para la obtención de ácidos nucleicos que inhiban la función de una proteína objetivo, y son particularmente útiles para la obtención de ácidos nucleicos que inhiban la función de las proteínas cuya función incluya la unión a ácido nucleico, nucleótidos, nucleósidos y derivados y análogos de ellos. Los procedimientos de la presente invención pueden proveer inhibidores de ácido nucleico, por ejemplo, de polimerasas, transcriptasas inversas, y otras enzimas en las que un ácido nucleico, nucleótido o nucleósido es un sustrato o cofactor.
Los procedimientos secundarios de selección que se pueden combinar con SELEX incluyen, entre otros, selecciones o cribados para la inhibición de enzimas, alteración de la unión a sustratos, pérdida de función, rotura de estructura, etc. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar entre varias alternativas aquellos procedimientos de selección o cribado que sean compatibles con los procedimientos aquí descritos.
Resultará fácilmente aparente para los expertos en la técnica que en algunos casos, por ejemplo, para ciertas moléculas objetivo o para ciertas aplicaciones, puede ser ventajoso utilizar moléculas de ARN como ligandos en lugar de moléculas de ADN, mientras que en otros casos los ligandos de ADN pueden resultar ventajosos con respecto a los de ARN.
Los procedimientos de selección aquí descritos también se pueden utilizar para seleccionar ácidos nucleicos que se unan de forma específica a un complejo molecular, por ejemplo, a un complejo sustrato/proteína o inhibidor/proteína. Entre estos ácidos nucleicos que se unen de forma específica a las moléculas complejas, pero no a las moléculas incompletas, existen ácidos nucleicos que inhibirán la formación del complejo. Por ejemplo, entre los ligandos de ácido nucleico que son seleccionados por unirse de forma específica a un complejo sustrato/enzima, existen ácidos nucleicos que se pueden seleccionar fácilmente y que inhibirán la unión de los sustratos a la enzima para así inhibir o interrumpir las catálisis realizadas por la enzima.
Una realización de la presente invención, que es particularmente útil para la identificación o aislamiento de ácidos nucleicos que se unen a un sitio funcional o activo en particular de una proteína, u otra molécula objetivo, utiliza una molécula conocida, o seleccionada, para unirse a un sitio deseado en la proteína objetivo con el fin de dirigir el proceso de selección/amplificación hacia un subconjunto de ligandos de ácido nucleico que se unan al sitio deseado o cerca de él en la molécula objetivo. En un ejemplo sencillo, una secuencia de ácido nucleico conocida por unirse a un sitio deseado de la molécula objetivo se incorpora cerca de la región aleatorizada de todos los ácidos nucleicos cuya unión está siendo probada. Entonces, se utiliza SELEX (Fig. 9) para seleccionar aquellas variantes que se unan más firmemente a la molécula objetivo y que contendrán todas la secuencia de unión conocida. A continuación se puede seleccionar una secuencia de unión más larga, que presumiblemente se unirá más firmemente a la molécula objetivo o más específicamente al objetivo. La secuencia de unión más larga se puede, entonces, introducir cerca de la región aleatorizada de la mezcla de prueba de ácidos nucleicos y se pueden repetir los pasos de selección/amplificación para seleccionar una secuencia de unión aún más larga. La iteración de estos pasos (por ejemplo, la incorporación de la secuencia seleccionada a las mezclas de prueba seguida de selección/amplificación para una unión mejorada o más específica) se pueden repetir hasta que se consiga el nivel deseado de fuerza o especificidad de unión. Esto proceso iterativo "andante" permite la selección de ácidos nucleicos altamente específicos para una molécula objetivo o sitio de una molécula objetivo en particular. Otra realización de dicho proceso iterativo "andante" utiliza una molécula "de anclaje" que no sea necesariamente un ácido nucleico (ver las Figuras 10 y 11). En esta realización, una molécula que se une a un objetivo deseado, por ejemplo, un sustrato o inhibidor de una enzima objetivo, es modificada químicamente de forma que se pueda unir covalentemente a un oligonucleótido de secuencia conocida (el "oligonucleótido guía" de la Fig. 10). El oligonucleótido guía químicamente unido a la molécula "de anclaje" que se une al objetivo también se une a la molécula objetivo. La secuencia complementaria del oligonucleótido guía se incorpora cerca de la región aleatorizada de la mezcla de prueba de ácidos nucleicos. A continuación, se lleva a cabo SELEX para seleccionar aquellas secuencias que se unan más firmemente el complejo molécula objetivo/anclaje. El proceso de iteración andante puede entonces emplearse para seleccionar o producir moléculas cada vez más largas de ácido nucleico con una mayor fuerza de unión o especificidad de unión al objetivo. Se espera que el uso del proceso de "anclaje" permita un aislamiento más rápido de los ligandos de ácido nucleico que se unen a, o cerca de, un sitio deseado de la molécula objetivo. En particular, se espera que el procedimiento de "anclaje" en combinación con los procesos iterativos "andantes" permita obtener ácidos nucleicos que sean inhibidores altamente específicos de la función de la proteína (Fig. 11).
En ciertas realizaciones de la ejecución de SELEX es deseable llevar a cabo cribados positivos/negativos en conjunción con el proceso de selección para garantizar que el proceso de selección no está sufriendo una desviación debida a algunos factores no relacionados con la afinidad de las secuencias de ácido nucleico por el objetivo. Por ejemplo, cuando la selección se realiza mediante la unión de la proteína a la nitrocelulosa, se ha observado que ciertas secuencias de ácido nucleico son retenidas ventajosamente por la nitrocelulosa y se pueden seleccionar durante el proceso SELEX. Estas secuencias se pueden eliminar de la mezcla de candidatos mediante la incorporación de pasos adicionales en los que la mezcla SELEX precedente se pasa a través de nitrocelulosa para eliminar de forma selectiva aquellas secuencias seleccionadas únicamente por poseer dicha propiedad. Dicho cribado y selección se pueden realizar siempre y cuando el objetivo contenga impurezas o el proceso de selección introduzca desviaciones no relacionadas con la afinidad por el objetivo.
SELEX ha sido demostrado mediante la aplicación al aislamiento de moléculas de ARN que se unen a e inhiben la función de la ADN polimerasa del bacteriófago T4, también denominado gp43. El nuevo ligando de ARN de la ADN polimerasa de T4 es útil como reactivo específico de ensayo para la ADN polimerasa de T4. La síntesis de la ADN polimerasa de T4 se regula de forma autogénica. En ausencia de proteína funcional, los fragmentos ámbar y las proteínas mutantes se sobreexpresan en comparación con la tasa de síntesis de proteína de tipo natural en infecciones con replicación deficiente (Russel (1973) J. Mol. Biol. 79:83-94). La traducción in vitro de un fragmento N-terminal de gp43 es reprimida de forma específica mediante la adición de gp43 purificado y el gp43 protege a una porción discreta del ARNm cercana a su sitio de unión al ribosoma del ataque de la nucleasa (Andrake et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7942-7946). Se han establecido el tamaño y la secuencia del operador translacional del ARN al que se une el gp43 y la fuerza de esta unión. El tamaño mínimo del operador de gp43 es una secuencia de unos 36 nucleótidos, como se ilustra en la Figura 1, que se prevé que presente una estructura de bucle en horquilla como allí se indica. El tamaño mínimo del operador fue determinado mediante el análisis de la unión de los fragmentos de la hidrólisis del extremo marcado del operador a gp43. El análisis de la unión de los mutantes del operador en la secuencia de bucles y horquillas indica que la unión de gp43 al operador es sensible a los cambios en las bases primarias de la hélice. La unión a la polimerasa se redujo aún más debido a los cambios que reducen de forma significativa la estabilidad de la horquilla. La unión del operador resultó ser muy sensible a la secuencia del bucle. Se observó que la replicación y la unión del operador en gp43 son actividades exclusivas entre si. Se observó que la adición de cantidades micromolares de ARN purificados que contenían un operador intacto inhibía fuertemente el replicado in vitro por gp43.
El operador gp43 del tipo natural, Figura 1, se utilizó como base para el diseño de una mezcla inicial de moléculas de ARN que contuvieran una región de secuencia aleatorizada para evaluar la capacidad del proceso de selección/amplificación de aislar moléculas de ácido nucleico que se unan a una proteína. La mezcla de prueba de ARN se preparó mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN de cadena simple de 110 bases. La plantilla se construyó según se ilustra en la Figura 1 para codificar la mayoría de las secuencias de operador del tipo natural, a excepción de la secuencia del bucle. La secuencia de ocho bases del bucle fue sustituida por una región de secuencia aleatorizada que se sintetizó para ser totalmente aleatoria en cada base. La plantilla también contenía las secuencias necesarias para una amplificación eficaz: una secuencia en su extremo 3' que era complementaria a un cebador para transcripción inversa y amplificación en las reacciones en cadena de la polimerasa y una secuencia en su extremo 5' que era necesaria para la iniciación trascripcional de la ARN polimerasa de T7 y una secuencia suficiente que era complementaria al ADNc del transcrito in vitro. La plantilla de ADN es una mezcla de todas las variantes de secuencia de bucle que contiene teóricamente 65.536 especies individuales.
La constante de disociación para el bucle de ARN de tipo natural resultó ser de aproximadamente 5 x 10^{-9} M. La constante de disociación para la población de las variantes de secuencia de bucle se determinó que era de 2,5 x 10^{-7} M. La aleatorización de la secuencia del bucle hizo descender la afinidad de unión en 50 veces.
Los transcritos in vitro que contenían las variantes de secuencia de bucle se mezclaron con gp43 purificado y se incubaron. La mezcla se filtró a través de un filtro de nitrocelulosa. Los complejos proteína-ARN quedaron retenidos en el filtro y el ARN no unido no quedó retenido. El ARN seleccionado fue entonces eluído de los filtros según se describe en el Ejemplo 1. Los ARN seleccionados fueron ampliados con transcriptasa inversa AMV en presencia de cebador 3' según se describe en Gauss et al. (1987) supra. El ADNc resultante fue amplificado con ADN polimerasa Taq en presencia del cebador 5' durante 30 ciclos, según se describe en Innis et al. (1986) supra. El ADN amplificado seleccionado sirvió como plantilla para la transcripción in vitro con el fin de producir transcritos de ARN amplificados y seleccionado que se sometieron, a continuación, a otra ronda de selección de unión/amplificación. La relación ARN/proteína en la mezcla de selección de unión se mantuvo constante a lo largo de los ciclos de la selección. La selección/amplificación iterativa se llevó a cabo utilizando diversas relaciones molares ARN/proteína. En todos los experimentos, el ARN se encontraba en exceso: en el experimento A se utilizó una relación ARN/gp43 de 10/1 (moles/moles); en el experimento B se utilizó una relación ARN/gp43 de 1000/1; y en el experimento C se utilizó una relación ARN/gp43 de 100/1.
El progreso del proceso de selección se monitorizó mediante ensayos de unión sobre filtro de los transcritos marcados de ADNc amplificado realizados al finalizar cada ciclo del proceso. También se llevó a cabo la secuenciación discontinua de los productos de ARN de cada ronda para el experimento B con el fin de monitorizar el progreso de la selección. Los autoradiogramas de los geles de secuenciación de los productos de ARN tras 2, 3 y 4 rondas de selección/amplificación se muestran en la Figura 3. Queda claro que no se introdujo ninguna desviación aparente de la secuencia de bucle hasta después de la tercera selección. Tras la cuarta ronda de selección, se puede discernir una secuencia consenso aparente para la secuencia de ocho bases del bucle, como: A(a/g)(u/c)AAC(u/c)(u/c). La secuenciación discontinua del ARN seleccionado tras la cuarta ronda de selección para los experimentos A, B y C se compara en la Figura 4. Los tres procesos SELEX independientes, que utilizan diferentes relaciones ARN/proteína, proporcionan similares secuencias consenso aparentes. Sin embargo, en el ARN seleccionado de los experimentos A y C existía cierta desviación aparente para la secuencia de bucle de tipo natural (AAUAACUC).
