ITPD20090168A1 - Coniugati polimerici fosfolipidi - Google Patents
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Description
"CONIUGATI POLIMERICI DI FOSFOLIPIDI"
DESCRIZIONE DI INVENZIONE INDUSTRIALE
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione concerne nuovi coniugati polimerici di fosfolipidi comprendenti almeno un polimero coniugato, tramite una molecola ramificata ad almeno due fosfolipidi, e il loro uso tal quali o in combinazione con altre sostanze amfipatiche per la veicolazione di agenti biologicamente attivi. Questi detti nuovi coniugati polimero-fosfolipidi possono essere usati in preparazioni, "kits", formulazioni liposomiali per indagini diagnostiche ed in applicazioni terapeutiche.
FONDAMENTI DELL'INVENZIONE
L'uso terapeutico o diagnostico di molti agenti richiede una loro formulazione in veicoli acquosi al fine di permettere la somministrazione in organismi viventi. Purtroppo molti agenti attivi hanno un carattere idrofobico e di conseguenza non sono solubili in acqua. Per superare questo limite opportuni formulazioni e/o sistemi di "drug delivery" sono stati studiati, per esempio solventi organici miscibili con l'acqua, miscele acquose di detergenti, co-solventi, coniugati polimerici, nanoparticelle, micelle, lisosomi, etc. Per esempio Parikh et al., U.S. Pat. No. 5,922,355, descrive microparticelle comprendenti sostanze insolubili, e Greenwald, J. Control. Release 74 159-171 (2001), descrive molti coniugati polimerici di farmaci insolubili. Da molti anni anche le micelle vengono studiate per la veicolazione di farmaci e per un lo direzionamento selettivo (Brodin et al., Acta Pharm. Suec. 19 267-284 (1982)) anche di farmaci antitumorali (Fung et al., Biomater. Artif. Cells. Artif. Organs 16: 439 et. seq. (1988); and Yokoyama et al., Cancer Res. 51: 3229-3236 (1991)). Formulazioni liposomiali sono state studiate e sviluppate per aumentare la solubilità e l'emivita sia di molecole idrofobiche che idrofiliche (vedi per esempio U.S. Pat. Nos. 4,837,028 and
Inoltre i lisosomi possono essere usati per colpire selettivamente dei particolari tipi di cellule o tessuti (vedi per esempio U.S. Pat. Nos. 5,527,528 and 5,620,689). Formulazioni liposomiali offrono ulteriori vantaggi di "drug delivery" come ad esempio un rilascio controllato del principio attivo veicolato.
Sebbene i lisosomi presentino già un aumentata emivita piasmatica rispetto al farmaco libero un ulteriore aumento dell'emivita à ̈ necessario per raggiungere particolari regioni bersaglio, cellule o siti, che si trovano distanti dal sito di somministrazione. Una metodica molto studiata per prolungare l'emivita di un liposoma consiste nel ricoprirlo con un agente idrofilico, come ad esempio le catene di un polimero idrofilico quale il poli (etilenglicole) (PEG). Questo approccio permette anche di evitare l'adsorbimento di proteine piasmatiche sulla superficie del liposoma, opsonizzazione , che porta l'agglutinazione degli stessi con un inevitabile aumento della velocità di eliminazione dal torrente sanguigno.
In genere questi liposomi modificati vengono chiamati a liposomi a lunga circolazione o sfericamente stabilizzati. La più usata modifica superficiale di liposomi per questo scopo di prolungamento farmacocinetico consiste nel legame di catene di PEG con un peso molecolare tra 1000 da e 5000 Da. Quando vengono utilizzati dei PEG-fosfolipidi pre sintetizzati in genere vengono aggiunti in una percentuale in moli di circa il 5% (in equivalenti di fosfolipide) di tutti i lìpidi costituenti la formulazione lisosomiale (vedi per esempio, Stealth Liposomes, CRC Press, Lasic, D. and Martin, F., eds., Boca Raton, Fla., (1995) e i riferimenti citati nello stesso). La farmacocinetica di questi liposomi à ̈ caratterizzata da una riduzione dose-indipendente della captazione degli stessi da parte del fegato e della milza, tramite il sistema del fagociti mononucleari, a differenza dei liposomi convenzionali che vengono in confronto più velocemente eliminati dal circolo sanguigno e accumulati in questi organi.
Il più comune fosfolipide PEGhilato disponibile in commercio à ̈ la distearil fosfaditil etanolammina (DSPE). PEG-DSPE (5000 Da) à ̈ stato impiegato nella preparazione liposomiale di doxorubicina (Doxil, Caelix®).
E' stato messo in evidenza che i liposomi PEGhilati possono andare incontro ad una inaspettata rapida eliminazione, denominata "accelerated blood clearance" (ABC), soprattutto in seguito a somministrazioni ripetute forse per un'attivazione del sistema del complemento. Come causa di questo fenomeno à ̈ stata indicata la facile perdita dello strato protettivo di PEG attorno ai liposomi, dovuto a distaccamento delle catene di PEG-DSPE (vedi per esempio, Parr MJ, et al. Biochimica et Biophysìca Acta, 1195: 21-30 (1994)).
Di conseguenza, sarebbe auspicabile lo sviluppo di nuovi polimeri fosfolipidi in grado di permanere per più tempo ancorati alla superficie del liposoma evitando una rapida perdita dello strato polimerico idrofilo protettivo. Questi coniugati polimero-fosfolipidi permetterebbero un ulteriore prolungamento dell'emivita piasmatica. Sarebbe importante anche sviluppare dei polimero-fosfolipidi in grado di controllare e rallentare il rilascio di farmaco dal liposoma, al fine di rendere attuabili queste formulazione anche per quei farmaci che possono incorrere in un veloce fuoriuscita dal liposoma vanificando i vantaggi di questo sistema di "drug delivery".
