BRPI0608635A2 - nanopartÍculas de quitosana e polietilenoglicol como sistema de administraÇço de molÉculas biologicamente ativas - Google Patents

nanopartÍculas de quitosana e polietilenoglicol como sistema de administraÇço de molÉculas biologicamente ativas Download PDF

Info

Publication number
BRPI0608635A2
BRPI0608635A2 BRPI0608635-7A BRPI0608635A BRPI0608635A2 BR PI0608635 A2 BRPI0608635 A2 BR PI0608635A2 BR PI0608635 A BRPI0608635 A BR PI0608635A BR PI0608635 A2 BRPI0608635 A2 BR PI0608635A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
chitosan
nanoparticles
peg
biologically active
active molecule
Prior art date
Application number
BRPI0608635-7A
Other languages
English (en)
Inventor
Maria Jose Alonso Fernandez
Kevin Janes
Noemi Csaba
Original Assignee
Advanced In Vitro Cell Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Advanced In Vitro Cell Tech filed Critical Advanced In Vitro Cell Tech
Publication of BRPI0608635A2 publication Critical patent/BRPI0608635A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1641—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0027—2-Acetamido-2-deoxy-beta-glucans; Derivatives thereof
    • C08B37/003—Chitin, i.e. 2-acetamido-2-deoxy-(beta-1,4)-D-glucan or N-acetyl-beta-1,4-D-glucosamine; Chitosan, i.e. deacetylated product of chitin or (beta-1,4)-D-glucosamine; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/91—Polymers modified by chemical after-treatment
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

NANOPARTÍCULAS DE QUITOSANA E POLIETILENOGLICOL COMO SISTEMA DE ADMINISTRAÇçO DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS. A invenção refere-se a sistemas nanoparticulados para a liberação de moléculas biologicamente ativas compreendendo polímero quitosana ou seus derivados, modificado quimicamente com polietilenoglicol e reticulado com um agente de reticulação. Estes sistemas são especialmente úteis para composições farmacêuticas, vacinas e formulações cosméticas.

