BRPI0609541A2 - uso de hidrofobinas, processo para tratar superfìcies duras de forma a repelir sujeira, agente de limpeza, e, superfìcie dura - Google Patents

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Abstract

USO DE HIDROFOBINAS, PROCESSO PARA TRATAR SUPERFìCIES DURAS DE FORMA A REPELIR SUJEIRA, AGENTE DE LIMPEZA, E, SUPERFìCIE DURA. Uso de hidrofobinas para o tratamento repelente-de-sujeira de superficies duras, particularmente em combinação com uma limpeza da superficie, processo para o tratamento repelente-de-sujeira de superficies duras, produto de limpeza para superficies duras e também superficies duras com um revestimento repelente-de-sujeira, compreendendo hidrofobinas.

Description

"USO DE HIDROFOBINAS, PROCESSO PARA TRATAR SUPERFÍCIES DURAS DE FORMA A REPELIR SUJEIRA, AGENTE DE LIMPEZA, E, SUPERFÍCIE DURA"
A presente invenção refere-se ao uso de hidrofobinas para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras, em particular em combinação com uma limpeza da superfície, processos para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras, agentes limpantes para superfícies duras e também superfícies duras com um revestimento repelente-de-sujeira, compreendendo hidrofobinas.
É de conhecimento geral como dotar superfícies duras, por exemplo, vidro, cerâmicas ou pisos, com revestimentos repelentes de sujeira. Estes acabamentos devem reduzir a adesão de sujeira, controle o ensujamento de superfícies e facilitar limpeza subseqüente. Por exemplo, resíduos de gorduras, óleos ou calcáreo devem ser mais fáceis de remover, ou deve-se evitar a ocorrência de trilhas secas de água à medida que a água escorre.
Os revestimentos podem ser revestimentos permanentes repelentes de sujeira, por exemplo, revestimentos inspirados pelo efeito do lótus.
Os revestimentos também podem ser revestimentos. Um efeito repelente-de-sujeira temporário pode ser obtido, por exemplo, via substâncias em uma formulação limpante que são aplicadas durante a limpeza da superfície. Campos significativos de uso para referidos limpadores são aplicações domésticas, como limpadores para a cozinha ou áreas sanitárias, mas também aplicações industriais, por exemplo, limpadores para a lavagem de automóveis.
A EP-A 467 472 divulga uma composição para incrementar a hidrofilicidade de superfícies duras, por exemplo, superfícies domésticas, para que seja possível proporcionar maior facilidade de limpeza em etapas de limpeza subseqüentes. A formulação compreende um polímero iônico ou não- iônico solúvel em água, por exemplo, um polímero catiônico apresentando unidades de alquil metacrilato de amônio quaternizadas. As formulações limpantes reveladas formulações limpantes compreendem de 0,02% a 5% em peso do polímero.
O WO 03/002620 revela o uso de (met)acrilatos de dialquilaminoalquila como polímeros liberadores de sujeira para superfícies duras, por exemplo, pisos de pedras finas ou superfícies de aço inoxidável. As formulações limpadoras divulgadas compreendem de 0,1% a 5% em peso do polímero.
A DE-A 100 61 897 divulga composições limpadoras compreendendo partículas hidrofílicas contendo silicato que levam a um melhor desprendimento de sujeira, associada com reduzido re-ensujamento. As partículas são captadas pela superfície dos substratos a serem limpados e, assim, afetam as propriedades da superfície.
Hidrofobinas são proteínas pequenas com cerca de 100 a 150 aminoácidos que são características de fungos filamentosos, por exemplo, Schizophyllum commune. Elas apresentam geralmente 8 unidades cisteína.
Hidrofobinas apresentam uma afinidade marcante por interfaces e, portanto, são úteis para o revestimento de superfícies. Por exemplo, é possível revestir Teflon com hidrofobinas para se obter uma superfície hidrofílica.
Hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Mas também é possível sintetizar hidrofobinas não naturalmente ocorrentes por meio de métodos de produção químicos e/ou biotecnológicos. Nosso pedido anterior DE 102005007480.4 divulga um processo para produzir hidrofobinas que não ocorrem na natureza.
Há estado da técnica que propõe o uso de hidrofobinas para várias aplicações.
WO 96/41882 propõe o uso de hidrofobinas como emulsificadores, espessantes ou tensoativos, para proporcionar propriedades hidrofílicas a superfícies hidrofóbicas, para melhorar a resistência à água de substratos hidrofílicos, para preparar emulsões óleo-em-água ou emulsões água-em-óleo. Propostas adicionais incluem aplicações farmacêuticas, como a preparação de ungüentos ou cremes e também aplicações cosméticas, como proteção da pele ou a produção de xampus ou condicionadores.
A EP-A 1 252 516 revela o revestimento de janelas, lentes de contato, biossensores, dispositivos médicos, recipientes para realização de ensaios ou para armazenamento, cascos de embarcações, partículas sólidas ou estrutura ou carroceria de veículos de passageiros, com uma solução contendo hidrofobina a de 30 a 80°C.
WO 03/53383 divulga o uso de hidrofobina para tratar materiais de queratina em aplicações cosméticas.
WO 03/10331 revela um sensor revestido com hidrofobina (um eletrodo de medição, por exemplo) a que se liga de forma não-covalente substâncias adicionais, por exemplo, substâncias eletro-ativas, anticorpos ou enzimas.
Nenhuma das referências indicadas divulga o uso de hidrofobinas para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras.
Constitui um objeto da presente invenção proporcionar técnicas inéditas para repelir sujeira.
Nós verificamos que este objeto é alcançado com o uso de uma hidrofobina para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras. Em uma concretização preferida da presente invenção, o tratamento repelente de sujeira é realizada em combinação com uma limpeza da superfície.
Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um processo para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras que compreende contatar a superfície com uma composição compreendendo pelo menos uma hidrofobina e também pelo menos um solvente. Em um terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um agente limpador para superfícies duras que compreende pelo menos uma hidrofobina, pelo menos um tensoativo e também pelo menos um solvente.
Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a superfícies duras compreendendo um revestimento repelente de sujeira compreendendo hidrofobinas.
Nós verificamos, com surpresa, que mesmo pequenas quantidades de hidrofobinas são suficientes para um tratamento repelente-de- sujeira efetivo de superfícies duras.
Uma descrição detalhada da presente invenção é dada a seguir:
O termo "superfícies duras" é conhecido pela pessoa versada na arte. Superfícies duras são superfícies que são minimamente compressíveis, se de tudo o forem, em particular superfícies lisas, por exemplo, superfícies de vidro, cerâmica, metais, por exemplo, aço inoxidável ou latão, esmalte, plástico e/ou superfícies laqueadas. Exemplos de superfícies laqueadas compreendem a superfície de carrocerias de automóveis laqueadas ou a superfície de utilidades domésticas. Superfícies duras podem compreender em particular superfícies domésticas típicas, por exemplo, a superfície de azulejos, pisos, armações, lavatórios, duchas, banheiras, vasos sanitários, cabines de ducha, móveis de banheiro, móveis de cozinha, como mesas, cadeiras, armários de cozinha, superfícies de trabalho ou outros móveis, espelhos, janelas, louças, cutelaria, vidros, artigos de porcelana ou as superfícies de utilidades domésticas, como máquinas de lavar, lava-louças, fogões ou coifas de extração de vapores.
O termo "repelente de sujeira" é conhecido por aqueles com prática na arte. Um tratamento repelente-de-sujeira de uma superfície controla seu ensujamento e/ou facilita o desprendimento da sujeira da superfície. Sujeira compreende de maneira conhecida qualquer tipo de contaminação indesejável de superfícies duras com entidades sólidas e/ou líquidas. Exemplos de sujeira compreendem gorduras, óleos, proteínas, restos de comida, pó ou sujeira. Ensujamento também pode compreender depósitos de calcáreo, como, por exemplo, trilhas secas de água que se formam devido à dureza da água. Exemplos adicionais compreendem resíduos de agentes de limpeza e de tratamento pessoal ou, então, sabões calcáreos insolúveis que podem formar-se de referidos agentes limpadores e de tratamento em conjunto com a dureza da água e que podem depositar-se sobre superfícies duras, como, por exemplo, pias, cabines de ducha ou banheiras.
De acordo com a presente invenção, pelo menos uma hidrofobina é usada para o tratamento repelente-de-sujeira de superfícies duras. E possível usar apenas uma hidrofobina ou uma mistura de uma pluralidade de diferentes hidrofobinas.
O termo "hidrofobinas" como usado aqui deve referir-se, abaixo, a polipeptídeos da fórmula estrutural geral (I)
Xn-Cl-X1-50-C2-X0-5-C3-X1-100-C4-X1-100-C5-X1-50-C6-X0-5-C7-X1-50-C8-Xm (I)
sendo que X pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturalmente ocorrentes (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, lie, Met, Thr, Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Cada X pode ser igual ou diferente. Os índices próximos de X indicam em cada caso o número de aminoácidos, C representa cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina, sujeito à condição de que pelo menos quatro dos aminoácidos identificados com C sejam cisteína, e os índices nem são independentemente números naturais na faixa de O a 500 e, de preferência, na faixa de 15 a 300.
