BRPI0608768B1 - Uso de um peptídio nativo para a produção de uma composição medicinal, processo para a obtenção in vitro de ctls com elevada avidez por um peptídio nativo e kit de vacinação - Google Patents
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Abstract
uso de peptídios nativos e seus derivados otimizados para vacinação. a presente invenção refere-se ao campo de vacinação e, mais particularmente, aos campos de vacinação antitumora! e antiviral. a invenção se refere ao uso de um peptídio nativo em uma composição medicinal para a seleção e/ou reforço de parte da resposta imune de gil que tenha sido iniciada por um peptídio imunogênico otimizado derivado do dito peptidio nativo. a invenção também se refere a kits de vacinação que compreendem várias doses de peptídios otimizados e seus peptídios nativos cognatos.
Description
A presente invenção refere-se ao campo de vacinação e, mais particularmente, aos campos de vacinação antitumoral e antiviral. A invenção refere-se ao uso de um peptídio nativo em uma composição medicinal para a seleção e/ou reforço de parte da resposta imune de CTL que tenha sido iniciada por um peptídio imunogênico otimizado derivado do dito peptídio nativo.
A imunoterapia de câncer se destina a estimular linfócitos T citotóxicos (CTL) que reconhecem peptídios derivados de antígenos tumorais e apresentados na superfície da célula tumoral por moléculas de HLA classe I. Peptídios alvo de CTL podem ser dominantes ou crípticos (Moudgil e Sercarz 1994). Peptídios dominantes têm elevada afinidade por HLA e são freqüentemente apresentados por células tumorais. Em contraste, peptídios crípticos têm baixa afinidade por HLA e raramente são apresentados por células tumorais. Todas as vacinas de câncer até agora testadas visaram a peptídios dominantes, com sucesso relativamente baixo (Slingluff, Yamshchikov et al. 2001; Knutson, Schiffman et al. 2002; Schaed, Klimek et al. 2002; Parkhurst, Riley et al. 2004; Vonderheide, Domchek et al. 2004). Estudos usando modelos de camundongo mostraram que essa falta de eficácia é devida à tolerância a antígenos tumorais e particularmente a seus peptídios dominantes (Cibotti, Kanellopoulos et al. 1992; Theobald, Biggs et al. 1997; Colella, Bullock et al. 2000; Hernandez, Lee et al. 2000; Grossmann, Davila et al. 2001; Gross, Graff-Dubois et al. 2004).
Para superar essa tolerância, recentemente propôs-se a vacinação com peptídios crípticos. Observou-se que, em camundongos humanizados, a tolerância de peptídios crípticos era fraca ou ausente, e que peptídios crípticos induziam eficientemente a imunidade antitumoral in vivo, contanto que sua imunogenicidade tenha sido otimizada (Tourdot, Scardino et al. 2000; Scardino, Gross et al. 2002; Gross, Graff-Dubois et al. 2004). Uma modificação de seqüência de peptídio que otimize a imunogenicidade de
Petição 870180165109, de 19/12/2018, pág. 4/12
ΟΥ quase todos os peptídios HLA-A*0201 -restringidos de baixa afinidade testados foi anteriormente descrita (Tourdot, Scardino et al. 2000).
TERT572Y é um peptídio críptico otimizado associado a HLAA*0201 derivado de TERT, um antígeno superexpressado por 85% dos tu- mores humanos (Kim, Piatyszek et al. 1994). TERT572 está presente tanto em TERT humano, quanto murídeo, e TERT572y foi capaz de induzir imunidade antitumoral em camundongos transgênicos HLA-A*0201; entretanto, não se observou nenhuma auto-imunidade contra tecidos que expressam TERT normais (Gross, Graff-Dubois et al. 2004). In vitro, TERT572Y estimulou
CTLs antitumorais tanto de doadores saudáveis, quanto de pacientes com câncer de próstata. CTLs mataram células tumorais que expressavam TERT, mas não células normais que expressavam TERT (Hernandez, Garcia-Pons et al. 2002; Scardino, Gross et al. 2002).
Entretanto, em uma abordagem de vacinação similar, relatou-se que a vacinação de pacientes com melanoma com gp10Q209M otimizado levou à amplificação de células T que não eram mais capazes de reconhecer o peptídio gp1002o9 nativo ou células de melanoma que expressavam gp100 (Clay, Custer et al. 1999).
Portanto, há atualmente necessidade de um protocolo de vaci20 nação que permita 0 início e a manutenção de uma resposta de células T direcionada a epítopos subdominantes ou crípticos, particularmente quando essa resposta é iniciada por peptídios otimizados.
O estudo apresentado no exemplo 1 abaixo foi projetado para avaliar: i) a capacidade de TERT572Y de estimular uma resposta imune antiiV25 tumoral in vivo em pacientes com câncer avançado; e ii) 0 risco de induzir auto-imunidade contra células e tecidos normais que expressam TERT, como precursores hematopoiéticos, intestino, timo e fígado. A vacinação de pacientes com câncer avançado com TERT572Y estimulou CTLs específicos que eram completamente funcionais e capazes de matar in vitro células tu30 morais que superexpressavam TERT. Além disso, a vacinação era segura e não induziu nenhuma auto-imunidade contra tecidos normais TERT positivos. Essa é a primeira demonstração in vivo em seres humanos de que pep tídíos ciípticos otimizados podem ser considerados para imunoterapia de tumores.
Além do mais, esses resultados, assim como aqueles apresentados nos Exemplos 2, 3 e 4, mostram que a injeção de um peptídio nativo, após a vacinação com seu peptídio otimizado cognato, pode manter a resposta imune iniciada pelo dito peptídio otimizado. Sem nos limitarmos a uma teoria, pode-se teorizar que o uso do peptídio nativo permite selecionar e/ou reforçar, entre as células T recrutadas pelo peptídio otimizado, aquelas com a maior especificidade para o peptídio nativo apresentado pelas células tumorais.
Esses achados permitem propor o uso de um peptídio críptico ou não otimizado nativo para melhorar a resposta imune de CTL gerados por um peptídio otimizado cognato.
Um peptídio críptico para uma dada molécula de MHC é um peptídio que é capaz de se ligar à dita molécula de MHC, mas apenas com uma fraca afinidade pela molécula de MHC e/ou uma fraca estabilidade do complexo MHC/peptídio. Como resultado, esse peptídio é apenas fracamente apresentado pela dita molécula de MHC na superfície de uma célula apresentadora de antígeno e, portanto, participa apenas levemente, ou não, na resposta de CTL ao antígeno do qual o dito peptídio é derivado. Por exemplo, no caso de HLA A2, peptídios crípticos podem ser definidos como peptídios que tenham uma baixa afinidade e uma fraca capacidade de estabilização (RA > 5 e DC50 < 2 horas), conforme descrito em WO 0208716.
Um peptídio nativo (críptico ou não) é um peptídio que corresponde a um fragmento de um antígeno, sem nenhuma modificação de seqüência.
Um peptídio otimizado para um dado peptídio nativo é um peptídio obtido por uma ou várias substituições de aminoácidos no dito peptídio nativo, as ditas modificações resultando em maior afinidade pela molécula de MHC e/ou maior estabilidade do complexo de MHC/peptídio. Por exemplo, peptídios associados a HLA-A2.1 podem ser otimizados por modificação de sua seqüência mediante introdução de uma tirosina na primeira posição oe>
(substituição P1Y) (Tourdot, Scardino et al. 2000). Um método para identificar peptídios crípticos e gerar peptídios otimizados cognatos é apresentado, por exemplo, no PCT WO 02/08716, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência. Outras modificações para otimização de peptídios HLA A2 tam- bém foram descritas, como a substituição do aminoácido na posição 2 por uma metionina ou uma leucina (Parkhurst, Salgaller et al. 1996; Bakker, van der Burg et al. 1997; Valmori, Fonteneau et al. 1998), ou a substituição do aminoácido C-terminal por uma valina ou uma leucina (Parkhurst, Salgaller et al. 1996). Essas modificações de peptídios podem ser feitas para se obter peptídios otimizados que realizar a presente invenção.
Um peptídio críptico não é capaz de gerar in vitro uma resposta de CTL específica contra células alvo que expressem a proteína da qual é derivado. Em contraste, o peptídio otimizado cognato é capaz de gerar uma resposta de CTL específica contra as mesmas células alvo, em que pelo menos parte dos CTLs têm uma elevada avidez pelo dito peptídio críptico.
Um objeto da presente invenção é o uso de um peptídio nativo para a produção de uma composição medicinal para manutenção da resposta imune de CTL iniciada por seu peptídio otimizado cognato. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o peptídio nativo é subdominante ou críptico.
