BRPI0607248A2 - conjugado de um polipeptìdeo e um oligossacarìdeo, composição farmacêutica, uso do conjugado, e, processo para a preparação de um conjugado - Google Patents

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Abstract

CONJUGADO DE UM POLIPEPTìDEO E UM OLIGOSSACARìDEO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, USO DO CONJUGADO, E, PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM CONJUGADO. A presente invenção refere-se a conjugados de um polipeptídeo e um oligossacarídeo, em que o polipeptídeo é conjugado com pelo menos um resíduo espaçador de oligossacarídeo, o oligossacarídeo sendo um oligossacarídeo sulfatado sintético, compreendendo 4-18 unidades monossacarídeas e por si tendo afinidade com antitrombina III e o espaçador sendo uma ligação ou um resíduo de ligação flexível, essencial e farmacologicamente inativo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Os conjugados da invenção têm melhoradas propriedades farmacocinéticas, quando comparados com os polipeptídeos originais (isto é, os polipeptídeos correspondentes não-conjugados por si).

Description

"CONJUGADO DE UM POLIPEPTÍDEO E UM OLIGOSSACARÍDEO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO CONJUGADO, E,PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM CONJUGADO"
A presente invenção refere-se a novos conjugados depolipeptídeos e oligossacarídeos, um processo para sua preparação,composições farmacêuticas contendo os compostos como ingredientes ativos,bem como o uso de ditos compostos para a manufatura de medicamentos.
Os recentes desenvolvimentos das técnicas de DNArecombinante e métodos sintéticos de peptídeo permitiram a produçãocomercial de quantidades medicamente úteis de polipeptídeos terapêuticos. Acurta meia-vida de muitos polipeptídeos terapêuticos, entretanto, temhistoricamente proposto um desafio para a administração destes compostos.Há diversos importantes medicamentos baseados em polipeptídeo atualmenteem uso, que se beneficiariam da aumentada meia-vida. Exemplos sãoritropoietina, insulina, interferon a-2b, interferon β, interferon γ, fatorestimulador de colônia de granulócitos, hormônio do crescimento humano,fator estimulante de colônia de macrófagos granulócitos, relaxina, urocinase,estreptocinase, ativador do plasminogênio do tecido, calcitonina, interleucina-2 e fator de necrose tumoral com meias-vias (significativamente) menores doque algumas horas. A insulina, por exemplo, tem uma meia-vida de somentecerca de 12 minutos no homem. Outros exemplos de polipeptídeos que estãosendo desenvolvidos como agentes terapêuticos potenciais, mas ressentem-sede curtas meias-vidas, são adrenomedulina, glucagon como peptídeo (GLP-I)e kisspeptina (metastina). Estendendo-se as meias-vidas dos polipeptídeosterapêuticos pode-se melhorar o tratamento em curso, permitindo-se quequantidades e freqüências de dosagem sejam reduzidas (Curr. Opin. DrugDisc. Dev. 2005, 8, 590 - 600).
Muitas proteínas já foram submetidas a estudos objetivandoestender a meia-vida in vivo empregando-se, por exemplo, adaptação porPEGilação (isto é, conjugação com um componente-polietileno glicol de30 kDa; Drug Discovery Today 2005, 10, 1451 - 1458). Atualmentedisponíveis são, por exemplo, análogos PEGilados da insulina com uma meiavida prolongada. Além da taxa de depuração reduzida, aspectos importantesdos últimos derivados da insulina são a reduzida imunogenicidade (p. ex.,U.S. 4.179.337) e aumentada solubilidade. Além disso, desenvolvimentos naPEGilação da insulina também resultaram em conjugados física eproteoliticamente mais estáveis do que a insulina ativa (vide, p. ex., WO2004/091494, WO 2002/098232, US 2005/0151848).
A eritropoietina PEGilada, com uma mais longa meia-vida emsoro é, por exemplo, descrita em WO 2004/022577. Constatou-se ainda que,por glicosilação alterada de eritropoietina, a meia-vida aumenta. Além disso,os análogos hiperglicosilados de eritropoietina foram relatados terem maiselevada atividade in vivo (WO 2000/24893). Outros exemplos de(poli)peptídeos PEGilados com prolongada duração de ação são peptídeo-1similar a glucagon (GLP-I) (WO 2005/058954, WO 2004/093823;Bioconjugate Chem. 2005, 16, 377-382; Biomaterials, 2005, 26, 3597-3606),polipeptídeo insulinotrópico dependente da glicose (GIP) (Bioorg. Med.Chem. Lett, 2005, 75, 4114- 4117), calcitonina (Pharm. Dev. Technol. 1999,4, 269-275) e octreotide (Pharm. Res. 2005, 22, 743-749).
Todavia, o uso de PEG tem limitações. PEG é obtido porsíntese química e, como todos os polímeros sintéticos, é polidisperso. Istosignifica que uma batelada de PEG consiste de moléculas tendo diferentesnúmeros de monômeros, resultando em uma distribuição Gaussiana dos pesosmoleculares. Quando um polipeptídeo é PEGilado, isto resulta em uma coletade conjugados, que podem ter diferentes propriedades biológicas, emparticular em meias-vidas e imunogenicidade. A reprodutibilidade dasatividades farmacêuticas dos polipeptídeos pegilados pode, portanto, ser umaséria desvantagem da técnica. Também é sabido que a PEGilação de proteínasé com freqüência acompanhada por perda da atividade biológica. Além disso,o uso de PEG pode provocar problemas relativos à excreção do corpo. Emelevados pesos moleculares, os PEGs podem acumular-se no fígado,resultando em síndrome macromolecular. Conseqüentemente, a PEGilação demedicamentos deve ser realizada com grande cuidado.
Resultados similares como com a PEGilação foram obtidospor derivação de polipeptídeos com polissacarídeos, em particular comcadeias de ácido polissiálico (p. ex., WO 92/22331 e WO 2001/87922).
Em JP 02/231077, os conjugados de heparina - superóxidodismutase (SOD) são descritos. Preferivelmente, numerosas moléculas deheparina são ligadas à SOD, resultando em conjugados tendo uma meia-vidamais longa do que a SOD nativa, enquanto retendo cerca de 90 % da atividadeenzimática.
Outros conjugados de polipeptídeos com aumentada meia-vidasão exemplificados por derivados conjugados de insulina (WO 2003/013573,WO 05/012346) ou GLP-I (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4395 -4398), que se ligam à albumina do soro circulante. A ligação à albumina dosoro naqueles compostos é baseada em particular em interações hidrofóbicasdo componente de ligação, dentro do conjugado com albumina de sorohumano. Quanto mais elevada a hidrofobicidade daquele componente, maisforte a afinidade de ligação à albumina de soro humano. Embora uma largavariedade de componentes de ligação seja adequada, um inconveniente de taisconjugados é a baixa afinidade e seletividades da interação dos conjugadoscom a albumina de soro humano, com um resultado de fraca previsibilidadedo comportamento farmacodinâmico. Alternativamente, a fusão do gene dainsulina humana diretamente naquele da albumina de soro humano resulta emuma forma de longa ação da insulina, que é ativa na redução dos níveis deglicose sangüínea, por um prolongado período após administração subcutânea(Duttaroy et al., Diabetes 2005, 54, 251-258). Entretanto, neste caso abiodisponibilidade do polipeptídeo fundido bem como a afinidade de ligaçãopara o receptor alvo são reduzidas.
Além disso, no WO 2000/40253, os conjugados de, porexemplo, um peptídeo e, especificamente, a(s) cadeia(s) deglicosaminoglicano são descritos, que são considerados como proteoglicanossintéticos. Nesses conjugados, a atividade farmacológica doglicosaminoglicano conjugado tem um impacto significativo sobre a atividadeterapêutica dos conjugados.
Também os oligossacarídeos são ligados a compostosfarmaceuticamente ativos, a fim de aumentar sua solubilidade (WO2004/03971).
A presente invenção refere-se a novos conjugados depolipeptídeos com aumentadas meias-vidas, sendo conjugados de umpolipeptídeo e um oligossacarídeo, em que o polipeptídeo é conjugado compelo menos um resíduo espaçador de oligossacarídeo sulfatado sintético, ooligossacarídeo compreendendo 4-18 unidades monossacarídeas e por sitendo afinidade para antitrombina III e o espaçador sendo uma ligação ou umresíduo de ligação flexível inativo essencialmente farmacologicamente inativoou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Oligossacarídeos preferidosconsistem de 4 - 6 unidades monossacarídeas e, em particular, preferidos sãoos pentassacarídeos. Os conjugados da invenção tiveram as propriedadesfarmacocinéticas melhoradas - e assim propriedades farmacológicasmelhoradas - quando comparados com os polipeptídeos originais (isto é, oscorrespondentes polipeptídeos não-conjugados por si).
A presente invenção refere-se ainda a uma nova tecnologiabaseada em um processo para a preparação de um conjugadoterapeuticamente ativo, compreendendo a etapa em que um oligossacarídeosulfatado sintético, em particular um pentassacarídeo, que por si tem afinidadepara antitrombina III (ATUI), é covalentemente ligado a um polipeptídeoatravés de uma ligação ou um resíduo de ligação flexível inativoessencialmente farmacologicamente inativo.
ATIII é um inibidor da serina protease, presente no plasmasangüíneo, que interrompe a cascata de coagulação, para fornecer um circuitode realimentação. A meia-vida de um pentassacarídeo sulfatado éessencialmente baseada em sua afinidade para ATIII (vide, p. ex., F. Paolucciet al. Clin. Pharmacokinet. 2002; 41 Suppl. 2: 11-18). Nos conjugados destainvenção, a meia-vida do soro é maior do que a meia-vida do polipeptídeooriginal, como resultado da meia-vida do pentassacarídeo que largamente éresponsável pela meia-vida do conjugado. Além disso, os conjugados dainvenção não somente têm uma meia-vida mais longa, mas também têmpropriedades farmacocinéticas sintonizáveis, com base na interação específicaentre a parte do pentassacarídeo do conjugado e ATIII (a última interação édescrita, p. ex., em Westerduin et. al. Bioorg. Med. Chem. 1994, 1267-1280;van Amsterdam et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1995; 15: 495 - 503).Em uma forma de realização da presente invenção, o conjugado deoligossacarídeo-polipeptídeo (o oligossacarídeo em particular consistindo de4-6 unidades monossacarídeas e, muitíssimo preferivelmente sendo umpentassacarídeo) tem um nível de plasma circulante de < 50 nM. Até estaconcentração, a atividade anticoagulante mediada-ATIII do oligossacarídeo(em particular pentassacarídeo) é insignificante, em particular com respeitoaos riscos de sangramento (vide, por exemplo (1) F. Donat et al., Clin.Pharmacokinet. 2002; 41 Suppl. 2: 1 - 9; (2) S. J. Keam et al. Drugs 2002; 62(11): 1673 - 1685 e (3) The Rembrandt Investigators Circulation 2000; 102:2726 - 2731). De acordo com uma forma de realização desta invenção, ooligossacarídeo (em particular consistindo de 4 - 6 unidades monossacarídease, muitíssimo preferivelmente, sendo um pentassacarídeo) usado nosconjugados por si tem uma atividade anticoagulante que é de nívelsubterapêutico, quando comparado com a atividade farmacológica dopolipeptídeo por si. Subterapêutico a este respeito significa: tendo um efeitomenor do que terapêutico e sem efeitos colaterais, tais como riscos desangramento. Por exemplo, os pacientes com diabetes tipo 1 requerem (longameia-vida) injeções de insulina para complementar (basais) os níveis doplasma terapêutico de ~[0,1 - 1,0] nM, que está bem na faixa subterapêuticados pentassacarídeos usados nos presentes conjugados. Uma pessoa hábil naarte entenderá como selecionar conjugados com um apropriado equilíbrioentre os níveis terapêuticos do polipeptídeo e do pentassacarídeo,respectivamente.
Os polipeptídeos dos conjugados da presente invenção retêmsua atividade biológica. Além disso, o comportamento farmacocinético lineardo pentassacarídeo ligado-ATIII dos conjugados desta invenção é responsávelpor um efeito terapêutico altamente previsível dos polipeptídeos conjugados,uma vez que os conjugados permanecem largamente no compartimentointravascular após dosagem i.v. ou s.c.
O resíduo oligossacarídeo dos conjugados desta invenção é umresíduo de um oligossacarídeo sulfatado sintético, que por si tem afinidadepara antitrombina III (ATUI). Os oligossacarídeos sulfatados e, em particular,pentassacarídeos, geralmente têm afinidade para ATUI, entretanto, umapessoa hábil na arte pode facilmente verificar a afinidade de umoligossacarídeo para ATIII (van Amsterdam et al., Arterioscler Thromb Vasc.Biol. 1995; 15: 495 - 503) e selecionar o desejado nível de afinidade. Osresíduos de oligossacarídeos sintéticos adequados e, em particular, resíduosde pentassacarídeo, podem ser derivados dos oligo e pentassacarídeosdescritos em EP 0.454.220, EP 0.529.715, WO 98/03554, WO 99/36428, J.Med. Chem. 2005; 48, 349 - 352, Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 52,1671 - 1690 e similares.
Os resíduos oligo e pentassacarídeos podem ser conjugadoscom o polipeptídeo diretamente ou via um resíduo de ligação fixado aqualquer posição quimicamente adequada dentro do resíduo depentassacarídeo. Portanto, em uma forma de realização desta invenção, osconjugados são conjugados em que o oligossacarídeo-resíduo espaçador tem aestrutura (I)
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que um resíduo de ligação flexível essencial efarmacologicamente inativo está presente e em que
R é independentemente OSO3", (l-8C)alcóxi ou um resíduo deligação flexível essencial e farmacologicamente inativo e
Ra é independentemente OSO3", (l-8C)alcóxi, um resíduo deligação flexível essencial e farmacologicamente inativo ou um resíduo deoligossacarídeo, compreendendo 1-13 unidades monossacarídeas e
Rb é independentemente (l-8C)alcóxi, um resíduo de ligaçãoflexível essencial e farmacologicamente inativo ou um resíduo deoligossacarídeo, compreendendo 1-13 unidades monossacarídeas, a cargasendo compensada por contra-íons positivamente carregados. Mais preferidossão os conjugados em que o resíduo oligonucleotídeo-espaçador é um resíduode pentassacarídeo-espaçador, tendo a estrutura (II)
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que um resíduo de ligação flexível essencial efarmacologicamente inativo está presente e em que
Ré independentemente OSO3" ou (l-8C)alcóxi, ou um resíduode ligação flexível essencial e farmacologicamente inativo, a carga sendocompensada por contra-íons positivamente carregados.Mais preferidos são os conjugados em que o resíduopentassacarídeo tem a estrutura (III)
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que R é independentemente OSO3" ou (1 - 8C)alcóxi, acarga sendo compensada por contra-íons positivamente carregados.
Compostos altamente preferidos de acordo com a presenteinvenção são compostos em que o resíduo pentassacarídeo tem a estrutura (IV)
<formula>formula see original document page 9</formula>
em que R é independentemente OCH3 ou OSO3", e, emparticular, ambos os grupos R de (II) são OSO3".
