ES2357968T3 - Composiciones para desencadenar una respuesta inmunitaria contra mycobacterium avium subespecie paratuberculosis. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende uno o más vectores de expresión para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra M. paratuberculosis; en el que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, y en el que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos antígenos de M. paratuberculosis; y en el que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD).

Description

La presente invención se refiere en general a la estimulación de respuestas inmunitarias, y más específicamente a composiciones y usos para estimular respuestas inmunitarias profilácticas y/o terapéuticas contra Mycobacterium 5 avium subespecie paratuberculosis.

La Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (MPT) es el agente causante de la enfermedad de Johne (EJ), que causa enteritis granulomatosa crónica en rumiantes. Los animales afectados clínicamente desarrollan diarrea crónica y pérdida de peso progresiva que, dado el caso, da como resultado la muerte, mientras que los animales infectados subclínicamente principalmente tienen una producción reducida de leche. La EJ es de enorme 10 importancia económica para la industria láctea mundial, causando pérdidas importantes debido a la producción reducida y al sacrificio temprano de animales con estimaciones de un 20% de los rebaños lecheros de EE.UU. afectados y costes de 220 millones de dólares al año para la industria láctea (Wells, y col. 2000. J. Am. Vet. Med. Assoc. 216: 1450-1457). El ganado vacuno es más susceptible de infección por este organismo en los primeros 6 meses de vida, pero la enfermedad típicamente no se evidencia hasta los 3 a 5 años de edad. La infección ocurre 15 mediante la ingestión de estiércol contaminado, calostro o leche de vacas infectadas (Sweeney, 1996. Vet. Clin. N. Am. Food Anim. Pract. 12: 305-312). También ocurre infección fetal, particularmente en vacas preñadas con enfermedad avanzada (Sweeney, y col. 1992. Am. J. Vet. Res. 53: 477-480). Aunque la EJ es una enfermedad infecciosa importante de los rumiantes, no existe una vacuna eficaz contra esta enfermedad. La única vacuna disponible actualmente en los Estados Unidos consiste en M. avium subespecie paratuberculosis inactivada en un 20 coadyuvante oleoso (Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978. Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Sin embargo, dichos programas de vacunación han generado graves problemas de salud pública. Por ejemplo, al menos un veterinario se inoculó accidentalmente en la mano durante la vacunación de animales (Patterson, y col., (1988) J. Am. Vet. Med. Assoc. 192: 1197-1199). Adicionalmente, los estudios han demostrado que hay una fuerte reacción en los sitios de inyección después de la vacunación con esta bacteria inactivada (Kormendy, B. 1992. Acta 25 Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978, Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Otra desventaja de esta vacuna es que los animales vacunados se vuelven positivos en la prueba cutánea de tuberculina (Kormendy, B. 1992. Acta Vet. Hung. 40: 171-184; Larsen, y col., 1978. Am. J. Vet. Res. 39: 65-69). Por tanto, existe la necesidad de desarrollar vacunas más eficaces contra la EJ que puedan usarse como composiciones profilácticas y/o terapéuticas seguras y eficaces para infección por MPT. 30

El documento WO 03/076898 describe diagnósticos de micobacterias.

Velaz-Faircloth y col. Infection and Immunity, vol. 67(8), agosto de 1999, páginas 4243-4250, describen la protección frente a M. avium por vacunas de ADN que expresan antígenos micobacterianos en forma de proteínas de fusión con GFP.

Uzonna J.E. y col., Vaccine, vol. 21, 2003, páginas 3101-3109, describen la eficacia de vacunaciones con la cepa 35 comercial y de campo M. paratuberculosis con IL-12 recombinante en un modelo de infección experimental bovina.

Mullerad J. y col., Med. Microbiol. Immunol., vol.190, 2002, páginas 179-187, describen la inmunogenicidad del antígeno 85B de M. paratuberculosis.

Shin y col. J. Vet. Sci. vol. 5(2), 2004, páginas 111-117, describen la respuesta de anticuerpos comparativa de cinco antígenos recombinantes con relación a los niveles de excreción bacteriana y el desarrollo de diagnóstico serológico 40 basado en el antígeno de 25 kDa de M. avium subespecie paratuberculosis.

Shin y col., Infect. Immun. vol. 73(8), agosto de 2005, páginas 5074-5085, describen las respuestas inmunitarias celulares in vitro ante antígenos recombinantes de M. avium subespecie paratuberculosis.

Dheenadhayalan y col., DNA Sequence, vol. 13(5), 2002, páginas 287-294, describen la clonación y caracterización de los genes que codifican los antígenos 85A, 85B y 85C de M. avium subespecie paratuberculosis. 45

La presente invención proporciona usos para estimular una respuesta inmunitaria en rumiantes contra M. paratuberculosis (MPT), como se define en las reivindicaciones. Las composiciones comprenden componentes inmunitarios, que son polinucleótidos que codifican antígenos de MPT, como se define en la reivindicación. Las composiciones comprenden al menos cinco componentes inmunogénicos recombinantes: los antígenos de MPT 85A, 85B, 85C, de 35kDa y superóxido dismutasa (SOD). Son otros antígenos de MPT ejemplares MptC, MptD y 50 proteína similar a ESAT-6.

El uso es para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra bacterias MPT.

Las composiciones que comprenden antígenos proteicos de MPT recombinantes, polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT o combinaciones de los mismos, pueden formularse con portadores farmacéuticos estándar y pueden ser para administración mediante cualquiera de una variedad de vías convencionales. Las 55

composiciones pueden ser para administración en cualquier momento a un rumiante susceptible de contraer infección por MPT o a un animal que esté infectado por MPT. Sin embargo, es preferible que las composiciones de la invención sean para administración antes de la infección por MPT, tal como para administración a rumiantes preñadas que pueden transferir componentes inmunogénicos profilácticos a sus crías mediante el calostro, o para administración durante el periodo de una a cinco semanas después del nacimiento. 5

La Fig. 1 es una representación gráfica de los datos del análisis de respuestas proliferativas de células mononucleares de sangre periférica de vacas infectadas y sanas de control estimuladas in vitro con 5 proteínas recombinantes de MPT. Los resultados se expresan como un índice de estimulación y las barras de error representan la desviación estándar de la media. No se observó una proliferación significativa ante ningún antígeno por PBMC de vacas no infectadas (P>0,05). Mostraron la mayor actividad proliferativa 85A y 10 la proteína de 35 kDa en animales de excreción baja y media, respectivamente.

La Fig. 2. es una representación gráfica de los datos del análisis de la producción de interferón γ en respuesta ante antígenos individuales con relación a los niveles de excreción de MPT. Los resultados se dan como valores de DO en pocillos estimulados–valores de DO en pocillos de control (IFN-γ producido naturalmente). Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias. 85A y 85B eran los antígenos más 15 inducibles a producir IFN-γ en células mononucleares de sangre periférica bovina a partir de animales con ambos tipos de excreción.

La Fig. 3. es una representación gráfica de los datos del análisis de las respuestas de anticuerpo ante antígenos individuales con relación a los valores de excreción de MPT. Las barras representan los valores medios de DO a 405 nm. Las barras de error representan las desviaciones estándar de las medias. Todos los antígenos 20 recombinante mostraron aumentos de las respuestas de anticuerpo según los niveles de excreción y las respuestas de anticuerpo ante la proteína de 35 kDa estaban positivamente separados entre las vacas sanas no infectadas y con ambos tipos de excreción (P<0,01).