Con el fin de determinar qué combinaciones de secuencia posibles estaban realmente presentes en los ARN seleccionados, los ADN individuales fueron clonados a partir de los ARN seleccionados tras la cuarta ronda de selección en el experimento B. La secuencia discontinua resultante del experimento B pareció indicar una distribución uniforme de los dos nucleótidos permitidos que componían cada una de las cuatro posiciones variables de la secuencia de bucle. Los individuos fueron clonados en pUC18, según se describe en Sambrook, J. Et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N.Y.), Secciones 1.13; 1.85-1.86. Se secuenciaron los veinte clones individuales que habían sido identificados mediante hibridación sobre filtro en colonias al cebador 3’. Ninguno de los clones secuenciados resultó ser mutante en ninguna posición de la secuencia del operador fuera de la secuencia de bucle. Sólo se observaron cinco secuencias de variantes, según se muestra en la Figura 7, y sorprendentemente sólo dos variantes de secuencia fueron los componentes mayoritarios de la mezcla seleccionada. Las frecuencias de cada secuencia de los 20 aislados individuales secuenciados también se muestran en la Figura 7. La secuencia de tipo natural AAUAA
CUC y el bucle AGCAACCU estaban presentes en aproximadamente la misma cantidad en el ARN seleccionado del experimento B. Las otras variantes seleccionadas eran mutaciones en una base de las dos variantes mayoritarias. La fuerza de unión de las variantes de secuencia fue comparada en ensayos de unión sobre filtro utilizando transcritos in vitro marcados derivados de cada aislado clonal purificado. Como se muestra en la Figura 6, se observó una burda correlación entre la afinidad de unión de un ARN para gp43 y la abundancia de la secuencia seleccionada. Las dos variantes de secuencia de bucle mayoritarias mostraron afinidades de unión aproximadamente iguales para gp43.
Todos los ARN de las variantes de secuencia de bucle aislados mediante el proceso de selección/amplificación, mostrados en la Figura 7, pueden actuar como inhibidores de la actividad de la polimerasa gp43, como se ha demostrado para la secuencia del operador de tipo natural.
Se ha proporcionado un ejemplo del uso de SELEX mediante la selección de un nuevo ligando de ARN de la ADN polimerasa del bacteriófago T4 (gp43) (Andrake et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7942-7946).
La presente invención incluye soluciones de ligando específicas, derivadas a través del proceso SELEX, que muestran tener una mayor afinidad por la transcriptasa inversa de HIV-1, la cubierta proteica de R17, la proteína Rev de HIV-1, la ADN polimerasa de HSV, la proteína ribosomal S1 de E. Coli, tPA y NGF. Estas soluciones de ligando pueden ser utilizadas por un experto en la técnica para sintetizar anticuerpos de ácido nucleico frente a varios objetivos.
Los siguientes ejemplos describen las aplicaciones exitosas de SELEX para una gran variedad de objetivos. Los objetivos se pueden dividir, generalmente, en dos categorías: aquellos que son proteínas de unión a ácidos nucleicos y aquellas proteínas que no son conocidas por interaccionar con ácidos nucleicos. En cada caso se obtiene una solución de ligando. En algunos casos es posible representar la solución de ligando como un motivo de ácido nucleico, como son un bucle en horquilla, una protuberancia asimétrica o un pseudonudo. En otros ejemplos, la solución de ligando se presenta como una secuencia primaria. Estos casos no implican necesariamente que la solución de ligando no contenga una estructura terciaria definitiva.
Además para la ADN polimerasa de T4, los objetivos en los que SELEX se ha llevado a cabo de forma exitosa incluyen la cubierta proteica del bacteriófago R17, la transcriptasa inversa de HIV (HIV-RT), la proteína Rev de HIV-1, la ADN polimerasa de HSV más o menos el cofactor, la proteína ribosomal S1 de E. Coli, tPA y NGF. Los siguientes experimentos también describen un protocolo para la prueba de la afinidad global de unión de una mezcla de ácidos nucleicos candidatos aleatorizados para una variedad de proteínas. El Ejemplo 7 también describe la inmovilización de bradiquinina y los resultados de los estudios de unión de los ácidos nucleicos aleatorizados en la bradiquinina.
Los ejemplos e ilustraciones aquí mostradas no deben tomarse como limitantes en ningún caso. La creencia fundamental en la que se basa la presente invención es que los ácidos nucleicos, como compuestos químicos, pueden formar una variedad virtualmente ilimitada de tamaños, formas y configuraciones y que son capaces de dar lugar a un enorme repertorio de funciones de unión y catalíticas, en el que las funciones existentes en los sistemas biológicos constituyen una cantidad ínfima dentro de las posibilidades.
Ejemplos
Los siguientes materiales y procedimientos se emplean a lo largo de todo el texto.
El vector de transcripción pT7-2 está disponible comercialmente (U.S. Biochemical Company, Cleveland, OH). El plásmido pUC18 se describe en Norrander et al. (1983) Gene 24:15-27 y también está comercialmente disponible en New England Biolabs. Todas las manipulaciones de ADN realizadas para crear nuevos plásmidos recombinantes se realizaron según lo descrito en Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, a menos que se indique lo contrario. Los oligonucleótidos de ADN se sintetizaron y purificaron según se describe en Gauss et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 206:24-34.
Las transcripciones in vitro con ARN polimerasa de T7 y la purificación por gel del ARN se realizaron según se describe en Milligan et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15:8783-8798, excepto en las reacción de marcaje, en donde las concentraciones de ATP, CTP y GTP eran de 0,5 mM cada una, y la concentración de UTP era de 0,05 mM. El UTP se marcó en la posición alfa con ^{31}P a una actividad específica de aproximadamente 20 Ci/mmol. Las preparaciones en bruto de ARNm para infecciones T4, el marcaje de los oligos, y la prolongación del cebador con transcriptasa inversa AMV se realizaron todos según lo descrito en Gauss et al. (1987) supra.
Las diluciones del ARN marcado y purificado por gel y del gp43 purificado se realizaron en KOAc 200 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 7,7 a 4°C. En los ensayos de unión sobre filtro de nitrocelulosa, el gp43 purificado se diluyó de forma serial y se añadieron alícuotas de 30 \mul de cada dilución de proteína a alicuotas de 30 \mul de ARN purificado por gel, diluido y marcado. La dilución de ARN (50 \mul ) fue colocada sobre un filtro de nitrocelulosa nuevo, secada y se realizó el recuento para determinar las entradas por tubo. La concentración de proteína en las reacciones varió desde 10^{-10} M hasta 10^{-8} M y la concentración de los ARN en cada experimento fue de aproximadamente 10^{-12} M. Tras la incubación a 4°C durante 30 minutos, cada tubo fue puesto a 37°C durante 3 minutos y se filtraron 50 \mul de cada muestra a través de filtros de nitrocelulosa previamente humedecidos (Millipore #HAWP 025 00) y lavados con 3 ml de KOAc 200 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,7. Los filtros fueron secados y se realizó el recuento en fluido de centelleo Ecolume™ (ICN Biomedicals, Inc.). Los controles se realizaron en ausencia de gp43, y a partir de ellos se determinó el nivel de fondo (siempre inferior a un recuento de aprox. 5% de entradas). En cada grupo de medidas se restó el nivel de fondo y se calculó el porcentaje de entradas totales que quedaba en los filtros. Con cada grupo de puntos de datos se generó una curva teórica de unión bimolecular con el mejor ajuste posible usando una versión de un programa publicado (Caceci y Cacheris, 1984 supra) y modificado para generar una curva descrita por la ecuación:
\theta = A[gp43]/(Kd + [gp43])
en donde \theta es la fracción del total de ARN unido al filtro, A es el porcentaje de ARN al que se satura la unión (aproximadamente al 60% para esta interacción proteína-ARN), [gp43] es la concentración de entrada de gp43, y Kd es la constante de disociación para la reacción bimolecular. Esta ecuación es un reajuste algebraico de la ecuación [1-5] de Bisswanger (1979) Theorie und Methoden der Enzymkinetik, Verlag Chemie, Weinheim, FRG, p. 9 asumiendo la simplificación de que la concentración de la proteína supera ampliamente la concentración de los complejos proteína-ARN, un supuesto que es válido en los experimentos descritos.
Ejemplo 1 Selección de inhibidores de ARN de la ADN polimerasa de T4
Una plantilla de ADN de cadena simple con 110 bases fue creada para realizar la transcripción in vitro, como se muestra en la Figura 2, mediante la ligación de tres oligonucleótidos sintéticos (Tablas 1, 3, 4 y 5) en presencia de dos oligonucleótidos de bloqueo (capping) (Tablas 1 y 2). Uno de los oligos que crean la plantilla también se utilizó como cebador 3' en la transcripción inversa del transcrito in vitro y en la posterior amplificación en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) (Innis et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9436-9440). Uno de los oligos de bloqueo (capping) (1) contiene la información necesaria para la iniciación transcripcional de la ADN polimerasa de T7 y una secuencia suficientemente complementaria al ADNc del transcrito in vitro como para servir de cebador 5' en los pasos de amplificación con PCR. La plantilla de ADN codifica un ARN que contiene todo el sitio de reconocimiento del ARN para la ADN polimerasa de T4, a excepción de una secuencia completamente aleatoria que sustituye a la secuencia que codificaría la secuencia AAUAACUC del bucle natural. La secuencia aleatoria se introdujo mediante síntesis química convencional usando un sintetizador de ADN comercial (Applied Biosystems), excepto por el hecho de que los cuatro dNTP se encontraban en cantidades equimolares en la mezcla de reacción para cada posición indicada como N en la secuencia del oligonucleótido número 4 (Tabla 1). La secuencia aleatoria está flanqueada por una secuencia de hibridación del cebador con información para los oligos 5' y 3' usados en PCR. Así, la plantilla de ADN es una mezcla de todas las variantes de secuencias de bucle, que teóricamente contiene 65.536 especies individuales. La constante de disociación es de aprox. 5 x 10^{-9} M para la secuencia de ARN de la variante de bucle de tipo natural y de aprox. 2,5 x 10^{-7} M para la población de secuencias, es decir, una afinidad de unión 50 veces inferior.
2
Los transcritos in vitro que contienen las variantes de secuencias de bucle se mezclaron con gp43 purificado en tres proporciones ARN-proteína diferentes a lo largo de las múltiples rondas de selección. (La concentración de gp43 era de 3 x 10^{-8} M para A y B "baja proteína", y de 3 x 10^{-7} M para C "alta proteína". La concentración de ARN era de aprox. 3 x 10^{-7} M para A "bajo ARN" y de aprox. 3 x 10^{-5} M para B y C "alto ARN".) Una ronda estaba formada por los siguientes pasos:
1) Selección. El ARN y la proteína se mezclaron en las proporciones deseadas descritas anteriormente, y la mezcla se incubó a 37ºC, se lavó sobre un filtro de nitrocelulosa y el ARN se eluyó de los filtros según se describe supra.
2) Amplificación. El ARN eluído de los filtros se amplió con transcriptasa inversa AMV en presencia de 50 picomoles de cebador 3' en 50 \mul de reacción bajo las condiciones descritas en Gauss et al. (1987) supra. Al ADNc resultante se añadieron 50 picomoles de cebador 5', se llevó a un volumen de reacción de 100 \mul y se amplificó con ADN polimerasa de Tag, según se describe en Innis (1988) supra durante 30 ciclos.
3) Transcripción. La transcripción in vitro se realizó sobre las plantillas amplificadas seleccionadas según se describe en Milligan et al. (1987) supra, tras lo cual se añadió ADNasa I para retirar la plantilla de ADN. Los transcritos de ARN seleccionados resultantes se utilizaron entonces en el paso 1 de la siguiente ronda. Sólo uno de cada veinte productos creados en este paso del ciclo fue utilizado en los ciclos posteriores, de forma que se pudiera trazar el historial de la selección. El progreso del procedimiento de selección se monitorizó mediante ensayos de unión sobre filtro de los transcritos marcados para cada reacción de PCR. Tras la cuarta ronda de selección y amplificación, los productos de ARN seleccionados marcados se unieron a gp43 equivalente al del ARN natural de control. Los productos de ARN, de cada ronda para un experimento (B) y de la cuarta ronda para los tres experimentos, fueron purificados por gel y secuenciados. En la Figura 3 mostramos la secuencia de los transcritos in vitro purificados derivados de la segunda, tercera y cuarta ronda de selección y amplificación para el experimento B. Queda claro que no se introdujo ninguna desviación aparente de la secuencia de bucle hasta después de la tercera selección. En este punto de la selección, existía una desviación detectable que resultó completa en la cuarta ronda para la secuencia consenso aparente A(a/g)(u/c)AAC(u/c)(u/c). La secuenciación discontinua del ARN transcrito tras la cuarta ronda de selección y amplificación para los ensayos A, B y C se muestra en la Figura 4. Las tres rondas independientes dieron resultados similares con diferentes proporciones proteína/ARN. Existe una cierta desviación aparente para la secuencia natural en cada una de las cuatro posiciones "variables" de los experimentos A y C.