Os polipeptídeos de Fórmula (I) são caracterizados adicionalmente pela propriedade (após revestimento de uma superfície de vidro) de incrementar o ângulo de contato de uma gota de água em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25°, mais preferivelmente pelo menos 30° e, da forma mais preferível, pelo menos 35°, em comparação com o ângulo de contato formado por uma gota de água do mesmo tamanho com a superfície de vidro não revestida, sendo que cada medição é realizada à temperatura ambiente.
Os aminoácidos indicados com de C1 a C8 são, de preferência, cisteínas; mas eles também podem ser substituídos por outros aminoácidos de tamanho similar, de preferência, por alanina, serina, treonina, metionina ou glicina. No entanto, pelo menos 4, de preferência, pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 e, particularmente, pelo menos 7 das posições de C1 a C8 devem consistir de cisteínas. Cisteínas nas proteínas usadas de acordo com a presente invenção podem estar presentes em forma reduzida ou formam pontes dissulfeto entre si. Prefere-se particularmente a formação intramolecular de pontes C-C, em particular que envolvem pelo menos uma, de preferência, 2, mais preferivelmente 3 e, da forma mais preferível, 4 pontes dissulfeto intramoleculares. No caso da troca de cisteínas descrita acima por aminoácidos de tamanho similar, é vantajoso que referidas posições de C 15 estejam envolvidas numa troca pareada como as que são capazes de formar pontes dissulfeto intramoleculares uma com a outra.
Quando se usa cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas ou treoninas nas posições indicadas com X, a numeração das posições C individuais nas fórmulas gerais podem variar correspondentemente.
Prefere-se o uso de hidrofobinas da fórmula geral (II) Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-15-C6-X0-2-C7-X3-35-C8-Xm (II) sendo que X, C e os índices próximos a X são, cada um, como definido acima, os índices nem representam números na faixa de 0 a 300, e as proteínas distinguem-se adicionalmente pela variação do ângulo de contato indicada acima.
Prefere-se o uso de hidrofobinas da fórmula geral (III) Xn-C1-X5-9-C2-C3-X11-39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6-18-C8-Xm (III) sendo que X, C e os índices próximos a X são cada um como definido acima, os índices nem representam números na faixa de 0 a 200, as proteínas distinguem-se adicionalmente pela variação do ângulo de contato indicada acima e, adicionalmente, pelo menos seis dos aminoácidos indicados como C são cisteína. E particularmente preferível que todos os aminoácidos indicados com C sejam cisteína.
Os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos que podem ser ligadas naturalmente a uma hidrofobina. No entanto, um ou ambos os radicais Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeos que não são naturalmente ligadas a uma hidrofobina. Isto também inclui radicais Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeos naturalmente ocorrente em uma hidrofobina é estendida por uma seqüência de peptídeos não naturalmente ocorrente em uma hidrofobina.
Quando Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeos que não ocorrem naturalmente em hidrofobinas, sendo que o comprimento de referidas seqüências é geralmente de pelo menos 20 aminoácidos, de preferência, pelo menos 35 aminoácidos, mais preferivelmente pelo menos 50 aminoácidos e, da forma mais preferível, pelo menos 100 aminoácidos. Um radical do tipo referido, que não é ligado naturalmente a uma hidrofobina, também será referido abaixo como uma porção de parceiro de fusão. Pretende-se articular o fato de que as proteínas consistem de uma porção hidrofobina e uma porção de parceiro de fusão que não ocorrem conjuntamente nesta forma, na natureza.
A porção de parceiro de fusão pode ser selecionada de uma multiplicidade de proteínas. Também é possível que uma pluralidade de porções de parceiros de fusão sejam ligadas a uma porção hidrofobina, por exemplo, na ponta amino (Xn) ou na ponta carbóxi (Xm) da porção hidrofobina. Mas também é possível, por exemplo, ligar duas porções de parceiros de fusão a uma posição (Xn ou Xm) da proteína usada de acordo com a presente invenção.
Porções de parceiros de fusão particularmente vantajosas são polipeptídeos que ocorrem naturalmente em microorganismos, em particular em E. coli ou Bacillus subtilis. Exemplos de referidas porções de parceiros de fusão são as seqüências yaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18) e tiorredoxina. Também são altamente vantajosos fragmentos ou derivados das seqüências previamente indicadas que compreendem apenas uma porção, de preferência, de 70% a 99% e, mais preferivelmente, de 80% a 98%, das referidas seqüências, ou em que nucleotídeos ou aminoácidos individuais foram alterados em comparação com a seqüência indicada.
Proteínas usadas de acordo com a presente invenção podem ser modificadas adicionalmente em sua seqüência de polipeptídeos, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação ou, então, por meio de reticulação química, por exemplo, com glutaraldeído.
Uma propriedade das proteínas usadas de acordo com a presente invenção é a alteração das propriedades de superfície quando as superfícies são revestidas com as proteínas. A alteração das propriedades de superfície pode ser determinada experimentalmente medindo-se o ângulo de contato de uma gota de água antes e após o revestimento da superfície com a proteína e determinando-se a diferença entre as duas medições.
Uma pessoa versada na arte saberá, em princípio, como realizar medições de ângulo de contato. As condições experimentais precisas para medição do ângulo de contato são descritas na porção experimental. Nas condições indicadas aqui, as proteínas usadas de acordo com a presente invenção apresentam a propriedade de incrementar o ângulo de contato de uma gotícula de água sobre uma superfície de vidro em pelo menos 20°, de preferência, pelo menos 25° e, mais preferivelmente, pelo menos 30°.
As posições dos aminoácidos polares e apolares na porção hidrofobina das hidrofobinas conhecidas até hoje são preservadas, resultando em um diagrama característico de hidrofobicidade. Diferenças das propriedades biofísicas e a hidrofobicidade levaram às hidrofobinas conhecidas até aqui são classificadas em duas classes, I e II (Wessels et al., Ann. Rev. Phytopathol., 1994, 32, 413-437).
As membranas combinadas de hidrofobinas de classe I são altamente solúveis (mesmo em uma solução aquosa a 1% em peso de n- dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma temperatura elevada e só podem ser dissociadas novamente com ácido trifluoroacético (TFA) concentrado ou ácido fórmico. Em contraste, as formas combinadas de hidrofobinas de classe II são menos estáveis. Elas podem ser dissolvidas novamente com apenas 60% em peso etanol ou 1% em peso de SDS (à temperatura ambiente).
Comparação das seqüências de aminoácidos revela que o comprimento da região entre cisteína C3 e cisteína C4 é distintamente mais curto em hidrofobinas de classe II do que em hidrofobinas de classe I. Hidrofobinas de classe II apresentam adicionalmente aminoácidos mais carregados do que as de classe I.
Hidrofobinas particularmente preferidas para concretização da presente invenção são aquelas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfl, basf2, que são caracterizadas estruturalmente na listagem de seqüências abaixo. Elas também podem ser apenas partes ou derivados das mesmas. Também é possível ligar uma pluralidade de hidrofobina, de preferência, 2 ou 3, com a mesma estrutura ou com uma estrutura diferente, em conjunto e a uma seqüência de polipeptídeo vantajosa correspondente que não é conectada naturalmente a uma hidrofobina.
E particularmente vantajoso para a prática da presente invenção que as proteínas de fusão apresentem as seqüências de polipeptídeos indicadas nas SEQ ID NO: 20, 22, 24 e também as seqüências de ácido nucleico que codificam para as mesmas, em particular as seqüências de acordo com SEQ ID NO: 19, 21, 23. Concretizações particularmente preferidas incluem adicionalmente proteínas que, partindo das seqüências de polipeptídeos indicados nas SEQ ID NO. 22, 22 ou 24, resultam da substituição, inserção ou deleção de pelo menos um, até 10, de preferência, 5, mais preferivelmente 5% de todos os aminoácidos e que ainda apresentam pelo menos 50% da propriedade biológica das proteínas de partida. A propriedade biológica das proteínas usadas de acordo com a presente invenção deve compreender o significado da alteração descrita acima no ângulo de contato em pelo menos 20°.
Polipeptídeos usados de acordo com a presente invenção podem ser preparados quimicamente por meio de técnicas familiares da síntese peptídica, por exemplo, a síntese de fase sólida de Merrifield.
Hidrofobinas naturalmente ocorrentes podem ser isoladas de fontes naturais com o emprego de métodos vantajosos. Como um exemplo, ver Wõsten et ai, Eur. JCell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO 96/41882.
Proteínas de fusão são preparadas, de preferência, por meio de processos de manipulação genética em que uma seqüência de ácido nucleico, em particular uma seqüência de DNA, codificando para o parceiro de fusão e uma seqüência de ácido nucleico, em particular uma seqüência de DNA, codificando para a porção de hidrofobina são combinadas de tal forma que a proteína desejada seja gerada em um organismo hospedeiro por meio de expressão gênica da seqüência de ácido nucleico combinada. Um método de preparação do tipo referido é divulgado em nosso pedido estado da técnica DE 102005007480.4.
Organismos hospedeiros, ou produtores, vantajosos para o método de preparação mencionado incluem procariontes (incluindo Archaea) ou eucariontes, particularmente bactérias incluindo halobactérias e metanococos, fungos, células de insetos, células de plantas e células mamíferas, mais preferivelmente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec., lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas), etc. Para os fins da presente invenção, é possível usar construções de expressão obtidas, sob o controle genético de seqüências de ácido nucleico reguladoras, uma seqüência de ácido nucleico que codifica para um polipeptídeo usado de acordo com a presente invenção, e também vetores compreendendo pelo menos uma destas construções de expressão, para preparar hidrofobinas.