RIASSUNTO DELL'INVENZIONE
Inseguito a studi estensivi dedicati allo sviluppo di coniugati in grado di superare il sopra riportato limite di distaccamento del PEG-DSPE dalla superficie del liposoma, abbiamo scoperto che l'emivita piasmatica dei liposomi e il rilascio del farmaco possono essere migliorati mediante l'incorporazione nei liposomi stessi di nuovi coniugati polimero-fosfolipidi, in grado di permanere ancorati alla superficie dei liposomi in modo più stabile. Questi coniugati formando uno strato idrofilico più stabile assicurano anche una maggiore prevenzione dell'adsorbimento di proteine sulla superficie dei liposomi.
Questi nuovi polimeri-fosfolipidi sono in grado di ancorarsi più stabilmente al doppio strato fosfolipidico del liposoma grazie ad un aumento del numero di fosfolipidi coniugati ad una catena di polimero idrofilico. Assieme, i fosfolipidi di una molecola di coniugato cooperano incrementando le interazioni con i fosfolipidi del doppio strato fosfolipidico del liposoma offrendo maggior stabilità al sistema. L'aumento delle dimensioni della parte idrofobica intercalata nella membrana del liposoma permette di ridurre la velocità di rilascio di farmaci incorporati nel liposoma.
In particolare la presente invenzione fornisce dei coniugati comprendenti un polimero idrofilo legato, direttamente o attraverso altre porzioni, ad almeno due molecole di fosfolipidi. Tali fosfolipidi possono essere coniugati al polimero idrofilo direttamente o attraverso uno o più spaziatori e/o uno o più altri polimeri. L'uso di ulteriori polimeri o di strutture dendrimeriche permette di legare al polimero idrofilo un numero maggiore di molecole di fosfolipidi. Gli spaziatori sono preferibilmente scelti tra gruppi alchilici o gruppi aromatici o peptidi idrolizzabili o altre sequenze biodegradabili. Inoltre, una o più molecole direzionatrici, quali anticorpi, ormoni o
zuccheri , possono essere legate al polimero idrofilo, all'estremità opposta rispetto ai fosfolipidi, direttamente o attraverso spaziatori e/o altri polimeri.
La natura anfifilica dei coniugati oggetto della presente invenzione permette una stabile localizzazione alla superficie di liposomi. In particolare la componente idrofobica di questi coniugati, costituita dai fosfolipidi, andrà a intercalarsi nel doppio strato fosfolipidico dei liposomi mentre il polimero idrofilo si protenderà verso il mezzo acquoso nel quale i liposomi sono dispersi. Le catene di polimero andranno a formare uno strato idrofilo che protegge il liposoma dal fenomeno dell'opsonizzazione . L' innovazione di questi nuovi coniugati polimerofosfolipidi consiste nel garantire una maggiore stabilità allo strato idrofilico diversamente da quanto mostrato dagli attuali liposomi a lunga circolazione dove lo strato idrofilico costituito usando PEG-DSPE va lentamente sfaldandosi in seguito al distaccamento di PEG-DSPE dal liposoma .
1 liposomi ottenuti con i nuovi coniugati polimerofosfolipidi hanno dimostrato una prolungata farmacocinetica in vivo rispetto agli attuali liposomi a lunga circolazione .
Gli inventori hanno anche visto che i liposomi ottenuti con i coniugati oggetto della presente invenzione possono rilasciare più lentamente l'agente terapeutico e per un periodo di tempo prolungato adatto ad applicazioni diagnostiche o terapeutiche.
DESCRIZIONE
La presente invenzione fornisce nuovi coniugati polimerofosfolipidi che possono essere impiegati nella preparazione di liposomi a lunga circolazione veicolanti agenti biologicamente attivi da impiegare sia a scopo diagnostico che terapeutico.
I polimero-fosfolipidi oggetto della presente invenzione (riportati qui anche come "coniugati") comprendono un polimero idrofilo legato attraverso un'unità ramificante a due o più molecole di fosfolipidi, il polimero idrofilo può anche eventualmente essere legato, direttamente o attraverso un'unità ramificante, ad una o più molecole direzionanti .
I coniugati possiedono preferibilmente la seguente formula:
(PL )n-MF-Poll- [Pol2- (BM )m]y
dove :
y à ̈ 0 o 1, m=l~10, n=2-20 e in alcune forme preferite dell'invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10
PL Ã ̈ un fosfolipide,
MF un' unità ramificante presentante residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni PL e Poli,
Poli à ̈ un polimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale.
Pol2 e BM possono essere presenti o assenti. In particolare, quando y=0, Pol2 e BM sono assenti.
Pol2, se presente, à ̈ un'unità ramificante che presenta residui funzionalizzabìli per legare direttamente o attraverso altre porzioni BM e Poli,
BM, se presente, Ã ̈ una molecola direzionante,
e le differenti porzioni sono coniugate, preferibilmente attraverso legami esterei, ammidici, carbammici, eterei, tioeterei, disolfuro o altri legami covalenti, direttamente o attraverso uno o più spaziatori, gli spaziatori preferibilmente scelti tra gruppi alchilici, quali NH2-(CH2)n-NH2(n=0-12) o HOOC-(CH2 )m-COOH (m=0-12), o gruppi aromatici o molecole idrolizzatili in funzione del pH o peptidi (quali Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly ) idrolizzabili da specifici enzimi lisosomiali.
