BRPI0608681A2 - uso de pelo menos uma hidrofobina, processo para estabilizar fases lìquidas em uma composição compreendendo pelo menos duas fases lìquidas, e, formulação - Google Patents

Abstract

USO DE PELO MENOS UMA HIDROFOBlNA, PROCESSO PARA ESTABILIZAR FASES LìQUIDAS EM UMA COMPOSIçãO COMPREENDENDO PELO MENOS DUAS FASES LìQUIDAS, E, FORMULAçãO. A invenção diz respeito a hidrofobinas que são especialmente adequados para estabilizar sistemas líquidos de duas fases.

Description

"USO DE PELO MENOS UMA HIDROFOBINA, PROCESSO PARAESTABILIZAR FASES LÍQUIDAS EM UMA COMPOSIÇÃOCOMPREENDENDO PELO MENOS DUAS FASES LÍQUIDAS, E,FORMULAÇÃO"

A presente invenção diz respeito ao uso de hidrofobina e/ouum de seus derivados para estabilização de fases em composições quecompreendem pelo menos duas fases líquidas, especialmente óleo e água.

As hidrofobinas são proteínas pequenas de cerca de 100 a 150aminoácidos, que são características de fungos filamentosos, por exemplo, deSchizophyllum commune. Estas têm, geralmente, 8 unidades de cisteína.

As hidrofobinas têm uma afinidade marcada por interfaces esão, portanto, adequadas para o revestimento de superfícies, por exemplo, afim de alterar as propriedades das interfaces pela formação de membranasanfipáticas. Por exemplo, Teflon pode ser revestido por meio de hidrofobinaspara obter uma superfície hidrofílica.

As hidrofobinas podem ser isoladas de fontes naturais. Alémdisso, os processos de produção para hidrofobinas e seus derivados sãoconhecidos. Por exemplo, o pedido de patente alemã DE 10 2005 007 480divulga um processo de produção para hidrofobinas e derivados destas.

A técnica anterior já propôs o uso de hidrofobinas para váriasaplicações.

O WO 96/4IB 82 propõe o uso de hidrofobinas comoemulsificantes, espessantes, substâncias ativas de superfície, para ahidrolisação de superfícies hidrofóbicas, para melhorar a resistência da águade substratos hidrofílicos, para a produção de emulsões óleo em água ouemulsões água em óleo. Também propostas são as aplicações farmacêuticas,tais como, a produção de ungüentos ou cremes, e aplicações cosméticas, taiscomo, proteção de pele ou a produção de xampus ou enxágües capilares. AWO 96/41882 adicionalmente descreve composições, especialmentecomposições para aplicações farmacêuticas, que compreendem hidrofobinas.

EP-A 1 252 516 divulga o revestimento de janelas, lentes decontato, biossensores, dispositivos médicos, recipientes para realização detestes ou para armazenamento, cascos de navio, partículas sólidas ouestruturas ou chassi de veículos de passageiro com uma solução quecompreende hidrofobina em uma temperatura de 30 a 80°C.

A WO 03/53383 descreve o uso de hidrofobina para otratamento de materiais de queratina em aplicações cosméticas.

A WO 03/10331 divulga que as hidrofobinas têm propriedadestensoativas. Por exemplo, um sensor revestido de hidrofobina é divulgado,por exemplo, um elétrodo de teste ao qual substâncias adicionais, porexemplo, substâncias eletroativas, anticorpos ou enzimas, são ligados nãocovalentemente.

A WO 2004/000880 apresenta o revestimento de superfíciescom hidrofobina ou substâncias semelhantes à hidrofobina.

A WO 01/74864, que diz respeito a proteínas semelhantes àhidrofobina, também determina que estas podem ser usadas para estabilizardispersões e emulsões.

O uso de proteínas para separação de fase também é conhecidoa princípio.

Por exemplo, EP-A 05 016 962 descreve o uso de proteínaspara melhorar a separação de fase de, por exemplo, óleo/água ou misturas decombustível/água. E conhecido por aqueles habilitados na técnica que, asmoléculas anfifílicas, dependendo da concentração de uso e meio adjacente,podem ter efeitos estabilizantes ou desestabilizantes nas interfaces de fase.

GB 195.876 divulga um processo para a quebra de emulsõeságua em óleo usando-se colóides. Os colóides mencionados são, por meio deexemplo, proteínas, tais como, gelatinas, caseína, albumina oupolissacarídeos, tais como, goma arábica ou goma tragacanto.JP-A 11-169177 descreve o uso de proteínas com atividade delipase para a quebra de emulsões.

WO 01/60916 divulga o uso de misturas isentas de tensoativode pelo menos uma proteína solúvel em água, pelo menos um polissacarídeosolúvel em água e pelo menos um polímero solúvel em água, por exemplo,óxido de polietileno, para vários usos, incluindo também para adesemulsificação de óleo bruto.

Entretanto, nenhum dos documentos citados divulga o uso dehidrofobinas para prevenir a re-emulsificação.

O uso de proteínas tem a vantagem geral que estas sãosubstâncias de ocorrência natural que são biodegradáveis e por esta razão nãoconduzem à poluição permanente do meio ambiente.

Em muitas aplicações na escala industrial, por exemplo, naseparação de emulsões de óleo bruto-água, um fator importante é a separaçãode fase muito rápida e um outro é a anulação ou prevenção de uma re-emulsificação das fases. É um objetivo da invenção fornecer um processomelhorado para estabilizar as fases pelo uso de proteínas.

De acordo com a invenção, este objetivo é alcançado pelo usode pelo menos uma hidrofobina em composições que compreendem pelomenos duas fases líquidas, especialmente óleo e água.

De acordo com a invenção, a hidrofobina pode ser, a princípio,usada em qualquer quantidade, contanto que seja garantido que aestabilização de fase nas composições que compreendem pelo menos duasfases líquidas seja melhorada.

No contexto da presente invenção, "o melhoramento naestabilização de fase" é entendido significar que a re-emulsificação de duasfases líquidas no caso de adição de uma substância a uma mistura procedemais lentamente do que na mesma mistura sem a adição da substância ou, quea adição da substância previne a re-emulsificação de duas fases líquidas.No contexto da presente invenção, uma hidrofobina também éentendida significar derivados desta ou hidrofobinas modificadas. Ashidrofobinas modificadas ou derivatizadas, por exemplo, podem ser proteínasde fusão de hidrofobina ou proteínas que tenham uma seqüência deaminoácido que tem pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 70 %, emparticular pelo menos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, especiale preferivelmente pelo menos 95 % de identidade com a seqüência de umahidrofobina, e que também satisfaz as propriedades biológicas de umahidrofobina até um ponto de 50 %, por exemplo, até um ponto de 60 %, emparticular até um ponto de 70 %, mais preferivelmente até um ponto de 80 %,especialmente as propriedades a fim de que as propriedades de superfíciesejam alteradas pelo revestimento com estas proteínas tal que o ângulo decontato de uma gotícula antes e depois do revestimento de uma superfície devidro com a proteína é aumentado em pelo menos 20°, preferivelmente empelo menos 25°, em particular, em pelo menos 30°.

Foi observado que, surpreendentemente, as hidrofobinas ou osderivados destas reduzem ou previnem a nova formação de emulsões depoisda separação de fase ser completada. Isto é especialmente vantajoso quandohá existência prolongada de duas fases junto uma da outra ou a ocorrência denovas emulsões deve ser prevenida. Neste contexto, mesmo pequenasquantidades de hidrofobina são extremamente eficazes.

Para a definição de hidrofobinas, o que é crucial é aespecificidade estrutural e não a especificidade de seqüência das hidrofobinas.A seqüência de aminoácido das hidrofobinas naturais é muito diversa, mastodas têm um padrão altamente característico de 8 resíduos de cisteínaconservados. Estes resíduos formam quatro pontes de dissulfetointramoleculares.

O término N e término C são variáveis em uma faixarelativamente ampla. E possível aqui adicionar nas proteínas parceiras defusão que têm um comprimento de 10 a 500 aminoácidos por meio detécnicas de biologia molecular conhecidas por aqueles habilitados na técnica.

Além disso, as hidrofobinas e os derivados destas sãoentendidos no contexto da presente invenção para significar proteínas comuma estrutura similar e equivalência funcional.

No contexto da presente invenção, o termo "hidrofobinas"deve ser entendido, a seguir, para significar polipeptídeos da fórmulaestrutural geral (I)

<formula>formula see original document page 6</formula>

onde X pode ser qualquer um dos 20 aminoácido que ocorremnaturalmente (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, Gln, Arg, Ile Met, Thr,Asn, Lys, Vai, Ala, Asp, Glu, Gly). Na fórmula, X pode ser o mesmo oudiferente em cada caso. Os índices junto a X são, cada um, o número deaminoácidos, C é cisteína, alanina, serina, glicina, metionina ou treonina,onde pelo menos quatro dos resíduos designados com C são cisteína e, osíndices nem são, cada um, independentemente, números naturais entre 0 e500, preferivelmente entre 15 e 300.

Os polipeptídeos da fórmula (I) também são caracterizadospelas propriedades que, em temperatura ambiente, depois do revestimento deuma superfície de vidro, ocasionam um aumento no ângulo de contato de umagotícula de pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25° e maispreferivelmente 30°, comparado, em cada caso, com o ângulo de contato deuma gotícula de água igualmente grande com a superfície de vidro nãorevestida.

Os aminoácidos designados com CaC são preferivelmentecisteínas; entretanto, também podem ser substituídos por outros aminoácidoscom enchimento de espaço similar, preferivelmente por alanina, serina,treonina, metionina ou glicina. Entretanto, pelo menos quatro, preferivelmentepelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6 e, em particular pelo menos7 das posições C1 a C8 deve consistir de cisteínas. Nas proteínas inventivas, ascisteínas podem estar presentes na forma reduzida ou formar pontes dedissulfeto uma com a outra. Preferência particular é dada à formaçãointramolecular de pontes C-C5 especialmente aquelas com pelo menos umaponte de dissulfeto intramolecular, preferivelmente 2, mais preferivelmente 3e mais preferivelmente 4 pontes de dissulfeto intramoleculares. No caso datroca descrita acima de cisteínas por aminoácidos com enchimento de espaçosimilar, tais posições C são vantajosamente trocados em pares que podemformar pontes de dissulfeto intramoleculares um com o outro.

