BRPI0609134A2 - vacinas combinadas com antìgeno celular total de pertussis - Google Patents
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Abstract
VACINAS COMBINADAS COM ANTìGENO CELULAR TOTAL DE PERTUSSIS. Têm sido vacinas estudadas que compreendem (a) antígenos D-T-Pw-HepB- Hib e (b) um ou mais antígenos meningocóccicos conjugados. Um número de melhoramentos e variações destas vacinas tem sido descoberto. As vacinas podem ser preparadas extemporaneamente no momento da utilização pela mistura de dois componentes juntos: (a) um primeiro componente compreendendo antigenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um conjugado Hib e um ou mais conjugados meningocóccicos.
Description
VACINAS COMBINADAS COM ANTIGENO CELULAR TOTAL DE PERTUSSIS
. . Todos os documentos citados aqui estão incorporados
por referência em sua totalidade.Campo Técnico
Esta invenção é no campo de vacinas combinadas que são
vacinas contendo uma mistura de imunogenos advindos de maisde um patógeno, tal que administração desta vacina podeimunizar um indivíduo contra mais de um patógenosimultaneamente. Fundamento da Arte
Vacinas combinadas oferecem aos pacientes a vantagemde receber um número reduzido de injeções, as quais levam avantagem clínica de conformidade aumentada (por exemplo,: veja Capítulo 29 da referência 1).
! Seis patogenos de assunto particular, particularmente
I
em crianças, são Corynebacterium diphtheriae (a causa da. difteria), Clostridium tetani (a causa de tétano/trismo,Bordetella pertussis (coqueluche), vírus da hepetite B("HepB", hepatite viral), Haemophilus influenzae tipo b("Hib", uma causa de meningite e pneumonia bacteriana) eNeisseria meningitidis (meningite e septicemiameningocóccica).
Vacinas contra cada um destes patogenos são conhecidase uma vacina pentavalente incluindo todos os cinco
y
componentes "D", "T", "P" , "HepB" e "Hib" paraadministração simultânea combinada é comercializada pelaGlaxoSmithKline sob o nome de TRITANRIX-HepB/Hib. Ocomponente "P" nesta vacina pentavalente é baseado noantígeno celular total de pertussis ("Pw"). Os componentes DTP e HepB desta vacina estão em uma solução dentro de umfrasco (e esta combinação tetravalente DTPw-HepB é vendidaseparadamente como o produto "TRITANRIX-HepB"), mas ocomponente Hib é congelado à seco e contido em um frascoseparado. A solução DTPw-HepB é utilizada para reconstituir
o componente Hib no momento da utilização,extratemporaneamente formando a vacina pentavalente nofrasco.
TRITANRIX-HepB/Hib não protege contra infecçãomeningocóccica.
Exemplo 3 da referência 2 divulga os resultados de
ensaios clínicos humanos nos quais o produto tetravalenteTRITANRIX-HepB foi extratemporaneamente misturado comsacarídeos capsulares conjugados de Hib e de sorogrupos A eC de meningococcus ("MenA" e "MenC"). Os autores reportaram
que esta mistura heptavalente induziu uma boa respostaimune contra cada antígeno e foi bem tolerada por crianças.Detalhes completos dos componentes Hib, MenA e MenC não sãodados. Informação similar está reportada nas referências 3e 4.
É um objetivo da invenção fornecer vacinas combinadas
adicionais e melhoradas para proteger contra todos seisCorynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetellapertussis, vírus da hepetite B, Haemophilus influenzae tipob e Neisseria meningitidis. Resumo da Invenção
A invenção é baseada em estudos de vacinas quecompreendem antígenos D-T-Pw-HepB-Hib (como no produtoTRITANRIX-HepB/Hib) e também compreende um ou maisantígenos meningocóccicos conjugados.
Um número de melhoramentos e variações destas vacinasfoi descoberto e estes são os tópicos da invenção.Vacinas da invenção compreendem:
(i) Um toxóide diftérico, "D";
(ii) Um toxóide tetânico, "T";
(iii) Um antígeno celular pertussis, "wP";
(iv) Um antígeno de superfície do vírus da hepatite B,"HBsAg";
(v) Um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilusinfluenzae ("Hib") conjugado a uma proteína carreadora; e
(vi) Pelo menos um sacarídeo capsular de Neisseria
meningitidis conjugado a uma proteína carreadora.
0(s) sacarídeo(s) meningocóccioco(s) pode(m) serformado (s) por um ou mais dos sorogrupos A, C, W135 e Y.Nomenclatura comum refere-se a estes quatro sorogrupos como
"Men", "MenC, "MenW153" e "MenY". Antígenos conjugados sãogeralmente referidos aqui como "MenA-X", etc, onde "X"representa a proteína carreadora conjugada. Conjugados comproteínas carreadoras específicas são então referidos como"MenA-CRM" ou "MenC-D", etc.
Vacinas preferidas contém conjugados meningocóccicos
para pelo menos sorogrupo C e, preferencialmente para ambosos sorogrupos A e C. desta maneira, vacinas preferidas sãohexavalentes (D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC) ou heptavalentes (D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenA-MenC). Em adição aos antígenos (i) a (vi) listados acima,
antígenos adicionais podem também estar presentes, porexemplo, para gerar uma vacina 8-valente, 9-valente, 10-valente, etc.
Vacinas da invenção podem ser preparadas no formato
líquido (ou seja, onde todos os antígenos estão em soluçãoaquosa ou suspensão) durante a produção ou eles podem serpreparados extratemporaneamente no momento da utilizaçãopela mistura de dois componentes juntos: (a) um primeirocomponente compreendendo antígenos D, T wP e HBsAg; e (b) um segundo componente compreendendo Hib e conjugadosmeningocóccicos. Os dois componentes estão
preferencialmente em frascos separados (por exemplo,frascos e/ou seringas) e a invenção fornece um kitcompreendendo componentes (a) e (b). os conteúdos do
primeiro frasco são preferencialmente aquosos e osconteúdos do segundo frasco são preferencialmenteliofilizados, tais que as vacinas da invenção possam serpreparadas pela reconstituição do componente liofilizadocom o componente aquoso D-T-wP-HBsAg.
(1) Proporção do peso do conjugado Hib
Conjugados Hib são bem conhecidos, mas eles vêm emdiversas formas. Por exemplo, Tabela 14-7 da referência 1fornece as características dos quatro diferentes conjugadosHib. Esta tabela reporta que a proporção de peso
sacarídeo:carreador varia entre 1,4:1 em "PRP-D" (sacarídeo
em excesso) a 0,06:1 em "PRP-OMP" (proteína em excesso).Todos estes conjugados foram utilizados em vacinascombinadas, mas um aspecto da invenção selecionou uma faixade proporção de peso específica para utilização em vacinas combinadas que incluem conjugados meningocóccicos.
A proporção de peso da proteína carreadora parasacarídeo em conjugados Hib foi reportada como exercendouma importante função na eficácia de vacinas conjugadas. Deacordo com a referência 5, em vacinas combinadas onde a
proteína carreadora está presente também como um antígeno(por exemplo, toxóide tetânico é utilizado tanto como umcarreador como um antígeno, como na presente invenção)então um conjugado Hib deve possuir uma faixa de proporçãode peso sacarideo:carreador de entre 1:0,3 e 1:2. Em contraste, de acordo com a presente invenção, a
faixa de proporção de sacarideo para carreador pode estaracima desta faixa e estar entre 1:2 e 1:4. Conjugados Hibnesta faixa mostram excelente imunogenicidade quandocombinados com conjugados meningocóccicos em vacinaspediátricas combinadas e não diferem de qualquerinterferência imune, mesmo que a proteína carreadora estejapresente como um antígeno livre (por exemplo, onde aproteína carreadora é toxóide tetâÂnico ou um toxóidediftérico). De fato, a proteína carreadora extra podej contribuir para imunidade, por exemplo, contra tétano ou
difteria.
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinadacompreendendo (i) uma toxina diftérica, (ii) um toxóidetetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície da hepatite B, (v) um sacarideocapsular tipo b de Haemophilus influenzae ("Hib") conjugadoa uma proteína carreadora (vi) pelo menos um sacarideocapsular de Neisseriã meningitidis conjugado a uma proteínacarreadora, caracterizada no processo compreendendo as etapas de: (a) combinação de um componente tetravalente;(b) combinação dos conjugados de H. influenzae e N.meningitidis para gerar um componente conjugado misturado,onde o conjugado H. influenzae possui um excesso de peso docarreador para sacarideo com uma proporção de peso do carreador para sacarideo de entre 2:1 e 4:1; e (c)misturando componente D-T-Pw-HBsAg com o componenteconjugado, para gerar a vacina combinada.
O conjugado Hib possui um excesso de peso da proteínacarreadora. A proporção de peso está entre 2:1 e 4:1 e está preferencialmente entre 2,5:1 e 3,5:1. Uma proporção depeso entre 2,8:1 e 3,2:1 pode ser utilizada e uma proporçãode peso de aproximadamente 3:1 é preferida. A uma dosetípica de 10 ug (medida como sacarídeo), por conseguinte,uma composição da invenção incluirá entre 20-4 0 ug do carreador, preferencialmente aproximadamente 30 ug. estaproporção está em contraste direto com o ensinado nareferência 5.
A proteína carreadora para o conjugado Hib épreferencialmente um toxõide tetânico, e então, para 10 ug do sacarídeo Hib, a composição pode incluir 20-40 pg detoxóide tetânico do conjugado Hib, mais toxóide tetânicoadicional como o antígeno "T" para proteção contra infecçãopor C. tetani.
Composições e processos preferidos utilizam um conjugado meningocóccico do sorogrupo C. Composições eprocessos mais preferidos utilizam conjugadosmeningocóccicos separados de ambos os sorogrupos A e C.Estes estão preferencialmente conjugados a uma proteína Dcarreadora de H. inluenzae, mas eles podem ser também conjugados a um carreador toxóide tetânico, um carreadortoxóide diftérico ou um carreador CRM197.
(2) Ligação carreador/sacarídeo no conjugado HibComo mostrado na Tabela 14-7 da referência 1, váriasligações químicas diferentes foram utilizadas para produzir conjugados Hib. Alguns conjugados são formados pelaativação do sacarídeo, alguns por ativação do carreador ealguns pela ativação de ambos. Para ativação do sacarídeo,periodato e cianoborohidrato são utilizados no produto"HbOC" e ADH, CNB e carbodiimida HC1 são utilizados no5 produto "PRP-T". Todos estes conjugados foram utilizados emvacinas combinadas, mas um aspecto da invenção selecionouum tipo específico de ligação para utilização em vacinascombinadas que incluem conjugados meningocóccicos.
De acordo com a presente invenção, o polissacarídeo
pode primeiro ser ativado utilizando brometo de cianogenio,então unido a um ácido adipínico ligante e esta entidadeligante-sacarídeo é então alcançada com uma proteínacarreadora e em particular com uma proteína carreadoratoxóide tetânica.
O primeiro passo envolve cianilação de um grupo -OH
livre no sacarídeo Hib, ilustrado como segue:<formula>formula see original document page 8</formula> Esta reação é realizada utilizando brometo de
cianogenio (CNBr). Resumidamente, CNBr é reagido com osacarídeo sob condições ácidicas (pH 10 a 12) . Neste pH,ésteres cianato são formados com os grupos hidroxil dosacarídeo. O alto pH ioniza o grupo hidroxil para permitir
ataque nucleofílico do íon hidroxil no íon cianato. Porcausa do alto pH, várias reações laterais podem ocorrer,mas apenas a formação do éster cianato é o tópico dainvenção.
O éster cianato é reagido com um reagente bifuncional (heterobifuncional ou, preferencialmente, homobifuncional)com o objetivo de fornecer um espaçador para ligação docarreador. De acordo com a invenção, um espaçador hidrazidaadipinica pode ser utilizado. Isto pode serconvenientemente realizado pela utilização de ácidoadipinico dihidrazida (AADH):
<formula>formula see original document page 9</formula>
O mecanismo da reação AADH com um éster cianato (paraformar uma ligação imidocarbamato) pode ser ilustrado como:
<formula>formula see original document page 9</formula>
O sacarídeo ativado é então reagido com um carreadortoxóide tetânico na presença de EDAC (l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida):
EDAC será tipicamente utilizado sob a forma de seu salhidroloreto:
(CH»)2N(CH2)s-NsOlSt-CHaCHa • HC1
EDAC permite o grupo carboxil na extremidade livre doligante ácido adípico reagir com a proteína carreadora(tipicamente com um -SH, -NH2 ou -OH livre ou uma cadeialateral de aminoácido), para formar um conjugado que podeser ilustrado como segue, onde -X- é -S-, -O- ou -NH-,originado do carreador:
<formula>formula see original document page 10</formula>
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinada
compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóidetetânico, um antigeno celular pertussis, um antígeno desuperfície do vírus da hepatite B, um sacarídeo capsulartipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e pelo menos um sacarídeo capsular de Neisseria
meningitidis conjugado a uma proteína carreadora,caracterizada tal que o conjugado de H. influenzae éobtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a)ativação do sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae com brometo de cianogênio, para resultar em uméster cianato; (b) adição de um espaçador hidrazidaadipínica ao éster cianato, para resultar em um sacarídeoativado e (c) união do sacarídeo ativado a uma proteínacarreadora por condensação carbodiimida. A invenção também fornece uma vacina combinadacompreendendo: (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóidetetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) umantígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) pelo menos umsacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que o conjugadode H. influenzae de (v) inclui um ligante com uma dasseguintes estruturas:
Onde -X- é selecionado a partir do grupo consistindode: -O-, -S- ou -NH-. O carbamato é preferido.
A proteína carreadora do conjugado Hib épreferencialmente um toxóide tetânico.
Composições e processos preferidos utilizam umconjugado meningocóccico do sorogrupo C e, composições eprocessos mais preferidos utilizam conjugadosmeningocóccicos separados de ambos os grupos A e C. Estesestão preferencialmente conjugados a uma proteínacarreadora D de H. influenzae.
