BRPI0608455A2

BRPI0608455A2 - composição compreendendo conjugados de alérgenos de gato bem como vacinas, composições farmacêuticas e medicamentos contendo a mesma, e processo para sua produção

Info

Publication number: BRPI0608455A2
Application number: BRPI0608455-9A
Authority: BR
Inventors: Martin Bachmann; Monika Bauer; Klaus Dietmeier; Nicole Schmitz; Stephan Utzinger
Original assignee: Cytos Biotechnology Ag
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2010-01-05
Also published as: US7767212B2; MX2007011160A; AU2006224529A1; RU2414239C2; EP1868642B1; NZ561040A; US20090175896A1; ES2424229T3; CA2599218C; RU2007138265A; CN101141979A; JP5302671B2; CY1114171T1; DK1868642T3; WO2006097530A3; CA2599218A1; CN103203016A; US20110045013A1; WO2006097530A2; PL1868642T3

Abstract

COMPOSIçãO COMPREENDENDO CONJUGADOS DE ALéRGENOS DE GATO BEM COMO VACINAS, COMPOSIçõES FARMACêUTICAS E MEDICAMENTOS CONTENDO A MESMA, E PROCESSO PARA SUA PRODUçãO. A presente invenção refere-se aos campos de medicina, saúde pública, imunologia, biologia molecular e virologia. A invenção fornece composições compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral e, pelo menos, um antígeno, particularmente, pelo menos um antígeno felino, e mais particularmente pelo menos um antígeno felino que é um alérgeno humano. Em certas concretizações, o antigeno é um antígeno da Fel dl, ou fragmento da mesma, ligado covalentemente à VLP. A invenção fornece também processos para produção das composições. As composições da invenção induzem respostas imunológicas eficientes, particularmente respostas de anticorpos, em mamíferos, particularmente em seres humanos. As composições e processos da invenção são úteis na produção de vacinas, particularmente para o tratamento e/ou prevenção de alergias à caspa de gato e a outros antigenos e alérgenos de gatos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONJUGADOS DE ALÉRGENOS DE GATO E USOS DOS MESMOS".

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos campos de medicina, saúde

pública, imunologia, biologia molecular e virologia. A invenção fornece composições compreendendo uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula de vírus e, pelo menos, um antígeno, particularmente, pelo menos, um antígeno felino e, mais particularmente, pelo menos um antígeno felino que é um alérgeno humano. Em certas concretizações, o antígeno é um antígeno Fel d1, ou um fragmento do mesmo, ligado covalentemente à VLP. A invenção fornece também processos para a produção das composições. As composições da invenção induzem respostas imunológicas eficientes, em particular, respostas de anticorpos, em mamíferos, particularmente, humanos. As composições e processos da invenção são úteis na produção de vacinas, em particular para o tratamento e/ou prevenção de alergias à capas de gatos e a outros antígenos e alérgenos de gatos. Técnica relacionada

O gato doméstico (Felis domesticus) é uma fonte importante de alérgenos internos (Lau, S. et al. (2000) Lancet 356, 1392-1397). De fato, gatos são encontrados em aproximadamente 25% das casas nos países ocidentais e a alergia a gatos é encontrada em grande parte da população. A gravidade dos sintomas varia de rinite leve e conjuntivite à asma exacerbada com risco de vida.

Embora os pacientes sejam ocasionalmente sensibilizados por diversas moléculas diferentes presentes na caspa e pelos de gato, o principal alérgeno é o Fel d 1 (isto é, alérgeno 1 do Felis domesticus, antigo Cat 1, isto é, alérgeno Cat 1). A importância deste alérgeno foi realçada em inúmeros estudos. De fato, mais de 80% dos pacientes alérgicos a gatos exibem anticorpos IgE contra este potente alérgeno (van Ree, R. et al. (1999) J. Al-lergyClin ImmunoM 04, 1223-1230).

O Fel d1 é uma glicoproteína ácida com 35-39 kDa contendo 10-20% de carboidratos ligados a N, estando presente no pêlo, saliva e glândulas lacrimais de gatos. Ela é formada por dois heterodímeros ligados de modo não covalente. Cada heterodímero é constituído por um peptídeo com 70 resíduos (conhecido como "cadeia 1") e um peptídeo com 78, 85, 90 ou 92 5 resíduos (conhecido como "cadeia 2"), que são codificados por genes diferentes (consultar Duffort, O. A. era/. (1991) Mol Immunol 28, 301-309; Mor-genstern, J. P. et at, (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88, 9690-9694 and Grif-fith, I. J. era/. (1992) Gene 113, 263-268).

O tratamento de pacientes alérgicos a gatos é efetuado atualmente por terapia dessensibilizante envolvendo injeções repetidas com doses crescentes de um extrato bruto de caspa de gatos ou de peptídeos curtos derivados da Fel d1. Lilja et al e Hedlin et aí descreveram um esquema para dessensibilização durante o qual foram fornecidos extratos brutos de caspa de gato a pacientes alérgicos a gatos (Lilja, Q et al. (1989) J Allergy Clin Immunol 83, 37-44 and Hedlin et al. (1991) J Allergy Clin Immunol 87, 955-964). Este esquema levou pelo menos de dois a três anos e os pacientes após o tratamento de três anos ainda apresentaram sintomas sistêmicos. O uso de peptídeos curtos, derivados da Fel d1, para a dessensibilização resultou em diferenças não significantes entre o grupo do peptídeo e o grupo do placebo (Oldfield, W. L. et al. (2002) Lancet 360, 47-53). A eficácia foi somente observada quando uma quantidade grande (750 ug) do peptídeo curto foi fornecida aos pacientes (Norman, P. S. et al. (1996) Am J Respir Crit Care Med 154, 1623-1628).

Os efeitos colaterais alérgicos como, reações asmáticas tardias, foram relatados tanto no tratamento com extrato bruto de caspa de gato como no tratamento com peptídeo curto. Por conseguinte, o choque anafilático decorrente de alérgeno injetado é uma questão importante de segurança em qualquer esquema para dessensibilização. No entanto, a prevenção deste efeito, pela redução da quantidade de alérgeno injetado, ou reduz a eficácia do tratamento ou prolonga o tratamento. Dessa forma, há uma grande necessidade na área de tratamento de alergia a gato para regimes alternativos de dessensibilização que sejam capazes de reduzir os sintomas alérgicos,porém que não desencadeiem a reação alérgica colateral. Sumário da Invenção

Descobriu-se surpreendentemente agora que as composições e vacinas da invenção compreendendo, respectivamente, pelo menos um antígeno da Fel d1, ou fragmento da mesma da invenção, são não só capazes de induzir respostas imunológicas contra o Fel d1, e, pela presente, em particular respostas de anticorpos, capazes de dessensibilizar pacientes que sofrem de alergia a gato e, pela presente, em particular, dentro de um curto período de tempo, indicando a alta eficácia das composições e vacinas da invenção, respectivamente. Ademais, descobriu-se surpreendentemente que o Fel d1 da invenção, quando ligado covalentemente à VLP, de acordo com a invenção, reduziu dramaticamente a atividade anafilática, quando comparado ao Fel d1 da invenção que estava ligado covalentemente à VLP, embora mantendo um alto grau de antigenicidade e imunogenicidade. Esse fato representa uma grande vantagem sobre tratamentos contra alergia a gato da técnica anterior uma vez que as composições e vacinas da invenção, respectivamente, reduzem dramaticamente o risco de provocar choque anafilá-tico em animais e seres humanos a serem imunizados. Além disso, as composições e vacinas da invenção, respectivamente, permitem que o antígeno seja fornecido em doses muito mais altas em comparação a tratamentos contra alergia a gatos da técnica anterior, o que por seu turno melhora a eficácia e/ou encurta a duração do esquema total de dessensibilização. Dessa forma, as composições e vacinas da invenção, respectivamente, induzem respostas imunológicas potentes contra o Fel d1, porém, sem desencadear uma reação alérgica.

Dessa forma, na primeira, característica, a presente invenção fornece uma composição que compreende (a) uma partícula central com pelo menos um sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral, e (b) pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de fixação, em que o referido pelo menos único antígeno é uma proteína Fel d1, ou fragmento da Fel d1, e em que (a) e (b) são ligados covalentemente por meio de pelo menosde um primeiro sítio de fixação referido e pelo menos um segundo sítio de fixação referido, para formar de preferência um arranjo antigênico ordenado e repetido.

Em outra característica, a presente invenção fornece uma composição de vacina. Além disso, a presente invenção fornece um processo para administração da composição da vacina para um ser humano ou mamífero não humano como um cachorro alérgico a gato, de preferência ao Fel d1 de gato. Em uma concretização preferida, a composição da vacina compreende ainda pelo menos um adjuvante. A composição da vacina da invenção é, no entanto, capaz de induzir uma forte resposta imunológica, particularmente resposta de anticorpos, sem a presença de pelo menos um adjuvante. Dessa forma, em uma concretização de preferência, a vacina é desprovida de um adjuvante. A prevenção do uso de adjuvante pode reduzir uma possível ocorrência de efeitos colaterais, relativos ao uso de adjuvantes.

Em uma concretização preferida, a VLP incluída na composição e na composição da vacina, respectivamente, é produzida por recombinação em um hospedeiro e a VLP é essencialmente livre do RNA do hospedeiro, de preferência, livre de ácidos nucleicos do hospedeiro. O mesmo é vantajoso para reduzir, ou de preferência, eliminar a quantidade de hospedeiro, preferencialmente livre de ácidos nucleicos do hospedeiro, para evitar respostas não desejadas de célula T, bem como outros efeitos colaterais não desejados como, por exemplo, febre.

Em uma concretização preferida, a composição da invenção compreende ainda pelo menos uma substância imunoestimuladora, de preferência, pelo menos um ácido nucléico imunoestimulador. Em ainda outra concretização de preferência, o ácido nucléico imunoestimulador está contido na VLP da invenção. A inclusão de substâncias imunoestimuladoras, preferencialmente, ácidos nucleicos imunoestimuladores, na composição da invenção pode direcionar as respostas imunológicas para respostas Th1 e, pelo mesmo, suprimir as respostas Th2 e, dessa forma, suprimir a produção de IgE.Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para o tratamento de alergia a gato pela administração da composição ou vacina da invenção, respectivamente, a um alvo alérgico a gato, de preferência humano.

Em ainda um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo a composição da invenção e um veículo farmacêutico aceitável.

Em mais um aspecto, a presente invenção fornece um processo para produção da composição da invenção compreendendo (a) uma partícuIa central com pelo menos um sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral; (b) provendo pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de fixação, em que o referido antígeno é uma proteína Fel d1 ou fragmento da Fel d1; e (c) combinando a referida partícula central e o referido pelo menos único antígeno para a produção da referida composição, em que o referido pelo menos único antígeno e a referida partícula central estão ligados por meio de pelo menos o referido primeiro e, pelo menos, o referido segundo sítios de fixação.

Em um aspecto, a invenção fornece uma proteína de fusão da Fel d1, compreendendo a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1, fundida por meio de um espaçador aminoácido, que liga o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia, em que o referido espaçador aminoácido é constituído por uma seqüência de aminoácidos com 10-30 resíduos de ami-noácidos e em que a referida proteína de fusão é produzida em E.coli ou em que a referida proteína de fusão não é glicosilada. Breve Descrição das Figuras

A FIG 1 mostra as proteínas de fusão com Fel d1, renaturadase purificadas, coradas por Coumassie em gel não redutor de SDS-PAGE. As amostras na faixa 1 usaram DTT como agente redutor. As amostras na faixa 2 não usaram DTT.

A FIG 2 mostra a desgranulação de basófilos pelas proteínas de fusão com Fel d1 isoladas ou pelas proteínas de fusão com Fel d1 acopla-das a Qp. O eixo X representa a concentração da proteína Fed d1 correspondente. O eixo Y representa o percentual de basófilos que foram desgra-nulados.

A FIG 3 mostra os resultados do teste de puntura na pele ("prick test") de um voluntário alérgico a gatos que recebeu Qp-FELDI no dia 0, 7 e 14 e os testes foram também conduzidos nos dias 0, 14 e 21.

A FIG 4A mostra a pontuação de escalonamento de dose nasal e pontuação global nasal (FIG 4B) de um voluntário alérgico a gatos que recebeu Qp-FELD 1 no dito 0, 7 e 14 e os testes foram conduzidos no dia 0, 14e21.

Descrição Detalhada da Invenção

Salvo se definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente têm os mesmos significados conforme habitualmente entendidos por aqueles com habilidade comum na técnica a qual pertence esta invenção.

Adjuvante: O termo "adjuvante", conforme utilizado no presente, refere-se a estimuladores não específicos da resposta imunologica ou substâncias que possibilitam a geração de um acúmulo no hospedeiro, o qual quando combinado à vacina e composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção pode fornecer uma resposta imunologica ainda mais acentuada. Pode ser utilizada uma variedade de adjuvantes. Os exemplos incluem adjuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de alumínio e muramildipeptídeo modificado. Outros adjuvantes são géis minerais como hidróxido de alumínio, substâncias de superfície ativa como lisoleicitina, polióois plurônicos, polianions, peptídeos, emulsões oleosas, hemocianina do molusco keyhole limpet, dinitrofenol e adjuvantes humanos potencialmente úteis como BCG (bacilo Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Estes adjuvantes são também bastante conhecidos na técnica. Outros adjuvantes que podem ser administrados junto às composições da invenção incluem, porém sem restrição, imunoestimulantes de monofosforil lipídeos, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sais de alumínio (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 e adjuvantes de tecnologia virossomal. Os adjuvantes po-dem compreender também uma mistura destas substâncias. A VLP foi descrita, de uma maneira geral, como um adjuvante. Contudo, o termo "adjuvan-te", conforme utilizado no contexto deste pedido, refere-se a adjuvantes de-ferentes da VLP que está sendo utilizada para as composições da invenção, mais em acréscimo à referida VLP.

Antígeno: Conforme utilizado no presente, o termo "antígeno" refere-se a uma molécula capaz de se ligar a um anticorpo ou a um receptor da célula T (TCR), se apresentada por moléculas MHC. O termo "antígeno", conforme utilizado no presente, engloba também epítopos de células T. Umantígeno é capaz ainda de ser reconhecido pelo sistema imunológico e/ou ou de induzir uma resposta imunológica humoral e/ou resposta imunológica celular que leva à ativação de linfócitos B e/ou T. Esta pode, contudo, requerer que, pelo menos em certos casos, o antígeno contenha ou esteja ligado a um epítopo de célula Th e seja fornecido em adjuvante. Um antígeno pode ter um ou mais epítopos (epítopos B e T). A reação específica, referida acima, visa indicar que o antígeno reagirá de preferência, tipicamente de maneira altamente seletiva, com o seu anticorpo correspondente ou TCR e não com a multiplicidade de outros anticorpos ou TCRs que poderão ser incitados por outros antígenos. Antígenos, conforme utilizados no presente, podem ser misturas de diversos antígenos individualizados.

Sítio antigênico: O termo "sítio antigênico" e o termo "epítopo antigênico", que são utilizados no presente alternadamente, referem-se a partes contínuas ou descontínuas de um polipeptídeo, que podem se ligar a um anticorpo ou um receptor de célula T, no contexto de uma molécula MHC. Ligação imunoespecífica exclui ligação não específica, porém não exclui necessariamente reatividade cruzada. O sítio antigênico compreende tipicamente 5-10 aminoácidos em uma conformação especial exclusiva para o sítio antigênico.

Associado: O termo "associado" (ou o seu substantivo, associação), conforme utilizado no presente, refere-se a todas as maneiras possíveis, de preferência por interações químicas, pelas quais duas moléculas estão unidas. As interações químicas incluem interações covalentes e nãocovalentes. Exemplos típicos de interações não covalentes são interações iônicas, interações hidrofóbicas ou ligações de hidrogênio, enquanto que interações covalentes têm como base, a título de exemplo, ligações covalentes como ligações éster, éter, éster fosfato, amida, peptídica, carbono-fósforo e carbono-enxofre, como ligações tioéter ou imida.

Sítio de fixação, Primeiro: Conforme utilizado no presente, a expressão "primeiro sítio de fixação" refere-se a um elemento que ocorre naturalmente com a VLP ou que é artificialmente acrescentado à VLP, e ao qual o segundo sítio de fixação pode estar ligado. O primeiro sítio de fixação pode ser uma proteína, um aminoácido, um peptídeo, um açúcar, polinucleotídeo, um polímero natural ou sintético, um metabólito ou composto secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, íons metálicos, fenilmetil sulfonil fluoreto) ou um grupo quimicamente reativo como um grupo amina, um grupo carboxila, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila, um grupo guanidina, um grupo histidina ou uma combinação dos mesmos. Uma concretização de preferência do primeiro sítio de fixação sendo um grupo quimicamente reativo é o grupo amina de um aminoácido como a lisina. O primeiro sítio de fixação está localizado tipicamente na superfície e, de preferência, na superfície externa da VLP. Existem diversos primeiros sítios de fixação na superfície, de preferência na superfície externa, da partícula semente a vírus, em uma configuração repetida. Em uma concretização preferida, o primeiro sítio de fixação é associado à VLP por meio de pelo menos uma ligação covalente, de preferência por meio de pelo menos uma ligação peptídica. Em uma outra concretização, o primeiro sítio de fixação ocorre naturalmente com a VLP.

Alternativamente, em uma concretização de preferência, o primeiro sítio de fixação é acrescentado artificialmente à VLP.

Sítio de Fixação, Segundo: Conforme utilizada no presente, a expressão "segundo sítio de fixação" refere-se a um elemento que ocorre naturalmente ou que é acrescentado artificialmente ao Fel d1 da invenção e ao qual o primeiro sítio de fixação pode se ligar. O segundo sítio de fixação da Fel d1 da invenção pode ser uma proteína, um polipeptídeo, um aminoácido, um açúcar, um polinucleotídeo, um polímero natural ou sintético, ummetabólito ou composto secundário (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigeni-na, íons metálicos, fenilmetil sulfonil fluoreto) ou um grupo quimicamente reativo como um grupo amina, um grupo carboxila, um grupo sulfidrila, um grupo hidroxila, um grupo guanidina, um grupo hitidina ou uma combinação dos mesmos. Uma concretização de preferência de um segundo sítio de fixação sendo um grupo quimicamente reativo é o grupo sulfidrila, preferencialmente de um aminoácido da cisteína. Os termos "Fel d1 da invenção com pelo menos um segundo sítio de fixação" referem-se, por conseguinte, a um constructo compreendendo o Fel d1 da invenção e pelo menos um segundo sítio de fixação. No entanto, particularmente para um segundo sítio de fixação que não ocorra naturalmente no Fel d1 da invenção, este constructo compreende ainda típica e preferencialmente um "ligador". Em outra concretização de preferência, o segundo sítio de fixação é associado ao Fel d1 da invenção por meio de pelo menos uma ligação covalente, preferencialmente por meio de pelo menos uma ligação peptídica. Em ainda outra concretização, o segundo sítio de fixação ocorre naturalmente no Fel d1 da invenção. Em mais uma outra concretização de preferência, o segundo sítio de fixação é acrescentado artificialmente ao Fel d1 da invenção por meio de um ligador, em que o referido ligador compreende ou é constituído, alternativamente, por uma cisteína. Preferencialmente, o ligador é fundido ao Fel d1 da invenção por uma ligação peptídica.

Proteína de revestimento: O termo "proteína de revestimento" e o termo "proteína de capsídeo", utilizado alternadamente neste pedido, refere-se a uma proteína viral, preferencialmente uma subunidade de um capsídeo natural de um vírus, preferencialmente de RNA de um fago, que é capaz de ser incorporado em um capsídeo viral ou em uma VLP.

Fel d1 da invenção: O termo "Fel d1 da invenção", conforme utilizado no presente, refere-se à pelo menos uma proteína Fel d1 ou pelo menos um fragmento da Fel d1.

Cadeia 1 da Fel d1: O termo "cadeia 1 da Fel d1", conforme utilizado no presente, refere-se a um polipeptídeo compreendendo ou, alternativamente, constituído por uma seqüência de aminoácidos como a SEQ IDNO:22 o uma seqüência homóloga da mesma. O termo "seqüência homóloga da SEQ ID NO:22", conforme utilizado no presente, refere-se a um poli-peptídeo que tenha uma identificação, em relação à SEQ ID NO:22, superior a 70%, preferencialmente, superior a 80%, mais preferencialmente superior a 90%, e ainda mais preferencialmente superior a 95%. O termo "cadeia 1 da Fel d1", conforme utilizado no presente, deve referir-se também a um po-lipeptídeo que abranja pelo menos uma modificação pós-translacional, incluindo, mas sem restrição, pelo menos uma glicosilação, da cadeia 1 da Fel d1, conforme definida no presente. Preferencialmente, a cadeia 1 Fel d1, conforme definida no presente, é constituída por no máximo 130, sendo ainda mais preferencialmente, por no máximo 100 aminoácidos no total.

