BRPI0607774A2 - uso de uma composiÇço, e, composiÇço para uso na estimulaÇço de uma resposta imune contra mpt em um animal - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIÇçO, E, COMPOSIÇçO PARA USO NA ESTIMULAÇçO DE UMA RESPOSTA IMUNE CONTRA MPT EM UM ANIMAL. A invenção fornece composições e método para estimular uma resposta imunológica contra Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MPT). As composições compreendem pelo menos cinco componentes imunogênicos recombinantes. Os componentes imunogênicos podem ser antígenos de MIPT ou polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT, ou combinações destes. Antígenos de MPT usados na invenção incluem MPT 85A, 85B, 85C, 35kDa, e superóxido dismutase (SOD), MptC, MptD e proteína ESAT-6. O método compreende administrar a composição a um animal em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imunológica contra bactérias MPT. O método é benéfico para qualquer animal susceptível à infecção por IVIPT, mas é particularmente benéfico para ruminantes.

Description

"MÉTODO PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE EM UMANIMAL, E, COMPOSIÇÃO PARA USO NA ESTIMULAÇÃO DE UMARESPOSTA IMUNE CONTRA MPT EM UM ANIMAL"

Este pedido reivindica prioridade para pedido de patenteNorte-Americana provisório no. de série 60/653.536, depositado em 16 deFevereiro de 2005, a descrição do qual é incorporada neste lugar em suatotalidade por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere geralmente à estimulação derespostas imunológicas, e mais especificamente a composições e métodospara estimular respostas imunológicas profiláticas ou e terapêuticas contraMycobacterium avium subespécie paratuberculosis.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (MPT) é oagente causador de doença de Johne (JD), que causa enterite granulomatosacrônica em ruminantes. Animais clinicamente afetados desenvolvem diarréiacrônica e perda de peso progressiva que eventualmente resulta em morte,enquanto animais subclinicamente infectados têm principalmente produção deleite diminuída. JD é de tremenda importância econômica para a indústria delaticínios no mundo inteiro, causando grandes perdas devido à produçãoreduzida e seleção precoce de animais com estimativas de 20% de rebanhosleiteiros norte-americanos afetados e custos de $220 milhões por ano para aindústria de laticínios (Wells, et al. 2000. J. Am. Vet. Med. Assoc.216:1450-1457). Gados são mais susceptíveis a infecção com este organismo dentro dosprimeiros 6 meses de vida, mas doença tipicamente não se torna evidente até3 a 5 anos de idade. Infecção ocorre por ingestão de estéreo, colostro, ou leitecontaminado de vacas infectadas (Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. FoodAnim. Pract. 12:305-312). Infecção fetal também ocorre, particularmente emvacas prenhes com doença avançada (Sweeney, et al. 1992. Am. J. Vet. Res.53:477-480). Embora JD seja uma doença infecciosa importante deruminantes, não existe vacina eficaz contra esta doença. A única vacinaatualmente disponível nos Estados Unidos consiste de M. avium subsp.paratuberculosis morta em um adjuvante oleoso (Kormendy, B. 1992. ActaVet. Hung. 40:171-184; Larsen, et l.,1978. Am. J. Vet. Res. 39:65-69).Entretanto, tais programas de vacinação levantaram sérias preocupações comsaúde pública. Por exemplo, pelo menos um veterinário foi acidentalmenteinoculado na mão durante vacinação de animais (Patterson, et al., (1988) J.Am. Vet. Med. Assoc. 192:1197-1199). Ademais, estudos demonstraram que existe uma forte reação nos sítios de injeção depois de vacinação com estasbactérias mortas (Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40:171-184; Larsen,et l.,1978. Am. J. Vet. Res. 39:65-69). Outra desvantagem desta vacina é queos animais vacinados se tornam positivos em teste de pele de tuberculina(Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40:171-184; Larsen, et l.,1978. Am. J. Vet. Res. 39:65-69). Assim, existe uma necessidade do desenvolvimento devacinas mais eficazes contra JD que podem ser usadas como composiçõesprofíláticas e/ou terapêuticas seguras e eficazes para infecção por MPT.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos para estimular uma resposta imunológica em animais contra MPT. As composiçõescompreendem componentes imunogênicos que podem ser antígenos de MPTou polinucleotídeos codificando para antígenos de MPT, ou combinaçõesdestes. Em uma forma de realização, as composições compreendem pelomenos cinco componentes imunogênicos recombinantes. Antígenos de MPT exemplares incluem MPT 85A, 85B, 85C, 35kDa, superóxido dismutase(SOD), MptC, MptD e proteína tipo ESAT-6.

O método compreende administrar a composição a um animalem uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imunológica contrabactérias MPT. O método é benéfico para qualquer animal susceptível àinfecção por MPT, mas é particularmente benéfico para ruminantes.

Composições compreendendo antígenos de proteína de MPT recombinantes, polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT, ou combinações destes podem ser formulados com carreadores farmacêuticos padrão e podem ser administrados através de qualquer das diversas vias convencionais. As composições podem ser administradas a qualquer momento a um animal susceptível a contrair infecção por MPT ou um animal que é infectado com MPT. Entretanto, é preferível administrar as composições da invenção antes de infecção por MPT, tal como por administração a animais prenhes que podem transferir componentes imunológicos profiláticos para seus recém-nascidos através de colostro, ou por administração durante o período de uma a cinco semanas depois de nascimento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS ILUSTRAÇÕES

Fig. 1 é uma representação gráfica de dados de análise derespostas proliferativas de células mononucleares de sangue periférico de vacas infectadas e saudáveis controle estimuladas in vitro com 5 proteínas recombinantes de MPT. Os resultados são expressos como um índice de estimulação e as barras de erro representam desvio padrão da média.

Nenhuma proliferação significante foi observada para qualquer antígeno por PBMCS de vacas não infectadas (P>0,05). 85A e a proteína de 35-kDa mostraram atividade mais proliferativa em excretores fracos e médios, respectivamente.

Fig. 2. é uma representação gráfica de dados de análise de produção de interferon-y em resposta a antígenos individuais em relação a níveis de excreção de MPT. Os resultados são dados como valores de O.D. em poços estimulados - valores de O.D. em poços controle (IFN-y produzido naturalmente).Barras de erro representam desvios padrões das médias. 85A e 85B foram antígenos mais induzíveis a produzir IFN-y em célulasmononucleares de sangue periférico bovino de ambos excretores.

Fig. 3. é uma representação gráfica de dados de análise de respostas de anticorpo a antígenos individuais em relação a níveis de excreção de MPT. Barras representam os valores médios de O.D. em 405 nm. Barras de erro representam desvios padrões das médias. Todos os antígenos recombinantes mostraram aumentos de respostas de anticorpo de acordo com níveis de excreção e respostas de anticorpo para a proteína de 35-kDa foram positivamente separadas entre vacas saudáveis não infectadas e ambos excretores (P<0,01).

Figs. 4A-4D são representações gráficas de dados de análise de mudanças em distribuição de subconjunto de célula T em linfócitos de sangue periférico bovino depois de estimulação com antígenos recombinantes, como determinado por análise FACS. Fig. 4A. CD4; Ag 85A e Ag 85B induziram uma maior proporção de linfócitos T CD4+ em excretores médios comparado com excretores fracos enquanto a porcentagem de linfócitos CD4+ não foi modificada em gado controle não infectado. Fig. 4B. CD8; Ag 85A aumentou a proporção de linfócitos T CD8+ em excretores médios, enquanto a porcentagem aumentada de linfócitos CD8+ foi muito baixa em gado não infectado. Fig. 4C. CD25; Ag 85A e Ag85B aumentaram a proporção de células T CD25+ em ambos os grupos de excretores enquanto eles tiveram pouco efeito em gado não infectado. Em contraste, Ag 85C e a proteína de 35-kDa aumentaram significantemente a proporção de células T CD25+ apenas nos excretores médios (P<0,05). Fig. 4D. Células T ye+; todos os antígenos resultaram em aumentos significantemente menores em todos os subconjuntos celulares tanto nos grupos excretores fracos como médios exceto SOD para células T yz+ em excretores médios.