Se cisteínas, serinas, alaninas, glicinas, metioninas outreoninas também são usadas nas posições designadas com X, a numeraçãodas posições C individuais nas fórmulas gerais pode mudarcorrespondentemente.

Preferência é dada para usar hidrofobinas da fórmula geral (II)Xn-C1-X3-25-C2-X0-2-C3-X5-50-C4-X2-35-C5-X2-l5-C6-Xo-2-C7-X3-35-C8-Xm (II)para realizar a presente invenção, onde X, C e os índices juntoa X e C são cada um, como definido acima, os índices nem são, cada um,números entre O e 300 e, as proteínas adicionalmente caracterizam a mudançailustrada acima no ângulo de contato, e, além disso, pelo menos 6 dosresíduos designados com C são cisteína. Mais preferivelmente, todos osresíduos C são cisteínas.

Preferência particular é dada para usar hidrofobinas dafórmula geral (III)

Xn-C1-X5.9-C2-C3-Xn.39-C4-X2-23-C5-X5-9-C6-C7-X6.i8-C8-Xm (III)

onde X, C e os índices junto a X são, cada um, como definidosacima, os índices nem são, cada um, números entre 0 e 200 e, as proteínasadicionalmente caracterizam a mudança ilustrada acima no ângulo de contatoe, pelo menos 6 dos resíduos designados com C são cisteína. Maispreferivelmente, todos os resíduos C são cisteínas.Os resíduos Xn e Xm podem ser seqüências de peptídeo quenaturalmente também são unidas a uma hidrofobina. Entretanto, um ou ambosos resíduos também podem ser seqüências de peptídeos que são naturalmentenão unidas a uma hidrofobina. Isto também é entendido significar aquelesresíduos Xn e/ou Xm em que uma seqüência de peptídeo que ocorrenaturalmente em uma hidrofobina é alongada por uma seqüência de peptídeoque não ocorre naturalmente em uma hidrofobina.

Se Xn e/ou Xm são seqüências de peptídeos que não sãonaturalmente ligados em hidrofobinas, tais seqüências são, geralmente, pelomenos 20, preferivelmente pelo menos 35, mais preferivelmente pelo menos50 e mais preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos no comprimento. Umtal resíduo que não é unido naturalmente a uma hidrofobina também seráreferido a seguir como um parceiro de fusão. Este é pretendido para expressarque as proteínas podem consistir de pelo menos uma porção de hidrofobina euma porção parceiro de fusão que não ocorre junto nesta forma in nature.

A porção parceiro de fusão pode ser selecionada de umamultidão de proteínas. Também é possível para uma pluralidade de parceirosde fusão ser unida a uma porção hidrofobina, por exemplo, no terminal amino(Xn) e no terminal carboxila (Xm) da porção hidrofobina. Entretanto, tambémé possível, por exemplo, para dois parceiros de fusão ser unidos a umaposição (Xn ou Xm) da proteína inventiva.

Os parceiros de fusão particularmente adequados são proteínasde ocorrência natural em microorganismos, especialmente em E. coli ouBacillus subtilis. Os exemplos de tais parceiros de fusão são as seqüênciasyaad (SEQ ID NO: 15 e 16), yaae (SEQ ID NO: 17 e 18), e tiorredoxina.Também muito adequados são os fragmentos ou derivados destas seqüênciasque compreendem apenas certa quantidade, por exemplo, de 70 a 99 %,preferencialmente de 5 a 50 % e mais preferivelmente de 10 a 40 % dasseqüências mencionadas, ou em que os aminoácidos individuais ounucleotídeos foram alterados comparados à seqüência mencionada, no casoque as porcentagens são, cada uma, com base no número de aminoácidos.

Em uma forma de realização preferida adicional, a hidrofobinade fusão, assim como o parceiro de fusão como um grupo Xn ou Xm, tambémtem um domínio de afinidade assim chamado (rótulo de afinidade / cauda deafinidade). De uma maneira conhecida, a princípio, isto compreende gruposâncoras que podem interagir com grupos complementares particulares epodem servir para elaboração mais fácil e purificação das proteínas. Osexemplos de tais domínios de afinidade compreendem grupos (His)k, (Arg)k,(Asp)k, (Phe)k ou (Cys)k, onde k é geralmente um número natural de 1 a 10.Pode ser preferivelmente um grupo (His)k, onde k é de 4 a 6.

As proteínas usadas de acordo com a invenção comohidrofobinas ou derivados destes também podem ser modificadas em suaseqüência de polipeptídeo, por exemplo, por glicosilação, acetilação ou entãopor reticulação química, por exemplo, com glutaraldeído.

Uma propriedade das hidrofobinas ou derivados destas usadasde acordo com a invenção é a mudança nas propriedades de superfície quandoas superfícies são revestidas com as proteínas. A mudança nas propriedadesde superfície pode ser determinada experimentalmente, por exemplo, pelamedição do ângulo de contato de uma gotícula antes e depois do revestimentoda superfície com a proteína e pela determinação da diferença das duasmedições.

O desempenho das medições do ângulo de contato é conhecidoa princípio por aqueles habilitados na técnica. As medições são com base natemperatura ambiente e gotícuias de água de 5 μΐ e o uso de placas de vidrocomo substratos. As condições experimentais exatas para um exemplo de ummétodo adequado para a medição do ângulo de contato são dadas na seçãoexperimental. Sob as condições mencionadas neste, as proteínas de fusãousada de acordo com a invenção tem a propriedade de aumentar o ângulo decontato em pelo menos 20°, preferivelmente pelo menos 25°, maispreferivelmente pelo menos 30°, comparado em cada caso com o ângulo decontato de uma gotícula de água igualmente grande, com a superfície de vidronão revestida.

As hidrofobinas particularmente preferidas para a realizaçãoda presente invenção são as hidrofobinas do tipo dewA, rodA, hypA, hypB,sc3, basfl, bas£2, que são estruturalmente caracterizadas na listagem deseqüência que segue. Também podem ser apenas partes ou derivados destes.Também é possível para uma pluralidade de porções de hidrofobina,preferivelmente 2 ou 3, de estrutura idêntica ou diferente ser ligada uma àoutra e ser ligada a uma seqüência de polipeptídeo adequada, correspondenteque não é ligada a uma hidrofobina in nature.

Também, particularmente adequadas, de acordo com a invenção, são as proteínas de fusão yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20),yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24),com as seqüências de polipeptídeo especificadas em suportes e as seqüênciasde ácido nucléico que então codificam especialmente as seqüências de acordocom as SEQs ID NOs: 19, 21, 23. As proteínas que, procedem das seqüênciasde polipeptídeo mostradas nas SEQs ID NOs. 20, 22 ou 24, originam-se datroca, inserção ou anulação de pelo menos um, até 10, preferivelmente 5aminoácidos, mais preferivelmente 5 % de todos os aminoácidos e, que aindatem a propriedade biológica das proteínas de partida até um ponto de pelomenos 50 %, também são formas de realização particularmente preferidas.Uma propriedade biológica das proteínas é entendida aqui significar amudança no ângulo de contato em pelo menos 20°, que já foi descrito.

Os derivados particularmente adequados para a realização dainvenção são resíduos derivados de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20),yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xabasfl-his (SEQ ID NO: 24)pela truncagem do parceiro de fusão yaad. No lugar do parceiro de fusão yaadcompleta (SEQ ID NO: 16) com 294 aminoácidos, pode ser vantajoso usarum resíduo yaad truncado. O resíduo truncado deve, entretanto, compreenderpelo menos 20, mais preferivelmente pelo menos 35 aminoácidos. Porexemplo, um radical truncado que tem de 20 a 293, preferivelmente de 25 a250, mais preferivelmente de 35 a 150 e, por exemplo, de 35 a 100aminoácidos pode ser usado.

Um sítio de clivagem entre a hidrofobina e o parceiro de fusãoou os parceiros de fusão podem ser utilizados para liberar a hidrofobina purana forma não derivatizada (por exemplo, pela clivagem de BrCN emmetionina, clivagem de fator Xa, clivagem de enterocinase, clivagem detrombina, clivagem de TEV, etc.).

Também é possível gerar proteínas de fusão na sucessão de umparceiro de fusão, por exemplo, yaad ou yaae e, uma pluralidade dehidrofobinas, mesmo de seqüência diferente, por exemplo, DewA-RodA ouSc3-DewA, Sc3-RodA. É igualmente possível usar fragmentos de hidrofobina(por exemplo, truncagens de terminal N ou C) ou muteína que têm até 70 %de homologia. As construções ótimas são, em cada caso, selecionadas emrelação ao uso particular, isto é, fase líquida a ser separada.

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção ou presentesnas composições inventivas podem ser quimicamente preparadas por métodosconhecidos de síntese de peptídeo, por exemplo, pela síntese de fase sólidaMerrifield.

As hidrofobinas de ocorrência natural podem ser isoladas defontes naturais por meio de métodos adequados. Referência é feita por meiode exemplo por Wõsten et. ai, Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) ou WO96/41882.

As proteínas de fusão podem ser preparadas preferivelmentepor métodos de engenharia genética, em que uma seqüência de ácidonucléico, especialmente seqüência de DNA, que codifica o parceiro de fusão euma que codifica a porção de hidrofobina são combinadas de um tal modoque a proteína desejada é gerada em um organismo hospedeiro como umresultado de expressão de gene da seqüência de ácido nucléico combinada.Um tal processo de preparação é divulgado, por exemplo, no pedido depatente alemã DE 102005007480.4.

