BRPI0607762A2 - anÁlogo de glp-1, mÉtodo para aumentar o tempo de aÇço em um paciente de um anÁlogo de glp-1, composiÇço farmacÊutica, e, uso de um composto - Google Patents

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Abstract

ANALOGO DE GLP-1, MÉTODO PARA AUMENTAR O TEMPO DE AÇçO EM UM PACIENTE DE UM ANALOGO DE GLP-1, COMPOSIÇçO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO. Compostos GLP-1 protraídos e usos terapêutieos destes.

Description

"ANÁLOGO DE GLP-1, MÉTODO PARA AUMENTAR O TEMPO DEAÇÃO EM UM PACIENTE DE UM ANÁLOGO DE GLP-1,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO" CAMPO DA INVENÇÃO Esta invenção se refere ao campo de peptídeos terapêuticos,isto é a novos compostos GLP-1 protraídos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Uma variedade de diferentes abordagens foi usada paramodificar a estrutura de compostos de peptídeo tipo glucagon 1 (GLP-1) a fimde fornecer uma duração mais longa de ação in vivo. WO 96/29342 descrevederivados de hormônio de peptídeo caracterizados pelo fato de que ohormônio de peptídeo parental foi modificado pela introdução de umsubstituinte lipofílico no resíduo de aminoácido C terminal ou no resíduo deaminoácido N terminal.
WO 98/08871 descreve derivados de GLP-1 caracterizadospelo fato de que pelo menos um resíduo de aminoácido do peptídeo parentaltem um substituinte lipofílico acoplado.
WO 99/43708 descreve derivados de GLP-1 (7-35) e GLP-1 (7-36) que têm um substituinte lipofílico acoplado ao resíduo de aminoácido Cterminal.
WO 00/34331 descreve análogos de GLP-1 acuados.
WO 00/69911 descreve peptídeos insulinotrópicos ativadospara serem injetados em pacientes onde eles são supostos para reagirem comcomponentes sangüíneos para formar conjugados e com isso supostamentefornecer duração mais longa de ação in vivo.
WO 02/46227 descreve análogos de GLP-1 e exendina-4fusionados a albumina no soro humano a fim de estender meia vida in vivo.
Muitos pacientes de diabete particularmente no segmento dediabete tipo 2 são sujeitos a assim chamada "fobia de agulha", isto é um medosubstancial de se injetarem. No segmento de diabete tipo 2 a maioria dospacientes são tratados com agentes hipoglicêmicos orais, e uma vez quecompostos GLP-1 são esperados serem o primeiro produto injetáveladministrado a estes pacientes, o medo de injeções pode se tornar um obstáculo sério para o uso difundido dos compostos GLP-1 muito promissoresclinicamente. Assim, existe uma necessidade de desenvolver novoscompostos GLP-1 que possam ser administrados menos do que uma vez pordia, por exemplo uma vez a cada dois ou três dias preferivelmente uma vezpor semana, embora retendo um perfil clínico aceitável.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção fornece um análogo de GLP-1 tendo umamodificação de pelo menos um resíduo de aminoácido proteogênico emposições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-37) (SEQ DD No 1), que éacilada com uma porção ao resíduo de lisina em posição 26, e onde ditaporção compreende pelo menos dois grupos ácidos, em que um grupo ácido éacoplado terminalmente.
A presente invenção também fornece composiçõesfarmacêuticas compreendendo um composto de acordo com a presenteinvenção e o uso de compostos de acordo com a presente invenção para preparar medicamentos para tratar doença.
A invenção fornece um método para aumentar o tempo deação em um paciente de um análogo de GLP-1, caracterizado por acilar ditoanálogo de GLP-1 com uma porção B-U' como descrito em qualquer dasreivindicações precedentes, no resíduo de lisina em posição 26 de dito análogo de GLP-1.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
No presente relatório, os termos seguintes têm o significadoindicado:
O termo "polipeptídeo" e "peptídeo" como usado neste lugarsignifica um composto constituído de pelo menos cinco aminoácidosconstituintes conectados por pontes peptídicas. Os aminoácidos constituintespodem ser do grupo dos aminoácidos codificados pelo código genético e elespodem ser aminoácidos naturais que não são codificados pelo código genético, assim como aminoácidos sintéticos. Aminoácidos naturais que nãosão codificados pelo código genético são por exemplo, Y-carboxiglutamato,ornitina, fosfoserina, D-alanina e D-glutamina. Aminoácidos sintéticoscompreendem aminoácidos fabricados por síntese química, isto é D-isômerosdos aminoácidos codificados pelo código genético tal como D-alanina e D- leucina, Aib (a-ácido aminoisobutírico), Abu (a-ácido aminobutírico), Tle(terc-butilglicina), (3-alanina, 3-aminometil ácido benzóico, ácido antranílico.Os 22 aminoácidos proteogênicos são:
Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína,Cistina, Glutamina, Ácido glutâmico, Glicina, Histidina, Hidroxiprolina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina,Treonina, Triptofano, Tirosina, Valina.
Assim um aminoácido não proteogênico é uma porção quepode ser incorporada a um peptídeo através de ligações peptídicas mas não éum aminoácido proteogênico. Exemplos são y-carboxiglutamato, ornitina,fosfoserina, os D-aminoácidos tal como D-alanina e D-glutamina.Aminoácidos não proteogênicos sintéticos compreendem aminoácidosfabricados por síntese química, isto é D-isômeros dos aminoácidoscodificados pelo código genético tal como D-alanina e D-leucina, Aib (a-ácido aminoisobutírico), Abu (a-ácido aminobutírico), Tle (terc-butilglicina), 3- aminometil ácido benzóico, ácido antranílico, desamino-Histidina, osanálogos beta de aminoácidos tal como (3-alanina etc. D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, (3-hidroxihistidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3 piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico,ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico,ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico,ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;
O termo "análogo" como usado neste lugar se referindo a umpolipeptídeo significa um peptídeo modificado em que um ou mais resíduosde aminoácidos do peptídeo foram substituídos por outros resíduos deaminoácidos e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácidos foramdeletados do peptídeo e/ou em que um ou mais resíduos de aminoácidosforam deletados do peptídeo e ou em que um ou mais resíduos deaminoácidos foram adicionados ao peptídeo. Tal adição ou deleção deresíduos de aminoácidos pode ocorrer no N terminal do peptídeo e/ou no Cterminal do peptídeo. Um sistema simples é freqüentemente usado paradescrever análogos: Por exemplo [ArglGLP-l(7-37) Lys indica um análogode GLP-1(7-37) em que a lisina naturalmente ocorrente em posição 34 foisubstituída com arginina e em que a lisina foi adicionada ao resíduo deaminoácido terminal, isto é ao Gly37. Todos os aminoácidos para os quais oisômero ótico não é determinado são para serem entendidos para significar oL-isômero. Em formas de realização da invenção um máximo de 17aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção ummáximo de 15 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização dainvenção um máximo de 10 aminoácidos foram modificados. Em formas derealização da invenção um máximo de 8 aminoácidos foram modificados. Emformas de realização da invenção um máximo de 7 aminoácidos forammodificados. Em formas de realização da invenção um máximo de 6aminoácidos foram modificados. Em formas de realização da invenção ummáximo de 5 aminoácidos foram modificados. Em formas de realização dainvenção um máximo de 4 aminoácidos foram modificados. Em formas derealização da invenção um máximo de 3 aminoácidos foram modificados. Emformas de realização da invenção um máximo de 2 aminoácidos forammodificados. Em formas de realização da invenção 1 aminoácido foimodificado.
O termo "derivado" como usado neste lugar em relação a umpeptídeo significa um peptídeo modificado quimicamente ou um análogodeste, em que pelo menos um substituinte não está presente no peptídeo nãomodificado ou um análogo deste, isto é um peptídeo que foi modificadocovalentemente. Modificações típicas são amidas, carboidratos, gruposalquila, grupos acila, ésteres e os semelhantes. Um exemplo de um derivadode GLP-1(7-37) é Ne26-((4S)-4-(hexadecanoilamino)- carboxi-butanoil)[Arg34, Lys26]GLP-l-(7-37).
O termo "peptídeo GLP-1" como usado neste lugar significaGLP-1(7-37) (SEQ ID No 1), um análogo de GLP-1(7-37), um derivado deGLP-1(7-37) ou um derivado de um análogo de GLP-1(7-37). Em uma formade realização o peptídeo GLP-1 é um agente insulinotrópicos.
O termo "agente insulinotrópico" como usado neste lugarsignifica um composto que é um agonista do receptor de GLP-1 humano, istoé um composto que estimula a formação de cAMP em um meio adequadocontendo o receptor de GLP-1 humano (um meio tal descrito abaixo). Apotência de um agente insulinotrópico é determinada calculando o valor de EC50 a partir da curva de dose-resposta como descrito abaixo.
Células de rim de filhote de hamster (BHK) expressando oreceptor de GLP-1 humano clonado (BHK- 467-12A) foram crescidas emmeios DMEM com a adição de 100 IU/mL de penicilina, 100 pg/mL deestreptomicina, 5% de soro fetal de bezerro e 0,5 mg/mL de Geneticina G-418 (Life Technologies). As células foram lavadas duas vezes em salinatamponada com fosfato e colhidas com Versene. Membranas de plasma forampreparadas a partir das células por homogeneização com um Ultraturrax emtampão 1 (20 mM de HEPES-Na, 10 mM de EDTA, pH 7,4). O homogenadofoi centrifugado a 48,000 x g por 15 min a 4°C. O pélete foi suspenso porhomogeneização em tampão 2 (20 mM de HEPES-Na, 0,1 mM de EDTA, pH7,4), então centrifugado a 48,000 x g por 15 min a 4°C. O procedimento delavagem foi repetido mais uma vez. O pélete final foi suspenso em tampão 2 eusado imediatamente para ensaios ou armazenado a -80°C.
O ensaio de receptor funcional foi realizado medindo AMPcíclico (cAMP) como uma resposta à estimulação pelo agente insulinotrópico.cAMP formado foi quantificado pelo Kit AlphaScreenTM cAMP (PerkinElmer Life Sciences). Incubações foram realizadas em placas de microtítulode 96 poços de metade da área em um volume total de 50 uL de tampão 3 (50mM de Tris-HCI, 5 mM de HEPES, 10 mM de MgC12, pH 7,4) e com asseguintes adições: 1 mM de ATP, 1 uM de GTP, 0,5 mM de 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX), 0,01 % de Tween-20, 0,1% de BSA, 6 ug depreparação de membrana, 15 |og/mL de microsferas de aceptor, 20fig/mL demicrosferas de doador pré-incubados com 6 nM de biotinil-cAMP.Compostos a serem testados para atividade de agonista foram dissolvidos ediluídos em tampão 3. GTP foi preparado recentemente para cadaexperimento. A placa foi incubada no escuro com agitação lenta por três horasem temperatura ambiente seguido por contagem no instrumento FusionTM(Perkin Elmer Life Sciences). Curvas de concentração-resposta foramplotados para os compostos individuais e valores de EC50 estimados usandoum modelo logístico de quatro parâmetros com Prism v. 4.0 (GraphPad,Carlsbad, CA).
O termo "protegido por DPP-IV" como usado neste lugar sereferindo a um polipeptídeo significa um polipeptídeo que foi modificadoquimicamente a fim de tornar dito composto resistente à peptidase dipeptidilaminopeptidase-4 (DPP-IV) de plasma. A enzima DPP-IV em plasma éconhecida por ser envolvida na degradação de diversos hormônios depeptídeo, por exemplo GLP-1, GLP-2, Exendina-4 etc. Assim, um esforçoconsiderável está sendo feito para desenvolver análogos e derivados dospolipeptídeos suscetíveis à hidrólise mediada por DPP-IV a fim de reduzir ataxa de degradação por DPP-IV. Em uma forma de realização um peptídeoprotegido por DPP-IV é mais resistente a DPP-IV do que GLP-l(7-37) ouExendina-4(l-39).
Resistência de um peptídeo a degradação por dipeptidilaminopeptidase IV é determinada pelo seguinte ensaio de degradação:
Alíquotas do peptídeo (5 nmol) são incubadas a 37 9C com 1uL de dipeptidil aminopeptidase IV purificada correspondendo a umaatividade enzimática de 5 mU por 10-180 minutos em 100 uL de 0,1 M detampão trietilamina-HCl, pH 7,4. Reações enzimáticas são finalizadas pelaadição de 5 uL de 10% de ácido trifluoracético, e os produtos de degradaçãode peptídeo são separados e quantificados usando análise HPLC. Um métodopara realizar esta análise é: As misturas são aplicadas em uma coluna VydacCl8 widepore (poros de 30 nm, partículas de 5 pm) de 250 x 4,6 mm e eluídas em uma vazão de 1 ml/min com gradientes em etapas lineares de acetonitrilaem 0,1% de ácido trifluoracético (0% de acetonitrila por 3 min, 0-24% deacetonitrila por 17 min, 24-48% de acetonitrila por 1 min) de acordo comSiegel et al., Regul. Pept. 1999;79:93-102 e Mentlein et al. Eur. J. Biochem.1993;214:829-35. Peptídeos e seus produtos de degradação podem ser monitorados por sua absorbância a 220 nm (ligações peptídicas) ou 280 nm(aminoácidos aromáticos), e são quantificados por integração de suas áreas depico em relação àquelas de padrões. A taxa de hidrólise de um peptídeo pordipeptidil aminopeptidase IV é estimada em tempos de incubação queresultam em menos do que 10% do peptídeo sendo hidrolisado.
O termo "alquil CiV como usado neste lugar significa umgrupo de hidrocarbono saturado, ramificado, linear ou cíclico tendo de 1 a 6átomos de carbono. Exemplos representativos incluem, mas não são limitadosa, metil, etil, n-propil, isopropil, butil, isobutil, sec-butil, terc-butil, n-pentil,isopentil, neopentil, terc-pentil, n-hexil, isohexil, ciclohexano e ossemelhantes. O termo "farmaceuticamente aceitável" como usado neste lugarsignifica adequado para aplicações farmacêuticas normais, isto é não gerandonenhum evento adverso em pacientes etc.
O termo "excipiente" como usado neste lugar significa oscompostos químicos que são normalmente adicionados a composiçõesfarmacêuticas, por exemplo tampões, agentes de tonicidade, conservantes e ossemelhantes.
O termo "quantidade eficaz" como usado neste lugar significauma dosagem que é suficiente para ser eficaz para o tratamento do pacientecomparado com nenhum tratamento.
O termo "composição farmacêutica" como usado neste lugarsignifica um produto compreendendo um composto ativo ou um sal destejunto com excipientes farmacêuticos tal como tampão, conservante, eopcionalmente um modificador de tonicidade e/ou um estabilizante. Assim acomposição farmacêutica também é conhecida na técnica como umaformulação farmacêutica.
O termo "tratamento de uma doença" como usado neste lugarsignifica a supervisão e cuidado de um paciente tendo desenvolvido a doença,condição ou distúrbio. O propósito de tratamento é combater a doença,condição ou distúrbio. Tratamento inclui a administração dos compostosativos para eliminar ou controlar a doença, condição ou distúrbio assim comopara aliviar os sintomas ou complicações associadas com a doença, condiçãoou distúrbio.
Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogode GLP-1 acilado que pode se ligar à albumina e ao receptor de GLP-1simultaneamente.
Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogode GLP-1 acilado que se liga ao receptor de GLP-1 com uma afinidade abaixode lOOnM, preferível abaixo de 30 nM na presença de 2% de albumina.Em outro aspecto a presente invenção se refere a um análogode GLP-1 acilado cuja afinidade para o receptor de GLP-1 é apenasparcialmente diminuída quando comparando a afinidade na presença deconcentração muito baixa (por exemplo 0,005% a 0,2%) de albumina humanacom a afinidade na presença de 2% de albumina humana. A mudança emafinidade de ligação sob estas condições é menos do que 50 vezes, preferívelabaixo de 30 vezes e mais preferível abaixo de 10 vezes.
O termo "porção de ligação de albumina" como usado nestelugar significa um resíduo que se liga não covalentemente a albumina no sorohumano. O resíduo de ligação de albumina acoplado ao polipeptídeoterapêutico tipicamente tem uma afinidade abaixo de 10 uM para albumina nosoro humano e preferivelmente abaixo de 1 uM. Uma variedade de resíduosde ligação de albumina são conhecidos entre porções lipofílicas lineares eramificadas contendo 4-40 átomos de carbono tendo um grupo ácido distai.
O termo "ligante hidrofílico" como usado neste lugar significaum espaçador que separa um peptídeo e um resíduo de ligação de albuminacom uma porção química que compreende pelo menos 5 átomos de nãohidrogênio onde 30-50% destes são ou N ou 0.
O termo "grupos ácidos" como usado neste lugar significagrupos químicos orgânicos que são completamente ou parcialmentecarregados negativamente em pH fisiológico. O valor de pKa de tais grupos éabaixo de 7, preferível abaixo de 5. Isto inclui mas não é limitado a ácidoscarboxílicos, ácidos sulfônicos, ácidos fosfóricos ou sistemas de anelheterocíclico que são completamente ou parcialmente carregadosnegativamente em pH fisiológico.
Na formula estrutural abaixo II a porção U é um di-radical quepode ser acoplado aos grupos B terminais e ao aminogrupo do aminoácidolisina no peptídeo de duas diferentes maneiras. Em formas de realização dainvenção o U em fórmula II é acoplado com o grupo B acoplado naextremidade da cadeia alquila e o peptídeo na outra extremidade.