Description

NANOPARTíCULAS DE QUITOSANA E POLIETILENOGLICOL COMO SISTEMA DE ADMINISTRAÇÃO DE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS
CAMPO DA INVENÇÃO
A invenção refere-se a sistemas nanoparticulados para a liberação de moléculas biologicamente ativas. Em particular refere-se a sistemas nanoparticulados, constituídos por um conjugado de quitosana-polietilenoglicol reticulado de forma iônica no qual se pode localizar uma molécula biologicamente ativa, bem como a procedimentos para sua obtenção.
ESTADO DA TÉCNICA
Os sistemas para a liberação de agentes biologicamente ativos constituem um campo de investigação em continuo desenvolvimento. Sabe-se que a administração de ingredientes ativos ao corpo humano e animal por diferentes vias de administração apresenta dificuldades. Alguns fármacos, entre os quais se encontram peptideos, proteínas e polissacarideos não são absorvidos de maneira efetiva através de superfícies mucosas tendo em vista a permeabilidade limitada das barreiras epiteliais. Por exemplo a insulina, cuja administração atualmente é por via subcutânea e portanto não interessante para o paciente, é um desses ingredientes ativos com uma capacidade pobre para atravessar barreiras mucosas como a nasal ou a intestinal, que torna necessário o desenvolvimento de sistemas de administração que permitam uma melhor absorção desta molécula ativa caso se deseje encontrar vias alternativas à a subcutânea.Dentro das possibilidades propostas recentemente para superar as barreiras biológicas que enfrentam os fármacos, destaca-se a incorporação dos ingredientes ativos em partículas de pequeno tamanho. A interação das ditas partículas com as mucosas é afetada, entre outros fatores, pelo tamanho destas partículas, aumentando a dita interação com a diminuição do tamanho das partículas.
Desta forma, o pedido de patente US 2004/138095 descreve uma suspensão aquosa de nanoparticulas para a liberação de insulina, entre outros princípios ativos, baseada em copolimeros tri-bloco polietileno-
glicol/poliaminoácido hidrofilico/poliaminoácido hidrofóbico. Por outro lado, a patente US 5.641.515 descreve uma formulação farmacêutica para a liberação controlada de insulina que compreende nanoparticulas formadas por policianoacrilato biodegradável no qual a insulina é fixada formando um complexo,
Da mesma forma, foram desenvolvidos sistemas nanoparticulados a base de polímeros hidrofilicos para aplicação como sistemas de liberação de fármacos. Assim o mostra a literatura abundante existente neste campo. Foram publicados numerosos trabalhos que descrevem diversos métodos de elaboração de nanoparticulas hidrofilicas a base de macromoléculas de origem natural como são as
nanoparticulas de albumina (W. Lin et al., Pharm. Res., 11, 1994) e gelatina (H.J. Watzke et al. , Adv. Colloid Interface Sei., 50, 1-14, 1994) e a base de polissacarideos como o alginato (M. Rajaonarivonvy et al., J. Pharm. Sei., 82, 912-7, 1993). Entretanto a maioria destes métodos requer a utilização de solventes orgânicos, óleos etemperaturas elevadas, aspectos que limitam enormemente a exploração destes sistemas. Entre estes métodos, o mais inócuo foi o proposto para a elaboração de nanoparticulas de alginato, baseado em um processo de gelificação iônica na presença de cálcio e posterior endurecimento na presença do polieletrólito catiônico pol-i-L-lisina. Estas nanoparticulas apresentam entretanto os problemas relativos à toxidez sistêmica e o custo elevado da poli-L-lisina.
Uma alternativa a estes sistemas foi o desenvolvimento de nanoparticulas de quitosana, existindo no estado da técnica publicações que descrevem sua utilidade na administração de ingredientes ativos assim como o procedimento de sua obtenção (J. Appl. Polym. Sei. 1997, 63, 12 5-132; Pharm. Res. 14, 1997b, 14 31-6; Pharm. Res. 16, 1991a, 157 6-81; S.T.P. Pharm. Sei. 9,1999b, 42 9-36, Pharm. Res. 16, 1999, 1830-5; J. Control Release 74, 2001, 317-2 3 e US 5.843.509). Estas nanoparticulas
apresentam o inconveniente de sua estabilidade limitada em determinadas condições de pH e força iônica.
O documento WO-A-01/32751 se refere a um procedimento para a preparação de quitosanas ou derivados de quitosana na forma de nanoparticulas, consistindo na dissolução da quitosana ou derivados em um meio aquoso e elevando-se posteriormente o pH na presença de um agente modificador de superfície, até que se chegue à precipitação da quitosana.
O documento WO-A-99/47130 se refere a nanoparticulas que apresentam um complexo de polieletrólito biocompativel e biodegradável, a partir de pelo menos um policátion (que pode ser a quitosana) e pelo menos um poliânion, como um ingrediente ativo, sendo as nanoparticulas obteniveistratando-se adicionalmente o complexo de polieletrólito durante o depois de sua formação com pelo menos um agente de reticulação (glioxal, TSTU ou EDAP).
É conhecida também a obtenção de nanoparticulas de quitosana em combinação com polioxietileno (ES 2098188 e ES 2114502), além do ingrediente ativo que pode ser uma macromolécula terapêutica ou antigênica. A formação destas nanoparticulas ocorre devido a um processo de precipitação conjunta da quitosana e da macromolécula ativa na forma de nanoagregados poliméricos, causado pela adição de um agente de caráter básico como é o caso do tripolifosfato.
Por outro lado, a quitosana pode ser modificada pela união covalente com polietilenoglicol através da função amino, o que se conhece como processo de peguilação. As patentes EP 1304346 e US 6.730.735 descrevem uma composição para a administração de f ármacos por vias mucosas que compreende um conjugado de quitosana e PEG, estando ambos unidos covalentemente através do grupo amino da quitosana.
O pedido de patente US 2004/0156904 descreve um sistema de liberação de agentes farmacêuticos, no qual o agente ativo se incorpora a uma matriz preparada a partir de uma composição que inclui quitosana-PEG e um polímero insolúvel em água como o ácido poliláctico-co-glieólico (PLGA).
0 pedido de patente WO 01/32751 descreve a obtenção de nanoparticulas de quitosana que se precipitam na presença de um tensoativo, entre eles o polietilenoglicol, pelo aumento do pH da solução em que se encontram. Entretanto, o PEG no se liga covalentemente à quitosana.Apesar das numerosas publicações dirigidas ao desenvolvimento de sistemas para a liberação de fármacos, ainda existe uma necessidade de se prover um tipo de sistema nanoparticulado que apresente uma grande capacidade de associação com uma molécula biologicamente ativa e que permita sua liberação a uma velocidade controlada.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Os inventores observaram que um sistema constituído por nanoparticuias de quitosana modificada com PEG obtidas por um procedimento de gelificação iônica na presença de um agente que provoca a reticulação da quitosana, permite uma eficaz associação de moléculas biologicamente ativas bem como sua posterior liberação em um ambiente biológico adequado. As nanoparticulas de quitosana modificada com PEG apresentam propriedades notáveis em relação às nanoparticulas de quitosana sem PEG, por exemplo na administração nasal de insulina ou na imunogenicidade como resposta à administração nasal de toxóide diftérico.
Desta forma, um objeto da presente invenção refere-se a um sistema que compreende nanoparticulas para a liberação de uma molécula biologicamente ativa, onde as nanoparticulas compreendem um conjugado que compreende a) pelo menos 50% em peso de quitosana ou um derivado deste e b) menos de 50% em peso de polietilenoglicol (PEG) ou um derivado deste, onde ambos os componentes a) e b) estão ligados covalentemente através dos grupos amino da quitosana, e caracterizado pelo fato das ditas nanoparticulas se encontrarem reticuladas por meio mediante um agente de reticulação.A expressão "molécula biologicamente ativa" tem um sentido amplo e compreende moléculas tais como fármacos de baixo peso molecular, polissacarideos, proteínas, peptideos, lipideos, oligonucleotideos e ácidos nucléicos e combinações destes. Em uma variante da invenção a molécula biologicamente ativa tem como função prevenir, aliviar, curar ou diagnosticar enfermidades. Em outra variante da invenção a molécula biologicamente ativa tem uma função cosmética.
Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou vacina que compreende as nanoparticulas definidas anteriormente. Em um aspecto preferível, a composição ou vacina é para administração por via mucosa.
Em outro aspecto, a invenção se dirige a uma composição cosmética que compreende as nanoparticulas definidas anteriormente.
Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição que compreende as nanoparticulas de quitosana-PEG em cujo seio pode estar retida uma ou mais moléculas biologicamente ativas que pode ser um fármaco, uma vacina, ou um material genético. Da mesma forma, se podem encontrar contidos na nanoestrutura peptideos, proteínas ou polissacarideos que não selam considerados moléculas biológicas ativas "per se", mas que podem contribuir para a eficácia do sistema de administração.
Um último aspecto da invenção refere-se a um procedimento de obtenção de um sistema para a liberação de uma molécula biologicamente ativa tal como definido, que compreende:a) preparação de uma solução aquosa do conjugado quitosana-PEG;
b) preparação de uma solução aquosa do agente de reticulação; e
c) mistura, sob agitação, das soluções obtidas nas etapas a) e b) , de modo que se obtêm espontaneamente as nanopartícuias de quitosana-PEG mediante gelificação iônica e conseqüente precipitação.
Em uma variante do procedimento o ingrediente ativo é bem incorporado na solução aquosa da quitosana ou à solução aquosa do agente de reticulação, antes de mistura de ambas as fases.
DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS
Figura IA: Efeito do grau de peguilação da quitosana, do pH da solução do polímero e da relação quitosana-PEG/TTP sobre o tamanho das nanoparticulas.