Construções de expressão usadas compreendem, de preferência, um promotor 5' a montante da seqüência codificante particular e uma seqüência terminadora 3' a jusante da seqüência codificante particular e também, se apropriado, elementos reguladores usuais adicionais, sendo que cada um é ligado operacionalmente à seqüência codificante.
"Ligação operativa" refere-se à disposição seqüencial de promotor, seqüência codificante, terminador e, se desejado, elementos reguladores adicionais de tal forma que cada um dos elementos reguladores seja capaz de preencher sua função conforme requerido na expressão da seqüência codificante.
Exemplos de seqüências ligáveis operacionalmente são seqüências de objetivação e também acentuadores, sinais de poliadenilação e análogos. Elementos reguladores adicionais compreendem marcadores selecionáveis, sinais de amplificação, origens de replicação e análogos. Seqüências reguladoras vantajosas são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990).
Adicionalmente a estas seqüências reguladoras, a regulação natural destas seqüências pode ainda estar presente a montante dos genes estruturais efetivos e, se desejado, pode ter sido geneticamente modificada de tal forma que a regulação natural tenha sido desativada e a expressão dos genes tenha sido acentuada.
Uma construção de ácido nucleico preferida também compreende vantajosamente uma ou mais das seqüências acentuadoras previamente indicadas que são ligadas funcionalmente ao promotor e que permitem uma expressão acentuada da seqüência de ácido nucleico. Seqüências vantajosas adicionais, como elementos reguladores adicionais ou terminadores, também podem ser inseridas na ponta 3' das seqüências de DNA.
Os ácidos nucleicos podem estar presentes na construção em uma ou mais cópias. A construção também pode compreender marcadores adicionais, como genes de resistências a antibióticos ou agentes complementadores de auxotrofia, se desejado para o fim de selecionar referida construção.
Seqüências reguladoras vantajosas para o processo estão presentes, por exemplo, em promotores, como cos, tac, trp, tet, trp- tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou promotor imlambda-P, sendo que referidos promotores são usados vantajosamente em bactérias Gram-negativas. Seqüências reguladoras vantajosas adicionais estão presentes, por exemplo, nos promotores Gram- positivos amy e SP02, nos promotores de levedura ou fungicos ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH. Também é possível usar promotores artificiais para regulação.
Para expressar a construção de ácido nucleico em um organismo hospedeiro, ele é inserido vantajosamente em um vetor, por exemplo, um plasmídeo ou fago, que permite expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores, e também plasmídeos e fagos, incluem adicionalmente todos os outros vetores conhecidos per se, i.e., por exemplo, vírus, como SV40, CMV, baculovírus e adenovírus, transpósons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos, e DNA linear ou circular, e também o sistema de Agrobacterium.
Estes vetores podem ser replicados autonomamente no organismo hospedeiro ou cromossomicamente. Estes vetores constituem uma forma adicional da invenção. Exemplos de plasmídeos vantajosos são, em E. coli, pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19,2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, pIN- ΙΙI"3-Bl, tgt11 ou pBdCI, in Streptomyces, p1J101, pIJ364, p1J702 ou p1J361, in Bacillus pUB110, pC194 ou pBD214, em Corynebacterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALS1, p1L2 ou pBB116, em leveduras 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 ou pEMBLYe23 ou em plantas pLGV23, pGHlac+, pBIN19, pAK2004 ou pDH51. Os plasmídeos indicados constituem uma pequena seleção dos plasmídeos possíveis. Plasmídeos adicionais são conhecidos per se e podem ser encontrados, por exemplo, no livro Cloning Vectors (Eds. Pouwels Ρ. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018).
Para expressar os outros genes que estão presentes, a construção de ácido nucleico também compreende vantajosamente seqüências reguladoras 3'- e/ou 5'-terminais para acentuar a expressão que são selecionadas para expressão ótima de acordo com a escolha do organismo hospedeiro e gene ou genes.
Estas seqüências reguladoras destinam-se a permitir a expressão específica dos genes e expressão de proteína. Dependendo do organismo hospedeiro, isto pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ou superexpresso apenas após indução, ou que é expresso e/ou superexpresso imediatamente.
Prefere-se a expressão dos genes que foram introduzidos [e] que podem ser influenciados positivamente e, com isto, acentuados pelos fatores ou seqüências reguladoras. Assim, os elementos reguladores podem ser acentuados vantajosamente no nível de transcrição por meio do uso de sinais de transcrição fortes, como promotores e/ou acentuadores. No entanto, adicionalmente a isto, também é possível acentuar a tradução por meio, por exemplo, do aperfeiçoamento da estabilidade do mRNA. Em uma forma adicional do vetor, o vetor que compreende a construção de ácido nucleico ou o ácido nucleico também pode ser introduzido vantajosamente nos microorganismos em forma de um DNA linear e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro via recombinação heterológa ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de um vetor linearizado, como um plasmídeo, ou apenas da construção de ácido nucleico ou do ácido nucleico.
Para expressão ótima de genes heterólogos em organismos é vantajoso modificar as seqüências de ácido nucleico de acordo com o uso de códon específico usado no organismo. O uso de códon pode ser determinado facilmente com o auxílio de análises de computador de outros genes conhecidos do organismo em questão.
Uma cassete de expressão é preparada com a fusão de um promotor vantajoso a uma seqüência de nucleotídeos codificante vantajosa e a um terminador ou sinal de poliadenilação. Com este objetivo e posição usar técnicas comuns de recombinação e clonagem como descrito, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) e também em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W. Enquist,
Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).
Para se obter a expressão em um organismo hospedeiro vantajoso, a construção de ácido nucleico recombinante, ou construção gênica, é inserida vantajosamente em um vetor específico-para-hospedeiro que proporciona expressão ótima dos genes no hospedeiro. Vetores são conhecidos per se e podem ser obtidos, por exemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels Ρ. H. et al., Eds, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
E possível preparar, com o auxílio dos vetores, microorganismos recombinantes que são transformados, por exemplo, com pelo menos um vetor e que podem ser usados para a produção dos polipeptídeos usados de acordo com a invenção. De maneira vantajosa, as construções recombinantes descritas acima são introduzidas em um sistema hospedeiro vantajoso e expressas. Em conexão com isto, métodos de clonagem e transfecção familiares conhecidos pela pessoa versada na arte, como, por exemplo, co-precipitação, fusão de protoplasto, eletroporação, transfecção retroviral e análogos, são usados, de preferência, para causar a expressão de ácidos nucleicos no sistema de expressão particular. Sistemas vantajosos encontram-se descritos, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et ai., Eds., Wiley Interscience, New York 1997, ou Sambrook et ai. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Também é possível preparar microorganismos recombinados homologamente. Para este fim, um vetor que compreende pelo menos uma seção de um gene a ser usado de acordo com a invenção ou de uma seqüência codificante em que se introduziu, se apropriado, pelo menos uma deleção de aminoácido, adição de aminoácido ou substituição de aminoácido para modificar, por exemplo, romper funcionalmente, a seqüência (vetor de knockout). A seqüência introduzida também pode ser, por exemplo, um homólogo de um microorganismo relacionado ou pode ser derivada de uma fonte mamífera, de levedura ou de inseto. Alternativamente, o vetor usado para recombinação homóloga pode ser projetado de tal forma que o gene endógeno, no caso de recombinação homóloga, é mutado ou, de outra forma, alterado, mas ainda codifica a proteína funcional (p. ex., a região reguladora a montante pode ter sido alterada de tal forma que a expressão da proteína endógena é alterada com isso). A seção alterada do gene usado de acordo com a invenção é no vetor de recombinação homóloga. A construção de vetores que são vantajosos para recombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, K.R. e Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.
Organismos hospedeiros recombinantes vantajosos para o ácido nucleico usado de acordo com a invenção ou a construção de ácido nucleico são, em princípio, quaisquer organismos procariontes ou eucariontes. De maneira vantajosa, usa-se microorganismos, como bactérias, fungos ou leveduras, como organismos hospedeiros. Usa-se de maneira vantajosa bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas, de preferência, bactérias das famílias Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae ou Nocardiaceae, de forma particularmente preferível, bactérias dos gêneros Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium ou Rhodococcus.