Nas fórmulas abaixo as ligações terminais dos gruposacoplados são para serem consideradas como ligações de acoplamento e nãoterminando em grupos de metileno a menos que determinado.
Nas fórmulas abaixo
<formula>formula see original document page 11</formula>
significa o H2N-His-Aib- N terminal do análogo de GLP-1.
Em uma forma de realização a invenção fornece um análogode GLP-1 acilado com uma porção lipofílica de ligação de albumina contendopelo menos dois grupos químicos ácidos livres acoplados através de umligante de aminoácido não natural ao resíduo de lisina em posição 26.
Em uma forma de realização, o termo grupos químicos ácidoslivres é para ser entendido como tendo o mesmo significado que "gruposácidos" como usado neste lugar.
Em uma forma de realização a invenção fornece um análogode GLP-1 acilado onde dito análogo de GLP-1 é estabilizado contra DPP-IVpor modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido em posições 7 e 8em relação à seqüência GLP-1 (7-3 7) (SEQ ID No 1), e onde dita acilação éum diácido acoplado ao resíduo de lisina em posição 26 opcionalmenteatravés de um ligante hidrofílico de aminoácido não natural.
Em uma forma de realização da invenção um análogo de GLP-1 tendo uma modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido nãoproteogênico em posições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-3 7) (SEQID No 1), que é acilado com uma porção ao resíduo de lisina em posição 26, eonde dita porção compreende pelo menos dois grupos ácidos, em que umgrupo ácido é acoplado terminalmente.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que a porção acoplada naposição 26 compreende um ligante hidrofilico.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com as formas de realização acima, em que o ligante hidrofilicocompreende pelo menos 5 átomos de não hidrogênio onde 30-50% destes sãoou N ou O.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que a porçãoacoplada na posição 26 compreende uma porção de ligação de albuminaseparada do peptídeo pelo ligante hidrofilico.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que a porção de ligação dealbumina é uma porção lipofílica linear ou ramificada contendo 4-40 átomosde carbono tendo um grupo ácido distai.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que a porção aciladaé B-U', onde U' é selecionado a partir de<formula>formula see original document page 13</formula>
m é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,
n é 1, 2 ou 3
s é 0, 1, 2, ou 3,
t é O, 1,2, 3, ou 4
p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19,
20,21,22, ou 23;
e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de
<formula>formula see original document page 13</formula>
onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, que é um composto defórmula I (SEQ ID No. 2):
<formula>formula see original document page 13</formula>
Fórmula I
em que
Xaa7, é L-histidina, imidazopropionil, a-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2 amino-histidina, P-hidroxi-histidina,homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina
Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Thr, Ser, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido(1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;
Xaa16 é Vai ou Leu;
Xaa18 é Ser, Lys ou Arg;
Xaa19 é Tyr ou Gln;
Xaa20 é Leu ou Met;
Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;
Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;
Xaa25 é Ala ou Vai;
Xaa27 é Glu ou Leu;
Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;
Xaa33 é Vai ou Lys;
Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;
Xaa35 é Gly ou Aib;
Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou é ausente;
Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é ausente;
e B e U' juntos é a porção acilada, onde U' é selecionado apartir de
<formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula>
m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,
n é 1, 2 ou 3
s é O, 1, 2, ou 3,
t é O, 1,2, 3, ou4
p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19,20,21,22, ou 23;
e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de
<formula>formula see original document page 15</formula>
onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;
Em uma forma de realização a invenção fornece um compostoque é um composto de fórmula II (SEQ ID No. 3):<formula>formula see original document page 16</formula>
Fórmula II
A fórmula II é idêntica à fórmula I como determinado em umaforma de realização acima, onde a porção B-U é substituída por B-U'.diferença sendo apenas a incorporação do grupo carboxi no U' em relação aU, que está sem o grupo carboxi de acoplamento.
Em fórmula II cada um dos Xaa's tem o seguinte significado:Xaa7, é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina, homohistidina, Na-acetil-histidina, a-fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3 piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalanina;
Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido(1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;
Xaa16 é Vai ou Leu;
Xaa18 é Ser, Lys ou Arg;
Xaa19 é Tyr ou Gln;
Xaa20 é Leu ou Met;
Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;
Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;
Xaa25 é Ala ou Vai;
Xaa27 é Glu ou Leu;
Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;
Xaa33 é Vai ou Lys;Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;
Xaa35 é Gly ou Aib;
Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou é ausente;
Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é ausente;
Xaa38 é Lys, Ser, amida ou é ausente;
e onde U é um espaçador selecionado a partir de
<formula>formula see original document page 17</formula>
onde n é 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18
I é 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18,
m é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,
s é 0, 1, 2, ou 3,
p é 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21,22, ou 23;
e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de
<formula>formula see original document page 17</formula>
Nas formas de realização abaixo quando se referindo a U' emfórmula I é para ser entendido como também se referindo a fórmula II e U,com a única diferença sendo o grupo carboxi.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com as formas de realização acima, em que U é selecionado a partirde<formula>formula see original document page 18</formula>
m é 2, 3, 4 ou 5,n é 1 ou 2s é 0, 1, ou 2,t é 0, 1, 2, ou 3pé 1,2,3,4, 7, 11 ou23
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com as formas de realização acima, em que BU'- é
<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>
onde I é 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;
pé 1,2,3,4, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.
s é 0, 1 ou 2
t é 0 ou 1;
Uma forma de realização de acordo com a acima em que
onde Ié 14, 15, 16, 17 ou 18
p é 1, 2, 3, 4 ou 11;
s é 0, 1 ou 2;
t é 0 ou 1;
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que B-U' é
<formula>formula see original document page 19</formula><formula>formula see original document page 20</formula>
onde I é 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;
p é 1, 2, 3, ou 4.
s é 0, 1 ou 2
n é 0, 1 ou 2
Uma forma de realização de acordo com qualquer das formasde realização acima em que B é
<formula>formula see original document page 20</formula>
elé 14,16, 18 ou20;
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que B é<formula>formula see original document page 21</formula>
onde I é 14, 15, ou 16.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que s é 1.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que n é 1.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que I é 14, 15 ou16; Em formas de realização I é 17, 18, 19 ou 20. Em formas de realização I é15, 16 ou 17. Em formas de realização I é 18, 19 ou 20. Em formas derealização I é 14. Em formas de realização I é 16. Em formas de realização I é18. Em formas de realização I é 20.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que p é 1.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que p é 2.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que p é 3.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que p é 4.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U é
<formula>formula see original document page 21</formula><formula>formula see original document page 22</formula>
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U' é
<formula>formula see original document page 22</formula>
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que B-U' é
<formula>formula see original document page 22</formula>
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com fórmula I acima, em que
Xaa7, é His ou desamino-histidina;
Xaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys ou Aib;
Xaa16 é Vai;
Xaa18 é Ser;
Xaa19 é Tyr;
Xaa20 é Leu;
Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;
Xaa23 é Gln ou Glu;
Xaa25 é Ala; Xaa27 é Glu;
Xaa3o é Ala ou Glu;
Xaa33 é Vai;
Xaa34 é Lys ou Arg;Xaa35 é Gly ou Aib;
Xaa36 é Arg ou Lys
Xaa37 é Gly, amida ou é ausente;
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com fórmula I acima, em que
Xaa7, é His
Xaag é Gly, ou Aib;
Xaa16 é Vai;
Xaa18 é Ser;
Xaa19 é Tyr;
Xaa20 é Leu;
Xaa22 é Glu ou Aib;
Xaa23 é Gln;
Xaa25 é Ala; Xaa27 é Glu;
Xaa30 é Ala;
Xaa33 é Vai;
Xaa34 é Lys ou Arg;
Xaa35 é Gly ou Aib;
Xaa36 é Arg
Xaa37 é Gly
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-1 compreende uma modificação da L-histidina N terminalem posição 7 da seqüência de GLP-1 (7-37).
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1compreende imidazopropionil7, a-hidroxi-histidina7 ou N-metil-histidina7,Dhistidina7, desamino-histidina7, 2-amino-histidina7, (3-hidroxi-histidina7,homohistidina7, N-acetil-histidina7, a-fluorometil-histidina7, a-metil-histidina7, 3-piridilalanina7, 2- piridilalanina7 ou 4-piridilalanina7.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditoanálogo de GLP-1 compreende uma substituição da L-alanina em posição 8 da seqüência de GLP-1 (7-37) por outro resíduo de aminoácido.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1compreende Aib8, Gly8, Vai8, lie8, Leu8, Ser8, Thr8, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1- aminociclohexil) carboxílico,ácido (1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1- aminociclooctil)carboxílico.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende Aib8.
Em uma forma de realização da invenção dito análogo deGLP-1 é Aib8,Arg34-GLP-1 (7-37) ou Aib8'22,Arg34-G LP-1 (7-37).
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1 compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácidos queforam trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1 (7-3 7)(SEQIDNo. 1).
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que não mais do que dezresíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionados ou deletados secomparado com GLP-l(7-37) (SEQ ID No. 1).
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com a forma de realização acima, em que dito análogo de GLP-1compreende não mais do que seis resíduos de aminoácidos que foramtrocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-l(7-37) (SEQ ID No. 1).
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo deGLP-1 compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácidos que não sãocodificados pelo código genético.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, em que dito análogo deGLP-1 compreende apenas um resíduo de lisina.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer das formas de realização acima, que é
Aib8, Arg -GLP-1 (7-3 7)
Aib8'22, Arg34-GLP-l(7-37)
Arg34-GLP-l(7-37)
[3-(4-Imidazolil)Propionil7,Arg34]G LP-1 -(7-37)peptídeo
Gly8,Arg34-GLP-l (7-37)
Aib8,Arg34,Pro37-GLP-l (7-37)
Aib8)22;27,30,35Arg345 ^37_ (7_37)am[dã}todos os quais são substituídos por B-U' em posição 26.
Uma forma de realização fornece um análogo de GLP-1 deacordo com qualquer uma das formas de realização precedentes, que éselecionado a partir de
<formula>formula see original document page 25</formula>
N-s2-(17-carboxiheptadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-1 -(7-37)-peptídeo,
<formula>formula see original document page 25</formula>
N-s26-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-l -(7-37)-peptídeo,<formula>formula see original document page 26</formula>
N-s26- (4- {[N-(2-carboxietil)-N-( 15-carboxipentadecanoil) amino]metil}benzoil)[Arg34p LP-1 -(7-37),
<formula>formula see original document page 26</formula>
N-E2642-(242-(242-(244-( 17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil] [Aib ,Arg ]GLP-l-(7- 37)peptídeo,
<formula>formula see original document page 26</formula><formula>formula see original document page 27</formula>
Uma forma de realização fornece um método para aumentar oação em um paciente de um análogo de GLP-1, caracterizado poracilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U como descrito emqualquer das formas de realização precedentes, no resíduo de lisina emposição 26 de dito análogo de GLP-1.
Uma forma de realização fornece um método para aumentar otempo de ação em um paciente de um análogo de GLP-1 para mais do quecerca de 40 horas, caracterizado por modificar pelo menos um dos resíduos deaminoácidos em posições 7 e 8 de um peptídeo GLP-1 (7-37) ou um análogodeste, e acilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U'- como descritoem qualquer das formas de realização precedentes no resíduo de lisina emposição 26 de dito análogo de GLP-1.
Uma forma de realização fornece uma composiçãofarmacêutica compreendendo um composto de acordo com qualquer dasformas de realização acima, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Uma forma de realização fornece uma composiçãofarmacêutica de acordo com a forma de realização acima, que é adequadapara administração parenteral.
Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento.
Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabetetipo 2, tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão,síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, arteriosclerose, infarto domiocárdio, doença coronária cardíaca e outros distúrbios cardiovasculares,derrame, síndrome de intestino inflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.
Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento para atrasar ou prevenir progressão de doença em diabetetipo 2.
Uma forma de realização fornece o uso de um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima para a preparaçãode um medicamento para diminuir consumo de comida, diminuir apoptose decélula p, aumentar função de célula p e massa de célula p\ e/ou para restaurarsensibilidade para glicose para células f3.
Em uma forma de realização a invenção fornece um compostode acordo com as formas de realização acima, em que dito análogo de GLP-1é Aib8,Arg34-GLP-1(7-37) ou Aib8,22,Arg34-GLP-l(7-37) acoplado a um liganteB-U';
Em uma forma de realização de fórmula II, B-U representa
<formula>formula see original document page 29</formula>
onde Ié 14, 15 ou 16; 20
n é 15, 16, 17 ou 18;
p é 3, 7, 11 ou 24.
Em formas de realização a invenção fornece um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que ditodiácido compreende um ácido dicarboxílico.
Em formas de realização a invenção fornece um composto deacordo com qualquer uma das formas de realização acima, em que o grupo deacilação compreende um a,co-ácido dicarboxílico de alcano de cadeia linearou ramificado.Em formas de realização a invenção fornece composto deacordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilaçãocompreende a estrutura HOOC-(CH2),C0-, em que n é 12 a 20.
Em formas de realização a invenção fornece um composto deacordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilaçãocompreende uma estrutura selecionada a partir de HOOC-(CH2)14C0-,HOOC(CH2)1500-, HOOC-(CH2)1600-, HOOC-(CH2)1700-, e HOOC-(CH2)18CO-.
Em formas de realização a invenção fornece um composto deacordo com a forma de realização acima, em que o grupo de acilaçãocompreende a estrutura HOOC-(CH2)16C0-.
Outro objeto da presente invenção é fornecer uma formulaçãofarmacêutica compreendendo um composto de acordo com a presenteinvenção que está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 25 mg/ml, eem que dita formulação tem um pH de 3,0 a 9,0. A formulação podecompreender adicionalmente um sistema tampão, conservante(s), agente(s) detonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. Em uma formade realização da invenção a formulação farmacêutica é uma formulaçãoaquosa, isto é formulação compreendendo água. Tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em uma forma de realização adicional dainvenção a formulação farmacêutica é uma solução aquosa. O termo"formulação aquosa" é definido como uma formulação compreendendo pelomenos 50 %w/w de água. Da mesma maneira, o termo "solução aquosa" édefinido como uma solução compreendendo pelo menos 50 %w/w de água, eo termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendopelo menos 50 %w/w de água.
Em outra forma de realização a formulação farmacêutica éuma formulação liofilizada, a qual o médico ou o paciente adiciona solventese/ou diluentes antes de uso.Em outra forma de realização a formulação farmacêutica éuma formulação seca (por exemplo liofilizada ou pulverizada em atmosferaaquecida) pronta para uso sem qualquer dissolução anterior.
Em um aspecto adicional a invenção se refere a umaformulação farmacêutica compreendendo uma solução aquosa de umcomposto de acordo com a presente invenção, e um tampão, em que ditocomposto está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml ou acima, e emque dita formulação tem um pH de cerca de 3,0 a cerca de 9,0.
Em outra forma de realização da invenção o pH da formulaçãoé de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. Em outra forma de realização da invenção opH da formulação é de cerca de 3,0 a cerca de 7,0. Em outra forma derealização da invenção o pH da formulação é de cerca de 5,0 a cerca de 7,5.Em outra forma de realização da invenção o pH da formulação é de cerca de7,5 a cerca de 9,0. Em outra forma de realização da invenção o pH daformulação é de cerca de 7,5 a cerca de 8,5. Em outra forma de realização dainvenção o pH da formulação é de cerca de 6,0 a cerca de 7,5. Em outra formade realização da invenção o pH da formulação é de cerca de 6,0 a cerca de7,0. Em outra forma de realização a formulação farmacêutica é de 8,0 a 8,5.
