BRPI0609667A2

BRPI0609667A2 - composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica, e, uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0609667A2
Application number: BRPI0609667-0A
Authority: BR
Inventors: Frank Diaz; Ryan C Holcomb; Edward A Kesicki; Hua Chee Ooi; Alexander Rudolph; Frank Stappenbeck; Eugene D Thorsett; Kimba L Fischer; Francine S Farouz; John Joseph Gaudino; Adam Wade Cook
Original assignee: Icos Corp
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2010-04-20
Also published as: PL1869020T3; AU2006230337A1; PT1869020E; HRP20100678T1; NO20074944L; HK1119670A1; MA29439B1; EP2330105A1; CY1111240T1; CN101151259B; KR20090031459A; ATE490248T1; TW200722090A; KR100912998B1; DK1869020T3; CA2602199A1; IL185481A0; JP2009227682A; CN101151259A; CN102219784A

Abstract

COMPOSTO OU UM SAL FARMACEUTICAMENTE ACEITáVEL DO MESMO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, E, USO DE UM COMPOSTO. São apresentados compostos de uréia substituida úteis no tratamento de doenças e condições relacionadas com danos no DNA ou lesões na replicação de DNA. São também apresentados métodos para a produção de compostos, e seu uso como agentes terapéuticos, por exemplo, no tratamento de câncer e outras doenças, caracterizadas por defeitos na replicação de DNA, segregação de cromossomos, ou divisão de células.

Description

"COMPOSTO, MÉTODOS DE INIBIÇÃO DA QUINASE DO PONTO DEVERIFICAÇÃO 1 EM UMA CÉLULA, DE SENSIBILIZAÇÃO DECÉLULAS EM UM INDIVÍDUO, E DE INIBIÇÃO DA PROLIFERAÇÃODE CÉLULA ABERRANTE, USO DE UM COMPOSTO, E, ARTIGO DEFABRICAÇÃO PARA USO FARMACÊUTICO HUMANO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a compostos úteis para ainibição de enzimas que mantêm e reparam a integridade do materialgenético. Mais especialmente, a presente invenção refere-se a uma série decompostos de uréia aril-e heteroaril substituídos, a métodos para a produçãodos compostos, e seu uso como agentes terapêuticos, como por exemplo, notratamento de câncer e outras doenças caracterizadas por defeitos nareplicação do ácido deoxiribonucleico (DNA), segregação de cromossomos,ou divisão de células.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma grande variedade de doenças, condições, e distúrbios(daqui por diante, "Indicações") são caracterizadas como envolvendo aproliferação de células aberrantes. Conforme usado aqui, "Células deproliferação aberrantes" (ou "Proliferação de células aberrantes") significa aproliferação de células que são desviadas do curso normal, apropriado, ouesperado. Por exemplo, a proliferação de células aberrantes inclui aproliferação não apropriada de células onde o DNA ou outros componentescelulares foram danificados ou são defeituosos. A proliferação de célulasaberrantes também caracteriza indicações clínicas provocadas por, mediadaspor, ou resultantes de níveis não apropriadamente elevados de divisão decélula, níveis não apropriadamente baixos de morte da célula (por exemplo,apoptose), ou ambos. Tais indicações podem ser caracterizadas, por exemplo,através de proliferações anormais locais únicas ou múltiplas de células,grupos de células ou tecidos, e inclui indicações cancerosas (benignas oumalignas) e não cancerosas.

Por definição, todos os cânceres (benignos e malignos)envolvem alguma forma de proliferação de célula aberrante. Algumasindicações não cancerosas também envolvem a proliferação de célulasaberrantes. Exemplos de indicações não cancerosas envolvendo a proliferaçãode células aberrantes incluem a artrite reumatóide, psoríase, vitiligo,granulomatose de Wegener, e lúpus sistêmico.

Uma estratégia para o tratamento de indicações envolvendocélulas de proliferação aberrantes envolve o uso de agentes que não danificamo DNA. Estes agentes são projetados para matar as células de proliferaçãoaberrantes interrompendo os processos celulares digitais, tais como ometabolismo do DNA, a síntese de DNA, a transcrição de DNA, e a formaçãode qualquer fuso microtubular. Eles também operam, por exemplo, através daintrodução de lesões no DNA que perturbam a integridade estrutural doscromossomos. Os agentes que danificam o DNA são projetados eadministrados por meios que tentam induzir o dano máximo e a conseqüentemorte da célula em células aberrantemente proliferantes com um mínimo dedanos para as células normais, sadias.

Uma grande variedade de agentes que danificam o DNA foidesenvolvida até o momento, incluindo quimioterápicos e radiação, e outrosestão em desenvolvimento. Infelizmente, a efetividade dos agentes quedanificam o DNA no tratamento de condições envolvendo a proliferação decélulas aberrantes tem sido menor do que o desejado, especialmente notratamento de câncer. A seletividade de tais agentes por célulasaberrantemente proliferantes em relação a células sadias (algumas vezesreferidas como índice terapêutico), com freqüência, é marginal.

Além disso, todas as células possuem mecanismos desensibilização e reparo que podem trabalhar em objetivos cruzados contraagentes que danificam o DNA. Tais mecanismos sensibilizantes, chamados depontos de verificação de ciclos de células, auxiliam a manter a ordem dosvários estágios de replicação de células e assegurar que cada etapa sejaexecutada com alta fidelidade (Hartwell et al., Science, 246: 629-634 (1989);Weinert et al., Genes Dev., 8:652 (1994)). Quando as células detectam danosno DNA, incluindo danos induzidos propositalmente pelos agentes quedanificam o DNA, certas vias indicativas ativam os pontos de verificação e ociclo de replicação da célula é temporariamente interrompido ("é parado").Esta parada permite que as células tenham o tempo para reparar o seu DNA,com freqüência até um grau suficiente para permitir que as mesmascontinuem a sobreviver e proliferar. No caso de células aberrantementeproliferantes, este reparo é indesejável, porque ele pode prejudicar os esforçospara induzir danos suficientes no DNA para matar as células.

Por exemplo, o agente quimioterapêutico chamado deGEMZAR® (gemcitabina, ou 2',2'-difluoro o-2'-deoxicitidina) danifica oDNA incorporando ele próprio no DNA durante a síntese. Quando é deixadonão reparado, o DNA danificado geralmente se torna incapaz de manter avida. No entanto, em muitas células marcadas, os pontos de verificação de umciclo de células detectam o DNA produzido de forma não apropriada (ou deoutra forma a danificado). Os pontos de verificação dos ciclos de célulasativadas provocam a parada do ciclo da célula durante um tempo suficientepara permitir que o DNA verificado seja reparado. Isto é uma forma na qualas células aberrantemente proliferantes são teorizadas para resistir ao efeito demorte da célula dos agentes que danificam o DNA, tais como osquimioterapêuticos, radiação e outras terapias.

Outros agentes que danificam o DNA fazem com que ascélulas de tumor sejam paradas na fase S. Observou-se que as células detumor resistem a certos quimioterapêuticos simplesmente parando na fase S,enquanto o agente quimioterapêutico está sendo administrado. Então, tão logoa droga é removida, os danos são reparados, a parada do ciclo da célula éinterrompida, e a células progride através do restante do ciclo da célula (Shi etai, Câncer Res. 61:1065-1072, 2001). Outros terapêuticos provocam a paradado ciclo da célula em outros pontos de verificação, incluindo Gl e G2. Eportanto esperado que a inibição de vários pontos de verificação de danos doDNA auxilie a evitar que células sejam reparadas dos danos no DNAinduzidos terapeuticamente e sensibilizem as células alvo para os agentes quedanificam o DNA. Tal sensibilização, por seu lado, espera-se que aumente oíndice terapêutico destas terapias.

O ciclo da célula é estruturalmente e funcionalmente o mesmono seu processo e modo básico de controle em todas as espécies eucarióticas.O ciclo de célula mitótico (somático) consiste de quatro fases: a fase Gl(intervalo), a fase S (síntese), a fase G2 (intervalo), e a fase M (mitose). Asfases Gl, S, e G2 são coletivamente referidas como inter-fases do ciclo dacélula. Durante a fase Gl, as atividades biossintéticas do progresso da célulaprogridem em alta velocidade. A fase S começa quando a síntese do DNA éiniciada, e termina quando o teor de DNA do núcleo da célula foi replicado esão formados dois conjuntos idênticos de cromossomos.

A células então entra na fase G2, que continua até ser iniciadaa mitose. Na mitose, o par de cromossomos e em separado, são formados doisnúcleos novos, e ocorre a citoquinese na qual a célula se divide em duascélulas filhas, cada uma delas recebendo um núcleo contendo um dos doisconjuntos de cromossomos. A citoquinese finaliza a fase M e marca o inícioda interface do ciclo de célula seguinte. A seqüência na qual os eventos dociclo de célula prossegue é rigidamente regulada, de tal forma que a iniciaçãode um evento do ciclo da célula é dependente do término do evento do ciclode célula anterior. Isto permite a fidelidade na duplicação e segregação dematerial genético de uma geração de células somáticas para a seguinte.

Foi relatado que os pontos de verificação do ciclo de célula sãocompostos pelo menos de três classes distintas de polipeptídeos, que atuamem seqüência em resposta aos sinais do ciclo de célula ou de defeitos emmecanismos de cromossomos (Carr, Science, 271: 314-315,1996). A primeiraclasse é uma família de proteínas que detectam o centro e os danos do DNAou as anormalidades no ciclo celular. Este sensores incluem a proteína Ataxia-telangiectasia Mutated (Atm) e Ataxia-Telangiectasia Rad-relacionada (Atr).A segunda classe de polipeptídeos amplifica e transmite o sinal detectado pelodetector e é exemplificada por Rad53 (Alen et al. Genes Dev. 8: 2416-2488,1994) e Chkl. Uma terceira classe de polipeptídeos inclui efetuadores,como p53, que mediam uma resposta celular, por exemplo, a parada da mitosee da apoptose.

Muito do entendimento atual da função de verificação do ciclocelular tem sido derivado do estudo de linhas de células derivadas de tumores.Em muitos casos, as células de tumor perderam os pontos de verificação dociclo de células chave (Hartwell et al., Science 266: 1821-28,1994). Foirelatado que uma etapa chave na evolução de células para um estadoneoplástico é a aquisição de mutações que inativam as vias de pontos deverificação do ciclo celular, como aquelas envolvendo p53 (Weinberg, Cell81:323-330, 1995; Levine, Cell 88: 3234-331,1997). A perda destes pontos deverificação do ciclo celular resulta na replicação das células do tumor, apesardos danos do DNA.

O tecido não canceroso, que tem intactos os pontos deverificação do ciclo celular, tipicamente é isolado da interrupção temporáriade uma via de um só ponto de verificação. As células de tumores, no entanto,têm defeitos em vias controlando a progressão do ciclo celular, de tal formaque a perturbação de pontos de verificação adicionais faz com que os mesmosse tornem especialmente sensíveis aos agentes que danificam o DNA. Porexemplo, as células de tumor que contêm o mutante p53 são defeituosas, tantono ponto de verificação de danos do DNA Gl como na habilidade paramanter o ponto de verificação de danos do DNA G2 (Bunz et al., Science,282: 1497-501, 1998). Os inibidores de pontos de verificação que visam ainiciação do ponto de verificação G2 ou do ponto de verificação da fase S,espera-se que danifiquem ainda mais a habilidade destas células de tumoresde reparar os danos no DNA, e portanto, são candidatos a aumentar o índiceterapêutico, tanto de radiação como de quimioterapia sistêmica (Gesner,Abstract at SRI Conference: Protein Phosphorylation and Drug DiscoveryWorld Summit, março 2003).

Na presença de danos no DNA ou de qualquer impedimento aréplica do DNA, as proteínas do ponto de verificação Atm e Atr iniciam umavia de transdução de sinal levando à parada do ciclo celular. A Atm mostrouter um papel no ponto de verificação dos danos de DNA em resposta aradiação por ionização (IR). A Atr é estimulada por agentes que provocam orompimento dos segmentos duplos do DNA, os rompimentos de segmentossimples de DNA, e de agentes que bloqueiam a radiação de DNA.

A Chkl é uma proteína quinase que se situa a jusante da Atme/ou Atr na via de transdução do sinal do ponto de verificação de danos doDNA (Sanchez et al., Science, 277: 1497-1.501,1997: patente americana denúmero 6.218.109). Em células de mamíferos, a Chkl é fosforilada emresposta a agentes que provocam danos no DNA, incluindo a radiação porionização (IR), luz ultra violeta (UV), e hidroxiuréia (Sanchez et al., supra;Lui et al., Genes Dev., 14:1448-1459, 2000). Esta fosforilação que ativa aChkl em células de mamíferos é dependente da Atm (Chen et al., Oncogene,18: 249-256, 1999) e Atr (Lui et al., supra). Além disso, a Chkl tem mostradofosforilar tanto o "weel" (O' Connell et al., EMBO J., 16: 545-554,1997)como o Pdsl (Sanchez et al., Science, 286: 1166-1171,1999), produtos degenes conhecidos como sendo importantes no controle do ciclo celular.

Estes estudos demonstraram que a Chkl de mamíferos tem umpapel no ponto de verificação dos danos do DNA dependentes de Atmlevando a parada na fase S. Uma função da Chkl nas células de mamíferos dafase S foi recentemente elucidada (Feijoo et al., J. Cell Biol., 154: 913-923,2001; Zhao et al., PNAS U.S.A., 99: 14.795-800, 2002; Xiao et al., J BiolChem., 278 (24): 21.767-21.773, 2003; Sorensen et al. Câncer Cell, 3 (3):247-58, 2003) ressaltando o papel da Chkl na monitoração da integridade dasíntese de DNA. A Chkl invoca uma parada da fase S através da fosforilaçãoda Cdc25a, que controla a atividade ciclinaA/cdk2 (Xiao et al, supra eSorensen et al, supra). A Chkl também invoca uma parada G2 através defosforilação e inativação de Cdc35c; a fosfatase de dupla especificidade quenormalmente desfosforila a ciclina-B/cdc2 (também conhecida como Cdkl)quando as células progridem de G2 para a mitose (Fernery et al, Science,277:1495-7, 1997; Sanchez et al, supra; Matsuoka et al, Science, 282:1893-1897,1998; e Blasina et al, Curr. Biol, 9: 1-10,1999). Em ambos os casos, ocontrole da atividade da Cdk induz uma parada do ciclo celular para evitarque as células entrem em mitose na presença de danos no DNA ou de DNAnão replicado.

Classes adicionais de inibidores de pontos de verificação dociclo celular operam na fase Gl ou G2/M. O UCN-01, ou 7-hidroxistaurosporina, originalmente foi isolado como um inibidor de quinasenão especifico tendo o seu efeito principal sobre a proteína quinase C, masrecentemente descobriu-se que inibe a atividade da Chkl e anula o ponto deverificação do ciclo celular G2 (Shi et al, supra). Assim sendo, como o UCN-01 é um inibidor de Chkl não seletivo, ele é tóxico para células em doseselevadas. Em doses pequenas, ele inibe não especificamente várias quinasescelulares e também inibe o ponto de verificação Gl (Tenzer et al, Curr. MedChem. Anticancer Agents, 3: 35-46, 2003).

UCN-01 tem sido usado em conjunto com terapias do câncer,como radiação, o agente anti-câncer camptotecina (Tenzer et al, supra), egemcitabina (Shi et al, supra), com sucesso limitado. Além disso, o UCN-01tem sido usado para potenciar os efeitos do reparo mal combinado (MMR) deDNA induzido por temozolomida (TMZ) em células de glioblastoma (Hiroseet al., Câncer Res., 61:5843-5849,2001). Na clínica, o UCN-01 não é umquimioterapêutico efetivo conforme o esperado, possivelmente devido a umafalha na programação do tratamento um e falta de identificação dos alvosmoleculares chave específicos (Grant et al., Drug Resistance Updates, 6: 15-26, 2003. Assim sendo, Mack et al. relatam a potência dependente do ciclocelular de cisplatina pelo UCN-01 em uma linha de células de carcinoma dopulmão em uma célula cultivada não pequena, mas não identificam comespecificidade o ponto de verificação do ciclo celular chave visado pela UCN-01. (Mack et al., Câncer Chemother. Pharmacol., 51 (4): 337-348, 2003).

Existem várias outras estratégias para sensibilização dascélulas de tumores para o tratamento com quimioterapêuticos que afetam ociclo celular. Por exemplo, a administração de 2-aminopurina anula osmecanismos múltiplos do ponto de verificação do ciclo celular, como a paradaGl induzida por mimosina ou a parada da fase S induzida por hidroxiuréia,permitindo que a célula progrida para dentro e através da mitose (Andreassenet al, Proc Natl Acad Sei U.S.A., 86: 2272-2276,1992). Cafeína, umametilxantina, também tem sido usada para aumentar a cito-toxidez dosagentes que danificam o DNA, como radiação cisplatina e ionizante, atravésda mediação da progressão através do ponto de verificação G2 e dessa formainduzindo a morte da célula (Bracey et al., Clin. Câncer res., 3:1371-1381,1997). Todavia, a dose de cafeína usada para se conseguir a anulação dociclo celular excede os níveis clinicamente aceitáveis e não é uma opçãoterapêutica viável. Adicionalmente, os nucleotídeos anti-sensibilizantes àquinase Chkl têm sido usados para aumentar a sensibilização ao inibidor detopoisomerase BNP1350 (Yin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.,295:435-44, 2002), mas demonstram problemas tipicamente associados com otratamento anti-sensibilizante de terapia de genes.

Tem sido apresentado inibidores de Chkl, incluindo oscompostos de uréia substituídos por arila e heteroarila descritos na solicitaçãode patente americana de número 10: 087.715 e nas solicitações de patentesamericanas provisórias de número 60/583.080, 60/585.292, e 60/602.968; oscompostos de diaril uréia descritos na publicação da patente americana denúmero 2004/0014765, publicação de patente americana númeroUS2003/199511, publicação de patente americana número 2004/0014765, eWO 03/101444; metilxantinas e compostos relacionados descritos em Fan etal., Câncer Res. 55: 1649-54. 1995; ureidotifenos descritos na WO 03/029241e na WO 03/028731; N-pirrolopiridinil carboxamidas descritas na WO03/028724; oligonucleotídeos Chkl anti-sensibilizantes descritos na WO01/57206 e na patente americana número 6.211.164; os antagonistasreceptores de Chkl descritos na WO 00/16.781; derivados heteroaromáticosde carboxamida descritos na WO 03/037886; aminotiofenos descritos na WO03/02 9242; (indazolil) benzimidazóis descritas na WO 03/004488;benzimidazol quinolinas descritas na publicação de patente americana denúmero 2004 0092535 e WO 04/018419; hidroxiimino-fluorenosheterocíclicos descritos na WO 02/16.326; derivados de sitonemano, comositonemina, descritos na patente americana de número 6.495.586; eheteroarilbenzamidas descritas na WO 01/53.274; indazóis descritas na WO01/53.268; indolcarbazóis descritas em Tenzer et al., supra; derivadoscromano descritos na WO 02/070515; paulonas descritos em Schultz et al., J.Med. Chem., vol: 2909-2919,1999; indenopirazóis descritos em WO99/17.769; flavonas descritas em Sedlacek et al., Int J. Oncol., 9:1143-1168,1996; derivados de peptídeos do circuito de peptídeos de serina treoninaquinases descritos na WO 98/53.050; oxindóis descritos na WO 03/051838;diazepinoindolonas descritos na WO 2004/063198; pirimidinas descritos naWO 2004/048343; compostos de uréia descritos na WO 2004/014876; epirrolocarbazóis, benzofuroisoindóis, e azaciclopentafluorenos descritos naWO 2003/091255.No entanto, permanece a necessidade na arte por inibidoresefetivos e seletivos de Chkl. A presente invenção trata desta e de outrasnecessidades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a inibidores potentes e seletivosdo ponto de verificação de quinase Chkl que apresentam propriedadesinesperadas nos ensaios bioquímicos e/ou baseados em células. Os inibidoresatuais de Chkl são úteis no tratamento de indicações envolvendo aproliferação de células aberrantes, e como agentes quimio-sensibilizantes erádio-sensibilizantes no tratamento de indicações relacionadas com danos doDNA ou lesões na replicação de DNA.

Assim sendo, um aspecto da presente invenção é apresentarcompostos da fórmula estrutural (I). Entre outras coisas, os compostos sãoúteis em um método para a inibição de Chkl composto de uma etapa deadministração de uma quantidade efetiva de um composto da fórmulaestrutural (I) a um indivíduo necessitando do mesmo.

Os compostos da fórmula (I) têm a fórmula estrutural:

<formula>formula see original document page 11</formula>

onde R1 é halogênio, alquila C1.3, CN, ou CF3;

R2 é hidrogênio, alquila C1.3, CN, alquila OQ.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila Q.3;

R3 é um anel heterocíclico saturado com seis ou sete membroscontendo um grupo do anel N-Ra e um segundo grupo do anel N-Ra, umoxigênio do anel, ou um enxofre do anel, onde Ra, independentemente, éhidrogênio, alquila Ci_3,CH2CN, ou CH2CH2CN, e onde R3 opcionalmente ésubstituído com oxo (=0);

R4 é hidrogênio, alquila C1.3, alquila OC1.3, alquila SC1.3,NRb)2, NRbC(=0)alquila C1.3, ou um anel heterocíclico saturado com cinco ouseis membros contendo um grupo N-Ra e opcionalmente substituído por anelcom um a três grupos alquila C1.3;

ou R2 e R4 em conjunto com os carbonos nos quais eles sãoligados são tomados para formar um anel carbocíclico saturado com cinco asete membros;

e R5 é hidrogênio ou halogênio,

desde que pelo menos um dos R2 e R4 seja diferente dehidrogênio, e que quando R5 é halogênio, R2 ou R4 é hidrogênio,

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, pró-drogas, ou solvatosdos mesmos.

Outro aspecto da presente invenção é apresentar compostoscom a fórmula estrutural (II) os quais, entre outras aplicações, podem serutilizados em um método para a inibição de Chkl.

<formula>formula see original document page 12</formula>

onde R1 é halogênio, alquila C1.3, CN, ou CF3;

R2 é hidrogênio, alquila C1.3, CN, alquila OQ.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila Ci_3;

R4 é hidrogênio, alquilaCi.3, alquila OC1.3, ou halogênio;ou R2 e R4 em conjunto com os carbonos nos quais eles sãoligados são tomados para formarem um anel carbocíclico saturado com cincoa sete membros,desde que pelo menos um dos R2 e R4 seja diferente dehidrogênio,

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, pró-drogas, ou solvatosdos mesmos.

Outro aspecto da presente invenção é apresentar composiçõesfarmacêuticas compostas de um ou mais composto com a fórmula estrutural(I) ou (II), e o uso das composições em um tratamento terapêutico de umaindicação, onde a inibição de Chkl, in vivo ou ex vivo, produz um benefícioterapêutico ou é de interesse para pesquisa ou diagnóstico.

Ainda outro aspecto da presente invenção é apresentar ummétodo para a sensibilização de células em um indivíduo sofrendo de umtratamento quimioterapêutico ou rádio-terapêutico para uma indicaçãocomposto da administração de um composto da fórmula estrutural (I) ou (II)em combinação com um agente quimioterapêutico, um agente rádio-terapêutico, ou ambos, ao indivíduo. Uma indicação não limitante tratada poreste método é um câncer.