A presente invenção é particularmente útil no domínio da imunoterapia antitumoral ou antivíral. Portanto, o peptídio nativo é vantajosa mente de um antígeno tumoral ou de um antígeno viral, particularmente de um antígeno de um vírus que produza infecções de longa duração, como HIV, HCV λ25 e HBV.
De acordo com a invenção, pode-se usar um peptídio nativo para vacinação de pacientes que tenham recebido anteriormente um peptídio otimizado cognato.
A presente invenção engloba, portanto, um método para a vaci30 nação de um paciente contra um antígeno tumoral ou viral, em que o dito método compreende uma primeira etapa de vacinação com um peptídio otimizado cognato de um peptídio nativo do dito antígeno, particularmente um
peptídio críptico, seguido por uma segunda etapa de vacinação com o dito peptídio nativo.
Um exemplo de vacinação antitumoral usando o peptídio críptico nativo TERT572 (RLFFYRKSV) e seu peptídio otimizado cognato TERT572Y 5 (YLFFYRKSV) é dado a seguir no Exemplo 1.
De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o peptídio críptico é apresentado por HLA A2, e o peptídio otimizado resulta da substituição do aminoácido N-terminal do dito peptídio críptico com um resíduo tirosina. Exemplos não limitativos de pares de peptídios crípticos e pep10 tídios otimizados, apresentados por HLA A2, e que podem ser usados na presente invenção são descritos no PCT WO 02/08716 e na Tabela 1 abaixo. Outros pares de peptídios nativos e otimizados cognatos que podem ser usados de acordo com a presente invenção também são apresentados na Tabela 1.
| Peptídio nativo | Peptídio otimizado | Referência | ||||
| Nome | Seqüência | N8 | Nome | Seqüência | N8 | |
| HIVgag7e | SLYNTVATL | 13 | HlVgag76Yi | YLYNTVATL | 14 | WO 0208716 |
| FIuMm | GIGLFVFTL | 11 | FIuMssy! | YIGLFVFTL | 12 | |
| HBVP0I575 | FLLSLGIHL | 15 | HBVpol57SYi | YLLSLGIHL | 16 | |
| HBVpoU | LLGCAANWIL | 17 | HBVpOl765Y1 | YLGCAANWIL | 18 | |
| Mart-127 | AAGIGILTV | 19 | Mart-127Y1 | YAGIGILTV | 20 | |
| Mart'126 | EAAGIGILTV | 21 | Mart-126L27 | ELAGIGILTV | 22 | Valmori.D., 1998 |
| Gp 100177 | AMLGTHTMEV | 23 | Gp100 177Y1 | YMLGTHTMEV | 24 | WO 0208716 |
| GplOOvs | MLGTHTMEV | 25 | Gp100 178Y1 | YLGTHTMEV | 26 | |
| Gp100iM | KTWGQYWQV | 8 | Gp100 154Y1 | YTWGQYWQV | 9 | |
| Gp100 184M155 | KMWGQYWQV | 10 | Bakker, A.B., 1997 | |||
| Gp1OOs7o | SLADTNSLAV | 27 | Gp100 570Y1 | YLADTNSLAV | 28 | WO 0208716 |
| GplOOaog | TDQVPFSV | 29 | Gp100 209Y1 | YDQVPFSV | 30 | |
| Gp100 209M210 | YMQVPFSV | 31 | Parkhust, M.R., 1996 | |||
| Gp10047e | VLYRYGSFSV | 32 | Gp100 476Y1 | YLYRYGSFSV | 33 | WO 0208716 |
| Gp10045? | LLDGTATLRL | 34 | Gp100 457Y1 | YLDGTATLRL | 35 | |
| HER-2/neu79g | QLMPYGCLL | 36 | HER-2/neu799Yi | YLMPYGCLL | 37 | |
| HER-2/neu369 | KIFGSLAFL | 38 | HER-2/neu369Yi | YIFGSLAFL | 39 | |
| HER*2/neu789 | CLTSTVQLV | 40 | HER-2/neu7B9Yi | YLTSTVQLV | 41 | |
| HER-2/neu4a | HLYQGCQW | 42 | HER-2/neu48Yi | YLYQGCQW | 43 | |
| HER-2/neu773 | VMAGVGSPYV | 44 | HER-2/neu773vi | YMAGVGSPYV | 45 | |
| HER-2/neUs | ALCRWGLL | 46 | HER-2/neuSYi | YLCRWGLL | 47 | |
| HER-2/neue5i | VLVKSPNHV | 48 | HER-2/neU85iYi | YLVKSPNHV | 49 |
Continuação
| Peptídio nativo | Peptídio otimizado | Referência | ||||
| Nome | Seqüência | Nc | Nome | Seqüência | Ns | |
| HER-2/neu66i | ILLVWLGV | 50 | HER-2/neUç6iYi | YLLVWLGV | 51 | |
| HER-2/neU650 | PLTSIISAV | 52 | HER-2/neu65oYi | YLTSIISAV | 53 | |
| HER-2/neu466 | ALIHHNTHL | 54 | HER-2/neu466vi | YLIHHNTHL | 55 | |
| HER-2/neu4o! | TLEEITGYL | 56 | HER-2/neu4o2Yi | YLEEITGYL | 57 | |
| HER-2/neu3gi | PLQPEQLQV | 58 | HER-2/neu39iYt | YLQPEQLQV | 59 | |
| HER-2/neug7i | ELVSEFSRM | 60 | Η E R-2/neug7i yi | YLVSEFSRM | 61 | |
| HBVpoJpe | LLDDEAGPL | 62 | HBVpol28yi | YLDDEAGPL | 63 | |
| HBVpolsw | PLEEELPRL | 64 | HBVpols94Yi | YLEEELPRL | 65 | |
| HBVpolaBs | NLQSLTNLL | 66 | HBVpoUy, | YLQSLTNLL | 67 | |
| EphA2ei | DMPIYMYSV | 68 | EphA2 61Y1 | YMPIYMYSV | 69 | WO 03091383 |
| HER29ii | TVWELMTFGA | 70 | HER911Y1V10 | YVWELMTFGV | 71 | WO 03083124 |
| HER4gn | TíWELMTFGG | 72 | ||||
| HER18u | TVWELMTFGS | 73 | ||||
| HER2722 | KVKVLGSGA | 74 | HER722Y1V9 | YVKVLGSGV | 75 | |
| HER3722 | KLKVLGSGV | 76 | ||||
| HER4722 | RVKVLGSGA | 77 | ||||
| HERI722 | KIKVLGSGA | 78 | ||||
| HER2845 | DLAARNVLV | 79 | HER845Y1 | YLAARNVLV | 80 | |
| HER3845 | NLAARNVLL | 81 | ||||
| HER2904 | DVWSYGVTV | 82 | HER904Y1 | YVWSYGVTV | 83 | |
| HER49M | DVWSYGVTI | 84 | ||||
| HER2m3 | DLLEKGERL | 85 | HER933Y1 | YLLEKGERL | 86 | |
| HERI933 | SILELKGERL | 87 | ||||
| HER2945 | PICTIDVYMI | 88 | HER945Y1 | YICTiDVYMV | 90 | |
| HER3945 | QICTIDVYMV | 89 | ||||
| HER4945 | PICTIDVYMV | 91 | ||||
| HERIws | PICTIDVYKI | 92 | ||||
| MAGE-A248G9 | YLEYRQVPG | 7 | MAGE-A248V9 | YLEYRQVPV | 6 | |
| MAGE-Aj48D9 | YLEYRQVPD | 5 | ||||
| TERTbbs | DLQVNSLQTV | 3 | TERT986Y1 | YLQVNSLQTV | 4 | WO 0208716 |
| tert572 | RLFFYRKSV | 1 | TERTs72Y1 | YLFFYRKSV | 2 |
Tabela 1: Exemplos de pares de peptídios nativos e otimizados, apresentados por HLA A2, que podem ser usados de acordo com a invenção.
Outro aspecto da presente invenção é um processo para obten- ção in vitro de CTLs com elevada avidez por um peptídio nativo, particularmente um peptídio críptico nativo, por estimulação, com o dito peptídio nativo, dos CTLs que estejam presentes em uma amostra biológica de um paciente que tenha sido imunizado com um peptídio otimizado cognato. Nesse 10 processo, os peptídios nativos e otimizados são vantajosamente conforme acima descritos.