De acordo com esta invenção, os resíduos oligossacarídeossulfatados sintéticos, em particular os resíduos pentassacarídeos, comafinidade para ATUI, podem ser conjugados com qualquer polipeptídeo. Porexemplo, o polipeptídeo pode ser um peptídeo bioativo (p. ex., 3 a 50aminoácidos de comprimento) ou pode ser um polipeptídeo mais longo, quepode ou não ter atividade catalítica. Exemplos não limitantes dos peptídeosbioativos incluem neutrotransmissores, tais como conantocina G, dinorfina,endorfina, encefalina ou neurotensina; ativadores gástricos tais comobombesina, motilina ou gastrina; reguladores do cálcio, tais como calcitoninaou hormônio da paratiróide (PTH); moduladores da reabsorção óssea, taiscomo osteoprotegerina (OPG); estimuladores da atividade osteoblástica, taiscomo adrenomedulina ou seus derivados truncados, tais como ADM(27-52);hormônios tais como polipeptídeo intestinal vasoativo, corticotropina,secretina; inibidores do hormônio, tais como somastatina; estimuladores dohormônio, tais como hormônio estimulador do melanócito, fator de liberaçãodo hormônio luteinizante, ou sermorrelina; agentes antidiabéticos, tais comoglucagons, amilina, peptídeo-1 similar a glucagon (GLP-I) ou seus derivadostruncados, tais como GLP-1(7-36), GLP-2, polipeptídeo insulinotrópicodependente da glicose (GIP) ou insulina ("Humulina", Eli Lilly); anti-infecciosos, tais como lisostafina; hormônios supressores do apetite, taiscomo obestatina; vasoconstritores tais como angiotensina II; vasodilatadores,tais como bradicinina, substância P ou calidina; agentes natriuréticos, taiscomo polipeptídeo natriurético atrial (ANP); hormônios antidiuréticos, taiscomo vasopressina ou desmopressina; e agentes oxitócico, tais comooxitocina. Exemplos adicionais de polipeptídeos que podem ser usadosincluem hormônio do crescimento humano ("Humantropo", Genentech); rLH;rG-CSF ("Neupogênio", Amgen); eritropoietina ("Epogen", Amgen),interferon α - 2a, interferon α - 2b, inteferon β ou interferon γ, fator VIII ououtros fatores de coagulação sangüínea, tais como proteína C ou fator Vila;hormônio estimulante do folículo (FSH); uma citocina, tal como interleucina(IL) (p. ex., IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, -9, 10, -11, 12 ou -18);hemoglobina; superóxido dismutase; CD4 solúvel ou receptor de CD4;Análogos de plaquetas GpIIb/IIIa e seus receptores ("ReoPro", Johnson &Johnson); glicocerebrosidase ("Ceredase" ou "cerezyme", Genzyme); ACTH;somatotropina; hormônio da paratiróide, hormônio antidiurético; prolactina;rHGH, tal como pegvisomant ("Somavert", Pfier); agonistas de GnRH, taiscomo leuprolida ("Lupron", "Leprorelin", Takeda) ou nafarrelina ("Synarel",Roche) e antagonistas GnRH, tais como ganirelix ("Antagon", organon);agonistas de GHRH, tais como sermorrelina ("Gerei", Serono); octreotide("Sandostatin", Novrtis); ou trombolíticos, tais como estreptocinase,estafilocinase, urocinase ou ativador do plasminogênio do tecido ("Ativase",Genentech); metastina (KISS1 ou kisspeptin-54) ou seus derivados truncados,tais como kisspeptin-10.
Os polipeptídeos preferidos têm um peso molecular de -0,3 -50 kDa. Outros polipeptídeos preferidos têm um peso molecular de -0,3 - 20kDa. Também preferidos são os polipeptídeos que têm um peso molecular de-0,3 a 7,5 kDa.
Polipeptídeos mais preferidos são insulina (t Vz = 12 min; Mw= 5,8 kDa), calcitonina (t Vi = 20 min; Mw = 3,4 kDa), GLP-1(7-36) (t 1Z2 A =6 min; Mw = 3.4 kDa), adrenomedulina (t 1/2 = 20 min; Mw = 6,0 kDa),ADM(27-52) (Mw 3.0 kDa), octreotide (t 1/2 = 1,7 h, Mw = 1,0 kDa),interleucina-2 (t 1/2 = 20 min; Mw = 15 kDa) e ganirelix (t 1/2=12 h; Mw =1,6 kDa). Em particular preferidos são insulina e [D-Ala ]-GLP-1(7-36). Uma15 outra forma de realização desta invenção é um conjugado de polipeptídeomonossubstituído por um resíduo espaçador de pentassacarídeo.
O espaçador é uma ligação ou um resíduo de ligação flexívelessencial e farmacologicamente inativo, em particular tendo 10-50 átomoscontados ao longo da "cadeia principal" do espaçador, o oxigênio do resíduode oligossacarídeo não incluído. A expressão "essencial efarmacologicamente inativo", como aqui usado, significa que o espaçador nãocontém átomos ou grupos que apresentam atividade farmacológica por si nasdoses em que os compostos da presente invenção são terapeuticamenteeficazes. Assim, em doses em que os compostos da presente invenção sãousados como medicamentos terapêuticos, a natureza do espaçador não resultaem efeitos colaterais farmacológicos demonstráveis.
O espaçador pode compreender elementos (um tanto) rígidos,tais como estruturas em anel e ligações insaturadas. O espaçador doscompostos da presente invenção é preferivelmente flexível. Espaçadoresadequados podem facilmente ser projetados por uma pessoa hábil na arte. Porrazões sintéticas, espaçadores mais longos são considerados menosadequados, entretanto, espaçadores mais longos podem ainda ser aplicadoscom sucesso nos compostos da presente invenção. Espaçadores preferidoscompreendem pelo menos um -elemento (CH2CH2O)-.
Exemplos representativos dos conjugados da presenteinvenção são conjugados das seguintes estruturas:
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e em que Y é selecionado das estruturas A, B, C and D
em que R1=R2=H, R3= ° Y ou em que R1=R3=H, R2= ° Y<formula>formula see original document page 13</formula>
ou outros seus sais, porém também conjugados em que oespaçador é um diferente ou é ligado ao pentassacarídeo em outra posição.Preferido é o sal de sódio. E preferivelmente, Y é selecionado das estruturasAeB.
Abreviaturas comumente usadas, que não são explicitamentedefinidas nesta descrição, podem ser encontradas na The American ChemicalSociety Style Guide, Segunda Edição, American Chemical Society,Washington, DC (1997), "2001 Guidelines for Authors" J. Org. Chem. 66(1),24A (2001), "A Short Guide to Abbreviations and Their Use in PolypeptideScience" J. Polypeptide. Sei. 5, 465-471 (1999).
O termo polipeptídeo refere-se a uma cadeia de pelo menostrês aminoácidos, independente das modificações pós-translacionais. Ospolipeptídeos podem ser naturalmente ocorrentes, quimicamente sintetizadosou polímeros recombinantemente produzidos de aminoácidos. Ospolipeptídeos têm três a 50 aminoácidos, tipicamente classificados comopeptídeos.
A frase "polipeptídeo com atividade catalítica" significa umaenzima.
O termo insulina como aqui usado refere-se a polipeptídeohipoglicêmico naturalmente ocorrente, encontrado em mamíferos, incluindohumanos, rato, porquinho da índia e coelhos, bem como a insulinarecombinante e polipeptídeos hipoglicêmicos similares, descritos nas PatenteU.S. No. 4.652.525, 4.431,740, 5.268.453, 5.506.202, 5.514.646 e 5.700.662.
Na descrição dos conjugados da invenção, mais as seguintesdefinições são usadas. Os termos (l-4C)alquila e (l-8C)alquila significam umgrupo alquila ramificado ou não-ramificado, tendo 1-4 e 1-8 átomos decarbono, respectivamente, por exemplo metila, etila, propila, isopropila,butila, sec-butila, terc-butila, hexila e octila. Metila e etila são grupos alquilapreferidos. O termo (l-8C)alcóxi significa um grupo alcóxi tendo 1-8 átomosde carbono, o componente alquila tendo o significado como anteriormentedefinido, Metóxi é um grupo alcóxi preferido.
O comprimento do espaçador é o número de átomos doespaçador, contados ao longo da cadeia mais curta entre o resíduo deoligossacarídeo e o polipeptídeo, não se contando o átomo de oxigênio doresíduo de oligossacarídeo que é conectado ao espaçador.
Uma forma de realização desta invenção é ainda um processopara a preparação de um conjugado terapeuticamente ativo, compreendendoum polipeptídeo, o conjugado tendo atividade anti-trombótica desprezível, emque o conjugado tem uma meia-vida plasmática mais longa do que opolipeptídeo original, enquanto a atividade biológica é essencialmente retida,compreendendo uma etapa em que um oligossacarídeo sulfatado sintético, emparticular em que o oligossacarídeo consiste de 4 - 6 unidadesmonossacarídeas e, muitíssimo particularmente, sendo um pentassacarídeosulfatado, por si tendo afinidade para antitrombina III, é ligado aopolipeptídeo, opcionalmente através de um resíduo de ligação flexívelessencial e farmacologicamente inativo.Aspectos sintéticos e analíticos gerais
Síntese dos pentassacarídeos
O oligossacarídeo de ligação-ATIII, em particularpentassacarídeo, dos compostos da presente invenção, podem ser preparadoscomo descrito, por exemplo, em Angew. Chem. Intl. Ed. Engl. 1994, 32, 1671- 1690. Diferentes oligo e pentassacarídeos com alterada afinidade para ATIIIpodem ser obtidos variando-se os blocos de construção de mono, di outetrassacarídeo tampões, por exemplo, por introdução de grupos alquila(permanentes) ou aplicação de diferentes grupos de proteção (temporários)dando acesso a diferentes oligo e pentassacarídeos diferentemente sulfatados,em um modo controlado (p. ex., Westerdu in et. al. Bioorg. Med. Chem. 1994,1267). O espaçador pode ser introduzido como descrito, por exemplo, no WO2001/42262. A molécula espaçadora oligo e pentassacarídea pode ainda serderivada com resíduos de ligação, tais como o grupo gama-maleimido butirila(GMB), o grupo N-hidroxissuccinimida (NHS) ou grupo tiol opcionalmenteprotegido (p. ex., Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 1996, 55, 331 - 333) parapermitir acoplamento direto com um polipeptídeo opcionalmente modificado.
Conjugação
Em geral, os conjugados da invenção são produzidos deacordo com um processo compreendendo (a) uma etapa opcional, em que opolipeptídeo é adaptado para conjugação e (b) uma etapa de acoplamento, emque o polipeptídeo opcionalmente adaptado é reagido com uma moléculaespaçadora de oligo ou pentassacarídeo.
Métodos sintéticos gerais para a produção de bioconjugadossão descritos em "Bioconjugate Techniques" por Greg T. Hermanson, 1996,Academic Press. Além disso, para conjugação pode ser considerada umaligação Staudinger (tal como descrita por K. L. Kiick et al., Proc. Nat. Acad.Sei, 2002; 99; 19-24) ou uma cicloadição 1,3-dipolar, empregando-se umderivado pentassacarídeo e polipeptídeo independentemente modificado porum grupo funcional alquina ou azida. Alternativamente, reações enzimáticastais como o alongamento mediado por IgA protease regiosseletivo depolipeptídeos no término-N (como descrito por M. Lewinska et al. inBioconjugate Chem. 2004, 75, 231- 234) ou a introdução catalisada portransglutaminase dos oligossacarídeos contendo espaçador amino (comodescrito por M. Sato et al. em J. Am. Chem. Soe. 2004, 126, 14013 - 14022)podem ser adaptadas para conjugação de um resíduo espaçador depentassacarídeo em um polipeptídeo opcionalmente modificado.
Além disso, a PEGilação de, por exemplo, insulina, GLP-I eoctreotide é bem documentada. Nestas proteínas, um componente-PEG de ~5-30 kDa pode ser introduzido sem abolir suas atividades biológicas; taisestratégias podem ser seguidas pela introdução de um componentepentassacarídeo(espaçador). Além disso, é um pré-requisito que a ligação doconjugado de pentassacarídeo em ATIII (-50 kDa) não tenha efeito deletériosubstancial sobre a atividade biológicas do polipeptídeo.
Insulina: As funções amino da Lisina do terminal-N B-I epróxima do terminal-C B29 não são essenciais para a bioatividade da insulina.A insulina PEGilada-Bl foi preparada (S.W. Kim et al, Adv. Drug Del. Rev.2002, 54, 505 - 530) em produção total de 20%, via reação de um derivadoPEG ativado por N-hidroxissuccinimida (NHS) com insulina di-N-Boc-protegida. Reação similar de um reagente de acoplamento bifuncional, talcomo éster de N-maleimidobutirilóxi succinimida (GMBS), dá acesso aconjugados de pentassacarídeo de insulina modificados BI, Alternativamente,o resíduo B29 Lys da insulina Zn desprotegida, pode ser seletivamentemodificado por um excesso de éster NHS em pH -10 - 11 em produção de-60%. Outros métodos bem estabelecidos para a conjugação regiosseletiva dainsulina podem ser adaptados de WO 98/02460, WO 2004/091494, WO2005/012346, US2005/0152848, Jensen et al. J. Pept. Sei. 2005, 11, 339-346,Lee et al. Bioconj. Chem. 2005, 16, 615-620, Jain et al. Biochim. Biophys.Act. 2003, 1622, 42-49, Tessmar et al. Tissue Engin. 2004, 10, 3, 441-453).Ganirelix: os derivados do éster NHS de um pentassacarídeo podem serconjugados com o amino grupo de terminal-N livre de ganirelix de-N-Ac ouum espaçador amino contendo derivado de pentassacarídeo pode serconjugado, opcionalmente via um espaçador adicional, com o grupo ácidocarboxílico de terminal livre de ganirelix desamido, que pode, por sua vez, serobtido por síntese de peptídeo avançada (fase sólida), como descrito, porexemplo, em J. Med. Chem. 1992, 55, 3942 - 3948.
Octreotide: O resíduo de aminoácido D-Phe de terminal-N deoctreotide, um peptídeo comercialmente disponível, pode ser modificado comaté PEG de até 5 kDa, sem abolir a bioatividade (D. Hee et al. Pharm. Res.2005, 22, 743-749). A funcionalização regioespecífica do amino grupo N-terminal pode ser conseguida com um excesso de reagente de ligação de ésterNHS bifuncional em pH ~6, em que mais conjugação com umpentassacarídeo veículo pode ser realizada de acordo com os métodossintéticos gerais, para a produção de bioconjugados como acima descritos (p.ex., por conjugação de um resíduo espaçador de pentassacarídeo, contendoum grupo tiol, com um derivado de maleimida de octreotide).
ADM(27-52'): A metade do terminal-N da adrenomedulina(ADM) de comprimento total não é essencial para sua atividade osteogênica eefeito inibitório sobre a calcificação vascular. A conjugação regioespecíficade um resíduo espaçador de pentassacarídeo com o resíduo Ala de terminal-Nde ADM(27-52) pode ser conseguida sintetizando-se ADM(27-52)opcionalmente N-terminalmente modificado, empregando-se métodos bemestabelecidos, empregando-se síntese de peptídeo de fase sólida e métodossintéticos gerais, para a produção de bioconjugados como descrito acima.
[D-Ala8J-GLP-I(7-36): A porção de terminal-C de GLP-1(736) e seus derivados, tais como Exendin-4(l-39), formam uma estruturahelicoidal-α, em que são expostos os resíduos aminoácidos que sãoimportantes para a ligação ao receptor. A extensão desta seqüência aminoácida com um resíduo de lisina adicional, que é modificado na posição-N6 poruma função maleimida, empregando-se uma síntese de peptídeo de fase sólidaadaptada, como descrito, por exemplo, no WO 2005/058954, ainda exibeligação de receptor e atividade funcional in vivo após ligação covalente com oaminoácido Cys34 da albumina de soro humano, enquanto a estabilidadeproteolítica pode (ainda) ser melhorada incorporando-se um resíduo D-Ala naposição 2 (Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4395-4398). De uma maneirasimilar, GLP-1(7-36) ou seus análogos, podem ser conjugados com umcomponente espaçador de pentassacarídeo funcionalizado (p. ex., contendoum grupo tiol). Alternativamente, um aminoácido Cys pode ser incorporadona seqüência de peptídeo, preferivelmente na(s) posição(ões) 11, 12, 16, 22,23, 24, 25, 26, 27, 30, 34, 35 ou 36 ou adicionado na posição 37, e que podeser acoplado a um componente espaçador-pentassacarídeo (p. ex., contendoum grupo maleimida), usando-se métodos similares como descritos para aPEGilação de derivados de GLPl (WO 2004/093823). Além disso, osconjugados de GLP-I podem ser obtidos por acoplamento direto com umreagente de ligação éster NHS bifuncional com GLP-1, seguido por separaçãodos isômeros posicionais (como descrito, por exemplo, para a PEGilaçãodireta de GLP-I por Lee et al. Bioconjugate Chem. 2005, 16, 377- 382) eacoplamento com um componente espaçador-pentassacarídeo adequadamentefuncionalizado.