Em uma forma de realização adicional da invenção o tampão éselecionado a partir do grupo consistindo de acetato de sódio, carbonato desódio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, fosfatodihidrogênio de sódio, fosfato dihidrogênio dissódico, fosfato de sódio, etris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido málico, succinato, ácidomaleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou misturas destes.Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um conservante farmaceuticamenteaceitável. Em uma forma de realização adicional da invenção o conservante éselecionado a partir do grupo consistindo de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol,butil p-hidroxibenzoato, 2-feniletanol, benzil álcool, clorobutanol, etiomerosal, bronopol, ácido benzóico, imiduréia, clorohexidina,dehidroacetato de sódio, clorocresol, etil p-hidroxibenzoato, cloreto debenzetônio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-l,2-diol) ou misturas destes.Em uma forma de realização o conservante é fenol ou m-cresol. Em umaforma de realização adicional da invenção o conservante está presente emuma concentração de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma forma de realizaçãoadicional da invenção o conservante está presente em uma concentração de0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção oconservante está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Emuma forma de realização adicional da invenção o conservante está presenteem uma concentração de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O usode um conservante em composições farmacêuticas é bem conhecido para apessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: TheScience andPractice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Em uma forma de realização adicional da invenção a formulação compreende adicionalmente um agente isotônico. Em uma formade realização adicional da invenção o agente isotônico é selecionado a partirdo grupo consistindo de um sal (por exemplo cloreto de sódio), um açúcar ouálcool de açúcar, um aminoácido (por exemplo L-glicina, L-histidina,arginina, Usina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol(por exemplo glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3- butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo PEG400), oumisturas destes. Em uma forma de realização o agente de isotonicidade épropilenoglicol. Qualquer açúcar tal como mono-, di-, ou polissacarídeos, ouglucanas solúveis em água, incluindo por exemplo frutose, glicose, manose,sorbose, xilose, maltose, lactose, sucrose, trealose, dextrana, pululana,dextrina, ciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietil ecarboximetilcelulose-Na pode ser usado. Em uma forma de realização oaditivo de açúcar é sucrose. Álcool de açúcar é definido como umhidrocarboneto de C4-C8 tendo pelo menos um grupo -OH e inclui, porexemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Emuma forma de realização o aditivo de álcool de açúcar é manitol. Os açúcaresou álcoois de açúcar mencionados acima podem ser usados individualmenteou em combinação. Não existe limite para a quantidade usada, contanto que oaçúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparação líquida e não afeteadversamente os efeitos estabilizantes atingidos usando os métodos dainvenção. Em uma forma de realização, a concentração de açúcar ou álcool deaçúcar é entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma forma derealização adicional da invenção o agente isotônico está presente em umaconcentração de 1 mg/ml a 50 mg/ml. Em uma forma de realização adicionalda invenção o agente isotônico está presente em uma concentração de 1mg/ml a 7 mg/ml. Em uma forma de realização da invenção o agenteisotônico está presente em uma concentração de 5 mg/ml a 7 mg/ml. Em umaforma de realização adicional da invenção o agente isotônico está presente emuma concentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma forma de realizaçãoadicional da invenção o agente isotônico está presente em uma concentraçãode 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específicosconstitui uma forma de realização alternativa da invenção. O uso de umagente isotônico em composições farmacêuticas é bem conhecido para apessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um agente quelante. Em uma formade realização adicional da invenção o agente quelante é selecionado a partirde sais de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido cítrico, e ácidoaspártico, e misturas destes. Em uma forma de realização adicional dainvenção o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1 mg/mla 5mg/ml. Em uma forma de realização adicional da invenção o agentequelante está presente em uma concentração de 0,lmg/ml a 2mg/ml. Em umaforma de realização adicional da invenção o agente quelante está presente emuma concentração de 2mg/ml a 5mg/ml. Cada um destes agentes quelantesespecíficos constitui uma forma de realização alternativa da invenção. O usode um agente quelante em composições farmacêuticas é bem conhecido para apessoa versada. Para conveniência é feita referência a Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um estabilizante. O uso de umestabilizante em composições farmacêuticas é bem conhecido para a pessoaversada. Para conveniência é feita referência a Remington: The Science andPractice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Mais particularmente, composições da invenção sãocomposições farmacêuticas líquidas estabilizadas cujos componentesterapeuticamente ativos incluem um polipeptídeo que possivelmente exibe formação agregada durante armazenamento em formulações farmacêuticaslíquidas. Por "formação agregada" é pretendida uma interação física entre asmoléculas de polipeptídeos que resulta em formação de oligômeros, quepodem permanecer solúveis, ou agregados visíveis grandes que precipitam dasolução. Por "durante armazenamento" é pretendida uma composição farmacêutica líquida ou formulação que uma vez preparada, não éimediatamente administrada ao sujeito. Preferivelmente, seguindo preparação,ela é embalada para armazenamento, ou em uma forma líquida, em um estadocongelado, ou em uma forma seca para reconstituição posterior em uma formalíquida ou outra forma adequada para administração a um sujeito. Por "formaseca" é pretendida a composição ou formulação farmacêutica líquida é secaou por liofilização (isto é, liofilização; veja, por exemplo, Williams and Polli(1984) J. Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), peletização em atmosferaaquecida (veja Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5th ed; LongmanScientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491676; Broadhead et al. (1992)Drug Devei. Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm.Res. 11:12-20), ou ar de secagem (Carpenter and Crowe (1988) Cryobiology25:459-470; e Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). Formação agregada por umpolipeptídeo durante armazenamento de uma composição farmacêuticalíquida pode afetar adversamente atividade biológica daquele polipeptídeo,resultando em perda de eficácia terapêutica da composição farmacêutica.Além disso, formação agregada pode causar outros problemas tal comobloqueio de sondas, membranas, ou bombas quando a composiçãofarmacêutica contendo polipeptídeo é administrada usando um sistema deinfusão.
As composições farmacêuticas da invenção podemcompreender adicionalmente uma quantidade de uma base de aminoácidosuficiente para diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durantearmazenamento da composição. Por "base de aminoácido" é pretendido umaminoácido ou uma combinação de aminoácidos, onde qualquer aminoácidodado está presente ou em sua forma de base livre ou em sua forma de sal.Onde uma combinação de aminoácidos é usada, todos os aminoácidos podemestar presentes em suas formas de base livre, todos podem estar presentes emsuas formas de sal, ou alguns podem estar presentes em suas formas de baselivre enquanto outros estão presentes em suas formas de sal. Em uma formade realização, aminoácidos para usar na preparação das composições dainvenção são aqueles portando uma cadeia lateral carregada, tal comoarginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero(isto é, L, D, ou uma mistura destes) de um aminoácido particular (porexemplo metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, ácidoaspártico, triptofano, treonina e misturas destes) ou combinações destesestereoisômeros, podem estar presentes nas composições farmacêuticas dainvenção contanto que o aminoácido particular esteja presente ou em suaforma de base livre ou sua forma de sal. Em uma forma de realização o L-estereoisômero é usado. Composições da invenção também podem serformuladas com análogos destes aminoácidos. Por "análogo de aminoácido" épretendido um derivado do aminoácido naturalmente ocorrente que causa oefeito desejado de diminuir formação agregada pelo polipeptídeo durantearmazenamento das composições farmacêuticas líquidas da invenção.Análogos de arginina adequados incluem, por exemplo, aminoguanidinas,ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos de metionina adequados incluemetionina e butionina e análogos de cisteínâ adequados incluem Smetil-Lcisteína. Como com os outros aminoácidos, os análogos de aminoácidos sãoincorporados nas composições ou em sua forma de base livre ou sua forma desal. Em uma forma de realização adicional da invenção os aminoácidos ouanálogos de aminoácidos são usados em uma concentração, que é suficientepara prevenir ou atrasar agregação da proteína.
Em uma forma de realização adicional da invenção metionina(ou outros aminoácidos sulfuricos ou análogos de aminoácidos) podem seradicionados para inibir oxidação de resíduos de metionina para sulfóxido demetionina quando o polipeptídeo atuando como o agente terapêutico é umpolipeptídeo compreendendo pelo menos um resíduo de metionina suscetívela tal oxidação. Por "inibir" é pretendida acumulação mínima de espécieoxidada de metionina com o tempo. Inibir oxidação de metionina resulta emmaior retenção do polipeptídeo em sua forma molecular própria. Qualquerestereoisômero de metionina (L ou D) ou combinações destes podem serusados. A quantidade a ser adicionada deve ser uma quantidade suficientepara inibir oxidação dos resíduos de metionina de forma que a quantidade desulfóxido de metionina seja aceitável para agências reguladoras. Tipicamente,isto significa que a composição contém não mais do que cerca de 10% a cercade 30% de sulfóxido de metionina. Geralmente, isto pode ser atingidoadicionando metionina de forma que a proporção de metionina adicionada aresíduos de metionina varie de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como 10:1acerca de 100:1.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um estabilizante selecionado a partirdo grupo de polímeros de alto peso molecular ou compostos de baixo pesomolecular. Em uma forma de realização adicional da invenção o estabilizanteé selecionado a partir de polietilenoglicol (por exemplo PEG 3350), polivinilálcool (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi-Zhidroxicelulose ou derivadosdestes (por exemplo HPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas,substâncias contendo enxofre como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e sais diferentes (por exemplo cloreto de sódio). Cada umdestes estabilizantes específicos constitui uma forma de realização alternativada invenção.
As composições farmacêuticas também podem compreenderagentes estabilizantes adicionais, que adicionalmente realçam estabilidade deum polipeptídeo terapeuticamente ativo nessas. Agentes estabilizantes deinteresse particular para a presente invenção incluem, mas não são limitadosa, metionina e EDTA, que protegem o polipeptídeo contra oxidação demetionina, e um tensoativo não iônico, que protege o polipeptídeo contraagregação associada com congelamento-descongelamento ou fragmentaçãomecânica.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente um tensoativo. Em outra forma derealização da invenção a composição farmacêutica compreende doistensoativos diferentes. O termo "Tensoativo" como usado neste lugar se referea quaisquer moléculas ou íons que são compreendidos de uma parte solúvelem água (hidrofilica), a cabeça, e um segmento solúvel em gordura(lipofílico). Tensoativos acumulam preferivelmente em interfaces, cuja partehidrofilica é orientada para a água (fase hidrofilica) e a parte lipofílica para afase oleosa ou hidrofóbica (isto é vidro, ar, óleo etc). A concentração na qualtensoativos começam a formar micelas é conhecida como a concentração demicela crítica ou CMC. Além disso, tensoativos diminuem a tensãosuperficial de um líquido. Tensoativos também são conhecidos comocompostos anfipáticos. O termo "Detergente" é um sinônimo usado paratensoativos em geral.
Tensoativos aniônicos podem ser selecionados a partir dogrupo de: Ácido quenodesoxicólico, Sal de sódio de ácido quenodesoxicólico,Ácido eólico, Ácido dehidrocólico, Ácido desoxicólico, Metil éster de ácidodeoxicólico, Digitonina, Digitoxigenina, N,N-Dimetildodecilamina N-óxido,Docusato de sódio, sódio de ácido glicoquenodeoxicólico, Hidrato de ácidoglicocólico, Monohidrato de ácido glicodesoxicólico, Sal de sódio de ácidoglicodesoxicólico, Sal de sódio de ácido glicodesoxicólico, Sal de 3-sulfatodissódico de ácido glicolitocólico, etil éster de ácido glicolitocólico, sal desódio de N-Lauroilsarcosina, sal de sódio de N-Lauroilsarcosina, N-Lauroilsarcosina, N-Lauroilsarcosina, Dodecil sulfato de lítio, Lugol, 1-Sal desódio de ácido octanosulfônico, 1 Sal de sódio de ácido octanosulfônico, 1-butanosulfonato de sódio, 1-decanosulfonato de sódio, 1-dodecanosulfonatode sódio, 1-heptanosulfonato de sódio, 1-heptanosulfonato de sódio, 1-nonanosulfonato de sódio, monohidrato de 1-propanosulfonato de sódio, 2-bromoetanosulfonato de sódio, Hidrato de colato de sódio, bile de boi ouovelha, Hidrato de colato de sódio, Coleato de sódio, Deoxicolato de sódio,Dodecil sulfato de sódio, Dodecil sulfato de sódio, Hexanosulfonato de sódio,Octil sulfato de sódio, Pentanosulfonato de sódio, Taurocolato de sódio, sal desódio de ácido tauroquenodesoxicólico, monohidrato de sal de sódio de ácidotaurodesoxicólico, sal de 3-sulfato dissódico de ácido taurolitocólico, sal desódio de ácido tauroursodesoxicólico, Trizma® dodecil sulfato, DSS(docusato de sódio, CAS registro no [577-11-7]), docusato de cálcio, (CASregistro no [128-49-4]), docusato de potássio, (CAS registro no [7491 09-0]),SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), Dodecilfosfocolina(FOS-Colina-12), Decilfosfocolina (FOS-Colina-10), Nonilfosfocolina (FOS-Colina9), dipalmitoil ácido fosfatídico, caprilato de sódio, e/ou ácidoursodesoxicólico.
Tensoativos catiônicos podem ser selecionados a partir dogrupo de: Brometo de alquiltrimetilamônio, Cloreto de benzalcônio, Cloretode benzalcônio, Cloreto de benzildimetilhexadecilamônio, Cloreto debenzildimetiltetradecilamônio, Tetracloroiodato de benziltrimetilamônio,Brometo de dimetildioctadecilamônio, Brometo de dodeciletildimetilamônio,Brometo de dodeciltrimetilamônio, Brometo de dodeciltrimetilamônio,Brometo de etilhexadecildimetilamônio, Brometo de hexadeciltrimetilamônio,Brometo de hexadeciltrimetilamônio, Polioxietileno(10)-N-sebo-l,3-diaminopropano, Brometo de tonzônio, e/ou Brometo detrimetil(tetradecil)amônio.
Tensoativos não iônicos podem ser selecionados a partir dogrupo de: BigCHAP, Bis(polietilenoglicol bis[imidazoil carbonil]),copolímeros de bloqueio como copolímeros de bloqueiopolietilenóxido/polipropilenóxido tal como poloxâmeros, poloxâmero 188 epoloxâmero 407, Brij®35, Brij® 56, Brij® 72, Brij® 76, Brij® 92V, Brij®97, Brij® 58P, Cremophor® EL, Decaetileno glicol monododecil éter, N-Decanoil-N-metilglucamina, n-Dodecanoil-N-metilglucamida, poliglicosídeosde alquila, óleo de ricínio etoxilado, Heptaetileno glicol monodecil éter,Heptaetileno glicol monododecil éter, Heptaetileno glicol monotetradecil éter,Hexaetileno glicol monododecil éter, Hexaetileno glicol monohexadecil éter,Hexaetileno glicol monooctadecil éter, Hexaetileno glicol monotetradecil éter,Igepal CA-630, Igepal CA-630, Metil-6-0-(Nheptilcarbamoil)-beta-D-glicopiranosídeo, Nonaetileno glicol monododecil éter, N-Nonanoil-N-metilglucamina, N-Nonanoil-N-metilglucamina, Octaetileno glicol monodeciléter, Octaetileno glicol monododecil éter, Octaetileno glicol monohexadeciléter, Octaetileno glicol monooctadecil éter, Octaetileno glicol monotetradeciléter, Octil-P-D-glicopiranosídeo, Pentaetileno glicol monodecil éter,Pentaetileno glicol monododecil éter, Pentaetileno glicol monohexadecil éter,Pentaetileno glicol monohexil éter, Pentaetileno glicol monooctadecil éter,Pentaetileno glicol monooctil éter, Polietilenoglicol diglicidil éter, Polietilenoglicol éter W-l, Polioxietileno 10 tridecil éter, Polioxietileno 100 estearato,Polioxietileno 20 isohexadecil éter, Polioxietileno 20 oleil éter, Polioxietileno40 estearato, Polioxietileno 50 estearato, Polioxietileno 8 estearato,Polioxietileno bis(imidazolil carbonil), Polioxietileno 25 propilenoglicolestearato, Saponina de cortiça de Quillaja, Span® 20, Span® 40, Span® 60,Span® 65, Span® 80, Span® 85, Tergitol, Tipo 15-S-12, Tergitol, Tipo 15-S-30, Tergitol, Tipo 15-S-5, Tergitol, Tipo 15-S-7, Tergitol, Tipo 15-S-9,Tergitol, Tipo NP-10, Tergitol, Tipo NP-4, Tergitol, Tipo NP-40, Tergitol,Tipo NP-7, Tergitol, Tipo NP-9, Tetradecil-13-D-maltosídeo, Tetraetilenoglicol monodecil éter, Tetraetileno glicol monododecil éter, Tetraetilenoglicol monotetradecil éter, Trietileno glicol monodecil éter, Trietileno glicolmonododecil éter, Trietileno glicol monohexadecil éter, Trietileno glicolmonooctil éter, Trietileno glicol monotetradecil éter, Triton CF-21, Triton CF-32, Triton DF-12, Triton DF-16, Triton GR-5M, Triton QS-15, Triton QS-44,Triton X-100, Triton X-102, Triton X-15, Triton X-151, Triton X-200, TritonX207, Triton® X-100, Triton® X-l 14, solução de Triton® X-165, solução deTriton® X-305, Triton® X405, Triton® X-45, Triton® X-705-70, TWEEN®20, TWEEN® 40, TWEEN® 60, TWEEN® 6, TWEEN® 65, TWEEN® 80,TWEEN® 81, TWEEN® 85, Tiloxapol, esfmgofosfolipídios(esfingomielina), e esfmgoglicolipídios (ceramidas, gangliosídeos),fosfolipídios, e/ou nUndecil (3-D-glicopiranosídeo."
Tensoativos zwitteriônicos podem ser selecionados a partir dogrupo de: CHAPS, CHAPSO, sal interno de 3-(Decildimetilamônio)propanosulfonato, sal interno de 3-(Dodecildimetilamônio)- propanosulfonato, sal interno de 3-(Dodecildimetilamônio)propanosulfonato, 3 (N,N-Dimetilmiristilamônio)propanosulfonato, 3-(N,N-Dimetiloctadecilamônio)-propanosulfonato, sal interno de 3-(N,N-Dimetiloctilamônio)propanosulfonato, 3 -(N,NDimetilpalmitilamônio)propanosulfonato, N-alquil-N,N-dimetilamônio-1 - propanosulfonatos, 3-colamido-1 -propildimetilamônio-1 -propanosulfonato,Dodecilfosfocolina, miristoil lisofosfatidilcolina, Zwittergent 3-12 (N-dodecilN,N-dimetil-3-amônio-l-propanosulfonato), Zwittergent 3-10 (sal interno dedimetilamônio 3-(Decildimetilamônio)- propanosulfonato), Zwittergent 3-08(3-(Octildimetilamônio)pro-panesulfonato), glicerofosfolipídios (lecitinas,cefalinas, fosfatidil serina), gliceroglicolipídios (galactopiranosídeo), alquil,alcoxi (alquil éster), alcoxi (alquil éter)- derivados de lisofosfatidil efosfatidilcolinas, por exemplo lauroil e miristoil derivados delisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo dacabeça polar, isto é colinas, etanolaminas, ácido fosfatídico, serinas,treoninas, glicerol, inositol, lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina,acilcarnitinas e derivados, derivados de lisina, arginina ou histidina Nbeta-acilados, ou derivados de lisina ou arginina de cadeia lateral acilada,derivados Nbeta- acuados de dipeptídeos compreendendo qualquercombinação de lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido,derivado Nbeta-acilado de um tripeptídeo compreendendo qualquercombinação de um aminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, ou otensoativo pode ser selecionado a partir do grupo de derivados de imidazolina,ácidos graxos de cadeia longa e sais destes C6-C12 (eg. ácido oléico e ácidocaprílico), N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-l-propanosulfonato,tensoativos monovalentes aniônicos (alquil-aril-sulfonatos), palmitoillisofosfatidil-L-serina, lisofosfolipídios (por exemplo l-acilsn-glicero-3-fosfato ésteres de etanolamina, colina, serina ou treonina), ou misturas destes.