Con el fin de encontrar cuáles eran las combinaciones permitidas que realmente existían, utilizamos dos oligonucleótidos "clones" que contenían una cierta restricción en el sitio de información para amplificar las secuencias del ARN obtenido de la cuarta ronda del experimento B, del que se clonaron individuos en pUC18, según se describe (Sambrook et al. (1989) supra; Innis et al. (1988) supra). A continuación, se eligieron los lotes seleccionados del ensayo B para su posterior examen, ya que parecían presentar una distribución uniforme de los dos nucleótidos permitidos que componían cada una de las cuatro posiciones "variables". Se secuenciaron veinte clones individuales que habían sido identificados mediante hibridación de colonias sobre filtro al cebador 3’. Ninguno de estos individuos resultó ser mutante en ningún punto de la secuencia del operador, aparte de las posiciones de la secuencia de bucle que habían sido variadas de forma deliberada. Las distribuciones de secuencia se resumen en la Figura 7. De forma sorprendente, la mezcla de ARN seleccionada estaba realmente compuesta por dos secuencias de bucle mayoritarias. Una era una secuencia de tipo natural, AAUAACUC, y se aisló en 9 de los 20 clones. La otra, AGCAACCU, era mutante en cuatro posiciones y existía en 8 de los 20 clones (ver la Figura 7). Las otras tres secuencias de bucle detectadas eran mutaciones simples de estas dos secuencias mayoritarias. Los experimentos de unión sobre filtro con transcritos in vitro marcados derivados de cada uno de estos aislados clonales indicaban que existía una burda correlación entre la afinidad de unión de un ARN para gp43 y la abundancia seleccionada (ver la Figura 7).
Ejemplo 2 Aislamiento de un ligando de ARN específico para la transcriptasa inversa de HIV
La actividad de la transcriptasa inversa del HIV-1 se compone de un heterodímero de dos subunidades (p51 y p66) que presentan un extremo amino terminal común. La región carboxiterminal adicional del péptido más grande comprende el dominio ARNasa H de transcriptasa inversa; la estructura de este dominio ha sido recientemente determinada a alta resolución.
Se ha mostrado previamente que esta transcriptasa inversa de HIV-1 interacciona directa y específicamente con su ARNt^{Lys3} cebador cognado con el que fue entrecruzado en el bucle y el brazo del anticodón de forma experimental. También se observó que el heterodímero exhibía este reconocimiento específico de ARN; ninguna de las especies homodiméricas de la transcriptasa inversa se unen de forma específica a este ARNt.
Se crearon dos poblaciones de plantillas (con aproximadamente 10^{14} secuencias diferentes cada una de ellas) para usarse en SELEX mediante ligación. En una población de plantillas se aleatorizaron 32 posiciones de nucleótidos, usando secuencias fijas en los extremos de la región aleatorizada para conseguir la síntesis de ADNc y la amplificación en PCR. La segunda población de plantillas presentaba, como secuencia fija adicional en el extremo 5' del ARN, el bucle y el brazo anticodón de tRNA^{Lys3}. (Todos los oligos empleados en este trabajo se describen en la Tabla 2). No existía ninguna diferencia de afinidad entre las dos poblaciones aleatorizadas de transcriptasa inversa de HIV-1 [RT] (y, como se muestra, los ARN que habían sido seleccionados no utilizaron la región 5' en una unión específica). Se realizaron nueve rondas de SELEX con cada población usando el heterodímero HIV-RT como proteína objetivo.
El mecanismo empleado para preparar el ADN aleatorizado utilizando ligaciones y oligonucleótidos puente se ha descrito previamente. Dicha metodología puede disminuir el número total de secuencias diferentes en la población inicial con respecto al límite teórico impuesto por la síntesis de ADN a escala micromolar.
En estas reacciones de ligación se utilizó aproximadamente 1 nanomol de cada oligonucleótido. El producto ligado se purificó por gel con un rendimiento aproximado del 50%. Esta plantilla purificada se transcribió con ARN polimerasa de T7, según se describe anteriormente. Se observó que HIV RT podía unirse de forma saturable a esta población aleatoria, produciéndose la unión media máxima a aprox. 7 x 10^{-7} M, según se determinó mediante ensayos con nitrocelulosa. Todas las reacciones de unión ARN-proteína se realizaron en un tampón de unión de KOAc 200 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,7, ditiotreitol 10 mM. Las diluciones de ARN y de proteína se mezclaron y almacenaron en hielo durante 30 minutos para, a continuación, pasarse a 37ºC durante 5 minutos. (En los ensayos de unión, el volumen de reacción es de 60 \mul, de los que se emplean 50 \mul; en las rondas SELEX el volumen de reacción es de 100 \mul). Cada reacción fue succionada a través de un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido (con tampón de unión) y lavada con 3 ml de tampón de unión, tras lo cual fue sometido a secado y conteo para los ensayos o sometido a elución como parte del protocolo SELEX. Se realizaron nueve rondas. La concentración de ARN en las nueve rondas fue de aproximadamente 3 x 10^{-5} M. La concentración de HIV-RT fue de 2 x 10^{-8} M en la primera selección y de 1 x 10^{-8} M en las selecciones 2-9.
El experimento que utilizaba ARN que contenía el bucle y el brazo del anticodón de tRNA^{Lys3} se completó en primer lugar. Los ensayos de unión sobre filtro de nitrocelulosa realizados en la novena ronda revelaron que la afinidad por HIV-1 RT de la población de ARN había aumentado en unas 100 veces en comparación con la mezcla inicial de candidatos, aunque la capacidad de unión de fondo a los filtros de nitrocelulosa en ausencia de proteína había aumentado de aprox. 2% del ARN de entrada al 15%. Las secuencias individuales se clonaron a partir de esta población (tras filtración a través de filtros de nitrocelulosa para eliminar parte del elevado fondo de secuencias potenciales seleccionadas para ser retenidas únicamente por los filtros) y se enumeran en la Tabla 3. Los ensayos de unión sobre filtros de nitrocelulosa de las secuencias seleccionadas por su afinidad por HIV RT se muestran en la Figura 14. Algunas de las secuencias fueron seleccionadas como ligandos para HIV RT, como se muestra en las curvas de unión de los ligandos 1.1 y 1.3a, y mostraron cierta homología en la secuencia, como se ilustra en las Tablas 4 y 5. Algunas de las secuencias de ligando exhibían una significativa retención en los filtros de nitrocelulosa en ausencia de la proteína, como por ejemplo ocurría con el ligando 1.4 (Figura 14), y parecían caracterizarse por una hélice larga con un bucle de repetidos elementos de purina (como se muestra en la Tabla 4). A pesar de nuestros mínimos esfuerzos finales por eliminarlas en este experimento antes de realizar la clonación, estas secuencias constituyeron una parte significativa de las secuencias obtenidas en este experimento.
Como consecuencia, el experimento 2 (que presenta una secuencia 5' fija diferente) fue prefiltrado sobre nitrocelulosa antes de realizar la primera, tercera, sexta y novena ronda de selección. Las secuencias obtenidas en este experimento se muestran en la Tabla 6. Existen de nuevo numerosas secuencias que presentan homología con las secuencias de alta afinidad del experimento 1, como se muestra en las Tablas 4 y 5. Existe un número mucho menor de secuencias, si existen, que se ajusten al motivo de las secuencias retenidas únicamente por los filtros de nitrocelulosa. Los ensayos de unión sobre nitrocelulosa de las secuencias de ligando seleccionadas en este experimento se compararon con los del ligando 1.1 y se muestran en la Figura 15.
Los ARN de los ligandos con alta afinidad con la secuencia más común (1.1) y con una secuencia similar (1.3a) se analizaron en detalle para determinar los entornos de información necesarios para que la unión a HIV-1 RT presente una alta afinidad. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 16. Estos experimentos establecen que el motivo común de estas secuencias, UUCCGNNNNNNNNCGGGAAA, se posiciona de forma similar dentro del dominio de reconocimiento. Las secuencias UUCCG y CGGGA de este motivo se pueden emparejar para formar una hélice de ARN con un bucle de ocho bases. Con el fin de determinar qué contribuía, además de estas secuencias fijas, a la alta afinidad de la unión a HIV-1 RT, se creó una mezcla de plantillas de candidatos que contenía una incorporación aleatoria en las posiciones de los nucleótidos que eran diferentes de estas dos secuencias, como se muestra en la Tabla 7. Tras ocho rondas de SELEX, las secuencias individuales fueron clonadas y secuenciadas. Las 46 secuencias obtenidas se muestran en la Tabla 7. La inspección de estas secuencias revela un extensivo apareamiento de bases entre la región variable 8n central y la región variable 4n secuencia abajo y las secuencias que la flanquean; el apareamiento de bases, combinado con lo anteriormente discutido, indicaría la formación de un pseudonudo de ARN. El hecho de que en esta población evolucionada no predomine ninguna secuencia específica sugiere que no existe ningún tipo de selección a nivel de la secuencia primaria, y que dicha selección se produce únicamente en base a la estructura secundaria, es decir, existen numerosas combinaciones de secuencias que presentan afinidades similares por HIV-1 RT, y ninguna de ellas presenta una ventaja competitiva. El análisis del primer y del segundo experimento SELEX revela que las secuencias individuales que comprenden las poblaciones que presentan homología en el motivo UUCCG...CGGGANAA, también muestran un fuerte potencial para este apareamiento de bases en forma de pseudonudo.
La Figura 31 muestra un diagrama esquemático de lo que aquí se denomina un pseudonudo. Un pseudonudo comprende dos secciones helicoidales y tres secciones de bucle. No todos los pseudonudos contienen los tres bucles. Con el fin de interpretar los datos obtenidos se han marcado las diferentes secciones del pseudonudo, como se muestra en la Figura 31. Por ejemplo, en la Tabla 5 se enumeran algunas de las secuencias obtenidas en los experimentos 1 y 2, de acuerdo con la configuración de pseudonudo asumida para las diferentes secuencias.
Los resultados de los experimentos 1 y 2, según se definen en la Tabla 5, condujeron al experimento 3 en el que se fijaron las secuencias S1(a), S1(b) y L3. De nuevo, los ácidos nucleicos derivados del SELEX se estructuraron casi exclusivamente formando pseudonudos. El examen de los resultados de cada uno de los experimentos revela que la solución de ácidos nucleicos para HIV-RT contiene un número relativamente grande de miembros, siendo el denominador común más básico el hecho de que todos están formando pseudonudos. Otras generalizaciones que definen la solución de ácidos nucleicos para HIV-RT son las siguientes:
1) S1(a) comprende frecuentemente la secuencia 5'-UUCCG-3' y S1(b) comprende frecuentemente la secuencia 5'-CGGGA-3'. Sin embargo, están permitidos los cambios de pares de base y el brazo se puede acortar.
2) L1 puede ser largo o corto, pero frecuentemente comprende dos nucleótidos en los ácidos nucleicos que presentan una unión más firme. El nucleótido 5' de L1 es, a menudo, U o A.
3) S2 suele comprender 5 ó 6 pares de bases, y parece ser independiente de la secuencia. Este brazo puede contener pares no-Watson/Crick.
4) L2 puede no estar formado por nucleótidos, pero, cuando existe, los nucleótidos son ventajosamente A.
5) L3 suele comprender 3 ó más nucleótidos, enriquecido en A.
6) En la mayoría de las secuencias obtenidas con SELEX, el número total de nucleótidos en L1, S2(a) y L2 es igual a 8.
El objetivo principal de este experimento era encontrar soluciones de ligandos para HIV-1 RT. La capacidad del clon 1.1 del ligando evolucionado se comparó con la capacidad de la población inicial del experimento 1 para inhibir la actividad de la transcriptasa inversa, y se muestra en la Figura 17. Incluso a concentraciones iguales del inhibidor de ARN y de RT, la transcriptasa inversa es inhibida de forma significativa por el ligando 1.1. En contraste, a una concentración de ARN en la población inicial de tan sólo 10 mM (o con un exceso de 200 veces), existe una inhibición significativa del HIV-1 RT. Así, el ligando de alta afinidad para HIV-1 RT bloquea o interacciona directamente con el sitio catalítico de la enzima.
Con el fin de comprobar la especificidad de esta inhibición, se probaron diferentes concentraciones de ligando 1.1 para inhibición de MMLV, AMV y transcriptasa inversa de HIV-1.
Los resultados de este experimento, mostrado en la Figura 18, muestran que la inhibición del ligando 1.1 es específica para la transcriptasa inversa de HIV-1.