Interleucina-2 (IL-2): O aminoácido Cys livre de recH-IL2nativo comercialmente disponível ou aminoácidos Cys livres adicionais dasmuteínas IL2 que são ainda biologicamente ativas, pode ser reagido com umcomponente espaçador-pentassacarídeo contendo um grupo maleimida, deacordo com um protocolo similar, como descrito para a PEGilação de IL2(US 5.206.344) com maleimida-PEG.
O acoplamento de peptídeo, uma possível etapa processual dométodo acima descrito para preparar os compostos da presente invenção, podeser realizado por métodos comumente conhecidos na arte para o acoplamento- ou condensação - de fragmentos de peptídeo, tais como pelo método azida,método anidrido misturado, método éster ativado, método carbodiimida ou,preferivelmente, sob a influência de sais de amônio/urônio, como TBTU,especialmente com a adição de compostos catalíticos e supressores daracemização, como N-hidroxissucinimida, N-hidroxibenzotriazol e 7-aza-N-hidroxibenzotrizol. São fornecidos resumos em The Peptides, Analysis,Syntesis, Biology, Vol. 3, E. Gross e J. Meienhofer, eds. (Academic Press,New York, 1981) e Peptides: Chemistry e Biology. N. Sewald e H.-D.Jakubke (Wiley-VCH, Weinheim, 2002).
As funções amina presentes nos compostos podem serprotegidas durante o procedimento sintético por um grupo de proteção-N, oque significa um grupo comumente usado na química de peptídeo para aproteção de α-amino grupo, como o grupo terc-butiloxicarbonila (Boc), ogrupo benziloxicarbonila (Ζ), o grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) ouo grupo ftaloíla (Phth), ou podem ser introduzidas por desmascaragem de umcomponente azida. Resumos dos grupos de proteção amino e métodos parasua remoção são dados nos acima mencionados The Peptides, Analysis,Syntesis, Biology, Vol. 3 e Peptides: Chemistry and Biology.
Os compostos da invenção, que podem ocorrer na forma deuma base livre, podem ser isolados da mistura de reação na forma de um salfarmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis podemtambém ser obtidos tratando-se a base livre de fórmula (I) com um ácidoorgânico ou inorgânico, tal como cloreto de hidrogênio, brometo dehidrogênio, iodeto de hidrogênio, ácido sulfurico, ácido fosfórico, ácidoacético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido maléico, ácido malônico,ácido metanossulfônico, ácido fumárico, ácido succínico, ácido tartárico,ácido cítrico, ácido benzóico, ácido ascórbico e similares.Os compostos da presente invenção ou seus intermediáriospodem possuir átomos de carbono quirais e podem, portanto, ser obtidoscomo um enantiômero puro ou como uma mistura de enantiômeros, ou umamistura contendo diastereômeros. Métodos para obter os enantiômeros purossão bem conhecidos na arte, p. ex., cristalização de sais que são obtidos deácidos opticamente ativos e a mistura racêmica ou cromatografiaempregando-se colunas quirais. Para diastereômeros, podem ser usadascolunas de fase reta ou inversa.
Análise físico e bioquímicas
Diversas técnicas para monitorar o efeito da reação comligadores bifuncionais e/ou componentes de pentassacarídeo reativos sobre abioatividade da proteína são disponíveis. A este respeito, análise de interaçãobiomolecular (ΒΙΑ), empregando-se moléculas receptoras solúveis comoagentes de ligação complementares (insulina) e determinação da atividade daenzima são ferramentas valiosas. Estudos de ligação do conjugado depentassacarídeo com ATIII podem ser incluídos nestes ensaios também.
Troca de íons, cromatografia de exclusão de tamanho ecromatografia de afinidade ATIII são métodos disponíveis parasubfracionamento dos conjugados de pentassacarídeo, enquanto técnicas deeletroforese são adequadas para caracterização ortogonal, qualitativa equantitativa (p. ex., SDS-PAGE, CZE). Locais de conjugação podem seridentificados por análise MALDI-TOF MS e seqüenciamento dos conjugados.
Estudos farmacocinéticos (PK)
Os estudos PK para determinar a meia-vida in vivo dopolipeptídeo não modificado e os correspondentes conjugados depentassacarídeo podem ser realizados em ratos. Diversas opções sãodisponíveis, p. ex., radiorrotulação com I empregando Iodogênio ouionização por lactoperoxidase, para induzir substituição eletrofilica, ouutilizando-se reagente de Bolton-Hunter como componente rotulante edeterminando-se a radiação-gama em amostras plasmáticas. Outros métodosconhecidos na arte são baseados em injeção de conjugados não-rotulados,seguido por análise imunoquímica através de ELISA ou tecnologia Luminex.
Avaliação farmacológica
Os efeitos farmacológicos da conjugação dos polipeptídeos dainvenção com um pentassacarídeo de ligação ATUI, podem ser estudados emensaios in vitro e modelos animais in vivo, como descrito abaixo.
A insulina é uma proteína de 5,8 kDa, consistindo de duascadeias de peptídeo, que são retidas entre si por duas pontes dissulfeto. Amodificação química específica de sítio dos grupos Lys ε-amino ou N-terminal α-amino é bem documentada. O efeito da conjugação de umpentassacarídeo com a insulina pode ser estudado analisando-se amostras desoro para glicose, teor de insulina e C-peptídeo (um biomarcador para corrigirquanto à secreção da insulina endógena). Um glucômetro eradioimunoensaios de insulina e C-peptídeo humanos são comercialmentedisponíveis. Os efeitos in vivo sobre os níveis da glicose sangüínea podem sermedidos em ratos ou cães Bigle.
Os efeitos farmacológicos in vitro e in vivo da conjugação depentassacarídeo do antagonista GnRH mimético decapeptídeo ganirelixpodem ser estudados em ensaios estabelecidos e modelos animais. A síntesedo polipeptídeo avançada supre uma molécula bem definida, cujos efeitospodem ser comparados com a maturação e ovulação do oócito de bloqueio deganirelix em camundongos e ratos. A comparação da meia-vida biológica doganirelix e sua contraparte conjugada-pentassacarídeo pode, por exemplo, serestudada, determinando-se em qual tempo, após a administração, o processonatural de maturação e ovulação restaurou-se.
GLP-1(7-36) é um hormônio da endocrina insulinotrópica bemconhecido e bem estudado, induzindo numerosos efeitos biológicos, tais comosecreção da insulina estimulante, inibição da secreção do glucagon,motilidade gástrica ou intestinal, aumentando a utilização da glicose einduzindo perda de peso. E rapidamente degradado pela dipeptidil peptidaseIV (DPPIV). A última degradação prematura pode, por exemplo, ser evitadapor substituição do resíduo de aminoácido da posição 8 (p. ex., por D-alanina). Outras abordagens tais como modificação com grandes cadeias deácido graxo ou PEG resultaram em GLP-I biologicamente ativo ou seusanálogos (como definido em p. ex., WO 2004/093823). O efeito estabilizador(adicional) da conjugação de um derivado de GLP-1(7-36) opcionalmentemodificado com um pentassacarídeo veículo pode ser estudado medindo-se aestabilidade do conjugado in vitro, na presença de DPPIV e in vivo, medindo-se a meia-vida plasmática empregando-se análise imunoquímica. A atividadefuncional do conjugado de pentassacarídeo pode ser determinada in vitro,medindo-se a capacidade de ligar-se a e ativar o receptor GLP-I e os efeitosfarmacodinâmicos in vivo podem ser estudados analisando-se as amostras desoro quanto a glicose e insulina.
A adrenomedulina é um polipeptídeo de 52 aminoácidos, comnumerosas funções biológicas, tais como vasodilatação, broncodilatação,neurotransmissão, regulação do crescimento e regulação da formação óssea.
O fragmento truncado ADM(27-52) não tem os requisitos estruturais paraatividade vasodilatadora, porém é ainda capaz de estimular o crescimento deosteoblastos de restos cultivados em uma maneira dependente da dose(Regulatory Peptides 2003, 112, 79-86). Além disso, foi recentementeestabelecido que ADM(27-52) inibe a calcificação vascular em ratos(Regulatory Peptides 2005, 129, 125 - 132) e pode, assim, ter aplicaçãoterapêutica potencial na prevenção ou calcificação da artéria. O efeito daconjugação de ADM(27-52) com um pentassacarídeo veículo pode seravaliado por ensaios bem estabelecidos, medindo-se a atividade osteogênicain vitro, em culturas de osteoblastos de rato fetais ativamente crescendo ou oaumento in vivo do índice da formação óssea (sem afetar a reabsorção óssea).Octreotide é um análogo do octapeptídeo sintético dasomatostatina e é clinicamente usada para o tratamento da acromegalia ecertos tumores endócrinos. Foi mostrado que formulações depósito de longaação (p. ex., depósito de Sanostatina LAR, Novartis Pharma, Basel, Suíça)são pelo menos tão eficazes na diminuição dos níveis do hormônio docrescimento plasmático e fator de crescimento similar à insulina (IGF-I),comparados com três injeções subcutâneas diárias. O efeito da conjugação dooctreotide em um pentassacarídeo em suas propriedades farmacocinéticas efarmacodinâmicas pode ser estudado em ratos machos, utilizando-se radio-imunoensaios estabelecidos, para determinar os níveis do octreotideconjugada e níveis alterados de IGF-I.
A interleucina-2 (IL-2) é uma proteína produzida naturalmenteno corpo pelas células sangüíneas (linfócitos-T) e é uma importante proteínado sistema imune. É comercialmente disponível (Aldesleucina, Proleukin(R),Chiron, U.S.) como um medicamento e é usada no tratamento para algunstipos de câncer (leucemia de células ciliadas) e é usada em conjunto com umaterapia anti-HIV, para induzir o crescimento das contagens das células CD4.
A bioatividade específica dos conjugados de pentassacarídeo-IL-2 pode serdeterminada in vitro usando-se o bioensaio de proliferação de células IL-2,descrito por Gillis et al. (J. Immunol. 1978, 120, 2027 - 2032).
Formulações farmacêuticas
Os conjugados da invenção podem ser administrados enteralou parenteralmente. As exatas dose e regime destes compostos e suascomposições necessariamente serão dependentes da atividade biológica dopolipeptídeo por si, das necessidades do sujeito individual a quem omedicamento está sendo administrado, do grau de aflição ou necessidade e dojulgamento do praticante médico. Em geral, a administração parenteral requermais baixas dosagens do que outros métodos de administração que são maisdependentes da absorção. Entretanto, as dosagens diárias são, para humanos,preferivelmente de 0,0001-1 mg por kg de peso corporal, maispreferivelmente 0,001-0,1 mg por kg de peso corporal.
O medicamento manufaturado com os compostos da presenteinvenção pode também ser usado como adjuvante em terapia. Em tal caso, omedicamento é administrado com outros compostos úteis no tratamento detais estados doentios.
Misturados com auxiliares farmaceuticamente adequados, p.ex., como descrito na referência padrão, Gennaro et al, Remington1SPharmaceutical Sciences, (18a. ed., Mack Publishing Company, 1990, videespecialmente Part 8: Pharmaceutical Preparations e Their Manufacture) oscompostos podem ser comprimidos em unidades de dosagem sólidas, taiscomo pílulas, tabletes, u ser processadas em cápsulas ou supositórios. Pormeio de líquidos farmaceuticamente aceitáveis, os compostos podem tambémser aplicados na forma de uma solução, suspensão, emulsão, p. ex., para usocomo preparação de injeção ou como um spray.
Para produzir unidades de dosagem, p. ex., tabletes, o uso deaditivos convencionais, tais como cargas, colorantes, aglutinantes poliméricose similares é contemplado. Em geral, qualquer aditivo farmaceuticamenteaceitável, que não interfira com a função dos compostos ativos, pode serusado. Veículos adequados, com que as composições podem seradministradas, incluem lactose amido, derivados de celulose e similares, ousuas misturas, usadas em quantidades adequadas. Quando a administração éintravenosa, as composições farmacêuticas podem ser dadas como um bolo,como duas ou mais doses separadas no tempo ou como uma infusão de fluxoconstante ou não-linear. Assim, as composições da invenção podem serformuladas para qualquer via de administração.
Tipicamente, as composições para administração intravenosasão soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, acomposição pode também incluir um agente solubilizante, um agenteestabilizador e um anestésico local como lidocaína, para aliviar a dor no localda injeção. Geralmente, os ingredientes serão supridos separadamente, p. ex.,em um kit, ou misturados entre si em uma forma de dosagem unitária, porexemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado livre de água. Acomposição pode ser armazenada em um recipiente hermeticamente selado,tal como uma ampola ou sachê, indicando a quantidade de agente ativo emunidades de atividade. Onde a composição for administrada por infusão, elapode ser ministrada com um frasco de infusão contendo "água para injeção"de grau farmacêutico estéril, solução salina ou outros fluidos intravenososadequados. Onde a composição for para ser administrada por injeção, umaampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser fornecida, demodo que os ingredientes podem ser misturados antes da administração. Ascomposições farmacêuticas desta invenção compreendem os compostos dapresente invenção e seus sais farmaceuticamente aceitáveis com qualqueringrediente, excipiente, carreador, adjuvante ou veículo farmaceuticamenteaceitável.
A menos que de outro modo definidos, todos os termostécnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumenteentendido por uma pessoa hábil na arte a que esta invenção pertença. Emboraos métodos e materiais similares ou equivalentes àquelas descritos possam serusados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiaisadequados são descritos neste documento. Todas as publicações, pedidos depatente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas porreferência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório,incluindo definições, regulará. Além disso, os materiais, métodos e exemplossão ilustrativos somente e não destinados a serem limitantes.
A invenção é ainda ilustrada mas não limitada pelos seguintesexemplos. Deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas comdiferentes pentassacarídeos, espaçadores e polipeptídeos, sem desvio doespírito e escopo desta invenção.
Legendas para as figuras.
Figura 1,
Reconhecimento do conjugado de pentassacarídeo-insulina 6(Insulina-penta) por ELISA específico de insulina.
Figura 2A.
Análise de interação biomolecular de conjugado depentassacarídeo(PS)-insulina 6.
Reação de anticorpo anti-insulina imobilizado com conjugadode insulina, com subseqüente ligação a receptor de insulina humano.
Figura 2B.
Análise biacore de conjugado de pentassacarídeo(PS)-insulina 6.
Reação de anticorpo anti-insulina imobilizado com conjugadode insulina, com subseqüente ligação de ATIII humano.
Figura 3.
Análise MALDI-TOF de conjugado de pentassacarídeo-insulina monossubstituído 6.
Figura 4.
Análise HP-SEC de conjugado de pentassacarídeo-insulinamonossubstituído 6 em Superdex 30.
Figura 5.
Ligação hATIII de resíduos de pentassacarídeo-espaçador dereferência 7, 8 e 9 (estudo ΒΙΑ).
Figura 6.
Ligação de hATIII de conjugados de insulina-pentassacarídeo24, 28 e 29 (estudo ΒΙΑ).
Figura 7.
Análise espectrométrica de massa (ESI-QTOF) de conjugadode insulina-pentassacarídeo 24.
Figura 7 A.