Fig. 5 é uma representação gráfica de dados de análise de mudanças diferenciais de linfócitos T CD3+ em resposta a estimulação com proteínas recombinantes e dois controles (ConA e PPD). Dados são expressoscomo a média de células marcando positivo para CD3 (erro padrão 1 da média) em resposta a cada antígeno recombinante em relação ao nível de excreção.

Fig. 6 é uma representação gráfica de dados de análise de subconjuntos aumentos de linfócito B CD21+ em linfócitos de sangue periférico bovino depois de estimulação com antígenos recombinantes, como determinado por análise FACS. Os resultados são relatados como o aumento percentual médio em células marcando positivo e as barras de erro representam erro padrão 1 da média (SEM). Proteína de 35-kDa recombinante induziu o maior aumento em linfócitos B CD21+ em excretores médios. Nenhum aumento significante na proporção de linfócitos B foi observado em resposta aos outros antígenos independente de níveis de excreção bacteriana (P>0,05).

Fig. 7. é uma representação gráfica de dados de análise de perfis de IL-2 de PBMCs bovinos de gado não infectado, excretores fracos e médios depois de estimulação com antígenos recombinantes por 24 hrs. Resultados representam os aumentos de vezes médios de IL-4 sobre PBMCs não estimulados, que serviram como calibradores. Ags 85 A e B estimularam mais fortemente excretores médios enquanto a proteína de 35 kDa e SOD tiveram efeitos menores (p < 0,05).

Figs. 8A-8C são representações gráficas de dados de análise de comparação de perfis de mRNA de citocina para IFN-y (Fig. 8A), IL-12p40 (Fig. 8B) e TNF-a (Fig. 8C) de PBMCs bovinos de gado não infectado, excretores fracos e médios depois de estimulação com antígenos recombinantes por 24 hrs. Resultados representam o aumento de vezes médio sobre PBMCs não estimulados, que serviram como calibradores. Os resultados são similares com Ags 85 A e B estimulando mais fortemente excretores médios enquanto a proteína de 35 kDa e SOD tiveram efeitos menores.Fig. 9. é uma representação gráfica de dados de análise de perfis de mRNA de IL-4 de PBMCs bovinos de gado não infectado, excretores fracos e médios depois de estimulação com antígenos recombinantes por 24 hrs. Resultados representam os aumentos de vezes médios de IL-4 sobre PBMCs não estimulados, que serviram como calibradores. A proteína de 35-kDa estimulou fortemente expressão de mRNA de IL-4 em ambos excretores fracos e médios.

Fig. 10 é uma representação gráfica de recuperação bacteriana a partir de baço e fígado depois de administração das construções de DNA e controles indicados e subseqüente desafio com MPT.

Fig. 11 é uma representação gráfica do número médio de granulomas em baço e fígado depois de administração das construções de DNA e controles indicados e subseqüente desafio com MPT.

Figs. 12A e 12B são representações fotográficas de coloração de Ziehl-Neelsen de tecidos revelando numerosos bacilos álcool-ácido resistentes (Fig. 12A). Em contraste, a infecção foi muito menos severa nos camundongos vacinados com as construções de DNA de MPT codificando todos os cinco antígenos (Fig. 12B). DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece composições e métodos para estimular uma resposta imunológica contra MPT em um animal. As composições compreendem polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT, antígenos de MPT, ou combinações destes. Em uma forma de realização, pelo menos cinco componentes imunogênicos são selecionados a partir de antígenos de MPT recombinantes e polinucleotídeos de DNA. O método compreende administrar a composição a um animal em uma quantidade eficaz para estimular uma resposta imunológica contra bactérias MPT.

Como usado neste lugar, um "componente imunológico" é umcomponente da composição que pode diretamente ou indiretamente estimular uma resposta imunológica. Por conseguinte, quando introduzido em um animal, vetores de expressão compreendendo polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT entram nas células do animal e expressam antígenos de MPT. Os antígenos de MPT expressos um por um estimulam uma resposta imunológica. Assim, um polinucleotídeo de DNA codificando um antígeno de MPT é considerado um componente imunogênico que indiretamente estimula uma resposta imunológica. Em respeito de um antígeno de proteína de MPT administrado, uma vez que o antígeno é reconhecido diretamente pelo sistema imune, o antígeno é considerado um componente imunogênico que diretamente estimula uma resposta imunológica.

O método pode fornecer benefício a qualquer animal susceptível a infecção por MPT, onde infecção é considerada significando colonização da mucosa intestinal do animal por MPT. Entretanto, as composições e método são particularmente bem apropriados para profilaxia ou terapia para infecção por MPT de ruminantes, incluindo mas não limitados a gado, ovelha, cabras, veado e alce, antílope, e búfalo.

Assim, as composições podem ser administradas a qualquer animal infectado ou não infectado por MPT. Administração das composições a animais infectados de acordo com o método da invenção é considerada estimulando uma resposta imunológica terapêutica. Entretanto, é preferível administrar as composições antes de infecção por MPT para estimular uma resposta profilática. Por exemplo, as composições podem ser administração a um animal prenhe que pode transferir componentes imunológicos profiláticos aos seus recém-nascidos não infectados através de colostro. Alternativamente, as composições podem ser administradas durante o período de uma a cinco semanas depois de nascimento para fornecer um efeito profilático que pode prevenir infecção ou reduzir a severidade de doença se infecção ocorre.Assim, em uma forma de realização, o método da invenção é profilático para infecção por MPT, enquanto em outra forma de realização, o método é terapêutico para infecção por MPT. O método também pode ser usado para profilaxia ou terapia de doença de Johne.

Antígenos de MPT apropriados para uso na invenção incluem mas não são limitados a proteínas de MPT 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD e proteína tipo ESAT-6. Antígenos de proteína de MPT recombinantes podem ser obtidos para uso na invenção por técnicas conhecidas por aqueles versados na técnica, tal como por métodos de clonagem recombinante convencionais. Procedimentos de clonagem de DNA apropriados e métodos para expressar e purificar proteínas recombinantes são conhecidos. (Veja, por exemplo, Sambrook et al.. 2001, Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, NY). Em geral, para obter antígenos de proteína de MPT recombinantes, DNA genômico de MPT pode ser obtido a partir de uma cultura de MPT de acordo com métodos padrão, tal como pelo bem conhecido procedimento de lise alcalina.

O DNA codificando os antígenos pode ser amplificado, tal como pela reação em cadeia da polimerase, a partir do DNA genômico e os produtos de amplificação podem ser clonados individualmente ou em várias combinações em um ou mais vetores de expressão apropriados. Células hospedeiras apropriadas podem ser transfectadas com o vetor de expressão e as células transfectadas podem ser cultivadas sob condições apropriadas para expressão dos antígenos. Os antígenos podem ser subseqüentemente extraídos e purificados da cultura de acordo com técnicas padrão.

Para administração a animais, antígenos de MPT recombinantes apropriadamente purificados podem ser combinados com carreadores farmacêuticos padrão. Carreadores farmacêuticos aceitáveis para uso com proteínas são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Edition, A. R. Gennaro et al. Eds., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990). Ademais, os antígenos podem ser fornecidos em formulações lipossomais ou microssomais convencionais.

Composições compreendendo os antígenos de MPT para uso para estimular uma resposta imunológica podem ser administradas por qualquer via aceitável. Vias apropriadas de administração incluem oral, mucosal e parenteral (por exemplo, injeção intravascular, intramuscular, e subcutânea). Aqueles versados na técnica irão reconhecer que a quantidade de antígenos administrada a um animal particular irá depender de diversos fatores tal como a via de administração, e o tamanho, condição física e o estado de MPT do animal. As quantidades relativas de cada antígeno em uma formulação podem ser ajustadas de acordo com parâmetros conhecidos, tal como para fornecer equivalentes molares ou outras proporções dos antígenos. Ademais, as composições podem ser usadas em uma administração única ou em uma série de administrações para estimular a resposta imunológica aos antígenos de MPT. Em geral, uma dosagem total de entre 10-200 ug de proteína pode ser administrada. Quando DNA codificando antígenos de MPT é administrado, em geral, entre 30-500 ug de DNA podem ser administrados.

