BRPI0609698A2 - uso da proteìna de mst para o tratamento de um distúrbio tromboembólico - Google Patents

Abstract

USO DA PROTEìNA DE MST PARA O TRATAMENTO DE UM DISTúRBIO TROMBOEMBóLICO. A presente invenção refere-se ao uso da proteína de Mst ou uma seqúência de nucleotídeo que codifica para a proteína de Mst para o tratamento de um distúrbio tromboembólico e a um método de triar um modulador da proteína de Mst ou a seqúência de nucleotídeo que codifica para a proteína de Mst.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DAPROTEÍNA DE MST PARA O TRATAMENTO DE UM DISTÚRBIO TROMBOEMBÓLICO".

A presente invenção refere-se ao uso da proteína de Mst ouuma seqüência de nucleotídeo que codifica para a proteína de Mst para otratamento de um distúrbio tromboembólico e a um método de triar um mo-dulador da proteína de Mst ou a seqüência de nucleotídeo que codifica paraa proteína de Mst.

Durante os últimos anos, várias terapias antiplaquetas, variandode aspirina a ticlopidina e clopidrogel, foram introduzidas e seus benefíciosestão bem documentados. Porém, embora todas destas terapias diferentesadicionem benefícios adicionais para o tratamento de distúrbios tromboem-bólicos, elas freqüentemente estão associadas a efeitos colaterais não-desejáveis e a eficácia dos tratamentos, até mesmo combinados, ainda nãoé suficiente. Desse modo, novos métodos para o tratamento de distúrbiostromboembólicos são urgentemente necessários.

As cinases relacionadas a STE20 constituem uma família evolu-cionariamente conservada de serina/treonina cinases. Ste20p, o fundadordesta família de cinase, é uma MEK cinase cinase cinase (MAP4K) envolvi-da na via de resposta de feromônio de levedura em brotamento (Leberer, E.et al. (1992) EMBO J. 11, 4815-4824). Nos últimos anos vários homólogosde Ste20 mamíferos e de levedura foram identificados. Eles entram em duasclasses: aqueles ligando Cdc42 e/ou Rac1 (cinases ativadas por p21 ouPAKs), e aqueles que não parecem ser regulados desta maneira (cinases decentro germinal ou GCKs) (para revisão vide Dan, C. et al. (2001) J. Biol.Chem. 276, 32115-32121). Mst1 é um membro da última classe: ele foi mos-trado ser homólogo às enzimas de Ste20 de levedura e de Pak mamíferasao longo do domínio de cinase, mas não contém o domínio de ligação deGTPase de p21, nem compartilha qualquer homologia significativa comSte20 ou Pak fora do domínio de cinase.

A Mst1 humana (semelhante ao Vinte Estéril Mamífero) foi origi-nalmente isolada por triagem de PCR de uma biblioteca de cDNA de linfócitohumano com preparadores degenerados projetados para amplificar os do-mínios catalíticos de serina/treonina cinases (Creasy, C. L. et al. (1995) J.Biol. Chem. 270, 21695-21700; Creasy, C. L. et al. (1995) Gene 167, 303-306). Um homólogo próximo de Mst1, Mst2 foi identificado logo depois delepelos mesmos autores. Em um estudo prematuro ambas, Mst1 e Mst2, fo-ram mostradas ser ativadas em resposta às condições de estresse e agen-tes apoptóticos e foram portanto alternativamente nomeadas Cinase Res-ponsiva ao Estresse (Krs) 1 e 2.