Comparação de uma distribuição de isótoposexperimentalmente determinada e calculada de um conjugado de insulina-pentassacarídeo (ESI-QTOF, M5+, composto 24).
Figura 8.
Ligação hATIII dos compostos 31, 32, 36, 37 (estudo biacore).Figura 9.
Ligação hATIII do composto 39 (como determinado por ΒΙΑ).
Figura 10.
Perfil de ligação hATIII do composto 41 (como determinadopor ΒΙΑ).
Figura 11,
Perfil de ligação hATIII do composto 44 (como determinadopor ΒΙΑ).
FIGURA 12.
Analises SDS-PAGE e Western blot do composto 47FIGURA 13.
Níveis de plasma médios (média ± s.e.m.) determinados pormedição da concentração da insulina após administração i.v. de 3,5 nmol/kgde insulina recH (círculos abertos) ou conjugado de pentassacarídeo-insulina6 (triângulos)
FIGURA 14.
Níveis de plasma médios (média ± s.e.m.) expressos como %da concentração medida em T = 1 minuto após administração i.v. deconjugado rotulado I (quadrados abertos), 24 (círculos abertos) e 28(triângulos abertos) e da própria insulina recH (bolas fechadas).FIGURA 15.
Níveis de plasma médios (média ± s.e.m.) expressos como %da concentração medida em T=I minuto após administração i.v. de conjugado rotulado I 31 (quadrados abertos) e 32 (triângulos fechados) (dados nãocorrigidos para desalogenação).
Figura 16.
Níveis de plasma médios (média ± s.e.m.) expressos como %da concentração medida em T=I minuto após administração i.v. de conjugadorotulado 125I 39 (quadrados abertos) e de ADM(27-52) rotulado 125I (triângulosfechados) (dados não corrigidos para desalogenação).
FIGURA 17.
Níveis de plasma médios (média ± s.e.m.) expressos como %da concentração medida em T=I minuto após administração i.v. de conjugadorotulado I 41 (triângulos fechados) e de GLP-I rotulado I (quadradosabertos).
FIGURA 18.
Detecção do complexo de pentassacarídeo-conjugado insulina6-ATIII, com anticorpos anti-humano e anti-coelho ATUI.
FIGURA 19.
Níveis médios de glicose (média ± s.e.m.) após administraçãoi.v. de 7 nmol/kg de conjugado de pentassacarídeo-insulina 6 (triângulosabertos) ou 3,5 nmol/kg insulina recH (círculos abertos).
FIGURA 20.
Níveis de glicose médios (média ± s.e.m.) após administraçãoi.v. de 12 nmol/kg de conjugado de pentassacarídeo-insulina 26 (triângulosfechados) ou 24 (círculos abertos), em comparação com os níveis de glicoseapós tratamento com 9 nmol/kg insulina-recH (círculos abertos).
FIGURA 21,
Níveis médios de glicose (média ± s.e.m.) após administraçãoi.v. de 24 nmol/kg de conjugado de pentassacarídeo-insulina 27 (quadradosfechados) ou 25 (losangos fechados), comparados com os níveis de glicoseapós tratamento com 9 nmol/kg insulina-recH (círculos abertos) ou 48nmol/kg de Insulina Detemir (triângulos abertos).Figura 22.
Níveis médios de glicose (média ± s.e.m.) após administraçãoi.v. de 24 nmol/kg de conjugado de pentassacarídeo-insulina 24 (triângulosfechados), 28 (círculos fechados) ou 29 (quadrados fechados), comparadoscom os níveis de glicose após tratamento com 9 nmol/kg de insulina-recH(triângulos abertos) ou 24 nmol/kg de Insulina Determir (losangos abertos).
EXEMPLOS
Abreviações usadas:
ACN acetonitrila
AcOH Acido acético
ADM adrenomedulina
(h)ATIII anti-trombina III (humana)
AUC Area sob a curva
BIA análise de interação biomolecular
Boc2O di-terc-butil dicarbonato
Cl depuração
DCCI N,N'-dicicloexilcarbodiimida
DIPEA diisopropiletilamina
DMF N,N'-dimetilformamida
DMSO dimetil sulfóxido
EDTA tetraacetato de etilenodiamina
ELISA ensaio imuno-sorvente ligado por enzima
Equiv. equivalentes
ESI ionização de pulverização eletrônica
GLP-I peptídeo semelhante a glucagon 1
GMB gama-maleimidobutirila
GMBS N-hidróxi succínico éster do ácido gama-maleimidobutírico
HBS-EP solução salina tamponada com hepes, contendoEDTA e polietileno glicol
HPLC cromatografia líquida de elevado desempenho
HP-SEC cromatografia de exclusão de tamanho de elevadodesempenho
HRP peroxidase de rábano silvestrei.v. intravenosa
IL-2 interleucina-2
MALDI-TOF ionização de dessorção leiser assistida pormatriz tempo de vôo
MoAb anticorpo monoclonal
MRT tempo médio de permanência
MS espectrometria de massa
NMM N-metil morfolina
NMR ressonância magnética nuclear
PAGE eletroforese gel de poliacrilamida
PBS solução salina tamponada com fosfato
PS pentassacarídeo
Q-TOF tempo de vôo quadripolarrecH humano recombinante
Rt tempo de retenção
SDS dodecil sulfato de sódioTBTU 2-( 1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3-tetrametiluroniotetra fluoroboratoTCA ácido tricloroacéticoTEA trietilaminaTFA ácido trifluoroacéticoTHF tetraidrofuranoVss volume de distribuição de estado constante
Materiais e métodos
Os espectros I-NMR foram registrados a 400 MHz em umBruker DRX-400 (ultra blindagem). As mudanças químicas dos solventesorgânicos são informados em ppm (δ) em relação a tetrametilsilano.
DMF, 1,4-dioxano, NMM5 acetato de amônio, Boc2O5 TFA,DMSO, DCCI (Acros), hidroxilamina (50 % em peso em H2O), anidridoiodoacético, GMBS (Sigma Aldrich), insulina recH (Diosynth), TEA, ácido 6-aminocapróico, N-hidroxissuccinimida (Janssen), THF (Biosolve), N-hidroxissuccinimica éster do ácido 2-mercapto-[S-acetil]acético (13), TBTU(Fluka), ACN (Merck), AcOH e Na2HPO4 (J. T. Baker) foram usados comorecebidos dos fornecedores comerciais mencionados.
Cromatografia de coluna foi realizada em MP BiomedicalsGermany GmbH kieselgel 60 (sílica MP 32-63, 60 À) e em MerckLiChroprep RP-18 (40-63 μιη). Análise TLC foi realizada em placas kieselgel60 F254 TLC Merck. Os compostos foram visualizados por absorção UV (254nm) e/ou carbonização com reagente USUI (ácido molibdênico fosfórico/AcOH/ H2SO4 em EtOH).
Espectros MALDI foram obtidos com um Voyager DE PRO(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA) em modo de extraçãoretardada linear e modo de íon positivo e negativo. Ácido alfa-ciano hidróxicinâmico recristalizado (CHCA, 3 g/l em 500 ml/l ACN /1 ml/l TFA) foiusado como matriz. Os pesos moleculares foram medidos utilizando-se umacalibração de dois pontos (p. ex., atribuindo-se insulina recH e uma de suascadeias de fragmento, ou mioglobina a m/z 16953 e m/z 8477).
Os espectros Q-TOF foram obtidos com um PE Sciex API Q-star Pulsar em modo de íon positivo, com uma fonte-ESI. As amostras foramdissolvidas em H2O e dessalinizadas pelo uso de Zipt Tip(R) de fase inversa.
HPLC analítica de valor padrão foi conduzida em um auto-amostrador Gilson 234 com sistema gradiente de três bombas Gilson (305),empregando-se uma coluna Luna™ C 18(2) (fase inversa, 150 χ 4,6 mm, 5μιη). Um detector UV Gilson (118) foi usado para detecção a 210 nm. Eluiçãogradiente foi realizada em uma temperatura de coluna de 40 0C e uma taxa defluxo de 1 ml/min começando com 95% de eluente A (0,1% TFA emH20/ACN, 9:1) e 5% de eluente B (0,1% TFA em ACN) por 5 min, emseguida aplicando-se um gradiente linear de 15 a 50% ACN em 25 min.
Análise analítica (HPLC) do composto 4 foi conduzida em umsistema de gradiente de bomba de duas direção (sistema controlador)Shimadzu SCL-109A vp, empregando-se uma coluna C 18(2) Luna™ (faseinversa, 150 χ 2,0 mm, 5 μιη). Um detector UV de sistema diodo Shimadzu(SPD-M10A vp) foi usado para detecção a 214 nm. Eluição de gradiente foirealizada em uma temperatura de coluna de 40 0C em uma taxa de fluxo de0,4 ml/min.
HPLC preparativa foi conduzida em um controlador deamostra Waters 2769 com um sistema gradiente de uma bomba (Waters 600),empregando-se uma coluna C 18(2) Luna™ (fase inversa, 250 χ 50 mm, 10μπι). Um detector UV Gilson (2996, sistema de fotodiodo) foi usado paradetecção a 210 nm. Eluição gradiente foi realizada em uma taxa de fluxo de50 ml/min, começando-se com 90% de eluente A (0,1% TFA em H2O/ACN,9:1) e 10% de eluente B (0,1% TFA em ACN) por 10 min, em seguidaaplicando-se um gradiente linear de 15 a 50% de eluente B em 50 min.
A cromatografia de troca aniônica foi conduzida em umaPharmacia Alta Explorer com um sistema gradiente de bomba Pharmacia (P-900), empregando-se uma coluna Pharmacia Biotech MonoQ HR 5/5. Umdetector UV Pharmacia (UV 900) foi usado para detecção a 210 nm, emcombinação com um detector de pH e condutividade Pharmacia (pH/C 900).Um detector AD (AD900) foi usado em combinação com um Chiralyser(IBZ). Além disso, um coletor de fração Pharmacia (Frac 950) e um auto-amostrador Pharmacia (A 900) foram usados. A eluição padrão foi realizadacom uma taxa de fluxo de 1 ml/min, começando com 74% de eluente A(ACN/H20 2:8) e 26% de eluente B (ACN/2M NaCl 2:8) por 5 min e entãoaplicando-se um gradiente a 20% de eluente A e 80% de eluente B em 15min.
A cromatografia de troca aniônica preparativa foi conduzidaem um sistema Pharmacia com uma bomba Pharmacia (P-50) e um sistemagradiente de misturador gradiente Pharmacia (LKB GP-10), empregando-seuma coluna de Fluxo-Rápido Q-sefarose Pharmacia Biotech XKl6. Umdetector UV Pharmacia (LKB-UV-MII) foi usado para detecção a 214 nm, emcombinação com uma detector de condutividade Biotechnics. Eluiçãogradiente padrão foi realizada em uma taxa de fluxo de 4,6 ml/mincomeçando-se com 80% de eluente A (H2O) e 20% de eluente B (2M NaClem H2O) por 20 min, em seguida aplicando-se um gradiente a 20% de eluenteA e 80% de eluente B em 210 min.
Filtragem gel preparativa em Sephadex G25 (dessalinização)foi conduzida em um sistema Pharmacia com uma bomba Watson-Marlow(101V), usando-se uma coluna fina Sephadex-G25 Pharmacia Biotech XK26.Um detector UV Pharmacia (LKB-UV-MII) foi usado para detecção a 214nm, em combinação com um detector de condutividade Biotechnics. Eluiçãoisocrática foi realizada com H2O em uma taxa de fluxo de 1 ml/min H2O por10 h.
HP-SEC analítica com o composto 6 foi realizada em umacoluna Pharmacia Superdex™ 30 HR 10/30, montada em um sistema decromatografia HPl 100. A eluição foi realizada com 0,2 mol/1 de tampão defosfato de sódio pH 7,0 em uma taxa de fluxo de 0,4 ml/ml.
HP-SEC analítica com os outros conjugados foi conduzida nosistema Akta Explorer, como descrito para a cromatografia O-sepharoseanalítica, com uma coluna Pharmacia Superdex™ 75 HR 10/30. Uma eluiçãoisocrática foi realizada com acetato de amônio 50 mM em uma taxa de fluxode 1 ml/min.
HPSEC preparativa foi conduzida no mesmo sistema AktaExplorer, como descrito para a cromatografia Q-Sepharose analítica, comuma coluna prep-grade Pharmacia Superdex™ 75 XK26 Hiload 26/60. Umaeluição isocrática foi realizada com acetato de amônio 50 mM em uma taxade fluxo de 1,32 ml/min.
Estudos de ligação de conjugados de pentassacarídeo emATUI, anticorpo anti-insulina e receptor de insulina foram realizados usando-se BIAtechnology. Os sensogramas e os pontos de informação foramanalisados com subtração de células de fluxo, empregando-se valores IC50 deBIAavaliação foram calculados usando-se graphpad Prism 3.0.
As medições A2so foram realizadas em um espectrofotômetroNano Dropw ND-1000 UV-VIS.
Esquema 1, Síntese do composto 4
<formula>formula see original document page 34</formula>
EXEMPLO 1Acido 6-(2-Iodo-acetilamino)-hexanóico (2)
Em uma suspensão de ácido 6-amino-hexanóico (1) (0.37 g,2.8 mmol) em 1,4-dioxano (60 ml) foi adicionado anidrido iodoacético (0.50g, 1,4 mmol). A mistura de reação foi agitada a 50 0C por 3 h e por 16 h emtemperatura ambiente após o que análise TLC (CH2Cl2/MeOH/AcOH,98/10/1, v/v/v) revelou completa conversão do composto 1 em um produtomenos lipofílico. EtOAc (100 ml) foi adicionado e a mistura de reação foilavada com 0.10 M solução de HCl aquosa (50 ml). A camada orgânica foientão lavada duas vezes com salmoura (50 ml) e as camadas de águacombinadas foram extraídas duas vezes com EtOAc (75 ml). As camadasorgânicas combinadas foram secadas (MgS04) e concentradas in vácuo. Oresíduo foi cromatografado sobre gel de sílica (CH2Cl2/MeOH/AcOH,98/10/1, v/v/v) para fornecer ácido 6-(2-iodo-acetilamino)-hexanóico (0.45 g,>100%). hNMR (MeOD): δ 3.67 (s, 2H), 3.17 (t, 2H), 2.29 (t, 2H), 1,66-1,33(m, 6H).
EXAMPLE 2
Ester 2,5-diixo-pirrolidin-l-ila do ácido 6-(2-Iodo-acetilamíno)-hexanóico (3)
Em uma solução de ácido 6-(2-iodo-acetilamino)-hexanóico(2) (0.20 g, 0.67 mmol) em THF (10 ml) foi adicionado N-hidroxissuccinimida (85 mg, 0.74 mmol) e N,N'-diciclohexilcarbodiimida(0.21 g, 1,0 mmol). A mistura de reação foi agitada no escuro por 16 h.
Quando análise TLC (EtOAc/Hep/AcOH, 80/20/1, v/v/v) revelou completaconversão no éster ativado 3, sete gotas de ácido acético foram adicionadas. Amistura foi então armazenada no freezer durante a noite (-20 0C). A misturabruta foi filtrada e o filtrado foi concentrado in vácuo. O produto bruto foipurificado por cromatografia de coluna (EtOAc/Hep/AcOH, 40/60/5 -->20/80/5, v/v/v) e a concentração das apropriadas frações forneceu derivado deéster de N-hidroxissuccinimida 3 (0.18 g, 67%). ihNMR (MeOD): δ 3.67 (s,2Η), 3.18 (t, 2Η), 2.82 (s, 4Η), 2.63 (t, 2Η), 2.0 - 1,0 (m, 6Η).