Figura 1B: Efeito do grau de peguilação da quitosana, do pH da solução do polímero e da relação quitosana-PEG/TTP sobre a polidispersão sobre o tamanho das nanoparticulas.
Figura 2A: Análise de eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial associado a nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG depois de 1 dia de incubação em tampão acetato (pH: 4 e 7,4) e em água purificada (MQ).
Figura 2B: Análise de eletroforese em gel de agarose de DNA plasmdial associado a nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG depois de 4 semanas de incubação em tampão acetato (pH: 4 e 7,4) e em água purificada (MQ).Figura 3: Análise de eletroforese em gel de agarose de DNA plasmidial associado a nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG na presença de quitosanase.
Figura 4A: Efeito do grau de peguilação sobre a eficácia na transfecção de nanoparticulas de quitosana (CS) de alto peso molecular.
Figura 4B: Efeito da carga de pDNA sobre a eficácia na transfecção de nanoparticulas de quitosana (CS) de alto peso molecular.
Figura 5A; Efeito da carga de pDNA sobre a eficácia na transfecção de nanoparticulas de quitosana (CS) de baixo peso molecular.
Figura 5B: Efeito do grau de peguilação sobre a eficácia na transfecção de nanoparticulas de quitosana (CS) de baixo peso molecular.
Figura 6: Glicemia depois da administração intranasal de 10 U/kg de insulina contida em diferentes formulações ou tampão acetato (controle). A glicemia é expressada em % em relação aos valores de base, em valor médio ± S.E.M. Os valores de base antes das administrações diferentes são os seguintes: tampão acetato (■): 423±16 mg/dl (n=7); insulina (□) : 430± mg/dl (n=7); insulina em solução de quitosana (•) : 439±12 mg/dl (n=8); nanoparticulas de quitosana (♦) : 469±14 mg/dl (n=7); nanoparticulas de quitosana-PEG (o) : 458±21 mg/dl (n=8).
Figura 7: Testes de tolerância à glicose realizados depois da administração intranasal das formulações que contêm insulina ou tampão acetato em fêmeas de rato diabéticas submetidas a jejum durante a noite. A glicose (2 g por kg de massa corporal) foi administrada por viaintra-gástrica no tempo 0 e uma hora depois das administrações intranasais: tampão acetato (■) (n=10); insulina (□) (n=6); insulina em solução de quitosana (•) (n=6); nanoparticulas de quitosana (♦) (n=6);
nanoparticuias de quitosana-PEG (o) (n=6).
Figura 8: Titulos finais de IgG anti-TD em soro de rato depois da administração intranasal de 10 jjg de TD incorporado em diferentes formulações de nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG nos dias 0, 7 e 14 (n=6) . IN: Intranasal; IP: Intraperitoneal.
* Diferenças estatisticamente significativas (a<0,5).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O sistema da presente invenção compreende nanoparticulas, cuj a estrutura compreende um conjugado reticulado de quitosana e polietilenoglicol (PEG), na qual se pode incorporar um ingrediente ativo.
Pelo termo "nanoparticuia" se entende uma estrutura que compreende um conjugado, resultante da ligação covalente entre a quitosana e o PEG através dos grupos amino da quitosana, o qual além disto se encontra reticulado mediante gelificação iônica pela ação de um agente de reticulação de caráter aniônico. A formação das ligações covalentes e a conseqüente reticulação iônica do sistema gera entidades fisicas características, independentes e observáveis, cuj o tamanho médio é inferior a 1 jam, isto é, um tamanho médio compreendido entre 1 e 999 nm.
Por "tamanho médio" se entende o diâmetro médio da população de nanoparticulas que se deslocam em conjunto nomeio aquoso no qual se formam. 0 tamanho médio destes sistemas se pode determinar mediante procedimentos padrão conhecidos do especialista na técnica, e que são descritos, por exemplo, na parte experimental abaixo.
As nanoparticulas do sistema se caracterizam pelo fato de apresentarem um tamanho médio de partículas inferior a 1 jam, pref erivelmente apresentam um tamanho médio compreendido entre 1999 nm, preferivelmente entre 50 e 800 nm, e ainda mais pref erivelmente entre 50 nm e 500 nm. O tamanho médio das partículas é influenciado
principalmente pela proporção de quitosana em relação ao PEG, pelo grau de desacetilação da quitosana e também pelas condições de formação das partículas (concentração de quitosana-PEG, concentração de agente de reticulação e relação entre ambos) . A presença do PEG reduz o tamanho médio das partículas em relação a sistemas formados por quitosana sem PEG.
Por outro lado, as nanoparticulas podem apresentar uma carga elétrica (medida pelo potencial Z), cuja magnitude pode variar de +0,1 mV a +50 mV, pref erivelmente entre +1 e +40 mV, dependendo das variáveis mencionadas e de forma particular do grau de funcionalização da quitosana com o PEG. A carga positiva das nanoparticulas pode ser de interesse para favorecer a interação das mesmas com superfícies mucosas. Não obstante a carga neutra pode resultar mais interessante para a administração parenteral das mesmas.
O sistema que compreende nanoparticulas para a liberação de uma molécula biologicamente ativa tal como definida acima apresenta um teor de quitosana no conjugadosuperior a 50%, pref erivelmente superior a 75% em peso. Por sua vez o teor de PEG no conjugado é inferior a 50%, preferivelmente inferior a 25%.
A quitosana é um polímero de origem natural derivado da quitina (poli-N-acetil-D-glicosamina) , de onde foi eliminada uma parte importante dos grupos acetil dos N por hidrólise. Em general, o grau de desacetilação se encontra em uma faixa compreendida entre 30 e 95%, preferivelmente entre 60 e 95%, o que indica que entre 5 e 40% dos grupos amino estão acetilados. Apresenta desta forma uma
estrutura aminopolissacaridica e caráter catiônico. Compreende a repetição de unidades monoméricas de fórmula (D :
OH
HO NH3+
(D
onde n é um número inteiro, e além disto m unidades em que o grupo amino está acetilado. A soma de n+m representa o grau de polimerização, isto é, o número de unidades monoméricas na cadeia da quitosana.
A quitosana empregada para a obtenção dos conjugados quitosana-PEG da presente invenção apresentam um peso molecular compreendido entre 5 e 2000 kDa, preferivelmente entre 10 e 500 kDa, mais pref erivelmente entre 10 e 100 kDa. Exemplos de quitosanas comerciais que se podeutilizar são UPG 113, UP CL 213 e UP CL113 que se pode obter da NovaMatrix, Drammen, Noruega.
0 número de unidades monoméricas que compreendem a quitosana empregada na obtenção dos conjugados quitosana-PEG está compreendido entre 30 e 3000 monômeros, preferivelmente entre 60 e 600,
Como alternativa a quitosana se pode utilizar um derivado da mesma, entendendo-se como tal uma quitosana na qual se modificou um ou mais grupos hidroxila e/ou um ou mais grupos amino, com a finalidade de se elevar a solubilidade da quitosana ou aumentar o caráter muco-adesivo da mesma. Estes derivados incluem, entre outros, quitosanas acetiladas, alquiladas ou sulfonatadas, derivados tiolados, tal como os descritos em Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166. Preferivelmente quando se utiliza um derivado se seleciona entre 0-alquiléteres, O-acilésteres, trimetilquitosana, quitosanas modificadas com polietilenoglicol, etc. Outros derivados possíveis são os sais, tais como citrato, nitrato, lactato, fosfato, glutamato, etc. Em qualquer caso, o especialista na técnica sabe identificar as modificações que se podem realizar na quitosana sem afetar a estabilidade e viabilidade comercial da formulação final.
Por seu lado, o polietilenoglicol (PEG), em sua forma mais comum, é um polímero de fórmula (II):
H-(0-CH2-CH2)p- 0- H (II)onde p é um número inteiro que representa o grau de polimerização do PEG. Na presente invenção o grau de polimerização do PEG se encontra na faixa compreendida entre 50 e 500, o que corresponde a um peso molecular de entre 2 e 20 kDa, preferivelmente de entre 5 e 10 kDa.
Para a formação do complexo quitosana-PEG é necessário empregar-se um PEG modificado no qual um ou os dois grupos hidroxila terminais se encontram modificados. Entre os PEG modificados que se pode empregar para a obtenção dos conjugados quitosana-PEG se encontram aqueles que apresentam a fórmula (III):
Xi- (0-CH2-CH2)p- O- X2 (III)
onde:
Xi é um grupo protetor de radicais hidroxila que bloqueia a função OH para reações posteriores. Os grupos protetores de hidroxila são bem conhecidos na técnica, grupos protetores representativos (incluindo o oxigênio a proteger) são os éteres silil tais como éter trimetilsilil, éter trietilsilil, éter tert-
butildimetilsilil, éter tert-butildifenilsilil, éter tri-isopropilsilil, éter dietilisopropilsilil, éter t-hexildimetilsilil, éter trifenilsilil, éter di-tert-butilmetilsilil; éteres alquilicos tais como éter metilico, éter tert-butil, éter benzilico, éter p-metoxibenzilico, éter 3,4-dimetoxibenzilico, éter tritil; éter alil; éter alcoximetil tal como éter metoximetil, éter 2-metoxietoximetil, éter benziloximetil, éter p-metoxi-benziloximetil, éter 2-(trimetilsilil)etoximetil; éter tetrahidropiranil e éteres relacionados; éter
metiltiometil; ésteres tais como éster acetato, éster benzoato; éster pivalato; éster metoxiacetato; és ter cloroacetato; éster levulinato; carbonatos tais como carbonato de benzila, carbonato de p-nitrobenzila, carbonato de tert-butil, carbonato de 2,2,2-tricloroetila, carbonato de 2-(trimetilsilil)etila, carbonato de alila. Exemplos adicionais de grupos protetores de hidroxila podem ser encontrados em livros de referência tais como "Protective Groups in Organic Synthesis" de Greene e Wuts, John Wiley & Sons, Inc. , Nova York, 1999. Em uma realização preferida o grupo protetor é um éter alquilico, mais preferivelmente é éter metilico.
X2 pode ser um hidrogênio ou um grupo ponte que permita a ligação aos grupos amino da quitosana. Entre as moléculas ponte utilizadas preferidas, mas não exclusivas, está uma succinimida ou um derivado desta.