Os organismos hospedeiros adequados (organismos deprodução) para o método de preparação mencionado podem ser procariotas(incluindo a Archaea) ou eucariotas, particularmente bactérias incluindohalobactérias e metanocócica, fungos, células de inseto, células de planta ecélulas de mamíferos, mais preferivelmente Escheriehia eoli, Bacillussubtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Piehia pastoris, Pseudomonas spee., lactobacilos,Hansenula polimorfa, Triehoderma reesei, SF9 (ou células relacionadas),entre outras.

Os estudos também dizem respeito ao uso de construções deexpressão que compreendem, sob o controle genético de seqüências de ácidonucléico reguladoras, uma seqüência de ácido nucléico que codifica umpolipeptídeo usado de acordo com a invenção, e também vetores quecompreendem pelo menos uma destas construções de expressão.

As construções usadas, preferivelmente compreendem, 5' amontante da seqüência de codificação particular, um promotor e, 3' a jusante,uma seqüência de terminação e, se apropriado, elementos reguladoreshabituais adicionais, em cada caso, ligados operativamente à seqüência decodificação.

No contexto da presente invenção, uma "ligação operante" éentendida significar o arranjo seqüencial de promotor, seqüência decodificação, terminação e, se apropriado, elementos reguladores adicionais,tais que, cada um dos elementos reguladores possa satisfazer sua função comopretendido na expressão da seqüência de codificação.Os exemplos de seqüências operativamente ligáveis sãoseqüências alvo, e também intensificadores, sinais de poliadenilação e outros.Os elementos reguladores adicionais compreendem marcadores selecionáveis,sinais de amplificação, origens de reprodução e outros. As seqüênciasreguladoras adequadas são, por exemplo, descritas em Goeddel, GeneExpression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, SanDiego, CA (1990).

Além dessas seqüências de regulação, a regulação naturaldestas seqüências ainda pode estar presente a montante dos genes estruturaispresentes e, se apropriado, ser geneticamente modificada a fim de desligar aregulação natural e aumentar a expressão dos genes.

Uma construção de ácido nucléico preferido tambémcompreende vantajosamente uma ou mais seqüências assim chamadas de"intensificadoras", funcionalmente unidas ao promotor, que permite aexpressão aumentada da seqüência de ácido nucléico. Também naextremidade 3' das seqüências de DNA, é possível que seqüências adicionaisvantajosas sejam inseridas, tais como, elementos reguladores adicionais outerminações.

Os ácidos nucléicos podem estar presente na construção deuma ou mais cópias. Também é possível que marcadores adicionais, taiscomo, resistências à antibióticos ou genes que complementam auxotrofias,estejam presentes na construção, se apropriado para a seleção na construção.

As seqüências de regulação vantajosas para a preparação estãopresentes, por exemplo, em promotores tais como, cos, tac, trp, tet, trp-tet,lpp, lac, lpp-lac, laclq-T7, T5, T3, gal, trc, ara, rhaP(rhaPBAD) SP6, lambda-PR ou promotor imlambda-P, que vantajosamente constata uso em bactériasGram-negativas. Além disso, as seqüências de regulação vantajosas estãopresentes, por exemplo, nos promotores Gram-positivos amy e SP02, e nospromotores de levedura e fungicos ADC1, MFalfa, AC, P-60, CYC1,GAPDH, TEF, rp28, ADH.

Também é possível usar promotores sintéticos para aregulação.

Para a expressão em um organismo hospedeiro, a construçãode ácido nucléico é vantajosamente inserida em um vetor, por exemplo, umplasmídeo ou um fago que permite expressão ótima dos genes no hospedeiro.

A parte de plasmídeos e fagos, vetores também são entendidos significartodos os outros vetores conhecidos por aqueles habilitados na técnica, porexemplo, vírus, tais como, SV40, CMV, baculovírus e adenovírus,transposons, elementos IS, fasmídeos, cosmídeos e, DNA linear ou circular e,também o sistema Agrobacterium.

Estes vetores podem ser autonomamente duplicados noorganismo hospedeiro ou cromossomicamente duplicado. Os plasmídeosadequados são, por exemplo, em E. coli pLG338, pACYC184, pBR322,pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHSl, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2,pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, ρΙΝ-ΙΙΓ'3-Bl, tgtll ou pBdCI, emStreptomyces pIJlOl, pIJ364, WM2 ou pIJ361, em Bacillus pUBllO, pC194ou pBD214, em Corynebaeterium pSA77 ou pAJ667, em fungos pALSl,pIL2 ou pBBl 16, em leveduras 2alfa, pAG-1, YEp6, YEp 13 ou pEMBLYe23ou em plantas pLGV23, pGHlac+, ρΒ1Ν19, pAK2004 ou pDH51. Osplasmídeos mencionados constituem uma pequena seleção dos plasmídeospossíveis. Os plasmídeos adicionais são conhecidos por aqueles habilitados natécnica e podem ser, por exemplo, retirados do livro Cloning Vectors (Eds.Pouwels Ρ. H. et al. Elsevier, Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985, ISBN O444 904018).

Vantajosamente, a construção de ácido nucléico, para aexpressão dos genes adicionais presentes, adicionalmente tambémcompreendem seqüências reguladoras de terminal 3' e/ou 5' para intensificara expressão, que são selecionadas para expressão ótima dependendo doorganismo hospedeiro e gene ou genes selecionados.

Estas seqüências reguladoras são pretendidas por permitir aexpressão controlada dos genes e da expressão de proteína. Dependendo doorganismo hospedeiro, pode significar, por exemplo, que o gene é expresso ousuperexpresso apenas depois da indução ou, que é expresso e/ousuperexpresso imediatamente.

As seqüências ou fatores reguladores podem influenciarpreferível e positivamente e, desse modo, aumentar a expressão de gene dosgenes introduzidos. Desse modo, uma amplificação dos elementosreguladores pode ser, vantajosamente realizada no nível de transcriçãousando-se sinais de transcrição fortes, tais como, promotores e/ouintensificadores. Além disso, também é possível intensificar a tradução, porexemplo, melhorando-se a estabilidade do mRNA.

Em uma forma de realização adicional do vetor, o vetor quecompreende a construção de ácido nucléico ou o ácido nucléico também podeser, vantajosamente, introduzido nos microorganismos na forma de um DNAlinear e ser integrado no genoma do organismo hospedeiro por meio derecombinação heteróloga ou homóloga. Este DNA linear pode consistir de umvetor linearizado, tal como, um plasmídeo ou apenas da construção de ácidonucléico ou do ácido nucléico.

Para uma expressão ótima de genes heterólogos emorganismos, é vantajoso alterar as seqüências de ácido nucléico de acordocom o "uso de códon" específico usado no organismo. O "uso de códon" podeser facilmente determinado com referência às avaliações de computador deoutros genes conhecidos do organismo em questão.

Um cassete de expressão é preparado pela fusão de umpromotor adequado com uma seqüência de nucleotídeo de codificaçãoadequada e um sinal de terminação ou sinal de poliadenilação. Para estafinalidade, a recombinação comum e as técnicas de clonagem são usadas,como descrito, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY (1989) e em T. J. Silhavy, M. L. Berman e L. W.Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, NY (1984) e em Ausubel, F. M. et al., Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience (1987).

Para a expressão em um organismo hospedeiro adequado, aconstrução de ácido nucléico recombinante ou a construção de gene évantajosamente inserida em um vetor específico de hospedeiro que permiteuma expressão ótima dos genes no hospedeiro. Os vetores são bemconhecidos por aqueles habilitados na técnica e podem ser retirados, porexemplo, de "Cloning Vectors" (Pouwels Ρ. H. et al., eds., Elsevier,Amsterdam-Nova Iorque-Oxford, 1985).

Com o auxílio de vetores, é possível preparar microorganismosrecombinantes que foram transformados, por exemplo, com pelo menos umvetor e podem ser usados para a produção das hidrofobinas ou derivadosdestas usados de acordo com a invenção. Vantajosamente, as construçõesrecombinantes descritas acima são introduzidas em um sistema hospedeiroadequado e expresso. Preferência é dada para o uso de métodos de clonagem etransfecção familiares àqueles habilitados na técnica, por exemplo, co-precipitação, fusão protoplástica, eletroporação, transfecção retroviral eoutros, a fim de realizar a expressão dos ácidos nucléicos mencionados nosistema de expressão particular. Os sistemas adequados são descritos, porexemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., ed.,Wiley Interscience, Nova Iorque 1997, ou Sambrook et al. MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.

Também é possível preparar homologamente microorganismosrecombinados. Para esta finalidade, um vetor é preparado, o qual compreendepelo menos uma seção de um gene a ser usado ou uma seqüência decodificação, em que, se apropriado, pelo menos uma anulação, adição ousubstituição de aminoácido foi introduzida a fim de mudar, por exemplo, pararomper funcionalmente, a seqüência (vetor "silenciado"). A seqüênciaintroduzida também pode ser, por exemplo, um homólogo de ummicroorganismo relacionado ou ser derivado de uma fonte de mamífero,levedura ou inseto. O vetor usado para a recombinação homóloga,alternativamente, pode ser configurado tal que, o gene endógeno no caso derecombinação homóloga foi mutado ou alterado de um outro modo, mas aindacodifica a proteína funcional (por exemplo, a região reguladora a montantepode ser alterada, tal que, a expressão da proteína endógena é alterada). Aseção alterada do gene usado de acordo com a invenção está no vetor derecombinação homóloga. A construção de vetores adequados para arecombinação homóloga é descrita, por exemplo, em Thomas, K. R. eCapecchi, Μ. H. (1987) Cell 51: 503.

A princípio, todos os organismos procarióticos ou eucarióticossão úteis como organismos hospedeiros recombinantes para tais ácidosnucléicos ou, construções de ácidos nucléicos. Vantajosamente, osorganismos hospedeiros usados são microorganismos, tais como, bactérias,fungos ou leveduras.

