JP2846018B2 - 核酸配列の増幅および検出 - Google Patents

核酸配列の増幅および検出

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 最近の分子生物学の一般的な分野における発達により
臨床および商業上重要な特定の核酸配列を検出すること
が可能となった。例えば、様々なヒト遺伝子の核酸配列
の分析によって、特定の疾患と関連して特有の変化が存
在することが明らかになった。同様に、各微生物を特異
的に特徴づけ、それらを極く近縁種のものからさえも区
別し得る、種々の病原体ゲノムの配列が同定された。そ
れらの配列に関する情報を利用することで、遺伝子レベ
ルでの疾患の診断が可能となった。
特定の核酸配列を検出する最も一般的な方法はハイブ
リダイゼーション（ハイブリッド形成法）である。この
方法は核酸が相補的な核酸配列と安定な非共有結合性の
複合体（コンプレックス）を形成し得るという点を利用
したものである。被検試料中に特定の核酸配列が存在す
るか否かを決定するには、相補的な核酸プローブを調製
し、検出可能な化学的修飾によって標識した後、被検試
料に加える。検出すべき配列が存在する場合、標識した
プローブがそれとハイブリダイズし、その標識が、ハイ
ブリダイゼーションの生起の有無および程度を既知の方
法で決定する手段を与える。
現在のハイブリダイゼーション法を被検試料中の核酸
配列を決定するために用いることは、それが充分に高感
度でなく特定の核酸配列の存在を正確に証明するにはか
なり多量の被検試料を要するという点で根本的に限界が
ある。このような限界は、通常、分析用として得られる
試料の量が得られている臨床面での実用化にとって重大
な限界である。従って、被検試料中の特定の核酸配列を
検出するためのハイブリダイゼーション法の感度の高め
る方法を開発し、該方法の診断技術面での利用を拡大す
ることが注目されていた。
一般的なハイブリダイセーション法の感度の改善法の
１つはハイブリダイゼーションプローブによって生成さ
れるシグナルを増大することであった。例えば、ニック
トランスレーション［リグビィら（Rigby）、ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）、113:237（1977）］またはSP6転写［メルトンら
（Melton）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nuc.
Acids Rs.）、12:7035（1984）］により、高い比活性
の放射能で標識された核酸プローブの調製法が報告され
ている。
シナイダーら（Schneider）［PCT国際特許出願公開N
o.WO87/03622］は、ハイブリダイゼーションにより生成
したシグナルを増幅する手段として、目的のDNAまたはR
NA配列とハイブリダイズしている第１プローブの各々と
結合可能な複数のシグナル産生性第２プローブ群を使用
することについて報告している。
チュら（Chu）［PCT国際特許出願公開No.WO87/0627
0］は核酸ハイブリダイゼーションプローブとして“複
製可能なRNA"を単独で、または親和性分子と一緒に使用
し、さらに、RNAを複製し、それによって産生されるシ
グナルを増加するためにRNA依存性のRNAポリメラーゼを
使用することについて報告している。
ロドランドら（Rodland）［米国特許出願No.第4,647,
529号］はハイブリダイゼーションプローブに取り込ま
れた場合にプローブと検出すべき核酸配列との結合量を
増加させるチオヌクレオチドの使用について報告してい
る。
プローブ検出法の感度の向上にかなりの努力が払われ
たのに対して被検試料中の研出すべき核酸配列を増幅さ
せて現在利用可能なハイブリダイゼーション法によって
検出するのに充分な量の配列を生産する方法に向けてな
された研究は殆どなかった。
ムリスら（Mullis）［米国特許出願No.第4,683,195
号］は２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて被
検試料中の特定の核酸配列を増幅する方法およびプライ
マー伸長産物の合成に関して教示している。１つのプラ
イマーの伸長産物は、もう１つのプライマーとハイブリ
ダイズした場合に所望の特定の核酸配列を生産するため
の鋳型となり、またその逆の関係が成り立ち、特定の配
列が所望の量、生産されるまでこの工程が繰り返され
る。
ムリスらは、非相補配列と結合したプライマーを用
い、この増幅法によって大量の組換え核酸を調製するこ
とも教示している。ムリスらはプロモーター、リンカー
または暗号配列のための核酸配列をプライマーの１方ま
たは両方に連結し、被検試料の核酸配列と非相補性配列
とを一緒に増幅させる方法を開示した。このようにし
て、選択された外因性の核酸配列と結合した既存の非検
核酸配列からなる組換え核酸が大量に生産される。
従って、ムリスらの方法の原料は、相補的なプライマ
ー伸長産物の形で所望の核酸配列を増幅することにあ
る。形成された各プライマー伸長産物がさらに他のプラ
イマー伸長生産における鋳型となるので、ムリスらのプ
ライマー伸長法を複数回繰り返すことにより、理論上、
反応サイクルの回数に対して指数関数的な速度で所望の
配列が蓄積されることになる。これに対し、目的物でな
い、プライマーハイブリダイゼーション副産物は自己触
媒作用をしないと思われるので、直線的な速度で蓄積さ
れる。
このように、ムリスらの方法の特異性および精度は、
厳密に、副産物の合成速度に対する所望の核酸配列の相
対的合成速度の実質的な増大にかかっている。しかしな
がら、実際には、副産物の蓄積は理論的な計算から予測
される速度よりもはるかに早く進むことが観察されてい
る。例えばムリスらはヒトゲノムDNAを含有する試料中
に存在するヒトベータ−ヘモグロビン遺伝子部分を増幅
させるためにこの方法を用い、ゲノム内の他の配列の増
幅により、所望の配列に相当する増幅配列の最終的な割
合は１％にすぎないという結果を認めた。
ムリスらの方法で所望の核酸配列以外の核酸配列が増
幅した程度から、この方法は実際に被検試料中に存在す
る所望の核酸配列よりも多くを検出し、偽陽性の効果を
与えることになる。従って、本発明は被検試料中の核酸
配列を特異的かつ定量的に増幅させることにより、偽陽
性および、さもなくば既存の方法に付随する不正確な結
果等の問題を回避し、所望の配列の検出感度を向上させ
る方法を提供することを目的とするものである。
さらにムリスらの方法は複数回のプライマーハイブリ
ダイゼーションおよびプライマー伸長合成のサイクルを
想定したものであるために面倒な作業を要するかまたは
自動化（オートメーション化）のための経費が必要であ
る。ムリスらの方法の自動化には、特殊な装置のみなら
ず特殊な試薬、熱的に安定なDNAポリメラーゼを必要と