Uma mistura dos conjugados Hib, MenA e MenC éutilizada tanto para misturar outras vacinas ou comovacinas por si mesma. Desta maneira, a invenção também fornece uma mistura de conjugados compreendendo (i) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado auma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteínacarreadora, caracterizada tal que o conjugado de H.influenzae é obtenível por um processo compreendendo asetapas de: (a) ativação do sacarídeo capsular tipo b deHaemophilus influenzae com brometo de cianogênio, para
resultar em um éster cianato; (b) adição de um espaçadorhidrazida adipínica ao éster cianato, para resultar em umsacarídeo ativado e (c) união do sacarídeo ativado a umaproteína carreadora por condensação carbodiimida.
A invenção também fornece uma mistura de conjugados
compreendendo: (i) um sacarídeo capsular tipo b deHaemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora,(ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidissorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) umsacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C
conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal queo conjugado de H. influenzae de (i) inclui um ligande deuma das seguintes estruturas:
ode: -O-, -S- ou -NH-. O carbamato é preferido.
(3) Ligação direta carreador-sacarídeo nos conjugadosmeningocóccicos
O conjugado Hib descrito acima está ligado a uma5 proteína carreadora por um espaçador. Em contraste, épreferível utilizar ligação direta nos conjugadosmeningocóccicos. Ligação direta foi vista como sendoparticularmente apropriada para conjugados meningocóccicos,especialmente onde proteína D é utilizada como o carreador
10 e onde o conjugado Hib não utiliza ligação direta (paraevitar os ligantes de cruzar qualquer limiar o qual elespodem se tornar imunogênicos).
Em uma situação de ligação direta, um grupo -OH nosacarídeo meningocóccico é primeiro cianilado (por exemplo,
15 como descrito acima) para resultar em um éster cianato. Ogrupo -OCN é então utilizado para ligar-se diretamente auma cadeia lateral no carreador, tal como um -NH2 livre, umgrupo -SH livre ou um grupo -OH livre. Ligação a um -NH2livre em uma cadeia lateral de lisina é preferida.
20 O mecanismo de ligação direta pode ser ilustrado como
segue:
25
E o produto conjugado desta reação pode ser ilustrado3 0 como segue:<formula>formula see original document page 14</formula>Em vez de utilizar brometo cianogenico como o agente
cianilante, a reação de cianilação é preferencialmenterealizada utilizando um agente cianilante orgânico, talcomo um reagente l-ciano-4-(dimetilamino)-piridínio("CDAP"). O agente cianilante orgânico pode ser selecionado
a partir do grupo consistindo de l-ciano-4-(dimetilamino)-piridínio tetrafluoroborato, p-nitrofenilcianato ("pNPC") eN-cianotrietil-amônia tetrafluoroborato ("CTEA").
Utilizando estes reagentes significa que a reação deativação pode ser realizada em um pH neutro, o qual pode ajudar a reter a estabilidade e integridade dopolissacarídeo. Em particular, isto pode ajudar a retergrupos -Ac (veja abaixo). Em métodos preferidos, o reagentecianilante é utilizado a pH 6-8 em um tampão nãonucleofílico, por exemplo, em salina, HEPES, fosfato, água e alguns solventes orgânicos [6] . O CDAP pode serdissolvido em acetonitrila e adicionado em solução aquosade sacarrídeo. Após conjugação, a reação pode ser saturada
pela adição de glicina, a qual bloqueia os grupos cianato
i
que não reagiram. Concentrando no conjugado meningocóccico do sorogrupoA, a invenção fornece uma vacina combinada compreendendo(i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii)um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno desuperfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeocapsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a umaproteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseriameningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteínacarreadora, caracterizada tal que o conjugado do sorogrupoA é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo A pararesultar em um éster cianato e (b) junção de um és tercianato diretamente a uma proteína carreadora. A vacinapode também incluir (vii) um sacarídeo capsular deNeisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteínacarreadora.
A invenção também fornece um processo para preparo deuma mistura combinada compreendendo (i) sacarídeo capsulartipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteínacarreadora, (ii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteínacarreadora e (iii(sacarídeo capsular de Neisseriameningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteínacarreadora, caracterizado tal que o conjugado do sorogrupoA é produzido por um processo compreendendo as etapas de:(a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo A pararesultar em um éster cianato e (b) junção de um éstercianato diretamente a uma proteína carreadora.
Voltando ao conjugado meningocóccico do sorogrupo C, ainvenção fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) umantígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfíciedo vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b deHaemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadorae (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidissorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora,caracterizada tal que o conjugado do sorogrupo C éobtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a)cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo C pararesultar em um éster cianato e (b) junção de um éster cianato diretamente a uma proteína carreadora. A vacinapode também incluir (vii) um sacarídeo capsular deNeisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteínacarreadora.
A invenção também fornece um processo para preparo de
uma mistura combinada compreendendo (i) sacarídeo capsulartipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteínacarreadora, (ii) sacarídeo capsular de Neisseriameningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteínacarreadora e (iii) sacarídeo capsular de Neisseria
meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteínacarreadora, caracterizado tal que o conjugado do sorogrupoC é produzido por um processo compreendendo as etapas de:(a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo C pararesultar em um éster cianato e (b) junção de um éster
cianato diretamente a uma proteína carreadora.
A invenção também fornece vacinas e processos nosquais ambos os conjugados do sorogrupo A e do sorogrupo Csão preparados desta maneira e depois combinados. Umconjugado Hib pode também ser adicionado, para resultar em
uma mistura conjugada compreendendo todos os três de Hib,MenA e MenC.
(4) O-Acetilação do conjugado do sorogrupo C
O sacarídeo meningocóccico capsular do sorogrupo C éum homopolímero a2-»9 ligado de ácido siálico (ácido N-5 acetilneuramínico), tipicamente com grupos O-acetil (OAc)nos resíduos C-7 ou C-8:
10 R = -H ou -COCH3
-»9) -Neu p NAc 7/8 OAc- (a2-»Algumas linhagens MenC (~ 12% dos isolados invasivos)produzem um polissacarídeo que não possui o grupo OAc. Apresença ou ausência de grupos OAc gera epítopos únicos e a
15 especificidade de ligação de anticorpos ao sacarídeo podeafetar a atividade bactericida destes contra linhagens O-acetiladas (OAc-) e des-O-acetiladas (OAc+) [9-9]. Vacinasconjugadas licenciadas incluem ambos os sacarídeos OAc-(NeisVac-C™) e OAc+ (Menjugate™ & Meningitec™) .
20 De acordo com a invenção, tanto a linhagem OAc+ como a
OAc- podem ser utilizadas.
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinadacompreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóidetetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um
25 antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"),(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que em, pelo
30 menos, 50% dos resíduos de ácido siálico no sacarídeocapsular do sorogrupo C de (vi) são O-acetilados na posiçãoC-7 ou C-8.
A invenção também fornece uma vacina combinadacompreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) umantígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"),(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a
uma proteína carreadora, caracterizada tal que o sacarídeocapsular do sorogrupo C é de uma linhagem 0Ac+.
A invenção também fornece uma vacina combinadacompreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóidetetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um
antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"),(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que os resíduos
de ácido siálico no sacarídeo capsular do sorogrupo C nãosão O-acetilados.
A invenção também fornece uma vacina combinadacompreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóidetetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um
antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"),(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que o sacarídeo
capsular do sorogrupo C é de uma linhagem OAc-.Estas vacinas podem também incluir (vii) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado auma proteína carreadora.
A invenção também fornece um processo para o preparo de uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóidediftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) umantígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno desuperfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae
conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que o processocompreende as etapas de: (a) combinação de um componentetetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg,
para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg;(b) combinação de conjugados H. influenzae e N.meningitidis para resultar em um componente conjugadomisturado, onde, pelo menos, 50% dos resíduos de ácidosiálico no sacarídeo capsular do sorogrupo C de (vii) são
O-acetilados na posição C-7 ou C-8.
A invenção também fornece um processo para o preparode uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóidediftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) umantígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno de
superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que o processo
compreende as etapas de: (a) combinação de um componentetetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg,para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg;(b) combinação de conjugados H. influenzae e N.meningitidis para resultar em um componente conjugado misturado, onde os resíduos de ácido siálico no sacarídeocapsular do sorogrupo C de (vii) não são O-acetilados.
A invenção também fornece um processo para o preparode uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóidediftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) um
antígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno desuperfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a
uma proteína carreadora, caracterizada tal que o processocompreende as etapas de: (a) combinação de um componentetetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg,para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg;(b) combinação de conjugados H. influenzae e N.
meningitidis para resultar em um componente conjugado
misturado, onde o sacarídeo capsular do sorogrupo C é dalinhagem OAc-.
A invenção também fornece um processo para o preparode uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico ("D"), (ii) um toxóide tetânico ("T"), (iii) umantígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno desuperfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo
capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizada tal que o processocompreende as etapas de: (a) combinação de um componentetetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg,para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg; (b) combinação de conjugados H. influenzae e N.meningitidis para resultar em um componente conjugadomisturado, onde o sacarídeo capsular do sorogrupo C é dalinhagem OAc+.
As vacinas produzidas por estes processos podem tambémincluir (vii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidissorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção também fornece uma mistura conjugadacompreendendo (i) sacarídeo capsular tipo b de Haemophilusinfluenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo Aconjugado a uma proteína carreadora e (iii) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizado tal que os resíduosde ácido siálico no conjugado MenC não são O-acetilados.
A invenção também fornece uma mistura conjugada
compreendendo (i) sacarídeo capsular tipo b de Haemophilusinfluenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii)sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo Aconjugado a uma proteína carreadora e (iii) sacarídeocapsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado auma proteína carreadora, caracterizado tal que o sacarídeocapsular MenC é da linhagem OAc-.
A invenção também fornece uma mistura conjugadacompreendendo (i) sacarídeo capsular tipo b de Haemophilusinfluenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii)sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que em, pelo menos, 50% dos resíduos de ácido siálico no conjugado MenC são O-acetilados na posição C-7 ou C-8.
A invenção também fornece uma mistura conjugada compreendendo (i) sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii)
sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o sacarídeo capsular de MenC é da linhagem OAc+.
Onde, pelo menos, 50% dos resíduos de ácido siálico do
conjugado do sorogrupo C são O-acetilados, a porcentagem mínima pode ser maior do que, por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou maiores.
Linhagens preferidas para produção dos conjugados do
sorogrupo C são linhagens 0Ac+, preferencialmente do sorotipo 16, preferencialmente do sorosubtipo P1.7a,l. Desta maneira, linhagens OAc+ C:16:P1.7a,l são preferidas. (5) O-Acetilação do conjugado do sorogrupo A O sacarídeo meningocóccico capsular do sorogrupo A é
um homopolímero de N-acetil-manosamina-fosfato ligado al-»6, com O-acetilação parcial nas posições C-3 e C-4:<formula>formula see original document page 23</formula>
Acetilação na posição C-3 pode ser tão alta quanto 70-15 95%. Condições utilizadas para purificar o sacarideo pode resultar em des-O-acetilação (por exemplo, sob condições básicas), mas a invenção procura reter OAc.
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinada (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii)
um antigeno celular pertussis, (iv) um antigeno de
superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarideo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarideo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que, pelo menos, 50% dos resíduos manosamina do sacarideo capsular do sorogrupo A são O-acetilados na posição C-3. A vacina pode também incluir (vii) sacarideo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína
carreadora.A invenção também fornece um processo para o preparo de uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) um antígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antigeno de 5 superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que o processo compreende as etapas de: (a) combinação de um componente tetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg; (b) combinação de conjugados H. influenzae e N. meningitidis para resultar em um componente conjugado misturado, onde, pelo menos, 50% dos resíduos manosamina do sacarídeo capsular do sorogrupo A são O-acetilados na posição C-3.
As vacinas produzidas por estes processos podem também incluir (vii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis
sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção também fornece uma mistura conjugada compreendendo (i) sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A
conjugado a uma proteína carreadora e (iii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que, pelo menos, 50% dos resíduos manosamina do sacarídeo capsular do sorogrupo A são O-acetilados na posição C-3. Onde, pelo menos, 50% dos resíduos manosamina dosacarídeo capsular do sorogrupo A são O-acetilados, a porcentagem mínima pode ser maior que, por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais altas. (6) Dosagem conjugada 5 Antígenos Hib conjugados não são baratos para produzir
e diversas estratégias para economizá-los foram desenvolvidas [10-12]. Uma abordagem foi fornecer duas doses conjugadas mais baixas que o padrão de 10 ug/dose (tipicamente frações de, por exemplo, 1/2, 1/3, 1/4, etc.)
[10-12] . Na ref. 12, por exemplo, conjugados Hib foram administrados a 5 ug/dose ou 3,3 3 ug/dose, ou seja 1/2 ou 1/3 da dose normal.
A mesma abordagem foi extendida para conjugados Hib dentro das vacinas DTP-Hib. Por exemplo, referência 13
compara utilização de dose completa, meia dose e um terço de dose do conjugado Hib em combinação com vacina DTwP e, apesar da média geométrica das concentrações de anticorpos PRP ter sido reduzida em pacientes que receberam vacinas DTP-Hib combinadas comparada a administração aeparada de
DTP e Hib, respostas imune protetorsa anti-Hib aceitáveis foram vistas em todos os casos. Referência 14 utiliza uma diluição de 10 vezes da dosagem conjugado Hib pela reconstituição de uma única dose Hib com um frasco de dez doses de DTwP. Referência 2 divulga reconstituição de
conjugado Hib liofilizado a dose completa, meia dose ou um quarto de dose utilizando vacina TRITANRIX™ DTwP-HBsAg.
Para as vacinas combinadas da invenção, uma quantidade de entre 8 ug e 12 ug (medida em sacarídeo) de Hib e conjugados meningocóccicos foi selecionada. Esta quantidade
pode estar presente em uma unidade de dose única ou podeestar presente por mililitro da vacina.
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) pelo menos sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que vacina contém entre 8 ug/mL e 12 ug/mL do sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae. É preferido incluir conjugados meningocóccicos para ambos os sorogrupos A e C.
A invenção também fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que a vacina
contém entre entre 8 ug/mL e 12 ug/mL do sacarídeo capsular meningocóccico do sorogrupo A. A vacina preferencialmente também inclui (vii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis do sorogrupo C conjugado a uma proteína 25 carreadora.