Preferibilmente il fosfolipide PL possiede la seguente formula generale:
R1-0-CH,
R2-0-CH O
CHr-O-P-O— R3
<2>I
o
dove :
RI e R2 sono indipendentemente un gruppo alchilico, saturo 0 insaturo, o un gruppo acilico, saturo o insaturo, preferibilmente comprendente da 12 a 22 carboni, eventualmente sostituito con uno o più gruppi preferibilmente selezionati tra un gruppo ossi, un gruppo idrossilico o amminico. Gruppi acilici possono essere ad esempio, ma non esclusivamente, stearoil, palmitoil.
R3 Ã ̈ un legame o un qualsiasi gruppo che permette la coniugazione del fosfolipide con un polimero, come ad esempio, ma non esclusivamente, etanolammina , serina, glicerolo .
1 fosfolipidi (PL) usati per la presente invenzione sono molecole amfipatiche contenenti un gruppo fosforico; i fosfolipidi possono essere naturali o ottenuti per via sintetica (Vedi J.M. Berg, J.L. Tymoczko, and L.
Biochemistry . 5th ed. 2002, New York: W.H. Freeman. Vili 974, (e pagine seguenti); J. Lindberg, et al. J. Org. Chem.
67(1): 194-199 (2002)). I fosfolipidi presenti nel coniugato sono capaci di interagire con il doppio strato fosfolipidico dei liposomi o di promuovere la formazione di micelle .
Tra i fosfolipidi preferibilmente, ma non esclusivamente, utilizzati nella presente invenzione vi sono distearoilfosfatidil-etanolammina (DSPE), dipalmitoil-f osfatidiletanolammina (DPPE), dimiristoil-fosfatidil-etanolammina (DMPE), dioleoil-fosfatìdil-etanolammina (DOPE) , dielaidoil-fosfatidil-etanolammina (DEPE), distearoilfosfatidil-serina (DSPS), dipalmitoil-fosfatidil-serina (DPPS), dimiristoil-fosfatidil-serina (DMPS), dioleoilfosfatidil-serina (DOPS) , dimiristoil-fosfatidiletanolammina (DMPE), distearoil-fosfatidil-glicerolo (DSPG), dipalmitoil-fosfatidil-glicerolo (DPPG), dimiristoil-fosfatidil-glicerolo (DMPG) .
BM può essere presente oppure no, e se presente à ̈ una molecola direzionante specifica per il riconoscimento di tumori, siti infiammati o infetti per l'impiego in diagnostica o in terapia. Tra le molecole direzionanti preferite dall'invenzione vi sono peptidi, anticorpi monoclonali, frammenti di anticorpi, biotina, ormoni e zuccheri .
Il numero intero n, che indica il numero di molecole di fosfolipide coniugato tramite la molecola ramificata a Poli e' un numero maggiore di 1, per esempio, ma non esclusivamente, da 2 a 20, e preferibilmente da 4 a 8, per ottenere un composto con una componente idrofobica maggiore rispetto ai coniugati PEG-DSPE.
Secondo alcune forme preferite dell' invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10.
MF à ̈ un'unità ramificante, che secondo alcune forme dell' invenzione può essere una molecola ramificata tri- o tetrafunzionale, un polimero ramificato o una struttura dendrimerica ; MF presenta residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni PL e Poli. MF preferiti includono acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, 3-idrossi 2 ammino propanolo, lisina o un altro acido amminobicarbossilico o amminotricarbossilico. Polimeri polifunzionali idrofili preferiti includono acido poliaspartico, acido poliglutammico, poli (idrossietilaspartammide), poli(idrossietilglutammide), poli (idrossipropilmetacrilammide) e polìlisina. Nelle situazioni preferite, il polimero polifunzionale ha un peso molecolare tra i 500 e i 5000 Da. Quando MF à ̈ un dendrimero, la porzione ramificata à ̈ rappresentata da acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, lisina o 3-idrossi 2 animino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico e amminotricarbossilico. Tra i gruppi funzionali di MF preferiti vi sono gruppi carbossilici e amminici. Quando MF à ̈ legato direttamente a Poli, la coniugazione può essere mediata da un legame estereo, ammidico, carbammico o da altri legami covalenti.
Pol2, se presente, à ̈ un'unità ramificante e secondo alcune forme dell'invenzione à ̈ una molecola ramificante tri- o tetra-funzionale , un polimero multifunzionale o una struttura dendrimerica , che presenta residui funzionalizzabili per il legame covalente di più BM (in questo caso m≥l, per es., da 1 a 10, e preferibilmente da 1 e 4), per ottenere un composto più selettivamente direzionato. La porzione ramificata può essere preferibilmente rappresentata da acido glutammico, acido aspartico, acido beta-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, 3-idrossi 2 ammino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico o amminotricarbossilico. Pol2 possiede inoltre un gruppo funzionale per la coniugazione a Poli direttamente o attraverso uno spaziatore. Tra ì gruppi funzionali preferiti di Pol2 vi sono gruppi carbossilici e amminici. Quando Pol2 à ̈ legato direttamente a Poli, la coniugazione può essere mediata da un legame estereo, ammidico, carbammico o da altri legami covalenti.
