BRPI0609031A2 - métodos para a sìntese de uma molécula de ácido nucleico, para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo de um dna ou de uma mistura de ácidos nucleicos, para amplificar duas ou mais seqüências de nucleotìdeos alvo simultaneamente, para seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvo, para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética, para detectar uma seqüência de nucleotìdeos alvo em uma amostra da ácido nucléico, e para permitir que uma especifidade anelar de um oligonucleotìdeo seja dualmente determinada por meio de uma estrutura do oligonucleotìdeo, e, oligonucleotìdeo de especifidade dual - Google Patents

métodos para a sìntese de uma molécula de ácido nucleico, para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo de um dna ou de uma mistura de ácidos nucleicos, para amplificar duas ou mais seqüências de nucleotìdeos alvo simultaneamente, para seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvo, para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética, para detectar uma seqüência de nucleotìdeos alvo em uma amostra da ácido nucléico, e para permitir que uma especifidade anelar de um oligonucleotìdeo seja dualmente determinada por meio de uma estrutura do oligonucleotìdeo, e, oligonucleotìdeo de especifidade dual Download PDF

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Abstract

METODOS PARA A SINTESE DE UMA MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO, PARA SELETIVAMENTE AMPLIFICAR UMA SEQUENCIA DE áCIDO NUCLEICO ALVO DE UM DNA OU DE UMA MISTURA DE ACIDOS NUCLEICOS, PARA AMPLIFICAR DUAS OU MAIS SEQUENCIAS DE NUCLEOTìDEOS ALVO SIMULTANEAMENTE, PARA SEQUENCIAR UMA MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ALVO, PARA DETECTAR UMA MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO COM DIVERSIDADE GENETICA, PARA DETECTAR UMA SEQUENCIA DE NUCLEOTìDEOS ALVO EM UMA AMOSTRA DA áCIDO NUCLéICO, E PARA PERMITIR QUE UMA ESPECIFICIDADE ANELAR DE UM OLIGONUCLEOTIDEO SEJA DUALMENTE DETERMINADA POR MEIO DE UMA ESTRUTURA DO OLIGONUCLEOTìDEO, E, OLIGONUCLEOTìDEO DE ESPECIFICIDADE DUAL. A presente invenção refere-se aos vários processos por uma reação de extensão dependente de gabarito usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e um oligonucleotídeo de especificidade dual composto de três porções de T~m~ para o mesmo. São demonstradas na presente invenção as características do oligonucleotídeo de especificidade dual, que são tolerância à má combinação e especificidade de hibridização alta.

Description

"MÉTODOS PARA A SÍNTESE DE UMA MOLÉCULA DE ÁCIDONUCLEICO, PARA SELETIVAMENTE AMPLIFICAR UMASEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ALVO DE UM DNA OU DE UMAMISTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS, PARA AMPLIFICAR DUAS OUMAIS SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEOS ALVOSIMULTANEAMENTE, PARA SEQÜENCIAR UMA MOLÉCULA DEÁCIDO NUCLEICO ALVO, PARA DETECTAR UMA MOLÉCULA DEÁCIDO NUCLEICO COM DIVERSIDADE GENÉTICA, PARADETECTAR UMA SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOS ALVO EM UMAAMOSTRA DA ÁCIDO NUCLEICO, E PARA PERMITIR QUE UMAESPECIFICIDADE ANELAR DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO SEJADUALMENTE DETERMINADA POR MEIO DE UMA ESTRUTURA DOOLIGONUCLEOTÍDEO, E, OLIGONUCLEOTÍDEO DEESPECIFICIDADE DUAL"
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se aos vários processos usando umoligonucleotídeo de especificidade dual e a um oligonucleotídeo deespecificidade dual para o mesmo. Mais particularmente, a presente invençãorefere-se aos vários processos por uma reação de extensão dependente degabarito usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e umoligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo. Mais particularmente,a presente invenção refere-se aos vários processos por uma reação deextensão dependente de gabarito usando um oligonucleotídeo deespecificidade dual e um oligonucleotídeo de especificidade dual para omesmo.
DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA
Amplificação de ácido nucleico é um processo fundamentalpara uma ampla variedade de métodos em biologia molecular, de tal modoque vários métodos de amplificação têm sido propostos. Por exemplo, Miller,Η. I. et al. (WO 89/06700) amplificaram uma seqüência de ácido nucleicobaseado na hibridização de uma seqüência de promotor / iniciador em umDNA de fita única alvo ("ssDNA") seguido por transcrição de muitas cópiasde RNA da seqüência. Outros procedimentos de amplificação de ácidonucleico conhecidos incluem sistema de amplificação baseada em transcrição(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 86:1173(1989); e GingerasT.R. et al., WO 88/10315).
O processo mais predominante para amplificação de ácidonucleico conhecido como reação em cadeia da polimerase (daqui em diantereferida como "PCR"), é baseado em ciclos repetidos de desnaturação deDNA de fita dupla, seguido por anelamento de iniciador oligonucleotídeo emDNA gabarito, e extensão de iniciador por uma DNA polimerase (Mullis et al.Patentes U.S. 4.683.195, 4.683.202, e 4.800.159; Saiki et al., (1985) Science230, 1350-1354). Os iniciadores oligonucleotídeos usados em PCR sãoplanejados para anelarem em fitas opostas do DNA gabarito. Os iniciadoressão estendidos por DNA polimerase, do qual o produto de um iniciador podeservir como a fita gabarito do outro iniciador em reações subseqüentes. Aamplificação por PCR resulta no aumento exponencial de fragmentos de DNAdiscretos cujo comprimento é definido pelas extremidades 5' dos iniciadoresoligonucleotídeos.
O sucesso em amplificações de ácido nucleico, em particularem amplificação por PCR, baseia-se na especificidade com a qual uminiciador anela apenas em suas seqüências alvo (e não em seqüências não-alvo); portanto, é importante otimizar esta interação molecular. Se uminiciador pode anelar em apenas seu complemento perfeito ou também emseqüências que possuem uma ou mais más combinações depende criticamenteda temperatura de anelamento. Em geral, a temperatura de anelamento maisalta acarretará anelamento mais específico do iniciador em seu gabaritoperfeitamente combinado, que por sua vez aumentará a possibilidade deamplificação de apenas a seqüência alvo. Por outro lado, mais máscombinações entre o gabarito e o iniciador podem ser toleradas emtemperaturas de anelamento mais baixas. Em consideração de tal fenômeno,ajuste da temperatura de anelamento pode alterar a especificidade depareamento do gabarito e iniciador. Por exemplo, de não houver produto, atemperatura pode ser muito alta para anelamento. Se houver vários produtosdiferentes em tamanho onde apenas um iniciador está presente, isto indica queo único iniciador está anelando em mais do que uma região do gabarito. Nestecaso, a temperatura de anelamento deve ser aumentada.
Em adição à temperatura de anelamento, vários "parâmetros depesquisa de iniciador", tais como comprimento de iniciador, conteúdo de GC,e comprimento de produto de PCR, devem ser considerados paraespecificidade de anelamento de iniciador. Um iniciador satisfazendo todostais parâmetros resultará em intensificação significativa de especificidade deanelamento de iniciador durante a amplificação de DNA alvo, enquantoresolve os problemas de resíduos gênicos e produtos não-específicosdecorrentes dos iniciadores usados nos experimentos. E normal queiniciadores bem planejados possam evitar resíduos e anelamento não-específico bem como distinguir entre cDNAs ou gabaritos genômicos emRNA-PCR.
Muitas abordagens têm sido desenvolvidas para melhorar aespecificidade de anelamento de iniciador e portanto realizar a amplificaçãodo produto desejado. Exemplos são "touchdown PCR" (Don et al., (1991)"Touchdown PCR to circumvent spurious priming during geneamplification", Nucleic Aeids Res., 19, 4008), "hot start PCR" (DAquila et al.,(1991) "Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplificationheating", Nueleie Aeids Res., 19, 3749), "nested PCR" (Mullis and Faloona,(1987) "Specific synthesis of DNA in vitro via a polimerase-catalyzed chainreaction", Methods Enzymol. 155, 335-350), e "booster PCR" (Ruano et al.,(1989) "Biphasic amplification of very dilute DNA samples via boosterPCR", Nucleic Acids Res. 17, 540). Em outras abordagens alternativastambém têm sido relatadas que vários compostos 'intensificadores' podemmelhorar a especificidade de PCR. Os compostos intensificadores incluemcompostos químicos que aumentam a temperatura de anelamento efetiva dareação, proteínas ligadoras de DNA, e reagentes comercialmente disponíveis.
Contudo, não há aditivo 'mágico' que garantirá o sucesso em cada PCR, e émuito tedioso testar aditivos diferentes sob condições diferentes tal comotemperatura de anelamento. Embora estas abordagens tenham contribuídopara melhoria da especificidade de anelamento de iniciador em alguns casos,não têm acessado fundamentalmente uma solução para os problemas deiniciadores usados na amplificação por PCR, tais como produtos nãoespecíficos e resíduos gênicos altos.
Técnicas baseadas em PCR têm sido amplamente usadas paraamplificação de uma seqüência de DNA alvo, mas também para aplicaçõescientíficas ou métodos nos campos de pesquisa médica e biológica, tais comoPCR com transcriptase reversa (RT-PCR), PCR de exibição diferencial (DD-PCR), clonagem de genes conhecidos e desconhecidos por PCR, amplificaçãorápida de extremidades de cDNA (RACE)5PCR de iniciação arbitrária PCR(AP-PCR), multiplex PCR, tipificação de genoma SNP, e análise genômicabaseada em PCR (McPherson e Moller, (2000) PCR. BIOS ScientificPublishers, Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelberg, NY).
Como descrito acima, todos estes métodos e técnicasenvolvendo amplificação de ácido nucleico, notavelmente amplificação porPCR, não podem estar completamente livres de limitações e problemasresultantes de não-especificidade de iniciadores usados em cada método, taiscomo positivos falsos, reprodutibilidade insatisfatória, resíduos gênicos altos,embora abordagens melhoradas para cada um dos métodos tenham sidocontinuamente introduzidas. Portanto, permanece uma necessidade de novosiniciadores e métodos para melhorar a especificidade de anelamento, quepodem ocasionar verdadeiros resultados de amplificação.
Por enquanto, hibridização de DNA é um processofundamental em biologia molecular e é afetada pela força iônica, composiçãode base, comprimento de fragmento ao qual o ácido nucleico tem sidoreduzido, o grau de má combinação, e a presença de agentes desnaturantes.
Tecnologias baseadas em hibridização de DNA seriam uma ferramenta muitoútil em determinação de seqüência de ácido nucleico específica e claramentevaliosa em diagnóstico clínico, pesquisa genética, e análise de laboratórioforense. Por exemplo, Wallace e colaboradores mostraram que as diferençasde seqüência tão sutis quanto uma única troca de base são suficientes parapermitirem discriminação de oligômeros curtos (e.g., 14-mer) e demonstraramcomo isto poderia ser aplicado em análise molecular de mutação pontual nogene de β-globina (Wallace, B.R., et al., (1981) "The use of syntheticoligonucleotides as hybridization probes. Hybridization of oligonucleotides ofmixed sequence to rabbit β-globin DNA", Nucleic Aeids Res. 9, 879-894; eConner, B.3., et al. (1983) "Detection of sickle cell β-globin allele byhybridization with synthetic oligonucleotides", Proe. Natl. Aead. Sei. USA 80,278-282).
Apesar do poder da hibridização de oligonucleotídeo decorretamente identificar uma fita complementar, pesquisadores ainda sedeparam com limitações. Híbridos contendo oligonucleotídeos são muitomenos estáveis do que híbridos de ácidos nucleicos longos. Isto é refletido emtemperatura de fusão menor. A instabilidade dos híbridos é um dos fatoresmais importantes a serem considerados quando se planeja hibridização deoligonucleotídeo. A diferença de estabilidade entre um complementoperfeitamente combinado e um complemento mal combinado em apenas umabase pode ser bastante pequena, correspondendo a tão pouco quanto 0,5°C emsuas Tms (temperatura de fusão de duplex). Quanto mais curto ooligonucleotídeo de interesse (permitindo identificação de uma fitacomplementar em uma mistura mais complexa), mais forte será o efeito deuma má combinação de base única sobre a estabilidade de duplex total.
Contudo, a desvantagem de uso de tais oligonucleotídeos curtos é quehibridizam fracamente, até mesmo em uma seqüência perfeitamentecomplementar, e assim têm que ser usados sob condições de estringênciareduzida, o que resulta seriamente em decréscimo de especificidade dehibridização.
Têm havido muitos esforços para melhorar a especificidade dehibridização de oligonucleotídeo. Têm sido propostos um método paramodificar quimicamente bases de DNA para hibridização de sensibilidade alta(Azhikina et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11460-11462) e ummétodo no qual a lavagem após a hibridização é conduzida em temperaturasbaixas por um período de tempo longo para intensificar a capacidade dediscriminação da má combinação (Drmanac et al., (1990) DNA and CellBiology, 9:527-534). Recentemente, outro método tem sido introduzido paraaumentar o poder de resolução de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs)em hibridização de DNA por meio de más combinações artificiais (Guo et al.,(1997) Nature Biotechnology, 15:331-5). Em adição, muitas Patentes U.S.incluindo Patentes U.S. 6.077.668, 6.329.,144, 6.140.054, 6.350.580,6.309.824, 6.342.355 e 6.268.128 descrevem a sonda para hibridização e suasaplicações. Embora as abordagens melhoradas para cada métodos tenham sidocontinuamente introduzidas, todos estes métodos e técnicas envolvendohibridização de oligonucleotídeo poderiam estar completamente livres daslimitações e dos problemas decorrentes da não-especificidade de hibridizaçãode oligonucleotídeo.
Ainda há uma possibilidade de que fatores artificiais, taiscomo as falhas de aplicação pontual de mancha e de imobilização deoligonucleotídeo sobre substrato e estabelecimento de condições dehibridização ótimas, afetariam os dados negativos de hibridização; o efeito deresultados errôneos é mais vulnerável para os resultados gerados do métodode triagem de rendimento alta. Tais fatores artificiais inerentes para aplicaçãopontual de mancha e hibridização são as desvantagens práticas principais emmicroarranjos de DNA baseados em oligonucleotídeo.
Além disso, o desenvolvimento de técnicas de determinação deseqüência de DNA com velocidade, sensibilidade, e rendimento intensificadosé de maior importância para o estudo de sistemas biológicos. Técnica deseqüenciamento de DNA convencional originalmente desenvolvida mais doque duas décadas atrás (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci., 74:5463-5467) apresenta limitações tanto em rendimento quanto em custo paraaplicações futuras.
Três métodos grandemente promissores sãoseqüenciamento por hibridização (Brain e Smith, (1988) J. Theor. Biol.,135:303-307); Drmanac et al., (1989) Genomics, 4:114-128); e Southern,E.M. (1989) Patente W0/10977), seqüenciamento por assinatura paralelabaseado em ligação e clivagem (Brenner et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci.,97:1665-1670), e pirosseqüenciamento (Ronaghi et al., (1996) Anal.Biochem., 242:84-89; e (1998) Science 281:363-365). Para todas as técnicasmencionadas acima, o sucesso das reações de seqüenciamento absolutamentedepende da especificidade de hibridização do iniciador de seqüenciamentopara um ácido nucleico alvo. Em consideração com a especificidade dehibridização do iniciador de seqüenciamento, métodos correntes estão sujeitosà limitação do comprimento dos ácidos nucleicos gabarito fornecidos para asreações de seqüenciamento. Em geral, reações de seqüenciamento sãoconduzidas usando ácidos nucleicos modelo preferivelmente menores do queumas poucas centenas de pares de bases em comprimento de tal modo que ahibridização específica do iniciador de seqüenciamento seja alcançada emcerta extensão.Para estudos avançados, contudo, reações de seqüenciamentode DNA com velocidade, sensibilidade, e rendimento intensificados não sãoimpedidas pelo tamanho dos ácidos nucleicos gabarito. A luz disto,seqüenciamento direto de um ácido nucleico alvo de uma população de ácidonucleico de gabarito é permitido, desde que os iniciadores de seqüenciamentosejam hibridizados com ácidos nucleicos alvo em especificidade alta.
Em todo este pedido, várias patentes e publicações sãoreferidas, e citações são proporcionadas entre parêntesis. As descrições destaspatentes e publicações em suas totalidades são por meio desta aquiincorporadas como referências com o objetivo de descrever maiscompletamente esta invenção e o estado da técnica ao qual esta invençãopertence.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Para eliminar os problemas e as desvantagens de taisoligonucleotídeos convencionais, usados como iniciadores ou sondas, e devários métodos envolvendo hibridização de ácido nucleico, o presenteinventor tem desenvolvido um o oligonucleotídeo de especificidade dual sepermite que uma reação dependente de gabarito prossiga com especificidademuito maior e tem encontrado suas excelentes aplicações em uma amplavariedade de processos envolvendo anelamento ou hibridização deoligonucleotídeo.
Conseqüentemente, um objetivo desta invenção é proporcionarum método para sintetizar uma molécula de ácido nucleico usando umoligonucleotídeo de especificidade dual por uma reação de extensãodependente de gabarito.
Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método paraseletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo de um DNAou de uma mistura de ácidos nucleicos.
Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar ummétodo para amplificar duas ou mais seqüências de ácido nucleico alvosimultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadores na mesma reação.
Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método paraseqüenciar uma molécula de ácido nucleico de um DNA ou de uma misturade ácidos nucleicos.
Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar ummétodo para detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidadegenética por uma reação de extensão dependente de gabarito.
Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método paradetectar uma seqüência de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácidonucleico pelo uso de microarranjo imobilizado de oligonucleotídeo deespecificidade dual.
Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar umoligonucleotídeo de especificidade dual para sintetizar uma molécula de ácidonucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito.
Outro objetivo desta invenção é proporcionar um método parapermitir que uma especificidade de anelamento de um oligonucleotídeo sejadualmente determinada por intermédio de uma estrutura do oligonucleotídeo.
Ainda outro objetivo desta invenção é proporcionar ummétodo para melhorar uma especificidade de anelamento de umoligonucleotídeo.