A invenção também fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que a vacina contém entre entre 8 ug/mL e 12 pg/mL do sacarídeo capsular 5 meningocóccico do sorogrupo C. A vacina preferencialmente também inclui (vii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis do sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção fornece uma vacina combinada compreendendo
(i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) pelo menos um sacarídeo capsular
de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que a vacina contém entre entre 8 ug e 12 ug do sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b por unidade de dose. É preferível incluir conjugados meningocóccicos de ambos os sorogrupos A e C.
A invenção também fornece uma vacina combinada
compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae
conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que a vacina contém entre entre 8 ug e 12 ug do sacarídeo capsular meningocóccico do sorogrupo A por unidade de dose. A vacina
preferencialmente também inclui (vii) sacarídeo capsular deNeisseria meningitidis do sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção também fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que a vacina contém entre entre 8 ug e 12 ug do sacarídeo capsular meningocóccico do sorogrupo C por unidade de dose. A vacina preferencialmente também inclui (vii) sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis do sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora.
Vacinas preferidas possuem uma dose sacarídica de entre 8 ug e 12 ug (por mililitro ou por unidade de dose) para todos os três conjugados de Hib, MenA e MenC.
(7) Processos extratemporâneos para preparação de
vacinas da invenção
Como mencionado acima, vacinas da invenção podem ser preparadas extratemporaneamente no momento da utilização pela mistura de dois componentes juntos: (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um conjugado Hib e, pelo menos, um conjugado meningocócico. Os dois componentes são preferencialmente embalados separadamente e, desta maneira, em geral a invenção fornece um kit contendo: (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e
HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo umconjugado Hib e, pelo menos, um conjugado meningocõcico. Esta abordagem evita a despolimerização dos conjugados que pode ocorrer durante estocagem em condições aquosas, o que é um problema particular para conjugados Hib e MenA, 5 particularmente quando combinados.
Os dois componentes (a) e (b) são embalados separadamente, por exemplo, em frascos separados. Os conteúdos do primeiro frasco (contendo D-T-wP-HBsAg) são preferencialmente aquosos e os conteúdos do segundo frasco
(contendo os conjugados) são preferencialmente liofilizados, tal que vacinas da invenção possam ser preparadas pela reconstituição do componente liofilizado com o componente aquoso. Desta maneira, a invenção fornece um processo para preparação de uma composição de vacina
compreendendo as etapas de (a) fornecimento de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg sob a forma aquosa; (b) fornecimento de um segundo componente compreendendo Hib e conjugados meningocóccicos sob a forma liofilizada e (c) combinação dos dois componentes sob a
forma de um kit.
Mais especificamente, a invenção fornece:
um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de
Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o conjugado H. influenzae possui um excesso de peso de carreador de sacarídeo com uma proporção de peso para
sacarídeo de entre 2:1 a 4:1.- processo para a preparação de um kit da invenção, compreendendo as etapas de: (a) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (b) preparação de um segundo componente compreendendo umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o conjugado H. influenzae possui um excesso de peso de carreador de 10 sacarídeo com uma proporção de peso para sacarídeo de entre 2:1 a 4:1 e (c) combinação de dois componentes sob a forma de um kit.
um kit compreendendo (i) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (ii) um segundo
componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o conjugado H. influenzae é obtenível por um processo
compreendendo as etapas de: (a) ativação do sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b com brometo de cianogênio, para resultar em um éster cianato; (b) adição de um espaçador hidrazida adipínica ao éster cianato, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união do sacarídeo
ativado a uma proteína carreadora por condensação carbodiimida.
- um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelmenos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o conjugado H. influenzae inclui um ligante com uma das duas estruturas seguintes:
onde -X- é selecionado a partir do grupo consistindo de: -O-, -S- ou -NH-.
- um processo para preparação de um kit da invenção
compreendendo as etapas de: (i) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (ii) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis
conjugado a uma proteína carreadora e (iii) combinação dos dois componentes sob a forma de um kit, caracterizado tal que o conjugado H. influenzae é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) ativação do sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae tipo b com brometo de
cianogênio, para resultar em um éster cianato; (b) adição de um espaçador hidrazida adipínica ao éster cianato, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união do sacarídeo ativado a uma proteína carreadora por condensação carbodiimida.
- um processo para preparação de um kit da invençãocompreendendo as etapas de: (a) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (b) preparação de um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e, pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora e (c) combinação dos dois componentes sob a forma de um kit, caracterizado tal que o conjugado H. influenzae inclui um ligante com uma das duas estruturas seguintes:
<formula>formula see original document page 32</formula>
onde -X- é selecionado a partir do grupo consistindo de: -O-, -S- ou -NH-.
- um processo para preparação de um kit da invenção
compreendendo as etapas de: (i) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (ii) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo A
conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o conjugado de N. meningitidis sorogrupo A é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo A para resultar em um éster cianato e (b) junção de um éster cianato diretamente a uma
proteína carreadora.- um processo para preparação de um kit da invenção compreendendo as etapas de: (a) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (b) um segundo componente compreendendo um sacarideo capsular tipo
b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarideo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o conjugado de N. meningitidis sorogrupo C é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarideo 10 capsular do sorogrupo A para resultar em um éster cianato e (b) junção de um éster cianato diretamente a uma proteína carreadora.
- um processo para preparação de um kit da invenção compreendendo as etapas de: (i) preparação de um primeiro
componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (ii) um segundo componente compreendendo um sacarideo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarideo capsular de N. meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o
conjugado de N. meningitidis sorogrupo A é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarideo capsular do sorogrupo A para resultar em um éster cianato e (b) reação do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarideo ativado e (c)
união do sacarideo ativado a uma proteína carreadora.
- um processo para preparação de um kit da invenção compreendendo as etapas de: (i) preparação de um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg; (ii) um segundo componente compreendendo um sacarideo capsular tipo b de H. influenzae conjugado a uma proteína carreadorae um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora caracterizado tal que o conjugado de N. meningitidis sorogrupo C é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo C para resultar em um éster cianato e (b) reação do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união do sacarídeo ativado a uma proteína carreadora. um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que, pelo menos, 50% dos resíduos de ácido siálico no conjugado do sorogrupo C de N. meningitidis são O-acetilados na posição C-7 ou C-8. um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que os resíduos de ácido siálico no conjugado do sorogrupo C de N. meningitidis não são O-acetilados. - um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo Cconjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C é da linhagem OAc+.
um kit compreendendo (a) um primeiro componente 5 compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C é da linhagem OAc-.
um kit compreendendo (a) um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo um sacarídeo capsular tipo b deHaemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que, pelo menos 50% dos resíduos de manosamina no sacarídeo capsular do sorogrupo A são O-acetilados na posição C-3.
- um processo para preparação de um kit da invenção,
compreendendo as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, para resultar em um primeiro componente do kit e (b) combinação de um sacarídeo capsular de H. influenzae tipo b conjugado 25 a uma proteína carreadora, um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e um sacarídeo capsular de N. meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, para resultar em um segundo componente do kit.
O primeiro componente do kit é preferencialmenteproduzido pela mistura do componente DTPw com o componente HBsAg. O segundo componente de um kit é preferencialmente um componente conjugado trivalente compreendendo: (1) um sacarídeo capsular de Haemophilus influenzae conjugado a 5 uma proteína carreadora; (2) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis do sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (3) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis do sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora.
(8) Processos para preparação de vacinas da invenção
Vacinas heptavalentes preferidas da invenção compreendem os sete componentes antigênicos D, T, Pw, HBsAg, Hib-X, MenA-X e MenC-X. apesar destes poderem, em princípio, ser misturados em qualquer ordem, é particularmente preferível, como descrito acima, preparar um primeiro componente (com os antígenos D, T, Pw e HBsAg) e um segundo componente (com os conjugados Hib, MenA e MenC) e combinar estes dois componentes no momento da utilização.
Além disso, é preferido que o componente D-T-Pw-HBsAg
seja preparado pela mistura de um componente D-T-Pw com um componente HBsAg. Esta ordem de mistura (ou seja, adição de HBsAg a uma mistura DTPw existente, em vez de adição de HBsAg antes de qualquer um dos antígenos D, T ou Pw) tem se mostrado particularmente útil para produção de vacinas combinadas, particularmente onde os componentes individuais da vacina são adsorvidos a sais de alumínio. Isto é diferente da ordem de mistura divulgada na referência 15, onde uma mistura D-T-HBsAg é inicialmente produzida, com uma solução estoque de Pw então sendo adicionada. Isto édiferente da ordem de mistura da referência 16, onde uma mistura Pw-HBsAg é combinada a uma mistura D-T.
Desta maneira, a invenção fornece um processo para preparo de uma vacina combinada compreendendo (i) um 5 toxóide diftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) um antígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora ("Hib-X"), (vi) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora ("MenA-X") e (vii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora ("MenC-X"), caracterizada tal que o processo compreende as etapas de:
(a) combinação de um componente tetravalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg; (b) combinação de um conjugado Hib com pelo menos um conjugado meningocóccico para resultar em um componente conjugado misturado e (c) mistura de um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg com o componente conjugado misturado, para resultar em uma vacina combinada.
O componente trivalente D-T-Pw preferencialmente inclui um adjuvante fosfato de alumínio e/ou um adjuvante hidróxido de alumínio. Mais preferencialmente, isto inclui ambos um adjuvante fosfato de alumínio e um adjuvante hidróxido de alumínio.
O componente monovalente HBsAg é preferencialmente adsorvido a adjuvante fosfato de alumínio [17]. Os toxóides 3 0 D e T são preferencialmente adsorvidos a um adjuvantehidróxido de alumínio.
O componente conjugado misturado preferencialmente compreende conjugados de Hib & MenA, Hib & MenC ou Hib & MenA & MenC.
Diferente da situação das vacinas tal como INFANRIX
HEXA™, é preferido que nenhum dos três conjugados em um componente conjugado seja adsorvido a um sal de alumínio [2] e mais preferencialmente o componente conjugado não inclui um sal de alumínio. Componentes conjugados mais
preferidos são sem adjuvantes. Eles podem, entretanto, conter açúcar, tal como lactose e/ou sacarose.
O componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg está preferencialmente sob a forma aquosa e o componente conjugado trivalente está preferencialmente sob a forma
liofilizada, para reconstituição por um componente D-T-Pw-HBsAg aquoso na etapa (c) . Para produção do componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg, os componentes D-T-Pw e HBsAg estão preferencialmente sob a forma aquosa quando misturados.
Para preparar um componente conjugado trivalente, três
conjugados podem ser misturados em qualquer ordem, por exemplo, adidicionando todos os três juntos ou misturando dois (por exemplo, MenA+MenC, MenA+Hib, MenC+Hib) e então adicionando o terceiro.
(9) Adjuvantes de alumínio
Assim como inclusão de antígenos, vacinas da invenção tipicamente incluem, pelo menos, um adjuvante sal de alumínio. As vacinas podem incluir ambos adjuvantes hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio.
A invenção fornece um kit compreendendo: (a) umprimeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e compreendendo ambos um adjuvante hidróxido de alumínio e um fosfato de alumínio e (b) um segundo componente compreendendo (i) um sacarídeo capsular de H. 5 influenzae do tipo b conjugado a uma proteína carreadora e (ii) pelo menos, um sacarídeo capsular de N. meningitidis conjugado a uma proteína carreadora.
Dentro do primeiro componente, HBsAg está preferencialmente adsorvido a um adjuvante fosfato de
alumínio, os toxóides D e T são preferencialmente adsorvidos a um adjuvante hidróxido de alumínio. O primeiro componente é preferencialmente produzido pela mistura de um componente DTPw com um componente HBsAg. O componente DTPw preferencialmente inclui ambos hidróxido de alumínio e
fosfato de alumínio. O componente HBsAg preferencialmente contém fosfato de alumínio.
Dentro do segundo componente, preferencialmente nenhum dos conjugados está adsorvido a um sal de alumínio e, mais preferencialmente, o segundo componente não inclui um sal
de alumínio. Mais preferido, segundo componentes não
possuem adjuvantes. Eles podem, entretanto, conter açúcar, tal como lactose ou, preferencialmente, sacarose.
O primeiro componente está, preferencialmente, sob a forma aquosa e o segundo componente está, preferencialmente, sob a forma liofilizada. Desta maneira, o primeiro componente pode ser utilizado para reconstituir um segundo componente para resultar em uma vacina da invenção.
(10) Ligação carreador-sacarídeo nos conjugados
meningocóccicos utilizando um espaçadorO conjugado Hib descrito acima é ligado a uma proteína carreadora por um espaçador. Espaçadores podem também ser utilizados em conjugados meningocóccicos, mas ligação direta é preferida (veja acima). Onde espaçadores são utilizados em combinação com cianilação, o esquema geral é para preparar um éster cianato como descrito acima. O éster é então ativado por reação com um grupo funcional de um ligante bifuncional (preferencialmente um ligante homo-bifuncional), para deixar os outros grupos funcionais
remanescentes para a ligação do carreador.
Desta maneira, a invenção fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"),
(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (vi) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que o conjugado do sorogrupo A de (vi) é obtenível por um processo
compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo A para resultar em um éster cianato, (b) reação do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união de um sacarídeo ativado a uma proteína carreadora. A vacina pode
também incluir (vii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção pode também fornecer um processo para preparo de uma mistura conjugada compreendendo (i) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzaeconjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína 5 carreadora, caracterizado tal que o conjugado do sorogrupo A é produzido por um processo compreendendo as etapas de:
(a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo A para resultar em um éster cianato, (b) reação do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarídeo
ativado e (c) união de um sacarídeo ativado a uma proteína carreadora.
A invenção fornece uma vacina combinada compreendendo (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de
superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora e (vi) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizada tal que o conjugado
do sorogrupo C de (vi) é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo C para resultar em um éster cianato,
(b) reação do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união de um
sacarídeo ativado a uma proteína carreadora. A vacina pode também incluir (vii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora.
A invenção pode também fornecer um processo para 3 0 preparo de uma mistura conjugada compreendendo (i) umsacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis sorogrupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de 5 Neisseria meningitidis sorogrupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o conjugado do sorogrupo C de (iii) é produzido por um processo compreendendo as etapas de: (a) cianilação do sacarídeo capsular do sorogrupo C para resultar em um éster cianato, (b) reação
do éster cianato com um ligante bifuncional, para resultar em um sacarídeo ativado e (c) união de um sacarídeo ativado a uma proteína carreadora.