A presente invenção também se refere a um kit de partes para a vacinação, compreendendo pelo menos uma dose de um peptídio nativo e pelo menos uma dose de seu peptídio otimizado cognato. Em uma modalidade preferida, o kit de vacinação compreende 2 ou 3 doses de peptídio otimizado, e 3, 4, 5 ou 6 doses de peptídio nativo. Um kit de vacinação particular de acordo com a invenção é adaptado para a primeira seqüência de vacinação de 6 injeções, e compreende 2 ou 3 doses de peptídio otimizado, e 4 ou 3 doses de peptídio nativo. No caso de doenças de longa duração, é preferível manter o nível de imunidade obtido após essa primeira vacinação por novas chamadas regulares. Isso pode ser feito, por exemplo, por injeções realizadas a cada 3 a 6 meses. Conseqüentemente, kits complementares compreendendo pelo menos 2 doses, e até 40 ou 50 doses de peptídio nativo, também são parte da presente invenção. Alternatívamente, o kit de vacinação pode compreender 2 a 3 doses de peptídio otimizado, e 3 a 40 ou até 50 doses de peptídio nativo. Evidentemente, os ditos peptídios nativos e otimizados presentes no kit são conforme acima descritos.
Cada dose compreende entre 0,5 e 10 mg de peptídio, de preferência de 1 a 5 mg. Em uma modalidade preferida, cada dose é formulada para injeção subcutânea. Por exemplo, cada dose pode ser formulada em 0,3 a 1,5 mL de uma emulsão de solução aquosa emulsificada com Montanide, usado como um adjuvante. Aqueles versados na técnica podem escolher qual(is)quer outro(s) adjuvante(s) no lugar do (ou além do) Montanide. Em uma modalidade particular, as doses estão na forma de uma solução aquosa. Alternativamente, as doses podem estar na forma de um peptídio liofilizado, para preparação extemporânea da solução líquida a ser injetada.
A invenção é adicíonalmente ilustrada pelas seguintes figuras e exemplos.
LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1: Células CD8 TERT572Y-específicas detectadas ex vivo nos pacientes n91, n9 3, n9 8, n9 11 e n9 13. PBMC descongeladas dos pacientes n9 1, n9 8, n9 11 e n9 13 coletadas antes da vacinação e depois das segunda (η- 1, ns 8,η211) e sexta (ne 13) injeções de vacina foram tingidas com o tetrâmero TERT572Y marcado com PE, anti-CD8 marcado com APC e anti-CD3 marcado com FITC. Células com porta CD3+ foram analisadas.
Figura 2: Células CD8 TERT572Y-específicas detectadas após estimulação in vitro de PBMC dos pacientes ne 6 e ns 18. PBMC descongeladas dos pacientes ns 6 e ns 18 foram cultivadas na ausência (não estimuladas) ou presença (estimuladas de 10 μΜ de TERT572y durante nove dias. As células foram, então, tingidas e analisadas conforme descrito na legenda da figura 1.
Figura 3: Curso temporal das respostas imunes.
Figura 4: Análise funcional de células CD8 TERT572Yespecíficas induzidas por vacinação:
A) PBMC do paciente ns 4, coletadas três semanas após a segunda injeção de vacina, foram estimuladas in vitro com peptídio TERT572y durante nove dias. Células TERT672y específicas foram purificadas e amplificadas com PHA. Células amplificadas foram tingidas com tetrâmero TERT572Ye CD8 mAb.
B) Células positivas para o tetrâmero TERT572y foram estimuladas com TERT572Y e peptídios FluM58 irrelevantes durante 6 horas, en- tão, tingidas com anti-CD107a marcadas com PE, permeabilizadas com Saponina e tingidas com anti-IFNy marcado com FITC para avaliar IFNy intracelular.
C) Células positivas para o tetrâmero TERT572Y foram incubadas com N418 marcado com 51Cr e células N418 transfectadas com TERT λ25 durante quatro horas em um ensaio clássico de liberação de 51 Cr. As razões E/T estão indicadas.
D) Cpélulas positivas para 0 tetrâmero TERT572y foram incubadas com NA8 marcado com 51Cr e células tumorais ME290 durante quatro horas em um ensaio clássico de liberação de 51Cr. As razões E/T estão indi- cadas.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Segurança e imunogenicidade do peptídio críptico otimizado TERT572Y em pacientes com malignidades avançadas: Estudo clínico de Fase I
1.1. Pacientes e métodos
Pacientes
Pacientes com tumores malignos resistentes a quimioterapia eram elegíveis para 0 estudo. Outros critérios de elegibilidade foram: doença progressiva para a qual não havia outra opção terapêutica de benefício comprovado; uma sobrevida esperada de pelo menos 6 meses; os pacientes tinham de ser HLA-A*0201 positivos; idade de 18 - 75 anos, status de desempenho (OMS) < 2, medula óssea adequada (contagem absoluta de neutrófilos > 1.500/mm3; contagem absoluta de linfócitos >_1.300/mm3; plaquetas > 100.000/mm3; Hgb > 10 g/dL), função renal (creatinina < 1,5 mg/dl_) e hepática (bilirrubina < 1,5 vezes o valor normal superior). Os pacientes eram excluídos se tivessem recebido quimioterapia, radioterapia, hormonoterapia, imunoterapia ou corticosteróides até um mês antes do alistamento ou se tivessem uma imunodeficiência ou doença auto-imune conhecida. O protocolo foi aprovado pelos Comitês de Ética e Científicos do Hospital Universitário de Heraklion e a Administração Nacional de Medicamentos da Grécia. Todos os pacientes deram seu consentimento informado por escrito para participar no estudo.
Preparação da vacina de peptídio
A vacina consistia nos peptídios otimizado TERT572Y (YLFFYRKSV) e nativo TERT572 (RLFFYRKSV), emulsificados em Montanide ISA51 (Seppic Inc, França). Os peptídios de vacina foram sintetizados na Faculdade de Farmácia, Universidade de Patras (Grécia) por meio de química Fmoc/Bu em fase sólida. Os estudos para assegurar a qualidade incluíram confirmação de identidade, esterilidade e pureza ((> 95% para ambos os peptídios). Nenhuma diminuição de pureza ou concentração foi observada depois de mais de dois anos de armazenamento a -80°C. Cada peptídio foi preparado como um pó liofilizado para reconstituição e diluição em água estéril.
Protocolo de vacinação
Os pacientes receberam um total de seis vacinações subcutâneas administradas a cada 3 semanas. Peptídios em 0,5 mL de solução aquosa foram emulsificados com 0,5 mL de Montanide ISA51 imediatamente 5 antes de serem injetados. O peptídio otimizado TERT572Y foi usado para as primeiras 2 vacinações e o peptídio nativo TERT572 para as 4 vacinações restantes. Cinco níveis de dose dos peptídios foram estudados; os níveis de dose incluíam 2, 3, 4, 5 e 6 mg de ambos os peptídios. Três pacientes entraram em cada nível de dose. Planejou-se que mais 3 pacientes fossem alis10 tados no nível de dose em que se observasse um evento limitativo de dose.
Cada paciente recebeu a mesma dose de peptídio para todas as seis vacinações. Nenhum outro tratamento com possível atividade antitumoral, isto é, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal ou administração de corticosteróides, foi permitido no decorrer da vacinação.
Avaliação dos pacientes
Antes de entrar no estudo, todos os pacientes foram avaliados por histórico médico completo, exame físico e contagem completa de células sanguíneas com medições diferenciais, de química sérica e basais de marcadores tumorais relevantes. Além disso, a doença mensurável foi determi20 nada por procedimentos padronizados de formação de imagem (radiografia de tórax, ultra-som, tomografia computadorizada de tórax e abdômen, imagem de ressonância magnética (MRI), caso indicado, e varreduras ósseas no corpo todo). A toxicidade durante o protocolo de vacinação foi avaliada repetindo-se a contagem completa de células sangüíneas semanalmente e λ25 efetuando-se um histórico médico, exame físico e química sérica a cada três semanas, antes de cada injeção subsequente, durante o período de vacinação e cada mês depois disso, durante o acompanhamento. A toxicidade foi avaliada e classificada usando os Critérios de Toxicidade Comuns do Instituto Nacional do Câncer (NCI) (Ajani, Welch et al. 1990). A toxicidade limitativa 30 de dose (DLT) foi avaliada durante todo o protocolo de vacinação e foi definida como a ocorrência de qualquer um dos seguintes: toxicidade hematológica de grau 4; neutropenia de grau 3 - 4 com febre > 38,2°C; toxicidade não
hematológica de grau 3 - 4; e qualquer atraso de tratamento por causa da toxicidade. A escalação da dose foi descontinuada, e o nível de dose DLT era atingido se pelo menos 50% dos pacientes tratados nesse nível desenvolvessem DLT. O nível de dose MTD foi definido como o primeiro nível abaixo do nível de dose DLT.