Em uma forma de realização, o método da invenção compreende administração de uma composição compreendendo pelo menos cinco antígenos de MPT recombinantes. Por exemplo, antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, antígeno de 35 kDa e superóxido dismutase (SOD) podem ser administrados em uma formulação única. 85A, 85B e 85C são proteínas de ligação a fibronectina; as proteínas 35 Kda e SOD são proteínas de superfície exterior. A seqüência de DNA codificando o gene 85A de MTP e a seqüência de aminoácidos do gene 85A, é fornecida em no. de acesso de GenBank AF280067 (entrada em 10 de Outubro de 2003). A seqüência de DNA codificando o gene 85B de MTP e a seqüência de aminoácidos do gene 85A é fornecida em no. de acesso de GenBank AF219121 85B gene (entrada em 21de Novembro de 2002). A seqüência de DNA codificando o gene 85C de MTP e a seqüência de aminoácidos do gene 85C é fornecida em no. de acesso de GenBank AF280068 (entrada em 21 de Novembro de 2002). A seqüência de DNA codificando o gene SOD de MTP e a seqüência de aminoácidos do gene SOD é fornecida em no. de acesso de GenBank AF180816 (entrada em 30 de Novembro de 2001). A seqüência de DNA codificando a proteína de 35 kDa é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:l. A seqüência de aminoácidos da proteína de 35 kDa é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:2. MPT adicionais incluem MptC, MptD e proteína tipo ESAT-6. A seqüência de DNA codificando a proteína MptC é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:3. A seqüência de aminoácidos da proteína MptC é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:4. A seqüência de DNA codificando da proteína tipo ESAT-6 é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:5. A seqüência de aminoácidos da proteína tipo ESAT-6 é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:6. A seqüência de DNA codificando a seqüência de MptD é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:7. A seqüência de DNA codificando a seqüência de aminoácidos de MptD é fornecida neste lugar como SEQ ID NO:8.

As seqüências de DNA de iniciadores usados para amplificar DNA codificando os antígenos de MPT usados neste lugar a partir de DNA genômico de MPT DNA são fornecidas em Tabela 1.

Tabela 1.

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Em outra forma de realização, composições compreendendo polinucleotídeos de DNA que codificam cinco ou mais antígenos de MPT podem ser preparadas. Seqüências codificando antígeno de MPT podem ser obtidas por amplificação de DNA genômico de MPT usando iniciadores apropriados e inserindo os produtos de amplificação em vetores de expressão da mesma maneira que descrito para preparação de proteínas de antígenos recombinantes.

Vetores de expressão apropriados contêm sinais eucarióticos apropriados de transcrição e tradução, e podem conter elementos adicionais, tal como sinais de poliadenilação e/ou de tráfego de proteína. Um exemplo de um vetor de expressão apropriado é pVR1020 (disponível a partir de Vical, Inc., San Diego, Calif.), que contém um promotor de citomegalovírus imediato-precoce para promover expressão eficiente em um hospedeiro eucariótico, assim como um sinal de secreção ativador de plasminogênio para facilitar secreção dos antígenos das células do hospedeiro eucariótico.

Será reconhecido por aqueles versados na técnica que um ou mais vetores de expressão distintos, como distinguidos um do outro pelos antígenos de APT que eles codificam e/ou por seus elementos reguladores ou outros, tal como sítios de policlonagem, serão usados no presente método.

Assim, um único vetor de expressão codificando pelo menos cinco antígenosde MPT, ou pelo menos cinco vetores de expressão codificando cada um diferente antígeno de MPT, ou combinações de vetores de expressão codificando cada pelo menos um antígeno de MPT, podem ser usados no presente método para entregar polinucleotídeos codificando pelo menos cinco antígenos de MPT.

Em uma forma de realização, seqüências de polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, SOD, MptC, MptD, 35kDa, e proteínas tipo ESAT6 podem ser fornecidas em vetores de expressão separados que podem ser usados para expressão e purificação de proteína e para administração em várias combinações a animais para estimular uma resposta imune.

Os vetores de expressão codificando os antígenos de MPT podem ser formulados em qualquer preparação farmaceuticamente eficaz para administração aos animais. Tais formulações podem ser, por exemplo, uma solução salina tal como salina tamponada com fosfato (PBS). É preferido utilizar formulações farmaceuticamente aceitáveis que também fornecem estabilidade a longo prazo do DNA. Assim, é preferível remover e/ou quelação de íons metálicos traço dos tampões de formulação ou de frascos e tampas nos quais o DNA é armazenado para estabilizar e proteger o DNA durante armazenamento. Em adição, inclusão de necrófagos de radical livre não redutor, tal como etanol ou glicerol, é útil para prevenir dano do DNA a partir de produção de radical livre que ainda pode ocorrer, mesmo em soluções aparentemente desmetalizadas. Ademais, o DNA pode ser fornecido em formulações lipossomais ou microssomais convencionais.

Não existe limitação para a via que os polinucleotídeos de DNA da invenção podem ser distribuídos, contanto que sua distribuição estimule uma resposta imunologica contra MPT nos animais receptores. Por conseguinte, os polinucleotídeos de DNA da presente invenção podem ser administrados ao animal por qualquer meio conhecido na técnica, tal comovias enterais e parenterais. Estas vias de distribuição incluem mas não são limitadas a injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, e distribuição oral. Uma via preferida é intramuscular.

Em outra forma de realização, a composição da invenção compreende pelo menos cinco componentes imunogênicos que são fornecidos como uma combinação de antígenos de proteína de MPT e polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT. Tais composições podem ser obtidas combinando os antígenos de MPT recombinantes descritos neste lugar e os polinucleotídeos codificando proteínas de MPT descritos neste lugar. Neste contexto, as seqüências de polinucleotídeos podem estar presentes em um ou mais vetores de expressão e os antígenos de MPT podem ser fornecidos como proteínas recombinantes. Composições compreendendo antígenos de MPT recombinantes e polinucleotídeos codificando antígenos de MPT podem ser combinadas com carreadores farmacêuticos convencionais e administradas como descrito neste lugar e/ou de acordo com técnicas padrão. Preparações lipossomais ou microssomais convencionais dos antígenos de MPT recombinantes e polinucleotídeos codificando antígenos de MPT podem ser fornecidas. Ademais, e como será reconhecido por aqueles versados na técnica, quer ou não as composições compreendam apenas antígenos recombinantes como os componentes imunogênicos, apenas polinucleotídeos de DNA como os componentes imunogênicos, ou combinações de antígenos recombinantes e polinucleotídeos de DNA codificando os antígenos recombinantes como os componentes imunogênicos, as composições da invenção podem compreender adicionalmente um adjuvante apropriado.

Assim, e sem pretender se ater a qualquer teoria particular, acredita-se que administração dos antígenos de MPT recombinantes, polinucleotídeos codificando antígenos recombinantes, e/ou combinações destes de acordo com o método da invenção estimule uma resposta imunológica que pode ser profilática ou terapêutica com respeito à infecçãopor MPT.

Os exemplos seguintes descrevem as várias formas de realização desta invenção. Estes exemplos são ilustrativos e não são pretendidos para serem restritivos.

Exemplo 1

Este exemplo fornece uma comparação de efeitos de linfoproliferação distintos em resposta a estimulação com antígenos individuais.