Outros objetivos e vantagens da presente invenção se tornarãoevidentes a partir da descrição detalhada tomada juntamente com os desenhose as reivindicações apendidas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
FIGS. IA e IB representam esquematicamente o princípio deoligonucleotídeo de especificidade dual (DS) desta invenção em uma reaçãode extensão dependente de gabarito. FIG IA mostra a especificidade dehibridização alta do oligonucleotídeo DS sob condições de estringência alta.FIG IB mostra tolerância de má combinação do oligonucleotídeo DS.
FIG 2 mostra representações esquemáticas para seletivamenteamplificar um ácido nucleico alvo de DNA de fita dupla usando iniciadoresoligonucleotídeo DS desta invenção.
FIG 3 mostra representações esquemáticas para seletivamenteamplificar um ácido nucleico alvo de mRNA usando iniciadoresoligonucleotídeo DS desta invenção.
FIG 4 mostra representações esquemáticas para reações deextensão dependente de gabarito em determinação seletiva de um ácidonucleico alvo usando oligonucleotídeos de especificidade dual sobremicroarranjo de oligonucleotídeos.
FIG 5 é uma fotografia de gel de agarose mostrando osresultados de amplificação por PCR para genes de família de citocina, IL-Iβ eIL-19, usando um conjunto de iniciadores convencionais (IL-lb-5'-0 e IL-Ib-3'-0, pista 1; IL-19-5'-0 e IL-19-3'-0, pista 3) e os oligonucleotídeos deespecificidade dual (IL-lb-5' e IL-lb-3', pista 2; IL-19-5' e IL-19-3', pista 4).M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp LadderPersonalizer (Seegene, Inc. Seoul, Coréia).
FIG 6A é uma fotografia de gel de agarose mostrando osresultados de 3'-RACE (amplificação rápida de extremidades de cDNA) dogene DEG 10, demonstrando especificidade de PCR do oligonucleotídeo deespecificidade dual. Pista 1 representa um iniciador com seqüência decombinação perfeita, pistas 2-4 representam iniciadores com 3, 2 e 1 máscombinações de bases em sua porção de especificidade de Tm baixa-3',respectivamente, e pistas 5-7 representam iniciadores com 5, 3 e 2 máscombinações de bases em sua porção de especificidade de Tm alta-5'. M é ummarcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp LadderPersonalizer.
FIG. 6B é uma fotografia de gel de agarose mostrando osresultados de 3'-RACE do gene DEG 10, demonstrando a tolerância à mácombinação do oligonucleotídeo de especificidade dual em PCR. Pista 1representa um iniciador com seqüência de combinação perfeita, pistas 2-4representam iniciadores com 3, 2 e 1 más combinações de bases em suaporção de especificidade de Tm baixa-3', respectivamente, e pistas 5-7representam iniciadores com 5, 3 e 2 más combinações de bases em suaporção de especificidade de Tm alta-5', respectivamente. M é um marcador detamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp Ladder Personalizer.
FIG 7A representa as seqüências de iniciadores 5' para 3'-RACE dos genes da família de homeobox específicos de placenta Psxl ePsx2. Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40 são iniciadores convencionais e Psxl-5'-41 ePsx2-5'-41 são iniciadores planejados de acordo com a presente invenção.
FIG 7B é uma fotografia de gel de agarose mostrando osresultados de 3 '-RACE de Psxl e Psx2. Pista 1, 3'-RACE de Psxl usando oiniciador oligonucleotídeo de especificidade dual Psxl-5'-41; Pista 2, 3'-RACE de Psx2 usando o iniciador oligonucleotídeo de especificidade dualPsx2-5'-41; Pista 3, 3'-RACE de Psxl usando iniciador convencional Psxl-5'-40; e Pista 4, 3'-RACE de Psx2 usando iniciador convenciona Psx2-5'-40. M éum marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bp LadderPersonalizer.
FIG 8 mostra os resultados de seqüenciamento cíclico diretopara genes Psxl e Psx2 de reunião de cDNA de placenta de camundongousando os iniciadores oligonucleotídeo de especificidade dual Psx 1-5'-41(para Psx 1) e Psx2-5'-41 (para Psx2) como um iniciador de seqüenciamento.
FIG 9 mostra os resultados de multiplex PCR usando 9conjuntos de iniciadores de especificidade dual específicos de gene da famíliade citocinas. Pista 1, multiplex PCR para 9 genes de citocinas; Pista 2,monoplex PCR para IL-3 (200 pb); Pista 3, monoplex PCR para IL-15 (250pb); Pista 4, monoplex PCR para IL-18 (300 pb); Pista 5, monoplex PCR paraIL-25 (350 pb); Pista 6, monoplex PCR para IL-2 (400 pb); Pista 7, monoplexPCR para IL-6 (450 pb); Pista 8, monoplex PCR para IL-19 (500 pb); Pista 9,monoplex PCR para IL-Ip (550 pb); e Pista 10, monoplex PCR para IL-IO(600 pb). M é um marcador de tamanho de 100-pb gerado por Forever 100-bpLadder Personalizer.
FIG 10 mostra os resultados de amplificação por PCR do genede glicoprotéina de fusão (F) de metapneumovírus de humano (hMPV) pelouso dos iniciadores de oligonucleotídeo de especificidade dual. Pista 1, PCRalvo usando hMPV5'-585 e conjunto de iniciadores 3-698 de hMPV; Pista 2,PCR alvo usando conjunto de iniciadores 5'-585 de hMPV e conjunto deiniciadores 3'-1007 de hMPV; Pista 3, PCR alvo usando iniciadores de β-actina de humano; Pista 4, PCR alvo sem gabarito; e Pista 5, PCR alvo semgabarito.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção em geral é direcionada a (a) uma amplavariedade de processos usando um oligonucleotídeo de especificidade dual e(b) um oligonucleotídeo de especificidade dual para o mesmo. Ooligonucleotídeo de especificidade dual desta invenção (daqui em diantereferido como "oligo DS") permite que iniciador ou sonda seja anelado emsua seqüência alvo com especificidade melhorada, de tal modo que aespecificidade da amplificação de ácido nucleico (em particular, PCR) e areação de hibridização possam ser significativamente melhoradas.Oligonucleotídeo de especificidade dual (Oligo DS)
Em um aspecto desta invenção, um oligonucleotídeo deespecificidade dual para sintetizar uma molécula de ácido nucleico por umareação de extensão dependente de gabarito, que é representada pela seguintefórmula geral:
5'-Xp-Yq-Zr-3
na qual, Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5' possuindouma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmentecomplementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizarcom o mesmo, Yq representa uma porção de separação compreendendo pelomenos duas bases universais, Zr representa a porção de especificidade de Tmbaixa-3' possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com o mesmo, p,qer representam o número de nucleotídeos,e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porção deespecificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm mais baixanas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas no ácidonucleico de gabarito, permitindo que a porção de especificidade de Tm alta-5'se separe da porção de especificidade de Tm baixa-3' em termos deespecificidade anelar para o ácido nucleico de gabarito, deste modo aespecificidade anelar do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela aporção de especificidade de Tm alta-5' e pela porção de especificidade de Tmbaixa-3' de tal maneira que a especificidade anelar total do oligonucleotídeoseja intensificada.
O termo "especificidade dual" com referência aooligonucleotídeo DS (daqui em diante referido como "oligo DS") destainvenção aqui usado é cunhado para descrever sua característica proeminentede que sua especificidade de anelamento em uma seqüência alvo é dualmentedeterminada por suas duas porções separadas, i.e., a porção de especificidadede Tm alta-5' a porção de especificidade de Tm baixa-3'. Em geral, aespecificidade de anelamento de iniciadores ou sondas é governada por suaseqüência consecutiva. Em contraste, a especificidade de anelamento do oligoDS é dualmente determinada por suas duas porções (a porção deespecificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3')separadas pela porção de separação, em cujo caso estas três porções estãolocalizadas em uma seqüência de oligonucleotídeo. Tal especificidade dualpermite que o oligo DS sirva como um iniciador e uma sonda exibindoespecificidade muito maior, tornando a presente invenção nova e não óbviasobre a técnica anterior.
Entretanto, o presente inventor já tem desenvolvido o ACP(iniciador de controle de anelamento) para melhorar a especificidade deanelamento como descrito em WO 03/050303, cujos ensinamentos são aquiincorporados como referência. O oligo DS desta invenção é distintamentediferente de ACP à luz do seguinte: (i) o oligo DS possui duas porções deespecificidade a serem hibridizadas com uma seqüência alvo enquanto que oACP possui apenas uma porção de especificidade; (ii) três porções no oligoDS são distintamente discriminadas em vista de Tm enquanto que as porçõesem ACP não o são; (iii) o iniciador DS é estendido para sintetizar umamolécula de ácido nucleico complementar ao gabarito apenas quandoanelamento ocorre por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5' e aporção de especificidade de Tm baixa-3', enquanto que o ACP é estendido atémesmo quando anelamento ocorre pela porção de extremidade 3'; e (iv) assima especificidade de anelamento ou de hibridização do oligo DS é determinadadualmente pelas duas porções separadas, i.e., a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3', enquanto que o ACP égovernado apenas pela porção de extremidade-3'. Conseqüentemente, poderiaser reconhecido que a especificidade de anelamento ou de hibridização dooligo DS em sua seqüência alvo é muito maior do que aquela de ACP,chamando a atenção de que o oligo DS é novo e não óbvio sobre o ACP.
A característica surpreendente do oligo DS é que possui trêsporções diferentes com propriedades distintas dentro de uma molécula deoligonucleotídeo: porção de especificidade de Tm alta-5', porção deespecificidade de Tm baixa-3' e porção de separação.
O oligo DS é útil em, uma ampla variedade de processos e deanálises envolvendo uma reação de extensão dependente de gabarito. O termoaqui usado "uma reação de extensão dependente de gabarito" significa umareação para estender uma molécula de oligonucleotídeo hibridizada em umaseqüência alvo pela incorporação de nucleotídeos sucessivos em seu grupo deextremidade no qual a seqüência estendida é determinada por uma seqüênciagabarito complementar.
Uma representação esquemática dos princípios governando aespecificidade de hibridização (anelamento) do oligo DS é ilustrada na Fig. A.Referindo à Fig. A, o oligo DS será descrito com mais detalhe.
Onde apenas a porção de especificidade de Tm alta-5' do oligoDS é anelada em um gabarito, ele não pode servir como um sítio de iniciaçãopara uma extensão dependente de gabarito, resultando em nenhumaocorrência de extensão.
Enquanto que a porção de especificidade de Tm alta-5' dooligo DS é anelada em uma seqüência não-alvo, a porção de especificidade deTm baixa-3' possuindo uma seqüência mais curta é improvavelmente aneladana seqüência não-alvo. As razões para isto são que a porção de especificidadede Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3'estão separadas pelaporção de separação em termos de eventos de anelamento. Em outraspalavras, a porção de especificidade de Tm baixa-3' está envolvida noseventos de anelamento em uma maneira relativamente independente daporção de especificidade de Tm alta-5' e o anelamento da porção deespecificidade de Tm baixa-3' é menos afetado pelo anelamento da porção deespecificidade de Tm alta-5'. Nesta conexão, a possibilidade de anelamento daporção de especificidade de Tm baixa-3' em uma seqüência não-alvo se tornamuito menor.
Onde apenas a porção de especificidade de Tm baixa-3' possuiuma seqüência complementar a um sítio não-alvo, o anelamento quer nãoocorre sob certas condições de estringência alta, e.g., condições estringentespara anelamento da porção de especificidade de Tm alta-5'. De acordo comuma modalidade preferida, é vantajoso realizar as reações de extensãodependente de gabarito usando o oligo DS sob condições estringentes comtemperatura de anelamento muito maior do que a Tm da porção deespecificidade de Tm baixa-3'.
Onde tanto a porção de especificidade de Tm alta-5' quanto aporção de especificidade de Tm baixa-3' possuem uma seqüênciasubstancialmente complementar com um gabarito, o oligo DS pode seranelado no gabarito e como conseqüência ocorre extensão bem sucedida.
Sem o desejo de se ligar a teoria, é crido que a porção deseparação torna a porção de especificidade de Tm baixa-3' mais sensível àscondições de anelamento (e.g., temperatura e complementaridade deseqüência). Com relação a isto, a incidência da hibridização não específicaentre a porção de especificidade de Tm baixa-3' e as seqüências não alvotorna-se muito menor sob certas condições de anelamento (ou estringentes).
Onde a porção de especificidade de Tm baixa-3' bem como a porção deespecificidade de Tm alta-5' é anelada em sua seqüência alvo, a extremidade-3' da porção de especificidade de Tm baixa-3' mais provavelmente gera umsítio extensível por DNA polimerases.
O termo "oligonucleotídeo" como aqui usado refere-se a umoligômero linear de ligações ou monômeros modificados ou naturais,incluindo desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos e semelhantes, capazesde especificamente hibridizarem com uma seqüência de nucleotídeos alvo,naturalmente ocorrente ou sinteticamente produzida. O oligonucleotídeo épreferivelmente de fita única para eficiência máxima em hibridização.
Preferivelmente, o oligonucleotídeo é um oligodesoxirribonucleotídeo. Ooligonucleotídeo desta invenção pode ser compreendido de dNMPnaturalmente ocorrente (i.e., dAMP, dGM, dCMP e dTMP), análogos denucleotídeo, ou derivados de nucleotídeo. O oligonucleotídeo também podeincluir ribonucleotídeos. Por exemplo, o oligonucleotídeo desta invençãopode incluir nucleotídeos com modificações de estrutura principal tais comoácido peptídeo-nucleico (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), fosforotioato DNA, fosforoditioato DNA, fosforamidato DNA,DNA amida-ligado, DNA MMI-ligado, 2'-0-metil-RNA, alfa-DNA e metil-fosfonato DNA, nucleotídeos com modificações de açúcar tais como 2'-0-metil RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alquil DNA, 2'-0-alil DNA,2'-0-alquinil DNA, hexose DNA, piranosil RNA, e hexitol DNA anidro, enucleotídeos possuindo modificações de base tais como pirimidinas C-5substituídas (substituintes incluindo fluoro-, bromo-, cloro-, iodo-, metil-, etil-vinil-, formil-, etinil-, propinil-, alquinil-, tiazolil-, imidazolil-, piridil-), 7-desazapurinas com substituintes C-7 (substituintes incluindo fluoro-, bromo-,cloro-, iodo-, metil-, etil-, vinil-, formil-, alquinil-, alquenil-, tiazolil-,imidazolil-, piridil-), inosina, e diamino-purina.
O termo "iniciador" como aqui usado refere-se a umoligonucleotídeo, que é capaz de atuar como um ponto de iniciação de síntesequando posto sob condições nas quais síntese de produto de extensão deiniciador que é complementar a uma fita de ácido nucleico (gabarito) éinduzida, i.e., na presença de nucleotídeos e de um agente para polimerização,tal como DNA polimerase, em uma temperatura e em um pH adequados. Oiniciador é preferivelmente de fita única para eficiência máxima emamplificação. Preferivelmente, o iniciador é um oligodesoxirribonucleotídeo.
O iniciador desta invenção pode ser compreendido de dNMP naturalmenteocorrente (i.e., dAMP, dGM, dCMP e dTMP), nucleotídeo modificado, ounucleotídeo não-natural. O iniciador também inclui ribonucleotídeos Oiniciador tem que ser suficientemente longo para iniciar a síntese de produtosde extensão na presença do agente de polimerização. O comprimento exatodependerá de muitos fatores, incluindo temperatura, aplicação, e fonte deiniciador. O termo "anelamento" ou "iniciação" como aqui usado refere-se àjustaposição de um oligodesoxinucleotídeo ou ácido nucleico em um ácidonucleico de gabarito, deste modo a justaposição permite que a polimerasepolimerize os nucleotídeos em uma molécula de ácido nucleico que écomplementar ao ácido nucleico de gabarito ou a uma sua porção. O termousado "hibridização" aqui usado refere-se à formação de um ácido nucleicode fita dupla a partir de ácidos nucleicos de fita única complementares. Nãohá distinção intencionada entre os termos "anelação" e "hibridização", e estestermos serão usados intercambiavelmente.
O termo aqui usado "sonda" refere-se a uma molécula de ácidonucleico de fita única compreendendo uma porção ou porções que é (são)substancialmente complementar(e)s a uma seqüência de nucleotídeos alvo.
O termo "porção" como aqui usado conjuntamente com ooligo DS desta invenção refere-se a uma seqüência de nucleotídeos separadapela porção de separação. O termo "porção de especificidade de Tm alta-5'Mou "porção de especificidade de Tm baixa-3"' refere-se a uma seqüência denucleotídeos na extremidade-5' ou na extremidade-3' do oligo DS destainvenção, respectivamente, que é separada pela porção de separação. O termo"porção de especificidade de Tm alta-5'" conjuntamente com o oligo DS éintencionado para se referir a uma porção com a Tm mais alta dentre as trêsporções e possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico codificadorgabarito. O termo "porção de especificidade de Tm baixa-3" em referência aooligo DS significa uma porção com uma Tm menor do que a de uma porção deespecificidade de Tm alta-5' mas maior do que a Tm da porção de separação epossuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmentecomplementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito.
O termo "Tm" como aqui usado refere-se à temperatura defusão na qual metade das moléculas de um duplex de ácido nucleico são defita única. Os termos "Tm alta" e "Tm baixa" conjuntamente com as porçõesno oligo DS são intencionados para descreverem um valor de Tm relativoainda não um valor de Tm absoluto. Isto é, é apenas requerido que a Tm deuma porção de especificidade de Tm alta-5' seja alta em relação àquela daporção de especificidade de Tm baixa-3'.
A porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' são planejadas para possuírem uma seqüênciade nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítiosobre uma molécula de ácido nucleico de gabarito para hibridizar com amesma. O termo "substancialmente complementar" em referência ao oligo DScomo aqui usado significa que a molécula de oligonucleotídeo ésuficientemente complementar para seletivamente hibridizar em umaseqüência de ácido nucleico de gabarito sob condições de anelamento oucondições estringentes planejadas, de tal modo que o oligonucleotídeoanelado pode ser estendido por uma polimerase para formar uma cópiacomplementar do gabarito. Portanto, este termo possui um significadodiferente de "perfeitamente complementar" ou seus termos relacionados. Seráreconhecido que uma porção de especificidade de Tm alta-5' e uma porção deespecificidade de Tm baixa-3' do oligo DS podem possuir uma ou mais máscombinações em um gabarito em uma extensão que o oligo DS pode servircomo iniciador ou sonda. Mais preferivelmente, a porção de especificidade deTm alta-5' e/ou porção de especificidade de Tm baixa-3' do oligo DS possuemuma seqüência de nucleotídeos perfeitamente complementar a um sítio sobreum gabarito, i.e., sem más combinações.
Para desempenho bem sucedido do oligo DS, é essencial que aTm de uma porção de especificidade de Tm alta-5' seja maior do que aquela daporção de especificidade de Tm baixa-3'. É preferido que a Tm de uma porçãode especificidade de Tm alta-5' varie de 40°C a 80°C, com maior preferência,40°C a 75°C, ainda com maior preferência, 50°C a 68°C, e maispreferivelmente, 50°C a 65°C. É preferido que Tm de uma porção deespecificidade de Tm baixa-3' varie de 10°C a 40°C, com maior preferência,15°C a 40°C, e mais preferivelmente, 20°C a 35°C. Preferivelmente, a Tm deuma porção de especificidade de Tm alta-5' é pelo menos 5°C mais alta, commaior preferência pelo menos 10°C, ainda com maior preferência pelo menos15°C, e mais preferivelmente pelo menos 20°C mais alta do que aquela daporção de especificidade de Tm baixa-3'. Vantajosamente, a Tm de umaporção de especificidade de Tm alta-5' é mais alta 5-70°C, preferivelmente,10-70°C, com maior preferência, 10-60°C, ainda com maior preferência, 10-50°C, ainda com preferência bem maior, 10-40°C e mais preferivelmente, 20-40°C do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3'.
De acordo com uma modalidade preferida, a porção deespecificidade de Tm alta-5' é mais longa do que a porção de especificidadede Tm baixa-3'. O comprimento da porção de especificidade de Tm alta-5' épreferivelmente 15 a 40 resíduos de nucleotídeos, com maior preferência, 15 a30 resíduos de nucleotídeos, e mais preferivelmente, 20 a 25 resíduos denucleotídeos. O comprimento da porção de especificidade de Tm baixa-3' épreferivelmente 3 a 15 resíduos de nucleotídeos, com maior preferência, 5 a15 resíduos de nucleotídeos, e mais preferivelmente, 6 a 12 resíduos denucleotídeos.
A porção de separação compreendendo pelo menos duas basesuniversais é parcialmente responsável pelas vantagens e características dooligo DS. O termo "base universal" como aqui usado refere-se a uma capaz deformar pares de bases umas com as outras das bases de DNA/RNA naturaiscom pouca discriminação entre elas.
Tem sido amplamente sabido que os nucleotídeos em algumasposições ambíguas de iniciadores degenerados têm sido substituídos pela baseuniversal tal como desoxiinosina (Ohtsuka, E. et al., (1985) J. Biol. Chem.260, 2605-2608; e Sakanari, J.A. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. 86,4863-4867), l-(2'-desoxi-beta-D-riboftiranosil)-3-nitro-pirrol (Nichols, R. etal., (1994) Nature 369, 492-493) e 5-nitro-indol (Loakes, D. et al., (1994)Nucleic Acids Res. 22, 4039-4043) para solucionar os problemas deplanejamento associados com os iniciadores degenerados, porque tais basesuniversais são capazes de parear bases não específicas com todas as quatrobases convencionais. Contido, não tem havido relatório de que estas basesuniversais permitem a formação de uma porção de uma molécula deoligonucleotídeo para gerar uma estrutura de bolha durante anelamento(hibridização) ou amplificação e então separam duas seqüências adjacentesopostas, resultando na elevação da especificidade de anelamento de iniciadorou sonda em uma seqüência alvo por especificidade dual por intermédio deduas porções de especificidade (anelamento) separada.
De acordo com uma modalidade preferida, a base universal naporção de separação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina,inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2!-OMe-inosina,2'-F-inosina, desoxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2'-OMe-3-nitro-pirrol, T-Y-3-nitro-pirrol, 1 -(2,-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desoxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desoxi-4-nitro-benzimidazol, 4-nitro-benzimidazol, desoxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desoxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, PNA-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5 -nitro-indol, fosforoamidato-nebularina,fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol,fosforoamidato-3 -nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações. Com maiorpreferência, a base universal ou análogo de base não-discriminatória édesoxiinosina, l-(2,-desoxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol, mais preferivelmente, desoxiinosina.
Tais bases universais podem estar contidas na porção deseparação em uma maneira contígua ou maneira interrompida com outrosnucleotídeos tais como dNMPs. É preferível que a porção de separaçãocompreenda nucleotídeos possuindo bases universais, preferivelmente,desoxiinosina.
É crítico que a porção de separação no oligo DS possua a Tmmais baixa nas três porções, com o objetivo de que a porção de separaçãoforme uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições deque a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' sejam aneladas no ácido nucleico de gabarito, permitindo que aporção de especificidade de Tm alta-5' se separe da porção de especificidadede Tm baixa-3' em termos de especificidade de anelamento no ácido nucleicode gabarito, deste modo a especificidade de anelamento do oligonucleotídeo édeterminada dualmente pela porção de especificidade de Tm alta-5' e pelaporção de seletividade de Tm baixa-3' de tal modo que a especificidade deanelamento total do oligonucleotídeo seja consideravelmente intensificada.
Preferivelmente, a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C, com maiorpreferência, 4°C a 15°C, e mais preferivelmente 5°C a 10°C.
De acordo com uma modalidade preferida, a porção deseparação entre a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' contém pelo menos 3 bases universais, commaior preferência pelo menos 4 bases universais, e mais preferivelmente pelomenos 5 bases universais. De acordo com uma modalidade preferida, a porçãode separação contém 2-10 bases universais, com maior preferência 3-10 basesuniversais, ainda com maior preferência, 4-8 bases universais, e maispreferivelmente, 5-7 bases universais.Onde um iniciador ou uma sonda possuindo uma seqüênciamais longa é requerido(a), as vantagens do oligo DS são mais realçadas. Porexemplo, de acordo com uma técnica convencional, um iniciador possuindouma seqüência de nucleotídeos mais longa do que 35 pb como uma seqüênciade hibridização é mais confiável para gerar amplicons não específicos. Emcontraste, o oligo DS pode gerar amplicons específicos até mesmo comseqüências longas, porque ele transporta duas seqüências de hibridização (i.e.,a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tmbaixa-3') separadas uma da outra em termos de interação molecular comgabaritos (i.e., anelamento). Por exemplo, o oligo DS pode conter 35-45 pb deuma seqüência de hibridização complementar a uma seqüência alvo. Comrelação a isto, poderia ser reconhecido que a presente invenção permite quesejam planejados iniciadores com seqüências muito maiores consideradascomo não praticáveis em estratégias de planejamento de iniciadorconvencionais.
De acordo com uma modalidade preferida, a porção deespecificidade de Tm alta-5' é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento, aporção de separação é de 3 a 15 nucleotídeos em comprimento, e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' é de 3 a 15 nucleotídeos em comprimento.
Com maior preferência, a porção de especificidade de Tm alta-5' é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento; a porção de separação é de 3 a10 nucleotídeos em comprimento; e a porção de especificidade de Tm baixa-3'é de 5 a 15 nucleotídeos em comprimento. Mais preferivelmente, a porção deespecificidade de Tm alta-5' é de 15 a 25 nucleotídeos em comprimento; aporção de separação é de 5 a 7 nucleotídeos em comprimento; e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' é de 6 a 10 nucleotídeos em comprimento. Deacordo com o oligo DS ilustrativo e exemplar descrito nos Exemplos, aporção de especificidade de Tm alta-5'é cerca de 20 nucleotídeos emcomprimento; a porção de separação é cerca de 5 nucleotídeos emcomprimento; e a porção de especificidade de Tm baixa-3' é cerca de 8-10nucleotídeos em comprimento.
Na modalidade mais preferida, o oligo DS é representado pelaseguinte fórmula geral: 5'-Xp-(dI)q.Zr-3' (definição e características de Xp e Zrsão as mesmas como descritas previamente, dl representa desoxiinosina, (dl)qrepresenta a porção de separação compreendendo nucleotídeos contíguospossuindo bases universais e q é um número inteiro entre 5 e 7).
O interessante é que o presente oligo DS também possuitolerância à má combinação sob as condições estringentes suficiente paratolerar má combinação em sua seqüência alvo.
Uma representação esquemática para os princípios governandoa tolerância à má combinação do oligo DS é ilustrada em Fig. 1B. Uma oumais, preferivelmente uma a três más combinações de bases na porção deespecificidade de Tm alta-5' podem ser toleradas sob a condição de que ambasa porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tmbaixa-3' sejam aneladas no gabarito. Uma ou mais, preferivelmente uma aduas más combinações de bases na porção de especificidade de Tm baixa-3'podem ser toleradas sob a condição de que ambas a porção de especificidadede Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' sejam aneladas nogabarito. Em adição, uma ou mais, preferivelmente uma a cinco máscombinações de bases em ambas a porção de especificidade de Tm alta-5' e aporção de especificidade de Tm baixa-3' podem ser toleradas sob condições deque ambas a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' sejam aneladas no gabarito.
Para impor tolerância à má combinação sobre o oligo DS, acondição de anelamento, notavelmente, a temperatura de anelamento éimportante. O anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre oanelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3', aindaanelamento por todas as porções ocorre quando a porção de especificidade deTm alta-5' e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3' possui uma ou mais,ainda limitadas, bases mal combinadas em seu sítio alvo. Os oligos DSpossuindo tolerância à má combinação são requeridos para amplificar oudetectar uma seqüência de nucleotídeos com diversidade genética. Os oligosDS com tolerância à má combinação podem ser anelados nas seqüências alvomostrando diversidade genética e resultam em amplificação e detecção bemsucedidas de seqüências de nucleotídeos de interesse. Em outras palavras, ooligo DS originalmente desenvolvido para dramaticamente intensificarespecificidade de anelamento e hibridização também pode ser usado emprocessos para requerer tolerância à má combinação onde condiçõesestringentes ou de anelamento são adequadamente ajustadas.
Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um métodopara permitir que uma especificidade de anelamento de um oligonucleotídeoseja dualmente determinada por intermédio de uma estrutura deoligonucleotídeo, que compreende as etapas de: (a) selecionar uma seqüênciade ácido nucleico; (b) planejar uma seqüência de um oligonucleotídeopossuindo (i) uma seqüência de hibridização substancialmente complementarao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelomenos duas bases universais, de tal modo que a porção de separação intervémna seqüência de hibridização para formar três porções no oligonucleotídeo; e(c) determinar a posição da porção de separação no oligonucleotídeo parapermitir que a porção na direção-5' da porção de separação possua uma Tmmais alta do que a da porção na direção-3' da porção de separação e parapermitir que a porção de separação possua a Tm mais baixa nas três porções,proporcionando deste modo um oligonucleotídeo possuindo três porçõesdiferentes com valores de Tm diferentes entre elas na qual (i) uma porção deespecificidade de Tm alta-5' do oligonucleotídeo possui uma seqüência denucleotídeos de hibridização substancialmente complementar ao ácidonucleico alvo, (ii) uma porção de especificidade de Tm baixa-3' dooligonucleotídeo possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao ácido nucleico alvo; e (iii) a porção deseparação do oligonucleotídeo entre a porção de especificidade de Tm alta-5' ea porção de especificidade de Tm baixa-3' compreende pelo menos duas basesuniversais; e a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' é maior do queaquela dá porção de especificidade de Tm baixa-3' e a porção de separaçãopossui a Tm mais baixa nas três porções, pelo qual a especificidade anelar dooligonucleotídeo para o ácido nucleico alvo é determinada dualmente tantopela porção de especificidade de Tm alta-5' quanto pela porção deespecificidade de Tm baixa-3'.
O presente método é direcionado para proporcionar umaabordagem nova para dramaticamente aumentar a especificidade deanelamento de um oligonucleotídeo a ser hibridizado com sua seqüência alvo.
O presente método também é expressado domo um método para melhoraruma especificidade de anelamento e um oligonucleotídeo. Além disso, apresente invenção é expressada como um método usando uma porção deseparação compreendendo pelo menos duas bases universais para melhorar aespecificidade de anelamento de um oligonucleotídeo hibridizado em umaseqüência alvo.
O presente método é realizado para preparar o oligo DSdiscutido aqui acima. Portanto, no interesse de evitar de redundânciadesnecessária, as descrições comuns entre eles não estão sendo repetidas massão incorporadas nesta descrição do método como se fossem repetidas.
A maioria dos métodos convencionais para planejamento deiniciadores ou sondas usa meramente uma seqüência como hibridizável emsuas seqüências alvo como disponível. Além disso, para aumentar aespecificidade de anelamento de oligonucleotídeos, tem sidoconvencionalmente tentado ajustar as condições de amplificação ou dehibridização tais como temperatura e concentração de íons.Em contraste, o presente método proporciona uma estratégianova para aumentar a especificidade de anelamento pela introdução decaracterísticas novas nas seqüências de oligonucleotídeo per se. O termo "porintermédio de uma estrutura do oligonucleotídeo" aqui usado com referência àpermissão de que a especificidade de anelamento de oligonucleotídeos sejadualmente determinada significa que a estrutura de oligonucleotídeoscontribui pesadamente para aumentar a especificidade de anelamento deoligonucleotídeos pela imposição sobre os oligonucleotídeos de umacaracterística nova para ser dualmente determinada em termos deespecificidade de anelamento.
É crítico no presente método o planejamento de uma seqüênciade um oligonucleotídeo possuindo (i) uma seqüência de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao ácido nucleico alvo e (ii) uma porção deseparação compreendendo pelo menos duas bases universais. Nesta etapa, oesboço estrutural do oligonucleotídeo é apresentado para mostrar uma porçãode extremidade-5' / porção de separação / porção de extremidade-3' nooligonucleotídeo. Ambas as porções de extremidade-5' e de extremidade-3'trazem uma seqüência de hibridização substancialmente complementar aoácido nucleico alvo e estão interpostas pela porção de separação.
A etapa mais crítica na presente invenção é determinar aposição da porção de separação no oligonucleotídeo para permitir que umaporção na direção-5' da porção de separação possua uma Tm maior do que ade uma porção na direção-3' da porção de separação e para permitir que aporção de separação possua a Tm mais baixa nas três porções, proporcionandodeste modo um oligonucleotídeo possuindo três porções distintas com valoresde Tm distintos uns dos outros.
As características estruturais novas introduzidas nosoligonucleotídeos pelo presente método são: (i) três porções distintas (porçãode especificidade de Tm alta-5', porção de separação e porção deespecificidade de Tm baixa-3') em seqüências de oligonucleotídeo; (ii) valoresde Tm diferentes uns dos outros das três porções; (iii) porção de separaçãoentre a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' compreendendo pelo menos duas bases universais; (iv) duasporções envolvidas em interação molecular com alvos em etapa deanelamento, que estão separadas em termos de evento de anelamento pelaporção de separação; (v) valores de Tm seguindo a ordem de a porção deespecificidade de Tm alta-5', porção de especificidade de Tm baixa-3' e porçãode separação. Tais características estruturais garantem que a especificidade deanelamento de oligonucleotídeos finalmente proporcionada pela presenteinvenção seja dualmente determinada por ambas a porção de especificidadede Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3', permitindo oaumento dramático na especificidade de anelamento de oligonucleotídeos emsua seqüência alvo.
Os oligonucleotídeos planejados e preparados de acordo com opresente método exibem especificidade de anelamento muito mais alta do queaqueles não possuindo tais três porções.
As características e vantagens do oligo DS serão descritascomo segue:
(a) a porção de separação do oligo DS compreende pelo menosduas bases universais que gera a região de Tm mais baixa no oligo DS5 demodo que forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sobcondições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' são aneladas no ácido nucleico de gabarito. Talestrutura de bolha de não pareamento de bases permite que a porção deespecificidade de Tm alta-5' se separe da porção de especificidade de Tmbaixa-3' em termos de especificidade de anelamento no ácido nucleico degabarito;
(b) A Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' é maior doque aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', e a porção deseparação mostra a Tm mais baixa, o que torna possível estabelecer condiçõesestringentes sob as quais não ocorre o anelamento pela porção deespecificidade de Tm baixa-3';
(c) assim, a especificidade total de anelamento do oligo DS édeterminada dualmente por ambas a porção de especificidade de Tm alta-5' e aporção de especificidade de Tm baixa-3'; e
(d) conseqüentemente, a especificidade total de anelamento dooligo DS é dramaticamente melhorada.
Pode ser reconhecido que o oligo DS da presente invenção émuito útil em uma variedade de (i) métodos de amplificação de ácido nucleicocodificador baseados em iniciador tais como os métodos de Miller, Η. I. (WO89/06700) e Davey, C. et al. (EP 329,822), Reação em Cadeia da Ligase(LCR, Wu, D.Y. et al., Genomics 4:560 (1989)), Reação em Cadeia daPolimerase Ligase (Barany, PCR Methods and Applic., 1:5-16(1991)), Gap-LCR (WO 90/01069), Reação em Cadeia de Reparo (EP 439.182), 3 SR(Kwoh et al., PNAS, USA, 86:1173(1989)) e NASBA (Pat. U.S. de No.5.130.238), (ii) tecnologias baseadas em extensão de iniciador tais comoseqüenciamento cíclico (Kretz et al., (1994) Cycle sequeneing. PCR MethodsAppl. 3:S107-S112) e pirosseqüenciamento (Ronaghi et al., (1996) Anal.Bioehem., 242:84-89; and (1998) Science 281:363-365), e (iii) tecnologiasbaseadas em hibridização tal como detecção de uma seqüência denucleotídeos alvo usando microarranjo de oligonucleotídeo.