Vantajosamente, as bactérias Gram-positivas ou Gram-negativas são usadas, preferivelmente as bactérias das famíliasEnterobacteriaceae, Pseudomonadaeeae, Rhizobiaceae, Streptomycetaeeaeou Noeardiaeeae, mais preferivelmente bactérias dos gêneros Eseherichia,Pseudomonas, Streptomyees, Noeardia, Burkholderia, Salmonella,Agrobaeterium ou Rhodococcus.

Os organismos usados nos processos de preparação descritosacima para proteínas de fusão são, dependendo do organismo hospedeiro,desenvolvidos ou cultivados de uma maneira conhecida por aqueleshabilitados na técnica. Os microorganismos são geralmente desenvolvidos emum meio líquido que compreende uma fonte de carbono, usualmente na formade açúcares, uma fonte de nitrogênio, usualmente na forma de fontes denitrogênio orgânico, tais como, extratos de levedura ou sais, tais como, sulfatode amônio, microelementos, tais como, sais de ferro, manganês e magnésio, etambém, se apropriado, vitaminas, em temperaturas entre O e IOO0C,preferivelmente entre IOa 60°C, com aspersão de oxigênio. O pH do líquidonutriente pode ser mantido em um valor fixo, quer dizer, é regulado ou nãodurante o crescimento. O crescimento pode ser realizado por batelada,semibatelada ou continuamente. Os nutrientes podem ser introduzidos nocomeço da fermentação ou ser reabastecidos semicontinuamente oucontinuamente. As enzimas podem ser isoladas dos organismos pelo processodescrito nos exemplos ou serem usadas para a reação como um extrato bruto.

As hidrofobinas usadas de acordo com a invenção, ou osfragmentos funcionais, biologicamente ativos destas, podem ser preparadospor meio de um processo para a preparação recombinante, em que ummicroorganismo que produz polipeptídeo é cultivado, a expressão dasproteínas é induzida, se apropriado, e estas são isoladas da cultura. Asproteínas também podem ser produzidas deste modo, em uma escalaindustrial se isto for desejado. O microorganismo recombinante pode sercultivado e fermentado por processos conhecidos. As bactérias podem serpropagadas, por exemplo, em meio TB ou LB e em uma temperatura de 20 a40°C e um pH de 6 a 9. As condições de cultivo adequadas sãoespecificamente descritas, por exemplo, em T. Maniatis, E. F. Fritsch e J.Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).

Se as proteínas não são secretadas no meio de cultura, ascélulas são então rompidas e o produto é obtido do lisato por processos deisolamento de proteína conhecidos. Como desejado, as células podem serrompidas por ultra-som de alta freqüência, por alta pressão, por exemplo, emuma célula de pressão francesa, por osmólise, pela ação de detergentes,enzimas líticas ou solventes orgânicos, por homogeneizadores ou pelacombinação de uma pluralidade dos processos listados.

As proteínas podem ser purificadas por processoscromatográficos conhecidos, tais como, cromatografia de peneira molecular(filtração em gel), tais como, cromatografia de Q Sepharose, cromatografia detroca iônica e cromatografia hidrofóbica e, também com outros processosusuais, tais como, ultrafiltração, cristalização, precipitação da proteína porsaturação de sal, diálise e eletroforese em gel natural. Os processos adequadossão descritos, por exemplo, em Cooper, F. G., BiochemischeArbeitsmethoden [Biochemical Techniques], Verlag Walter de Gruyter,Berlin, Nova Iorque, ou em Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag,Nova Iorque, Heidelberg, Berlim.

Pode ser particularmente vantajoso facilitar o isolamento e apurificação das hidrofobinas de fusão pelo fornecimento destas com gruposâncoras específicos que podem se ligar a grupos complementarescorrespondentes em suportes sólidos, especialmente polímeros adequados.Tais suportes sólidos, por exemplo, podem ser usados como um enchimentopara colunas de cromatografia e, a eficiência da separação, geralmente, podeser aumentada significantemente desta maneira. Tais processos de separaçãotambém são conhecidos como cromatografia de afinidade. Para aincorporação dos grupos âncoras, é possível usar, na preparação das proteínas,sistemas de vetor ou oligonucleotídeos que estendem o cDNA pelasseqüências de nucleotídeo particulares e por isso codifica proteínas alteradasou proteínas de fusão. Para purificação mais fácil, as proteínas modificadascompreendem os assim chamados "rótulos" que funcionam como âncoras,por exemplo, a modificação conhecida como a hexa-histidina âncora. Ashidrofobinas de fusão modificadas com histidinas âncoras podem serpurificadas cromatograficamente, por exemplo, usando-se níquel-Sepharosecomo o enchimento de coluna. A hidrofobina de fusão pode sersubseqüentemente eluída novamente da coluna por meio de agentesadequados para eluição, por exemplo, uma solução de imidazol.

Em um processo purificação simplificado, é possível dispensara purificação cromatográfica. Para esta finalidade, as células são primeiroremovidas do caldo de fermentação por meio de um método adequado, porexemplo, por microfiltração ou por centrifiigação. Subseqüentemente, ascélulas podem ser rompidas por meio de métodos adequados, por exemplo,por meio dos métodos já mencionados acima, e os resíduos celulares podemser separados dos corpos de inclusão. O último pode ser, vantajosamenterealizado por centrifugação. Finalmente, os corpos de inclusão podem serrompidos de uma maneira conhecida, a princípio a fim de liberar ashidrofobinas de fusão. Isto pode ser feito, por exemplo, por meio de ácidos,bases e/ou, detergentes. Os corpos de inclusão com as hidrofobinas de fusãousadas de acordo com a invenção geralmente podem ser completamentedissolvidos mesmo usando-se 0,1 M de NaOH dentro de aprox. 1 h. A purezadas hidrofobinas de fusão obtida por este processo simplificado é geralmentede 60 a 80 % em peso com base na quantidade de todas as proteínas. Assoluções obtidas pelo processo de purificação simplificado descrito podem serusadas para realizar esta invenção sem purificação adicional.

As hidrofobinas preparadas como descrito podem ser usadasdiretamente como proteínas de fusão ou, depois desmembramento e remoçãodo parceiro de fusão, como hidrofobinas "puras".

Quando uma remoção do parceiro de fusão é pretendida, éaconselhável incorporar um sítio de clivagem potencial (sítio dereconhecimento específico para proteases) na proteína de fusão entre porçãode hidrofobina e porção de parceiro de fusão. Os sítios de clivagemadequados são especialmente aquelas seqüências de peptídeos que outromodo não ocorre nem na porção de hidrofobina nem na porção de parceiro defusão, que podem ser facilmente determinadas com ferramentas debioinformática. Particularmente os exemplos adequados são clivagem deBrCN em metionina ou, clivagem mediada por protease com clivagem defator Xa, clivagem de enterocinase, clivagem de trombina, clivagem de TEV(protease do vírus etch do tabaco).

De acordo com a invenção, as hidrofobinas ou derivadosdestas podem ser usadas para estabilizar as fases já separadas emcomposições que compreendem pelo menos duas fases líquidas. Ascomposições a princípio, podem ser qualquer composições, contanto quetenham pelo menos duas fases líquidas.

Em particular, as composições também podem sercomposições que, antes da adição de pelo menos uma hidrofobina ou derivadodesta, estiveram presentes na forma de uma emulsão, foram então separadasem duas fases em um processo prolongado (preferivelmente mais do que 1minuto, especialmente mais do que 5 minutes) e foram depois, apenasmisturados com hidrofobina.

No contexto da presente invenção, a composição, bem como,pelo menos duas fases líquidas, a princípio, também pode compreender fasesadicionais.

As, pelo menos, duas fases líquidas são duas fases líquidas dedensidade diferente, preferivelmente um óleo e água, duas soluções orgânicasde densidade diferente, um combustível e água ou um solvente e água. Nocontexto da presente invenção, as soluções aquosas são soluções quecompreendem água, opcionalmente em combinação com um solventeadicional. Cada uma destas fases líquidas, no contexto da presente invenção,podem compreender substâncias adicionais.

De acordo com a invenção, um óleo é preferivelmente um óleobruto.Os solventes adequados são todos os líquidos que formammisturas bifásicas com água, especialmente solventes orgânicos, por exemplo,éteres, compostos aromáticos, tais como, tolueno ou benzeno, álcoois,alcanos, alquenos, cicloalcanos, cicloalquenos, ésteres, cetonas, naftenos ouhidrocarbonetos halogenados.

Ainda em uma forma de realização adicional, portanto, apresente invenção diz respeito a um uso como descrito acima, de pelo menosuma hidrofobina ou de pelo menos um derivado desta, a dita composição quecompreende óleo, preferivelmente óleo bruto e, água, ou outro combustível eágua.

No contexto da presente invenção, a composição também podecompreender fases adicionais, por exemplo, uma fase sólida ou liquida,especialmente uma fase sólida.

As hidrofobinas ou derivados deste podem ser usadas paratodos os usos conhecidos por aqueles habilitados na técnica. Em particular, nocontexto da presente invenção, deve ser feita menção do uso como umestabilizador de fase em misturas de combustível gasolina/água, em outrasmisturas de combustível/água, óleo bruto e fases aquosas em extração de óleobruto ou transporte de óleo bruto, e a dessalinização de óleo bruto pelaextração de óleo bruto com água e subseqüente condução adicional das fasesresultantes.