Os organismos usados no processo de preparação de proteínas de fusão são, dependendo do organismo hospedeiro, desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida da pessoa versada na arte. Microorganismos são desenvolvidos usualmente em um meio líquido que compreende uma fonte de carbono, usualmente em forma de açúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente em forma de fontes de nitrogênio orgânico, como extrato de levedura ou sais, como sulfato de amônio, traços de elementos, como sais de ferro, sais de manganês e sais de magnésio e, se desejado, vitaminas, em temperaturas entre 0°C e 100°C, de preferência, entre 10°C e 60°C, enquanto são abastecidos com oxigênio. Em conexão com isto, o pH do líquido nutriente pode ser mantido em um valor fixo, i.e. pode ou não ser regulado durante o cultivo. O cultivo pode ser realizado em modo de bateladas, em modo de semi-bateladas ou continuamente. Nutrientes podem ser introduzidos inicialmente no início da fermentação ou podem ser introduzidos subseqüentemente de uma maneira semi-contínua ou contínua. As enzimas podem ser isoladas dos organismos por meio do processo descrito nos exemplos ou usadas na reação como um extrato bruto. Também são vantajosos processos para preparar recombinantemente polipeptídeos ou fragmentos biologicamente ativos funcionais dos mesmos, com um microorganismo produtor de polipeptídeo que está sendo cultivado, sendo que a expressão dos polipeptídeos é induzida, se desejado, e referidos polipeptídeos são isolados da cultura. Polipeptídeos também podem ser produzidos desta maneira numa escala industrial, se isto for desejado. O microorganismo recombinante pode ser cultivado e fermentado por meio de métodos conhecidos. Bactérias podem ser preparadas, por exemplo, em meio TB ou meio LB e a uma temperatura de 20 a 40°C e um pH de 6 a 9. Condições de cultura vantajosas são descritas detalhadamente, por exemplo, em T. Maniatis, E.F. Fritsch e J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
Se os polipeptídeos não forem secretados no meio de cultura, as células serão então rompidas e o produto obtido do lisado por meio de processos conhecidos de isolamento de proteínas. As células podem ser disrompidas, conforme desejado, por meio de ultra-som de alta freqüência, por meio de pressão elevada, como, por exemplo, em uma célula de pressão Francesa, por meio de osmólise, pela ação de detergentes, enzimas líticas ou solventes orgânicos, por meio de homogeneizadores ou por meio de uma combinação de dois ou mais dos processos listados.
Polipeptídeos podem ser purificados usando-se métodos cromatográficos conhecidos, como cromatografia com peneiras moleculares (filtração em gel), como cromatografia em Q Sepharose, cromatografia de troca de íon e cromatografia hidrofóbica, e também usando-se outros métodos usuais, como ultrafiltração, cristalização, dessalinização, diálise e eletroforese em gel nativa. Processos vantajosos são descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York ou em Scopes, R., Protein Purifieation, Springer Verlag, New York, Heidelber g, Berlin.
Pode ser vantajoso isolar a proteína recombinante por meio do uso de sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendem o cDNA por meio de seqüências de nucleotídeos particulares e, com isso, codificam para para simplificar a purificação. Exemplos de modificações vantajosas deste tipo são marcadores que atuam como âncoras, como a modificação conhecida como a âncora hexa-histidina, ou epitopos que podem ser reconhecidos como antígenos por parte de anticorpos (como descrito, por exemplo, em Harlow, E. e Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Outros marcadores vantajosos são, por exemplo, HA, calmodulina-BD, GST, MBD; quitina-BD, etapatavidina-BD-avi-tag-, Flag- tag T7 etc. Estas âncoras podem ser usadas para ligar as proteínas a um suporte sólido, como uma matriz de polímero, por exemplo, que pode ser empacotada, por exemplo, em uma coluna de cromatografia, ou pode ser usada em uma placa de microtitulação ou sobre outro suporte. Os protocolos de purificação correspondentes podem ser obtidos de fornecedores de marcadores de afinidade comerciais.
As proteínas preparadas como descrito podem ser usadas diretamente como proteínas de fusão ou, após remoção por clivagem e remoção da porção de parceiro de fusão, como hidrofobinas "puras".
Quando se pretende a remoção da porção de parceiro de fusão é aconselhável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio de reconhecimento específico para proteases) na proteína de fusão entre a porção hidrofobina e a porção de parceiro de fusão. Referidos sítios de clivagem vantajosos incluem, em particular, aquelas seqüências de peptídeos que, de outra forma, não ocorrem na porção hidrofobina nem na porção de parceiro de fusão, como é facilmente determinado por meio de ferramentas da bioinformática. São particularmente vantajosos, por exemplo, a clivagem de BrCN na metionina ou clivagem mediada-com-protease com fator Xa, clivagem de enteroquinase, trombina, clivagem de TEV (protease do vírus da cicatriz do tabaco).
Hidrofobinas podem ser usadas em substância quando são usadas de acordo com a presente invenção para o tratamento repelente-de- sujeira de superfícies duras. De preferência, contudo, as hidrofobinas são usadas como formulações ou composições em pelo menos um solvente vantajoso.
A escolha de hidrofobinas para concretizar a invenção não é restrita. Assim, é possível usar uma hidrofobina ou então uma pluralidade de hidrofobinas diferentes. Uma pessoa versada na arte será capaz de fazer uma escolha apropriada. Por exemplo, é possível usar proteínas de fusão, como, por exemplo, yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) ou yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 21).
Os solventes para formulações podem compreender água e/ou solventes orgânicos. Também é possível usar misturas de solventes. A identidade do solvente depende da hidrofobina, da identidade da superfície a ser tratada e também do uso, e é selecionada apropriadamente por alguém com prática na arte. De uma maneira geral, água ou formulações aquosas são preferidas para aplicações domésticas. Formulações aquosas, predominantemente aquosas e não-aquosas são vantajosas para aplicações industriais.
O solvente compreende, de preferência, água ou misturas de água e solventes orgânicos miscíveis em água. Exemplos de referidos solventes orgânicos compreendem álcoois poliídricos ou monoídricos miscíveis em água, por exemplo, metanol, etanol, n-propanol, i-propanol, etileno glicol, propileno glicol ou glicerol. Álcoois de éter também são uma possibilidade. Exemplos compreendem éteres de monoalquila de (poli)etileno ou (poli)propileno glicóis, como monobutil éter de etileno glicol. A identidade e quantidade dos solventes orgânicos e solúveis em água podem ser selecionadas por alguém com prática na arte. Misturas aquosas compreendem, de preferência, pelo menos 80% em peso de água com base na soma total de todos os solventes. Além de água, álcoois são solventes preferidos.
Para preparar a composição usada de acordo com a presente invenção, pode ser preferível empregar as soluções de hidrofobina aquosas conforme sintetizadas, conforme isoladas e/ou conforme purificadas. Estas ainda podem compreender, dependendo de sua pureza, resíduos de auxiliares da síntese. Mas também é possível isolar as hidrofobinas inicialmente como substância, por exemplo, por meio de secagem por congelamento, e formulá- las apenas em uma segunda etapa.
A quantidade de hidrofobina na formulação pode ser determinada por alguém versado na arte de acordo com a identidade da superfície e/ou o uso planejado. No entanto, até mesmo quantidades relativamente pequenas são suficientes para proporcionar um efeito repelente de sujeira. Verificou-se que uma quantidade de 0,0001% a 1% em peso baseada na soma total de todos os constituintes da formulação é satisfatória sem restringir a invenção a esta faixa. A quantidade situa-se, de preferência, na faixa de 0,0005% a 0,5% em peso e, mais preferivelmente, na faixa de 0,001% a 0,1% em peso.
De preferência, a composição usada compreende um agente de limpeza, por exemplo, limpadores de vidro, limpadores de pisos, limpadores de uso múltiplo, limpadores de banho, auxiliares de enxágüe, auxiliares de lavagem de louça para limpeza manual ou a máquina, limpadores de máquina, desengraxantes de metal, limpadores de alta pressão, limpadores alcalinos, limpadores ácidos, desengraxadores pontuais ou limpadores de laticínios. O agente de limpeza da presente invenção, e também um solvente e pelo menos uma hidrofobina, compreendem de maneira conhecida, em princípio, um ou mais tensoativos em quantidades eficazes. As composições também podem compreender agentes de pré- tratamento ou pós-tratamento para superfícies duras, em particular para vidro, cerâmicas ou pisos.
Tensoativos podem compreender tensoativos aniônicos, não- iônicos, anfóteros e/ou catiônicos. Referidos tensoativos e também seu uso respectivo preferido são conhecidos, em princípio, por alguém com prática na arte.
Exemplos de tensoativos aniônicos compreendem sulfatos de álcool graxo, sulfatos de alquil éter, alcanossulfonatos, alquilbenzenossulfonatos ou fosfatos de alquila. E possível usar os ácidos livres ou sais dos mesmos.
Exemplos de tensoativos não-iônicos compreendem álcoois alcoxilados com C8-C22, como alcoxilados de álcool graxo ou alcoxilados de álcool de processo oxo, etoxilados de alquilfenol apresentando cadeias alquila com C6-14 e de 5 ã 30 moles de unidades de óxido de etileno, alquilpoliglucosídeos apresentando de 8 a 22 na cadeia alquila, alcoxilados de alquilamina ou etoxilados de alquilamida.
Exemplos de tensoativos anfóteros compreendem alquilbetaínas, alquilamidabetaínas, aminopropionatos, aminoglicinatos ou compostos de imidazólio anfóteros.
Exemplos de tensoativos catiônicos compreendem sais de amônio quaternários, substituídos ou não substituídos, de cadeia reta ou ramificada, por exemplo, halogenetos de dialquildimetilamônio com C8-6, halogenetos de dialcoxidimetilamônio ou sais de imidazólio apresentando um radical alquila de cadeia longa.
Exemplos adicionais de tensoativos são indicados nas seções de [0056] a [0073] da DE-A 101 60 993.