し、さらにプライマーハイブリダイゼーションおよびプ
ライマー伸長合成工程を連続的に行うために、各分析試
験系に合わせて反応条件を設定する必要がある。従っ
て、本発明は、費用および工程の繰り返し、特定の装置
および試薬、あるいは異なる被検試料ごとに反応条件を
変更しなければならない繁雑さを必要とせず、迅速かつ
簡便に被検試料中の特定の核酸配列を検出する方法を提
供することを目的とするものである。
発明の要約 本発明の目的は、 （ａ）検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本
鎖核酸を合成し、 （ｂ）核プロモーターのコントロール下で該２本鎖核酸
から複数個のRNA転写物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）で得たRNA転写物の存在を測定し、さ
らに （ｄ）該RNA転写物の存在を、検出すべき核酸配列の存
在に関係づけることからなる方法によって達成された。
さらに実施態様において、上位工程（ａ）の核酸を、 （１）プライマーと結合したプロモーターを含むオリゴ
ヌクレオチド、プロモーター−プライマーを得、 （２）検出すべき核酸配列にプロモーター−プライマー
がハイブリダイズする条件下で被検試料とプロモーター
−プライマーとを接触させ、さらに （３）工程（２）においてプロモーター−プライマーが
ハイブリダイズした被検試料核酸配列を鋳型とし、検出
すべき核酸配列と相補的な伸長産物をプロモーター−プ
ライマーから合成することからなる方法で調製すること
を含む方法によって本発明目的はより高く、達成され
る。
さらに他の実施態様として、工程（ａ）の核酸を、 （１）プライマーと結合したプロモーターからなるオリ
ゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーおよびオリ
ゴヌクレオチド第２プライマーであって、これらプライ
マーは互いに相補的でなく、しかも１方のプライマーか
ら合成された伸長産物をその相補体から分離したとき
に、それがもう１方のプライマーの伸長産物の合成にお
ける鋳型となるよう選択されているものを得、 （２）プロモーター−プライマー伸長産物が合成される
ハイブリダイゼーション条件下でプロモーター−プライ
マーに被検試料を接触させ、さらに （３）第２プライマーの伸長産物が合成されるハイブリ
ダイゼーション条件下で被検試料を接触させることから
なる方法で得ることからなる方法によっても、本発明の
目的は達成される。
本発明は被検試料中の特定の核酸配列の存在を測定す
る方法の改良法および本発明の実施に必要な試薬を含有
するキットを提供するものである。総括すると、本発明
方法は、検出すべき核酸配列とプロモーターとを含有す
る２本鎖核酸の合成、そのプロモーターのコントロール
下での複数個の様々なRNA転写物の合成、および産生さ
れた特定のRNA転写物の検出を含む。DNAプライマー伸長
産物の形でなくRNA転写物の形で増幅させることの利点
は、ポリメライゼーションのための酵素とリボヌクレオ
シド三りん酸の存在下においてRNA転写物の合成は連続
的に起こるので、極めて、また本質的に誤りを生じやす
いプライマーハイブリダイゼーション反応を何度も繰り
返さずに、検出すべき核酸配列を任意の所望のレベルに
まで増幅させることができるという点にある。
図面の簡単な説明 第１図は１本鎖核酸中の検出すべ特定の配列へのオリ
ゴヌクレオチド、プロモーター−プライマーのハイブリ
ダイゼーション、検出すべき配列とプロモーター−プラ
イマーのプロモーターを含有する２本鎖核酸の合成、お
よびプロモーターの制御下における２本鎖核酸からの複
数個のRNA転写物の合成を示す模式図である。
第２図は、本発明の１実施態様であって、オリゴヌク
レオチド、プロモーター−プライマーとオリゴヌクレオ
チド、第２プライマーとを一緒に用い、検出すべき核酸
配列とプロモーター−プライマーのプロモーターとを含
有する２本鎖核酸を製造することを含む実施態様の模式
図である。プロモーター−プライマーと、１本鎖核酸中
の検出すべき配列とがハイブリダイズし、プロモーター
−プライマー伸長産物の中の検出すべき配列と相補的な
配列に第２プライマーがハイブリダイズする。得られた
生産物は２本鎖核酸であり、１本の鎖はオリゴヌクレオ
チド、プロモーター−プライマー伸長産物を、もう１本
の鎖はオリゴヌクレオチド、第２プライマー伸長産物を
含有しており、それから、プロモーターのコントロール
下でRNA転写物が産生される。
第３図は本発明の他の実施態様であって、オリゴヌク
レオチド、プロモーター−プライマーと、オリゴヌクレ
オチド、第２プライマーとを一緒に用いることからなる
実施態様の模式図である。オリゴヌクレオチド、第２プ
ライマーと１本鎖核酸内の検出すべき配列とがハイブリ
ダイズし、オリゴヌクレオチド、プロモーター−プライ
マーと第２プライマー伸長産物内の検出すべき配列に相
補的な酸列とがハイブリダイズする。
発明の詳細な説明 本明細書中、“プロモーター”という語句はそれにRN
Aポリメラーゼ酵素が結合し、RNA転写物の合成を開始す
る核酸配列を意味する。プロモーターは専用の（dedica
ted）プロモーターであり、RNAポリメラーゼは専用のRN
Aポリメラーゼであることが好ましい。“専用の”とい
う語句はそのプロモーターが、実質上、分析すべき被検
試料中に通常存在しているポリメラーゼ以外の、１つの
RNAポリメラーゼによってのみ認識されるものであるこ
とを意味する。同様に、“専用のRNAポリメラーゼ”は
被検試料中に存在する他のプロモーターと比較したと
き、専ら、あるいは優先的に専用のプロモーターと結合
し、プロモーターの下流に位置する核酸のRNA転写物を
合成する。専用のプロモーターと専用のRNAポリメラー
ゼとの組み合わせにより、通常でない、特異的なプロモ
ーター−RNAポリメラーゼ相互反応が起きる。
一般に、専用のプロモーターと専用のRNAポリメラー
ゼとは、例えばバクテリオファージT7またはバクテリオ
ファージSP6等、同じ供給源から得られる。T7およびSP6
の両者の場合、ファージがコードしているDNAポリメラ
ーゼは同族起源のファージプロモーターからのRNA転写
物の合成を有効に開始する。他の原核性または真核性プ
ロモーターからRNA転写が開始されることは殆ど認めら
れない。しかも、単塩バッファー、２本鎖核酸鋳型、リ
ボヌクレオシド三りん酸およびファージRNAポリメラー
ゼからなる転写反応によって大量のRNAが迅速に合成さ
れる。被検試料DNAに含まれる既知の任意の配列との偶
発的なハイブリダイゼーションを最小限に止めるよう、
プロモーターを、固有の配列から選択するか、そのヌク
レオチド配列を修飾することが好ましい。
本明細書中“プライマー”という語句は、天然に存在
するか、合成されたオリゴヌクレオチド配列であって、