Cadeia 2 da Fel d1: O termo "cadeia 2 da Fel d1", conforme utilizada no presente, refere-se a um polipeptídeo compreendendo ou, alternativamente, sendo constituído por uma seqüência de aminoácidos como as SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26, ou uma seqüência homóloga das mesmas. O termo "seqüência homóloga da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26", conforme utilizado no presente, refere-se a um polipeptídeo que tenha uma identificação, em relação à SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26, superior a 70%, preferencialmente superior a 80%, mais preferencialmente superior a 90%, e ainda mais preferencialmente superior a 95%. O termo "cadeia 2 da Fel d1", conforme utilizado no presente, deve referir-se também a um polipeptídeo que abranja pelo menos uma modificação pós-tranlacional, incluindo, mas sem restrição, pelo menos uma glicosilação da cadeia 2 da Fel d1, conforme utilizado no presente. Preferencialmente, a cadeia 2 da Fel d1, conforme definida no presente, é constituída por no máximo 150, mais preferencialmente de no máximo 130, sendo ainda mais preferencialmente de no máximo 100 aminoácidos no total.

Proteína Fel d1: O termo "proteína Fel d1", conforme utilizado no presente, refere-se a uma proteína que compreende ou, alternativamente, é constituída pela cadeia 1 da Fel d1 e cadeia 2 da Fel d1. Preferencialmente, a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 estão ligadas covalentementeEm uma concretização de preferência, a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 estão ligadas por meio de, pelo menos, uma ligação dissulfeto. Em outra concretização de preferência, a cadeia 1 e a cadeia 2 estão fundidas diretamente ou por meio de um espaçador, em cujo caso, a referida proteína Fel d1 compreende ainda ou é constituída por um espaçador. Preferencialmente, a proteína Fel d1, conforme definida no presente, é constituída por, no máximo 300, ainda mais preferencialmente por no máximo 200, aminoá-cidos no total. Típica e preferencialmente, a proteína Fel d1, de acordo com a invenção, é capaz de induzir in vivo a produção de anticorpos que se ligam especificamente à proteína natural Fel d1 ou a Fel d1 recombinante,conforme produzida segundo o EXEMPLO 5 da presente invenção.

Fragmento da Fel d1: O termo "fragmento da Fel d1", conforme utilizado no presente, refere-se a um polipeptídeo compreendendo ou, alternativamente, sendo constituído por, pelo menos, um sítio antigênico da Fel d1. Típica e preferencialmente, o termo "fragmento da Fel dl", conforme utilizado no presente, refere-se a um polipeptídeo compreendendo ou, alternativamente, sendo constituído por pelo menos dois sítios antigenicos da Fel d1. Preferencialmente, os sítios antigenicos são ligados covalentemente, mais preferencialmente, os sítios antigenicos são ligados por pelo menos uma ligação peptídica, e em cujo caso, poderá ser necessário um espaçador entre os sítios antigenicos. De preferência, os pelo menos dois sítios antigenicos derivam da cadeia 1 da Fel d1 e da cadeia 2 da Fel d1. De preferência, o fragmento da Fel d1, conforme definido no presente, é constituído por no máximo 130, mais preferencialmente por no máximo 100 e ainda mais preferencialmente por 60 aminoácidos no total. Típica e preferencialmente, o fragmento da Fel d1 é capaz de induzir in vivo a produção de anticorpos que se ligam especificamente à proteína natural Fel d1 ou a Fel d1 recombinante, conforme produzida segundo o EXEMPLO 5 da presente invenção.

Ligado: O termo "ligado" (ou o seu substantivo: ligação), conforme utilizado no presente, refere-se a todas maneiras possíveis, de preferência, interações químicas, pelas quais pelo menos um primeiro sítio de fixação e o pelo menos segundo sítio de fixação são unidos. Interações quími-cas incluem interações covalentes e não covalentes. Exemplos típicos para interações não covalentes são interações tônicas, interações hidrofóbicas ou ligações de hidrogênio, enquanto que interações covalentes têm como base, a título de exemplo, ligações covalentes como ligações éster, éter, ésterfosfato, amida, peptídica, carbono-fósforo e carbono-enxofre como ligações tio-éter ou imida. Em certas concretizações de preferência, o primeiro sítio de fixação e o segundo sítio de fixação são ligados por meio de uma ligação covalente, preferencialmente, por meio de, pelo menos, uma ligação não peptídica, e ainda mais preferencialmente por meio exclusivamente de ligações não peptídicas. O termo "ligado", conforme utilizado no presente, no entanto, abrangerá não só uma ligação direta do, pelo menos, primeiro sítio de fixação e do, pelo menos, segundo sítio de fixação, mas também, alternativa e preferencialmente, uma ligação indireta do, pelo menos, primeiro sítio de fixação e do, pelo menos, segundo sítio de fixação, por meio de molécula(s) intermediária(s) e, pelo presente, típica e preferencialmente, utilizando, pelo menos, um ligador cruzado heterobifuncional.

Ligador: Um "ligador", conforme utilizado no presente, associa o segundo sítio de fixação à Fel d1 da invenção ou já compreende, é constituído essencialmente ou é constituído pelo segundo sítio de fixação. De preferência, um "ligador", conforme utilizado no presente, já compreende o segundo sítio de fixação, típica e preferencialmente - porém, não necessariamente - sob a forma de um resíduo de aminoácido, de preferência um resíduo de cisteína. Um "ligador", conforme utilizado no presente, também é denominado "ligador de aminoácido", particularmente quando um ligador, segundo a invenção, contém pelo menos um resíduo de aminoácido. Dessa forma, os termos "ligador" e "ligador de aminoácido" são utilizados alterna-damente no presente. No entanto, esse fato não implica que um ligador seja constituído exclusivamente por resíduos de aminoacidos, apesar de um ligador constituído por resíduos de aminoacidos ser uma concretização preferida da presente invenção. Os resíduos de aminoacidos são compostos, de preferência, por aminoacidos que ocorrem naturalmente ou aminoacidos não naturais conhecidos na técnica, todos os L ou todos os D ou misturas dosmesmos. Concretizações adicionais de preferência de um ligador, de acordo com esta invenção, são moléculas compreendendo um grupo sulfidrila ou um resíduo de cisteína e estas moléculas são, por conseguindo, abrangidas também nesta invenção. Outros ligadores úteis para a presente invenção são moléculas compreendendo uma metade C1-C6 alquila, uma cicloalquila como uma ciclopentila ou ciclohexila, arila ou metade heteroarila. Ademais, ligadores compreendendo, preferencialmente, uma metade C1-C6 alquila, cicloalquila (C5, C6), arila ou heteroarila e aminoácido(s) adicional(is) podem também ser utilizadas como ligadores para a presente invenção e serão abrangidas no escopo da invenção. A associação do ligador com a Fel d1 da presente invenção é de preferência por meio de, pelo menos, uma ligação covalente, mais preferencialmente, por meio de, pelo menos, uma ligação peptídica.

Arranjo antigênico ordenado e repetido: Conforme utilizado no presente, o termo "arranjo antigênico ordenado e repetido" refere-se geralmente a um padrão de antígeno que se repete ou categorizado, típica e preferencialmente, por um alto grau de uniformidade na disposição espacial dos antígenos em relação à partícula semelhante a vírus, respectivamente. Em uma concretização da invenção, o padrão repetido pode ser um padrão geométrico. Certas concretizações da invenção, como antígenos acoplados a RNA de fagos, são exemplos típicos e preferidos de arranjos antigênicos ordenados e repetidos adequados, os quais, além disso, possuem ordens paracristalina rigorosamente repetidas de antígenos, de preferência com espaços de 1 a 30 nanometros, preferencialmente de 2 a 15 nanometros, ainda mais preferencialmente de 2 a 10 nanometros, e, mais uma vez, ainda mais preferencialmente de 2 a 8 nanometros e ainda mais preferencialmente de 1,6 a 7 nanometros.

Empacotado: O termo "empacotado", conforme utilizado no presente, refere-se ao estado de uma macromolécula polianiônica ou substâncias imunoestimulantes em relação à VLP. O termo "empacotado", conforme utilizado no presente, inclui ligação que poderá ser covalente, por exemplo, por acoplamento químico, ou não covalente, por exemplo, interações iôni-cas, interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio, etc. O termo inclui também o confinamento, ou confinamento parcial, de uma macromolécula polia-niônica. Dessa forma, a macromolécula polianiônica ou substâncias imuno-estimulantes podem ser confinadas pela VLP, sem a existência efetivamente de uma ligação, particularmente de uma ligação covalente. Em concretizações de preferência, a, pelo menos, única macromolécula polianiônica ou substâncias imunoestimulantes estão empacotadas dentro da VLP, mais preferencialmente de maneira não covalente.

Espaçador: o termo "espaçador", bem como o seu termo igualmente utilizado "espaçador de aminoácido", conforme utilizado no presente, refere-se a um segmento de seqüência de aminoácido que não possui mais de 30 aminoácidos e que liga o N-terminal de uma cadeia com o C-terminal de outra cadeia da Fel d1.

Partícula viral: O termo "partícula viral", conforme utilizado no presente, refere-se à forma morfológica de um vírus. Em alguns tipos de vírus, ele compreende um genoma envolvido por um capsídeo protéico; outros possuem estruturas adicionais (por exemplo, envelopes, caudas, etc).

Partícula semelhante a vírus (VLP), conforme utilizado no presente, refere-se a um vírus não replicante ou não infeccioso, de preferência uma partícula viral não replicante e não infecciosa, ou refere-se a uma partícula que se assemelhe a vírus não replicante e não infeccioso, de preferência uma estrutura que se assemelhe a vírus não replicante e não infeccioso, preferencialmente um capsídeo de um vírus. O termo "não replicante", conforme utilizado no presente, refere-se a ser incapaz de replicar o genoma incluído na VLP. O termo "não infeccioso", conforme utilizado no presente, refere-se a ser incapaz de entrar na célula hospedeira. De preferência, uma partícula semelhante a vírus, de acordo com a invenção, é não replicante e/ou não infecciosa uma vez que ela carece de todo ou parte do genoma viral ou de função genômica. Em uma concretização, uma partícula semelhante a vírus é uma partícula viral em que o genoma viral foi física ou quimi-camente inativado. Tipicamente e mais preferencialmente, uma partícula semelhante a vírus não possui todos ou parte dos elementos replicantes einfecciosos do genoma viral. Uma partícula semelhante a vírus, de acordo com a invenção, pode conter ácido nucléico distinto de seu genoma. Uma concretização típica e preferida de uma partícula semelhante a vírus, de a-cordo com a presente invenção, é um capsídèo viral, como o capsídeo viral do vírus correspondente, bacteriófago, de preferência RNA fago. O termo "capsídeo viral" ou "capsídeo" referem-se à montagem macromolecular composta por subunidades de proteínas virais. Tipicamente, há 60,120, 180, 240, 300, 360 e mais de 360 subunidades de proteínas virais. Típica e preferencialmente, as interações destas subunidades levam à formação de capsídeo viral ou de estrutura semelhante a capsídeo viral com uma organização inerente repetitiva, em que a referida estrutura é, tipicamente, esférica ou tubular. Por exemplo, os capsídeos de RNA fagos ou HBcAgs possuem uma forma esférica de simetria icosaédrica. O termo "estrutura semelhante a capsídeo", conforme utilizado no presente, refere-se a uma montagem macromolecular composta por subunidades de proteínas virais que se assemelha . à morfologia do capsídeo, no sentido definido acima, porém se desvia da montagem simétrica típica ao mesmo tempo em que mantém um grau suficiente de ordem e de repetição.

Uma característica comum de partícula viral e partícula semelhante a vírus é o arranjo altamente ordenado e repetitivo de suas subunidades.

Partícula semelhante a vírus de um RNA fago: Conforme utilizado no presente, o termo "partícula semelhante a vírus de um RNA fago" refere-se a uma partícula semelhante a vírus que compreende ou, de preferência, é constituída essencialmente ou é constituída por proteínas de revestimento, mutantes ou fragmentos das mesmas, de um RNA fago. Além disso, partícula semelhante a vírus de um RNA fago assemelha-se à estrutura de um RNA fago, sendo não replicante e/ou não infecciosa e desprovida, pelo menos, do gene ou genes que codificam o mecanismo de replicação do RNA fago e, tipicamente, e desprovida também do gene ou genes que codificam a proteína ou proteínas responsáveis pela fixação ou entrada no hospedeiro. Esta definição deve, contudo, abranger também partículas semelhantes avírus de RNA fagos, em que o gene ou os genes supramencionados ainda está presente, porém são inativos, e, por conseguinte, levando também a partículas semelhantes a vírus de um RNA fago, não replicante e/ou não infeccioso. VLPs de preferência, derivadas de RNA fagos, exibem simetria icosaédrica e consistem em 180 subunidades. Nesta divulgação, o termo "subunidade" e "monômero" são utilizados alternadamente e igualmente dentro deste contexto. Neste pedido, o termo "RNA fago" e o termo "RNA bacteriófago" são utilizados alternadamente. Processos utilizados de preferência para produção de uma partícula semelhante a vírus de um RNA fago não replicante e/ou não infeccioso é por inativação física e química como, radiação por UV, tratamento com formaldeído e, tipicamente e preferencialmente, por manipulação genética.

Um ou uma: quando os termos "um" ou "uma" são utilizados nesta divulgação, eles significam "pelo menos um" ou "um ou mais", salvo se indicado de outra forma.

A identificação da seqüência de aminoácidos pode ser terminada pelo processo tradicional, utilizando programas conhecidos de computador, como o programa Bestfit. Ao utilizar o programa Bestfit ou qualquer outro de alinhamento de seqüência, de preferência utilizando o Bestfit, para determinar se uma seqüência específica é, por exemplo, idêntica em 95% a uma seqüência de aminoácidos de referência, os parâmetros são definidos de forma que o percentual da identificação é calculado sobre toda a extensão da seqüência de aminoácidos de referência e para que falhas de até 5% na homologia do número total de resíduos de aminoácidos, na seqüência de referência, sejam permitidas. Este processo supramencionado, para determinação do percentual de identificação entre polipeptídeos pode ser aplicado a todas as proteínas, polipeptídeos ou a um fragmento dos mesmos, descritos nesta invenção.

Neste pedido de patente, anticorpos são definidos como sendo especificamente ligados se eles se ligarem ao antígeno com uma afinidade de ligação (Ka) de 106 M"1 ou mais alta, de preferência 107 M"1 ou mais alta, mais preferencialmente de 108 M"1 ou mais alta e, ainda mais preferencial-mente, de 109 M"1 ou mais alta. A afinidade de um anticorpo pode ser determinada rapidamente por alguém que possua habilidade comum na técnica (por exemplo, pela análise de Scatchard).

Esta invenção fornece composições da invenção compreendendo: (a) uma partícula central com pelo menos um primeiro sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral; e (b) pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de fixação, em que o, pelo menos, único antígeno é uma proteína Fel d1, ou fragmento da Fel d1, e em que (a) e (b) estão ligados covalentemente por meio do, pelo menos, único primeiro sítio de fixação e o, pelo menos, segundo único sítio de fixação. De preferência, uma proteína Fel d1 ou um fragmento da Fel d1 está ligado à partícula central, de forma a permitir que um arranjo ordenado e repetido de antígeno-VLP seja formado. Em concretizações de preferência da invenção, pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 30, mais preferencialmente, pelo menos, 60 e, uma vez mais, mais preferencialmente, pelo menos 120 e ainda mais preferencialmente, pelo menos 180 de proteína Fel d1 ou fragmento da Fel d1 estão ligados à partícula central.

Qualquer vírus conhecido na técnica, o qual tenha uma estrutura ordenada e repetida pode ser selecionado como uma VLP ou uma partícula viral da invenção. Exemplos de vírus com DNA ou RNA, da proteína de revestimento ou de capsídeo que podem ser utilizados para o preparo de VLPs foram expostos na linha 10-21 da página 25, linha 11-28 da página 26 e linha 4 da página 39 à linha 4 da página 31 da Patente WO 2004/009124. Essas exposições são aqui incorporadas por referência.

Vírus ou partícula semelhante a vírus podem ser produzidos e purificados a partir de culturas de células infectadas por vírus. O vírus ou partícula semelhante a vírus resultante para ser utilizado em vacinas deve, de preferência, ser não replicante ou não infeccioso e mais preferencialmente não é replicante nem infeccioso. Radiação por UV, tratamento químico, como com o formaldeído ou clorofórmio, são os processos geralmente conhecidos por pessoa capacitada na técnica para inativar vírus.Em uma concretização de preferência, a partícula central é uma partícula viral em que de preferência a partícula viral é uma partícula viral de um bacteriófago e, em que ainda preferencialmente, o referido bacteriófago é um RNA fago e, em que ainda mais preferencialmente o referido RNA fago é um RNA selecionado de Q|3, fr, GA ou AP205.

Em uma outra concretização preferida, a VLP é uma VLP re-combinante. Praticamente todos os vírus comumente conhecidos foram se-qüenciados e estão disponíveis facilmente para o público. O gene que codifica a proteína de revestimento pode ser facilmente identificado por um artesão capacitado. O preparo de VLPs, pela expressão recombinante da proteína de revestimento em um hospedeiro, faz parte do conhecimento comum de um artesão capacitado.

Em uma concretização de preferência, a partícula semelhante a vírus compreende, ou alternativamente é constituída por proteínas recombinantes, mutantes ou fragmentos das mesmas, de um vírus selecionado do grupo composto por: a) RNA fagos; b) bacteriófagos; c) vírus de hepatite B, preferencialmente a proteína de seu capsídeo (Ulrich et al., Virus Res 50:141-182 (1998)) ou sua proteína de superfície (WO 92/11291); d) vírus de sarampo (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)); e) vírus Sindbis; f) rotavírus (US 5,071,651 e US 5,374,426); g) vírus da doença pé-boca (Twomey, et al., Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) vírus Norwalk (Jiang, X. et al., Science 250:1580 1583 (1990), Matsui, S.M., et al., J. Clin). Invest. 87:1456 1461 (1991); i) Alfavírus; j) retrovírus, preferencialmente sua proteína GAG (WO 96/30523); k) retrotransposon Ty, preferencialmente a proteína p1; I) vírus do papiloma humano (WO 98/15631); m) vírus polioma; n) vírus do mosaico do tabaco e o) vírus Flock House.

Em uma concretização de preferência, a VLP compreende, ou é constituída por mais de uma seqüência de aminoácidos, de preferência, duas seqüências de aminoácidos, das proteínas recombinantes, mutantes ou fragmentos das mesmas. A VLP que compreende ou é constituída por mais de uma seqüência de aminoácidos é referida, neste pedido, como VLP de mosaico.O termo "fragmento de uma proteína recombinante" ou o termo "fragmento de uma proteína de revestimento", conforme utilizado no presente, é definido como um polipeptídeo que tenha pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% e ainda mais preferencialmente pelo menos 95% da extensão da proteína recombinante do tipo natural, ou proteína de revestimento, respectivamente, e que preferencialmente conserve a capacidade de formar VLP. Preferencialmente o fragmento é obtido por pelo menos uma exclusão interna, pelo menos uma truncagem ou pelo menos uma combinação dos mesmos. O termo "fragmento de uma proteína recombinante" ou "fragmento de uma proteína de revestimento" abrangerá ainda polipeptídeo que tenha pelo menos 80%, preferencialmente 90% e ainda mais preferencialmente 95% da identificação de seqüência de aminoácidos com o "fragmento de uma proteína recombinante" ou "fragmento de uma proteína de revestimento", conforme definido acima, e que de preferência seja capaz de ser montada em uma partícula semelhante a vírus.

O termo "proteína recombinante mutante" ou o termo "mutante de uma proteína recombinante", conforme utilizados alternadamente nesta invenção, ou o termo "proteína de revestimento mutante" ou o termo "mutante de uma proteína de revestimento", conforme utilizados alternadamente nesta invenção, referem-se a um polipeptídeo que tenha uma seqüência de aminoácidos derivada da proteína recombinante do tipo natural, ou da proteína de revestimento, respectivamente, no qual a seqüência de aminoácidos é pelo menos 80%, preferencialmente, pelo menos, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idêntica à seqüência do tipo natural e de preferência que conserve a capacidade para ser montado em uma VLP.