A resposta ao tratamento foi avaliada repetindo-se os estudos de imagem basais e as medições de marcadores de tumor relevantes após cada 2 vacinações ou antes se clinícamente indicado. A resposta ao tratamento foi classificada como resposta completa (CR), resposta parcial (PR), doença estável (SD) e doença progressiva (PD) usando-se critérios padornizados da OMS (Miller, Hoogstraten et al. 1981). As respostas radiológicas foram confirmadas por um painel independente de radiologistas. CR e PR tinham de ser mantidas durante um mínimo de 4 semanas. A duração da resposta foi medida a partir da primeira documentação de resposta até o progresso da doença. O tempo até o progresso (TTP) foi determinado pelo intervalo entre o início da terapia e a primeira data em que a progressão da doença foi objetivamente documentada. A sobrevida global (OS) foi medida a partir da data de entrada no estudo até a data da morte. O tempo de acompanhamento foi medido a partir do dia da primeira administração de tratamento até o último contato ou a morte. As respostas imunes foram examinadas antes da primeira injeção e depois da segunda, quarta e sexta injeções. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram coletadas em cada momento e congeladas.
Linhagens celulares
T2 é um híbrido T/B humano mutante desprovido de moléculas TAP, masque expressa HLA-A*0201. Fibroblastos N418 positivos para HLAA*0201, células N418 transfectadas com TERT e as linhagens celulares de melanoma Na8 e Me290 foram fornecidas por P. Romero (Ludwig Institute for Câncer Research, Lausanne, Suíça).
Peptídios
Peptídios restringidos classe I usados para estudos laboratoriais incluíam TERT572 (RLFFYRKSV, SEQ ID No: 1), TERT572y (YLFFYRKSV,
1γ
SEQ ID No: 2), e FluM56 (GILGFVFTL, SEQ ID No: 11), todos produzidos pela Epytop (Nimes, França).
Estimulação in vitro de PBMC
PBMC descongeladas (3 x 105 células/cavidade em 200 pL) fo5 ram incubadas na presença de 10 pM de peptídio TERT572Y em meio completo (RPM11640 suplementado com 8% de soro AB humano) em placas de 96 cavidades de fundo redondo. Adicionou-se IL2 a uma concentração final de 10 U/mL após 48 h e 96 h. As células foram incubadas a 37°C em 5% de CO2-ar. No dia 9 de cultura, células de seis cavidades foram reunidas e ana10 lisadas quanto a presença de células CD8 TERT572Y-específicas por coloração to tetrâmero TERT572y.
Coloração do tetrâmero TERT572Y
As células foram incubadas com tetrâmero TERT572y conjugado a PE (Proimmune Ltd, Oxford, RU) durante 30 min à temperatura ambiente e, então, com mAbs anti-CD8 conjugado a APC (BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) e anti-CD3 conjugado a FITC (BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) durante 30 min a 4°C. As células tingidas foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, Mountain View, CA).
Expanção policlonal de células positivas para 0 tetrâmero
TERT572Y
PBMCs foram estimuladas com 10 μΜ de TERT572Y na presença de 10 U/mL de IL2 durante 9 dias. As células foram marcadas com mAb antiCD8 e tetrâmero TERT572y antes do isolamento com um classificador de células. As células classificadas foram estimuladas com PHA (Difco) durante ‘?25 14 dias.
Marcação dupla com CD107 e IFNy intracelular
Células T foram estimuladas com células T2 carregadas com peptídio (10 μΜ) na presença de 20 pg/mL de Brefeldin A (Sigma, Oakville, Canadá). Seis horas depois foram lavadas, tingidas com mAb anti-CD107 conjugado a PE (BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) em PBS durante 25 minutos a 4°C, novamente lavadas e fixadas com 4% de paraformaldeído. As células foram permeabilizadas com PBS/0,2% de Saponina/0,5% de BSA (Sigma) e tingidas com mAb anti-l FNy conjugado a APC (BD Pharmingen, Mississauga, Canadá) antes da análise citométrica de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences, Mountain View, CA).
Ensaio de citotoxicidade
As células alvo foram marcadas com 100 pCi de 51Cr durante 90 min, lavadas duas vezes e plaqueadas em placas de 96 cavidades de fundo redondo (3 x 103 células/cavidade em 100 pL de RPMI 1640 mais 5% de soro de novilho fetal). Células efetoras (100 pl_) foram, então, adicionadas a cada cavidade. Depois de 4 h, 100 μΙ_ de sobrenadante foram coletados, e a radioatividade foi medida com um contador gama. A porcentagem de lise específica foi determinada da seguinte maneira: lise = (liberação experimental - liberação espontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea) x 100.
1.2. Resultados
Características dos pacientes, vacinação e respostas clínicas
As características dos 19 pacientes alistados no ensaio são mostradas na Tabela 2. Todos os pacientes, exceto um (paciente n2 11), tinham câncer de estágio IV com múltiplas metástases, principalmente nos ossos, fígado e pulmão. Todos tinham doença ativa e progressiva e tinham recebido vários tratamentos, principalmente quimioterapia, antes de entrar no protocolo de vacinação. Três pacientes foram alistados nos níveis de dose de 2, 3, 4 e 5 mg dos peptídios, ao passo que sete pacientes receberam a dose de 6 mg. Cinco pacientes foram retirados do protocolo depois da quarta (ne 1, n2 5, n2 14 e n2 19) ou qinta (n2 18) injeção de vacina, por causa da rápida progressão da doença. Todos os cinco pacientes morreram subseqüentemente em seis meses de progressão da doença. Os 14 pacientes restantes completaram o protocolo de vacinação. A doença estabilizou em quatro (29%) pacientes (n2 9, n211, n212 e n213) e continuou a progredir em 10 pacientes. Estes últimos 10 pacientes receberam subseqüentemente quimioterapia, e seis deles ainda estão vivos. Um (paciente n2 11) dos 4 pacientes cuja doença estabilizou durante 9 meses subseqüentemente progrediu, ao passo que os outros três pacientes ainda têm doença estável (depois de 12
meses para os pacientes ne 9 e ne 12, e 9 meses para o paciente n5 13) sem nenhuma terapia adicional após o término da vacinação.
| Pc | I Idade | Sexo | Câncer | Estágio | PS | Tratamento anterior | Dose de vacina | N® de injeções | Resposta clinica | Sobrevida (meses) |
| n® 1 | 73 | Μ | colorretal | IV | 1 | 7 linhas de CT | 2 mg | 4 | PD | 6,1 |
| n®2 | 75 | F | mama | IV | 1 | 5 linhas de CT | 2 mg | 6 | PD | 27,6 |
| n®3 | 64 | Μ | melanoma | IV | 1 | 1 linha de CT | 2 mg | 6 | PD | 8,8+ |
| n®4 | 60 | Μ | NSCLC | IV | 1 | 2 linhas de CT | 3 mg | 6 | PD | 22,8+ |
| n®5 | 71 | Μ | NSCLC | IV | 1 | 6 linhas de CT | 3 mg | 4 | PD | 5,7 |
| n®6 | 73 | F | cérvíx | IV | 1 | 2 linhas de CT | 3 mg | 6 | PD | 5,3 |
| η2 7 | 53 | Μ | cabeça e pescoço | IV | 1 | 4 linhas de CT | 4 mg | 6 | PD | 15,1 |
| η2 8 | 57 | F | colorretal | IV | 1 | 5 linhas de CT | 4 mg | 6 | PD | 12,3 |
| η2 9 | 66 | Μ | renal | IV | 1 | 1 linha de IT | 4 mg | 6 | SD | 11,1 + |
| η2 10 | 73 | F | colorretal | IV | 1 | 2 linhas de CT | 5 mg | 6 | PD | 4,6 |
| η211 | 49 | Μ | NSCLC | lllb | 0 | 3 linhas de CT | 5 mg | 6 | SD | 17,5+ |
| η2 12 | 45 | F | mama | IV | 1 | 2 linhas de CT | 5 mg | 6 | SD | 11,2+ |
| η2 13 | 51 | Μ | renal | IV | 1 | 1 linha de CT, 1 linha de IT | 6 mg | 6 | SD | 6,9+ |
| η2 14 | 61 | Μ | origem desconhecida | IV | 1 | 2 linhas de CT | 6 mg | 4 | PD | 8 |
| η® 15 | 70 | F | colorretal | IV | 0 | 2 linhas de CT | 6 mg | 6 | PD | 10,7+ |
| η2 16 | 69 | Μ | próstata | IV | 1 | 2 linhas de CT 1 linha de HT | 6 mg | 6 | PD | 17+ |
| η217 | 69 | F | ovariano | IV | 1 | 8 linhas deCT | 6 mg | 6 | PD | 13,7+ |
| η218 | 51 | F | ovariano | ÍV | 1 | 4 linhas de CT | 6 mg | 5 | PD | 6,4 |
| η® 19 | 48 | Μ | esôfago | IV | 1 | 1 linha de CT | 6 mg | 4 | PD | 4,4+ |
Tabela 2: Características dos pacientes. NSCLC = câncer de pulmão de células não pequenas, S = cirurgia, CT = quimioterapia, HT = te5 rapia hormonal, RT = radioterapia, IT = imunoterapia (IL2, INFa), OS = status de desempenho, PD = doença progressiva, SD = doença estável
No total, após umn acompanhamento médio de 10,7 meses (faixa 4,4 - 27,6), nove pacientes morreram, todos devido a progressão da doença. O tempo mediano de progressão do tumor foí de 4,2 meses (faixa 2,3
- 11,2), e a sobrevida global mediana foi de 15,2 meses (faixa 4,4 - 27,6).