Outro aspecto da presente invenção é apresentar um métodopara a inibição ou prevenção de proliferação de célula aberrante. Em umarealização, o método é composto do contato de uma população de célulascompostas de células aberrantemente proliferantes com pelo menos umativador Chkl em uma quantidade e durante um tempo suficiente parasubstancialmente sincronizar a parada do ciclo celular entre as célulasaberrantemente proliferantes. Após obter a sincronização substancial daparada do ciclo celular na população de células, a população de células écontatada com pelo menos um inibidor de Chkl em uma quantidade e duranteum tempo suficiente para anular substancialmente a parada do ciclo celular.

Outro aspecto da presente invenção é apresentar um artigoproduzidos para uso farmacêutico composto de:

(a) uma composição farmacêutica composta de um compostocom a fórmula estrutural (I) ou (II);

(b) uma inserção de pacote desde que a composição seja útilno tratamento de indicações envolvendo a proliferação de célula aberrante; e

(c) um recipiente.

Outro aspecto da presente invenção é apresentar:

(a) uma composição farmacêutica composta de um compostoda fórmula estrutural (I) ou (II);

(b) uma inserção de pacote desde que a composição seja útilcomo um quimio-sensibilizante ou rádio-sensibilizante em um tratamento de uma indicação relacionada com lesões do DNA ou replicação do DNA;

(c) um recipiente.

Estes e outros aspectos da presente invenção ficarão aparentesa partir da seguinte descrição detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os compostos da presente invenção têm a fórmula estrutural (I):

<formula>formula see original document page 14</formula>

onde R1 é halogênio, alquila Q.3, CN, ou CF3;

R2 é hidrogênio, alquila C1.3, CN, alquila OC1.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila d_3;

R4 é hidrogênio, alquila C1.3, alquila OC1.3, alquila SC1.3,N(Rb)2, NRbC(=0)alquila C1.3, ou um anel heterocíclico saturado com cincoou seis membros contendo um grupo N-Ra e opcionalmente substituído poranel com um a três grupos alquila Ci.3;

e R5 é hidrogênio ou halogênio,

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, pró-drogas, ou solvatosdos mesmos.

Em uma realização preferida, os compostos têm a formaestrutural (II):

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde R1 é halogênio, alquila C1.3, CN, ou CF3;

R2 é hidrogênio, alquila C1.3, CN, alquila OC1.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila C1.3;

R3 é um anel heterocíclico saturado com seis ou sete membroscontendo um grupo do anel N-Ra e um segundo grupo do anel N-Ra, umoxigênio do anel, ou um enxofre do anel, onde Ra, independentemente, éhidrogênio, alquila C1.3, ou CH2CN, e onde R3 opcionalmente é substituídocom oxo (=0);

R4 é hidrogênio, alquilaCi_3, alquila OC1.3, ou halogênio;

ou R2 e R4 em conjunto com os carbonos nos quais eles sãoligados são tomados para formarem um anel carbocíclico saturado com cincoa sete membros,desde que pelo menos um dos R2 e R4 seja diferente de hidrogênio,

ou sais farmaceuticamente aceitáveis, pró-drogas, ou solvatosdos mesmos.

Em uma realização preferida dos compostos das fórmulas (I) e(II), R1 é cloro, metila, CN, ou CF3.

Em outra realização preferida, R2 é hidrogênio, metila, etila,cloro, bromo, dimetilamino, ciano, ou metóxi.

Em mais realizações preferidas, R2 é diferente de hidrogênio.

Em outras realizações preferidas com as fórmulas (I) e (II), R4é metila, cloro, flúor, metóxi, isopropoxila, dimetilamino,-SCH3,-NHC(=0)CH(CH3)2,-NHC(K))CH3, pirrolidinila, ou 3,3-dimetil-pirrolidinila.

Em mais realizações preferidas, R4 é metila, cloro, ou metóxi.Ainda em outra realização preferida, R2 e R4 em conjunto com os carbonosnos quais eles são ligados são tomados para formarem um anel carbocíclicosaturado com cinco membros ou seis membros.

Ainda em outra realização preferida das fórmulas (I) e (II),quando R5 é halogênio, R4 é hidrogênio.

Em uma realização preferida, R5 é flúor. Em mais realizaçõespreferidas, R5 é hidrogênio.

Em uma realização das fórmulas (I) e (II), quando R1 ciano, R2é hidrogênio e R4 de preferência é cloro ou metila. Em outra realização, R5 éflúor, R4 é hidrogênio, e R2 é metila, cloro, ou bromo.

Exemplos de grupos R3 preferidos com as fórmulas (I) e (II)incluem, mas não são limitados a,<formula>formula see original document page 17</formula>

Conforme usado aqui, o termo "alquila C1.3" inclui gruposalquila de cadeia linear e ramificada contendo um a três átomos de carbono,i.e., metila, etila, n-propila, e isopropila.

"Halogênio" é definido aqui como flúor, cloro, bromo, e iodo.

"Ciano" é definido como-CN.

"Trifluoro metila" é definido como significando-CF3.

A abreviatura "Me" é metila, i.e.,-CH3.

Agentes que danificam o DNA que ativam os pontos deverificação do ciclo celular geralmente são referidos aqui como "ativadores deponto de verificação". Os agentes que danificam o DNA que ativam o pontode verificação designados por "Chkl" (pronunciado como "check-one") sãoreferidos aqui como "ativadores de Chkl".

Da mesma forma, inibidores de tais pontos de verificação sãoreferidos aqui como "Inibidores de ponto de verificação" e "inibidores deChkl", respectivamente.

Conforme usado aqui, os inibidores de Chkl são compostosque são capazes de anular pelo menos parcialmente pelo menos uma atividadede ponto de verificação de ciclo celular da proteína Chkl. A anulação de umponto de verificação do ciclo celular é feita quando o mecanismo do ponto deverificação celular é superado o suficiente para permitir que a célula passe dafase de ciclo celular na qual ela é interrompida para a fase seguinte do ciclocelular ou para permitir que a célula passe diretamente a uma célula morta. Aanulação de um ponto de verificação de ciclo celular permite que a célulatransporte material genético danificado ou imperfeito para a fase seguinte dociclo celular, dessa forma induzindo ou promovendo a morte da célula. Amorte da célula pode ocorrer por qualquer mecanismo, incluindo apoptose ecatástrofe mitótica. Os compostos da invenção são inibidores de Chkl.

O ativador de Chkl inclui qualquer agente conhecido oudescoberto posteriormente tendo a habilidade de ativar a atividade quinaseChkl, e portanto induzir pelo menos a parada parcial do ciclo celular. Osativadores de Chkl incluem agentes capazes de interromper o ciclo celular emqualquer fase do ciclo celular, cuja fase poderá ser referida aqui como " fasevisada" para aquele ativador. As fases visadas incluem quaisquer das fases dociclo celular, exceto a mitose, i.e., quaisquer das fases Gl, S, e G2. Osativadores de Chkl úteis na invenção incluem os agentes que danificam oDNA, tais como agentes quimioterapêuticos e/ou de radiação. Os ativadoresde radiação Chkl incluem, mas não são limitados a, radiação por ionização. Aradiação por ionização inclui a radiação eletromagnética ou de particuladoscapaz de produzir pares de íons através da interação com a matéria. Aradiação por ionização inclui raios x e gama, partículas alfa e beta, nêutrons enúcleos carregados. A radiação inclui luz ultravioleta, luz visível, radiaçãoinfravermelha, radiação de microondas, e misturas dos mesmos. Ensaioscomo aqueles descritos no exemplo 8 podem ser usados para se determinar seum agente é um ativador de Chkl.

"Inibição da proliferação de célula aberrante" significa retardara velocidade na qual as células proliferantes aberrantemente proliferam oueliminam tal proliferação em conjunto. Esta inibição pode resultar de umaredução da replicação, de um aumento da morte celular, ou de ambos. Amorte celular pode ocorrer através de qualquer mecanismo, incluindoapoptose e catástrofe mitótica.

A "prevenção da proliferação de célula aberrante" significa ainibição da proliferação de célula aberrante antes da ocorrência, ou a inibiçãoda recorrência da mesma.

"In vivo" significa dentro de um indivíduo vivo, como dentrode um animal ou ser humano. Neste contexto, podem ser usadosterapeuticamente agentes in vivo para retardar ou eliminar a proliferação decélulas aberrantemente replicantes. Os agentes também podem ser usados invivo como profilaxia para evitar a proliferação de célula aberrante ou amanifestação de sintomas associados a mesma.

"Ex vivo" significa fora de um indivíduo vivo.

Exemplos de populações de células ex vivo incluem culturasde células e amostras biológicas como amostras de fluidos ou tecidos de sereshumanos ou animais. Tais amostras podem ser obtidas por intermédio demétodos bem conhecidos na arte. Amostras de fluidos biológicos de exemploincluem sangue, fluidos cérebro espinhal, urina, saliva. Amostras de exemplosde tecidos incluem tumores e biópsias. Neste contexto, os compostos atuaisem numerosas aplicações podem ser tanto terapêuticos como experimentais."Rádio-sensibilizante", conforme usado aqui, significa umcomposto, que é administrado a um ser humano ou outro animal em umaquantidade terapeuticamente efetiva para aumentar a sensibilização dascélulas à radiação eletromagnética e/ou para promover o tratamento dedoenças tratáveis com a radiação eletromagnética.

"Radiação" conforme usado aqui inclui, mas não é limitado a,radiação tendo comprimentos de onda na faixa de IO"20 a 100 metros.

O termo "recipiente" significa qualquer receptáculo einvólucro do mesmo adequado para a estocagem, despacho, aplicação, e/oumanuseio de um produto farmacêutico.

O termo "Bula da embalagem" significa a informaçãoacompanhando o produto, que fornece uma descrição de como administrar oproduto, juntamente com os dados de segurança e eficácia requeridos parapermitir que o médico, farmacêutico, e o paciente façam uma decisão beminformados em relação ao uso do produto. A bula da embalagem geralmente éolhada como o "rótulo" para um produto farmacêutico.

A presente invenção inclui todos os estereoisômeros possíveisde isômeros geométricos dos compostos da fórmula estrutural (I) ou (II). Apresente invenção inclui não somente compostos racêmicos, mas tambémisômeros oticamente ativos. Quando um composto com a fórmula estrutural(I) ou (II) é desejado como um só enanciômero, ele pode ser obtido através deresolução do produto final ou através de síntese estéreo específica de ummaterial inicial isomericamente puro ou pelo uso de um reagente auxiliarquiral, como por exemplo, ver Z.Ma et al., Tetrahedron: Asymmetry, 8(6),883-888 (1997). A resolução do produto final, um intermediário, ou ummaterial inicial pode ser conseguida por qualquer método adequadoconhecido na arte. Adicionalmente, em situações onde os tautômeros doscompostos da fórmula estrutural (I) ou (II) são possíveis, a presente invençãose destina a incluir todas as formas tautoméricas dos compostos. Conformedemonstrado abaixo, os estereoisômeros específicos podem apresentar umahabilidade excepcional para inibir o Chkl em combinação com tratamentosquimioterapêuticos ou rádio-terapêuticos.

Pró-drogas de compostos da fórmula estrutural (I) ou (II)também podem ser usados como o composto em um método da presenteinvenção. Está bem estabelecido que uma estratégia de pró-droga, quando umcomposto é derivado para uma forma adequada para a formulação e/ouadministração, e então liberado como uma droga in vivo, tem sido utilizadacom sucesso para transitoriamente (por exemplo, bio-reversivelmente) alteraras propriedades psíquico-químicas do composto (ver, H. Bundgaard, Ed.,"Design of Prodrugs", Elsevier, Amsterdam, (1985); R.B. Silverman, "TheOrganic Chemistry of Drug Design and Drug Action, "Academic Press, SanDiego, capítulo 8, (1992); K.M. Hillgren et al., Med. Res. Rev., 15, 83 (1995)).

Os compostos da presente invenção contêm um ou maisgrupos funcionais. Os grupos funcionais, se desejado ou necessário, podemser modificados para produzirem uma pró-droga. Pró-drogas adequadasincluem, por exemplo, derivados ácidos, tais como amidas e ésteres. Tambémé considerado por aqueles adestrados na arte que os N-óxidos podem serusados como uma pró-droga.

Os compostos da invenção podem existir como sais.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos dainvenção geralmente são preferidos nos métodos da invenção. Conformeusado aqui, o termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais ouformas zuiteriônicas dos compostos da fórmula estrutural (I) ou (II).

Os sais dos compostos da fórmula (I) ou (II) podem serpreparados durante o isolamento e purificação final dos compostos ouseparadamente, pela reação do composto com um ácido tendo um cátionadequado. Os cátions adequados farmaceuticamente aceitáveis incluem metaisalcalinos (por exemplo, sódio ou potássio) e cátions de metais alcalinoterrosos (por exemplo, de cálcio ou magnésio). Além disso, os saisfarmaceuticamente aceitáveis dos compostos da fórmula estrutural (I) ou (II)que contêm um centro básico são sais de adição ácidos formados com ácidosfarmaceuticamente aceitáveis.

O exemplos de ácidos que podem ser utilizados para formarsais farmaceuticamente aceitáveis inclui ácidos inorgânicos tais como oclorídrico, brômico, sulfurico, e fosfórico, e os sais orgânicos, tais comooxálico, maleico, succínico, malônico, e cítrico. Exemplos não limitantes desais de compostos da invenção incluem, mas não são limitados a sais de,cloridrato, bromato, iodato, sulfato, diz sulfato, 2-hidróxi etano sulfonato,fosfato, bifosfato, acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato,canforato, canforsulfonato, citrato, di gluconato, glicerofosfato, hemisulfato,heptanoato, hexanoato, formiato, succinato, malonato, fumarato, maleato,metanossulfonato, mesitileno sulfonato, nafítileno sulfonato, nicotinato, 2-naftaleno sulfonato, o oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, tricloro acetato, trifluoro o acetato,glutamato, bicarbonato, para tolueno sulfonato, undecanoato, lactato, citrato,tartarato, gluconato, benzeno sulfonato, e p-tolueno sulfonato. Além disso, osgrupos amino disponíveis presentes nos compostos da invenção podem serquaternizados com metila, etila, propila, the butil cloretos, brometos e iodetos;

Em dimetila, dietila, de butila, e diamil sulfato; decila, laurila,miristila, e cloretos, brometos, de iodetos de esterila; e brometos de benzila defenetila. a luz do que foi mencionado anteriormente, qualquer referência àcompostos da presente invenção que aparecem aqui se destina a incluircompostos com a fórmula estrutural (I) ou (II) assim como os sais, solvatos, opró-drogas farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Exemplos não limitantes de compostos da presente invençãosão:<formula>formula see original document page 23</formula><formula>formula see original document page 24</formula><formula>formula see original document page 25</formula><formula>formula see original document page 26</formula><formula>formula see original document page 27</formula><formula>formula see original document page 28</formula><formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula><formula>formula see original document page 31</formula><formula>formula see original document page 32</formula><formula>formula see original document page 33</formula><formula>formula see original document page 34</formula><formula>formula see original document page 35</formula>

l-[5-metil-2-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metilpirazin-2-il)-uréia(LRMS (ES, positivo) m/e-372,4)

<formula>formula see original document page 35</formula>

l-[5-metil-2-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-feml]-3-(5-metilpirazin-2-^(LRMS (ES, positivo) m/e-392,4)

<formula>formula see original document page 35</formula>

1 -(5 -ciano-pirazin-2-il)-3 - [2-( 1,4-dimetil-piperazin-2-ilmetoxi)-5 -metil-fenil] -uréia

(LRMS (ES, positivo) m/e-396,4)

<formula>formula see original document page 36</formula>

1 - [5 -cloro-2-R-( 1 -metil-piperazin-2-ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivo) m/e-391,3)

<formula>formula see original document page 36</formula>

1 - [5 -bromo-2-R-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-feriil] -3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivo) m/e-438,0)

-(5-ciano-pirazina-2-il)-3-[5-metil-2-R-(4-metil-morfolina-2-il metóxi)-fenil]-o uréia(LRMS (ES, a positivo) que m/e-383,0 )

<formula>formula see original document page 37</formula>

1 -[5-cloro-2-(4-metil-[ 1,4]oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazina-2-il) uréias

(LRMS (ES, positivo) m/e-406,0

<formula>formula see original document page 37</formula>

1 -[5-cloro-2-S-(5-oxo-o morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-piperazina-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivo ) m/e-392,2 )

<formula>formula see original document page 37</formula>

ON-[2-cloro-4-[3-(5-metil-pirazina-2-il)-ureido]-5-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-acetamidaA (LRMS (ES, positivo ) m/e-435,0

<formula>formula see original document page 38</formula>

O 1 -[5-cloro-3-flor-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-piperazina é-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivos ) m/e-396,3) e

<formula>formula see original document page 38</formula>

OI-[5 metóxi e-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil ]-3-(5 o-metil-pirazina-2-il)-uréia (LRMS (ES, positivo) m/e-374,3)

<formula>formula see original document page 38</formula>

l-[5-metóxi e-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazina-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivo ) m/e-358,3)<formula>formula see original document page 39</formula>

l-[4-cloro-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazina-2-il)-uréia(LRMS (que ES, positivo ) m/e-378,3 )

<formula>formula see original document page 39</formula>

01-[5-cloro-4-fluoro -2-(S-morfolina que-2-ilmetoxi)-fenil ]-3-(5-metil-pirazina que-2-il)-o uréia(LRMS (ES, positivo ) m/e-396,1 )

<formula>formula see original document page 39</formula>

1 -[ a 5-ciano-4-metil-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazinaque-3-il)-a Uréia

(LRMS (ES, positivo ) m/e-383,3)<formula>formula see original document page 40</formula>

O 1 -[5-cloro-4-dimetilamino-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil ]-3-(5-metil-pirazina-2-il)-uréia

(LRMS que (ES, positivo) m/e que-421,2)

<formula>formula see original document page 40</formula>

N-2[ cloro [4-[3-( a 5-metil-pirazina-2-il)-ureido]-5-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-isobutiramida

(LRMS (ES, positivo ) m/e-463,2)

<formula>formula see original document page 40</formula>

l-(5-metil-pirazina-2-il)-3-[5-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-indan-5-il]-uréia(LRMS (ES, positivo) m/a e-que 384,3)<formula>formula see original document page 41</formula>

l-[5-cloro-2-( e 4 que-ciano metil-tio morfolina-2-ilmetoxi)-fenil ]-3-(5-emetil-pirazina-2-il)-uréia

(LRMS (ES, positivo ) m/e 433,0

<formula>formula see original document page 41</formula>

l-{5-cloro-2-[4-(2-ciano-e etil )-S-morfolina-2-ilmetoxi]-e fenil )-3-(5-metil-o pirazina-2-il)-uréia

LRMS (ES, positivos) m/e-431,0)

<formula>formula see original document page 41</formula>

l-[5-cloro-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-4-pirrolidina-l-il-fenil]-3-(5-metil-piperazina-2-il que)-uréia

(LRMS (ES, positivo ) m/e que-447,2)<formula>formula see original document page 42</formula><formula>formula see original document page 43</formula><formula>formula see original document page 44</formula>

ou sais, solvatos (por exemplo, hidratos), o pró-drogas e dos mesmos.

Os compostos da presente invenção podem ser administradosterapeuticamente como o produto químico puro, mas é preferível administraros compostos como uma composição com formulação farmacêutica. Assimsendo, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica compostade um composto da fórmula (I) ou (II) junto com um diluente e o veículo dosmesmos farmaceuticamente aceitável. Também é apresentado um processopara a preparação de uma composição farmacêutica composta da mistura deum composto da fórmula (I) com (II) com um diluente e o veículo do mesmofarmaceuticamente aceitável.

Assim sendo, a presente invenção apresenta ainda formulaçõesfarmacêuticas compostas de um composto com a fórmula estrutural (I) ou (II),ou um sal, pró-droga ou solvato do mesmo farmaceuticamente aceitável,juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e,opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos e/ou profiláticos. Os veículossão "Aceitáveis" no sentido de ser compatíveis com os outros ingredientes daformulação de e não prejudiciais à ao recipiente da mesma.

Os compostos da invenção, inesperadamente, apresentam umapotência. A potência tipicamente é expressa como a concentração de umcomposto requerida para se obter um certo resultado. Quanto maior for apotência, será requerido menos composto para executar a sua funçãopretendida.

Potência in vitro tipicamente é expressa em termos de valoresIC50 e a medida utilizando-se de um ensaio de resposta a dose. Os valores deIC50 podem ser medidos contatando de um sistema de ensaio sensível comum composto de interesses ao longo de uma faixa de concentrações, incluindoconcentrações nas quais nenhum o um efeito mínimo é observado, atéconcentrações mais elevadas nas quais o efeito parcial é observado, atéconcentrações de saturação nas quais um efeito máximo é observado.Teoricamente, tais ensaios do efeito de resposta da dose dos compostosinibidores pode ser descrita como uma curva sigmoidal expressando 1 ° deinibição como uma função da concentração quando registrados em uma escalalogarítmica. A curva e, teoricamente, também passa através de um ponto noqual a concentração é suficiente para reduzir a atividade e da enzima do pontode verificação até um nível que é 51% daquele da diferença entre a atividademínima e máxima observada no ensaio. Esta concentração é definida como aconcentração inibidora a 50% de inibição ou IC50.

Os valores de IC50 podem ser determinados utilizando-se detécnicas convencionais de ensaio bioquímico (não celular) como técnicas deensaio baseados em células bem conhecidos por aqueles com conhecimentonormal na arte. Um exemplo de tal ensaio é apresentado no exemplo 1 abaixo.

O de preferência, os valores IC50 são obtidos executando esseé o ensaio relevante pelo menos duas vezes com o valor IC50 expresso comoa média (média aritmética, o "") dos valores individuais obtidos. Mais depreferência, o ensaio é repetido em três a dez vezes (ou mais) com o valorIC50 expresso como a média dos valores obtidos. Mais de preferência, oensaio é executado em um número de vezes suficiente para gerar um valormédio é IC50 estatisticamente confiável, utilizando-se métodos estatísticosconhecidos por aqueles de conhecimento normal na arte.

Os compostos da invenção e inesperadamente apresentamvalores IC50 baixos, correspondendo a potenciais in filtro inesperadamenteelevadas. Os compostos da invenção, quando ensaiados conforme descrito noexemplo 1 abaixo apresentam valores IC50 menores do que cerca de 200 nM,em algumas realizações menos de cerca de 150 nM, em outras realizaçõesmenos de cerca de 100 nM, em outras menos de cerca de 50 nM, em outrasmenos de cerca de 10 nM, e em outras menos de cerca de 5 nM. Em outrasrealizações, os compostos da invenção apresentam valores IC50 de cerca de0,1 nM a cerca de 5 nM.

Os compostos da invenção em apresentam seletividade para ainibição de Chkl sobre outras proteínas quinases.

Um a seletividade poderá ser vantajosa na redução de efeitoscolaterais adversos e/ou aumentando o índice terapêutico.