Em uma concretização de preferência, a partícula semelhante a vírus da invenção é do vírus da hepatite B. O preparo de partículas semelhantes a vírus da hepatite B foi exposto, entre outras, nas Patentes WO 00/32227, WO 01/8508 e na WO 02/056905. Todos os três documentos são explicitamente incorporados aqui por referência. Outras variantes de HbcAg, adequadas para o uso prático da presente invenção foram expostas na pá-gina 34-39 da WO 02/056905.

Em ainda outras concretizações de preferência da invenção, um resíduo de lisina é introduzido no polipeptídeo do HBcAg para mediar a ligação da Fel d1 da invenção à VLP do HBcAg. Em concretizações de preferência, as VLPs e composições da invenção são preparadas utilizando um HBcAg que compreende, ou alternativamente é constituído por aminoácidos 1-144 ou 1-149, 1-185 da SEQ ID NO:20, a qual é modificada para que os aminoácidos nas posições 79 e 80 sejam substituídos por um peptídeo que tenha a seqüência de aminoácidos de Gli-Gli-üs-Gli-Gli. Essa modificação altera a SEQ ID NO:20 para SEQ ID NO:21. Em ainda outras concretizações de preferência, os resíduos de cisteína, nas posições 48 e 110 da SEQ ID NO:21, ou seus fragmentos correspondentes, preferencialmente 1-144 ou 1-149, sofrem uma mutação para serina. A invenção inclui ainda composições que compreendem proteínas mutantes do núcleo do Hepatite B que tenham as alterações de aminoácido correspondentes, observadas acima. A invenção inclui ainda composições e vacinas, respectivamente, que compreendam polipeptídeos do HbcAg, os quais compreendem ou, alternativamente, são constituídos por seqüências de aminoácidos que sejam pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% idênticas à SEQ ID NO:21.

Em uma concretização de preferência da invenção, a partícula semelhante a vírus da invenção, compreende, ou é essencialmente constituída ou/alternativamente, é constituída por proteínas de revestimento recom-binantes, mutantes ou fragmentos das mesmas, de um RNA fago. Preferencialmente o RNA fago é selecionado do grupo composto por a) bacteriófago Q(3; b) bacteriófago R17; c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11; h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95; k) bacteriófago f2; I) bacteriófago PP7 e m) bacteriófago AP205.

Em uma concretização de preferência da invenção, a composição compreende uma proteína de revestimento, ou mutantes ou fragmentos desta, de RNA fagos, em que a proteína de revestimento possui uma seqüência de aminoácidos, selecionada do grupo composto por (a) SEQ IDNO:1; referente a Qp CP; (b) uma mistura da SEQ ID N0:1 e SEQ ID N0:2 (referente a proteína Qp A1); (c) SEQ ID NO:3; (d) SEQ ID NO:4; (e) SEQ ID NO:5; (f) SEQ ID NO:6, (g) uma mistura da SEQ ID N0:6 e SEQ ID NO:7; (h) SEQ ID NO:8; (i) SEQ ID NO:9; (j) SEQ ID NO:10; (k) SEQ ID NO:11; (I) SEQIDNO:12;(m)SEQIDNO:13;e(n)SEQIDNO:14.

Em uma concretização de preferência da invenção, a VLP é uma VLP de mosaico compreendendo ou, alternativamente, sendo constituída por mais de uma seqüência de aminoácidos, de preferência por duas seqüências de aminoácidos de proteínas de revestimentos, ou mutantes ou fragmentos das mesmas, de um RNA fago.

Em uma concretização muito preferida, a VLP compreende ou, alternativamente, é constituída por duas proteínas de revestimento diferentes de um RNA fago, as duas referidas proteínas de revestimento possuindo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO:2, ou da SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7.

Em uma concretização de preferência da invenção, a partícula semelhante a vírus, da invenção, compreende, é essencialmente constituída ou, alternativamente, é constituída por proteínas de revestimento recombi-nantes, ou mutantes ou fragmentos das mesmas, de RNA bacteriófago Qp, fr, AP205 ou GA. Em uma concretização preferida, a VLP é de um RNA bacteriófago, preferencialmente de um RNA bacteriófago Qp, fr, AP205 ou GA.

Em uma concretização preferida, a VLP da invenção é uma VLP do RNA fago Qp. O capsídeo ou partícula semelhante a vírus do Qp exibiu uma estrutura icosaédrica semelhante a capsídeo de fago com um diâmetro de 25 nm e T=3 de quase simetria. O capsídeo contém 180 cópias da proteína de revestimento, as quais estão ligadas em pentâmeros e hexâmeros covalentes por pontes de dissulfetos (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-5554 (1996)), levando a uma estabilidade notável do capsídeo Qp. Capsídeos ou VLPs construídos a partir de proteína de revestimento Qp recombinante pode conter, no entanto, subunidades que não estão ligadas por meio de ligações dissulfeto a outras subunidades no capsídeo, ou não estarem completamente ligadas. O capsídeo ou VLP de Qp exibe uma resistên-cia incomum a solventes orgânicos e agentes de desnaturação. Surpreendentemente, observou-se que concentrações de DMSO e acetonitrila, em concentrações tão altas quanto de 30%, e concentrações de guanidina tão altas quanto de 1 M não afetam a estabilidade do capsídeo. A alta estabilidade do capsídeo ou VLP de Q(3 é uma característica vantajosa, particularmente, para o seu uso em imunização e vacinação de mamíferos e humanos, de acordo com a presente invenção.

Outras partículas semelhantes a vírus, de RNA fagos, particularmente de Qp e fr, de acordo com esta invenção, estão expostas no WO 02/056905, cuja exposição é aqui incorporada em sua totalidade por referência. O exemplo 18, principalmente, do WO 02/056905 fornece uma descrição detalhada do preparado de partículas VLP de Qp.

Em uma concretização preferida, a VLP da invenção é uma VLP do RNA fago AP205. Formas mutantes, montadas competentemente, de VLPs de AP205, incluindo proteína de revestimento de AP205 com substituição de prolina no aminoácido 5 para treonina, podem também ser utilizadas na prática da invenção e levar a outras concretizações preferidas da invenção. O WO 2004/007538 descreve, particularmente no Exemplo 1 e Exemplo 2, como obter VLP compreendendo proteínas de revestimento de AP205 e, pelo presente, a expressão e a purificação das mesmas. O WO 2004/007538 é aqui incorporado por referência. VLPs de AP205 são altamente imunogê-nicas e podem estar ligadas a Fel d1 da invenção para gerar, típica e preferencialmente, constructos de vacinas exibindo a Fel d1 da invenção, orientada de maneira repetitiva. É extrato um título alto de anticorpo é extraído com a assim exibida Fel d1 das invenções, demonstrando que a Fel d1 das invenções provêem acesso para interação com moléculas de anticorpos e são imunogênicas.

Em uma concretização preferida, a VLP da invenção compreende ou é constituída por uma proteína de revestimento mutante de um vírus, preferencialmente de um RNA fago, em que a proteína de revestimento mutante foi modificada pela remoção de, pelo menos, um resíduo de lisina por substituição e/ou por exclusão. Em uma concretização preferida, a VLP dainvenção compreende, ou é constituída, uma proteína de revestimento mutante de um vírus, preferencialmente de um RNA fago, em que a proteína de revestimento mutante foi modificada pelo acréscimo de, pelo menos, um resíduo de lisina por substituição e/ou por exclusão. A exclusão, substituição ou acréscimo de, pelo menos, um resíduo de lisina permite variar o nível de acoplamento, ou seja, a quantidade de Fel d1 da invenção por subunidades da VLP de um vírus, preferencialmente de RNA fagos, particularmente, para combinar e se adequar às exigências da vacina.

Em uma concretização preferida, as composições e vacinas da invenção possuem uma densidade antigênica de 0,5 a 4,0. O termo "densidade antigênica", conforme utilizado no presente, refere-se ao número médio de Fel d1 da invenção, ligado por subunidade, preferencialmente, por proteína de revestimento, da VLP, e, pelo presente, preferencialmente da VLP de um RNA fago. Dessa forma, esse valor é calculado como uma média sobre todas as subunidades ou monômeros da VLP, preferencialmente da VLP do RNA fago, na composição ou vacinas da invenção.

VLPs ou capsídeos de proteína de revestimento de Qp exibem um número definido de resíduos de lisina em sua superfície, com uma topologia definida de três resíduos de lisina apontados em direção ao interior do capsídeo e interagindo com o RNA, e quatro outros resíduos de lisina expostos para o exterior do capsídeo. Preferencialmente, o, pelo menos, primeiro sítio de fixação é um resíduo de lisina, apontado ou na parte externa da VLP.

Mutantes de Qp, dos quais resíduos de lisina são substituídos por argininas podem ser utilizados para a presente invenção. Dessa forma, em outra concretização preferida da presente invenção, a partícula semelhante a vírus compreende, é essencialmente constituída ou é, alternativamente, constituída por proteínas de revestimento mutantes de Qp. Preferencialmente estas proteínas de revestimento mutantes compreendem ou, alternativamente, são constituídas por uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo de a) Qp-240 (SEQ ID NO:15, Lis13-Arg da SEQ ID NO: 1) b) Qp-243 (SEQ ID NO:16, Asn10-Lis da SEQ ID NO:1); c) Qp-250 (SEQ ID NO:17, Lis2-Arg da SEQ ID NO:1) d) Qp-251 (SEQ ID NO:18, Lis16-Arg daSEQ ID N0:1); e e) Qp-259" (SEQ ID N0:19, Lis2-Arg, Lis16-Arg da SEQ ID N0:1. A construção, expressão e purificação das VLPs e capsídeos de proteínas de revestimento de Qp, proteína de revestimento mutante de Qp, respectivamente, acima indicadas, estão descritas em WO 02/056905. Particularmente é aqui referido o Exemplo 18 do pedido supramencionado.

Em outra concretização de preferência da presente invenção, a partícula semelhante a vírus compreende ou, alternativamente, é essencialmente constituída, ou ainda alternativamente é constituída por proteína de revestimento mutante de Qp, ou mutantes ou fragmentos da mesma, e pela proteína A1 correspondente. Em ainda outra concretização de preferência, a partícula semelhante a vírus compreende ou, alternativamente, é essencialmente constituída, ou ainda alternativamente é constituída por proteína de revestimento mutante com seqüência de aminoácido da SEQ ID NO:15, 16, 17, 18 ou 19 e pela proteína A1 correspondente.

Outras proteínas de revestimento de RNA fagos demonstraram também se automontarem mediante expressão em um hospedeiro bacteria-no (Kastelein, RA. et al., Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). Particularmente, foram expostas as propriedades biológicas e bioquímicas de GA (Ni, CZ., et al., Protein Sei. 5:2485-2493 (1996), Tars, K et al., J. Mol.Biol. 271:759-773(1997)) e de fr (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L et al. J Mol. Biol. 244:279-290, (1994)). Foi determinada a estrutura em cristal de diversos RNA bacteriófagos (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). Utilizando estas informações, resíduos de superfície expostos podem ser identificados e, dessa forma, proteínas de revestimento de RNA fagos podem ser modificadas de forma que um ou mais resíduos reativos de aminoácidos possam ser inseridos por meio de inserção ou substituição. Outra vantagem das VLPs, derivadas de RNA fagos, é o alto nível de expressão obtido em bactérias, possibilitando a produção de grandes quantidades de material em um custo acessível.

Em uma concretização de preferência, a composição da inven-ção compreende, pelo menos, um antígeno, em que o referido pelo menos um antígeno é uma proteína Fel d1.

Em outra concretização de preferência, a proteína Fed d1 compreende ou, alternativamente, é constituída por Fel d1 que ocorre naturalmente. A estrutura primária da cadeia 1 é a seqüência da SEQ ID NO 22. . Variantes relatadas da cadeia 1 são Lis29-Arg ou Asn, Va133-Ser, Val60-Leu. A estrutura primária da cadeia 2 é a seqüência da SEQ ID NO 23, 25 ou 26. Variantes relatadas da cadeia 2 são Cis7-Fe, Fe15-Tr, Asn19-Ser, GH20-Leu, Ile55-Val, Arg57-Lis, Val58-Fe da SEQ ID NO:23, 25 ou 26. Outras variantes da cadeia 2 são Glu69-Val, Tir70-Asp, Met72-Tr, Gln-77-Glu e Asn86-Lis da SEQ ID NO:25; Met74-Tr, Gln79-Glu e Asn88-Lis da SEQ ID NO:23. (Griffith I.J. et al, Gene 113:263-268 (1992); Morgenstern J.P. et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 88:9690-9694 (1991) Duffort O.A., et al Mol. Immunol. 28:301-309 (1991); Leitermann K., et al, J. Allergy Clin. Immunol. 74:147-153 (1984); Kristensen, A. K, et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908). A Fel d1 que ocorre naturalmente é obtida pela purificação de, por exemplo, saliva de gato, caspa de gato, poeira doméstica de uma casa em que vive um gato, etc.

Em uma concretização preferida, a Fel dt da invenção é uma proteína recombinante Fel d1 ou um fragmento recombinante de Fel d'1. Proteína recombinante Fel d1 ou fragmento recombinante de Fel d 1, conforme utilizado no presente, refere-se a uma proteína Fel d1 ou um fragmento de Fel d1 que é obtido por um processo que compreende, pelo menos, uma etapa da técnica de recombinação de DNA. Os termos "proteína recombinante Fel d1 ou fragmento recombinante de Fel d1" e "proteína Fel d1 produzida por recombinação ou fragmento de Fel d1 produzido por recombinação" são utilizados alternadamente no presente e devem ter o mesmo significado. Proteína recombinante Fel d1 ou seu fragmento podem ser produzidos em sistemas procarióticos de expressão, como E. coli (WO 2004/094639) ou em sistemas eucarióticos de expressão, como baculovírus (WO 00/20032) Seppálá et al expuseram, simultaneamente, a expressão da cadeia 1 e da cadeia 2 da Fel d1 por promotor bicistrônico em baculovírus (J.Biol. Chem. Nov, 2004). Proteína Fel d1 ou fragmento, produzidos por re-combinação, pode ser por glicosilação ou não, dependendo da célula hospedeira utilizada para produzir a proteína recombinante.

Em uma concretização, a proteína Fel d1 recombinante compreende ou, alternativamente, é constituída pela cadeia 1 da Fel d1 e cadeia 2 da Fel d1, em que a referida cadeia 1 da Fel d1 está ligada à cadeia 2 da Fel d1, exclusivamente por ligação não covalente, como interações hidrofóbicas.

Em uma concretização, a proteína Fel d1 recombinante compreende ou, alternativamente, é constituída pela cadeia 1 da Fel d1 e cadeia 2 da Fel d1, em que a referida cadeia 1 da Fel d1 está ligada à cadeia 2 da Fel d1 por pelo menos uma ligação covalente. Em uma concretização de preferência, a, pelo menos, uma ligação covalente é uma ligação não peptídica, em que a referida ligação não peptídica é uma ligação dissulfeto ou em que, preferencialmente, a referida ligação não peptídica é uma ligação dissulfeto.

Por exemplo, a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 podem ser expressadas separadamente e combinadas em seguida em condições que permitam a formação correta da ligação dissulfeto, como um processo de misturas repetidas.

Alternativamente, a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 podem ser expressadas simultaneamente em um hospedeiro, por exemplo, pela clonagem dos genes que codificam a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1, respectivamente, de acordo com dois promotores em um plasmí-deo. Em sistemas eucarióticos de expressão, a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 podem ser transcritas em um mRNA e traduzidas separadamente por sítio de entrada interno de ribossomo (IRES).

Em uma concretização de preferência, a proteína Fel d1 compreende ou, alternativamente, é constituída por uma proteína de fusão, em que a referida proteína de fusão compreende a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1. Em uma concretização de preferência, a referida cadeia 1 da Fel d1 e a referida cadeia 2 da Fel d1 são diretamente fundidas por uma ligação peptídica, ligando o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia. Em uma concretização de preferência, a referida cadeia 1 da Fel d1e a referida cadeia 2 da Fel d1 são diretamente fundidas por meio de um espaçador, ligando o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia. Preferencialmente, o referido espaçador possui de 1-30, preferencialmente de 1-25, preferencialmente de 1-20, preferencialmente de 1-15, preferencialmente de 1-9, preferencialmente de 1-5 e preferencialmente de 1-3 aminoácidos. Alternativamente, o referido espaçador possui de 10-30, preferencialmente de 10-25, mais preferencialmente de 10-20, mais preferencialmente de 13-20, mais preferencialmente de 15-20, mais preferencial de 13-17 e mais preferencialmente de 15-17 aminoácidos. Preferencialmente o referido espaçador é constituído por uma seqüência de aminoácidos com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 resíduos de aminoácidos. Em uma concretização de preferência, o referido espaçador possui 15 aminoácidos. Em ainda outra concretização de preferência, o referido espaçador é (GGGGS).

Em uma concretização de preferência, a proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo composto por: (a) SEQ ID NO:24; (b) SEQ ID NO:54; (c) SEQ ID NO:55; (d) SEQ ID NO:56; e (e) SEQ ID NO:57.

Em uma concretização de preferência, a referida cadeia 2 da Fel d1 é fundida por seu C-terminal ao N-terminal da cadeia 1 da Fel 'dl, seja diretamente ou por meio de um espaçador.

Em ainda outra concretização de preferência, a referida proteína Fel d1 compreende ou, alternativamente, é constituída por uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:24.

O WO 2004/094639 expôs uma Fel d1 recombinante dobrada com propriedades moleculares e biológicas semelhantes à sua espécime natural e, especificamente, um código genético sintético para fusão direta do N-terminal da cadeia 2 à cadeia 1 da Fel d1. A expressão em E. coli resultou em um homodímero, ligado não covalentemente, com um peso molecular aparente de 30 kDa, definido por cromatografia de exclusão por tamanho, cada subunidade de 19177 Da exibindo um padrão dissulfeto idêntico ao encontrado na Fel d1 natural e a Fel d1 e a recombinante possuindo dobrasidênticas. A Fel d1 recombinante reagiu com a IgE, do soro de pacientes alérgicos a gato, da mesma forma que a Fel d1 natural. Dessa forma, esta proteína de fusão da Fel d1 mimetiza a antigenicidade da Fel d1 natural.

Em uma concretização de preferência, a cadeia 1 da Fel d1 é fundida por seu C-terminal ao N-terminal da cadeia 2 da Fel d1, seja diretamente ou por meio de um espaçador.

Em uma concretização de preferência, a cadeia 1 da Fel d 1 compreende ou, alternativamente, é constituída por seqüência da SEQ ID NO:22 ou uma seqüência homóloga da mesma, em que a referida seqüência homóloga possui uma identificação em relação à SEQ ID NO:22 superior a 80%, preferencialmente superior a 90%, ou ainda mais preferencialmente superior a 95%.

Em uma concretização de preferência, a cadeia 2 da Fel d 1 compreende ou, alternativamente, é constituída por seqüência da SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:26 ou uma seqüência homóloga da mesma, em que a referida seqüência homóloga possui uma identificação em relação à SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 ou SEQ ID NO:26 superior a 80%, preferencialmente superior a 90%, ou ainda mais preferencialmente superior a 95%.

Em uma concretização preferida, a proteína Fel d1 é uma proteína Fel d1 recombinante, em que pelo menos uma ligação dissulfeto é desfeita, preferencialmente por mutação, mais preferencialmente por substituição conservadora, como de Cis para Ser. Três pontes dissulfeto entre cadeias, ligando os dois peptídeos nativos da Fel d 1 foram identificadas, ou seja, Cis3(1)-Cis73(2), Cis44(1)-48Cis(2) e Cis70(l)-Cis7(2), sugerindo uma orientação antiparalela de peptídeos da Fel d1. (Kristensen, A. K., et al. (1997) Biol Chem 378, 899-908). Em outra concretização preferida, uma ligação dissulfeto da proteína Fel d1 é desfeita. Em outra concretização preferida ainda, duas destas ligações dissulfeto da proteína Fel d1 são desfeitas.