E possível quebrar emulsões pela adição de desemulsificantes.Por exemplo, óleo bruto extraído, geralmente, está presente em uma emulsãode água em óleo relativamente estável que, de acordo com o tipo de depósito,pode compreender até 90 % em peso de água. No trabalho e purificação doóleo bruto, depois da remoção da maioria da água, um óleo bruto que aindacompreende de aproximadamente 2 a 3 % em peso de água é obtido. Istoforma uma emulsão estável com o óleo, que não pode ser completamenteremovido mesmo pela centrifugação e adição de desemulsificantesconvencionais. Isto é problemático visto que a água primeiramente tem umalto teor de sal e conseqüentemente ação corrosiva e, em segundo lugar a águaresidual aumenta o volume a ser transportado e a ser armazenado, que leva acustos aumentados. Foi observado que hidrofobinas ou derivados destaspodem ser usados a fim de melhorar a separação de fase nestas composições.Uma separação muito rápida é conseguida.

Neste caso, o desemulsificante deve ser ajustado ao tipo deóleos e gorduras e emulsificados e a quaisquer emulsificantes e tensoativospresentes a fim de conseguir uma ação ótima. A quebra de emulsões pode seradicionalmente promovida por uma temperatura elevada, por exemplo, umatemperatura de 0 a 100°C, por exemplo, de 10 a 80°C, especialmente de 20 a 60°C.

Um uso inventivo adicional é a estabilização de fase emmisturas de óleo em água ou água em óleo, por exemplo, sistemas bifásicosque foram usados como lubrificantes de resfriamento e devem ser reciclados.As misturas de água/óleo também são obtidas, por exemplo, em embarcaçõescomo água que se acumula na estiva dos navios. Neste caso, a separação deemulsões e manutenção das fases separadas são necessárias de modo quesejam capazes remover a água com segurança.

A quantidade da hidrofobina ou derivado usada pode variardentro de faixas amplas, a quantidade vantajosamente a ser ajustada à própriacomposição e quaisquer componentes adicionais presentes na composição.

Quando, por exemplo, a composição compreende substânciasque retardam ou pioram a separação de fase de, pelo menos duas faseslíquidas, por exemplo, tensoativos ou emulsificantes, uma quantidade maiorde uma hidrofobina ou de um derivado é vantajosamente usada.

Visto que óleos, especialmente óleos brutos, consistem de umamistura de muitos compostos químicos, é necessário, devido à composiçãoquímica diferente do óleo, os teores de água e sal e as condições específicasda separação de emulsão, tais como, temperatura, duração da separação deemulsão, tipo de adição e interações medidas com componentes adicionais damistura, ajustarem o desemulsificante às condições específicas.

Foi observado que, surpreendentemente, mesmo pequenasquantidades de uma hidrofobina ou derivado desta, leva a uma melhora naestabilização de fase.

A hidrofobina ou derivado desta, de acordo com a invenção,pode ser usada em qualquer quantidade adequada. No geral, pelo menos umahidrofobina ou derivado desta é usada em uma quantidade de 0,001 a 100ppm com base na composição global; preferivelmente em uma quantidade de0,001 a 80 ppm, mais preferivelmente de 0,001 a 20 ppm e maispreferivelmente de 0,01 a 10 ppm.

No contexto da presente invenção, a unidade ppm significa mgpor kg.

Ainda em uma forma de realização adicional, a presenteinvenção, portanto, diz respeito a um uso como descrito acima, em que ahidrofobina ou pelo menos um derivado desta é usada em uma quantidade de0,001 a 100 ppm com base na composição global. A concentração usada édeterminada pela pessoa habilitada na técnica dependendo do tipo decomposição de fase a ser estabilizada.

Quando a composição é uma composição que compreendecombustíveis e água, a hidrofobina ou derivado desta, é usada geralmente emuma quantidade de 0,001 a 20 ppm, preferivelmente de 0,005 a 2 ppm,especialmente de 0,01 a 1 ppm, mais preferivelmente de 0,05 a 1 ppm.

Quando a composição é uma composição que compreendeóleo bruto e água, a hidrofobina ou derivado desta, é usada geralmente emuma quantidade de 0,01 a 100 ppm, preferivelmente de 0,1 a 80 ppm,especialmente de 0,1 a 50 ppm, mais preferivelmente de 0,1 a 20 ppm.

De acordo com a invenção, também é possível que acomposição, assim como, pelo menos uma hidrofobina ou derivado desta,compreendam compostos adicionais que melhorem a estabilização de fase. Oscompostos podem ser todos os compostos conhecidos por aqueles habilitadosna técnica para tais aplicações. Os exemplos de compostos adicionaisadequados para melhorar a estabilização de fase são, especialmente para aaplicação como desmembradores de emulsão na produção de óleo bruto,resinas de fenol-formaldeído oxialquiladas, copolímeros de bloco EO/PO,diepóxidos reticulados, poliamidas ou alcoxilatos destes, sais de ácidossulfônicos, aminas graxas etoxiladas, succinatos e os compostos especificadosna DE 10 2005 006 030.7 para tais usos.

Ainda em uma forma de realização adicional, a presenteinvenção diz respeito a um uso como descrito acima, em que pelo menos umoutro composto que melhore a estabilização de fase é usado, assim como pelomenos uma hidrofobina ou pelo menos um derivado desta.

Em um aspecto adicional, a presente invenção também dizrespeito a um processo para estabilizar fases líquidas em uma composição quecompreende pelo menos duas fases líquidas, que compreendem a adição depelo menos uma hidrofobina ou pelo menos um derivado desta, à composição.

A composição pode ser uma composição como descrito acima,que compreende pelo menos duas fases líquidas, por exemplo, composiçõesque compreendem óleo, preferivelmente óleo bruto e, água, ou outrascomposições que compreendem combustível e água.

O processo de acordo com a invenção pode compreenderetapas adicionais, por exemplo, primeiro o desempenho de uma separação defase ou a quebra de emulsões e subseqüente adição de hidrofobinas à faseaquosa.

De acordo com a invenção, as hidrofobinas ou derivadosdestas, podem ser adicionadas à fase aquosa de um sistema de 2 fases ou,então às formulações que compreendem combustíveis. No contato daformulação com água, permite a estabilização das fases ou previne a re-emulsificação.

E igualmente vantajoso adicionar hidrofobinas ou derivadosdestas às fases de óleo bruto-água a fim de, por exemplo, prevenir uma novaformação de emulsões no curso do transporte.

A formulação que compreende combustíveis, no contexto dapresente invenção, pode compreender aditivos adicionais que estãotipicamente presentes em tais formulações. Os aditivos adequados são, porexemplo, especificados no WO 2004/087808.

No contexto da presente invenção, os combustíveis sãoentendidos significar óleos de aquecimento leve, médio ou pesado.

No contexto da presente invenção, os combustíveis sãoentendidos significar combustíveis de gasolina, combustíveis diesel oucombustíveis de turbina. Os combustíveis são mais preferivelmentecombustíveis de gasolina.

Os aditivos mencionados são usados nas quantidades queparecem ser adequadas àquelas pessoas habilitadas na técnica para a aplicaçãoparticular.

As formulações inventivas adicionalmente, podem sercombinadas com componentes e aditivos usuais, adicionais. Aqui, deve serfeita menção, por exemplo, de óleos carregadores sem ação detergentepronunciada.

Os óleos carregadores minerais adequados são frações obtidasno processamento de óleo bruto, tais como, óleos límpidos e isentos deumidade ou de base tendo viscosidades, por exemplo, da classe SN 500-200;mas também hidrocarbonetos aromáticos, hidrocarbonetos parafínicos ealcoxialcanóis. Igualmente adequada, de acordo com a invenção, é uma fraçãoque é conhecida como "óleo de hidrocraqueamento" e é obtido na refinaçãode óleo mineral (corte de destilado a vácuo que tem uma faixa de ebulição decerca de 360 a 500°C, obtenível de óleo mineral natural cataliticamentehidrogenado e isomerizado e também desparafinizado sob alta pressão).Igualmente adequadas são as misturas de óleos carregadores mineraismencionados acima.

Os exemplos de óleos carregadores sintéticos utilizáveis deacordo com a invenção são selecionados de: poliolefinas (polialfaolefinas oupoliinternalolefinas), (poli)ésteres, (poli)alcoxilatos, poliéteres, polieteraminasalifáticas, poliéteres iniciados por alquilfenol, polieteraminas iniciadas poralquilfenol e éster carboxílico de alcanóis de cadeia longa.

Os sistemas de óleo carregador adequados adicionais são, porexemplo, descritos em DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074,EP-A 0 452 328 e EP-A 0 548 617, que são, por meio destes, explicitamenteincorporados por referência.

Os óleos carregadores sintéticos adequados, adicionais sãoalquilfenóis alcoxilados, como descritos em DE-A 10 102 913.6.

Os óleos carregadores mencionados são usados nasquantidades que parecem ser adequadas àqueles habilitados na técnica para aaplicação particular.

Os aditivos usuais adicionais são inibidores de corrosão, porexemplo, com base em sais amônio de ácidos carboxílicos orgânicos, ditossais de amônio que tendem a formar películas ou, em aromáticosheterocíclicos no caso de proteção de corrosão de metal não ferroso;antioxidantes ou estabilizadores, por exemplo, com base nas aminas, taiscomo, p-fenilenodiamina, dicicloexilamina ou derivados destes ou, em fenóis,tais como, 2,4-di-terc-butilfenol ou ácido 3,5-di-terc-butil-4-hidroxifenilpropiônico; desemulsificantes convencionais adicionais;antiestáticos; metalocenos, tais como, ferroceno; metilciclopentadienil-manganês tricarbonila; melhoradores de lubricidade (aditivos de lubricidade)tais como, ácidos graxos particulares, ésteres alquenil-succínicos, aminasgraxas de bis(hidroxialquila), hidroxiacetamidas ou castor óleo; e corantes(marcadores). Se apropriado, as aminas também são adicionadas paradiminuir o pH do combustível.

Os aditivos detergentes mencionados com as porções polaresde (a) a (i) são adicionados ao combustível tipicamente em uma quantidade de10 a 5000 ppm em peso, especialmente de 50 a 1000 ppm em peso. Sedesejado, os outros componentes e os aditivos mencionados são adicionadosem quantidades usuais para este fim.