Toxicidade e eventos adversos
Nenhuma DLT foi observada durante todo o estudo e, consequentemente, o nível de dose MTD não foi atingido (Tabela 3). Treze pacientes desenvolveram toxicidade de grau I. Consistia em reação cutânea local (11 pacientes), anemia (6 pacientes), trombocitopenia (2 pacientes), fadiga (1 paciente) e anorexia (1 paciente). Exceto pela reação cutânea local, as outras toxicidades estavam mais provavelmente relacionadas à doença do que com a vacinação. Toxicidades de grau I apareceram cedo no decorrer da vacinação. Três pacientes desenvolveram toxicidade de grau II, que consistiu em fadiga (3 pacientes), náusea (2 pacientes) e anorexia (2 pacientes). No paciente n2 5 (NSCLC), a fadiga e náusea apareceram depois da terceira vacinação e desapareceram duas semanas depois, sem nenhum tratamento específico. No paciente ns 10 (câncer colorretal), a fadiga, náusea e anorexia observadas após a terceira vacinação foram consideradas como devidas à doença em vez de à vacinação. Esse paciente desenvolveu uma obstrução intestinal fatal. O paciente n218 teve uma progressão extremamente rápida de sua doença e, conseqüentemente, foi retirada do protocolo depois da quarta vacinação. Ela morreu dois meses depois. Especificamente, não se observou nenhuma toxicidade hematológica, renal, gastrointestinal ou hepática significativa, embora TERT fosse expressado nessas células e tecidos normais. Os pacientes foram monitorizados quanto à toxicidade durante uma mediana de 10,7 meses (faixa 4,4 - 27,6). Mesmo depois de completar ou descontinuar o programa de vacinação, os pacientes foram acompanhados mensalmente quanto à ocorrência de qualquer toxicidade retardada. Entretanto, não se observou nenhum sinal ou achado de toxicidade retardada.
| Paciente | Toxicidade | ||
| Grau I | Grau II | Grau lll/IV | |
| ne 1 | não | não | não |
| n82 | Cutânea local | não | não |
| n83 | Anemia, cutânea local | não | não |
| n84 | Cutânea local | não | não |
| ne5 | não | fadiga, náusea | não |
| ns6 | Anemia, cutânea local, fatigue, anorexia | não | não |
| ne7 | não | não | não |
| ne8 | Trombopenia, cutânea local | não | não |
| ne9 | Cutânea local | não | não |
| n810 | não | anorexia, fadiga, náusea | não |
| n811 | trombocitopenia | não | não |
| n812 | Anemia, cutânea local | não | não |
| n813 | Cutânea local | não | não |
| n814 | Cutânea local | não | não |
| n815 | não | não | não |
| ne16 | Anemia | não | não |
| n817 | Anemia, cutânea local | não | não |
| n®18 | Cutânea local, anemia | anorexia, fatigue | não |
| n819 | não | não | não |
Tabela 3: Toxicidade
Respostas imunes
Células CD8+ peptídio-específicas foram detectadas em sangue periférico por coloração tripla de PBMCs com tetrâmero TERT572y, mAbs 5 anti-CD8 e anti-CD3, ambos ex vivo e após 9 dias de estimulação in vitro com peptídio TERT572y. Em um estudo preliminar, tetrâmero TERT572y marcou menos de 0,11% das células CD8 em sete doadores saudáveis de HLAA*0201 (média 0,035 ± 0,035, faixa 0,0 - 0,11%) (dados não mostrados). O corte de positividade para imunidade específica foi, portanto, estabelecido 10 em 0,14% (média + 3 DP). As respostas imunes foram estudadas em 14 pacientes vacinados (Tabela 4). Apenas um paciente (ns 2) não foi capaz de responder à vacina. Células TERT572Y-específicas foram detectadas ex vivo em quatro (29%) pacientes (Figura 1). A imunidade específica apareceu depois da segunda injeção nos pacientes ne 1, ne 8 e ne 11, e depois da sexta 15 vacinação no paciente ne 13. Deve-se notar que, antes da vacinação, o tetrâmero TERT572y marcou 0,29%, 0,33% e 1,00% das células CD8+ nos pa17 cientes η91, η2 8 e η911 depois da estimulação de PBMC in vitro (Tabela 4). Células TERT572Y-específicas também foram detectadas em 9 pacientes (64%) depois da estimulação in vitro, 3 semanas após a 2- (n2 3, n2 4, n2 5, n2 6, n2 12, n215, e ns 19) ou 4- (n2 7 e n2 18) injeção. Resultados representativos (pacientes n2 6 e n218) são mostrados na Figura 2. A resposta imune também foi medida 3 e 14 meses após o término do protocolo de vacinação nos pacientes n2 13 e n211, respectivamente. Em todos os dois pacientes, mais de 1,5% das células CD8 positivas para o tetrâmero foram detectadas após estimulação in vitro de seus PBMC (Figura 3).
| Paciente | Pré-vacinação | Após a 2S ou 4e injeção | Pós-vaci nação | |||
| não estimulado | estimulado | não estimulado | estimulado | não estimulado | estimulado | |
| n81 | 0,14 | 0,29 | 0,69 | 1,25 | NT | NT |
| n82 | 0,02 | 0 | 0 | 0,11 | NT | NT |
| n83 | 0 | 0 | 0,11 | 1,14 | NT | NT |
| ns4 | NT | NT | 0,05 | 4,00 | 0,02 | 0,48 |
| n°5 | 0,01 | 0 | 0,06 | 0,36 | NT | NT |
| n86 | 0 | 0,01 | 0 | 4,20 | NT | NT |
| n87 | 0,02 | 0,14 | 0,01 | 0,42 | 0.12 | 0,36 |
| n88 | 0,02 | 0,33 | 0,33 | 0,98 | NT | NT |
| n811 | 0,3 | 1,00 | 0,7 | 1,30 | 0,05 | 0,52 |
| n812 | 0,04 | 0,11 | 0,10 | 0,98 | NT | NT |
| n813 | 0 | 0 | 0 | 0,88 | 0,32 | 0,48 |
| n»15 | 0 | 0,04 | 0,05 | 0,45 | NT | NT |
| n218 | 0 | 0 | 0,06 | 0,62 | NT | NT |
| ns19 | 0 | 0,03 | 0 | 0,73 | NT | NT |
Tabela 4: Porcentagem de células CD8 positivas para tetrâmero
TERT572Y entre células mononucleares de sangue periférico de pacientes vacinados. % acima do fundo em negrito
Para avaliar a funcionalidade de células CD8+ TERT572yespecíficas, células positivas para 0 tetrâmero TERT572Y de PBMCs estimulados in vitro do paciente n2 4 (Figura 4A) foram classificadas, amplificadas com PHA e testadas quanto a sua capacidade de responder especificamente ao peptídio TERT572y e matar células tumorais que superexpressam TERT. Mais de 90% das células amplificadas foram marcadas com tetrâmero TERT572y (Figura 4A). Células TERT572Y-específicas purificadas eram completamente funcionais, pois produziam IFNye mostravam regulação positiva de CD107a por ativação com peptídio TERT572y (Figura 4B). CTL reconheceram TERT endógeno e mataram especificamente fibroblastos N418 transfectados com TERT, mas não os não transfectados (Figue 4C). De maneira im18
Λ3 portante, CTLs mataram células tumorais que superexpressavam TERT (célula Na8), mas não células tumorais que expressavam TERT em baixos níveis (células ME290) (Figura 4D).