E, ainda em uma outra concretização preferida, todas as três destas ligações dissulfeto da proteína Fel d1 são desfeitas. Em uma concretização preferida, a Cis70 da cadeia 1 é excluída ou sofre mutação. Em uma outra concretiza-ção preferida, a Cis73 da cadeia é excluída ou sofre mutação. Em uma concretização preferida, a referida proteína Fel d1 é uma proteína de fusão compreendendo a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1, fundidas diretamente ou por meio de um espaçador, em que todas as três destas ligações dissulfeto são desfeitas. Em uma outra concretização preferida, a referida proteína Fel d1, compreendendo ou, alternativamente, sendo constituída por seqüência de aminoácido conforme a SEQ ID NO:24, 55 ou 57, em que, pelo menos uma, preferencialmente, pelo menos, três, e ainda mais preferencialmente, pelo menos, cinco cisteínas são removidas por substituição ou exclusão.

Em uma concretização de preferência, o antígeno da invenção compreende ou, alternativamente, é constituído por um fragmento da Fel d1. É fato conhecido que a posse de imunogenicidade não requer geralmente a extensão completa de uma proteína e que uma proteína geralmente contém mais de um epítopo antigênico, isto é, sítio antigênico. Um fragmento ou um peptídeo curto pode ser suficiente para conter, pelo menos, um sítio antigênico que possa se ligar imunoespecificamente a um anticorpo ou um receptor de célula T, no contexto de uma molécula MHC. Sítio ou sítios antigêni-cos podem ser determinados por algumas técnicas conhecidas geralmente da pessoa capacitada na técnica. Essa determinação pode ser efetuada por alinhamento de seqüência e predição de estrutura. A título de exemplo, é possível prever possíveis a-hélices, voltas, ligações dissulfeto intra e entre cadeias, etc, utilizando um programa como o Rasmol. É possível ainda prever seqüências que estão inseridas na molécula ou seqüências que estão expostas na superfície da molécula. Seqüências expostas na superfície da molécula são mais possíveis de compreender sítio(s) natural(is) antigêni-co(s) e, dessa forma, são úteis na indução de anticorpos terapêuticos. Após uma seqüência de peptídeo de superfície ter sido determinada, o sítio antigênico nesta seqüência pode ainda ser definido, por exemplo, por processos intensos de mutagênese (como mutagênese de seleção de alanina, Cunnin-gham BC, Wells JA. Science 1989 Jun 2; 244(4908):1081-5). Resumidamente, aminoacidos nesta seqüência sofrem mutações, uma a uma, para alaninae os aminoácidos cujas mutações de alanina mostram, respectivamente, redução da capacidade de ligação a um anticorpo (cultivado contra a seqüência do tipo natural), ou a perda total da capacidade de ligação, são possivelmente componentes do sítio antigênico. Outro processo para determinar sítio(s) antigênico(s) é gerar superposição de peptídeos que cobrem a extensão toda da seqüência da Fel d1 (Geysen, PNAS Vol 81: 3998-4002, (1984) e Slootstra, J. W. et al., (1996) Mol. Divers. 1, 87-96).

Em uma concretização de preferência, o antígeno da invenção compreende ou, alternativamente, é constituído por pelo menos um, preferencialmente por pelo menos dois epítopos da Fel d1, mais preferencialmente por pelo menos um epítopo que derive da cadeia 1 da Fel d1 e, pelo menos, um epítopo que derive da cadeia 2 da Fel d1.

Os epítopos reativos de célula T da Fel d1 foram mapeados em toda a proteína Fel d1 e foram expostos em técnicas anteriores, como no quarto parágrafo da coluna 14 da US 6120769 e na coluna 130 e 131 da US6025162, sendo estas exposições incorporadas aqui por referência. Em uma concretização de preferência, o epítopo de célula T da Fel d1 é selecionado de um grupo composto por: SEQ ID NO: 27-32.

A presente invenção prove um processo para produção da composição da invenção compreendendo (a) fornecimento de uma VLP com pelo menos um sítio de fixação; (b) fornecendo pelo menos um antígeno, em que o referido antígeno é uma proteína Fel d1 ou um fragmento de Fel d1, com pelo menos um segundo sítio de fixação; e (c) a combinação da referida VLP e o referido, pelo menos, um antígeno, para produção da referida composição, em que o referido, pelo menos, um antígeno e a referida VLP estão ligados pelo primeiro e o segundo sítio de fixação. Em uma concretização de preferência, o fornecimento do, pelo menos, único antígeno, isto é, uma proteína Fel d1 ou um fragmento de Fel d1 com o, pelo menos, único segundo sítio de fixação ocorre por expressão, preferencialmente, por expressão em um sistema bacteriano, preferencialmente em E. coli. Geralmente um códon de parada {tag), como His tag, Mie tag é acrescentado para facilitar o processo de purificação. Em ainda outra abordagem específica, os fragmentosde Fel d1, com menos de 50 aminoácidos, podem ser quimicamente sintetizados.

Em uma concretização preferida da invenção, a VLP com pelo menos um único primeiro sítio de fixação é ligada à Fel d1 da invenção, com pelo menos um único segundo sítio de fixação, por meio de pelo menos uma ligação peptídica. O gene que codifica a Fel d1 da invenção, preferencialmente o fragmento de Fel d1, mais preferencialmente um fragmento com no máximo 50 aminoácidos e ainda mais preferencialmente com menos de 30 aminoácidos, é ligado dentro da estrutura {in-frame), seja internamente ou preferencialmente ao N ou C-terminal do gene que codifica a proteína de revestimento da VLP. Concretizações do uso do antígeno da invenção para proteína de revestimento, ou mutantes ou fragmentos da mesma, para uma proteína de revestimento de um vírus, foram descritas na linha 20 da página 62 à linha 17 da página 68 do WO 2004/009124, sendo estas aqui incorporadas por referência.

Em uma concretização de preferência, um fragmento de Fel d| é fundido ao N ou C-terminal de uma proteína de revestimento, ou mutantes ou fragmentos da mesma, de RNA fago AP205. Em ainda outra concretização de preferência, a proteína de fusão compreende ainda um espaçador, em que o referido espaçador é fundido à proteína de revestimento, ou fragmentos ou mutantes da mesma, de AP205 e a um fragmento de Fel d1.

Em uma concretização preferida da presente invenção, a composição compreende ou, alternativamente, é constituída essencialmente por uma partícula semelhante a vírus com, pelo menos, um primeiro sítio de fixação ligado a uma pelo menos Fel d1 da invenção, com pelo menos um segundo sítio de fixação por meio de, pelo menos, uma ligação covalente, e preferencialmente esta ligação covalente é uma ligação não peptídica. Em uma concretização preferida da presente invenção, o primeiro sítio de fixação compreende ou, preferencialmente, é um grupo amina e, preferencialmente, o grupo amina é um resíduo de lisina. Em outra concretização preferida da presente invenção, o segundo sítio de fixação compreende ou, preferencialmente, é um grupo sulfidrila e, preferencialmente, um grupo sulfidrilade uma cisteína.

Em uma concretização muito preferida da invenção, o, pelo menos, único primeiro sítio de fixação é um grupo amino, preferencialmente um grupo amina de um resíduo de lisina e o, pelo menos, único segundo sítio de fixação é um grupo sulfidrila, preferencialmente um grupo sulfidrila de uma cisteína.

Em uma concretização de preferência da invenção, a Fel d1 da invenção é ligada à VLP por meio de uma ligação química cruzada, típica e preferencialmente utilizando um ligador cruzado heterobifuncional. Em concretizações preferidas, o ligador cruzado heterobifuncional contém um grupo funcional que pode reagir com os primeiros sítios de fixação preferidos, preferencialmente com o grupo amina, mais preferencialmente com os grupos aminas de resíduo(s) de lisina da VLP e ainda um outro grupo funcional que pode reagir com o segundo sítio de fixação preferido, isto é, um grupo sulfidrila, preferencialmente de resíduo de cisteína(s), inerentes ou artificialmente acrescentadas à Fel d1 da invenção, e opcionalmente também disponibilizadas para reação por redução. Diversos ligadores cruzados heterobifuncinais são conhecidos na técnica. Eles incluem os ligadores cruzados preferidos SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA e outros ligadores cruzados disponíveis, por exemplo, da Pierce Chemical Company, e que possuem um grupo funcional reativo para grupos amina e um grupo funcional reativo para grupos sulfidrila. Todos os ligadores cruzados mencionados acima levam à formação de uma ligação amida após reação com o grupo amina e uma ligação tioéter com os grupos sulfidrila. Outra classe de ligadores cruzados, adequados na prática da invenção, é caracterizada pela introdução de uma ligação dissulfe-to entre a Fel d1 da invenção e a VLP no acoplamento. Ligadores cruzados de preferência pertencem a esta classe e incluem, por exemplo, SPDP e Sulfo-LC-SPDP (Pierce).

Em uma concretização preferida, a composição da invenção compreende ainda um ligador. A engenharia de um segundo sítio de fixação na Fel d1 da invenção é obtida pela associação de um ligador, o qual conte-nha preferencialmente, pelo menos, um aminoácido adequado como segundo sítio de fixação, de acordo com as exposições desta invenção. Por conseguinte, em uma concretização preferida da presente invenção, um ligador é associado à Fel d1 da invenção por, pelo menos, uma ligação covalente, preferencialmente por, pelo menos, tipicamente uma ligação peptídica. Preferencialmente, o ligador compreende ou, alternativamente, é constituído pelo segundo sítio de fixação. Em ainda outra concretização preferida, o ligador compreende um grupo sulfidrila, preferencialmente de um resíduo de cisteína. Em uma outra concretização preferida, o ligador aminoácido é um resíduo de cisteína.

A seleção de um ligador dependerá da natureza da Fel d1 da invenção, de suas propriedades bioquímica, como pl, distribuição de carga e glicosilação. De uma maneira geral, ligadores aminoácidos flexíveis são os preferidos. Em ainda outra concretização preferida da presente invenção, o ligador consiste em aminoácidos, em que, ainda preferencialmente, o ligador consiste em, no máximo, 25, preferencialmente em, no máximo, 20 e ainda mais preferencialmente em no máximo 15 aminoácidos. Em uma, mais uma vez preferida, concretização da invenção, o ligador aminoácido não contém mais de 10 aminoácidos. Concretizações preferidas do ligador são selecionadas do grupo composto por: (a) CGG; (b) ligador N-terminal gama 1 (por exemplo, CGDKTHTSPP, SEQ ID N0:58); (c) ligador N-terminal gama 3 (por exemplo, CGGPKPSTPPGSSGGAP, SEQ ID N0:69); (d) regiões articuladas de Ig; (e) ligadores N-terminal glicina (por exemplo, GCGGGG, SEQ ID N0:59); (f) (G)kC(G)n com n=0-12 e k=0-5; (g) ligadores N-terminal glicinaserina ((GGGGS)n, n=1-3, com ainda outra cisteína, (por exemplo, SEQ ID NO:60, que corresponde a uma concretização em que n=1); (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n, com n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2 (por exemplo, SEQ ID NO:61, que corresponde a um concretização em que n=1, k=1,1=1 e m=1); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (I) ligador C-terminal gama 1 (por exemplo, DKTHTSPPCG, SEQ ID N0:62 ); (m) ligador C-terminal gama 3 (por exemplo, PKPSTPPGSSGGAPGGCG, SEQ ID N0:63); (n) ligadores C-terminal glicina (GGGGCG, SEQ ID NO:64); (o) (G)nC(G)k, com n=0-12 e k=0-5; (p)ligadores C-terminal glicina-serina ((SGGGG)n, n=1-3 com uma cisteína adicional (por exemplo, SEQ ID NO:65, que corresponde a uma concretização, em que n=1)); (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k, com n=0-3, k=0-5, m=0-10, 1=0-2, e o=0-8 (por exemplo, SEQ ID NO:66, que corresponde a uma concretização, em que n=1, k=1, 1=1, o=1 e m=1). Em ainda uma outra concretização preferida, o ligador é acrescentado ao N-terminal da Fel d1 da invenção. Em ainda outra concretização preferida da invenção, o ligador é acrescentado ao C-terminal da Fel d1 da invenção.

Ligadores preferidos, de acordo com esta invenção, são ligadores de glicina (G)n, contendo ainda um resíduo de cisteína como segundo sítio de fixação, como o ligador N-terminal glicina (GCGGGG) e ligador C-terminal glicina (GGGGCG). Outras concretizações preferidas são o ligador C-terminal glicina-lisina (GGKKGC, SEQ ID NO:67) e ligador N-terminal gli-cina-lisina (CGKKGG, SEQ ID NO:68), ligadores GGCG a GGC ou GGC-NH2 ("NH2" designando amidação) no C-terminal do peptídeo ou CGG em seu N-terminal. Geralmente, resíduos de glicina serão inseridos entre ami-noácidos a granel e a cisteína a serem utilizados como segundo sítio de fixação, de forma a evitar impedimento estérico do aminoacido a granel na reação de acoplamento.

Em uma concretização de preferência, o ligador é fundido ao N-terminal da proteína Fel d1 ou fragmento de Fel d1. Em ainda outra concretização preferida, o ligador é GCGG. Em outra concretização de preferência, o ligador é fundido ao C-terminal da proteína Fel d1 ou fragmento de Fel d1. Em ainda outra concretização preferida, o ligador é GGC. No caso da proteína Fel d1 ou fragmento de Fel dl serem constituídos por duas cadeias de polipeptídeos, esta proteína Fel d1 ou o fragmento de Fel d1 possui duas porções N-terminal e duas porções C-terminal. O ligador pode ser fundido às duas porções N-terminal ou as duas porções C-terminal. Preferencialmente, o ligador é fundido a somente uma das duas porções N-terminal ou a somente uma das duas porções C-terminal.

A ligação da Fel d1 da invenção à VLP, usando um ligador cruzado heterobifuncional, de acordo com os processos preferidos descritosacima, permite o acoplamento da Fel d1 da invenção à VLP de maneira orientada. Outros processos de ligação da Fel d1 da invenção à VLP incluem processos em que a Fel d1 da invenção é ligada cruzada à VLP, utilizando o carbodiimida EDC e NHS. A Fel d1 da invenção pode ser também inicialmente tiolada, por meio de reação, por exemplo, com SATA, SATP ou imino-tiolano. A Fel d1 da invenção, após ter sido retirada a proteção, pode ser em seguida acoplada à VLP da forma como segue. Após a separação do excesso do reagente de tiolação, a Fel d1 da invenção reage com a VLP, previamente ativada com um ligador cruzado heterobifuncional, compreendendo uma porção reativa de cisteína e exibindo, por conseguinte, pelo menos um ou diversos grupos funcionais reativos para resíduos de cisteína, com os quais a Fel d1 tiolada da invenção pode reagir, conforme descrito acima. Opcionalmente, quantidades baixas de um agente redutor são incluídas na mistura da reação. Em ainda outros processos, a Fel d1 da invenção é anexada à VLP, utilizando um ligador cruzado homobifuncional, como glutaral-deído, DSG, BM[PEO]4, BS3, (Pierce) ou outros ligadores cruzados homobi-funcionais conhecidos com grupos funcionais reativos para grupos amina ou grupos carboxila da VLP.

Em ainda outras concretizações da presente invenção, a composição compreende ou, alternativamente, é essencialmente constituída por uma partícula semelhante a vírus ligada à Fel d1 da invenção por meio de interações químicas, em que, pelo menos, uma destas interações não é uma ligação covalente. Por exemplo, a ligação da VLP à Fel d1 da invenção pode ser efetuada por biotinilação da VLP e expressão da Fel d1 da invenção sob a forma de uma proteína de fusão-estreptavidina.

Uma ou diversas moléculas de antígeno, isto é, a Fel d1 da invenção, pode ser anexada a uma subunidade da VLP, preferencialmente de proteínas de revestimento de RNA fago, preferencialmente pelos resíduos de lisina expostos das proteínas de revestimento da VLP de RNA fago, se estericamente possível. Uma característica específica de VLPs de RNA fago e, particularmente de VLP com proteína de revestimento Qp é possibilitar, dessa forma, o acoplamento de diversos antígenos por subunidade. Issopermite a geração de um arranjo repleto de antígeno.

Em concretizações muito preferidas da invenção, a Fel d1 da invenção é ligada, por meio de um resíduo de cisteína, que foi acrescentado ao N-terminal ou o C-terminal da Fel d1 da invenção, ou resíduo natural de cisteína contido na Fel d1 da invenção, a resíduos de lisina de proteínas de revestimento das VLPs de RNA fago e, particularmente, à proteína de revestimento de Qp.

Como descrito acima, há quatro resíduos de lisina expostos na superfície da VLP de proteína de revestimento de Qp. Típica e preferencialmente, estes resíduos são derivatizados ao reagirem com uma molécula de um ligador cruzado. Caso nem todos os resíduos de lisina expostos possam ser acoplados a um antígeno, os resíduos de lisina que reagiram com o ligador cruzado são deixados com uma molécula do ligador cruzado, anexada ao grupo e-amina após a etapa de derivatização. Isso leva ao desaparecimento de uma ou diversas cargas positivas, podendo prejudicar a solubilida-de e estabilidade da VLP. Pela substituição de alguns dos resíduos de lisina com argininas, conforme nos mutantes de proteína de revestimento Qp, impedimos o desaparecimento excessivo de cargas positivas uma vez que os resíduos de arginina não reagem com os ligadores cruzados de preferência.

Ademais, a substituição de resíduos de lisina por resíduos de arginina pode levar a arranjos antigênicos mais definidos, uma vez que um número menos de sítios está disponível para reação com o antígeno.

De acordo com o precedente, resíduos de lisina expostos foram substituídos por argininas nos seguintes mutantes de proteína de revestimento Qp: Qp-240 (Lis13-Arg; SEQ ID NO: 15), Qp-250 (Lis 2-Arg, Lis13-Arg; SEQ ID NO:17), Qp-259 (Lis 2-Arg, Lis16-Arg; SEQ ID NO:19) e Qp-251; (Lis16-Arg, SEQ ID NO:18). Em ainda outra concretização, expomos uma proteína de revestimento Qp mutante com um resíduo adicional de lisina Qp-243 (Asn 10-Lis; SEQ ID NO:16), adequado para se obter arranjos antigênicos com uma densidade mais alta.

Em uma concretização preferida da invenção, a VLP da invenção é produzida por recombinação por um hospedeiro em que a referidaVLP é essencialmente livre do RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro. Em ainda outra concretização preferida, a composição compreende ainda, pelo menos, uma macromolécula polianiôni-ca ligada, preferencialmente empacotada ou inserida na VLP. Em ainda outra concretização preferida, a macromolécula polianiônica é o ácido poliglu-tâmico e/ou ácido poliaspártico.

Essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro. O termo "essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro", conforme utilizado no presente, refere-se à quantidade de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro, compreendido pela VLP, sendo esta quantidade típica e preferencialmente inferior a 30 ug, preferencialmente inferior a 20 ug, mais preferencialmente inferior a 10 ug, ainda mais preferencialmente inferior a 8 ug, ainda mais preferencialmente inferior a 6 ug, ainda mais preferencialmente inferior a 4 ug e mais preferencialmente ainda inferior a 2 ug por mg da VLP. Hospedeiro, conforme utilizado no contexto precedente, refere-se ao hospedeiro no qual a VPL é produzida por recombinação. Métodos convencionais para determinação da quantidade RNA, preferencialmente de ácidos nucléicos, são conhecidos pela pessoa capacitada na técnica. O método típico e preferido para determinar a quantidade de RNA, preferencialmente de ácidos nucléicos, de acordo com a presente invenção, é descrito no Exemplo 17 do PCT/EP2005/055009, protocolizado em 05 de outubro de 2005, pelo mesmo designador. Condições idênticas, semelhantes ou análogas são típica e preferencialmente utilizadas para a determinação da quantidade de RNA, preferencialmente de ácidos nucléicos, para composições da invenção, compreendendo VLPs diferentes da Qp. As modificações das condições eventualmente necessárias fazem parte do conhecimento da pessoa capacitada na técnica. O valor numérico das quantidades determinadas deve típica e preferencialmente ser entendido como compreendendo valores que distanciem ± 10%, preferencialmente que se distanciem ± 5% do valor numérico indicado.