Poli à ̈ un polimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale, che possiede almeno uno gruppo funzionale per la coniugazione a MF e almeno due gruppi funzionali se sono presenti anche Pol2 e BM. Tramite MF, Poli à ̈ coniugato ad almeno due PL. Quando Poli à ̈ un polimero monofunzionalizzato l'unico gruppo derivatizzabile deve essere coniugato al blocco comprendente i PL. Tale coniugazione può essere diretta o mediata da spaziatori. Quando Poli possiede due gruppi terminali (Poli bifunzionale o eterobifunzionale) uno deve essere coinvolto nella coniugazione al blocco PL, comprendente almeno due molecole di PL (anche diverse tra loro), e l'altro può essere alternativamente coniugato direttamente o tramite Pol2 a BM. In ogni caso la coniugazione può essere diretta o attraverso spaziatori. Tra i Poli monofunzionali, bifunzionali o eterobifunzionali preferiti vi sono poli (etilenglicole), polivinilpirrolidone o poliacriloilmorfolina, poli(2-etil-2-ossazolina) . Il/i gruppo/i terminale/i di Poli può/possono essere attivato/i ad esempio secondo procedure note (ad esempio per PEG-COOH, PEG-NH2)e altre (Sabine Herman, et al. J. of Bioactive and Compatible Polymers, 10: 145-187 (1995)). Il polimero Poli ha preferenzialmente un peso molecolare medio compreso tra 1000 e 40000 Da, preferibilmente di almeno 1500 Da, più preferibilmente di almeno 2000 Da, e ancora più preferibilmente di almeno 5000 Da. Nelle situazione preferite, Poli à ̈ un derivato di poli(etilenglicole) (PEG) , lineare o branched, monofunzionale, bifunzionale o eterobifunzionale, con un peso molecolare medio tra i 1000 e i 40000 Da. Alcuni Poli preferiti sono mPEG-OH 2000 Da, mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-OH 3400 Da, mPEG-COOH 3400 Da, mPEG-OH 5000 Da e mPEG-COOH 5000 Da.
Le differenti porzioni dei coniugati sono legate preferibilmente via legami esterei, ammidici, carbammici o altri legami covalenti, direttamente o attraverso uno o più spaziatori, gli spaziatori preferibilmente scelti tra gruppi alchilici quali NH2- (CH2)n-NH2(n=0-12) o HOOC-{CH2)m-COOH (m=0-12), o gruppi aromatici o molecole idrolizzabili in funzione del pH o peptidi (quali Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly ) idrolizzabili da specifici enzimi lisosomiali .
Tra i coniugati preferiti in accordo con la presente invenzione vi sono coniugati che possiedono le seguente formula :
nei quali, come di seguito riportato, y à ̈ 0, n=2-20, e nei quali, secondo alcune forme preferite dell' invenzione n>2 oppure n>3 oppure n>4 oppure n>5 oppure n>6, oppure n>10. Tra i coniugati preferiti aventi questa formula, vi sono coniugati nei quali Poli à ̈ poli(etilenglicole) (PEG), lineare o branched, monofunzionale, bifunzionale o eterobifunzionale , con un peso molecolare medio tra i 1000 e i 40000 Da, e preferibilmente mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-COOH 3400 Da o mPEG-COOH 5000 Da. ME à ̈ una molecola ramificante che può avere una struttura dendrimerica; per esempio, MF può contenere uno o più residui di acido betaglutammico (BG) come molecola ramificante, o MF può essere un omopolimero, basato sull'acido glutammico (AG). PL à ̈ distearoil fosfatidii etanolammina (DSPE) e n=2 o 4.
Alcuni esempi di coniugati preferiti secondo la presente invenzione hanno la seguente formula:
 I coniugati in accordo con la presente invenzione sono adatti sia per un uso diretto, quali molecole anfifiliche per la solubilizzazione di molecole idrofobiche, o per la preparazione di liposomi a lunga circolazione. In ogni caso I coniugati oggetto della presente invenzione possono essere usati in percentuali molari variabili dal 1-100% della composizione lipidica totale. I liposomi così ottenuti possono essere impiegati per la veicolazione, conservazione e formulazione di farmaci (idrofili ed idrofobica), peptidi, proteine e agenti diagnostici.
ESEMPI
Esempio 1: Preparazione di (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da
Step 1. Sintesi (COOH)2~BG-mPEG 5000 Da.
Il gruppo carbossilico di mPEG-COOH (5000 Da) à ̈ stato attivato via DCCI/NHS e coniugato al gruppo amminico dell'acido β-glutammico, per ottenere il prodotto desiderato: COOH)2-BG-mPEG 5000 Da.
440 mg di mPEG-COOH (0,088 mmol; MW 5000 Da) sciolti in 10 mi di CH2CI2 sono stati raffreddati a 4°C e sono stati quindi aggiunti di 15,20 mg di N-idrossisuccinimide (NHS) (0,132 mmol; MW 115,19 Da) e 54,47 mg di N,N'dicicloesilcarbodimide (DDC) (0,264 mmol; MW 206,33 Da). La miscela à ̈ stata mantenuta sotto atmosfera di Argon e lasciata a temperatura ambiente. Dopo 5 ore sotto costante
la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 ml di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto.
362 mg di mPEG-NHS (0,071 mmol; MW 5100 Da) vengono addizionati a una soluzione di 52,50 mg di beta-glutammico (0,357 mmol; MW 147,1 Da) in tampone borato 0,2 M pH 8. Dopo tre ore la soluzione viene acidificata a pH 3 con HC1 0,1 N, filtrata ed estratta con CHCI3(6 x 80 mi). La fase organica, anidrificata con Na2S04anidro, viene concentrata a 2-3 mi in rotavapor. Questa soluzione viene fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto.
La resa fu pari al 82%.
Step 2. Sintesi (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da.
I gruppi carbossilici di (COOH)2-BG-mPEG sono stati attivati via DCCI/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da.