A invenção também fornece vacinas e processos nos quais ambos conjugados do sorogrupo A e sorogrupo C são
preparados desta maneira e então combinados.
Qualquer ligante bifuncional apropriado pode ser utilizado, dado que isto possui um grupo funcional para ligação covalente ao sacarídeo meningocóccico cianilado e um grupo funcional para ligação ao carreador. os dois
grupos funcionais podem ser o mesmo (ou seja, um ligante homobifuncional) ou eles podem ser diferentes (ou seja, um ligante heterobifuncional) , dependendo dos grupos os quais a ligação é desejada.
(11) Processo de adição de um preservativo
Vacinas tipicamente contêm preservativos para prevenir
crescimento microbiano danoso. Em uma vacina combinada formada pela mistura de diversos componentes então a pessoa habilitada deve escolher onde e quando incluir o preservativo. De acordo com a invenção, diferentes
componentes contêm diferentes preservativos.Desta maneira, a invenção fornece um processo para preparo de uma vacina combinada que compreende (i) um toxóide diftérico ("D"), (ii) um toxóide tetânico ("T"), (iii) um antígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um 5 antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (vi) pelo menos um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora e (vii) um preservativo de
mercúrio, caracterizado tal que o processo compreende as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg, onde o componente D-T-Pw também contém o preservativo; (b) combinação dos
conjugados de H. influenzae e N. meningitidis para resultar em um componente conjugado misturado e (c) mistura do componente D-T-Pw-HBsAg com o componente conjugado misturado, para resultar na vacina combinada.
A invenção fornece um processo para preparo de um kit
da invenção, compreendendo as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, onde o componente D-T-Pw inclui um preservativo de mercúrio, para resultar em um primeiro componente do kit e (b) combinação de um sacarídeo capsular
tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora com, pelo menos, um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, para resultar em um segundo componente do kit.
Como uma etapa alternativa, (a) nestes processos, o
primeiro componente do kit pode ser preparado pela misturade (i) um componente trivalente D-T-Pw, (ii) um HBsAg e (iii) um preservativo separado, onde o preservativo de (iii) não está presente em (ii).
O preservativo de mercúrio pode ser tiomersal (também 5 conhecido como tiomerosal ou mertiolate) ou timerfonato. O componente conjugado misturado (e o segundo componente do kit) pode ou não incluir o preservativo. Este preferencialmente não inclui o preservativo. O componente monovalente HBsAg pode ou não incluir o preservativo. Se um
preservativo de mercúrio foi utilizado então um HBsAg purificado pode ser sujeitado a diálise (por exemplo, com cisteína) antes de ser utilizado para produzir a vacina combinada [18].
O componente conjugado misturado preferencialmente
inclui um conjugado Hib, um conjugado MenA e um conjugado MenC.
A invenção também fornece um processo para preparo de uma vacina combinada que compreende (i) um toxóide diftérico ("D"), (ü) um toxóide tetânico ("T"), (iii) um
antígeno celular pertussis ("Pw"), (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B ("HBsAg"), (v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (vi) pelo menos um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora e (vii) um preservativo 2-fenoxietanol, caracterizado tal que o processo compreende as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, para resultar em um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg, onde o componente
D-T-Pw não contém 2-fenoxietanol; (b) combinação dosconjugados de H. influenzae e N. meningitidis para resultar em um componente conjugado misturado e (c) mistura do componente D-T-Pw-HBsAg com o componente conjugado misturado, para resultar na vacina combinada. A invenção fornece um processo para preparo de um kit
da invenção, compreendendo as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T-Pw com um componente monovalente HBsAg, onde o componente D-T-Pw inclui um preservativo 2-fenoxietanol, para resultar em um primeiro componente do kit e (b) combinação de um sacarideo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora com, pelo menos, um sacarideo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, para resultar em um segundo componente do kit.
Como uma etapa alternativa, (a) nestes processos, o
primeiro componente do kit pode ser preparado pela mistura de (i) um componente trivalente D-T-Pw, (ii) um HBsAg e (iii) um preservativo 2-fenoxietanol separado, onde o preservativo de (iii) não está presente em (ii).
O componente conjugado misturado (e o segundo
componente do kit) pode ou não incluir preservativo 2-fenoxietanol. Este preferencialmente não inclui o preservativo. O componente monovalente HBsAg pode ou não incluir preservativo 2-fenoxietanol.
(12) Remoção de impurezas dos conjugados
Química de conjugação não é sempre precisa ou estequiométrica e pode produzir subprodutos que não são desejáveis em um produto vacinai final. A invenção fornece métodos para avaliar e/ou remover estes subprodutos no preparo de um componente conjugado misturado. Estecomponente pode ser utilizado para produzir vacinas da invenção ou como um componente do kit da invenção.
A invenção fornece um processo para o preparo de uma mistura conjugada que compreende (i) um sacarídeo capsular 5 tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo C conjugado a uma proteína
carreadora, caracterizado tal que o processo compreende as etapas de: (a) conjugação do sacarídeo capsular Hib a um toxóide tetânico utilizando EDAC e então removendo EDU; (b) conjugação do sacarídeo capsular MenA a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP e então removendo
DMAP; (c) conjugação do sacarídeo capsular MenC a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP e então removendo DMAP e (d) mistura do conjugado Hib da etapa (a), o conjugado MenA da etapa (b) e o conjugado MenC da etapa (c) para resultar na mistura conjugada.
Após a etapa de mistura, a mistura conjugada pode ser
liofilizada, por exemplo, para resultar em um componente para utilização em kits da invenção. Antes da liofilização, o pH do componente trivalente pode ser reduzido, por exemplo, para dentro da faixa de 6,0 ± 0,5, ou
aproximadamente 6,1.
"EDAC" é l-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, uma carbodiimida solúvel em água que foi utilizada para ligar de forma cruzada substâncias biológicas que contêm ácidos carboxilados e aminas primárias (veja acima). Isto
será tipicamente utilizado como o sal hidrocloreto."EDU" é N-etil-N'-3-dimetilaminopropil)uréia, um produto de reação solúvel da união EDAC:
<formula>formula see original document page 47</formula>
EDU e EDAC em excesso podem ambos ser removidos após a reação de conjugação por lavagem com ácido ou água diluídos [19] .
Reagentes "CDAP" incluem grupo l-ciano-4-10 (dimetilamino)-piridínio e são utilizados como reagentes cianilantes. Eles são preferencialmente utilizados como o sal tetrafluoroborato:
BF4®
"DMAP" é 4-dimetilamino-piridina, um produto de reação da cianilação de CDAP:
<formula>formula see original document page 47</formula>
DMAP pode ser removido por filtração em gel,
cromatograf ia de permeação em gel, etc. uma coluna de cromatografia de permeação em gel pode ser utilizada para separar conjugados, carreadores que não reagiram, sacarídeo não tratado, CDAP não tratado, glicina e DMAP não os em uma
única corrida, para resultar em conjugado purificado.
As reações de conjugação podem envolver a utilização de ligantes, etc, como descrito acima (por exemplo, a utilização de um espaçador hidrazida adipínica para preparação de Hib-T).
A invenção também fornece um processo para o preparode uma mistura conjugada que compreende (i) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo A conjugado a uma 5 proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o processo compreende as etapas de: (a) conjugação do sacarídeo capsular Hib a uma proteínac arreadora utilizando EDAC; (b)
conjugação do sacarídeo capsular MenA a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP; (c) conjugação do sacarídeo capsular MenC a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP; (d) mistura do conjugado Hib da etapa (a), o conjugado MenA da etapa (b) e o conjugado
MenC da etapa (c) para resultar na mistura conjugada e (e) removendo EDU e/ou DMAP da mistura conjugada.
A invenção também fornece um processo para o preparo de uma mistura conjugada que compreende (i) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma
proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o processo
compreende as etapas de: (a) união de um sacarídeo capsular Hib a um toxóide tetânico utilizando EDAC e então avaliando EDU; (b) união de um sacarídeo capsular MenA a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP e então avaliando DMAP; (c) união de um sacarídeo capsular MenC a uma
proteína carreadora utilizando um reagente CDAP e entãoavaliando DMAP. O processo incluirá tipicamente a etapa adicional de (d) mistura do conjugado Hib da etapa (a) , o conjugado MenA da etapa (b) e o conjugado MenC da etapa (c) para resultar na mistura conjugada. 5 A invenção também fornece um processo para o preparo
de uma mistura conjugada que compreende (i) um sacarideo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo A conjugado a uma
proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o processo compreende as etapas de: (a) união de um sacarídeo capsular Hib a um toxóide tetânico utilizando EDAC; (b) união de um
15 sacarídeo capsular MenA a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP; (c) união de um sacarídeo capsular MenC a uma proteína carreadora utilizando um reagente CDAP; misturando o conjugado Hib da etapa (a) , o conjugado MenA da etapa (b) e o conjugado MenC da etapa (c) para resultar em uma mistura conjugada e (e) avaliando EDU
e/ou DMAP na mistura conjugada.
A invenção também fornece um processo para o preparo de uma mistura conjugada que compreende (i) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma 25 proteína carreadora, (ii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo A conjugado a uma proteína carreadora e (iii) um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis soro grupo C conjugado a uma proteína carreadora, caracterizado tal que o processo
compreende as etapas de: (a) conjugação de um sacarídeocapsular Hib a uma proteína carreadora utilizando EDAC; (b) conjugação de um sacarídeo capsular MenA a uma proteína carreadora utilizando EDAC; (c) conjugação de um sacarídeo capsular MenC a uma proteína carreadora utilizando EDAC; 5 misturando o conjugado Hib da etapa (a) , o conjugado MenA da etapa (b) e o conjugado MenC da etapa (c) para resultar em uma mistura conjugada e (e) removendo EDU e/ou DMAP da mistura conjugada.
O protocolo EDAC/EDU é particularmente apropriado onde toxóide tetânico é a proteína carreadora. O protocolo CDAP/DMAP é particularmente apropriado quando proteína D é a proteína carreadora.
(13) Combinação de traços caracterizantes Secções (1) a (12) acima incluem diversos traços 15 caracterizantes da invenção:
<table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table>n. Qualquer de a. a m. em combinação com (7) o. Qualquer de a. a n. em combinação com (8) p. Qualquer de a. ao. em combinação com (9) q. Qualquer de a. a p. em combinação com (11) 5 combinações e. e f. (e depois g., h., i. & j.) são
vantajosas porque, onde CDAP é utilizado, grupos acetil delicados nos sacarídeos meningocóccicos podem ser retidos. Combinação k. é vantajosa porque a ordem correta da mistura dos adjuvantes e antígenos pode ser crítica para adsorção
e, desta maneira, para eficácia e para a estabilidade em estocagem por longo período. Combinação 1. é vantajosa porque minimiza a necessidade de adicionar preservativo em múltiplos estágios durante a produção. (14) O toxóide diftérico
Difteria é causada por Corynebacterium diphteriae, uma
bactéria Gram positiva não esporulante aeróbica. Este organismo expressa uma endotoxina ADP-ribosilante codificada por pró-fago ("toxina diftérica"), a qual pode ser tratada (por exemplo, utilizando formalina ou
formaldeído) para resultar em um toxóide que não é maistóxico, mas continua antigênico e é capaz de estimular a produção de anticorpos específicos antitoxina após injeção. Toxóides diftéricos estão divulgados em mais detalhes no capítulo 13 da referência 1. Toxóides
diftéricos preferidos são aqueles preparados por tratametno com formaldeído. O toxóide diftérico pode ser obtido pelo crescimento de C. diphteriae em meio de crescimento (por exemplo, meio Fenton ou meio Linggoud Fenton) , o qual pode ser suplementado com extrato bovino, seguido de tratamento
por formaldeído, ultrafiltração e precipitação. O materialque sofreu adição de toxóide pode ser então tratado por um processo compreendendo filtração estéril e/ou diálise.
O toxóide diftérico é preferencialmente adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio. 5 Preferencialmente, o componente toxóide diftérico é
substancialmente livre de quaisquer preservativos de mercúrio.
Quantidades de toxóide diftérico podem ser expressas em unidades internacionais (IU). Por exemplo, o
fornecimento de NIBSC, o "Diphtheria Toxoid Adsorved Thrid International Standard 1999" [20,21], o qual contém 160 IU por ampola. Como uma alternativa ao sistema IU, a "unidade LF" ("unidades floculantes" ou "dose floculante de lima") é definida como a quantidade de toxóide a qual, quando
misturada com uma Unidade Internacional de antitoxina, produz uma mistura floculante ótima [22] . Por exemplo, o fornecimento de NIBSC, "Diphtheria Toxoid, Plain" [23], o qual contém 3 00 LF por ampola e também fornecimento "The lst International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid
For Flocculation Test" [24] , o qual contém 900 LF por ampola.
Onde materiais bovinos são utilizados na cultura de C. diphteriae, eles devem ser obtidos de fontes que são livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou outras 25 encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs).
A proporção de toxóide diftérico: toxóide tetânico em vacinas da invenção usualmente entre 2:1 e 3:1 (medida em unidades Lf) , preferencialmente entre 2,4:1 e 2,6:1 e é mais preferencialmente 2,5:1. 3 0 A quantidade de toxóide diftérico em vacinas dainvenção é tipicamente, pelo menos, 3 0 IU/dose. (15) O toxóide tetanico
Tétano é causado por Clostridium tetani, um bacilo Gram positivo, formador de esporo. Este organismo expressa 5 uma endopeptidade ("toxina tetânica"), a qual pode ser tratada para resultar em um toxóide que não é mais tóxico, mas continua antigênico e é capaz de estimular a produção de anticorpos específicos antitoxina após injeção. Toxóides tetânicos estão divulgados em mais detalhes no capítulo 17
da referência 1. Toxóides tetânicos preferidos são aqueles preparados por tratamento com formaldeído. O toxóide tetanico pode ser obtido por crescimento de C. tetani em meio de crescimento (por exemplo, meio Latham derivado de caseína bovina), seguido de tratamento por formaldeído,
ultrafiltração e precipitação. O material que sofreu adição de toxóide pode ser então tratado por um processo compreendendo filtração estéril e/ou diálise.