Para examinar respostas linfoproliferativas, cinco antígenos de MPT recombinantes, 85A, 85B, 85C, antígeno de 35 kDa e superóxido dismutase (SOD), foram analisados para sua capacidade de obter respostas proliferativas em PBMCs obtidos de vacas com diferentes níveis de excreção de MPT. Para isto e outros Exemplos como indicado neste lugar, um total de 38 vacas Holstein, de 2 a 3 anos de idade, foram divididas em 3 grupos. Controles sadios (n=18) foram negativos para infecção por MPT como determinado por cultura fecal negativa e teste de PCR IS900 negativo. Os controles sadios vieram de uma fazenda que foi negativa para cultura fecal e PCR IS900 pelos últimos dez anos. Animais positivos foram subdivididos em excretores fracos (n=16) e excretores médios baseado no número de unidades formadoras de colônia (CFU)/grama de fezes (n=4). Excretores fracos são considerados animais com 1-30 CFU/grama de fezes. Excretores médios são considerados animais com entre 31-300 CFU/grama de fezes. Excretores fortes (>300 CFU/gm de fezes) foram indisponíveis uma vez que eles são selecionados imediatamente das fazendas uma vez que eles são identificados. Teste de culturas fecais e PCR IS900 para determinar estado de infecção por MPT foram realizados como previamente descrito (Shin et al, (2004) J. Vet. Diagn. Invest. 16:116-120).

Para uso em ensaios de linfoproliferação, antígenos recombinantes 85A, 85B, 85C, antígeno de 35 kDa e SOD foram clonados eexpressos usando técnicas padrão e como previamente descrito. (Dheenadhayalan et al., (2002) DNA Seq. 13:287-294; Shin et al., (2004) J. Vet. Sei. 5:111-117) e purificados como previamente descrito (Skeikyet al., (1998) J. Immunol. 161:6171-6179). Os antígenos usados nestes Exemplos tiveram endotoxina (10 pg/ml) negligível em um ensaio de amebócito Limulus.

Para isolamento e cultura de células mononucleares de sangue periférico bovino, sangue periférico (20 ml) de todas as vacas foi coletado da veia caudal com tubos a vácuo heparinizados. Isolamento de linfócitos de sangue heparinizado foi realizado por centrifugação diferencial usando Histopaque 1.077 (Sigma). Vinte ml de sangue total heparinizado foi superposto sobre 15 ml de Histopaque em um tubo de polipropileno estéril de 50-ml (Falcon) e então centrifugados a 1000 X g por 30 min em temperatura ambiente. A camada de plasma foi descartada e a camada de célula mononuclear foi cuidadosamente coletada e lavada três vezes com salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2). Células sangüíneas vermelhas contaminantes foram Usadas com 0,87% de tampão amônio KC1 invertendo por 2min em temperatura ambiente, então adicionando imediatamente 30 ml PBS.

Os grânulos celulares lavados foram suspensos em PBS e contados usando um hemacitômetro e azul tripano para determinar viabilidade percentual. Contagens celulares diferenciais consistentemente mostraram mais do que 96 % de linfócitos, 1 % de monócitos e menos do que 3 % de granulócitos na suspensão celular.

Os linfócitos foram ressuspensos a 2 X 106/ml em RPMI 1640 contendo 10 % deFCS livre de endotoxina (Cellect Gold; ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA), 2 mM de Lglutamina, 10 mM de HEPES, 100 IU/ml de Penicilina, 100 ug/mL de estreptomicina e 50 ug/mL de gentamicina (Sigma) e 250ul foram adicionados ou a placas de fundo redondo ou placasde fundo plano de 96 poços, dependendo dos propósitos do experimento.

Para investigar proliferação de linfócito em resposta a osantígenos individuais, um ensaio de blastogênese foi realizado.Resumidamente, PBMCs foram inicialmente incubados em uma microplacade fundo plano de 96 poços por 3 dias a 37C em uma atmosfera umidificadacom 5% de C02. Culturas foram então estimuladas com Con A (10 (ig/mL),derivado de proteína purificado (PPD) (cada controle positivo) (10 ug/mL) oucada proteína recombinante purificada (10 (ig/mL) e 40 ul (1,0 uCi) de metil-3H-timidina (PerkinElmer Life Science Inc, MA, USA) em meio de culturaforam adicionados a cada poço. As células foram incubadas por um adicionalde 18h nas mesmas condições, e as células foram então coletadas usando umcoletor celular semi-automático (Skatronas Liter Norway). Atividadeblastogênica foi registrada como contagens por minuto (cpm) deradioatividade baseada em contagem de cintilação líquida. Resultados foramexpressos como índices de estimulação (SI) calculados como segue:

SI (índice de (CPM de cultura positiva estimulada de antígeno) - (CPM de fundo) estimulação)= (CPM de cultura controle ou Negativa) - (CPM de fundo)

Para este e outros Exemplos neste lugar, análise estatística dedados foi realizada em Excel e pacote de aplicativo computacional GraPadPrism versão 2.0. Diferenças entre grupos individuais, antígenos e expressãogênica de citocina foram analisadas com o teste t de Student. Diferençasforam consideradas significantes se valores de probabilidade de P<0,05 foramobtidos.

Como demonstrado em Fig. 1, atividades proliferativas de PBMCs bovinos de vacas excretoras médias foram maiores do que outros grupos em resposta a todas as proteínas recombinantes e dois controles positivos (P<0,05) embora tenha havido variação entre vacas individuais. PBMCs de vacas excretoras médias tratadas com antígenos 85A, 85B e a proteína de 35-kDa demonstraram um índice de estimulação (SI) significantemente maior (P <0,005) do que aquele de PBMCs tratados comoutros antígenos recombinantes. Em adição, respostas proliferativas à proteína de 35kDa em excretores fracos foram ainda maiores do que aquelas de excretores médios em resposta a 85C e SOD (Fig. 1). Assim, este Exemplo indica que os antígenos 85A, 85B e a proteína de 35-kDa podem ser importantes para afetar proliferação de linfócito em animais previamente expostos a MPT.

Exemplo 2

Este Exemplo demonstra os efeitos de antígenos recombinantes em produção de IFN-y. Para analisar produção de IFN-y, níveis de IFN-y foram medidos em sobrenadantes de cultura usando um kit comercial específico para IFN-y bovino seguindo as instruções do fabricante (Biosource Int. Camarillo, CA). As placas foram lidas em 450 nm em um leitor de ELISA Bio-Tek 312E (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT 05404-0998), usando qualquer filtro de referência de 630 nm a 750 nm. Osresultados foram calculados baseados em comparação de densidade opcional (0.D) de controle negativo e positivo. Resultados foram determinados como ou negativos (<0D de controle positivo) ou positivos (> OD de controle positivo) em relação ao valor de corte de acordo com as instruções do fabricante.

Produção de IFN-y depois de estimulação com os cincoantígenos recombinantes ou dois controles positivos foi medida em PBMCs de vacas infectadas e não infectadas controle. Os resultados são apresentados em Fig. 2 como valores de OD corrigidos (OD de antígeno estimulado menos OD de controle) representando a elevação de produção de IFN-y pelos vários antígenos.

Como pode ser visto a partir de Fig. 2, todos os antígenos recombinantes testados induziram liberação significante de IFN-y em culturas de PBMCs bovinos de gado infectado comparado com controles não infectados (P < 0,05), e níveis de IFN-g foram consistentemente maiores emexcretores médios do que em excretores fracos (P < 0,05). Os antígenos recombinantes 85A e 85B induziram níveis significantemente maiores de IFN-y nos excretores fracos do que os outros antígenos recombinantes testados e se comparado com os dois controles positivos (P< 0,05). Assim, este Exemplo indica que os antígenos recombinantes 85A e 85B podem ser importantes para estimular uma resposta mediada por célula contra MPT.

Exemplo 3

Este exemplo fornece uma comparação de anticorpos em soros isolados de vacas não infectadas e infectadas que reconhecem os antígenos recombinantes da invenção.

Ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA) foram realizados para avaliar a sororeatividade dos antígenos recombinantes seguindo etapas como previamente descrito (Shin, et al., (2004) J. Vet. Sei. 5:111-117). Resumidamente, um ELISA indireto foi otimizado usando 2,5, 5 ou 10 ug/mL de cada antígeno e soro diluído 1:100 por titulação em tabuleiro. Placas de 96 poços de fundo plano (Maxisorp, Nunc, Denmark) foram revertidas com 100 uL de cada antígeno em tampão carbonato-bicarbonato (14,2 mM de Na2C03, 34,9 mM de NaHC03, 3,1 mM de NaN3, pH 9,5) a 4°C durante a noite, seguido por lavagem três vezes com PBS contendo 0,05 % de Tween 20 (PBST, tampão de lavagem) usando um lavor de placa de micropoços Bio-Tek ELx405 (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT). Sítios não revestidos nos poços foram bloqueados com 5% de leite desnatado em PBST a 37 °C por 1 h. As placas foram lavadas duas vezes com PBST e 100 uL de IgG anti-bovino-HRP conjugados (Sigma) otimamente diluídos (1:25.000) foram adicionados a todos os poços e incubados a 37 °C por 1 h. As placas foram lavadas três vezes em PBST e 200 uL de 2- 2'-Azino-Bis-Tiazolina-6-Ácido sulfônico (Sigma) foram adicionados a cada poço. As placas foram incubadas a 37°C no escuro. Depois de incubação de 30min, solução de parada (1M de HC1) foi adicionada e as placas foram lidas 3 vezesem 405 nm em intervalos de 2 minutos em um leitor de ELISA Bio-Tek 312 (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT 05404-0998). Soros positivos e negativos e controles de antígeno e anticorpo foram incluídos em cada placa.

Os resultados de medir níveis de anticorpos IgG para os antígenos recombinantes em soros tanto de grupos excretores como controles sadios são representados em Fig. 3. Embora tenha havido uma ampla variação em teor de anticorpo em soros de vacas individuais, as respostas de anticorpo IgG médias contra todos os antígenos recombinantes aumentou significantemente tanto nos grupos excretores fracos como médios. Nenhuma diferença significante foi observada entre os níveis médios de anticorpo do grupo excretor fraco para qualquer dos antígenos testados (Fig. 3). Visivelmente, respostas de anticorpo para a proteína de 35-kDa foram significantemente maiores no grupo excretor médio do que aquelas para os outros antígenos (P<0,05), o que pode ser importante pois a proteína de 35-kDa também é eficaz para estimular proliferação de linfócito, e assim pode estimular tanto repostas imunes mediadas por célula como humorais.

Exemplo 4

Este Exemplo demonstra mudanças em distribuição de subconjunto de linfócito em PBMCs obtidos a partir de vacas não infectadas, excretoras fracas e excretoras médias em resposta a estimulação com os antígenos recombinantes.

Para realizar esta análise, uma análise citométrica de fluxo de cor única foi realizada com anticorpos monoclonais contra marcadores de linfócito bovino (Tabela 2). Resumidamente, células foram lavadas três vezes em tampão FACS, incubadas com o primeiro

_Tabela 2._

<table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table>

anticorpo (Tabela 1) por 30min a 4 C, lavadas três vezes, subseqüentementeincubadas com um anticorpo imunoglobulina anti-camundongo de cavalomarcado com fluoresceína isotiocianato (Vetor) por 30 min a 4C, lavadasduas vezes, e coletadas em 200 ul de tampão fixador FACS antes de análise.

Análise foi feita em um citômetro de fluxo (FACSCalibur; Becton Dickson).

Uma barreira elétrica de espalhamento direto-espalhamento lateral foi usadapara medir 5.000 a 10.000 linfócitos por amostra. Baseado nos dados defluorescência dos linfócitos, os resultados foram expressos como aporcentagem de células com coloração positiva em relação a uma amostra colorida com um anticorpo controle de isotipo irrelevante.

Como representado em Figs. 4A-4D, subconjuntos de célula T e/ou célula B estimulados por antígeno foram examinados por citômetro de fluxo de única cor para diferenças na porcentagem de subconjuntos de linfócitos CD4+, CD8+, CD3+ (CD3+ é representado em Fig. 5), CD21+ e CD25+, assim como células T em culturas de PBMC tanto de grupos excretores como controles sadios depois de estimulação com cada antígeno recombinante (Figs. 4 e 5). Todos os subconjuntos de linfócitos investigados neste estudo aumentaram mas, dependendo de níveis de excreção bacteriana, houve suaves diferenças (P<0,05) entre gado não infectado e excretores fracos de acordo com antígenos recombinantes.

CD3 é um marcador de célula T global que é expresso por células CD4+ e CD8+ assim como células T ya+. A proporção de células TCD25+ aumentou em cultura independente do antígeno recombinante usado (P < 0,05) (Fig. 4C). Estes resultados sugerem que todos os antígenos usados neste estudo são capazes de estimular células T sensibilizadas.

Embora todos os antígenos recombinantes testados tenham aumentado a proporção de células CD4+ em culturas de PBMCs bovinos de gado infectado comparado com controles não infectados (P < 0,05), 85A e 85B aumentaram a proporção de células T CD4+ para níveis significantemente maiores do que 85C, a proteína de 35-kDa, e SOD (P < 0,05) (Fig. 4A). A proporção de células T CD4+ também foi maior em culturas tratadas com 85A e 85B entre PBMCs de excretores médios do que de excretores fracos (P < 0,05) (Fig. 4A). Ademias, 85A e 85B não aumentaram células T CD4+ em gado não infectado. Embora não pretendendo se ater a qualquer teoria particular, estes resultados podem indicar que antígenos 85A e 85B induzem células T CD4+ especificamente sensibilizadas por MTP e fornecem imunidade protetora contra infecção por MTP mantendo populações circulantes de célula T CD4+ na fase infecciosa precoce, isto é, no momento em que colonização da mucosa por MPT está ocorrendo primeiro.

Em contraste ao aumento de células CD4+ induzido por todos os antígenos em relação a controles não infectados, um aumento significante na proporção de células T CD8+ foi encontrado apenas em culturas tratadas com 85A, 85B, e 85C e a proporção de células CD8+ também foi maior em culturas tratadas com 85A e 85B entre PBMCs de excretores médios do que de excretores fracos (P < 0,05) (Fig. 4B). Assim, estes antígenos podem preferencialmente estimular respostas mediadas por célula.

Apenas SOD foi capaz de aumentar significantemente a proporção de células T yc+ nas culturas de excretores médios (P < 0,05) (Fig. 4D). Entretanto, SOD estimulou linfócitos em um grau menor do que os outros antígenos testados, exceto para linfócitos T yc+, pois o número de células T ja+ foi significantemente maior em culturas de PBMC tratadas comSOD em gado não infectado, assim como em ambos grupos excretores (Fig. 4D). Assim, SOD pode preferencialmente estimular linfócitos T ya+ comparado com os outros antígenos. Ademais, uma vez que células T ya+ são numerosas em tecidos mucosais, que é o ponto de entrada para patógenos micobacterianos, o antígeno de SOD pode ser importante nos estágios

anteriores de infecção através de sua estimulação preferencial de células T + ya .

Todos os antígenos recombinantes testados aumentaram significantemente a proporção de células B CD21+ em culturas de PBMCs bovinos tanto de excretores fracos como médios comparado com controles não infectados (P 0,05) (Fig. 6). Interessantemente, a proporção de células B CD21+ foi significantemente maior em culturas de PBMCs bovinos de excretores médios do que aquele dos outros antígenos recombinantes testados (P < 0,05).

Exemplo 5

Este exemplo fornece uma comparação de estimulação de produção de mRNA de citocina em PBMCs bovinos depois de estimulação com antígenos recombinantes.

Para preparação de RNA e tratamento com DNase I de células, grânulos celulares de PBMC foram obtidos e lavados duas vezes em 50 mL de salina tamponada com fosfato (PBS), pelotizados e 5 X IO6 células foram lisadas com 350 uL de tampão de lise de acordo com as recomendações do fabricante (RNeasy mini kit, Qiagen, CA) e mantidas a -80 C até extração de RNA e síntese de DNA complementar (cDNA). RNA total (tRNA) foi extraído de células lisadas ou PMBCs usando o RNeasy mini kit (Qiagen). O tRNA extraído foi tratado com 10 U/ul de DNase I livre de RNase a 37 C por 10 min seguido por inativação térmica a 95 C por 5 min e então resfriado em gelo.