検出すべき核酸配列の全体または一部と実質上、ホモロ
ーガスであるか、また相補的な配列を指す。プライマー
は検出すべき配列またはその相補配列を含有する鋳型核
酸とハイブリダイズし、ポリメライゼーション用試薬の
存在下で伸長産物の合成を開始（プライム）するのに充
分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さ
はハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長合成反
応の条件、並びに検出すべき特定の核酸配列の組成など
の様々な因子に左右される。通常、プライマーは10−25
またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それより
少ないこともある。しかしながら、プライマーは、検出
すべき核酸配列またはその相補体の配列を正確に反映し
たものである必要はない。例えば、選択された条件下で
プライマーが検出すべき核酸配列またはその相補配列と
特異的にハイブリダイズする限り、プライマー内に非相
補的な塩基が分散されていたり、プライマーから相補的
な塩基が欠失されていてもよい。
本明細書中、“プロモーター−プライマー”という語
句はプライマーの５′末端にプロモーターが結合してな
る、天然に存在するまたは合成されたオリゴヌクレオチ
ドを指す。適当な条件下、ポリメライゼーションのため
の試薬の存在下でプロモーター−プライマーは、検出す
べき核酸配列またはその相補配列と、プロモーター−プ
ライマーのプロモーターとを包含するプロモーター−プ
ライマー伸長物産生の開始点として作用することができ
る。ハイブリダイゼーション効果を最大にするために、
プロモーター−プライマーは１本鎖であることが好まし
いが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合には、伸長
産物の製造に用いる前に、まずプロモーター−プライマ
ーを処理してそのストランドを解く。
“第２プライマー”という語句は、天然に存在する
か、または合成されたオリゴヌクレオチドであって、適
当な条件下、ポリメライゼーションのための試薬の存在
下で検出すべき核酸配列またはその相補配列を含む第２
プライマー伸長生産の開始点として作用することができ
るものを指す。ハイブリダイゼーション効果を最大にす
るためには、第２プライマーは１本鎖であることが好ま
しいが、２本鎖であってもよい。２本鎖の場合には、伸
長産物の製造に用いる前に、まずプロモーター−プライ
マーを処理してそのストランドを解く。第２プライマー
は、検出すべき核酸配列の全部また一部と実質上、相補
的であれば、いかなるヌクレオチド配列を含有していて
もよいが、プロモーター−プライマーの相補配列でない
ように選択することが好ましい。
“プローブ”という語句は、検出すべき核酸配列の全
部または一部とホモローガスまたは相補的な、天然に存
在する、または合成されたオリゴヌクレオチドを指す。
プローブは、適当な条件下、検出すべき核酸配列のRNA
転写物と特異的にハイブリダイズすることができる。
本明細書中、プライマーおよびプローブに関して“オ
リゴヌクレオチド”という語句は２またはそれ以上のデ
オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからな
る分子を意味する。所望のオリゴヌクレオチドは、例え
ば、天然に存在する核酸から精製する、あるいは新たに
合成する等、適当な方法で調製される。様々な有機化学
の技術を用い、ヌクレオシド誘導体からオリゴヌクレオ
チドを合成することに関する幾つかの方法が文献に記載
されている。有機合成の１つの型はホスホトリエステル
法であり、この方法では、ヌクレオシド三りん酸エステ
ルが結合して所望の配列を有するオリゴヌクレオチドを
形成する［ナラングら（Narang）、Meth.Enzymol.、68:
90（1979）］。ヌクレオシド二りん酸［ブラウン（Brow
n）、Meth.Enzymol.、68:109（1979）］、またはヌクレ
オシド・ホスホラミデート［カルーサー（Caruther
s）、Meth.Enzymol.、154:287（1985）］の使用を含む
他の有機合成法が報告されている。次いで、これらの方
法のいずれかで合成されたオリゴヌクレオチドを一緒に
して、必要な長さおよび配列を有する任意の１本鎖オリ
ゴヌクレオチドを形成することができる。別法として、
インビトロでの転写性増幅、宿主細胞へのクローニン
グ、あるいは適当な制限酵素を使用して天然の供給源か
ら回収することによりオリゴヌクレオチドを生産する。
本明細書中、“RNA転写物”という語句はプロモータ
ー−プライマーのプロモーターのコントロール下でRNA
ポリメラーゼ酵素によって合成されたリボ核酸分子を指
す。検出すべき特定の核酸配列のRNA転写物は、プロモ
ーター−プライマーの性質により核配列とホモローガス
であるか相補的である。
本明細書中、“伸長産物”という語句は、プライマー
がハイブリダイズしている核酸分子を合成の鋳型として
用い、プライマーの３′OH末端から合成が開始される該
酸分子を指す。
“ポリメライゼーション用試薬”という語句は、一般
に、既存の核酸を鋳型としてデオキシリボヌクレオチド
またはリボヌクレオチドからの核酸の合成を触媒する酵
素を意味する。
被検試料としては、精製形または非精製形の任意の起
源の核酸を鋳型として用い得る。例えば、被検試料は食
物、農産物、あるいはヒトまたは動物の臨床標本であっ
てよい。通常、標本試料は、尿、血液、血漿、血清、お
よび啖などの生物学的な液体である。被検試料中の検出
すべき核酸は細菌、酵母、ウイルス、および植物または
動物などのより高等な生物に由来する細胞または組織な
ど、任意の源からのDNAまたはメッセンジャーRNAをも含
むRNAである。そのような核酸の抽出および精製法は、
例えば、マニアティス（Maniatis）［モレキュラー・ク
ローニング（Molecular Cloning）：実験手引書（A Lab
oratory Manual）、ニューヨーク、コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー（1982）］によって報告さ
れた。
被検試料中の検出すべき核酸配列は最初から分離した
分子として存在し、検出すべき配列が全核酸を構成して
いてもよく、あるいは大きい分子の単なる一部分であっ
てもよい。検出すべき核酸配列が最初から、精製された
形である必要はない。被検試料は検出すべき核酸配列が
少数部分である核酸複合体（コンプレックス）混合物を
含有するものであってもよい。例えば、検出すべき核酸
配列は全ヒトゲノムDNAに含有された腫瘍遺伝子、また
は臨床標本の少数部分である微生物、病原体の核酸配列
の一部に該当するものであってもよい。
本発明方法によれば、いかなる核酸配列をも検出する