O oligo DS da presente invenção pode ser aplicado em umavariedade de tecnologias baseadas em amplificação, seqüenciamento ehibridização de ácido nucleico. Exemplos representativos para provar o efeitodo oligo DS são como segue:
I. Aplicação para sintetizar uma molécula de ácido nucleico
Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um métodopara sintetizar uma molécula de ácido nucleico usando oligonucleotídeo deespecificidade dual por uma reação de extensão dependente de gabarito, quecompreende as etapas de:
(a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual em umamolécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo deespecificidade dual possui três porções nas quais uma porção deespecificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácidonucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, uma porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com o mesmo; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' émaior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a separaçãopossui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separação forma umaestrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais aporção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tmbaixa-3' são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamento érealizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por umaporção de especificidade de Tm baixa-3'; e
(b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual parasintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao ácido nucleico degabarito.
Visto que o método de síntese desta invenção emprega o oligoDS desta invenção, as descrições comuns entre eles são omitidas com oobjetivo de evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretandomultiplicidade indevida.
Este pedido usando o oligo DS da presente invenção podeproporcionar um método melhorado para seletivamente sintetizar umaseqüência de ácido nucleico complementar a uma seqüência alvo por umareação de extensão dependente de gabarito envolvendo etapas de anelamentoe extensão. Em particular, a síntese de uma seqüência de ácido nucleicocomplementar a uma seqüência alvo pode ser realizada pela repetição doprocesso de reação de extensão dependente de gabarito no qual as etapas deanelamento e extensão são seguidas pela etapa de desnaturação.
O método da presente invenção pode ser usado para sintetizaruma molécula de ácido nucleico complementar a qualquer molécula de ácidonucleico de gabarito. Tal molécula pode ser quer DNA quer RNA. Amolécula pode estar na forma quer de fita única quer de fita dupla. Onde oácido nucleico como material inicial é de fita dupla, é preferido tornar as duasfitas em uma forma de fita única ou parcialmente de fita única. Métodos queconhecidamente separam as fitas incluem, mas sem limitação, aquecimento,tratamento com álcali, com formamida, com uréia ou com glioxal, métodosenzimáticos (e.g., ação de helicase), e proteínas ligantes. Por exemplo,separação de fitas pode ser realizada por aquecimento em temperaturavariando de 80°C a 105°C. Métodos gerais para realizar este tratamento sãoproporcionados por Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y.(2001).
Onde um mRNA é empregado como material inicial, umaetapa de transcrição reversa é necessária antes da realização da etapa deanelamento, cujos detalhes são encontrados em Joseph Sambrook, et al.,Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic AcidsRes. 16:10366 (1988)). Para transcrição reversa, é usado um iniciadoroligonucleotídeo dT hibridizável em cauda poli A de mRNA. O iniciadoroligonucleotídeo dT é compreendido de dTMPs, um ou mais dos quais podeser substituído por outros dNMPs desde que o iniciador dT possa servir comoiniciador. Transcrição reversa pode ser feita com transcriptase reversa quepossui atividade de RNase H. Se se utiliza uma enzima possuindo atividadede RNase H, pode ser possível omitir a etapa de digestão por R Nase Hseparada pela escolha cuidadosa das condições de reação.
Os presentes métodos não requerem que as moléculas de ácidonucleico de gabarito possuam qualquer comprimento ou seqüência particular.
Em particular, as moléculas incluem qualquer ácido nucleico procariótico,eucariótico (por exemplo, de protozoário e de parasitas, de fungos, delevedura, de plantas superiores, de animais inferiores e superiores, incluindomamíferos e humanos), viral (por exemplo, vírus do Herpes, fflV, vírus deinfluenza, vírus Epstein-Barr, vírus da hepatite, poliovírus, etc.), ou viróide. Amolécula de ácido nucleico também pode ser qualquer molécula de ácidonucleico que tem sido ou pode ser quimicamente sintetizada. Assim aseqüência de ácido nucleico pode ou não ser encontrada na natureza.
O oligo DS usado na presente invenção é hibridizado ouanelado em um sítio sobre o gabarito de tal modo que seja formada umaestrutura de fita dupla. Condições de anelamento de ácido nucleico adequadaspara formar tais estruturas de fita dupla são descritas por Joseph Sambrook, etal., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) e Haymes, B. D., et al.,Nucleic Aeid Hybridization, A Praetieal Approaeh, IRL Press, Washington,D.C. (1985). As seqüências da porção de especificidade de Tm alta-5' e daporção de especificidade de Tm baixa-3' do oligo DS não precisam exibircomplementaridade precisa, porém necessitam apenas ser substancialmentecomplementares em seqüência para serem capazes de formarem uma estruturade fita dupla estável. Assim, desvios da complementaridade completa sãopermissíveis, desde que tais desvios não sejam suficientes paracompletamente impedirem a hibridização para formar uma estrutura de fitadupla. Anelamento do oligo DS em um sítio sobre o ácido nucleico degabarito é um pré-requisito para sua polimerização dependente de gabaritocom polimerases. Fatores (veja Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning,A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, N.Y.(2001); e Haymes, B.D., et. al., Nucleic Aeid Hybridization, APraetieal Approaeh, IRL Press, Washington, D.C.(1985)) que afetam opareamento de bases do oligo DS em seus ácidos nucleicos complementaressubstancialmente afetam a eficiência de iniciação. A composição denucleotídeos do oligo DS pode afetar a temperatura na qual o anelamento éótimo e portanto pode afetar sua eficiência de iniciação.
A porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' do oligo DS durante a etapa de anelamentodesempenham um papel como uma porção de hibridização ou um sítio dedeterminação de especificidade (i.e., sítio de determinação de especificidadedual), enquanto que a porção de separação não serve como um sítio dehibridização e não interage com o gabarito para pareamento de bases.
Uma variedade de DNA polimerases pode ser usada na etapade extensão dos presentes métodos, que inclui fragmento de "Klenow" e DNApolimerase I de E. eoli, uma DNA polimerase termoestável, e DNApolimerase de bacteriófago T7. Preferivelmente, a polimerase é uma DNApolimerase termoestável que pode ser obtida de uma variedade de espéciesbacterianas, incluindo Thermus aquatieus (Taq), Thermus thermophilus (Tth),Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermocoeeus literalis, e Pyrocoeeusfuriosus (Pfu). Quando uma reação de polimerização estiver sendo conduzida,é preferível proporcionar os componentes requeridos para tal reação emexcesso no vaso de reação. Excesso em referência aos compostos da reação deextensão refere-se a uma quantidade de cada componente de tal modo que acapacidade para alcançar a extensão desejada não seja substancialmentelimitada pela concentração daquele componente. É desejável proporcionar àmistura reacional uma quantidade de cofatores requeridos tais como Mg2+ ,dATP, dCTP, dGTP, e dTTP em quantidade suficiente para manterem o graude extensão desejada.
Anelamento ou hibridização no presente método é realizadosob condições estringentes que permitem a ligação específica entre o oligo DSe o ácido nucleico de gabarito. Tais condições estringentes para anelamentoserão dependentes de seqüência e variadas dependendo dos parâmetrosambientais. No presente método, a etapa de anelamento é geralmenterealizada sob condições de estringência alta. In Contudo, se o presentemétodo for aplicado em processos requerendo tolerância à má combinação,será preferível que a etapa de anelamento seja realizada sob condiçõesestringentes nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' são aneladas no gabarito a despeito da presençade uma ou mais, ainda limitadas, más combinações de pares de bases. Taltolerância à má combinação é muito útil na amplificação ou detecção de umgene com diversidade genética. Condições estringentes podem serprontamente determinadas do conhecimento padrão na técnica.
É vantajoso realizar a etapa de anelamento em umatemperatura de anelamento maior do que a Tm da porção de especificidade deTm baixa-3', garantindo que não ocorra anelamento apenas pela porção deespecificidade de Tm baixa-3'. Preferivelmente, a temperatura de anelamentoé mais alta pelo menos 5°C, com maior preferência pelo menos 10°C, aindacom maior preferência pelo menos 15°C, e mais preferivelmente pelo menos20°C do que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3'.
Em uma modalidade preferida, a temperatura de anelamentovaria de cerca de 40°C a 75°C, com maior preferência, 45°C a 72°C, aindacom maior preferência, 50°C a 68°C, e mais preferivelmente, 55°C a 65°C.
Temperaturas de anelamento adequadas no presente método podem serdeterminadas pela consideração independentemente do valores de Tm daporção de especificidade de Tm alta-5' e da porção de especificidade de Tmbaixa-3'. Em outras palavras, temperaturas de anelamento no presente métodonão são determinadas pelo comprimento total e pelas composições denucleotídeos de ambas a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' mas pelo comprimento individual e pelacomposição individual da porção de especificidade de Tm alta-5' e/ou daporção de especificidade de Tm baixa-3'. Normalmente, a temperatura deanelamento determinada pela consideração apenas da Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' pode ser muito maior do que a Tm da porção deespecificidade de Tm baixa-3' e se tornar uma ótima.
Se tolerância à má combinação for requerida na etapa deanelamento, será preferido que a temperatura de anelamento seja ajustadapara se tornar menor do que aquelas indicadas acima.
O presente método pode ser combinado com muitos outrosprocessos conhecidos na técnica para alcançar um objetivo específico. Porexemplo, o isolamento (ou a purificação) de produto sintetizado pode depoisda reação de extração. Isto pode ser realizado por eletroforese em gel,cromatografia em coluna, cromatografia de afinidade, ou hibridização. Emadição, o produto sintetizado desta invenção pode ser inserido em veículoadequado para clonagem. Além disso, o produto sintetizado desta invençãopode ser expressado em um vetor de expressão hospedando hospedeiroadequado.
II. Aplicação para amplificar seqüência de ácido nucleico alvo
Em ainda outro aspecto desta invenção, é proporcionado ummétodo para seletivamente amplificar uma seqüência de ácido nucleico alvo apartir de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos, que compreendeamplificar a seqüência de ácido nucleico alvo pela realização de pelo menosdois ciclos de anelamento de iniciador, extensão de iniciador, e desnaturação,usando um par de oligonucleotídeos de especificidade dual como uminiciador; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui trêsporções nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aum sítio sobre o ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, umaporção de separação compreende pelo menos duas bases universais e umaporção de especificidade de Tm baixa-3' possui uma seqüência denucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobreo ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porção deespecificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm mais baixanas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de nãopareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas no ácidonucleico alvo; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sobcondições nas quais não ocorre anelamento apenas pela porção deespecificidade de Tm baixa-3'.
Visto que o método de amplificação desta invenção emprega ooligo DS desta invenção, as descrições comuns entre eles são omitidas com opropósito de se evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretandomultiplicidade indevida. Em adição, visto que este método envolve processosde anelamento e extensão, as descrições dos dois processos são omitidas como objetivo de se evitar a complexidade deste relatório descritivo acarretandomultiplicidade indevida. Por exemplo, a composição e a estrutura do oligo DSusado e as condições para o anelamento e a extensão são comuns entre esteprocesso e o método para a síntese de molécula de ácido nucleico previamentediscutido.
Este pedido usando o oligo DS da presente invenção podeproporcionar um método melhorado para seletivamente amplificar umaseqüência de ácido nucleico alvo a partir de um ácido nucleico ou de umamistura de ácidos nucleicos (DNA ou mRNA) pela realização deamplificações de ácido nucleico codificador, preferivelmente, PCR (reaçãoem cadeia de polimerase).
Uma representação esquemática para a amplificação seletivade um ácido nucleico alvo de DNA de fita dupla usando o oligo DS comodescrito acima é ilustrada na Fig. 2. Como mostrado na Fig. 2, um par deoligos DS é anelado em um dsDNA gabarito desnaturado. A porção deespecificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3'durante o anelamento desempenham um papel como uma porção dehibridização ou um sítio de determinação de especificidade (i.e., sítio dedeterminação de especificidade dual), enquanto que a porção de separaçãonão serve como um sítio de hibridização e não interage com o gabarito parapareamento de bases. Neste momento, a porção de separação forma umaestrutura de bolha no oligo DS, com o objetivo de que duas porções deextremidade, i.e., a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' podem estar espacialmente separadas paradualmente determinar a especificidade total do oligo DS. Detalhes de reaçõessubseqüentes são similares àqueles das amplificações de ácido nucleicobaseadas em iniciador convencional conhecidas na técnica descrita aquiacima.
O presente método para amplificar uma seqüência de ácidonucleico pode ser realizada de acordo com várias amplificações de ácidonucleico baseadas em iniciador conhecidas na técnica. Preferivelmente, osmétodos são realizados de acordo com o processo de PCR descrito emPatentes U.S. 4.683.195, 4.683.202, e 4.800.159, com maior preferência, ométodo de "hot start PCR".
Fig. 3 ilustra uma representação esquemática para aamplificação seletiva de um ácido nucleico alvo de mRNA usando o oligoDS. Na primeira etapa, mRNA obtido de várias amostras biológicas éreversamente transcrito usando o iniciador oligo dT hibridizável na cauda poliA de mRNA e transcriptase reversa. Detalhes de transcrição reversa sãoencontrados em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001); e Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res. 16:10366 (1988)). Adescrição de reações subseqüentes é similar àquela das amplificações de ácidonucleico baseadas em iniciador convencionais conhecidas na técnica discutidapreviamente.
III. Aplicação em amplificacão de Multiplex DNA
Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um métodopara amplificar duas ou mais seqüências de nucleotídeos alvosimultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadores na mesma reação,que compreende amplificar as seqüências de nucleotídeos alvo pela realizaçãode pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão edesnaturação de iniciador, usando dois ou mais pares de oligonucleotídeos deespecificidade dual como um iniciador, caracterizado pelo fato de que osoligonucleotídeos de especificidade dual possuem três porções nas quais umaporção de especificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeosde hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência denucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeosalvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porçãode separação possui a Tm mais baixa nas três porções; uma porção deseparação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sobcondições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo;no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nasquais não ocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tmbaixa-3'.
Este pedido usando o oligo DS da presente invenção tambémpode proporcionar um método melhorado para amplificar mais do que umaseqüência alvo usando mais do que um par de iniciadores na mesma reação.
Em geral, é extremamente difícil configurar condições de multiplex PCR paraamplificar mais do que 10 seqüências alvo em paralelo, porque uma reaçãoPCR ótima é requerida para amplificar até mesmo um locus específico semquaisquer subprodutos não específicos. Visto que o anelamento necessitaocorrer em temperatura suficientemente alta para permitir a ocorrência dascombinações perfeita de DNA-DNA na reação, o oligo DS da presenteinvenção é ideal na otimização de amplificação de multiplex DNA devido àsua função de melhoria da especificidade de amplificação. "Multiplex PCR"como aqui usado refere-se à amplificação simultânea de alvos de multiplexDNA em uma única mistura de reação em cadeia de polimerase (PCR).
Em uma modalidade específica desta invenção, este processode Multiplexação compreende realização de uma reação de amplificaçãocompreendendo pelo menos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensãoe desnaturação de iniciador, usando os pares de iniciadores de oligo DS,caracterizado pelo fato de que os iniciadores são um oligonucleotídeo deespecificidade dual possuindo três porções nas quais uma porção deespecificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência denucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeosalvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porçãode separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo; no qual oanelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quaisnão ocorre anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3'.
Visto que esta aplicação usando o oligo DS desta invenção érealizada de acordo com o presente método para amplificação de seqüência deácido nucleico previamente discutido, exceto pelo uso de mais do que umaseqüência de nucleotídeos alvo e pares de iniciadores, as descrições comunsentre eles são omitidas para se evitar a complexidade deste relatório descritivoacarretando multiplicidade indevida. Por exemplo, a composição e a estruturado oligo DS usado e as condições para amplificação, são comuns entre esteprocesso e os presentes métodos para amplificação de seqüência de ácidonucleico previamente discutido.
De acordo com uma modalidade preferida, a temperatura deanelamento varia de cerca de 40°C a 70°C, com maior preferência, 450C a68°C, ainda com maior preferência, 50°C a 65°C, e mais preferivelmente,55°C a 65°C.
Em uma modalidade preferida, os produtos amplificados decada uma das seqüências de nucleotídeos alvo são diferentes em tamanho paraanálise subseqüente. De acordo com uma modalidade preferida, os produtosde amplificação das seqüência de nucleotídeos alvo multiplex podem seranalisados por meio de separação de tamanho. A comparação de separação detamanho é realizada usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica,tais como eletroforese através de uma matriz de gel de poliacrilamida oumatriz de gel de agarose e seqüenciamento de nucleotídeos. Oseqüenciamento de nucleotídeos pode ser rapidamente realizado com umseqüenciador automático disponível em vários fabricantes.Como exemplificado em Exemplo abaixo, a multiplexaçãodesta invenção permite que os produtos amplificados finais estejam livres deproblemas de resíduos gênicos bem como de não-especificidade decorrente deprocessos multiplex convencionais conhecidos na técnica.
A vantagem da amplificação multiplex é que numerosasdoenças ou alterações de seqüência de nucleotídeos específicas (e.g.,polimorfismo de nucleotídeo único ou mutação pontual) podem ser ensaiadasna mesma reação. O número de análises que podem ser realizadassimultaneamente é ilimitado; contudo, o limite superior é provavelmentecerca de 20 e é provavelmente dependente da diferença de tamanho requeridapara resolução e métodos que estão disponíveis para resolver o produtoamplificado.
O método da presente invenção pode ser aplicado para odiagnóstico de doenças genéticas e infecciosas, determinação de gênero,análise de ligação genética, e estudos forenses.
IV. Aplicação em seqüenciamento de DNA
A especificidade melhorada permite que oligo DS seja usadoem seqüenciamento direto como um iniciador de seqüenciamento em fase desolução (em particular, seqüenciamento cíclico) ou como uma sonda deseqüenciamento em fase sólida (em particular, seqüenciamento de chip deoligonucleotídeo) pelo uso do princípio de extensão dependente de gabaritodo oligo DS.