Recentes publicações sugerem um papel para Mst1 e Mst2 emapoptose. Mst1 e Mst2 ambas sofrem proteólise mediada por caspase emresposta aos estímulos apoptóticos, como ligação de CD95/Fas ou tratamen-to com estaurosporina (Graves, J. D. et al. (1998) EMBO J 17, 2224-2234;Lee, K. K. et al. (1998) Oncogene 16, 3029-3037). Porém, embora Mst1 te-nha dois sítios diferentes cliváveis por caspase que geram dois fragmentosbioquimicamente catalíticos distintos, só um sítio clivável por caspase foirelatado para Mst2. Devido ao efeito regulador negativo dos domínios C-terminais de Mst1 e Mst2, sua remoção através de clivagem por caspaseativa a atividade de cinase das formas resultantes in vitro e in vivo, e leva àtranslocação celular (Creasy, C. L. et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 21049-21053; Deng, Y. et al. (2003) J. Biol. Chem. 278, 11760-11767; Graves, J. D.et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 14909-14915; Graves, J. D. et al. (1998)supra; Lee, K. K. et al. (1998) supra). Além disso, sobreexpressão de Mst1induz característica de alterações morfológicas de apoptose em células de Blinfomas humanas (Graves, J. D. et al. (2001), supra. Clonagem de cDNA dehomólogos de MST em camundongo e nematódeo mostra que seqüênciasclivadas por caspase são evolucionariamente conservadas.

Sobreexpressão de Mst1 ativa as vias de MAP cinase JNK ep38 por meio de MKK4/MKK7 e MKK3/MKK6, respectivamente (Graves, J.D. et al. (2001) supra; Ura, S. et al. (2001) Genes Cells 6, 519-530). Comoexpressão de Mst1 resulta em ativação de caspase-3, Mst1 é não só um al-vo das caspases mas também um ativador de caspases. Esta ativação decaspase e alterações apoptóticas ocorrem através de JNK, uma vez que aco-expressão de um mutante dominante-negativo de JNK inibiu alteraçõesmorfológicas induzidas por Mst1 como também ativação de caspase (Ura, S.et al. (2001) supra). Em um recente documento, (Khokhlatchev, A. et al.(2002) Curr. Biol. 12, 253-265 suporte forte para a existência de uma via efe-tora de Ras nova influenciando a sobrevivência celular foi mostrado. Seguin-do este modelo, Ras ativado pode ligar a um complexo consistindo em Noree Mst1 e subseqüentemente realizar as vias de sinalização a jusante (Khok-hlatchev, A. et al. (2002) supra). Porém, substratos diretos fisiológicos po-tenciais de Mst1 não foram identificados até agora. Mst1 é expressada emmegacariócitos, as células progenitoras para as plaquetas (Sun, S. et al.(1999) J. Cell Biochem. 76, 44-60). Megacariócitos sofrem ciclos celularesendomitóticos como parte de seu processo de maturação. Além de poliploi-dização, um conjunto de genes como fator de plaqueta 4 (PF4), acetilcolinaesterase e glicoproteína Mb (GPIIb) é ativado nos megacariócitos de matura-ção. Diferenciação de megacariócito é promovida pela trombopoietina decitocina (TPO) como o ligando de receptor de c-Mpl. TPO sinaliza para aregulação do nível de DNA por meio dos membros da família de cinase deJanus JAK2 e Tyk2, Shc, as proteínas de Stat 3 e 5 e por meio da cinase 2regulada por sinal extracelular. Expressão de Mst1 e atividade de Mst1 cina-se são sobre-reguladas através de ligando de Mpl em células cultivadas damedula óssea e na linhagem celular megacariocítica de camundongoY10/L8057. Além disso, a expressão induzida de Mst1 intensificou a expres-são de vários marcadores de diferenciação e aumentou poliploidização emresposta a PMA (Sun, S. et al. (1999) supra).

Foi relatado recentemente que Mst2 participa na via de sinaliza-ção de Raf-1: sob falta de soro Mst2 co-precipita com Raf-1 em células deCOS-1 transfectadas com um Raf-1 marcado com Marcador como tambémem células não-transfectadas (0'Neill, E. et al. (2004) Science 306, 2267-2270). Mst2 é uma cinase cuja atividade é aumentada através de agentespró-apoptóticos por meio de homodimerização e transfosforilação (Deng, Y.et al. (2003) supra; Lee, K. K. et al. (1998) supra). 0'Neill e colegas mostra-ram que ambos estes processos são inibidos por Raf-1 através de um me-canismo que não é dependente da atividade de Raf-1 cinase, mas prova-velmente contam com o recrutamento de uma Mst2 fosfatase ainda não i-dentificada (0'Neill, E. et al. (2004) supra).