Ejemplo 3 Aislamiento de un ligando de ARN específico para la cubierta proteica del bacteriófago R17
El procedimiento SELEX se realizó en la cubierta proteica del bacteriófago R17. La proteína se purificó según se describe en Carey et al., Biochemistry, 22, 2601 (1983). El tampón de unión fue KOAc 100 mM más ditiotreitol 50 mM, Tris-acetato pH 7,5. La proteína y el ARN se incubaron juntos durante tres minutos a 37ºC y, a continuación, se filtró la mezcla sobre filtros de nitrocelulosa para separar el ARN unido a proteína del ARN libre. Los filtros se lavaron con Tris-acetato 50 mM pH 7,5. La concentración de la proteína era de 1,2 x 10^{-7} M en las primeras cuatro rondas de SELEX y de 4 x 10^{-8} para las rondas 5 a 11.
El ARN inicial se transcribió a partir de ADN, según se ha descrito anteriormente. La secuencia de ADN incluye la secuencia promotora de ARN polimerasa de T7 que permite sintetizar el ARN según las técnicas estándares. La síntesis de ADNc durante la fase de amplificación del ciclo SELEX es cebada por un ADN de la secuencia:
3
Los cebadores de ADN usados para amplificar el ADNc incluían en la secuencia el promotor T7, 32 posiciones aleatorizadas, un dinucleótido AT, y la secuencia fija complementaria del cebador 1 de PCR. El ARN usado para iniciar el primer ciclo de SELEX presentaba la secuencia:
4
Tras la ronda 11 de SELEX se obtuvo y secuenció un conjunto de clones. Entre las 38 secuencias diferentes obtenidas en los 47 clones, tres se encontraron más de una vez: una secuencia apareció seis veces, una secuencia apareció cuatro veces y otra apareció dos veces. Las 35 secuencias restantes aparecieron una vez cada una. Dos secuencias no eran similares a las otras en lo que respecta a las secuencias primarias o a las estructuras secundarias probables, y no se analizaron más en detalle. Treinta y seis secuencias presentaban la secuencia ANCA en común, situada como un bucle tetranucleótido de una horquilla protuberante; el nucleótido protuberante era una adenina en los 36 casos. Las secuencias del conjunto completo se muestran en la Tabla 8, alineadas por los cuatro nucleótidos del bucle en horquilla. Los dos nucleótidos 3' de la porción aleatorizada del ARN inicial (un AU) no habían sufrido cambios ni habían sido eliminados, ya que el cebador de ADNc no incluye los dos nucleótidos complementarios; en muchos clones se habían cambiado uno o dos de estos nucleótidos.
El motivo de ARN ganador, mostrado en la Figura 19, presenta una relación directa con el sitio de unión de la cubierta previamente identificado mediante mutagénesis dirigida por el sitio de unión y mediante estudios de unión. Ver, Uhlenbeck et al. supra (1983); Ramaniuk et al. supra (1987). Sin embargo, algunas de las secuencias de este conjunto son más conservadoras de lo que cabía esperar. La secuencia AUCA del bucle predomina, mientras de los datos previos de unión habían sugerido que las secuencias ANCA eran todas equivalentes. El sitio de unión natural del genoma de R17 incluye la secuencia y la estructura mostradas a continuación:
5
La estructura natural incluye la secuencia GGAG, que sirve para facilitar la unión de ribosomas y para iniciar la traducción de la región codificadora de la replicasa R17. Dicho requisito no está presente durante SELEX, y las secuencias ganadoras contienen los pares de bases C:G más a menudo que los pares de bases G:C alrededor del bucle y de la protuberancia. Así, SELEX relaja las restricciones impuestas por la biología y por la evolución, haciendo que los ligandos presenten mayores afinidades que el ligando natural. De igual forma, la citidina del bucle encontrada en cada una de las 36 secuencias es una uridina en el sitio natural, y es conocido que C proporciona mayor afinidad que U. Durante la evolución, los sitios naturales deben presentar una afinidad apropiada y no deben presentar la máxima afinidad, ya que la unión más firme posible podría suponer una desventaja para el organismo.
Ejemplo 4 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para una proteasa de serina
Las proteasas de serina son enzimas proteínicas que rompen los enlaces peptídicos de las proteínas. Las proteasas de serina son miembros de una familia génica en los mamíferos, y son importantes enzimas en la vida de los mamíferos. Las proteasas de serina no son conocidas por unirse a ácidos nucleicos. Ejemplos de proteasas de serina son el activador tisular del plasminógeno, tripsina, elastasa, quimotripsina, trombina y plasmina. Numerosos estados patológicos se pueden tratar con ligandos de ácido nucleico que se unen a proteasas de serina como, por ejemplo, los trastornos de coagulación y la formación de trombos. Las proteasas que no son proteasas de serina también son importantes en la biología de los mamíferos, y éstas también podrían ser objetivos para ligandos de ácido nucleico con afinidades apropiadas obtenidas según la invención aquí descrita.
El activador tisular del plasminógeno humano (htPA), disponible comercialmente, fue elegido como una proteasa de serina para emplearse en el procedimiento SELEX de esta invención. La mezcla de candidatos de ARN utilizada era idéntica a la descrita en el Ejemplo 11 siguiente en el experimento de la ADN polimerasa de HSV.
Durante SELEX, la unión se realizó en NaCl 50 mM más Tris-acetato 50 mM pH 7,5 durante 3 minutos a 37ºC. SELEX se llevó a cabo durante diez rondas. La mezcla de candidatos 30N se unió a hPA con una afinidad (kd) de 7 x 10^{-8} M en NaAc 150 mM más Tris-acetato 50 mM pH 7,5; la afinidad del ARN presente tras nueve rondas de SELEX era aproximadamente tres veces más firme. Se aislaron y secuenciaron 9 clones y algunos de ellos fueron probados para determinar su unión a tPA como ARN puros. Las secuencias de los nueve clones obtenidos a baja salinidad fueron los siguientes:
6
Todas las secuencias probadas se unían con una fuerza al menos ligeramente mejor que la mezcla de candidatos 30N inicial. Sin embargo, la serie A se unía más firmemente a la nitrocelulosa en ausencia de tPA que la mezcla de candidatos, como si el motivo de secuencia compartida causara una retención de la matriz de nitrocelulosa por sí misma. Dicho motivo aparece subrayado en las secuencias mostradas arriba. En otros experimentos SELEX, se aislaron repeticiones de AGG al intentar identificar una solución de ligando para transcriptasa inversa de HIV-1, para el dominio extracelular del receptor de la hormona de crecimiento humana e, incluso, para la cubierta proteica de R17 en un primer experimento andante. Al ser probadas, estas secuencias mostraron una unión modesta o sustancial a los filtros de nitrocelulosa sin la presencia de la proteína objetivo. Parece que las repeticiones AGG se pueden encontrar en los bucles en horquilla. Dado que SELEX es un proceso iterativo en la mayoría de las realizaciones, no es sorprendente que aparezcan dichos motivos de unión.
La existencia de motivos unidos a nitrocelulosa se puede evitar empleando una o varias estrategias obvias. El ARN se puede filtrar sobre filtros de nitrocelulosa antes de realizar el proceso SELEX para eliminar dichos motivos. Se pueden emplear matrices alternativas en rondas alternativas de SELEX, por ejemplo, filtros de fibra de vidrio. Se pueden utilizar sistemas de separación alternativos, por ejemplo, columnas, gradientes de sucrosa, etc. Es evidente que cualquier proceso único generará desviaciones en el proceso iterativo que favorecerán los motivos que no presentan una mayor unión al objetivo, pero que son seleccionados por el proceso de selección. Por ello, es importante utilizar procesos alternativos o procesos de cribado para eliminar estos motivos. Se ha demostrado que las repeticiones AGG, al igual que otros motivos aislados como desviaciones independientes del objetivo, tenderán a aparecer más frecuentemente cuando la afinidad por el objetivo de las mejores secuencias sea baja o cuando las afinidades de las mejores secuencias sólo sean ligeramente superiores a la afinidad de la mezcla de candidatos inicial para el objetivo.
Ejemplo 5 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para un receptor mamífero
Los receptores mamíferos son, a menudo, proteínas que residen en las membranas citoplasmáticas de las células y que responden a las moléculas que circulan por el exterior de dichas células. La mayoría de los receptores no son conocidos por unirse a ácidos nucleicos. El receptor de la hormona de crecimiento humano responde a la hormona de crecimiento humano circulante, mientras que el receptor de insulina responde a la insulina circulante. Los receptores tienen, a menudo, una porción globular de la molécula del lado extracelular de la membrana, y dicha porción globular se une de forma específica a la hormona (que es el ligando natural). Numerosos estados patológicos se pueden tratar con ligandos de ácidos nucleicos que se unen a receptores.
Los ligandos que se unen a un dominio globular soluble del receptor de la hormona de crecimiento humano (shGHR) se identificaron y purificaron usando la mezcla de candidatos del Ejemplo 4. De nuevo, los tampones de unión estaban libres de DTT. El dominio globular soluble del receptor de la hormona de crecimiento humano está disponible comercial y académicamente, habiéndose creado normalmente mediante tecnología de ADN recombinante aplicada a todo el gen que codifica una proteína receptora unida a membrana. Se utilizó SELEX de forma reiterada hasta que se encontraron los ligandos. Los ligandos fueron clonados y secuenciados, y se midieron sus afinidades de unión para el receptor soluble. Para el mismo ligando, se midieron las afinidades de unión por otros receptores solubles con el fin de determinar la especificidad, a pesar de que la mayoría de los receptores no muestran fuertes homologías proteicas con los dominios extracelulares de otros receptores. Los ligandos se utilizaron para medir la inhibición de la actividad normal de unión de shGHR mediante la medición de la unión competitiva entre el ligando de ácido nucleico y el ligando natural (hormona).
Ejemplo 6 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para una hormona o factor mamífero
Las hormonas o factores mamíferos son proteínas, por ejemplo, la hormona de crecimiento, o pequeñas moléculas (por ejemplo, epinefrina, hormona tiroidea) que circulan por el animal ejerciendo sus efectos mediante la combinación con los receptores que residen en el interior de las membranas citoplasmáticas de las células. Por ejemplo, la hormona de crecimiento humano estimula las células interaccionando primero con el receptor de la hormona de crecimiento humano, mientras de que la insulina estimula las células interaccionando primero con el receptor de la insulina. Muchos factores de crecimiento, por ejemplo, el factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF), incluyendo algunos que son específicos del tipo de célula, interaccionan primero con los receptores de las células objetivo. Así, las hormonas y los factores son ligandos naturales de algunos receptores. Las hormonas y los factores no son conocidos, normalmente, por unirse a ácidos nucleicos. Numerosos estados patológicos, por ejemplo, hipertiroidismo o hipoglucemia crónica, se pueden tratar con ligandos de ácido nucleico que se unen a hormonas y factores.
Los ligandos que se unen a la insulina humana se identifican y purifican usando el material inicial del Ejemplo 3. La insulina humana está disponible comercialmente, habiéndose creado normalmente mediante tecnología de ADN recombinante. Se utilizó SELEX de forma reiterada hasta que se encontró un ligando. Los ligandos fueron clonados y secuenciados, y se midieron las afinidades de unión para la insulina humana. Para el mismo ligando, se midieron las afinidades de unión por otras hormonas o factores con el fin de determinar la especificidad, a pesar de que la mayoría de las hormonas y factores no muestran fuertes homologías proteicas con la insulina humana. No obstante, existen algunas familias génicas de hormonas y factores, incluyendo una pequeña familia de IGF, o factores de crecimiento de tipo insulina. Los ligandos de ácido nucleico se usan para medir la inhibición de la actividad normal de unión de la insulina humana por su receptor mediante la medición de la unión competitiva entre el receptor de insulina y el ligando de ácido nucleico en presencia o ausencia de insulina humana, el ligando natural.
Ejemplo 7 Preparación de una matriz columna para SELEX
Siguiendo los procedimientos descritos en el Ejemplo 9 siguiente, se demuestra que la bradiquinina polipeptídica no es retenida por la nitrocelulosa. Para poder realizar el proceso SELEX en la bradiquinina, la proteína se unió a CH Sepharose 4B activada (Pharmacia LKB) como matriz soporte según los procedimientos estándares. Mediante ensayo con ninhidrina, se determinó que la matriz resultante era 2,0 mM en bradiquinina. Ver Crestfidld et al. J. Siol. Chem. vol. 238, pp. 238, pp. 622-627 (1963) ; Rosen Arch, Biochem. Biophys., vol. 67, pp. 10-15 (1957). Los grupos activados que quedaron en la matriz soporte fueron bloqueados con Tris. Ver Pharmacia, Affinity Chromatography: Principles and Methods, Ljungforetagen AB, Uppsala, Suecia (1988).