Em ainda outro aspecto desta invenção, é proporcionado ummétodo para seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvo usando umoligonucleotídeo de especificidade dual a partir de um DNA ou de umamistura de ácidos nucleicos, que compreende as etapas de:
(a) seqüenciar uma molécula de ácido nucleico complementarà molécula de ácido nucleico alvo a ser seqüenciada pela realização de pelomenos dois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação deiniciador, usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como uminiciador de seqüenciamento; no qual o oligonucleotídeo de especificidadedual possui três porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5'possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmentecomplementar ao sítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizarcom a mesma, a porção de separação compreende pelo menos duas basesuniversais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aosítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com a mesma,Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porçãode especificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm maisbaixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha denão pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidadede Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas namolécula de ácido nucleico alvo; no qual o anelamento na reação de síntese érealizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pelaporção de especificidade de Tm baixa-3'; e
(b) determinar uma seqüência de nucleotídeos da molécula deácido nucleico complementar sintetizada.
Geralmente, seqüenciamento de DNA tem sido realizado porvárias metodologias tais como seqüenciamento de Maxam-Gilbert,seqüenciamento de Sanger, pirosseqüenciamento, e seqüenciamento comdigestão por exonuclease. O presente método de seqüenciamento intenciona opirosseqüenciamento bem como seqüenciamento cíclico térmico.
O presente método pode ser realizado de acordo com variaçõesdo método de didesoxi de Sanger. Seqüenciamento cíclico térmico dapresente invenção pode ser realizado em gabaritos de ácido nucleicoamplificados por PCR. Em adição, de acordo com a invenção,seqüenciamento cíclico térmico serão realizados sobre um gabarito de ácidonucleico que não tem sido amplificado por PCR imediatamente antes doseqüenciamento.
Em resumo, seqüenciamento de Sanger é baseado no princípiode que DNA polimerase incorporará 2',3'-didesoxinucleotídeos em cadeias deácido nucleico resultando em terminação de cadeia (Sanger et al., (1977)PNAS. USA 74:5463). O método desenvolvido por Sanger é referido como ométodo de terminação de cadeia didesoxi. No mais tradicional deste método,um segmento de DNA para o qual a seqüência é desejada é clonado em umfago de DNA de fita única, tal como Ml3. Estes DNAs de fago podem servircomo modelos para a síntese iniciada da fita complementar pelo fragmento deKlenow de DNA polimerase I. O iniciador é um oligonucleotídeo sintéticopara hibridizar especificamente com uma região do vetor Ml3 próxima daextremidade 3' do inserto clonado. Em cada uma de quatro reações deseqüenciamento, a síntese iniciada é realizada na presença de didesoxi-análogo suficiente de um dos quatro possíveis desoxinucleotídeos, com oobjetivo de que as cadeias em crescimento sejam aleatoriamente terminadaspela incorporação destes nucleotídeos de extremidade-morta. A concentraçãorelativa das formas didesoxi para desoxi é ajustada para dar uma propagaçãode eventos de terminação correspondendo a todos os possíveis comprimentosde cadeia que podem ser resolvidos por eletroforese em gel. Marcadoresincorporados nas cadeias em crescimento são usados para desenvolverimagem de autorradiograma do padrão de DNA em cada canaleta deeletroforese. A seqüência dos desoxinucleotídeos no gabarito de ácidonucleico clonado é determinada a partir de um exame do padrão de bandasnas quatro pistas.
Como uma variação do método de Sanger, o método deseqüenciamento cíclico térmico normalmente envolve o uso de soluçõescontendo um iniciador de seqüenciamento de ácido nucleico,desoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs), uma solução tampão adequada, umaDNA polimerase termicamente estável (e.g., Taq polimerase), e o gabarito deácido nucleico a ser seqüenciado. Os detalhes de seqüenciamento cíclicotérmico podem ser encontrados em Patentes U.S. 5.432.065, 5.23.298,5.756.285, 5.817.797 e 5.831.065, cujos ensinamentos são aqui incorporadoscomo referências em suas totalidades. Os processos do método sãogeralmente realizados sob condições de ciclo térmico similares à PCRcomum.
Uma vez tendo sido realizada uma reação de seqüenciamentosobre um gabarito de ácido nucleico, a determinação da seqüência damolécula requer que os produtos de reação sejam identificados. Um númeroconsiderável de métodos de detecção é conhecido na técnica. Estes métodosgeralmente envolvem a detecção de marcadores incluindo marcadores deradionuclídeo, fluorescentes, de infravermelho e quimioluminescentes comodescritos em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology,(1993) John Wiley & Sons, Inc., New York, N.Y. Os marcadores podem sermarcados com iniciadores ou ddNTP, preferivelmente, ddNTP. O marcadormais preferido é um fluorescente incluindo 6- carbóxi-fluoresceína, 6-carbóxi-X-rodamina, 3-(8-carbóxi-pentil)-3'-etil-5,5'-dimetil-oxa-carbocianina, 6-carbóxi-X-rodamina, derivados de ácido 4,4-difluoro-4-bora-3oc,4a-diaza-s-indaceno-3-propiônico, e corantes de 4,7-dicloro-rodamina.
Preferivelmente, a temperatura de anelamento varia de cercade 40°C a 70°C, com maior preferência, 450C a 68°C, e mais preferivelmente,50°C a 65°C.
O presente método prova um seqüenciamento específico altode uma molécula de ácido nucleico alvo como demonstrado no Exemplo aquiabaixo. Mais especificamente, os genes da família homeobox específicos deplacenta de camundongo, Psxl e Psx2 podem ser diferentementeseqüenciados usando nosso iniciador de seqüenciamento planejado parapossuir uma estrutura incomum de oligo DS. Tal seqüenciamento diferencialé realçado no sentido de que as seqüências totais dos iniciadores deseqüenciamento são diferentes em apenas uma base em uma porção deespecificidade de Tm baixa-3'.
Surpreendentemente, a presente invenção permite que umamolécula de ácido nucleico alvo contida em um DNA genômico ou umapopulação de cDNAs seja diretamente seqüenciada sem purificação ouisolamento. O sucesso no seqüenciamento direto de uma molécula de ácidonucleico alvo em um DNA genômico ou em uma população de cDNAs aindanão tem sido relatado. Onde o presente método de seqüenciamento éempregado para diretamente seqüenciar uma molécula de ácido nucleico alvocontida em uma população de cDNAs a partir de um RNA total, este métodocompreende as etapas de:
(a) contatar uma população de mRNAs com um iniciadoroligonucleotídeo dT que é hibridizado na cauda poli A de mRNAs sobcondições suficientes para ocorrer a síntese de ácido desoxirribonucleicoenzimática conduzida por gabarito;
(b) reversamente transcrever os mRNAs nos quais o iniciadoroligonucleotídeo dT hibridiza para produzir uma população de fitas deprimeiro DNA que são complementares aos mRNAs nos quais o iniciadoroligonucleotídeo dT hibridiza;
(c) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar àprimeira fita de cDNA a ser seqüenciada pela realização de pelo menos doisciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador,usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como um iniciador deseqüenciamento; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui trêsporções nas quais uma porção de especificidade de Tm aIta-5' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aosítio sobre a primeira fita de cDNA para hibridizar com a mesma, a porção deseparação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção deespecificidade de Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a primeira fita decDNA para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tmalta-5'é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', aporção de separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção deseparação forma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sobcondições nas quais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção deespecificidade de Tm baixa-3' são aneladas na primeira fita de cDNA; no qualo anelamento na reação de síntese é realizado sob condições nas quais nãoocorre o anelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3'; e
(d) determinar uma seqüência de nucleotídeos da primeira fitade cDNA sintetizada.
V. Aplicação em detecção de molécula de ácido nucleico com diversidadegenética
Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um métodopara detectar uma molécula de ácido nucleico com diversidade genética poruma reação de extensão dependente de gabarito de um oligonucleotídeo deespecificidade dual, que compreende as etapas de:
(a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual em umamolécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo deespecificidade dual possui três porções nas quais uma porção deespecificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar ao sítio sobre o ácido nucleicode gabarito para hibridizar com a mesma, a porção de separação compreendepelo menos duas bases universais e uma porção de especificidade de Tmbaixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'émaior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porção deseparação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamentoé realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas pelaporção de especificidade de Tm baixa-3' e anelamento ocorre quando a porçãode especificidade de Tm alta-5' e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3'possui uma ou mais bases mal combinadas em seu sítio alvo; e
(b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual parasintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito.
(c) detectar a ocorrência de extensão dependente de gabaritodo oligonucleotídeo de especificidade dual.
Visto que esta aplicação usando o oligo DS desta invenção érealizada de acordo com os presentes métodos para sintetizar a seqüência deácido nucleico previamente discutida, as descrições comuns entre eles sãoomitidas com o propósito de se evitar complexidade deste relatório descritivoacarretando multiplicidade indevida.
Esta aplicação usando o oligo DS da presente invenção podeproporcionar um método melhorado para seletivamente detectar umaseqüência de ácido nucleico com diversidade genética por uma reação deextensão dependente de gabarito envolvendo etapas de anelamento eextensão. Em particular, a detecção de uma seqüência de ácido nucleico alvocom diversidade genética pode ser realizada pela repetição do processo dereação de extensão dependente de gabarito no qual as etapas de anelamento ede extensão são seguidas pela etapa de desnaturação
A presente invenção é baseada em tolerância à má combinaçãodo oligo DS.
Diversidade genética tem sido relatada para vários genomas.Este fenômeno tem sido considerado um obstáculo para detectar um gene ougenoma de interesse sem falha. A presente invenção é direcionada paraproporcionar uma abordagem para suplantar tais problemas convencionaispelo uso de oligo DS com tolerância à má combinação. O oligo DS com umaseqüência definida pode ser anelado em várias seqüências alvo mostrandodiversidade genética e resultar em amplificação e detecção bem sucedidas dasseqüências de nucleotídeos de interesse. Em outras palavras, o oligo DSoriginalmente desenvolvido para dramaticamente intensificar a especificidadede anelamento e de hibridização também pode ser usado em processosrequerendo tolerância à má combinação onde condições estringentes eanelamento são adequadamente ajustadas.
Para proporcionar o oligo DS demonstrando tolerância à mácombinação, ele deve ser planejado tendo por base uma região conservada demoléculas de ácido nucleico geradas pelo alinhamento de todas as seqüênciasde nucleotídeos disponíveis. O termo "região conservada" como aqui usadorefere-se a um segmento de seqüência de nucleotídeos de um gene ou umaseqüência de aminoácidos de uma proteína que é significativamente similarentre várias seqüências de nucleotídeos diferentes de um gene. Este termo éintercambiavelmente usado com o termo "seqüência conservada".
Em uma modalidade preferida, a seqüência mais conservadadentro da região conservada está localizada na porção de extremidade-3' dooligo DS e a seqüência menos conservada em uma porção de separação. Aporção de especificidade de Tm alta-5' e/ou a porção de especificidade de Tmbaixa-3', preferivelmente a porção de especificidade de Tm alta-5' podempossuir uma ou mais, preferivelmente, uma a três, com maior preferência umaou duas bases mal combinadas em seu sítio alvo devido à tolerância à mácombinação do oligo DS.
Para impor tolerância à má combinação ao oligo DS, acondição de anelamento, em particular, temperatura de anelamento éimportante. O anelamento é realizado sob condições nas quais não ocorre oanelamento apenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3', porémocorre anelamento por todas as porções quando a porção de especificidade deTm alta-5' e/ou a porção de especificidade de Tm baixa-3' possui uma ou maisbases mal combinadas em seu sítio alvo.
Preferivelmente, a temperatura de anelamento varia de cercade 40°C a 70°C, com maior preferência, 45°C a 68°C, e mais preferivelmente,50°C a 65°C.
De acordo com uma modalidade preferida, a presente invençãoé realizada de acordo com a reação em cadeia de polimerase (PCR).
A etapa de detecção do presente método pode ser realizada poruma multiplicidade de técnicas convencionais. Por exemplo, a detecção doproduto da extensão dependente de gabarito pode ser prontamente realizadapor eletroforese em gel convencional se o presente método for executado emuma maneira repetida para gerar produtos suficientes para serem detectadosem um gel. Se materiais marcados incluindo aqueles detectáveis por mediçãoespectroscópica, medição fotoquímica, medição bioquímica, mediçãobioeletrônica, medição imunoquímica, medição eletrônica, e mediçãoquímica, uma medição adequada pode ser realizada para detectar a ocorrênciada extensão dependente de gabarito.
Diversidade genética é mais freqüentemente verificada egerada em genoma viral (Nathalie B. et ai., (2004) Journal of ClinicaiMicrobiology, 42, 3532; Tersa C. et al., (2002) Journal of Infectious Diseases,185, 1660; Takashi E. et al., (2004) Journal of Clinicai Microbiology, 42,126; e Elizabeth R. et al., (2001) Clinicai Infectious Diseases, 32, 1227). Comrelação a isto, é preferido que a molécula de ácido nucleico com diversidadegenética a ser detectada seja um ácido nucleico de um vírus exibindodiversidade genética. Por exemplo, onde a presente invenção é aplicada paradetectar metapneumovírus de humano exibindo diversidade genética porPCR, o conjunto de iniciadores mais preferível planejado para possuir aestrutura do oligo DS é mostrado nas SEQ ID NOs: 39 (para iniciador 5') e 40(para iniciador 3') de SEQ ID NOs: 39 e 41 (para 3' iniciador).
VI. Aplicação em detecção de seqüência de nucleotídeos alvo usandooligos DS imobilizados sobre microarranjo
Esta aplicação é um processo novo para detectar seqüência denucleotídeos alvo pela repetição da reação dependente de gabarito sobre oligoDS imobilizado sobre microarranjo.
Em outro aspecto desta invenção, é proporcionado um métodopara detectar a seqüência de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácidonucleico por uma reação de extensão dependente de gabarito, compreendendoas etapas de:
(a) estender um oligonucleotídeo de especificidade dual comouma sonda imobilizada sobre um substrato compreendendo pelo menos umciclo de uma hibridização, uma extensão dependente de gabarito e umadesnaturação, no qual a hibridização é realizada pelo contato dooligonucleotídeo de especificidade dual na amostra de ácido nucleico, no qualo oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quais umaporção de especificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeosde hibridização substancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência denucleotídeos alvo para hibridizar com a mesma, a porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar ao sítio sobre a seqüência de nucleotídeosalvo para hibridizar com a mesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porçãode separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo, no qual ahibridização é realizada sob condições nas quais não ocorre hibridizaçãoapenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3'; e
(b) analisar a ocorrência da extensão dependente de gabarito.
Uma representação esquemática para detectar uma seqüênciade nucleotídeos alvo em uma amostra de ácido nucleico pelo uso de oligo DSimobilizado sobre microarranjo é ilustrada na Fig. 4.
Este processo usando o oligos DS pode ser realizado sobcondições de hibridização adequadas rotineiramente determinadas porprocedimentos de otimização. Condições tais como temperatura, concentraçãode componentes, tempos de hibridização e de lavagem, componentes detampão, e seu pH e sua força iônica podem ser variadas dependendo de váriosfatores, incluindo o comprimento e o conteúdo por GC de oligonucleotídeo eseqüência de nucleotídeos alvo. Por exemplo, quando um oligonucleotídeorelativamente curto é usado, é preferível que condições de estringência baixasejam adotadas. As condições detalhadas para hibridização podem serencontradas em Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N.Y.(2001); e M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999).
Os oligos DS estão imobilizados sobre um substrato. Umsubstrato preferível inclui suportes sólidos ou semi-sólidos adequados, taiscomo membrana, filtro, chip, lâmina, bolacha, fibra, glóbulo magnético ounão-magnético, gel, tubo, placa, macromolécula, micropartícula e tubocapilar. Tal imobilização pode ocorrer por meio de ligação química ou ligaçãocovalente por radiação ultravioleta. Em uma modalidade desta invenção, osoligos DS são ligados em uma superfície de vidro modificada para contergrupos epóxido ou grupos aldeído ou em uma superfície revestida compolilisina. Além disso, os oligos DS são ligados em um substrato porintermédio de ligantes (e.g. diamina e oligômero de etileno-glicol). Oligos DSimobilizados podem ser fabricados para produzirem arranjo ou arranjos parauma dada aplicação por tecnologias de fabricação convencionais tais comofotolitografia, jato de tinta, micromanchamento mecânico, e seus derivados.
De acordo com o presente método, dNTPs usados na etapa deextração são preferivelmente marcados. Para marcação, são usados materiaisdetectáveis por medição espectroscópica, medição fotoquímica, mediçãobioquímica, medição bioeletrônica, medição imunoquímica, mediçãoeletrônica, ou medição química. Por exemplo, os marcadores incluem, masnão se limitam a, radioisótopos como P e S , compostosquimioluminescentes, marcadores espectroscópicos, tais como marcadores defluorescência e corantes, e marcadores magnéticos. Os corantes, por exemplo,incluem, mas não se limitam a, corante de quinolina, corante de triaril-metano, ftaleína, corante azo, e corante de cianina. Os marcadores defluorescência incluem, mas não se limitam a, fluoresceína, fícoeritrina,rodamina, lissamina, Cy3 e Cy5 (Pharmacia). Marcação é realizada de acordocom vários métodos conhecidos na técnica.
Seqüências de nucleotídeos alvo em uma amostra de ácidonucleico são hibridizadas com os oligos DS como sondas imobilizadas em umsubstrato,preferivelmente, um suporte sólido, e por sua vez os oligos DShibridizados com a seqüências de nucleotídeos alvo são estendidos usandodNTPs, preferivelmente dNTPs marcados com fluorescência e DNApolimerase em um modo dependente de gabarito. A etapa (a) épreferivelmente repetida para realizar as reações de hibridização na extensãona qual todos ou a maioria dos oligos DS são hibridizados com as seqüênciasde nucleotídeos alvo, tornando os resultados de análise de hibridização maisreprodutíveis.
A ocorrência de hibridização é verificada com vários métodosconhecidos na técnica dependendo dos tipos de marcadores usados. Porexemplo, microscópio de fluorescência, preferivelmente, microscópio defluorescência confocal é usado para marcadores de fluorescência, e aintensidade do sinal detectado com tais instrumentos aumentaproporcionalmente à extensão de hibridização. Microscópios de fluorescência,em geral, são equipados com um dispositivo de varredura que constrói umaimagem bidimensional quantitativa da intensidade de hibridização. Aintensidade do sinal detectado com tais instrumentos aumentaproporcionalmente à extensão de hibridização e então a extensão da reação deextensão dependente de gabarito.