Molécula polianiônica: O termo "macromolécula polianiônica",conforme utilizado no presente, refere-se a uma molécula de alta massa molecular relativa que compreenda grupos repetidos de carga negativa, a estrutura da qual essencialmente compreendendo a repetição múltipla de unidades que são derivadas, realmente efetiva ou conceitualmente, de moléculas de baixa massa molecular relativa. Uma macromolécula polianiônica deve possuir um peso molecular de pelo menos 2000 Dalton, mais preferencialmente de, pelo menos, 3000 Dalton e ainda mais preferencialmente de, pelo menos, 5000 Dalton. O termo "macromolécula polianiônica", .conforme utilizado no presente, refere-se típica e preferencialmente a uma molécula que não é capaz de ativar receptores Toll-like. Dessa forma, o termo "macromolécula polianiônica" típica e preferencialmente exclui ligantes de receptores Toll-like e, ainda mais preferencialmente, exclui substâncias imunoestimulan-tes como ligantes de receptores Toll-like, ácidos nucleicos imunoestimulan-tes e lipopolissacarídeos (LPS). Mais preferencialmente, o termo "macromolécula polianiônica", conforme utilizado no presente, refere-se a uma molécula que não é capaz de induzir produção de citoquina. Ainda mais preferencialmente, o termo "macromolécula polianiônica" exclui substâncias imunoes-timulantes. O termo "substância imunoestimulante", conforme utilizado no presente, refere-se a uma molécula que é capaz de induzir e/ou aprimorar resposta imunológica especificamente contra o antígeno compreendido na presente invenção.

RNA de hospedeiro, preferencialmente ácidos nucleicos de hospedeiro: O termo "RNA de hospedeiro, preferencialmente ácidos nucleicos de hospedeiro" ou o termo "RNA de hospedeiro, preferencialmente ácidos nucleicos de hospedeiro com estrutura secundária", conforme utilizados no presente, refere—se ao RNA, preferencialmente ácidos nucleicos que são sintetizados originalmente pelo hospedeiro. O RNA, preferencialmente ácidos nucleicos, pode, no entanto, ser submetidos a alterações químicas e/ou físicas, durante o processo para reduzir ou suprimir a quantidade de RNA, preferencialmente de ácidos nucleicos, típica e preferencialmente por meio dos processos da invenção, por exemplo, o tamanho do RNA, preferencialmente de ácidos nucleicos, pode ser encurtado ou a estrutura secundária domesmo pode ser alterada. No entanto, mesmo este RNA ou ácidos nucléicos resultantes são ainda considerados RNA de hospedeiro ou ácidos nucléicos de hospedeiro.

Métodos para determinar a quantidade de RNA e para reduzir a quantidade de RNA compreendido pela VPL, foram descritos no PCT/EP2005/055009, protocolizado pelo mesmo designador em 05 de outubro de 2005, e, dessa forma, o pedido em sua totalidade é aqui incorporado por referência. A redução ou eliminação da quantidade de RNA do hospedeiro, preferencialmente ácido nucléico do hospedeiro, minimiza ou reduz respostas não desejadas de células T, como resposta inflamatória de célula R e resposta citotóxica de célula T, e outros efeitos colaterais não desejados, como febre, enquanto mantém forte resposta de anticorpo especificamente contra a Fel d1.

Em uma concretização de preferência, esta invenção prove um processo para o preparo das composições da invenção e de VLP de um RNA bacteriófago - Fel d1 da invenção, em que a referida VLP é produzida por recombinação por um hospedeiro e em que a referida VLP é essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro, compreendendo as etapas de: a) produção por recombinação de uma partícula semelhante a vírus (VLP), com pelo menos um primeiro sítio de fixação, por um hospedeiro, em que a referida VLP compreende proteínas de revestimento, variantes ou fragmentos das mesmas, de um RNA bacteriófago; b) desmontagem da referida partícula semelhante a vírus para as referidas proteínas de revestimento, variantes ou fragmentos das mesmas, do referido RNA bacteriófago; c) purificação das referidas proteínas de revestimento, variantes ou fragmentos das mesmas, do referido RNA bacteriófago para uma partícula semelhante a vírus, em que a referida partícula semelhante a vírus é essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro; e e) a ligação de pelo menos um antígeno da invenção com pelo menos um segundo sítio de fixação com a referida VLP obtida da etapa (d). Em ainda outra concretização de preferência, a remontagem das referidas proteínas de revestimento purificadas,variantes ou fragmentos das mesmas, é efetuada na presença de pelo menos uma macromolécula polianiônica.

Em uma concretização preferida, a composição da invenção compreende ainda pelo menos uma substância imunoestimulante capaz de induzir e/o aprimorar uma resposta imunológica. Preferencialmente a substância imunoestimulante é um ligante do receptor Toll-like, preferencialmente selecionada do grupo composto por: (a) ácidos nucléicos imunoestimulantes; (b) peptídeoglicanos; (c) lipopolissacarídeos; (d) ácidos lipoteicônicos; (e) compostos imidazoquinolinas; (f) flagelinas; (g) lipoproteínas; (h) moléculas orgânicas imunoestimulantes; (i) oligonucleotídeos contendo CpG não meti-lado; e (j) quaisquer misturas de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) e (i).

Em ainda outra concretização preferida, o ácido nucléico imunoestimulante é preferencialmente selecionado do grupo composto por: (a) um ácido nucléico de origem bacteriana; (b) um ácido nucléico de origem viral;

(c) um ácido nucléico compreendendo um motivo CpG não metilado; (d) um RNA dupla fita; (e) um RNA fita simples; e (g) um ácido nucléico livre de motivo CpG não metilado. Ácidos nucléicos imunoestimulantes que não contêm motivo CpG não metilado foram descritos na técnica anterior, por exemplo, na WO01/22972. O termo "ácido nucléico", conforme utilizado no presente, refere-se a uma molécula composta por monômeros (nucleotídeos) lineares ligados covalentemente. Ele indica uma cadeia molecular de nucleotídeos e não se refere a uma extensão específica do produto. Dessa forma, oligonucleotídeos estão incluídos na definição de ácido nucléico. A ligação entre os nucleotídeos é típica e preferencialmente uma ligação fosfodiéster. Também são abrangidos por esta invenção, ácidos nucléicos que compreendam modificações de ligação como, por exemplo, uma ligação fosforotioato.

Em uma concretização preferida, a substância imunoestimulante é misturada com a VLP recombinante. Em ainda outra concretização preferida, a substância imunoestimulante está ligada, preferencialmente inserida, a VLP da invenção.

Descrições detalhadas de substância imunoestimulante, particularmente ácido nucléico imunoestimulante, mais particularmente, oligonucle-otídeos compreendendo CpG não metilada foram expostas no WO 03/024480, 03/024481 e PCT/EP/04/003165. Métodos para mistura de substâncias imunoestimulantes com a VPL-antígeno foram expostos no WO 03/024480. Métodos de empacotamento de substâncias imunoestimulantes no interior da VLP foram expostos no WO 03/024481. Os pedidos WO 03/024480, 03/024481 e a PCT/EP/04/003165 em sua totalidade são aqui incorporados por referência. VLP pode geralmente induzir e/ou aprimorar o sistema imunológico. No entanto, o termo "substância imunoestimulante", conforme utilizado no contexto deste pedido, refere-se a uma substância imunoestimulante diferente da VLP utilizada para as composições da invenção, em vez de se acrescentar à referida VLP.

A inclusão de substâncias imunoestimulantes, preferencialmente ácidos nucléicos imunoestimulantes, na composição da invenção pode direcionar as respostas imunológicas para respostas Th1 e, pelo mesmo, suprimir as respostas Th2.

Em uma característica, a invenção fornece uma vacina compreendendo a composição da invenção. Em uma característica, a invenção fornece uma vacina compreendendo a composição da invenção e um tampão adequado. Em uma concretização preferida, a composição da vacina compreende ainda um adjuvante. A administração de, pelo menos, o único adju-vante pode, pelo presente, ocorrer antes, simultaneamente ou após a administração da composição da invenção. O termo "adjuvante", conforme utilizado no presente, refere-se a estimulantes não específicos da resposta imu-nológica que permitem a geração de um acúmulo no hospedeiro, o qual quando combinado com a vacina e uma composição farmacêutica, respectivamente, da presente invenção pode proporcionar uma resposta imunológi-ca ainda mais aprimorada.

Em outra concretização preferida, a composição da vacina é desprovida de adjuvante. Uma característica vantajosa da presente invenção é a alta imunogenicidade da composição, mesmo na ausência de adjuvan-tes. O uso evitado de adjuvantes pode reduzir uma possível ocorrência de efeitos colaterais, relativos ao uso de adjuvantes. Dessa forma, a adminis-tração da vacina da invenção para um pacientes ocorrerá preferencialmente sem a administração de, pelo menos um adjuvante para o mesmo paciente antes, simultaneamente ou após a administração da vacina.

A invenção descreve ainda um método para imunização compreendendo a administração da vacina da presente invenção para um mamífero humano ou não humano, como um cachorro ou gato. Sem pretender limitar a presente invenção pela teoria, a injeção da composição da vacina para um gato pode neutralizar a Fel d1 e, por conseguinte, reduzir a quantidade de Fel d1 na saliva do gato.

A vacina pode ser administrada por diversos modos conhecidos na técnica, porém será normalmente administrada por injeção, infusão, inalação, administração oral ou outros modos físicos adequados. Os conjugados poderão ser alternativamente administrados pelas vias intramuscular, intravenosa, transmucosa, transcutânea, intranasal, intraperitoneal ou subcutânea. Componentes de conjugados para administração incluem soluções estéreis aquosas (por exemplo, solução salina fisiológica) e não aquosas e suspensões. Exemplos de solventes não aquosos são o propileno glicol, po-lietileno glicol, óleos vegetais, como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como etil oleato. Veículos ou curativos oclusivos podem ser utilizados para aumentar a permeabilidade cutânea e melhorar a absorção do antíge-no.

Vacinas da invenção são consideradas como "farmacologica-mente aceitáveis" se a sua administração puder ser tolerada por um recipiente individual. E ainda, as vacinas da invenção serão administradas em uma "quantidade terapeuticamente eficaz" (isto é, uma quantidade que produza um efeito fisiológico desejado). A natureza ou tipo de resposta imuno-lógica não é um fator limitante desta exposição. Sem pretender limitar a presente invenção pela explicação do mecanismo seguinte, a vacina da invenção talvez induza anticorpos, presumivelmente subtipos de IgG, os quais se ligam à Fel d1, impedindo dessa forma que a Fel d1 seja vista pelo IgE ligado a mastócitos e basófilos. Alternativa ou simultaneamente, a composição da presente invenção direciona as respostas imunológicas para respostasTh1, suprimindo o desenvolvimento de respostas Th2 e, por conseguinte, a produção de anticorpos IgE, um dos principais componentes em reações alérgicas.

Em um aspecto, a invenção prove uma composição farmacêutica compreendendo a composição, conforme descrita na presente invenção, e um veículo farmacêutico aceitável. Quando a vacina da invenção é administrada a um indivíduo, ela pode estar em uma forma que contenha sais, tampões, adjuvantes ou outras substâncias que são convenientes para melhorar a eficácia do conjugado. Exemplos de materiais adequados para uso no preparo de composições farmacêuticas são fornecidos em diversas fontes, incluindo Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co., (1990)).

A invenção ensina um processo para a produção da composição da invenção compreendo as etapas de: a) fornecimento de uma partícula central com pelo menos um sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus ou uma partícula viral; (b) fornecimento de pelo menos um antígeno, em que o referido antígeno é uma proteína Fel d1 ou um fragmento de Fel d1, com pelo menos um segundo sítio de fixação; e (c) a combinação da referida partícula central e o referido, pelo menos, um antígeno, para produção da referida composição, em que d referido, pelo menos, um antígeno e a referida VLP estão ligados pelo primeiro e o segundo sítio de fixação.

Em uma outra concretização de preferência, a etapa para o fornecimento de partícula central, com pelo menos um único primeiro sítio de fixação, compreende ainda as etapas: (a) desmontagem da referida partícula central para proteínas de revestimento, mutantes ou fragmentos das mesmas, da referida partícula central; (b) purificação das referidas proteínas de revestimento, mutantes ou fragmentos das mesmas; (c) remontagem das referidas proteínas de revestimento purificadas, da referida partícula central, em que a referida partícula central é essencialmente livre de RNA do hospedeiro, preferencialmente de ácidos nucléicos do hospedeiro. Em ainda uma outra concretização preferida, a remontagem das referidas proteínas de re-vestimento purificadas é efetuada na presença de pelo menos uma macro-molécula polianiônica ou, pelo menos, um ácido nucléico imunoestimulante.

Em um aspecto, a invenção prove um método de uso das composições da invenção para prevenção e/ou tratamento de alergia a gatos em um mamífero, em que preferencialmente o referido mamífero é humano ou um cachorro.

Em um aspecto, a invenção expõe uso da composição da invenção como um medicamento. Em outro aspecto, a invenção prove o uso da composição da invenção para a fabricação de um medicamento para tratamento de alergia a gato em um mamífero, em que preferencialmente o referido mamífero é um ser humano ou um cachorro.

Em um aspecto, esta invenção fornece uma proteína de fusão da Fel d1, compreendendo a cadeia 1 da Fel d1 e a cadeia 2 da Fel d1 fundidas por meio de um espaçador de aminoácidos que liga o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia, em que o referido espaçador é constituído por uma seqüência de aminoácidos com 10-30, preferencialmente 10-25, preferencialmente 10-20, preferencialmente 13-20, preferencialmente 15-20, preferencialmente 13-17 e preferencialmente 15-17 aminoácidos e, em que a referida proteína de fusão não é uma proteína de fusão que compreenda a cadeia 1 da SEQ ID NO:22 fundida através de (GGGGS)3 ao N-terminal da cadeia 2 da SEQ ID NO:23, 25 ou 26, e em que a referida proteína de fusão recusada é expressada em sistema de expressão de baculo-vírus.

A WO2004094639 descreve uma proteína de fusão Fel d1 pela ligação da cadeia 1 e cadeia 2 com um ligador selecionado de uma ligação carbono-nitrogênio e um peptídeo curto, isto é, com de 1 a 9, preferencialmente de 1 a 5 e, particularmente preferível de 1 a 3 aminoácidos. Ele ainda afirma que surpreendentemente uma ligação ou peptídeo curto não induz restrições ou desdobramentos relevantes. No entanto o WO2004094639 deixa de mencionar um ligador mais extenso do que 9 aminoácidos.

O WO 00/20032 descreve a Fel D1 recombinante, expressada pelo baculovírus, compreendendo cadeia 1 e cadeia 2, expressadas em sé-rie e unidas por um ligador glicina/serina (GGGGS)3. A WO 00/20032 relatou também que a imunorreatividade da rFel d1 para anticorpo IgG e IgE é expressivamente aprimorada pela expressão do alérgeno no baculovírus, comparado ao alérgeno expressado em E. coli. A proteína de fusão Fel d1 da invenção pode ser produzida em

um sistema de expressão procariótico ou em um sistema de expressão eu-cariótico, como um sistema baculovírus. Em uma concretização de preferência, a referida proteína de fusão Fel d1 da invenção é produzida a partir do E. coli.

Em uma concretização de preferência, o espaçador, compreendido pela proteína de fusão Fel d1, é constituído por uma seqüência de ami-noácidos com 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 resíduos de ami-noácidos.

Em uma concretização preferida, o espaçador, compreendido pela proteína de fusão Fel d1, é constituído por uma seqüência de aminoáci-dos com 2, 3 ou 4 quatro repetições de GGGGS.

Em uma concretização preferida, a cadeia 2 da Fel d1 está no N-terminalda proteína de fusão da invenção.

Em outra concretização preferida, a cadeia 1 da Fel d1 está no N-terminal da proteína de fusão da invenção. Em uma outra concretização preferida, a proteína de fusão é produzida a partir do E. coli.

Em uma concretização muito preferida, a proteína de fusão Fel d1 da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo composto por: (a) SEQ ID NO:54; (b) SEQ ID NO:55; e (c) SEQ ID NO:57. A invenção fornece ainda a seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína de fusão Fel d1 da invenção. Em uma concretização de preferência, a invenção fornece uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão da invenção, selecionada do grupo composto por: (a) SEQ ID NO:54; (b) SEQ ID NO:55; e (c) SEQ ID NO:57. Em ainda uma outra concretização de preferência, a proteína de fusão Fel d1 da invenção é produzida em E. coli. Em outra concretização de preferência, a proteína de fusão Fel d1 da invenção compreende ou, alternativamente, é constituída por uma se-qüência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, em que a referida proteína de fusão da invenção é produzida em E. coli.

Em um aspecto, a invenção proporciona um uso da proteína de fusão Fel d1 da invenção para diagnóstico e tratamento de alergia a gato.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Preparo de VLPs de Qp da invenção por desmonta-gem/remontagem na presença de macromoléculas polianiônicas diferentes, resultando em VLPS de Qp remontados.

(A) Desmontagem de VLP de Qp de técnica anterior 45 mg de VLP Qp da técnica anterior (2,5 mg/ml, conforme determinado por análise de Bradford) em PBS (Fosfato a 20 mM, NaCI a 150 mM NaCI, pH 7,5), purificado de lisado de E. coli, foi reduzido com DTT a 10 mM por 15 min em temperatura ambiente, sob agitação. Em seguida, foi acrescentado cloreto de magnésio até uma concentração final de 0,7 M e a incubação continuou por 15 min em temperatura ambiente, sob agitação, levando ã precipitação do RNA encapsulado da célula hospedeira. A solução foi centrifugada por 10 min, a 4000 rpm, a 4 gC (Eppendorf 5810 R, em rotor de ângulo fixo A-4-62, utilizada em todas as etapas seguintes), para remover o RNA precipitado da solução. O sobrenadante, contendo a proteína de revestimento Qp dimérica liberada, foi utilizado para as etapas de purificação por cromatografia.

(B) Purificação da proteína de revestimento Qp, por cromatografia por troca catiônica e por cromatografia de exclusão por tamanho. O sobrenadante da reação de desmontagem, contendo a proteína de revestimento dimérica, proteínas celulares do hospedeiro e resíduos do RNA celular do hospedeiro, foi diluído em uma proporção de 1:15 em água para ajustar a condutividade para abaixo de 10 ms/cm, sendo injetada em uma coluna SP-Sefarose FF (xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience). A coluna foi equilibrada de antemão com tampão sódio fosfato a 20 mM, pH7 A eluição da proteína de revestimento ligada foi atingida por gradiente em etapa fosfato de sódio a 20 mM / cloreto de sódio a 500 mM, e a proteína foi coletada em um volumede fração de aproximadamente. A cromatografia foi conduzida em temperatura ambiente com uma vazão de 5 ml/min, e a absorbância foi monitorada em 260 nm a 280 nm.

Na segunda etapa, a proteína de revestimento Qp isolada (a fração eluída da coluna de troca catiônica) foi carregada (em duas etapas) em uma coluna Sefacril S-100 HR (xk26/60, 320ml, Amersham Bioscience), e-quilibrada com fosfato de sódio a 20 mM / cloreto de sódio a 250 mM, pH 6,5. A cromatografia foi conduzida em temperatura ambiente com uma vazão de 2,5 ml/min, e a absorbância foi monitorada em 260 nm a 280 nm. Foram coletadas frações de 5 ml.

(C1) Remontagem da VLP Qp por diálise Proteína de revestimento Qp purificada (2,2 mg/ml em fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,5), uma macromolécula pólianiônica (2 mg/ml em á-gua), uréia (7,2 M em água) e DTT (0,5 M em água) foram misturados até as concentrações finais de 1,4 mg/ml de proteína de revestimento, 0,14 mg/ml da macromolécula correspondente, uréia a 1 M e DTT a 2,5 mM. As misturas (1 ml, cada) foram dialisadas por dois dias a 5 9C em TrisHCL a 20 mM, Na-Cl a 150 mM, pH 8, utilizando membranas com limite de 3,5 kDa. As moléculas polianiônicas eram: ácido poligalacturônico (25000-50000, Fluka), dextrano sulfato (PM 5000 e 10000, Sigma), ácido poli-L-aspártico (PM 11000 e 33400, Sigma), ácido poli-L-glutâmico (PM 3000, 13600 e 84600, Sigma) e tRNAs de leveduras e germe de trigo.

(C2) Remontagem da VLP Qp por diafiltração 33 ml de proteína de revestimento Qp purificada (1,5 mg/ml em fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,5, NaCI a 250 mM) foram misturados com água e uréia (7,2 mM em água),NaCI (5 M em água) e ácido poli-L-glutâmico (2 mg/ml em água, PM: 84600). O volume da mistura foi de 50 ml e as concentrações finais dos componentes foram 1 mg/ml de proteína de revestimento, NaCI a 300 mM, uréia a 1,0 mM e 0,2 mg/ml de ácido poli-L-glutâmico. A mistura foi diafiltrada em seguida em temperatura ambiente, contra 500 ml de TrisHCI a 20 mM, pH8, NaCI a 50 mM, aplicado uma vazão cruzada de 10 ml/min e uma taxa de permeabilidade de fluxo de 2,5 ml/min,em um aparelho de filtração tangencial de fluxo, usando um compartimento de membrana Pellicon XL (Biomax 5K, Millipore).