O toxóide tetanico é preferencialmente adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio, mas isto não ê necessário
(por exemplo, adsorção de entre 0-10% do total de toxóide tetanico pode ser utilizada).
Preferencialmente, o componente toxóide tetanico é substancialmente livre de quaisquer preservativos de mercúrio.
Quantidades de toxóide tetanico podem ser expressas em
unidades internacionais (IU) . Por exemplo, o fornecimento de NIBSC, o "Diphtheria Toxoid Adsorved Thrid International Standard 2000" [25,26], o qual contém 469 IU por ampola. Como uma alternativa ao sistema IU, a "unidade LF"
("unidades floculantes" ou "dose floculante de lima") édefinida como a quantidade de toxóide a qual, quando misturada com uma Unidade Internacional de antitoxina, produz uma mistura floculante ótima [22] . Por exemplo, o fornecimento de NIBSC, "Diphtheria Toxoid, Plain" [23] , o 5 qual contém 3 00 LF por ampola e também fornecimento "The lst International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test" [27] , o qual contém 1000 LF por ampola.
Onde materiais bovinos são utilizados na cultura de C. 10 tetani, eles devem ser obtidos de fontes que são livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou outras encefalopatias espongiformes transmissíveis (TSEs).
A proporção de toxóide tetânico:toxóide diftérico em vacinas da invenção usualmente entre 1:1 e 1:3 (medida em 15 unidades Lf) , preferencialmente entre 1:2,4 e 1:2,6 e é mais preferencialmente 1:2,5.
A quantidade de toxóide tetânico em vacinas da invenção é tipicamente, pelo menos, 60 IU/dose.
(16) O antígeno celular pertussis
Antígenos pertussis em vacinas são tanto celulares
(célula inteira) ou acelulares. A invenção utiliza antígenos celulares pertussis, sob a forma de células B. pertussis inativadas. Preparação de antígenos celulares pertussis está bem documentada [por exemplo, veja capítulo 25 21 da referância 1] por exemplo, estes podem ser obtidos pela inativação por calor de uma cultura fase I de B. pertussis.
O antígeno celular pertussis pode ser adsorvido em ou misturado com um adjuvante fosfato de alumínio.
Quantidades de antígenos wP podem ser expressos emunidades internacionais (IU) . Por exemplo, o fornecimento de NIBSC, o "Thrid International Standard For Pertussis Vacines" [28] , o qual contém 46 IU por ampola. Cada ampola comtém o resíduo seco por congelamento de 2,0 mL de uma 5 solução aquosa a qual contém 10 L de suspensão bacteriana (equivalente a 18 0 unidades de opacidade nos termos da U.S. Opacity Standard) diluída com oito litros de tampão M/15 Sorensen's pH 7,0. Como uma alternativa ao sistema IU, a unidade "OU" ("unidades de opacidade") é também utilizada
(por exemplo, 4 OU deve ser aproximadamente 1 IU).
A quantidade de antígeno wP da invenção é tipicamente, pelo menos, 4 IU/dose.
(17) Antígeno de superfície da Hepatite B
O vírus da Hepatite B (HBV) é um dos agentes
conhecidos que causam hepatites virais. O vírion HBV consiste em um núcleo interno circundado por uma cobertura protéica externa ou capsídeo. O núcleo viral contém o genoma de DNA viral. O principal componente do capsídeo é uma proteína conhecida como antígeno de superfície de HBV
ou, mais comumente, "HBsAg", uma 226-aminoácidos com um peso molecular de ~24kDa. Todas as vacinas existentes para hepatite B contêm HBsAg e quando este antígeno é administrado para uma vacina este estimula a produção de anticorpos anti-HBsAg os quais protegem contra infecção por
HBV.
Para fabricação de vacina, HBsAg pode ser produzido de duas maneiras. O primeiro método envolve purificação do antígeno na forma particular do plasma de carreadores de hepatite B crônicos, como grandes quantidades de HBsAg são 3 0 sintetizadas no fígado e liberadas na corrente sangüíneadurante uma infecção por HBV. A segunda maneira envolve expressão da proteína por métodos de DNA recombinante. HBsAg para utilização como método da invenção pode ser preparado por estas duas formas, mas é preferível utilizar 5 HBsAg que foi recombinantemente expresso. Em particular, é preferível que o HBsAg seja preparado pela expressão em uma levedura, tal como uma Saccharomyces (tal como S. cerevisiae) ou uma Hanensula (tal como H. polymorpha).
HBsAg expresso por levedura geralmente será não não glicosilado.
O HBsAg geralmente será na forma de partículas substancialmente esféricas (diâmetro médio de
aproximadamente 20 nm) , incluindo uma matriz lipídica compreendendo fosfolipídios. Partículas de HBsAg expressas por leveduras podem incluir fosfatidilinositol, o qual não é encontrado em vírios naturais de HBV. As partículas podem também incluir uma quantidade não-tóxica de LBS com o objetivo de estimular o sistema imune [29].
O HBsAg é preferencialmente do HBV do subtipo adw2. Apesar do HBsAg poder estar adsorvido a um adjuvante
hidróxido de alumínio na vacina final (assim como no produto bem conhecido ENGERIX-B™) ou pode permanecer não adsorvido, este será gerlamente adsorvido a um adjuvante fosfato de alumínio antes de ser utilizado no processo da
invenção [17] .
Quantidades de HBsAg são tipicamente expressas em microgramas.
Uma quantidade típica de HBsAg por dose de vacina é
lOug.
(18) O conjugado HibO antígeno de H. influenzae tipo b utilizado nas vacinas da invenção compreendem um antígeno sacarídico capsular Hib. Antígenos sacarídicos de H. influenzae b são bem conhecidos [por exemplo, capítulo 14 da ref. 1] . 0 5 sacarídeo Hib está conjugado a uma proteína carreadora com o objetivo de acentuar sua imunogenicidade, especialmente em crianças. A preparação do sacarídeo capsular Hib está bem documentada [por exemplo, referências 3 0 a 3 9] .
Como mostrado na Tabela 14-7 da referência 1, várias
ligações de proteínas carreadoras foram utilizadas em conjugados Hib. O produto PRP-D utiliza uma proteína carreadorad e toxóide diftérico e este carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. O produto HbOC utiliza uma proteína carreadora CRM197 e este
carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. 0 produto PRP-OMP utiliza um complexo proteico da membrana externa do sorogrupo B meningocóccico como o carreador e este carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. O produto PRP-T utiliza uma proteína
carreadora toxóide tetânico e este carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. Proteína D de H. influenzae (veja abaixo) pode também ser utilizada como o carreador para o conjugado Hib.
Conjugados Hib preferidos utilizados de acordo com a
presente invenção utiliza toxóide tetânico como a proteína carreadora, para resultar no produto comumente referido como "PRP-T". este é o conjugado presente no produto HIBERIX™.
A proteína carreadora no conjugado Hib é 30 preferencialmente diferente da(s) proteína(s) carreadora(s)no(s) conjugado(s) meningocóccico(s), mas o mesmo carreador pode ser utilizado em algumas incorporações.
A porção monossacarídica do conjugado pode compreender poliribosilribitol fosfato (PRP) de comprimento completo como preparado a partir da bactéria Hib e/ou pode compreender fragmentos de PRP de comprimento completo.
Conjugados com uma proporção sacarídeo:proteína (w/w) de entre 1:5 (ou seja, proteína em excesso) e 5:1 (ou seja, sacarídeo em excesso) podem ser utilizadas, por exemplo, proporções entre 1:2 e 5:1 e proporções entre 1:1,25 e 1:2,5. Em vacinas preferidas, entretanto, a proporção de peso de sacarídeo para proteína carreadora está entre 1:2,5 e 1:3,5.
Em vacinas onde toxóide tetânico está presente tanto como antígeno como uma proteína carreadora então a proporção de peso de sacarídeo para proteína carreadora no conjugado pode estar entre 1:0,3 e 1:2 [5] .
Ignorando toxóide tetânico incluído como um antígeno, carreador não conjugado é preferencialmente não mais do que 20 5% da quantidade total da proteína carreadora na composição como um todo e, mais preferencialmente, presente em menos de 2% em peso.
Administração de um antígeno Hib preferencialmente resulta em uma concentração de anticorpo anti-PRP de > 0, ug/mL e, mais preferencialmente, a 1 ug/mL. Estes são os limiares padrão de resposta aceitáveis.
Quantidades de conjugados Hib são geralmente dadas em termos de massa de sacarídeo (ou seja, a dose do conjugado (carreador + sacarídeo) como um todo é mais alta do que a 3 0 dose estabelecida) com o objetivo de prevenir variaçãodevido à escolha do carreador. Uma quantidade típica do sacarídeo Hib por dose de vacina é 10 ug.
Conjugados Hib podem ser liofilizados antes de sua utilização de acordo com a invenção. Componentes adicionais podem também ser adicionadosantes da secagem por congelamento, por exemplo, como estabilizantes. Estabilizantes preferidos para inclusão são lactose, sacarose e manitol, assim como misturas destes, por exemplo, misturas lactose/sacarose, misturas
sacarose/manitol, etc. A vacina final pode, desta maneira, conter lactose e/ou sacarose. Utilizando uma mistura sacarose/manitol pode acelerar o processo de secagem. (19) Os conjugados menizigocõccicos
Os antígenos meningocóccicos utilizados nas vacinas da
invenção compreendem antígenos sacarídeos capsulares conjugados a proteínas carreadoras. Antígenos sacarídeos de N. meningitidis são bem conhecidos: uma vacina bivalente MENCEVAX AC™ e uma vacina tetravalente MENCEVAX ACWY™ são conhecidas por muitos anos [4 0, 41] . Além disso, vacinas
conjugadas contre sorogrupo C foram aprovadas para utilização humana e incluem MENJUGATE™ [42] , MENGITEC™ e NEISVAC-C™. Misturas de conjugados dos sorogrupos A+C são conhecidas [43, 44] e misturas de conjugados de sorogrupos A+C+W135+Y foram reportados [45-48].
0(s) sacarídeo(s) meningocóccico(s) utilizado(s) nos
produtos e processos da invenção podem ser formados por um ou mais dos sorogrupos A, C, W135 e Y, por exemplo, A+C, A+W135, A+Y, C+W135, C+Y, W135+Y, A+C+W135, A+C+Y, C+W135+Y, A+C+W135+Y. É preferível utilizar, pelo menos, o
sacarídeo do sorogrupo C e, preferencialmente, utilizar ossacarídeos de ambos os grupos A e C.
A invenção pode utilizar quaisquer conjugados meningocóccicos apropriados, com qualquer ligação química apropriada e quaisquer espaçadores apropriados (exceto onde 5 detalhes específicos são dados).
Os produtos MENJUGATE™ E MENINGITEC™ utilizam uma proteína carreadora CRM197 e este carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. O produto NEISVAC-C™ utiliza uma proteína carreadora toxóide tetânica e este
carreador pode também ser utilizado de acordo com a invenção. Uma proteína carreadora particularmente preferida para os conjugados meningocóccicos é proteína D de Haemophilus influenzae, a qual não está presente em quaisquer vacinas combinadas aprovadas. Esta proteína está descrita em detalhe nas referências 49 & 50 e sua utilização como uma proteína carreadora em conjugados está descrita na referência 51. O termo "proteína D" inclui fragmentos da proteína nativa completa, como divulgado na referência 51 e também proteínas de fusão compreendem tanto
proteína D completa ou seus fragmentos (por exemplo, uma fusão de um fragmento da proteína NS1 do vírus influenza e um fragmento da proteína D) . Os fragmentos reterão a habilidade de converter antígenos sacarídeos T independentes em um antígeno T dependente quando conjugados
neste. Fragmentos típicos incluirão, pelo menos, o 1/3 N-tertninal da proteína D. A proteína pode convenientemente ser expressa em E. coli [50] e este material recombinante é preferido para utilização com a invenção [51].
Onde um carreador de proteína D é utilizado, os
conjugados são referidos como "MenA-D" e "MenC-D".É preferível que conjugados meningocóccicos separados devem utilizar proteínas carreadoras separadas (conforme referência 52) , mas é preferível que estes carreadores separados sejam os mesmos de cada um, por exemplo, todos 5 conjugados meningocóccicos na composição devem utilizar um carreador toxóide tetânico ou os conjugados meningocóccicos na composição devem utilizar uma proteína D carreadora, etc.
A(s) proteína(s) carreadora(s) no(s) conjugado(s) 10 meningocóccico(s) é/são preferencialmente diferentes da proteína carreadora no conjugado Hib, mas o mesmo carreador pode ser utilizado em algumas incorporações.
A porção sacarídica do conjugado pode compreender sacarídeos completos como preparados a partir de 15 meningococcos e/ou isto pode compreender fragmentos de sacarídeos completos.
Conjugados meningocóccicos com uma proporção sacarídeo:proteína carreadora (w/w) de entre 1:10 (ou seja, excesso de proteína) e 10:1 (ou seja, excesso de sacarídeo) 20 podem ser utilizadas, por exemplo, proporções entre 1:5 e 5:1, entre 1:1,25 e 2,5:1 ou entre 1:1,25 e 1,25:1.
Administração de conjugados meningocóccicos preferencialmente resulta em um aumento no título no ensaio de soro bactericida (SBA) para o sorogrupo relevante de, 25 pelo menos, 4 vezes e preferencialmente, pelo menos, 8-vezes. Títulos SBA podem ser mensurados utilizando complemento de coelho neonato ou complemento humano [53].
Concentrações de conjugados meningocóccicos são geralmente dados em termos de massa de sacarídeo (ou seja, 3 0 a dose do conjugado (carreador + sacarídeo) como um todo émais alta do que a dose estabelecida) com o objetivo de impedir variação devido à escolha do carreador. A quantidade típica de cada sacarídeo meningocóccico por dose de vacina é de aproximadamente 5 ug a aproximadamente 10 5 ug.