De forma alternativa Xi pode ser igualmente um grupo que permita a ligação com outros grupos distintos do grupo amino. Por exemplo, para se obter a ligação com grupos SH se utiliza como molécula ponte a maleimida.
0 número de grupos amino da quitosana que reagem com o PEG, ou o que é o mesmo, a funcionalização dos grupos amino da quitosana com o PEG, o que se conhece como PEGuilação, é compreendido entre 0,1% e 5%, preferivelmente entre 0,2% e 2%, mais preferivelmente entre 0,5% e 1%.
O conjugado de quitosana-PEG resultante apresenta um peso molecular compreendido entre 5 e 3000 kDa, preferivelmente entre 10 e 500 kDa.O sistema de nanoparticulas da invenção se caracteriza pelo fato de se haverem formado mediante reticulação iônica do conjugado quitosana-PEG. 0 agente de reticulação é um sal aniônico que permite a reticulação do conjugado quitosana-PEG mediante. gelificação iônica, favorecendo a formação espontânea das nanoparticulas. Na presente invenção o agente de reticulação é um sal de polifosfato, sendo preferido o emprego de tripolifosfato de sódio (TTP) . A reticulação para produzir o sistema de nanoparticulas é simples e conhecida do especialista na técnica, tal como mencionado nos antecedentes da invenção.
Um segundo aspecto da presente invenção constitui uma composição farmacêutica que compreende as nanoparticulas previamente definidas. Exemplos de composições
farmacêuticas incluem qualquer composição liquida (suspensão de nanoparticulas em água ou em água com aditivos tais como agentes de viscosidade, tampões de pH, etc) ou sólida (nanoparticulas liofilizadas ou atomizadas formando um pó que se pode utilizar para a obtenção de granulados, comprimidos ou cápsulas) para sua administração por via oral, bucal ou sub-lingual, tópica, ou em forma liquida ou semi-sólida para sua administração por via transdérmica, ocular, nasal, vaginal ou parenteral. No caso das vias não parenterais o contato das nanoparticulas com a pele ou mucosas poderá ser melhorada dotando as partículas de uma carga positiva importante, o que favorecerá sua interação com as citadas superfícies carregadas negativamente. No caso das vias parenterais, mais especificamente para a administração intravenosa, estes sistemas oferecem a possibilidade de modular adistribuição in vivo dos fármacos ou moléculas que podem estar associadas.
Em um aspecto preferido a formulação é administrada por via mucosa. A carga positiva que o conjugado quitosana-PEG apresenta proporciona uma melhor absorção dos fármacos na superfície mucosa através de sua interação com a mucosa e as superfícies das células epiteliais que são carregadas negativamente.
As nanoparticulas de quitosana-PEG são sistemas que apresentam uma alta capacidade de associação de moléculas bioativas. Esta capacidade de associação depende do tipo de molécula incorporada assim como dos parâmetros de formulação apontados. Desta forma, outro aspecto da presente invenção é uma composição que compreende nanoparticulas de quitosana-PEG como as definidas previamente e pelo menos uma molécula biologicamente ativa.
0 termo "molécula biologicamente ativa" refere-se a qualquer substância empregada no tratamento, cura, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou que é empregada para melhorar o bem-estar fisico e mental de humanos e animais. Estas moléculas biologicamente ativas podem incluir desde fármacos de baixo peso molecular até moléculas do tipo de polissacarideos, proteínas, peptideos, lipideos, oligonucleotideos e ácidos nucléicos e combinações destes. Exemplos de moléculas associadas a estas nanoparticulas incluem proteínas como o toxóide tetânico e o toxóide diftérico, polissacarideos como heparina, peptideos como a insulina, assim como plasmideos codificadores de diversas proteínas.Em uma realização preferida a molécula biologicamente ativa é a insulina. Em outra realização preferida a molécula biologicamente ativa é o toxóide diftérico ou tetânico. Em outra realização preferida a molécula
biologicamente ativa é a heparina. Em outra realização preferida a molécula biologicamente ativa é um plasmideo de DNA.
Os sistemas nanoparticulados da presente invenção também podem incorporar outras moléculas ativas que não apresentam efeito terapêutico, mas que produzem composições cosméticas. Estas composições cosméticas incluem qualquer composição liquida (suspensão de nanoparticuias) ou emulsão para sua administração por via tópica. Entre as moléculas ativas que podem ser incorporadas nas nanoparticuias cabe citar agentes antiacne, anti-fúngicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, branqueadores de pele, bronzeadores, absorventes de luz UV, enzimas, biocidas cosméticos, entre outros.
Outro aspecto da presente invenção é uma vacina que compreende as nanoparticulas previamente definidas e um antigeno. A administração de um antigeno com o sistema constituído pelas nanoparticulas permite se obter uma resposta imunológica. A vacina pode compreender uma proteina, polissacarideo ou pode ser uma vacina de DNA. Estritamente falando, uma vacina de DNA é uma molécula de DNA que codifica a expressão de um antigeno que produzirá a uma resposta imunológica. Em uma realização preferida o antigeno é o toxóide tetânico e o toxóide diftérico.
Outro aspecto da presente invenção refere-se a um procedimento para a preparação de nanoparticulas dequitosana-PEG como as definidas previamente, que compreende:
a) preparação de uma solução aquosa do conjugado quitosana-PEG;
b) preparação de uma solução aquosa do agente de reticulação; e
c) mistura, sob agitação, das soluções das etapas a) e b) , de modo a se obter espontaneamente as nanoparticuias de quitosana-PEG mediante gelificação iônica e conseqüente precipitação.
0 pH da solução inicial do conjugado quitosana-PEG é modificado até alcançar valores compreendidos entre 4,5 e 6,5 mediante a adição de hidróxido de sódio previamente à mistura das soluções.
Em uma variante do procedimento, a relação quitosana-PEG/agente de reticulação resultante está compreendida entre 2/1 e 8/1, sendo preferida a relação 3/1, a qual proporciona formulações com uma polidispersão relativamente baixa. Não obstante, o emprego de relações quitosana-PEG/agente de reticulação maiores assim como a preparação de partículas em meios mais ácidos também é possível.
A presença do agente de reticulação permite o entrecruzamento do conjugado quitosana-PEG de tal maneira que é formada uma malha entre a qual se pode inserir uma molécula biologicamente ativa que posteriormente pode ser liberada. Além disto, o agente de reticulação confere às nanoparticuias as características de tamanho, potencial e estrutura que as torna adequadas como sistema de administração de moléculas biologicamente ativas.A molécula biologicamente ativa pode ser incorporada diretamente nas soluções das etapas a) ou b) , ou previamente ser dissolvida em uma fase aquosa ou orgânica, de modo que são obtidas espontaneamente as nanoparticuias de quitosana-PEG contendo a molécula biologicamente ativa mediante gelificação iônica e conseqüente precipitação.
Desta forma a incorporação da molécula biologicamente ativa pode ser realizada segundo os métodos a seguir:
a) a molécula ativa é dissolvida diretamente nas soluções do agente de reticulação ou de quitosana-PEG;
b) a molécula ativa é dissolvida em uma solução aquosa ácida ou básica, previamente a sua incorporação nas soluções de agente de reticulação ou de quitosana-PEG; ou
c) a molécula ativa é dissolvida em um solvente orgânico polar, miscivel em água, previamente a sua incorporação nas soluções de agente de reticulação ou de quitosana-PEG.
O procedimento de preparação das nanoparticulas de quitosana-PEG pode compreender além disto uma etapa adicional, na qual as ditas nanoparticulas são liofilizadas. Do ponto de vista farmacêutico é importante poder se dispor das nanoparticulas na forma liofilizada já que assim se melhora sua estabilidade durante o armazenamento. As nanoparticulas de quitosana-PEG (com diferentes graus de PEGuilação) podem ser liofilizadas na presença de um crioprotetor como pode ser a glicose em uma concentração de 5%. Outros aditivos habituais podem estar presentes. De fato, a determinação do tamanho da partículaantes e depois de sua liofilização não é modificada significativamente. Isto é, as nanoparticulas podem ser liofilizadas e re-suspendidas sem que se produza uma variação nas mesmas (tabela I).
Tabela I: Características das nanoparticulas de CS-
PEG antes e depois da liofilização.
tamanho tamanho
P.I.* P.I. (nm) (nm)
Formulação
antes da liofilizadas com 5% de
liofilização glicose
quitosana-PEG
74,7 ± 9,5 0,231 78,6 ± 18,3 0,224
0, 5%
quitosana-PEG 1% 76,9 ±6,0 0,500 87,7 ± 22,3 0,418 *P.I.: indice de polidispersão
A seguir, são descritos alguns exemplos ilustrativos que evidenciam as características e vantagens da invenção, não devem ser interpretados como limitativos do obj eto da invenção.
EXEMPLOS Exemplo 1
Otimização na preparação de nanoparticulas de quitosana-PEG
As nanoparticulas de quitosana-PEG se são preparadas segundo a técnica de gelificação iônica descrita para quitosana, por exemplo, no documento WO 9804244. Concretamente, a quitosana com 0,5% ou 1% de grau de peguilação (percentagem de grupos amino que estão funcionalizados com PEG) foi dissolvida inicialmente em água ultra-pura a uma concentração de 1 mg/ml. Com opropósito de se estudar seu possível efeito sobre a formação das nanopartículas, o pH inicial da solução de quitosana-PEG foi modificado até alcançar valores compreendidos entre 4,5 e 6,5 mediante a adição de NaOH antes da preparação das partículas. 0 tripolifosfato de sódio (TTP) também foi dissolvido em água a diferentes concentrações com o obj etivo de se obter relações de quitosaria-PEG/TTP de 2/1, 3/1 e 4/1. A formação das nanopartícuias ocorre espontaneamente depois da adição de um volume fixo da solução de TTP (0,6 ml) a um volume fixo da solução de quitosana-PEG (1,5 ml) sob agitação magnética.