EXEMPLO 2

Montagem in vitro de VPLs AP205 5 (A) Purificação de proteína de revestimento AP205 Desmontagem: 20 ml de solução contendo VLP AP205 (1,6 mg/ml em PBS, purificada de extrato de E.coli) foram misturados com 0,2 ml de DTT a 0,5 M e incubados por 30 min em temperatura ambiente. 5 ml de NaCI a 5 M foram acrescentados e a mistura foi então incubada por 15 min a 60°C, provocando precipitação das proteínas de revestimento, reduzidas pelo DTT. A mistura turva foi centrifugada (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20°C) e o sobrenadante foi descartado e o pelete, dispersado em 20 ml de uréia a 1 M/Citrato de NA a 20 mM, pH 3,2. Após agitação por 30 min em temperatura ambiente, a dispersão foi ajustada para pH 6,5 pelo acréscimo de Na2HP04 a 1,5 M e, em seguida, centrifugada (rotor Sorvall SS34, 10000 g, 10 min, 20 °C) para obter um sobrenadante contendo proteína de revestimento dimérica.

Cromatografia por troca catiônica: O sobrenadante (vide acima) foi diluído com 20 ml de água para ajustar a condutividade de aproximadamente 5 ms/cm. A solução resultante foi injetada em uma coluna de 6 ml SP Sefarose FF (Amersham Bioscience), previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,5. Após a carga, a coluna foi lavada com 48 ml de tampão fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,5, seguido por eluição da proteína de revestimento ligada por gradiente linear até NaCI a 1 M sobre 20 volumes da coluna. As frações do pico principal foram reunidas e analisadas por SDS-PAGE e espectroscopia por UV. De acordo com a análise por SDS-PAGE, a proteína de revestimento isolada estava essencialmente pura de outras contaminações protéicas. De acordo com a espectroscopia por UV, a concentração protéica foi de 0,6 mg/ml (quantidade total: 12 mg), considerando que 1 unidade de A280 reflete 1,01 mg/ml de proteína de revestimento AP205. Ademais, o valor de A280 (0,5999) sobre o valor de A260 (0,291) é 2, indicando que o preparado é essencialmente livre de ácidos nucléicos.(B) Montagem de VLPs AP205

Montagem na ausência de qualquer macromolécula polianiônica: A fração de proteína eluída da etapa precedente foi diafiltrada e concentrada por TFF para uma concentração protéica de 1 mg/ml em fosfato de sódio a 5 20 mM, pH 6,5. 500 ul desta solução foram misturados a 50 ul de uma solução de NaCI a 5 M e incubados por 48 h em temperatura ambiente. A formação de VLPs remontados na mistura foi mostrada por SDS-Page não redutor e por HPLC de exclusão por tamanho. Uma coluna TSKgel G5000 PWXL (Tosoh Bioscience), equilibrada com fosfato de sódio a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,2, foi utilizada para a análise por HPLC.

Montagem na presença de ácido poliglutâmico: 375 ul de proteína de revestimento AP205 purificada (1 mg/ml em fosfato de sódio a 20 mM, pH 6,5) foram misturados com 50 ul de solução estoque de NaCI (5 M em água), 50 ul de solução estoque de ácido poliglutâmico (2 mg/ml em água, PM: 86400, Sigma) e 25 ul de água. A mistura foi incubada por 48 h em temperatura ambiente. A formação de VLPs remontados na mistura foi mostrada por SDS-Page não redutor e por HPLC de exclusão por tamanho. A proteína de revestimento na mistura foi quase que completamente incorporada nas VLPs, mostrando uma eficiência de montagem mais alta do que a para a proteína de revestimento AP205 montada na ausência de qualquer macromolécula polianiônica.

EXEMPLO 3

Clonagem de proteínas de fusão Fel d1 Genes que codificam a cadeia 1 e cadeia 2 da Fel d1, respecti-25 vãmente, foram produzidos por amplificação-PCR, utilizando iniciadores sobrepostos de DNA, conforme mostrado abaixo. Estão indicados iniciadores forward (F) e reversos (R). Os fragmentos foram ligados em um vetor pCRIl-TOPO (Invitrogen) e transformados em XL1-Azul. A seqüência de insertos da cadeia 1 e cadeia 2 da Fel d1 foi verificada. Seqüência do IniciadoMF: SEQ ID NO:34;

Seqüência do Iniciador 2R: SEQ ID NO:35

Seqüência do Iniciador 3F: SEQ ID NO:36Seqüência do Iniciador 4R: SEQ ID NO:37 Seqüência do Iniciador 5F: SEQ ID NO:38 Seqüência do Iniciador 6R: SEQ ID NO:39 Seqüência do Iniciador 7F: SEQ ID NO:40 Seqüência do Iniciador 8R: SEQ ID NO:41

Seqüência do Iniciador 9F: SEQ ID NO:42 Seqüência do Iniciador 10R: SEQ ID NO:43 Construtos de fusão de Fel d1:

FELD1 refere-se à proteína com a cadeia 2 no N-terminal fundido diretamente com a cadeia 1. As seqüências de nucleotídeos que codificaram a FELD 1 foram criadas pela técnica de PCR-splicing overlap extension (SOE), utilizando o ligador do iniciador 11 (SEQ ID NO:44).

FD12 refere-se à proteína com a cadeia 1 no N-terminal fundida diretamente com a cadeia 2. A seqüência de nucleotídeo que codificou a FD12 foi criada pela técnica de PCR- splicing overlap extension (SOE), utilizando os iniciadores 12-1 (SEQ ID NO:45), 12-3 (SEQ ID NO:46) e 12-2-1 (SEQ ID NO:47).

FELD1-10aa e FELD1-15aa referem-se a proteínas com cadeia 2 no N-terminal fundida por meio de um espaçador de 10 (GGGGS)2 ou 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, com a cadeia 1 no C-terminal. Foi utilizado o plasmídeo contendo a seqüência de nucleotídeos que codifica a FELD1, como modelo, para criar os espaçadores de 10 ou 15 aminoácidos por mutagênese reversa-PCR (IPCRM). Para o espaçador 1-15, foram utilizados dois iniciadores (iniciador 1-1 Oaa, SEQ ID NO:48 e iniciador 2-5aa, SEQ ID NO:49). Para o espaçador 1-10, foram utilizados dois iniciadores (iniciador 1-5aa, SEQ ID NO:50 e iniciador 2-5aa). O fragmento resultante da PCR foi anelado por ligação. Ele é resistente à digestão por Dpn I, que somente reconhece a seqüência contendo adenina metilada, enquanto o plasmídeo modelo foi digerido por Dpnl. FELD1-10aa e FELD1-15aa referem-se a proteínas com cadeia 2 no N-terminal fundida por meio de um espaçador de 10 (GGGGS)2 ou 15 (GGGGS)3 aminoácidos, respectivamente, com a cadeia 2 no C-terminal. Afusão de FD12-10aa e FD12-15aa foi produzida de forma semelhante à descrita acima. Para o espaçador de 15 aminoácidos, foi utilizado o iniciador FD2-10aa (SEQ ID NO:51) e o iniciador FD1-5 aa (SEQ ID NO:52). Para o espaçador de 10 aminoácidos, foi utilizado o iniciador FD1-5aa e o iniciador FD2-5 aa (SEQ ID NO:53). EXEMPLO 4

Expressão bacteriana e purificação de proteínas de fusão Fel d1 com His-tea As seqüências de nucleotídeos que codificam diversos construc-tos de fusão de Fel d1, conforme descritos no EXEMPLO 3, foram subclonadas em um sistema de expressão pET-42T(+) a base de T7, modificado do plasmídeo pET-42a(+) (Novagen). O C-terminal dos constructos de fusão foi fundido a uma seqüência de His-tag, seguida por GGC, um ligador de ami-noácido contendo cisteína como o segundo sítio de fixação. Os constructos resultantes recebem denominados de acordo, pelo acréscimo de "-HC", em seu final.

FELD1-HC, FELD1-10aa-HC e FELD1-15aa-HC e FD12-15aa-HC foram expressas e purificadas da seguinte maneira: O plasmídeo foi transformado em BL21(DE3). A expressão foi induzida pelo acréscimo de IPTG a 1 mM à cultura em OD600 de aproximadamente. A cultura foi cultivada por 30 horas adicionais a 20 s, recolhida e submetida à lise por sonica-ção em tampão nativo de lise (NaH2P04 a 50 mM, NaCI a 300 mM, imidazol a 10 mM, pH8,0).

O lisado bacteriano clarificado foi levado a 50 ml com o tampão de lise nativo. 5 ml de agarose de ácido de níquel-nitrilo-tri-acético (Ni-NTA) (Qiagen) foram acrescentados e o lisado foi incubado, invertido, por uma hora a 4 °C. Proteínas ligadas inespecificamente foram removidas por lavagem, repetida quatro vezes, em tampão de lise nativo. A proteína ligada foi eluída por ressuspensão do agarose Ni-NTA em 2 ml de tampão de eluição (NaH2P04 a 50 mM, NaCI a 300 mM, imidazol a 250 mM, pH 8,0).

EXEMPLO 5

Ligações dissulfeto dobradas oxidativas em proteínas de fusão Fel d1

FELD1-HC purificada com afinidade com Ni2+ consiste em umavariedade de espécies com pontes misturadas de dissulfeto de 15 kD a 20 kD. O dobramento natural da FELD1-HC foi obtido pela mistura intramolecu-lar repetida das ligações dissulfeto com glutation oxidado (GSSG, Appli-chem) e glutation reduzido (GSH, Applichem) em uma razão molar de 1:1. A reação ocorreu por 24 horas, imediatamente após a eluição de FELD1 no tampão de eluição pelo acréscimo de GSSG a 2,5 mM e de GSH a 2,5 mM em temperatura ambiente. A FELD1-HC redobrada exibiu uma única faixa em um peso molecular de 15 kD, sob condições não redutoras (FIG.1, o primeiro painel, faixa 2). Os grupos sulfidrila de potencial livre da FELD1-HC foram transformados em alquilas, utilizando iodoacetamida (Sigma). As sondas foram tratadas com iodoacetamida a 5 mM em bicarbonato de amônia a 20 mM, em pH 8,0 por 15 minutos em temperatura ambiente.

A FELD1-HC redobrada foi ainda purificada até a homogeneidade por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) (Superdex 75 pg, A mersham Pharmacia Biosciences), equilibrada em PBS.

A FELD1-10aa-HC e a FELD1-15aa-HC foram renaturadas por um processo fundamentalmente igual ao do descrito acima (FIG.1, os dois painéis do meio).

O dobramento natural da FD12-15aa-HC foi obtido igualmente pela mistura repetida de ligações dissulfeto com glutation oxidado e glutation reduzido em uma razão molar de 10:1. Após a eluição, a FD12-15aa foi diluída vinte vezes no tampão de redobramento de FD12-15aa (Tris-CI a 50 mM, pH 8,5, NaCI a 240 mM, KCI a 10 mM, EDTA a 1 mM, PEG 3,550 a 0,05%, GSH a 0,1 mM, GSSH a 0,1 mM) e incubada a 4 eC por 24 horas. A FD12- 15aa redobrada apresentou uma fita única em um peso molecular de 20 kD, comparado a forma reduzida correndo em 23 kD (FIG. 1, ultimo painel). EXEMPLO 6

As proteínas de fusão Fel d1 são reconhecidas por anticorpos monoclonais específicos de epítopos. A ligação de proteínas de fusão Fel d1, em comparação à Fel dí natural (nFel d1), com anticorpos monoclonais epítopo-específicos (mAB) foi determinada por um teste ELISA tipo sanduíche, utilizando o kit ELISA deFel d1 (6F9/3E4) da Indoor biotechnologies (Cardiff, Reino Unido).

Resumidamente, o anti-Fel d1 mAB 6F9, fornecido sob a forma de solução estoque de 2 mg/ml, foi diluído para 1:1000 em tampão carbona-to-bicarboneto a 50 mM, pH 9,6. Os poços de microtitulação foram revestidos com 100 ul do mAB 6F9 diluído por poço em 4e durante a noite. As placas foram lavadas três vezes com PBS-0,05% Tween20 (PBS-T) e, em seguida, bloqueadas com 100 pi de tampão bloqueador (BSA a 1%(Sigma) em PBS-T). Os poços de microtitulação foram incubador por uma hora com 100 ul de proteínas de fusão Fel d1 ou nFel d1 padrão (Indoors technologies;

Reino Unido), utilizando diluições duplas de 80-0,16 ng/ml. A nFel d1 de referência foi subpadronizada da referência E10 de caspa de gato CBER, a qual contém 13,47 U/ml Fel d1 (1 unidade = 4 mg de proteína).

As placas foram lavadas em seguida e 100 ul diluídos (1:1000 em BSA/PBS-T a 1) de anticorpo anti-Fel d1 mAB 3E4 contendo biotinila foram acrescentados e incubados por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com PBS-T, utilizando 100 ul diluídos (1:1000 em BSA/PBS-T a 1%) de Estreptavidina-Peroxidase (Sigma S5512, 0,25 mg reconstituídas em 1 ml de água destilada). Após 30 minutos de in-cubação em temperatura ambiente, os poços foram lavados três vezes com PBS-T. A detecção foi efetuada com solução de substrato OPD e H2S04 a 5%, como solução de parada. A absorbância foi determinada, utilizando um aparelho de leitura de ELISA (BioRad) em 450 nm e para cálculo de médias aritméticas e erro padrão da média (SEM), o programa EXCEL (MS Office; Microsoft) foi utilizado. Os resultados são apresentados na TABELA 1. Dessa forma, o reconhecimento de proteínas de fusão Fel d1 e de nFel d1 por mABs epítopo-específicos reflete a alta semelhança de antigenicidade de ambas as proteínas.

TABELA 1

<table>table see original document page 54</column></row><table>EXEMPLO 7

Acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 a VLPs, derivadas de QB

Uma solução a 143 uM de VLP QB em tampão HEPES (HEPES a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,2) reagiu com excedente molar 5 vezes maior (715 uM) de SMPH (Pierce) por 30 minutos em 25 eC, sob agitação. O SMPH foi retirado de um estoque a 50 mM, dissolvido em sulfóxido de dime-tila. Os produtos da reação foram dialisados em relação a duas mudanças de PBS, utilizando uma unidade de diálise com um limite de corte de 10,000 Da de peso molecular (Slide-A-Lyzer, Pierce. A diálise foi conduzida a 4 °C em temperatura ambiente, com um tampão mais de >1000 vezes o da mistura da reação.

Antes de acoplar as proteínas de fusão Fel d1 para VPL QB, de-rivatizadas por SMPH, as FELD1, FELDMOaa, FELD1-15aa e FD12-15aa, respectivamente, conforme obtidas, segundo o EXEMPLO 5, foram incubadas com TCEP (Pierce, Perbio Science) em quantidades equimolares por 30 minutos em temperatura ambiente.

As proteínas de fusão Fel d1 foram acrescentadas em excedente molar 5 vezes maior ao da solução a 143 uM de VPLs QB, derivatizadas por SMPH. O volume de reação foi de 650 ul e reações múltiplas foram realizadas em paralelo. As reações foram incubadas por 4 horas em temperatura ambiente, sob agitação. Após o acoplamento, as alíquotas foram centrifugadas em 16.000 x g por 3 minutos em 4 eC até serem transformadas em material insolúvel peletizado. Os sobrenadantes foram reunidos em novos tubos. O acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 à VLP de QB foi avaliado por SDS-PAGE redutor.

O acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 à VLP remontada de QB (obtida do EXEMPLO 1) ocorre substancialmente da mesma forma conforme o descrito acima.

EXEMPLO 8

Acoplamento de FELD1. FELD1-15aa e FD12-15aa a HBcAa1-185-Lis

A construção de HBcAg1-185-Lis, sua expressão e purificação foram substancialmente descritas no EXEMPLO 2-5 do WO 03/040164. Umasolução de VLP HBcAg1-185-Lis VLP a 120 uM em Hepes a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,2, reage por 30 minutos com um excedente molar, 25 vezes maior de SMPH (Pierce), diluído da solução estoque em DMSO, a 25 °C em um agitador rotativo. A solução de reação é duas vezes dialisada subse-5 qüentemente por duas horas contra 1 litro de Hepes a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,2 , em 4 °C. A mistura dialisada de HBcAg1-185-Lis reage, em seguida, com a Fel d1 recombinante obtida no EXEMPLO 5. Na reação de acoplamento, a FELD1, FELD1-15aa a FD12-15aa, respectivamente/estão presentes em um excedente molar duas vezes maior do que o da VLP HB-10 cAg1-185-Lis derivatizada. A reação de acoplamento prossegue por quatro horas em 25°C em um agitador rotativo.

EXEMPLO 9

Acoplamento de FELD1. FELD1-15aa e FD12-15aa com VLPs derivadas de AP205

O preparo de VLP de AP205 VLP foi descrito no EXEMPLO 1 e 2 no WO 2004/007538. A derivatização de VLP de AP205 é substancialmente a mesma da descrita no EXEMPLO 7 para VLP Qp. Antes de acoplar as proteínas de fusão Fel d1 para VPL AP205, derivatizadas por SMPH, as FELD1, FELD1-10aa, FELD1-15aa e FD12-15aa, respectivamente, conforme obtidas, segundo o EXEMPLO 5, foram incubadas com TCEP (Pierce, Perbio Science) em quantidades equimolares por 30 minutos em temperatura ambiente.

As proteínas de fusão Fel d1 são acrescentadas em excedente molar 5 vezes maior do que o da solução a 143 uM de VLPs AP205, derivatizadas por SMPH. As reações foram incubadas por 4 horas em temperatura ambiente, sob agitação.

O acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 com VLP remontada de AP205 (obtida do EXEMPLO 2) ocorre substancialmente da mesma forma conforme o descrito acima.

EXEMPLO 10

Produção da composição da invenção baseada em bacteriófaao QB.

Uma cultura com 601 E. coli AB259 (5x107 células/ml) foi culti-vada por 2-3 horas a 37 °C, sob intensa aeração (1 volume de ar / volume of minuto em cultura) para que fosse obtida uma cultura de aproximadamente 2-4x109 células/ml. O lisado clarificado de Qp fago foi inoculado em um múltiplo de infecção de 5 e CaCI2 foi acrescentado para uma concentração final de 2,2 mM. Após uma fase de adsorção de 5 minutos, a aeração foi intensificada (1,5 volumes de ar / volume de minuto em cultura). As células foram cultivadas ainda por mais 3 horas, até que OD65o nm atingisse um valor de equilíbrio, produzindo 4-6x1012 partículas de fago na cultura. Estas foram purificadas da seguinte maneira: E.coli foi lisada pelo acréscimo de 10 ml de CHCI3 / I cultura, 0,1 mg de lisozima / I cultura e EDTA para uma concentração final de 20 mM. O lisado foi clarificado por centrifugação, em uma centrífuga contínua resfriada, e as partículas do fago sedimentadas do lisado por precipitação com sulfato de amônia (500 g/l, produzindo aproximadamente 66% de saturação). A suspensão foi inicialmente decantada e o precipitado isolado por centrifugação por 30 minutos, utilizando uma centrífuga Janetzki K26 com rotor W.R. 6 x 500 ml a 6000 rpm, ou em uma centrífuga Beckman J21 C com rotor JA-10. O pelete foi novamente solubilizado em tampão NT (NaCI a 0,15 e Trypton a 0,1%) e clarificado por centrifugação. O sobrena-dante foi precipitado com sulfato de amônia (acrescentados 500 g/1, aproximadamente 66% de saturação). O precipitado foi isolado por centrifugação, ressolubilizado em tampão NT e clarificado de novo por centrifugação. As partículas do fago foram isoladas do sobrenadante resultante por ultracentri-fugação por 3,5 h, utilizando um roto Beckman do tipo 35 em 32 000 rpm. Os fagos sedimentados foram ressuspendidos em tampão NT e purificados por ultracentrifugação em um gradiente convencional contínuo de CsCI. A centrifugação foi conduzida utilizando um rotor Beckman Ti-70 (8x38,5) rotor, em 55 000 rpm por 20 horas. As partículas do fago foram subseqüentemente dialisadas em Hepes a 20 mM, NaCI a 150 mM, pH 7,4 para serem utilizadas em etapas de ligação cruzada química, conforme descrita no EXEMPLO 7.