EXEMPLO 3
Composto 4
Em uma suspensão de insulina recH (50 mg, 8.6 μπιοί) emDMF (15 ml) foi adicionado H2O (9.0 ml), até a solução tornar-setransparente. A solução foi agitada por 15 minutos pra ajustar-se àtemperatura ambiente. O pH da solução foi ajustado em 10 pela adição emgotas de 0,1 M NaOH em H2O. Após isto, o frasco de reação foi embrulhadoem folha de estanho. Uma solução de 3 (5.0 mg, 8.6 μηιοί) em DMF (1,0 ml)foi adicionada em gotas à mistura de reação em 1 min. A mistura de reaçãofoi agitada usando-se uma barra agitadora magnética e o pH foi mantido em10. Após 30 min, um excesso de 0.1% TFA em H2O (5.0 ml) foi adicionadopara extinguir a reação. H2O (200 ml) foi adicionado e a mistura de reação foiliofilizada para fornecer 4 (60 mg, >100%, max. 8,6 μηιοί). Análise HPLC(Shimadzu, fase inversa) partindo-se com 80% de eluente A (0.1% TFA emH2O) e 20% de eluente B (ACN) por 5 min., em seguida aplicando-se umgradiente a 20% de eluente A e 80% de eluente B em 30 min. revelou apresença de 45% do produto monossubstituído (insulina recH Rt: 12.84 min;Composto 4 Rt: 13.54 min; produto dissubstituído B29/A1: Rt 14.16 min). Oproduto bruto foi usado sem purificação na próxima reação.
EXEMPLO 4
Composto 6
O composto bruto 4 (60 mg) foi dissolvido em uma solução0,05 desgaseificada (passando-se através de N2) de NH2OH em tampão 0,1 MNa2HP04. A mistura de reação foi agitada utilizando-se uma barra agitadoramagnética e desgaseificando-se por 30 min (passando-se através de N2). Emseguida o composto espaçador-pentassacarídeo 5 (95 mg, 43 μηιοί), que foipreparado como descrito em Angew. Chem. Intl. Ed. (1996), 55, 331-333, foiadicionado como um sólido e a mistura de reação foi agitada sob umaatmosfera de nitrogênio por 16 h.
Esquema 2. Síntese do Composto 6.
<formula>formula see original document page 37</formula>Esquema 2.
<formula>formula see original document page 38</formula>
Purificação do conjugado de pentassacarídeo-insulina 6Pela mistura de reação do parágrafo anterior, conjugado depentassacarídeo-insulina monossubstituído foi purificado a próximo dahomogeneidade por cromatografia de troca de ânions (etapa de captura) ecromatografia de exclusão de tamanho (etapa de polimento).
A solução contendo conjugado foi aplicada em uma coluna deQ-Sepharose FF, equilibrada em tampão de fosfato de sódio 20 mmol/1 pH8,0. Após a fração de proteína não reagida ter passado pela coluna, umaextensa lavagem com tampão de equilíbrio foi realizada até A2So ter retornadopara o nível da linha de base. Insulina ligada, não reagida, foi eluída em tornode 0,4 mol/1 NaCl e o conjugado de pentassacarídeo-insulinamonossubstituído a 0,7 mol/1 NaCl como determinado por HP-SEC analíticaem Superdex 30 e MALDI-TOF-MS. A fração conjugada foi concentrada porultrafiltragem ou cromatografia de troca de ânions, empregando-se um choquede NaCl 2 mol/1 como etapa de eluição e foi aplica em uma coluna Superdex30 preparativa, equilibrada em sistema de soldagem tamponada com fosfato.Frações contendo monoconjugados puros, como determinado por HP-SEC eMALDI-MS foram reunidas. O produto final foi armazenado a -70 0C apóscongelamento instantâneo em uma mistura de etanol/gelo seco. Aconcentração de conjugado foi estimada por medição A2so utilizando-se umcoeficiente de absorvência de 0,8 para 1 mg/ml.
Caracterização do Composto 6
A identidade do conjugado de insulina-pentassacarídeopurificado 6 foi determinado por um ELISA para insulina e por Análise deInteração Biomolecular (ΒΙΑ), utilizando-se o receptor de insulina humano eATIII humano como analisados. Pureza e monomericidade foram avaliadospor HP-SEC em Superdex 30 e MALDI-MS.
Como é mostrado na Fig. 1, duas bateladas de conjugado deinsulina-pentassacarídeo 6 são reconhecidas pelo ELISA específico deinsulina, que demonstra a presença de um componente de insulinaimunorreativo. Por experimentos BIA do Biacore pode ser concluído que ainsulina conjugada com pentassacarídeo é ainda capaz de ligar-se ao receptorde insulina humano (Fig. 2A). Nestes experimentos, um MoAb para insulinahumana (clone M3222213, 10-130, batelada 223, Fitzgerald IndustriesInternational, designado MoAb 13) foi imobilizado em um chip sensor CM5,empregando-se acoplamento amino padrão. HBS-EP (Biacore, cat. No. 22-0512-44) foi usado como tampão de corrimento em uma taxa de fluxo de 5μl/min. Injeção do conjugado de insulina resultou na ligação do conjugado aoanticorpo imobilizado. O conjugado de insulina imunoligado foi capaz dereagir com o receptor de insulina humano, bem como com ATUI, o últimosendo indicativo para um pentassacarídeo covalentemente ligado (Fig. 2B).
Espectros MALDI-TOF do conjugado de insulina-pentassacarídeo 6 foram obtidos como descrito sob Materiais e Métodos.
Antes da análise, as amostras foram dessalinizadas e concentradas em μΟ 18-ZipTips (Millipore Corporation, Billerica MA, USA). A eluição foidiretamente sobre um alvo MALDI de ácido inoxidável em 1 μΐ de umasolução contendo 10 g/l de alfa-ciano em 500 ml/l ACN/ 1 ml/l TFA. A Fig. 3representa um típico perfil MS MALDI-TOF de um conjugado de insulina-pentassacarídeo monossubstituído, com picos em torno de m/z 6700 e 7400.
A aparente heterogeneidade é causada por dessulfatação induzida por leiserdo componente pentassacarídeo, resultando em uma perda serial de 80 Da.Nenhum conjugado de insulina-pentassacarídeo dissubstituído foi encontradona análise MS MALDI-TOF, uma vez que não foram encontrados picos nafaixa de m/z 9400 característicos de insulina dissubstituída. Deve serobservado que também os picos para a insulina não-reagida estão ausentes(m/z 5808).
Análise HP-SEC (Fig. 4) mostra um pico maior com um tempode retenção de 22 min. A pureza foi estimada a 97% (insulina e conjugadodissubstituído não reagidos parecem estar ausentes).
EXEMPLO 5
Composto 11
Pentassacarídeo 7 (46 mg) [que pode ser obtido poracoplamento do monossacarídeo dissubstituído 5, descrito no WO2001/42262, com o tetrassacarídeo que foi obtido conduzindo-se a rotasintética para o tetrassacarídeo 30 descrito em Bioorg. Med. Chem. (1994), 2,1267-1280, em que o bloco de construção de monossacarídeo final redutor 12foi substituído por metil 2,3-di-0-benzil-6-0-metil-a-D-glicose, empregando-se métodos similares àqueles descritos nestas publicações, incluindodesproteção e sulfatação] e derivado de glicol 10 (18 mg, 1,6 equiv.) foramdissolvidos em DMF (5 ml) sob atmosfera de nitrogênio. NMM (61 μΐ, 5equiv.) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada durante a noite emtemperatura ambiente. O solvente foi evaporado in vácuo e o resíduo restantefoi purificado por cromatografia de troca de ânions preparativa. As fraçõesapropriadas foram combinadas e dessalinizadas em uma coluna G25preparativa. As frações combinadas foram liofilizadas para fornecer 11 (25mg, 57%) como um pó branco. Pureza > 98% (troca de ânions analítica,UV210nm)- 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5,31 (d, 1H), 5,23 (m,1H), 4,91 (m, 1H), 4,45-4,35 (m, 1H), 4,48-3,93 (m, HH), 3,87-3,62 (m, 9H),3,60- 3,45 (m, 39H), 3,41-3,34 (m, 15H), 3,33-3,23 (m, 7H), 3,18-3,08 (m,2H), 2,97 (t, 2H), 2,23 (s, 3H).
EXEMPLO 6
Composto 12
Pentassacarídeo 8 (0,2 g), que foi preparado como descritoem WO 2001/42262, e derivado de glicol 10 (53 mg, 1,3equiv.), que foi preparado como descrito em Angew. Chem. Intl. Ed. (1996),55, 331-333, foram dissolvidos em DMF (5,0 ml). NMM (61 μιηοΐ, 5 equiv.)foi adicionado e a mistura de reação foi agitada durante a noite emtemperatura ambiente. O solvente foi evaporado in vácuo e o resíduo foipurificado por cromatografia de troca de ânions preparativa. As fraçõesapropriadas foram combinadas e dessalinizadas em uma coluna G25preparativa. As frações combinadas foram liofilizadas para fornecer 12(0,13g, 55%) Como um pó branco. Pureza >95% (troca de ânions analítica,UV2IOnm)- 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5,12 (d, 1H), 5,03 (d,1H), 4,70 (d, 1H), 4,34-4,18 (m, 2H), 4,09-4,03 (m, 1H), 3,98-3,90 (m, 5H),3,85-3,74 (m, 6H), 3,66-3,48 (m, 7H), 3,43-3,24 (m, 41H), 3,23-3,15 (m,13H), 3,12 (m, 2H), 3,10-3,01 (m, 7H), 2,99-2,88 (m, 3H), 2,78 (t, 2H), 2,04 (s, 3H).EXEMPLO 7
Composto 14
Pentassacarídeo 9 (100 mg) [que pode ser obtido poracoplamento do monossacarídeo derivatizado 5, descrito em WO 01/42262com o tetrassacarídeo 48 descrito em US 2004/0024197 utilizando-semétodos similares àqueles descritos nestes pedidos de patente, incluindodesproteção e sulfatação] e Composto 13 (18 mg, 1,5 equiv.) foramdissolvidos em DMF. NMM (15 μΐ, 2,5 equiv.) foi adicionado e a mistura dereação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. O solvente foievaporado in vácuo e o resíduo restante foi purificado em uma coluna G25preparativa. As frações apropriadas foram combinadas e liofilizadas parafornecer 14 (84 mg, 79%) como um pó branco. Pureza: >95% (troca de ânionsanalítica, UV2I0nm). 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 5,12 (d, 1H),5,09 (d, 1H), 4,82 (d, 1H), 4,40-4,26 (m, 1H), 4,10-3,87 (m, 8H), 3,82-3,73(m, 4H), 3,67-3,43 (m, HH), 3,41-3,35 (m, 14H), 3,31-3,26 (m, 13H), 3,24-3,15 (m, 8H), 3,14-3,02 (m, 5H), 3,01-2,87 (m, 3H), 2,08 (s, 3H).
Esquema 3, Síntese dos derivados espaçador pentassacarídeo11, 12 e 14.<formula>formula see original document page 43</formula>
EXEMPLO 8
Composto 15
Insulina Rech (779) foi dissolvida em DMSO anidro (25 ml) eAcOH (465 μΐ). Boe2O (73 mg, 2,5 equiv) foi adicionado à solução e amistura resultante foi agitada por 5 h em temperatura ambiente. A reação foiextinta pela adição de 0,1% TFA em H2O/ACN (9/1, v/v, 150 ml) e a soluçãofoi liofilizada quatro vezes. O resíduo foi dissolvido em 0,1% TFA emH2OMCN (9/l)/ACN (3:1) e o produto principal foi isolado por HPLCpreparativa. As frações apropriadas foram combinadas e liofilizadas parafornecer insulina Al,Bl-diBoc 15 (200 mg, 26%) como um pó branco.Pureza: 98% (HPLC analítica). MS calcd. para C207H399N6508iS6 = 6008,encontrado em MALDI-TOF 6008 (utilizando-se insulina recH como padrãode referência interno).
EXEMPLO 9
Composto 16Insulina recH (752 mg) foi dissolvida em DMSO anidro (20ml) e TEA (0,75 ml). Boc2O (66 mg, 2,5 equiv.) em DMSO (5 ml) foiadicionado à solução e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 1,5h. A reação foi extinta pela adição de 0,1% TFA em H2O/ACN (9/1, v/v, 150ml) e a mistura foi liofilizada três vezes. 0 resíduo resultante foi dissolvidoem 0,1% TFA em H20/ACN (9/1) e foi submetido a HPLC preparativa. Asfrações apropriadas foram combinadas e liofilizadas para fornecer insulinaAl,B29-diBoc 16 Como um pó branco (332 mg, 43%). Pureza: >98% (HPLCanalítica). MS calcd. para Q67H399N65O81S6 = 6008, encontrado em MALDI-TOF 6008 (utilizando-se insulina recH como um padrão de referênciainterno).
EXEMPLO 10
Composto 17
Insulina Al,Bl-diBoc 15 (200 mg) foi dissolvida em dimetilsulfóxido anidro (5 ml) e trietilamina (145 μΐ). GMBS (45 mg, 5 equiv.) foiadicionado e a mistura de reação foi agitada por 30 min em temperaturaambiente. A mistura de reação foi extinta pela adição de 0,1% TFA emH2OAACN (9/1, v/v, 150 ml) e a mistura resultante foi liofilizada parafornecer insulina Al,Bl-diBoc-B29-GMB 17 (0,5 g, brutos), que foi usada naetapa seguinte sem mais purificação.
EXEMPLO 11
Composto 18
Insulina Al,B29-diBoc 16 (330 mg) foi dissolvida em DMSOanidro (5 ml) e TEA (332 μΐ). GMBS (230 mg, 15 equiv.) foi adicionado e amistura de reação foi agitada por 30 min em temperatura ambiente. A misturade reação foi extinta pela adição de 0,1% TFA em H2OAACN (9/1, v/v, 150ml) e a solução resultante foi liofilizada para fornecer insulina Al,B29-diBoc-Bl-GMB 18 (0,6 g, brutos), que foi usada na etapa seguinte sem maispurificação.EXEMPLO 12
Composto 19
Insulina Al,Bl-diBoc-B29-GMB 17 (0,5 g, brutos) foidissolvida em TFA (5 ml) e agitada por 10 min em temperatura ambiente. OTFA foi removido sob pressão reduzida, o resíduo foi dissolvido em 0,1%TFA em H2O/ACN (2/1, v/v) e a solução foi imediatamente submetida aHPLC preparativa. As frações apropriadas foram combinadas e liofilizadaspara fornecer insulina B29-GMB 19 como um pó branco (93 mg, 47%).
Pureza >99% (HPLC analítica).
EXEMPLO 13
Composto 20
Insulina Al,B29-diBoc-Bl-GMB 18 (0,6 g, brutos) foidissolvida em TFA (5 ml) e a mistura foi agitada por 10 min em temperaturaambiente. Te TFA foi evaporado in vácuo, o produto bruto foi dissolvido em0,1% TFA em H2OAACN (9/2, v/v) e a solução resultante foi imediatamentesubmetida a HPLC preparativa. As frações apropriadas foram combinadas eliofilizadas para fornecer insulina Bl-GMB 20 como um pó branco (127 mg,40%). Pureza >99% (HPLC analítica). MS calcd. para C267H399N65OsiS6 =5973, encontrado em MALDI-TOF 5973 (utilizando-se insulina recH comoum padrão de referência interno).
EXEMPLOS 14-19
Procedimento geral para a conjugação de insulina-GMBcom pentassacarídeo
Insulina-GMB 19 ou 20 (25 mg) foi dissolvida em um tampão0,1 M de Na2HPO4 (12 ml, pH 7,0, desgaseificada por passagem de N2 atravésda solução). A solução foi agitada utilizando-se uma barra agitadoramagnética e foi desgaseificada por mais 30 min. Em seguida opentassacarídeo 5, 11, 12 ou 14 (23 mg, 2,5 equiv.) foi adicionado como umsólido, seguido pela adição de NH2OH (50 μΐ, 0,05M). A mistura de reaçãofoi agitada sob uma atmosfera de nitrogênio em temperatura ambiente. Após16 horas, a mistura de reação foi submetida a HPSEC preparativa (S75). Asapropriadas frações foram combinadas e liofilizadas para fornecer pentaconjugados de insulina 24, 25, 26, 27, 28, 29 como um pó branco em umaprodução típica de 30% - 50%. As produções foram determinadas pormedições A280, utilizando-se o mesmo coeficiente de extinção molar quepara insulina recH.