Para síntese de cDNA, transcrição reversa (RT) foi realizadaem um volume final de 20 uL, contendo 1,6 uL de RNA total, 200 U Superscript II RT (GibcoBRL), 50 mM de Tris-Hcl (pH 8,3), 75 mM de KC1, 3 mM de MgC12, 0,01 M de DTT, e 0,5 mM de dNTPs. A mistura de reação foi sujeita a 42 C por 50 min e inativada a 70 C por 15 min. O cDNA foi analisado imediatamente ou armazenado a -20 C até uso.

Para realizar quantitativo em tempo real (RT-PCR), aproximadamente 1 a 5jig de RNA total de cada grupo de tratamento foi transcrito reverso usando transcriptase reversa Superscript, Hexâmeros aleatórios, e reagentes de transcriptase reversa (Gibco BRL). Iniciadores e sondas de tempo real foram projetados por aplicativo computacional Primer Express (Applied Biosystems) usando as seqüências para GAPDH, citocinas e fatores de crescimento bovinos obtidos a partir de Genbank. As sondas internas foram marcadas com o corante repórter fluorescente 5-carboxifluorosceína (FAM) na extremidade 5' e o corante supressor N', N', N', N', N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) na extremidade 3'. A mistura de PCR consistiu de 400 nM de iniciadores, 80 nM de sonda Taqman e PCR Mastermix comercialmente disponível (TaqMan Univeral PCR Mastermix, Applied Biosytems) contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KC1, 5 mM de MgCl2, 2,5 mM de desoxinucleotídeo trifosfatos, 0,625 U de DNA polimerase AmpliTaq Gold por reação, 0,25 U de AmpErasw UNG por reação e 10 ul da amostra diluída de cDNA em um volume final de 25 ul. As amostras foram colocadas em placas de 96 poços e amplificadas em um fluorômetro automático (ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems). Condições de amplicon foram 2 min a 50C, 10 min a 95C, seguido por 40 ciclos a 95C por 15 s e 60C por I min. Quantificação final foi feita usando o método de limiar de ciclo comparativo (Cp) e é registrada como transcrição relativa ou a diferença de n-vezes em relação a um cDNA calibrador.

Como pode ser visto a partir de Fig. 7, todos os antígenosrecombinantes estimularam níveis superiores de mRNA de IL-2 de PBMCs de excretores médios, com o complexo 85 de antígeno tendo um efeito maior do que ou a proteína de 35-kDa ou SOD (P < 0,05) (Fig. 7). 85A também induziu um nível maior de mRNA de IFN-y, IL-12p40, e TNF-a (Fig. 8A, B, e C, respectivamente) em excretores médios (P < 0,05). Visivelmente, PBMCs estimulados com o antígeno de proteína de 35-kDa expressaram altamente mRNA de IL-4 em ambos excretores fracos e médios (P < 0,05) (Fig. 9). Esta indução de mRNA de IL-4 pela proteína de 35-kDa aumentou significantemente dependendo de níveis de excreção (P<0,001). Em contraste, nenhuma diferença signifícante foi observada entre os outros antígenos (P>0,05). Estes estudos estão de acordo com os resultados apresentados em Exemplo 3 que indicam que respostas imunes para a proteína de 35-kDa proteína podem ser mais importantes no estágio tardio de doença uma vez que análise citométrica de fluxo mostrou que a proteína de 35-kDa induziu fortemente proliferação de linfócitos B, especialmente em excretores médios (Fig. 3). Assim, este Exemplo demonstra que todos os antígenos recombinantes testados podem estimular uma resposta imunológica mediada por célula.

Exemplo 6

Este Exemplo demonstra o efeito de vacinar camundongos com polinucleotídeos de DNA codificando antígenos de MPT e subseqüente desafio com MPT.

Para demonstração do efeito das construções de DNA, camundongos fêmeas C57/BL6 livres de patógenos específicos foram obtidos a partir do Harlan Sprague Dawley Inc (Indianapolis, IN). Os camundongos tinham semanas de idade no momento de vacinação. Existiram cinco grupos de camundongos e cada grupo de vacina consiste de 25 animais durante este experimento. Os animais foram alimentados com comida de camundongo comercial e água ad libitum, e mantidos em um ciclo de 12/12-horas luz/escuro.O plasmídeo de expressão eucariótico disponível comercialmente pVR1020 (Vical, Inc., San Diego, Calif.) foi usado para a vacina de DNA. Este plasmídeo contém um promotor de citomegalovírus imediato-precoce para assegurar expressão eficiente em um hospedeiro eucariótico assim como o sinal de secreção de ativador de plasminogênio de tecido humano (hTPA) para facilitar secreção do antígeno alvo da célula eucariótica (Brandt, et al. 2000. Infect. Immun. 68:791-795). DNA codificando genes de MPT 85A, 85B, 85C, SOD, 35kDa, 35kDa(li), MptC, MptD, e tipo ESAT-6 foi amplificado por reação em cadeia da polimerase a partir de DNA genômico de MPT usando os iniciadores específicos para gene listados em Tabela 1. Resumidamente, os iniciadores usados para amplificação de seqüências de codificação de MPT 85A, 85B e 85C incluíram cada um sítio BamHI. Um iniciador para amplificação de seqüências de codificação de SOD, MptC, MptD, 35kDa, e tipo ESAT6 incluiu um sítio BamHI enquanto o outro inclui um sítio BglII. Os produtos de amplificação foram digeridos usando as enzimas de restrição indicadas e clonados no vetor de clonagem pCR2.1 TOPO disponível comercialmente (Invitrogen, CA) usando técnicas padrão. Os genes de MPT foram então subclonados depois do sinal de secreção de ativador de plasminogênio de tecido humano (hTPA) no plasmídeo pVR1020 (Vical, Inc., San Diego, Calif.) usando técnicas padrão e essencialmente como previamente descrito (Dheenadhayalan et al., (2002) DNA Seq. 13:287-294; Shin et al., (2004) J. Vet. Sei. 5:111-117) (Skeikyet al., (1998) J. Immunol. 161:6171-6179). Estas construções recombinantes foram transfectadas em células HEK-293 (rim embrionário humano) com reagente de transfecção usando lipofectamina™ 2000 (Invitrogen, CA) e a expressão dos genes de antígeno foi confirmada no nível de transcrição usando RT-PCR.

Para imunização e desafio com MPT, camundongos foram divididas em cinco grupos diferentes (Tabela 3). Os animais foram administrados com 50 ug de cada DNA em 50 ulTabela 3.

<table>table see original document page 27</column></row><table>

PBS por dose através de injeção intramuscular. Camundongos foramimunizados três vezes em intervalos de 3 semanas. Genes de IL-12 foramadicionalmente injetados como indicado em Tabela 3. Três semanas depoisdos segundo estimuladores, os animais foram desafiados por injeçãointraperitoneal de IO9 CFU unidades de (MPT). Seis animais em cada grupoforam sacrificados em 4th, 8th, 12th e 16th semana depois de desafio e arecuperação de bactérias a partir dos órgãos (fígado, baço, linfonodomesentérico, pulmão) foi enumerada em ágar inclinado de gema de ovo deHerald (HEY) suplementado com Micobactina J e antibióticos comopreviamente descrito (Kamath, et al. Infect. Immun. 67:1702-1707). Depoisde desafio, fezes também foram coletadas a cada semana das gaiolas doscamundongos e cultivados usando o mesmo ágar. Tecidos incluindo fígado,baço, pulmão, intestino e linfonodo mesentérico foram fixados por imersãoem 10% em formalina tamponada e processados para verificaçãohistopatológica usando técnicas de histotecnologia padrão. A presença deMPT (bactérias álcool-ácido resistentes) no fígado e baço de cadacamundongo foi verificada por coloração de Ziehl-Neelsen.