Por meio de métodos proteômicos descobrimos que Mst1 eMst2 são expressadas em plaquetas humanas. Nesse ínterim estas desco-bertas foram confirmadas por outros traçadores: usando análise proteômicacom base em gel de 2D clássica extratos de plaqueta, 0'Neill et al. confir-mou a expressão de Mst2 em plaquetas (0'Neill, E., (2002) Proteomics 2,288-305). Além disso, Kris Gevaert e colaboradores identificaram fosfoprote-ínas de Mst1 e Mst2 em plaquetas (Gevaert, K. et al. "Novel Strategies andApplications for Non-gel Proteomics", Proteomic Fórum München 2003 - In-ternational Meeting on Proteome Analysis, 14-17 de setembro de 2003, Mu-nique, Alemanha) usando uma Cromatografia Diagonal Fracionária Combi-nada (Gevaert, K. etal. (2003) Nat. Biotechnol. 21, 566-569). Porém, emboraidentificando Mst1 e/ou Mst2 em plaquetas, nenhum destes estudos prove-ram quaisquer dados acerca de uma função potencial para Mst cinases emplaquetas. Desse modo, até agora, nenhum papel potencial para cinases dafamília de Mst na sinalização de plaquetas e ativação de plaquetas foi des-crito.

Agora, a presente invenção refere-se à descoberta que a proteí-na de Mst está envolvida em eventos de transdução de sinal que conduzempor fim à ativação e agregação de plaquetas.

Por conseguinte, a presente invenção é direcionada ao uso daproteína de Mst, em particular de Mst 1 e/ou Mst 2, ou uma seqüência denucleotídeo que codifica para a proteína de Mst, em particular para Mst 1 ouMst 2, para o tratamento de um distúrbio tromboembólico, em particular paraa produção de um medicamento para o tratamento de um distúrbio trombo-embólico. Preferivelmente a proteína de Mst, em particular a proteína de Mst1 e/ou Mst 2, é uma proteína de Mst humana. É observado que em geralMst1 humana e Mst2 humana têm uma identidade de 77,6% no nível de a-minoácido. O genoma de Peixezebra contém apenas um homólogo que re-presenta ambas, Mst1 e Mst2, com uma identidade de aminoácido de 76,8%e 88,8%, respectivamente. As seqüências de MST2 humanas e de rato têmum percentual de identidade de 96,7% no nível de aminoácido.

Em uma modalidade preferida, a proteína de Mst 1 humana ousua seqüência de nucleotídeo é caracterizada pela seqüência de aminoácidoda SEQ ID NO: 1 ou a seqüência de nucleotídeo SEQ ID NO: 2, respectiva-mente, e a proteína de Mst 2 humana ou sua seqüência de nucleotídeo écaracterizada pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3 ou a seqüên-cia de nucleotídeo SEQ ID NO: 4, respectivamente.

De acordo com a presente invenção o termo proteína de Mstrefere-se em geral a qualquer proteína de Mst de ocorrência natural comotambém mutantes de Mst biologicamente ativos. Proteínas de Mst de ocor-rência natural incluem proteínas de Mst de espécies diferentes, por exemplode peixe-zebra, preferivelmente vertebrados, mais preferivelmente mamífe-ros, como também variantes de encaixe biologicamente ativas. As proteínasde Mst mais preferidas já estão mencionadas acima.

O termo "mutante de Mst biologicamente ativo" refere-se a umaproteína derivada da proteína de Mst e que retém sua atividade biológica,isto é a atividade de cinase. Portanto, no presente caso o termo "biologica-mente ativo" refere-se à atividade de Mst cinase que pode ser medida emqualquer ensaio de cinase em geral conhecido, como os ensaios descritosno presente relatório descritivo, em particular o ensaio de consumo de ATPdescrito nos Exemplos. Em resumo, o ensaio de consumo de ATP refere-sea um ensaio de cinase in vitro contendo uma solução de tampão de cinasecom ATP e íons de Mg2+ ou íons de Mn2+ e a cinase, aqui o mutante de Mst,a ser testado. Portanto, o consumo de ATP e a atividade de cinase são emgeral medidos por bioluminescência.