A presente invenção agora será descrita com mais detalhe porexemplos. Será óbvio para aquelas pessoas experientes na técnica que estesexemplos são intencionados para serem mais concretamente ilustrativos e oescopo da presente invenção como descrito nas reivindicações apendidas énão limitado aos ou pelos exemplos.
EXEMPLO 1: Especificidade de PCR usando oligonucleotídeos deespecificidade dual (DS)
Os oligonucleotídeos DS desenvolvidos pela presenteinvenção foram aplicados como iniciadores para amplificar seqüências denucleotídeos alvo de genes da família de citocina de camundongo IL-19 e IL-lbeta. O processo e os resultados para a amplificação das seqüências denucleotídeos alvo de IL-19 e IL-Ibeta usando iniciadores DS são aquidescritos.
As seguintes seqüências de iniciador convencionais foramescolhidas e usadas para comparar com os oligonucleotídeos DS em vista deespecificidade de PCR:
Os iniciadores convencionais específicos para IL-19 usados noExemplo (500 pb) são:
EL19-5'-0 S5-GTcTcArcTGcTGCCCTTAAGTCTCTAGGAGAACT-S' (SEQ ID NO:l);e
IL19-3'-0 5 '-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGCTTTACAATAAGTTAG-3' (SEQ ID NO:2).Os iniciadores convencionais específicos para IL-I-betausados no Exemplo (550 pb) são:ILlb-5'-0 5'-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCAATACCCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO:3);
e
ILlb-3'-0 5 '-AGACCTCAGTGCAGGCTArGACCAATTCATCCC-3' (SEQ ID NO:4).
Os oligonucleotídeos DS da presente invenção foram aplicadosnestas seqüências de iniciador convencionais para demonstrar se osoligonucleotídeos DS podem suplantar os problemas principais decorrentesdestas seqüências de iniciador convencionais, tais como geração de resíduogênico e produtos não-específicos.
Os seguintes iniciadores DS compreendem seqüênciasidênticas àquelas dos iniciadores convencionais acima exceto por uma porçãode separação possuindo um ligante polidesoxiinosina [poli(dl)] entre a porção5' e a porção 3'. Os iniciadores DS são planejados para compreenderem umaporção de especificidade de Tm alta-5' e uma porção de especificidade de Tmbaixa-3' em um modo que a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'émaior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', enquantoque a porção de separação possui a Tm mais baixa dentre as três porções.
Os iniciadores DS para IL-19 usados no Exemplo (500 pb)são:
IL19-5' 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAIIinTAGGAGAACT-3' (SEQ ID NO:5);e
ILl 9-3' 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGimiCAATAAGTTAG-3' (SEQ ID NO:6),nos quais I é desoxiinosina.
Os iniciadores DS para IL-Ibeta usados no Exemplo (550 pb)são:
ILlb-5' 5 '-GGAGAGTGTGGATCCCAAGCIimCCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO:7);e
ILlb-3' 5'-AGACCTCAGTGCAGGCTATGmnTTCATCCC-3' (SEQ ID NO:8),nos quais I é desoxiinosina.
A amplificação por "PCR alvo" foi conduzida no volume finalde 20 μί contendo 2 μί (50 ng) de DNA genômico isolado de tecidos deplacenta de ICR de cérebro de camundongo, 2 de tampão de reação PCR10 χ contendo 15 mM MgCl2 (Roche), 2 μΐ, de dNTP (2 mM de cada dATP,dCTP, dGTP e dTTP), 1 μL de 5' DS ou iniciador convencional (10 μΜ), 1μί de 3' DS ou iniciador convencional (10 μΜ), e 0,5 μί de Taq polimerase(5 unidades^L; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi deixado emum termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60°C, e 1 min a 72°C,seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C.
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforeseem um gel de agarose a 2% e foram detectados por coloração com brometo deetídio. Os produtos de PCR resultantes também poderiam ser detectados sobreum gel de poliacrilamida desnaturado ou por métodos de detecção não-radioativos, tal como coloração com prata (Gottschlich et ai., (1997) Res.Commun. Mol. Path Pharm. 97, 237-240; Kociok, N., et al. (1998) Mol.Biotechnol. 9, 25-33), ou pelo uso de oligomarcadores marcados comfluorescência (Bauer D., et al., (1993) Nucleic Aeids Res. 21, 4272-4280; Ito,T. et al., (1994) FEBS Lett 351, 231-236. Luehrsen, K.R. et al., (1997)BioTeehniques 22, 168-174; Smith, N.R. et al., (1997) BioTeehniques 23,274-279), e o uso de iniciadores biotinilados (Korn, B. et al., (1992) Hum.Mol. Genet. 1, 235-242; Tagle, D.A. et al., (1993) Nature 361. 751-753;Rosok, O. et al., (1996) BioTeehniques 21,114-121).
Como mostrado na FIG. 5, as amplificações por "PCR alvo"para os genes da família de citocina IL-Ib e IL-19 usando cada conjunto deiniciadores de ILlb-5' e ILlb-3', e IL19-5' e IL19-3' geram uma única bandaque corresponde ao tamanho esperado de 550-pb para IL-Ibeta (pista 2) e otamanho esperado de 500-pb para IL-19 (pista 4), respectivamente. Clonageme análise de seqüência subseqüentes dos clones confirmaram que as bandassão fragmentos de IL-Ibeta e IL-19. Em contraste, os conjuntos de iniciadoresconvencionais (IL19-5'-0 e IL19-3'-0; ILlb-5'-0 e ILlb-3'-0), que não contêm[poli(dl)], produziram produtos não-específicos (FIG 5, pistas 1 e 3). Estesresultados indicam que os iniciadores DS planejados para possuírem trêsporções de Tm diferente (porção de especificidade de Tm alta-5', porção deespecificidade de Tm baixa-3'e porção de separação) podem suplantar osproblemas principais decorrentes das seqüências de iniciador convencionaltais como resíduo gênico e produtos não-específicos e intensificarnotavelmente a especificidade de PCR.
EXEMPLO 2: Avaliação de especificidade de PCR usandooligonucleotídeos de especificidade dual (DS)
Os oligonucleotídeos de especificidade dual são caracterizadospor especificidade de hibridização alta e tolerância à má combinaçãodecorrente de sua estrutura incomum, dependendo da estringência dehibridização. Especificidade de hibridização alta dos oligonucleotídeos DS éalcançada sob condições de estringência alta nas quais ambas as porções-5'- e3' são aneladas no gabarito. Entretanto, tolerância à má combinação dooligonucleotídeos DS é alcançada sob condições de estringência nas quaisambas as porções-5'- e 3' são aneladas no gabarito a despeito da presença deuma ou mais, porém limitadas, má combinações de pares de bases.
Os oligonucleotídeos de especificidade dual DS desenvolvidosde acordo com a presente invenção foram avaliados em termos deespecificidade de hibridização e tolerância à má combinação por 3 '-RACE dogene novo, DEG10, que foi identificado para ser expressado em placenta decamundongos (Kim, Y.J. et al., (2004) "Annealing control primer system foridentification of differentially expressed genes on agarose gels",BioTechniques 36:424-434; XM_129567). Para esta avaliação, uns poucosnucleotídeos em ambas as porções foram substituídos por outros nucleotídeosde modo a serem mal combinados com a seqüência gabarito alvo.
Os iniciadores DS específicos de 5'-DEG10 usados noExemplo são:
DEG10-5'-108: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIiniCTCCGATG-3' (SEQID NO:9);
DEG10-5'-103: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCmnCTGCÇATÇ-3' (SEQ ID N0:10);
DEG10-5M02: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCmnCTCCCATÇ-3' (SEQ ID NO:ll);
DEG10-5'-101: 5'-TGTAGTTTTGGGTTTCCTCCIiniCTCCCATG-3' (SEQ ID NO: 12);
DEG10-5'-158: 5'-TGTAÇTTATGÇGTATCGTCCimiCTCCGATG-3' (SEQ ID N0:13);
DEG10-5'-138: 5'-TGTAÇTTTTGÇGTTTCGTCCIiniCTCCGATG-3' (SEQ ID NO: 14);
e
DEG10-5'-128: 5'-TGTAGTTATGGGTATCCTCCmnCTCCGATG-3' (SEQ ID NO: 15),nos quais os nucleotídeos substituídos estão sublinhados e emnegrito, e I é desoxiinosina.
A. Intensificação em especificidade de PCR sob estringência altaRNAs totais de tecidos de placenta 17.5-dpc (El7.5) de cepaICR de camundongo foram isolados e usados para a síntese de cDNAs de fitaúnica por transcriptase reversa, como descrito previamente (Hwang, I.T., etal., (2003) "Annealing control primer system for improving specificity ofPCR amplification", BioTechniques 35:1180-1184). Reação de transcriçãoreversa foi realizada usando os RNAs totais por 1,5 h a 42 C um volume dereação de 20 μΙ. composto do seguinte: 3 μg de RNA total, 4 μΙ, de tampãode reação 5 χ (Promega, USA), 5 μΙ, de dNTPs (cada 2 mM), 2 μΐ^ deiniciador de síntese de cDNA 10 μΜ (oligo (dT)2o-Adaptador), 0,5 μι deinibidor de RNase (40 unidades/^L, Promega), e 1 μΙ, de transcriptase reversa(200 unidades/^L, Promega). cDNAs de primeira fita foram diluídos pelaadição de 180 μΐ, de H2O ultra-purificada. O iniciador de síntese de cDNAoligo (dT) 18-ACPi é Si-CtgtgaatgctgcgactacgaTIIIII(T)18-S', noqual I é desoxiinosina.
A 3'-RACE de DEG10 foi conduzida em um volume final de20 μL. contendo 2 μΙ. (30 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 μL detampão de reação PCR 10 χ contendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 \iL de dNTP(2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 μΐ de um dos iniciadores DSespecíficos para DEGlO (10 μΜ), ΙμΙ. de oligo (dT)i5-ACP2 (10 μΜ), e 0,5pL de Taq polimerase (5 unidades/^L; Roche); o tubo contendo a misturareacional foi posicionado dentro de um termociclo preaquecido (94°C);amostras foram desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1min a 94°C, 1 min a 68°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7min a 72°C. O oligo (dT)15-ACP2 é: 5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATIIIII(T)i5-3', no qual I é desoxiinosina.
B. Tolerância à má combinação de oligonucleotídeos DS
Os iniciadores DS de amostra, gabarito, e condições de PCRpara a 3'-RACE de DEG10 usada no Exemplo 2A foram empregados excetopara a temperatura de anelamento. Amplificação por PCR foi conduzida sobas seguintes condições: um ciclo de 94°C por 5 min, 60°C por 3 min, e 72°Cpor 3 min; seguido por 29 ciclos de 94°C por 40 s, 65°C por 1 min, e 72°Cpor 40 s, e um ciclo de extensão final de 7 min a 72°C.
Como um resultado, FIG 6A mostra a especificidade dehibridização rápida de iniciadores oligonucleotídeo DS pela 3'-RACE deDEG10. O iniciador DS específico para 5'-DEG10 (DEG10-5'-108) gerou umproduto de 677-pb esperado de DEG10 3'-RACE (pista 1). Em contraste, osoutros iniciadores (DEG10-5'-103, DEG10-5'-102, DEG10-5'-101, DEG10-5'-158, DEG10-5'-138, e DEG10-5'-128) com seqüências mal combinadas naporção 5' ou na porção 3' não geraram qualquer produto: a má combinação detrês (pista 2), duas (pista 3), ou uma (pista 4) base(s)na porção 3'; a mácombinação de cinco (pista 5), três (pista 6), ou duas (pista 7) base(s) naporção 5'.
Estes resultados demonstram que a especificidade dual dosiniciadores DS pode discriminar as bases mal combinadas não apenas naextremidade-3' mas também na extremidade-5' sob tais condições deestringência alta.
Em geral, a região de iniciadores que deve ser perfeitamentecomplementar ao gabarito é a extremidade-3', porque esta extremidade é aregião estendida pela DNA polimerase e é portanto a mais importante paragarantir ocorrência de anelamento na seqüência alvo correta. Entretanto, aextremidade-5 de iniciadores é menos importante na determinação daespecificidade de anelamento na seqüência alvo e pode ser modificada paratrazer seqüência adicional tais como sítios de restrição e seqüências depromotor que não são complementares ao gabarito (McPherson, M.J., Moller,S.G. (2000) PCR. BIOS Scientifrc Publishers, Springer-Verlag, New York,Berlin, Heidelberg, N.Y.). Em contraste a estes, a vantagem excepcional dosiniciadores DS é demonstrada pela especificidade dual devido à sua estruturaincomum, permitindo discriminação das bases mal combinadas emextremidade-5' bem como em extremidade-3'.
FIG 6B mostra um exemplo da tolerância à má combinação deiniciadores oligonucleotídeo DS por 3'-RACE de DEGl0. Embora osiniciadores DS (DEG10-5'-108, DEG10-5'-101, DEG105'-128, e DEG10-5'-138) não possuindo nucleotídeos mal combinados ou uns poucos nucleotídeosmal combinados em suas porções de extremidade-51 ou 3' ainda geraram umproduto esperado de 677 pb de DEG10 3'-RACE (pistas 1, 4, 6 e 7). Emcontraste, os outros iniciadores (DEG10-5'-103, DEGl0-5'-102, e DEGl0-5'-158) com mais nucleotídeos mal combinados em suas porções- 5' ou 3' nãogeraram qualquer produto (pistas 2, 3 e 5). Estes resultados indicam que osiniciadores DS também podem ser aplicados em amplificações de diversasseqüências de nucleotídeos requerendo tolerância à má combinação.
Em sumário, estes resultados confirmam os seguintesprincípios de iniciadores DS:
1) apenas quando anelamento ocorre por ambas a porção deespecificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3', oiniciador DS é estendido para sintetizar uma molécula de ácido nucleicocomplementar ao gabarito (pista 1); contudo,
2) quando anelamento ocorre apenas pela porção deespecificidade de Tm alta-5' e não pela porção de especificidade de Tm baixa-3', o iniciador DS não é estendido para sintetizar uma molécula de ácidonucleico complementar ao gabarito (pistas 2-4); e
3) embora a seqüência da porção de especificidade de Tmbaixa-3' possua uma combinação perfeita com o gabarito, o anelamentoapenas pela porção de especificidade de Tm baixa-3' não ocorre sob condiçõesde estringência alta (pistas 5-7). Referindo-se à porção de anelamento, oiniciador DS é distintamente diferente do iniciador de controle de anelamento(ACP) que é estendido apenas pelo anelamento da porção de extremidade-3'em uma etapa de PCR inicial PCR (Hwang, I.T., et al., (2003) "Annealingcontrol primer system for improving specificity of PCR amplification",BioTechniques 35:1180-1184).
EXEMPLO 3: Discriminação de base única usando oligonucleotídeos deespecificidade dual (DS)
Para demonstrar a especificidade dual de oligonucleotídeos DSpara discriminação de base única, os Psxl e Psx2 cDNAs de genes da famíliahomeobox específicos de placenta de camundongo foram amplificados cominiciadores convencionais ou com iniciadores DS . Identidade de seqüênciatotal entre os dois Psx cDNAs foi 91% em nível de nucleotídeo (Han, Y.J., etal., (2000) "Identification and characterization of Psx2, a novel member of thePsx (placenta-specific homeobox) family", Gene 241:149-155). Osiniciadores-5' foram designados para distinguir Psxl e Psx2 por discriminaçãode uma ou duas bases (FIG 7A). Contudo, o iniciador-3'-foi designado parapossuir uma seqüência conservada para ambos os Psx cDNAs. As seqüênciasde iniciador DS e convencionais específicas para Psxl e Psx2 são:Psxl-5'-10: 5 '-AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTAGCT-3' (SEQID N0:16);
Psx2-5'-10: 5' -AAGGAAGACATGCTGGTGATGGTGCTTCTGGCC-3' (SEQ ID N0:17);
Psxl-5'-ll: 5'-AAGGAAGACATGCTGGTGArmnTTCTAGCT-3' (SEQ ID N0:18);
Psx2-5'-ll: 5' -AAGGAAGACATGCTGGTGATnmTTCTGGCÇ-3' (SEQ ID N0:19);
Psxl-5'-40: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATGTGA-3' (SEQ ID N0:20);
Psx2-5'-40: 5 '-TCTTGCACGATGGATGGGTGTGGATGAATÇTGA-3' (SEQ ID N0:21);
Psxl-5'-41: 5'-TCTTGCACGATGGATGGGTGmnGAAIGIGA-3' (SEQ ID NO:22);
e
Psx2-5'-41: 5 '-TCTTGCACGATGGATGGGTGiniIGAAIÇIGA-3' (SEQ ED NO:23);Psx-3'-2: 5'-TTCATCCACACCCATCCATCIiniAGATCCCT-3' (SEQ ID NO:24),nas quais os nucleotídeos específicos para Psxl ou Psx2 estãosublinhadas e em negrito.
Síntese de cDNA de primeira fita
cDNA de primeira fita de placenta de camundongo sintetizadoem Exemplo 2 foi usado como um material inicial para 3'-RACE e uma "PCRalvo" de Psx cDNA.
3'-RACE de Psxl e Psx2 usando iniciador DS específico paraPsxl e Psx2 A 3'-RACE de Psxl e Psx2 foram conduzidas em um volumefinal de 20 μΙ, contendo 2\iL (30 ng) de cDNA de primeira fita diluído, 2 \iLde tampão de reação PCR 10 χ contendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 μΙ, dedNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 μΙ. de um deiniciadores DS específicos para 5'-P sxl ou 5'-Psx 2 ou iniciadoresconvencionais (10 μΜ), 1 μι de oligo (dT)i5-ACP2 (10 μΜ), e 0,5 μΕ de Taqpolimerase (5 unidades/μΕ; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foiposicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostras foramdesnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 72°C.
C. Amplificayão de ácido nucleico alvo de Psxl e Psx2 usando iniciadores DSespecíficos para Psxl e Psx2
As amplificações por "PCR alvo" de Psxl e Psx2 foramconduzidas em um volume final de 20 μΐ, contendo 2 μί (30 ng) de cDNA deprimeira fita diluído, 2 de tampão de PCR 10 χ contendo MgCl2 15 mM(Roche), 2 μι de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 μΐ, deum dos iniciadores DS específico para 5'-Psxl ou 5'-Psx2 ou iniciadoresconvencionais (10 μΜ), 1 de Psx-3'-2 (10 μΜ), e 0,5 \\L de Taq polimerase (5unidades/yL; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado emum termociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a Il0C.