"A seletividade" é expressa que aqui como um "Seletividade edobrada". Em geral, a seletividade dobrada, conforme usado aqui, é o IC50 deum composto de testes para o uma enzima de comparação é dividida peloIC50 de uma enzima compradora. Especialmente, a seletividade e dobradapara um inibidor o Chkl, conforme usado aqui, é o IC50 de um inibidor de FeChkl (um composto de teste) para a Chkl (a enzima de comparação) divididopelo IC50 que para uma enzima compradora. As enzimas compradoras contraas quais os compostos da invenção poderiam ser medidos, incluem pelomenos as seguintes proteínas quinases:Cdc2, Chk2, CTAK, EphAl, EphA2,Erkl, FGFR1, FGR4, IR, JNK1, c-Kit, p38alfa, p38beta, p38delta, Ros, Rse,Rsk2, TrkA, TrkB,, proteína quinas A, proteína quinas C, quepp50v-src,proteína quinases B/Akt-1, p38Mapk, p70S6K, que quinase II dependente decálcio calmodulina, e tirosina quinase abi.

Os ensaios para determinação dos valores de IC50 para umcomposto de testes contra uma enzima compradora são descritos no exemploII e são bem conhecidos por aqueles com conhecimento normal na arte. Oscompostos da invenção apresentam pelo menos cerca de vinte vezesseletividade em relação às proteína quinases testadas mencionadasanteriormente. Em algumas realizações, os inibidores de Chkl da presenteinvenção apresentam pelo menos cerca de 50 vezes a seletividade, em outrasrealizações, pelo menos cerca de 75 vezes a seletividade, em outrasrealizações, pelo menos cerca de 100 * a seletividade na inibição de a Chklem relação às proteínas quinases testadas mencionadas anteriormente.

Os compostos da invenção, inesperadamente, apresentam umapotência elevada em um ensaio com base em célula. Para medir o a potênciacom base em célula de um inibidor de da e Chkl, foi desenvolvido um ensaioque permite que uma pessoa possa medir a concentração do inibidor de Chklrequerida para aumentar os efeitos de inibição do crescimento do de umagente de daninhos de DNA em um modelo com base em célula envolvendocélulas aberrantemente proliferantes. Esta medição de potência com base emcélula é expressa a aqui como um valor "ECrrs", onde "ECrra" é aconcentração efetiva do inibidor de Chkl que produz uma sensibilização duplade uma população de células aberrantemente proliferantes para os efeitos deinibição do crescimento de um agente daninho ao DNA. O ECrrs é calculadocomo sendo a concentração do inibidor de Chkl que reduz a quantidade deagente daninho de DNA requerida para a 90% de inibição do crescimento doda célula pela metade o. Os solicitantes descobriram que os compostos dainvenção, inesperadamente, apresentam valores ECrrs inesperadamentebaixos, correspondendo a potências com base em células inesperadamenteelevadas.

Outro parâmetro que poderá ser medido é a sensibilizaçãodobrado a obtidas em um LD50 (a dose do composto sozinho que inibe ocrescimento do de 50% das células) para o composto de inibidor de Chkl.estes dois valores, ECrrs e sensibilização dobrada no LD50, permitem umaclassificação direta de ambos a potência e a toxidez dos inibidores de Chklcom relação um ao outro.

Um exemplo do ensaio útil para a medição dos valores ECrrs édescrito no exemplo III abaixo. Resumidamente, este ensaio é utilizadacélulas de carcinoma o do colo humano HT29 como a população de célulasaberrantemente proliferantes, gemcitabina como o agente daninho de DNAe/ativador de Chkl, e um composto da invenção como o inibidor de Chkl. Oque a população de células aberrantemente proliferantes é cultivada edeixadas crescer em um meio de crescimento adequado. Posteriormente, ascélulas são submetidas a um agente daninho de DNA ao longo de uma faixade concentrações. Depois de uma quantidade predeterminada de tempo, oagente daninho de DNA é removido, e as células são submetidas a uminibidor de Chkl ao longo de uma faixa de concentrações e durante umperíodo predeterminado de tempo. As placas de culturas cultivadas então sãocolhidas e o número relativo de células sobreviventes é contado. Os dados sãonormalizado. A um o inibidor de Chkl sozinho como o controle, e então sãoregistrados em um gráfico log/log da concentração do agente daninho deDNA contra a sobrevivência e relativa das células (100% sendo igual a 1,0).A sensibilização dobrada a é derivada da diferença entre a quantidade deagente daninho de DNA requerida para se obter 90% de inibição docrescimento como e sem o inibidor de Chkl para cada concentração usada deo inibidor de Chkl. estes dados são então registrados em um gráfico deconcentração do o inibidor de Chkl vb. sensibilização dobrada do qual écalculado o ECrrs.De preferência, os valores de EC^ são obtidos executando-seo ensaio pelo menos duas vezes, com o valor de EC^ expresso como a médiados valores individuais obtidos. Mais de preferência, o ensaio é repetido de 3a 10 vezes (ou mais) com o valor de ECn-s sendo expresso como a média dosvalores obtidos. Mais de preferência, o ensaio é executado um número devezes necessário para gerar um valor EC^ médio estatisticamente confiável,utilizando-se métodos estatísticos conhecidos por aqueles com conhecimentonormal na arte.

Todos os compostos que foram submetidos a um ensaio deECrrs apresentaram valores de EC^ menores do que cerca de 1000 nM. Aocontrário, os compostos estruturalmente semelhantes que eram conhecidosanteriormente apresentaram valores ECn-s em torno de 11.000 nM. Emalgumas realizações, os compostos da presente invenção apresentaram valoresECn-s menores do que cerca de 500 nM, em outros, menores do que cerca de300 nM, em outros, menores do que cerca de 200 nM, em outros, menores doque cerca de 150 nM, em outros, menores do que cerca de 100 nm, em outros,menores do que cerca de 50 nM, em outros, menores do que cerca de 30 nM,e em outros, menores do que cerca de 20 nM, ou menos de cerca de 10 nM,ou em outras realizações, menores do que cerca de 5 nM.

Os compostos e as composições farmacêuticas adequados parauso na presente invenção incluem aqueles onde o ingrediente ativo éadministrado em uma quantidade efetiva para se conseguir o seu objetivopretendido. Mais especificamente, uma "quantidade terapeuticamente efetiva"significa uma quantidade suficiente para tratar um indivíduo sofrendo de umaindicação, ou aliviar os sintomas existentes da indicação. A determinação deuma quantidade terapeuticamente efetiva está bem dentro da capacidadedaqueles adestrados na arte, especialmente a luz da apresentação detalhadaapresentada aqui.

Além do inibidor de Chkl, as composições farmacêuticas dainvenção podem ser formuladas para incluir agentes biologicamente ativos,como citoquinas, linfoquinas, fatores de crescimento, outros fatoreshenatopoiéticos, ou misturas dos mesmos, para reduzir os efeitos colateraisadversos que podem se originar de, ou serem associados com, a administraçãoda composição farmacêutica sozinha. Alternativamente, tais agentesbiologicamente ativos poderão ser incluídos na composição farmacêutica dainvenção para promover um efeito terapêutico desejado. Agentesbiologicamente ativos auxiliares úteis nas composições farmacêuticas dainvenção incluem, mas não são limitados a, M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, TL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14,IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IFN, TNF, G-CSF, Meg-CSF, GM-CSF,trombopoietina, fator de crescimento de célula tronco, eritropoietina,angiopoietina, incluindo Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-y, e/ou o polipeptídiosemelhante a angiopoietina humana, fator de crescimento endotelial vascular(VEGF), angiogecina, proteína-1 morfogênica do osso (BMP-1), BMP-2,BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15, receptor IA de BMP, receptor IBde BMP, fator neurotrófico derivado de cérebro, fator neutrófico ciliario, fator1 quimiotático neutrofil induzido por citoquina receptor de fator neutróficociliario, fator neutrofil quimiotático 2 induzido por citoquina, fator neutrofilquimiotático induzido por citoquina, fator de crescimento de célula endotelial,de endotelina 1, fator de crescimento epidérmico, neutrofil atrativo derivadoeptelial, fator de crescimento do fibroblasto (FGF) 4, FGF 5 FGF 6, FGF 7,FGF 8, FGF 8b, FGF 8c, FGF 9, FGF 10, FGF acidulado, FGF básico,receptor 1 de fator neutrófico derivado de linha de células, receptor de fatorneutrófico derivado de linha de células glial, proteína relacionada com ocrescimento, proteína relacionada com o crescimento, proteína relacionadacom o crescimento, proteína relacionada com o crescimento, fator decrescimento epidérmico de ligação com heparina, fator de crescimento dehepatócito, receptor de fator de crescimento de hepatócito, fator decrescimento I semelhante a insulina, receptor de fator de crescimentosemelhante a insulina, fator de crescimento II semelhante a insulina, proteínade ligação com fator de crescimento semelhante a insulina, fator decrescimento de queratinócito, fator inibidor de leucemia, receptor de fatores einibidor de leucemia, receptor de fator de crescimento de nervos, fator decrescimento de nervos, neurotrofina-3, neurotrofina-4, fator de crescimento deplacenta, fator de crescimento 2 de placenta, fator de crescimento de célulaendotelial derivada de plaqueta, fator de crescimento derivado de plaqueta,cadeia de fator A de crescimento derivado de plaqueta, fator AA decrescimento derivado de plaqueta, fator AB de crescimento derivado deplaqueta, cadeia de fator B de crescimento derivado de plaqueta, fator BB decrescimento derivado de plaqueta, receptor de fator de crescimento derivadode plaqueta, receptor de fator de crescimento derivado de plaqueta, fatorestimulante de crescimento de célula pré-B, fator de célula tronco, receptor defator de célula tronco, fator de crescimento de transformação (TGF), TGF,TGF 1, TGF 1.2, TGF 2, TGF 3, TGF 5, TGF latente 1, TGF, proteína deligação I, proteína de ligação II com TGF, proteína de ligação III com TGF,tipo I de receptor de fatores de necrose de tumor, tipo II receptor de fator denecrose de tumor, receptor de ativador de plasminogeno do tipo uroquinase,fator de crescimento endotelial vascular, e proteínas quiméricas e fragmentosbiologicamente ou imunologicamente ativos dos mesmos.

Os compostos das fórmulas estruturais (I) e (II) tambémpodem ser conjugados ou ligados em radicais auxiliares que promovem umapropriedade benéfica (ou aliviam uma propriedade não desejada) doscompostos em um método de uso terapêutico. Tais conjugados podemaumentar a administração dos compostos para um sítio ou região anatômicoespecífico de interesse (por exemplo, um tumor), permitir concentraçõesterapêuticas prolongadas dos compostos em células alvo, alterar propriedadesfarmacocinéticas e farmacodinâmicas dos compostos, e/ou melhorar o índiceterapêutico ou perfil de segurança dos compostos. Os radicais auxiliaresadequados incluem, por exemplo, aminoácidos, oligopeptídeos, oupolipeptídios, como por exemplo, anticorpos, tais como anticorposmonoclonais e outros anticorpos engenheirados; e ligandos naturais ousintéticos receptores em células ou tecidos alvo. Outros auxiliares adequadosincluem radicais de ácido graxo ou de lipídios que promovem a bio-distribuição e/ou a adsorção do composto através de células alvo (ver, porexemplo, Bradley et al., Clin. Câncer Res. 7:3229,2001).

As formulações da presente invenção podem ser administradasde uma forma standard para o tratamento das doenças indicadas, tais comooralmente, parenteralmente, transmucosamente (por exemplo,sublingualmente ou através de administração bucal), topicamente,transdermicamente, retalmente, e via inalação (por exemplo, inalação nasal ouprofunda de pulmão). A administração parenteral inclui, mas não é limitada aintravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular,intratecal, e intra-articular. A administração parenteral também pode ser feitautilizando-se uma técnica de alta pressão, como POWDERJECT® (Powderject Pharmaceuticals, Plc, Oxford, England).

Para a administração oral e para a administração bucal, acomposição pode estar na forma de tabletes ou pastilhas, formulados de formaconvencional. Por exemplo, os tabletes e cápsulas podem conter excipientesconvencionais, tais como agentes de ligação (por exemplo, xarope, acácia,gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilagem de amido, ou polivinilpirrolidona),cargas (por exemplo, lactose, açúcar, celulose microcristalina, amido demilho, fosfato de cálcio, ou sorbitol), lubrificantes (por exemplo, estearato demagnésio, ácido esteárico, talco, polietileno glicol ou sílica), desintegrantes(por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio), ou agentesumidificantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os tabletes podem serrevestidos de acordo com os métodos bem conhecidos na arte.

Alternativamente, os compostos da presente invenção podemser incorporados em preparações líquidas orais, tais como, por exemplo,suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires.Além disso, as formulações contendo estes compostos podem estar presentescomo um produto seco para a constituição com água ou outro veículoadequado antes do uso. As preparações líquidas podem conter aditivosconvencionais, como por exemplo, agentes de colocação em suspensão, taiscomo xarope de sorbitol, metil celulose, xarope de glicose/açúcar, gelatina,hidroxietil celulose, hidroxipropil metil celulose, carboximetilcelulose, gel deestearato de alumínio, e gorduras comestíveis hidrogenadas; agentesemulsificantes, tais como lecitina, monooleato de sorbitano, ou acácia;veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), tais como óleode amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos, propileno glicol, eálcool etílico; e conservantes, como metil ou propil p-hidroxibenzoato e ácidosórbico.

Também podem ser formuladas preparações comosupositórios, como por exemplo, contendo bases convencionais parasupositórios, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos. Ascomposições para inalação tipicamente podem ser fornecidas na forma deuma solução, suspensão, ou emulsão, que pode ser administrada como um póseco ou na forma de um aerossol utilizando um propelente convencional,como o diclorodifluoro metano ou triclorofluoro o-metano.

Formulações tópicas e transdérmicas são compostas deveículos convencionais aquosos ou não aquosos, tais como gotas para osolhos, cremes, unções, loções, e pastas, ou estão na forma de emplastromedicado, curativo, ou membrana.

Adicionalmente, as composições da presente invenção podemser formuladas para administração através de injeção ou infusão contínua. Asformulações para injeção podem estar na forma de suspensões, soluções, ouemulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes deformulação, tais como agentes de colocação em suspensão, estabilizantes,e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na formade pó para a constituição com um veículo adequado (por exemplo, estéril,água isenta de pirogênio) antes do uso.

Uma composição da presente invenção também pode serformulada como uma preparação de estoque. Tais formulações de longaatuação podem ser administradas através da implantação (por exemplo,subcutaneamente ou intramuscularmente) ou através de injeção intramuscular.Dessa forma, os compostos da invenção podem ser formulados com materiaispoliméricos adequados (por exemplo, polímeros solúveis em água) materiaishidrófobos (por exemplo, uma emulsão em um óleo aceitável), resinas detroca de íons, como derivados grandemente solúveis (por exemplo, um salgrandemente solúvel).

Para o uso veterinário, um composto da fórmula (I) ou (II),como um sal farmaceuticamente aceitável, pró-droga, ou solvato do mesmo, éadministrado como uma formulação adequadamente aceitável de acordo comprática veterinária normal. Os veterinários podem determinar rapidamente oregime de dosagem e a rota de administração que é mais apropriada para umanimal especifico.

Animais tratáveis pelos compostos e métodos atuais incluem,mas não são limitados a, animais domésticos, gado de criação, animais deexibição, espécimes de um zoológico.

MÉTODOS SINTÉTICOS

Os compostos da presente invenção podem ser preparadospelos seguintes esquemas sintéticos. Primeiramente, as alcoxiaril-aminasusadas para a preparação dos inibidores de Chkl descritos aqui podem serpreparados por esquemas sintéticos gerais diferentes. Por exemplo, o esquemageral 1 resume a reação de um nitrofenol com uma forma ativada de umálcool, formado in situ ou preparado e isolado independentemente, paraproduzir um produto de nitrofenil éter. A redução do éter sob condiçõesstandard produz uma arilamina que é usada para a produção de um compostoda invenção.

Esquema geral 1

<formula>formula see original document page 55</formula>

Alternativamente, a reação de um halo nitrobenzeno com umálcool na presença de uma base forte, como o hidreto de sódio ou bis(trimetilsilil) amida de potássio, também produz nitro aril éteres, conformeilustrado no esquema geral 2. Estes éteres então são reduzidos conformeindicado no esquema geral 1.

Esquema geral 2

<formula>formula see original document page 55</formula>

A conversão de uma arilamina em uma uréia pode ser obtidapor um de vários esquemas sintéticos. Por exemplo, uma arilamina pode serreagida com um carbamato de pirazina para produzir uma uréia, conformeilustrado no esquema geral 3.

Esquema geral 3

<formula>formula see original document page 55</formula>

Alternativamente, conforme mostrado no esquema geral 4, adecomposição induzida por calor de uma acil azida produz um aril isocianatoreativo o qual então pode reagir com uma arilamina para produzir a uréiadesejada.Esquema geral 4

<formula>formula see original document page 56</formula>

Outra estratégia, ilustrada no esquema geral 5, utiliza fosgenoou um equivalente a fosgeno para ligar 2 arilaminas e produzir uma uréia.

Esquema geral 5

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As abreviaturas usadas nas sínteses descritas aqui são: h (h),min (min), libras por polegada quadrada (psi), saturado (sat'd), água (H20),desionizada (Dl), nitrogênio (N2), hidrogênio (H2), paládio sobre carbono(Pd/C), oxido de platina ( Pt20), sulfato de magnésio ( MgS04), ácidoclorídrico (HC1), diisopropil azodicarboxilato (DIAD), cloreto de metileno(CH2C12), clorofórmio (CHC13), metanol (MeOH), hidróxido de amônio(NH4OH), tetraidrofuran (THF), N-metilpirrolidona (NMP), ácido acético(AcOH), NaOH (NaOH), EtOAc (EtOAc), etanol (EtOH), dimetil sulfóxido(DMSO), dimetil sulfóxido deuterado ( dô-DMSO), carbonato de sódio(Na2CC>3), clorofórmio deuterado (CDCI3), bicarbonato de sódio (NaHC03),hidreto de sódio (NaH), TEA (TEA), carbonato de césio (CS3CO3), dióxidode carbono (C02), hidróxido de paládio ( Pd(OH)2), ácido sulfurico (H2S04),ácido nítrico (HNO3), cloreto de sódio (NaCl), sulfato de sódio (Na2S04), edimetil-formamida (DMF).

Preparação de compostos

Os seguintes compostos da presente invenção forampreparados utilizando-se os esquemas gerais apresentados acima. Oscompostos adicionais da invenção podem ser preparados utilizando-se osesquemas gerais acima, e as seguintes sínteses especificas, através de umaseleção criteriosa dos materiais iniciais.Composto 1

<formula>formula see original document page 57</formula>

1 - [5 -cloro-2- S-( [ 1,4] oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréiaEtapa 1: 2-amino-5-metilpirazina. Um sal deaminomalononitrila p-toluenossulfonato (20,0 g, 79 mmols) e piruvaldeido 1-oxima (6,88 g, 79 mmols) foram combinados em um frasco. Foi adicionadoiPrOH (140 ml), e a suspensão amarela resultante foi deixada sob agitação natemperatura ambiente durante 18h, durante cujo tempo foi acumulado umprecipitado amarelo. A mistura foi filtrada e o precipitado foi lavado comiPrOH (2 x 50 ml) e H20 Dl (20 ml), e então liofilizada para produzir 2-amino-3-ciano-5-metilpirazina N-óxido (10,7 g).

O pirazina N-óxido foi colocado em suspensão em MeOH (22ml) e AcOH (5 ml). Foram cuidadosamente adicionados na mesma, 5% dePt/C (1,6 g) e Darco KB-B (8 g). A mistura foi deixada absorver H2 a 60 psi(414 kPa) durante 18h. A reação foi interrompida com NaOH a 25% (34 ml) epurgada com N2 durante 30 minutos. A mistura foi filtrada através de um leitode celite úmido e lavada com MeOH (4 x 100 ml). O filtrado foi concentradoa vácuo até um quarto do volume. O filtrado foi diluído com EtOAc (150 ml)e lavado com NaOH a 5% (30 ml) e extraído de volta com EtOAc ( 2 x 70ml). As camadas orgânicas foram combinadas e lavadas com NaCl safd (20ml), filtradas, e concentradas a vácuo para produzir um sólido pegajosolaranja (5,16 g).

Etapa 2: Fenil éster do ácido (metilpirazin-2-il) carbâmico. 2-amino-5-metilpirazina (5,16 g, 47 mmols) foi dissolvido em CH2C12 (52 ml),agitado e resfriado até 0°C sob N2. Foi adicionado ao mesmo piridina (4,8 ml,59 mmols) seguido por cloroformiato de fenila (6,2 ml, 59 mmols), gota agota, durante 15 minutos, fazendo com que fosse formado um precipitado. Amistura foi agitada a 0°C durante hora. Então a reação foi resinada com HC10,25 M (40 ml) e éter anidro (50 ml), e agitada a 0°C, durante 30 minutos. Oprecipitado foi isolado através de filtração, lavado com H20 Dl (20 ml) e éter(2 x 25 ml), e secado sob vácuo para produzir o produto (7,4 g) como um pófofo branco.

Etapa 3: terc-butil éster do ácido (S)-2-hidroximetil-[l,4]oxazepano-4-carboxilico. Em um frasco de fundo redondo de 250 ml foiadicionado (S)-(+)-benzil glicidil éter (1,31 g, 7,9 mmols), 3-benzilamino-propan-l-ol (1,3 g, 7,9 mmols) e 10 ml de EtOH. A mistura foi aquecida a40°C durante 15h. A reação foi resinada e concentrada a vácuo e o produtooleoso resultante foi usado sem purificação adicional. O diol foi colocado emum frasco de fundo redondo de 250 ml e dissolvido em 75 ml de piridina seca.A solução foi resfriada a 0°C e cloreto de tolueno sulfonila (5,27 g, 27,7mmols) foi adicionado em uma porção. A mistura foi agitada durante 6h,mantendo-se cuidadosamente a temperatura da reação em ° 0 C. A reação afrio foi interrompida com 50 mililitros de solução de NaHC03 aquoso. Foramadicionados mais 20 ml de água e a mistura foi extraída três vezes comporções de 100 ml de EtOAc. Os orgânicos combinados foram secados sobNa2SC>4 e concentrados a vácuo. O álcool foi então purificado através decromatografia de coluna utilizando-se um gradiente 25-50% de EtOAc ehexanos como o eluente. Isto produziu 1,39 g de tosil álcool como um óleoamarelo.

O álcool foi dissolvido em 50 ml de DMF e resinado a 0°C.Foram adicionados cuidadosamente na mistura fria agitada NaH a 95% empeso (0,29 g, 11,5m mols). A reação foi agitada a 0°C durante 15 minutos, eentão foi deixada aquecer-se lentamente até a temperatura ambiente e agitadadurante 6h. A reação foi cuidadosamente interrompida com 50 mililitros deágua e foi extraída três vezes com porções de 50 ml de EtOAc. Os orgânicoscombinados foram secados sob Na2S04 e concentrados a vácuo. O produtocru foi colocado em EtOH e colocado em um aparelho de hidrogenação Parr.Foram também adicionados à solução Pd/C a 10% em peso (0,426 g, 0,30mmols) e HC1 2M (2,1 ml). A hidrogenação foi feita a 50 psi (345 kPa)durante dois dias em cujo ponto a reação foi considerada como feita atravésde análise LCMS. A solução foi neutralizada com solução de NaHC03 aquosae extraída utilizando-se uma mistura 3:1 de CHC13:iPrOH. Os orgânicoscombinados foram concentrados sob vácuo e o produto cru foi utilizado para aetapa seguinte.