Las Fig. 4A-4D son representaciones gráficas de los datos del análisis de los cambios en la distribución de subconjuntos de linfocitos T en linfocitos de sangre periférica bovina después de estimulación con antígenos 25 recombinantes, como se determina mediante análisis por FACS. Fig. 4A. CD4; Ag 85A y Ag 85B inducían una mayor proporción de linfocitos T CD4+ en animales de excreción media en comparación con animales de excreción baja, mientras que el porcentaje de linfocitos CD4+ no cambiaba en el ganado vacuno de control no infectado. Fig. 4B. CDB; Ag 85A aumentaba la proporción de linfocitos T CD8+ en animales de excreción media, mientras que el porcentaje aumentado de linfocitos CD8+ era muy bajo en ganado vacuno no 30 infectado. Fig. 4C. CD25; Ag 85A y Ag85B aumentaban la proporción de linfocitos T CD25+ en ambos grupos de excreción, mientras que tenían poco efecto en ganado vacuno no infectado. En contraposición, Ag 85C y la proteína de 35 kDa aumentaban significativamente la proporción de linfocitos T CD25+ solo en animales con excreción media (P<0,05). Fig. 4D. linfocitos T γδ+; todos los antígenos dieron como resultado aumentos significativamente menores en todos los subconjuntos celulares en ambos grupos de excreción baja y media, 35 excepto SOD para linfocitos T γδ+ en animales de excreción media.

La Fig. 5 es una representación gráfica de los datos del análisis de los cambios diferenciales de linfocitos T CD3+ en respuesta a la estimulación con proteínas recombinantes y dos controles (ConA y PPD). Los datos se expresan como la media de células que se teñían positivamente por CD3 (1 error estándar de la media) en respuesta a cada antígeno recombinante respecto al nivel de excreción. 40

La Fig. 6 es una representación gráfica de los datos del análisis de subconjuntos de linfocitos B CD21+ aumentados en linfocitos de sangre periférica bovina después de la estimulación con antígenos recombinantes, determinado mediante análisis de FACS. Los resultados se notifican como el aumento porcentual medio de células con tinción positiva y las barras de error representan 1 error estándar de la media (EEM). La proteína recombinante de 35 kDa inducía el mayor aumento de linfocitos B CD21+ en animales con excreción media. 45 No se observó un aumento significativo en la proporción de linfocitos B en respuesta a los demás antígenos independientemente de los niveles de excreción bacteriana (P>0,05).

La Fig. 7 es una representación gráfica de los datos del análisis de los perfiles de IL-2 de PBMC bovinas de ganado vacuno no infectado, animales con excreción baja y media después de la estimulación con antígenos recombinantes durante 24 horas. Los resultados representan los aumentos medios en veces de IL-4 frente a 50 las PBMC no estimuladas, que servían como calibradores. Los Ag 85A y B estimulaban más fuertemente a los animales con excreción media, mientras que la proteína de 35 kDa y SOD tenían menores efectos (p < 0,05).

Las Fig. 8A-8C son representaciones gráficas de los datos del análisis de comparación de los perfiles de ARNm de citocina para IFN-γ (Fig. 8A), IL-12p40 (Fig. 8B) y TNF-α (Fig. 8C) de PBMC bovinas de ganado vacuno no 55 infectado, animales con excreción baja y media después de la estimulación con antígenos recombinantes durante 24 horas. Los resultados representan el aumento medio en veces frente a las PBMC no estimuladas, que servían como calibradores. Los resultados son similares, con los Ag 85A y B estimulando más fuertemente los animales con excreción media, mientras que la proteína de 35 kDa y SOD tenían menores

efectos.

La Fig. 9 es una representación gráfica de los datos del análisis de los perfiles de ARNm de IL-4 de PBMC bovinas de ganado vacuno no infectado, animales con excreción baja y media después de la estimulación con antígenos recombinantes durante 24 horas. Los resultados representan el aumento medio en veces de IL-4 frente a PBMC no estimuladas, que servían como calibradores. La proteína de 35 kDa estimulaba 5 fuertemente la expresión de ARNm de IL-4 tanto en animales con excreción baja como media.

La Fig. 10 es una representación gráfica de la recuperación bacteriana del bazo e hígado después de la administración de las construcciones de ADN indicadas y controles y la posterior aplicación de la infección con MPT.

La Fig. 11 es una representación gráfica del número medio de granulomas en bazo e hígado después de la 10 administración de las construcciones de ADN indicadas y controles y la posterior aplicación de la infección con MPT.

Las Fig. 12A y 12B son representaciones fotográficas de la tinción de Ziehl-Neelsen de tejidos que revelan numerosos bacilos acidorresistentes (Fig. 12A). En contraposición, la infección era mucho menos grave en los ratones vacunados con construcciones de ADN de MPT que codifican los cinco antígenos (Fig. 12B). 15

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona usos, como se definen en las reivindicaciones, para estimular una respuesta inmunitaria contra M. paratuberculosis (MPT) en un rumiante. Las composiciones comprenden al menos 5 polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT. La administración de la composición a un rumiante estimula una respuesta inmunitaria contra bacterias MPT. 20

Como se usa en la presente memoria, un “componente inmunitario” es un componente de la composición que puede estimular directa o indirectamente una respuesta inmunitaria. En consecuencia, cuando se introducen en un rumiante, los vectores de expresión que comprenden polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT entran en las células del rumiante y expresan antígenos de MPT. Los antígenos de MPT expresados estimulan a su vez una respuesta inmunitaria. Por tanto, un polinucleótido de ADN que codifica un antígeno de MPT se considera 25 un componente inmunogénico que estimula indirectamente una respuesta inmunitaria. Con respecto a un antígeno de proteína de MPT administrado, puesto que el antígeno es reconocido directamente por el sistema inmunitario, se considera al antígeno un componente inmunogénico que estimula directamente una respuesta inmunitaria.

El uso puede proporcionar beneficios a cualquier rumiante susceptible de infección por MPT, en que infección se considera que significa colonización de la mucosa intestinal del rumiante por MPT. La invención es particularmente 30 bien adecuada para la profilaxis o terapia de infección por MPT en rumiantes incluyendo, pero sin limitación, ganado vacuno, ovejas, cabras, ciervos, alces, antílopes y búfalos.

Por tanto, las composiciones pueden ser para administración a cualquier rumiante infectado por MPT o no infectado. El uso de las composiciones para rumiantes infectados según la invención se considera que estimula una respuesta inmunitaria terapéutica. Sin embargo, es preferible que las composiciones sean para administración antes de la 35 infección por MPT, para estimular una respuesta profiláctica. Por ejemplo, las composiciones pueden ser para administración a un rumiante preñado que puede transferir componentes inmunitarios profilácticos a sus crías no infectadas mediante el calostro. Como alternativa, las composiciones pueden ser para administración durante el periodo de una a cinco semanas después del nacimiento para proporcionar un efecto profiláctico que pueda prevenir la infección o reducir la gravedad de la enfermedad si ocurre infección. Por tanto, en una realización, el uso de la 40 invención es profiláctico para infección por MPT, mientras que en otra realización el uso es terapéutico para infección por MPT. El uso puede usarse también para profilaxis o terapia de la enfermedad de Johne.