286 mg dì (COOH)2-BG-mPEG (0,055 mmol; MW 5200 Da) sciolti in 10 mi di CH2CI2sono stati raffreddati a 4°C e sono stati quindi aggiunti di 19,00 mg di ΠΗS (0,165 mmol; MW 115,19 Da) e 68,90 mg di DDC (0,330 mmol; MW 206,33 Da). La miscela à ̈ stata mantenuta sotto atmosfera di lasciata a temperatura ambiente. Dopo 5 ore sotto costante agitazione, la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto.
254 mg di (NHS)2-BG-mPEG (0,047 mmol ; MW 5400 Da) vengono addizionati a una soluzione, precedentemente costituita, di 77,8 mg di DSPE (0,104 mmol; MW 748,06 Da) in 15 mi di CHCI3. Alla soluzione sì addizionano 28,98 Î1⁄4Î di Et3N (0,208 mmol; MW 101,19 Da). Si lascia reagire per 12 ore a 45°C. la soluzione viene filtrata e tirata a secco in rotavapor .
Step 3. Purificazione (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da.
Il residuo secco ottenuto dallo step 2 viene ripreso con acqua e dializzato contro acqua contenente 50 mM NaCl con una membrana di dialisi avente un cut-off di 100 kDa per eliminare il polimero che non ha reagito. Dopo 24 ore la soluzione del coniugato viene liofilizzata. Il coniugato liofilizzato viene caratterizzato mediante<1>H-NMR. Se di evidenzia la presenza di DSPE libera si prosegue con la seguente purificazione. Il coniugato viene sciolto in CHCI3e addizionato di un eccesso di 2 equivalenti di cloruro dell'acido laurico e di 1,5 equivalenti di Et3N per ogni equivalente di DSPE libera. Dopo 3 ore sotto costante agitazione, la soluzione viene filtrata su gooch e fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato purificato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto. Resa finale: 70%
Esempio 2: Preparazione di (DSPE)4-(BG)2-BG-mPEG 5000Da Step 1. Sintesi (COOH)«- (BG)2-BG-mPEG 5000Da.
I gruppi carbossilici attivati di (NHS)2-BG-mPEG (5400 Da), ottenuti come descritto allo step 2 dell'esempio 1, sono stati coniugati al gruppo amminico dell'acido β-glutammico, per ottenere il prodotto desiderato: (COOH)4- (BG)2-BG~mPEG 5000 Da.
383 mg di (NHS )2-BG-mPEG (0,071 mmol; MW 5400Da) vengono addizionati a una soluzione di 104.4 mg di beta-glutammico (0,71 mmol; MW 147,1 Da) in tampone borato 0.2 M pH 8. Dopo tre ore la soluzione viene acidificata a pH 3 con HC1 0.1 N, filtrata ed estratta con CHC13(6 x 80 mi). La fase organica, anidrificata con Na2S04anidro, viene concentrata a 2-3 mi in rotavapor. Questa soluzione viene fatta gocciolare in 150 mi di dietiletere sotto vigorosa agitazione. Il precipitato viene posto a 4°C per 6 ore e quindi filtrato su gooch ed essiccato sotto vuoto.
La resa fu pari al 80%.
Step 2. Sintesi e purificazione (DSPE )4- (BG)2-BG-mPEG 5000 Da.
I gruppi carbossilici di (COOH)4-(BG)2-BG-mPEG 5000 Da sono stati attivati via DCCI/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)4-(BG)2<_>BG-mPEG 5000 Da.
La reazione di coniugazione e la purificazione del prodotto vengono condotte come riportato allo step 2 e 3 dell'esempio 1, usando eccessi di DSPE e EtN3in proporzione ai carbossili attivati di (NHS)4-(BG)2-BG-mPEG. Resa finale: 65%
Esempio 3: Preparazione di (DSPE)4-(AG)4-mPEG 5000 Da
I gruppi carbossilici di (AG)n-mPEG 5000 Da, detto anche copolimero PEG-acido poliglutammico, con una valore medio di n di circa 4 sono stati attivati in situ via EDC/NHS e fatti reagire con il gruppo amminico della DSPE per ottenere il prodotto desiderato: (DSPE)4-(AG)4-mPEG 5000 Da.
400 mg di (AG)n-mPEG (0,073 nunol; MW 5500 Da) vengono sciolti in DMSO e addizionati di 112 mg di N'-(3-dimetilaminopropil )-N-etilcarbodimide HC1 (EDC) (0,584 mmol; MW 191,71 Da) e 50,45 mg di NHS (0,438 mmol ; MW 115,19 Da). Dopo tre ore questa soluzione viene addizionata a una soluzione dì 240,0 mg di DSPE (0,321 mmol; MW 748,06 Da) in CHCI3, ottenendo un rapporto DMSO/CHCI3do 3 : 1 (v/v). Alla soluzione si addizionano 89,48
(0,642 mmol; MW 101,19 Da). Si lascia reagire per 12 ore a 45°C. la soluzione viene filtrata e tirata a secco in rotavapor. Il residuo viene ripreso in acqua e il prodotto purificato come riportato allo step 3 dell'esempio 1.
Resa finale: 85%
Esempio 4 : Preparazione di una formulazione liposomiale comprendente uno dei coniugati oggetto della presente invenzione
I liposomi possono essere preparati con varie metodiche. In questo caso, come esempio non esclusivo, Ã ̈ riportato il metodo definito "d'evaporazione di un film sottile" ("thin layer evaporation" ).
Come farmaco modello à ̈ stata incorporata nella formulazione liposomiale 1' epirubicina, noto farmaco antitumorale, al fine di studiarne le cinetiche di rilascio dai liposomi e la farmacocinetica degli stessi in topi.