O termo "poliglicosídeos de alquila" como usado neste lugarreferindo-se a uma cadeia linear ou ramificada de C5.2o-alquil, -alquenil ou -alquinil que é substituída por uma ou mais porções de glicosídeo tal comomaltosídeo, sacarídeo etc. Formas de realização destes poliglicosídeos dealquila incluem Ce.\s- poliglicosídeos de alquila. Formas de realizaçãoespecíficas destes poliglicosídeos de alquila incluem the cadeias de carbononumeradas igual tal como cadeia de alquila de C6, C8, Cio, Ci2, C]4, Ci6, CJ8 eC2o- Formas de realização específicas das porções de glicosídeo incluempiranosídeo, glicopiranosídeo, maltosídeo, maltotriosídeo e sucrose. Emformas de realização da invenção menos do que 6 porções de glicosídeo sãoacopladas ao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos doque 5 porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas derealização da invenção menos do que 4 porções de glicosídeo são acopladasao grupo alquila. Em formas de realização da invenção menos do que 3porções de glicosídeo são acopladas ao grupo alquila. Em formas derealização da invenção menos do que 2 porções de glicosídeo são acopladasao grupo alquila. Formas de realização específicas de alquilpoliglicosídeossão alquil glicosídeos tal n-decil p-D-glicopiranosídeo, decil P-Dmaltopiranosídeo, dodecil P-D-glicopiranosídeo, n-dodecil P-D-maltosídeo, n-dodecil P-D-maltosídeo, n-dodecil p-D-maltosídeo, tetradecil P-D-glicopiranosídeo, decil p-D-maltosídeo, hexadecil p-D-maltosídeo, decil P-D-maltotriosídeo, dodecil P-D-maltotriosídeo, tetradecil P-D-maltotriosídeo,hexadecil p-D-maltotriosídeo, n-dodecil-sucrose, n-decil-sucrose, sucrosemonocaprato, sucrose monolaurato, sucrose monomiristato, e sucrosemonopalmitato.O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas éconhecido para a pessoa versada. Para conveniência é feita referência aRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação compreende adicionalmente inibidores de protease tal comoEDTA (ácido etilenodiamina tetracético) e benzamidinaHCI, mas outrosinibidores de protease disponíveis comercialmente também podem ser usados.O uso de um inibidor de protease é particularmente útil em composiçõesfarmacêuticas compreendendo zimogênios de proteases a fim de inibirautocatálise.
É possível que outros ingredientes possam estar presentes naformulação farmacêutica de peptídeo da presente invenção. Tais ingredientesadicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificantes, antioxidantes,agentes de diluição, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, íonsmetálicos, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina no sorohumano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácidotal como betaína, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Taisingredientes adicionais, claro, não devem afetar adversamente a estabilidadegeral da formulação farmacêutica da presente invenção.
Composições farmacêuticas contendo um composto de acordocom a presente invenção podem ser administradas a um paciente comnecessidade de tal tratamento em diversos sítios, por exemplo, em sítiostópicos, por exemplo, pele e sítios de mucosa, em sítios que evitam absorção,por exemplo, administração em uma artéria, em uma veia, no coração, e emsítios que envolvem absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele,em um músculo ou no abdômen.
Administração de composições farmacêuticas de acordo com ainvenção pode ser através de diversas vias de administração, por exemplo,lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal,pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou umacombinação destas, epidermal, dermal, transdermal, vaginal, retal, ocular, porexemplo através da conjuntiva, uretral, e parenteral para pacientes comnecessidade de um tal tratamento.
Composições da presente invenção podem ser administradasem diversas formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões,emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, ungüentos, pastas,emplastros, pomadas, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágües,cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina duras e cápsulas de gelatinamacias, supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, líquidos pulverizáveis, pó,aerossóis, inalantes, gotas oculares, pomadas oftálmicas, enxágües oftálmicos,pessários vaginais, anéis vaginais, pomadas vaginais, solução de injeção,soluções de transformação in situ, por exemplo gelificação in situ, deposiçãoin situ, precipitação in situ, cristalização in situ, solução de infusão, eimplantes.
Composições da invenção podem adicionalmente sercompostas em, ou acopladas a, por exemplo através de interações covalentes,hidrofóbicas e eletrostáticas, um portador de droga, sistema de entrega dedroga e sistema de entrega de droga avançado a fim de realçar adicionalmenteestabilidade do composto da presente invenção, aumentar biodisponibilidade,aumentar solubilidade, diminuir efeitos adversos, atingir cronoterapia bemconhecida para aqueles versados na técnica, e aumentar adaptação ao pacienteou qualquer combinação destes. Exemplos de portadores, sistema de entregade drogas e sistema de entrega de droga avançados incluem, mas não sãolimitados a, polímeros, por exemplo celulose e derivados, polissacarídeos, porexemplo dextran e derivados, amido e derivados, poli(vinil álcool), polímerosde acrilato e metacrilato, ácido poliláctico e poliglicólico e co-polímeros debloqueio destes, polietilenoglicóis, proteínas carreadoras, por exemploalbumina, géis, por exemplo, sistemas de termogelificação, por exemplosistemas co-poliméricos de bloqueio bem conhecidos para aqueles versadosna técnica, micelas, lipossomos, microesferas, nanoparticulatos, cristaislíquidos e dispersões destes, fase L2 e dispersões destes, bem conhecidos paraaqueles versados na técnica de comportamento de fase em sistemas de lipídio-água, micelas poliméricas, emulsões múltiplas, auto-emulsifícante, auto-microemulsificante, ciclodextrinas e derivados destes, e dendrímeros.
Composições da presente invenção são úteis na formulação desólidos, semisólidos, pó e soluções para administração pulmonar decompostos da presente invenção, usando, por exemplo um inalador de dosemedida, inalador de pó seco e um nebulizador, todos sendo dispositivos bemconhecidos para aqueles versados na técnica.
Composições da presente invenção são especificamente úteisna formulação de sistema de entrega de drogas controlado, sustentado,prolongado, retardado, e de liberação lenta. Mais especificamente, mas nãolimitado a, composições são úteis em formulação de sistemas parenterais deliberação controlada e liberação sustentada (ambos sistemas levando a umaredução primordial em número de administrações), bem conhecidos paraaqueles versados na técnica. Ainda mais preferivelmente, são sistemas deliberação controlada e liberação sustentada administrados subcutaneamente.
Sem limitar o escopo da invenção, exemplos de sistema de liberaçãocontrolada útil e composições são hidrogéis, géis oleaginosos, cristaislíquidos, micelas poliméricas, microesferas, nanopartículas, Métodos paraproduzir sistemas de liberação controlada úteis para composições da presenteinvenção incluem, mas não são limitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão,homogeneização em alta pressão, encapsulação, liofilização,microencapsulação, coacervação, separação de fase, evaporação de solventepara produzir microsferas, extrusão e processos de fluidos supercríticos.Referência geral é feita a Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise, D.L., ed. Mareei Dekker, New York, 2000) e Drug and thePharmaceutical Sciences vol. 99: Protein Formulation and Delivery(MacNally, E.J., ed. Mareei Dekker, New York, 2000).
Administração parenteral pode ser realizada por injeçãosubeutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de umaseringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta. Alternativamente,administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba deinfusão. Uma opção adicional é uma composição que pode ser uma soluçãoou suspensão ou um pó para a administração do composto da presente invenção na forma de um líquido pulverizável de pó ou líquido nasal oupulmonar. Como uma opção ainda adicional, as composições farmacêuticascontendo o composto da invenção também podem ser adaptadas paraadministração transdermal, por exemplo por injeção livre de agulha ou a partirde um esparadrapo, opcionalmente um esparadrapo iontoforético, ouadministração transmucosal, por exemplo bucal.
Os compostos da presente invenção podem ser administradosatravés da via pulmonar em um veículo, como uma solução, suspensão ou póseco usando qualquer de tipos conhecidos de dispositivos adequados paraentrega pulmonar de droga. Exemplos destes compreendem, mas não são limitados a, os três tipos gerais de geração de aerossol para entrega pulmonarde droga, e podem incluir nebulizadores a jato ou ultra-sônicos, inaladores dedose medida, ou inaladores de pó seco (Cf. Yu J, Chien YW. Pulmonary drugdelivery: Physiologic and mechanistic aspects. Crit Rev Ther Drug Carr Sys14(4) (1997) 395-453).
Baseado em metodologia de teste padronizada, o diâmetroaerodinâmico (da) de uma partícula é definido como o diâmetro geométricoequivalente de uma partícula esférica padrão de referência de densidadeunitária (1 g/cm3). No caso mais simples, para partículas esféricas, da érelacionado a um diâmetro de referência (d) como uma função da raizquadrada da proporção de densidade como descrito por: Modifications to thisrelationship occur for non-spherical particles (cf. Edwards DA, BenJebria A,Langer R. Recent advances in pulmonary drug delivery using large, porousinhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385). Os termos "MMAD"e "MMEAD" são bem descritos e conhecidos para a técnica (cf. Edwards DA,Ben-Jebria A, Langer R e representam uma medida do valor médio de umadistribuição de tamanho de partícula aerodinâmica. Recent advances inpulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol84(2) (1998) 379-385). Diâmetro aerodinâmico médio de massa (MMAD) ediâmetro aerodinâmico efetivo médio de massa (MMEAD) são usadospermutavelmente, são parâmetros estatísticos, e descrevem empiricamente otamanho de partículas de aerossol em relação ao seu potencial de depositarnos pulmões, independente de forma atual, tamanho, ou densidade (cf.Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer R. Recent advances in pulmonary drugdelivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol 84(2) (1998)379-385). MMAD é normalmente calculado a partir da medida feita comimpactadores, um instrumento que mede o comportamento inercial dapartícula no ar. Em uma forma de realização adicional, a formulação pode seraerossolizada por qualquer tecnologia de aerossolização conhecida, tal comonebulização, para atingir um MMAD de partículas de aerossol menores doque 10 pm, mais preferivelmente entre 1-5 pm, e o mais preferivelmente entre1-3 pm. O tamanho de partícula preferido é baseado no tamanho mais efetivopara entrega de droga para o interior do pulmão, onde proteína é otimamenteabsorvida (cf. Edwards DA, Ben-Jebria A, Langer A, Recent advances inpulmonary drug delivery using large, porous inhaled particles. J Appl Physiol84(2) (1998) 379-385).
Deposição no interior do pulmão das formulações pulmonarescompreendendo o composto da presente invenção pode opcionalmente seradicionalmente otimizada usando modificações das técnicas de inalação, porexemplo, mas não limitado a: fluxo lento de inalação (eg. 30 L/min), bloqueioda respiração e momento de ativação.
O termo "formulação estabilizada" se refere a uma formulaçãocom estabilidade física aumentada, estabilidade química aumentada ou estabilidade física e química aumentada.
O termo "estabilidade física" da formulação protéica comousado neste lugar se refere à tendência da proteína para formar agregadosbiologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado deexposição da proteína a estresses termo-mecânicos e/ou interação com interfaces e superfícies que são desestabilizantes, tal como superfícies einterfaces hidrofóbicas. Estabilidade física das formulações protéicas aquosasé avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turbidez depois deexposição da formulação carregada em recipientes adequados (por exemplocartuchos ou frascos) a estresse mecânico/físico (por exemplo agitação) emdiferentes temperaturas por vários períodos de tempo. Inspeção visual dasformulações é realizada em uma luz de foco definido com um fundo escuro. Aturbidez da formulação é caracterizada por um escore visual ranqueando ograu de turbidez por exemplo em uma escala de 0 a 3 (uma formulaçãomostrando nenhuma turbidez corresponde a um escore visual 0, e umaformulação mostrando turbidez visual na luz do dia corresponde a escorevisual 3). Uma formulação é classificada instável fisicamente com respeito àagregação de proteína, quando ela mostra turbidez visual na luz do dia.Alternativamente, a turbidez da formulação pode ser avaliada por medidas deturbidez simples bem conhecidas para a pessoa versada. Estabilidade física das formulações protéicas aquosas também pode ser avaliada usando umagente espectroscópico ou sonda do estado conformacional da proteína. Asonda é preferivelmente uma molécula pequena que se liga preferencialmentea um confôrmero não nativo da proteína. Um exemplo de uma sondaespectroscópica molecular pequena de estrutura protéica é Tioflavina T.Tioflavina T é um corante fluorescente que foi amplamente usado para adetecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e talvez outrasconformações protéicas também, Tioflavina T leva a ocorrer um novomáximo de excitação em cerca de 450 nm e emissão realçada em cerca de 482nm quando ligada a uma forma protéica fibrilar. Tioflavina T não ligada éessencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.
Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas dasmudanças em estrutura protéica de estados nativos para não nativos. Porexemplo as sondas de "trecho hidrofóbico" que se ligam preferencialmente atrechos hidrofóbicos expostos de uma proteína. Os trechos hidrofóbicos sãogeralmente encobertos dentro da estrutura terciária de uma proteína em seuestado nativo, mas se tornam expostos à medida que a proteína começa adesenovelar ou desnaturar. Exemplos destas sondas espectroscópicasmoleculares pequenas são corantes hidrofóbicos aromáticos, tal comoantraceno, acridina, fenantrolina ou os semelhantes. Outras sondasespectroscópicas são complexos de metal-aminoácido, tal como complexosmetálicos de cobalto de aminoácidos hidrofóbicos, tal como fenilalanina,leucina, isoleucina, metionina, e valina, ou os semelhantes.
O termo "estabilidade química" da formulação protéica comousado neste lugar se refere a mudanças covalentes químicas na estruturaprotéica levando a formação de produtos de degradação química com menorpotência biológica potencial e/ou propriedades imunogênicas aumentadaspotenciais comparado à estrutura protéica nativa. Vários produtos dedegradação química podem ser formados dependendo do tipo e natureza daproteína nativa e do ambiente ao qual a proteína é exposta. Eliminação dedegradação química mais provavelmente não pode ser completamente evitadae quantidades crescentes de produtos de degradação química éfreqüentemente visto durante armazenamento e uso da formulação protéicacomo bem conhecido pela pessoa versada na técnica. A maioria das proteínasé propensa a desamidação, um processo no qual o grupo amida de cadeialateral em resíduos de glutaminil ou asparaginil é hidrolisado para formar umácido carboxílico livre. Outras vias de degradações envolvem formação deprodutos de transformação de alto peso molecular onde duas ou maismoléculas de proteína são covalentemente ligadas uma a outra através detransamidação e/ou interações dissulfeto levando a formação de produtos dedegradação de dímero, oligômero e polímero covalentemente ligado (Stabilityof Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, NewYork 1992). Oxidação (de por exemplo resíduos de metionina) pode sermencionada como outra variante de degradação química. A estabilidadequímica da formulação protéica pode ser avaliada medindo a quantidade dosprodutos de degradação química em vários momentos depois de exposição adiferentes condições ambientais (a formação de produtos de degradação podefreqüentemente ser acelerada por exemplo aumentando temperatura). Aquantidade de cada produto de degradação individual é freqüentementedeterminada por separação dos produtos de degradação dependendo detamanho e/ou carga de molécula usando várias técnicas de cromatografia (porexemplo SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
Por isso, como esboçado acima, uma "formulaçãoestabilizada" se refere a uma formulação com estabilidade física aumentada,estabilidade química aumentada ou estabilidade física e estabilidade química.Em geral, uma formulação deve ser estável durante uso e armazenamento (emconformidade com condições recomendadas de uso e armazenamento) até adata de validade ser atingida.
Em uma forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável pormais do que 6 semanas de utilização e por mais do que 3 anos dearmazenamento.
Em outra forma de realização da invenção a formulaçãofarmacêutica compreendendo o composto da presente invenção é estável pormais do que 4 semanas de utilização e por mais do que 3 anos dearmazenamento.
Em uma forma de realização adicional da invenção aformulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção éestável por mais do que 4 semanas de utilização e por mais do que dois anosde armazenamento.
Em uma forma de realização ainda adicional da invenção aformulação farmacêutica compreendendo o composto da presente invenção éestável por mais do que 2 semanas de utilização e por mais do que dois anosde armazenamento.
Em outro aspecto a presente invenção se refere ao uso de umcomposto de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento.
Em uma forma de realização um composto de acordo com ainvenção é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento ouprevenção de hiperglicemia, diabete tipo 2, tolerância à glicose prejudicada,diabete tipo 1, obesidade, hipertensão, síndrome X, dislipidemia, distúrbioscognitivos, arteriosclerose, infarto do miocárdio, derrame, doença coronáriacardíaca e outros distúrbios cardiovasculares, síndrome de intestinoinflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.