O amino álcool puro foi dissolvido em 100 ml de CH2C12 seco.Nesta solução foram adicionados TEA (1,59 ml, 11,5 mmols) e di-terc-butildicarbonato (5,74 g, 5,74 mmols). A solução foi agitada na temperaturaambiente durante 18h, e então interrompida com solução aquosa sat'd deNaHC03 e extraída três vezes utilizando-se porções de 50 ml de CH2C12. Osorgânicos combinados foram secados sobre Na2S04 e concentrados a vácuo.O produto foi purificado através de cromatografia de coluna utilizando umgradiente de 25-50% de EtOAc/hexanos. Isto produziu 0,240 g do álcooloxazapano como um óleo amarelo.

Etapa 4: terc-butil éster do ácido (S)-2-(4-cloro-2-nitro-fenoximetil)-[l,4] oxazepano-4-carboxilico. Em um frasco de fundo redondode 50 ml foram adicionados álcool oxazapano (0,240 g, 1,03 mmols), TEA(0,21 ml, 1,545 mmoles), e 10 ml de CH2C12 seco. A solução foi resinada a0°C e foi adicionado gota a gota cloreto de metano sulfonila (0,10 ml). Amistura foi agitada durante 1,5 horas a 0°C e então foi interrompida, a frio,com água. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída umavez com 20 mililitros de CH2C12. Os orgânicos combinados foram secadossobre Na2S04 e concentrados a vácuo. O mesilato cru foi então dissolvido em5 ml de DMF. Nesta solução foi adicionado CS2C03 (0,671 g, 2,06 mmols) e4-cloro-2-nitro-fenol (0, 215 g, 1,24 mmols). Esta solução amarelo brilhantefoi então aquecida a 100°C durante a noite. A reação foi resinada até atemperatura ambiente, interrompida com 50 mililitros de água, e extraída trêsvezes com porções de 50 ml de EtOAc. O produto foi purificado através decromatografia de expansão utilizando-se um gradiente a 10-35% deEtOAc/hexanos. Esta seqüência de etapas produziu 0,120 g de nitrofeniloxazapano como um óleo amarelo brilhante.

Etapa 5: l-(5-cloro-2-([l,4]oxazepan-2-(S)ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. Em um frasco de fundo redondo de 25 ml foicolocado nitrofenil oxazapano (0,120 g, 0,31 mmols) e Pt20 (0,007 g, 0,03mmols) em 5 ml de MeOH. Foi ligado à mesma um balão de hélio, o frascofoi evacuado utilizando um aspirador, e foi enchido outra vez com H2 trêsvezes, e deixado sob agitação sob H2 durante 2h. A reação foi filtrada atravésde celite, o tampão de celite foi lavado duas vezes com porções de 20 ml deMeOH. A solução foi concentrada a vácuo. A anilina crua foi dissolvida em 5ml de DMF seco. Nesta solução foi adicionada TEA (0,005 ml, 0,34 mmols) efenil éster do ácido (5-metilpirazin-2-il)carbamico (0,07 g, 0,31 mmols). Estamistura foi agitada durante 18h na temperatura ambiente. O solvente foiremovido sob vácuo e o resíduo foi redissolvido em 10 ml de EtOAc e lavadocom solução de aquosa sat'd de NaHC03. Os orgânicos foram secados sobreNa2S04 e concentrados em pressão reduzida. O resíduo cinza/marrom foicoberto com 3 mililitros de CH2C12 e foi adicionado a este 1 ml de ácidotrifluoro acético concentrado. Após a adição do ácido todos os sólidos foramdissolvidos. A reação foi agitada na temperatura ambiente durante 4h em cujotempo a solução aquosa safd de NaHC03 é adicionada até que a soluçãoalcance um pH 8. A mistura foi extraída três vezes com porções de 10 ml deuma mistura a 3: de CHC13:iPrOH. Os orgânicos combinados foram secadossob Na2S04 e concentrados a vácuo. Os sólidos diferentes de branco foramentão triturados em EtOAc e filtrados através de um filtro de fritas médio, elavados com 50 mililitros de EtOAc. O sólido branco foi intensamente secadosob vácuo. Esta seqüência produziu 0,020 g da uréia desejada como um póbranco fino. XH-RMN (300 MHz, D6-DMSO) ô ^-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ 10.83 (br s, 1H), 8.39 (dd, 1H), 8.18 (s, 1H) 8.04 (br s, 1H), 6.99(dd, 1H), 6.82 (d, 1H), 4.25-3.98 (m, 2H), 3.90-3.76 (m, 1H), 3.38 (d, 1H),3.13-3.06 (m, 2H), 3.00 (dd, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.06-1.89 (m, 3H). LCMS

(ES, positivo) m/e 392.3 (M+l).

Composto 2

l-[5-cloro-2-(R-morfolin-3-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Etapa 1: terc-butil éster do ácido 3-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxílico. Em uma solução resinada (banho a 0°C de 4-terc-butil éster doácido morfolina-3-R-4-dicarboxílico (1,00 g, 432 mmols) em THF seco (40ml) foi adicionado borano (4,76 ml de solução a 1M em THF, 4,76 mmols),gota a gota, durante 15 minutos sob uma atmosfera de nitrogênio. Depois deagitação durante 1 hora, o banho foi removido e a agitação continuada por mais 3h na temperatura ambiente. Foi então adicionado ácido acético (14,3 mlde solução aquosa a 1M, 14,3 mmols). Depois de agitação durante 1 hora, asolução foi neutralizada através da adição de excesso de bicarbonato de sódioaquoso saturado. Foi adicionado diclorometano (20 ml) e a solução foi agitadadurante 15 minutos, e então as camadas foram separadas. A camada aquosa foi extraída com CH2C12 (3 x 20 ml), e as camadas orgânicas combinadasforam secadas (MgS04), e filtradas. A solução filtrada foi concentrada até umsólido branco (0,46 g).

Etapa 2: Terc-butil éster do ácido 3-(4-cloro-2-nitro-fenoximetil)-R-morfolina-4-carboxílico. Em uma solução agitada e resfriada (banho a 78°C) de terc-butil éster do ácido 3-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico (0,13 g, 0,60 mmols) e 5-cloro-2-fluoro nitrobenzeno (0,11 g, 0,66mmols) em THF seco (40 ml) foi adicionado bis(trimetilsilil) amida depotássio (2,4 ml de solução a 0,5 M em THF, 1,2 mmols) gota a gota durante15 minutos sob atmosfera de nitrogênio. Após agitação por mais 15 minutos,solução de cloreto de amônio aquosa saturada (10 ml) foi adicionada e obanho foi removido para permitir que a solução se aquecesse até atemperatura ambiente. Depois de agitação durante 1 hora, foram adicionadoságua (15 ml) e CH2C12 (10 ml) e agitados durante 5 minutos e as camadasforam separadas. A camada aquosa foi extraída com CH2CI2 (2x10 ml) e ascamadas orgânicas combinadas foram secadas (MgS04), e filtradas. Asolução filtrada foi concentrada até um óleo amarelo (0,26 g) que foipurificado através de cromatografia de coluna eluindo-se com hexanos/EtOAc(1:1) para produzir um óleo amarelo claro (0,195 g).

Etapa 3: Terc-butil éster do ácido 3-(2-amino-4-cloro-fenoximetil)-R-morfolina carboxilico. Em uma solução agitada de terc-butiléster do ácido 3-(4-cloro-2-nitro-fenóxi metil)-R-morfolina carboxilico (0,17g, 0,46 mmols) em MeOH (4 ml) foi adicionado Pt20 (0,020 g, 0,088 mmols).O frasco foi evacuado, e então foi enchido outra vez com H2 durante trêsinterações. Depois de agitação durante 4h, a solução foi filtrada sobre umalcochoado de celite e o filtrado foi concentrado para produzir o produtocomo um óleo amarelo.

Etapa 4: Terc-butil éster do ácido 3-(4-cloro-2-[3-(5-metil-pirazin-2-il)-ureido]-fenóxi metil)-R-morfolina-4-carboxilico. Uma soluçãodo óleo amarelo e do fenil éster do ácido (5-metil-pirazin-2-il)-carbamico(0,13 g, 0,57 mmols) em DMF seco (2 ml) foi preparada e foi adicionadoTEA (0,074 ml, 0,53 mmols). Depois de agitação durante 24h, a reação foiconcentrada sob pressão reduzida, e então redissolvida em água (10 ml) eEtOAc (10 ml). Depois de agitação durante 15 minutos, as camadas foramseparadas e a camada aquosa foi extraída com EtOAc (2 x 10 ml) e ascamadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (10 ml), e entãosecada (Na2S04) e filtradas. A solução filtrada foi concentrada, e entãopurificada através de cromatografia de coluna eluindo-se com EtOAc/CH2Cl2(1:1) para produzir um óleo amarelo (0,8 g).

Etapa 5: l-[5-cloro-2-(R-morfolin-3-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. Em uma solução de terc-butil éster do ácido 3-(4-cloro-2- [3 - { 5 -metil-pirazin-2-il)-ureido] -fenoximetil)-R-morfolina-4-carboxílico (0,8 g) em CH2CI2 (6 ml) foi adicionado ácido trifluoro acético (3ml). Depois de agitação durante 5h, a solução foi tratada com solução aquosade carbonato de potássio (1M) até ficar básica, e então foi agitada durante 30minutos. As camadas foram separadas e a camada aquosa foi extraída comCH2C12 (3 x 10 ml). As camadas orgânicas combinadas foram secadas(MgS04), e filtradas. A solução filtrada foi concentrada, e então purificadapor cromatografia de coluna, diluída com MeOH/CH2Cl2 (1:9), para produzirum sólido amarelo claro (0,0523 g). 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) ô. !H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) ô 10.22 (s, 1H), 9.96 (br s, 1H), 8.74 (s, 1H),8.28 (d, 1H), 8.18 (s, 1H), 7.04 (dd, 2H), 3..94 (m, 3H), 3.71 (br d, 1H), 3.43(m, 1H), 3.23 (m, 2H), 3.34 (br m, 2H), 2.66 (br m, 1H), 2.43 (s, 3H). LRMS(es, positivo) m/e 378,3 (M+l).

Composto 3

l-[2-(l,4-dimetil-piperazin-2-ilmetoxi)-5-metil-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Etapa 1: 1,4-dimetil-2-(4-metil-2-nitro-fenoximetil)-piperazina. 4-metil-2-nitro-fenol (0,95 g,6,20 mmols), (1,4-dimetil-piperazin-2-il)-MeOH (0,98 g, 6,82 mmols), e trifenilfosfina (1,79 g, 6,82 mmols)foram combinados em THF, agitados durante 5 minutos, e então tratados comDIAD (1,38 g, 6,82 mmols). A reação foi deixada sob agitação durante anoite. A concentração sob vácuo produziu um óleo laranja que foi dissolvidoem EtOAC e extraído com solução de HC1 aquosa a 2M. As lavagens aquosasforam combinadas, lavadas com EtOAC, e tratadas com NaOH sólido atéficarem básicas. A mistura aquosa resultante foi extraída com EtOAC e osextratos orgânicos combinados foram secados sobre Na2S04, filtrados econcentrados a vácuo para produzir um óleo marrom. Cromatografia deexpansão (1% MeOH em CH2CI2) produziu 1,0 g do aril éter desejado.

Etapa 2: 2-(l,4-dimetil-piperazin-2-ilmetoxi)-5-metil-fenilamina. l,4-dimetil-2-(4-metil-2-nitro-fenoximetil)-piperazina ( 1,02 g,3,65 mmols) foi dissolvido em MeOH (75 ml) e tratado com solução decloreto de amônio aquoso sat'd até que a mistura se tornou turva. Foiadicionado zinco (0,24 g, 3,65 mmols). A mistura quente resultante da reaçãofoi deixada sob agitação por mais trinta minutos em cujo tempo o LCMSindicou que o material inicial tinha sido consumido. A reação foi diluída comEtOAc e Na2C03 aquoso e as camadas foram separadas. A camada orgânicafoi lavada com solução de NaCl saturada e secada sobre Na2S04 anidro"splid". A mistura foi filtrada e concentrada a vácuo para produzir a anilinadesejada.

Etapa 3: 1 -[2-( 1,4-dimetil-piperazin-2-ilmetoxi)-5-metil-fenilJ-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. Ácido 5-metil-pirazina-2-carboxilico (691 mg,5 mmols) foi agitado em tolueno (15 ml) e tratado como TEA (765 ml, 5,5mmols) seguido por difenilfosforil azida (1,0 ml, 5,0 mmols). A soluçãoresultante foi agitada durante trinta minutos, e então foi utilizada diretamente.

Uma solução de 5-metil-pirazina-2-carbonil azida (1,0 mmols)em tolueno foi aquecida a 90°C durante 10 minutos. O frasco da reação foiremovido do banho de aquecimento e a solução marrom foi tratada com 2-(l,4-dimetil-piperazina-2-ilmetoxi)-5-metil-fenilamina (0,25 g, 1,0 mmols). Ofrasco foi retornado para o banho de aquecimento e aquecido a 40°C durante4h. A mistura foi deixada resfriar-se, e então foi filtrada para produzir oproduto como um pó bronzeado. 'H-RMN (400 MHz, CDC13) ô. !H-RMN(400 MHz, CDC13) 5 10.90 (s, 1, H), 8.4 (s, 1, H), 8.2 (m, 3, H), 6.8 (m, 2, H),4.2 (dd, 1, H), 3.9 (t, 1, H), 3.1 (d, 1, H), 2.8 (br d, 1, H), 2.6 (m, 2, H), 2.5 (s,3, H), 2.4 (m, 1, H), 2.4 (s, 3, H), 2.3 (s, 3, H), 2.25 (m, 1, H), 2.2 (s, 3, H),2.1 (m, 1, H). LRMS (esi, positivo) m/e 385,30 (M+l).

Composto 4

<formula>formula see original document page 65</formula>

l-[4,5-dicloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Etapa 1: Terc-butil éster do ácido (S)-2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilico. Em um frasco de 500 ml foram combinados (S)-benzil glicidil éter (15 g, 91,4 mmols), MeOH (10 ml), e NaOH a 50% empeso (30 ml, 365 mmols). Foi adicionado a esta mistura 2-amino metilsulfato(25,8 g,183 mmols) em porções. Esta mistura heterogênea foi aquecida até40°C em cujo ponto a solução se tornou homogênea. A temperatura foimantida em 40°C durante 4h. A reação foi resfriada ligeiramente e foiadicionado mais NaOH sólido (14,6 g, 365 mmols) juntamente com 50 ml detolueno. A solução bifásica foi então aquecida até 65°C durante 12h. A reaçãofoi resfriada até a temperatura ambiente, e as camadas foram separadas e acamada aquosa foi extraída uma vez com 75 ml de tolueno. As camadasorgânicas combinadas foram lavadas três vezes com porções de HC1 1M de75 ml. O pH das camadas aquosas combinadas foi ajustado até um pH 12 comsolução aquosa de NaOH e extraídas quatro vezes com porções de EtOAC de70 ml. As camadas orgânicas foram secadas sobre Na2S04 e concentradas avácuo para produzirem 10,084 g da morfolina desejada como um óleo opaco.O produto cru de morfolina foi dissolvido em CH2CI2 (100 ml)e TEA (12,1 ml, 87,5 mmols) e foi adicionado di-terc-butil dicarbonato (15,9g,73 mmols) acompanhado pela geração de gás CO2. A reação foi agitada natemperatura ambiente durante 18h, e então foi analisada com solução aquosasatd' de NaHCC>3. Foram adicionados mais 50 ml de água e as camadas foramseparadas. A camada orgânica foi secada sobre Na2SC>4 anidro, concentrada avácuo e purificada através de cromatografia de expansão (20% deEtOAC/hexano) para produzir a N-Boc-O-benzil morfolina desejada comoum óleo amarelo claro (5,536 g).

A morfolina desprotegida purificada foi dissolvida em 50 litrosde EtOH absoluto e foi adicionado Pd(OH)2 (1,26 g, 20% em peso, 1,8mmols). Um balão de hidrogênio foi ligado e o frasco foi evacuadoutilizando-se um aspirador e foi enchido de volta com H2 três vezes. A reaçãofoi agitada sobre H2 durante 30h. A mistura foi filtrada sobre celite, rinsando-se o tampão de celite intensamente com EtOH. A solução filtrada foiconcentrada sob vácuo para produzir o álcool N-boc-morfolina desejadocomo um sólido branco claro (3,918 g).

Etapa 2: 4,5-dicloro-2-nitro-fenol. Um frasco de fundoredondo de 250 ml foi carregado com 3,4-diclorofenol (3,053 g, 18,7 mmols)em 50 ml de CH2CI2 foi resfriado a 0o C em um banho de gelo. Foiadicionado na solução agitada H2S04 concentrado (1,56 ml, 28,1 mmols). Asolução se tornou turva.

Foi adicionado nesta mistura HNO3 concentrado (1,2 ml, 18,7mmols), gota a gota, e cuidadosamente, para manter uma temperatura abaixode 5°C. A reação foi agitada durante 30 minutos a 0°C, e então foi resfriadacom um banho de gelo e finalizada como 150 ml de H20. As camadas foramseparadas e a camada aquosa foi extraída uma vez com 35 ml de CH2CI2. Osorgânicos combinados foram secados sobre Na2S04 anidro, concentrados avácuo e purificados utilizando-se cromatografia de expansão (10%EtOAC/hexanos como o eluente) para produzir o nitrofenol desejado comoum sólido amarelo brilhante (1,793 g).

Etapa 3: l-[4,5-dicloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia.

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando-se 4,5-dicloro-2-nitrofenol e terc-butil éster do ácido(S)-2-benziloximetil-morfolina-4-carboxilico. 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ 10.42 (s, 1H), 10.29 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.21 (s,1H), 7.32 (s, 1H), 4.18-3.41 (m, 5H), 3.03-2.66 (m, 4H), 2.38 (s, 3H). LRMS(ES, positivo) m/e 412,2 (M+l).

Composto 5

<formula>formula see original document page 67</formula>

1- (5-ciano-pirazin-2-il)-3-[5-metil-2-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-uréia

Etapa 1: 5-bromo-pirazin-2-ilamina. Uma solução de pirazin-2- ilamina (6,66 g,70 mmols) em CH2C12 (200 ml) foi resfriada a 0°C, tratadacom N-bromosuccinamida (12,5 g,70 mmols) e deixada aquecer-se até atemperatura ambiente. A mistura resultante da reação foi agitada durante anoite, e então diluída com mais CH2CI2 (200 ml) e lavada com solução aquosade Na2CC>3 a 10%. As camadas foram separadas, e a camada orgânica foilavada com solução aquosa de NaCl sat'd, e então foi secada sobre MgS04anidro, filtrada, e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi colocadoem EtOAC (50 ml) e o produto foi precipitado pela adição de hexano (300ml). O precipitado foi secado sob vácuo para produzir 5,57 g de um sólidobronzeado.

Etapa 2: 5-amino-pirazina-2-carbonitrila. 5-bromo-pirazin-2-ilamina foi combinada com iodeto (I) de cobre (1,3 g, 6,9 mmols), cianeto depotássio (0,44 g, 6,8 mmols), tetracis (trifenilfosfina) paládio (0) (0,95 g, 0,83mmols), e 18-coroa-6 (0,058 g, 0,22 mmols) em DMF (15 ml). A misturaresultante foi agitada durante 40 minutos, e então foi aquecida até o refluxo(155°C) durante 2h. A reação foi resinada até a temperatura ambiente, e entãodeixada em repouso durante a noite. O precipitado foi separado por filtração eo filtrado foi concentrado até a secura a vácuo. O resíduo alaranjado foicolocado em EtOAc e hexanos e foi formado um precipitado inicial, e entãofoi separado por filtração. Após repouso foi formado mais precipitado no licormãe e foi recolhido por filtração. Os sólidos foram combinados paraproduzirem 0,10 g de um sólido laranja brilhante.

Etapa 3: Terc-butil éster do ácido 2-{2-[3-(5-ciano-pirazin-2-il)-ureido)-4-metil-fenoximetil}-morfolina-4-carboxilico. Terc-butil éster doácido 2-(2-amino-4-metil-fenoximetil)-morfolina-4-carboxilico (0,0 87 g,0,270 mmols) foi preparado a partir de 2-amino-4-metil-fenol de acordo comos métodos do composto 3, etapas 1 e 2, utilizando o terc-butil éster do ácido2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilico (preparado de acordo com oprocedimento para o composto 2, etapa 1, utilizando o ácido correspondente)e 4-metil-2-nitrofenol. Ele foi combinado com trifosgeno (0,029 g, 0,10mmols), tolueno (2 ml) e base de Hunig (0,15 ml, 0,86 mmols), e agitado até atemperatura ambiente durante 25 minutos. A suspensão foi então transferidaatravés de uma cânula para uma solução fria (-78°C) contendo 5-amino-pirazina-2-carbonitrila (0,032 g, 0,27 mmols), e lítio bis(trimetilsilil) amida(0,27 mmols) em THF (1 ml), que estava sob agitação a-78°C durante 30minutos. A reação foi deixada aquecer-se, e então foi agitada durante 16h natemperatura ambiente. Foi formado um precipitado e foi recolhido porfiltração para produzir o produto desejado (0,043 g).

Etapa 4: l-(5-ciano-pirazin-2-il)-3-[5-metil-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-uréia. Uma suspensão do terc-butil éster do ácido 2-{2-[3-(5-ciano-pirazin-2-il)-ureido]-4-metil-fenoximetil]-morfolina-4-carboxilico(0,043 g, 0,0918 mmols) em THF (2 ml) foi tratado com HCL em dioxano(3M, 0,11 ml) e agitado durante 20h. Foi adicionado mais HC1 em dioxano(4M, 0,25 ml) e a reação foi aquecida a 50°C durante 18h. A reação foiresfriada e concentrada. O sólido resultante foi colocado em suspensão eméter, e a suspensão foi filtrada e secada ao ar para produzir o produto desejadocomo o sal de HC1 (0,042 g).

Etapa 5: l-(5-ciano-pirazin-2-il)-3-[5-metil-2-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-uréia. Uma solução de sal de cloridrato de l-(5-ciano-pirazin-2-il)-3-[5-metil-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-uréia (0,0104 g,0,129 mmols) em MeOH (1 ml) foi resfriada a 0°C e tratada com soluçãoaquosa de formaldeído (0,12 mmols) seguido por triacetoxiboroidreto desódio (0,06 g, 0,298 mmols). A reação foi agitada durante 12h, e então foiconcentrada a vácuo. O resíduo foi submetido a cromatografia sobre sílica(2% de MeOH em CH2C12) para produzir o produto como um sólido branco(0,014 g). 'H-RMN (400 MHz, d6-DMSO) 5 10.90 (s, 1, H), 10 (br s, 1, H),8.9 (s, 1, H), 8.8 (s, 1, H), 8 (s, 1, H), 6.9 (m, 1, H), 6.8 (m, 1, H), 3.9 (m, 4,H), 3.6 (t, 1, H), 2.9 (d, 1, H), 2.7 (d, 1, H), 2.2 (s, 3, H), 2.1 (s, 3, H), 2 (t, 1,H), 1.8 (t, 1, H). LRMS (esi, positivo) m/e 383.40 (M+l).