De acordo com a invenção, os combustíveis adequados sãotodos os combustíveis conhecidos por aqueles habilitados na técnica, porexemplo, combustíveis de gasolina, como descrito, por exemplo, emUllmann's Enciclopédia of Industrial Chemistry, 5a Ed. 1990, Volume Al 6, p.719ff. De acordo com a invenção, os combustíveis adequados também sãocombustível diesel, querosene e combustível de jato.

Em particular, um combustível de gasolina tendo um teor dearomáticos de não mais do que 60 % em volume, por exemplo, não mais doque 42 % em volume e, um teor de enxofre de não mais do que 2000 ppm empeso, por exemplo, não mais do que 150 ppm em peso, é adequado.

O teor de aromáticos do combustível de gasolina é, porexemplo, de 10 a 50 % em volume, por exemplo, de 30 a 42 % em volume,especialmente de 32 a 40 % em volume. O teor de enxofre do combustível degasolina é, por exemplo, de 2 a 500 ppm em peso, por exemplo, de 5 a 150ppm em peso, ou de 10 a 100 ppm em peso.

Além disso, um combustível de gasolina adequado pode ter,por exemplo, um teor de olefina de até 50 % em volume, por exemplo, de 6 a21 % em volume, especialmente de 7 a 18 % em volume; um teor de benzenode até 5 % em volume, por exemplo, de 0,5 a 1,0 % em volume,especialmente de 0,6 a 0,9 % em volume, e/ou um teor de oxigênio de até25 % em peso, por exemplo, até 10 % em peso, ou de 1,0 a 2,7 % em peso,especialmente de 1,2 a 2,0 % em peso.

Em particular, pode ser feita menção por meio de exemplodesses combustíveis de gasolina que simultaneamente têm um teor dearomáticos de não mais do que 38 % em volume, um teor de olefina de nãomais do que 21 % em volume, um teor de enxofre de não mais do que 50 ppmem peso, um teor de benzeno de não mais do que 1,0 % em volume e um teorde oxigênio de 1,0 a 2,7 % em peso.

O teor de álcoois e éteres no combustível de gasolina podevariar em uma ampla faixa. Os exemplos de teores máximos típicos são 15 %em volume para metanol, 65 % em volume para etanol, 20 % em volume paraisopropanol, 15 % em volume para terc-butanol, 20 % em volume paraisobutanol e 30 % em volume para éteres tendo 5 ou mais átomos de carbonona molécula.

A pressão de vapor de verão de um combustível de gasolinaadequado de acordo com a invenção é tipicamente de não mais de 70 kPa,especialmente 60 kPa (em cada caso a 37°C).

O RON do combustível de gasolina é geralmente de 75 a 105.Uma faixa usual para o MON correspondente é de 65 a 95.

As especificações mencionadas são determinadas por métodosusuais (DIN EN 228).

A invenção é ilustrada em detalhes, a seguir, por exemplos.

Exemplos

Exemplo 1

Preparações para a clonagem de yaad-His^/ yaaE-His6

Uma reação de cadeia de polimerase foi realizada com oauxílio dos oligonucleotídeos Hal570 e Hal571 (Hal 572/ Hal 573). O DNApadrão usado foi o DNA genômico da bactéria Bacillus subtilis. O fragmentode PCR resultante compreendeu a seqüência de codificação dos genes yaaD /yaaE do Bacillus subtilis e, um sítio de clivagem de restrição de NcoI e BgIIIrespectivamente em cada extremidade. O fragmento de PCR foi purificado ecortado com as endonucleases de restrição NcoI e BgIII. Este fragmento deDNA foi usado como uma inserção e clonado no vetor pQE60 de Qiagen, quefoi linearizado anteriormente com as endonucleases de restrição NcoI e BgIII.Os vetores pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 assim formados, podem serusados para expressar as proteínas que consistem de YAAD::HIS6 ouYAAE: :fflS6.

Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactgaHal571: gcagatctccagccgcgttcttgcatacHal572: ggccatgggattaacaataggtgtactaggHal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattccExemplo 2

Clonagem de Hidrofobina yaad DewA-His*Uma reação de cadeia de polimerase foi realizada com oauxílio dos oligonucleotídeos KaM 416 e KaM 417. O DNA padrão usado foio DNA genômico do mofo Aspergillus nidulans. O fragmento de PCRresultante compreendeu a seqüência de codificação do gene de hidrofobinadewA e um sítio de clivagem de proteinase Xa de fator terminal N. Ofragmento de PCR foi purificado e cortado com a endonuclease de restriçãoBamffl. Este fragmento de DNA foi usado como uma inserção e clonado novetor pQE60YAAD#2 que foi linearizado anteriormente com a endonucleasede restrição BgIII.

O vetor #508 formado desse modo, pode ser usado paraexpressar uma proteína de fusão que consiste de YAAD::Xa::dewA::fflS6.KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGCKaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

Exemplo 3

Clonagem de hidrofobina yaad RodA-His*O plasmídeo #513 foi analogamente clonado ao plasmídeo#508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 434 e KaM 435.

KaM 434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC

KaM 435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

Exemplo 4

Clonagem de hidrofobina yaad BASFl-His^O plasmídeo #507 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintético(hidrofobina BASF1) (ver apêndice, SEQ ID NO. 11 e 12).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAGExemplo 5

Clonagem de hidrofobina yaad BASF2-His*O plasmídeo #506 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 usando-se os oligonucleotídeos KaM 417 e KaM 418.

O DNA padrão usado foi uma seqüência de DNA sintético(hidrofobina BASF2) (ver apêndice, SEQ ID NO. 13 e 14).

KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC

KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAGExemplo 6

Clonagem de hidrofobina yaad SC3-His^O plasmídeo #526 foi clonado analogamente ao plasmídeo#508 usando-se os oligonucleotídeos KaM464 e KaM465.

O DNA padrão usado foi o cDNA de Schyzophillum commune(ver apêndice, SEQ ID NO. 9 e 10).KaM 464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM 465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

Exemplo 7

Fermentação da hidrofobina vaad DewA-Hisg da cepa E. colirecombinante

Inoculação de 3 ml de meio líquido LB com uma cepa E. colique expressa hidrofobina yaad DewA-His6 em tubos Greiner 15 ml.Inoculação por 8 h a 37°C em um agitador a 200 rpm. Em cada caso doisfrascos Erlenmeyer de 1 litro com chicanas e 250 ml de meio de LB (+ 100jxg/ml de ampicilina) são inoculados com 1 ml em cada caso da culturapreliminar e incubados por 9 h a 37°C em um agitador a 180 rpm.

Inocular 13,51 de meio de LB (+ 100 (ig/ml de ampicilina) com0,51 de cultura preliminar (OD600nm 1:10, medido contra H2O) em umfermentador de 20 1. Em um OD600nm de -3,5, a adição de 140 ml de IPTG a100 mM. Depois de 3 horas, o fermentador esfria a IO0C e o caldo defermentação separado por centrifugação. Uso de grânulo celular parapurificação adicional.

Exemplo 8

Purificação da proteína de fusão de hidrofobina recombinante

100 g de grânulo celular (100 - 500 mg de hidrofobina) sãofeitos até o volume total de 200 ml com 50 mM de tampão de fosfato desódio, pH 7,5 e, recolocado em suspensão. A suspensão é tratada com um tipoUltraturrax T25 (Janke e Kunkel; IKA-Labortechnik) por 10 minutos esubseqüentemente incubada com 500 unidades de Benzonase (Merck,Darmstadt; ordem No. 1.01697.0001) em temperatura ambiente por 1 horapara degradar os ácido nucléicos. Antes do rompimento celular, a filtração érealizada com um cartucho de vidro (PI). Para o rompimento celular e para acisão do DNA genômico remanescente, dois ciclos homogeneizadores sãorealizados a 1500 bar (Microfluidizer M-110EH; Microfiuidics Corp.). Ohomogenato é centrifugado (Sorvall RC-5B, rotor GSA5 copa de centrífuga de250 ml, 60 minutos, 4°C, 12.000 rpm, 23 000 g), o sobrenadante foi colocadoem gelo e o grão foi recolocado em suspensão em 100 ml de tampão defosfato de sódio, pH 7,5.

A centrifugação e a recolocação em suspensão são repetidastrês vezes, o tampão de fosfato de sódio que compreende 1 % de SDS naterceira repetição. Depois da recolocação em suspensão, a mistura é agitadapor uma hora e uma centrifugação final é realizada (Sorvall RC-5B, rotorGSA5 copa de centrífuga de 250 ml, 60 minutos, 4°C, 12 000 rpm, 23 000 g).

De acordo com a análise SDS-PAGE, a hidrofobina estápresente no sobrenadante depois da centrifugação final (figura 1). Osexperimentos mostram que a hidrofobina provavelmente está presente naforma de corpos de inclusão nas células de E. coli correspondentes. 50 ml deum sobrenadante que compreende hidrofobina são aplicados a uma coluna 17-5268-02 de alto Desempenho de níquel Sepharose de 50 ml (Amersham) quefoi equilibrado com 50 mM de tampão de Tris-Cl, pH 8,0. A coluna é lavadacom 50 mM de tampão de Tris-Cl, pH 8,0 e a hidrofobina ésubseqüentemente eluída com 50 mM de tampão de Tris-Cl, pH 8,0 quecompreendem 200 mM de imidazol. Para remover o imidazol, a solução édialisada contra 50 mM de tampão de Tris-Cl, pH 8,0.

A Figura 1 mostra a purificação da hidrofobina preparada:

Caminho A: Aplicação à coluna de níquel-Sepharose (diluição 1:10)

Caminho B: Fluxo atravessante = eluído de etapa de lavagem

Caminhos C-E: OD 280 Máximos das frações de eluição (WP1, WP2, WP3)

Caminho F mostra o marcador aplicado.