Em outra forma de realização um composto de acordo com ainvenção é usado para a preparação de um medicamento para atrasar ouprevenir progressão de doença em diabete tipo 2.
Em outra forma de realização um composto de acordo com ainvenção é usado para a preparação de um medicamento para diminuirconsumo alimentar, diminuir apoptose de célula (3, aumentar função de célulaB e massa de célula (3, e/ou para restaurar sensibilidade a glicose para célulasB.
O tratamento com um composto de acordo com a presenteinvenção também pode ser combinado com um segundo ou mais substânciasfarmacologicamente ativas, por exemplo selecionado a partir de agentesantidiabéticos, agentes antiobesidade, agentes reguladores de apetite, agentesantihipertensivos, agentes para o tratamento e/ou prevenção de complicaçõesresultando de ou associadas com diabete e agentes para o tratamento e/ouprevenção de complicações e distúrbios resultando de ou associadas comobesidade. Exemplos destas substâncias farmacologicamente ativas são:Insulina, sulfoniluréias, biguanidas, meglitinidas, inibidores de glucosidase,antagonistas de glucagon, inibidores de DPP-IV (dipeptidil peptidase-IV),inibidores de enzimas hepáticas envolvidas em estimulação de gliconeogênesee/ou glicogenólise, moduladores de absorção de glicose, compostosmodificando o metabolismo lipídico tal como agentes antihiperlipidêmicoscomo inibidores de HMG CoA (estatinas), Polipeptídeos Inibidores Gástricos(análogos de GIP), compostos diminuindo consumo alimentar, agonistas deRXR e agentes atuando no canal de potássio dependente de ATP das célulasP; Colestiramina, colestipol, clofibrato, gemfibrozil, lovastatina, pravastatina,simvastatina, probucol, dextrotiroxina, neteglinida, repaglinida; bloqueadoresp tal como alprenolol, atenolol, timolol, pindolol, propranolol e metoprolol,inibidores de ACE (enzima conversora de angiotensina) tal como benazepril,captopril, enalapril, fosinopril, lisinopril, alatriopril, quinapril e ramipril,bloqueadores de canal de cálcio tal como nifedipina, felodipina, nicardipina,isradipina, nimodipina, diltiazem e verapamil, e bloqueadores a tal comodoxazosina, urapidil, prazosina e terazosina; agonistas de CART (transcritoregulado por anfetamina cocaína), antagonistas de NPY (neuropeptídeo Y),agonista de PYY, agonistas de PYY2, agonistas de PYY4, agonistas dePPY2/PYY4 misturados, agonistas de MC4 (melanocortina 4), antagonistasde orexina, agonistas de TNF (fator de necrose tumoral), agonistas de CRF(fator de liberação de corticotropina), antagonistas de CRF BP (proteína deligação de fator de liberação de corticotropina), agonistas de urocortina,agonistas de In, agonistas de MSH (hormônio estimulador de melanócito),antagonistas de MCH (hormônio concentrador de melanócito), agonistas deCCK (colecistocinina), inibidores de re-consumo de serotonina, inibidores dere-consumo de serotonina e noradrenalina, compostos de serotonina enoradrenérgicos misturados, agonistas de 5HT (serotonina), agonistas debombesina, antagonistas de galanina, hormônio de crescimento, compostos deliberação de hormônio de crescimento, agonistas de TRH (hormônio deliberação de tireotropina), moduladores de UCP 2 ou 3 (proteína dedesacoplamento 2 ou 3), agonistas de leptina, agonistas de DA(bromocriptina, doprexina), inibidores de lipase/amilase, moduladores deRXR (receptor X retinóide), agonistas de TR (3; antagonistas de histamina H3,agonistas ou antagonistas de Polipeptídeo Inibidor Gástrico (análogos deGIP), gastrina e análogos de gastrina.
O tratamento com um composto de acordo com esta invençãotambém pode ser combinado com cirurgia- uma cirurgia que influencie osníveis de glicose e/ou homeostase de lipídio tal como bandeamento gástricoou derivação gástrica.
Deve ser entendido que qualquer combinação adequada doscompostos de acordo com a invenção com um ou mais dos compostosmencionados acima e opcionalmente uma ou mais substânciasfarmacologicamente ativas adicionais é considerada estar dentro do escopo dapresente invenção.
A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelosexemplos seguintes que, entretanto, não são para serem construídos paralimitar o escopo de proteção. As características descritas na descriçãoprecedente e nos exemplos seguintes podem, tanto separadamente como emqualquer combinação desta, ser material para realizar a invenção em diversasformas desta.EXEMPLOS
Abreviações usadas:
r.t: Temperatura ambiente
DIPEA: diisopropiletilamina
H20: água CH3CN: acetonitrila
DMF: NN dimetilformamida
HBTU: 2-(lH-Benzotriazol-l-il-)-l,l,3,3 hexafluorofosfato detetrametilurônio
Fmoc: 9 H-fluoren-9-ilmetoxicarbonil
Boc: terc-butiloxicarbonil
OtBu: terc-butil éster
tBu: terc-butil
Trt: trifenilmetil
Pmc: 2,2,5,7,8-Pentametil-croman-6-sulfonil
Dde: 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)etil
ivDde: 1 -(4,4-Dimetil-2,6-dioxociclohexilideno)-3-metilbutil
Mtt: 4-metiltritil
Mmt: 4-metoxitritil
DCM: diclorometano
TIS: triisopropilsilano)
TFA: ácido trifluoracético
Et20: dietiléter
NMP: 1 -Metil-pirrolidin-2-ona
DIPEA: Diisopropiletilamina
HO At: l-Hidroxi-7-azabenzotriazol
HOBt: 1-Hidroxibenzotriazol
DIC: Diisopropilcarbodiimida
A: Síntese de peptídeo ligado em resina.
A resina de peptidil protegida foi sintetizada de acordo com aestratégia de Fmoc em um sintetizador de peptídeo Applied Biosystems 433em escala de 0,25 mmol ou 1,0 mmol usando os protocolos FastMoc UVfornecidos pelo fabricante que empregam acoplamentos mediados por HBTU( 2-(lH-Benzotriazol-l-il)-l,1,3,3 hexafluorofosfato de tetrametilurônio) ouHATU (0-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3-hexafluorofosfato detetrametilurônio) em NMP (N-metil pirrolidona), e monitoramento de UV dadesproteção do grupo de proteção de Fmoc. A resina inicial usada para asíntese das amidas de peptídeo GLP-1 foi resina Rink-Amida e ou resina deWang ou clorotritil foi usada para peptídeos GLP-1 com um carboxi Cterminal. Os derivados de aminoácidos protegidos usados foram aminoácidosde Fmoc padrão (fornecidos a partir de por exemplo Anaspec, ouNovabiochem) fornecidos em cartuchos pré-pesados adequados para osintetizador ABI433A com a exceção de aminoácidos não naturais tal comoFmoc-Aib-OH (ácido aminoisobutírico de Fmoc). O aminoácido N terminalfoi protegido com Boc no grupo amino alfa (por exemplo Boc-His(Boc)OHfoi usado para peptídeos com His no N terminal). O grupo amino epsilon delisina em posição 26 foi protegido ou com Mtt, Mmt, Dde, ivDde, ou Boc,dependendo da via para acoplamento da porção de ligação de albumina eespaçador. A síntese dos peptídeos pode em alguns casos ser melhorada pelouso de dipeptídeos protegidos na ligação de amida de dipeptídeo com umgrupo que pode ser clivado sob condições ácidas tal mas não limitado a 2-Fmoc-oxi-4-metoxibenzil ou 2,4,6-trimetoxibenzil. Em casos onde uma serinaou uma treonina está presente no peptídeo, o uso de dipeptídeos depseudoprolina pode ser usado (veja por exemplo catálogo de Novobiochem2002/2003 ou versão mais recente, ou W.R. Sampson (1999), J. Pep. Sei. 5,403).
Procedimento para remoção de proteção por ivDde ou Dde.
A resina (0,25 mmol) foi colocada em um equipamentomanual de agitação/filtração e tratada com 2% de hidrazina em N-metilpirrolidona (20 ml, 2x12 min) para remover o grupo Dde ou ivDde e lavarcom N-metil pirrolidona (4x20 ml).
Procedimento para remoção de proteção por Mtt ou Mmt.
A resina (0,25 mmol) foi colocada em um equipamentomanual de agitação/filtração e tratada com 2% de TF A e 2-3% de TIS emDCM (20 ml, 5-10 min repetido 6-12 vezes) para remover o grupo Mtt ouMmt e lavar com DCM (2x20 ml), 10%de MeOH e 5% de DIPEA em DCM(2x20ml) e N-metil pirrolidona (4x20 ml).
Procedimento para acoplamento de cadeias laterais a resíduo de Lisina.
O resíduo de ligação de albumina (B-U- cadeia lateral defórmula I) pode ser acoplado ao peptídeo GLP-1 ou por acilação parapeptídeo ligado em resina ou acilação em solução para o peptídeo nãoprotegido usando reagente acilante padrão tal como mas não limitado a DIC,HOBt/DIC, HOAt/DIC, ou HBTU.
Acoplamento a peptídeo ligado em resina:
Vial
Resíduo de ligação de albumina ativado (éster ativo ouanidrido simétrico) (B-U- cadeia lateral de fórmula I) tal como ácidooctadecanodióico mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-il) éster (Ebashi et al.EP511600, 4 equivalentes molares em relação a peptídeo ligado em resina) foidissolvido em NMP (25 mL), adicionado à resina e agitado durante a noite emtemperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada e a resina foi lavadaextensivamente com NMP, diclorometano, 2-propanol, metanol e dietil éter.Via II
25 O resíduo de ligação de albumina (B-U- cadeia lateral defórmula I) foi dissolvido em N-metil pirrolidona/metileno cloreto (1:1, 10 ml).O reagente de ativação tal como hidroxibenzotriazol (HOBt) (4 equivalentesmolares em relação à resina) e diisopropilcarbodiimida (4 equivalentesmolares em relação à resina) foi adicionado e a solução foi agitada por 15min. A solução foi adicionada à resina e diisopropietilamina (4 equivalentesmolares em relação à resina) foi adicionada. A resina foi agitada 2 a 24 horasem temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (2x20ml), N-metil pirrolidona/Metileno cloreto (1:1) (2x20ml) e metileno cloreto(2x20 ml).
Via III
Resíduo de ligação de albumina ativado (éster ativo ouanidrido simétrico) (B-U- cadeia lateral de fórmula I) tal como ácidooctadecanodióico mono-(2,5-dioxo-pirrolidin-l-il) éster (Ebashi et al.EP511600), 1-1,5 equivalentes molares em relação ao peptídeo GLP-1 foidissolvido em um solvente orgânico tal como acetonitrila, THF, DMF, DMSOou em uma mistura de água/solvente orgânico (1-2 ml) e adicionado a umasolução do peptídeo em água (10-20ml) junto com 10 equivalentes molaresde DIPEA. Em caso de grupos de proteção no resíduo de ligação de albuminatal como tert.-butil, a mistura de reação foi liofilizada 0/N e o peptídeo brutoisolado desprotegido depois disso - em caso de um grupo terc-butil o peptídeofoi dissolvido em uma mistura de ácido trifluoracético, água etriisopropilsilano (90:5:5). Depois por 30min a mistura foi evaporada a vácuoe o peptídeo final purificado por HPLC preparativo.
Procedimento para remoção de proteção por Fmoc:
A resina (0,25 mmol) foi colocada em um frasco de filtro emum equipamento de agitação manual e tratada com N-metilpirrolidona/metileno cloreto (1:1) (2x20 ml) e com N-metil pirrolidona (1x20ml), uma solução de 20% de piperidina em N-metil pirrolidona (3x20 ml, 10min cada). A resina foi lavada com N-metil pirrolidona (2x20 ml), N-metilpirrolidona/Metileno cloreto (1:1) (2x20ml) e metileno cloreto (2x20 ml).Procedimento para clivar o peptídeo da resina:
O peptídeo foi clivado da resina agitando por 180 min emtemperatura ambiente com uma mistura de ácido trifluoracético, água etriisopropilsilano (95:2,5:2,5 para 92:4:4). A mistura de clivagem foi filtrada eo filtrado foi concentrado para um óleo por uma corrente de nitrogênio. Opeptídeo bruto foi precipitado deste óleo com 45 ml de dietil éter e lavado 1 a3 vezes com 45 ml de dietil éter.
Purificação: O peptídeo bruto foi purificado por HPLCsemipreparativo em uma coluna de 20 mm x 250 mm embalada ou com 5 |i ou7|i ou de sílica C-18. Dependendo do peptídeo um ou dois sistemas depurificação foram usados.
TFA: Depois de secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5ml de H20 com 50% de ácido acético e diluído para 20 ml com H20 e injetadona coluna que então foi eluída com um gradiente de 40-60 % de CH3CN em0,1% de TFA 10 ml/min durante 50 min a 40 °C. As frações contendopeptídeo foram coletadas. O peptídeo purificado foi liofilizado depois dediluição do eluato com água. Sulfato de amônio: A coluna foi equilibrada com40% de CH3CN em 0,05M de (NH4)2S04, que foi ajustado para pH 2,5 comH2S04 concentrado. Depois de secagem o peptídeo bruto foi dissolvido em 5ml de H20 com 50% de ácido acético e diluído para 20 ml com H20 e injetadona coluna que então foi eluída com um gradiente de 40% - 60% de CH3CNem 0,05M de (NH4)2S04, pH 2,5 a 10 ml/min durante 50 min a 40 °C. Asfrações contendo peptídeo foram coletadas e diluídas com 3 volumes de H20e passadas através de um cartucho Sep-Pak® Cl8 (Waters part. #:51910) quehavia sido equilibrado com 0,1% de TFA. Ele foi então eluído com 70% deCH3CN contendo 0,1% de TFA e o peptídeo purificado foi isolado porliofilização depois de diluição do eluato com água.
O produto final obtido foi caracterizado por RP-HPLCanalítico (tempo de retenção) e por LCMS
A análise RP-HPLC foi realizada usando detecção de UV em214 nm e uma coluna de sílica C-18 de 5\i de 4,6mm x 250mm Vydac218TP54 (The Separations Group, Hesperia, USA) que foi eluída a 1 ml/mina 42 °C. Duas condições de eluição diferentes foram usadas:
Al:Equilíbrio da coluna dentro de um tampão consistindo de0,1 M de (NH4)2504, que foi ajustada para pH 2,5 com H2504 concentrado eeluição por um gradiente de 0% a 60% de CH3CN no mesmo tampão durante50 min.
BI: Equilíbrio da coluna com 0,1 % de TF A / H20 e eluiçãopor um gradiente de 0% de CH3CN / 0,1% de TF A / H20 a 60% de CH3CN /0,1% de TF A / H20 durante 50 min.
B6: Equilíbrio da coluna com 0,1 % de TFA / H20 e eluição por um gradiente de 0% de CH3CN / 0,1% de TFA / H20 a 90% de CH3CN /0,1% de TFA / H20 durante 50 min.
Alternativamente a análise RP-HPLC foi realizada usandodetecção de UV em 214 nm e uma coluna de sílica C-18 de 3,5g de 3,6mm x150mm Symmetry300 (Waters) que foi eluída a 1 ml/min a 42 °C.
B4: Equilíbrio da coluna com 0,05% de TFA / H20 e eluiçãopor um gradiente de 5% de CH3CN / 0,05% de TFA / H20 a 95% de CH3CN/ 0,05% de TFA / H20 durante 15 min.
A instrumentação seguinte foi usada:
LCMS foi realizado em uma estrutura consistindo de espectrômetro de massa quadrupolar Sciex API 100 Single, bomba PerkinElmer Series 200 Quard, amostrador automático Perkin Elmer Series 200,detector de UV Applied Biosystems 785A, detector do espalhamento da luzpor um evaporado Sedex 75
O controle de instrumento e aquisição de dados foram feitos pelo aplicativo computacional de controle Sciex Sample rodando em umcomputador com Windows 2000.
A bomba de FíPLC é conectada a dois reservatórios deeluentes contendo:
A: 0,05% de Ácido trifluoracético em águaB: 0,05% de Ácido trifluoracético em acetonitrila
A análise é realizada em temperatura ambiente injetando umvolume apropriado da amostra (preferivelmente 20 ul) na coluna que é eluídacom um gradiente de acetonitrila.
As condições de HPLC, ajustes de detector e ajustes deespectrômetro de massa usados são dados na tabela seguinte.
Coluna : Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 pm
Gradiente : 5% - 90 % de acetonitrila linear durante 7,5 min a l,5ml/min
Detecção : 210 nm (emissão de análogo a partir de DAD)
ELS (emissão de análogo a partir de ELS), 40 °C
MS ionização modo API-ES
Alternativamente LCMS foi realizado em um ajusteconsistindo de Bomba Hewlett Packard series 1100 G1312A Bin,compartimento de Coluna Hewlett Packard series 1100, detector por conjuntode diodos Hewlett Packard series 1100 G1315A DAD, Hewlett Packard series1100 MSD e detector do espalhamento da luz por um evaporado Sedere 75controlado por aplicativo computacional HP Chemstation. A bomba de HPLCé conectada a dois reservatórios de eluentes contendo:
A: 10mMdeNH4OHemágua
B: 1 OmM de NH40H em 90% de acetonitrila
A análise foi realizada a 23° C injetando um volumeapropriado da amostra
(preferivelmente 20 pl) na coluna que é eluída com umgradiente de A e B.
As condições de HPLC, ajustes de detector e ajustes deespectrômetro de massa usados são dados na tabela seguinte.