ことができる。配列の内、検出すべき核酸配列またはそ
の相補体とハイブリダイズし得る最小限１個、または好
ましくは２個のプライマーを調製するのに充分な数の配
列中のヌクレオチドが分かっているだけで十分である。
検出すべき核酸配列は、例えば、任意の既知の核酸配列
決定法によって確かめるか、決定されたタンパク質配列
に基づいて推測することができる。検出すべき核酸配列
についての知識が多いほど選択されるプライマーの特異
性がより大きくなり、本発明方法の精度が一層高くな
る。
例えば、選択された条件下、被検試料中の検出すべき
核酸配列またはその相補的配列とは特異的にハイブリダ
イズするが他の配列とはハイブリダイズしないプロモー
ター−プライマーを選択し得るよう、充分な配列情報を
入手することが好ましい。プロモーター−プライマーと
第２プライマーの両方を用いるときは、検出すべき核酸
配列について、相互に相補的でないプライマーを選択し
得るだけの知識を得ることが望ましい。
第１−３図記載の方法はいずれも、中核となる第１段
階として、検出すべき配列とプロモーターとを含有する
２本鎖核酸の製造工程を含む。一般に、この２本鎖核酸
の調製にはプライマーがハイブリダイズした１本鎖核酸
を鋳型として用いるプロモーター−プライマー伸長産物
の合成、および、場合によっては、第２プライマー伸長
産物の合成が含まれる。プロモーター−プライマーを単
独で用いるか、第２プライマーと併用するかによって、
鋳型は検出すべき配列を含有する被検試料核酸か、また
は先に合成された検出すべき核酸配列の相補配列を含有
するプライマー伸長産物のいずれかで構成される。
もしも鋳型が元々２本鎖核酸に含有されていたもので
あればプライマー伸長産物の合成の前、または同時に核
酸ストランドを分離しなければならない。ストランドの
分離は、被検試料を90〜100℃で約１〜10分間加熱して
熱変成する方法によることが好ましいが、他の物理的、
化学的または酵素的な方法を使用することもできる。
プライマーハイブリダイゼーションは、通常、プライ
マーが、検出すべき核酸配列またはその相補配列と特異
的にハイブリダイズするが、他のいかなる配列ともハイ
ブリダイズしない、十分なストリンジェンシーとなるよ
う、温度、塩濃度およびpHに関する条件を選択した緩衝
化水溶液中で行う。一般に、プライマーと鋳型とのハイ
ブリダイゼーション効果は、加えられたプライマーが鋳
型に対して過剰モル、好ましくは1000〜106モル濃度過
剰に存在するような条件下で促進される。しかしなが
ら、被検試料中の鋳型の量が不明の場合には鋳型に対す
るプライマーの相対量も確実に決定されないということ
は理解されるであろう。
第1A−Ｇ図は、本発明の実施態様を示しており、プロ
モーター−プライマーを用いた、検出すべき配列とプロ
モーターとを含有する２本鎖核酸の調製を示す図であ
る。
第1A図では、プロモーター−プライマーｃ、ｄのプラ
イマーｃは、相補的なヌクレオチド配列の非共有結合的
な塩基対形成ｅを介して核酸ａの一部である検出すべき
核酸配列ｂとハイブリダイズしている。プロモーター−
プライマーのプロモーターｄは被検試料中の既知の核酸
配列のどれとも非相補的であるよう、好適に選択されて
いるのでハイブリダイズしないままである。
次いで、ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリヌクレ
オチドポリメラーゼｆを加えると、最初にプライマーが
ハイブリダイズした配列のｂの５′側に境界を接してい
る被検試料核酸配列ａを含有する１本鎖鋳型に沿って、
プライマーの３′末端から始まり、５′側に向けてプロ
モーター−プライマー伸長産物が合成される（第１図1B
−Ｃ）。このようにプライマー伸長産物は、検出すべき
核酸配列およびもしあるならば、５′側に隣接する被検
試料核酸配列と相補的な２本鎖分子を形成する。
３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有する物質ｈの
存在下、もしあるならば被検試料核酸の３′末端側１本
鎖配列を第1D図のように切断し、ポリヌクレオチドポリ
メラーゼｆにより、被検試料核酸配列の３′末端でプロ
モーター−プライマーのプロモーターを鋳型として開始
され、合成された新しい核酸で置換する（第１図Ｅ−
Ｇ）。
検出すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖分子
を生成する第1A−Ｇ図の方法はプロモーター−プライマ
ーと検出すべき核酸配列とのハイブリダイゼーション、
およびその後の、プロモーター−プライマー伸長合成、
核酸の切除、および置換合成からなる工程によるもので
ある。切除反応には、プロモーター−プライマー伸長合
成および置換合成に用いた試薬ｆと異なる試薬ｈが使用
されるが、２本鎖産物の合成が、プロモーター−プライ
マーハイブリダイゼーションに続いて行われるよう、単
一の試薬を使用することが望ましい。従って、ポリヌク
レオチドポリメラーゼは、大腸菌のDNAポリメラーゼ
Ｉ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片、およびT
4DNAポリメラーゼ等の５′−３′ポリメラーゼ活性と
３′−５′エキソヌクレアーゼ活性の両者を有するもの
であることが好ましい。これらの酸素はいずれもプライ
マー伸長合成に鋳型を必要とするので、それらを第1Bお
よび第1F図記載の方法で使用するのに適切な場合は、検
出すべき配列がDNAである場合である事が分かる。
検出すべき配列とプロモーターとを含有する２本鎖核
酸は、検出すべき配列の複数個のRNA転写物の供給源と
して作用する。第1H−Ｉ図に示すように、被検試料に適
当なRNAポリメラーゼaaを加えると２本産鎖物のプロモ
ーターにRNAポリメラーゼが結合し、次いで、リボヌク
レオシドトリホスファターゼの存在下、検出すべき核酸
配列をも含む。核酸配列のRNA転写物がプロモーターの
下流に位置して合成される。
必要な試薬の存在を含む、適当な条件下、RNA転写物
の合成は連続的に、しかも元々被検試料中に存在してい
た検出すべき核酸配列の量に比例して起こる。所望の量
のRNA転写物を調製するために必要ならば試薬を追加し
てもよい。RNA転写物の合成は、本質的でないリボヌク
レアーゼ不純物（混合物）によって有り得る偶発的な転
写物の分解を避けるために、バナジル−リボヌクレオシ
ド複合体またはヒト胎盤リボヌクレアーゼ・インヒビタ
ーなどのリボヌクレアーゼ・インヒビターの存在下で行
うことが好ましい［バーガーら（Berger）、Meth.Enzym
ol.、152:227（1987）；ド・マルチノフら（de Martyno
ff）、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ（Biochem.Biophys.Res.