Composto 6

<formula>formula see original document page 69</formula>

1 - [5 -cloro-2-( [ 1,4] oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréia

Etapa 1: 3-benzil-3-clorometil-[l,3]oxazepan. Uma soluçãode 3-benzilamino-propan-l-ol (14 g, 88,1 mmols) e epicloridrina (81,4g,880 mmols) foi aquecida a 40°C. Após agitação durante 3h a reação foiresfriada e o excesso de epicloridrina foi removido por evaporação a vácuo.Foi adicionado ácido sulfurico (10 ml) lentamente, e então o frasco dareação foi colocado em um banho de óleo previamente aquecido a 150°C.A agitação prosseguiu durante 1 hora, e então a reação foi deixada resfriar-se até a temperatura ambiente e foi interrompida com a adição de gelo. Amistura foi ajustada até um pH básico com solução aquosa de Na2CC>3 a10% e extraída com EtOAc (3 x 300 ml). As camadas orgânicascombinadas foram secadas sobre MgS04 anidro, filtradas, e secadas sobpressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia deexpansão (70:28:2 hexanos/CH2Cl2/NH4OH 2M aq) para produzir 5 g deum óleo amarelo claro.

Etapa 2: Terc-butil éster do ácido 2-(4-cloro-2-nitro-fenoximetil)-[l,3]oxazepano-3-carboxilico. Em uma solução agitada de 4-bromo-2-nitrofenol (1,39 g, 8,0 mmols) em DMSO (30 ml) foi adicionadocarbonato de potássio (2,76 g, 20,0 mmols) seguido por 3-benzil-2-clorometil-[l,3]oxazepano. A reação foi agitada a 60°C durante 12h e então foi deixadaresfriar-se até a temperatura ambiente e foi diluída com EtOAc (200 ml) esolução aquosa de Na2C03 a 10% (200 ml). As camadas foram separadas e acamada orgânica foi lavada com salmoura, secada sobre MgS04 anidro, econcentrada a vácuo. O produto cru foi purificado por cromatografia deexpansão (70:30 hexanos /EtOAc) para produzir 480 mg de um óleo laranjaclaro.

O óleo foi colocado em CH2C12 (5 ml) e resfriado em umbanho de gelo. Foi adicionado alfa cloro etil cloroformiato (0,18 ml, 1,65mmols). A reação foi agitada durante 2h, e então foi adicionada soluçãoaquosa a 2N de HC1. A agitação foi continuada durante 10 minutos, eentão a mistura foi concentrada até a secura. O resíduo resultante foicolocado em MeOH e colocado em refluxo durante 2h. A reação foiconcentrada sob pressão reduzida e o resíduo foi colocado em soluçãoaquosa a 2N de HCL (75 ml) e lavada com EtOAc (2 x 50 ml). O pH dacamada aquosa foi ajustado para um pH de 11 através da adição de NaOHsólido. A solução básica resultante foi extraída com EtOAc (2 x 50 ml) eas camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura e secadassobre MgSC>4.

A filtração e a concentração a vácuo produziram 240 mg deproduto como um óleo amarelo claro.

O óleo foi dissolvido em CH2C12 (3 ml), e então foi tratadocom TEA (0,116 ml, 0,831 mmoles) e di-terc-butil dicarbonato (0,181 g,0,831 mmols). A reação foi deixada sob agitação na temperatura ambientedurante 1 hora e então foi diluída com mais CH2CI2 (100 ml) e lavada comsolução aquosa de Na2C03 a 10% (100 ml). A camada orgânica foi secadasobre MgSC>4, filtrada e concentrada sob pressão reduzida. Foi feita umapurificação utilizando-se cromatografia de expansão (7:3 hexano/EtOAc) paraproduzir 252 mg do produto como uma espuma branca.

Etapa 3: Terc-butil éster do ácido 2-(2-amino-4-cloro-fenoximetil)-[l,3]oxazepano-3-carboxilico. Preparado a partir do terc-butiléster do ácido 2-(4-cloro-2-nitro-fenoximetil)-[l,3]oxazepano-3-carboxilico(0,252 g, 0,65 mmols) de acordo com o procedimento para o composto 3,etapa 2, para produzir 150 mg do produto como um óleo claro.

Etapa 4: l-[5-cloro-2-([l,4]oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. Preparado a partir do terc-butil éster do ácido 2-(2-amino-4-bromo-fenoximetil)-[l ,3]oxazepano-3-carboxilico utilizando-se oprocedimento para o composto 2, etapa 4 e o composto 5, etapa 4, paraproduzir 0,175 g de produto. 'H-RMN (400 MHz, CDC13), ô 8.65 (br s, 1, H),8.3 (s, 1, H), 8.25 (s, 1, H), 6.98 (dd, 1, H), 6.8 (d, 1, H), 4.08 (m, 3, H), 3.8(m, 1, H), 3.35 (s, 1, H), 3.25 (d, 1, H), 3 (m, 3, H), 2.5 (s, 3, H), 1.98 (m, 2,H). LRMS (esi, positivo) m/e 391.90 (M+l).. LRMS (esi, positivo) m/e391,90 (M+l).Composto 7

<formula>formula see original document page 72</formula>

l-[5-metil-2-(l-metil-piperazin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia.

Etapa 1: Terc-butil éster do ácido 3-hidroximetil-4-metil-piperazina-l-carboxilico. Ácido piperazina-2-carboxilico (20 g,154 mmols)em uma suspensão com 200 ml de 1:1 de H20/dioxano foi resfriada em umbanho de gelo e tratada com NaOH sólido (11 g) seguido por uma solução dedi-terc-butil dicarbonato (21,6 g, 99 mmols) em dioxano e adicionada gota agota a partir de um funil de adição. O pH da reação foi ajustado para um pH >10 conforme o necessário durante o curso da reação. A mistura resultante foideixada sob agitação durante 3h, e então foi diluída com água até ficarhomogênea e foi acidulada com HC1 aquoso concentrado até o pH ficar entre2 e 3. A solução foi lavada com éter e então o pH foi ajustado com NaOH atéo pH ficar entre 6,5 e 7. A solução foi deixada em repouso vários dias e oprecipitado resultante foi recolhido por filtração para produzir 1-terc-butiléster do ácido piperazina-l,3-dicarboxílico como um sólido branco (9,7 g.)

Uma suspensão de 1-terc-butil éster do ácido 1,3-dicarboxilico(4,62 g, 20,0 mmols) em CH3OH (100 ml) foi tratada com formaldeídoaquoso (41 mmols) e ácido fórmico (71 mmols), e então foi aquecida a 65°Cdurante várias horas. Após o término por intermédio de HPLC, a reação foideixada resfriar-se e foi concentrada a vácuo.

O resíduo foi colocado em THF e resfriado em um banho degelo, e então tratado com uma solução de hidreto de lítio e alumínio em THF(19,0 mmols). Depois de 1 hora, a reação foi deixada aquecer-se até atemperatura ambiente e foi agitada por mais 30 minutos. A reação foi entãoresfriada em um banho de gelo e foi interrompida com H20 (0,75 ml) esolução aquosa de NaOH a 15% (0,75 ml), e outra vez H20 (3 x 0,75 ml). Ossais foram removidos por filtração e o filtrado foi concentrado a vácuo paraproduzir o produto cru. A cromatografia sobre sílica gel (2,5 MeOH emCH2CI2) produziu o produto como um óleo amarelo (0,70 g).

Etapa 2: l-[5-metil-2-(l-metil-piperazin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. A preparado de acordo com o procedimento parao composto 3 utilizando terc-butil éster do ácido 3-hidroximetil-4-metil-piperazina-l-carboxilico, e o procedimento para o composto 5, etapa 4. 1H-RMN (400 MHz, oVDMSO) ô 10.24 (br s, 1, H), 10.1 (s, 1, H), 9.7 (br s, 1,H), 9.42 (s, 1, H), 9.12 (s, 1, H), 8.2 (s, 1, H), 8.08 (s, 1, H), 6.91 (d, 1, H),6.82 (d, 1, H), 4.6 (d, 1, H), 4.4 (m, 1, H), 4.1 (m, 1, H), 3.6 (m, 6, H), 3 (s, 3,H), 2.4 (s, 3, H), 2.2 (s, 3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 371,40 (M+l).

Composto 8

<formula>formula see original document page 73</formula>

1 -(5 -ciano-pirazin-2-il)-3 - [5 -metil-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil] -uréia

Preparado de acordo com os procedimentos para o composto5, etapas 1 a 4, utilizando-se 4-metil-2-nitrofenol. 'H-RMN (400 MHz,CD3OD), ô 8.80 (s, 1, H), 8.7 (s, 1, H), 7.9 (s, 1, H), 6.8 (m, 2, H), 4.2 (m, 4,H), 3.8 (m, 1, H), 3.6 (m, 1, H), 3.5 (m, 1, H), 3.2 (m, 2, H), 2.3 (s, 3, H).LRMS (esi, positivo) m/e 369,30 (M+l).

Composto 9

<formula>formula see original document page 73</formula>l-[5-cloro-4-metil-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico, preparado utilizando o procedimento para o composto 4, etapa 1e 4-cloro-5-metil-2-nitrofenol, preparado de acordo com o procedimento parao composto 4, etapa 2. !H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) ô 10.32 (s, 1H), 10.21(s, 1H), 8.75 (s, 1H), 8.29-8.10 (m, 2H), 7.06 (d, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.12-3.42(m, 5H), 3.29-2.63 (m, 4H), 2.48 (s, 3H), 2.25 (s, 3H). LRMS (ES, positivo)m/e 392,2 (M+l).

Composto 10

<formula>formula see original document page 74</formula>

l-[5-cloro-4-metil-2-(R-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando o ácido 2-hidroximetil-R-morfolina-4-carboxilico,preparado a partir do terc-butil éster do ácido (R)-benzil glicidil éter,utilizando o procedimento para o composto 4, etapa 1, e 4-cloro-5-metil-2-nitrofenol, preparado de acordo com o procedimento para o composto 4, etapa2. 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) S 10.32 (s, 1H), 10.21 (s, 1H), 8.75 (s,1H), 8.29-8.10 (m, 2H), 7.06 (d, 1H), 7.18 (d, 1H), 4.12-3.42 (m, 5H), 3.29-2.63 (m, 4H), 2.48 (s, 3H), 2.25 (s, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e 392,3 (M+l).Composto 11

<formula>formula see original document page 75</formula>

1 - [4,5 -dicloro-2-(R-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4,5-dicloro-2-nitrofenol, preparado de acordo com oprocedimento para o composto 4, etapa 2. ^-RMN (300 MHz, d6-DMSO) 510.42 (s, 1H), 10.29 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.21 (s, 1H), 7.32 (s,1H), 4.18-3.41 (m, 5H), 3.03-2.66 (m, 4H), 2.38 (s, 3H). LRMS (ES, positivo)m/e 412,2 (M+l).

Composto 12

<formula>formula see original document page 75</formula>

l-[4,5-dimetil-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com os procedimentos para o composto1, etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4,5-dimetil-2-itro fenol, preparado de acordo com oprocedimento para o composto 4, etapa 2. JH-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ10.02 (s, 1H), 9.89 (br s, 1H), 8.85 (br s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.91 (s, 1H), 6.84(s, 1H), 4.18-3.97 (m, 3H), 3.69 (t, 1H), 3.43-3.26 (m, 2H), 2.97 (t, 2H), 2.33(s, 3H), 2.18 (s, 2H), 2.12 (s, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e 372,3 (M+l).

Composto 13<formula>formula see original document page 76</formula>

l-[4-cloro-5-metil-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com os procedimentos para o composto1, etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 5-cloro-4-metil-2-nitro fenol, preparado de acordocom o procedimento para o composto 4, etapa 2. JH-RMN (300 MHz, dVDMSO) õ 10.26 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 7.10 (s, 1H),4.21-3.96 (m, 2H), 3.90-3.86 (m, 2H), 3.54 (dt, 1H), 2.98 (d, 1H), 2.84 (t,2H), 2.36 (s, 3H), 2.21 (s, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e 392,1 (M+l).

Composto 14

<formula>formula see original document page 76</formula>

l-[5-ciano-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando-se o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4-hidróxi-3-nitro-benzonitrila, preparado de acordocom o procedimento para o composto 4, etapa 2. !H-RMN (300 MHz, d^-DMSO) ô 10.43 (br s, 1H), 10.30 (s, 1H), 8.62 (br s, 1H), 8.53 (s, 1H), 8.21(s, 1H), 7.48 (d, 1H), 7.33 (d, 1H), 4.20-4.11 (m, 2H), 3.94-3.73 (m, 2H), 3.51(dt, 1H), 3.00 (d, 1H), 2.77-2.61 (m, 2H). LRMS (ES, positivo) m/e 369,2 (M+l).Composto 15

<formula>formula see original document page 77</formula>

l-[5-cloro-4-etil-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparando de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4-cloro-5-etil-2-nitrofenol, preparado de acordo com oprocedimento para o composto 4, etapa 2. ^-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ10.33 (s, 1H), 10.19 (s, 1H), 8.66 (s, 1H), 8.33-8.01 (m, 3H), 7.05 (d, 1H),4.29-3.39 (m, 5H), 3.29-2.91 (m, 2H), 2.89-2.70 (m, 2H), 2.58 (q, 2H), 2.49(s, 3H), 1.17 (t, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e 406,1 (M+l).

Composto 16

<formula>formula see original document page 77</formula>

l-[5-cloro-4-metóxi-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-3-il)-uréia

Preparado de acordo com os procedimentos para o composto1, etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4-cloro-5-metóxi-2-nitrofenol, preparado de acordocom o procedimento para o composto 4, etapa 2. 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ 10.11 (s, 1H), 10.05 (br s, 1H), 8.64 (s, 1H), 8.19 (s, 2H), 6.91 (s,1H), 4.29 (s, 2H), 4.16 (m, 1H), 4.09 (d, 1H), 3.87 (s, 3H), 3.75 (t, 1H), 3.44-3.17 (m, 2H), 3.01 (t, 2H), 2.39 (s, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e 408,0(M+l).

Composto 17

<formula>formula see original document page 78</formula>

l-[5-dimetilamino-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 4 e 5, utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4-dimetilamino-3-nitrofenol, preparado de acordo com oprocedimento para o composto 4, na etapa 2. JH-RMN (300 MHz, d6-DMSO)õ 10.11 (s, 1H), 10.05 (br s, 1H), 8.69 (s, 1H), 8.19 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 6.90(d, 1H), 6.34 (dd, 1H), 4.05-3.81 (m, 4H), 3.56 (t, 1H), 3.14 (d, 1H), 2.93 (d,1H), 2.80 (s, 6H), 2.76-2.63 (m, 2H), 2.41 (s, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e387,4 (M+l).

Composto 18

<formula>formula see original document page 78</formula>

l-[5-bromo-4-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4,utilizando 4-bromo-5-metil-2-nitrofenol, preparado usando o procedimentopara o composto 4, etapa 2. ^-RMN (300 MHz, oVDMSO) õ 10.31 (br s,1H), 10.19 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.20 (s, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.13-3.94 (m, 3H), 3.87-3.74 (m, 2H), õ 3.52 (td, 1H), 3.00 (d, 1H), 2.69 (t, 2H),2.42 (s, 1H), 2.25 (s, 1H). LRMS (ES, positivo) m/e 438,2,0 (M+l).

Composto 19

<formula>formula see original document page 79</formula>

l-[5-metil-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 3,utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilicoque foi preparado a partir do ácido correspondente de acordo com oprocedimento para o composto 2, etapa 1. 'H-RMN (400 MHz, CD3OD), 58.90 (s, 1, H), 8.6 (s, 1, H), 7.9 (s, 1, H), 6.9 (m, 2, H), 4.2 (m, 4, H), 3.8 (t, 1,H), 3.7 (s, 2, H), 3.5 (d, 1, H), 3.2 (m, 1, H), 2.6 (s, 3, H), 2.3 (s, 3, H).LRMS (esi, positivo) m/e 358,20 (M+l).

Composto 20

<formula>formula see original document page 79</formula>

l-[5-cloro-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia.

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 3,utilizando 4-cloro-2-nitrofenol e terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilico que foi preparado a partir do ácido correspondente deacordo com o procedimento para o composto 2, etapa 1. 'H-RMN ( 400 MHz,CD3OD), S. 'H-RMN (400 MHz, CD3OD), 8 8.70 (s, 1, H), 8.5 (s, 1, H), 8.4(s, 1, H), 7.05 (m, 1, H), 4.2 (m, 4, H), 3.8 (t, 1, H), 3.5 (d, 1, H), 3.2 (m, 2,H), 2.6 (s, 3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 378,50 (M+ 1).Composto 21

<formula>formula see original document page 80</formula>

l-[5-cloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4,utilizando 4-cloro-2-nitrofenol. 'H-RMN (400 MHz, oVDMSO) ô 10.35 (s, 1,H), 9.4 (br s, 1, H), 8.55 (br s, 1, H), 8.25 (m, 2, H), 7.22 (m, 2, H), 4.2 (m, 3,H), 4 (d, 1, H), 3.8 (t, 1, H), 3.4 (d, 1, H), 3.2 (d, 1, H), 2.8 (m, 1, H), 2.45 (s,3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 378,30 (M+l).

Composto 22

<formula>formula see original document page 80</formula>

l-[5-metil-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4,utilizando (R)-benzil glicidil éter e 4-metil-2-nitrofenol. *H-RMN (400 MHz,d6-DMSO) 8 10.20 (s, 1, H), 10.1 (br s, 1, H), 9.89 (br s, 1, H), 9.5 (br s, 1,H), 8.7 (s, 1, H), 8.3 (s, 1, H), 7.98 (s, 1, H), 6.9 (m, 1, H), 6.8 (m, 1, H), 4 (m,3, H), 3.42 (m, 2, H), 3.19 (m, 2, H), 3 (m, 2, H), 2.43 (s, 3, H), 2.25 (s, 3, H).LRMS (esi, positivo ) m/e 358,30 (M+l).

Composto 23

<formula>formula see original document page 80</formula>l-[5-cloro-2-(R-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4,utilizando (R)-benzil glicidil éter e 4-cloro-2-nitrofenol. 'H-RMN (400 MHz,d6-DMSO) 5 10.45 (s, 1, H), 9.6 (br s, 1, H), 9.3 (br s, 1, H), 8.7 (br s, 1, H),8.3 (s, 1, H), 7.19 (m, 2, ), 4.2 (m, 2, H), 4 (d, 1, H), 3.84 (t, 1, H), 3.41 (d, 1,H), 3.21 (d, 1, H), 3.02 (m, 2, H), 2.5 (s, 3, H) LRMS (esi, positivo) m/e378,30 (M+l).

Composto 24

<formula>formula see original document page 81</formula>

1 -[5-cloro-2-R-([ 1,4]oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréiaPreparado de acordo com o procedimento para o composto 1,utilizando o terc-butil éster do ácido (R)-2-hidroximetil-[l,4]oxazepano-4-carboxilico. !H-RMN (300 MHz, dé-DMSO) õ 10.83 (br s, 1H), 8.39 (dd,1H), 8.18 (s, 1H), 8.04 (br s, 1H), 6.99 (dd, 1H), 6.82 (d, 1H), 4.25-3.98 (m,2H), 3.90-3.76 (m, 1H), 3.38 (d, 1H), 3.13-3.06 (m, 2H), 3.00 (dd, 1H), 2.54(s, 3H), 2.06-1.89 (m, 3H). LRMS (ES, positivo) m/e. 392,3 (M+l).

Composto 25

<formula>formula see original document page 81</formula>

l-[5-cloro-2-(l-metil-piperazin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 7,utilizando 4-cloro-2-nitrofenol. 'H-RMN (400 MHz, dVDMSO) ô 10.35 (br s,1, H), 10.2 (s, 1, H), 9.84 (br s, 1, H), 9.6 (s, 1, H), 8.31 (s, 1, H), 8.21 (s, 1,H), 7.08 (m, 2, H), 4.58 (d, 1, H), 4.42 (d, 1, H), 3.7 (m, 6, H), 3 (s, 3, H),2.44 (s, 3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 391,40 (M+l).

Composto 26

<formula>formula see original document page 82</formula>

l-[5-cloro-2-S-(l-metil-piperazin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 7,utilizando o ácido S-piperazina-2-carboxilico e 4-cloro-2-nitrofenol. ^-RMN(400 MHz, CD3OD) ô. !H-RMN (400 MHz, CD3OD) ô 8.80 (s, 1, H), 8.28 (d, 2,H), 6.99 (s, 2, H), 4.17 (m, 3, H), 3.1 (d, 1, H), 2.92 (d, 2, H), 2.84 (t, 1, H), 2.5 (s,3, H), 2.45 (m, 2, H), 2.42 (s, 3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 391,30 (M+l).

Composto 27

<formula>formula see original document page 82</formula>

1- [5-cloro-4-metil-2-S-([l,4]-oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2- il)-uréia.

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1utilizando 4-cloro-5-metil-2-nitrofenol que foi preparado de acordo com oprocedimento para o composto 4, etapa 2. ^-RMN (300 MHz, d6-DMSO) 510.2 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 8.24 (s, 1H), 7.32 (m, 1H), 7.18 (s,1H), 4.09-3.91 (m, 3H), 3.90-3.79 (m, 1H), 3.77-3.62 (m, 1H), 3.14 (d, 1H),2.85 (m, 1H), 2.73 (s, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.27 (s, 1H), 1.82-1.67 (m, 2H).LRMS (ES positivo ) m/e 406,2 (M+l).Composto 28

<formula>formula see original document page 83</formula>

l-(5-bromo-2-(S-morfolina-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4,utilizando 3-bromo-2-nitrofeno. !H-RMN (400 MHz, d6-DMSO), 6 10.30 (s,1, H), 8.63 (br s, 1, H), 8.43 (s, 1, H), 8.22 (s, 1, H), 7.15 (m, 1, H), 7.05 (d, 1,H), 4.08 (m, 3, H), 3.82 (m, 2, H), 3.47 (t, 1, H), 3.17 (s, 2, H), 3 (d, 1, H),3.07 (s, 3, H), 2.68 (m, 2, H). LRMS (esi, positivo) m/e 423,90 (M+l).

Composto 29

<formula>formula see original document page 83</formula>

l-[5-bromo-2-R-(R-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4utilizando (R)-benzil glicidil éter e 4-bromo-2-nitrofenol. XH-RMN (400MHz, d6-DSMO), ô. 'H-RMN (400 MHz, d6-DMSO), 5 10.30 (br s, 1, H),8.65 (br s, 1, H), 8.43 (s, 1, H), 8.25 (s, 1, H), 7.18 (dd, 1, H), 7.03 (d, 1, H),4.03 (m, 2, H), 3.82 (m, 2, H), 3.52 (t, 2, H), 3.19 (d, 1, H), 3 (d, 1, H), 2.76(m, 2, H), 2.43 (s, 3, H). LRMS (esi, positivo) m/e 443,90 (M+l).