O efeito que o grau de peguilação da quitosana, o pH da solução do polímero e a relação quitosana-PEG/TTP provocam sobre o tamanho e polidispersão das nanopartícuias é mostrado nas figuras IA e 1B. A partir dos resultados obtidos se pode concluir que as nanopartículas de quitosana-PEG com um grau de peguilação de 0,5-1% podem ser preparadas facilmente com uma faixa ampla de condições experimentais, sendo o pH o parâmetro mais influente no tamanho das nanopartículas. Além disto, o efeito do pH chega a ser mais marcante a medida que o grau de peguilação aumenta de 0,5 a 1%.
Por outro lado, a distribuição de tamanhos das nanopartículas também é afetada pelo grau de peguilação da quitosana assim como pelo pH da solução de quitosana-PEG. Aparentemente, a relação ideal quitosana-PEG/TTP é de 3/1 para se obter formulações com uma dispersão relativamente baixa.O tamanho das nanoparticuias é determinado mediante espectroscopia de correlação fotônica, empregando-se para isto um Zetasizer III (Malvern Instruments, Malvern, UK) . 0 tamanho das nanoparticuias de quitosana-PEG oscilou entre 70 e 310 nm.
Exemplo 2
Comparação entre as nanoparticuias de quitosana e as de quitosana-PEG
Como se pode observar a partir da Tabela II, a peguilação altera a solubilidade da quitosana. Isto tem influência sobre a formação das nanoparticulas. A relação ótima quitosana/TTP tipicamente situada entre 6/1 e 4/1 se desloca no caso da quitosana-PEG para valores menores, tipicamente entre 4/1 e 2/1. Estas diferenças são devidas provavelmente à modificação química da quitosana, que sofre uma alteração dos grupos disponíveis que podem interagir podendo alterar as condições de gelificação ionotrófica.
Tabela II
quitosana quitosana-PEG 0,5% quitosana-PEG 1%
pH inicial limite de solubilidade 4,7-4,8 6,4-6,5 4,6-4,7 6,9-7,1 4,6-4,7 7,1-7,2
No que diz respeito às nanoparticulas, se pode observar que as nanoparticulas preparadas a partir de quitosana peguilada são significativamente diferentes das constituídas de quitosana pura. Isto é ilustrado na tabela III, onde são mostradas as características das nanoparticulas formadas por quitosana, quitosana-PEG comgraus de peguilação de 0,5% e 1% (no valor de pH inicial, em sua relação ideal de polímero).
A peguilação provoca uma redução marcada no tamanho das nanoparticulas e na carga da superfície. Neste último caso, o grau de peguilação também tem uma grande influência já que a carga da superfície se reduz ainda mais quando o grau de peguilação aumenta de 0,5% a 1%.
Tabela III
quitosana, 4/1
quitosana-PEG 0,5%, 3/1
quitosana-PEG 1%, 3/1
tamanho (nm) P.I.
265 ± 10 0,363
74 ± 9 0,231
77+6 0,500
potencial (mV) +29,1 ± 1,1 +12,1 ± 1,8 +1,6 ± 0,6
P.I.=indice de polidispersão
Exemplo 3
Formação e caracterização de nanoparticulas de quitosana com diferentes graus de peguilação carregadas com DNA
Para sua encapsulamento, DNA plasmidial foi incorporado à solução de TTP previamente à formação das nanoparticulas. Esta solução de TTP contendo o DNA foi adicionada posteriormente à solução de quitosana-PEG e se manteve sob agitação magnética. As cargas teóricas de DNA foram de 5, 10 ou 20% em relação à quantidade total de quitosana-PEG empregada para a preparação das nanoparticulas (1 mg) . A eficiência da encapsulamento do DNA plasmidial foi sempre superior a 90% como é confirmadopelos ensaios de fluorescência (corante Pico Green dsDNA) e eletroforese em gel de agarose.
As tabelas IV, V e VI mostram as características das diferentes nanoparticuias de quitosana e quitosana-PEG. Similarmente às nanoparticulas sem carga, as formulações carregadas de DNA contendo PEG são muito menores e apresentam menos carga positiva em sua superfície que as formulações sem PEG.
Em todos os casos, a presença de DNA também causa alterações nas características dos veículos, especialmente a altas percentagens de DNA, onde a carga da superfície geralmente é reduzida. No que diz respeito ao tamanho da nanoparticuia, cargas grandes de DNA permitem induzir a formação de estruturas mais reticuladas, o que provoca uma redução do tamanho da partícula. Isto se pode observar no caso de veículos não peguilados, onde o tamanho se reduz de aproximadamente 270-300 nm para 220 nm.
Entretanto, o tamanho dos veículos peguilados aumenta com a carga de DNA, especialmente quando se emprega quitosana-PEG com um grau de peguilação de 0,5%.
Tabela IV
quitosana sem PEG, 4/1 tamanho (nm) P.I. potencial (mV)
branco 265 ± 10 0,363 29,1 ± 1,1
+5% DNA 278 ± 17 0,340 40,5 ± 5,6
+10%DNA 309 ± 2 0,378 41,6 ±0,8
+20%DNA 216 ± 7 0,363 35,2 ± 1,8
Tabela V
quitosana-PEG .
n co o/i tamanho (nm) P.I. potencial (mV)branco +5% DNA +10%DNA +20%DNA 74 + 9 115 ± 14 131 ± 13 181 ± 8 0,231 0,227 0,207 0,209 +121 + 1,8 +13,4 ± 2,1 +11,3 + 3,9 +5,7 + 1,6
Tabela VI quitosana-PEG 1%, 3/1 tamanho (nm) P. I. potencial (mV)
branco +5% DNA +10%DNA +20%DNA 77 + 6 78 ± 7 78 ± 10 105 ± 2 0, 500 0, 485 0,256 0,229 + 1,6 ± 0,6 +3,7 ± 0,4 +1,3 + 2,1 -0,6 ± 0,4
Exemplo 4
Liberação in vítro de DNA plasmidial
DNA plasmidial foi eficazmente associado tanto a partículas de quitosana quanto de quitosana-PEG. Como é mostrado nas figuras 2A e 2B, não se detecta liberação de DNA plasmidial (segundo análise de eletroforese em gel de agarose) quando as nanoparticulas carregadas com DNA plasmidial são incubadas durante mais de um mês, tanto em tampão acetato (pH: 4, pH: 7,4) quanto em água purificada (MQ) .
Exemplo 5
Liberação in vitro de DNA plasmidial na presença de enzimas
Como se pode observar a partir da análise de eletroforese (Figura 3), o DNA plasmidial pode ser liberado das nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG quando as nanoparticulas carregadas de DNA plasmidial são incubadasem tampão acetato a pH 6 na presença de quitosanase (0,6 mg/ml) .
Estes resultados evidenciam que o DNA plasmidial foi eficazmente associado às nanoparticulas, entretanto, não está irreversivelmente fixado a elas já que pode ser liberado quando o veiculo polimérico é degradado enzimaticamente.
Exemplo 6
Eficácia na transfecção do DNA plasmidial (GFP) associado a nanoparticulas de quitosana-PEG
A eficácia da transfecção mediante nanoparticulas de quitosana e quitosana-PEG foi avaliada para a codificação do plasmideo GFP em um modelo de linhagem celular HEK 293.
A figura 4 mostra o efeito que o grau de peguilação da quitosana (0,5% e 1%) provoca sobre a eficácia na transfecção de nanoparticulas de quitosana de alto peso molecular (125 kDa, HMW CS NP) que contêm uma carga de 20% de DNA plasmidial (pDNA). A dose de plasmideo por poço foi de 1 \ig. Os resultados indicam que um grau de peguilação de 0,5% tem um efeito positivo na capacidade de transfecção destas nanoparticulas. Este grau de peguilação foi escolhido para os experimentos posteriores. Os resultados mostrados na figura 4b indicam que a eficácia da transfecção aumenta com a carga de pDNA das nanoparticulas. Esta observação é interessante já que a dose de plasmideo foi constante (1 yig) e por tanto, a dose de nanoparticulas se reduz a medida que a carga de pDNA aumenta.
O efeito da carga de plasmideo sobre a eficácia na transfecção também foi avaliado para nanoparticulas dequitosana-PEG de baixo peso molecular (10 kDa, LMW CS-PEG NP) neste caso, o maior nivel de expressão foi observado para a carga menor (5%) (Figura 5a). Por outro lado, para esta carga baixa (5% pDNA) se observou que a peguilação apresentava um efeito negativo na eficácia de transfecção (Figura 5b).
A conclusão principal destes experimentos é que a peguilação da quitosana tem um efeito positivo (HMW CS-PEG NP) ou negativo (LMW CS-PEG NP) dependendo do peso molecular da quitosana.
Exemplo 7
Efeito biológico da administração intranasal de insulina encapsulada e insulina livre a uma concentração de 10 U/kg
Para realizar o encapsulamento da insulina nas ■nanoparticulas de quitosana, foram dissolvidos previamente 2,4 mg de insulina em uma solução de NaOH à qual se incorporou posteriormente 1,2 ml de TTP. Esta mistura foi adicionada depois a 3 ml de quitosana. Transcorridos 5 minutos sob agitação magnética, a preparação foi centrifugada a 10.000 g por 40 minutos. O sobrenadante foi retirado e o precipitado foi dissolvido em tampão. Por sua vez, para a preparação das nanoparticulas de quitosana-PEG foi realizado o mesmo procedimento, adicionando-se, no entanto, 10 mg/ml de PEG 400 a 2 mg/ml de quitosana.
O tamanho final das nanoparticulas de quitosana, determinado por espectroscopia de correlação fotônica, foi de 605 ± 15 nm enquanto que o das nanoparticulas de quitosana-PEG foi de 590 ± 6 nm.Inicialmente, a diabetes é induzida em ratos Wistar, pesando entre 200 e 220 g, por injeção de estreptozotocina (65 mg/kg i.v.) em um tampão citrato a pH 4,5. Foram considerados diabéticos quando a concentração de glicemia era acima de 4 00 mg/dl transcorridas três semanas de tratamento com estreptozotocina.
Para realizar este experimento foram empregados ratos submetidos a jejum. Os ratos foram divididos em diferentes grupos dependendo da formulação que lhes seria administrada. As diferentes formulações consistiam em: uma solução controle (tampão acetato, pH 4,3), insulina dissolvida em tampão acetato, insulina dissolvida em solução de quitosana, insulina associada a nanoparticulas de quitosana e insulina associada a nanoparticulas de quitosana-PEG, sendo a concentração de insulina de 10 U por kg de massa corporal. A administração destas formulações foi realizada colocando-se um pequeno volume das mesmas (10-20 |il) em cada orifício nasal utilizando-se uma pipeta Eppendorf, os ratos estando anestesiados com éter em posição costal. Posteriormente, os animais foram mantidos conscientes durante todo o experimento com a finalidade de se evitar qualquer influência que a anestesia pudesse provocar nos niveis de glicose no sangue.
Para se determinar os niveis de glicose no sangue, foram coletadas amostras de sangue da veia da cauda, antes da administração nasal e a cada quarto de hora depois até finalizados 90 minutos. Posteriormente, foram coletadas a cada hora durante 2 a 7 horas e por último transcorridas 24 horas desde a administração nasal. O nivel de glicose no sangue foi determinado imediatamente empregando-se umanalisador de glicose (Prestige da Chronolyss). Durante o experimento, os ratos foram mantidos em jejum.