Commun.）、93:645（1980）；およびシールら（Shee
l）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシィーズ（Proc.Natl.Acad.Sc
i.）、76:4898（1979）］。
産生された特異的なRNA転写物の測定は、RNA転写物を
その合成の間、または合成後に検出可能な部分で標識す
るか、検出すべき核酸配列のRNA転写物と特異的にハイ
ブリダイズすることができる標識したプローブを用いて
標識することにより行われる。
RNA転写物は、例えば、それ自身、検出可能な部分で
標識されており、RNAポリメラーゼの基質として利用さ
れ、そのことによりRNA転写物に組み込まれるリボヌク
レオシド三りん酸を供給することによって標識される。
検出可能な部分は直接または間接的に検出可能なシグナ
ルを産生し得るものであればよい。例えば、１つの態様
として、検出可能な部分は32P、3H、14C、125Iおよび35
S等の放射性同位元素であってよい。また別の態様とし
て、検出可能な部分は１またはそれ以上の適当な試薬と
相互反応したときに検出可能なシグナルを産生する非放
射性能の化学修飾である。即ち、例えば、検出可能な部
分はビオチンであってよく、ビオチン部分と、アビジ
ン、ストレプトアビジン、または核ビオチン抗体などビ
オチンと特異的に結合し得るタンパク質と複合体の形成
によって検出可能なシグナルが生成されるものであり、
ここに、結合したタンパク質はフルオレスセイン、また
は適当な基質と反応して蛍光、ルミネセンス、または着
色生成物を形成する酵素と抱合体を形成する（コンジュ
ゲートする）ものである［ランガーら（Langer）、プロ
シーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンシィーズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、70:6633
（1981）；ベイヤー（Bayer）およびウィルチェック（W
ilchek）、Meth.Biochem.Anal,26:1（1980）］。
他の実施態様においては、生産された特異的なRNA転
写物を核酸ハイブリダイゼーションプローブを用いて測
定する［ファルコウら（Falkow）、米国特許出願No.4,3
58,535、グッドソンら（Godson）、欧州特許出願No.023
8332］。検出すべき核酸配列と相補的またはホモローガ
スなRNA転写物の配列とハイブリダイズするように選択
することが好ましい。ハイブリダイゼーション法は欧州
特許公開No.78,685および70,687記載の液相ハイブリダ
イゼーション法、および米国特許出願No.4,358,535（フ
ァルコウ）および4,647,529（ロドランド（Rodlan
d））、欧州特許出願No.0,238,332（グッドソン）、お
よびランキら（Ranki）、Gene（21:77（1983）に記載の
液−固相ハイブリダイゼーションなど、任意の適当な方
法で行うことができる。液−固ハイブリダイゼーション
の場合には、プローブ分子またはRNA転写物のいずれか
を固体支持体に固定化すればよい。
例えば、定められた量の検出すべき配列または他の既
知配列を含有する核酸標準と、被検試料中の検出すべき
配列の量を同時に測定する方法など、任意の適当な方法
を用いてRNA転写物の量と被検試料中の検出すべき核酸
配列の量とを関係づけることができる（ランキら、英国
特許出願2187283A）。
また、本発明の別の実施態様では、検出すべき配列と
プロモーターとを含有する２本鎖核酸の合成を、プロモ
ーター−プライマーと第２プライマーとを一緒に用いて
互いにハイブリダイズし得る２個の異なるプライマー伸
長産物の合成を開始することにより行う。
第2A−Ｆ図は、まずプロモーター−プライマー伸長産
物を合成し、次いで、第２プライマー伸長産物を合成す
ることからなる方法を示す図である。第2A図は、プロモ
ーター−プライマーcdにおけるプライマーｃが検出すべ
き核酸配列ｂの３′末端に結合し、相補的なヌクレオチ
ド配列の非共有結合的な塩基対形成ｅを介してハイブリ
ダイズしていることを示す図である。ヌクレオシド三り
ん酸の存在下、ポリメライゼーション用の試薬ｆを加え
ると、１本鎖鋳型に沿って、プロモーター−プライマー
の３′末端から５′方向に伸長産物ｇの合成が開始され
る。このようにして得られる生成物は１本の鎖が被検試
料核酸であり、他の鎖がプロモーター−プライマー伸長
産物ｇである２本鎖核酸である。
次の工程（第2D図）では上記の方法の内、任意の方法
で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この鎖分離工程
の後、第２プライマーとプロモーター−プライマー伸長
産物中の検出すべき配列と相補的な配列とのハイブリダ
イゼーションに適した条件下、被検試料と第２プライマ
ーｈとを接触させる。しかしながら、分析の正確さを増
すためには第２プライマーとプロモーター−プライマー
とは相補的でないことが望ましいので、相補配列の３′
末端とハイブリダイズするように第２プライマーを選択
することが好ましい（第2E図）。
プロモーター−プライマー伸長合成に用いたポリメラ
イゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、またポリメラ
イゼーション用試薬ｉの添加により、第２プライマーの
３′末端からプロモーター−プライマー伸長産物鋳型に
沿って５′側に向かう第２プライマーの伸長産物の合成
が開始される（第2F図）。このように、第２プライマー
伸長産物はプロモーター−プライマー伸長産物と相補的
であり、それとハイブリダイズして検出すべき配列とプ
ロモーター−プライマーのプロモーターとを含有する２
本鎖核酸を形成する。
プロモーター−プライマー伸長産物の合成に用いられ
るポリメライゼーション用試薬はエキソヌクレアーゼ欠
損T7DNA［ターバー（Tabor）およびリチャードソン（Ri
chardson）、プロシーディングズ・オブ・ナションナル
・アカデミー・オブ・サイエンシィーズ（Proc.Natl.Ac
ad.Sci.）、84:4767（1987）］であることが好ましい逆
転写酵素やその他の３′−５′エキソヌクレアーゼ活性
を欠損したポリヌクレオチド・ポリメラーゼ等の他の試
薬を用いることもできる。市販の３′−５′エキソヌク
レアーゼ活性を欠損したポリメラーゼ［シークエナーゼ
TM（SequenaseTM）、ユナイテッド・ステイツ・バイオ
ケミカル・コーポレイテッド（United States Biochemi
cal Corp.）、クリーブランド（Cleveland）、オハイオ
（Ohio）］は残存量の３′−５′エキソヌクレアーゼ活
性を有しており、例えば、プロモーター−プライマーが
結合している、被検試料デオキシリボ核酸のハイブリダ