EXEMPLO 14
Composto 24
Insulina B29-GMB 19 (25 mg) foi conjugada compentassacarídeo 5 (23 mg), de acordo com o procedimento geral, parafornecer derivado de insulina pentassacarídeo-B29 24 (15 mg, 45%). ESI-MScalcd. para C32OH48TN67Oi37S14 = 7913, encontrado em Q-TOF 2638,7 M3+;1979,2 M4+; 1583,6 M5+, 1319,8 M6+. Pureza: >98% (HPSEC analítica, trocade ânions analítica).
EXEMPLO 15
Composto 25
Insulina Bl-GMB 20 (25 mg) foi conjugada compentassacarídeo 5 (23 mg) de acordo com o procedimento geral para fornecerderivado de insulina de pentassacarídeo-B 1 25 (16 mg, 47%). ESI-MS calcd.para C320H487N67Oi37S14 = 7913, encontrado em Q-TOF 2637 M3+; 1978 M4+;1583 M5+. Pureza: >95% (HPSEC analítica), >98% (troca de ânionsanalítica).
EXEMPLO 16
Composto 26
Insulina B29-GMB 19 (13 mg) foi conjugada compentassacarídeo 14 (12 mg) de acordo com o procedimento geral parafornecer Derivado de insulina de pentassacarídeo-B29 26 (5 mg, 31%). ESI-MS calcd. para C312H47IN67O133S14 = 7737, encontrado em Q-TOF 2578 M3+;1934 M4+. Pureza: >98% (HPSEC analítica).
EXEMPLO 17
Composto 27
Insulina Bl-GMB 20 (15 mg) foi conjugada compentassacarídeo 14 (13 mg), de acordo com o procedimento geral, parafornecer derivado de insulina de pentassacarídeo-B 1 27 (8 mg, 40%). ESI-MScalcd. para C312H47IN67O133S14= 7737, encontrado em Q-TOF 2578 M3+; 1934M4+. Pureza: >98% (HPSEC analítica).
EXEMPLO 18
Composto 28
Insulina B29-GMB 19 (15 mg) foi conjugada compentassacarídeo 12 (13 mg), de acordo com o procedimento geral, parafornecer derivado de insulina de pentassacarídeo-B29 28 (6 mg, 30%). ESI-MS calcd. para C32IH4SgN67O134S13= 7847, encontrado em Q-TOF 1962 M4+;1570 M5+; 1308 M6+. Pureza HPSEC: >98%.
EXEMPLO 19
Composto 29
Insulina B29-GMB 19 (15 mg) foi conjugada compentassacarídeo 11 (13 mg) de acordo com o procedimento geral parafornecer derivado de insulina de pentassacarídeo-B29 29 (7 mg, 33%). ESI-MS calcd. para C322H491N67O131S12= 7782, encontrado em Q-TOF 2593 M3+;1945 M4+; 1556 M5+. Pureza: >98% (HPSEC analítica).
Esquema 4 Síntese de conjugados de pentassacarídeo-insulina 24-29.<formula>formula see original document page 48</formula>
Caracterização
Cromatografia de exclusão de tamanho analítica
Os compostos 24-29 foram submetidos a análise HP-SECanalítica em uma coluna Superdex 75 26/10. Eluição foi realizada com acetatode amônio 50 mM em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min.
Tabela 1. Análises HPSEC de conjugados de insulina 24-29
<table>table see original document page 49</column></row><table>
Todos os conjugados foram observados como picos únicos(pelo menos > 95% de pureza) ilustrando a ausência de formas agregadas depentassacarídeo-insulina.
Análise de seqüência N-Terminal
Os conjugados de pentassacarídeo-insulina 24-29, bem comoos correspondentes precursores 15, 16, 19 e 20, foram submetidos a análise deseqüência de terminal-N (degradação Edman). Em cada um dos ciclosrealizados, os
Em cada um dos ciclos realizados, os derivados de insulinasubstituída B29 15, 19, 24, 26, 28 e 29 produziram quantidades equimolaresde aminoácidos de cadeia tanto A como B, a um nível comparável com aqueledas quantidades iniciais dos conjugados. Isto indica total acessibilidade deambos os términos e, assim, ausência de componentes conjugados, que são,portanto, confinados à posição B29. Ao contrário, somente aminoácidos decadeia A foram encontrados durante o seqüencialmente de terminal-N dosderivados de insulina substituída-B 1 16, 20, 25 e 27, demonstrandoconjugação na posição Bl como conseqüência da inibição da degradaçãoEdman no término-N da cadeia-B.
Ensaio de ligação hATIII competitivo, utilizando-se Análisede Interação Biomolecular
Princípio e objetivo do teste: A Análise de InteraçãoBiomolecular estuda a interação entre (bio)moléculas por imobilizaçãocovalente de um dos interatuantes em uma superfície de chip sensor e injeçãodo outro interatuante no fluxo intermediário contínuo através desta superfície.A ligação é registrada como uma mudança do índice refrativo nesta superfíciee é proporcional ao peso molecular (Mw) dos interatuantes.
Para estudar a interação entre hATIII e os conjugados depentassacarídeo, o composto 9 é covalentemente unido à superfície de chipsensora. A ligação de hATIII ao pentassacarídeo gera um forte sinal, comoresultado da diferença em Mw entre o ligando pentassacarídeo (pequeno)ligado e o analisado hATIII (grande). Amostras pré-incubadas, contendo umaconcentração constante de hATIII e concentrações variáveis dopentassacarídeo ou conjugado, foram injetadas sobre a superfície. A ligaçãodo pentassacarídeo ou conjugado com ATIII durante a pré-incubação resultaem uma redução de ligação ATIII com o pentassacarídeo imobilizado. Esteensaio de ligação competitivo permite a determinação dos valores IC50 paracada conjugado de pentassacarídeo.
Procedimento experimental: O composto 9 é covalente unidoa um chip sensor CM5 por acoplamento de amina em pH 8.5. O chip sensor éativado por EDC/NHS por 15 min e subseqüentemente o composto 9 éinjetado em uma concentração de 100 μg/ml. Os grupos hidroxissuccinimidanão-reagidos são reagidos com etanolamina por 7 min. A superfície éregenerada por três curtas injeções de 5 μΐ 5 mol/1 NaCl, em uma taxa defluxo de 25 μΐ/min. A imobilização do pentassacarídeo pode não serdetectada, entretanto, a ligação de hATIII com uma superfície tratada comodescrito foi constatada específica, demonstrando a presença dopentassacarídeo na superfície.
Uma série de concentrações de hATIII foi testada para estimaruma concentração sensível para inibição (a 80% de ligação máxima). Em umataxa de fluxo de 20 μΐ/min três injeções por minuto foram realizadas emsuperfície tanto branca como imobilizada em série a 25 0C. Um ponto reporteé gerado a 170 s. A superfície é regenerada por uma injeção 12s de 5 mol/1NaCl.
As amostras foram testadas em relação a uma concentraçãoconstante de hATIII (isto é, 15 nmol/1) e concentrações de conjugado depentassacarídeo variando entre 0,78 - 100 nM. A injeção hATIII ou pontoreporte sem conjugado de pentassacarídeo é ajustada a 100 % de ligação. Aligação % relativa dos pentassacarídeos e dos conjugados, em comparaçãocom a ligação máxima, foi usada para gerar uma curva sigmoidal (cominclinação variável) plotando-se Log [concentração] vs % ligação de que osvalores IC50 foram derivados.
Tabela 2. Valores IC5o expressando potencial de ligação ATIIIem um ensaio de ligação competitiva (estudo ΒΙΑ)
<table>table see original document page 51</column></row><table>
Conclusão - A diferença em IC5o's entre os pentassacarídeoscarreadores de referência 7-9 (Fig. 5, Tabela 2) confirma que seu potencial deligação competitiva em ATUI, uma medida para a afinidade de ligação paraATIII, pode ser sintonizada mudando-se o número de grupos sulfato contidosnestas moléculas. O potencial de ligação (competitiva) (IC50) de todos osconjugados de insulina-pentassacarídeo (24-29) em hATIII situa-se na mesmafaixa, quando comparados com os pentassacarídeos de referência precursor 7- 9 (Fig. 6, Tabela 2). Estes dados indicam que as propriedades farmacêuticasdos conjugados podem ser sintonizadas utilizando-se pentassacarídeoscarreadores alternativos, com diferente afinidade de ligação para ATUI.
Espectrometria de Massa
Uma típica análise espectrométrica de um conjugado depentassacarídeo é representada na Fig. 7. Por exemplo, o composto 24 com afórmula bruta C32oH487N67Oi37Si4 e uma massa mono isotópica calculada de7913, foi analisado com um sistema ESI-QTOF. No espectro ESI-MS,múltiplos íons carregados em relações m/z 1319,8 (6+), 1583,6 (5+), 1979,2(4+), 2638,7 (3+), em linha com a distribuição de carga da insulina recH,foram encontrados. Além disso, a distribuição de isótopos de um picomultiplamente carregado aleatoriamente selecionados (p. ex., 5+) paraC32oH487N67Oj37Si4 (composto 24) está de acordo com a distribuição deisótopos teoricamente calculada com o programa Isopro (vide linhaspontilhadas na Fig. 7A).
Procedimento geral para a conjugação de decapeptídeosantagonistas GnRH com pentassacarídeo (EXEMPLOS 20, 21, 24, 25)
Derivado de ganirelix 30 ou 35 (70 mg) foi dissolvido emDMF (20 ml) sob uma atmosfera de nitrogênio. TBTU (14 mg, 1,05 equiv.) eNMM (25 μΐ, 5 equiv.) foram adicionados e a mistura foi agitada por 1 horaem temperatura ambiente. Pentassacarídeo 8 ou 9 (88 mg, 1,1 equiv.) foidissolvido em DMF (10 ml) para fornecer uma suspensão. Esta suspensão foiadicionada à mistura de reação e a mistura restante foi agitada por 16 horasem temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com água (200 ml)e foi liofilizada. O resíduo resultante foi purificado em sílica de fase inversa(Cl8) com 0,01 M acetato de amônio (pH 7) e um gradiente de 10 a 50%ACN em eluições-bloco. As apropriadas frações foram combinadas eliofilizadas par fornecer o conjugado de pentassacarídeo ganirelix 31, 32, 36ou 37 como um pó branco. HPLC analítica foi realizada com uma eluição degradiente, começando-se com 90% de eluente A (acetato de amônio 0,01 M) e10% de eluente B (ACN) por 5 min, em seguida aplicando-se um gradiente a100% de eluente B em 30 min.
EXEMPLO 20
Composto 31
Derivado-ganirelix 30 (70 mg), que foi preparado por síntse depeptídeo de fase sólida, como descrito em J. Med. Chem. 1992, 55, 3942-3948, foi conjugado com pentassacarídeo 8 (88 mg) de acordo com oprocedimento geral, para fornecer 31 (16 mg, 40%). Pureza 96% (HPLCanalítica), 97% (troca de ânions analítica). ESI-MS calcd. paraC126H19IClN18O62S6 = 3175,0359, encontrado 792,7390 [M-4H]4-, 1057,3258[M-3H]3-, 1062,9883 [M+NH3-3H]\ 1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY):δ 8,56 (m, 1H), 8,53 (m, 1H), 8,10 (m, 1H), 7,76 (m, 2H), 7,68 (m, 2H), 7,47(m, 1H), 7,39 (m, 2H), 7,16 (m, 3H), 7,04 (m, 2H), 6,95 (m, 2H), 6,63 (m,2H), 5,35-5,25 (m, 2H), 4,95 (m, 1H), 4,68- 4,61 (m, 1H), 4,61-4,51 (m, 2H),4,50-4,38 (m, 2H), 4,38-4,25 (m, 3H), 4,24-3,96 (m, 15H), 3,90-3,84 (m, 1H),3,84-3,67 (m, 8H), 3,67-3,20 (m, 53H), 3,19-3,09 (m, 4H), 3,09-2,98 (m,12H), 2,98-2,84 (m, 8H), 2,77 (m, 2H), 2,13 (m, 1H), 1,96-1,72 (m, 5H),1,68-1,42 (m, 5H), 1,42-1,20 (m, 7H), 1,18-0,89 (m, 13H), 0,85-0,71 (m, 5H).
EXEMPLO 21
Composto 32
O derivativo-ganirelix 30 (70 mg) foi conjugado com opentassacarídeo 9 (88 mg), de acordo com o procedimento geral, parafornecer 32 (52 mg, 35%). Mass calcd. para C125H189ClN18O65S7 = 3240,9770;encontrado em ESI-QTOF 809,2219 [M-4H]4-, 1079,2994 [M-3H]3\1084,9739 [M+NH3]3~, 1090,6340, [M+2NH3-3H]3- 1H-NMR (D2O, 400MHz, HH-COSY): δ 8,45 (m, 1H), 8,38 (m, 1H), 7,90 (m, 1H), 7,78 (d, 1H),7,73 (m, 2H), 7,59 (m, 1H), 7,50 (m, 1H), 7,43 (m, 2H), 7,20 (m, 3H), 7,05(d, 2H), 6,97 (m, 2H), 6,66 (m, 2H), 5,40-5,30 (m, 2H), 5,09 (d, 1H), 4,67-4,48 (m, 2H), 4,40-3,92 (m, 18H), 3,92-3,75 (m, 7H), 3,77-3,17 (m, 56H),3,12-3,02 (m, HH), 3,02-2,98 (m, 8Η), 2,97-2,83 (m, 4Η), 2,81-2,75 (m, 2Η),2,14 (m, 1Η), 1,99-1,86 (m, 5Η), 1,82-1,23 (m, 12Η), 1,22-0,90 (m, 13Η),0,87- 0,72 (m, 5Η). Pureza: 95% (HPLC analítica), 97% (pureza troca deânions analítica).
EXEMPLO 22
Composto 34
O Composto 30 (100 mg) foi dissolvido em DMF. TBTU (36mg, 2 equiv.) e NMM (60 μΐ, 10 equiv.) foram adicionados e a mistura dereação foi agitada por 1 hora em temperatura ambiente. Em seguida oComposto 33 (34 mg, 2 equiv.), que foi preparado como descrito em WO2005090382, foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por 16 horas emtemperatura ambiente. O solvente foi removido in vácuo e o resíduo restantefoi dissolvido em água/CAN, a solução resultante foi submetida a HPLCpreparativa (gradiente: 80% de eluente A (0,1 % TFA em H2O) e 20% deeluente B (ACN) em 20% de eluente A e 80% de eluente B em 45 min.). Asfrações apropriadas foram combinadas para fornecer, após liofilização, ocomposto 34 (60 mg, 60%) como um pó branco. HPLC analítica foi realizadaaplicando-se um gradiente começando com 75% de eluente A (0,1% TFA emH2O) e 25% de eluente B (CH3CN) em 20% de eluente A e 80% de eluente Bem 15 min.. Mass calcd. para Cg4H139ClNi8Oig = 1859, encontrado emMALDI-TOF 1860 [M+H]+ e 1882 [M+Na]+. Pureza: >90% (HPLCanalítica). EXEMPLO 23
Composto 35
O composto 34 (60 mg) foi dissolvido em H20/TFA/ACN (7ml, 5:1:1) e foi agitado por 2 horas em temperatura ambiente. Umaquantidade extra de TFA (2,5 ml) foi adicionada e a mistura de reação foiagitada por outras 22 horas. O TFA foi evaporado in vácuo e a soluçãorestante foi liofilizada para fornecer 35 (45 mg, 77%) como um pó branco.Mass calcd. para C90H131ClN,80,9= 1803, encontrado em MALDI-TOF 1804[M+H]+ e 1826 [M+Na]+. Pureza: >95% (HPLC analítica).