Conjugados meningocóccicos podem ser liofilizados antes de sua utilização de acordo com a invenção. Componentes adicionais podem também ser adicionados antes da secagem por congelamento, por exemplo, como 10 estabilizadores. Estabilizadores preferidos para inclusão são lactose e/ou sacarose. A vacina final pode, desta maneira, conter lactose e/ou sacarose. (20) Misturas conjugadas
A invenção fornece misturas conjugadas e processos 15 para a preparação destas. Estas tipicamente compreendem uma mistura de (i) conjugado Hib, (ii) um conjugado MenA e (iii) um conjugado MenC. As misturas conjugadas podem ser utilizadas como vacinas por elas mesmas e também como componentes para mistura com outros antígenos para produzir 20 vacinas combinadas.
A mistura conjugada pode conter mais de três conjugados, mas esta é preferencialmente uma mistura conjugada trivalente. Misturas conjugadas pentavalentes adicionalmente compreendendo sacarídeos capsulares 25 conjugados dos sorogrupos W135 e Y meningocóccicos podem também ser preparadas.
A mistura conjugada está preferencialmente sob a forma liofilizada.
A mistura conjugada preferencialmente compreende 30 nenhum dos seguintes antígenos: toxóide diftérico;antígenso B. pertussis; antígenos de poliovírus; HBsAg.
Preferencialmente, nenhum dos conjugados está adsorvido a um sal de alumínio [2] e, mais preferencialmente, não inclui um sal de alumínio. 5 Componentes conjugados misturados mais preferidos não estão com adjuvantes. Eles podem, entretanto, conter açúcares, tal como lactose ou, preferencialmente, sacarose. (21) Adjuvantes
Em adição a componentes antigênicos, vacinas da
invenção tipicamente incluirão, pelo menos, um adjuvante sal de alumínio. Como mencionado acima, as vacinas podem incluir tanto adjuvante hidróxido de alumínio como alumínio fosfato. Onde ambos estão incluídos, a proporção de peso dos dois adjuvantes é aproximadamente 1:1, por exemplo, uma
proporção hidróxido de alumínio:fosfato de alumínio de aproximadamente 1,58:1,6.
Apesar de adjuvantes de alumínio ser tipicamente referidos tanto como adjuvantes "hidróxido de alumínio" ou como "fosfato de alumínio", estes são nomes de
conveniência, como nenhum é uma descrição precisa do atual composto químico o qual está presente [por exemplo, veja capítulo 9 da referência 54] . A invenção pode utilizar qualquer dos adjuvantes "hidróxido" ou "fosfato" que são em geral utilizados como adjuvantes.
Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio"
são tipicamente sais oxihidróxido de alumínio, os quais são usualmente, pelo menos, parcialmente cristalinos. Oxihidróxido de alumínio, o qual pode ser representado pela fórmula AlO(OH)3, por espectroscopia infravermelha (IR), em
particular pela presença de uma banda de adsorção de 1070cm"1 e um forte rebaixamento de 3090-3100 cm-1 [capítulo 9 da referência 54].
Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio" são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, sempre também 5 contendo uma pequena quantidade de sulfato (ou seja, sulfato hidroxifosfato de alumínio). Eles podem ser obtidos por precipitação e as condições e concentrações de reação durante a precipitação influenciam no grau de substituição do fosfato por hidroxila no sal. Hidroxifosfatos geralmente
possuem uma proporção molecular de P04/A1 entre 0,3 e 1,2. Hidroxifosfatos podem ser distinguidos de A1P04 estrito pela presença de grupos hidroxila. Por exemplo, uma banda de espectro IR a 3164 cm"1 (por exemplo, quando aquecido a 200°C) indica a presença de hidroxilas estruturais
[capítulo 9 da referência 54].
Os adjuvantes podem tomar qualquer forma apropriada (por exemplo, cristalina, amorfa, etc) .
A proporção molecular de P04/A13+ de um adjuvante fosfato de alumínio estará geralmente entre 0,3 e 1,2,
preferencialmente entre 0,8 e 1,2 e, mais preferencialmente 0,95 ± 0,1. Um adjuvante típico é hidroxifosfato de alumínio amorfo com proporção molecular de P04/A1 entre 0,84 e 0,92, incluído a 0,6 mg Al+3/mL. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo, particularmente para sais
hidroxifosfatos. O fosfato de alumínio será geralmente particulado. Diâmetros típicos das partículas estão na faixa de 0,5-20 um (por exemplo, 5-10 um) após qualquer adsorção de antígeno.
O PZC de fosfato de alumínio está inversamente
relacionado ao grau de substituição do fosfato porhidroxila e este grau de substituição pode variar dependendo das condições de reação e concentração dos reagentes utilizados para preparo do sal por precipitação. PZC é também alterado por mudança da concentração de íons fosfato livres na solução (mais fosfato = mais PZC acídico) ou pela adição de um tampão tal como um tampão histidina (torna PZC mais básico). Fosfatos de alumínio utilizados de acordo com a invenção geralmente possuirão um PZC de entre 5,0 e 7,0, mais preferencialmente entre 5,5 e 6,0, por exemplo, aproximadamente 5,7.
O fosfato de alumínio é preferencialmente utilizado sob a forma de uma solução aquosa a qual antígenos são adicionados (NB: é comum referir-se a um fosfato de alumínio aquoso como uma "solução" apesar de, em uma visãofísico-química estrita, o sal é insolúvel e forma uma suspensão). É preferível diluir o fosfato de alumínio à concentração requerida e para garantir uma solução homogênea antes da adição dos componentes antigenicos.
A concentração de Al+3 antes da adição de antígenos é geralmente entre 0 e 10 mg/mL. Uma concentração preferida está entre 2 e 6 mg/mL.
Uma solução de fosfato de alumínio utilizada para preparar uma vacina da invenção pode conter um tampão (por exemplo, um tampão fosfato ou histidina), mas isto não é necessário. A solução de fosfato de alumínio está preferencialmente estéril e livre de pirõgenos. A solução de fosfato de alumínio pode incluir íons fosfato livres, por exemplo, presente a uma concentração entre 1,0 e 20 mM, preferencialmente entre 5 e 15 mM e, mais preferencialmente aproximadamente 10 mM. A solução de fosfato de alumíniopode também compreender cloreto de sódio. A concentração de cloreto de sódio está preferencialmente na faixa de 0,1 a 100 mg/mL (por exemplo, 0,5-50 mg/mL, 1-20 mg/mL, 2-10 mg/mL) e está mais preferencialmente aproximadamente 3 ± 1 mg/mL. A presença de NaCl facilita a correta medição do pH antes da adsorção de antígenos.
Onde um antigeno está descrito como sendo "adsorvido" a um adjuvante, é preferível que, pelo menos, 50% (em peso) daquele antigeno esteja adsorvido, por exemplo, 50%, 60%,
70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais. Em algumas incorporações, o toxóide diftérico e toxóide tetânico estão ambos totalmente adsorvidos, ou seja, nenhum é detectado no sobrenadante. Adsorção total de HBsAg é também preferida. (22) Componentes adicionais da vacina
Assim como contém antigeno e adjuvante(s), etc, as
vacinas combinadas da invenção podem incluir componentes adicionais. Estes componentes podem possuir diversas fontes. Por exemplo, eles podem estar presentes em um dos componentes antigenicos que são misturados durante o
processo da invenção ou podem ser adicionados durante o processo separadamente dos componentes antigenicos.
Para controlar tonicidade do produto final da vacina, é preferível incluir um sal fisiológico, tal como um sal de sódio. Cloreto de sódio (NaCl) é preferido, o qual pode
estar presente no produto final da vacina entre 1 a 20 mg/mL.
Devido à natureza de adsorção dos antígenos, o produto final da vacina pode ser uma suspensão com uma aparência turva. Esta aparência significa que contaminação microbiana não está prontamente visível e que a vacinapreferencialmente contém um agente antimicrobiano. Isto é particularmente importante quando a vacina está embalada em frascos multidose. Antimicrobianos preferidos para inclusão são 2-fenoxietanol e tiomersal. Isto é preferido, entretanto, não utilizar preservativos de mercúrio (por exemplo, tiomersal) durante o processo da invenção. Entretanto, a presença de quantidades traço pode não ser permitida se um antígeno utilizado durante o processo (por exemplo, HBsAg) tiver sido tratado com tal preservativo.
Para segurança, entretanto, é preferido que o produto final da vacina contenha menos que aproximadamente 25 ng/mL de mercúrio. Mais preferencialmente, o produto final da vacina contenha tiomersal não detectável. Isto geralmente será realizado pela remoção do material preservativo de uma
preparação antigênica antes da sua adição no processo da invenção ou evitando a utilização de tiomersal durante a preparação de componentes antigênicos individuais.
Assim como substâncias como tiomersal, outros componentes residuais de antígenos individuais podem também
estar presentes em quantidades traço na vacina final produzida pelo processo da invenção. Por exemplo, se formaldeído é utilizado para preparar os toxóides de difteria, tétano e pertussis então o produto final da vacina pode reter quantidades traço de formaldeído (por
exemplo, menos que 10 ug/mL, preferencialmente < 5 ug/mL). Aminoácidos livres (por exemplo, alanina, arginina, aspartato, cisteína e/ou cistina, glutamato, glutamina, histidina, prolina e/ou hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e/ou valina), vitaminas (por exemplo,colina, ascorbato, etc), fosfato disódio, fosfato monopotássio, cálcio, glicose, adenina sulfato, vrmelho de fenol, acetato de sódio, cloreto de potássio, etc podem ser retidos na vacina final a <100 ug/mL de cada (por exemplo, s50 pg/mL, <10 ug/mL). Um componente adicionalmente possível da vacina final originada nas preparações de antígeno surge da ourificação menos do que total de antígenos. Pequenas quantidades de proteínas de B. pertussis, C. diphtheriae, C. tetani e S. cerevisiae e/ou
DNA genômico pode, por conseguinte, estar presente. Para minimizar as quantidades destes componentes residuais, preparações de antígenos são preferencialmente tratadas para removê-los antes dos antígenos seres utilizados no processo da invenção.
Onde sais de alumínio estão presentes na vacina final,
a quantidade total de alumínio, expressa em termos de Al+3, é preferencialmente < 2 mg/mL (por exemplo, entre 1,2-1,5 mg/mL, ou aproximadamente 1,4 mg/mL ou entre 0,4 e 0,8 mg/mL, ou aproximadamente 0,6 mg/mL).
Durante o processo da invenção, diluição de
componentes para resultar na concentração final desejada será usualmente realizada com WFI (água para injeção).
Para prevenir interferência entre antígenos, particularmente antígenos conjugados, é possível incluir um
polímero polianiônico, tal como ácido poli-L-glutâmico [55] .
(23) Embalagem da vacina combinada
Em utilização típica, o processo da invenção será utilizado para fornecer massa da vacina combinada a qual é apropriada para embalagem e então para distribuição eadministração. Concentrações mencionadas acima são tipicamente concentrações na embalagem final da vacina, e então concentrações na massa da vacina podem ser mais altas (por exemplo, para serem reduzidas as concentrações finais por diluição).
O processo da invenção pode, por conseguinte, compreender a etapa adicional de embalagem da vacina em frascos para utilização. Reservatórios apropriados incluem frascos e seringas para disposição (preferencialmente as estéreis).
Onde a vacina é embalada em frascos, estes são preferencialmente feitos de vidro ou de um material plástico. O frasco é preferencialmente esterilizado antes de a vacina ser adicionada neste. Para evitar problemas com pacientes sensíveis a látex, frascos podem ser lacrados com uma tampa livre de látex. O frasco pode incluir uma única dose da vacina ou pode incluir mais do que uma dose (um frasco "multidose"), por exemplo, 10 doses. Quando utilizando um frasco multidose, cada dose deve ser colocada com uma agulha estéril e uma seringa sob condições
assépticas estritas, tomando cuidado para evitar contaminação do conteúdo do frasco. Frascos preferidos são feitos de vidro incolor.
Onde a vacina é embalada em uma seringa, a seringa não 25 vai normalmente possuir uma agulha acoplada a esta, apesar de uma agulha separada poder ser fornecida com a seringa para montagem e utilização. Agulhas seguras são preferidas. Agulhas de 1-polegada calibre 23, 1-polegada calibre 25 e 5/8-polegadas calibre 25 são típicas. Seringas podem ser fornecidas com etiquetas removíveis nas quais o número dolote e data de validade dos conteúdos podem ser impressos, para facilitar manutenção da gravação. O embolo da seringa possui preferencialmente uma tampa para prevenir o embolo de ser acidentalmente removido durante aspiração. As seringas podem ter uma capa de borracha látex e/ou embolo. Seringas para disposição contêm uma única dose de vacina. A seringa geralmente possuirá uma capa para selar a ponta antes do acoplamento de uma agulha e a capa da ponta é preferencialmente feita de borracha metil. Se a seringa e agulha forem embaladas separadamente então a agulha é preferencialmente adaptada a uma blindagem de borracha butil. Borracha butil cinza é preferida. Seringas preferidas são aquelas comercializadas sob a marca chamada "Tip-Lock"™.
Onde um reservatório de vidro (por exemplo, umaseringa ou um frasco) é utilizado, então é preferível utilizar um reservatório feito de vidro borosilicato em vez de um vidro de soda de lima.
Quando contidos separadamente, antígnos conjugados tipicamente serão secos por congelamento (liofilizados) em um reservatório separado, tal que a vacina embalada conterá, pelo menos, dois frascos separados. Antes da administração a um paciente, o material seco por congelamento será reconstituído e diluído com a formalíquida de outro reservatório. Tipicamente, por conseguinte, o reservatório conjugado será um frasco e o outro reservatório conterá um líquido dentro de um frasco ou uma seringa pré-preenchida. Os conteúdos líquidos do segundo reservatório serão transferidos para um reservatório contendo antígeno conjugado em pó seco porcongelamento, assim reconstituindo os antigenos conjugados para administração a um paciente.
O reservatório para conjugados liofilizados é preferencialmente um frasco o qual possui uma tampa (por 5 exemplo, uma trava Luer) adaptada tal que uma serinda preenchida pode ser inserida na tampa, os conteúdos da seringa podem ser expelidos no reservatório para reconstituir o material seco por congelamento neste e os conteúdos do frasco podem ser removidos de volta para a
seringa. Após remoção da seringa do frasco, uma agulha pode ser então acoplada e a vacina pode ser administrada a um paciente. A tampa é preferencialmente colocada dentro de um lacre ou capa tal que o lacre ou capa precise ser removido antes que a tampa seja removida.