Fig. 10 mostra a carga micobacteriana diminuída nos fígados ebaços de camundongos vacinados em relação a controles em 4, 8 e 12semanas após desafio e demonstra uma redução de aproximadamente 90% (1loglO) na carga bacteriana nos baços e fígados para camundongos vacinadoscom o coquetel de vacina de DNA de MPT comparado com controles nãoimunizados. Os dados relativos de histopatologia de fígado e baço em 4, 8 e12 semanas após desafio foram comparáveis aos resultados de crescimentobacteriano. Diferenças substantivas foram vistas em tecidos de fígado e baçotirados de animais imunizados com o coquetel de plasmídeo comparado comcamundongos não imunizados (Fig. 11). Controles não vacinados infectadoscom MPT tiveram numerosos granulomas aleatoriamente dispersos commacrófagos epitelióides centrais circundados por linfócitos pequenos.

Coloração de ZiehlNeelsen revelou que numerosos bacilos álcool-ácidoresistentes foram vistos (Fig. 12A e suplemento). Em contraste, a infecção foimuito menos severa nos camundongos vacinados com o coquetel de vacina deDNA de MPT (Fig. 12B).

Assim, este Exemplo demonstra que administração com umvetor de expressão de DNA codificando pelo menos cinco antígenos de MPT pode fornecer proteção significante de infecção por MPT.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Chang, Y.F.

<120> COMPOSIÇÕES PARA OBTER UMA RESPOSTA IMUNE CONTRAMYCOBACTERIUM AVIUMSUBESPÉCIE PARATUBERCULOSIS

<130> 018617.00120

<140> PCT/US2006/005509

<141> 2006-02-16

<150> ÜS 60/653,536

<151> 2005-02-16

<160> 24

<210> 1

<211> 828

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis

<220>

<223> Seqüência codificando DNA de proteina de 35 kDa de MPT

<400> 1

atggccaatc cgttcgtcaa ggcgtggaag tacctgatgg cgaagttcaa cgccacgatc 60

gacgagcgcg ccgaccccaa ggtgcagatc caacaggcca tcgaggaagc ccagcgcacc 120

caccaggcgc tgacccagca ggccgctcag gtcatcggca accagcgcca actcgagatg 180

cggctcaacc gccagctcgc cgacgtggag aagctgcagg tcaacgtgcg tcaggcgctg 240

acgctggccg accaggccac cgccgccggc gacaccgcca aggccaccga gtacaacaac 300

gccgccgagg cgttcgccgc ccagctggtc accgccgagc aaagcgtcga agacctcaag 360

acgctgcacg accaggcgct caacgccgcc gcgcaggcca agaaggcggt cgagcagaac 420

gcgatggtgc tgcagcagaa gatcgccgag cgcaccaagc tgctcagcca gctcgaacag 480

gccaagatgc aggaacaggt cagcgcctca ctgcagtcga tgagcgagct ggccgccccc 540

ggcaacgtgc ccagcctgga cgaggtgcgc gacaagatcg agcggcgcta cgccaacgcg 600

atcggggccg ccgaactggc acagggctcc gtgcagggca ggatgctcga ggtcgagcag 660

gccggcgtgc agatggccgg gcattcccgg ctcgagcaga tccgcgcctc gatgcgggac 720

gaggcgttgc cgaccggagg cacaccggcc gccggcggca cccaggccgc ccccgcgccc 780

ggccagggcg ccggcgacgc ggtcagcgag aaaccacttg gtcagtag E S28

<210> 2<211> 275<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis

<220><table>table see original document page 30</column></row><table>catctcgcca cgctgccaat cggctggttc cgcaccgatc gcaccggacc gatcgggcgt 360

ctgctcagca aggggaccat ggacgtcgcg gaccttcccg cgcacctgct gcggcatgtc 420

atcgtgggtg tagccgcgcc tgccaccatg atcatcggaa gctatgtgct ggactggcgg 480

gtcgggctcg cattcaccgc cggcgcgctg ctatgcgcac tgacgcttcg actactcatg 540

gtcgtcatcc accgcaacga cgaccagtac gatcacgaca tcggagtgac cgcgtcacgc 600

atcgtcgagt acgcccgtca gcagccgaca ctgcgtgcat acggcgtcct gaaccggccc 660

ggactgggaa cgctagagga atcgcttgtc cggcaacaga cttcgcagtc ccgcttgacc 720

attcgcggcg cgtgggcgct catcggattc ttcggaaccg tccaactggt ggtgaccgcc 780

atcatcgcgc tcaccgtcgc tctcgcagta agcggcagcc ttgcgctttc gacgatggtc 840

ggtttgctga tcatcacctt gcgcatgatc gacccgattt ctcagctcgg cgatctcgcc 900

ggccatgtcc aggtcaacgc cgacgccatc cgccgagtgc gtgaactgtt gacggtaccc 960

ccgttgcccg aacccaccca tccaggtcaa gccacgggtg ccgacatcga attgcagggg 102(

gttcgtttcg cttacgacgg aggtcaaccc accatcgatg gtatcgacgc cgtctttcca 108(

caaggtagcc tgactgccgt cgtcggcccg tctggcgcgg gaaaaagcac gctgctcaaa 1140

ctaatcgggc ggttcttcga cgtcgacgaa ggcagcatca ccatcggcgg ctgcgacatc 1200

cgccaactcg gcaccgccgg cgtctcacat ctcacggcgc aagttttcca agacgtgtac 1260

ctctttgaag gcacaattgc cgacaacctg cggatggccg atccgcaagc caccgatgat 1320

gatctccgcc acgtcgccac gatcagtcgc ctcgacgagg tagtcgatcg ccttcccaat 1380

gggtgggaaa cccgcgttgg tgaggcgggg tcgacgctgt ccggcgggga aaagcagcgt 1440

gtctccatag cgcgcgccct gctcaaagac gcaccggtag tactgctgga cgaggcgacc 1500

gcggcgctgg atgccgccaa tgagaccgcc gtttccgacg ctatccacga actagcgcgt 1560

gaccgcacag tcatcgttgt cgcacaccgc ctttcgaccg tggcggccgc cgatcagata 1620

ctggtgctcg acggcggccg gatcaccgag cgtggccgcc acgacacact ggtgggtgcg 1680

ggcggcacct acgcccgctt ctgggaagaa cgaactcgcg cgcgagggtg gcaactgcgc 1740

caaattgcgc ccactcctga actgcaggca cctcgaccat ga 1782

<210> 4

<211> 593

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis

<220>

<223> seqüência de aminoácido da proteína de MptC

<400> 4

Met Ser Thr Met lie Arg Tyr Leu Leu Glu Leu Leu Asp Glu Arg5 10 15<table>table see original document page 32</column></row><table>485 490 495

Leu Asp Glu Ala Thr Ala Ala Leu Asp Ala Ala Asn Glu Thr Ala500 505 510

Vai Ser Asp Ala lie His Glu Leu Ala Arg Asp Arg Thr Vai lie515 520 525

Vai Vai Ala His Arg Leu Ser Thr Vai Ala Ala Ala Asp Gln lie530 535 540

Leu Vai Leu Asp Gly Gly Arg lie Thr Glu Arg Gly Arg His Asp545 550 555

Thr Leu Vai Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Ala Arg Phe Trp Glu Glu560 565 570

Arg Thr Arg Ala Arg Gly Trp Gln Leu Arg Gln lie Ala Pro Thr575 580 585

Pro Glu Leu Gln Ala Pro Arg Pro590

<210> 5

<211> 288

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis

<220>

<223> DNA seqüência de DNA codificando a proteina tipo ESAT-6

<400> 5

atgtccgacc cgatcactta caacccgggc gcggtggccg acttcgccac cgacgtcgcc 60tcccgcgccg gccagttgca gtccattttc gacgacacct ccaaccgcaí gcacgccctg 120caggaattct tcgccgggca cggcgcgtcg ggctttttcg aggcgcaggc ccagatgctg 180tccgggctgc aggggctcat cgacacgatc cgccagcacg ggcagaccac ctcgcacgtg 240ctggacagcg cgatcagcac ggaccagcac atcgccggcc tgttctga 288