EXEMPLO 24
Composto 36
O derivativo-ganirelix 35 (17 mg) foi conjugado compentassacarídeo 8 (19 mg), de acordo com o procedimento geral. Purificaçãoadicional foi realizada por HPLC preparativa (gradiente: 90% de eluente A(0,01 M acetato de amônio) e 10% de eluente B (CH3CN) por 5 min., emseguida em 100% B em 50 min.). As frações apropriadas foram combinadas eliofilizadas para fornecer 36 (2 mg, 6%). Pureza: 94% (HPLC analítica),>98% (troca de ânions analítica).
EXEMPLO 25
Composto 37
O derivativo-ganirelix 35 (17 mg) foi conjugado compentassacarídeo 9 (19 mg), de acordo com o procedimento geral. Purificaçãoadicional foi realizada por HPLC preparativa, como descrito para o Composto36. As frações apropriadas foram combinadas e liofilizadas para fornecer 37(1,16 mg, 3%). Pureza: 88% (HPLC analítica). Pureza de troca de ânionsanalítica: >95%.
Esquema 5. Síntese dos Compostos 31, 32, 36 e 37.<formula>formula see original document page 56</formula>
Conclusão: As diferenças de potencial de ligação competitivaem ATIII, entre, por um lado, os conjugados 31 e 32 e, por outro lado, osconjugados 36 e 37 (como representado na Fig. 8), revelaram que,independente da extensão do resíduo de ligação, a afinidade para ATIII podeser sintonizada por mudança do número de grupos sulfato contidos nestasmoléculas. Estes dados indicam ainda que as propriedades farmacocinéticas invivo destes conjugados podem ser sintonizáveis pela escolha dopentassacarídeo (vide estudo farmacocinético abaixo). Além disso, a ligaçãodos conjugados em ATIII é específica, uma vez que ganirelix de peptídeoprecursor não-conjugado não apresenta ligação competitiva em ATUI.
EXEMPLO 24
Composto 39
O composto 38 (26,5 mg, 8,4 μπιοί), suprido por NeoMPS(Strasbourg, França), foi dissolvido em tampão Na2HPO4ZNaH2PO 0,1 Mdesgaseificado (16 ml, pH 7,0). Pentassacarídeo 5 (45,5 mg, 21 μπιοί, 2,5equiv.) foi adicionado sob atmosfera de nitrogênio e a mistura resultante foiagitada por aproximadamente 10 min. Em seguida uma solução aquosa deNH2OH (50 % em peso, 69 μΐ) foi adicionada e a mistura de reação foiagitada por 16h. O produto foi purificado em uma coluna Q-Sepharose (2MNaCl(aq)/H20/ACN, 10/40/1 —> 40/10/1, v/v/v). A dessalinização dasfrações apropriadas foi realizada utilizando-se cromatografia sephadex G25,como descrito acima, para produzir o Composto 39 (15,7 mg, 35%). Aprodução foi determinada por medição A280, utilizando-se uma absorvênciateórica de 0,48 para uma solução de 1 mg/ml. Massa Calcd. paraC196H3O9N4IO1OiS8 = 5108,8; encontrado em ESI-Q-TOF = 1740,6 [M+5Na]3+,1311,2 [M-lH+6Na]4+, 1053,5 [M-2H+7Na]5+ Esquema 6. Síntese do Composto 39<formula>formula see original document page 58</formula>
Conclusão: Como representado na Fig. 9, o potencial deligação competitiva em ATIII do conjugado 39 é conservado, quandocomparado com o resíduo espaçador de pentassacarídeo precursor (vide Fig.5, composto 9). Estes dados sugerem que uma extensão significativa da meia-vida in-vivo do peptídeo pode ser conseguida por conjugação com umpentassacarídeo carreador de ligação ATIII (vide estudo farmacocinéticoabaixo). Além disso, a ligação do conjugado em ATIII é específica, uma vezque o peptídeo precursor conjugado ADM(27-52) não apresenta ligaçãocompetitiva significativa em ATUI.
EXEMPLO 25
Composto 41
O composto 40 (15 mg, 4,2 μηιοί), preparado por NeoMPS(Strasbourg, França), foi dissolvido em tampão Na2HPO4ZNaH2PO4 (8 ml, pH7,0) 0,1 M desgaseificado. Pentassacarídeo 5 (22,7 mg, 10,4 μπιοί, 2,5 equiv.)foi adicionado sob uma atmosfera de nitrogênio e a mistura foi agitada poraproximadamente 10 min. Em seguida, uma solução aquosa de NH2OH (50 %p, 0,14 ml) foi adicionada e a mistura de reação foi agitada por 16 h. Oproduto foi purificado como descrito para o Composto 39, para produzir ocomposto 41 (1,38 mg, 6%). A produção foi determinada por medição A2so,utilizando-se uma absorvência teórica de 1,22 para uma solução de 1 mg/ml.
Massa calcd. para C2I8H342N44Ok^Ss = 5528; encontrado em ESI Q-TOF =1843,7 [M+3H]3+, 1383,0 [M+4H]4+, 1107M+5H]5+.
Conclusão: O potencial de ligação competitiva em ATIII doconjugado 41 é conservado quando comparado com o composto do resíduoespaçador de pentassacarídeo precursor 9 (vide Fig. 10). Estes dados sugeremque uma extensão significativa de meia-vida in vivo do peptídeo pode serobtida por conjugação com um pentassacarídeo carreador de ligação ATIII(vide estudo farmacocinético abaixo).
Esquema 7. Síntese do Composto 41<formula>formula see original document page 60</formula>
Composto 44
Octreotide (Composto 42, 50 mg, 0,04 mmol), que pode serobtido em fornecedores comerciais, tais como Bachem (Weil am Rhein,Alemanha), foi dissolvido em DMSO (5 ml). AcOH (7 μΐ) foi adicionado paragerar uma solução ligeiramente ácida. Subseqüentemente, GMBS (11,2 mg,0,04 mmol, 1,0 equiv.) foi adicionado e a solução resultante foi agitada sobnitrogênio por 1 h. Análise LC-MS mostrou uma conversão próxima decompleta para octreotide GMB 43, em que o componente GMB é introduzidono resíduo Phe N-terminal em uma maneira altamente regiosseletiva. Areação foi esfriada a ~ 5 0C, após o que uma solução de NaH2PO4/ Na2HPO4(20 ml, pH 7,0) foi adicionado. Após 10 min, uma mistura foi permitidaalcançar a RT e N2 foi conduzido através da solução por 10 min. Em seguidapentassacarídeo 5 (21,8 mg, 0,01 mmol, 0,25 equiv.) foi adicionado como umsólido sob uma atmosfera de nitrogênio, seguido por uma solução aquosa deNH2OH (0,11 ml, 50 % p) e a mistura de reação foi agitada por 16h. Oproduto foi purificado cromatografia de troca iônica, as descrito acima, paraproduzir o composto 44 (6,3 mg, 19%). Mass calcd. para Ci 12H170N12O70S10 =3122,7; encontrado em ESI-Q-TOF = 1562,3 [M+2H]2+, 1041,9 [M+3H]3+.1H-NMR (D2O, 400 MHz, HH-COSY): δ 7,52-7,29 (m, 10H), 7,26-7,14 (m,4H), 7,03 (s, 1H), 5,44 (m, 1H), 5,37 (m, 1H), 5,14 (m, 1H), 5,12-4,89 (m,2H), 4,77-4,60 (m, 3H), 4,45-3,97 (m, 18H), 3,95-3,76 (m, 13H) 3,75-3,35(m, 57H), 3,33-2,59 (m, 18H), 2,22-1,16 (m, 2H), 1,85- 1,76 (m, 3H), 1,71-1,38 (m, 3H), 1,32-1,15 (m, 7H), 0,81-0,61 (Μ, 2H).
Esquema 8. Síntese do Composto 44
<formula>formula see original document page 61</formula>
Conclusão: O potencial de ligação competitiva para ATIII doconjugado 44 é conservado quando comparado com o composto de resíduoespaçador de pentassacarídeo precursor 9 (vide Fig. 11). Estes dados sãoindicativos de uma extensão significativa de meia-vida in vivo do peptídeo,pela conjugação com um pentassacarídeo carreador de ligação ATUI.
EXEMPLO 27
Composto 46
O pentassacarídeo 9 (100 mg) e GMBS (22 mg, 1,5 equiv.)foram dissolvidos em DMF (10 ml). DiPEA (18 μΐ, 2 equiv.) foi adicionado ea mistura de reação foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. Osolvente foi evaporado in vácuo e o resíduo foi purificado em uma colunapreparativa G25. As frações combinadas foram liofilizadas para fornecer 46(50 mg, 46%) como um pó branco. ESI-MS calcd. para C53H77N2O55S7Na9 =2052; encontrado em ESI-Q-TOF = 1027 M2+.
EXEMPLO 28
Composto 47
O derivado de maleimida pentassacarídeo 46 foi conjugadocom Cys125 livre de IL-2-RecH nativo (R&D systems, 202-IL/CF). Antes daconjugação, IL-2-recH foi analisado por HPSEC, SDS-PAGE e MALDI-TOFMS, indicando uma composição monomérica predominante. IL2-RecH (1 mg,800 μΐ, 1,26 mg/ml em PBS contendo 0,5% SDS) foi tratado durante a noiteem RT em um conjunto de rolos com um excesso do composto 46 (59 μΐ deuma solução aquosa de 10 mg/ml, 5 equiv.), para obter-se completa conversãodo material de partida. Em seguida, maleimida não-reagida 46 foi bloqueadacom um excesso molar de 5 vezes de cisteamina (16 μΐ, 10 mg/ml) por 3h. Amistura de reação foi dialisada (corte de 6-8 kDa) em contato com 0,5% SDSem PBS para remover cisteamina em excesso e 46 e a quantidade final doproduto, como determinado por A2so foi de 0,69 mg.
O conjugado final 47 foi caracterizado por SDS-PAGE (4-12%) e Western blot (vide Fig. 12). Pelas alamedas 3 e 4 conclui-se que ocomposto 47 tem um Mw mais elevado em relação a IL2-recH(correspondendo à presença de um componente pentassacarídeo). AnáliseWestern blot com subseqüentes incubações de a) 10 μ§/πι1 de hATIII (HAT950A2L - Kordia); b) a-hATIII (MoAb HATIII 200 - Kordia); c) GAM-HRP(W402B 20373201- Promega) e detecção com reagente DAB revelouclaramente a ligação ATIII específica a IL2 contendo pentassacarídeo(alameda 7 vs 8).
Esquema 9.
Síntese do conjugado 47
<formula>formula see original document page 63</formula>
Farmacolosia
Determinação da farmacocinética dos (poli)peptídeos conjusados
As propriedades farmacocinéticas dos exemplosrepresentativos dos compostos da presente invenção foram determinadascomo descrito nos seguintes parágrafos.
ELISA da Insulina Humana, para determinação da Insulinaem plasma de ratos
O Ensaio Imuno-Sorvente Ligado por Enzima humana(ELISA) foi desenvolvido para medir a insulina humana em plasma dehumano e de rato ou no sistema tampão. Desta maneira, o ELISA pôde serusado para determinar a concentração de insulina em amostras de plasmaderivadas de experimentos farmacocinéticos.
O ensaio é baseado no princípio de "sanduíche"imunoquímico, empregando-se dois anticorpos monoclonais, isto é, umanticorpo de captura, ligado em fase sólida e um anticorpo de detecção, que érotulado com peroxidase de rábano silvestre (HRP).
Para a determinação das propriedades farmacocinéticas doconjugado de insulina-pentassacarídeo 6 e insulina humana recombinante(insulina recH, batelada SIHRO17, da Diosynth, Países Baixos), as amostrasde plasma de rato foram incubadas por 1 h em temperatura ambiente,enquanto agitando-se a 10 Hz. Durante esta incubação, o conjugado deinsulina-pentassacarídeo 6 ou insulina recH liga-se ao anticorpo anti-insulinaimobilizado. Após um secundo procedimento de lavagem, o anti-insulinaanticorpo de detecção, conjugada com HRP, foi adicionada para ligar-se aocomplexo de insulina imobilizado. A placa foi lavada para remover anticorporotulado-enzima não-ligada e, subseqüentemente, a solução de substrato de3,3',5,5'-tetrametilbenzidina / H2O2 foi adicionada. A reação foi parada comácido sulfurico 0,5 M e a placa de microtítulo foi lidaespectrofotometricamente a 450 nm. A intensidade da cor é diretamenteproporcional à concentração da insulina. Em seguida, para cada amostra deplasma a concentração média (mol/1) de insulina foi determinada.
Determinação das propriedades farmacocinéticas docomposto 6
O comportamento farmacocinético do conjugado de insulina 6e insulina recH foi estudado em ratos Wistar machos de 300 - 400 g. Os ratosforam anestesiados por inalação de uma mistura de C^/^O/isoflurano, após oque a veia jugular direita foi canulada. No dia seguinte os ratos foram tratadosi.v. com doses de 3,5 nmol/kg do composto 6 ou insulina recH, após o quesangue foi amostrado em diversos intervalos de tempo. O sangue foicentrifugado, após o que o plasma foi extraído por meio de sifao earmazenado a -20 0C até uso. A concentração dos compostos testados dasamostras de plasma foi determinada usando-se ELISA humano em relação auma curva de calibração, que foi feita da solução estoque do própriocomposto testado. A concentração das amostras foi expressa em nmol/1 e osparâmetros cinéticos foram calculados com o modelo não-compartimental deWinNonlin.
Conclusão: Como pode ser visto na Fig. 13 e Tabela 3, aspropriedades farmacocinéticas do conjugado de insulina-pentassacarídeo 6foram fortemente melhoradas, em comparação com aquelas da insulina recHprecursora.
Tabela 3. Parâmetros farmacocinéticos após administraçãoi.v. do composto 6 ou insulina recH (3,5 nmol/kg) em rato. Experimentorealizado em η = 3/tratamento.
<table>table see original document page 65</column></row><table>Determinação das farmacocinéticas após rotulação com 125I
Conjugados de pentassacarídeo 24, 28, 29, 31, 32, 39 e 41foram rotulados com I, empregando-se o método de lactoperoxidase, deacordo com Machalonis et al. (Biochem J. 1969, 113: 299-305). Apósrotulação, o conjugado foi purificado por filtragem gel em Sephadex G25 etrocador de ânions HiTrap Q10. Experimentos cinéticos foram repetidos comodescrito para o composto 6, porém utilizando-se conjugados rotulados- I. Afim de evitar acúmulo de I" na tiróide, os ratos foram oralmente tratadoscom 10 mg/kg de iodeto de potássio antes da administração do composto.
A correta determinação do destino dos conjugados I-rotulados poderia ser afetadas adversamente pela desalogenação endógenaintracelular metabólica, para fornecer I" livre em circulação. Uma vez que opróprio I" livre apresentou uma meia-vida de eliminação de 3,2 h em ratos(controle, dados não mostrados), a meia-vida total medida dos compostosrotulados I, com uma meia-vida relativamente curta, poderia ser prolongadae a meia-vida experimentalmente determinada dos compostos com uma meia-vida relativamente longa poderia ser mais curta. Na realidade, as meias-vidasde eliminação observadas dos conjugados 31, 32 e 39 demonstram em umamaneira qualitativa que a conjugação dos peptídeos com um pentassacarídeocarreador resulta em tempos de permanência prolongados.
A adaptação do método acima descrito, medindo-se aradioatividade da pelota (0,1 ml), após precipitação com um volume 40 vezesmais elevado de TCA (10% concentração final), produziu parâmetrosfarmacocinéticos dos compostos 24, 28, 29 e 41 que foram corrigidos paradesalogenação- I endógena competitiva.