A vacina combinada da invenção é preferencialmente
administrada a pacientes em doses de 0,5 mL. O processo da invenção pode, por conseguinte, compreender uma etapa de extração e embalagem de uma amostra de 0,5 mL da maior parte da vacina em um reservatório. Para situações
multidose, quantidades de doses múltiplas serão extraídas e embaladas juntas em um único reservatório. Onde uma vacina é apresentada como um kit com um componente liofilizado então a dose final após reconstituição é preferencialmente 0,5 mL. Referências as doses de 0,5 mL aqui devem ser
levadas a significar 0,5 mL ± 0,5 mL.
O reservatório no qual a vacina é embalada será usualmente ntão fechado dentro de uma caixa para distribuição, por exemplo, dentro de uma caixa de papelão e a caixa será etiquetada com detalhes da vacina, por
exemplo, seu nome comercial, uma lista dos antigenos navacina (por exemplo, "Difteria, tétano, célula total pertussis inativada e hepatite B recombinante, vacina adsorvida", etc), o reservatório de apresentação (por exemplo, "Seringas Tip-Lock Preenchidas Descartáveis" ou 5 "Frascos Dose única 10 x 0,5 mL) sua dose (por exemplo, "cada uma contendo uma dose de 0,5 mL) , avisos (por exemplo, "Apenas Para Utilização Pediátrica"), uma data de validade, etc. Cada caixa deve conter mais do que um pacote de vacina, por exemplo, cinco ou dez pacotes de vacina (particularmente para frascos). Se a vacina está contida em uma seringa, então a embalagem pode mostrar uma figura da seringa.
A vacina pode ser empacotada junta (por exemplo, na mesma caixa) com um folheto incluindo detalhes da vacina, 15 por exemplo, instruções de administração, detalhes dos antígenos dentro da vacina, etc. As instruções podem também conter avisos, por exemplo, para manter uma solução de adrenalina prontamente disponível no caso de reação anafilática seguindo a vacinação, etc.
2 0 Os materiais da vacina empacotada estão
preferencialmente estéreis.
Os materiais da vacina empacotada são, preferencialmente, não pirogênicos, por exemplo, contendo < 1 EU (unidade de endotoxina, uma medida padrão) por dose e, 25 preferencialmente, < 0,1 EU por dose.
Os materiais da vacina empacotada são preferencialmente livres de glúten.
O pH de quaisquer materiais da vacina empacotada está preferencialmente entre 6 e 8, por exemplo, entre 6,5 e
7,5. O processo da invenção pode, por conseguinte, incluiruma etapa de ajuste do pH da maior parte da vacina antes do empacotamento.
Qualquer material aquoso dentro da vacina empacotada é preferencialmente uma suspensão branca turva. 5 A vacina empacotada é preferencialmente estocada a 2°C
e 8°C. esta não deve ser congelada. (24) Administração da vacina
As vacinas combinadas finais da invenção são apropriadas para administração a humanos e, em particular, 10 a crianças. Um típico calendário de dosagem para a vacina ou, para obter eficácia total, envolve administração de mais de uma dose em um calendário de imunização primária. Um típico calendário primário envolverá três doses, dadas em intervalos de aproximadamente 6 a 8 semanas, com a 15 primeira dose sendo dada a uma criança com idade entre 6 e 9 semanas de idade. Um calendário primário de 3 doses nas semanas 6, 10 e 14 de idade é preferido e este pode ser seguido de uma quarta dose em meses.
A vacina pode também ser utilizada para completar o 20 calendário de imunização primária de uma vacina diferente.
A invenção fornece um método para criar uma resposta imune em um paciente, compreendendo administração de uma composição da invenção ao paciente.
A invenção também fornece uma composição da invenção, 25 para utilização na medicina.
A invenção também fornece a utilização de (i) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular tipo b de 3 0 Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadorae (vi) pelo menos um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, na produção de um medicamento para imunização de, um paciente.
A invenção também fornece a utilização de (i) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae conjugado a uma proteína carreadora, (ii) pelo menos, um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora na produção de um medicamento para imunização de um paciente, onde o medicamento é liofilizado e administrado após reconstituição por uma vacina aquosa compreendendo, pelo menos, um antígeno adicional.
Características adicionais específicas de diversos medicamentos são dadas abaixo. Medicamentos preferidos são vacinas.
Medicamentos serão geralmente administrados
diretamente a um paciente. Distribuição direta pode ser acompanhada de injeção parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular ou para o espaço intersticial de um tecido) ou por
administração retal, oral, vaginal, tópica, transdermal, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra administração mucosa. Em geral, entretanto, eles são administrados por injeção intramuscular. Sítios preferidos para injeção são as coxas anterolaterais ou o músculo deltóide do antebraço.
Estas utilizações, métodos e medicamentos são
preferencialmente para imunização contra os patógenos estabelecidos acima. O paciente é preferivelmente um humano e pode ser uma criança (por exemplo, crianças que acabaram de aprender a andar ou bebê), um adolescente ou um adulto,
mas será geralmente uma criança. Pacientes preferidospossuem idade entre 0-36 meses, por exemplo, entre 0-24 meses, entre 0-12 meses ou entre 0-6 meses.
Métodos para checagem da eficácia de antígenos separados são conhecidos na arte. 5 Vacinas da invenção podem ser administradas
substancialmente ao mesmo tempo como uma vacina oral de pólio, tal como uma vacina oral de pólio trivalente, por exemplo, contendo poliovirus Tipo 1, poliovirus Tipo 2 e poliovírus Tipo 3. Uma criança recebendo a vacina da 10 invenção pela primeira vez pode ter recebido previamente vacina oral de pólio e/ou vacina de Bacilo Calmette-Guérin (BCG).
Desta maneira, grupos de pacientes preferidos para imunização incluem, mas não se limitam a: (a) crianças as
15 quais previamente receberam vacina oral de pólio; (b) crianças as quais previamente receberam vacina de BCG; (c) crianças as quais previamente receberam ambas as vacinas oral de pólio e de BCG; (d) crianças no grupo (a) , (b) ou (c) as auqis não receberam previamente qualquer de D, T,
2 0 Pw, HbsAg, conjugado Hib e, pelo menos, um conjugado meningocóccico e (e) crianças as quais previamente receberam vacina oral de pólio, BCG, D, T, Pw, HbsAg, conjugado Hib e, pelo menos, um conjugado meningocóccico. Estas crianças podem estar em qualquer dos grupos de idade
25 especificado acima, por exemplo, 0-36, 0-24, 0-12 ou 0-6 meses.
Desta maneira, a invenção fornece a utilização de (a) um toxóide diftérico, (ii) um toxóide tetânico, (iii) um antígeno celular pertussis, (iv) um antigeno de superfície 30 do vírus da hepatite B, (v) um sacarídeo capsular deHaemophilus influenzae tipo b conjugado a uma proteína carreadora, (vi) pelo menos, um sacarídeo capsular de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, na produção de um medicamento para imunização de um 5 paciente em um dos referidos grupos (a) a (e).
Se a vacina da invenção contém um adjuvante baseado no alumínio, assentamento de componentes pode ocorrer durante a estocagem. A vacina deve, por conseguinte, ser balançada antes da administração a um paciente. A vacina balançada 10 será uma suspensão túrbida branca.
Geral
O termo "compreendendo" pode significar "incluindo" assim como "consistindo", por exemplo, uma composição "compreendendo X" pode consistir exclusivamente de X ou 15 pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
A palavra "substancialmente" não inclui
"completamente", por exemplo, uma composição a qual está "substancialmente livre" de Y pode estar completamente livre de Y. Onde necessário, a palavra "substancialmente"
pode ser omitida da definição da invenção.
O termo "aproximadamente" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x + 10%.
Informação geral em técnicas de conjugação pode ser encontradas na referência 39. 25 Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra resultados de western blot para estabilidade de HBsAg em uma composição. Na Figura IA, as linhas são: (1) tampão de amostra Laemmli (LSB); (2) marcadores MW; (3-5) 1 ug de três controles separados das
preparações de HBsAg; (6-8) sobrenadante de três lotespentavalentes separados; (9-10) LSB. Na Figura 1B, as linhas são: (1) marcadores MW; (2-4) 1 ug de três controles separados das preparações de HBsAg; (5-7) sobrenadante de três lotes pentavalentes separados, estocado por 2 semanas 5 a 2-8°C; (8-10) sobrenadante de três lotes pentavalentes separados, estocado por 2 semanas a 36-38°C.
Figura 2 mostra a variação do pH no decorrer do tempo para uma composição pentavalente.
Figura 3 mostra resultados de western blot para 10 estabilidade de HBsAg em uma composição octavalente. Nas Figuras 3A e 3B: linha 1 contém marcadores MW; linha 2 contém um controle HBsAg a 1 ug/mL; linha 3 contém o sobrenadante da composição octavalente. Na Figura 3B: linha 4 contém LSB; linha 5 contém o mesmo controle da linha 2; 15 linha 6 contém um extrato DOC/TCA.
Modos para Realizar a Invenção
Vacina octavalente D-T-Pw-HBsAg-Hib-MenC-MenW135-MenY
HBsAg expresso por leveduras, toxóide diftérico, toxóide tetânico e antigenos pertussis de célula inteira 2 0 foram adicionados a uma suspensão de um adjuvante sal de alumínio. O pH da mistura foi ajustado e então o conjugado Hib-CRM197 foi adicionado, tal que este não vem adsorvido a um adjuvante alumínio. Este processo resultou em uma vacina combinada com a seguinte composição:
<table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table>
Em trabalho adicional, conjugados meningocóccicos
CRM197 separados a partir de cada dos sorogrupos C, W135 e Y foram adicionados após o componente CRM-Hib com objetivo de resultar em uma vacina octavalente.
<table>table see original document page 79</column></row><table>
eficácia da vacina é a porcentagem de hidrólise do conjugado Hib, o limite clínico sendo 25% do sacarídeo livre (referência 56 reporta que 20% não afeta imunogenicidade clínica). Este parâmetro foi medido na 10 vacina pentavalente por HPAEC-PAD, o qual permite quantificação direta de carbiodratos não conjugados a níveis picomolares com separação mínima e limpeza. Análise focou na quantidade de sacarídeo livre. Sacarídeo foi ensaiado para: 15 (a) A quantidade total em ug/mL
(b) A quantidade no sobrenadante (ou seja, não adsorvido) em ug/mL(c) A quantidade a qual esta livre (hidrólise do conjugadao Hib CRM-197) em pg/mL
Valor de (c) foi expresso tanto como em (d) uma porcentagem de (b) ou como (e) uma porcentagem do total 5 teórico da concentração de sacarídeo (20 pg/mL). Resultados foram como segue:
<table>table see original document page 80</column></row><table>Um máximo de 25% de sacarídeo livre é clinicamente aceitável. Todos os valores ficaram abaixo deste limiar e ficaram 6,5% abaixo por mais de 4 semanas a 2-8 °C. sob
condições de estresse térmico (4 semanas a 36-38°C) um nível mais alto foi visto, mas continuava abaixo do valor 25%, com o máximo sendo 11,6% para o lote 1. Estudo prévio em vacinas Hib multivalentes mostrou que um mês deestocagem a 36-38°C resultam em mais hidrólise CRM-Hib do que dois anos de estocagem a 2-8°C. Hidrólise aceitável pode, desta forma, ser esperado por mais de, pelo menos, uma escala de tempo de 2 anos sob condições normais de 5 estocagem.
Análise HPAEC-PAD de sacarideo livre foi também realizada após 6 meses a 2-8°C. os dados foram os seguintes:<table>table see original document page 81</column></row><table>Desta maneira, há apenas um pequeno aumento no percentual de sacarídeo livre a 6 meses comparado a 4 semanas, com valores ainda abaixo do valor 25%. CRM-197 é, desta maneira, estável nas três formulações.
Figura 2A mostra variação do pH na vacina pentavalente por 6 meses para três lotes estocados a 2-8°C. Figura 2B 15 mostra variação do pH por 4 semanas de três lotes estocados a 36-38°C. a 2-8°C pH foi estável por 6 meses, enquanto sob condições normais de estresse houve uma leve diminuição de 0,1 unidade de pH após 2 semanas e uma diminuição adicional após 4 semanas. Ainda assim, todos os valores de pH 20 continuaram dentro da faixa aceitável de 6,0 - 7,0.
Osmolaridade dos três lotes pentavalentes ficou entre 321 e 315 mOsm/Kg, centralmente dentro da faixa aceitável de 24 0-3 60 mOsm/Kg para vacinas injetáveis.
Avaliação da potência e imunogenicidade de antígenos é importante para o objetivo de testar a eficácia de uma vacina combinada. A potência dos antígenos Diftérico,Tetânico e Pertussis na vacina pentavalente foi avaliada e a imunogenicidade de ambos CRM-Hib e HBsAg foi testada. Análise por ELISA foi realizada para avaliar o nível de anticorpos específicos após imunização. Imunogenicidade de 5 HBsAg foi realizada utilizando um modelo animal e um calendário de imunização diferente no que diz respeito ao utilizado para a potência do HBV.
Valores de potência DTP foram os seguintes:
<table>table see original document page 82</column></row><table>
Para cada um destes três antígenos os resultados do 10 teste da potência são todos significativamente abaixo dos limites aceitáveis e estes resultados indicam boa eficácia para estes três antígenos.