Composto 30

<formula>formula see original document page 83</formula>l-[5-bromo-2-S-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 4utilizando 4-bromo-2-nitrofenol e os procedimentos para o composto 2, etapa4 e o composto 5, etapas 4 e 5. 'H-RMN (400 MHz, CDC13), S 11.43 (br s, 1,H), 9.02 (s, 1, H), 8.6 (s, 1, H), 8.33 (s, 1, H), 8.2 (s, 1, H), 7.12 (d, 1, H), 6.76(d, 1, H), 4 (m, 3, H), 3.8 (t, 1, H), 3.02 (d, 1, H), 2.73 (d, 1, H), 2.51 (s, 3, H),2.3 (t, 1, H), 2.22 (s, 3, H), 2.08 (t, 1, H).

Composto 31

<formula>formula see original document page 84</formula>

1 - [5 -bromo-2-( [ 1,4] oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -metil-pirazin-3 -il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 6utilizando 4-bromo-2-nitrofenol, que foi preparado de acordo com oprocedimento para a o composto 4, etapa 2. !H-RMN (400 MHz, CDCI3), ô8.72 (br s, 1, H), 8.48 (s, .1, H), 8.45 (s, 1, H), 7.11 (d, 1, H), 6.75 (d, 1, H),4.02 (m, 3, H), 3.8 (m, 1, H), 3.21 (d, 1, H), 2.97 (m, 2, H), 2.51 (s, 3, H),1.92 (br m, 2, H). LRMS (esi, positivo ) m/e 436,00 (M+l).

Composto 32

<formula>formula see original document page 84</formula>

l-[5-bromo-2-(4-metil-[l,4]oxazepan-2-ilmetoxi)-fenil]-3-( 5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 6,utilizando 4-bromo-2-nitrofenol, através do procedimento para o composto 5,etapa 5. 'H-RMN (400 MHz, CDC13), ô 8.25 (s, 1, H), 8.23 (s, 1, H), 7.1 (d, 1,H), 6.72 (d, 1, H), 4.19 (m, 1, H), 4 (m, 1, H), 3.95 (m, 2, H), 3.42 (br s, 1, H),3.02 (d, 1, H), 2.84 (m, 1, H), 2.62 (t, 1, H), 2.5 (s, 3, H), 2.4 (s, 3, H), 2 (m,2, H). LRMS (esi, positivo) m/e 451,90 (M+l).

Composto 33

<formula>formula see original document page 85</formula>

1- [5-cloro-2-S-(4-cianometil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

l-[5-cloro-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2- il)-uréia (0,189 g, 0,5 mmols) foi colocado em suspensão em DMF (2 ml).Foram adicionados carbonato de potássio (0,64 g, 0,75 mmols) e bromoacetonitrila (0,035 ml, 0,5 mmols) e a mistura da reação foi aquecida até 80°Cdurante 8h. A mistura da reação foi deixada resfriar-se até a temperaturaambiente e foi finalizada pela adição de H20 (2 ml). O sólido resultante foirecolhido por filtração e foi recristalizado a partir de MeOH para produzir oproduto como um pó branco (0,072 g). !H-RMN (400 MHz, d6-DMSO) ô10.46 (br s, 1H), 10.26 (br s, 1H), 8.63 (br s, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.17 (s, 1H),7.10 (d, 1H), 7.03 (dd, 1H), 4.14 (dd, 1H), 4.09 (dd, 1H), 3.96-4.01 (m, 1H),3.91-3.95 (m, 1H). 3.81 (d, 1H), 3.72 (d, 1H), 3.64 (td, 1H), 2.95 (br d, 1H),2.72 (br d, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.32 (td, 1H), 2.18 (t, 1H). LRMS (esi, positivo)m/e 417 (M+l).Composto 34

<formula>formula see original document page 86</formula>

l-[5-cloro-2-(tiomorfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 2,etapa 2 (utilizando terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-tiomorfolina-4-carboxilico que é obtido do 4-terc-butil éster do ácido tiomorfolina-2,4-dicarboxilico, de acordo com o procedimento para o composto 2, etapa 1) e osprocedimentos para o composto 3, etapa 2 e o composto 2, etapas 4 e 5.LRMS (esi, positivo) m/e 394 (M+l). !H-RMN (400 MHz, d6-DMSO) 510.48 (br s, 1H), 10.27 (br s, 1H), 8.62 (br s, 1H), 8.31 (d, 1H), 8.21 (s, 1H),7.12 (d, 1H), 7.03 (dd, 1H), 4.36 (t, 1H), 4.12 (dd, 1H), 3.24 (dd, 1H), 3.10-3.17 (m, 1H), 2.99 (dd, 1H), 2.94-2.98 (m, 1H), 2.89 (ddd, 1H), 2.71 (ddd,1H), 2.46-2.48 (m, 1H), 2.44 (s, 3H).

Composto 35

<formula>formula see original document page 86</formula>

l-(5-metil-pirazin-2-il)-3-[3-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-5, 6, 7, 8-tetraidro-naftalen-2-il]-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 3,etapa 1 (utilizando o terc-butil éster do ácido (S)-2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilico preparado a partir do 4-terc-butil éster do ácido S-morfolina-2,4-dicarboxílico de acordo com o procedimento para o composto 2, etapa 1 e 3-nitro-5,6,7,8-tetraidro-naftalen-2-ol, preparado de acordo com o procedimentopara o composto 4, etapa 2, e o procedimento para o composto 1, etapa 5. H-RMN (400 MHz, oVDMSO) ô 10.09 (br,l,H), 10.05 (s,l,H), 8.60 (br s,l,H),8.17 (s,l,H), 7.86 (s,l,H), 6.68 (s,l,H), 3.97 (m,l,H), 3.89 (m,l,H), 3.78(m,2,H), 3.31 (t,l,H), 2.98 (d,l,H), 2.63 (m,6,H), 2.44 (m,l,H), 2.41 (s,3,H),1.68 (m,4,H).

Composto 36

<formula>formula see original document page 87</formula>

1 - [5 -cloro-2-S-(morfolin-3 -ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 2,utilizando 4-terc-butil éster do ácido morfolina-3-S-4-dicarboxilico. 'H-RMN(400 MHz, oVDMSO) 6 10.22 (s,l,H), 9.96 (br,l,H), 8.74 (s,l,H), 8.29(d,l,H), 8.18 (s,l,H), 7.04 (m,2,H), 3.94 (m,3,H) 3.70 (br d, 1,H), 3.42(m,l,H), 3.23 (m,2,H), 2.83 (br s,2,H), 2.43 (s,3,H).

Composto 37

<formula>formula see original document page 87</formula>

l-[5-metil-2-R-(morfolin-3-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 2,utilizando 4-metil-2-nitrofenol. 'H-RMN (400 MHz, d6-DMSO) ô 10.08 (brs,l,H), 9.76 (br,l,H), 8.17 (s,l,H), 8.03 (d,l,H), 6.90 (d,l,H), 6.80 (d,l,H),3.88 (m,3,H), 3.70 (br d,2,H), 3.41 (m,l,H), 3.20 (m,2,H), 2.82 (m,2,H), 2.43(s,3,H), 2.24 (s,3,H).Composto 38

<formula>formula see original document page 88</formula>

l-[5-cloro-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-trifluoro metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapas 2 até 5, utilizando 5-trifluoro metilpirazin-2-ilamina preparada deacordo com o método de Miesel, patente americana de número 4.293.552 eterc-butil éster do ácido (S)-2-hidroximetil-morfolina-4-carboxilico. 'H-RMN(d6-DMSO) 5 10.85 (bs, 1H), 9.97 (bs, 1H), 9.11 (bs, 1H), 8.98 (bs, 1H), 8.73(bs, 1H), 8.22 (bs, 1H), 7.08 (bs, 1H), 4.19-3.73 (m, 6H), 3.32-2.98 (m, 4H).LRMS (esi, positivo) m/e 432 (M+l).

Composto 39

<formula>formula see original document page 88</formula>

l-[4-cloro-5-metil-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil)-3-(5-ciano-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com os procedimentos para o composto5, etapas 1 até 4, utilizando 5-cloro-4-metil-2-nitrofenol preparado a partir de3-cloro-4-metil-fenol de acordo com o procedimento para o composto 4, etapa2. !H-RMN (300 MHz, CDC13) ô 10.39 (br s, 1H), 9.05 (br s, 1H), 8.74 (s,1H), 8.68 (s, 1H), 8.18 (s, 1H), 6.91 (s, 1H), 4.04 (m, 4H), 3.78 (m, 1H), 3.19(d, 1H), 2.97 (m, 2H), 2.78 (m, 1H), 2.36 (s, 3H). LCMS (esi, positivo ) m/z403,16 (M+l).Composto 40

<formula>formula see original document page 89</formula>

1 - [5 -cloro-4-metóxi-2-(S-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil] -3-(5 -ciano-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapa 2 (utilizando 5-amino-pirazina-2-carbonitrila preparado de acordo comos procedimentos para o composto 5, etapas 1 e 2, e os procedimentos para ocomposto 1, etapas 4 e 5 (utilizando-se terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico 4-cloro-5-metóxi-2-nitrofenol,preparado de acordo com o procedimento para o composto 4, etapa 2). 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ 10.82 (s, 1H), 9.93 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.81(s, 1H), 8.14 (s, 1H), 6.93 (s, 1H), 4.25 (s, 2H), 4.13-3.98 (m, 2H), 3.83 (s,3H), 3.61 (t, 1H), 3.41-3.19 (m, 2H), 3.17-2.91 (m, 2H). LRMS (ES, positivo)m/e 419,1 (M+l).

Composto 41

<formula>formula see original document page 89</formula>

l-[5-cloro-2-S-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-ciano-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 1,etapa 2 (utilizando 5-amino-pirazina-2-carbonitrila preparado de acordo comos procedimentos para o composto 5, etapas 1 e 2, e os procedimentos para ocomposto 1, etapas 4 e 5 (utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e 4-cloro-2-nitrofenol). 'H-RMN (d6-DMSO) 810.97 (bs, 1H), 10.02 (bs, 1H), 9.05 (bs, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.2 (s,1H), 7.10 (m, 1H), 3.96-4.24 (m, 4H), 3.68-3.78 (m, 2H), 3.3 (m, 2H), 3.0 (m,2H). LRMS (esi, positivo) m/e 388 (M+l).

Composto 42

<formula>formula see original document page 90</formula>

1 - [5 -cloro-2- S-(4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil] -3 -(5 -ciano-pirazin-2-il)-uréia

Etapa 1: l-[5-cloro-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-ciano-pirazin-2-il)-uréia. Preparado de acordo com o procedimento para o composto1, etapa 2 (utilizando5-amino-pirazina-2-carbonitrila preparado de acordocom os procedimentos para o composto 5, etapas 1 e 2) e os procedimentospara o composto 1, etapas 4 e 5 (utilizando o terc-butil éster do ácido 2-hidroximetil-S-morfolina-4-carboxilico e nitrofenol) para produzir 0,27 g do produto.

Etapa 2: l-[5-cloro-2-(morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-ciano-pirazin-2-il)-uréia (0,276 g, 0,73 mmols) foi colocado em suspensão em DMF(5 ml) e tratado com carbonato de potássio (0,15 g, 1,1 mmols) e iodeto demetila (0,046 ml, 0,73 mmols). A mistura tornou-se homogênea e foi agitadana temperatura ambiente durante 4h. A reação foi interrompida com a adiçãode água (20 ml) e extraída com uma mistura 3:1 de CHCl3:iPrOH ( 3 x 25ml). As camadas orgânicas combinadas foram concentradas sob pressãoreduzida e o resíduo foi triturado com EOAc. A filtração produziu 0,214 g doproduto como um sólido branco. 'H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) ô. 'H-RMN(300 MHz, d6-DMSO) ô 11.01 (s, 1H), 10.16 (s, 1H), 8.86 (d, 2H), 8.27 (d,1H), 8.17 (s, 1H), 7.18 (m, 2H), 4.25-4.06 (m, 2H), 3.95 (m, 1H), 3.83 (d,1H), 3.61 (t, 1H), 2.89 (d, 1H), 2.65 (d, 1H), 2.18 (s, 3H), 2.02 (td, 1H), 1.83(t, 1H). LRMS (ES, positivo) m/e 403,0 (M+l).

Composto 43

<formula>formula see original document page 91</formula>

l-[5-cloro-2-(S-4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia

Preparado de acordo com o procedimento para o composto 42,etapa 2, utilizando l-[5-cloro-2-(S-4-metil-morfolin-2-ilmetoxi)-fenil]-3-(5-metil-pirazin-2-il)-uréia. !H-RMN (300 MHz, d6-DMSO) õ 10.54 (br s, 1H),10.24 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.27 (s, 1H), 7.12-6.93 (m, 2H),4.17-3.81 (m, 4H), 3.59 (t, 1H), 3.91 (d, 1H), 2.64 (d, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.18(s, 3H), 2.03 (td, 1H), 1.82 (t, 1H). LRMS (ES, positivo) m/e 392,1. (M+l).

MÉTODOS TERAPÊUTICOS

Os compostos da invenção podem ser utilizados para tratarcondições envolvendo a proliferação de célula aberrante. Por exemplo, oscompostos podem ser usados para potenciarem os efeitos terapêuticos deradiação e/ou de um agente quimioterapêutico usado no tratamento decânceres e outras indicações de proliferação de célula envolvendo célulaseucarióticas, incluindo aquelas em seres humanos e outros animais. Em geral,os compostos atuais inibem as células aberrantemente proliferantes, tantocancerosas como não cancerosas. Por exemplo, os compostos da invençãopodem ser usados para aumentar o tratamento de tumores costumeiramentetratados com um anti-metabólito, como por exemplo, metotrexato,gencitabina, ou 5-fluoro ouracila (5-FU).

O uso de compostos da presente invenção pode resultar emuma regressão parcial ou completa de células aberrantemente proliferantes,i.e., a redução ou eliminação de tais células da população de células. Porexemplo, quando a população de células aberrantemente proliferantes é decélulas de tumor, os compostos da invenção podem ser usados para retardar avelocidade de crescimento do tumor, reduzir o número de tumores, e/ouinduzir a regressão parcial ou completa do tumor.

Os compostos da presente invenção podem ser utilizados invivo ou ex vivo quando não foi identificada nenhuma proliferação de célulaaberrante ou quando não está acontecendo nenhuma proliferação de célulaaberrante, mas quando a proliferação de célula aberrante é suspeita ou éesperada. Os compostos da presente invenção também podem ser usadosquando a proliferação de célula aberrante foi tratada anteriormente e paraevitar ou inibir a recorrência da mesma.

Um método da presente invenção é composto da administraçãode uma quantidade terapeuticamente efetiva de um inibidor de Chkl presente,em combinação com um agente quimioterapêutico, a um indivíduonecessitando do mesmo. Alternativamente, um método da presente invenção écomposto da administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva depelo menos um inibidor presente de Chkl a um indivíduo necessitando domesmo, em combinação com um anticorpo, como por exemplo, herceptinaque tem atividade na inibição da proliferação de células cancerosas.

Os cânceres, portanto, são suscetíveis a tratamento aumentadopela administração de um inibidor de Chkl presente em combinação com umagente quimioterapêutico ou um anticorpo. Os cânceres tratáveis pela presenteinvenção incluem carcinomas e sarcomas que são caracterizados por tumoressólidos, e cânceres dos sistemas mielóide ou lifóide, incluindo leucemias,linfomas, e outros cânceres que tipicamente não têm uma massa de tumor,mas são distribuídos nos sistemas vascular ou linfo-reticular. Estes cânceres,incluem, por exemplo, cânceres colo-retais, cânceres da cabeça e do pescoço,cânceres pancreáticos, câncer do seio, câncer gástrico, câncer da bexiga,câncer da vulva, leucemias, linfomas, melanomas, carcinoma de célulasrenais, cânceres ovarianos, cânceres do cérebro, osteosarcomas, e cânceres dopulmão.

Os compostos da presente invenção, portanto, são úteis emcânceres mediados pela atividade Chkl. Mais especialmente, a atividade Chklé associada com formas de câncer incluindo, mas não limitados a, oncologiaadulta e pediátrica, crescimento de tumores/malignidades sólidos, carcinomade célula mixóide e redonda, tumores avançados locais, Câncer metastático,sarcomas de tecido macio humano, incluindo o sarcoma de Ewing, metástasedo câncer, incluindo metástase linfática, carcinoma de células escamosas,especialmente da cabeça e pescoço, carcinoma de célula escamosa esofageal,carcinoma oral, malignidades de célula do sangue, incluindo mielomamúltiplo, leucemias, incluindo leucemia linfocítica aguda, leucemia anti-linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica, eleucemia de células dos cabelos, linfomas de efusão (linfoma com base nacavidade do corpo), câncer tímico de linfoma do pulmão (incluindocarcinoma de célula pequena, linfoma cutâneo de célula, linfoma de Hodgkin,linfoma diferente de Hodgkin, Câncer do córtex adrenal, tumores de produçãode ACTH, cânceres de células não pequenas, câncer do seio, incluindocarcinoma de célula pequena e carcinoma ductal), cânceres gastrintestinais(incluindo câncer do estômago, câncer do cólon, câncer colo-retal, e póliposassociados com neoplasia colo-retal), câncer pancreático, câncer do fígado,cânceres urológicos (incluindo câncer da bexiga, como tumores primáriossuperficiais da bexiga, carcinoma de célula invasiva transicional da bexiga, ecâncer de músculo invasivo da bexiga), câncer da próstata, malignidades dotrato genital feminino (incluindo carcinoma ovariano, neoplasma epitelialperitoneal primário, carcinoma cervical, cânceres endometriais uterinos,câncer da vagina, câncer da vulva, câncer uterino e tumores sólidos nofolículo ovariano), malignidades do trato genital masculino (incluindo ocâncer do testículo es câncer do pênis), câncer dos rins (incluindo carcinomade célula renal, câncer do cérebro (incluindo tumores intrínsecos do cérebro,neuroblastoma, tumores astrocíticos do cérebro, gliomas, e invasãometastática de células de tumor no sistema nervoso central), cânceres do osso(incluindo osteomas e osteosarcomas), cânceres da pele (incluindo melanomamaligno, progressão de tumor de queratinócitos de pele humana, e câncer decélulas escamosa), câncer da tiróide, retinoblastoma, neuroblastoma, efiisãoperitoneal, efusão pleural maligna, mesotelioma, tumores de Wilm, câncer dabexiga irritada, neoplasma trofoblástico, hemangiopericitoma e sarcoma deKaposi.

Um composto da presente invenção também pode ser usadopara rádio-sensibilizar células. Doenças tratáveis com radiação incluem, masnão são limitadas a doenças neoplásticas, tumores benignos e malignos, ecélulas cancerosas. O tratamento por radiação utiliza radiação eletromagnéticacomo gama-radiação (10"2° a 10"13 m), a radiação por raios X (IO"12 a 10"9m),luz ultravioleta (10 nm a 400 nm), luz visível (400 nm a 700 nm), radiaçãoinfravermelha (700 nm a 1,0 mm), e radiação por microondas (1 mm até 30 cm).

Alguns protocolos de tratamento do câncer utilizamatualmente rádio-sensibilizantes ativados por radiação eletromagnética, comopor exemplo, raios X. Exemplos de rádio sensibilizantes ativados por raios Xincluem, mas não são limitados aos seguintes: metronidazol, misonidazol,desmetilmisonidazol, pimonidazol, etanidazol, nimorazol, mitomicina C, RSU1069, SR 4233, E09, RB 6145, nicotinamida, 5-bromodeoxiuridina (BUdR),5-iododeoxiuridina (IUdR), bromodeoxicitidina, fluoro deoxiuridina (FUdR),hidroxiuréia, cisplatina, e análogos terapeuticamente efetivos e derivados dosmesmos.

A terapia foto-dinâmica ( PDT) de cânceres utiliza luz visívelcomo o ativador de radiação do agente sensibilizante. Exemplos de rádio-sensibilizantes foto-dinâmicos incluem os seguintes, mas não são limitados a:derivados de hematoporfirina, PHOTOFRIN®, derivados de benzoporfirina,NPe6, etioporfirina de estanho (SnET2), feoforbide-a, bacterioclorofila,naftalocianinas, ftalocianinas, ftalocianina de zinco, e análogosterapeuticamente efetivos e derivados dos mesmos.

Os rádio-sensibilizantes podem ser administrados em conjuntocom uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ou mais compostos,além do inibidor de Chkl, como compostos incluindo, mas não limitados a,compostos que promovem a incorporação de rádio-sensibilizantes nas célulasalvo, compostos que controlam o fluxo de terapêuticos, nutrientes, e/ouoxigênio para as células alvo, agentes quimioterapêuticos que atuam no tumorcomo ou sem radiação adicional, ou outros compostos terapeuticamenteefetivos para o tratamento de câncer ou outra doença. Exemplos de agentesterapêuticos adicionais ou métodos que podem ser usados em conjunto comrádio-sensibilizantes incluem, mas não são limitados a, 5-fluoro ouracil (5-FU), leucovorin, oxigênio, carbogênio, transfusões de célula vermelha,perfluoro carbonos (por exemplo, FLUOSOLW®-DA), 2,3-DPG, BW12C,bloqueadores de canal de cálcio, pentoxifilina, compostos anti-angiogênese,hidralazina, e L-BSO.

Agentes quimioterapêuticos que podem ser usados emcombinação com um composto da presente invenção para tratar um câncerincluem, mas não são limitados a, agentes alquilantes, anti-metabólitos,hormônios e antagonistas dos mesmos, rádio-isótopos, anticorpos, assimcomo produtos naturais, e combinações dos mesmos. Por exemplo, umcomposto inibidor da presente invenção pode ser administrado comantibióticos, como doxorubicina e outros análogos de antraciclina, mostardasde nitrogênio, tais como ciclofosfamida, análogos de pirimidina como 5-fluoro ouracil, cisplatina, hidroxiureia, taxol e seus derivados naturais esintéticos, e semelhantes. Como outro exemplo, no caso de tumoresmisturados, como adenocarcinoma do seio, onde os tumores incluem célulasdependentes de gonadotropina e independentes de gonadotropina, o compostopode ser administrado em conjunto com leuprolide ou goserelina (análogossintéticos de peptídeos de Lh-RH). Outros protocolos antineoplásticosincluem o uso de um composto inibidor com outra modalidade de tratamento,como por exemplo, cirurgia ou radiação, também referida aqui como"modalidades antineoplásticas auxiliares". Os agentes quimioterapêuticostradicionais úteis na invenção incluem hormônios e antagonistas dos mesmos,rádio-isotopos, anticorpos, produtos naturais, e combinações dos mesmos.

Exemplos de agentes quimioterapêuticos úteis em métodos que utilizam oscompostos da presente invenção são listados na tabela seguinte.

TABELA 1

<table>table see original document page 96</column></row><table>TABELA 1 <table>table see original document page 97</column></row><table>

Exemplos de agentes quimioterapêuticos que sãoespecialmente úteis em conjunto com rádio-sensibilizantes incluem, porexemplo, camptotecina, carboplatina, cisplatina, daunorubicina, doxorubicina,interferon (alfa, beta, gama), irinotecan, hidroxiuréia, clorambucil, 5-fluoroouracil (5-FU), metotrexate, 2-cloroadenosine, fludarabine, azacitidine,gemcitabine, pemetrexed, interleucina 2, irinotecan, docetaxel, paclitaxel,topotecan, e análogos terapeuticamente efetivos e derivados dos mesmos.