Como um resultado, FIG 7B mostra os produtos de 3'-RACE ede PCR alvo gerados pelos iniciadores específicos para 5'Psxl ou Psx2. Vistoque os dois Psx cDNAs diferem um do outro por inserção ou deleção de 29 pbna direção de sua extremidade-3', é esperado que os produtos diferentes emtamanho em 29-pb sejam amplificados por sua 3'-RACE. A 3'-RACE de PsxlcDNA usando cada um dos iniciadores DS específicos para Psxl ou Psx2,Psxl-5'-41 e Psx2-5'-41, gerou uma banda única que corresponde ao tamanhoesperado de 311-pb (pista 1) e de 282-pb (pista 2), respectivamente. Análisesubseqüente de seqüência dos produtos gerados pela 3 '-RACE confirmou queos iniciadores específicos para 5'-Psxl e Psx2 amplificaram os Psxl e Psx2cDNAs, respectivamente. Em contraste, os iniciadores convencionais (Psxl-5-40 e Psx2-5'-40), que não correspondem aos princípios dosoligonucleotídeos DC, não distinguiram dois Psx cDNAs (pistas 3 e 4).
Estes resultados indicam que os iniciadores DS de acordo coma presente invenção podem discriminar uma má combinação de base única.Portanto, oligonucleotídeos DS podem ser aplicados para identificar mutaçõespontuais ou genotipificação de polimorfismo de nucleotídeo único.
EXEMPLO 4: Seqüenciamento direto de cDNA alvo a partir de reuniãode cDNA usando oligonucleotídeos de especificidade dual (DS)
A maioria das tentativas para identificar e isolar um cDNAnovo resulta na aquisição de clones que representam apenas uma parte daseqüência de mRNA. Uma vez tenha sido identificada a seqüência parcial, orestante do transcrito pode ser muitas vezes obtido por meio de típica triagemde biblioteca de cDNA ou por métodos baseados em PCR tal como RACE(amplificação rápida de extremidades de cDNA), seguido por seqüenciamentodo cDNA obtido. Assim, todos os métodos correntes são uma etapapreviamente necessária para obter informação de seqüência do restante dotranscrito. Se a informação de seqüência faltante for diretamente obtida apartir de uma população de cDNAs gerados a partir de uma célula alvo, estasetapas previamente necessárias consumidoras de tempo podem sercompletamente eliminadas e a seqüência do cDNA alvo pode ser determinadadiretamente a partir de uma amostra biológica bruta.
Os oligonucleotídeos DS da presente invenção foram aplicadoscomo iniciadores para diretamente seqüenciar Psx cDNAs de gene homeoboxespecífico de placenta de camundongo usando reunião de cDNA de primeirafita de placenta. O processo e os resultados para o seqüenciamento direto decDNAs de gene específico de placenta da reunião de cDNA de placenta sãoaqui descritos. Os mesmos iniciadores DS específicos para 5'-Psx usados emExemplo 3 foram utilizados. Eles são Psxl-5'-ll, Psx2-5'-ll, Psxl-5'-41, ePsx2-5'-41.
Síntese de cDNA de primeira fita
O cDNA de primeira fita de placenta de camundongosintetizado em Exemplo 2 foi usado como um gabarito para seqüenciamentodireto de Psx cDNAs.
Seqüenciamento direto de Psx cDNA de reunião de cDNA de placenta usandoiniciador DS de especificidade para Psx
A reação de seqüenciamento cíclico foi conduzida em umvolume final de 20 \\L contendo 13 μι (150 ng) de cDNA de primeira fitadiluído, 2 μι de mistura ABI PRISM Big Dye Terminator Reaction (AppliedBiosystems, USA), 3 μΐ. de tampão de reação de seqüência 5 χ (AppliedBiosystems), e 1,6 de um dos iniciadores DS específicos para 5'-Psxl ou5'-Psx2 (1 μΜ); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em umtermociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a94°C e submetidas a 40-50 ciclos de 10 s a 94°C, 3 min a 50-60°C, e 4 min a60-65°C. Os produtos de seqüenciamento foram purificados como segue: 1)adicionar 2 μΙ, de acetato de sódio 3 M (pH 4,6) e 50 μΐ, de EtOH 100% friofresco, 2) manter a -75°C por 30 min, 3) centrifugar por 15-30 min a 13.000 ge remover o sobrenadante, 4) lavar com 200 \iL de EtOH 70%, 5) centrifugarpor 15-30 min a 13.,000 g e remover o sobrenadante cuidadosamente, e secar.
A pelota foi ressuspensa em 10 μΙ, de Formamida HiDi imediatamente antesda corrida do produto de seqüenciamento no ABI PRISM 3100 GeneticAnalyzer.
Surpreendentemente, os iniciadores Psx DS precisamenteseqüenciaram seus específicos Psx cDNAs. Em outras palavras, iniciador DSespecífico para Psxl (Psxl-5'-41) seqüenciou apenas Psxl cDNA e iniciadorDS específico para Psx2 (Psx2-5'-41) seqüenciou apenas Psx2 cDNA (FIG 8).
A região de deleção de 29-pb em Psx2 é mostrada em uma barra preta. Emcontraste, os iniciadores convencionais (Psxl-5'-40 e Psx2-5'-40), que nãocorrespondem aos princípios de oligonucleotídeos DS, não distinguem doisPsx cDNAs.
Estes resultados indicam que iniciadores DS podemdiscriminar má combinação de base única até mesmo em seqüenciamentocíclico bem como em amplificação por PCR.
EXEMPLO 5: Multiplex PCR usando oligonucleotídeos de especificidadedual (DS)
Para demonstrar a aplicação de iniciadores oligonucleotídeoDS em multiplex PCR, nove genes diferentes da família de citocina foramamplificados com iniciadores DS. O processo e os resultados para aamplificação por multiplex PCR usando iniciadores DS são aqui descritos. Osiniciadores DS específicos para gene de família de citocina foram designadospara gerarem uma escada de 50 pb pelo uso de uma seqüência de exon maislonga de cada gene de citocina.
Os iniciadores DS para IL-3 usados no Exemplo (200 pb) são:IL3-5' 5 '-GCTGCC AGGGGTCTTCATTCIIIIICTGGATGA-3' (SEQID NO:25);
e
IL3-3' 5 '-GGCCATGAGGAACATTCAGAmiIGGTGCTCT-35 (SEQ ID NO:26).
Os iniciadores DS para IL-15 usados no Exemplo (250 pb)são:
IL15-5' 5 '-ATGTAGCAGAATCTGGCTGCmnATGTGAGG-3' (SEQ ID NO:27);
e
ILl 5-3' 5 '-ATGTGATCCAAGTGGCTCAITiniCCTTGTTAGG-3' (SEQ ID NO:28).
Os iniciadores DS para IL-18 usados no Exemplo (300 pb)são:
IL18-5' 5' -AGGAAATGGATCC ACCTGAAinnTGATGATATA-3' (SEQ ID NO:29);
e
ILl 8-3' 5 '-ATGGAAATACAGGCGAGGTCmnAAGGCGCA-3' (SEQ IDNC>:30).
Os iniciadores DS para IL-25 usados no Exemplo (350 pb)são:
IL25-5' 5 '-AGCTCTCCAAGCTGGTGATCinnCAAGGCGG-3' (SEQ ID NO:31);
e
IL25-3' 5'-GAGCTGCCCTGGATGGGGTTmnGTGGTCCT-3' (SEQ ID NO:32).
Os iniciadores DS para IL-2 usados no Exemplo (400 pb) são:IL2-5' 5'-CTCTGACAACACATTTGAGTGCnmCGATGATGAG-3' (SEQ ID NO:33);
e
EL2-3' 5' -GTGCTGTCCTAAAAATGACAGAimiGAGCTTATTT-3' (SEQ ID NO:34).
Os iniciadores DS para IL-6 usados no Exemplo (450 pb) são:IL6-5' 5'-CCAATGCTCTCCTAACAGATAAinnAGTCACAGAA-3' (SEQ ID NO:35);IL6-3' 5'-AGGTAAACTTATACATTCCAAGAAAnmTGGCTAGG-3' (SEQID NO:36).
Os iniciadores DS para IL-19 usados no Exemplo (500 pb) são:
IL19-5' 5'-GTCTCATCTGCTGCCCTTAAnmTAGGAGAACT-3' (SEQ ID NO:5);
e
IL19-3' 5'-CATAGGCCTGGAAGAAGCCGIIinCAATAAGTTAG-3' (SEQ ID N 0:6).
Os iniciadores DS para IL-Ibeta usados no Exemplo (550 pb) são:
ILlb-5' 5' -GGAGAGTGTGGATCCCAAGCmnCCAAAGAAG-3' (SEQ ID NO:7);
e
ILlb-3' 5' -AGACCTCAGTGCAGGCTATGnmTTCATCCC-3' (SEQ ID NO:8).
Os iniciadores DS para IL-IO usados no Exemplo (600 pb)são:
ILl 0-5' 5 '-AAGGCCATGAATGAATTTGAIIIIITCATCAACTG-3' (SEQ ID NO:37);
e
ILl 0-3' 5'-TGACAGTAGGGGAACCCTCTDinGCTGCAGG-3' (SEQ ID NO:38).A- Monoplex PCR usando um conjunto de iniciadores DS específicos paragene da família de citocinas
A amplificação por "único PCR alvo" para cada gene dafamília de citocinas foi conduzida em um volume final de 20 μί contendo 2μί (50 ng) de DNA genômico de camundongo, 2 μι de tampão de PCR IOxcontendo MgCl2 15 mM (Roche), 2 de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP,dGTP, dTTP), 1 μί de cada iniciador 5'DS específico para gene da família decitocinas (10 μΜ), 1 de cada iniciador 3'DS específico para gene dafamília de citocinas (10 μΜ), e 0,5 μΐ, de Taq polimerase (5 unidades/^L;Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado em umtermociclo preaquecido (94°C); amostras foram desnaturadas por 5 min a94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a72°C, seguidos por uma incubação de 7 min a 12°C.
B- Multiplex PCR usando 9 conjuntos of iniciadores DS específicos para Reneda família citocina
A amplificação por multiplex PCR foi conduzida em um únicotubo pelo uso de 9 conjuntos de iniciadores DS específicos para gene dafamília de citocinas; a mistura reacional esteve em volume final de 50 μίcontendo 100 ng de DNA genômico de camundongo, 5 μΐ, de tampão de PCR10 χ contendo MgCl2 15 mM (Roche), 5 μΙ. de dNTP (2 mM de cada dATP,dCTP, dGTP e dTTP), 1 μί d cada iniciador 5'DS específico para gene dafamília de citocinas (0,2-5 μΜ), 1 μί de cada iniciador 3'DS específico paragene da família de citocinas (0,-5 μΜ), e 0,5 μι de Taq polimerase (5unidades/^L; Roche); o tubo contendo a mistura reacional foi posicionado emum termociclo preaquecido (94°C); as condições de PCR são um ciclo de94°C por 5 min, 50°C por 3 min, e 12°C por 3 min; seguido por 29 ciclos de94°C por 40 s, 60°C por 1 min, e 12°C por 40 s, e um ciclo de extensão finalde 5 min a 72°C.
Como mostrado na FIG 9, amplificação por multiplex PCRgera múltiplas bandas que correspondem aos tamanhos esperados de 200 pb a600 pb para 9 produtos de gene de citocina diferentes (FIG 4, pista 1). Cadaamplificação por monoplex PCR gerou uma banda única que corresponde aotamanho esperado de 200 pb para IL-3 (FIG 4, pista 2), 250 pb para IL-15(FIG 4, pista 3), 300 pb para IL-18 (FIG 4, pista 4), 350 pb para IL-25 (FIG 4,pista 5), 400 pb para IL-2 (FIG. 4, lane 6), 450 pb para IL-6 (FIG 4, pista 7),500 pb para IL-19 (FIG 4, pista 8), 550 pb para IL-Ibeta (FIG 4, pista 9), e600 pb para IL-10 (FIG 4, pista 10), respectivamente.
Conseqüentemente, poderia ser reconhecido que os iniciadoresDS desenvolvidos pela presente invenção podem se bem sucedidamenteaplicados em multiplex PCR. A estrutura incomum de oligonucleotídeos DSpermite suplantar o problema comum de qualquer multiplex PCRconvencional, a saber a interferência de iniciador e a formação de dímero.
EX£MPLO 6: Detecção de metapneumovírus de humano tolerância à mácombinação de oligonucleotídeos de especificidade dual (DS)
Para demonstrar a aplicação de iniciadores oligonucleotídeoDS em tolerância à má combinação, iniciadores DS foram aplicados paradetectar metapnemovírus de humano (hMPV) em amostras clínicas. Oprocesso e os resultados para a detecção de metapnemovírus de humanousando iniciadores DS são aqui descritos. Este Exemplo não deve serentendido como limitante das aplicações da invenção à detecção de vírusespecífico.
Os iniciadores DS foram planejados baseado na regiãoconservada do gene de glicoproteína de fusão (F) gerado pelo alinhamento deseqüências de todos os isolados de hMPV disponíveis (veja Tabela 1). Paratolerar a diversidade genética destes isolados, os iniciadores foram planejadosbaseado nos seguintes critérios: (a) regiões conservadas devem ser de pelomenos 30 nucleotídeos em comprimento a despeito da presença de uma oumais, porém limitadas, má combinações de pares de bases (Tabela 1); (b) asseqüências mal combinadas dentro das regiões conservadas estão em suamaioria preferivelmente localizadas em uma porção de separação no iniciadorDS (e.g., hMPV 5'-585, hMPV 3'-698, e hMPV 3'4007); (c) caso contrário, osnucleotídeos mal combinados estão localizados na porção de extremidade-5',alguns dos quais poderiam ser substituídos por bases universais tais comodesoxiinosinas (e.g., hMPV 3'-698 e hMPV 3'-1007); e (d) um ou doisnucleotídeo(s) mal combinados na porção de extremidade 3' podem sersubstituídos por nucleotídeo(s) degenerado(s) ou por base(s) universal(ais)(e.g., hMPV 3'-1007 ).TABELA 1. Iniciadores oligonueleotídeo DS específicos para hMPVbaseados em região conservada do gene de glicoproteína de fusão (F) detodos os isolados de hMPV disponíveis
<table>table see original document page 70</column></row><table>hMPV 3'-1007 5 '-TTGAITGCTCAGCIACATTGATnmCWGCTGTGTC-3' (SEQ IDNO:41),
no qual W pode ser A ou T, e I é desoxiinosina.
RNA viral total foi extraído pelo uso do método RNAzol B deacordo com o protocolo de fabricante (RNAzoI LS; Tel-Test, Inc.). Reação detranscrição reversa foi realizada para sintetizar cDNA usando o RNA viral por1,5 h a 42°C um volume de reação de 20 μΐ, composto do seguinte: 5 \ib deRNA total (aproximadamente 100 ng), 4 μΐ, de tampão de reação 5 χ(Invitrogen, USA), 5 \iL de dNTPs (cada 5 mM), 2 μΐ, dehexadesoxinuclotídeos aleatórios 10 μΜ, 0,5 μΙ/de inibidor de RNase (40unidades^L, Promega), e 1 μΙ> de transcriptase reversa de vírus de leucemiamurina Moloney (200 unidades/^L, Promega).
A amplificação por "PCR alvo" do gene hMPV F foiconduzida em um volume final de 20 μί contendo 2 \iL (30 ng) de cDNA deprimeira fita, 2 μΐ, de tampão de PCR IOx contendo MgCl2 15 mM (Roche),2 μL. de dNTP (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 1 μΐ, de iniciadorDS específico para 5' hMPV (hMPV 5'-585; 10 μΜ), 1 μΐ, de iniciador DSespecífico para 3' hMPV (hMPV 3'-698 ou hMPV 3'-1007; 10 μΜ), e 0,5 μLde Taq polimerase (5 unidades/^L; Roche); o tubo contendo a misturareacional foi posicionado em um termociclo preaquecido (94°C); amostrasforam desnaturadas por 5 min a 94°C e submetidas a 30 ciclos de 1 min a94°C, 1 min a 60-65°C, e 1 min a 72°C, seguidos por uma incubação de 7 mina 72°C.
Como mostrado na FIG 10B, cada par de iniciadores DSespecíficos para hMPV (hMPV 5'-585 e hMPV 3'-698, e hMPV 5'-585 ehMPV 3'-1007) gera uma única banda que corresponde aos tamanhosesperados de 150-pb e 459-pb, respectivamente (pistas 1 e 2). Análise deseqüência subseqüente dos produtos confirmou que são as seqüências parciaisde gene de glicoproteína de fusão (F) de hMPV. Em contraste, estesiniciadores não geram produto em uma PCR de controle negativo sem ogabarito (pistas 4 e 5). Como um controle positivo, foi usado o conjunto deiniciadores específicos para beta-actina de humano (pista 3).
Estes resultados indicam que is iniciadores DS podem seraplicados para detectar hMPVs de paciente com infecções respiratórias.
Assim, poderia ser entendido que os oligonucleotídeos DS podem seradaptados, como iniciadores em amplificação por PCR ou como sondas emchip de oligonucleotídeo, para todas as situações potenciais encontradas nocampo.
EXEMPLO 7: Detecção de seqüência de nucleotídeos alvo usando oligoDS imobilizado em microarranjo
Os oligos DS complementares a uma região de uma moléculade ácido nucleico alvo são sintetizados por meio de sintetizador de DNA(Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems (ABI))de acordo com um protocolo padrão. Os oligos DS sintetizados sãoimobilizados sobre uma lâmina de vidro para microarranjo. Então, a misturade reação de extensão dependente de gabarito contendo 50-200 ng de amostrade DNA, 5 μΙ. de tampão de PCR 10 χ (Promega), 5 μι de MgCl2 15 mM, 5μΙ, de dNTP marcado com fluorescência (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTPe dTTP) e 0,5 de Taq polimerase (5 unidades/^L; Promega) é adicionadano microarranjo, após o qual o microarranjo é posicionado em um termociclopreaquecido (94°C). A reação de extensão dependente de gabarito éconduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação por 5 min a94°C, e 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C e 1-4 min a 60-72°C, seguidos por uma extensão de 5 min a 72°C. Após a reação de extensãodependente de gabarito, os oligos DS estendidos são lavados e detectados porsuas imagens fluorescentes por intermédio de um escâner de microarranjo,seguido por análise das imagens.