La metodica di seguito riportata à ̈ stata impiegata per preparare :
1) liposomi convenzionali, costituiti solo da fosfatidilcolina/colesterolo,
2) liposomi a lunga circolazioni, costituiti da fosfatidilcolina/colesterolo/DSPE-mPEG 5000 Da (prodotto commerciale per la preparazione di liposomi a lunga circolazione )
3) nuovi liposomi a lunga circolazione contententi uno dei coniugati oggetto della presente invenzione e in particolare sono stati preparate due formulazioni, una contenente fosfatidilcolina/colesterolo/ (DSPE )2-BG-mPEG 5000 Da e l'altra una contenente fosfatidi lcolina /colesterolo/ (DSPE)4- (BG)2- (BG)-mPEG 5000 Da.
In tabella 1 sono riportate le concentrazioni molari e i mg utilizzati per la preparazione dei diverse formulazioni liposomiali .
Ogni preparazione liposomiali viene preparata separatamente addizionando in un pallone la fosf atidilcolina , il colesterolo e seconda dei casi il coniugato amfifilico, sciolti in 3 ml di CHCI3. La miscela viene tirata a secco in rotavapor ed essiccata sotto vuoto. Il film sottile del residuo secco viene idratato con 2 mi di PBS contenente l'epirubicina . La miscela viene scaldata a 60°C (3 min) e agitata con vortex (3 min) per 3 volte e quindi posta in frigo a 4°C per 1 ora. La sospensione di lìposomi così ottenuta viene sonnicata in bagno di ghiaccio per 5 min e filtrata con un filtro 0,22 Î1⁄4m. Il filtrato viene purificato mediante GPC con resina sephadex G-50 su colonna (15 x 1 cm) eluita con PBS. I liposomi purificati sono impiegati per studi di rilascio del farmaco incorporato e per studi farmacocinetici.
Tabella 1. Composizioni delle formulazioni liposomiali preparate . 0 Formulazione Componente millimoli milligrammi liposomiale
Fosfatidilcolina 0,08 63
LIPO 1 Colesterolo 0,053 21
Epirubicina 0,007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63
DSPE-mPEG 5000 Da 0,0052 31
LIPO 2
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63 (DSPE)2-BG-mPEG 5000 Da 0,0052 35
LIPO 3
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4
Fosfatidilcolina 0,08 63
(DSPE)4- (BG) (BG)-mPEG44
LIPO 4 5000 Da
Colesterolo 0,053 21 Epirubicina 0,007 4
Esempio 5 : Studio di rilascio di epirubicina da liposomi preparati come riportato all'esempio 4.
Il rilascio del farmaco contenuto in ognuna delle soluzioni liposomiali ottenute come riportato all'esempio 4 à ̈ sta studiato ponendo 2 mi di una formulazione in una membrana da dialisi con cut-off lOOOODa e immersa in 100 mi di PBS. A tempi predeterminati sono stati eseguiti prelievi nella soluzione ricevente e il farmaco à ̈ stato valutato via RP-HPLC . Dall'elaborazione delle cinetiche di rilascio di epirubicina per ogni formulazione liposomiale si à ̈ dimostrato che la formulazione LIPO 4 presenta una velocità di rilascio inferiore a tutte le altre preparazioni (tabella 2). In particolare il rallentamento della cinetica di rilascio cresce all'aumentare del numero di fosfolipidi coniugati al PEG.
Tabella 2. T1⁄2di rilascio di epirubicina dale formulazioni liposomìali preparate come riportato all'esempio 4.
Rilascio di
epirubicina
Formulazione
tw
(ore)
LIPO 1 9,51
LIPO 2 9,57
LIPO 3 11,92
LIPO 4 30,10
Esempio 6: Studio della farmacocinetica delle formulazioni liposomiali preparate come riportato all'esempio 4.
Le formulazioni sono state testate direttamente come ottenute all'esempio 4 o dopo eventuale concentrazione della sospensione liposomiale mediante ultrafiltrazione con membrana a cut-off 60000 Da. La farmacocinetica à ̈ stata valutate in topi Balb-c del peso di 23 g. Gli animali sono stati trattati con una dose dì 3 mg/kg (epirubicina equiv.) iniettando attraverso la vena caudale 180 Î1⁄4Î di sospensione liposomiale. A intervalli stabili si sono prelevati 150 Î1⁄4Î di sangue dal bulbo retrooculare, che sono stati analizzati per determinarne il quantitativo di epirubicina. In tabella 3 sono riportati i principali parametri farmacocinetici che dimostrano la maggiore emivita piasmatica della formulazione LIP04, composta da liposomi contenenti (DSPE)4- (BG)2- (BG)-mPEG 5000 Da.
Tabella 3 . Principali parametri farmacocinetici di epirubìcina libera delle formulazioni liposomiali ottenute dall'esempio 4.