Los antígenos de MPT usados en la invención incluyen al menos las proteínas de MPT 85A, 85B, 85C, 35 kDa y SOD. Son otros antígenos de MPT MptC, MptD y proteína similar a ESAT-6. Los antígenos de proteína de MPT pueden obtenerse para uso en la invención mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales como 45 mediante procedimientos de clonación recombinante convencional. Son conocidos procedimientos de clonación de ADN adecuados para expresar y purificar proteínas recombinantes. (Véase, por ejemplo, Sambrook y col. 2001, “Molecular cloning: a laboratory manual”, 3ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, NY). Generalmente, para obtener antígenos de proteína de MPT recombinantes, puede obtenerse ADN genómico de MPT a partir de un cultivo de MPT según procedimientos estándar, tales como mediante el bien conocido 50 procedimiento de lisis alcalina. El ADN que codifica los antígenos puede amplificarse, tal como mediante la reacción en cadena de la polimerasa, a partir del ADN genómico y los productos de amplificación pueden clonarse individualmente o en diversas combinaciones en uno o más vectores de expresión adecuados. Las células hospedadoras apropiadas pueden transfectarse con el vector de expresión y las células transfectadas pueden cultivarse en condiciones apropiadas para la expresión de los antígenos. Los antígenos pueden extraerse 55 posteriormente y purificarse del cultivo según técnicas estándar.

Para administración a animales, los antígenos de MPT recombinantes adecuadamente purificados pueden

combinarse con portadores farmacéuticos estándar. Se describen portadores farmacéuticos estándar para uso con proteínas en “Remington’s Pharmaceutical Sciences” (18ª edición, A. R. Gennaro y col. Eds., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990). Además, los antígenos pueden proporcionarse en formulaciones liposómicas o microsómicas convencionales.

Las composiciones que comprenden los antígenos de MPT para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria 5 pueden administrarse mediante cualquier vía aceptable. Las vías de administración adecuadas incluyen oral, por mucosa y parenteral (por ejemplo, inyección intravascular, intramuscular y subcutánea). Los expertos en la técnica reconocerán que la cantidad de antígenos administrada a un animal particular dependerá de una serie de factores tales como la vía de administración y el tamaño, estado físico y estado de MPT del animal. Las cantidades relativas de cada antígeno en una formulación pueden ajustarse según parámetros conocidos, de modo que proporcionen 10 equivalentes molares u otras relaciones de los antígenos. Adicionalmente, las composiciones pueden usarse en una administración única o en una serie de administraciones como recuerdo de la respuesta inmunitaria a los antígenos de MPT. Generalmente, puede administrarse una dosificación total de entre 10-200 µg de proteína. Cuando se administra ADN que codifica antígenos de MPT, pueden administrarse generalmente entre 30-500 µg de ADN.

Como se define en las reivindicaciones, la invención proporciona el uso de polinucleótidos que codifican al menos 15 cinco antígenos de MPT recombinantes. Los polinucleótidos que codifican los antígenos de MPT antígeno de 85A, 85B, 85C, 35 kDa y superóxido dismutasa (SOD) pueden administrarse en una formulación única. 85A, 85B y 85C son proteínas de unión a fibronectina; las proteínas de 35 kDa y SOD son proteínas de superficie externa. La secuencia de ADN que codifica el gen de 85A de MTP y la secuencia aminoacídica del gen de 85A se proporcionan en el nº de acceso de GenBank AF280067 (10 de octubre de 2003, entrada). La secuencia de ADN que codifica el 20 gen de 85B de MTP y la secuencia aminoacídica del gen de 85B se proporcionan en el nº de acceso a GenBank AF219121 (21 de noviembre de 2002, entrada). La secuencia de ADN que codifica el gen 85C de MTP y la secuencia aminoacídica del gen de 85C se proporcionan en el nº de acceso de GenBank AF280068 (21 de noviembre de 2002, entrada). La secuencia de ADN que codifica el gen de SOD de MTP y la secuencia aminoacídica del gen de SOD se proporcionan en el nº de acceso a GenBank AF180816 (30 de noviembre de 2001, 25 entrada). La secuencia de ADN que codifica la proteína de 35 kDa se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO:1. La secuencia aminoacídica de la proteína de 35 kDa se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO:2. Antígenos de MPT adicionales incluyen MptC, MptD y proteína similar a ESAT-6. La secuencia de ADN que codifica la proteína MptC se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO: 3. La secuencia aminoacídica de la proteína MptC se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO:4. La secuencia de ADN 30 que codifica la proteína similar a ESAT-6 se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO:5. La secuencia aminoacídica de la proteína similar a ES AT-6 se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO:6. La secuencia de ADN que codifica la secuencia de MptD se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO: 7. La secuencia de ADN que codifica la secuencia aminoacídica de MptD se proporciona en la presente memoria como SEQ ID NO: 8. 35

Las secuencias de ADN de los cebadores usados para amplificar ADN que codifica los antígenos de MPT usados en la presente memoria a partir de ADN genómico de MPT se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1

Nombre de gen/cebador

SEQ ID NO: Secuencia de cebador (5’->3’) Longitud del producto de ADN (pb) Nº de acceso del producto de amplificación mc y de la secuencia aminoacídica del antígeno

85A pVR85AF pVR85AR

9 10 CGGGATCCATGATGACGCTTGTCGACA CGGGATCCTTAGGTGCCCTGG 1050 AF280067

85B pVR85BF pVR85BR

11 12 CGGGATCCATGACAGATCTG CGGGATCCTTATCCGCCGCC 1000 AF219121

85C pVR85CF pVR85CR

13 14 CGGGATCCATGTCGTTCATCGAA CGGGATCCTCAGGTGGCGGGC 1100 AF280068

SOD pVRSODF pVRSODR

15 16 GGATCCTGGGACTATGCAGC AGATCTTCAGCCGAAGATCAGGC 590 AF180816

35kDa (MAP2121c) pVR35KDF pVR35KDR

17 18 GGATCCCCACTTGGTGATCT AGATCTTCACTTGTACTCATGGAACT 910

MptC (MAP 3734) pVRMPTCF pVRMPTCR

19 20 GGATCCCGCGGTCGGCGT AGATCTTCATGGTCGAGGTGCCT 1750

MptD (MAP 3733) pVRMPTDF pVRMPTDR

21 22 GGATCCCGCCGCATCGAC AGATCTTCAAGCTAGGCCGGC 600

Similar a ESAT 6 (MAP 0161) pVRESATF pVRESATR

23 24 GGATCCCCGGGCGCGGTG AGATCTTCAGAACAGGCCG 270

En otra realización, pueden prepararse composiciones que comprenden polinucleótidos de ADN que codifican cinco o más antígenos de MPT. Las secuencias que codifican antígeno de MPT pueden obtenerse mediante amplificación de ADN genómico de MPT usando cebadores apropiados e insertando los productos de amplificación en vectores de 5 expresión de la misma manera que se describe para la preparación de proteínas de antígeno recombinantes.

Los vectores de expresión adecuados contienen señales de transcripción y traducción eucarióticas apropiadas, y pueden contener elementos adicionales tales como señales de poliadenilación y/o de tráfico de proteínas. Es un ejemplo de un vector de expresión adecuado pVR1020 (disponible en Vical, Inc., San Diego, Calif.), que contiene un promotor inmediato-temprano de citomegalovirus para promover una expresión eficaz en un hospedador eucariótico, 10 así como una señal de secreción de activador de plasminógeno para facilitar la secreción de los antígenos a partir de las células del hospedador eucariótico.