Uma pessoa versada na arte será capaz de realizar uma seleção adequada com relação ao tipo e à quantidade de tensoativo. Verificou-se que uma quantidade de 0,01% a 30% em peso de tensoativo com base na soma total de todos os componentes da formulação é satisfatória.
Opcionalmente, a formulação pode compreender adicionalmente outros componentes, por exemplo, materiais de mistura e/ou auxiliares. Exemplos de referidos componentes compreendem ácidos ou bases, por exemplo, ácidos carboxílicos ou amônia, sistemas tamponadores, polímeros, partículas inorgânicas, como S1O2 ou silicatos, corantes, fragrâncias ou biocidas. Exemplos adicionais de materiais de mistura são indicados na DE-A 101 60 993, em particular nas seções de [0074] a [0131]. Uma pessoa versada na arte será capaz de realizar uma seleção vantajosa com relação ao tipo e à quantidade de componentes adicionais, dependendo da aplicação.
De acordo com a presente invenção, superfícies duras são tratadas de uma maneira repelente de sujeira por meio de contato da superfície dura com uma composição compreendendo pelo menos uma hidrofobina e também pelo menos um solvente.
O contato é determinado de acordo com o tipo do artigo. Ele pode ser realizado, por exemplo, por meio de pulverização, enxágüe ou esfregamento da superfície com a composição ou, então, por meio de imersão de todo o artigo na formulação. Naturalmente, este último só é possível com artigos que não foram instalados. O tempo de tratamento é decidido por alguém versado na arte. Este pode durar de alguns segundos até várias horas. Após tratamento, a superfície pode ser enxaguada com água, por exemplo, para remover o excesso da solução de tratamento.
O tratamento repelente de sujeira pode ser realizado de maneira particularmente vantajosa em combinação com um limpador, i.e., no decurso do próprio processo de limpeza efetivo. Isto é realizado usando-se a composição limpadora compreendendo, como descrito acima, pelo menos uma hidrofobina, pelo menos um tensoativo e também pelo menos um solvente.
O tratamento pode ser realizado a temperaturas abaixo da temperatura ambiente, à temperatura ambiente ou a temperaturas elevadas, por exemplo, a de 20 a 100°C, de preferência, de 20 a 60°C. O tratamento é realizado, de preferência, a temperaturas não superiores a 30°C, em particular de 20 a 30°C.
Após tratamento com a composição, a superfície tratada é secada. A secagem da superfície tratada pode ocorrer quase por si só à temperatura ambiente, ou a secagem também pode ser realizada a temperaturas elevadas.
O tratamento e também, se apropriado, a secagem da superfície pode ser seguida de um pós-tratamento térmico da superfície a temperaturas elevadas, por exemplo, a temperaturas de até 120°C. O pós- tratamento térmico também pode ser realizado combinado com a secagem. As temperaturas de pós-tratamento térmico situam-se, de preferência, na faixa de 30 a 100°C, mais preferivelmente na faixa de 40 a 80°C e, por exemplo, na faixa de 50 a 70°C. O tempo de tratamento é decidido por alguém versado na arte, sendo que pode situar-se na faixa de 1 min a 10 h, por exemplo.
O processo da presente invenção proporciona uma superfície dura que compreende um revestimento repelente de sujeira compreendendo pelo menos uma hidrofobina. O revestimento compreende geralmente pelo menos uma camada monomolecular de hidrofobina sobre a superfície.
O efeito repelente de sujeira pode ser determinado por meio de métodos conhecidos em princípio, por exemplo, comparando-se a capacidade de desprendimento da sujeira por meio de enxágüe realizado com água no caso de uma superfície não-tratada contra uma superfície tratada com hidrofobinas.
Hidrofobinas apresentam um efeito distinto, mesmo em pequenas quantidades. Tratamento com uma composição compreendendo apenas 0,01% em peso de hidrofobinas levará a uma liberação de sujeira nitidamente aperfeiçoada.
O tratamento repelente de sujeira de acordo com a presente invenção é particularmente útil para superfícies cerâmicas, por exemplo, no caso de azulejos. Aqui é possível obter uma hidrofobização distinta da superfície por meio de tratamento e também do efeito repelente de sujeira. Esta é uma vantagem significativa, particularmente em recintos úmidos, como banheiros, por exemplo.
Os exemplos a seguir ilustram a invenção:
Parte A:
Preparação e testes de hidrofobinas usados de acordo com invenção
Exemplo 1
Trabalho preliminar para a clonagem de yaad-His^/ yaaE-Hisg
Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o auxílio dos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O modelo de DNA usado foi DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmento de PCR obtido consistiu da seqüência codificante do gene de Bacillus subtilis yaaD / yaaE e, em suas pontas, em cada caso, um sítio de clivagem de restrição NcoI e, respectivamente, BglII. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com as endonucleases de restrição NcoI e BglII. Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonado no vetor pQE60 da Qiagen, que havia sido previamente linearizado com as endonucleases de restrição NcoI e BglII. Os vetores assim obtidas, pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5, podem ser usados para expressar proteínas que consistem de YAAD::HIS6 e YAAE::HIS6, respectivamente.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc Exemplo 2
Clonagem de DewA-His6 de hidrofobina yaad
Realizou-se uma reação em cadeia de polimerase com o oligonucleotídeo KaM 416 e KaM 417. O modelo de DNA usado foi DNA genômico do mofo Aspergillus nidulans. O fragmento de PCR obtido compreendeu a seqüência codificante do gene de hidrofobina dewA e um sítio de clivagem de proteinase de fator Xa N-terminal. O fragmento de PCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restrição BamHL Este fragmento de DNA foi usado como inserto e clonado no vetor pQE60YAAD#2 previamente linearizado com a endonuclease de restrição BglII.
O vetor assim obtido, #508, pode ser usado para expressão de uma proteína de fusão consistindo de YAAD::Xa::dewA::HIS6. KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417:
CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT
CCGC
Exemplo 3
Clonagem de RodA-His^ de hidrofobina yaad
O plasmídeo #513 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se o oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435. KaM434:
GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Exemplo 4
Clonagem de BASFl-His^ de hidrofobina yaad
O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O modelo de DNA empregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente - hidrofobina BASFl (ver apêndice). KaM417:
CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT CCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Exemplo 5
Clonagem de BASF2-His^ de hidrofobina yaad
O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418. O modelo de DNA empregado foi uma seqüência de DNA sintetizada artificialmente - hidrofobina BASF2 (ver apêndice). KaM417:
CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCT CCGC
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG Exemplo 6
Clonagem de SC3-His6 de hidrofobina yaad
O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo #508, usando-se os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.
O modelo de DNA empregado foi cDNA de Schyzophyllum commune (ver apêndice).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT Exemplo 7
Fermentação do DewA-His6 de hidrofobina yaad da cepa de E. coli recombinante
Inoculação de 3 ml de meio LB líquido com uma cepa de E. coli expressando DewA-His6 de hidrofobina yaad em tubos Greiner de 15 ml. Incubação em um agitador a 200 rpm a 37°C durante 8 h. Em cada caso, 2 frascos de Erlenmeyer com volume de 1 1 com defletores e 250 ml de meio LB (+ 100 μg/ml de ampicilina) foram inoculados com 1 ml de pré-cultura e incubadas em um agitador a 180 rpm a 37°C durante 9 h. Inocular 13,5 1 de meio LB (+100 μg/ml de ampicilina) com 0,5 1 de pré-cultura (OD600nm 1:10 medida contra H2O) em um fermentador de 20 1. A adição de 140 ml de 100 mM de IPTG a uma OD60nm de -3,5. Após 3 h, resfriar o fermentador a IO0C e remover o caldo de fermentação por meio de centrifugação. Usar pellet de células para purificação adicional. Exemplo 8
Purificação da proteína de fusão de hidrofobina recombinante (purificação de proteínas de fusão de hidrofobina apresentando um marcador Hisó C-terminal)
100 g de pellet de células (100 - 500 mg de hidrofobina) foram constituídos com 50 mM tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5, a um volume total de 200 ml e ressuspensos. A suspensão foi tratada com um Ultraturrax tipo T25 (Janke e Kunkel; IKA-Labortechnik) durante 10 minutos e subseqüentemente, para os fins de degradação dos ácidos nucleicos, incubada com 500 unidades de benzonase (Merck, Darmstadt; número de ordem 1.01697.0001) à temperatura ambiente durante 1 hora. Antes da disrupção de células, realizou-se uma filtração usando-se um cartucho de vidro (PI). Para os fins de disrupção das células e de cisalhamento do DNA genômico remanescente, realizou-se duas operações em homogeneizador a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). O homogeneizado foi centrifugado (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, béquer de centrifugação de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g), o sobrenadante foi colocado sobre gelo e o pellet foi ressuspenso em 100 ml de tamponador de fosfato de sódio, pH 7,5. Centrifugação e ressuspensão foram repetidos três vezes, o tamponador de fosfato de sódio compreendendo 1% SDS na terceira repetição. Após ressuspensão, a solução foi agitada durante uma hora, seguido de uma centrifugação final (Sorvall RC-5B, GSA Rotor, béquer de centrifugação de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23.000 g). De acordo com análise SDS-PAGE, a hidrofobina está presente no sobrenadante após a centrifugação final (Figura 1). Os experimentos mostram que a hidrofobina está presente nas células de E. coli correspondentes, provavelmente em forma de corpos de inclusão. 50 ml do sobrenadante contendo hidrofobina foram aplicados em uma coluna de 50 ml de níquel-Sepharose High Performance 17-5268-02 (Amersham) equilibrada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0. A coluna foi lavada com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, e a hidrofobina foi eluída subseqüentemente com 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0, compreendendo 200 mM de imidazol. Com o objetivo de remover o imidazol, a solução foi dialisada contra 50 mM de tamponador de Tris-Cl, pH 8,0.