Para avaliação da imunogenicidade HBsAg, grupos de camundongos CD1 receberam a vacina pentavalente por injeção subcutânea (0,5 mL, diluída 1:4 em salina) nos dias 0 e 14. Os camundongos foram sangrados no dia 21 e anticorpos HBsAg-específicos foram avaliados por ELISA utilizando tanto (a) o teste "Enzugnost Anti-HBs II" (Dade Behring) ou (b) o teste "Ausab EIA" (Abbott). Estes testes ELISA possuem formatos diferentes e sensibilidades diferentes para HBsAg. Valores de Média Geométrica de Título não são, desta maneira, comparáveis entre os dois testes. Entretanto, dentro do escopo de cada teste os valores GMT para o soro foram ótimos. Resultados como segue:<table>table see original document page 82</column></row><table><table>table see original document page 83</column></row><table> 0
Adsorção de HBsAg a uma djuvante hidróxido de alumínio é um fator importante para imunogenicidade da vacina e este parâmetro foi mensurado por imunoblot. O procedimento de
imunoblot seguido foi essencialmente como segue: um volume de 1 mL do sobrenadante da vacina foi precipitado com DOC/TCA e desnaturado com LSB e então carregado em um SDS-PAGE acrilamida 12%; 1 ug de cada lote de HBsAg foi carregado como controle; uma preparação de anticorpo de
cabra anti-HBsAg foi utilizada como anticorpo primário(diluído 1:1000) e um conjugado POD anti-cabra (diluído 1:2500) foi utilizado como anticorpo secundário.
Resultados para a vacina pentavalente estão mostrados na Figura 1. Linhas 6-8 da Figura IA mostram que não há 5 HBsAg solúvel detectado na composição no tempo zero e linhas 5-10 das Figuras 1B & 1C confirmam que isto continua verdadeiro após 2 semanas e 4 semanas de estocagem a 2-8°C ou 36-38°C. Em três diferentes lotes, -99% do HBsAg continua adsorvido ao adjuvante sob estas diversas 10 condições.
Um ensaio adicional de estabilidade foi realizado após
i 6 meses de estocagem a 2-8°C (Figura 1D). Adsorção
I
j permaneceu a -99% para cada um dos três lotes.
Os controles positivos utilizados na Figura 1 15 continham 1 pg de HBsAg. Uma única banda correspondente ao peptídeo S (24kDa) foi vista, mais uma banda característica de agregados (~45kDa). Pré-S2 não foi vista.
A vacina octavalente foi também testada para adsorção de HBsAg de uma maneira similar. Uma amostra de 1 mL foi 20 centrifugada a 3500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi removido para um novo tubo e precipitado com DOC/TFA. O pellet foi ressuspenso em 200 uL de tampão de extração, aquecido por 5 minutos e centrifugado a 1300 rpm por 10 minutos. 20 uL deste extrato e o sobrenadante precipitado 25 com DOC/TCA foram carregados em SDS-PAGE 12% para Western Blot.
Figura 3A mostra a vacina octavalente no tempo zero e Figura 3B mostra a vacina após 8 meses de estocagem a 2-8°C. A ausência de qualquer mancha significante nas linhas 3 0 3 & 6 da Figura 3B (certamente manos mancha do que visto`com 1 pg do HBsAg nas linhas controle 2 & 5) mostra que adsorção de HBsAg continua estável por este período de estocagem.
Vacina heptavalente D-T-Pw-HBsAg-Híb-MenA-MenC
Cinco componentes antigênicos foram coletados como
segue:
- UM COMPONENTE TRIVALENTE D-T-Pw: um componente D-T-Pw foi preparado tal que inclui toxóide diftérico adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio, toxóide tetânico
também adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio e antígenos de célula total pertussis com fosfato de alumínio. Este componente contém tiomersal, mas não contém 2 -fenoxietanol.
- UM COMPONENTE HBsAg: HBsAg é expresso e purificado a 15 partir de uma S. cerevisiae recombinante. A proteían
purificada é adsorvida a um antígeno fosfato de alumínio [17] .
- UM COMPONENTE CONJUGADO Hib: polissacarídeo Hib é preparado a partir de Hib, linhagem 20752 e após ativação com brometo de cianogênio e derivatização com um espaçador hidrazida adípica é covalentemente acoplado a um toxóide tetânico via condensação carbodiimida, a uma proporção de peso sacarídeo:carreador de aproximadamente 1:3. Após a reação envolvendo EDAC, níveis de EDU são mensurados. - UM COMPONENTE CONJUGADO MenA: sacarídeo capsular do
meningococo sorogrupo A . é purificado e conjugado covalentemente a proteína D de H. influenzae utilizando a técnica de CDAP. Após a reação envolvendo CDAP, conteúdo DMAP residual é mensurado e retenção de grupos OAc na
posição C-3 é confirmada. Um conjugado utilizando umcarreador toxóide tetânico é também preparado, também por conj ugação CDAP.
- UM COMPONENTE CONJUGADO MenC: sacarídeo capsular de um meningococo sorogrupo C Oac+ é purificado e conjugado 5 covalentemente a proteína D de H. influenzae utilizando a técnica de CDAP. Após a reação envolvendo CDAP, conteúdo DMAP residual é mensurado. Conjugados são também preparados a partir de linhagem Oac-. Um conjugado utilizando um carreador toxóide tetânico é também preparado, também por 10 conjugação CDAP.
O componente D-T-Pw é misturado com o componente HBsAg e esta mistura tetravalente é embalada sob a forma aquosa em um frasco tampado. O nível de HBsAg é 10 ug/dose.
Os três conjugados são misturados e liofilizados como 15 descrito na referência 2. O pó liofilizado é embalado em um frasco tampado. Cada conjugado está presente a 5 ug/dose. Uma mistura com o dobro desta dose para cada conjugado é também preparada. A mistura do conjugado é livre de adjuvante.
2 0 Os dois frascos são embalados juntos em uma caixa.
Para administração ao paciente, o material D-T-Pw-HBsAg aquoso é colocado em uma seringa e é introduzido em um frasco conjugado liofilizado. Após o material liofilizado ser reativado, é colocado de volta na seringa, 25 pronto para administração aos pacientes.
Para crianças são dadas uma vacinação de 3 doses primárias em 6, 10 e 14 semanas, administradas por injeção intramuscular. Para comparação, 14 0 crianças receberam vacina TRITANTRIX-HepB/Hib da GSK. A vacina mostra
excelente imunogenicidade.Em um ensaio de seguimento, crianças receberam vacina 7-valente em 6, 10 e 14 semanas. Pacientes controle receberam tanto TRITANTRIX-HepB/Hib ou TRITANTRIX-HepB/Hib mais a vacina MENINGITEC. Níveis de anticorpo no soro foram 5 mensurados antes de e em um mês após o curso desta imunização primária. Local solicitado e eventos adversos gerais foram reportados por 8 dias e eventos adversos não solicitados por 3 0 dias seguindo cada dose da vacina. Seguindo o curso primário, 99% - 100% dos indivíduos que receberam a vacina 7-valente alcançaram um nível anti-PRP de > 0,15 ug/mL comparado a 100% no grupo controle TRITANTRIX-HepB/Hib. 99-100% dos indivíduos que' receberam a vacina 7-valente possuíam um título SBA-MenC > 1:8 (contra 100% dos indivíduos que receberam Meningitec) . Pelo menos 97,7% dos indivíduos que receberam a vacina 7-valente possuíam um título SBA-MenA a 1:8 (contra < 10% dos indivíduos que receberam Meningitec). Níveis de soroproteção contra antígenos de difteria, tétano e hepatite B e as concentrações anti-toxóide pertussis induzida pelas vacinas 7-valente são altas e similares às
vacinas controle. A incidência de eventos adversos relevantes solicitados/não solicitados foi baixa e distribuída igualmente entre todos os grupos. Não foram reportados eventos adversos sérios relacionados à 25 vacinação. A vacina 7-valente exibe imunogenicidade excelente e um perfil bom de segurança, sugerindo que esta é uma vacina combinada apropriada para vacinação primária de crianças vivendo em regiões endêmicas para MenA e MenC.
Em um estudo adicional, a memória imune e persistência do anticorpo para componentes Hib, MenA e MenC da vacina emcrianças de 10 meses de idade é avaliada. Persistência de anticorpo e memória imune para Hib, MenA e MenC em crianças inoculadas com a vacina 7-valente é excelente: 10 ug de cada conjugado elícita altos níveis de anticorpos 5 correspondentes, demonstrando que a primeira dose da vacina conjugada é adequada desde que seja mais alta do que a resposta em crianças jovens não vacinadas (para MenA e menC) e similar ao Hiberix™ (para Hib) .
Será entendido que a invenção foi descrita para meio 10 de exemplo apenas e modificações podem ser feitas desde que permaneçam dentro do escopo e espírito da invenção.
Referências (os conteúdos das quais estão aqui
l
incorporados por referência)
l
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Claims (38)
1. Composição de vacina caracterizada pelo fato de compreender:(i) um toxóide diftérico, "D"; (ii) um toxóide tetânico, "T";(iii) um antígeno celular de pertussis, uwP";(iv) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B, "HBsAg";(v) um sacarídeo capsular tipo b de Haemophilus influenzae ("Hib") conjugado a uma proteína carreadora; e(vi) pelo menos um sacarídeo capsular tipo b de Neisseria meningitidis conjugado a uma proteína carreadora, onde o sacaríseo capsular tipo b de H. influenzae e o(s) sacarídeo(s) capsular(es) de N. meningitidis estão cada um deles conjugados a uma proteína toxóide tetânica carreadora.
2. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do componente (vi) incluir sacar ídeos a partir dos sorogrupos A e C de N. meningitidis.
3. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o conjugado do componente (iv) possui um excesso de peso do carreador e onde a proporção de peso do sacarídeo está entre 1:2 e 1:4.
4. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que o conj ugado do componente (iv) é obtenível por um processo compreendendo as etapas de: (a) ativação de um sacarídeo capsular do tipo B de Haemophilus influenzae com brometo de cianogênio, para gerar um éster cianato; (b)adição de um separador adípico de hidrazida a um éster cianato, para gerar um sacarídeo ativado; e (c) união do sacarídeo ativado a uma proteína carreadora pela condensação carbodiimida.
5. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato de que o conjugado do componente (iv) inclui um ligante com a seguinte estrutura:<formula>formula see original document page 92</formula>
6. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o(s) conjugado(s) do componente (vi) é/são obtenlveis por um processo compreendendo as etapas de (a) cianilação de um sacarídeo capsular meningocóccico para gerar um éster cianato e (b) união do éster cianato diretamente a uma proteína carreadora.
7. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular meningocóccico é do sorogrupo A.
8. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo capsular meningocóccico é do sorogrupo C.
9. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o (s) conj ugado (s) do componente (vi) compreende um sacarídeo capsular meningocóccico do sorogrupo C OAc+.
10. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o(s) conjugado (s) do componente (vi) compreende(m) um sacarídeo capsular meningocóccico do sorogrupo C OAc-.
11. Compôsição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, `7, 8, 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que o (s) conjugado (s) do componente (iv) compreende um sacarideo capsular meningocóccico do sorogrupo A no qual em pelo menos 8 0 % dos seus resíduos manosamina são O-acetilados na posição C-3 .
12. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a vacina inclui entre 8 pg/mL e 12 pg/mL do conj ugado do componente (iv) .
13. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, caracterizada pelo fato de que uma dose única da vacina inclui entre 8 pg/mL e 12 pg/mL do conjugado do componente (iv).
14. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizada pelo fato de que a vacina inclui entre 8 pg/mL e 12 pg/mL do conjugado do componente (vi).
15. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, `9, 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que uma dose única da vacina inclui entre 8 pg/mL e 12 pg/mL do conj ugado do componente (vi).
16. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, `9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a vacina inclui ambos um adjuvante fosfato de alumínio e um adj uvante hidróxido de alumínio.
17. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, `9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que HBsAg é adsorvido a um adjuvante fosfato de alumínio.
18. Compôsição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que o toxóide diftérico é adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio.
19. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que o toxóide tetânico é adsorvido a um adjuvante hidróxido de alumínio.
20. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou `19, caracterizada pelo fato de que a vacina inclui um preservativo de mercúrio e um preservativo 2 -fenoxietanol.
21. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou , caracterizada pelo fato de que a proporção de toxóide diftérico para toxóide tetânico está entre `2:1 e 3:1, medida em unidades Fl.
22. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizada pelo fato de que o HBsAg é não-glicosilado e esta na forma de partículas que incluem matriz lipidica compreendendo fosfolipídios e fosfatidilinositol.
23. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o HBsAg é de subtipo adw2.
24. Composição de vacina, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada pelo fato de que o a vacina para administração para pacientes está em uma dose de 0,5 mL.
25. Processo para preparação da vacina de qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que o processo compreende as etapas de: (a) combinação de um componente trivalente D-T- Pw com um componente monovalente HBsAg, para gerar um componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg; (b) combinação de um conjugado Hib com, pelo menos, um conjugado meningocóccico para resultar em um componente conjugado misturado e (c) mistura do componente tetravalente D-T-Pw-HBsAg com o componente misturado para resultar em uma vacina.
26. Processo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o componente trivalente D-T-Pw inclui ambos adjuvante hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 2 6,caracterizado pelo fato de que o componente monovalente HBsAg está adsorvido a um adjuvante fosfato de alumínio.
28. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que o componente monovalente HBsAg está adsorvido a um adjuvante fosfato de alumínio.
29. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o componente misturado está sem adjuvante.
30. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25, 26, 27, 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que o componente trivalente D-T-Pw contém um preservativo de mercúrio.
31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, 15 caracterizado pelo fato de que o preservativo de mercúrio étiomersal.
32. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que o componente misturado não contém um preservativo de mercúrio.
33. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que a vacina inclui um preservativo 2-fenoxietanol, mas o componente trivalente D- T-Pw não contém um preservativo 2-fenoxietanol.
34. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato do conjugado Hib ser preparado por: conj ugação de um sacarídeo Hib a um carreador toxóide tetânico utilizando l-etil-3(3-dimetilaminopropil)carbodiimida e então removendo N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)uréia.
35. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 ou 34, 5 caracterizado pelo fato de que o (s) conjugado (s) meningocóccios é/são preparados por: conjugação de um sacarídeo meningocóccico a um carreador toxóide tetânico utilizando l-ciano-4-(dimetilamino)-piridino e então removendo 4-dimetilamino-piridina.
36. Kit para preparação da composição de vacina dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, `17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizado pelo fato de compreender: (aO um primeiro componente compreendendo antígenos D, T, wP e HBsAg e (b) um segundo componente compreendendo conjugados Hib e meningocóccicos, onde os dois componentes estão em compartimentos separados.
37. Kit, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que os conj ugados do segundo componente estão liofilizados.
38. Kit, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o segundo componente inclui lactose, sacarose e manitol.
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