Coluna Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 m
Gradiente 5% - 100% de acetonitrila linear durante 6,5 min al,5ml/min
Detecção 210 nm (emissão de análogo a partir de DAD)ELS (emissão de análogo a partir de ELS)MS ionização modo API-ES. Scan 100-1000 amu step 0,1 amuLigação radioligante a membranas de plasma expressando o receptor de GLP-1 humano
O ensaio de ligação foi realizado com membranas de plasmapurificadas contendo o receptor de GLP-1 humano. As membranas de plasmacontendo os receptores foram purificadas a partir de 13 células expressandoestavelmente BHK tk-ts. As membranas foram diluídas em Tampão de Ensaio(50 mM de HEPES, 5 mM de EGTA, 5 mM de MgC12, 0,005% de Tween20, pH=7,4) para uma concentração final de 0,2 mg/ml de proteína edistribuídas para placas de microtítulo de 96 poços pré-revestidas com 0,3 %de PEI.
Membranas na presença de 0,05 nM [1251]GLP-1, ligantesnão marcados em concentrações crescentes e diferentes concentrações deHSA (0,005%, 0,05%, e 2%) foram incubadas 2 hr a 30°C. Depois deincubação, ligantes não ligados foram separados de ligantes ligados porflltração através de um coletor de vácuo seguido por lavar 2X100 ul com tampão de ensaio congelado. Os filtros foram secos durante a noite a RT,registrados e quantificados em um contador y.
Exemplo 1
<formula>formula see original document page 61</formula>
Uma resina (Fmoc-Gly-NovaSyn TGT, 0,22 mmol/g Novabiochem 0,25 mmole) foi usada para produzir a seqüência primária emuma máquina ABI433A de acordo com orientações de fabricante. Todos osgrupos de proteção foram ácido-lábeis com a exceção do resíduo usado emposição 26 (FmocLys(ivDde)-OH, Novabiochem) permitindo desproteçãoespecífica desta lisina preferivelmente do que qualquer outra lisina.Procedimento
A resina (0,09 mmole) foi colocada em um equipamentomanual de agitação/filtração e tratada com 4% de hidrazina em N-metilpirrolidona em (4x10 min. 4x4 ml) para remover o grupo ivDde. A resina foilavada com N-metil pirrolidona (3x4 ml). Ácido octadecanodióico mono-(2,5-dioxopirrolidona-l-il)éster) (4 equivalentes molares em relação a resina) foidissolvido em DMF (4m 1).
A solução foi adicionada à resina e diisopropiletilamina (8equivalentes molares em relação à resina) foi adicionada. A resina foi agitada24 horas em temperatura ambiente. A resina foi lavada com N-metilpirrolidona (4x4 ml) e DCM (4x4ml). O peptídeo foi clivado da resinaagitando por 180 min em temperatura ambiente com uma mistura de ácidotrifluoracético, água e triisopropilsilano (92,5:5,0:2,5 4 ml).A mistura declivagem foi filtrada e o peptídeo bruto foi precipitado de 40 ml de dietil étere lavado 3 vezes com 45 ml de dietil éter. O peptídeo bruto foi purificado porHPLC preparativo em uma coluna de 20 mm x 250 mm embalada com sílicaC-18 de 7 (i. O peptídeo bruto foi dissolvido em 5 ml de 50% ácido acéticoem água e diluído para 20 ml com H20 e injetado na coluna que então foieluída com um gradiente de 25-65 % (CH3CN em água com 0,1% de TF A)20 ml/min durante 40 min a RT. As frações contendo peptídeo foramcoletadas. O peptídeo purificado foi liofllizado depois de diluição do eluatocom água.
HPLC (método B4): RT= 9,94 min (91%)
LCMS: m/z = 1232 (MH33+) Calculado para (MH33+) = 1232Exemplo 2
<formula>formula see original document page 63</formula>
N-s26-(19-carboxinonadecanoil)-[Aib8,Arg34PLP-l-(7-37)-peptídeo Preparado como em Exemplo 1 e em conformidade com "métodossintéticos". HPLC (método B4): RT= 10,42 min (91%)
LCMS: m/z = 1242 (MH33+) Calculado para (MH33+) = 1242
Exemplo 3
N-e -(4-{ [N-(2-carboxietil)-N-(l 5- carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil[Arg34]G LP-1 -(7-37)-peptídeo
Para uma solução de 4-(N-(2-(terc-butoxicarbonipentil)-N-(15-(terc-butoxicarbonil)pentadecanoil)aminometil)ácido benzóico (36 mg, 60iimol) em THF (1 ml) foram adicionados DIPEA (7 ul) e O-(l-succinimidil)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametilurônio (TSTU, 17 mg, 56 ul).Depois de agitar por 1 h em temperatura ambiente, a mistura foi diluída comTHF (1 ml), e 1 ml da solução resultante foi adicionado a uma solução de[Arg34]GLP-l-(7-37) peptídeo (aprox 100 mg) e DIPEA (103 ul) em água (5ml). Depois de 0,5 h foi adicionado mais da solução THF de agente acilante(0,4 ml). Depois de agitar em temperatura ambiente por um total de 1,5 h amistura de reação foi filtrada e aplicada a um HPLC preparativo (eluição degradiente com 35-55% de MeCN/55-35% de água/10% de água com 1% deTF A). Frações contendo o produto desejado foram combinadas e liofilizadas.
O produto foi então tratado com 25 ml de uma mistura de TFA e água (95/5vol) por 15 min em temperatura ambiente, concentrado, e purificado maisuma vez por HPLC. 15,4 mg do composto título foram obtidos.
HPLC (método B4): RT = 9,41 min (99%)
LCMS: m/z = 1287 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1287
Exemplo 4
N-826-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetilpib8,Arg34]GLP-l-(7- 37)peptídeo.
<formula>formula see original document page 64</formula>
[Aib8,Arg34]GLP-l-(7-37)-peptídeo foi preparado por síntesede peptídeo de fase sólida de Fmoc padrão e purificado por HPLCpreparativo. [Aib8,Arg34]GLP-l-(7-37)-peptídeo foi dissolvido em água(15ml) e DIPEA (50ul) foi adicionado. 17-((S)-l-terc-Butoxicarbonil-3-{2-[2-({242-(2,5-dioxopirrolidin-l-iloxicarbonilmetoxi)etoxi] etilcarbamoil} metoxi)etoxi] etilcarbamoil }propilcarbamoil)ácidoheptadecanóico terc-butil éster (21 mg) foi dissolvido em acetonitrila/água 2:1 (1.5 ml) e adicionado em pequenas porções. A reação foi monitorada porHPLC. Quando não foi mais encontrado [Aib8,Arg34]GLP-l-(7-37)- peptídeoa mistura de reação foi liofilizada 0/N. Ao composto isolado foi adicionado10 ml de 90% de TFA / 5% de TIS/ 5% de água e a mistura de reação foiconstante por 2 horas, evaporada a vácuo, e co-evaporada com heptano. O óleo residual foi dissolvido em 15ml de água contendo 1 % de NH3-aq epurificado por HPLC preparativo para gerar o composto título.
HPLC (método B4): RT = 9,60 min (100%)
LCMS: m/z = 1372 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1372
Exemplo 5
<formula>formula see original document page 64</formula>N-826-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(19-Carboxinonadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetilpib8,Arg34]GLP-l-(7- 37)peptídeo.
O peptídeo foi preparado de acordo com: A. Síntese depeptídeo ligado em resina em escala de 0,25 mMol em uma resina Fmoc-Gly-Wang (0,66 mmol/g Novabiochem) foi usada para produzir a seqüênciaprimária em uma máquina ABI433A de acordo com orientações defabricante. Todos os grupos de proteção foram ácido-lábeis com a exceção doresíduo usado em posição 26 (FmocLys(Mtt)-OH, Novabiochem) que é superácido-lábil, permitindo desproteção específica desta lisina preferivelmente doque qualquer outra lisina.
Procedimento para remoção de proteção por Mtt. A resina(0,25 mmol) foi colocada em um equipamento manual de agitação/filtração etratada com 2% de TF A, 3% de TIS em DCM (20 ml, 5-10 min repetido 6-12vezes) para remover o grupo Mtt e lavar com DMF. Síntese foi continuadacom Procedimento para acoplamento de cadeias laterais para resíduo deLisina, seguindo Via II, com o Procedimento para remoção de proteção porFmoc apropriado. Desproteção final, purificação por HPLC e análise porHPLC e LC-MS de acordo com os procedimentos.
HPLC (método B6): RT = 34,56 min (100%)
LCMS: m/z = 1381,8 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4142,7
Exemplo 6
<formula>formula see original document page 65</formula>
N-s2-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino] etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi] etoxi)acetil] [3 -(4-Imidazolil)Propionil7,Arg34]GLP-1 -(7-3 7)peptídeo
Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com"métodos sintéticos". HPLC (método B6): RT = 32,89 min (100%)
LCMS: m/z = 1362,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4085,6
Exemplo 7
<formula>formula see original document page 66</formula>
N-e 26-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(l 7-Carboxiheptadecanoilamino)-(Carboximetilamino)acetilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l-(7- 37)peptídeo
Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com"métodos sintéticos".
HPLC (método B6): RT = 32,67 min (100%)LCMS: m/z = 1367,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4100,6
Exemplo 8
<formula>formula see original document page 66</formula>
(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-3(S)-Sulfopropionilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l-(7- 37)peptídeo
Preparado como em Exemplo 5 e em conformidade com"métodos sintéticos".
HPLC (método B6): RT = 32,04 min (100%)LCMS: m/z = 1379,8 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4136,7
Exemplo 9
<formula>formula see original document page 67</formula>
N-e -[2-(2 [2-(2[2-(2[4-( 17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Gly8,Arg34]GLP-l-(7-37)peptídeo.
[Gly8,Arg34]GLP-l(7-37) peptídeo começando de 150 mg deresina de 2-clorotritil cloreto (1,4 mmol/g) foi preparado por síntese depeptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. Oresíduo de Lys em posição 26 foi protegido como Lys(ivDde) enquanto ascadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas comgrupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegidocom 3% de hidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. Então, as duasunidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutamico e ácidooctadecanodióico foram acopladas ao peptídeo acoplado à resina usandoDIC/HOAt. O peptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina comTFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.
HPLC: Elui a 46% de acetonitrila
MALDI: 4087 (MH+)
Exemplo 10
<formula>formula see original document page 67</formula>
N-e 26-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l-(7-37)-amida
[Aib ,34]GLP-1(7-37) amida começando de 200 mg de resinaTentagel RAM S (0,26 mmol/g) foi preparada por síntese de peptídeo de fasesólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduo de Lysem posição 26 foi protegido como Lys(ivDde) enquanto as cadeias lateraisfuncionais para os outros aminoácidos foram protegidas com grupos deproteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 3% dehidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. Então, as duas unidades de,8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutâmico ácido octadecanodióicoforam acopladas ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeofoi finalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol(90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.
HPLC: Elui a 49% de acetonitrila
MALDI:4114(MH+)
Exemplo 11
<formula>formula see original document page 68</formula>
N-826-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino] etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi] etoxi)acetil] [Aib8, Arg34,Pro 37]GLP-l-(7-37)amida
O peptídeo foi preparado em uma resina de amida Rink (0,70 mmol/g Novabiochem) e também como em Exemplo 5 e em conformidade com "métodos sintéticos".
HPLC (método B6): RT = 32,13 min (100%). (método Al): RT = 44,33 min (98,4%) LCMS: m/z = 1385,3 (MH33+) Calculado para (M+H+): 4153,8
Exemplo 12
<formula>formula see original document page 68</formula>Aib8,Lys28(N-E28-{2-(2-(2-(242-(2-(4-(pentadecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)etoxi)etoxi] acetipetoxi)etoxi)acetil))), Arg34)GLP-1 H(7-37)-OH
HPLC (método B6): RT= 30,41 minLCMS: m/z = 1362,9 (MH33+) Calculado para (M+) = 4085,61
Exemplo 13
<formula>formula see original document page 69</formula>
N-826T2-(2[2-(2[2-(2[4-{[N-(2-carboxietil)-N-(17-carboxiheptadecanoil)amino]metil} benzoil)amino] etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l(7-37)
[Aib8,Arg34]GLP-l(7-37) peptídeo começando de 150 mg deresina de 2-clorotritil cloreto (1,4 mmol/g) foi preparado por síntese depeptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. Oresíduo de Lys em posição 26 foi protegido como Lys(ivDde) enquanto ascadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas comgrupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegidocom 3% de hidrazina/3% de piperidina em NMP por 1 hr. As duas unidadesde 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico e 4{[(2-terc-butoxicarboniletil)-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoil)-amino] -metil} -ácido benzóico foramacoplados ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foifinalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol(90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS preparativo.
HPLC: Elui a 52% de acetonitrilaMALDI: 4191 (MH+)Exemplo 14
<formula>formula see original document page 70</formula>
N-a7-formil, N-s26-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino] etoxi)etoxi] acetilamino)etoxi] etoxi)acetil] [Arg 1GLP-1 -(7-37)- peptídeo
HPLC (método B6): RT= 32,6 minLCMS: m/z = 1377,3 (MH33+) Calculado para (M+) = 4128,0
Exemplo 15
<formula>formula see original document page 70</formula>
N-82626-[2-(2[2-(2[2-(2[4-(l 7-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Glu22,Arg34]GL P-l-(7-37)peptídeo.
[Aib8,Glu22,Arg34]GLP-l(7-37) peptídeo começando de 150mg de resina Fmoc-Gly-Wang (0,66mmol/g) foi preparado por síntese depeptídeo de fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. Oresíduo de Lys em posição 26 foi protegido como Lys(Mtt) enquanto ascadeias laterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas comgrupos de proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegidocom 2% de TF A/270 de TIS em DCM por 4 x 5 min. As duas unidades de 8- amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-glutâmico e ácido octadecanóico tertbutiléster foram acoplados ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. Opeptídeo foi finalmente desprotegido e clivado da resina comTFA/TIS/H20/tioanisol (90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por LC-MS.
HPLC: Elui a 50% de acetonitrilaMALDI:4187(MH+)Exemplo 16
<formula>formula see original document page 71</formula>
N-826{3[2-(2-{2[2-(2-{2[2-(2[4-(15-(N-((S)-l,3-dicarboxipropil)carbamoil)pentadecanoilamino)-(S)-4- carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]etoxi}etoxi)etoxi]propionil} [Aib8,Arg34]GLP-1 -(7-37)-peptídeo
Método e análise
Preparado como em Exemplo 3 e em conformidade com"métodos sintéticos".
HPLC (método B4): RT = 10,29 min (92%)
LCMS: m/z = 1450 (MH33+) Calculado para (MH33+): 1450
Exemplo 17
<formula>formula see original document page 71</formula>
N-£26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-{[N-(2-carboxietil)-N-(17- carboxiheptadecanoil)amino]metil} benzoil)amino] 4(S)- carboxibutirilamino)etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil] [Aib8,Arg34]GLP-1 (7- 3 7)
[Aib8,Arg34]GLP-l(7-37) peptídeo começando de 150 mg deresina Fmoc-Gly Wang (0,66mmol/g) foi preparado por síntese de peptídeode fase sólida de Fmoc usando Apex396 de Advanced Chemtech. O resíduode Lys em posição 26 foi protegido como Lys(Mtt) enquanto as cadeiaslaterais funcionais para os outros aminoácidos foram protegidas com gruposde proteção ácido-lábeis padrão. O resíduo de Lys foi desprotegido com 2%de TF A/2% de TIS em DCM por 4x5 min. As duas unidades de 8-amino-3,6-ácido dioxaoctanóico, y-ácido glutâmico e 4{[(2-terc-butoxicarbonil etil)-(17-terc-butoxicarbonil-heptadecanoil)-amino]-metil}-ácido benzóico foramacopladas ao peptídeo acoplado à resina usando DIC/HOAt. O peptídeo foifinalmente desprotegido e clivado da resina com TFA/TIS/H20/tioanisol(90/5/3/2). O peptídeo foi isolado por HPLC preparativo.
HPLC: Elui a 51% de acetonitrilaMALDI: 4320 (MH+)
Exemplo 18
<formula>formula see original document page 71</formula>
N-£26-{(S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4-((S)-4-carboxi-4-( 19- carboxinonadecanoilamino)butirilamino)butirilamino)butirilamino)butirilaminollAib8,Arg34]GLP-l-(7-37)
O peptídeo foi sintetizado usando química Fmoc em umSintetizador de Peptídeo Liberty Microwave (CEM Corporation). A síntesefoi realizada em uma resina Gly-Wang (Novabiochem) com uma carga de0,66 mmol/g usando excesso de 4 vezes de aminoácidos e DIC/HOAt paraacoplamento. A histidina N terminal foi protegida com Boc e a lisina a sermodificada foi protegida com Mtt. Depois de síntese do esqueleto de peptídeo, o grupo Mtt foi removido com 3% de TF A em DCM e a cadeialateral foi construída no Liberty usando protocolos de síntese de peptídeopadrão. Na última etapa o diácido graxo foi adicionado como um mono-t-butiléster.