1.3. Discussão
Os objetivos do presente ensaio clínico foram os de avaliar o perfil de toxicidade e provar o conceito de que peptídios críptícos derivados de antígenos tumorais universais podem induzir imunidade em pacientes com câncer e podem, conseqüentemente, ser considerados para imunoterapia de tumores. Os inventores usaram o peptídio críptico TERT572, que é a10 presentado por HLA-A*0201 e é derivado de TERT, um antígeno tumoral universal superexpressado por 85% dos tumores. A imunogenicidade foi intensificada por substituição do primeiro aminoácido por uma tirosina (Tourdot, Scardino et al. 2000). Os resultados mostraram que a vacinação com TERT572Y de pacientes com câncer avançado estimula CTLs específi15 cos que são completamente funcionais e capazes de matar células tumorais que superexpressam TERT in vitro. A vacinação foi bem tolerada e não pareceu induzir auto-imunidade contra tecidos normais que expressam TERT. Esses resultados oferecem a primeira confirmação in vivo humana de que peptídios críptícos otimizados são bons candidatos para imunoterapia tumo20 ral.
Antígenos tumorais são proteínas self sem mutação também expressadas por tecidos normais, incluindo o timo, e estão envolvidos na indução de tolerância. A tolerância, o processo pelo qual CTL, principalmente aqueles com elevada avidez, são purgados do repertório de células T, é a uV25 principal barreira que impede o desenvolvimento de respostas de células T antitumoraís eficazes. Entretanto, a tolerância modela principalmente o repertório de células T específico para peptídios dominantes, em vez de críptícos (Cibotti, Kanellopoulos et al. 1992; Moudgil e Sercarz 1994). Com o uso de um modelo de camundongo humanizado, mostrou-se recentemente que a 30 vacinação com dois peptídios críptícos derivados de TERT murídeo (TERT572y e TERT988Y) recrutou CTLs de elevada avidez capazes de provocar uma potente imunidade antitumoral (Gross, Graff-Dubois et al. 2004). No presente estudo clínico, mais de 90% dos pacientes vacinados desenvolveram células T específicas capazes de matar células tumorais que superexpressam TERT. Em contraste, apenas 50% dos pacientes tratamentos com o peptídio dominante TERT540 emulsificado em Monatanide responderam à vacina (Parkhurst, Riley et al. 2004). Entretanto, o processamento natural do TERT540 dominente inicialmente descrito (Vonderheide, Hahn et al. 1999; Minev, Hipp et al. 2000; Vonderheide, Domchek et al. 2004) não foi confirmado em estudos mais recentes (Ayyoub, Migliaccio et al. 2001; Parkhurst, Riley et al. 2004), o que sugere a possibilidade de que TERT540 não pertence ao self imunológico. Dada essa ambiguidade com relação à apresentação do peptídio TERT540 dominante, uma comparação randomizada direta com o peptídio críptico podería produzir resultados que seriam muito difíceis de interpretar.
A taxa de resposta à vacina nos pacientes do presente estudo é mais elevada que a obtida nos aproximadamente cinquenta estudos clínicos de vacinação de tumor até agora relatados (Pullarkat, Lee et al. 2003; Slingluff, Petroni et al. 2003). Também se deve notar que quase todos os estudos clínicos anteriores mostrando altas taxas de resposta imune envolveram pacientes com doença mínima e excelente status de desempenho (Disis, Gooley et al. 2002; Pullarkat, Lee et al. 2003; Disis, Schiffman et al. 2004; Vonderheide, Domchek et al. 2004). Scheibenbogen et aí (Scheibenbogen, Lee et al. 1997) demonstraram que a reatividade imune em pacientes com melanoma se correlacionada com a remissão da doença. Em contraste, no presente estudo, todos os pacientes tinham doença em estágio terminal.
Não se encontrou nenhuma correlação entre a magnitude da resposta imune e a dose de peptídio administrada. Isso concorda com dados recentes que indicam que respostas imunes a vacinas de HER2/neu não dependiam da dose da vacina (Disis, Schiffman et al. 2004). Não se encontrou nenhuma correlação entre a dose de vacina e o intervalo de tempo requerido para que surgisse uma resposta detectável. Todos os 13 pacientes que responderam tinham CTLs específicos detectáveis entre a 2- e a 4- injeção de vacina. Uma indução rápida de imunidade pode ser importante nesse ambiente, particularmente para pacientes com malignidades rapidamente progressivas.
A razão do uso de peptídio TERT572 nativo para as 38 e 6- injeções de vacina foi a de selecionar, entre as células T recrutadas pelo TERT572Y otimizado, aqueles com a especificidade mais elevada para TERT572 apresentado por células tumorais. De fato, Clay et al. (Clay, Custer et al. 1999) demonstraram que a vacinação de pacientes com melanoma com gp1002o9M otimizado, amplificava células T que não eram mais capazes de reconhecer o peptídio gp100209 nativo ou células de melanoma que expressavam gpl 00. Os resultados acima demonstram que a injeção do peptídio nativo pode manter a resposta imune iniciada pelo peptídio otimizado. Além disso, a persistência da resposta imunemais de um ano após 0 término da vacinação sugere que 0 peptídio nativo apresentado na superfície de células tumorais pode manter a resposta imune específica por si mesmo. A característica da imunidade antitumoral in vivo é a auto-imunidade. A autoimunidade é aceitável quando tem como alvo células e tecidos normais não essenciais, como melanócitos, mas pode prejudicar o desenvolvimento da vacina que tem como alvo células essenciais, como precursores hematopoiéticos. Embora TERT seja expressado por células tronco hematopoiéticas, intestino, timo e células B e T ativadas (Ramakrishnan, Eppenberger et al. 1998; Liu, Schoonmaker et al. 1999), nenhum dos pacientes mostrou sinais de auto-imunidade mesmo 24 meses após o término da vacinação. Isso confirma os resultados anteriores obtidos em camundongos HHD transgênicos para HLA-A*0201 vacinados com peptídiio TERT572y, que também é parte do TERT murídeo (Gross, Graff-Dubois et al. 2004). Camundongos HHD vacinados desenvolveram imunidade antitumoral sem sinais de auto-imunidade. Além disso, CTLs específicos para TERT572Y mataram células tumorais, mas não células B ativadas. Uma possível explicação é que a expressão de TERT é insuficiente em células normais (contrariamente a células tumorais) para permitir a apresentação de peptídios de baixa afinidade, como TERT572.
A toxicidade observada no presente estudo era essencialmente mínima e, com exceção de reações cutâneas transitórias causadas pelo ad21
juvante Montanide, todas as outras toxicidades leves também podiam ser atribuídas à doença subjacente. Dadas as limitações do pequeno número de pacientes alistados nesse ensaio e o acompanhamento relativamente curto devido ao avanço da doença, pode-se concluir que esse programa de vaci5 nação é livre de qualquer grande toxicidade aguda e a curto prazo. Entretanto, toxicidades a longo prazo terão de ser avaliadas em pacientes com melhores prognósticos que tenham maior probabilidade de cura de sua doença maligna.
Por razões éticas, esse estudo envolveu pacientes com câncer em estágio terminal, que não são os melhores candidatos para imunoterapia tumoral. Concorda-se atualmente em geral que a imunoterapia é melhor administrada a pacientes com doença residual mínima, e a finalidade deve ser a de prevenir o relapso, em vez de curar câncer avançado. A incapacidade de vacinas de erradicar ativamente tumores em crescimento foi claramente mostrada em modelos animais (Cheever e Chen 1997). Embora atividade antitumoral clínica por meio de contração do tumor não fosse observada nesse grupo de pacientes pesadamente pré-tratados, quatro pacientes mostraram estabilização da doença de longa duração nesse ensaio de fase I. Esses pacientes tinham doença anteriormente progressiva e desenvolveram
CTL específicos para TERT que podiam ser detectados em seu sangue mesmo meses após completar o programa de vacinação. É interessante que dois desses pacientes (ns 9 e n° 13), ambos com carcinoma de células renais, foram tratados com sucesso no passado com IL2 ou IFNa, confirmando a sensibilidade desse câncer à imunoterapia. Em contraste, nenhum dos 11 pacientes com câncer renal que foram vacinados com o peptídio TERT540 dominante teve uma resposta clínica objetiva, mesmo quando desenvolveram uma resposta imune específica para o peptídio (Parkhurst, Riley et al. 2004).