Mais particularmente o termo "mutante de Mst biologicamenteativo" refere-se a uma seqüência de aminoácido que difere da seqüência deMst de ocorrência natural em um ou mais aminoácidos mas que retém suaatividade de cinase. Um tal mutante difere do polipeptídeo do tipo selvagemna substituição, inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos. Preferidassão substituições de aminoácido semiconservadoras, mais preferidas con-servadoras. Substituições típicas estão entre os aminoacidos alifaticos, entreos aminoacidos tendo cadeia lateral de hidroxila alifática, entre os aminoaci-dos tendo resíduos acídicos, entre os derivados de amida, entre os aminoa-cidos com resíduos básicos, ou os aminoacidos tendo resíduos aromáticos.

Substituições semiconservadoras e conservadoras típicas são:

<table>table see original document page 7</column></row><table>

Além disso, alterando de A, F, H, I, L, M, P, V, W ou Y para C ésemiconservadora se a cisteína nova permanecer como um tiol livre. Alémdisso, a pessoa versada apreciará que glicinas em posições estericamenteexigentes não deveriam ser substituídas e que P não deveria ser introduzidoem partes da proteína tendo uma estrutura alfa-helicoidal ou de folha beta.

O mutante em geral difere em estrutura primária (seqüência deaminoácido), mas pode ou não diferir significativamente em estrutura secun-daria ou terciária ou em sua função (atividade de cinase) com relação à pro-teína de ocorrência natural. Em todo caso o mutante mostra uma identidadeà proteína de Mst 1 ou proteína de Mst 2 do tipo selvagem de pelo menos70%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos85%, até mesmo mais preferivelmente pelo menos 95% e o mais preferivel-mente pelo menos 99%.

Exemplos de mutantes de Mst1 biologicamente ativos com mu-tações de ponto são:

D326N que é resistente à clivagem de protease, isto é caspase,em DEMD326S, D349E que é resistente à clivagem de protease emTMTD349G e D326N-D349E que é uma forma resistente à protease dupla(Graves J. D. et al. (2001), supra).

T183E, T175E, T175A, T177E e T177A que são mutações naalça de ativação de MST como também D326N, S327A e S327E (Glantsch-nig, H. et al. (2202) J. Biol. Chem., 277, 42987-42996).

T175A e T177A que são também mutações na alça de ativaçãode MST, L444P que é uma variante deficiente de dímero como tambémT120A e o mutante duplo S438A-T440A (Praskova, M. et al. (2004) Bio-chem. J., 381, 453-462).

Exemplos de mutantes de Mst2 biologicamente ativos com mu-tações de ponto são:

T117A e T384A (Deng, Y. et al. (2003), supra).

O mutante pode também ser uma porção da proteína de Mstsuficiente para sua atividade de cinase. A porção compreende pelo menos30 aminoácidos, preferivelmente pelo menos 100 aminoácidos, mais preferi-velmente pelo menos 300 aminoácidos, até mesmo mais preferivelmentepelo menos 450 aminoácidos e o mais preferivelmente pelo menos 482 ami-noácidos para Mst1 e pelo menos 486 aminoácidos para Mst2. Esta porçãodo análogo pode diferir da porção de polipeptídeo do tipo selvagem na subs-tituição, inserção ou deleção de um ou mais aminoácidos como detalhadoacima. Em uma modalidade a proteína de Mst ou o mutante de Mst biologi-camente ativo podem ser fundidos com outra molécula, por exemplo umaproteína e/ou um marcador, por exemplo Glutationa-S-transferase (GST).

Exemplos de fragmentos de Mst1 biologicamente ativos são:

A327-487 e A-487 que são os dois produtos de clivagem decaspase cataliticamente ativos de Mst1 (Graves, J. D. et al. (2001), supra;Lee, K., K. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276, 19276-19285; Glantschnig, H. etal. (2002), supra) e os aminoácidos de forma truncada de Mst1 1-455, 1-430,1-360 e 1-330, as deleções de A331-360 e A331-394 (Creasy, C. L. et al.(1996), supra) como também o domínio de Mst1 cinase como mostrado naFigura 12.

Exemplo de um fragmento de Mst2 biologicamente ativo:

A323-491 que é o produto de clivagem de caspase catalitica-mente ativo de Mst2 (Deng, Y. et al. (2003), supra).