Se reconocerá por los expertos en la técnica que se usarán en la invención uno o más vectores de expresión distintos, distinguidos entre sí por los antígenos de MPT que codifican y/o por sus elementos reguladores u otros, tales como sitios de policlonación. Por tanto, puede usarse en la presente invención un solo vector de expresión que 15 codifica al menos cinco antígenos de MPT, o al menos cinco vectores de expresión que codifican cada uno un antígeno de MPT diferente, o combinaciones de vectores de expresión que codifican cada uno al menos un antígeno de MPT, para suministrar polinucleótidos que codifican al menos cinco antígenos de MPT, como se define en las reivindicaciones.

En una realización, pueden proporcionarse secuencias polinucleotídicas de ADN que codifican los antígenos de 20 MPT 85A, 85B, 85C, SOD, MptC, MptD, 35kDa y proteína similar a ESAT6 en vectores de expresión separados que pueden usarse para la expresión y purificación de proteína y para la administración en diversas combinaciones a rumiantes para estimular una respuesta inmunitaria.

Los vectores de expresión que codifican los antígenos de MPT pueden formularse en cualquier preparación farmacéuticamente eficaz para administración a rumiantes. Dichas formulaciones pueden ser, por ejemplo, una 25 disolución salina tal como disolución salina tamponada con fosfato (BPS). Se prefiere utilizar formulaciones farmacéuticamente aceptables que proporcionen también estabilidad a largo plazo al ARN. Por tanto, es preferible retirar y/o quelar los iones de metal traza de los tampones de formulación o de los viales y cierres en que se almacena el ADN para estabilizar y proteger al ADN durante el almacenamiento. Además, la inclusión de secuestrantes de radicales libres no reductores, tales como etanol o glicerol, es útil para evitar el daño del ADN por 30 la producción de radicales libres que puede aún ocurrir, incluso en disoluciones aparentemente desmetalizadas.

Además, el ADN puede proporcionarse en formulaciones liposómicas o microsómicas convencionales.

No hay límites a la vía por la que pueden suministrarse polinucleótidos de ADN de la invención, a condición de que su suministro estimule una respuesta inmunitaria contra MPT en los rumiantes receptores. En consecuencia, los polinucleótidos de ADN usados en la presente invención pueden ser para administración al rumiante mediante cualquier medio conocido en la técnica, tal como por vías entérica y parenteral. Estas vías de suministro incluyen, 5 pero sin limitación, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección intravenosa y suministro oral. Es una vía preferida la intramuscular.

La composición para uso en la invención comprende al menos cinco componentes inmunogénicos que se proporcionan como polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT. Dichas composiciones pueden obtenerse combinando los vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos que codifican proteínas de 10 MPT descritas en la presente memoria. A este respecto, las secuencias polinucleotídicas pueden estar presentes en uno o más vectores de expresión. Las composiciones que comprenden polinucleótidos que codifican antígenos de MPT pueden combinarse con portadores farmacéuticos convencionales y administrarse como se describe en la presente memoria y/o según técnicas estándar. Pueden proporcionarse preparaciones liposómicas o microsómicas convencionales de los polinucleótidos que codifican antígenos de MPT. Adicionalmente, y como se reconocerá por 15 los expertos en la técnica, las composiciones para uso en la invención pueden comprender adicionalmente un coadyuvante adecuado.

Por tanto, y sin pretender ligarse a teoría particular alguna, la administración de polinucleótidos que codifican antígenos recombinantes según el uso de la invención, se cree que estimula una respuesta inmunitaria que puede ser profiláctica o terapéutica con respecto a la infección por MPT. 20

Los siguientes ejemplos describen las diversas realizaciones de esta invención. Estos ejemplos son ilustrativos y no se pretende que sean restrictivos.

Ejemplo 1

Este ejemplo proporciona una comparación de distintos efectos de linfoproliferación en respuesta ante la estimulación con antígenos individuales. 25

Para examinar las respuestas linfoproliferativas, se analizó en cinco antígenos recombinantes de MPT, 85A, 85B, 85C, antígeno de 35 kDa y superóxido dismutasa (SOD) su capacidad de desencadenar respuestas proliferatvas en PBMC obtenidas de vacas con distintos niveles de excreción de MPT. Para este y otros ejemplos como se indican en la presente memoria, se dividieron un total de 38 vacas Holstein de 2 a 3 años de edad en 3 grupos. Los controles sanos (n= 18) eran negativos de infección por MPT, determinado mediante un cultivo fecal negativo y un 30 ensayo PCR IS900 negativo. Los controles sanos provenían de una granja que ha sido negativa de cultivo fecal y negativa de PCR IS900 durante los últimos 10 años. Se subdividieron los animales positivos en animales con excreción baja (n=16) y con excreción media basándose en el número de unidades formadoras de colonias (UFC)/g de heces (n= 4). Se consideran animales con excreción baja los animales con entre 1-30 UFC/g de heces. Se consideran animales con excreción media los animales con entre 31-300 UFC/g de heces. Los animales con 35 excreción alta (>300 UFC/g de heces) no estaban disponibles, puesto que se sacrifican inmediatamente en las granjas una vez se identifican. Se efectuaron los cultivos fecales y el ensayo PCR IS900 para determinar el estado de infección por MPT como se describe anteriormente (Shin y col., (2004) J. Vet. Diagn. Invest. 16: 116-120).

Para uso en ensayos de linfoproliferación, se clonaron y expresaron los antígenos recombinantes 85A, 85B, 85C, el antígeno de 35 kDa y SOD usando técnicas estándar y como se describen anteriormente (Dheenadhayalan y col., 40 (2002) DNA Seq. 13: 287-294; Shin y col., (2004) J. Vet. Sci. 5: 111-117), y se purificaron como se describe anteriormente (Skeiky y col., (1998) J. Immunol. 161: 6171-6179). Los antígenos usados en estos ejemplos tenían una endotoxina despreciable (10 pg/ml) en un ensayo de amebocito de Limulus.

Para el aislamiento y cultivo de células mononucleares de sangre periférica bovina, se recogió sangre periférica (20 ml) de todas las vacas de la vena de la cola con tubos de vacío heparinizados. 45

Se efectuó el aislamiento de linfocitos de la sangre heparinizada mediante centrifugación diferencial usando Histopaque 1.077 (Sigma). Se dispusieron 20 ml de sangre completa heparinizada sobre 15 ml de Histopaque en un tubo de polipropileno estéril de 50 ml (Falcon), y se centrifugó entonces a 1000 x durante 30 min a temperatura ambiente. Se desechó la capa de plasma, se recogió cuidadosamente la capa de células mononucleares y se lavó tres veces con disolución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2). Se lisaron los eritrocitos contaminantes con 50 tampón de KCl con 0,87% de amonio invirtiendo durante 2 min a temperatura ambiente, y añadiendo entonces inmediatamente 30 ml de PBS.