Como é mostrado na figura 6, a administração nasal de tampão acetato, pH 4,3, provoca a redução lenta e progressiva da glicemia em função do tempo, sendo a redução máxima de 28% em relação aos valores de controle, transcorridas 6 horas desde a administração. A administração nasal de 10 U/kg de insulina em solução de tampão acetato não alterou significativamente o resultado anterior. Entretanto, quando a insulina está associada a nanopartículas de quitosana-PEG, os níveis de glicemia são reduzidos 18% (p<0,01) em apenas 15 minutos depois da administração, chegando a alcançar uma redução máxima de 45-50% (p<0,01 e p<0,001 respectivamente) aos 45 minutos da dita administração. Deve ser ressaltado que, esta redução se mantém transcorridas pelo menos 7 horas desde a administração nasal. Da mesma forma, se observa uma redução nítida nos níveis de glicemia quando se administra, por via intranasal, insulina associada a nanopartículas de quitosana. Neste caso, a glicemia se reduz significativamente a partir dos 30 minutos, concretamente em 16% (p<0,01) sendo a redução máxima de 32% (p<0,001) observada depois de 2 horas desde a administração intranasal. Quando a insulina é dissolvida em uma solução de quitosana também se reduz a glicemia, no entanto em um grau significativamente menor que quando a insulina está associada a nanopartículas de quitosana-PEG.
Exemplo 8Efeito das nanopartícuias que contêm insulina sobre a resposta glicêmica a uma administração oral de glicose.
Para realizar este experimento foram empregados camundongos diabéticos submetidos a jejum durante a noite. Receberam por via nasal cada uma das preparações descritas no exemplo 7. Transcorrida uma hora, cada grupo de camundongos recebeu por via oral uma administração de glicose de 2 g por cada kg de peso corporal. A glicemia foi determinada em sangue de amostras coletadas da veia da cauda antes da administração de glicose e depois de 10, 20, 30, 60, 90 e 120 minutos.
A figura 7 mostra o efeito das nanoparticuias que contêm insulina sobre a resposta glicêmica à administração oral de glicose. Nos camundongos de controle que receberam tampão acetato, a administração oral de glicose foi seguida de um aumento da glicemia cuj o valor máximo, 105% (p<0,001), foi alcançado 30 minutos depois.
Posteriormente, a glicemia se reduziu suavemente durante 2 horas. Por sua vez, a insulina dissolvida em tampão acetato (10 U/kg) não alterou significativamente este resultado.
Entretanto, a mesma quantidade de insulina em solução de quitosana aumentou, a resposta.. glicêmica à glicose em 189% (p<0,05) enquanto que a insulina associada a nanoparticulas de quitosana ou quitosana-PEG a aumentou em 193% (p<0,01) e 225% (p<0,01) respectivamente.
Portanto, comparando-se as A.U.C. (área abaixo da curva) a partir das diferentes formulações analisadas, a preparação mais efetiva foi a correspondente a insulina associada a nanoparticulas de quitosana-PEG, seguida dainsulina associada a nanoparticulas de quitosana e por último a correspondente a insulina em solução de quitosana.
Estes resultados evidenciam que o emprego das nanoparticulas de quitosana-PEG descritas na presente invenção aumenta a absorção nasal de insulina em camundongos diabéticos. Os resultados experimentais
mostram que a insulina (10 U/kg de peso corporal) associada a nanoparticulas de quitosana-PEG reduz consideravelmente a gli cernia a partir dos 15 minutos até pelo menos 7 horas depois da liberação intranasal e melhora a resposta glicêmica quando se produz uma carga oral de glicose. Um efeito menos acentuado se detecta com 4 U/kg de insulina associada às ditas nanoparticulas.
Quando a insulina é associada a nanoparticulas constituídas unicamente por quitosana ou quando a insulina se encontra em solução com quitosana, a eficiência é menor que quando está associada a nanoparticulas quitosana-PEG, enquanto que a insulina livre não apresenta qualquer efeito significativo sobre os parâmetros biológicos depois de sua liberação intranasal em camundongos diabéticos.
Exemplo 9
Avaliação in vivo da resposta imunológica provocada pelas nanoparticulas carregadas com toxóide diftérico.
A associação do toxóide diftérico (TD) às nanoparticulas de quitosana ou quitosana-PEG é realizada por incorporação do TD a uma solução aquosa de TTP (300 jjg de TD). As nanoparticulas se formam espontaneamente pela adição de diferentes volumes da solução aquosa de TTP (1 mg/ml) a 3 ml de uma solução de quitosana ou quitosana-PEG(1 mg/ml) com agitação magnética. Os volumes da solução de TTP são calculados com a finalidade de se conseguir relações quitosana:TTP de 8:1 e 2:1. A quitosana é comercializada na forma de seu sal de hidrocloreto, Protosan Cl® 113 e Protosan Cl® 213 com um grau de desacetilação de 8 6%. As nanoparticuias de quitosana são isoladas por centrifugação a 10.000 g por 40 minutos a 5°C. No caso de quitosana-PEG, as nanoparticulas são coletadas com um ultra-filtro de centrifugação (Amicon® ultra-4 100000 NMWL, Millipore) a 3800 g por 30 minutos. O sobrenadante é eliminado e as nanoparticulas são re-suspendidas em tampão fosfato salino de pH 7,4 para sua administração aos camundongos.
A imunogenicidade das formulações de quitosana e quitosana-PEG foi determinada com camundongos mediante imunização intranasal. Foram empregados camundongos BALB/c de 6 semanas de idade e 22-25 g de peso. Os camundongos foram divididos em 5 grupos. Dois grupos foram tratados com nanoparticulas de quitosana carregadas com TD (CS-113 Cl, CS-213 Cl) e um grupo com nanoparticulas de quitosana-PEG carregadas com TD. A dose empregada foi de 10 pg de TD incorporados em 100 \ig de nanoparticulas em 10 \il de tampão fosfato de pH 7,4, administrando-se 5 pl em cada orifício nasal. Outro grupo foi tratado com toxóide livre (10 ]ig/camundongo) em tampão fosfato salino de pH 7,4. Além disto, como controle, um grupo recebeu uma vacina de DTP (difteria, tétano e pertusse) por via intraperitoneal, adsorvida em fosfato de alumínio (10 iig/camundongo) . As doses foram administradas nos dias 0, 7 e 14 a camundongos conscientes.Para realizar os ensaios de resposta imunológica in vivo, foram coletadas amostras de sangue da cauda dos camundongos nos dias 14, 28, 42, 56 e 70 depois da administração da primeira dose. Por sua vez, foram coletadas também amostras de lavagem de saliva, bronco-alveolar e intestinal no dia 70. A salivação foi induzida mediante injeção intraperitoneal de pilocarpina (50 \xl, 1 mg/ml) . Foi coletada uma alíquota de 100 pi do fluxo inicial de saliva de cada camundongo. Posteriormente os camundongos ' foram anestesiados com pentobarbital e foram sacrificados. As lavagens bronco-alveolares foram obtidas injetando-se e aspirando-se 5 ml de meio de lavagem na traqueia para inflar os pulmões mediante uma cânula intravenosa. Por sua vez, os segmentos intestinais
(duodeno, j ej uno, ileo) foram retirados assepticamente e homogeneizados em 4 ml de uma solução de 1 PMSF, 1 mM de ácido iodoacético e 10 mM de EDTA. As amostras foram clarificadas por centrifugação e azida sódica, PMSF e soro bovino foram adicionados como conservantes. Todas as amostras foram armazenadas a -20 °C até a realização dos ensaios de concentração de anticorpos.
A avaliação das respostas de anticorpo em soro e em tecidos de mucosa foi realizada por um teste ELISA. Em primeiro lugar, as microplacas (DYNEX, immulon®) foram cobertas com 100 pi de TD (4 pg/poço) em 0,05 M de tampão carbonato de pH 9,6 e incubadas durante a noite a 4°C. Entre as etapas os poços foram lavados três vezes com PBST de pH 7,4 (0,01 M PBS, ou tampão fosfato, contendo 5% v/v de Tween® 20) . Com a finalidade de minimizar as reações não especificas, foram adicionados a todos os poços 100 \xl dePBSTM (PBST contendo 5% p/v de leite desnatado em pó e 0,1% p/v de azida sódica como conservante) incubou-se por 1 hora a 37°C. Após lavagem com PBST, as amostras foram diluídas em série em duas etapas em PBSTM e as placas foram incubadas por mais 2 horas a 37°C. Posteriormente, foram diluídos 100 ]jl de conjugado de peroxidase de imunoglobulina IgG anti-camundongo de cabra a 1:2000 em PBSTM, isto foi adicionado aos poços e incubou-se a 37°C por 2 h. As placas foram lavadas e foram adicionados aos poços 50 jal de o-fenilendiamina dihidrocloreto (0,45 mg/ml) em 0,05 M de tampão citrato-fosfato de pH 5,0 como substrato. Após aquecimento (30 minutos a 37°C) as placas foram lidas a 4 50 nm em um leitor de microplacas (3350-UV, Biorad).
Os niveis de IgG anti-difteria provocados pelas nanoparticuias carregadas com TD e a solução controle de TD após uma imunização intranasal são mostrados na figura 8. Nesta figura, são apresentados também os resultados correspondentes à formulação comercial (TD adsorvido em fosfato de alumínio) administrada por via intraperitoneal. Em termos generais, os resultados indicam que, transcorrido o primeiro mês, os niveis de IgG observados para nanoparticuias carregadas com TD foram significativamente melhores que os correspondentes à vacina fluida (p<0,05). De fato, estes valores são comparáveis com os obtidos para a formulação utilizada como adjuvante (TD adsorvida em fosfato de alumínio) administrada por via parenteral. Conseqüentemente, estes resultados refletem claramente o efeito adjuvante das formulações contendo as nanoparticulas. Outra observação a se ressaltar foi a crescente e duradoura resposta imunológica a no tempo. Finalmente, no que dizrespeito à influência da composição das nanoparticulas, é interessante se apontar que o peso molecular da quitosana não apresenta qualquer efeito sobre a resposta imunológica alcançada pelas nanoparticulas de quitosana, entretanto, a PEGuilação da quitosana tem uma conseqüência marcada na eficácia das nanoparticulas. De fato, transcorrido um mês, os niveis de IgG foram significativamente maiores para as nanoparticulas de quitosana-PEG que para as nanoparticulas de quitosana.