Se empleó la separación en columnas centrifugadas para poner en contacto las soluciones de las mezclas de candidatos con la matriz perlada. En un procedimiento general para realizar el paso de selección de SELEX, se transfirieron 40 \muL de una mezcla 50:50 de sefarosa objetivo en tampón de reacción a un tubo Eppendorf de 0,5 ml. Se añadió la mezcla de candidatos de ARN con 60 \muL de tampón de reacción y se permitió que la mezcla de reacción se equilibrase durante 30 minutos a 37ºC. En el fondo del tubo se perforó un orificio, y el tubo se colocó en el interior de un tubo Eppendorf más grande, ambos sin tapón, y se centrifugaron los tubos (1000 rpm, 10 minutos, 21ºC) para separar el eluato. A continuación, se transfirió el tubo pequeño a un nuevo tubo más grande, y el contenido se lavó cuatro veces mediante separación con 50 \muL del tampón de lavado seleccionado y agitación. Para realizar los ensayos de unión, el tubo que contenía el ARN radioactivo fue transferido a un nuevo tubo Eppendorf y agitado hasta sequedad.
Se realizó un experimento de unión en el que se aplicó una mezcla de candidatos de ARN, que comprende un segmento aleatorizado de 30 ácidos nucleicos, a la matriz de sefarosa con bradiquinina. Usando la técnica de columnas centrifugadas, la unión del ARN 30N global a varias matrices se determinó bajo altas concentraciones de sal para determinar las condiciones más adecuadas para minimizar la unión de fondo a la sefarosa. La unión de fondo del ARN a la sefarosa se minimizó bloqueando con Tris los grupos activados de la sefarosa y usando un tampón de unión de DEM 10 mM y KOAc 10-20 mM. Bajo estas condiciones tamponadas, la curva de unión de la solución global aleatorizada de ARN proporcionó un Kd global de aprox. 1,0 x 10^{-5}. Ver la Figura 20. La curva se determinó diluyendo la sefarosa con bradiquinina frente a la sefarosa activada bloqueada.
Ejemplo 8 Preparación de mezclas de candidatos enriquecidas en estructuras con motivos de ARN
En la realización ventajosa, la mezcla de candidatos a utilizar en SELEX comprende una región contigua de entre 20 y 50 ácidos nucleicos aleatorizados. El segmento aleatorizado está flanqueado por secuencias fijas que permiten la amplificación de los ácidos nucleicos seleccionados.
En una realización alternativa, las mezclas de candidatos se crean para mejorar el porcentaje de ácidos nucleicos en la mezcla de candidatos que posee determinados motivos de ácidos nucleicos. Aunque aquí se muestran dos ejemplos específicos, esta invención no está limitada a ellos. Un experto en la técnica podría crear mezclas de candidatos equivalentes para conseguir el mismo resultado general.
En un ejemplo específico, mostrado en la Secuencia A de la Figura 21, la mezcla de candidatos se prepara de forma que la mayoría de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se desviarán para formar una región helicoidal de entre 4 y 8 pares de bases, y un "bucle" de 20 ó 21 secuencias aleatorizadas contiguas. Los extremos 5' y 3' de la mezcla de secuencias contendrán secuencias fijas que son esenciales para la amplificación de los ácidos nucleicos. De forma paralela, las secuencias fijas funcionales serán secuencias fijas elegidas para emparejarse con las secuencias fijas del lado opuesto de la región aleatorizada. Yendo del extremo 5' al extremo 3' de las secuencias, existirán 5 regiones bien definidas: 1) secuencias fijas para amplificación; 2) secuencias fijas para formar una estructura helicoidal; 3) residuos de 20 ó 21 ácidos nucleicos aleatorizados; 4) secuencias fijas para formar una estructura helicoidal con las secuencias de la región 2; y 5) secuencias fijas para amplificación. La mezcla de candidatos A de la Figura 21 estará enriquecida en motivos de bucle en horquilla y en motivos protuberantes asimétricos y simétricos. En una realización ventajosa, la mezcla de candidatos contendría cantidades iguales de secuencias en las que la región aleatorizada fuera de 20 y 21 bases de longitud.
Un segundo ejemplo, mostrado en la Figura 21 como secuencia B, está diseñado para enriquecer la mezcla de candidatos en ácidos nucleicos suspendidos en el motivo de pseudonudo. En esta mezcla de candidatos, las secuencias fijas para amplificación flanquean tres regiones de 12 posiciones aleatorizadas. Las tres regiones aleatorizadas están separadas por dos regiones fijas de cuatro nucleótidos, con las secuencias fijas seleccionadas para formar, ventajosamente, una estructura helicoidal de cuatro pares de bases. Yendo del extremo 5' al extremo 3' de la secuencia, existirán 7 regiones bien definidas: 1) secuencias fijas para amplificación; 2) 12 nucleótidos aleatorizados; 3) secuencias fijas para formar una estructura helicoidal; 4) 12 nucleótidos aleatorizados; 5) secuencias fijas para formar una estructura helicoidal con los nucleótidos de la región 3; 6) 12 nucleótidos aleatorizados; y 7) secuencias fijas para
amplificación.
En una mezcla de candidatos ventajosa, las regiones helicoidales creadas han sido diseñadas para generar pares de bases GC, CG, GC, CG alternativos. Este motivo de pares de bases ha demostrado proporcionar una estructura helicoidal particularmente estable.
Ejemplo 9 Unión global de secuencias de ARN aleatorizadas a proteínas no conocidas por unirse a ácidos nucleicos
Siguiendo los procedimientos generales de selección con nitrocelulosa descritos en el Ejemplo 1 anterior para SELEX, un grupo de proteínas seleccionadas de forma aleatoria fue probado para determinar si mostraban alguna afinidad por una mezcla global de candidatos de secuencias de ARN. La mezcla de candidatos utilizada en cada experimento está formada por una solución de ARN 40N (una mezcla aleatorizada que presenta un segmento de 40 ácidos nucleicos aleatorizados) marcada radiactivamente para permitir la detección del porcentaje de unión. La mezcla de candidatos se diluyó en tampón de unión (KOAc 200 mM, TrisOAc 50 mM pH 7,7 con DTT 10 mM) y se utilizaron 30 \mul en una reacción de unión de 60 \mul. A cada reacción se añadieron 20 \mul, 10 \mul ó 1 \mul de cada proteína. A continuación, se añadió tampón de unión hasta alcanzar un volumen total de 60 \mul. Las mezclas de reacción se incubaron a 37ºC durante 5 minutos y, a continuación, fueron sometidas a unión sobre filtro.
Las proteínas probadas fueron acetilcolinesterasa (MW 230.000); N-acetil-\beta-D-glucosaminidasa (MW 180.000); actina (MW 43.000); alcohol deshidrogenasa (MW 240.000); aldehido deshidrogenasa (MW 200.000); angiotensina (MW 1.297); ascorbato oxidasa (MW 140.000); factor natriurético atrial (MW 3.064); y bombesina (MW 1.621). Las proteínas fueron adquiridas a Boehringer Ingelheim, y se utilizaron en la composición tamponada en la que se suministraron.
La mezcla de candidatos de ARN usada en cada experimento contenía 10.726 recuentos de radiomarcador, y se encontró una unión de fondo de unos 72 recuentos. Los resultados se resumen en la Tabla 9. Todas las proteínas probadas, a excepción de acetilcolinesterasa, N-acetil-\beta-D-glucosaminidasa y actina, mostraron cierta afinidad global por ARN. Debido a la baja concentración en N-acetil-\beta-D-glucosaminidasa de la solución adquirida, los resultados para dicha proteína no fueron definitivos. Además, si alguna de las proteínas probadas no se une a nitrocelulosa, como sucede en el caso de la bradiquinina, en este experimento no se pudo detectar ninguna afinidad. El Ejemplo 7 anterior, en el que se discute el caso de la bradiquinina soportada en una columna, demuestra que el hecho de que no se pueda mostrar la unión global en este experimento no significa que dicha unión global no exista para una proteína dada.
Ejemplo 10 Aislamiento de una solución de ligando de ARN para el factor de crecimiento nervioso
El factor de crecimiento nervioso (NGF) es un factor de proteína que actúa a través de un receptor en las superficies externas de las células objetivo. Los antagonistas frente a factores de crecimiento y otras hormonas pueden actuar bloqueando un receptor o valorando el factor o la hormona. Mediante el proceso SELEX se buscó un ARN que se uniera directamente al NGF.
Los ARN iniciales se prepararon exactamente igual que en el caso de la ADN polimerasa de HSV (Ejemplo 11).
Se realizaron dos experimentos diferentes con NGF. El primero de ellos fue un SELEX de 10 rondas en el que se usó un tampón de unión con baja salinidad, incubación a 37 grados durante 3 minutos y, a continuación, filtración y lavado con el mismo tampón utilizado durante el SELEX. El tampón de unión con baja salinidad era NaCl 50 mM más Tris-acetato 50 mM a pH 7,5. En el segundo experimento se utilizó como tampón de unión NaCl 200 mM más Tris-acetato 50 mM a pH 7,5 y, a continuación y tras la filtración, se realizó un lavado con Tris-acetato 50 mM pH 7,5; este experimento SELEX se llevó a cabo durante siete rondas únicamente.
El experimento con baja salinidad permitió obtener 36 secuencias clonadas. Quince de los clones eran prácticamente idénticos: los números 2, 3, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 19, 22, 28, 33 y 34 eran idénticos, mientras que los números 15 y 25 presentaban una única diferencia:
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7
Una segunda secuencia abundante, encontrada seis veces, fue
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8 
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A partir del SELEX con alta salinidad se habían secuenciado diez clones, pero ocho de ellos eran idénticos y, obviamente, relacionados con la segunda clase más abundante (aunque minoritaria) del experimento realizado con baja salinidad. La secuencia ganadora fue:
9
Entre los dos experimentos, se obtuvo un total de 14 secuencias diferentes (las secuencias que presentaban una sola diferencia han sido agrupadas en este análisis); dichas secuencias se enumeran aquí, con las semejanzas marcadas y las frecuencias anotadas. ngf.a a ngf.k provienen del experimento realizado con baja salinidad, mientras que hsngf.a a hsngf.c provienen del experimento realizado con alta salinidad:
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11
Aunque ninguna estructura secundaria evidente esté incorporada en las secuencias similares, es probable que las secuencias ganadoras coloquen los nucleótidos críticos en una estructura que se ajuste perfectamente por un sitio de unión de NGF.
Se realizó un ensayo de unión del ácido nucleico hsngf.a a NGF, y se observó que este ácido nucleico presentaba una Kd unas 20 a 30 veces superior que la mezcla global de candidatos 30N. También se observó que este mismo ácido nucleico presentaba una afinidad por la cubierta proteica de R17 y por tPA que era inferior o igual a la afinidad de una mezcla de candidatos 30N. Así, el ligando hsngf.a de ácido nucleico derivado de SELEX es un ligando selectivo para NGF.
Ejemplo 11 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para la ADN polimerasa de HSV-1
El virus del Herpes simplex (HSV-1) es un virus de mamíferos que contiene ADN. El HSV-1, al igual que muchos otros virus que contienen ADN, codifica su propia ADN polimerasa. La ADN polimerasa de HSV-1 ha sido purificada en dos formas, que presentan diferentes cualidades aunque ambas catalizarán la replicación de ADN in vitro. La forma simple, que es un polipéptido, se purifica a partir de células que expresan el gen clonado de acuerdo con Hernández, T.R. y Lehman, I.R., J. Biol. Chem., 265, 11227-11232 (1990). La segunda forma de la ADN polimerasa, un heterodímero, se purifica a partir de células infectadas por HSV-1, de acuerdo con Crute, J.J. y Lehman, I.R., J. Biol. Chem., 264, 19266-19270 (1989); el heterodímero contiene un péptido que corresponde a la polimerasa en sí misma y otro péptido, UL42, también codificado por HSV-1.
El proceso SELEX se realizó en ambos, el polipéptido simple y el heterodímero. El tampón de unión en ambos casos fue KOAc 50 mM más Tras-acetato 50 mM, pH 7,5, y ditiotreitol 1 mM. La filtración necesaria para separar el ARN unido se realizó tras 4 minutos de incubación a 37 grados; los filtros fueron lavados con tampón de unión sin ditiotreitol.
La mezcla de candidatos de ARN se transcribió a partir de ADN, según se ha descrito anteriormente. Al igual que en el caso de otras realizaciones, la secuencia de ADN incluye la secuencia promotora de ARN polimerasa del bacteriófago T7 que permite sintetizar el ARN según las técnicas estándares. La síntesis de ADNc durante la fase de amplificación de SELEX es cebada por un ADN de la secuencia:
12
Los cebadores de ADN usados para amplificar el ADNc en dicha fase del ciclo SELEX incluyen, en uno de ellos, el promotor de T7; dicho cebador PCR presenta la secuencia:
13
El ARN aleatorizado inicial incluía en su secuencia el promotor de T7, 30 posiciones aleatorizadas, y la secuencia fija complementaria al cebador 1 de PCR. El ARN que se utiliza para iniciar el primer ciclo de SELEX presenta así la secuencia:
14
Se realizaron siete rondas de SELEX, tras lo cual se preparó y clonó el ADNc según se ha descrito anteriormente. Las series de secuencias denominadas "H" se obtuvieron teniendo la ADN polimerasa de HSV simple como objetivo, mientras que la serie "U" se obtuvo con la polimerasa heterodimérica que incluye el polipéptido UL42.