Além disso, a presente invenção é direcionada ao uso da proteí-na de Mst, em particular de Mst 1 e/ou Mst 2, ou uma seqüência de nucleotí-deo que codifica para a proteína de Mst para a descoberta de um moduladorde proteína de Mst, em particular um inibidor, como um medicamento para otratamento de um distúrbio tromboembólico. Preferivelmente a proteína deMst, em particular a proteína de Mst 1 e/ou Mst 2, é uma proteína de Msthumana, também como especificada acima.

Em geral, a proteína de Mst descrita ou uma seqüência de nu-cleotídeo que codifica para a proteína de Mst, é colocada em contato comum composto de teste e a influência do composto de teste na proteína deMst é medida ou detectada.

De acordo com a presente invenção o termo "modulador de pro-teína de Mst" significa uma molécula moduladora ("modulador") da atividadebiológica da proteína de Mst, em particular uma molécula inibidora ou ativa-dora ("inibidor" ou "ativador"), especialmente um inibidor da proteína de Mstidentificável de acordo com o ensaio da presente invenção. Um inibidor emgeral é um composto que, por exemplo liga, parcial ou totalmente bloqueia aatividade, diminui, impede, retarda a ativação, inativa, dessensibiliza ou sub-regula a atividade ou expressão de pelo menos um da proteína de Mst comopreferivelmente descrito acima em detalhes, em particular da proteína deMst 1 humana. Um ativador em geral é um composto que, por exemplo au-menta, abre, ativa, facilita, intensifica a ativação, sensibiliza, agoniza ou so-bre-regula a atividade ou expressão de pelo menos uma das proteínas deMst como preferivelmente descrito acima em detalhes, em particular da pro-teína de Mst 1 humana. Tais moduladores incluem ligandos de ocorrêncianatural ou sintéticos, antagonistas, agonistas, peptídeos, peptídeos cíclicos,ácidos nucléicos, anticorpos, moléculas anti-sentido, ribozimas, moléculasorgânicas pequenas e similares.

Em outra modalidade preferida da presente invenção o distúrbiotromboembólico mencionado acima é causado por ativação e/ou agregaçãode plaquetas. De acordo com a presente invenção o distúrbio tromboembóli-co é selecionado de infartação do miocárdio, angina instável, síndromes co-ronárias agudas, doença de artéria coronária, restenose, acidente vascularcerebral, ataques isquêmicos transitórios, embolia pulmonar, disfunção ven-tricular esquerda, prevenção secundária de complicações vasculares clínicasem pacientes com doenças cardiovasculares e/ou cerebrovasculares, ate-rosclerose e/ou co-medicação para intervenções vasculares, em particularacidente vascular cerebral, infartação do miocárdio, aterosclerose e/ou res-tenose.

A presente invenção é também direcionada a um método de triarum modulador da proteína de Mst ou a seqüência de nucleotídeo que codifi-ca para a proteína de Mst, em que o método compreende as etapas de:

(a) contatar uma proteína de Mst ou a seqüência de nucleotídeo que co-difica para a proteína de Mst em um ensaio selecionado de um ensaiorelacionado à trombose, um ensaio de cinase e/ou um ensaio de sis-tema de célula com base em repórter com um composto de teste, e

(b) medir ou detectar a influência do composto de teste na atividade deuma proteína de Mst.

Em uma modalidade preferida o ensaio relacionado à tromboseé um ensaio de agregação de trombócitos em que a agregação de trombóci-tos é induzida por um indutor como ADP, Trombina, TRAP, colágeno, con-vulxina, calciomionofor e/ou ristocetina.Em particular, é preferido usar um ensaio de cinase in vitro, porexemplo, o ensaio de consumo de ATP como descrito acima e nos Exem-plos. Condições de ensaio preferidas são na presença de MnCI2, em particu-lar em uma concentração de 2 mM de MnCI2. Um tampão ótimo é por exem-pio 40 mM Hepes a pH 7,5.