EXEMPLO 8: Genotipificação de SNP (polimorfismo de nucleotídeoúnico) usando oligonucleotídeos DSOs oligos DS são sintetizados por meio de sintetizador deDNA (Expedite 8900 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems(ABI)) de acordo com um protocolo padrão com posicionamento de uma basepolimórfica (sítio de interrogação) no centro da porção de especificidade deTm baixa-3'. Os oligonucleotídeos sintetizados são imobilizados sobre umalâmina de vidro para microarranjo. Então, uma mistura reação de extensãodependente de gabarito contendo 50-200 ng de amostra de DNA, 5 \ÍL detampão de PCR 10 χ (Promega), 5 μΐ, de MgCl2 15 mM, 5 μι de dNTPmarcado com fluorescência (2 mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e 0,5μί de Taq polimerase (5 unidades/^L; Promega) é adicionada nomicroarranjo, após o qual o microarranjo é posicionado em um termociclopreaquecido (94°C). A reação de extensão dependente de gabarito éconduzida de acordo com o seguinte ciclo térmico: desnaturação por 5 min a94°C, e 15-50 ciclos de 1 min a 94°C, 1-3 min a 50-65°C e 1-4 min a 60-72°C,seguido por uma extensão de 5 min a 72°C. Após a reação de extensãodependente de gabarito, os oligos DS estendidos são lavados e detectados porsuas imagens fluorescentes por intermédio de um escâner de microarranjo,seguido por análise das imagens.
Tendo descrito uma modalidade preferida da presenteinvenção, é para ser entendido que variantes e modificações da mesma caindodentro do espírito da invenção podem se tornar evidentes para aquelas pessoasexperientes nesta técnica, e o escopo desta invenção é para ser determinadopelas reivindicações apendidas e seus equivalentes.

Claims (59)

1. Método para a síntese de uma molécula de ácido nucleicousando um oligonucleotídeo de especificidade dual por uma reação deextensão dependente de gabarito, caracterizado pelo fato de compreender asetapas de:(a) anelar o oligonucleotídeo de especificidade dual em umamolécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo deespecificidade dual possui três porções nas quais uma porção deespecificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácidonucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, uma porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com o mesmo; Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' émaior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porção deseparação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamentoé realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por umaporção de especificidade de Tm baixa-3'; e(b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual parasintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao ácido nucleico degabarito.
2. Método para seletivamente amplificar uma seqüência deácido nucleico alvo de um DNA ou de uma mistura de ácidos nucleicos,caracterizado pelo fato de compreender amplificar a seqüência de ácidonucleico alvo por realização de pelo menos dois ciclos de anelamento deiniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando um conjunto deiniciadores que compreende pelo menos um oligonucleotídeo deespecificidade dual; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possuitrês porções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aum sítio sobre o ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, umaporção de separação compreende pelo menos duas bases universais e umaporção de especificidade de Tm baixa-3' possui uma seqüência denucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobreo ácido nucleico alvo para hibridizar com o mesmo, Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porção deespecificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm mais baixanas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas no ácidonucleico alvo; no qual o anelamento na reação de amplificação é realizado sobcondições nas quais não ocorre o anelamento apenas por uma porção deespecificidade de Tm baixa-3'.
3. Método para amplificar duas ou mais seqüências denucleotídeos alvo simultaneamente usando dois ou mais pares de iniciadoresna mesma reação, compreendendo a amplificação das seqüências denucleotídeos alvo por realização de pelo menos dois ciclos de anelamento deiniciador, extensão e desnaturação de iniciador, usando dois ou mais pares deiniciadores nos quais pelo menos um iniciador do par de iniciadores é umoligonucleotídeo de especificidade dual, caracterizado pelo fato de que osoligonucleotídeos de especificidade dual possuem três porções nas quais umaporção de especificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeosde hibridização substancialmente complementar a um sítio sobre a seqüênciade nucleotídeos alvo para hibridizar com o mesmo, uma porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre a seqüência de nucleotídeosalvo para hibridizar com o mesmo, Tm da porção de especificidade de Tm alta--5' é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porçãode separação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm aíta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas na seqüência de nucleotídeos alvo; no qual oanelamento na reação de amplificação é realizado sob condições nas quaisnão ocorre o anelamento apenas por uma porção de especificidade de Tmbaixa-3'.
4. Método para seqüenciar uma molécula de ácido nucleicoalvo usando um oligonucleotídeo de especificidade dual de um DNA ou deuma mistura de ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de compreender asetapas de:(a) sintetizar uma molécula de ácido nucleico complementar àmolécula de ácido nucleico a ser seqüenciada por realização de pelo menosdois ciclos de anelamento de iniciador, extensão e desnaturação de iniciador,usando o oligonucleotídeo de especificidade dual como um iniciador deseqüenciamento; no qual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui trêsporções nas quais uma porção de especificidade de Tm alta-5' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aum sítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com omesmo, uma porção de separação compreende pelo menos duas basesuniversais e uma porção de especificidade de Tm baixa-3' possui umaseqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmente complementar aum sítio sobre a molécula de ácido nucleico alvo para hibridizar com amesma, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' é maior do que aquelada porção de especificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tmmais baixa nas três porções; a porção de separação forma uma estrutura debolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção deespecificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' sãoaneladas na molécula de ácido nucleico alvo; no qual o anelamento na reaçãode síntese está sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas poruma porção de especificidade de Tm baixa-3'; e(b) determinar uma seqüência de nucleotídeos da molécula deácido nucleico complementar sintetizada.
5. Método para detectar uma molécula de ácido nucleico comdiversidade genética por uma reação de extensão dependente de gabarito deum oligonucleotídeo de especificidade dual, caracterizado pelo fato decompreender as etapas de:(a) anelar um oligonucleotídeo de especificidade dual em umamolécula de ácido nucleico de gabarito, no qual o oligonucleotídeo deespecificidade dual possui três porções nas quais uma porção deespecificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar a um sítio sobre o ácidonucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo, uma porção de separaçãocompreende pelo menos duas bases universais e uma porção de especificidadede Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com o mesmo, Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' émaior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3', a porção deseparação possui a Tm mais baixa nas três porções; a porção de separaçãoforma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nasquais a porção de especificidade de Tm alta-5' e a porção de especificidade deTm baixa-3' são aneladas no ácido nucleico de gabarito, no qual o anelamentoé realizado sob condições nas quais não ocorre o anelamento apenas por umaporção de especificidade de Tm baixa-3' e ocorre anelamento quando umaporção de especificidade de Tm alta-5' e/ou uma porção de especificidade deTm baixa-3' possui uma ou mais bases mal combinadas em seu sítio alvo;(b) estender o oligonucleotídeo de especificidade dual parasintetizar a molécula de ácido nucleico complementar ao gabarito; e(c) detectar a ocorrência da extensão dependente de gabaritodo oligonucleotídeo de especificidade dual.
6. Método para detectar uma seqüência de nucleotídeos alvoem uma amostra da ácido nucleico por uma reação de extensão dependente degabarito de um oligonucleotídeo de especificidade dual, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:(a) estender um oligonucleotídeo de especificidade dual comouma sonda imobilizada sobre um substrato compreendendo pelo menos umciclo de uma hibridização, uma extensão dependente de gabarito e umadesnaturação, no qual a hibridização é realizada pelo contato dooligonucleotídeo de especificidade dual com a amostra de ácido nucleico, noqual o oligonucleotídeo de especificidade dual possui três porções nas quaisuma porção de especificidade de Tm alta-5' possui uma seqüência denucleotídeos de hibridização substancialmente complementar a um sítio sobrea seqüência de nucleotídeos alvo para hibridizar com o mesmo, uma porçãode separação compreende pelo menos duas bases universais e uma porção deespecificidade de Tm baixa-3' possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar a um sítio sobre a seqüência denucleotídeos alvo para hibridizar com o mesmo, Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porção deespecificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm mais baixanas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas naseqüência de nucleotídeos alvo, no qual a hibridização está sob condições nasquais não ocorre hibridização por uma porção de especificidade de Tm baixa-3';e(b) analisar a ocorrência da extensão dependente de gabarito.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a base universal na porção de separação éselecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2'-F-inosina, desóxi--3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2'-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol,-4-nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol,desóxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, PNA-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, PNA--3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol,fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol,-2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a base universal é desoxiinosina, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a base universal é desoxiinosina.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de separação compreendenucleotídeos contíguos possuindo bases universais
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5' émais longa do que a porção de especificidade de Tm baixa-3'.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3'possui a seqüência de nucleotídeos de hibridização perfeitamentecomplementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar como mesmo.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5' é 15a 40 nucleotídeos em comprimento.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5' é 15 a 25nucleotídeos em comprimento.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de separação é pelo menos de 3nucleotídeos em comprimento.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de separação é de 3 a 10nucleotídeos em comprimento.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 --6, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3' éde 3 a 15 nucleotídeos em comprimento.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5' é de-15 a 25 nucleotídeos em comprimento, a porção de separação é de 3 a 10nucleotídeos em comprimento, e a porção de especificidade de Tm baixa-3' éde 3 a 15 nucleotídeos em comprimento.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--6, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' varia de 40°C a 80°C.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tmbaixa-3' varia de IO0C a 40°C.
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações Ι-ό, caracterizado pelo fato de que o anelamento é realizado em temperaturavariando de 45°C a 68°C.
23. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 5,caracterizado pelo fato de que a síntese de uma seqüência de ácido nucleicoalvo é realizada pela repetição do processo da reação de extensão dependentede gabarito na qual as etapas de extensão e anelamento de nucleotídeo deespecificidade dual são seguidas pela etapa de desnaturação.
24. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3,caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada de acordo com areação em cadeia da polimerase.
25. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que a molécula de ácido nucleico alvo a ser seqüenciada estácontida em um DNA genômico ou em uma população de cDNAs.
26. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a molécula de ácido nucleico com diversidade genética é umácido nucleico de um vírus exibindo diversidade genética.
27. Oligonucleotídeo de especificidade dual para a síntese deuma molécula de ácido nucleico por uma reação de extensão dependente degabarito, caracterizado pelo fato de que é representado pela seguinte fórmulageral:-5 '-Xp-Yq-Zr-3'em que, Xp representa uma porção de especificidade de Tm alta-5' possuindouma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmentecomplementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizarcom o mesmo, Yq representa uma porção de separação compreendendo pelomenos duas bases universais, Zr representa a porção de especificidade de Tmbaixa-3' possuindo uma seqüência de nucleotídeos de hibridizaçãosubstancialmente complementar a um sítio sobre o ácido nucleico de gabaritopara hibridizar com o mesmo, p, q e r representam o número de nucleotídeos,e X, Y, e Z são desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo; a Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' é maior do que aquela da porção deespecificidade de Tm baixa-3', a porção de separação possui a Tm mais baixanas três porções; a porção de separação forma uma estrutura de bolha de não-pareamento de bases sob condições nas quais a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' são aneladas no ácidonucleico de gabarito, permitindo que a porção de especificidade de Tm alta-5'se separe da porção de especificidade de Tm baixa-3' em termos deespecificidade anelar para o ácido nucleico de gabarito, deste modo aespecificidade anelar do oligonucleotídeo é determinada dualmente pela aporção de especificidade de Tm alta-5' e pela porção de especificidade de Tmbaixa-3' de tal maneira que a especificidade anelar total do oligonucleotídeoseja intensificada.
28. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a base universal na porção deseparação é selecionada do grupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza-2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2'-F-inosina,desóxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2'-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol,-1 -(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3 -nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol, 4-nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desóxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol,ΡΝΑ-5-introindol, PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, PNA-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina, morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pirrol, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina,fosforoamidato-inosina, fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol,fosforoamidato-3 -nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pirrol, e suas combinações
29. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a base universal édesoxiinosina, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol ou 5-nitro-indol.
30. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a base universal édesoxiinosina.
31. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a porção de separaçãocompreende nucleotídeos contíguos possuindo bases universais.
32. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade deTm alta-5' é mais longa do que a porção de especificidade de Tm baixa-3'.
33. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a porção de especificidade deTm baixa-3' possui a seqüência de nucleotídeos de hibridização perfeitamentecomplementar ao sítio sobre o ácido nucleico de gabarito para hibridizar como mesmo.
34. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que ρ representa um númerointeiro de 15 a 40.
35. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 34, caracterizado pelo fato de que ρ representa um númerointeiro de 15 a 25.
36. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que q é pelo menos 3.
37. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que q representa um númerointeiro de 3 a 10.
38. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que r representa um númerointeiro de 3 a 15.
39. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que ρ é um número inteiro de 15a 25, q é um número inteiro de 3 a 10, e r é um número inteiro de 3 a 15.
40. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção deespecificidade de Tm alta-5' varia de 40°C a 80°C.
41. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção deespecificidade de Tm baixa-3' varia de IO0C a 40°C.
42. Oligonucleotídeo de especificidade dual de acordo com areivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a Tm da porção de separaçãovaria de 3°C a 15°C.
43. Método para permitir que uma especificidade anelar de umoligonucleotídeo seja dualmente determinada por meio de uma estrutura dooligonucleotídeo, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(a) selecionar uma seqüência de ácido nucleico alvo;(b) planejar uma seqüência de um oligonucleotídeo possuindo(i) uma seqüência de hibridização substancialmente complementar ao ácidonucleico alvo e (ii) uma porção de separação compreendendo pelo menosduas bases universais, de tal modo que a porção de separação intervém naseqüência de hibridização para formar três porções no oligonucleotídeo; e(c) determinar a posição da porção de separação nooligonucleotídeo para permitir que a porção na direção-5' da porção deseparação possua uma Tm mais alta do que a da porção na direção-3' daporção de separação e para permitir que a porção de separação possua a Tmmais baixa nas três porções, proporcionando deste modo um oligonucleotídeopossuindo três porções diferentes com valores de Tm diferentes entre elas naqual (i) uma porção de especificidade de Tm alta-5' do oligonucleotídeopossui uma seqüência de nucleotídeos de hibridização substancialmentecomplementar ao ácido nucleico alvo, (ii) uma porção de especificidade de Tmbaixa-3' do oligonucleotídeo possui uma seqüência de nucleotídeos dehibridização substancialmente complementar ao ácido nucleico alvo; e (iii) aporção de separação do oligonucleotídeo entre a porção de especificidade deTm alta-5' e a porção de especificidade de Tm baixa-3' compreende pelomenos duas bases universais; e a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5'é maior do que aquela da porção de especificidade de Tm baixa-3' e a porçãode separação possui a Tm mais baixa nas três porções,pelo qual a especificidade anelar do oligonucleotídeo para oácido nucleico alvo é determinada dualmente tanto pela porção deespecificidade de Tm alta-5' quanto pela porção de especificidade de Tmbaixa-3'.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a base universal na porção de separação é selecionada dogrupo consistindo de desoxiinosina, inosina, 7-desaza-2'-desoxiinosina, 2-aza--2'-desoxiinosina, 2'-OMe-inosina, 2-F-inosina, desóxi-3-nitro-pirrol, 3-nitro-pirrol, 2'-OMe-3-nitro-pirrol, 2'-F-3-nitro-pirrol, l-(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pirrol, desóxi-5-nitro-indol, 5-nitro-indol, 2'-OMe-5-nitro-indol, 2'-F-5-nitro-indol, desóxi-4-nitro-benzimidazol,4-nitro-benzimidazol, desóxi-4-amino-benzimidazol, 4-amino-benzimidazol, desóxi-nebularina, 2'-F-nebularina, 2'-F-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-5-introindol,PNA-nebularina, PNA-inosina, ΡΝΑ-4-nitro-benzimidazol, ΡΝΑ-3-nitro-pirrol, morfolino-5-nitro-indol, morfolino-nebularina, morfolino-inosina,morfolino-4-nitro-benzimidazol, morfolino-3-nitro-pinOl, fosforoamidato-5-nitro-indol, fosforoamidato-nebularina, fosforoamidato-inosina,fosforoamidato-4-nitro-benzimidazol, fosforoamidato-3-nitro-pirrol, 2'-0-metóxi-etil-inosina, 2'-0-metóxi-etil-nebularina, 2'-0-metóxi-etil-5-nitro-indol, 2'-0-metóxi-etil-4-nitro-benzimidazol, 2'-0-metóxi-etil-3-nitro-pinOl, esuas combinações.
45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que a base universal é desoxiinosina, 1 -(2'-desóxi-beta-D-ribofuranosil)-3-nitro-pinOl ou 5-nitro-indol.
46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que a base universal é desoxiinosina.
47. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a porção de separação compreende nucleotídeos contíguospossuindo bases universais
48. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a porção de especificidade de Tm alta-5' é mais longa do quea porção de especificidade de Tm baixa-3'.
49. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a porção de especificidade de Tm baixa-3' possui a seqüênciade nucleotídeos de hibridização perfeitamente complementar ao sítio sobre oácido nucleico de gabarito para hibridizar com o mesmo.
50. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que ρ representa um número inteiro de 15 a 40.
51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizadopelo fato de que ρ representa um número inteiro de 15 a 25.
52. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que q é pelo menos de 3.
53. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que q representa um número inteiro de 3 a 10.
54. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que r representa um número inteiro de 3 a 15.
55. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que ρ é um número inteiro de 15 a 25, q é um número inteiro de 3a 10, e r é um número inteiro de 3 a 15.
56. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tm alta-5' varia de 40°Ca 80°C.
57. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a Tm da porção de especificidade de Tm baixa-3' varia de-100C a 40°C.
58. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a Tm da porção de separação varia de 3°C a 15°C.
59. Método de acordo com a reivindicação 43, caracterizadopelo fato de que a reação de extensão dependente de gabarito é uma reaçãoem cadeia da polimerase.
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