Se suspendieron los sedimentos celulares lavados en PBS y se contaron usando un hemacitómetro y azul de tripano para determinar el porcentaje de viabilidad. Los recuentos celulares diferenciales mostraron consistentemente más de un 96% de linfocitos, 1% de monocitos y menos de 3% de granulocitos en la suspensión celular. 55

Se suspendieron los linfocitos a 2 x 106/ml en RPMI 1640 que contenía FCS al 10% exento de endotoxinas (Cellect

Gold; ICN Biomedicals, Inc., Costa Mesa, CA), L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 µg/ml y gentamicina 50 µg/ml (Sigma) y se añadieron 250 µl a placas de fondo redondeado de 96 pocillos o placas de fondo plano, dependiendo de los fines del experimento.

Para investigar la proliferación de linfocitos en respuesta a antígenos individuales, se efectuó un ensayo de blastogénesis. Brevemente, se incubaron inicialmente PBMC en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos 5 durante 3 días a 37ºC en atmósfera humidificada con 5% de CO2. Se estimularon entonces los cultivos con ConA (10 µg/ml) y se añadieron a cada pocillo derivado de proteína purificado (PPD) (cada control positivo) (10 µg/ml) o cada proteína recombinante purificada (10 µg/ml) y 40 µl (1,0 µCi) de metil-3H-timidina (PerkinElmer Life Science Inc, MA, EE.UU.) en medio de cultivo. Se incubaron las células durante 18 h adicionales en las mismas condiciones y se recogieron entonces las células usando un recolector celular semiautomático (Skatronas Liter Norway). Se registró la 10 actividad blastogénica como cuentas por minutos (cpm) de radiactividad basada en el recuento de centello líquido. Los resultados se expresaron como índices de estimulación (IE) calculados como sigue:

)()()()()(fondodeCPMnegativoocontroldecultivodeCPMfondodeCPMantígenoconestimuladopositivocultivodeCPMónestimulacideíndiceIE

Para este y otros ejemplos de la presente memoria, se efectúo el análisis estadístico de los datos en Excel y el paquete de software GraPad Prism versión 2.0. Se analizaron las diferencias entre grupos individuales, antígenos y 15 expresión de gen de citocina con la prueba de t de Student. Las diferencias se consideraron significativas si se obtenían valores de probabilidad P<0,0.

Como se demuestra en la Fig. 1, las actividades proliferativas de PBMC bovinas de vacas con excreción media eran mayores que en otros grupos en respuesta a todas las proteínas recombinantes y dos controles positivos (P<0,05), aunque había variación entre las vacas individuales. Las PBMC de vacas con excreción media tratadas con los 20 antígenos de 85A, 85B y de proteína de 35 kDa mostraron un índice de estimulación (IE) significativamente mayor (P <0,005) que el de PBMC tratadas con otros antígenos recombinantes. Además, las respuestas proliferativas a la proteína de 35 kDa en animales con baja excreción eran aún mayores que las de los animales con excreción media en respuesta a 85C y SOD (Fig. 1). Por tanto, este ejemplo indica que los antígenos de 85A, 85B y de proteína de 35 kDa pueden ser importantes para afectar a la proliferación de linfocitos en animales expuestos anteriormente a 25 MPT.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra los efectos de antígenos recombinantes sobre la producción de IFN-γ. Para analizar la producción de IFN-γ, se midieron los niveles de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo usando un kit comercial específico de IFN-γ bovino siguiendo las instrucciones del fabricante (Biosource Int. Camarillo, CA). Se leyeron las 30 placas a 450 nm en un lector ELISA Bio-Tek 312E (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT 05404-0998), usando cualquier filtro de referencia de 630 nm a 750 nm. Se calcularon los resultados basándose en la comparación de la densidad óptica (DO) de control negativo y positivo. Los resultados se determinaron como negativos (<DO que el control positivo) o positivos (>DO que el control positivo) respecto al valor de corte según las instrucciones del fabricante. 35

Se midió la producción de IFN-γ después de la estimulación con los cinco antígenos recombinantes o dos controles positivos en PBMC de vacas infectadas y de control no infectadas. Los resultados se presentan en la Fig. 2 como valores de DO corregida (DO de estimulado con antígeno menos DO de control) que representan la elevación de la producción de IFN-γ por los diversos antígenos.

Como puede observarse en la Fig. 2, todos los antígenos recombinantes ensayados inducían una liberación 40 significativa de IFN-γ en cultivos de PBMC bovinas de ganado vacuno infectado en comparación con controles no infectados (P<0,05), y los niveles de IFN-γ eran consistentemente mayores en animales con excreción media que en animales con excreción baja (P<0,05). Los antígenos recombinantes 85A y 85B inducían niveles significativamente mayores de IFN-γ en los animales con baja excreción que los demás antígenos recombinantes ensayados y en comparación con los dos controles positivos (P<0,05). Por tanto, este ejemplo indica que los antígenos 45 recombinantes 85A y 85B pueden ser importantes en la estimulación de una respuesta mediada por célula contra MPT.

Ejemplo 3

Este ejemplo proporciona una comparación de anticuerpos en sueros aislados de vacas no infectadas e infectadas que reconocen los antígenos recombinantes de la invención. 50

Se efectuaron ensayos de enzimoinmunosorción (ELISA) para evaluar la reactividad sérica de los antígenos recombinantes siguiendo las etapas descritas anteriormente (Shin, y col., (2004) J. Vet. Sci. 5: 111-117). Brevemente, se optimizó un ELISA indirecto usando 2,5, 5 o 10 µg/ml de cada antígeno y suero diluido 1:100 mediante titulación en damero. Se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo plano (Maxisorp, Nunc, Dinamarca) con 100 µl de cada antígeno en tampón carbonato-bicarbonato (Na2CO3 14,2 mM, NaHCO3 34,9 mM, NaN3 3,1 mM, 55

pH 9,5) a 4ºC durante una noche, seguido de lavado tres veces con PBS que contiene 0,05% de Tween 20 (PBST, tampón de lavado) usando un lavador de placa de micropocillos Bio-Tek ELx405 (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT). Los sitios no recubiertos en los pocillos se bloquearon con leche desnatada al 5% en PBST a 37ºC durante 1 h. Se lavaron las placas dos veces con PBST y se añadieron 100 µl de anticuerpo dirigido contra IgG-HRP bovina conjugada diluido óptimamente (1:25.000) (Sigma) a todos los pocillos y se incubó a 37ºC durante 1 h. Se lavaron 5 las placas tres veces con PBST y se añadieron 200 µl de ácido 2,2’-azinobistiazolin-6-sulfónico (Sigma) a cada pocillo. Se incubaron las placas a 37ºC en la oscuridad. Después de 30 min de incubación, se añadió disolución de terminación (HCl 1 m) y se leyeron las placas 3 veces a 405 nm a intervalos de 2 minutos en un lector ELISA Bio-Tek 312 (BioTEK Instruments, Inc, Winooski, VT 05404-0998). Se incluyeron en cada placa sueros positivos y negativos y controles de antígeno y anticuerpo. 10

Se representan en la Fig. 3 los resultados de medir los niveles de anticuerpos de IgG ante los antígenos recombinantes en sueros de ambos grupos de excreción y controles sanos. Aunque había una amplia variación en el contenido de anticuerpo en los sueros de vacas individuales, las respuestas de anticuerpo de IgG medias contra todos los antígenos recombinantes aumentaron significativamente en ambos grupos de excreción baja y media. No se observaron diferencias significativas entre los niveles medios de anticuerpo del grupo de baja excreción ante 15 ninguno de los antígenos ensayados (Fig. 3). Sorprendentemente, las respuestas de anticuerpo ante la proteína de 35 kDa eran significativamente mayores en el grupo de excreción media que las de los demás antígenos (P<0,05), lo que puede ser importante porque la proteína de 35 kDa es también eficaz para estimular la proliferación de linfocitos, y por tanto puede estimular ambas respuestas inmunitarias mediadas por célula y humoral.