Em conclusão, esse estudo demonstra que a vacinação de pa30 cientes com câncer avançado com o peptídio críptico otimizado TERT572Y é segura e induz uma imunidade antitumoral em mais de 90% dos pacientes. Essa é a primeira confirmação clínica de que peptídios crípticos são candi22 datos promissores para imunoterapia de câncer.
Exemplo 2: Seleção e amplificação in vitro de CTLs com elevada avidez pelo peptídio críptico nativo
2.1. Materiais e Métodos
Peptídios
Os peptides TERT988Y (YLQVNSLQTV, SEQ ID No: 4), TERT988 (DLQVNSLQTV, SEQ ID No: 3), MAGE-A248V9 (YLEYRQVPV, SEQ ID No: 6) e MAGE-A248d9 (YLEYRQVPD, SEQ ID No: 5) foram produzidos pela Epytop (Nimes, França).
Animais e células
Os camundongos HHD transgênicos para HLA-A*0201 e as células tumorais RMAS/HHD murídeas foram conforme anteriormente descritos (Pascolo, Bervas et al. 1997).
Geração de CTL em camundongos HHD
Camundongos HHD receberam a injeção subcutânea com 100 pg de peptídios nonaméricos emulsificados em adjuvante de Freund incompleto (IFA) na presença de 150 pg do epítopo de T-auxiliador HBVcore128 lAb restringido. Células esplênicas (5 x 107 células em 10 mL) de camundongos HHD imunizados foram estimuladas in vitro com peptídio (10 pM) em 20 RPMI1640 + 10% de FCS durante cinco dias. As linhagens de CTL foram estabelecidas por reestimulação semanal in vitro com células esplênicas irradiadas na presença de peptídio e 50 U/mL de IL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA).
Ensaio de Citotoxicidade ’?25 Células RMAS/HHD murídeas foram usadas como alvos para citotoxícidade conforme descrito (Tourdot, Scardino et al. 2000). Resumidamente, 2,5 x 103 alvos marcados com 51Cr foram pulsados com doses crescentes (0,00001 - 10 pM) de peptídios a 37°C durante 60 min. Células efetoras em 100 pL foram, então, adicionadas e incubadas a 37°C durante 4 ho30 ras. Depois da incubação, 100 pL de sobrenadante foram coletados, e a radioatividade foi medida em um contador gama. A lise específica foi determinada como:
Lise = (Liberação Experimental - Liberação Espontânea) / (Liberação Máxima - Liberação Espontânea).
A avidez de CTL é definida como a concentração de peptídio que fornece metade da lise máxima. Portanto, quanto menor a avidez medi5 da (em nM), maior a avidez dos CTLs.
Ensaio de proteção contra tumor in vivo
Camundongos HHD foram vacinados com 100 pg de peptídio emulsificado em IFA na presença de 150 pg do epítopo HBVcorel28 lAb restringido uma vez e, então, novamente duas semanas mais tarde. Uma 10 semana após a segunda vacinação, foram desafiados por via subcutânea com 2 x 104 células EL4/HHD. A sobrevida foi registrada a cada dois dias.
2.2. Resultados
Resultados obtidos com um epítopo críptico do antígeno TERT
Camundongos HHD foram imunizados com o peptídio críptico o15 timizado TERT988y. Onze dias mais tarde, células esplênicas de camundongos vacinados foram reunidas e estimuladas serialmente in vitro'com 10 pM de peptídios TERT988y ou críptico nativo TERT988 na presença de 50 lU/mL de IL2. As estimulações foram repetidas a cada semana. Depois da primeira, terceira e sexta estimulação in vitro, as linhagens de CTL foram testadas 20 quanto a sua avidez pelo peptídio TERT988 nativo em um ensaio clássico de citotoxicidade de liberação de 51Cr (Tabela 5).
| Ns de estimulações in vitro | Peptídio usado para estimulação in vitro | Avidez da linhagem de CTL (nM) |
| 1 | tert988 | 170 |
| TERT988y | 300 | |
| 3 | tert988 | 70 |
| TERT988Y | 500 | |
| 6 | tert988 | 3 |
| TERT988Y | 600 |
Tabela 5: Avidez de linhagens de CTL pelo peptídio TERT98e na25 tivo, estabelecida a partir de células esplênicas ativadas com TERT988y in vitro estimuladas com peptídios TERT98sy ou TERT988
Resultados obtidos com um epítopo críptico do antígeno ΜΑΘΕ
Camundongos HHD foram imunizados com o peptídio otimizado MAGE-A248V9, que corresponde ao críptico MAGE-A248D9 (ambos descritos no W003083124). Onze dias depois, células esplênicas de camundongos vacinados foram reunidas e estimuladas serialmente in vitro com 10 pM de 5 peptídios MAGE-A248V9 ou críptico nativo MAGE-A248D9 na presença de 50 lU/mL de IL2. As estimulações foram repetidas a cada semana. Depois da primeira, terceira e sexta estimulação in vitro, as linhagens de CTL foram testadas quanto a sua avidez pelo peptídio MAGE-A248d9 nativo em um ensaio clássico de citotoxícidade de liberação de 51Cr (Tabela 6).
__
| Ne de estimulações in vitro | Peptídio usado para estimulação | Avidez de CTL (nM) |
| 1 | MAGE-A248D9 | 200 |
| MAGE-A248V9 | 4Õ0 | |
| 3 | MAGE-A248D9 | 40 |
| MAGE-A248V9 | 450 | |
| 6 | MAGE-A248D9 | 0,8 |
| MAGE-A248V9 | 320 |
Tabela 6: Avidez de linhagens de CTL estabelecidas a partir de células esplênicas ativadas com MAGE-A248V9 in vitro estimuladas com peptídios MAGE-A248V9 OU MAGE-A248D9
2.3. Conclusão
A vacinação com peptídios crípticos otimizados recruta um repertório de CTL que contém células com elevada avidez pelo peptídio críptico nativo. Esses CTL de elevada avidez podem ser selecionados e amplificados in vitro por estimulação com o peptídio críptico nativo, em vez do otimizado.
Exemplo 3: Seleção in vivo de CTLs com elevada avidez por reforço com o peptídio nativo
3.1. Materiais e Métodos
Foram usados os mesmos materiais e métodos do Exemplo 2.
3.2. Resultados
Camundongos HHD foram vacinados com o peptídio críptico otimizado TERT572Y acima descrito. Quinze dias depois, eles foram reforçados com o mesmo peptídio otimizado ou com o críptico nativo TERT572. Sete dias
depois do reforço, suas células esplênicas foram estimuladas in vitro com 10 μΜ de TERT572· CTL gerados após um ciclo de estimulação in vitro foram testados quanto a sua avidez por TERT572. A Tabela 7 apresenta resultados de seis camundongos individuais.
| Camundongo | 19 vacinação | 2® vacinação | Avidez de CTL (nM) |
| 1 | TERTs72y | TERT572Y | 350 |
| 2 | TERTs72y | TERT572y | 700 |
| 3 | TERT572y | TERT572y | 650 |
| 1 | TERT572y | tert572 | 110 |
| 2 | TERT572y | tert572 | 190 |
| 3 | TERTs72y | TERT572 | 70 |
Tabela 7: Avidez de CTL gerados em camundongos HHD ativados com peptídio críptico otimizado TERT572Y e reforçados com o mesmo peptídio otimizado ou o nativo TERT572.
3.3. Conclusão
A ativação in vivo com os peptídios crípticos otimizados recruta um repertório contendo CTL com elevada avidez pelo peptídio nativo. Esses CTLs de elevada avidez podem ser selecionados e amplificados in vivo por reforço com o peptídio nativo, em vez de com 0 otimizado.
Exemplo 4: Imunidade a tumor em camundongos HHD
4.1. Materiais e Métodos
Foram usados os mesmos materiais e métodos do Exemplo 2.
Um peptídio adicional, chamado de gp100i54, também foi usado: KTWGQYWQV (SEQ ID NO: 8).