A hidrofobina da figura 1 tem um peso molecular deaproximadamente 53 kD. Certa quantidade das faixas menores representam osprodutos de degradação da hidrofobina.

Exemplo 9Teste de Desempenho: caracterização da hidrofobina pelamudança no ângulo de contato de uma gotícula no vidroSubstrato:

Vidro (vidro de janela, vidro Süddeutsche, Mannheim):

A hidrofobina purificada de acordo com o exemplo 8 foiusada.

Concentração da hidrofobina na solução: 100 fJ.g/ml, a soluçãoainda compreendeu 50 mM de tampão de acetato de sódio e 0,1 %de polioxietileno(20)- monolaurato de sorbitano (Tween® 20), pHda solução: 4

Imersão de placas de vidro nesta solução durante a noite(temperatura 80°C)

As placas de vidro revestidas com hidrofobina são então retiradasda solução e lavadas em água destilada,

- Depois, incubação por 10 minutos / 80°C / 1 % de solução SDS emágua destilada

Novamente lavagem em água destilada

As amostras são secadas sob ar e o ângulo de contato (emgraus) de uma gotícula de 5 jlxI de água com a superfície de vidro revestida édeterminada em temperatura ambiente.

O ângulo de contato foi medido em um sistema de ângulo decontato Dataphysics OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (Novembro 2002). Amedição foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

O vidro não tratado deu um ângulo de contato de 30 ± 5o.

A placa de vidro revestida com a hidrofobina de acordo com oexemplo 8 (yaad-dewA-his6) deu um ângulo de contato de 75 ± 5o.=> Aumento no ângulo de contato: 45°

Exemplo 10

Experimentos na estabilização de fase por uma hidrofobinaEm cada caso, 50 ml de uma emulsão de óleo mineral bruto(óleo mineral bruto homogêneo, Wintershall AG, Emlichheim, sonda 60, 64,83, 87, 301 e 507) e água foram introduzidos em garrafas de vidro snap-lid. Aemulsão foi preparada pela emulsificação de 1000 ppm de óleo mineral brutoem aproximadamente 50 ml de água por meio de um agitador Ultraturrax(tempo de agitação de 4 Minutos a 24000 rpm).

Foram adicionados a esta emulsão:

No caso A nenhum desemulsificante adicionado,

No caso B 10 ppm de hidrofobina de Exemplo 8,

NocasoC 10 ppm de poliDADMAC (desemulsificante com teor de sólidosde 28 a 32 % (IS03251), viscosidade de 200 a 800 mPas(IS02595))

NocasoD 10 ppm de Lupasol SK (poliamidoamina enxertado compolietilenoimina, fabricante: Nippon Shokubai, Japão)

Conseqüentemente, as amostras foram deixadas repousar por 3dias, no decorrer do que as emulsões se separaram (ver ilustração esquemáticana figura 2, fileira superior).

As amostras foram então suavemente agitadas de modomanual por um par de movimentos circulares. Nos casos A, C e D isto formounovamente opacidade elevada (formação de emulsão); no caso de B (quecompreende hidrofobina), a separação de fase foi preservada.

Em casos individuais, os flocos também formaram-se naamostra B que compreende 10 ppm de hidrofobina, mas elevaram-seimediatamente à fase oleosa superior (ver fileira inferior da ilustraçãoesquemática na figura 2).

Estes experimentos demonstram que as hidrofobinasestabilizam emulsões que já foram separadas em duas fases separadas melhordo os desemulsificantes comerciais.

A hidrofobina também podem ser adicionada à fase aquosadepois da emulsão ser separada.

Exemplo 11

Comparação de estabilização de fase

5 % em peso de soluções dos desemulsificantes listados naTabela na mistura de xileno/isopropanol de 3:1 (com base no volume) são,primeiro, preparados.

A hidrofobina do Exemplo 8 foi preparada como uma soluçãode 1 % (0,25 % de substância ativa) em água destilada 1 h antes da adição.

Os desemulsificantes usados por meio de exemplo são:

Pluronic® PE 6800: (copolímero de óxido de etileno/óxido depropileno) Basorol® P380: (triol poliol poliéter)

Basorol® HP: (copolímero óxido de tetrol-etileno/óxido depropileno)

Uma emulsão de óleo bruto (Wintershall AG, Emlichheim,sondas 60, 64, 83, 87, 301 e 507 com um teor de água de 62 % em volume,determinada pelo processo de destilação DIN ISO 3733) foi aquecida a umatemperatura de 52°C em um recipiente fechado em um banho de água poraproximadamente 2 h.

A emulsão de óleo bruto foi homogeneizada por agitação poraproximadamente 30 segundos e em cada caso, 100 ml da emulsão de óleobruto foram enchidos em cilindros de agitação de 100 ml. O cilindro deagitação enchido de óleo foi introduzido no banho de água.

Uma pipeta Eppendorf foi usada em cada caso para dosar 50 jilda solução de 5 % em peso dos desemulsificantes mencionados acima em umcilindro de agitação que compreende emulsão de óleo bruto e, o cilindro foifechado com a tampa de vidro. Conseqüentemente, o cilindro de agitação foiretirado do banho de água, agitado 60 x e descomprimido.

O cilindro de agitação foi então colocado novamente no banhode água (52°C) e o volume da água que depois separou-se foi lido depois de30 e 240 minutos. Os resultados são reproduzidos na Tabela que segue.

Depois de 240 minutos, as quantidades de hidrofobinadeterminadas na Tabela são introduzidas por meio de uma seringa na águaque foi separada, em cada caso, por meio de uma seringa descartável.

Subseqüentemente, as misturas são agitadas por 30 segundos em cada caso.Conseqüentemente, as amostras são deixadas repousar a 52°C por 1 minuto edepois a quantidade da água que separou-se é determinada. Os resultados sãocompilados na tabela.

Tabela

<table>table see original document page 37</column></row><table>

E visto claramente que a adição da hidrofobina acelera a re-separação das fases. Conseqüentemente, a re-emulsificação da fase aquosa nafase oleosa parece ser reduzida pela proteína.

Também é surpreendente a baixa concentração de 0,5 a 1 ppmde hidrofobina que é suficiente para alcançar o resultado.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> BASFAktiengeseIIschaft

<120> Uso de proteínas como desemulsificantes

<130> AE 200500040<160> 24

<170> PatentIn versão 3.1

<210> 1

<211> 405

<212> DNA

<213> basf-dewA

<220>

<221 > CDS

<222> (1)..(405)

<223>

<400> 1

atg cgc ttc ate gtc tet etc etc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48Met Arg Phe Ile Vai Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala15 10 15

acc gcc ctc ccg gcc tet gcc gea aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30

gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser35 40 45

ate gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60

age ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80

ggc age gcc tgc gcc aag gcg age ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95

gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac ate gtc 336Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val100 105 110

gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384Ala Cys Cys Pro Glu Gly ThrThr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala115 120 125

ggc gct ggt acc aag gct gag 405

Gly Ala GIy Thr Lys Ala Glu130 135

<210> 2<211> 135<212> PRT

<213> basf-dewA<400> 2

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala15 10 15

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser20 25 30

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser35 40 45

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu50 55 60

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr65 70 75 80

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu85 90 95Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val100 105 110

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Aia115 120 125

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu130 135

<210> 3<211> 471<212> DNA<213> basf-rodA

<220><221 > CDS<222> (1)..(471)<223>

<400> 3

atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val20 25 30

ggc aac aag ggc aac age aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val35 40 45

acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tet 192

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60

tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp TTir Thr Thr Val Asp Glu65 70 75 80

ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc age ggc ctc ate ggc gcc ggg tet ggt 288Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95

gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala100 105 110

gtc ctc att ggc ate caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125

att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc age gcg gat ggc aac ctt att 432Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile130 135 140

ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc ate ctc 471

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu145 150 155

<210> 4<211> 157<212> PRT<213> basf-rodA

<400> 4

Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val20 25 30

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val35 40 45

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser50 55 60

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu65 70 75 80

Gly Leu Leu Ser Gly Aia Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly85 90 95

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala100 105 110

Val Leu Ile Gly IIe Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn115 120 125

Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile130 135 140

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu145 150 155

<210> 5<211> 336

<212> DNA

<213> basf-HypA

<220><221 > CDS<222> (1)..(336)<223>

<400> 5

atg ate tet cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu15 10 15

gtt act gea act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc age agt cag tgc 96Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys20 25 30

gac gtc ggt gaa ate cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144Asp Vai Giy Giu lie His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His35 40 45

acc age gcc gcc gcg tet ggt ttg ctt ggt gtt ccc ate aac ctt ggt 192Thr Ser Ala Aia Aia Ser Giy Leu Leu Giy Vai Pro ile Asn Leu Gly50 55 60

gct ttc etc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro lie Ser Vai Leu Gly Val Giy65 70 75 80

ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288Gly Asn Asn Cys Ala Aia Gln Pro Val Cys Cys Thr Giy Asn Gin Phe85 90 95

acc gea ttg att aac gct ctt gac tgc tet cct gtc aat gtc aac ctc 336Thr Aia Leu lie Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu100 105 110

<210> 6<211> 112<212> PRT<213> basf-HypA

<400> 6

Met Ile Ser Arg Val Leu Vai Aia AIa Leu Vai Aia Leu Pro Ala Leu15 10 15

Vai Thr Aia TTir Pro Afa Pro Giy Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gin Cys20 25 30

Asp Vai Giy Glu lie His Cys Cys Asp Thr Gin Gln Thr Pro Asp His35 40 45

Thr Ser Aia Ala Ala Ser Giy Leu Leu Giy Vai Pro lie Asn Leu Gly50 55 60

Aia Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro lie Ser Val Leu Giy Vai Giy65 70 75 80Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe85 90 95