Outro ensaio preferido é o ensaio com base em polarização deFluorescência (FP) homogênea. Ensaios com base em FP são ensaios queusam luz polarizada para excitar os peptídeos de substrato fluorescente nasolução. Estes peptídeos fluorescentes estão livres na solução e reviram,levando a luz emitida a ser despolarizada. Quando o peptídeo de substratoliga a uma molécula maior, porém, como (P)-Tyr, suas taxas de desmoro-namento são grandemente diminuídas, e a luz emitida permanece altamentepolarizada. Para um ensaio de cinase há em geral duas opções:

(a) um traçador de fosfopeptídeo fluorescente é ligado a um anticorpo(P)-específico. Produtos fosforilados competirão com o fosfopeptídeofluorescente do anticorpo que resulta em uma alteração da polariza-ção de alta para baixa;

(b) um peptídeo de substrato fosforilado liga ao anticorpo fosfoespecíficoque resulta em uma alteração de polarização de baixa para alta.

Também preferido é o ensaio de deslocamento da mobilidadede incubação fora da fatia usando uma fatia microfluídica para medir a con-versão de um substrato de peptídeo fluorescente para um produto fosforila-do. Neste ensaio a mistura de reação de uma cavidade da placa de microti-tulação deslizou através de um vaso capilar sobre a fatia onde o substratode peptídeo e o produto fosforilado é separado através de eletroforese e de-tectado por meio de fluorescência induzida a laser. Por este meio a assinatu-ra do sinal fluorescente revela a extensão da reação. Um tal ensaio está porexemplo comercialmente disponível de Caliper LifeSciences, Hopkinton, MA,EUA sob o nome LabChip® Assay for Mst2.

Outro ensaio preferido para triagem secundária é o sistema decélula baseado em repórter onde, seguindo sobreexpressão do gene deMst1 de ocorrência natural ou um mutante, os efeitos das perturbações nasvias endógenas ativadas ou inativas podem ser detectados medindo os efei-tos na expressão de gene dos genes repórteres a jusante. Um tal gene re-pórter poderia ser - por exemplo - luciferase sob o controle de elementospromotores induzidos por fatores de transcrição como NFkB, AP1 ou p53.Os genes repórteres e de Mst1 podem ser co-expressados em linhagenscelulares como células de Hela ou de HEK293. Preferivelmente, as célulassão semeadas sobre uma cavidade de uma placa de teste de multicavida-des. Exemplos de ensaios baseados em célula similares são descritos emHill, S. J. et al. (2001) Curr. Opin. Pharmacol., 1, 526-532 e Hexdall, L. et al.(2001) Biotechniques, 1134-8, 1140. Uma visão geral dos genes repórteresfreqüentemente mais usados e métodos de detecção pode ser encontradaem Bronstein, I. et al. (1994) Anal. Biochem., 219, 169-181.

Além dos ensaios de cinase acima descritos, os seguintes en-saios heterogêneos e homogêneos podem também ser usados para a de-terminação da atividade de cinase da proteína de Mst ou mutantes de Mst.

Os ensaios heterogêneos abrangem por exemplo um ELISA(ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), um DELFIA (imunoensaio deflúor de lantanídeo intensificado de dissociação), um SPA (ensaio de proxi-midade de cintilação) e um ensaio de placa instantânea.

Ensaios com base em ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado àenzima) são oferecidos por várias companhias. Os ensaios empregam pep-tídeos aleatórios que podem ser fosforilados por uma cinase, como Mst.Amostras contendo cinase são usualmente diluídas em um tampão de rea-ção contendo por exemplo ATP e cátions de requisito e depois adicionadasàs cavidades da placa. Reações são paradas simplesmente removendo asmisturas. Depois disso, as placas são lavadas. A reação é iniciada por e-xemplo pela adição de um substrato biotinilado para a cinase. Após a rea-ção, é adicionado um anticorpo específico. As amostras são usualmentetransferidas para placas de proteína G pré-bloqueadas e após lavar, por e-xemplo, estreptavidina-HRP é adicionada. Depois disso, estreptavidina-HRPnão-ligada (peroxidase de raiz-forte) é removida, a reação de cor de peroxi-dase é iniciada mediante adição do substrato de peroxidase e a densidadeóptica é medida em um densitômetro adequado.