Ejemplo 4 20

Este ejemplo demuestra los cambios en la distribución de subconjuntos de linfocitos en PBMC obtenidas de vacas no infectadas, con excreción baja y con excreción media en respuesta a la estimulación con los antígenos recombinantes.

Para efectuar este análisis, se efectuó un análisis citométrico de flujo monocolor con anticuerpos monoclonales contra marcadores linfocíticos bovinos (Tabla 2). Brevemente, se lavaron las células tres veces con tampón FACS, 25 se incubaron con el primer anticuerpo (Tabla 1) durante 30 min a 4ºC, se lavaron tres veces, se incubaron posteriormente con un anticuerpo de caballo dirigido contra inmunoglobulina de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (Vector) durante 30 min a 4ºC, se lavaron dos veces y se recogieron en 200 µl de tampón de fijación FACS antes del análisis. Se realizó el análisis en un citómetro de flujo (FACSCalibur; Becton Dickson). Se usó una adquisición selectiva con dispersión frontal-dispersión lateral para medir de 5.000 a 10.000 linfocitos por muestra. 30 Basándose en los datos de fluorescencia de los linfocitos, se expresaron los resultados como el porcentaje de células con tinción positiva respecto a una muestra teñida con un anticuerpo de control de isotipo irrelevante.

Tabla 2

Anticuerpo monoclonal

Isotipo Antígeno identificado Referencia de Ab

IL-A11

IgG2a CD4 (Brodersen, y col., 1998. Vet. Immunol. Immunopathol. 64: 1-13)

CACT80C

IgG1 CD8α (Davis, y col. 1989. Am. Fish. Soc. Symp. 7: 521-540.)

MM1A

IgG1 CD3 (Rhodes, y col. 2001. J. Immunol. 166: 5604-5610)

BAQ15A

IgM Linfocitos B CD21 (Mukwedeya, y col. 1993. Vet. Immunol. Immunopathol. 39: 177-186)

CACT116A

IgG1 CD25 (IL-2Ra) (Naessens y col. 1992. Immunology 76: 305-309.)

CACT63A

IgG1 Linfocitos T γδ (Davis, y col. 1996. Vet. Immunol. Immunopathol. 52: 301-311)

Como se representa en las Fig. 4A-4D, se examinaron en los subconjuntos de linfocitos T y/o linfocitos B 35 estimulados con antígeno mediante citometría monocolor las diferencias en el porcentaje de subconjuntos de linfocitos CD4+, CD8+, CD3+ (CD3+ se representa en la Fig. 5), Cod21+ y CD25+, así como de linfocitos γδ+ en cultivos de PBMC de ambos grupos de excreción y controles sanos después de la estimulación con cada antígeno recombinante (Fig. 4 y 5). Todos los subconjuntos de linfocitos investigados en este estudio aumentaron pero, dependiendo de los niveles de excreción bacteriana, hubo ligeras diferencias (P<0,05) entre ganado vacuno no 40 infectado y animales con excreción baja según los antígenos recombinantes.

CD3 es un panmarcador de linfocitos T que se expresa por células CD4+ y CD8+ así como linfocitos T γδ+. La proporción de linfocitos T CD25+ aumentaba en el cultivo independientemente del antígeno recombinante usado (P<0,05) (Fig. 4C). Estos resultados sugieren que todos los antígenos usados en este estudio son capaces de estimular linfocitos T sensibilizados. 45

Aunque todos los antígenos recombinantes ensayados aumentaban la proporción de células CD4+ en cultivos de PBMC bovinas de ganado vacuno infectado en comparación con controles no infectados (P<0,05), 85A y 85B aumentaban la proporción de linfocitos T CD4+ a niveles significativamente mayores que 85C, la proteína de 35 kDa y SOD (P<0,05) (Fig. 4A). La proporción de linfocitos T CD4+ era también mayor en los cultivos tratados con 85A y 85B entre las PBMC de animales con excreción media que de animales con excreción baja (P<0,05) (Fig. 4A). 5 Adicionalmente, 85A y 85B no aumentaban los linfocitos T CD4+ en ganado vacuno no infectado. Aun sin pretender limitarse a teoría particular alguna, estos resultados pueden indicar que los antígenos de 85A y 85B inducen linfocitos T CD4+ sensibilizados específicamente por MTP y proporcionan inmunidad protectora frente a infección por MTP al mantener poblaciones de linfocitos T CD4+ en circulación en la fase infecciosa temprana, concretamente, en el momento en que ocurre por primera vez la colonización mucosa por MPT. 10

En contraposición con el aumento de células CD4+ inducido por todos los antígenos respecto a los controles no infectados, se encontró un aumento significativo en la proporción de linfocitos T CD8+ solo en cultivos tratados con 85A, 85B y 85C, y la proporción de células CD8+ era también mayor en cultivos tratados con 85A y 85B entre las PBMC de animales con excreción media que de animales con excreción baja (P<0,05) (Fig. 4B). Por tanto, estos antígenos pueden estimular preferiblemente las respuestas mediadas por células. 15

Solo SOD fue capaz de aumentar significativamente la proporción de linfocitos T γδ+ en los cultivos de animales con excreción media (P<0,05) (Fig. 4D). Sin embargo, SOD estimulaba linfocitos en un menor grado que los demás antígenos ensayados, excepto por los linfocitos γδ+, ya que el número de linfocitos T γδ+ era significativamente mayor en cultivos de PBMC tratados con SOD en ganado vacuno no infectado, así como en ambos grupos de excreción (Fig. 4D). Por tanto, SOD puede estimular preferiblemente linfocitos T γδ+ en comparación con los demás 20 antígenos. Adicionalmente, debido a que los linfocitos T γδ+ son numerosos en los tejidos de mucosa, que son el punto de entrada de patógenos micobacterianos, el antígeno de SOD puede ser importante en las etapas más tempranas de la infección mediante su estimulación preferida de linfocitos T γδ+.

Todos los antígenos recombinantes ensayados aumentaban significativamente la proporción de linfocitos B CD21+ en cultivos de PBMC bovinas de animales con excreción baja y media en comparación con controles no infectados 25 (P<0,05) (Fig. 6). De forma interesante, la proporción de linfocitos B CD21+ era significativamente mayor en cultivos de PBMC bovinas de animales con excreción media que de los demás antígenos recombinantes ensayados (P<0,05).

Ejemplo 5

Este ejemplo proporciona una comparación de la estimulación de la producción de ARNm de citocina en PBMC 30 bovinas después de la estimulación con antígenos recombinantes.

Para la preparación de ARN y el tratamiento con ADNasa I de las células, se obtuvieron sedimentos celulares de PBMC y se lavaron dos veces con 50 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS), se sedimentaron y se lisaron 5 x 106 células con 350 µl de tampón de lisis según las recomendaciones del fabricante (RNeasy mini kit, Qiagen, CA), y se mantuvieron a -80ºC hasta la extracción de ARN y la síntesis de ADN complementario (ADNc). Se 35 extrajo el ARN total (ARNt) de las células lisadas o PMBC usando el RNeasy mini kit (Qiagen). Se trató el ARNt extraído con 10 U/µl de ADNasa I exenta de ARNasa a 37ºC durante 10 min, seguido de inactivación térmica a 95ºC durante 5 min y se enfrió entonces en hielo.