イズされていない３′末端は第2D図記載の鎖分離工程に
かける前に切除されるような場合には望ましくない。こ
のような現象は、被検試料の核酸が機械的に剪断される
場合や制限酵素消化によってプロモーター−プライマー
が結合する配列の３′側に位置する被検試料の核酸配列
の長さが短縮されるような場合に起こり得ると予測され
る。
第２プライマー伸長産物の合成は第２プライマーの
３′末端から合成を開始し、プロモーター−プライマー
伸長産物鋳型に沿って５′方向に進行し得る任意のポリ
メライゼーション用試薬を用いて行うことができる。こ
の目的に適した酵素には、例えば、大腸菌DNAポリメラ
ーゼＩ、大腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片、T4D
NAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ欠損T7DNAポリメ
ラーゼ、および逆転写酵素が含まれる。
第3A−Ｉ図は、まず第２プライマー伸長産物を合成
し、次いで、プロモーター−プライマー伸長産物を合成
することからなる方法を図示したものである。第3A図
は、第２プライマーｃが、相補的なヌクレオチド配列の
非共有結合的塩基対ｄを介して検出すべき核酸配列ｂの
３′末端にハイブリダイズしている様子を示す図であ
る。ヌクレオシド三りん酸の存在下、ポリメライゼーシ
ョン用の試薬ｅを加えると、１本鎖鋳型に沿って、第２
プライマーの３′末端から開始され５′方向に向けて伸
長産物ｆが合成される。このようにして得られる生成物
は１本の鎖が被検試料の核酸であり、他の鎖が第２プラ
イマー伸長産物である２本鎖核酸である（第3C図）。
次の工程（第3D図）では上記の方法の内、任意の方法
で２本鎖を分離して１本鎖分子を得る。この鎖分離工程
の後、プロモーター−プライマーと第２プライマー伸長
産物の中の検出すべき配列と相補的な配列とのハイブリ
ダイゼーションに適した条件下、被検試料とプロモータ
ー−プライマーghとを接触させる。しかしながら、発明
の精度の向上のためにはプロモーター−プライマーと第
２プライマーとが相補的でないことが望ましいので、相
補配列の３′末端とハイブリダイズするようにプロモー
ター−プライマーのプライマーを選択することが好まし
い。
第２プライマー伸長産物ｅの合成に用いたポリメライ
ゼーション用試薬ｆの継続的な存在下、またはポリメラ
イゼーション用試薬ｉの添加により、プロモーター−プ
ライマーの３′末端から開始され、第２プライマー伸長
産物鋳型に沿って５′側に向かい、プロモーター−プラ
イマーの伸長産物ｊに合成される。プロモーター−プラ
イマー伸長産物は検出すべき核酸配列であって、第２プ
ライマー伸長産物中の該配列に相補的な配列とハイブリ
ダイズする配列およびプロモーターを含有している。こ
のように、得られた生産物は検出すべき核酸配列とプロ
モーター−プライマーのプロモーターとを含有する２本
鎖核酸である。
3,−5,エキソヌクレアーゼ活性を有する試薬ｋの存在
下、もしあれば、プロモーター−プライマー伸長産物の
３′末端の１本鎖配列を切除し、プロモーター−プライ
マーのプロモーターを鋳型としてプロモーター−プライ
マー伸長産物の３′末端からポリメライゼーション試薬
ｉにより合成が開始されるプロモーター相補配列によっ
て置換する（第3G−Ｉ図）。
第２プライマー伸長産物の合成は第２プライマーの
３′末端から合成を開始し、被検試料の核酸配列の鋳型
に沿って５′方向に進行する任意のポリメライゼーショ
ン用試薬を用いて行うことができる。この目的に達した
酵素には、例えば、大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌D
NAポリメラーゼＩのクレノウ断片、T4DNAポリメラー
ゼ、エキソヌクレアーゼ欠損T7DNAポリメラーゼ、およ
び逆転写酵素が含まれる。プロモーター−プライマー伸
長産物の合成およびプロモーター相補配列の合成は第２
プライマー伸長産物の合成に用いたポリメライゼーショ
ン用試薬をも含めて、同一の試薬または異なる試薬を用
いて行うことができる。しかしながら、第３図記載の工
程を効率的に行うためには、プロモーター−プライマー
伸長産物の合成に使用する試薬が第3G図記載の切除反応
をも行って第２プライマー伸長産物のハイブリダイズし
ていない３′末端側の配列を除去し得るものであること
が好ましい。合成と切除反応の両方を行うのに適した酵
素には大腸菌DNAポリメラーゼＩ、大腸菌DNAポリメラー
ゼＩのクレノウ断片およびT4DNAポリメラーゼなどの
３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリヌクレ
オチド・ポリメラーゼが含まれる。
この、または前記の方法により２本鎖核酸生成物が形
成されると、それは検出すべき配列の複数個のRNA転写
物の源として作用し、その合成および測定は上記方法の
いずれかを用いて行うことができる。
検出すべき配列とプロモーターを含有する２本鎖核酸
の生産にプロモーター−プライマーと第２プライマーと
を一緒に用いることの利点は、分析の精度がより大きい
という点にある。プロモーター−プライマーまたは第２
プライマーが、検出すべき配列はその相補配列以外の配
列と間違ってハイブリダイズした場合、得られたプライ
マー伸長副産物は被検試料核酸または他のプライマー伸
長産物とハイブリダイズして、RNA転写物が合成される
ような２本鎖生成物を与えるとは考えられない。
また、２個のプライマーを一緒に用いることの他の利
点は、検出すべき配列のRNA転写物が様々な大きさで得
られることである。第２図および第３図に記載のごと
く、プロモーター−プライマーと第２プライマーとを、
１本のプライマーが検出すべき配列の３′末端にハイブ
リダイズし、他のプライマーが相補配列の３′末端にハ
イブリダイズするようにプロモーター−プライマーと第
２プライマーとを選択することにより、RNA転写物が合
成される核酸生成物の２本鎖領域は、検出すべき配列と
プロモーター−プライマーのプロモーターのみに限定さ
れる。得られたRNA転写物が様々なサイズであるという
ことは、ゲルろ過クロマトグラフィー等によって被検試
料から所望のRNA転写物を分離するなど、以後の転写物
の検出または単離に好都合である。さらに、生成された
転写物が第１図記載の方法で生成されたものよりも短い
と、その合成はより迅速に進み、かつ必要な試薬の量も
少い。
以下の実施例は単なる例示であって、いかなる意味に
おいても本発明を限定するものではない。本明細書で引
用した文献は、すべて明確に記載されている。
実施例１ 本実施例では式： ５′AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGATGTACCTCTGTATCATATGC3′ で示される配列を有するデオキシリボヌクレオチドプロ
モーター−プライマーを用いたHIV（ヒト免疫不全症ウ