De acordo com a presente invenção, os compostos da presenteinvenção são úteis em combinação com gemcitabine, sozinho ou além dissocom paclitaxel. Os compostos da presente invenção são também úteis emcombinação com pemetrexed, sozinhos ou ainda com cisplatina, carboplatina,ou outras platinas. Um inibidor de Chkl atual também pode ser administradoem combinação com gemcitabine e pemetrexed.

Um inibidor atual de Chkl administrado em combinação comgemcitabine pode ser útil no tratamento, por exemplo, de carcinomapancreático, leiomiosarcoma do útero, sarcoma de osso, câncer metastático dopulmão de células não pequenas, sarcoma de tecido macio do tronco e deextremidades, câncer de célula renal, adenocarcinoma, e doença de Hodgkin.

Um inibidor atual de Chkl administrado com pemetrexed pode ser útil notratamento de mesotelioma.

Os compostos da presente invenção também podem potenciara eficácia de drogas usadas no tratamento de doenças inflamatórias,condições, ou distúrbios caracterizados pela proliferação de célula aberrante.

Exemplos de doenças inflamatórias que podem ser tratadas com os compostosda presente invenção incluem, mas não são limitados a, artrite reumatóide(RA), psoríase, vitiligo, granulomatose de Wegener, artrite crônica juvenilinicial-sistêmica (SLE). O tratamento de artrite, granulomatose de Wegener, eSLE, com freqüência, envolvem o uso de terapias imunossupressivas, taiscomo radiação por ionização, metotrexate, e ciclofosfamida. Tais tratamentostipicamente induzem, direta ou indiretamente, danos no DNA. A inibição daatividade de Chkl dentro das células imunes ofensivas faz com que as célulasse tornem mais sensitivas ao controle por intermédio desses tratamentostandard. A psoríase e o vitiligo são comumente tratados com radiaçãoultravioleta (UV) em combinação com um psoralen. Os compostos dapresente invenção aumentam os efeitos de morte por UV e um psoralen, eaumentam o índice terapêutico deste regime de tratamento. Em geral, oscompostos da presente invenção potenciam o controle de células de doençasinflamatórias quando usados em combinação com drogas imuno-supressivas.O composto da presente invenção também pode ser usado emmétodos de tratamento de outras condições não cancerosas, caracterizadas porcélulas aberrantemente proliferantes. Tais condições incluem, mas não sãolimitadas a, aterosclerose, restenose, vasculite, nefrite, retinopatia, doençasrenais, distúrbios proliferativos da pele, psoríase, cicatrizes quelóides,queratose actínica, síndrome de Stevens-Johnson, osteoporose, doenças hiper-proliferativas do olho, incluindo crescimento de penugem epitelial,vitreoretinopatias proliferativas (PVR), retropatia diabética, doençashemangio-proliferativas, ictiose e papilomas.

Um método preferido de administração de um inibidor de Chklda presente invenção é descrito em Keegan et al., solicitação de PCT númeroPCT/US 2004/30806, depositada em 17 de setembro de 2004, que é baseadana solicitação provisória número de série 60/503.925, depositada em 17 desetembro de 2003, a apresentação integral da qual é incorporada comoreferência. Tais métodos para a inibição da proliferação de célula aberranteenvolvem a administração programada de um ativador de Chkl (por exemplo,um agente quimioterapêutico) e um inibidor de Chkl de acordo com apresente invenção. Neste método, pelo menos um ativador de Chkl éadministrado em uma dose e por um tempo suficiente para induzir umasincronização substancial da parada do ciclo celular em células proliferantes.Após obter uma sincronização substancial de fase, pelo menos um inibidor deChkl é administrado para interromper a parada do ciclo celular e induzir amorte celular terapêutica. O método é útil com qualquer ativador de Chkl eencontra aplicação no tratamento ou prevenção de condições cancerosas e nãocancerosas envolvendo a proliferação de célula aberrante.

Uma população de células aberrantemente proliferantes podeser contatada com um, ou mais de um inibidor de Chkl da invenção. Se éutilizado mais de um inibidor de Chkl, os inibidores de Chkl podem sercontatados com as células usando os mesmos ou métodos diferentes (porexemplo, simultaneamente ou em seqüência, para a mesma ou para duraçõesdiferentes, ou pela mesma ou por modalidades diferentes) conformedeterminados pelo artesão adestrado, por exemplo, um médico (no caso depacientes humanos) ou um técnico de laboratório (no caso de umprocedimento in vitro ou ex vivo).

Uma população de células aberrantemente proliferantestambém pode ser contatada com um ou mais ativadores de Chkl.

Se mais de um ativador de Chkl é usado, os ativadores de Chklpodem ser contatados com as células utilizando-se o mesmo ou métodosdiferentes, geralmente conforme descrito no contexto de inibidores de Chklacima.

Os compostos da presente invenção podem ser aplicados empopulações de células ex vivo. Por exemplo, os compostos atuais podem serutilizados ex vivo para a obtenção de informação relativas à programaçãoe/ou dosagens ótimas para a administração de um inibidor de Chkl para umadeterminada indicação, tipo de células, pacientes, e/ou parâmetro detratamento. Essa informação pode ser usada para fins experimentais ou emuma clínica para a determinação de protocolos para tratamentos in vivo.Outros usos ex vivo para compostos da presente invenção ficarão aparentespara as pessoas adestradas na arte.

Conforme visto pelas pessoas adestradas na arte, agentesadicionais ativos ou auxiliares poderão ser usados nos métodos descritos aqui.Conforme também verificado por pessoas adestradas na arte, a referência aquia tratamentos se estende à profilaxia, assim como ao tratamento de doençasou sintomas estabelecidos.

A quantidade de um composto da invenção requerida para usoem tratamentos varia com a natureza da condição sendo tratada, e com a idadee a condição do paciente, e finalmente, é determinada pelo médico ouveterinário atendente. Em geral, no entanto, doses administradas para otratamento adulto humano tipicamente estão na faixa de 0,001 mg/kg a cercade 100 mg/kg por dia. A dose pode ser administrada em uma só dose, oucomo doses múltiplas administradas em intervalos apropriados, como porexemplo, 2, 3, 4 ou mais subdoses por dia. Na prática, o médico determina oregime de dosagem adequado para cada paciente individual e a dosagem variacom a idade, peso, e resposta do paciente especifico. As dosagens acima sãoexemplos do caso médio, mas existem casos individuais onde dosagensmaiores ou menores são devidas, e essas estão dentro do escopo da presenteinvenção.

O contato da população de células com um inibidor atual deChkl, em qualquer dose, é por um tempo suficiente para se obter a interrupçãosubstancial do ponto de verificação do ciclo celular. Tipicamente, apesar denão ser necessário, tais tempos incluem até cerca de 72h a cerca de 96h,dependendo de vários fatores. Em algumas realizações, é desejável ounecessário administrar-se o inibidor de Chkl durante um período de até cercade várias semanas ou mais, conforme determinado pelo médico ou técnicoatendente. Assim sendo, um inibidor atual de Chkl tipicamente pode seradministrado em até cerca de 1 hora, até cerca de 2h, até cerca de 3h, atécerca de 4h, até cerca de 6h, até cerca de 12h e, até cerca de 18h, até cerca de24h, até cerca de 48h, ou até cerca de 72h. Pessoas adestradas na arteverificaram que as faixas de tempo expressas aqui são meramente de exemploe que tais faixas e sub-faixas dentro e fora daquelas expressas também estãodentro do escopo da invenção.

Os inibidores de Chkl da presente invenção podem seradministrados em várias doses. Por exemplo, o inibidor de Chkl pode seradministrado em uma freqüência de: 4 doses administradas como uma dosepor dia em intervalos de quatro dias (q4d x 4); 4 doses administradas comouma dose por dia em intervalos de três dias (q3d x 4); e uma doseadministrada por dia em intervalos de cinco dias (qd x 5); uma dose porsemana durante três semanas (qwk3); 4 doses diárias, com 2 dias de intervalo,e outras 5 doses diárias (5/2/5); ou, qualquer regime de doses determinadoscomo sendo apropriado para a circunstância.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Determinação dos valores ICso de inibidores de Chkl

Foi identificado o cDNA de Chkl humano e clonado conformedescrito anteriormente na publicação da solicitação internacional número WO99/11.795, depositada em 4 de setembro de 1998. Um sinalizador FLAG® foiinserido na estrutura em conjunto com o "amino terminus" do Chkl decomprimento integral. Os primeiros 5 pés contêm um sítio EcoRI, umaseqüência Kozak, e também codifica um FLAG® em relação a purificação daafinidade utilizando o anticorpo M2 (Sigma, St.Louis, MO). O revestimentode 3 pés contém um sítio SalL O fragmento amplificado por PCR foi clonadono pCI-Neo como um fragmento EcoRI-SalI (Invitrogen, Carlsbad, CA), eentão subclonado como um fragmento EcoRI-Notl no pFastBacI (Gibco-BRL, Bethesda, MD). O baculovírus recombinante foi preparado conformedescrito no manual Gibco-BRL Bac-to-Bac e usado para infectar as célulasSf-9 crescidas em um meio CCM3 (HyClone Laboratories, Logan, UT) para aexpansão da proteína Chkl marcada com FLAG®.

A Chkl marcada com FLAG® foi purificada a partir degrânulos congelados de células SF9 infectadas por baculovírus. Os grânulosde células congeladas foram misturados com um volume igual a 2 x soluçãotampão lisada contendo 100 mM de Tris-HCl pH 7,5, e 200 mM NaCl, 50mM B-glicerofosfato, 25 mm NaF, 4 mM MgCl2, 0,5 mM EGTA, 0,2% deTWEEN®-20, 2 mM vanadato de sódio, 2 mM DTT, e um coquetel deinibidores de protease (Complete mini, Boehringer Mannheim 2000 catálogo# 1836170). As células foram então "dounced" vinte vezes com o pilão soltode um homogenizador "dounce" e centrifugadas a 48.400 x g durante lh. Aafinidade M2 foi previamente lavada com 1 e 10 volumes de coluna de glicina50 mM pH 3,5 seguido por Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM alternando trêsvezes e terminando com uma lavagem de Tris NaCl. A coluna foi entãolavada com 25 volumes de coluna de Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM,0,1% de TWEEN®-20, EGTA 1 mM, tabletes completos de mini proteaseEDTA e IX. O lisato liberado foi ligado a resina de afinidade M2 em bateladaa 4°C durante 4h. A mistura de resina e lisato foi então colocada dentro deuma coluna e o fluxo através da mesma foi recolhido. A resina foi lavada comdez volumes de coluna Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, e N-octilglucosídeo 3 mM. A Chkl marcada com um FLAG® foi então diluída dacoluna com 6 volumes de coluna de Tris 20mM pH 7,5, e NaCl 150 mM, N-octil glicosídeo 3 mM contendo 0,5 mg/ml de peptídeo de FLAG® (Sigma,2000 catálogo # F-3290). Foram recolhidas 3 frações e analisadas em relaçãoa presença de Chkl marcada com FLAG.

O ensaio da atividade quinase Chkl que inclui 100 ng não deChkl-FLAG® purificada (150 pmol de ATP/min), 20 micrometros depeptídeo Cdc25C (H-leu-tyr-arg-ser-pro-ser-met-pro-glu-asn-leu-asn-arg-arg-arg-arg-OH) (SEQ ID NO: .1), 4 micrometros de ATP, 2 uCi [32P]Y-ATP, 20mM Hepes ph 7,2, 5 mM MgCl2, 0,1% NP40, e 1 mM DTT. As reações foraminiciadas pela adição de mistura da reação contendo ATP e foi executada natemperatura ambiente durante 10 minutos. As reações foram interrompidaspela adição de ácido fosfórico (150 mM de concentração final) e transferidaspara discos de fosfo-celulose. Os discos de fosfo-celulose foram lavadoscinco vezes com 150 mM ácido fosfórico e secados ao ar. Foi adicionadofluido de cintilação e os discos foram contados em um contador de cintilaçãoWallac. O ensaio foi incubado na presença de uma larga faixa deconcentrações de composto inibidor de Chkl e foi calculado um valor de IC50para o composto. Todos os compostos da invenção que foram submetidos aoensaio apresentaram valores IC50 no ensaio menores do que cerca de 200 nM.Exemplo 2

Seletividade

Os inibidores de Chkl da presente invenção foram testados emrelação a seletividade, com a Chkl como a enzima de comparação e asseguintes proteínas quinases como enzimas comparadoras: Cdc2, Chk2,CTAK, EphAl, EphA2, Erkl, FGFR1, FGFR4, IR, JNK1, c-Kit, p38alfa,p38beta, p38delta, Ros, Rse, Rsk2, TrkA, TrkB, proteína quinase A, proteínaquinase C, pp60v-arc, proteína quinase B/Akt-1, p38MapK, p70S6K, quinaseII dependente de cálcio-calmodulin, e abi tirosina quinases.

O valor IC50 de um composto contra a Chkl foi medidoconforme descrito acima. O valor IC5o do composto contra as enzimascomparadoras foi medido utilizando-se a plataforma de tecnologiaproprietária SelectSmart® (MDS Pharma Servies, Bothell, Washington, USA)com um procedimento ELISA modificado ou polarização de fluorescência.

Todos os inibidores testados mostraram pelo menos uma seletividade de vintevezes para Chkl em relação às enzimas comparadoras testadas.

Alternativamente, os ensaios para a determinação do IC5o paracada uma destas quinases foram descritos anteriormente na literatura,incluindo a publicação de patente americana número 2002-016521 Al, e aPCT/US 95/00912, depositada em 23 de janeiro de 1995, ambas as quais sãoincorporadas aqui como referência.

Exemplo 3

Ensaio baseado em células para a determinação dos valores ECt, deinibidores de Chkl

A potência baseada em células dos inibidores de Chkl deacordo com a invenção foi avaliada medindo-se a habilidade do compostopara sensibilizar a linha de células de carcinoma humano HT29 pelagemcitabine. Um valor médio de ECn-s foi derivado seguindo-se váriasexperiências. Assim sendo, um inibidor de Chkl de acordo com a invenção foisintetizado pelos métodos descritos aqui. O composto foi dissolvido em 6%de sulfóxido de dimetila (DMSO) em uma concentração de estoque de 10 mMe estocado a-70°C. As células HT29 foram obtidas da ATCC e mantidas emmeio de crescimento consistindo de RPMI contendo 10% de soro fetal debezerro 9FCS), "pen/strep", glutamina e outros suplementos. O cloridrato degemcitabina foi obtido da Qventas e dissolvido em solução salina tampão defosfato (PBS) a 50 mM e estocado a-20°C. A 3H-timidina foi obtida daPerkin-Elmer.

As células HT29 foram inoculadas em placas de cultura decélulas com 96 poços (Corning) com uma densidade de 1,3 x IO3 por poço edeixadas para serem aderidas durante a noite. No dia seguinte, a gemcitabinafoi inicialmente diluída 125 vezes, seguido por diluições de 5 vezes em TiterTubes® ( (BioRad) de 1,2 ml. As concentrações das séries de diluição finaleram 11, 20, 4, 0,8, 0,16, 0,032, 6,4 x IO"3, 1,28 x IO"4, e 5,12 x 10"5 nM. Agemcitabina diluída foi então adicionada nas células durante 2h. Agemcitabina foi então removida e o inibidor de Chkl diluído da invenção foiadicionado nas células durante 24h. Após uma diluição inicial de 1000 vezes,no meio de crescimento, um inibidor de Chkl de 10 uM (estoque de DMSO)de acordo com a invenção foi diluído 3 vezes em série em "Titer Tubes® de1,2 ml, produzindo uma série final de diluição de: 2,5, 0,83, 0,28, 0,09, 0,09 e0,03 uM. 72h mais tarde, as células em cada poço foram marcadas comluMCi 3H-timidina durante 12h, e então congelados a-70°C. As placas foramentão descongeladas e semeadas sobre placas de filtro com 96 poços(Millipore) utilizando uma semeadura de placas Cell Mate® (Perkin Elmer).

Então foram adicionados 30 ulitros de Microscint® 20 (Perkin Elmer) e asplacas foram contadas em um leitor de contagem de placas no topo (PerkinElmer). Os dados foram normalizados para as células tratadas com uminibidor de Chkl de acordo com a invenção sozinha; e então foram registradosem um gráfico log/log de concentração de gemcitabina (uM) contra ocrescimento relativo de célula ( 100% igual a 1,0). A sensibilização múltiplaaumentada a 90% de inibição do crescimento foi derivada para cadaconcentração de inibidor de Chkl usado, a qual foi então registrada em umgráfico de concentração do inibidor de Chkl contra a sensibilização múltipla.O valor de ECm foi então calculado.

Os inibidores de Chkl para o ensaio mediram valores EC,rrsmenores do que cerca de 1000 nM.

Exemplo 4

Os inibidores de Chkl da presente invenção aumentam a morte de célulasatravés de tratamentos do câncer

Para demonstrar que a inibição de Chkl por um composto dapresente invenção sensibiliza células alvo para efeito de morte de agentes dedanificação do DNA, as células podem ser incubadas na presença de uminibidor Chkl presente e expostas a irradiação ou a um agente que danifique oDNA. As células cultivadas com uma densidade de 1000-2000 por poço emplacas de micro-titulação de 96 poços são cultivadas em RMPI 1640 contendo10% FBS, 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina durante 18ha 37°C em uma incubadora umidificada com 5% de C02. As células testadaspodem incluir quaisquer células ou linhas de células de interesse, tais comoHeLa, ACHN, 786-0, HCT116, HCT15, SW620, HT29, Colo205, SK-MEL-5, SK-MEL-28, A549, H322, OVCAR-3, SK-OV-3, MDA-MB-231, MCF-7,PC-3, HL-60, K562, Bx-PC3, Mia-PaCa2, H810, H226, H2126, e Molt4.

Todas as designações de linhas de células referem-se às seguintes linhas decélulas humanas:

HeLa Adenocarcinoma cervical

ACHN adenocarcinoma renal

786-0 adenocarcinoma renal

HCT116 carcinoma de cólon

SW620 carcinoma de cólon, metástase de nodo linfático

HT-29 adenocarcinoma colo-retal

Colo205 adenocarcinoma de cólon

SK-MEL-5 MelanomaSK-MEL-28 Melanoma maligno

A549 Carcinoma de pulmão

H322 Carcinoma broncoalveolar

OVCAR-3 adenocarcinoma ovariano

SK-OV-3 Adenocarcinoma ovariano

MDA-MB-231 Adenocarcinoma de mama

MCF-7 Adenocarcinoma de mama

PC-3 adenocarcinoma de próstata, de

metástase óssea

HL-60 Leucemia promielocitica aguda

K562 Leucemia linfoblástica aguda; T

MOLT4 linfoblástico

As células são tratadas com meio contendo a drogaquimioterapêutica sozinha ou as drogas quimioterapêuticas de um inibidor deChkl. As células são incubadas durante aproximadamente cinco dias antes e ocrescimento é medido por determinação de níveis de absorção de 3H-timidina. As drogas quimioterapêuticas incluem etoposide, doxorubicina,cisplatina, clorambucila, 5-fluoro ouracila (50FU). A concentração da droganecessária para inibir o crescimento da célula a 90% de células de controlenão tratadas é definida como GI90.

Os compostos da presente invenção podem ser testados comanti-metabólitos adicionais, incluindo metotrexate, hidroxiuréia, 2-cloroadenosine, fludarabine, azacitidine, e gemcitibina para avaliar nosmesmos a habilidade de aumentar a mortalidade dos agentes. Os compostosda presente invenção podem ser comparados uns aos outros através daavaliação da mortalidade aumentada do carcinoma colo-retal HT29 emcombinação com gemcitibina.

Além disso, pode ser testada a habilidade dos inibidores deChkl da invenção para aumentar a mortalidade por radiação.

Exemplo 5

Ensaio de sensibilização para medir a atividade inibidora de Chkl em modelosde animais.

O seguinte ensaio de sensibilização foi desenvolvido paramedir a atividade inibidora de Chkl em modelos de tumores de roedores.Especialmente, o ensaio pode ser utilizado, inter alia, para medir a habilidadede um inibidor de Chkl de bloquear a função Chkl no modelo de tumor, epermitir a avaliação das condições que facilitam o acesso do inibidor de Chklpara a molécula visada.

A habilidade dos inibidores seletivos de Chkl parainterromperem o ponto de verificação induzido por quimioterapia é medidautilizando-se um ensaio quantitativo imunofluorescente que mede o índicemitótico através da monitoração da fosforilação H3 histona sobre serina 10(H3-P), um evento específico de mitose (Ajiro et al., J Biol Chem., 271:13.197-201, 1996; Goto et al., J Biol Chem., 274: 25.543-9, 1999). Oprotocolo de ensaio é como se segue. Os tumores de roedores tratados ou nãotratados com um ativador de Chkl (no estudo atual, agente de quimioterapia)e/ou o inibidor de Chkl, são excitados e embebidos em parafina. Os tumoressão cortados em fatias com 6 mícrons de espessura e montados em lâminas devidro. A parafina é removida das lâminas por intermédio de tratamentossucessivos de 3 minutos com xileno, 100% de metanol, 95% de etanol, 70%de etanol e água desionizada. As lâminas então são aquecidas a 95 °C emcitrato de sódio a 10 mM durante 10 minutos seguido por uma etapa deresfriamento de 20 minutos. As lâminas são bloqueadas durante 30 minutoscom solução tampão de bloqueamento (20% de soro humano normal e 2% dealbumina de soro bovino em solução salina tamponada por fosfato contendo0,05% de Triton X-100 (PBST)). O anticorpo H3 antifosfo-histoína (UpstateBiotech, Cat. # 06-570) é diluído a 1:200 na solução tampão e é bloqueado eincubado com as lâminas durante lh. As lâminas são lavadas três vezesdurante 5 minutos em PBST. O anticorpo secundário, "donkey antirabbitrhodamine" (Jackson, cat # 711-295-152) é adicionado durante 30 minutos.As lâminas então são lavadas duas vezes em PBST e são adicionados 75 uMde 0,1 uM/ml de DAPI (Sigma) em solução salina tamponada por fosfato(PBS) e deixada para produzir mancha durante 30 minutos. As lâminas entãosão lavadas duas vezes mais em PBST e montadas com Vectashield (Vector,cat # H-1400). As lâminas são vistas utilizando-se microscopia defluorescência. A percentagem de células manchadas com o anticorpo H3-Pem relação ao total de células (DAPI manchadas) é quantificada utilizando-seo programa Metamorph (Universal Imaging Corporation, Version 4.6).

Exemplo 6

Os inibidores seletivos de Chkl interrompem os danos de DNA induzidos porpontos de verificação das fases G2 e S

Estudos anteriores demonstraram que os inibidores seletivosde Chkl interrompem substancialmente os danos no DNA induzidos pelospontos de verificação G2/M e S. No primeiro, os danos de DNA sãoinduzidos por radiação por ionização (IR), cuja fase visada é a fase G2. Noúltimo, o dano do DNA é induzido pelos agentes quimioterapêuticos cuja fasevisada é a fase S. Ver a publicação de solicitação de patente americanapublicada 2003/0069284 e referências citadas na mesma.