Para la síntesis de ADNc, se efectuó una transcripción inversa (TI) en un volumen final de 20 µl que contenía 1,6 µl de ARN total, 200 U de TI Superscript II (GibcoBRL), Tris-HCl 50 mM (pH 8,3), KCl 75 mM, MgCl2 3 mM, DTT 0,01 M 40 y dNTP 0,5 mM. Se sometió la mezcla de reacción a 42ºC durante 50 min y se inactivó a 70ºC durante 15 min. Se analizó el ADNc inmediatamente o se almacenó a -20ºC hasta su uso.

Para efectuar un análisis cuantitativo instantáneo (PCR-TI), se transcribieron de forma inversa aproximadamente 1 a 5 µg de ARN total de cada grupo de tratamiento usando la transcriptasa inversa Superscript, hexámeros aleatorios y reactivos de transcriptasa inversa (Gibco BRL). Se diseñaron los cebadores y sondas instantáneos mediante el 45 software Primer Express (Applied Biosystems) usando las secuencias de GAPDH bovina, citocinas y factores de crecimiento obtenidos de Genbank. Se marcaron las sondas internas con el tinte informador fluorescente 5-carboxifluorosceína (FAM) en el extremo 5’ y el tinte inactivador N’,N’,N’,N’,N’-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA) en el extremo 3’. La mezcla de PCR consistía en cebadores 400 nM, sonda Taqman 80 nM y PCR Mastermix disponible comercialmente (TaqMan Universal PCR Mastermix, Applied Biosytems) que contenía Tris-HCl 50 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, trifosfatos de desoxinucleótidos 2,5 mM, 0,625 U de ADN polimerasa AmpliTaq Gold por reacción, 0,25 U de AmpErasw UNG por reacción y 10 µl de muestra de ADNc diluida en un volumen final de 25 µl. Se dispusieron las muestras en placas de 96 pocillos y se amplificaron en un fluorómetro automatizado (ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems). Las condiciones de amplicón eran 2 min a 50ºC, 10 min a 95ºC, seguido de 40 ciclos a 95ºC durante 15 s y 60ºC durante 1 min. Se realizó la 55 cuantificación final usando el procedimiento de umbral de ciclo comparativo (UC) y se notifica como la transcripción relativa o la diferencia en nº de veces respecto a un ADNc calibrador.

Como puede observarse en la Fig. 7, todos los antígenos recombinantes estimulaban altos niveles de ARNm de IL-2

a partir de PBMC de animales con excreción media, teniendo el complejo antigénico 85 mayor efecto que la proteína de 35 kDa o SOD (P<0,05) (Fig. 7). 85A inducía también un alto nivel de ARNm de IFN-γ, IL-12p40 y TNF-α (Fig. 8A, B y C, respectivamente) en animales de excreción media (P<0,05). Sorprendentemente, las PBMC estimuladas con el antígeno de proteína de 35 kDa expresaban en gran medida ARNm de IL-4 tanto en animales de excreción baja como media (P<0,05) (Fig. 9). Esta inducción del ARNm de IL-4 por la proteína de 35 kDa aumentaba 5 significativamente dependiendo de los niveles de excreción (P<0,001). En contraposición, no se observaron diferencias significativas entre los demás antígenos (P>0,05). Estos estudios están de acuerdo con los resultados presentados en el Ejemplo 3, que indican que las respuestas inmunitarias ante la proteína de 35 kDa pueden ser más importantes en la etapa tardía de la enfermedad, puesto que el análisis de citometría de flujo mostró que la proteína de 35 kDa inducía fuertemente la proliferación de linfocitos B, especialmente en animales con excreción 10 media (Fig. 3). Por tanto, este ejemplo demuestra que todos los antígenos recombinantes ensayados pueden estimular una respuesta inmunitaria mediada por célula.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra el efecto de vacunar ratones con polinucleótidos de ADN que codifican antígenos de MPT y aplicar infección con WIT posteriormente. 15

Para demostrar el efecto de las construcciones de ADN, se obtuvieron ratones C57/BL6 hembra exentos de patógenos específicos de Harlan Sprague Dawley Inc (Indianápolis, IN). Los ratones eran de 8 semanas de edad en el momento de la vacunación. Había cinco grupos de ratones y cada grupo de vacuna consistió en 25 animales durante este experimento. Se alimentaron los animales con pienso de ratones comercial y agua a voluntad, y se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 horas. 20

Se usó el plásmido de expresión eucariótica comercialmente disponible pVR1020 (Vical, Inc., San Diego, Calif.) para la vacuna de ADN. Este plásmido contiene un promotor de citomegalovirus inmediato-temprano para asegurar una expresión eficaz en un hospedador eucariótico, así como la señal de secreción de activador de plasminógeno de tejido humano (hTPA) para facilitar la secreción del antígeno diana de la célula eucariótica (Brandt, y col. 2000. Infect. Immun. 68: 791-795). Se amplificó ADN que codifica los genes de MPT 85A, 85B, 85C, SOD, 35kDa, 25 35kDa(li), MptC, MptD y similar a ESAT-6 mediante reacción en cadena de la polimerasa a partir de ADN genómico de MPT usando los cebadores específicos de gen enumerados en la Tabla 1. Brevemente, los cebadores usados para la amplificación de las secuencias de codificación de MPT 85A, 85B y 85C incluían cada uno un sitio BamHI. Un cebador para la amplificación de secuencias de codificación de SOD, MptC, MptD, 35kDa y similar a ESAT6 incluía un sitio BamHI, mientras que el otro incluía un sitio BglII. Se digirieron los productos de amplificación usando 30 las enzimas de restricción indicadas y se clonaron en el vector de clonación pCR2.1 TOPO comercialmente disponible (Invitrogen, CA) usando técnicas estándar. Se subclonaron entonces los genes de MPT en dirección 3’ de la señal de secreción de activador de plasminógeno de tejido humano (hTPA) en el plásmido pVR1020 (Vical, Inc., San Diego, Calif.) usando técnicas estándar y esencialmente como se describe anteriormente (Dheenadhayalan y col., (2002) DNA Seq. 13: 287-294; Shin y col., (2004) J. Vet. Sci. 5: 111-117) (Skeiky y col., (1998) J. Immunol. 161: 35 6171-6179). Se transfectaron estas construcciones recombinantes en células HEK-293 (riñón embriónico humano) usando el reactivo de transfección Lipofectamin™ 2000 (Invitrogen, CA) y se confirmó la expresión del antígeno a nivel de transcripción usando PCR-TI.