4.2. Resultados
Camundongos HHD foram vacinados com os peptídios crípticos otimizados TERT572y e TERTgesY, θ, quinze dias depois, reforçados com o mesmo peptídio otimizado ou com 0 críptico nativo correspondente. Dez dias após 0 reforço, os camundongos foram desafiados com células tumorais EL4/HHD e monitorizados quanto ao crescimento do tumor e sobrevida. Camundongos ativados e reforçados com 0 peptídio gp100i54 foram usados como controles negativos (Tabela 8). 100% dos camundongos de controle morreram até o dia 43 após 0 desafio. 17% dos camundongos ativados e
31.
reforçados com os peptídios otimizados e 50% dos camundongos ativados com o peptídio otimizado e reforçados com o nativo foram definitivamente protegidos contra o tumor.
| Ativação | Reforço | Sobrevida após 0 desafio (dias) |
| Gp1 OO154 | Gp100i54 | 41 |
| 40 | ||
| 39 | ||
| 39 | ||
| 43 | ||
| 41 | ||
| TERT572Y | TERT572Y | 31 |
| 40 | ||
| 40 | ||
| 40 | ||
| 200+ | ||
| 45 | ||
| TERT572Y | tert572 | 200+ |
| 200+ | ||
| 32 | ||
| 35 | ||
| 200+ | ||
| 40 | ||
| TERTgseY | TERTgssY | 200+ |
| 40 | ||
| 40 | ||
| 40 | ||
| 43 | ||
| 43 | ||
| TERT988Y | TERT988 | 39 |
| 40 | ||
| 41 | ||
| 200+ | ||
| 200+ | ||
| 200+ |
Tabela 8: Sobrevida de camundongos HHD ativados com o peptídio otimizado e reforçados com o mesmo otimizado ou o nativo correspondente.
4.3. Conclusão
A imunidade tumoral é muito mais eficiente em camundongos ativados com o peptídio otimizado e reforçados com o nativo do que em ca10 mundongos ativados e reforçados com o mesmo peptídio otimizado.
REFERÊNCIAS
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Claims (14)
- reivindicações1. Uso de um peptídio nativo, caracterizado pelo fato de que é para a produção de uma composição medicinal para a manutenção da resposta imune de CTL iniciada por seu peptídio otimizado cognato, em que o referido peptídio nativo é um peptídio críptico e o referido peptídio otimizado cognato é um peptídio obtido por uma ou várias substituições de aminoácidos no referido peptídio nativo, as referidas modificações resultando numa maior afinidade para a molécula de MHC e/ou uma maior estabilidade do MHC complexo de peptídeo.
- 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito peptídio nativo é de um antígeno tumoral ou de um antígeno viral.
- 3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídio nativo e o peptídio otimizado são apresentados por HLA A2, e o peptídio otimizado resulta da substituição do aminoácido N-terminal do dito peptídio nativo por um resíduo tirosina.
- 4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que os peptídios nativo e seu cognato otimizado são selecionados dos seguintes pares de peptídios: [TERT572 (SEQ ID No: 1), TERT572Y1 (SEQ ID No: 2)] ; [TERTgss (SEQ ID No: 3), TERT988Y1 (SEQ ID No: 4)] ; [MAGE-A248D9 (SEQ ID No: 5), MAGE-A248V9 (SEQ ID No: 6)] ; [MAGEA248G9 (SEQ ID No: 7), MAGE-A248V9 (SEQ ID No: 6)]; [HBVpol575 (SEQ ID No: 15), HBVpol575Y1 (SEQ ID No: 16)] ; [HBVpol765 (SEQ ID No: 17), HBVpol765Y1 (SEQ ID No: 18)] ; [Gp100 177 (SEQ ID No: 23), Gp100 177Y1 (SEQ ID No: 24)] ; [Gp100 178 (SEQ ID No: 25), Gp100 178Y1 (SEQ ID No: 26)] ; [Gp100 570 (SEQ ID No: 27), Gp100 570Y1 (SEQ ID No: 28)] ;; [HER-2/neu799 (SEQ ID No: 36), HER-2/neu799Y1 (SEQ ID No: 37)] ;[HER-2/neu48 (SEQ ID No: 42), HER2/neu48Y1 (SEQ ID No: 43)] ; [HER-2/neu773 (SEQ ID No: 44), HER-2/neu773Y1 (SEQ ID No: 45)] ;; [HER-2/neu851 (SEQ ID No: 48), HER-2/neu851Y1 (SEQ ID No: 49)] ; [HER-2/neu661 (SEQ ID No: 50), HER-2/neu661Y1 (SEQ ID No: 51)] ; [HER-2/neu650 (SEQ ID No: 52), HER-2/neu650Y1 (SEQ ID No: 53)] ; [HER2/neu466 (SEQ ID No: 54), HER-2/neu466Y1 (SEQ ID No: 55)] ; [HER-2/neu402Petição 870180165109, de 19/12/2018, pág. 5/12 (SEQ ID No: 56), HER-2/neu402Yi (SEQ ID No: 57)] ; [HER-2/neu39i (SEQ ID No: 58), HER-2/neu391Y1 (SEQ ID No: 59)] ; [HER-2/neu971 (SEQ ID No: 60), HER-2/neu971Y1 (SEQ ID No: 61)] ; [HBVpol28 (SEQ ID No: 62), HBVpol28Y1 (SEQ ID No: 63)] ; [HBVpol594 (SEQ ID No: 64), HBVpol594Y1 (SEQ ID No: 65)] ; [HBVpol985 (SEQ ID No: 66), HBVpol985Y1 (SEQ ID No: 67)] ; [EphA2 61 (SEQ ID No: 68), EphA2 61Y1 (SEQ ID No: 69)] ; [HER2 911 (SEQ ID No: 70), HER911Y1V10 (SEQ ID No: 71)] ; [HER4 911 (SEQ ID No: 72), HER911Y1V10 (SEQ ID No: 71)] ; [HER1 911 (SEQ ID No: 73), HER911Y1V10 (SEQ ID No: 71)] ; [HER2722 (SEQ ID No: 74), HER722Y1V9 (SEQ ID No: 75)] ; [HER3 722 (SEQ ID No: 76), HER722Y1V9 (SEQ ID No: 75)] ; [HER4 722 (SEQ ID No: 77), HER722Y1V9 (SEQ ID No: 75)] ; [HER1722 (SEQ ID No: 78), HER722Y1V9 (SEQ ID No: 75)] ; [HER2 845 (SEQ ID No: 79), HER845Y1 (SEQ ID No: 80)] ; [HER3 845 (SEQ ID No: 81), HER845Y1 (SEQ ID No: 80)] ; [HER2904 (SEQ ID No: 82), HER904Y1 (SEQ ID No: 83)] ; [HER4 904 (SEQ ID No: 84), HER904Y1 (SEQ ID No: 83)] ; [HER2 933 (SEQ ID No: 85), HER933Y1 (SEQ ID No: 86)] ; [HER1933 (SEQ ID No: 87), HER933Y1 (SEQ ID No: 86)] ; [HER2 945 (SEQ ID No: 88), HER945Y1 (SEQ ID No: 90)] ; [HER3 945 (SEQ ID No: 89), HER945Y1 (SEQ ID No: 90)] ; [HER4945 (SEQ ID No: 91), HER945Y1 (SEQ ID No: 90)] ; e [HER1 945 (SEQ ID No: 92), HER945Y1 (SEQ ID No: 90)].
- 5. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídio críptico nativo é TERT572 (RLFFYRKSV, SEQ ID No: 1), e seu peptídio otimizado cognato é TERT572Y (YLFFYRKSV, SEQ ID No: 2).
- 6. Uso de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o peptídio críptico nativo é TERT988 (DLQVNSLQTV, SEQ ID No:3) , e seu peptídio otimizado cognato é TERT988Y (YLQVNSLQTV, SEQ ID No:4) .
- 7. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 5, caracterizado pelo fato de que o peptídio críptico nativo é MAGE-A248D9 (YLEYRQVPD, SEQ ID No: 5) or MAGE-A248G9 (YLEYRQVPG, SEQ ID No: 7), e seu peptídio otimizado cognato é MAGE-A248V9 (YLEYRQVPV, SEQ ID No: 6).
- 8. Processo para a obtenção in vitro de CTLs com elevada avidezPetição 870180165109, de 19/12/2018, pág. 6/12 por um peptídio nativo, caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa de estimulação de CTLs presentes em uma amostra biológica de um paciente que tenha sido imunizado com um peptídio imunogênico otimizado derivado do dito peptídio nativo, em que a dita estimulação é efetuada com o peptídio nativo.
- 9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os referidos peptídios nativos e otimizados são conforme descritos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
- 10. Kit de vacinação, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma dose de um peptídio nativo e pelo menos uma dose de um peptídio imunogênico otimizado derivado do dito peptídio nativo.
- 11. Kit de vacinação de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende 2 ou 3 doses de peptídio otimizado, e 3, 4, 5, 6 ou até 50 doses de peptídio nativo.
- 12. Kit de vacinação de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que cada dose compreende de 1 a 5 mg de peptídio.
- 13. Kit de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que as referidas doses de vacinação são formuladas para injeção subcutânea.
- 14. Kit de vacinação de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que os ditos peptídios nativos e otimizados são conforme descritos em qualquer uma das reivindicações de 1 a 7.
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