EXEMPLO 11

Preparo da composição da invenção baseada em faao GA

Uma cultura de 12 I E. coli Q 13 Hfr RNASse I' , em meio M9contendo 2% de hidrolisado de caseína, 0,5% de extrato de levedura, 0,2% de glicose, foi cultivada até um OD540 nm de 0,6-0,7, que corresponde a aproximadamente 2x108 células/ml, e infectada com GA fago em um múltiplo de infecção de 10-20. A cultura cresceu por mais 2,5 a 3 horas a 37 °C e produziu aproximadamente 1011 partículas de fago em toda a cultura. As células foram submetidas à lise pelo acréscimo de CHCI3 a 1-2% v/v e a cultura incubada por 15 minutos. O lisado foi clarificado por centrifugação por 30 minutos a 5000 rpm em um rotor Janetzi K26. As partículas de fato foram precipitadas com sulfato de amônia (60% de saturação) do meio da cultura durante diversos dias a 4°C. A suspensão foi inicialmente decantada, e o precipitado isolado por centrifugação por 30 minutos a 6000 rpm em um roto Janetzki K26. O pelete foi ressuspendido em tampão NET (Tris a 20 mM, pH 7,8, NaCI a 150 mM, EDTA a 5 mM), e as partículas extraídas por diversos ciclos de centrifugação e ressuspensão, em partes pequenas do tampão NET. As partes contendo capsídeos foram reunidas e precipitadas com sulfato de amônia a 60%. As partículas ressuspendidas em tampão NET foram purificadas três vezes em uma coluna Sefarose 4B e, subseqüentemente em dois gradientes de sacarose. Resumidamente, um gradiente de 7 ml de sa-carose com as seguintes concentrações v/v, 50%, 43%, 36%, 29% e 22% foi preparado em tampão NET em tubos de centrífuga. A solução de fagos (em tampão NET) foi posta em camadas sobre gradiente e centrifuga por 17 horas em um rotor Beckman SW 28 a 25 000 rpm. As frações contendo capsídeos foram reunidas e separadas da sacarose por filtração em gel em uma coluna Sefarose 4B. As partículas de fagos foram subseqüentemente dialisadas em água e liofilizadas para uso posterior.

A condição do acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 com o bacteriófago Qp ou GA é substancialmente a mesma condição do acoplamento com a VLP de Qp, conforme exposto no EXEMPLO 7.

EXEMPLO 12

Proteínas de fusão Fel d1 Qp são altamente imunoqênicas em camundon-aos Camundongos BALB/c foram imunizados sc com 50 ug de Qp-FELD1, obtida do EXEMPLO 7 ou 50 ug de Qp, misturada com Fel d1 re-combinante (obtida do EXEMPLO 5) nos dias 0, 14 e 21 e as amostras de sangue foram coletadas nos dias 0, 21 e 28. Foram determinados anticorpos específicos da Fel d1 por ELISA, utilizando FELD1 para revestimento (10 ug/ml). Em resumo, foram utilizados 96 poços F96, que foram pré-revestidos a 4°C durante a noite com 10 jxg/ml de FELD1 em NaHC03 a 0,1 M e pH 9,6. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-Tween 20 e o fundo foi reduzido pela incubação das placas 2 horas a 37°C com tampão de parada (BSA a 2%, Sigma) em PBS-Tween20. O soro foi diluído em tampão de diluição de soro (BSA a 2%, FCS a 1% em PBS-Tween20). Foram conduzidas duas etapas de diluição e incubação por 2 horas em temperatura ambiente em agitador de placa de ELISA. As placas foram lavadas cinco vezes e anticorpo de detecção, diluído em 1:1000 (IgG HRPO anti-camundongo acoplado (Sigma)), foi incubado por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes com PBS-Tween20 e a detecção foi efetuada usando solução de substrato OPD (Na2HP04 a 0,066 M, ácido cítrico a 0,035, pH 5,0, contendo 10 mg de OPD (Fluka) e 8 M-l de H202 a 30% (Fluka) por 25ml) e H2S04 a 5% em H20, como solução de parada. A absorbância foi determinada utilizando um aparelho de leitura de ELISA em 450 nm e, para cálculo de médias aritméticas e erro padrão de média (SEM), foi utilizado o programa EXCEL (Microsoft).

Camundongos imunizados com a Qp-FELD1 descreveram uma meia absorção máxima de 120.000 e 75.000 no 21e dia e 289 dia, respectivamente. Por outro lado, camundongos imunizados com uma mistura de Qp/FELD 1 sem ligamento cruzado, apresentaram títulos mais baixos de 7000 e 6000 no 219 e 28e dia, respectivamente.

EXEMPLO 13

Imunização de camundonqo com alumínio, como adiuvante Camundongos Balb/c de 7-8 semanas foram vacinados três vezes (dias 0, 14 e 28) com 50 ug da QpVLP-FELD1-HC da técnica anterior. As vacinas foram diluídas em 200 ul de PBS estéril ou 100 ul de PBS e 100 ul de AluGel-S (Serva), respectivamente, e injetadas por via subcutânea naregião inguinal esquerda e direita.

Foi coletado soro nos dias 14, 21, 28, 42, 56, 84 e 112. Foram determinados por ELISA anticorpos específicos contra a Fel d1 natural, FELD-HC e QB VLP. Placas de microtitulação foram revestidas durante a noite com 1

ng/ml de Fel d1 natural (nFel d1, Indoors biotechnologies), 10 mg/ml de FELD1-HC e 10 mg/ml de Qb VLP, respectivamente. Após a lavagem (Twe-en 20/PBS a 0,05%) e parada com BSA a 2% em PBS, o soro foi acrescentado em diluições diferentes em BSA a 2%/FCS a 1 %/PBS.

Posteriormente, foi conduzido o ELISA pelo método padrão. As vacinas com Q(3 VLP-FELD1-HC induziram uma resposta de anticorpo duradoura alta específica para Feldl para FELD1 natural e FELD1. O título de anticorpos foi mais alto na presença de alumínio do que na ausência de a-lumínio (TABELA 2).

TABELA 2

<table>table see original document page 60</column></row><table>

EXEMPLO 14

FELD1 acoplado com QB reduziu drasticamente potencial alérgico in vitro

Para testar a capacidade da Qp-FELD1-HC para desencadear uma reação alérgica in vitro, foram isolados basófilos do sangue de três gatos doadores alérgicos. Em um gato alérgico, estes basófilos são revestidos com IgE específica da Fel d1 e respondem com aumento regulado de CD63 à estimulação alérgena. Dessa forma, basófilos do indivíduo alérgico foram estimulados com quantidades graduadas de Qp-FELDI-HC ou FELD1-HC isolada e o aumento regulado de CD63 foi determinado por citometria defluxo. Enquanto que a FELD1-HC (obtida do EXEMPLO 5) desencadeou um forte aumento regulado de CD63, na mais baixa diluição testada (aproximadamente 0,2ng/ml), QP-FELD1-HC (obtida do EXEMPLO 7) exibiu um potencialmente alérgico drasticamente reduzido e requereu quantidades de 100-1000 vezes mais altas (aproximadamente 70ng/ml) de FELD1-HC para que os basófilos apresentassem uma resposta.

Este teste foi igualmente repetido para as proteínas de fusão FELD-15aa-HC e FD12-15aa-HC, isoladas ou acopladas com Qp. Os resultados são mostrados na FIG 2. Estas proteínas de fusão Fel d1, quando acopiadas com Qp, exibem todas um potencial alérgico drasticamente reduzido.

EXEMPLO 15

FELD1 acoplada com Qp não é capaz de desencadear uma reação de puntura cutânea em um indivíduo alérgico

Se forem introduzidos alérgenos por uma puntura feita na pele de um indivíduo alérgico, um edema local será criado em aproximadamente 20 minutos em virtude da ativação de mastócitos, abrigados na pele. Neste exemplo, o teste cutâneo foi empregado para determinar o potencial alérgico de Qp-FELD1-HC (obtida do EXEMPLO 7). Quantidades graduadas de Qp-FELD1-HC ou quantidades correspondentes de FELD1-HC (obtida do E-XEMPLO 5) foram introduzidas na pele de um gato alérgico e a reação cutânea foi avaliada 20 minutos mais tarde. A Qp-FELD1-HC não foi capaz de desencadear uma reação cutânea enquanto que a FELD1-HC foi ativa em concentrações mais de 100 vezes mais baixas (TABELA 3)

TABELA 3: Quantidades correspondentes de FELD1-HC presentes em ambos os preparados.

<table>table see original document page 61</column></row><table>EXEMPLO 16

Imunização de um indivíduo alérgico com QB-FELD1-HC reduz reatividade de teste de puntura cutânea

A fim de testar a capacidade da Qp-FELD-HC de aliviar sintomas clínicos, um paciente sofrendo de alergia a gato foi vacinado com 17ug de Qp-FELDI-HC (obtida do EXEMPLO 7), no dia 0 (3 injeções de 2, 5 e 10 ug), 40 ug no dia 7 (3 injeções de 10, 10 e 20 ug) e 50 ug no dia 14 (2 injeções de 10 e 40 ug). Foram realizados testes de puntura cutânea com um extrato padronizado de gato nos dias 0, 14 e 21 e os diâmetros da reação inchada central foram quantificados (FIG 3). Em 3 semanas, foram necessárias concentrações de alérgenos 1000 vezes mais altas para induzir sintomas clínicos no teste de puntura cutânea, do que a quantidade inicial necessária suficiente para induzir sintomas no teste de puntura. EXEMPLO 17 Imunização de um indivíduo alérgico com QB-FELD1-HC reduz sintomas nasais em teste de provocação nasal

A fim de testar a capacidade da Qp-FELD1-HC de aliviar sintomas clínicos, um paciente sofrendo de alergia a gato foi vacinado com 17ug Qp-FELDI-HC (obtida do EXEMPLO 7) no dia 0 (3 injeções de 2, 5 e 10 ug), 40 ug no dia 7 (3 injeções de 10, 10 e 20 ug) e 50 ug no dia 14 (2 injeções de 10 e 40 ug). Foram efetuados testes de provocação nasal com um extrato padronizado de gato nos dias 0, 14 e 21 e os sintomas clínicos foram avaliados em cada nível de escalonamento de dose (FIG 4A) e uma pontuação alérgica global foi preparada de acordo com (FIG 4B). Em 3 semanas, foram necessárias quantidades de alérgeno de 100 a 1000 mais altas para induzir sintomas clínicos e a pontuação global alérgica foi fortemente reduzida.

EXEMPLO 18

Empacotamento de ácidos nucléicos imunoestimulantes na QB VLP

Proteína de revestimento desmontada e purificada de Qp foi obtida conforme descrito no EXEMPLO 1 (A) e (B). Remontagem: p-mercaptoetanol foi acrescentado à fração de 10 ml do dímero até uma concentração final de 10%, e 300 ul de uma solução de (CpG)2oOpA oligodeoxi-nucleotídeo, contento 12,3 nmols de oligonucleotídeo foram acrescentados. A mistura de remontagem foi inicialmente dialisada 30 ml de tampão NET (Tris-HCI a 20 nM, pH 7,8 com EDTA a 0,5 mM e NaCI a 150 mM), contendo 10% de beta-mercaptoetanol, por 2 horas a 4 °C e, em seguida, dialisada de modo contínuo com um fluxo de tampão NET de 8 ml/h por 4 dias a 4 °C. A mistura de remontagem foi em seguida dessalinizada em água por diálise, com 6 trocas de tampão (4 X 100 ml, 2 X 1 litro).

O acoplamento de proteínas de fusão Fel d1 com a QpVLP, contendo CpG no interior é conduzida substancialmente do mesmo modo descrito no EXEMPLO 7.

EXEMPLO 19

Soro específico da Fel d1 inibiu à desgranulação de basófilos induzida por proteínas de fusão Fel d1 in vitro

A fim de testar a capacidade de IgG específico anti-Fel d1 de inibir a desgranulação, basófilos de um indivíduo alérgico foram estimulados com uma quantidade definida de FELD1-HC ou FELD1-15aa-HC, pré-incubadas com uma diluição em série de quantidades decrescentes de IgGs isoladas de ratos imunizados com Qp-FELD1-HC. O aumento regulado de CD63 foi determinado por citometria de fluxo. A IgG anti-Fel d1 bloqueou a desgranulação induzida pela Fel d1 em todas as concentrações testadas, enquanto que a IgG de controle não exibiu qualquer efeito (TABELA 4).

TABELA 4

<table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table>

EXEMPLO 20

Imunização de camundongos alérgicos a Fel d1 com Q(3-FELD1-HC

Um modelo experimental de asma de inflamação alérgica de vias aéreas em camundongos foi utilizado para avaliar os efeitos de vacinação 5 contra o alérgeno natural Fel d1 sobre a resposta de anticorpo IgE em soro e em LBA (Lavado broncoalveolar) de camundongos BALB/c. camundongos por grupo foram sensibilizados por entalhe peritoneal com Fel d1 natural em AlumGel-S no dia 0. Os camundongos foram vacinados por via subcutânea no dia 35 e 49 com 50ug de Q(3 isolada ou com 50ug de Q(3-FELD1-HC, antes de dois testes subseqüentes intranasais no dia 63 e dia 70. 5 dias após o último teste intranasal, os camundongos foram sacrificados para que fossem recolhidos o soro e o LLBA (líquido do lavado broncoalveolar) para serem analisados em relação à resposta imunológica humoral (títulos de subclas-ses de IgE) por ELISA.

Placas de ELISA foram revestidas com uma IgE mAB anti-rato (2ug/ml), diluído em tampão carbonato durante a noite a 4 °C. Depois do bloqueio nas placas com PBS/BSA a 5% por 2 horas, as placas foram incubadas por duas horas mais com soro (primeiro poço: 1:100 pré-diluído, depois 1:3 de diluição ao longo de 8 etapas) ou LBA (primeiro poço, LBA puro, depois 1:3 de diluição ao longo de 8 etapas) de camundongos sensibilizados, vacinados e testados com antígenos. Após 2 horas de incubação da amostra, IgE do soro e de LBA foi detectada com um anticorpo marcado IgE-HRP anti-camundongo de ratos antes de detecção com substrato OPD.64

TABELA 5

<table>table see original document page 65</column></row><table>Listagem de Seqüência

<110> Cytos Biotechnology AG Bachmann, Martin F Monika, BAUER F Dietmeier, Klaus Schmitz, Nicole Uzinger, Stefan

<120> CONJUGADOS DE ALÉRGENOS DE GATO E USOS DOS MESMOS

<130> P1048PC00

<150> 60/662,918 <151> 2005-03-18

<160> 69

<170> Patentln version 3.2

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> Bacteriófago Q-beta

<400> 1

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn lie Gly Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> Bacteriófago Q-beta

<400> 2

Met Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn lie Gly Lys Asp Gly 1 5 10 15

Lys Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Vai Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Vai Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu lie Ala Gly Gly Gly Ser Gly 130 135 140

Ser Lys Pro Asp Pro Vai lie Pro Asp Pro Pro lie Asp Pro Pro Pro 145 150 155 160

Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala lie Trp Ser Leu Glu Glu 165 170 175

Vai Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro lie Tyr Asn Ala 180 185 190

Vai Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Vai Ala Leu Lys Asp Leu Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr 210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr lie Asp Leu Asp Ala Thr Tyr 225 230 235 240

Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp lie Arg Glu 245 250 255

Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn lie Glu Arg Phe lie Tyr Leu 260 265 270

Lys Ser lie Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp lie Ala Ala Tyr His 275 280 285

Ala Asp Gly Vai lie Vai Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly 290 295 300

Ala lie Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro lie 305 310 315 320

Gln Ala Vai lie Vai Vai Pro Arg Ala 325

<210> 3

<211> 129

<212> PRT

<213> Bacteriófago R17

<400> 3

Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Vai Leu Vai Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15

Asn Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30

lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser Vai 35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Vai Glu Vai 50 55 60

Pro Lys Vai Ala Thr Gln Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai Ala 65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Vai Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago fr

<400> 4

Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr 15 10 15

Gly Asp Vai Lys Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu 20 25 30

Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser 35 40 45

Vai Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Vai Lys Vai Glu 50 55 60

Vai Pro Lys Vai Ala Thr Gln Vai Gln Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai 65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Vai Phe 85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Vai Lys Ala Leu Gln Gly Thr 100 105 110

Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125

Ile Tyr 130

<210> 5

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago GA

<400> 5

Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr Gly 15 10 15Asn Vai Thr Vai Vai Pro Vai Ser Asn Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30

Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Vai Thr Ala Ser Tyr 35 40 45

Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala lie Lys Leu Glu Vai 50 55 60

Pro Lys lie Vai Thr Gln Vai Vai Asn Gly Vai Glu Leu Pro Gly Ser 65 70 75 80

Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser lie Asp Leu Thr lie Pro lie Phe Ala 85 90 95

Ala Thr Asp Asp Vai Thr Vai lie Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe 100 105 110

Lys Vai Gly Asn Pro lie Ala Glu Ala lie Ser Ser Gln Ser Gly Phe 115 120 125

Tyr Ala 130

<210> 6 <211> 132 <212> PRT

<213> Bacteriófago SP

<400> 6

Met Ala Lys Leu Asn Gln Vai Thr Leu Ser Lys lie Gly Lys Asn Gly 15 10 15

Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Vai Thr Vai Ser Vai Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys 50 55 60

Vai Gln lie Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Vai Thr Leu Ser Phe 85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu lie Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro.Leu lie Vai Asp Ala lie Asp Asn Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 7

<211> 329

<212> PRT

<213> Bacteriófago SP

<400> 7

Ala Lys Leu Asn Gln Vai Thr Leu Ser Lys lie Gly Lys Asn Gly Asp 1 5 10 15

Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Vai 50 55 60

Gln lie Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp 65 70 75 80

Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Vai Thr Leu Ser Phe Thr 85 90 95

Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu lie Arg Thr Glu Leu Ala 100 105 110

Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu lie Vai Asp Ala lie Asp Asn Leu Asn 115 120 125

Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Vai Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp 130 135 140

Asn Pro Ser Asp Pro Asp Vai Pro Vai Vai Pro Asp Vai Lys Pro Pro 145 150 155 160

Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly 165 170 175Ser lie Tyr Glu Vai Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp lie Tyr Glu Arg 180 185 190

Gly Asp Glu Vai Ser Vai Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205

Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp 210 215 220

lie Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr lie Asp Leu Asp 225 230 235 240

Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Vai Leu Ser Gly Arg Tyr Gly 245 250 255

Vai Arg Lys Vai Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser lie Lys Tyr Leu 260 265 270

Leu Asn lie Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Vai Thr Ala 275 280 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Vai lie Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300

Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro 305 310 315 320

Vai Gln Thr Vai lie lie lie Pro Ser 325

<210> 8

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago MS2

<400> 8

Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Vai Leu Vai Asp Asn Gly Gly Thr 1 5 10 15

Gly Asp Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu 20 25 30

Trp lie Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser 35 40 45

Vai Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr lie Lys Vai Glu 50 55 60Vai Pro Lys Vai Ala Thr Gln Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro Vai 65 70 75 80

Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr lie Pro lie Phe 85 90 95

Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu lie Vai Lys Ala Met Gln Gly Leu 100 105 110

Leu Lys Asp Gly Asn Pro lie Pro Ser Ala lie Ala Ala Asn Ser Gly 115 120 125

lie Tyr 130

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> Bacteriófago M11

<400> 9

Met Ala Lys Leu Gln Ala lie Thr Leu Ser Gly lie Gly Lys Lys Gly 1 5 10 15

Asp Vai Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Vai Thr lie Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Vai Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Vai Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Vai Glu Glu Arg Ala Leu Vai Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Vai Asn Ala lie Asp Asn 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130<210> 10

<211> 133

<212> PRT

<213> Bacteriófago MX1

<400> 10

Met Ala Lys Leu Gln Ala lie Thr Leu Ser Gly lie Gly Lys Asn Gly 1 5 10 15

Asp Vai Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45

Vai Thr lie Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Vai Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr 65 70 75 80

Cys Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser 85 90 95

Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Vai Arg Thr Glu 100 105 110

Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu lie Asp Ala lie Asp Asn 115 120 125

Leu Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 11 <211> 330 <212> PRT

<213> Bacteriófago NL95 <400> 11

Met Ala Lys Leu Asn Lys Vai Thr Leu Thr Gly lie Gly Lys Ala Gly 15 10 15

Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly 20 25 30

Vai Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg 35 40 45Vai Thr Vai Ser Vai Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys 50 55 60