Claims (28)

RE IVINDI CAÇOE S
1. Sistema que compreende nanoparticulas para a liberação de moléculas biologicamente ativas, caracterizado pelo fato das nanoparticulas compreenderem um conjugado que compreende a) pelo menos 50% em peso de quitosana ou um derivado do mesmo e b) menos de 50% em peso de polietilenoglicol (PEG) ou um derivado do mesmo, onde ambos os componentes a) e b) estão unidos covalentemente por meio dos grupos amino do quitosana, e pelo fato das ditas nanoparticulas se encontrarem reticuladas mediante um agente de reticulação.
2. Sistema de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato da proporção de quitosana ou um derivado deste em relação ao polietilenoglicol ser preferivelmente superior a 75% em peso.
3. Sistema de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato da proporção de polietilenoglicol ser preferivelmente inferior a 25% em peso.
4. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato do grau de polimerização do quitosana ou do número de unidades monoméricas que compreendem o quitosana ou um derivado deste estar compreendido entre 30 e 3000, preferivelmente entre 60 e 600.
5. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato do quitosana ou seu derivado apresentarem um peso molecular compreendido entre 5 e 2 000 kDa, preferivelmente entre 10 e 500 kDa, mais preferivelmente entre 10 e 100 kDa.
6. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato do quitosana ou seu derivado apresentarem um grau de desacetilação compreendido entre 30% e 95%, preferivelmente entre 60% e 95%.
7. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato do PEG ser um PEG modificado que apresenta uma fórmula (III):Xi-(0-CH2-CH2)p- O- X2onde Xi é um grupo protetor de radicais hidroxila, X2 é um hidrogênio ou um grupo ponte que permita a ligação aos grupos amino do quitosana, e p é o grau de polimerização.
8. Sistema de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de Xi ser um grupo alquil, preferivelmente metil.
9. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato do PEG apresentar um grau de polimerização compreendido entre 50 e 500.
10. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato do PEG apresentar um peso molecular compreendido entre 2 e 20 kDa, preferivelmente entre 5 e 10 kDa.
11. Sistema de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato da funcionalização dos grupos amino do quitosana ou seu derivado com PEG estar compreendida entre 0,1% e 5%, preferivelmente entre 0,5% e 1%.
12. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente uma molécula biologicamenteativa selecionada do grupo consistindo em fármacos de baixo peso molecular, polissacarideos, proteínas, peptideos, lipideos, oligonucleotideos e ácidos nucléicos e combinações destes.
13. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato do agente de reticulação ser um sal de polifosfato, preferivelmente tripolifosfato de sódio.
14. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato do tamanho médio das nanoparticuias estar compreendido entre 1 e 999 nanômetros, preferivelmente entre 50 e 800 nm.
15. Sistema de acordo com qualquer uma das reivindicações la 14, caracterizado pelo fato da carga elétrica (potencial Z) estar compreendida entre +0,1 mV e +50 mV, preferivelmente entre +1 e +40 mV.
16. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um sistema como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e uma molécula biologicamente ativa capaz de prevenir, aliviar ou curar doenças.
17. Composição de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de ser para administração por via oral, bucal, sublingual, tópica, transdérmica, ocular, nasal, vaginal o parenteral.
18. Composição de acordo com as reivindicações 16 ou 17, caracterizada pelo fato da molécula biologicamente ativa ser selecionada de polissacarideos, proteínas, peptideos, lipideos, oligonucleotideos, ácidos nucléicos e combinações destes.
19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, caracterizada pelo fato da molécula biologicamente ativa ser insulina, heparina, antigenos protéicos ou DNAs plasmidiais.
20. Composição cosmética caracterizada pelo fato de compreender um sistema para a liberação de uma molécula biologicamente ativa como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
21. Composição cosmética de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato da molécula ativa ser selecionada de agentes antiacne, antifúngicos, antioxidantes, desodorantes, antitranspirantes, anticaspa, branqueadores de pele, bronzeadores, absorventes de luz UV, enzimas e biocidas cosméticos.
22. Vacina caracterizada pelo fato de compreender um sistema para a liberação de uma molécula biologicamente ativa como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 e um antigeno.
23. Vacina de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato do antigeno ser selecionado de proteínas, polissacarideos e moléculas de DNA.
24. Vacina de acordo com a reivindicação 22 o 23, caracterizada pelo fato do antigeno ser o toxóide tetânico ou o toxóide diftérico.
25. Processo para a obtenção de um sistema para a liberação controlada de uma molécula biologicamente ativa conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de compreender:a) preparação de uma solução aquosa do conjugado quitosana-PEG;b) preparação de uma solução aquosa do agente de reticulação; ec) mistura, sob agitação, das soluções obtidas nas etapas a) e b) , de modo que se obtêm espontaneamente as nanoparticulas de quitosana-PEG mediante gelificação iônica e conseqüente precipitação.
26. Processo para a obtenção de nanoparticulas de acordo com reivindicação 25, caracterizado pelo fato do agente de reticulação ser um tripolifosfato, preferivelmente tripolifosfato de sódio.
27. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 e 2 6, caracterizado pelo fato da molécula biologicamente ativa ser dissolvida previamente em a) ou em b) ou em outra fase aquosa ou orgânica que se adiciona em a) o b) .
28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato da molécula biologicamente ativa ser selecionada de insulina, heparina, DNA plasmidial, toxóide tetânico e toxóide diftérico.
BRPI0608635-7A 2005-03-14 2006-03-14 nanopartÍculas de quitosana e polietilenoglicol como sistema de administraÇço de molÉculas biologicamente ativas BRPI0608635A2 (pt)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200500590A ES2259914B1 (es) 2005-03-14 2005-03-14 Nanoparticulas de quitosano y polietilenglicol como sistema de administracion de moleculas biologicamente activas.
PCT/ES2006/000123 WO2006097558A2 (es) 2005-03-14 2006-03-14 Nanopartículas de quitosano y polientilenglicol como sistema de administración de moléculas biológicamente activas