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu100 105 110

<210> 7<211> 357<212> DNA<213> basf-HypB

<220><221 > CDS<222> (1)..(357)<223>

<400> 7

atg gtc age acg ttc ate act gtc gea aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu15 10 15

ctc ttc gtc aat ate aat ate gtc gtt ggt act gea act acc ggc aag 96Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30

cat tgt age acc ggt cct ate gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tet 144His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser35 40 45

aag age cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60

ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc age cct 240Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro65 70 75 80

ate acg gea att ggt att ggc tcc ggc age caa tgc tet ggc cag acc 288Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr85 90 95gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys100 105 110

act ccc att aat gcc aat gtg 357

Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val115

<210> 8<211> 119<212> PRT<213> basf-HypB

<400> 8

Met Val Ser Thr Phe lie Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu15 10 15

Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys20 25 30

His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser35 40 45

Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu50 55 60

Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Aia Asn Cys Ser Pro65 70 75 80

Ile Thr AIa lie Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr85 90 95

Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys100 105 110

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<220><221 > CDS<222> (1)..(408)<223>

<400> 9

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aac cag gtt caa tcg gcg age age age cct gtt acc gcc ctc ctc ggc 240Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val ThrAIa Leu Leu Gly65 70 75 80

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ggt tgc acc ccc ate aac ate etc 408

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu130 135

<210> 10<211> 136<212> PRT<213> basf-sc3

<400> 10

Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe15 10 15

Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr20 25 30

Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr35 40 45

Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys50 55 60

Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly65 70 75 80

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser85 90 95

Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala100 105 110

Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn lie115 120 125Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu130 135

<210> 11<211> 483<212> DNA<213> basf-BASF1

<220><221 > CDS<222> (1)..(483)<223>

<400> 11

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tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc 240Tyr AIa Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly65 70 75 80

ctc ctc aag aac ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu GIy85 90 95

ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc 336Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln He Ser Val Ile GIy100 105 110ate cct ate cag gac etc etc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln115 120 125

aac ate gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc etc 432Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu130 135 140

gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc etc cat 480Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Vd Ser Leu Leu His145 150 155 160

atg 483

Met

<210> 12<211> 161<212> PRT<213> basf-BASF1

<400> 12

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly65 70 75 80

Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly85 90 95Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly100 105 110

Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln115 120 125

Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu130 135 140

Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His145 150 155 160

Met

<210> 13<211> 465<212> DNA<213> basf-BASF2

<220><221 > CDS<222> (1)..(465)<223>

<400> 13

aíg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Aia Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtcAla Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val20 25 30

ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc accGly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Vai Lys Gln Ala Thr35 40 45

gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192Asp Lys Cys Gly Asp Gln Aia Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr50 55 60

tac gcc ggc gac gtc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc 240Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu65 70 75 80

ctc aag aac ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu85 90 95

ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate 336Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile100 105 110

cct ate cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 384Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys115 120 125

tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly130 135 140

aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465

Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met145 150 155

<210> 14<211> 155<212> PRT<213> basf-BASF2

<400> 14

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val15 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val20 25 30Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Vai Thr Val Lys Gin Ala Thr35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gin Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr50 55 60

Tyr Ala Giy Asp Val Thr Asp lie Asp Glu Giy ile Leu Ala Gly Leu65 70 75 80

Leu Lys Asn Leu lie Giy Giy Gly Ser Giy Ser Glu Gly Leu Giy Leu85 90 95

Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln lie Ser Vai lie Gly Ile100 105 110

Pro Ile Gin Asp Leu Leu Asn Gln Gin Cys Lys Gln Asn lie Aia Cys115 120 125

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala TTir Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly130 135 140

Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met145 150 155

<210> 15<211> 882<212> DNA<213> basf-yaad

<220><221 > CDS<222> (1)..(882)<223><400> 15

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Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile Gly Val Gly Leu435 440 445

Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu Gly Ser His His His His His450 455 460His465

<210> 23<211> 1407<212> DNA

<213> basf-yaad-Xa-BASF1 -his

<220><221 > CDS<222> (1)..(1407)<223>

<400> 23

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48Met Ala Gln Thr Gly Thr Giu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met15 10 15

caa aaa ggc ggc gtc ate atg gac gtc ate aat gcg gaa caa gcg aaa 96Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

ate gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

aca ate gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tet ate ccg gta atg gca 240Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

aaa gcg cgt ate gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly TTir Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Vai Val195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly lie Phe Lys225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta ate gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Giu Leu Ser Lys Giu Leu Gly260 265 270

act gca atg aaa ggg att gaa ate tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg aga tct att gaa ggc cgc atg aag ttc tcc 912Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser lie Glu Giy Arg Met Lys Phe Ser290 295 300

gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc gcc gcc ctc cct 960Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc ggc aac aag ttc 1008Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val Gly Asn Lys Phe325 330 335

cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc gac aag tgc ggc 1056Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly340 345 350

gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc tac gcc ggc gac 1104Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp355 360 365

gtc ctc acc gac ate gac gag ggc ate ctc gcc ggc ctc ctc aag aac 1152Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn370 375 380

ctc ate ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc ttc gac cag 1200Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln385 390 395 400

tgc gtc aag ctc gac ctc cag ate tcc gtc ate ggc ate cct ate cag 1248Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile Pro Ile Gln405 410 415

gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag aac ate gcc tgc 1296Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys420 425 430

tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 1344Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly435 440 445

ctc ggc aac cct tgc ate cct gtc tcc ctc ctc cat atg gga tet cat 1392Leu Gly Asn Pro Cys lie Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His450 455 460

cac cat cac cat cac 1407

His His His His His

465

<210> 24<211> 469<212> PRT

<213> basf-yaad-Xa-BASF1 -his<400> 24

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met1 5 10 15

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met85 90 95

Gly Val Asp Tyr He Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser130 135 140

Met Leu Arg TTir Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val195 200 205Asn Phe Ala Ala Gly Gly Vai Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly He Phe Lys225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp Arg Ser Ile Glu Gly Arg Met Lys Phe Ser290 295 300

Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val Ala Ala Leu Pro305 310 315 320

Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly VaI Gly Asn Lys Phe325 330 335

Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr Asp Lys Cys Gly340 345 350

Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp355 360 365

Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu Leu Lys Asn370 375 380

Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln385 390 395 400

Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Vai fie Gly He Pro Ile Gln405 410 415Asp Leu Leu Asn GIn Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys420 425 430

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly435 440 445

Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met Gly Ser His450 455 460

His His His His His465

Claims (24)

1. Uso de pelo menos uma hidrofobina, caracterizado pelo fatode ser para a estabilização de fase em composições que compreendem pelomenos duas fases líquidas.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a composição tem uma fase aquosa e uma fase orgânica.

3. Uso de acordo com cada uma das reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é uma hidrofobina de fusão.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-3, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina de fusão é pelo menos umaselecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), ondeyaad também pode ser um parceiro de fusão truncado yaad' tendo de 20 a 293aminoácidos.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-4, caracterizado pelo fato de que a composição que compreende pelo menosduas fases líquidas é uma composição que compreende óleo e água ou umacomposição que compreende combustível ou gasolina e água.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-5, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma hidrofobina é usada emuma quantidade de 0,001 a 80 ppm com base na composição global.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-6, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição de óleobruto-água e a hidrofobina é usada em uma quantidade de 0,001 a 20 ppmcom base na composição global.

8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-6, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição decombustível/gasolina-água e a hidrofobina é usada em uma quantidade de-0,01 a 10 ppm com base na composição global.

9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a-8, caracterizado pelo fato de que pelo menos um outro composto que melhorea estabilização de fase é usada assim como a pelo menos uma hidrofobina.

10. Processo para estabilizar fases líquidas em umacomposição compreendendo pelo menos duas fases líquidas, caracterizadopelo fato de que compreende a adição de pelo menos uma hidrofobina àcomposição.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a hidrofobina é uma hidrofobina de fusão ou um derivadodesta.

12. Processo de acordo com cada uma das reivindicações 10ou 11, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina de fusão é pelo menosuma selecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ ID NO: 24), ondeyaad também pode ser um parceiro de fusão truncado yaad' tendo de 20 a 293aminoácidos.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a composição que compreende pelomenos duas fases líquidas é uma composição que compreende óleo e água ouuma composição que compreende combustível ou gasolina e água.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 13, caracterizado pelo fato de que a hidrofobina é usada em umaquantidade de 0,001 a 80 ppm com base na composição global.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição deóleo bruto-água e a hidrofobina é usada em uma quantidade de 0,001 a 20ppm com base na composição global.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 14, caracterizado pelo fato de que a composição é uma composição decombustível/gasolina-água e a hidrofobina é usada em uma quantidade de-0,001 a 20 ppm com base na composição global.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesde 10 a 16, caracterizado pelo fato de que as fases são primeiro separadas edepois uma hidrofobina é adicionada à fase aquosa.

18. Formulação, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos uma fase orgânica que consiste de combustíveis, gasolinas e/oupetróleos brutos e uma fase aquosa que compreende pelo menos umahidrofobina.

19. Formulação de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a hidrofobina está presente na formulação emuma quantidade de 0,001 a 80 ppm com base na formulação global.

20. Formulação de acordo com as reivindicações 18 ou 19,caracterizada pelo fato de que a formulação compreende pelo menos umcombustível ou gasolina e a hidrofobina ou o derivado desta estão presentes naformulação em uma quantidade de 0,01 a 1 ppm com base na formulação global.

21. Formulação de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que o combustível ou gasolina é um combustívelselecionado do grupo de combustíveis para motor tipo Otto, combustíveisdiesel ou combustíveis de turbina.

22. Formulação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 18 a 21, caracterizada pelo fato de que a hidrofobina é uma(,hidrofobina de fusão ou um derivado desta.

23.

Formulação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 18 a 22, caracterizada pelo fato de que a hidrofobina defusão é pelo menos uma selecionada do grupo de yaad-Xa-dewA-his (SEQ IDNO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) ou yaad-Xa-basfl-his (SEQ IDNO: 24), onde yaad também pode ser um parceiro de fusão truncado yaad'tendo de 20 a 293 aminoácidos.