イルス、以前はHTLV−III/LAVと呼称されていた）のenv
遺伝子の検出に関して示す。このプロモーター−プライ
マーの配列は、プロモーター−プライマーの５′末端側
がバクテリオファージT7クラスIIIプロモーター［ダン
（Dunn）およびスタディア（Studier）、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Biol.）、1
66:477（1983）］の機能的な領域の配列に対応し、３′
末端側はHIVのenv遺伝子の暗号配列、HIVゲノム配列の
ヌクレオチド5981−6000の間の配列［ミュシングら（Mu
esing）、ネイチャー（Nature）、313:450（1985）］と
相補的であるように選択されている。
分析用の核酸はクエン酸処理したヒト血液またはウイ
ルス感染H9細胞［ポポビックら（Popovic）、サイエン
ス（Science）、224:497（1984）］から、［ハーマン
（Hermann）およびフィシャウフ（Fischauf）、Meth.En
zymol.、152:180（1987）］の方法に従って抽出され
た。
40mM Tris−HCl（pH8.0）、20mM MgCl2、1mMジチオス
レイトール、5mg/mlゼラチン、10mMバナジル−リボヌク
レオシド複合体、および各10mMの４種のデオキシリボヌ
クレオシド三りん酸（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）お
よび４種のリボヌクレオシド三りん酸（ATP、UTP、GTP
およびCTP）を含有する反応バッファー100μのプロモ
ーター−プライマー100pmolに被検試料核酸合計10μｇ
を加える。混合物を100℃で１分間加熱し、37℃まで放
冷する。次いで、この混合物に大腸菌DNAポリメラーゼ
Ｉのクレノウ断片５単位とT7RNAポリメラーゼ５単位と
を加え、37℃で１時間反応を続ける。
生成したRNA転写物を、式： ５′TTGATGATCTGTAGTGCTAC3′ で示される配列を有する32P末端標識デオキシオリゴヌ
クレオチドをハイブリダイゼーションのプローブとして
用いるドット−ブロットハイブリッド形成法によって検
出する。上記プローブの配列はHIVゲノム配列のヌクレ
オチド5875から5895の間に位置するHIVenv遺伝子の暗号
配列部分とホモローガスなように選択されている。
RNA合成反応の一部をとり15×SSCバッファー（１×SS
C＝0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、
pH7.0）100μに加え、６×SSC中で予め湿らせておい
たニトロセルロースフィルターによってろ過する。次い
で、フィルターを80℃で１時間、真空オーブン中で乾燥
する。
乾燥後、各フィルターを５×SSC、50mMリン酸ナトリ
ウム（pH6.5）、５×デンハート溶液（１×＝0.02％ポ
リビニルピロリドン、0.02％フィコール、0.02％ウシ血
清アルブミン、0.2mM Tris−HCl、0.2mM EDTA、pH8.
0）、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム、および0.2％変性
サケ精子DNAからなるハイブリダイゼーション溶液と42
℃で１時間接触させる。次いで、標識したプローブを終
濃度107cpm/mlとなるようにハイブリダイゼーション溶
液を加え、42℃で２時間、フィルターのインキュベーシ
ョンを続ける。
最後に、フィルターを６×SSC中、バッファーを２回
交換して37℃で１時間洗浄する。乾燥後、フィルターを
オートラジオグラフィーにかけるかチェレンコフの放射
能測定に付す。
実施例２ 本実施例または以後の実施例はプロモーター−プライ
マーと第２プライマーとを一緒に用いてHIVenv遺伝子を
検出する方法に関するものである。
実施例１と同様にしてヒト血液またはウイルス感染H9
細胞から調製した被検試料10μｇを反応バッファー100
μ中でプロモーター−プライマー100pmolおよび第２
プライマー（５′ATGAGAGTGAAGGAGAAATA3′）100pmolと
混合する。この第２プライマーはHIVのenv遺伝子のアミ
ノ末端暗号配列（ヌクレオチド5803−5822）とホモロー
ガスである。このプロモーター−プライマーと第２プラ
イマーとの特殊な組み合わせは、隣接するT7プロモータ
ーの調節（コントロール）下に、それから206ヌクレオ
チドのRNA転写物が合成される。HIVのenv遺伝子配列中
の198塩基対を含有する225塩基対の２本鎖核酸が生産さ
れるよう、選択されている。
２個のプライマーと被検試料核酸を含有する混合物を
100℃で１分間加熱した後、100℃で１分間加熱し、37℃
まで放冷する。この時点でエキソヌクレアーゼ不含T7DN
Aポリメラーゼ［シークエナーゼTM（SequenaseTM）、ユ
ナイテッド・ステイツ・バイオケミカル・コーポレイテ
ッド（United States Biochemical Corp.）］５単位を
加える。37℃で５分間インキュベートした後、再度、反
応混合物を100℃で１分間加熱し、次いで、37℃で30分
間〜１時間反応を続ける。最後に、反応混合物を100℃
で５分間加熱し、42℃まで冷却する。
生成したRNA転写物を第２プライマーと発生期のRNA転
写物とのハイブリダイゼーションによって特異的に開始
される逆転写によって測定する。被検試料反応混合物に
逆転写酵素５単位と一緒に、終濃度１μＭとなるように
α−32P−dTTP（比活性約3000Ci/mmol）を加えた後、反
応混合物を42℃で15分間インキュベートする。
32P標識逆転写産物を、反応混合物中の全酸不溶性放
射能を測定することにより、定量する。反応混合物の１
部をポリスチレンチューブに入れた10％トリクロロ酢酸
（TCA）500μに加え、氷上で10分間インキュベートす
る。次いで、各チューブの内容物をワットマンのグラス
ファイバーフィルターを用いて吸引ろ過し氷冷TCAでフ
ィルターを洗浄する。乾燥後、フィルターのチェレンコ
フの放射能を計数する。
実施例３ ヒト血液またはウイルス感染H9細胞から単離した核酸
を音波処理して剪断し、平均の長さが500ヌクレオチド
の断片を調製する。次いで、剪断した被検試料核酸10μ
ｇを40mM Tris−HCl（pH8.0）、20mM MgCl2、1mMジチオ
スレイトール、5mg/mlゼラチン、10mMバナジル−リボヌ
クレオシド複合体、および各10mMの４種のデオキシリボ
ヌクレオシド三りん酸（dATP、dTTP、dGTPおよびdCTP）
および500μM ATP、500μM UTP、500μM GTPおよび500
μM CTP、および１μM α−32P−UTP（比活性約3000Ci/
mmol）を含有する反応バッファー100μ中でプロモー