Vai Gln lie Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Vai Thr Leu Ser Phe 85 90 95

Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu lie Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu lie Vai Asp Ala lie Asp Asn Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly 130 135 140

Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Vai Pro Asp Ser Pro Asn Vai Lys Pro Pro 145 150 155 160

Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly 165 170 175

Glu Leu lie Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys 180 185 190

Gly Ser Glu Ala Leu Vai Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu 195 200 205

Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp 210 215 220

lie Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Vai Asp Leu Asp 225 230 235 240

Ala Ser Vai Met Gln Ser Asp Glu Tyr Vai Leu Ser Gly Ala Tyr Asp 245 250 255

Vai Vai Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr 260 265 270

Leu His Leu Met Asp Gly lie Tyr Vai Asp Leu Ala Glu Vai Thr Ala 275 280 285

Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Vai lie Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser 290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro 305 310 315 320

Vai Gln Thr Vai Ile Vai Ile Pro Ser Leu 325 330

<210> 12

<211> 129

<212> PRT

<213> Bacteriófago f2

<400> 12

Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Vai Leu Vai Asn Asp Gly Gly Thr Gly 1 5 10 15

Asn Vai Thr Vai Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Vai Ala Glu Trp 20 25 30

Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Vai Thr Cys Ser Vai 35 40 45

Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Vai Glu Vai 50 55 60

Pro Lys Vai Ala Thr Gln Thr Vai Gly Gly Vai Glu Leu Pro vai Ala 65 70 75 80

Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala 85 90 95

Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Vai Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu 100 105 110

Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile 115 120 125

Tyr

<210> 13

<211> 128

<212> PRT

<213> Bacteriófago PP7

<400> 13

Met Ser Lys Thr Ile Vai Leu Ser Vai Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu 1 5 10 15Thr Glu lie Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln lie Phe Glu Glu Lys Vai 20 25 30

Gly Pro Leu Vai Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn 35 40 45

Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Vai Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp 50 55 60

Vai Vai Asp Cys Ser Thr Ser Vai Cys Gly Glu Leu Pro Lys Vai Arg 65 70 75 80

Tyr Thr Gln Vai Trp Ser His Asp Vai Thr lie Vai Ala Asn Ser Thr 85 90 95

Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Vai Ala 100 105 110

Thr Ser Gln Vai Glu Asp Leu Vai Vai Asn Leu Vai Pro Leu Gly Arg 115 120 125

<210> 14

<211> 131

<212> PRT

<213> Bacteriófago AP205

<400> 14

Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro lie Thr Ser Thr Ala Asn Lys lie 1 5 10 15

Vai Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu 20 25 30

Leu Arg Gln Arg Vai Lys Vai Gly lie Ala Glu Leu Asn Asn Vai Ser 35 40 45

Gly Gln Tyr Vai Ser Vai Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly 50 55 60

Cys Ala Asp Ala Cys Vai lie Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser lie Arg 65 70 75 80

Thr Vai lie Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu 85 90 95

Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Vai Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn 100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala lie Vai Ser Ser Asp 115 120 125

Thr Thr Ala 130

<210> 15

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 240 mutante

<400> 15

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn 1 5 10

15

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 16

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 243 mutante

<400> 16Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Lys lie Gly Lys Asp Gly Lys 15 10 15

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 17

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 250 mutante

<400> 17

Ala Arg Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn lie Gly Arg Asp Gly Lys

1 5 10

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai

20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai

35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 18

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Bacteriófago A-beta 251 mutante

<400> 18

Ala Lys Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn lie Gly Lys Asp Gly Arg 15 10 15

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr130

<210> 19

<211> 132

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 259 mutante

<400> 19

Ala Arg Leu Glu Thr Vai Thr Leu Gly Asn 1 5 10

15

Gln Thr Leu Vai Leu Asn Pro Arg Gly Vai Asn Pro Thr Asn Gly Vai 20 25 30

Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Vai Pro Ala Leu Glu Lys Arg Vai 35 40 45

Thr Vai Ser Vai Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Vai 50 55 60

Gln Vai Lys lie Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys 65 70 75 80

Asp Pro Ser Vai Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Vai Thr Phe Ser Phe 85 90 95

Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Vai Arg Thr Glu Leu 100 105 110

Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu lie Asp Ala lie Asp Gln Leu 115 120 125

Asn Pro Ala Tyr 130

<210> 20

<211> 185

<212> PRT

<213> Vírus hepatite B

<400> 20

Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Vai Glu Leu Leu 15 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60

Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Vai Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80

Ser Arg Asp Leu Vai Vai Asn Tyr Vai Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95

lie Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110

Glu Thr Vai Leu Glu Tyr Leu Vai Ser Phe Gly Vai Trp lie Arg Thr 115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140

Glu Thr Thr Vai Vai Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg 145 150 155 160

Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg 165 170 175

Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185

<210> 21

<211> 188

<212> PRT

<213> vírus hepatite B

<400> 21

Met Asp lie Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Vai Glu Leu Leu 1 5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Vai Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30

Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala lie Leu Cys Trp Gly Asp 50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Vai Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly 65 70 75 80

Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Vai Vai Ser Tyr Vai Asn Thr Asn Vai 85 90 95

Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His lie Ser Cys Leu Thr 100 105 110

Phe Gly Arg Glu Thr Vai Leu Glu Tyr Leu Vai Ser Phe Gly Vai Trp 115 120 125

lie Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro lie Leu Ser 130 135 140

Thr Leu Pro Glu Thr Thr Vai Vai Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser 145 150 155 160

Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro 165 170 175

Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 185

<210> 22

<211> 70

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 22

Glu lie Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly 1 5 10 15

Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro 20 25 30

Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys 35 40 45

Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie 50 55 60

Tyr Thr Ser Pro Leu Cys 65 70

<210> 23 <211> 92 <212> PRT<213> Felis domesticus

<400> 23

Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 15 10 15

Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai 20 25 30

Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp Cys 35 40 45

Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met 50 55 60

Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln Asn 65 70 75 80

Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 85 90

<210> 24

<211> 162

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Fusão de corrente 2+ corrente 1

<400> 24

Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 15 10 15

Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai 20 25 30

Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp Cys 35 40 45

Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met 50 55 60

Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln Asn 65 70 75 80

Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu lie Cys Pro 85 90 95

Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu100 105 110

Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu 115 120 125

Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu 130 135 140

Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr Ser Pro 145 150 155 160

Leu Cys

<210> 25 <211> 90 <212> PRT

<213> Felis domesticus <400> 25

Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 15 10 15

Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai 20 25 30

Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp Cys 35 40 45

Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met 50 55 60

lie Ala lie Asn Glu Tyr Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln Asn Thr Vai 65 70 75 80

Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg 85 90

<210> 26

<211> 78

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 26

Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala 15 10 15

Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai 20 25 30Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp Cys 35 40 45

Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met 50 55 60

Pro Ser Thr Asn lie Ala Trp Vai Lys Gln Phe Arg Thr Pro 65 70 75

<210> 27

<211> 27

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 27

Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai 1 5 10 15

Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Vai 20 25

<210> 28 <211> 27 <212> PRT

<213> Felis domesticus <400> 28

Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys 15 10 15

Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu 20 25

<210> 29

<211> 26

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 29

Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu 15 10 15

Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg 20 25

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> Felis domesticus<400> 30

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr 15 10 15

Ser Pro Leu

<210> 31

<211> 19

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 31

Met Gly Glu Ala Vai Gln Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr 15 10 15

Leu Gly Arg

<210> 32

<211> 16

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 32

Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr 15 10 15

<210> 33

<211> 174

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> fusão com his tag and GGC

<400> 33

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 1 5 10 15

Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 20 25 30

Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp 35 40 45

Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 50 55 60Met Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln 65 70 75 80

Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu lie Cys 85 90 95

Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp 100 105 110

Glu Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu 115 120 125

Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu 130 135 140

Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr Ser 145 150 155 160

Pro Leu Cys Leu Glu His His His His His His Gly Gly Cys

170

165

<210> 34

<211> 85

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 1F

<400> 34

gtacatatgg aaatctgccc ggctgttaaa cgtgacçttg acctgttcct gaccggtacc ccggacgaat acgttgaaca ggttg

<210> 35

<211> 38

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 2R

<400> 35

ggcagagctt tgtactgagc aacctgttca acgtattc

<210> 36

<211> 75

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 3F<400> 36

gctcagtaca aagctctgcc ggttgttctg gaaaacgctc çrtatcctgaa aaactgcgtt gacgctaaaa tgacc

<210> 37

<211> 89

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador4R

<400> 37

cctctcgagg cacagcgggg aggtgtagat tttgtccagc agggacagag cçttttcttt gtcttcttcg gtcattttag cgtcaacgc

<210> 38

<211> 76

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 5F

<400> 38

gtacatatgg ttaaaatggc tgaaacctgc ccgatcttct acgacgtttt cttcgctgtt gctaacggta acgaac

<210> 39

<211> 75

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 6R

<400> 39

ggtacgttcc ggttcggtag cgttaacttt ggtcagggac aggtccagca gcagttcgtt accgttagca acagc

40 80 DNA

Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 7F

<400> 40

ctaccgaacc ggaacgtacc gctatgaaaa aaatccagça ctgctacgtt gaaaacggtc tgatctcccg tgttctggac

<210>

<211>

<212>

<213>

<210> 41<211> 71

<212> DNA

<2i3> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 8R

<400> 41

gcttcaccca tgcagtcttt ggaggaggag atggtggtca taaccagacc gtccagaaca cgggagatca g

<210> 42

<211> 75

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 9F

<400> 42

caaagactgc atgggtgaag ctgttcagaa caccgttgaa gacctgaaac tgaacaccct gggtcgctcg agagg

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 10R

<400> 43

cctctcgagc gacccagggt g 21

<210> 44

<211> 45

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador ligante

<400> 44

cgtttaacag ccgggcagat ttcacgaccc agggtgttca gtttc 45

<210> 45

<211> 28

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 12-1

<400> 45

gtacatatgg aaatctgccc ggctgtta 28<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador2-10aa

<400> 51

ggtggaggag gtagcggtgg aggaggtagc gttaaaatgg ctgaaacctg cccgatctt

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> jniciador 1-5aa

<400> 52

gctacctcct ccaccgcaca gcggggaggt gtagattttg tc

<210> 53

<211> 44

<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> iniciador 2-5aa

<400> 53

ggtggaggag gtagcgttaa aatggctgaa acctgcccga tctt

<210> 54

<211> Í75

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> FELDl-lOaa

<400> 54

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 15 10 15

Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 20 25 30

Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp 35 40 45

Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 50 55 60

Met Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln 65 70 75 80Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly 85 90 95

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu lie Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp 100 105 110

Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gln Vai 115 120 125

Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu 130 135 140

Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala 145 150 155 160

Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Leu Glu

170 175

165

<210> 55

<211> 180

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> FELDl-l5aa

<400> 55

Met Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe Tyr Asp Vai Phe Phe 1 5 10 15

Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys 20 25 30

Vai Asn Alá Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys lie Gln Asp 35 40 45

Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai Leu Asp Gly Leu Vai 50 55 60

Met Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Vai Gln 65 70 75 80

Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly 85 90 95

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu lie Cys Pro 100 105 110

Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu115 120 125

Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Vai Vai Leu Glu 130 135 140

Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu 145 150 155 160

Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys lie Tyr Thr Ser Pro 165 170 175

Leu Cys Leu Glu 180

<210> 56

<211> 165

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> FD12

<400> 56

Met Glu lie Cys Pro Ala 1 5

10 15

Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu 20 25 30

Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala 35 40 45

Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys 50 55 60

lie Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie 65 70 75 80

Phe Tyr Asp Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu 85 90 95

Asp Leu Ser Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala 100 105 110

Met Lys Lys lie Gln Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg 115 120 125

Vai Leu Asp Gly Leu Vai Met Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys 130 135 140Met Gly Glu Ala Vai Gln Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr 145 150 155 160

Leu Gly Arg Leu Glu 165

<210> 57

<211> 180

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> FD12-15aa

<400> 57

Met Glu lie Cys Pro Ala Vai Lys Arg Asp Vai Asp Leu Phe Leu Thr 1 5 10 15

Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Vai Glu Gln Vai Ala Gln Tyr Lys Ala Leu 20 25 30

Pro Vai Vai Leu Glu Asn Ala Arg lie Leu Lys Asn Cys Vai Asp Ala 35 40 45

Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys 50 55 60

lie Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Vai Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro lie Phe 85 90 95

Tyr Asp Vai Phe Phe Ala Vai Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp 100 105 110

Leu Ser Leu Thr Lys Vai Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met 115 120 125

Lys Lys lie Gln Asp Cys Tyr Vai Glu Asn Gly Leu lie Ser Arg Vai 130 135 140

Leu Asp Gly Leu Vai Met Thr Thr lie Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met 145 150 155 160

Gly Glu Ala Vai Gln Asn Thr Vai Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu 165 170 175Gly Arg Leu Glu 180

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador gamma 1

<400> 58

Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 10

<210> 59

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> ligador glicina N-terminal

<400> 59

Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5

<210> 60

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial <220>

<223> ligador glicina serina N-terminal

<400> 60

Cys Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> gcgsggggs ligador

<400> 61

Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5

<210> 62<211> 10

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador 1 gamma C-terminal

<400> 62

Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly 15 10

<210> 63

<211> 18

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador 3 gamma C-terminal

<400> 63

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly 1 5 10 15

Cys Gly

<210> 64

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador glicina C-terminal

<400> 64

Gly Gly Gly Gly Cys Gly

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador glicina serina C-terminal

<400> 65

Ser Gly Gly Gly Gly Cys 1 5

<210> 66 <211> 10 <212> PRT<213> Seqüência artificial

<220>

<223> GSGGGGSGCG ligante

<400> 66

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly 15 10

<210> 67

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> ligador glicina lisina

<400> 67

Gly Gly Lys Lys Gly Cys 1 5

<210> 68

<211> 6

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> . ligador 2 glicina lisina

<400> 68

Cys Gly Lys Lys Gly Gly

1 5

<210> 69

<211> 17

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> CGGPKPSTPPGS SGGAP

<400> 69

Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala 15 10 15

Pro

Claims

1. Composição compreendendo:(a) uma partícula central com pelo menos um primeiro sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral, (b) pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de fixação, em que o referido pelo menos um antígeno é uma proteína Fel d1 ou um fragmento da Fel d1 e, em que (a) e (b) estão covalentemente ligados por meio do referido pelo menos um primeiro sítio de fixação e o referido pelo menos um segundo sítio de fixação.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a referida proteína Fel d1 compreende cadeia 1 de Fel d1 e cadeia 2 de Fel d1, em que a referida cadeia 1 da Fel d1 está associada à cadeia 2 da Fel d1 por pelo menos uma ligação covalente.

3. Composição de acordo com a reivindicação 1 e 2, em que a referida proteína Fel d1 é uma proteína de fusão compreendendo cadeia 1 de Fel d1 e cadeia 2 de Fel d1, em que a referida cadeia 1 de Fel d1 e cadeia 2 de Fel d1 são fundidas diretamente ou por meio de uma ligaçãotidica ou por meio de um espaçador, que liga o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia.

4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a referida cadeia 2 de Fel d1 está fundida por seu C-terminal ao N-terminal da referida cadeia 1 de Fel d1, diretamente ou por meio de um espaçador.

5. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a referida cadeia 1 de Fel d1 está fundida por seu C-terminal ao N-terminal da referida cadeia 2 de Fel d1, diretamente ou por meio de um espaçador.

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5, em que o referido espaçador é um espaçador de aminoacidos com 1-20 resíduos de aminoacidos.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-6, em que a referida proteína de fusão compreende uma seqüência de a-minoácidos selecionados do grupo constituído por:(a) SEQ ID NO: 24;(b) SEQ ID NO:54;(c) SEQ ID NO:55;(d) SEQ ID NO:56; e(e) SEQ ID NO:57.

8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-6, em que a referida cadeia 1 de Fel d 1 compreende uma seqüência da SEQ ID NO: 22 ou uma seqüência homóloga da mesma, em que a referida seqüência homóloga possui uma identificação em relação à SEQ ID NO: 22 superior a 80%, preferencialmente superior a 90% ou ainda mais preferencialmente superior a 95%.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-6, em que a referida cadeia 2 de Fel d 1 compreende uma seqüência de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26, ou uma seqüência homóloga da mesma, em que a referida seqüência homóloga possui uma identificação em relação às SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 ou SEQ ID NO: 26 superior a 80%, preferencialmente superior a 90% e ainda mais preferencialmente superior a 95%.

10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a referida partícula central é uma partícula viral, e em que, preferencialmente, a referida partícula viral é uma partícula viral de um RNA bacteriófago.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus, e em que, preferencialmente, a referida partícula semelhante a vírus é uma partícula semelhante a vírus de um RNA bacteriófago.

12. Composição de acordo com reivindicação 10 ou 11, em que o referido RNA bacteriófago é selecionado de Qp, fr, GA ou AP205.

13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes em que o referido primeiro sítio de fixação compreende ou, preferencialmente é um grupo amina, preferencialmente um grupo amina deuma lisina.

14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o referido segundo sítio de fixação compreende ou, preferencialmente, é um grupo sulfidrila, preferencialmente um grupo sulfidriIa de uma cisteína.

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo ainda um ligador.

16. Composição de acordo com reivindicação 15, em que o referido ligador é fundido ao C-terminal da referida proteína Fel d1 ou ao C-terminal do referido fragmento de Fel d1.

17. Vacina compreendendo a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 1-16.

18. Vacina de acordo com a reivindicação 17 ainda compreendendo, pelo menos, um adjuvante.

19. Composição farmacêutica compreendendo:(a) a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16; e(b) um veículo farmacêutico aceitável.

20. Processo de produção da composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1-16 compreendendo:(a) o fornecimento de uma partícula central com pelo menos um primeiro sítio de fixação, em que a referida partícula central é uma partícula semelhante a vírus (VLP) ou uma partícula viral;(b) o fornecimento de pelo menos um antígeno com pelo menos um segundo sítio de fixação, em que o referido antígeno é uma proteína Fel d1 ou um fragmento de Fel d1; e(c) a ligação da referida partícula central e do referido pelo menos um antígeno, para produção da referida composição, em que a referida partícula central e o referido pelo menos um antígeno estão ligados por, pelo menos, o referido primeiro e por, pelo menos, o referido segundo sítio de fixação.

21. Uso da composição como definida em qualquer uma das rei-vindicações 1-16 para a produção de um medicamento para o tratamento de alergia a gatos.

22. Método de tratamento de alergia a gato compreendendo a administração da composição de qualquer uma das reivindicações 1-16, ou da vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 17-18 para um ser humano ou um mamífero não humano, em que preferencialmente o referido mamífero não humano é um cachorro ou um gato.

23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 ou da vacina de qualquer uma das reivindicações 17-18 para uso em um método para tratamento de alergia a gato compreendendo a administração da referida composição ou da referida vacina para um ser humano ou para um mamífero não humano, em que preferencialmente o referido mamífero não humano é um cachorro ou um gato.

24. Proteína de fusão Fel d1 compreendendo cadeia 1 de Fel d1 e cadeia 2 de Fel d1, fundidas por meio de um espaçador de aminoácidos, que liga o N-terminal de uma cadeia ao C-terminal da outra cadeia, em que o referido espaçador de aminoácidos é constituído por uma seqüência de aminoácidos com 10-30 resíduos de aminoácidos, e em que a referida proteína de fusão não é uma proteína de fusão compreendendo cadeia 1 de SEQ ID 20 NO:22, fundida por (GGGGS)3 ao N-terminal da cadeia 2 de SEQ ID NO:23, 25 ou 26 e em que a referida proteína de fusão renunciada é expressa em sistema de expressão de baculovírus.

25. Proteína de fusão Fel d1 de acordo com a reivindicação 24, em que o referido espaçador é constituído por uma seqüência de aminoácidos com 2, 3 ou 4 repetições de GGGGS.

26. Proteína de fusão Fel d1 de acordo com a reivindicação 24 ou 25, em que a referida proteína de fusão Fel d1 é produzida em E. coli.

27. Proteína de fusão Fel d1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-26, em que a cadeia 2 da Fel d1 está localizada no N-terminal da proteína de fusão.

28. Proteína de fusão Fel d1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-26, em que a cadeia 1 da Fel d1 está localizada no N-terminal da proteína de fusão.

29. Proteína de fusão Fel d1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 24-28 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionados do grupo composto por:(a) SEQ ID NO:54;(b) SEQ ID NO:55; e(c) SEQ ID NO:57.

30. Proteína de fusão Fel d1 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:57, em que a referida proteína de fusão é produzida em E. coli.