<210> 6

<211> 95

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis

<220>

<223> seqüência de aminoácidos da proteina tipo ESAT-6

<400> 6

Met Ser Asp Pro lie Thr Tyr Asn Pro Gly Ala Vai Ala Asp Phe5 10 15

Ala Thr Asp Vai Ala Ser Arg Ala Gly Gln Leu Gln Ser lie Phe20 25 30

Asp Asp Thr Ser Asn Arg Thr His Ala Leu Gln Glu Phe Phe Ala35 40 45

Gly His Gly Ala Ser Gly Phe Phe Glu Ala Gln Ala Gln Met Leu50 55 60

Ser Gly Leu Gln Gly Leu lie Asp Thr lie Arg Gln His Gly Gln65 70 75

Thr Thr Ser His Vai Leu Asp Ser Ala lie Ser Thr Asp Gln His80 85 90

lie Ala Gly Leu Phe95<210> 7<211> 627<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Seqüência de DNA codificando a proteina de MptD<400> 7

atgacggcca ctagctcgac gacccagtcc agtcgccgca tcgacgtccg gatgagcgcc 60agggatctca tcaacatcgg ggtcttcggc gctctctaca tcgccactgt gttcgcgatc 120aacgtgttcg ctttcatcaa tccgctcgtc atgttggtcg ccctggcggt cagcatgatc 180gccggcggcg tgccgttcat gttgttcctc acccgggtgc gacatgcggg catggtgacg 240gtgtttgcga ttatcacggc cggactgctc gcactgaccg ggcacccccc gatctgcttc 300gtgatcacag ttgcgtgcgc gttggtggcc gaagtcgtcc tgtggctggg acgctatcgc 360tcccgcacca tgggtgtact ggcgtacgca atctacgcgg cgtggtacat cgggccgctg 420ctgcccatct tctacgctcg cgatgaatat ttctccagtc ccggcatggc acagatgggt 480ccgcgctacc tcgaagagat ggaacggttg ttgtcgccag ccgtgctaat cgcattcgac 540ctgtccacgg tggtattcgg gctgatcggc ggactgctcg gagtaaggtt gctgcgcaag 600cattttcaga gggccggcct agcttga 627

<210> 8<211> 208<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Seqüência de aminoácidos de MptD<400> 8

Met Thr Ala Thr Ser 5 Ser Thr Thr Gln Ser 10 Ser Arg Arg lie Asp 15

Vai Arg Met Ser Ala 20 Arg Asp Leu lie Asn 25 lie Gly Vai Phe Gly 30

Ala Leu Tyr lie Ala 35 Thr Vai Phe Ala lie 40 Asn Vai Phe Ala Phe 45

lie Asn Pro Leu Vai 50 Met Leu Vai Ala Leu 55 Ala Vai Ser Met lie 60

Ala Gly Gly Vai Pro 65 Phe Met Leu Phe Leu 70 Thr Arg Vai Arg His 75

Ala Gly Met Vai Thr 80 Vai Phe Ala lie lie 85 Thr Ala Gly Leu Leu 90

Ala Leu Thr Gly His 95 Pro Pro lie Cys Phe 100 Vai lie Thr Vai Ala 105

Cys Ala Leu Vai Ala 110 Glu Vai Vai Leu Trp 115 Leu Gly Arg Tyr Arg 120

Ser Arg Thr Met Gly 125 Vai Leu Ala Tyr Ala 130 lie Tyr Ala Ala Trp 135

Tyr lie Gly Pro Leu 140 Leu Pro lie Phe Tyr 145 Ala Arg Asp Glu Tyr 150

Phe Ser Ser Pro Gly 155 Met Ala Gln Met Gly 160 Pro Arg Tyr Leu Glu 165Glu Met Glu Arg Leu170

Leu Ser Thr Vai Vai185

Arg Leu Leu Arg Lys200

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> iniciador direto de 85A

<400> 9

cgggatccat gatgacgctt gtcgaca 27

<210> 10<211> 21<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> iniciador reverso de 85A<400> 10

cgggatcctt aggtgccctg g 21

<210> 11<211> 20<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> iniciador direto de 85B<400> 11

cgggatccat gacagatctg 20

<210> 12<211> 20<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> iniciador reverso de 85B<400> 12

cgggatcctt atccgccgcc 20

<210> 13<211> 23<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> iniciador direto de 85C

Leu Ser Pro Ala Vai Leu lie Ala Phe Asp175 180Phe Gly Leu lie Gly Gly Leu Leu Gly Vai190 195His Phe Gln Arg Ala Gly Leu Ala205

<400> 13

cgggatccat gtcgttcatc gaa 23<210> 14<211> 21<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> iniciador reverso de 85C<400> 14

cgggatcctc aggtggcggg c 21

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador direto de SOD

<400> 15

ggatcctggg actatgcagc 20

<210> 16<211> 23<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador reverso de SOD<400> 16

agatcttcag ccgaagatca ggc 23

<210> 17<211> 20<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> iniciador direto de 35 kDa<400> 17

ggatccccac ttggtgatct 20

<210> 18<211> 26<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador reverso de SOD<400> 18

agatcttcac ttgtactcat ggaact 26

<210> 19<211> 18<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador direto de MptC<400> 19

ggatcccgcg gtcggcgt 18

<210> 20<211> 23<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador reverso de MptC<400> 20

agatcttcat ggtcgaggtg cct 23

<210> 21<211> 18<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador direto de MptD<400> 21

ggatcccgcc gcatcgac 18

<210> 22<211> 21<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador reverso de MptD<400> 22

agatcttcaa gctaggccgg c 21

<210> 23<211> 18<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador direto de tipo ESAT-6<400> 23

ggatccccgg gcgcggtg 18

<210> 24<211> 19<212> DNA

<213> Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis<220>

<223> Iniciador reverso de tipo ESAT-6<400> 24

agatcttcag aacaggccg 19

Claims (19)

1. Método para estimular uma resposta imune em um animal,caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade eficazde uma composição compreendendo pelo menos cinco componentesimunogênicos, em que os componentes imunogênicos são selecionados apartir do grupo consistindo de:a) seqüências de DNA isoladas codificando antígenos de MPT;b) antígenos de MPT recombinantes; ouc) combinações de a) e b).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que os antígenos de MPT são selecionados a partir do grupoconsistindo de 85A, 85B, 85C, 35kDa, 35kE>a(Li), SOD, MptC, MptD eESAT-6.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que as seqüências de polinucleotídeos codificando antígenos de MPTcodificam um antígeno de MPT selecionado a partir do grupo consistindo de-85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD e ESAT-6.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a composição compreende seqüências de polinucleotídeoscodificando antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, proteína de 35kDa MPT, esuperóxido dismutase (SOD).

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a composição é administrada a um ruminante.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o ruminante é um bovino, uma ovelha, uma cabra, um veado ouum alce.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que o ruminante é um bovino.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o ruminante não é infectado com MPT.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o ruminante é infectado com MPT.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o bovino tem Doença de Johne.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a composição compreende adicionalmente um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o animal está prenhe.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a composição compreende adicionalmente um adjuvante.

14. Composição para uso na estimulação de uma respostaimune contra MPT em um animal, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos cinco componentes imunogênicos, em que os componentesimunogênicos são selecionados a partir do grupo consistindo de:a) antígenos de MPT recombinantes;b) seqüências de polinucleotídeos isoladas codificando antígenos deMPT;c) combinações de a) e b).

15. Composição de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que os antígenos de MPT são selecionados a partirdo grupo consistindo de 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD e ESAT-6.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15,caracterizada pelo fato de que as seqüências de polinucleotídeos codificandoantígenos de MPT codificam um antígeno de MPT selecionado a partir dogrupo consistindo de 85A, 85B, 85C, 35kDa, SOD, MptC, MptD e ESAT-6.

17. Composição de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de que a composição compreende seqüências depolinucleotídeos codificando antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, proteína de35kDa MPT, e superóxido dismutase (SOD).

18. Composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

19. Composição de acordo com a reivindicação 14,caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um adjuvante.