Composto/ formulazione t1⁄2a t1⁄2β CI (min) (min) (ml/min) Epirubicina 1,4 182,4 0,175 LIPO 1 18,7 163,1 0,2128 LIPO 2 19,6 206,9 0,4370 LIPO 3 7,95 1248,6 0,0579 LIPO 4 11 , 1 2783,1 0,0563
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Un coniugato comprendente almeno un polimero idrofilo legato attraverso un'unità ramificata (MF) a due o più fosfolipidi caratterizzato dal fatto che possiede la seguente formula: (PL)n-MF-Poll- [Pol2- (BM)Jy dove: y à ̈ 0 o 1, m = 1-10, n = 2-20 e in alcune forme preferite n≥2 oppure n≥3 oppure n≥4 oppure n≥5 oppure n≥6, oppure n≥10 PL à ̈ un fosfolipide, MF à ̈ una unità ramificante presentante residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni PL o Poli, Poli à ̈ un polimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale, Pol2 e BM possono essere presenti o assenti, Pol2, se presente, à ̈ una molecola ramificante che presenta residui funzionalizzabili per legare direttamente o attraverso altre porzioni BM $ Pol1, BM, se presente, à ̈ una molecola direzionante, e le differenti porzioni sono coniugate, preferibilmente attraverso legami esterei, ammidici, carbammici, eterei, tioeterei, dissolfuro o altri legami covalenti, direttamente o attraverso uno o più spaziatori, gli spaziatori preferibilmente scelti tra gruppi alchilici, quali NH2-(CH2)n-NH2 (n=0-12) o HOOC-(CH2)m-COOH (m=0-12), gruppi aromatici o molecole idrolizzabili in funzione del pH o peptidi (quali Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Leu-Phe-Gly) idrolizzabili da specifici enzimi lisosomiali. Un coniugato come nelle rivendicazioni 1, dove i fosfolipidi (PL) possiedono la formula generale: R1- -O— CH, R2- -O-CH O Cl-L-O-P-O— R3 <2>I o RI e R2 sono indipendentemente un gruppo alchilico, saturo o insaturo, preferibilmente comprendente da 1 a 22 carboni, eventualmente sostituito con uno o più gruppi preferibilmente selezionati tra un gruppo ossi, un gruppo idrossilico o amminico, R3 à ̈ un legame o qualsiasi gruppo che permette la coniugazione del PL con MF, come ad esempio, ma non esclusivamente, etanolammina, serina, glicerolo. 3. Un coniugato come nelle rivendicazione 2, dove i fosfolipidi sono preferibilmente, ma non esclusivamente scelti tra distearil-fosfaditil-etanolammina (DSPE), dipalmitoil-fosfatidil-etanolammina (DPPE), dimiristoilfosfatidil-etanolammina (DMPE), dioleoil-fosfatidiletanolammina (DOPE), dielaidoil-fosfatidil-etanolamina (DEPE), distearil-fosfaditil-serina (DSPS), dipalmitoil-fosfaditilserina (DPPS), dimiristoil-fosfaditil-serina (DMPS), dioleoilfosfatidil-serina (DOPS), dimiristoil-fosfatidil-etanolammina (DMPE), distearil-fosfaditil-glicerolo (DSPG), dipalmitoilosfaditil-glicerolo (DPPG), dimiristoil-fosfaditil-glicerolo (DMPG). 4. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove il numero (n) di molecole di PL à ̈ n>l, oppure n≥2 oppure n≥3 oppure n≥4 oppure n≥5 oppure n≥6, oppure n≥10,e dove n compreso preferibilmente da 2 a 20, e più preferibilmente da 2 a 8 e ancora più preferibilmente da 2 a 4 o da 3 a 4. 5. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove Poli à ̈ un polimero o copolimero idrofilo solubile in acqua, sintetico o naturale, che possiede almeno un gruppo funzionale per la coniugazione a MF, essendo tale polimero preferibilmente poli (etilenglicole), polivinilpirrolidone, N-idrossi-etil metacrilammide copolimero, poliossazolina, poliacriloilmorfolina, acido poliglutammico, acido ialuronico, acido polisialico. 6. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove almeno una delle unità ramificanti MF o Pol2 à ̈ una molecola ramificante tri- o tetra- funzionale, o un polimero polifunzionale o una struttura dendrimerica. 7. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove almeno una delle unità ramificanti MF o Pol2 à ̈ una molecola selezionata preferenzialmente tra acido glutammico, acido aspartico, acido β-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, lisina o 3-idrossi 2 ammino propanolo o un altro acido amminobicarbos silice e amminotricarbossilico . Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove almeno una delle unità ramificanti MF o Pol2 à ̈ un polimero polifunzionale preferibilmente selezionato tra l'acido poliaspartico, acido poliglutammico, poli(idrossi etilaspartammide) , poli(idrossi etilglutammide) , poli(idrossi propilmetacrilammide) e polilisina, e nelle situazioni preferite, il polimero polifunzionale ha un peso molecolare tra i 500 e i 5000 Da. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove almeno una delle unità ramificanti MF o Pol2 à ̈ un dendrimero che à ̈ costituito nella porzione ramificata da acido glutammico, acido aspartico, acido β-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, lisina o 3-idrossi 2 ammino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico e amminotricarbossilico. 1 . Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove y =1, Pol2 à ̈ assente o à ̈ una molecola ramificante scelta tra acido glutammico, acido aspartico, acido β-glutammico, acido omoglutammico, acido amminoadipico, 3-idrossi 2 ammino propanolo o un altro acido amminobicarbossilico o amminotricarbossilico e dove BM à ̈ scelto tra un peptide, un anticorpo monoclonale, un frammento di anticorpo, biotina, un ormone o uno zucchero. Un coniugato come in una qualsiasi delle rivendicazioni precedenti dove y = 0 avente la formula generale: (PL)n-MF-Poll Un coniugato come nella rivendicazione 11 dove Poli à ̈ un polimero idrofilo scelto preferibilmente tra poli(etilenglicole), polivinilpirrolidone, poliacriloilmorfolina, poliossazolina, e più preferibilmente Poli à ̈ un derivato di poli(etilenglicole) (PEG), lineare o branched, monofunzionale, con un peso molecolare medio tra i 1000 e i 40000 Da, ancora più preferibilmente tra 2000 e 10000 Da. Alcuni Poli preferiti sono mPEG-OH 3400Da, mPEG-COOH 3400Da, mPEG-OH 5000 Da, mPEG-COOH 5000 Da. Un coniugato come nella rivendicazioni 11 o 12 dove Poli à ̈ mPEG-COOH 3400Da o mPEG-COOH 5000 Da, MF à ̈ acido βglutammico, n=2 e PL à ̈ DSPE, avente la formula: 01⁄2—O— Ρ— O-CHj—CHj-NH O— — O-CHj-GH—NH (DSPE)2-BG-mPEG (PEG MW a 2000 Da, 3400 Da o 5000 Da) Un coniugato come nella rivendicazioni 11 o 12 dove Poli à ̈ seclto tra mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-COOH 3400 Da e mPEG-COOH 5000 Da, MF à ̈ una struttura à ̈ una struttura dendimerica basata sull'acido beta-glutammico (BG), n=4 e PL à ̈ DSPE, e avente la formula: CHj—0—P—0 <2>~NH. CH,— O — P — O mPEG o· O-CH— CHj— NH .O— CH. â– O— CH. (DSPE)4-(B6)2~ (B6)- mPEG (PEG MW = 2000 Da, 3400 Da o 5000 Da) 15. Un coniugato come nella rivendicazioni 11 o 12 dove Poli à ̈ scelto tra mPEG-COOH 2000 Da, mPEG-COOH 3400Da o mPEG-COOH 5000 Da, MF à ̈ un omopolimero basato sull'acido glutammico (AG), PL à ̈ DSPE e n=2 o n=4, avente rispettivamente le formule: NH— mPEG 0=p— o 0= P— O CH.-CH-CH. Ή-CH. O O O O o o (DSPE)2-(AG)2-mPEG (PEG MV = 2000 Da, 3400 Da o 5000 Da) NH— mPEG 0=P— O 0=P— O 0=P— O 0=P— O IH-CH. ;H,-CH-CH. H-CH. ;H-CH. O 0 o o 0 0 o o o o o o (DSPE)4-(AG)4-mPEG (PEG MW = 2000 Da, 3400 Da o 5000 Da) Una preparazione farmaceutica o diagnostica comprendente un coniugato come definiti in qualsiasi delle rivendicazione 1-15, preferibilmente in una percentuale molare compresa tra 1 e 100%, e più preferibilmente tra 1 e 30%, e ancora più preferibilmente tra 1 e 10% dei lipidi della formulazione stessa, e comprendente preferibilmente anche un agente terapeuticamente attivo o un agente diagnostico, e opzionalmente anche un eccipiente farmaceuticamente accettabile . 17. Una preparazione come definita nella rivendicazione 16 comprendente liposomi o micelle, e deve nel caso in cui siano presenti liposomi, i liposomi presentano preferibilmente un gradiente di pH, più alto all'interno, circa 7,6-9, e più basso all'esterno, circa 6-7,5. La preparazione delle rivendicazioni 16 e 17 per uso orale, parenterale, rettale, topico, vaginale, oftalmico o inalatorio . Uso di un coniugato secondo qualsiasi delle rivendicazioni 1-15, come additivo per stabilizzare formulazioni farmaceutiche in forma liposomiale e/o per minimizzare la fuoriuscita di un farmaco contenuto nei liposomi di una preparazione farmaceutica e/o per aumentare l'emivita piasmatica di un farmaco. Un metodo di trattamento o un metodo di diagnosi comprendente la somministrazione di una formulazione secondo qualsiasi delle rivendicazioni 16-18. Metodo per la preparazione di una formulazione farmaceutica o diagnostica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16-18 comprendente un agente terapeuticamente attivo o un agente diagnostico, il metodo comprendente i seguenti passaggi: a) Solubilizzazione di un fosfolipide e di un coniugato secondo qualsiasi delle rivendicazioni 1-15 in un solvente organico, preferibilmente etanolo; b) Nel caso in cui la molecola terapeuticamente attiva o l'agente diagnostico siano una sostanza solubile in solvente organico, e non vengano solubilizzati in acqua secondo il punto e), addizione dell'agente alla soluzione organica ottenuta al punto a); c) Opzionalmente, aggiunta sotto agitazione di un agente viscosizzante, preferibilmente glicerolo; d) Sterilizzazione della soluzione ottenuta mediante filtrazione con membrane sterilizzanti preferibilmente di PTFE con un cutoff di 0,22 micron; e) Nel caso in cui la molecola terapeuticamente attiva o l'agente diagnostico siano sostanze solubili in acqua, e non siano state aggiunte alla soluzione organica secondo il punto b), solubilizzazione di questi agenti in acqua, e sterilizzazione attraverso membrane sterilizzanti preferibilmente di PTFE con un cut-off di 0,22 micron; f)Aggiunta della soluzione ottenuta al punto e), o dove necessario, aggiunta di acqua sterile, alla soluzione del punto d) e agitazione vigorosa preferibilmente per almeno 20 minuti e preferibilmente ad una temperatura compresa tra 20 e 25°C, per ottenere la formulazione di liposomi; g)Omogeneizzazione della miscela risultante con un processo quale l'estrusione o la filtrazione con membrane per uniformare i liposomi e opzionalmente purificazione per dialisi o gel-filtrazione; h) Diluizione della sospensione purificata con acqua sterile per iniezioni per ottenere il volume finale desiderato.
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| DE19851239A1 (de) * | 1998-11-06 | 2000-05-11 | Aesculap Ag & Co Kg | Sterilisierbehälter |
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Non-Patent Citations (2)
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| PRINCIPE ET AL.: "PEG Branched Polymer for Functionalization of Nanomaterials with Ultralong Blood Circulation", J. AM CHEM. SOC., vol. 131, 27 January 2009 (2009-01-27), pages 4783 - 4787, XP002561286 * |
Also Published As
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