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0608635A2 true BRPI0608635A2 (pt) 2010-01-19

Family

ID=36992092

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0608635-7A BRPI0608635A2 (pt) 2005-03-14 2006-03-14 nanopartÍculas de quitosana e polietilenoglicol como sistema de administraÇço de molÉculas biologicamente ativas

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20080095810A1 (pt)
EP (1) EP1864653A4 (pt)
JP (1) JP2008533108A (pt)
KR (1) KR20070119694A (pt)
CN (1) CN101175486A (pt)
AU (1) AU2006224548A1 (pt)
BR (1) BRPI0608635A2 (pt)
CA (1) CA2602031A1 (pt)
ES (1) ES2259914B1 (pt)
MX (1) MX2007011212A (pt)
WO (1) WO2006097558A2 (pt)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009007247A1 (en) * 2007-07-12 2009-01-15 Basf Se Nitrocellulose based dispersant
CN101293933B (zh) * 2008-06-17 2011-05-04 浙江大学 聚乙二醇修饰壳寡糖脂肪酸嫁接物及制备方法和应用
US8557288B2 (en) * 2008-08-15 2013-10-15 Washington University Hydrogel microparticle formation in aqueous solvent for biomedical applications
JP5841044B2 (ja) * 2009-03-23 2016-01-06 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッドＴｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ． 複合糖質ワクチン
CN102438657A (zh) * 2009-03-26 2012-05-02 沃萨乌整形外科公司 鉴别定向药物递送组合物的潜在组分的方法
JP5804453B2 (ja) * 2009-05-14 2015-11-04 国立大学法人 東京大学 結晶性ポリオール微粒子及びその調製方法
US8642088B2 (en) 2009-09-04 2014-02-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Tannin-chitosan composites
CN106913902A (zh) * 2009-11-09 2017-07-04 聚光灯技术合伙有限责任公司 多糖基水凝胶
US8802076B2 (en) 2010-10-04 2014-08-12 Duke University Compositions and methods for modulating an immune response
KR101346661B1 (ko) * 2010-11-15 2014-02-06 부경대학교 산학협력단 키토올리고당을 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물
TWI400088B (zh) * 2010-12-17 2013-07-01 Univ Nat Chiao Tung 藥物載體原料及其製備方法和使用方法
CN102406610B (zh) * 2011-08-17 2013-06-12 杭州师范大学 一种具有长循环性能的微粒给药系统及其制备方法
CN103172874B (zh) * 2013-04-15 2015-02-11 北京中地泓科环境科技有限公司 以壳聚糖/珍珠岩为原料制备颗粒的方法
CN104274830B (zh) * 2013-07-04 2016-08-17 复旦大学 一种基于抗原共价结合壳聚糖纳米粒的鼻腔免疫载体
EP3151856B1 (en) * 2014-06-06 2019-08-07 Merck Patent GmbH Antigen-loaded chitosan nanoparticles for immunotherapy
CA3016457A1 (en) * 2016-03-02 2017-09-08 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Sting activating nanovaccine for immunotherapy
ES2971884T3 (es) 2016-10-17 2024-06-10 Pola Chem Ind Inc Partículas compuestas que incluyen polímero aniónico y polímero catiónico o péptido, y método para producir partículas compuestas
CN109125264B (zh) * 2017-06-19 2020-10-30 林海祥 一种抗感染抗肿瘤的粘膜免疫制剂
JP2021501339A (ja) * 2017-10-31 2021-01-14 エヌゲイジアイティー・デジタル・ヘルス・インコーポレイテッド 息の中の化合物を検出し識別するためのポータブルデバイスおよび方法
CN111587129A (zh) * 2018-01-12 2020-08-25 波士顿科学国际有限公司 实现止血的粉末
JP7366434B2 (ja) 2018-06-29 2023-10-23 信福（北京）医▲薬▼科技有限公司 免疫応答を強化するための複合物
GB201818517D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Univ Liverpool John Moores Nanoparticles and uses thereof
CN110101681B (zh) * 2019-05-16 2021-11-05 中国计量大学 提高火龙果γ-生育酚生物利用度的微粒制备方法
US20200383932A1 (en) * 2019-06-05 2020-12-10 The Florida International University Board Of Trustees Biotherapy for viral infections using biopolymer based micro/nanogels
US12263252B2 (en) 2019-06-05 2025-04-01 The Florida International University Board Of Trustees Biotherapy for viral infections using biopolymer based micro/nanogels
CN110384684B (zh) * 2019-08-26 2021-04-06 安徽农业大学 一种单羧基壳聚糖/紫草素复合纳米颗粒及其制备方法
US12234578B2 (en) 2020-01-29 2025-02-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Tannin composite fibers
CN111388452B (zh) * 2020-04-30 2021-10-26 中国药科大学 脂肪组织靶向肽p3-壳聚糖寡聚乳酸-聚乙二醇递送系统及其在核酸药物递送上的应用
US12303564B2 (en) 2021-03-19 2025-05-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Composite chitosan-tannin-active agent compositions and methods of making and using same
WO2023147504A1 (en) * 2022-01-29 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Polysaccharide a-based particulate systems for attenuation of autoimmunity, allergy, and transplant rejection

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE80468B1 (en) * 1995-04-04 1998-07-29 Elan Corp Plc Controlled release biodegradable nanoparticles containing insulin
ES2093562B1 (es) * 1995-05-26 1997-07-01 Univ Santiago Compostela Estabilizacion de sistemas coloidales mediante formacion de complejos ionicos lipido-polisacarido.
ES2114502B1 (es) * 1996-07-29 1999-07-01 Univ Santiago Compostela Aplicacion de nanoparticulas a base de polimeros hidrofilicos como formas farmaceuticas.
US6649192B2 (en) * 1996-07-29 2003-11-18 Universidade De Santiago De Compostela Application of nanoparticles based on hydrophilic polymers as pharmaceutical forms
US6730735B2 (en) * 1997-07-03 2004-05-04 West Pharmaceutical Services Drug Delivery & Clinical Research Centre Limited Conjugate of polyethylene glycol and chitosan
US20020054914A1 (en) * 1999-02-03 2002-05-09 Tulin Morcol Compositions and methods for therapuetic agents complexed with calcium phosphate and encased by casein
FR2822834B1 (fr) * 2001-04-02 2005-02-25 Flamel Tech Sa Suspension colloidale de nanoparticules a base de copolymeres amphiphile pour la vectorisation de principes actifs et leur mode de preparation
FR2842106B1 (fr) * 2002-07-11 2006-07-14 Centre Nat Rech Scient Dispersions aqueuses de particules nanometriques ou micrometriques pour l'encapsulation de composes chimiques
US20040156904A1 (en) * 2003-02-12 2004-08-12 The Research Foundation Of State University Of New York Biodegradable polymer device

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006097558A3 (es) 2006-11-09
MX2007011212A (es) 2009-02-19
US20080095810A1 (en) 2008-04-24
EP1864653A2 (en) 2007-12-12
WO2006097558A2 (es) 2006-09-21
CA2602031A1 (en) 2006-09-21
EP1864653A4 (en) 2012-07-18
KR20070119694A (ko) 2007-12-20
JP2008533108A (ja) 2008-08-21
AU2006224548A1 (en) 2006-09-21
ES2259914A1 (es) 2006-10-16
ES2259914B1 (es) 2007-06-16
CN101175486A (zh) 2008-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0608635A2 (pt) nanopartÍculas de quitosana e polietilenoglicol como sistema de administraÇço de molÉculas biologicamente ativas
JP5443976B2 (ja) 化学架橋ヒアルロン酸誘導体を含むハイブリッドゲルおよびそれを用いた医薬組成物
Kim et al. Surface modification of lipid-based nanocarriers for cancer cell-specific drug targeting
JP4537057B2 (ja) 脂質化グリコサミノグリカン粒子ならびに診断及び処置のための薬物及び遺伝子送達におけるその使用
KR100353496B1 (ko) 하이드로겔마이크로캡슐화백신
JP5655147B2 (ja) 治療用ペプチド−ポリマーの複合体、粒子、組成物および関連の方法
KR101924519B1 (ko) 펩타이드-키토산 개질 나노입자 및 이를 포함하는 약물 전달체
WO1999011703A1 (en) Cross-linked particles
BRPI0714718B1 (pt) Composição de micela polimérica de encapsulamento de polipeptídeos ou proteínas e seu método de preparo
EP3009140B1 (en) Composition including polycationic triblock copolymer, polyanionic polymer, and biologically active peptide
KR20140019214A (ko) 폴리에틸렌글리콜-폴리락트산-폴리에틸렌이민 양이온성 공중합체, 이의 제조방법 및 상기 공중합체를 포함하는 약물 전달용 조성물
CN105168130B (zh) 一种肿瘤靶向聚合物胶束及其制备方法
CN107596385A (zh) 一种肿瘤靶向性且环境pH刺激响应型药物控释纳米载体及其制备方法
Lee et al. A charge-switched nano-sized polymeric carrier for protein delivery
CN118576724A (zh) 一种针对胞内幽门螺杆菌的驱动型口服纳米制剂
Xiao et al. Recent developments in intelligent biomedical polymers
KR101210713B1 (ko) 온도 민감성 생리활성 물질 전달체 및 이의 제조방법
EP1500664A1 (en) Gelatin derivatives and high-molecular micelles comprising the same
BR112020000599A2 (pt) maltodextrinas reticuladas para a liberação oral de ativos biológicos
US7605231B2 (en) Gelatin derivatives and high-molecular micelle comprising the derivatives
ITPD20090168A1 (it) Coniugati polimerici fosfolipidi
BR102022002426A2 (pt) Nanopartículas adjuvantes para uso em composições de vacinas
Fields Novel Polymeric Nanoparticles for Pulmonary Gene Delivery

Legal Events

Date Code Title Description
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AS 5A E 6A ANUIDADES.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2161 DE 05/06/2012.