ター−プライマー100pmolおよび第２プライマー100pmol
と混合する。混合物を100℃で１分間加熱し、28℃まで
放冷した時点で、逆転写酵素５単位を加える。28℃で15
分間インキュベートした後、反応混合物を100℃で１分
間再度加熱し、28℃まで放冷する。逆転写酵素５単位お
よびT7DNAポリメラーゼ５単位を加え、28℃で１時間反
応を進行させる。
32P標識逆転写産物を、上記のごとく、反応混合物中
の全酸不溶性放射能を測定することにより、定量する。
206ヌクレオチドの標識RNA転写物も、RNA合成反応物の
一部を種々の量の放射性標識RNA標準と一緒に尿素−ポ
リアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィーにかけ
て測定することができる。次いで、現像したオートラジ
オグラムをデンシトメーター（濃度計）にかけて解析す
ることによりenv遺伝子配列の206ヌクレオチド転写物を
定量する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平２−500565（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】１本鎖DNAを含有する被検試料中の特定の
    核酸配列を検出する方法であって、 （ａ）被検試料と、プライマーと結合している、専用の
    RNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するオリ
    ゴヌクレオチドプロモーター−プライマーとを、プロモ
    ーター−プライマーを検出すべき核酸配列にハイブリダ
    イズさせる条件下で接触させ、 （ｂ）被検試料をDNAポリメラーゼと接触させて検出す
    べき核酸配列とプロモーター−プライマーのプロモータ
    ーとを含有する２本鎖核酸を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物をオリゴヌクレオチドプロモ
    ーター−プライマーのプロモーターを認識し得る専用の
    RNAポリメラーゼと接触させ、それによって該プロモー
    ターのコントロール下にRNAポリメラーゼにより、検出
    すべき核酸配列の様々なRNA転写物を合成し、 （ｄ）工程（ｃ）で合成されたRNA転写物の存在を決定
    し、そして （ｅ）RNA転写物の存在と検出すべき核酸配列の存在と
    を関係づけることからなる方法。
  2. 【請求項２】RNAまたは１本鎖DNAを含有する被検試料中
    の特定の核酸配列を検出する方法であって、 （ａ）被検試料とオリゴヌクレオチド第２プライマーと
    を、第２プライマーを検出すべき特定の核酸配列にハイ
    ブリダイズさせる条件下で接触させ、 （ｂ）被検試料を逆転写酵素と接触させ、工程（ａ）で
    第２プライマーがハイブリダイズした被検試料RNAまた
    は１本鎖DNAを第２プライマー伸長産物合成の鋳型とし
    て第２プライマー伸長産物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物を変性条件下で処理して第２
    プライマーDNA伸長産物をその鋳型から分離し、 （ｄ）工程（ｃ）で生産された１本鎖核酸を、専用のRN
    Aポリメラーゼのためのプロモーターがプライマーに結
    合してなるプロモーター−プライマーであって、検出す
    べき核酸配列の全体または一部とホモローガスである
    が、工程（ａ）で用いた第２プライマーとは相補的でな
    いように選択されているオリゴヌクレオチドプロモータ
    ー−プライマーと、該プロモーター−プライマーを第２
    プライマー伸長産物にハイブリダイズさせる条件下で接
    触させ、 （ｅ）工程（ｄ）の生産物をDNAポリメラーゼと接触さ
    せて第２プライマーDNA伸長産物をプロモーター−プラ
    イマーDNA伸長産物の合成における鋳型としてプロモー
    ター−プライマーDNA伸長産物を合成し、 （ｆ）工程（ｅ）の生産物をオリゴヌクレオチドプロモ
    ーター−プライマーのプロモーターを認識し得る専用の
    RNAポリメラーゼと接触させ、それによって該プロモー
    ターのコントロール下に検出すべき核酸配列の複数のRN
    A複写物を合成し、そして （ｇ）該RNA転写物の存在を検出すべき核酸配列の存在
    に関係づけることからなる方法。
  3. 【請求項３】１本鎖DNAを含有する被検試料中の特定の
    核酸配列を検出する方法であって、 （ａ）被検試料とオリゴヌクレオチド第２プライマーと
    を、第２プライマーを特定の核酸配列にハイブリダイズ
    させる条件下で接触させ、 （ｂ）被検試料をDNAポリメラーゼと接触させて、工程
    （ａ）で第２プライマーがハイブリダイズした被検試料
    RNAまたは１本鎖DNAを第２プライマー伸長産物合成の鋳
    型として第２プライマー伸長産物を合成し、 （ｃ）工程（ｂ）の生産物を変性条件下で処理して第２
    プライマーDNA伸長産物をその鋳型から分離し、 （ｄ）工程（ｃ）で生産された１本鎖核酸と、専用のRN
    Aポリメラーゼのためのプロモーターがプライマーに結
    合してなるプロモーター−プライマーであって、検出す
    べき核酸配列の全体または一部とホモローガスである
    が、工程（ａ）で用いた第２プライマーとは相補的でな
    いように選択されているオリゴヌクレオチドプロモータ
    ー−プライマーとを、プロモーター−プライマーを第２
    プライマー伸長産物にハイブリダイズさせる条件下で接
    触させ、 （ｅ）工程（ｄ）の生産物をDNAポリメラーゼと接触さ
    せて第２プライマーDNA伸長産物をプロモーター−プラ
    イマーDNA伸長産物の合成における鋳型としてプロモー
    ター−プライマーDNA伸長産物を合成し、 （ｆ）工程（ｅ）の生産物をオリゴヌクレオチドプロモ
    ーター−プライマーのプロモーターを認識し得る専用の
    RNAポリメラーゼと接触させ、該プロモーターのコント
    ロール下に検出すべき核酸配列の複数のRNA転写物を合
    成し、そして （ｇ）該RNA転写物の存在を検出すべき核酸配列の存在
    に関係づけることからなる方法。
  4. 【請求項４】オリゴヌクレオチドプロモーター−プライ
    マーとオリゴヌクレオチドプローブとを含有する被検試
    料中の核酸配列を検出するために用いられるキットであ
    って、プロモーター−プライマーは被検試料核酸配列と
    ハイブリダイズすることができ、オリゴヌクレオチドプ
    ローブは検出すべき核酸配列の全体または一部とホモロ
    ーガスであるキット。
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