Para inmunización y aplicación de la infección por MPT, se dividieron los ratones en cinco grupos diferentes (Tabla 3). Se administró a los ratones 50 µg de cada ADN en 50 µl de PBS por dosis mediante inyección intramuscular. Se 40 inmunizaron los ratones tres veces a intervalos de 3 semanas. Se inyectaron adicionalmente genes de IL-12 como se indica en la Tabla 3. Tres semanas después de los segundos recuerdos, se aplicó la infección a los animales mediante la inyección intraperitoneal de 109 unidades UFC de MPT. Se sacrificaron 6 animales de cada grupo en la 4ª, 8ª, 12ª y 16ª semanas después de la aplicación de la infección y se enumeró la recuperación de bacterias de órganos (hígado, bazo, nódulo linfático mesentérico, pulmón) en agar inclinado en yema de huevo de Herrold (HEY) 45 suplementado con micobactina J y antibióticos como se describe anteriormente (Kamath, y col. Infect. Immun. 67: 1702-1707). Después de la aplicación de la infección, se recogieron también las heces cada semana de las jaulas de los ratones y se cultivaron usando el mismo agar. Se fijaron los cultivos, incluyendo hígado, bazo, pulmón, intestino y nódulo linfático mesentérico, mediante inmersión en formalina tamponada al 10% y se procesaron para examen histopatológico usando técnicas de histotecnología estándar. Se valoró la presencia de MPT (bacterias 50 acidorresistentes) en el hígado y bazo de cada ratón mediante tinción de Ziehl-Neelsen.

Tabla 3

Grupos

1 2 3 4 5

Vacuna de ADN

85A, 85B 85C, 35kDa y SOD Grupo 1 + IL-2 MptC, MptD similar a ESAT61 y 35kDa(Li) Grupo 3 + IL-12 Control de vector (pVR1020)

La Fig. 10 muestra la carga micobacteriana reducida en los hígados y bazos de ratones vacunados respecto a los

controles a las 4, 8 y 12 semanas después de la aplicación de la infección, y muestra una reducción de aproximadamente un 90% (1 log 10) de la carga bacteriana en los bazos e hígados de ratones vacunados con el cóctel de vacuna de ADN de MPT en comparación con los controles no inmunizados. Los datos de histopatología relativos a hígado y bazo a las 4, 8 y 12 semanas después de la aplicación de la infección eran análogos a los resultados de crecimiento bacteriano. Se observaron diferencias sustanciales en tejidos de hígado y bazo tomados 5 de animales inmunizados con el cóctel de plásmido en comparación con ratones no inmunizados (Fig. 11). Los controles no vacunados infectados por MPT tenían numerosos granulomas dispersados aleatoriamente con macrófagos epitelioides centrales rodeados por linfocitos pequeños. La tinción de Ziehl-Neelsen reveló que se observaban numerosos bacilos acidorresistentes (Fig. 12A e inserto). En contraposición, la infección era mucho menos grave en ratones vacunados con el cóctel de vacuna de ADN de MPT (Fig. 12B). 10

Por tanto, este ejemplo demuestra que la administración de vectores de expresión de ADN que codifican al menos cinco antígenos de MPT puede proporcionar una protección significativa frente a infección por MPT.

Listado de secuencias

<110> Chang, Y.F.

<120> COMPOSICIONES PARA DESENCADENAR UNA RESPUESTA INMUNITARIA CONTRA 15 MYCOBACTERIUM AVIUM SUBESPECIE PARATUBERCULOSIS

<130> 018617.00120

<150> US 60/653.536

<151> 16-02-2005

<160> 24 20

<210> 1

<211> 828

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 25

<223> Secuencia de codificación de ADN de proteína de 35 kDa de MPT

<400> 1

<210> 2

<211> 275

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 5

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de la proteína de 35 kDa

<400> 2

<210> 3

<211> 1782

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 5

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica la proteína MptC

<400> 3

<210> 4

<211> 593

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de la proteína MptC 5

<400> 4

<210> 5

<211> 288

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 5

<220>

<223> Secuencia de ADN que codifica la proteína similar a ESAT-6

<400> 5

<210> 6

<211> 95

<212> PRT 5

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de la proteína similar a ESAT-6

<400> 6

10

<210> 7

<211> 627

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 15

<223> Secuencia de ADN que codifica la proteína MptD

<400> 7

<210> 8

<211> 208

<212> PRT

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 5

<220>

<223> Secuencia aminoacídica de MptD

<400> 8

<210> 9

<211> 27

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 5

<223> Cebador directo de 85A

<400> 9

<210> 10

<211> 21 10

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador inverso de 85A

<400> 10 15

<210> 11

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 20

<220>

<223> Cebador directo de 85B

<400> 11

<210> 12 25

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador inverso de 85B 30

<400> 12

<210> 13

<211> 23

<212> ADN 35

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador directo de 85C

<400> 13

5

<210> 14

<211> 21

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 10

<223> Cebador inverso de 85C

<400> 14

<210> 15

<211> 20 15

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador directo de SOD

<400> 15 20

<210> 16

<211> 23

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 25

<220>

<223> Cebador inverso de SOD

<400> 16

<210> 17 30

<211> 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador directo de 35 kDa 35

<400> 17

<210> 18

<211> 26

<212> ADN 5

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador inverso de SOD

<400> 18

10

<210> 19

<211> 18

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 15

<223> Cebador directo de MptC

<400> 19

<210> 20

<211> 23 20

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador inverso de MptC

<400> 20 25

<210> 21

<211> 18

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis 30

<220>

<223> Cebador directo de MptD

<400> 21

<210> 22 35

<211> 21

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador inverso de MptD 5

<400> 22

<210> 23

<211> 18

<212> ADN 10

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220>

<223> Cebador directo de similar a ESAT6

<400> 23

15

<210> 24

<211> 19

<212> ADN

<213> Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis

<220> 20

<223> Cebador inverso de similar a ESAT6

<400> 24

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de una composición que comprende uno o más vectores de expresión para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un rumiante contra M. paratuberculosis;

   en el que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, y en el que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos 5 antígenos de M. paratuberculosis; y

   en el que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD).
2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que el rumiante es un animal bovino, una oveja, una cabra, un ciervo o un alce. 10
3. 3. Uso según la reivindicación 2, en el que el rumiante es animal bovino.
4. 4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el rumiante no está infectado por M. paratuberculosis.
5. 5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el rumiante está infectado por M. paratuberculosis.
6. 6. Uso según la reivindicación 3, en el que el animal bovino tiene la enfermedad de Johne.
7. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el animal está preñado. 15
8. 8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable.
9. 9. Uso según la reivindicación 8, en el que la composición comprende adicionalmente un coadyuvante.
10. 10. Una composición que comprende uno o más vectores de expresión para uso en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra M. paratuberculosis en un rumiante; 20

    en la que el uno o más vectores de expresión comprenden al menos cinco secuencias polinucleotídicas aisladas que codifican antígenos de M. paratuberculosis, en la que los vectores de expresión son capaces de expresar dichos antígenos de M. paratuberculosis; y

    en la que los antígenos de M. paratuberculosis son los antígenos de M. paratuberculosis 85A, 85B, 85C, proteína de 35 kDa de M. paratuberculosis y superóxido dismutasa (SOD). 25
11. 11. La composición de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.
12. 12. La composición de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un coadyuvante.
13. 13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o de una composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la composición comprende un vector de expresión que comprende dichas al menos 30 cinco secuencias polinucleotídicas aisladas, en el que dicho vector de expresión es capaz de expresar dichos al menos cinco antígenos de M. paratuberculosis.
14. 14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, o de una composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, en el que la composición comprende al menos cinco vectores de expresión, en el que cada uno de dichos al menos cinco vectores de expresión comprende una diferente de dichas al menos cinco secuencias 35 polinucleotídicas aisladas, y en el que cada uno de dichos al menos cinco vectores de expresión es capaz de expresar uno diferente de dichos al menos cinco antígenos de M. paratuberculosis.