Cerca del 25% de las secuencias de la serie H contienen una secuencia exacta de 12 nucleótidos en el extremo 5' de la región aleatorizada (las letras mayúsculas son las de la región aleatorizada). En algunas secuencias, la longitud existente entre los cebadores fijos no era exactamente de 30 nucleótidos, y en un caso (H2) se encontró que faltaba un segmento grande de la región aleatorizada. Los miembros de este subconjunto H incluyen:
15
Dos miembros de la serie U comparten este motivo de secuencia primaria:
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16 
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Las secuencias restantes de las series H y U no muestran una secuencia común evidente; además, ninguna secuencia obtenida en la ronda 7 aparece como secuencia única ganadora en ninguna de las dos series, lo que sugiere que será necesario realizar más rondas de SELEX para encontrar la mejor familia de ligandos para inhibir la ADN polimerasa de HSV.
Parece que la secuencia primaria,
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17
puede ser un candidato para una especie antagonista, aunque todavía hay miembro de las series que deben ser probados como inhibidores de la síntesis de ADN. Parece que la secuencia fija sólo 5' a la secuencia UAAGGAGGCCAC debe participar en la aparición de este subconjunto, o que los 12 nucleótidos compartidos se habrían colocado de forma variable dentro de la región aleatorizada.
Ejemplo 12 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para la proteína ribosómica S1 de E. coli
La proteína ribosómica S1 30S de E. coli es la proteína 21 30S más grande. La proteína ha sido purificada en base a su alta afinidad por polipirimidinas, y se cree que se une de forma bastante firme a los polinucleótidos de cadena simple que son ricos en pirimidina. Se cuestionó si el ARN identificado mediante SELEX como una solución de ligando era, de alguna manera, más rico en información que un ARN de cadena simple rico en pirimidinas.
El cebador de ARN, ADN, cebador de ADNc (cebador 1 de PCR), y el cebador 2 de PCR eran idénticos a los empleados para la ADN polimerasa de HSV-1 (ver el Ejemplo 11). El tampón de unión contenía cloruro de amonio 100 mM además de cloruro de magnesio 10 mM más ditiotreitol 2 mM más Tris-acetato 10 mM, pH 7,5. La unión se produjo a temperatura ambiente, y los complejos fueron separados nuevamente mediante filtración sobre nitrocelulosa. La proteína se purificó de acuerdo con I. Boni et al., European J. Biochem., 121, 371 (1992).
Tras 13 rondas de SELEX, se obtuvo un conjunto de 25 secuencias. Más de veinte de ellas contenían pseudonudos, y dichos pseudonudos contenían elementos en común.
La estructura general de los pseudonudos se puede representar como:
BRAZO 1a - BUCLE 1 - BRAZO 2a - BRAZO 1b - BUCLE 2 - BRAZO 2b (Ver la Figura 31)
La mayoría de los ligandos de la proteína S1 contienen:
BRAZO 1 con 4 a 5 pares de bases, con un G sólo 5’ al BUCLE 1
BUCLE 1 con unos 3 nucleótidos, frecuentemente ACA
BRAZO 2 con 6 a 7 pares de bases, apilado directamente sobre el BRAZO 1
BUCLE 2 con 5 a 7 nucleótidos, frecuentemente finalizando con GGAAC
Una interpretación razonable de estos datos es que el BUCLE 2 está extendido por el BRAZO 1 de forma tal que dicho bucle se mantenga rígido en una forma que simplifique y mejore la unión de la cadena simple al sitio activo de la proteína S1. Un dibujo del pseudonudo consenso en dos dimensiones sería el siguiente:
18
En dichas figuras, se muestran los pares de bases como líneas y puntos, las selecciones de bases de la región aleatorizada se muestran en letras mayúsculas, Y es una pirimidina, R es una purina, N- N' significa cualquier par de bases, N significa cualquier nucleótido, y las letras minúsculas se utilizan para la secuencia fija usada en las amplificaciones PCR.
Parece que las proteínas de unión a polinucleótidos de cadena simple y los dominios de las proteínas seleccionarán frecuentemente, durante SELEX, un pseudonudo que presente una cadena simple rígida y ampliada, denominada BUCLE 2, para el sitio de unión de la proteína de forma tal que se maximicen las interacciones con dicho sitio. Así, cuando aparece el pseudonudo de HIV-RT, resulta razonable pensar que el dominio de cadena simple BUCLE 2 está unido dentro de la región de RT que sostiene la cadena de la plantilla durante la replicación. Es decir, parece razonable pensar que la mayoría de las enzimas de replicación (ADN polimerasa, ARN polimerasa, ARN replicasas, transcriptasas inversas) poseerán un dominio para sostener la cadena de la plantilla que puede preferir un pseudonudo como el ligando de elección del SELEX.
Ejemplo 13 Aislamiento de un ligando de ácido nucleico para la proteína Rev de HIV-1
El sitio de reconocimiento de ARN de la proteína Rev de HIV-1 parece ser complejo, y su función es esencial para la infección productiva de una patología vírica epidémica. Ver, Olsen et al., Science, vol. 247, pp. 845-848 (1990). El proceso SELEX se realizó en esta proteína para conocer más en profundidad el elemento de reconocimiento y para aislar un ligando para la proteína objetivo.
Así, se creó una mezcla de candidatos con una región aleatoria de 32 nucleótidos de longitud de acuerdo a lo descrito en el Ejemplo 2 anterior. Se observó que la proteína Rev se podría unir de forma saturable a la mezcla de candidatos inicial con una unión al 50% que se produciría a aprox. 1 x 10^{-7} M, según se determinó en los ensayos con nitrocelulosa. Todas las reacciones de unión ARN-proteína se realizaron en un tampón de unión de KOAc 200 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,7, ditiotreitol 10 mM. Las diluciones de ARN y de proteína se mezclaron y almacenaron en hielo durante 30 minutos para, a continuación, pasarse a 37 grados durante 5 minutos. (En los ensayos de unión, el volumen de reacción es de 60 \mul, de los que se emplean 50 \mul; en las rondas SELEX el volumen de reacción es de 100 \mul). Cada reacción fue succionada a través de un filtro de nitrocelulosa previamente humedecido (con tampón de unión) y lavada con 3 ml de tampón de unión, tras lo cual fue sometida a secado y conteo para la realización de los ensayos o sometida a elución como parte del protocolo SELEX. Se realizaron diez rondas de SELEX usando una concentración de ARN de aprox. 3 x 10^{-5} M. La concentración de la proteína Rev era de 1 x 10^{-7} M en la primera ronda y de 2,5 x 10^{-8} M en todas las rondas posteriores. La mezcla inicial de candidatos se pasó a través de un filtro de nitrocelulosa para reducir el número de secuencias que presentaban una alta afinidad por nitrocelulosa. Este proceso se repitió de igual forma tras las rondas 3, 6 y 9. El producto ADNc fue purificado cada tres rondas de selección para evitar la presencia de especies de tamaño anómalo que se generan normalmente con la realización de repetidas rondas de SELEX. Tras 10 rondas, la secuencia de la región invariable de la población de ARN era no aleatoria, según se determinó mediante secuenciación de la terminación de cadena didesoxi. Se clonaron y secuenciaron 53 aislados.
En la Tabla 10 se enumeran cada una de las secuencias clonadas. Todas las secuencias fueron analizadas por el programa de predicción de estructura secundaria de ARN Zucker. Ver, Zucker, Science, vol. 244, pp. 48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 86, pp. 7706-7710 (1989). En base a la estructura secundaria común, las secuencias fueron agrupadas en tres motivos comunes, como se muestra en la Tabla 11. Los motivos I y II son similares en conformación, incluyendo un bucle protuberante cerrado en cada extremo de una hélice. En la Tabla 12 se ha ilustrado esta estructura generalizada, y se han marcado los dominios para facilitar la discusión; así, desde 5' hacia 3' existen las regiones Brazo 1a (con pares de bases hacia el 3’ del Brazo 1b), Bucle 1, Brazo 2a, Bucle 3, Brazo 2b, Bucle 2, y Brazo 1b. Las secuencias que se ajustan en los diferentes dominios se enumeran en la Tabla 12 para conocer sus secuencias individuales. (Observar que en la secuencia 3a, la alineación homóloga está girada 180 grados, de forma que sea el Brazo 1 el que se cierre con un bucle.) Las energías de plegamiento de la molécula de ARN (incluyendo las secuencias fijas que la flanquean) se muestran en la Tabla 13.
El elemento que reacciona con Rev (RRE) de tipo natural, que se ha determinado que está involucrado al menos mínimamente en la unión de Rev a los transcritos de HIV-1, también fue plegado por este programa, y se incluye en las Tablas 12 y 13.
En las secuencias también se buscaron las subsecuencias correspondientes mediante un procedimiento basado en lo descrito en Hertz et al. Comput. Appl. Biosci., vol.6. pp.81-92 (1990). Se identificaron dos patrones significativos. Se dio una puntuación a cada aislado para identificar su mejor adecuación a los patrones, y los resultados se muestran en la Tabla 13. Los motivos de subsecuencias correspondientes se presentan clasificados por las estructuras secundarias comunes en conformaciones similares; es decir, la primera secuencia UUGAGAUACA se encuentra comúnmente como Bucle 1 además de en el CA 3' terminal, que se aparea con el UG del extremo 5' de la segunda secuencia UGGACUC rica en información (comúnmente, Bucle 3). Existe también un claro pronóstico de apareamiento de bases del GAG de la secuencia I con el CUC de la secuencia II. El Motivo II es similar al Motivo I en lo que respecta a que la subsecuencia GAUACAG predomina como un bucle opuesto a CUGGACAC con un apareamiento similar de CA y UG. El Motivo II se diferencia en el tamaño de los bucles y en alguna de las secuencias, especialmente en ausencia del apareamiento de bases previsto en el bucle. Un dominio del RRE de tipo natural presenta grandes semejanzas con el Motivo II. El Motivo III es el que presenta menos semejanzas con el resto de las secuencias, aunque se caracteriza por dos U protuberantes adyacentes a las bases apareadas GA-UC, al igual que el Motivo I. Desafortunadamente, resulta complicado realizar otro tipo de comparaciones, ya que el patrón de plegamiento del Motivo II incluye la región de secuencia fija 3' en estructuras secundarias críticas; dado que estas secuencias no varían, no es posible analizar la importancia de ninguna de ellas. Las secuencias plegadas de representantes de cada Motivo I se muestran en la Figura 23, junto con la secuencia plegada del RRE de tipo natural.
Las secuencias se analizaron más en detalle para conocer su afinidad por la proteína Rev. Las plantillas se sometieron a PCR de un cierto número de clones, a partir de los cuales se prepararon transcritos in vitro marcados que se probaron de forma individual para conocer su capacidad de unión a la proteína Rev. Estas curvas de unión se muestran en las Figuras 24 a 28. A partir de las plantillas de oligonucleótidos también se prepararon transcritos marcados que contenían el RRE de tipo natural discutido arriba, y que se infieren para ser el motivo consenso en una conformación altamente estable. Para controlar las variaciones experimentales, la secuencia que presentaba una mayor unión, el aislado 6a, fue probada como un patrón en todos los experimentos de unión. Las mezclas ARN-proteína fueron tratadas según se describe anteriormente, excepto por el hecho de que los ARN diluidos fueron calentados a 90 grados durante 1 minuto y enfriados sobre hielo antes de mezclarlos. El Ka medio para el aislado 6a fue de 8,5 x 10^{-8} M, y los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 13.