Depois de clivagem com TFA/TIS/água (95:2,5:2,5), o20 peptídeo foi dissolvido em 50% de acetonitrila por adição de DIPEA epurificado em um sistema Waters LC-MS usando uma coluna de 7,8 x 300mm X-Terra Prep MS Cl8 10 pm correndo em temperatura ambiente. Depoisde 5 minutos a 30% de CH3CN, 0,08% de TFA, 4 ml/min, a coluna foi eluídacom um gradiente linear de 30 a 70% de CH3CN por 40 minutos. As fraçõescontendo o composto desejado foram coletadas e a concentração do peptídeono eluato foi determinada por mensuração da absorção de UV em 280 nmassumindo coeficientes de extinção molar de 1280 e 3690 para tirosina etriptofano respectivamente. A identidade e pureza foram confirmadas porMALDI. Depois da determinação da concentração o eluato foi aliquotado emfrascos contendo a quantidade desejada e seco por centrifugação a vácuo.
HPLC: Elui a 52% de acetonitrila MALDI: 4239 (MH+)
Exemplo 19
N-8 -4-(l 7-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutiril4Aib ,Arg pLP-l-(7-37)- peptídeo
Método e análise
Preparado como em Exemplo 4 e em conformidade com "métodos sintéticos".
HPLC (método B4): Rt = 9,64 min (97 %)
LCMS: m/z: = 1276 (MH33+) Calculado para (MH33+) 1276
Exemplo 20
N-s26-{3[2-(2-{2[2-(2-{2[2-(2[4-(17-carboxiheptadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino] etoxi)etoxi] etoxi} etoxi)etoxi] etoxi} etoxi)etoxi]propionil}[Aib8,Arg34pLP-1 -(7- 37)-peptídeo.
LCMS*: m/z: = 1417 (MH33+), Calculado para (MH33+) 1417
*HPLC (Eluiu a 0,5 mL/min a 42°C por um gradiente linear de5 —->80% de acetonitrila, 85—>10% de água e 10% de uma solução de1,0%) de ácido trifluoracético por 50min. Detecção de UV em 214 em umacoluna Symmetry300, 5um, 3,9 mm x 150 mm C-18 sílica)método B4): Rt =32,09 min (95 %)Exemplo 21
<formula>formula see original document page 74</formula>
N-s26-{2-(2-(2-(2[2-(2-(4-(l 7-carboxiheptadecanoilamino)-4-carboxibutirilamino)etoxi)etoxi]acetipetoxi)etoxi)acetil)}4Aib8'22'27'3"5,Arg34,Pro37, Lys26] GLP-1 (7-37)amida
HPLC (método B6): RT= 35,0 min
LCMS: mlz = 1394,0 (MH33+) Calculado para (M+) = 4180,0
Exemplo 22
<formula>formula see original document page 74</formula>
N-826[2-(2[2[4-(21 -Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino]etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-1 -(7-37) Preparado usando o mesmométodo que em Exemplo 19.
HPLC: Elui a 53,4% de acetonitrila MALDI: 4025 (MH+)
Outros compostos desta invenção incluem:
<formula>formula see original document page 74</formula>
N-826[2-(2[2-(2[2-(2[4-(21 -Carboxiuneicosanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l -(7- 37)peptídeo.
<formula>formula see original document page 74</formula>
N-al-formil-N-826[2-(2[2-(2[2-(2[4-(lCarboxinonadecanoilamino)-4(S)-carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Arg34]G LP-1 -(7- 37)peptídeo.<formula>formula see original document page 75</formula><formula>formula see original document page 76</formula>
Estudo farmacodinâmico usando camundongos db/db
Em um aspecto desta invenção os agonistas de GLP-1 têmuma duração de ação de pelo menos 24hrs depois de dosagem de 30nmol/kgpara camundongos db/db
A eficácia e duração de ação são medidas em camundongos db/db
Dinamarca na idade de 8-10 semanas. A partir da hora de chegada, oscamundongos são alojados sob condições padrão mas a 24 °C. Oscamundongos são mantidos em 10 por gaiola até experimento com acesso livre a comida padrão (Altromin, Brogaarden APS., Denmark) e água detorneira em um dia normal: ciclo de luz (luz às 6 am). Os camundongos sãousados para 1 experimento por semana por 3 semanas. Depois disso, oscamundongos são eutanizados.
sangüínea é medida por amostragem do capilar da ponta da cauda. Emresumo, 5 ul de sangue é amostrado em tubos capilares de vidro heparinizadoe imediatamente suspenso em 250 ul de solução tampão EBIO (Eppendorf,Germany) em um tubo Eppendorf de 1,5 ml. A concentração de glicose nosangue é medida pelo método de glicose oxidase no analisador EBIO PlusAuto (Eppendorf, Germany).
O corte de valor para glicose sangüínea é 10 mM. Ao avaliaros camundongos, é essencial, que todos os 42 camundongos que entram noexperimento tenham valores de glicose sangüínea acima de 10 mM, mastambém que a variância entre camundongos seja pequena. Portanto, se muitoscamundongos não são severamente diabéticos, ao passo que alguns são, ocomeço dos experimentos deve ser postergado uma semana e novas medidasbasais de glicose sangüínea serem feitas.
Baseado nos valores basais de glicose sangüínea, oscamundongos são alocados em 7 grupos de n=6 com valores de glicosesangüínea médios de grupo compatível.
No dia de teste os valores matinais basais de glicose sangüíneasão verificados como descrito acima e o peso corporal basal de cadacamundongo é verificado. Em tempo 0, o composto é dosadosubcutaneamente na nuca do pescoço (volume de dosagem ap. 300 ul/50 g decamundongo).
Os valores de glicose sangüínea são acompanhados até 48horas (tempo 1, 3, 6, 24 e 48 h) e o peso corporal terminal é verificado.
Todos os dados são colocados em Graphpad Prism ondeglicose sangüínea média e pesos corporais delta médios são calculados.
Um aspecto desta invenção é preparar análogos/derivados deGLP-1 com meias-vidas no plasma estendidas que são adequados paraadministração uma vez por semana. As propriedades farmacocinéticas podemser avaliadas em minisuínos ou suínos domésticos como descrito abaixo
Triagem farmacocinética de análogos de GLP-1 uma vez por semana
Triagem farmacocinética de análogos de GLP-1 paraidentificação de candidatos uma vez por semana adequados foi realizada emcandidatos que de acordo com os planos de seleções de projeto mostraram sersuficientemente potentes com respeito a potencial de redução de glicose emum modelo de camundongo diabético (camundongos db/db) esubseqüentemente tiveram um tempo de duração de 48 horas ou mais nomodelo de camundongo db/db.
Triagem primária
A primeira parte da triagem farmacocinética consistiu deadministração subcutânea de uma única dose de 2 nmol/kg para trêsminisuínos pesando 8-12 kg. Amostras de sangue foram extraídas de cadaanimal em pré-dose, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72, 96 e 120 horas apósinjeção. Todas as amostras de sangue foram estabilizadas com um tampão deestabilização especial consistindo de:
EDTA (di-sódio) 0,18 M, Aprotenina 15000 KIE/ml, Val-Pyr0,30 mM, pH ajustado para 7,4 a fim de prevenir degradação enzimática dosanálogos de GLP-1. Plasma foi coletado de cada uma das amostras de sangueestabilizadas por centrifugação (4°C, 10 min., 1270 G (4000 rpm)), eanalisado para o teor de análogo de GLP-1 por ensaios ELISA. Três ensaiosELISA diferentes foram usados para a análise de plasma: O "Ensaio total"usando a combinação de anticorpo Fl/Ra2135 detectando tanto a molécula 7-37GLP-1 intacta N-terminalmente como a molécula 9-37GLP-1 N-terminalenzimaticamente degradada com um limite de detecção (LOD) de 35 pM euma extensão analítica dinâmica de 35-30000 pM. O "Ensaio intacto" usandoa combinação de anticorpo Fl/Mab26.1. Este ensaio foi detectar molécula 7-37GLP-1 intacta N-terminalmente apenas. O LOD foi 35 pM e uma extensãoanalítica dinâmica de 35-30000 pM. O "Ensaio de Aib-intacto" usando acombinação de anticorpo F1/GLP162-3F15. Este ensaio foi detectar o N-terminal estabilizado de Aib da molécula de GLP-1 possibilitando detecção deanálogos de GLP-1 estabilizados. O LOD foi 45 pM e a extensão analíticadinâmica 45-30000 pM.
Todos os perfis de concentração-tempo no plasma foramanalisados farmacocineticamente por uma análise não compartimental. Osseguintes parâmetros farmacocinéticos foram calculados se dados permitiram:tmax, Cmax, AUC, AUC/Dose, AUCO/OExtrapoi, Az, tl/2, CUF, VziF eMRT.
Triagem secundária
Uma segunda parte da triagem farmacocinética foi conduzidanaqueles compostos com uma meia vida terminal inicial de 60-70 horas oumais. Esta triagem consistiu de administração intravenosa e subcutânea deuma única dose de 2 nmol/kg para seis minisuínos por cada via deadministração. O cronograma de amostragem sangüínea foi prolongado de 0-120 horas para 0-432 e 0504 horas depois de administração intravenosa esubcutânea respectivamente. Isto foi feito a fim de aumentar a precisão eacurácia das estimativas de parâmetro farmacocinético, especialmente a meiavida terminal, AUC e os parâmetros derivados depuração e volume dedistribuição, e para estimar a biodisponibilidade depois de administraçãosubcutânea.
ENSAIO DE GLP-1 (Aib8- INTACTO)
O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubaçãosimultânea do analito com anticorpo receptor e detector. Um substratoquimioluminescentes pronto para usar foi usado para maximizar sinal. Oensaio não reconhece GLP-1 (7-37) endógeno nem o GLP-1 (9-37) clivadocom DPPIV.
Plasma de referência para ensaios de GLP-1
0-plasma foi preparado a partir de plasma EDTA combinadosem Valina Pirrolidida e Aprotinina de animais em jejum. O plasma EDTAcombinado foi incubado a 37°C por 4 horas para remover traços de GLP-1 edepois de incubação Valina Pirrolidida e Aprotinina foram adicionadas.
Tampões
Tampão de revestimento
PBS foi usado como tampão de revestimento: lOmM defosfato de sódio e 145mM de cloreto de sódio ajustado para pH 7,4.
Tampão de lavagem
PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20
Tampão de ensaio
PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20, lOg/L de BSA e lOmg/L de anti-TNP.
Tampão de estreptavidina
Tampão de lavagem com um 0,5M de NaCI adicional.
Substrato
Substrato SuperSignal ELISA Femto (Pierce, cat.no. 37075) pronto para usar.
Padrões
Padrões foram preparados a partir de uma solução estoque de uM de 0113-0000-0217. O peptídeo foi diluído serialmente em plasma de referência para fazer padrões com concentrações finais de 30000 10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Padrões foram armazenados em tubos Micronic emalíquotas de lOOuL a -20°C.
Procedimento de ensaio
Microplacas Crystal 2000 (pretas) foram revestidas comanticorpo monoclonal GLPM-7F1, lOOuL de 5 ug/mL em PBS durante anoite a 4°C.
Placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem em umlavador de placas automático (SkanWasher, Skatron) e permitidas parapermanecer por pelo menos 30min. com tampão de lavagem para bloquear sítios remanescentes.
20uL de amostra ou padrão foram adicionados a cada poço emduplicata imediatamente seguido por lOOuL de GLP162-3F15 biotinilado,1 ug/mL em tampão de ensaio. Placas foram incubadas por 2 horas emtemperatura ambiente em um agitador de placa seguido por 5 ciclos delavagem como previamente descrito. IOOuL de solução de estreptavidina-peroxidase (KPL, código 14-30-00, 1:20000 em tampão de estreptavidina)foram adicionados a cada poço e incubados por 1 hora em temperaturaambiente em um agitador de placa. Placas foram lavadas como previamentedescrito e depois de esvaziar IOOuL de SuperSignal femto foram adicionados.Placas foram postas em um agitador por 1 minuto e medidas em LuminômetroOrion (Berthold). Dados foram transferidos para MultiCalc e curvas padrãocalculadas usando o método de 4PL pesado. Concentrações de amostrasforam calculadas a partir da curva padrão.
ENSAIO DE GLP-1 (TOTAL)
O ensaio foi um ensaio de dois sítios com incubaçãosimultânea do analito com anticorpo receptor e detector. O ensaio nãoreconhece GLP-1 clivado N-terminalmente até GLP-l(12-37).
Tampões
Tampão de revestimento
PBS foi usado como tampão de revestimento: lOmM defosfato de sódio e 145mM de cloreto de sódio ajustado para pH 7,4.Tampão de lavagem
PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20Tampão de ensaio
PBS com 0,05% (v/v) de Tween 20, lOg/L de BSA e lOmg/L de anti-TNP.
Tampão de estreptavidina
Tampão de lavagem com um 0,5M de NaCI adicional.
Substrato
Substrato TMB (KemEnTec código 4380A) pronto para usar
Tampão de parada
4 M H3P04
Padrões
Padrões foram preparados a partir de uma solução estoque de25 uM de 0113-0000-0217. O peptídeo foi diluído serialmente em plasma dereferência para fazer padrões com concentrações finais de 30000 10000-3333-1111-370-123-41 e 0 pM. Padrões foram armazenados em tubos Micronic emalíquotas de lOOuL a -20°C.
Procedimento de ensaio
Placas de microtítulo Maxisorp (NUNC) foram revestidas comanticorpo monoclonal GLPM-7F1, lOOuL de 5 ng/mL em PBS durante anoite at 4°C.
Placas foram lavadas 5 vezes com tampão de lavagem em umlavador de placas automático (SkanWasher, Skatron) e permitidas parapermanecer por pelo menos 30min. com tampão de lavagem para bloquearsítios remanescentes.
20uL de amostra ou padrão foram adicionados a cada poçoimediatamente seguido por lOOuL de Ra2135- biotinilado, lug/mL emtampão de ensaio. Placas foram incubadas por 2 horas em temperaturaambiente em um agitador de placa seguido por 5 ciclos de lavagem comopreviamente descrito.
lOOuL de solução de estreptavidina-peroxidase (AmershamBioscinces código RPN4401 V, 1:8000 em tampão de ensaio ) foramadicionados a cada poço e incubados por 1 hora em temperatura ambiente emum agitador de placa. Placas foram lavadas como previamente descrito edepois de esvaziar lOOgL de TMB foram adicionados e depois de 5 minutosparadas com lOOuL de H3P04.
Placas foram medidas em Victor Multilabel Reader (Wallac).
Dados foram transferidos para MultiCalc e curvas padrão calculadas usando ométodo de 4PL pesado. Concentrações de amostras foram calculadas a partirda curva padrão.
Os procedimentos experimentais em vida, análise de plasma eanálise farmacocinética foram idênticas àqueles descritos sob a triagemprimária.
Formulação farmacêutica:
Um composto da invenção pode ser formulado como:
Composto de exemplo 4 6,25 mg/ml
Propilenoglicol 14,0 mg/ml
Fenol 5,5 mg/ml
Tampão Fosfato pH 8,15
Opcionalmente o composto é tratado com calor e/ou base antesde formulação como descrito em PCT/ EP2005/055946.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Novo Nordisk A/S
<120> Compostos GLP-1 acilados
<130> 7140-204-WO
<140> PCT/EP2006/060855<141> 2006-03-20
<150> EP05102171.5<151> 2006-03-18
<160> 43
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 31
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Lys Gly Arg Gly20 25 30
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (1)..(1)
<223> xaa em posição i é L-histidina, imidazopropionil, alfa-hidroxi-histidina, D-histidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, p-hidroxi-histidina,homohistidina, Nalfa-acetil-histidina, Nalfa-formil-histidina, alfa—fluorometil-histidina, alfa-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4- piridilalanina
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2) . . (2)
<223> Xaa em posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Thr, Ser, Lys, Aib,ácido (1-aminociclopropil) carboxilico, ácido (1- aminociclobutil)carboxilico, ácido (1-aminociclopentil) carboxilico, ácido (1-aminociclohexil) carboxilico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxilico, ouácido (1-aminociclooctil) carboxilico.
<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (10)..(10)
<223> Xaa em posição 10 é Vai ou Leu;<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (12)..(12)
<223> Xaa em posição 12 é Ser, Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (13)..(13)
<223> Xaa em posição 13 é Tyr ou Gln<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (14)..(14)
<223> Xaa em posição 14 é Leu ou Met<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (16)..(16)
<223> Xaa em posição 16 é Gly, Glu ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> .(17)..(17)
<223> Xaa em posição 17 é Gln, Glu, Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (19)..(19)
<223> Xaa em posição 19 é Ala ou Vai<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (21)..(21)
<223> Xaa em posição 21 é Glu ou Leu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (24) . . (24)
<223> Xaa em posição 24 é Ala, Glu ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (27)..(27)
<223> Xaa em posição 27 é Vai ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (28)..(28)
<223> Xaa em posição 28 é Lys, Glu, Asn ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (29)..(29)
<223> Xaa em posição 29 é Gly ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (30)..(30)
<223> Xaa em posição 30 é Arg, Gly ou Lys, ou é absent<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (31)..(31)
<223> Xaa em posição 31 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é absent<400> 2
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa15 10 15
Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe lie Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30
<210> 3
<211> 32
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (1)..(1)
<223> xaa em posição i é L-histidina, D-histidina, desamino-histidina,
2-aminohistidina, (3-hidroxi-histidina, homohistidina, Nalfa-acetil-histidina, alf a-f luorome t i 1-hi s t idina , alfa-meti l-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4- piridilalanina
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (2)..(2)
<223> Xaa em posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib, ácido (1aminociclopropil) carboxilico, ácido (1- aminociclobutil) carboxilicoácido (1-aminociclopentil) carboxilico, ácido (1-aminociclohexil)carboxilico, ácido (1-aminocicloheptil) carboxilico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxilico.