Farmacocinética dos conjugados de insulina-pentassacarídeo24, 28 e 29, comparada com insulina recH
Tabela 4. Parâmetros farmacocinéticos após administraçãoi.v. de conjugados de insulina 24, 28 e 29. Experimento realizado emn=3/tratamento. Para comparação, a insulina recH foi testada em n=l(doses expressas em cpm foram normalizadas).
<table>table see original document page 67</column></row><table>
Conclusão: As propriedades farmacocinéticas do conjugado deinsulina-pentassacarídeo 24, como determinadas pelo método de rotulação-125 I (Fig. 14, Tabela 4) estavam de acordo com aquelas obtidas com umconjugado de insulina-pentassacarídeo similar (composto 6), determinadaspelo método ELISA (Fig. 3, Tabela 3). As diferenças dos parâmetros cinéticospara insulina recH, como determinadas por dois métodos analíticos, podemser explicadas pelas diferenças na extrapolação de curva (para calcular Vss eCl), devido ao rápido desaparecimento do rótulo da circulação, durante osprimeiros 15 min. Além disso, as diferenças observadas em AUC, CI e Vssdos conjugado de insulina-pentassacarídeo 24, 28, 29 (Fig. 14, Tabela 4)claramente demonstram que as propriedades farmacocinéticas dos conjugadospodem ser sintonizadas utilizando-se pentassacarídeos carreadoresalternativos, com diferente afinidade de ligação para ATIII (o que está deacordo com os achados do estudo ΒΙΑ, vide Fig. 6 e Tabela 2).
Farmacocinética dos conjugados de pentassacarídeo 31 e 32Tabela 5. Parâmetros farmacocinéticos após administraçãoi.v. dos dois conjugados 31 e 32. Experimento realizado em n=3/tratamento(dados não corrigidos para desalogenação).<table>table see original document page 68</column></row><table>
Conclusão: A meia-vida do ganirelix livre (TI/2 1,4 h em rato,i.v., Chan et al., Drug. Metab. Dispôs 1991, 19, 858) é significativamenteprolongada quando conjugado com um pentassacarídeo carreador (Fig. 15,Tabela 5). A comparação da farmacocinética do composto 32 com aquela do32 mostra que ume melhoria na eliminação de Vss, Cl e T1/2 é obtidautilizando-se um pentassacarídeo com uma afinidade mais elevada paraATUI. Estes dados, em combinação com os achados do estudo BIA (vide Fig.8), indicam que as propriedades farmacocinéticas dos conjugados podem sersintonizadas utilizando-se pentassacarídeos carreadores alternativos, comdiferente afinidade de ligação para ATUI.
Farmacocinética do conjugado de pentassacarídeo 39 e ADM(27-52)
Tabela 6. Parâmetros farmacocinéticos após administraçãoi.v. de ADM(27-52) e composto 39. Experimento realizado em η =3/tratamento (dados não corrigidos para desalogenação).<table>table see original document page 69</column></row><table>
Conclusão: As propriedades farmacocinéticas de ADM(27-52)foram aperfeiçoadas por conjugação com um pentassacarídeo carreador deligação ATIII (composto 39, Fig. 16, Tabela 6). O Tl/2 de ADM(27-52) porsi pode ter sido superestimado, uma vez que os dados não foram corrigidospara desalogenação. Além disso, a meia-vida da adrenomedulina livre ésomente de 22 min em humano (Meeran et ai. J. Clin. Endocrin. Met. 1997,82, 95-100). Estas e outras observações do estudo BIA (Fig. 9) sustentam aconclusão de que uma melhoria das propriedades farmacocinéticas de um(poli)peptídeo pode ser conseguida por conversão em um conjugado(carreador) com afinidade de ligação específica para ATIII circulante.
Farmacocinética do conjugado de particularmente 41,comparada com [D-Ala0J-GLP-I (7-36)
Tabela 7. Parâmetros farmacocinético após administração i.v.de GLP-I e composto 41
Experimento realizado em n=3/tratamento (dados expressosem cpm foram normalizados)<table>table see original document page 70</column></row><table>
Conclusão: As propriedades farmacocinéticas de [D-Ala8]-GLP 1(7-36) foram melhoradas pela conjugação com um pentassacarídeocarreador de ligação ATIII (composto 41, Fig. 17, Tabela 7). A Cl docomposto 41 foi diminuída -100 vezes e Vss 13 vezes, resultando em umaumento de -100 vezes de AUC (exposição), em comparação com o peptídeonão-conjugado. Combinado com os dados BIA (Fig. 10), estas observaçõessustentam a conclusão de que uma melhoria das propriedadesfarmacocinéticas de um (poli)peptídeo pode ser conseguida por conversão emum conjugado de ligação ATUI.
Determinação de um complexo de (poli)peptídeo-pentassacarídeo-ATIII em plasma de rato
Para assegurar que os conjugados de pentassacarídeo de(poli)peptídeo liguem-se à Antitrombina III in vivo, um ELISA tiposanduíche, empregando-se um Mab anti-insulina como captura e anticorposanti-ATIII conjugados HRP como detector, foi realizado em amostras deplasma do experimento farmacocinético do composto 6. Obviamente, somentecomplexo intacto de pentassacarídeo-insulina-ATIII pode ser detectado nestetipo de ensaio, em que a insulina recH foi usada como um controle negativo.
Pela amostra de plasma obtida 1 min após administração i.v.de 3,5 nmol/kg composto 6 ou insulina recH em rato, a ligação do conjugadode insulina-pentassacarídeo 6 e insulina recH em rato ATIII foi determinada.Os resultados são mostrados na Fig. 18.
Conclusão: O conjugado de insulina-pentassacarídeo 6 éligado a ATUI, ao contrário de insulina recH, que não pode formar umcomplexo com ATIII. Embora o anticorpo ATIII anti-coelho fosse menossensível, ambos os anticorpos ATIII foram capazes de detectar o complexo deconjugado de insulina-pentassacarídeo 6-ATIII. Estes resultados demonstramque o composto 6 é ligado a ATIII em circulação e que a meia-vidaprolongada dos pentassacarídeos ligando-se-ATIII é o resultado destacomplexação. Portanto, pode ser concluído que a melhoria das propriedadesfarmacocinéticas dos conjugados de (poli)peptídeo-pentassacarídeo (taiscomo o composto 6), em comparação com aquelas do (poli)peptídeo não-conjugado original, pode ser atribuída à ligação específica do conjugado aATIII.
Supressão de glicose em teste in vivo em ratos
As atividades biológicas da insulina e dos conjugados deinsulina foram testadas em um modelo de rato, medindo-se os níveis dedepressão da glicose. Os animais foram jejuados durante a noite (16 horas)antes do experimento. De manhã, o sangue foi amostrado de todos os ratos,cortando-se um pequeno pedaço da cauda, após o que o sangue foi gotejadoem uma tira de teste e os níveis de glicose foram medidos com um monitor deglicose sangüínea ACCU-Check Sensor (Roche Diagnostics). O conjugado deinsulina-pentassacarídeo 6 e insulina foram administrados i.v. na veia dacauda, após pré-aquecimento dos ratos em uma caixa de aquecimento a 39 0Cdurante 10 min. As doses aplicadas foram 7 nmol/kg para conjugado deinsulina-pentassacarídeo 6 e 3,5 nmol/kg para insulina recH. Em váriosintervalos do tempo, as amostras de sangue foram retiradas removendo-se osangue incrustado, após o que o teor de glicose foi determinadoimediatamente como descrito.Farmacodinâmica do conjugado de insulina-pentassacarídeo 6
As propriedades farmacocinéticas aperfeiçoadas do conjugadode insulina-pentassacarídeo 6, comparadas com aquelas da insulina recH, sãoconfirmadas pelos prolongados níveis de supressão de glicose, apósadministração i.v (vide Fig. 19).
Nos experimentos realizados com os compostos 24, 25, 26, 27e detemir insulina (controle), os ratos estavam esfomeados exatamente antesda administração do composto (para garantir os níveis de glicose consistentesdo grupo de controle).
A comparação do conjugado de insulina-B29 24 com oconjugado de insulina-B29 26 (Fig. 20) e conjugado de insulina-Bl 25 comconjugado de insulina-Bl 27 (Fig. 21) revela que atividades de supressão deglicose prolongadas similares são obtidas independentemente docomprimento do espaçador.
Surpreendentemente, foi constatado que o início da ação detodos os conjugados de insulina testados era mais lento do que o da insulinarecH ou determir insulina (administração i.v.) e que a exposição eraaumentada pela mais longa duração da ação.
A comparação direta de conjugados de insulina-B29 24, 28 e29, dentro de um experimento na dose de 24 nmol/kg, substancia a diferençade duração da ação de suas atividades de diminuição da glicose sangüínea(vide Fig. 22). Assim, a supressão dos níveis de glicose com o composto 24durou além de 7 h, enquanto os conjugados 28 e 29 não eram mais ativos doque 5,5 h após administração i.v. As diferenças farmacodinâmicascorrespondem às diferenças farmacocinéticas, mencionadas anteriormente, dadistribuição do volume e depuração do composto 24, em comparação com ocomposto 28 e 29, respectivamente. Finalmente, determir insulina foi testadacomo um Exemplo Comparativo mostrando atividade menos pronunciada emenos prolongada, em doses de 24 e 48 nmol/kg (Fig. 21, 22).

Claims (32)

1. Conjugado de um polipeptídeo e um oligossacarídeo,caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ser conjugado com pelo menos umresíduo espaçador-oligossacarídeo, o oligossacarídeo ser um oligossacarídeosulfatado sintético, compreendendo 4-18 unidades monossacarídeas e por sitendo atividade para antitrombina III e o espaçador sendo uma ligação ou umresíduo de ligação flexível essencial e farmacologicamente inativo, ou um seusal farmaceuticamente aceitável.
2. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de o oligossacarídeo consistir de 4 - 6 unidades monossacarídeas.
3. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de o oligossacarídeo ser um pentassacarídeo.
4. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 3, caracterizado pelo fato de ter um nível de plasma circulante de < 50nM.
5. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 4, caracterizado pelo fato de o oligossacarídeo por si ter uma atividadeanticoagulante, que é de nível subterapêutico, quando comparada com aatividade farmacológica do polipeptídeo por si.
6. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 5, caracterizado pelo fato de o resíduo espaçador-oligossacarídeo ter aestrutura (I) <formula>formula see original document page 73</formula> em que um resíduo de ligação flexível essencial efarmacologicamente inativo está presente e em queR é independentemente OSO3", (l-8C)alcóxi ou um resíduo deligação flexível essencial e farmacologicamente inativo, eRa é independentemente OSO3", (l-8C)alcóxi, um resíduo deligação flexível essencial e farmacologicamente inativo ou um resíduo deoligossacarídeo, compreendendo 1-13 unidades monossacarídeas eRb é independentemente (l-8C)alcóxi, um resíduo de ligaçãoflexível essencial e farmacologicamente inativo ou um resíduo deoligossacarídeo compreendendo 1-13 unidades monossacarídeas,a carga sendo compensada por contra-íons positivamentecarregados.
7. Conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de o resíduo oligonucleotídeo-espaçador ser umresíduo de espaçador-pentassacarídeo, tendo a estrutura (II)<formula>formula see original document page 74</formula>em que um resíduo de ligação flexível inativo essencialmentefarmacologicamente inativo está presente e em queR é independentemente OSO3" ou (l-8C)alcóxi, ou um resíduode ligação flexível essencial e farmacologicamente inativo, a carga sendocompensada por contra-íons positivamente carregados.
8. Conjugado de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de o resíduo pentassacarídeo ter a estrutura (III)<formula>formula see original document page 74</formula>em que R é independentemente OSO3" ou (l-8C)alcóxi, a cargasendo compensada por contra-íons positivamente carregados.
9. Conjugado de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de o resíduo pentassacarídeo ter a estrutura (IV)<formula>formula see original document page 75</formula>em que R é independentemente OCH3 ou OSO3".
10. Conjugado de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de ambos os grupos R de (IV) serem OSO3".
11. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ter um pesomolecular de ~0,3 - 50 kDa.
12. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ter um pesomolecular de -0,3 - 20 kDa.
13. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ter um pesomolecular de ~0,3 - 7,5 kDa.
14. Conjugado de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ser selecionado de insulina,calcitonina, ganirelix, GLP-I, [D-Ala J-GLP-I(7-36), adrenomedulina,ADM(27-52), kisspeptina-10, octreotide ou interleucina-2.
15. Conjugado de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de o polipeptídeo ser selecionado de insulina,ADM(27-52) e [D-Ala8]-GLP-1(7-36).
16. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de o polipeptídeo sermonossubstituído com um resíduo de pentassacarídeo-espaçador.
17. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de o espaçador ser um resíduode ligação flexível essencial e farmacologicamente inativo.
18. Conjugado de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de o espaçador ter um comprimento de 10-50átomos.
19. Conjugado de acordo com a reivindicação 17 ou 18,caracterizado pelo fato de o espaçador compreender pelo menos um elemento-(CH2CH2O)-.
20. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ser selecionado das estruturas<formula>formula see original document page 76</formula>=em que Rl =R2 =H,R3 = ou em que R1=R3=H, R2=<formula>formula see original document page 76</formula>e em que Y é selecionado das estruturas A, B, C e D.
21. Conjugado de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de Y ser selecionado das estruturas AeB.
22. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ter a estrutura<formula>formula see original document page 78</formula>
23. Conjugado de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de ter a estrutura <formula>formula see original document page 78</formula>
24. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23 e auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.
25. Conjugado de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.
26. Uso do conjugado como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 23, dito uso caracterizado pelo fato de ser para amanufatura de um medicamento para tratar um paciente em necessidade detratamento com um certo polipeptídeo terapêutico, em que o medicamentocompreende o conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 23, que tem melhoradas propriedades farmacocinéticas em relação a ditopolipeptídeo.
27. Processo para a preparação de um conjugado de umpolipeptídeo e um oligossacarídeo, em que o polipeptídeo é conjugado compelo menos um resíduo de oligonucleotídeo-espaçador, o oligossacarídeosendo um oligossacarídeo sulfatado sintético, compreendendo 4-18 unidadesmonossacarídeas por si, tendo afinidade para antitrombina III e o espaçadorsendo uma ligação ou um resíduo de ligação flexível essencial efarmacologicamente inativo, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, ditoprocesso caracterizado pelo fato de compreender(a) uma etapa opcional em que o polipeptídeo é adaptado paraconjugação e(b) uma etapa de copulação, em que o polipeptídeoopcionalmente adaptado é reagido com uma molécula de oligossacarídeo-espaçador.
28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de o oligossacarídeo consistir de 4 - 6 unidades monossacarídeas.
29. Processo de acordo com a reivindicação 27 ou 28,caracterizado pelo fato de o oligossacarídeo ser um pentassacarídeo.
30. Processo para a preparação de um conjugadoterapeuticamente ativo compreendendo um polipeptídeo, o conjugado tendoatividade anticoagulante desprezível, em que o conjugado tem uma meia-vidade plasma mais longa do que o polipeptídeo original, enquanto a atividadebiológica é essencialmente retida, dito processo caracterizado pelo fato decompreender a etapa em que um oligossacarídeo, sendo um oligossacarídeosulfatado sintético, compreendendo 4-18 unidades monossacarídeas, que porsi tem afinidade para antitrombina III (ATUI), é covalentemente ligado a umpolipeptídeo através de uma ligação ou um resíduo de ligação flexívelessencial e farmacologicamente inativo.
31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de o oligossacarídeo consistir de 4 - 6 unidades monossacarídeas.32. Processo de acordo com a reivindicação 30 ou 31,
caracterizado pelo fato de o oligossacarídeo ser um pentassacarídeo.
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