Las curvas de unión de la Figura 24 muestran que la población evolucionada (P) mejoró en aproximadamente 30 veces su unión a la proteína Rev en comparación con la mezcla de candidatos inicial. La unión del RRE de tipo natural es muy similar a la del clon más abundante, 1c. Este experimento también ilustra la elevada sensibilidad de la interacción de unión Rev para la estructura secundaria. Los aislados 6a y 6b son idénticos en las regiones de alto contenido de información, pero son bastante diferentes a nivel de la estructura secundaria, por lo que se producen cambios en las posiciones de tres nucleótidos. Estos cambios, que predicen el apareamiento del Brazo 1, hacen que disminuya la afinidad de 6b en un factor de 24. La sensibilidad a las anomalías en la estructura secundaria se ilustra más en detalle con la unión del aislado 17, como se muestra en la Figura 25. El aislado 17 presenta el mayor valor de información, como se muestra en la Tabla 12. Sin embargo, existe una U protuberante adicional en el extremo 5' del Bucle 1, como se muestra en la Tabla 11. Esta U adicional reduce la afinidad por Rev del aislado 17 en comparación con otras secuencias del Motivo I. Por otra parte, las eliminaciones de nucleótidos individuales de las secuencias del Bucle 2, incluso aquellas que disminuyen el panorama de apareamiento cruzado de protuberancias, son bien toleradas por la interacción con Rev.
Otra comunalidad convincente es la conservación de la secuencia ACA opuesta a UGG, en donde el CA se aparea con el UG para comenzar el Brazo 2. Esta secuencia es compartida por los Motivos I y II, así como por el RRE de tipo natural. Las secuencias 11 y 12 exhiben una sustitución de pares de bases en esta posición (ver la Tabla 12), y la secuencia 12 fue probada y presentó una afinidad reducida en comparación con las otras secuencias del Motivo I.
Las secuencias de ARN determinadas por SELEX para ser ligandos de Rev se pueden clasificar por su estructura primaria y secundaria. Un consenso surge de una protuberancia asimétrica flanqueada por dos hélices, en las que los nucleótidos de cadena simple y doble se conservan configurados de forma específica. Aunque el apareamiento de bases en la protuberancia se pronostica en numerosas de las secuencias aisladas (Motivo I), dicho apareamiento puede no ser esencial o crucial para la interacción con Rev. Los tamaños óptimos para el Bucle 1 parecen ser 8 (Motivo I) ó 6 (Motivo III), y existe una penalización observada para los tamaños de 9 ó 3. Los tamaños óptimos para el Bucle 3 son 5 y 4. Además, la interacción de Rev con los diferentes dominios de estos ligandos puede ser aditiva. El Motivo II presenta semejanzas con el Motivo I, fundamentalmente en la unión de los Bucles 1 y 3 en el Brazo 2. El Motivo III presenta semejanzas con el Motivo I en la unión de los Bucles 1 y 3 en el Brazo 1. Los diagramas consenso de las soluciones de ácido nucleico de los Motivos I y II para HIV-Rev se muestran en las Figuras 29 y 30.
La abundancia de las secuencias en la población clonada no está estrictamente correlacionada con la afinidad por la proteína Rev. Es posible que la concentración de la proteína Rev usada a lo largo del proceso SELEX fuera insuficiente para unirse a un porcentaje significativo de todos estos aislados. Como consecuencia, se puede haber producido selección para replicabilidad del ADNc y del ADN durante PCR sobrepuesta a una selección de baja dificultad para unirse a Rev. La naturaleza altamente estructurada de estos ligandos y las posibles diferencias en la eficacia de la síntesis de ADNc en estas plantillas refuerza esta potencial desviación replicativa. Además, durante el proceso SELEX se produce alguna mutación. La semejanza entre la secuencia 6a y la 6b es tal que deben tener un antecesor común. Esta llegada relativamente tardía durante las rondas de SELEX puede explicar la escasez de esta secuencia, con independencia de su mayor afinidad por el objetivo. De la misma manera, algunos de los ligandos que han surgido pueden haber mutado bastante recientemente durante la selección de las secuencias antecesoras que existen en la mezcla de candidatos inicial, pero que no están representadas en la población clonada.
La invención aquí revelada no está limitada en alcance a las realizaciones aquí reveladas. La invención, tal como se revela, puede ser aplicada por expertos en la técnica a un gran número de ligandos de ácido nucleico y objetivos. Las apropiadas modificaciones, adaptaciones y expedientes para la aplicación de las enseñanzas aquí mostradas a casos individuales pueden ser empleadas y comprendidas por los expertos en la técnica, dentro del alcance de la invención, tal como aquí se revela y reivindica.
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TABLA 2
19
TABLA 3
20 
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Los nucleótidos de las regiones fijas se muestran en letras minúsculas.
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TABLA 4
22 
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TABLA 4 (continuación)
23
Las estructuras secundarias, según previstas por el programa Zuker, se muestran con flechas superpuestas que destacan las repeticiones invertidas indicativas de un apareamiento de bases.
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(Tabla pasa a página siguiente)
24
TABLA 6
25
27
TABLA7
28
30
31
TABLA 8
33
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TABLA 10
35
TABLA 11
36
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TABLA 12
100
38 
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Secuencia I = UUGAGAUACA
Secuencia II = UUGGACUC
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Selección. Un mecanismo de cinética sencillo para la formación reversible de complejos proteína-ARN en una solución bien mezclada se describe como sigue:
39
i = 1, ... n,
en donde [Pf] es la concentración de proteína libre, [RNAf_{i}] es la concentración de especie i de ARN libre, [P:RNA_{i}] es la concentración de los complejos proteína-especie i de ARN. k_{+i} es la constante de velocidad de asociación de la proteína libre y de la especie i de ARN, k_{-i} es la constante de velocidad de disociación de los complejos proteína-especie i de ARN, y n es el número de secuencias de ARN con un único conjunto de constantes de velocidad. Mecanismos alternativos, incluyendo los sitios de unión múltiples o la cooperatividad, se podrían considerar en tratamientos posteriores con las apropiadas ampliaciones de este esquema simple.
Para cualquier sistema representado por el esquema anterior, las ecuaciones cinéticas de química fundamental o de acción de masas que describen el cambio en la concentración de cada complejo proteína-especie i de ARN como una función del tiempo son:
101
i = 1, ... n,
en donde [P_{f}], [RNAf_{i}], y [P:RNA_{i}], son las concentraciones de proteína libre, especie i de ARN libre, y complejo proteína-especie i de ARN en el tiempo t.
La concentración de proteína libre es la diferencia entre la concentración total de proteína y la concentración de todos los complejos proteína-ARN ([P] - .\Sigma[P:RNA_{k}]); del mismo modo, la concentración de la especie i de ARN libre es la diferencia entre la concentración total de la especie i de ARN y la concentración de los complejos proteína-especie i de ARN ([RNA_{i}] - [P:RNA_{i}]): ANEXO
102
i = 1, ... n,
Estas ecuaciones dinámicas se pueden utilizar tanto para análisis cinéticos como de equilibrio. La forma diferencial continua es válida siempre que la velocidad media de cada proceso sea grande en comparación con la variación en dicho proceso o, en otras palabras, la Ec. (3) describe de forma precisa un conjunto de ARN con varias moléculas representando cada conjunto único de constantes de velocidad. Siempre que exista una sola molécula, o sólo unas cuantas moléculas de los ARN unidos más firmemente, se utiliza una descripción estadística de la unión para determinar las condiciones que proporcionan una alta probabilidad de recuperar el ARN unido más firmemente. Estas fórmulas estadísticas se derivan en una sección posterior en la probabilidad de éxito.
En el equilibrio, el cambio de concentración de cada complejo proteína-especie-i de ARN es igual a cero:
103
i = 1, ... n,
con los mismos símbolos definidos en la Ec. (3), y siendo K_{di} la constante de disociación en el equilibrio para el complejo proteína-especie i de ARN (K_{di} = k_{-i}/K_{+i}).
\newpage
Cuando sólo se considera una especie de ARN (es decir, n = 1), es posible una solución analítica para la concentración en el equilibrio de los complejos proteína-ARN es posible mediante la resolución de la siguiente ecuación cuadrática:
104
que tiene dos raíces reales, una físicamente realizable:
105
Por supuesto, existen numerosas aplicaciones clásicas para las concentraciones de los complejos en el equilibrio o en el estado casi estacionario, como las del formalismo de Michaelis-Menten, aunque ninguna proporciona suficiente precisión en el rango de concentraciones de ARN total y de proteína utilizado en SELEX. (Para discusiones reveladoras de algunos posibles fallos y limitaciones de las aproximaciones clásicas, ver Savageau, 1991, Straus & Goldstein, 1943; Webb, 1963.) Aunque la solución analítica de la ecuación cuadrática para la asociación reversible simple de una única especie de ARN con un único sitio de unión en la proteína es precisa para todas las concentraciones de ARN y proteína utilizadas en SELEX, y, aunque las concentraciones de unión de dos especies competidoras se pueden calcular mediante una solución analítica de una ecuación cúbica, los procedimientos numéricos iterativos son necesarios para calcular las concentraciones en el equilibrio de los complejos proteína-ARN, siempre que se consideren tres o más especies de ARN competidoras.
Hemos desarrollado un programa de ordenador para resolver la concentración en el equilibrio para cada complejo de proteína-especie i de ARN, [P:RNA_{i}], dada cualquier concentración total de proteína, [P], cualquier distribución de concentraciones de especie i de ARN, [RNA_{i}], y cualquier distribución de constantes de disociación de equilibrio, K_{di}. La matriz Jacobiana (ver, por ejemplo, Leunberger, 1973) para una solución implícita de la Ec. (4) mediante el procedimiento de Newton (ver, por ejemplo, Leunberger, 1973; Press et al., 1988) se calcula utilizando la siguiente fórmula.
106
en donde a_{ij} es el elemento de la línea i y la columna j de la matriz Jacobiana, con \delta_{ii}= 1 y \delta_{ij} = 0 para i\neqj.
A menudo, el éxito del procedimiento de Newton depende de una buena estimación inicial para la solución (ver, por ejemplo, Leunberger, 1973; Press et al., 1988); en este caso, la concentración en el equilibrio de cada complejo proteína-especie i de ARN [P:RNA_{i}]. Mediante la utilización de Kd global para el conjunto total de ARN, se puede estimar la concentración de proteína en todos los complejos proteína-ARN como:
107
en donde [P:RNA] es la concentración de todos los complejos proteína-ARN. [RNA] es la concentración del conjunto total de ARN, y <K_{d}> es la constante global de disociación en el equilibrio para el conjunto total de ARN, calculada utilizando la siguiente fórmula:
108
en donde [RNA][P]/2 es la concentración de ARN total que se une a la mitad de la proteína, y F_{i}º = [RNA_{i}] / [RNA].
\newpage
Con esta estimación de la concentración de proteína en los complejos se puede realizar una aproximación inicial para la concentración de cada complejo proteína-especie i de ARN utilizando la siguiente fórmula:
109
i = 1, ... n.
Las soluciones para los valores de [P:RNA_{i}] que satisfagan la Ec. (4) se puede refinar hasta obtener un elevado nivel de precisión mediante la aplicación iterativa del procedimiento de Newton utilizando la Ec. (7). En esta implementación, hemos conseguido soluciones con más de doce cifras significativas en menos de cuatro o cinco iteraciones del procedimiento de Newton. Esta rápida convergencia hacia una solución precisa se debe a las aproximaciones iniciales de la Ec. (10) que proporcionan, normalmente, una o más cifras significativas para el inicio del proceso, que depende del rango de constantes de disociación en el equilibrio y de la abundancia de cada especie de ARN. Una explicación para este nivel de precisión es que los errores en [P:RNA] tienden a anularse en la Ec. (10), en donde [P] - [P:RNA] es mayor que K_{di}, por ejemplo, cuando [RNA] es inferior a K_{di} o cuando K_{di} es inferior a <K_{d}>. De forma interesante, esto significa que la precisión tiende a ser mayor para cualquier complejo proteína-especie i de ARN con una unión más firme que el conjunto global de ARN. Ejemplos representativos de la precisión inicial de los cálculos de enriquecimiento, definidos como el incremento en la fracción del conjunto de ARN total compuesto en cada ronda por las especies de ARN que presentan una unión más firme, y aproximado mediante la sustitución de la Ec. (10) en la Ec. (20). La precisión global mostrada es un reflejo de la precisión en las concentraciones de equilibrio calculadas para cada complejo proteína-especie i de ARN utilizando la Ec. (10). En una sección posterior, nos centramos en esta precisión para calcular las concentraciones óptimas de ARN y proteína para un enriquecimiento máximo.
Separación. Cualquier procedimiento de separación de diferentes especies de secuencias de ácido nucleico, incluyendo la unión sobre filtro (Tuerk & Gold, 1990), cambios de la movilidad en geles (Blackwell & Weintraub, 1990), cromatografía de afinidad (Ellington & Szostak, 1990; Green et al., 1990; Oliphant & Struhl. 1987; Oliphant & Struhl, 1988), precipitación de anticuerpos, separaciones de fases, o protección de anclajes nucleolíticos (Robertson & Joyce, 1990), se podría utilizar para la mejora con SELEX. Por ejemplo, con la unión sobre filtro, la mayoría de complejos proteína-ARN se quedan pegados al filtro de nitrocelulosa mientras que la mayoría de moléculas de ARN libres pasan a través de ellos (Uhlenbeck et al., 1983; Yarus, 1976; Yarus & Berg, 1967; Yarus & Berg, 1970). La fracción real de complejo proteína-ARN que se pega, y que después se puede recuperar del filtro, se aborda en la siguiente sección.