Figura 1 ilustra a purificação da hidrofobina preparada:
Faixa 1: solução aplicada em coluna de níquel-Sepharose (diluição a 1:10)
Faixa 2: perfluxo = eluado da etapa de lavagem
Faixas 3-5: picos a OD 280 de frações de eluição
A hidrofobina da Figura 1 tem um peso molecular de aprox. 53 kD. Algumas das bandas menores representam produtos de degradação de hidrofobina.
Exemplo 9
Teste de desempenho; caracterização da hidrofobina por meio de alteração do ângulo de contato de uma gotícula de água sobre vidro
Substrato:
Vidro (vidro de janela, Süddeutsche Glas, Mannheim, Alemanha):
Concentração de hidrofobina: 100 μg/ml Incubação de lâminas de vidro de um dia para o outro (temperatura 80°C) em 50 mM acetato de sódio (pH 4) + 0,1% em peso de Tween 20 seguido de lavagem das lâminas de vidro com revestimento de hidrofobina em água destilada seguido de incubação: 10 min / 80°C / 1% em peso de solução aquosa de n-dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada lavagem em água destilada
As amostras são secadas ao ar (temperatura ambiente) e submetidas à temperatura ambiente para uma determinação do ângulo de contato (em graus) de uma gotícula de 5 μΐ de água.
O ângulo de contato medição foi determinado em um sistema Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0, (novembro de 2002). A medição foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.
Vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o; um revestimento com a hidrofobina funcional do Exemplo 8 (yaad-dewA-Iiis6) deu um ângulo de contato de 75 ± 5º. Parte B:
Uso de hidrofobinas para revestimento repelente de sujeira sobre superfícies duras
Solução usada:
Os testes de desempenho foram realizados empregando-se uma solução-em-água da proteína de fusão yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 19) preparada de acordo com Exemplo 8. Concentração da hidrofobina em solução: 100 μg/ml (0,01% em peso). Superfície dura empregada:
Azulejo de cerâmica, branco brilhante, 10 cm χ 15 cm (da Novocker), limpado com etanol e água. Sujeira usada:
Os testes foram realizados empregando sujeira de lastro IKW (de acordo com Seifen, Fette, Õle, Wachse (SÒFW) -Journal, Volume 124, 14/98, página 1029) Método de tratamento
Um azulejo continha 2 g da solução aquosa de hidrofobina mencionada acima apresentando uma concentração de 100 μ§/πύ aplicada por gotejamento sobre o mesmo (1,3 μιη de hidrofobina/cm) e distribuída cuidadosamente com um pano para cobrir toda a superfície. O azulejo foi deixado descansar para secar ao ar durante 24 h.
Em seguida, o azulejo foi enxaguado com água e colocado durante 3x10 min em um béquer de vidro com água. Usou-se água fresca em cada enxágüe. Em seguida, o azulejo foi deixado de pé para secar ao ar. Medição do ângulo de contato e efeito repelente de sujeira
O azulejo tratado deu uma medição de ângulo de contato contra uma gotícula de água (S μΐ, método como descrito acima) de 56° (média de 10 medições). Para comparação, um azulejo não tratado apresenta um ângulo de contato de 20°. Assim, o azulejo foi hidrofobizado nitidamente.
O azulejo tratado e, em comparação, um azulejo não tratado, foram manchados individualmente com 50, 100 e 200 μg de sujeira de lastro IKW empregando-se uma pipeta de transferência e deixados secar à temperatura ambiente durante uma hora.
Os azulejos foram então enxaguados 3 vezes com 500 ml de água a cada vez. Embora isto não tenha desprendido a sujeira da superfície não tratada, observou-se desprendimento parcial da sujeira da superfície não tratada no caso do azulejo previamente tratado com hidrofobina.
Assim, o pré-tratamento com hidrofobina levou a uma reduzida adesão da sujeira sobre a superfície do azulejo. LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> BASF Aktiengesellschaft
<120> USO DE HIDROFOBINAS PARA TRATAMENTO REPELENTE-DE-SUJEIRA DE
SUPERFÍCIES DURAS]
<130> PF 56486
<140> PCT/EP2006/061069
<141> 27/03/2006
<150> DE 102005014844.1
DE 102005036341.5 <151> 30/03/2005
29/07/2005 <160> 24
<170> PatentIn versão 3.1 <210> SEQ ID NO:1 <211> 405 <212> DNA
<213> Aspergillus nidulans <220> <221> CDS <222> (1)..(405) <223> <4 00> 1
atg cgc ttc ate gtc tet ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 15 10 15
acc gcc ctc ccg gcc tet gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
ate gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu
50 55 60
age ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240
Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80
ggc age gcc tgc gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
ggc gct ggt acc aag gct gag 405
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135
<210> SEQ ID NO:2 <211> 135 <212> PRT
<213> Aspergillus nidulans <400> 2
Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala 15 10 15
Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser
20 25 30
Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser
35 40 45
Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr 65 70 75 80
Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu
85 90 95
Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val
100 105 110
Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala
115 120 125
Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu 130 135
<210> SEQ ID NO:3 <211> 471 <212> DNA
<213> Aspergillus nidulans
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(471)
<223>
<400> 3
atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ggc aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tet 192
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80
ggt ctt ctg tet ggt gcc ctc age ggc ctc ate ggc gcc ggg tet ggt 288
Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly
85 90 95
gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336
Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala
100 105 110
gtc ctc att ggc ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384
Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn
115 120 125
att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc age gcg gat ggc aac ctt att 432
Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile
130 135 140
ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc ate ctc 471
Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155
<210> SEQ ID NO:4 <211> 157 <212> PRT
<213> Aspergillus nidulans <400> 4
Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val
35 40 45
Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser
50 55 60
Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu 65 70 75 80 Gly Leu Leu Ser Gly 85 Ala Leu Ser Gly Leu 90 Ile Gly Ala Gly Ser 95 Gly Ala Glu Gly Leu 100 Gly Leu Phe Asp Gln 105 Cys Ser Lys Leu Asp 110 Val Ala Val Leu Ile 115 Gly Ile Gln Asp Leu 120 Val Asn Gln Lys Cys 125 Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile 130 135 140 Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu 145 150 155 <210> SEQ ID NO: 5 <211> 336 <212> DNA <213> Agaricus bisporus <220> <221> CDS <222> (1).. (336) <223> <400> 5 atg ate tet cgc gtc Ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc CCC gct Ctt 48 Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 gtt act gea act CCt gct ccc gga aag CCt aaa gcc age agt cag tgc 96 Val Thr Ala Thr 20 Pro Ala Pro Gly Lys 25 Pro Lys Ala Ser Ser 30 Gln Cys gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act CCC gac cac 144 Asp Val Gly 35 Glu Ile His Cys Cys 40 Asp Thr Gln Gln Thr 45 Pro Asp His acc age gcc gcc gcg tet ggt ttg Ctt ggt gtt CCC ate aac Ctt ggt 192 Thr Ser 50 Ala Ala Ala Ser Gly 55 Leu Leu Gly Val Pro 60 Ile Asn Leu Gly gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc CCC att tcc gtc Ctt ggc gtc ggt 240 Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 ggc aac aac tgt gct gct cag CCt gtc tgc tgc aea gga aat caa ttc 288 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 acc gea ttg att aac gct Ctt gac tgc tet CCt gtc aat gtc aac ctc 336 Thr Ala Leu Ile 100 Asn Ala Leu Asp Cys 105 Ser Pro Val Asn Val 110 Asn Leu
<210> SEQ ID NO:β <211> 112 <212> PRT
<213> Agaricus bisporus <400> 6
Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Ala Thr 20 Pro Ala Pro Gly Lys 25 Pro Lys Ala Ser Ser 30 Gln Cys Asp Val Gly 35 Glu Ile His Cys Cys 40 Asp Thr Gln Gln Thr 45 Pro Asp His Thr Ser 50 Ala Ala Ala Ser Gly 55 Leu Leu Gly Val Pro 60 Ile Asn Leu Gly Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly 65 70 75 80 Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe 85 90 95 Thr Ala Leu Ile 100 Asn Ala Leu Asp Cys 105 Ser Pro Val Asn Val 110 Asn Leu
<210> SEQ ID NO:7 <211> 357 <212> DNA <213> Agaricus bisporus
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (357)
<223>
<400> 7
atg gtc age acg ttc ate act gtc gea aag acc ctt etc gtc gcg ctc 48
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 15 10 15
ctc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aag 96
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
cat tgt age acc ggt cct ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tet . 144
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
aag age cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc age cct 240
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80
ate acg gea att ggt att ggc tcc ggc age caa tgc tet ggc cag acc 288
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
act ccc att aat gcc aat gtg 357
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115
<210> SEQ ID NO:8 <211> 119 <212> PRT
<213> Agaricus bisporus <400> 8
Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu 15 10 15
Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys
20 25 30
His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser
35 40 45
Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro 65 70 75 80
Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr
85 90 95
Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys
100 105 110
Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val 115
<210> SEQ ID NO:9 <211> 408 <212> DNA
<213> Schizophyllum communae
<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (408)
<223>
<400> 9
atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe 15 10 15 ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg 96
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
acc ate gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tet tgc tgc Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
aac cag gtt caa tcg gcg age age age cct gtt acc gcc ctc ctc ggc Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly 65 70 75 80
ctg ctc ggc att gtc ctc age gac ctc aac gtt ctc gtt ggc ate age Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
tgc tet ccc ctc act gtc ate ggt gtc gga ggc age ggc tgt tcg gcg Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg ate aac ate Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
ggt tgc acc ccc ate aac ate ctc Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210> SEQ ID NO:10 <211> 136 <212> PRT
<213> Schizophyllum coirununae <400> 10
Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe 1 5 10 15
Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr
20 25 30
Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr
35 40 45
Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys
50 55 60
Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly 65 70 75 80
Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser
85 90 95
Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala
100 105 110
Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile
115 120 125
Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu
130 135
<210> SEQ ID NO:11 <211> 483 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> CDS
<221> CDS
<222> (1)..(483)
<223> Seqüência de hidrofobina artificial com padrão de cisteina
característico
<400> 11
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 1 5 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val 20 25 30 ggc aac Gly Asn
gac Asp
tac
Tyr
65
ctc
Leu
aag
Lys
50
gcc
Ala
ctc Leu
aag ttc cct Lys Phe Pro 35
tgc ggc gac Cys Gly Asp
ggc gac gtc Gly Asp Val
aag Lys
gac Asp
ate Ile 115 gcc Ala
aac Asn
cag Gln 100 cag Gln
ctc ggc ctc Leu Gly Leu
ctc ttc Leu Phe
ate cct Ile Pro
aac ate Asn Ile 130 gtc aac Val Asn 145 atg Met
<210> SEQ ID NO <211> 161 <212> PRT <213> Seqüência <220>
<223> Seqüência característico <4 00> 12 Met Lys Phe Ser 1
Ala Ala Leu Pro 20
Gly Asn Lys Phe 35
Asp Lys Cys Gly 50
Tyr Ala Gly Asp 65
Leu Leu Lys Asn
Leu Phe Asp Gln 100
Ile Pro Ile Gln 115
Asn Ile Ala Cys 130
Val Asn Leu Gly
145
Met
ctc
Leu
85
tgc
Cys
gac Asp
tgc tgc Cys Cys
gtc Val
cag Gln
ctc
Leu
70
ate
Ile
gtc Val
ctc Leu
cag Gln
ggc Gly 150
cct gac gac Pro Asp Asp 40
gcc cag ctc Ala Gln Leu 55
acc gac ate Thr Asp Ile
ggc ggc ggc Gly Gly Gly
aag ctc Lys Leu
ctc Leu
aac Asn 135 aac Asn
aac Asn 120 tcc Ser
cct Pro
gac Asp 105 cag Gln
cct Pro
tgc Cys
gtc acc Val Thr
tcc tgc Ser Cys
gac gag Asp Glu
75 tcc ggc Ser Gly 90
ctc cag Leu Gln
gtc aac Val Asn
tcc gac Ser Asp
ate cct Ile Pro 155
gtc Val
tgc Cys 60 ggc Gly
tcc Ser
ate Ile
aag Lys
gcc Ala 140 gtc Val
aag cag gcc acc Lys Gln Ala Thr 45
aac aag gcc acc Asn Lys Ala Thr
ate Ile
gag Glu
tcc Ser
cag Gln 125 acc Thr
ctc gcc Leu Ala
ggc ctc Gly Leu 95
gtc ate Val Ile 110
tgc aag Cys Lys
ggc Gly 80 ggc Gly
ggc Gly
cag Gln
ggc tcc ctc Gly Ser Leu
tcc ctc ctc cat Ser Leu Leu His 160
144
192
240
288
336
384
432
480
483
: 12
artificial
de hidrofobina artificial com padrão de cisteína
Val Ser 5
Gln His
Pro Val
Asp Gln
Val Leu
70 Leu Ile 85
Cys Val
Asp Leu
Cys Gln
Leu Gly 150
Ala Ala
Asp Ser
Pro Asp 40
Ala Gln 55
Thr Asp
Gly Gly
Lys Leu
Leu Asn 120 Asn Ser 135
Asn Pro
Val
Ala
25
Asp
Leu
Ile
Gly
Asp 105 Gln
Pro
Cys
Leu Ala 10
Ala Gly
Val Thr
Ser Cys
Asp Glu
75 Ser Gly 90
Leu Gln
Val Asn
Ser Asp
Ile Pro 155
Phe Ala
Asn Gly
Val Lys
45 Cys Asn 60
Gly Ile
Ser Glu
Ile Ser
Lys Gln 125 Ala Thr 140
Val Ser
Ala
Asn
30
Gln
Lys
Leu
Gly
Val 110 Cys
Gly
Leu
Ser Val 15
Gly Val
Ala Thr
Ala Thr
Ala Gly 80 Leu Gly 95
Ile Gly
Lys Gln
Ser Leu
Leu His 160
<210> SEQ ID NO:13 <211> 465 <212> DNA
<213> Seqüência artificial <220> CDS <221> CDS <222> (1)..(465)
<223> Seqüência de hidrofobina artificial com padrão de cisteina
característico
<4 00> 13
atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
tac gcc ggc gac gtc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc 240
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80
ctc aag aac ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate 336
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
cct ate cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 384
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115 120 125
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155
<210> SEQ ID NO:14 <211> 155 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Seqüência de hidrofobina artificial com padrão de cisteina
característico
<4 00> 14
Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val 15 10 15
Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val
20 25 30
Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr
35 40 45
Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr
50 55 60
Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu 65 70 75 80
Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu
85 90 95
Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile
100 105 110
Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
115 120 125
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
130 135 140
Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met 145 150 155
<210> SEQ ID NO:15 <211> 882 <212> DNA
<213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(882) <223> <4 00> 15
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg 882 Met Gln Glu Arg Gly Trp 290
<210> SEQ ID NO: 16 <211> 294 <212> PRT
<213> Bacillus subtilis <400> 16
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp 290
<210> SEQ ID NO:17 <211> 591 <212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(591)
<223>
<4 00> 17
atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu 15 10 15
cac ate cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20 25 30
cgt ceg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly 35 40 45 gag age acg acg atg cgc cgt ttg ate gat acg tat caa ttc atg gag 192
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50 55 60
ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80
gcc gga tta att ata tta gea aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85 90 95
cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100 105 110
cag gtt gac age ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
115 120 125
cct ttt act ggg gta ttc ate cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
130 135 140
gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg 480
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala 145 150 155 160
aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa 528
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165 170 175
gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag 576
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
180 185 190
caa aag gea ctt gta 591
Gln Lys Ala Leu Val 195
<210> SEQ ID NO:18 <211> 197 <212> PRT
<213> Bacillus subtilis <400> 18
Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu 15 10 15
His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys
20 25 30
Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly
35 40 45
Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu
50 55 60
Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys 65 70 75 80
Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro
85 90 95
His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg
100 105 110
Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu
115 120 125
Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly
130 135 140
Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala 145 150 155 160
Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu
165 170 175
Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys
180 185 190
Gln Lys Ala Leu Val 195
<210> SEQ ID NO:19 <211> 1329 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> CDS
<221> CDS
<222> (1) .. (1329)
<223> proteína de fusão
<400> 19
atg gct caa aca ggt act gaa Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu 1 5
caa aaa ggc ggc gtc ate atg Gln Lys Gly Gly Val Ile Met 20
ate gct gaa gaa gct gga gct Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala 35
cca gea gat att cgc gcg gct Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala
50
55
aca ate gtg gaa gaa gta atg Thr Ile Val Glu Glu Val Met 65 70
aaa gcg cgt ate gga cat att Lys Ala Arg Ile Gly His Ile 85
ggt gtt gac tat att gat gaa Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu 100
gaa ttt cat tta aat aaa aat Glu Phe His Leu Asn Lys Asn 115
tgc cgt gat ctt ggt gaa gea Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala
130
135
atg ctt cgc aca aaa ggt gag Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu 145 150
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt Val Arg His Met Arg Lys Val 165
atg agt gag gat gag cta atg Met Ser Glu Asp Glu Leu Met 180
tac gag ctt ctt ctt caa att Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile 195
aac ttt gcc gct ggc ggc gta Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val 210 215
atg cag ctt ggt gct gac gga Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly 225 230
tca gac aac cct gct aaa ttt Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe 245
cac ttt act gat tac aaa tta His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu 260
act gea atg aaa ggg att gaa Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu 275
atg caa gaa cgc ggc tgg aga Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg
cgt Arg
gac Asp
gtc
Val
40
gga
Gly
aat Asn
gtt Val
agt Ser
gaa Glu 120 aca Thr
cct Pro
aac Asn
aca Thr
aaa Lys 200 gea Ala
gta Val
gcg Ala
ate Ile
ate Ile 280 tcc Ser
gta aaa Val Lys 10 gtc ate Val Ile 25
gct gta Ala Val
gga gtt Gly Val
gea gta Ala Val
gaa gcg Glu Ala
90 gaa gtt Glu Val 105
tac aca Tyr Thr
cgc cgt Arg Arg
gga aca Gly Thr
gct Ala
gaa Glu 185 aaa Lys
caa Gln 170 gcg Ala
gac Asp
act cca Thr Pro
ttt gtt Phe Val
aaa Lys
gct Ala 265 tca Ser
gea Ala 250 gag Glu
aac Asn
att gaa Ile Glu
cgc Arg
aat Asn
atg Met
gcc Ala
tet
Ser
75
cgt
Arg
ctg Leu
gtt Val
att Ile
ggt Gly 155 gtg Val
aaa Lys
ggc Gly
gct Ala
ggt Gly 235 att Ile
ttg Leu
tta Leu
ggc Gly
gga atg gea gaa atg Gly Met Ala Glu Met 15
gcg Ala
gcg Ala
cgt Arg 60 ate Ile
gtg Val
acg Thr
cct Pro
gcg Ala 140 aat Asn
cgc Arg
aac Asn
aag Lys
gat Asp 220 tet Ser
gtg Val
tca Ser
ctt Leu
cgc Arg
gaa caa Glu Gln
30 cta gaa Leu Glu 45
atg gct Met Ala
ccg gta Pro Val
ctt gaa Leu Glu
ccg gct Pro Ala 110 ttt gtc Phe Val 125
gaa ggt Glu Gly
att gtt Ile Val
aaa gta Lys Val
cta ggt Leu Gly 190 ctt cct Leu Pro 205
gct gct Ala Ala
ggt att Gly Ile
gaa gea Glu Ala
gcg aaa Ala Lys
cgt gtg Arg Val
gac cct Asp Pro
atg gea Met Ala 80 gct atg Ala Met 95
gac gaa Asp Glu
tgt ggc Cys Gly
gct tet Ala Ser
gag Glu
gtt Val 175 gct Ala
gct Ala 160 gcg Ala
cct Pro
gtc gtt Val Val
ctc atg Leu Met
aaa Lys
cca Pro 285 atg Met
gag Glu 270 gaa Glu
cgc Arg
ttt Phe
aca Thr 255 ctt Leu
aaa Lys 240 act Thr
ggt Gly
cag cgt Gln Arg
ttc ate Phe Ile
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912 290 295 300
gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg acc gcc ctc ccg 960
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320
gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg gcg gcc ttc gcc 1008
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325 330 335
aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg ate gct tgc tgc 1056
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
340 345 350
aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg age ggt ctg ctc 1104
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
355 360 365
ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act ggc age gcc tgc 1152
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
370 375 380
gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc gct ctc gtc gac 1200
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp 385 390 395 400
cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc gct tgc tgc cct 1248
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
405 410 415
gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct ggc gct ggt acc 1296
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
420 425 430
aag gct gag gga tct cat cac cat cac cat cac 1329
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
435 440
<210> SEQ ID NO:20 <211> 443 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
proteína de fusão <400> 20
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met 210 215 220 Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Arg Phe Ile
290 295 300
Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Leu Pro 305 310 315 320
Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser Ala Ala Phe Ala
325 330 335
Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser Ile Ala Cys Cys
340 345 350
Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu
355 360 365
Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr Gly Ser Ala Cys
370 375 380
Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu Ala Leu Val Asp 385 390 395 400
His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val Ala Cys Cys Pro
405 410 415
Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala Gly Ala Gly Thr
420 425 430
Lys Ala Glu Gly Ser His His His His His His
435 440
<210> SEQ ID NO:21 <211> 1395 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> CDS
<221> CDS
<222> (1) .. (1395)
<223> proteína de fusão
<400> 21
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser 130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala
145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 57 6
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys
225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc gcg gcc ctc cct 960
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro
305 310 315 320
cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt ggc aac aag ggc 1008
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325 330 335
aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg acc gtc aag cag 1056
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340 345 350
gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct tgc tgc aac aag 1104
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355 360 365
gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag ggt ctt ctg tct 1152
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370 375 380
ggt gcc ctc age ggc ctc ate ggc gcc ggg tct ggt gcc gaa ggt ctt 1200
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu
385 390 395 400
ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct gtc ctc att ggc 1248
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405 410 415
ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac att gcc tgc tgc 1296
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420 425 430
cag aac tcc ccc tcc age gcg gat ggc aac ctt att ggt gtc ggt ctc 1344
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu
435 440 445
cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc ate ctc gga tct cat cac cat cac cat 1392
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His
450 455 460 cac 1395 His 465
<210> SEQ ID NO:22 <211> 465 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
<223> proteína de fusão <400> 22
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Gly
325 330 335
Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val Thr Val Lys Gln
340 345 350
Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys
355 360 365
Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu Gly Leu Leu Ser
370 375 380
Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly Ala Glu Gly Leu 385 390 395 400
Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala Val Leu Ile Gly
405 410 415
Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys Cys
420 425 430
Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu 435 440 445
Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His 450 455 460
His 465
<210> SEQ ID NO:23 <211> 1407 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> CDS
<221> CDS
<222> (1)..(1407)
<223> proteína de fusão
<400> 23
atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 15 10 15
caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly
115 120 125
tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tet 432
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 57 6
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tet ggt att ttt aaa 720
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 7 68
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816 His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
atg caa gaa cgc ggc tgg aga tet att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325 330 335
cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340 345 350
gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355 360 365
gtc ctc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
370 375 380
ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400
tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate cct ate cag 1248
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
405 410 415
gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 1296
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420 425 430
tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435 440 445
ctc ggc aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tet cat 1392
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450 455 460
cac cat cac cat cac 1407
His His His His His 465
<210> SEQ ID NO:24 <211> 469 <212> PRT
<213> Seqüência artificial <220>
proteína de fusão <400> 24
Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met 1 5 10 15
Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys
20 25 30
Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val
35 40 45
Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro
50 55 60
Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala 65 70 75 80
Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met
85 90 95
Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu
100 105 110
Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly 115 120 125
Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser
130 135 140
Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala 145 150 155 160
Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala
165 170 175
Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val
195 200 205
Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met
210 215 220
Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys 225 230 235 240
Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr
245 250 255
His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly
260 265 270
Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg
275 280 285
Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser
290 295 300
Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro 305 ' 310 315 320
Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe
325 330 335
Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly
340 345 350
Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp
355 360 365
Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn
370 375 380
Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln 385 390 395 400
Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln
405 410 415
Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys
420 425 430
Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly
435 440 445
Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His
450 455 460
His His His His His 465

Claims (17)

1. Uso de hidrofobinas, caracterizado pelo fato de que é para tratamento repelente de sujeira de uma superfície dura.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido tratamento repelente de sujeira é efetuado em combinação com um limpador de superfície.
3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que referido tratamento é realizado usando um agente de limpeza compreendendo pelo menos uma hidrofobina, um tensoativo e também um solvente.
4. Processo para tratar superfícies duras de forma a repelir sujeira, caracterizado pelo fato de que compreende contatar referida superfície com uma composição compreendendo pelo menos uma hidrofobina e também um solvente.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que referida composição compreende um agente de limpeza compreendendo pelo menos uma hidrofobina, um tensoativo e também um solvente.
6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a quantidade de hidrofobina em referida composição situa-se na faixa de 0,0001% a 1% em peso com base na soma total de todos os constituintes de referida composição.
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -4 a 6, caracterizado pelo fato de que referido tratamento é efetuado a temperaturas abaixo de 30°C.
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -4 a 7, caracterizado pelo fato de que referida hidrofobina compreende pelo menos uma hidrofobina de fusão.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de -4 a 8, caracterizado pelo fato de que referida superfície compreende uma superfície doméstica.
10. Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que referida superfície dura compreende uma superfície dura selecionada do grupo que consiste de superfícies de azulejos, pisos, armações, lavatórios, duchas, banheiras, vasos sanitários, cabines de ducha, móveis de banheiro, móveis, espelhos, louça, cutelaria, vidros, artigos de porcelana ou as superfícies de utilidades domésticas.
11. Agente de limpeza para uma superfície dura, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma hidrofobina, pelo menos um tensoativo e também um solvente.
12. Agente de limpeza de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos um solvente compreende água.
13. Agente de limpeza de acordo com a reivindicação 11 ou -12, caracterizado pelo fato de que a quantidade de hidrofobina situa-se na faixa de 0,0001% a 1% em peso com base na soma total de todos os constituintes do agente de limpeza.
14. Agente de limpeza de acordo com a reivindicação 11 ou -12, caracterizado pelo fato de que a quantidade de hidrofobina situa-se na faixa de 0,001% a 0,1% em peso com base na soma total de todos os constituintes do agente de limpeza.
15. Superfície dura compreendendo um revestimento repelente de sujeira, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma hidrofobina.
16. Superfície dura de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida por meio de um processo como definido em qualquer uma das reivindicações de 4 a 10.
17. Superfície dura de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que referida superfície dura é uma superfície dura selecionada do grupo de superfícies de azulejos, pisos, armações, lavatórios, duchas, banheiras, vasos sanitários, cabines de ducha, móveis de banheiro, móveis, espelhos, louças, cutelaria, vidros, artigos de porcelana ou as superfícies de utilidades domésticas.
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