<220>
<221> MIS C_CARAC T E R f S TICA
<222> (10)..(10)
<223> Xaa em posição 10 é Vai ou Leu;<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (12) . • (12)
<223> Xaa em posição 12 é Ser, Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (13)..(13)<223> Xaa em posição 13 é Tyr ou Gln<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (14) . . (14)
<223> Xaa em posição 14 é Leu ou Met<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (16)..(16)
<223> Xaa em posição 16 é Gly, Glu ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (17) . . (17)
<223> Xaa em posição 17 é Gln, Glu, Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (19)..(19)
<223> Xaa em posição 19 é Ala ou Vai<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituida<220>
<22Í> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (21)..(21)
<223> Xaa em posição 21 é Glu ou Leu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (24) .. (24)
<223> Xaa em posição 24 é Ala, Glu ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (27) .. (27)
<223> Xaa em posição 27 é Vai ou Lys<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (28) .. (28)
<223> Xaa em posição 28 é Lys, Glu, Asn ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (29)..(29)
<223> Xaa em posição 29 é Gly ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (30)..(30)
<223> Xaa em posição 30 é Arg, Gly ou Lys, ou é absent<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (31)..(31)
<223> Xaa em posição 31 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é absent<220><221> MISC_CARACTERÍSTICA<222> (32)..(32)
<223> Xaa em posição 32 é is Lys, Ser, amide ou é absent<400> 3
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa15 10 15
Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe lie Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30
<210> 4
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 4
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 5
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 5His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 6
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 6
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 7
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) .. (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 7
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 8<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 8
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 9
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE<222> (2) .. (2)<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 10
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 11
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 12
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly<table>table see original document page 92</column></row><table><220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 15
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 16
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 17
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 18
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 18
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 19
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 19
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 20<211> 31<212> PRT<213> artificial<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 20
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 21
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 21
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 22
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) .. (2)
<223> Xaa é aib<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 22
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 23
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> MOD_RES<222> (20).. (20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 23
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 24
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2).. (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 24
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 25
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa em posição 1 é 3-(4-imidazolil)propionil
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 25
Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 26
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 26
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30<210> 27
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituida<400> 27
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly
<210> 28
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituida<400> 28
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly
20
25
30
20
25
30
<210><211><212><213>
2931PRT
artificial<220>
<223> construto sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 29
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Pro20 25 30
<210> 30
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 30
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 31
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa em posição 1 é N-alfa-formil-histidina
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 31
Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 32
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 32
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Glu15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 33
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 33
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 34
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) .. (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> M0D_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 34
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 35
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 35
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 36
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 36
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly1 5 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 37
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<400> 37
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 38
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> VARIANTE
<222> (16)..(16)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<220>
<221> VARIANTE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> VARIANTE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> VARIANTE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa é aib
<400> 38
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Xaa15 10 15
Gln Ala Ala Lys Xaa Phe lie Xaa Trp Leu Vai Arg Xaa Arg Pro20 25 30
<210> 39
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético<220>
<221> VARIANTE
<222> (2).. (2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 39
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 40
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa é aib
<220>
<221> M0D_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<400> 40
His Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu Gly15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 41
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa em posição 1 é N-alfa-formil-histidina<220>
<221> MOD_RES<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituida<400> 41
Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Vai Ser Ser Tyr Leu Glu15 10 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Vai Arg Gly Arg Gly20 25 30
<210> 42
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(D • . (D
Xaa em posição 1 é HIS ou desamino-histidine
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(2) . . (2)
Xaa em posição 2 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys, Aib
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERISTICA(10)..(10)
Xaa em posição 10 é Vai
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(12)..(12)
Xaa em posição 12 é Ser
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(13)..(13)
Xaa em posição 13 é Tyr
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(14) . . (14)
Xaa em posição 14 é Leu
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERÍSTICA(16)..(16)
Xaa em posição 16 é Gly, Glu ou Aib
<220><221><222><223>
MISC_CARACTERISTICA(17) . . (17)
Xaa em posição 17 é Gln ou Glu<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (19)..(19)
<223> Xaa em posição 19 é Ala
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (21)..(21)
<223> Xaa em posição 21 é Glu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (24)..(24)
<223> Xaa em posição 24 é Ala ou Glu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (27)..(27)
<223> Xaa em posição 27 é Vai
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (28)..(28)
<223> Xaa em posição 28 é Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (29)..(29)
<223> Xaa em posição 29 é Gly ou Aib
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (30)..(30)
<223> Xaa em posição 30 é Arg ou Lys
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (31)..(31)
<223> Xaa em posição 31 é Gly, amida ou ausente
<400> 42
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa15 10 15
Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe lie Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30
<210> 43
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> sintético<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (1) .. (1)
<223> Xaa em posição 1 é HIS
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (2) . . (2)
<223> Xaa em posição 2 é Gly ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (10)..(10)
<223> Xaa em posição 10 é Vai
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (12)..(12)
<223> Xaa em posição 12 é Ser
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (13)..(13)
<223> Xaa em posição 13 é Tyr
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (14)..(14)
<223> Xaa em posição 14 é Leu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (16)..(16)
<223> Xaa em posição 16 é Glu ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (17)..(17)
<223> Xaa em posição 17 é Gln
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (19)..(19)
<223> Xaa em posição 19 é Ala
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (20)..(20)
<223> Lys em posição 20 é substituída<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (21)..(21)
<223> Xaa em posição 21 é Glu
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (24)..(24)
<223> Xaa em posição 24 é Ala
<220><221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (27) . . (27)
<223> Xaa em posição 27 é Vai
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (28)..(28)
<223> Xaa em posição 28 é Lys ou Arg<220>
<221> MISC_CARACTERISTICA
<222> (29)..(29)
<223> Xaa em posição 29 é Gly ou Aib<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (30) .. (30)
<223> Xaa em posição 30 é Arg
<220>
<221> MISC_CARACTERÍSTICA
<222> (31)..(31)
<223> Xaa em posição 31 é Gly
<400> 43
Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa15 10 15
Xaa Ala Xaa Lys Xaa Phe lie Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30

Claims (36)

1. Análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de que tem umamodificação de pelo menos um resíduo de aminoácido não proteogênico emposições 7 e/ou 8 em relação à seqüência GLP-1 (7-37) (SEQ ID No 1), que é acilado com uma porção ao resíduo de lisina em posição 26, e onde ditaporção compreende pelo menos dois grupos ácidos, em que um grupo ácido éacoplado terminalmente.
2. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a porção acoplada na posição 26 compreende um ligante hidrofílico.
3. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o ligante hidrofílico compreende pelo menos 5átomos de não hidrogênio onde 30-50% destes não são N nem 0.
4. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a porção acopladana posição 26 compreende uma porção de ligação de albumina separada dopeptídeo pelo ligante hidrofílico.
5. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 4caracterizado pelo fato de que a porção de ligação de albumina é uma porção lipofílica linear ou ramificada contendo 4-40 átomos de carbono tendo umgrupo ácido distai.
6. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a porção acilada éB-U', onde U' é selecionado a partir de<formula>formula see original document page 109</formula>m é O, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,n é 1, 2 ou 3s é 0, 1, 2, ou 3,t é O, 1,2, 3, ou 4p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20,21,22, ou 23;e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de onde Ié 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20
7. Análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de que é umcomposto de fórmula I (SEQ ID No. 2):Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa16-Ser-Xaa18-Xaa19-Xaa20-Glu-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25—N^lJ—Xaa27-Phe-lle-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa.<formula>formula see original document page 111</formula>Fórmula Icaracterizado pelo fato de queXaa7 é L-histidina, imidazopropionil, a-hidroxi-histidina, Dhistidina, desamino-histidina, 2-amino-histidina, (f3-hidroxi-histidina,homohistidina, Na-acetil-histidina, Na-formil-histidina, a fluorometil-histidina, a-metil-histidina, 3-piridilalanina, 2-piridilalanina ou 4-piridilalaninaXaa8 é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Thr, Ser, Lys, Aib, ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1- aminociclobutil) carboxílico, ácido(1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido(1-aminocicloheptil) carboxílico, ou ácido (1-aminociclooctil) carboxílico;Xaaiô é Vai ou Leu;Xaai8 é Ser, Lys ou Arg;Xaai9 é Tyr ou Gln;Xaa2o é Leu ou Met;Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;Xaa23 é Gln, Glu, Lys ou Arg;Xaa25 é Ala ou Vai;Xaa27 é Glu ou Leu;Xaa30 é Ala, Glu ou Arg;Xaa33 é Vai ou Lys;Xaa34 é Lys, Glu, Asn ou Arg;Xaa35 é Gly ou Aib;Xaa36 é Arg, Gly ou Lys, ou é ausente;Xaa37 é Gly, Ala, Glu, Pro, Lys, ou é ausente;e B e U' juntos é a porção acilada, onde U' é selecionado apartir de<formula>formula see original document page 112</formula>m é 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6,n é 1, 2 ou 3s é 0, 1, 2, ou 3,té 0, 1, 2, 3, ou4p é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19,-20,21,22, ou 23;e onde B é um grupo ácido selecionado a partir de<formula>formula see original document page 112</formula>onde I é 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20.
8. Análogo de GLP-1 de acordo com as reivindicações 6-7,caracterizado pelo fato de que U' é selecionado a partir de<formula>formula see original document page 113</formula>mé 2, 3, 4 ou 5,n é 1 ou 2s é 0, 1, ou 2,t é 0, 1, 2, ou 3p é 1,2,3,4, 7, 11 ou23
9. Análogo de GLP-1 de acordo com as reivindicações 6-8,caracterizado pelo fato de que B-U'- é<formula>formula see original document page 114</formula>onde I é 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20;pé 1,2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. sé 0,1 ou 2t é 0 ou 1;m é 2, 3 ou 4.
10. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que onde Ié 14, 15, 16, 17 ou 18p é 1, 2, 3, 4 ou 11;s é 0, 1 ou 2;t é 0 ou 1;
11. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações 6-10, caracterizado pelo fato de que s é 1.
12. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações 6-10 caracterizado pelo fato de que I é 16
13. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações 6-10 caracterizado pelo fato de que p é 3 ou 4.
14. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações 6-10 caracterizado pelo fato de que n é 1.
15. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações 7-14, caracterizado pelo fato de queXaa7, é His ou desamino-histidina;Xaag é Ala, Gly, Vai, Leu, lie, Lys ou Aib;Xaai6 é Vai; Xaai8 é Ser;Xaaiç é Tyr;Xaa2o é Leu;Xaa22 é Gly, Glu ou Aib;Xaa23 é Gln ou Glu;Xaa25 é Ala;Xaa27 é Glu;Xaa3o é Ala ou Glu;Xaa33 é Vai;Xaa34 é Lys ou Arg;Xaa35 é Gly ou Aib;Xaa36 é Arg ou LysXaa37 é Gly, amida ou é ausente;
16. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de queXaa7, é HisXaa8 é Gly, ou Aib;Xaai6 é Vai;Xaai8 é Ser;Xaaiç é Tyr;Xaa2o é Leu;Xaa22 é Glu ou Aib;Xaa23 é Gln; Xaa25éAla;Xaa27 é Glu;Xaa3o é Ala;Xaa33 é Vai;Xaa34 é Lys ou Arg; Xaa35 é Gly ou Aib;Xaa36 é ArgXaa37 é Gly
17. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-15, caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1compreende uma modificação da L-histidina N terminal em posição 7 daseqüência de GLP-1 (7-37).
18. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1 compreendeimidazopropionil7, a-hidroxi-histidina7 ou N-metil-histidina7, D-histidina7, desamino histidina7, 2-amino-histidina7, (3-hidroxi-histidina7, homohistidina7,Na-acetil-histidina7, a-fluorometil-histidina7, a-metil-histidina7, 3-piridilalanina7, 2-piridilalanina7 ou 4- piridilalanina7.
19. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1-18, caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1compreende uma substituição da L-alanina em posição 8 da seqüência deGLP-1(7-37) por outro resíduo de aminoácido.
20. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1 compreende Aib8, Gly8,Val8 , lle8 , Leu8 , Ser8 , Thr8 , ácido (1-aminociclopropil) carboxílico, ácido (1-aminociclobutil) carboxílico, ácido (1-aminociclopentil) carboxílico, ácido (1-aminociclohexil) carboxílico, ácido (1- aminocicloheptil) carboxílico, ouácido (1-aminociclooctil) carboxílico.
21. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1 compreende Aib8;
22. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-1 compreende não mais do que quinze resíduos de aminoácidos queforam trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1(7-3 7)(SEQIDNo. 1).
23. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que não mais do que dez resíduos de aminoácidosque foram trocados, adicionados ou deletados se comparado com GLP-1(7-37) (SEQIDNo. 1).
24. Análogo de GLP-1 de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que dito análogo de GLP-1 compreende não maisdo que seis resíduos de aminoácidos que foram trocados, adicionados oudeletados se comparado com GLPl(7-37) (SEQ ID No. 1).
25. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-1 compreende não mais do que 3 resíduos de aminoácidos que não sãocodificados pelo código genético.
26. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que dito análogo deGLP-1 compreende apenas um resíduo de lisina.
27. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de serAib8,Arg34-G LP-1 (7-37)Aib8'22,Arg34-GLP-l (7-37).Arg34-GLP-1 (7-37).[3-(4- Imidazolil)Propionil7,Arg34]GLP-l -(7-37)peptídeoGly8,Arg34-GLP-l (7-37)Aib8,Arg34, Pro37-GLP-l (7-37)Aib8;22,27;30,35Arg34 ? pro37 _GLp_j (7.37)^^todos os quais são substituídos por B-U' em posição 26.
28. Análogo de GLP-1 de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser selecionado a partirde<formula>formula see original document page 118</formula>N-E26-(17-carboxiheptadecanoil)-[Aib8,Arg34]GLP-l -(7-37)-<formula>formula see original document page 118</formula>peptídeo,<formula>formula see original document page 118</formula>N-s26- (4-{[N-(2-carboxietil)-N-(15-carboxipentadecanoil)amino]metil}benzoil)[Arg34p LP-1 -(7-37),<formula>formula see original document page 119</formula>N-82642-(242-(242-(244-( 17-Carboxiheptadecanoilamino)-4(S)- carboxibutirilamino]etoxi)etoxi]acetilamino)etoxi]etoxi)acetil][Aib8,Arg34]GLP-l-(7- 37)peptídeo,<formula>formula see original document page 119</formula><formula>formula see original document page 120</formula>
29. Método para aumentar o tempo de ação em um paciente deum análogo de GLP-1, caracterizado pelo fato de acilar dito análogo de GLP-1 com uma porção B-U' como descrito em qualquer das reivindicaçõesprecedentes, no resíduo de lisina em posição 26 de dito análogo de GLP-1.
30. Método para aumentar o tempo de ação em um paciente deum análogo de GLP-1 para mais do que cerca de 40 horas, caracterizado pelofato de modificar pelo menos um dos resíduos de aminoácidos em posições 7e 8 de um peptídeo GLP-1 (7-3 7) ou um análogo deste, e acilar dito análogode GLP-1 com uma porção B-U'- como descrito em qualquer dasreivindicações precedentes no resíduo de lisina em posição 26 de dito análogode GLP-1.
31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-28, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-31, caracterizada pelo fato de ser adequada para administração parenteral.
33. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-28 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento.
34. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-28 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento para o tratamento ou prevenção de hiperglicemia, diabete tipo 2,tolerância à glicose prejudicada, diabete tipo 1, obesidade, hipertensão,síndrome X, dislipidemia, distúrbios cognitivos, arteriosclerose, infarto domiocárdio, doença coronária cardíaca e outros distúrbios cardiovasculares, derrame, síndrome de intestino inflamatório, dispepsia e úlceras gástricas.
35. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1-28 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento para atrasar ou prevenir progressão de doença em diabete tipo 2.
36. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1-28 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de ummedicamento para diminuir consumo alimentar, diminuir apoptose de célula(3, aumentar função de célula (3 e massa de célula p, e/ou para restaurarsensibilidade de glicose para células (3.
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Ipc: C07K 14/605 (2006.01), A61K 38/00 (2006.01)

Ipc: C07K 14/605 (2006.01), A61K 38/00 (2006.01)

Free format text: PROCEDIMENTO AUTOMATICO DE RECLASSIFICACAO. AS CLASSIFICACOES IPC ANTERIORES ERAM: C07K 14/605; A61K 38/26; A61K 47/48.

B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
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B16A Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette]

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/05/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. (CO) 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 07/05/2019, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS

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B22O Other matters related to patents and certificates of addition of invention: legal action concerning patent

Free format text: INPI NO 52402.012746/2021-70 ORIGEM: 14A VARA FEDERAL CIVEL DA SJDF (TRF1) PROCESSO NO: 1086937-78.2021.4.01.3400 ACAO DE PROCEDIMENTO COMUM AUTOR: NOVO NORDISK A/S E NOVO NORDISK FARMACEUTICA DO BRASIL LTDA. REU(S): INPI - INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

B22O Other matters related to patents and certificates of addition of invention: legal action concerning patent

Free format text: INPI NO 52402.011018/2025-74 ORIGEM: 7A VARA FEDERAL CIVEL DA SJDF PROCESSO NO: 1031074-98.2025.4.01.3400 SUB JUDICE AUTOR: NOVO NORDISK A/S REU(S): INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL - INPI