Dado que una fracción de moléculas de ARN libre también se queda pegada al filtro como fondo no específico, la cantidad total de cada especie i de ARN recogida en el filtro se calcula utilizando la siguiente fórmula, que tiene en cuenta tanto la señal deseada de las moléculas de ARN que presentan una unión más firme en los complejos proteína-ARN como el ruido de las moléculas de ARN libre recogidas como fondo no específico además de las moléculas de ARN competidoras en los complejos proteína-ARN:
110
i = 1, ... n,
en donde RNA_{i}^{filt} es el número de moléculas de especie i de ARN recogidas, Vol es el volumen de la mezcla de reacción que pasa a través del filtro, [P:RNA_{i}] es la concentración en el equilibrio del complejo proteína-especie i de ARN calculada según se describe en la sección precedente. BG es la fracción de ARN libre recogido como fondo no específico, y [RNA_{i}] es la concentración total de especie i de ARN. Cualquier procedimiento de separación proporciona, normalmente, una separación menos que perfecta entre los ligandos unidos y no unidos, y, por lo tanto, requiere una medida para la fracción de ligandos libres recogidos como fondo con los ligandos unidos en cada ronda.
Como ya se ha mencionado, no todos los complejos proteína-ARN en solución se pueden recoger en el filtro. Es más, el ARN que se encuentra en los complejos firmemente unidos se puede retener mejor en el filtro que el ARN de los complejos unidos débilmente. Siempre que esto sea cierto, el enriquecimiento en moléculas de ARN que se unen firmemente se mejoraría aún más en cada ronda de SELEX. Por otro lado, si algunas moléculas no pudieran ser eluídas del filtro tan fácilmente como otras, su enriquecimiento se vería reducido.
Amplificación y Renormalización. La cantidad de cada especie i de ARN recuperada del filtro se calcula utilizando la siguiente fórmula:
111
i = 1, ... n,
en donde FR es la fracción de ARN que se puede recuperar del filtro, y RNA_{i}^{filt} es el número de moléculas de especie i de ARN recogidas en el filtro, según se ha calculado con la Ec. (11). En este tratamiento, se asume que el valor de FR es constante y se determina a partir de la fracción de complejo proteína-ARN que se pega al filtro y a partir de la fracción de ARN en dichos complejos que se pueden recuperar y copiar por la transcriptasa inversa para producir ADNc para PCR. Asumir que FR es constante para todas las especies es un punto de inicio razonable, ya que si se les da el tiempo suficiente, cuando todas las moléculas tengan los mismos sitios de cebado para PCR y se utilice un exceso de moléculas de cebador, todas las especies - ya sean raras o abundantes - tienen virtualmente la misma probabilidad de hibridarse con una molécula de cebador. Además, dado que todas las moléculas de ARN tienen la misma longitud, no existe una velocidad diferencial de amplificación en base al tamaño. Por supuesto, si cualquier especie de ARN presenta una estructura secundaria que interfiere en la hibridación del cebador para la síntesis de ADNc, o si la estructura primaria o secundaria del correspondiente ADNc disminuye la velocidad de ADN polimérico durante el proceso de amplificación PCR, el enriquecimiento de dicha especie se reduce. Nosotros no incorporamos estos efectos, ya que no existen reglas adecuadas para predecir qué estructuras marcarán una diferencia real. A medida que aumenten los datos relativos a estas estructuras, se podrá añadir cualquier efecto significativo a la descripción matemática de SELEX.
La cantidad total de ARN recuperado del filtro se calcula sumando el número de moléculas de cada especie recogidas para producir copias de ADNc para la amplificación PCR:
112
Cualquier molécula "portadora" o "competidora no específica" debe excluirse del total en la Ec. (13), ya que estas moléculas no se amplifican sin sitios de cebador PCR. Los protocolos de medición de afinidad incluyen, a menudo, estas moléculas de ARN competidor no específico y, si dichas moléculas también se usan en SELEX, obviamente deben ser no amplificables. De forma interesante, siempre que moléculas competidoras no específicas interaccionen con la proteína en el mismo sitio que las moléculas de ligando que presentan una unión más firme, la consecuencia principal de la adición de moléculas competidoras es una reducción en el número de sitios específicos disponibles para la selección.
Por lo tanto, para determinar la concentración de proteína que se une a la cantidad deseada de moléculas de ligando amplificable con una alta concentración de moléculas competidoras no específicas presentes, se deben generar curvas de unión correctas mediante la inclusión de la concentración apropiada de estas moléculas en cada valoración. Las ventajas de utilizar una alta concentración de moléculas competidoras no específicas y no amplificables en cada ronda de SELEX pueden incluir una reducción en la adsorción de moléculas de ligando amplificables en cualquier sitio no específico del material de laboratorio, una reducción en la unión de las moléculas de ligando amplificables a cualquier sitio no específico de la proteína objetivo, o una reducción en la fracción de moléculas amplificables libres recogidas como fondo no específico en los sitios de "falsa separación", pero sólo cuando dichos sitios estén presentes en un número significativo y se saturen de forma eficaz por la cantidad utilizada de moléculas competidoras no específicas. Si no se dan estas condiciones, el efecto de la adición de moléculas competidoras no específicas es esencialmente el mismo que el de reducir la cantidad de proteína utilizada.
La cantidad de cada especie i de ARN amplificable que se recupera tras una ronda, relativa al total en la Ec. (13), se calcula como sigue:
113
i = 1, ... n.
Tras la amplificación PCR de las copias de ADNc y la renormalización del conjunto de ARN a su concentración original mediante una transcripción in vitro (a partir de sitios promotores idénticos en todas las moléculas de ADNc), la concentración de cada especie de ARN tras una ronda de SELEX es:
114
i = 1, ... n,
en donde [RNA] es la concentración total del conjunto de ARN. Para cada ronda adicional de SELEX, se puede computar la concentración de todas las especies de ARN mediante la reiteración de las Ecs. (7)-(15), con F_{i}^{l} para cada especie de ARN de una ronda siendo igual a la fracción inicial F_{i}^{0} en la siguiente [ver Ec. (9)].

Claims (40)

1. Procedimiento que incluye la unión específica in vitro de un ligando de ácido nucleico a una molécula objetivo, en lugar de que se produzca la unión entre los ácidos nucleicos; en donde, cuando la molécula objetivo sea una proteína, será una proteína la que no se unirá a los ácidos nucleicos como parte de su función biológica y en donde el ligando de ácido nucleico habrá sido identificado mediante un proceso que comprende los pasos de:
(a) puesta en contacto de una mezcla de ácidos nucleicos con el objetivo bajo condiciones favorables de unión;
(b) separación de los ácidos nucleicos no unidos y de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a moléculas objetivo;
(c) disociación de los pares ácido nucleico-objetivo;
(d) amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los pares ácido nucleico-objetivo para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando;
(e) repetición de los pasos de unión, separación, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee,
para obtener el(los) ligando(s) que se unan de forma específica a la molécula objetivo.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el procedimiento se utiliza:
- para la detección, cuantificación o purificación de moléculas objetivos;
- para la detección, cuantificación, aislamiento o purificación de una proteína objetivo;
- en un ensayo;
- en un proceso diagnóstico;
- en separación celular;
- como un inhibidor de la función de la molécula objetivo;
- como una sonda o agente secuestrante;
- para detectar la presencia o ausencia de, y/o medir la cantidad de, una molécula objetivo en una muestra;
- para modificar una función de la molécula objetivo; o
- para afectar, inhibir o aumentar la función de la proteína.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el ligando es un reactivo en una prueba diagnóstica.
4. Utilización de un ligando de ácido nucleico para la fabricación de un agente terapéutico o de diagnóstico para un proceso terapéutico o de diagnóstico que involucre la unión específica in vivo del ligando a una molécula objetivo, en lugar de que se produzca la unión entre los ácidos nucleicos; en donde, cuando la molécula objetivo sea una proteína, será una proteína la que no se unirá a los ácidos nucleicos como parte de su función biológica, y en donde el ligando de ácido nucleico habrá sido identificado mediante un proceso que comprende los pasos de:
(a) puesta en contacto de una mezcla de ácidos nucleicos con el objetivo bajo condiciones favorables de unión;
(b) separación de los ácidos nucleicos no unidos y de aquellos ácidos nucleicos que se han unido a moléculas objetivo;
(c) disociación de los pares ácido nucleico-objetivo;
(d) amplificación de los ácidos nucleicos disociados de los pares ácido nucleico-objetivo para obtener una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en ligando;
(e) repetición de los pasos de unión, separación, disociación y amplificación a través de tantos ciclos como se desee,
para obtener el(los) ligando(s) que se unan de forma específica a la molécula objetivo.
5. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ligando o agente modifica una función de la molécula objetivo.
6. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ligando o agente inhibe la función del objetivo.
7. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ligando o agente activa la función del objetivo.
8. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el objetivo es una proteína y el ligando o agente afecta, inhibe o mejora la función de la proteína.
9. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el objetivo es una proteína y el ligando inhibe la función de la proteína.
10. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el ligando o agente:
(i) afecta a la actividad catalítica de las enzimas;
(ii) afecta a la funcionalidad de los receptores de proteínas;
(iii) afecta a la formación de multímeros de proteína;
(iv) inhibe la unión a receptores;
(v) modifica la especificidad de la unión a receptores;
(vi) modifica la acción hormonal; o
(vii) modifica las propiedades de transporte de las proteínas.
11. Utilización según la reivindicación 4, en donde el ligando o agente se usa:
(i) en la detección, o cuantificación de una proteína objetivo;
(ii) en un ensayo;
(iii) en un proceso diagnóstico;
(iv) como un agente secuestrante;
(v) como un vehículos de entrega de medicamentos; o
(vi) como un modificador de la acción hormonal.
12. Utilización según la reivindicación 4, en donde el ligando dirige una toxina u otro agente terapéutico hacia un sitio objetivo específico.
13. Utilización según la reivindicación 4, en donde el ligando comprende además un elemento diferente a un ácido nucleico que es capaz de dirigir al ácido nucleico hacia una posición seleccionada en el cuerpo de un paciente.
14. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando de ácido nucleico es de cadena simple.
15. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el ligando comprende un ARN de cadena simple.
16. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde el ligando comprende un ADN de cadena simple.
17. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando comprende ARN o ADN modificado químicamente.
18. Procedimiento o utilización según la reivindicación 17, en donde la modificación se realiza en el amino exocíclico de la citosina, o es una sustitución 5-bromo de uracilo o es una metilación.
19. Procedimiento o utilización según las reivindicaciones 17 ó 18, en donde la modificación no interfiere con la amplificación del ácido nucleico.
20. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando contiene al menos 15 nucleótidos.
21. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando comprende una pluralidad de secuencias de ligando específico de un objetivo.
22. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando comprende una pluralidad de secuencias de ligando específico de un objetivo.
23. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando comprende además un elemento diferente a un ácido nucleico.
24. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ligando se encuentra en forma de una solución de ligando que comprende una pluralidad de ligandos de ácido nucleico, con una estructura tridimensional mantenida en común que define los componentes conservados.
25. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la molécula objetivo se selecciona entre proteínas, péptidos, carbohidratos, polisacáridos, glicoproteínas, hormonas, receptores, antígenos, anticuerpos, virus, sustratos, metabolitos, inhibidores, medicamentos, nutrientes o factores de crecimiento.
26. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde la molécula objetivo se selecciona entre proteínas y péptidos.
27. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde la molécula objetivo es una proteína.
28. Procedimiento o utilización según una de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es la bradiquinina.
29. Procedimiento o utilización según una de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es una proteasa.
30. Procedimiento o utilización según una de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es una proteasa de serina.
31. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es el activador tisular del plasminógeno humano.
32. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es la tripsina.
33. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es la elastasa.
34. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es quimotripsina.
35. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es la trombina.
36. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha proteasa de serina es la plasmina.
37. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es un receptor mamífero.
38. Procedimiento o utilización según una de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es la insulina humana.
39. Procedimiento o utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en donde el objetivo es una hormona o factor mamífero.
40. Procedimiento o utilización según la reivindicación 30, en donde dicha hormona o factor es la epinefrina o la hormona tiroidea.
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