Resumidamente, a interrupção do inibidor de Chkl do ponto deverificação de danos do DNA induzidos por IR é ensaiada através deexperiências de índice mitótico. Aproximadamente lxlO6 células HeLa sãoirradiadas com 800 rads e incubadas durante 7h a 37°C. Como essas célulassão funcionalmente p53 negativas, elas são interrompidas exclusivamente emG2. É então adicionado nocodazol em uma concentração de 0,5 ug/ml eincubada durante 15h a 37°C. (a adição de nocodazol é projetada para reter ascélulas que progridem através da parada G2 em mitose, dessa forma evitandoque as mesmas progridam adicionalmente para Gl e permitindo aquantificação de células da fase M). Um inibidor seletivo de Chkl éadicionado durante 8h, e as células são cultivadas por centrifugação, lavadasuma vez com PBS, e então recolocadas em suspensão em 2,5 ml de KC1 75mM e centrifugadas outra vez. A células então são fixadas em 3 ml de ácidoacético:MeOH (1:13), preparado recentemente, frio, e incubadas sobre gelodurante 20 minutos. As células são granuladas, a solução fixa é aspirada e ascélulas são recolocadas em suspensão em 0,5 ml de PBS. Pastas "mitóticas"são preparadas pipetando-se 100 ulitros das células fixadas sobre uma lâminamicroscópica de vidro e mergulhando a mostra em 1 ml de solução fixa. Aslâminas são então secadas ao ar, manchadas com solução Wrights (Sigma, St.Louis, MO) durante 1 minuto, seguido por uma lavagem em água e umalavagem em MeOH a 50%. A presença de cromossomos condensados e faltado envelope nuclear identificaram as células mitóticas. Os inibidores de Chklresultam em um aumento no número de células mitóticas na presença deirradiação, dessa forma demonstrando o término da parada G2 induzida porIR. Este término do ponto de verificação resulta em um aumento na atividadede CiclinB/cdc2, que é requerida para a progressão de células para mitose. Acélulas tratadas com IR seguido pelo inibidor de Chkl progridem assim para amitose com o DNA danificado. Estas experiências confirmam a hipótese deque a Chkl é envolvida no G2 induzido por IR.

Exemplo 7

Um inibidor de Chkl é retirado pela células do tumor na presença do ativadorde Chkl em um modelo de tumor xenografítado

Em um modelo de tumor xenografitado, camundongos sãoinoculados com tumores de carcinoma do cólon HT29 no flanco e deixadoscrescer até 200 mm3. Os camundongos são então tratados com qualquerveículo, 300 mg/kg de inibidor de Chkl, 20 mg/kg de gemcitabina ou co-administrados com 300 mg/kg de inibidor de Chkl e 20 mg/kg degemcitabina duas vezes, com intervalo de três dias, nos dias 1 e 4. Otratamento de camundongos contendo tumores através da co-administração deinibidor de Chkl e gemcitabina resulta em um retardo do crescimento durante4 dias em tumores, em comparação com a gemcitabina sozinha.

Para avaliar a difusão dos inibidores de Chkl em tecido detumor, são medidos os níveis de plasma de um tecido do inibidor de Chkl.Utilizando-se uma bomba Alzet, 500 mg/kg de inibidor de Chkl sãoadministrados em um camundongo contendo o tumor HT-29 em um sistemade administração contínua durante um período de 24h. As amostras de plasmasão retiradas, e então os tumores, rins, fígado, baço, e o pulmão são semeados.Os intervalos de tempo de recolhimento são 1, 2, 4, 8, e 24h. Os tecidos sãoextraídos e os níveis de inibidor de Chkl são quantificados. Esta experiênciademonstra que um inibidor de Chkl penetrou no tecido normal do tumor,alcançou um nível de cerca de 15 micrometros no tecido do tumor, e picos notecido do baço em 8h em cerca de 20 uM. Assim sendo, os inibidores de Chklforam rapidamente absorvidos pelas células proliferantes e são úteis, emconjunto com os agentes quimioterapêuticos de ativação de Chkl, comoterapias para o tratamento de doenças proliferativas.

Exemplo 8

Resposta a dose de tumores tratados com inibidores de Chkl e gemcitabina

Para se determinar uma dose eficaz de um inibidor de Chklapós o tratamento com gemcitabina e se a interrupção do ponto de verificaçãodependente de dose é correlacionada com a atividade anti-rumor, é executadauma experiência de resposta da dose.

Camundongos foram inoculados com células de tumor HT29 eos tumores foram deixados em desenvolvimento durante dez dias. Os tumoresno início tinham aproximadamente 100 o mm3. Os animais foram tratadoscom gemcitabina na MTD (160 mg/kg) seguido pelo inibidor de Chkl a 50mg/kg, 200 mg/kg, ou 400 mg/kg.

O tempo de pré-tratamento com gemcitabina é de 32h nestaexperiência, conforme determinado pelo ensaio baseado em células queindicou este momento como sendo ótimo para este tipo de tumor. A análise dovolume do tumor em cada regime de tratamento indicou que o tratamento doscamundongos contendo o tumor HT29 com a terapia descrita reduz ocrescimento do tumor mais do que a gemcitabina sozinha, com 200 mg/kg ou400 mg/kg de inibidor de Chkl acrescido de gemcitabina outra vez mostrandoos efeitos dependentes da dose de inibidor de Chkl.

Exemplo 9

Ensaio para determinar se um agente é um ativador de Chkl

Para se determinar se um agente é um ativador de Chkl, oestado de fosforilação de Chkl pode ser medido utilizando-se anticorposfosfo-específícos para sítios específicos de fosforilação na Chkl. As serinas317 e 345 mostraram ser fosforiladas após o tratamento de células com aradiação ionizante, radiação ultravioleta, hidroxiuréia, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), temozolmide e gemcitabine. Liu et al., GenesDev. 14:1448-1.459, 2000; Zhao et al., Mol. Cell Biol. 21: 4129-4139, 2001;Lopez-Girona et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 98: 11.289-11.294, 2001;Guo et al., Genes Dev. 14:2745-2756, 2000; Gatei et al., J. Biol. Chem. 278:4.806-14811, 2003; Ng et al., J Biol Chem. 279 (10):8808-19, 2004; Wang etal., Natl Acad Sei USA. 100 (26): 15.387-92, 2003; Stojic et al. Genes Dev.18 (11): 1331-44, 2004. Estes sítios de serina são fosforilados através dequinase dos pontos de verificação a montante, Atm e Atr. Liu et al. GenesDev. 14: 1448-1459, 2000; Zhao et al. Mol. Cell Biol, 21: 4129-4139, 2001).

A fosforilação destes sítios em resposta a um ativadorcandidato Chkl pode ser monitorada pelo "Western blot" ouimunoistoquímica de células de tumor. Por exemplo, o seguinte procedimentopode ser usado para demonstrar que a gemcitabina resulta na ativação de Chklna serina 345 e 317. As células HT29 são tratadas com 20 uM de gemcitabinadurante 2h. A gemcitabina é removida do meio de crescimento de célula e ascélulas são incubadas por mais 22h. Os lisatos de proteína são preparados eseparados por eletroforese de gel SDS-poliacrilamida. As proteínas sãotransferidas para membranas PVDF e sensibilizadas com anti-soro especifico(Cell Signalling) para a serina fosforilada 317 ou 345 (Cell Signalling). Os"Western blots" mostram que o tratamento com gemcitabina resulta nafosforilação de ambas as serinas 317 e 345.

Exemplo 2

Ensaio para monitorar a atividade Chkl em resposta a um inibidor de Chkl

Descobriu-se que a fosforilação de Chkl na serina 296 éestimulada pelo tratamento de células do tumor com gemcitabina, e que afosforilação neste sítio é inibida pelos inibidores de Chkl. A fosforilação nestesítio não é inibida por "wortmannin", que inibe a Atm e Atr. Portanto, afosforilação da serina 296 é diferente da fosforilação nas serinas 317 e 345.Além disso, descobriu-se que este sítio é fosforilado em preparaçõespurificadas de Chkl, sugerindo que a enzima purificada é capaz de fosforilarela própria ou outras moléculas de Chkl na serina 296. Considerados emconjunto, estes dados sugerem que a fosforilação na serina 296 é executadapela própria Chkl. Assim sendo, esta abordagem pode ser usada paramonitorar a atividade da Chkl em tumores, em resposta a ativadores de Chkl.

Alem disso, esta abordagem pode ser usada para medir a inibição da ativaçãode Chkl pelos inibidores de Chkl.

Assim sendo, as células HT29 são tratadas com 20 uM degemcitabina durante 2h. A gemcitabina é removida dos meios de crescimentoda célula e as células são incubadas por mais 22h. Os lisatos são preparados eseparados por uma eletroforese gel SDS-poliacrilamida. As proteínas sãotransferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF) einoculadas com anti-soro (Cell Signalling) específico para serina fosforilada296 (Cell Signalling).

O "Western blot" mostra que o tratamento com gemcitabinadas células de carcinoma do cólon HT29 resulta na fosforilação da serina 296.Além disso, as células HT 29 tratadas com inibidores seletivos de Chkldurante 15 minutos não mostram nenhuma fosforilação da serina 296. Estesdados sugerem que a fosforilação da serina 296 é executada pela quinaseChkl.Exemplo 11

Modelos de tumores de animais

Para testar a habilidade dos inibidores de Chkl da invenção deaumentarem a mortalidade de tumores pelos agentes que danificam o DNAem camundongos, são estabelecidos modelos de tumor xenografitadosutilizando linhas de células de tumor do cólon. 5-fluoro ouracil (5-FU) ougemcitabina podem ser usados como os agentes que danificam o DNA. HT29e Colo205 (carcinoma do cólon humano) e células H460 e Calu-6 (carcinomade células não pequenas) podem ser usadas para a propagação de tumoresxenografitados em camundongos Balb/c tímicos fêmea com idade de 6-8semanas. Os camundongos são mantidos em uma cabine com fluxo de arlaminar sob condições isentas de patógenos e alimentados com alimentosestéreis e água ad libitum. As linhas de células são cultivadas parasubconfluência em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, 100U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina, e 1,5 mM de L-glutaminaem um ambiente umidificado com 5% de CO2. Suspensões de uma só célulasão preparadas em CMF-PBS, e a concentração da célula é ajustada para 1 xIO8 células/ml. Os camundongos são inoculados subcutaneamente (s.c.) noflanco direito ou na perna direita com um total de 1 x IO7 células (100ulitros).

Os camundongos são distribuídos aleatoriamente (5-15camundongos/grupo) em quatro grupos de tratamento e usados quando ostumores alcançam um volume de 75-100 cm3 (usualmente 7-11 dias após ainoculação). Os tumores são medidos com calibres verniers e os volumes dostumores são estimados utilizando-se a fórmula derivada empiricamente:volume do tumor (cm3) = comprimento do tumor (cm) x largura do tumor(cm) x profundidade do tumor (cm)/3,3. O tratamento consiste de i ) 100microlitros de injeção intraperitoneal (i.p.) de gemcitabina a 160 mg/kg. Éobservado um retardo no crescimento do tumor nos camundongos tratadoscom gemcitabina. Espera-se que o tratamento dos camundongos com 160mg/kg de gemcitabina em combinação com a administração oral de inibidoresde Chkl reduza os volumes do tumor e prolongue a vida. O tamanho do tumoré monitorado dia sim dia não, durante a duração da experiência.

Obviamente, várias modificações e variações da invenção,conforme apresentado aqui anteriormente, podem ser feitas sem se afastaremdo espírito e escopo da mesma, e portanto, somente as limitações indicadaspelas reivindicações anexas devem ser impostas à mesma.

Claims

1. Composto ou um sal, pró-droga, ou solvatofarmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ter afórmula estrutural: <formula>formula see original document page 116</formula> e R1 ser halogênio, alquila C1.3, CN, e CF3;R2 é hidrogênio, alquila Ci_3, CN, alquila OC1.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila Q.3;R3 é um anel heterocíclico saturado de seis ou sete membroscontendo um grupo de N-Ra do anel e um segundo grupo de N-Ra do anel, umoxigênio do anel, um enxofre do anel, onde Ra, independentemente, éhidrogênio, alquila Q.3, CH2CN, ou CH2CH2-CN, e onde a R3 opcionalmenteé substituído com oxo (=0);R4 é hidrogênio, alquila Ci_3, alquila OC1.3, alquila SQ.3,alquila N(Rb)2, NRbC (=0) C 1.3, ou um anel heterocíclico saturado com cincoou seis membros contendo um grupo N-Ra e opcionalmente um anelsubstituído com um a três grupos Ci_3 alquila;ou R2 e R4 em conjunto com os carbonos nos quais eles sãoligados são tomados para formarem um anel carbocíclico saturado com cincoa sete membros;e R5 é hidrogênio ou halogênio,desde que pelo menos um dos R2 e R4 seja diferente dehidrogênio, e que quando R5 é halogênio, R2 ou R4 é hidrogênio.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R1 ser cloro, metila, CN, ou CF3.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R2 ser hidrogênio, metila, etila, cloro, bromo, dimetilamino,ciano, ou metóxi.

4. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R2 ser diferente de hidrogênio.

5. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R4 ser hidrogênio, metila, cloro, metóxi, flúor, dimetilamino,-SCH3, isopropoxila,-NHC (O) CH (CH3)2,-NHC (=0) CH3, <formula>formula see original document page 117</formula>

6. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R4 ser metila, cloro, ou metóxi.

7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de R5 ser halogênio.

8. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de R5 ser flúor.

9. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de R2 ou R4 ser hidrogênio.

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de R4 ser hidrogênio.

11. Composto de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de R2 e R4 serem tomados em conjunto paraformarem um anel carbocíclico saturado com cinco membros ou seismembros.

12. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato R3 ser selecionado do grupo consistindo de: <formula>formula see original document page 118</formula>

13. Composto ou um sal, pró-droga, ou solvatofarmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado pelo fato de ter afórmula estrutural: <formula>formula see original document page 119</formula> e R1 ser halogênio, alquila C1.3, CN, ou CF3;R2 é hidrogênio, alquila Ci_3, CN, alquila OC1.3, halogênio, ouN(Rb)2, onde Rb, independentemente, é hidrogênio ou alquila C1-3;R3 é um anel heterocíclico saturado com seis ou sete membroscontendo um grupo N-Ra do anel e um segundo grupo N-Ra do anel, umoxigênio do anel, um enxofre do anel, onde Ra, independentemente, éhidrogênio, alquila C1.3, ou CH2CN, e onde R3 é opcionalmente substituídocom oxo (=0);R4 é hidrogênio, alquila Ci_3, alquila OCi_3, ou halogênio;ou R2 e R4 em conjunto com os carbonos com os quais eles sãoligados são tomados para formarem um anel carbocíclico saturado com cincoa sete membros,desde que pelo menos um dos R2 e R4 seja diferente dehidrogênio.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R1 ser cloro, metila, CN, ou CF3.

15. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R2 ser metila, cloro, ou metóxi.

16. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R4 ser metila, cloro, ou metóxi.

17. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R2 e R4 em conjunto com os carbonos nos quais eles são ligadossão tomados para formarem um anel carbocíclico saturado com seis membros.

18. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R3 ser selecionado do grupo consistindo de: <formula>formula see original document page 120</formula>droga dos mesmos de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelode ter uma estrutura: <formula>formula see original document page 121</formula><formula>formula see original document page 122</formula><formula>formula see original document page 123</formula><formula>formula see original document page 124</formula><formula>formula see original document page 125</formula><formula>formula see original document page 126</formula><formula>formula see original document page 127</formula><formula>formula see original document page 128</formula><formula>formula see original document page 129</formula><formula>formula see original document page 130</formula><formula>formula see original document page 131</formula><formula>formula see original document page 132</formula><formula>formula see original document page 133</formula><formula>formula see original document page 134</formula><formula>formula see original document page 135</formula><formula>formula see original document page 136</formula><formula>formula see original document page 137</formula><formula>formula see original document page 138</formula>

19.

20. Composto e misturas ou um sal, um solvato, ou uma pró-droga dos mesmos de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato <formula>formula see original document page 138</formula>de ter a estrutura: <formula>formula see original document page 139</formula><formula>formula see original document page 140</formula><formula>formula see original document page 141</formula><formula>formula see original document page 142</formula><formula>formula see original document page 143</formula><formula>formula see original document page 144</formula><formula>formula see original document page 145</formula><formula>formula see original document page 146</formula><formula>formula see original document page 147</formula><formula>formula see original document page 148</formula><formula>formula see original document page 149</formula><formula>formula see original document page 150</formula><formula>formula see original document page 151</formula>

21. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de R1 ser metila ou ciano; R2 ser metila, ciano, cloro, ou bromo; e R3]e<formula>formula see original document page 151</formula>

22. Composto de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de R4 ser hidrogênio.

23. Composto de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de R4 ser metila ou etila.

24. Composto de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de R4 ser cloro.

25. Composto e misturas ou um sal, um solvato, ou uma pró-<formula>formula see original document page 152</formula><formula>formula see original document page 153</formula><formula>formula see original document page 154</formula><formula>formula see original document page 155</formula><formula>formula see original document page 156</formula><formula>formula see original document page 157</formula>

26. Método de inibição da quinase do ponto de verificação 1em uma célula, caracterizado pelo fato de ser composto de uma etapa decontato da célula com uma quantidade efetiva de um composto como definidona reivindicação 1 ou reivindicação 13.

27. Método de sensibilização de células em um indivíduosofrendo um tratamento quimioterapêutico ou rádio-terapêutico para umaindicação médica, caracterizado pelo fato de ser composto da administraçãoao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um compostocomo definido na reivindicação 1 ou reivindicação 13, em combinação comum agente quimioterapêutico, um agente radioterapêutico, ou uma misturados mesmos.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de ser ainda composto da administração ao indivíduo de umacitoquina, linfoquina, fator de crescimento, outro fator hematopoiético, oumistura dos mesmos.

29. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do agente quimioterapêutico ser selecionado do grupo consistindo deum agente alquilante, um anti-metabólito, um hormônio ou antagonista domesmo,um radioisótopo, um anticorpo, e misturas dos mesmos.

30. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do agente radioterapêutico ser selecionado do grupo consistindo degama-radiação, radiação por raios X, luz ultravioleta, luz visível, radiaçãoinfravermelha, e radiação por microondas.

31. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato da condição ser um câncer selecionado do grupo consistindo de umcâncer colo-retal, um câncer de cabeça e pescoço, um câncer pancreático, umcâncer do seio, um câncer gástrico, um câncer na bexiga, um câncer da vulva,uma leucemia, um linfoma, um melanoma, um carcinoma de célula renal, umcâncer ovariano, um câncer no cérebro, um osteosarcoma, e um câncer dopulmão.

32. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato da condição ser um câncer selecionado do grupo consistindo decarcinoma de célula mixóide e redonda, um tumor desenvolvido localmente,um câncer metastático, sarcoma de Ewing, metástase do câncer, metástaselinfática, carcinoma de células escamosas, carcinoma oral, mieloma múltiplo,leucemia linfocítica aguda, leucemia anti-linfocítica aguda, leucemialinfocítica crônica, leucemia de células dos cabelos, linfoma de efusão(linfoma com base na cavidade do corpo), câncer tímico de linfoma dopulmão, carcinoma de célula pequena, linfoma de célula T cutânea, linfomade Hodgkin, linfoma diferente de Hodgkin, câncer do córtex adrenal, tumoresde produção de ACTH, câncer de célula não pequena, câncer do seio,carcinoma de célula pequena, carcinoma ductal, câncer do estômago, câncerdo cólon, câncer colo-retal, pólipos associados com neoplasia colo-retal,câncer pancreático, câncer do fígado, câncer da bexiga, tumor primáriosuperficial da bexiga, carcinoma de célula invasiva transicional da bexiga,câncer de músculo invasivo da bexiga, câncer da próstata, carcinomaovariano, neoplasma epitelial peritoneal primário, carcinoma cervical,cânceres endometriais uterinos, câncer da vagina, câncer da vulva, cânceruterino e tumores sólidos no folículo ovariano, câncer do testículo, câncer dopênis, carcinoma de célula renal, tumor intrínseco do cérebro, neuroblastoma,tumor astrocítico do cérebro, glioma, invasão em célula de tumor metastáticono sistema nervoso central, osteoma e osteosarcoma, melanoma maligno,progressão de tumor queratinócito de pele humana, câncer de célulasescamosas, câncer da tiróide, retinoblastoma, neuroblastoma, efusãoperitoneal, efusão pleural maligna, mesotelioma, tumor de Wilm, câncer dabexiga irritada, neoplasma trofoblástico, hemangiopericitoma e sarcoma deKaposi.

33. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do tratamento ser administrado para uma condição inflamatóriaselecionada do grupo consistindo de artrite reumatóide, psoríase, vitiligo,granulomatose de Wegener e lúpus eritematoso sistêmico.

34. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do composto como definido na reivindicação 1 ter pelo menos umaseletividade de vinte vezes na inibição de Chkl em relação a proteína quinaseA, proteína quinase C, cdc2, e pp60v-src.

35. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do composto como definido na reivindicação 1 ter pelo menos umaseletividade de 75 vezes na inibição de Chkl em relação a proteína quinase A,proteína quinase C, cdc2, e pp60v-src.

36. Método de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato do composto como definido na reivindicação 1 ter pelo menos umaseletividade de 100 vezes a inibição de Chkl em relação a proteína quinase A,proteína quinase C,cdc2, e pp60v-src.

37. Método de inibição da proliferação de célula aberrante,caracterizado pelo fato de ser composto do contato de uma população decélulas compostas de células aberrantemente proliferantes com um ativadorde Chkl para sincronizar substancialmente a parada do ciclo celular entre asreferidas células aberrantemente proliferantes, e posteriormente o contato dareferida população de células com um composto como definido nareivindicação 1 ou reivindicação 13, para finalizar substancialmente a paradado referido ciclo celular.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato do referido ativador de Chkl ser composto pelo menos de um agentequimioterapêutico.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato do referido ativador de Chkl ser composto de radiação por ionizaçãoou ultravioleta.

40. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato da referida radiação por ionização ser administrada em conjuntocom um radio-sensibilizante, um fotossensibilizante, ou uma mistura dosmesmos.

41. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato das referidas células aberrantemente proliferantes não seremcancerosas.

42. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 ou-13, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para ainibição da quinase 1 do ponto de verificação.

43. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 ou-13, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para asensibilização de células em um indivíduo sofrendo um tratamentoquimioterapêutico ou radioterapêutico para uma indicação médica.

44. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 ou-13, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento para ainibição da proliferação de célula aberrante em uma população de célulascompreendendo células aberrantemente proliferantes.

45. Uso de um composto como definido na reivindicação 1 ou-13, caracterizado pelo fato de ser para a produção de um medicamento emuma célula para o tratamento curativo ou profilático de uma condição onde ainibição da quinase 1 de ponto de verificação é de benefício terapêutico.

46. Artigo de fabricação para uso farmacêutico humano,caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma composição farmacêutica compreendendo umcomposto como definido na reivindicação 1 ou 13;(b) uma bula de embalagem desde que a composição seja útilno tratamento de indicações envolvendo a proliferação de célula aberrante; e(c) um recipiente.

47. Artigo de fabricação para uso farmacêutico humano,caracterizado pelo fato de compreender:(a) uma composição farmacêutica compreendendo umcomposto como definido na reivindicação 1 ou 13;(b) uma bula de embalagem mostrando que a composição éútil como um quimio-sensibilizante ou radio-sensibilizante em um tratamentode uma indicação relacionada com lesões do DNA ou replicação do DNA; e(c) um recipiente.