Ensaios com base DELFIA (imunoensaio de flúor de lantanídeointensificado de dissociação) são ensaios de fase sólida. O anticorpo usual-mente é marcado com Európio ou outro lantanídeo e a fluorescência de Eu-rópio é detectada após ter lavado os anticorpos rotulados com Európio não-ligados.

SPA (ensaio de proximidade de cintilação) e o ensaio de placainstantânea usualmente exploram interações de biotina/avidina para capturarsubstratos radiorrotulados. Em geral a mistura de reação inclui a cinase, umsubstrato de peptídeo biotinilado e y-[P33]ATP. Após a reação, os peptídeosbiotinilado são capturados através de estreptavidina. Na detecção de SPA,estreptavidina é ligada em contas contendo cintilante enquanto que na de-tecção da placa instantânea, estreptavidina é ligada ao interior da cavidadeda microplaca contendo cintilante. Uma vez imobilizado, o substrato radio-marcado está próximo o bastante do cintilante para estimular a emissão deluz.

Os ensaios homogêneos abrangem por exemplo um ensaio deTR-FRET (transferência de energia de ressonância por fluorescência tempo-resolvida), um ensaio de FP (polarização de fluorescência), como já descritoacima, um ensaio de ALFA (ensaio homogêneo de proximidade luminescen-te amplificada), um ensaio de EFC (complementação de fragmento de enzi-ma).

Ensaios com base em TR-FRET (transferência de energia deressonância por fluorescência tempo-resolvida) são ensaios que usualmenteexploram a transferência de energia ressonância por fluorescência entre Eu-rópio e APC, uma aloficocianina modificada ou outras tinturas com espectrossobrepostos como Cy3/Cy5 ou Cy5/Cy7 (Schobel, U. et al. (1999) Bioconju-gate Chem. 10, 1107-1114). Após excitação por exemplo de Európio com luza 337 nm, a molécula fluoresce a 620 nm. Mas se este fluoróforo estiver pró-ximo o bastante de APC, o Európio transferirá sua energia de excitação paraAPC, que fluoresce a 665 nm. O substrato de cinase usualmente é um subs-trato rotulado com biotina. Após a reação de cinase, os anticorpos rotuladoscom Európio (P)-específicos são adicionados juntos com estreptavidina-APC. Os peptídeos fosforilados colocam o anticorpo marcado com Európio ea estreptavidina-APC em contato íntimo. A proximidade íntima do APC aofluoróforo de Európio causará uma extinção da fluorescência de Európio nobenefício da fluorescência de APC (FRET).

Ensaios com base em ALFA (homogêneo de proximidade lumi-nescente amplificada) são ensaios que contam com a transferência de oxi-gênio singleto entre as contas de doador e aceitante colocadas em proximi-dade por um peptídeo fosforilado. Sob excitação a 680 nm, fotossensibiliza-dores nas contas de doador convertem o oxigênio ambiente em oxigênio deestado singleto que difunde até uma distância de 200 nm. Grupos quimiolu-minescentes nas contas de aceitante transferem energia para aceitantesfluorescentes dentro da conta que depois emitem luz a aproximadamente600 nm.

Ensaios com base em EFC (complementação de fragmento deenzima) ou ensaios equivalentes podem ser usados em particular para tria-gem de processamento alto dos compostos. O ensaio de EFC é com baseem uma enzima de p-galactosidase criada que consiste em dois fragmentos- o aceitante de enzima (EA) e o doador de enzima (ED). Quando os frag-mentos são separados, não há nenhuma atividade de B-galactosidase, masquando os fragmentos estão juntos eles associam-se (complementam-se)para formar a enzima ativa. O ensaio de EFC utiliza um conjugado de Ed-analito em que o analito pode ser reconhecido por uma proteína ligadoraespecífica, como um anticorpo ou receptor. Na ausência da proteína ligadoraespecífica, o conjugado de Ed-analito é capaz de complementar EA paraformar B-galactosidase ativa, produzindo um sinal luminescente positivo. Seo conjugado de Ed-analito estiver ligado por uma proteína ligadora específi-ca, complementação com EA é impedida, e não há nenhum sinal. Se analitolivre for fornecido (em uma amostra), competirá com o conjugado de Ed-analito para ligar à proteína ligadora específica. O analito livre liberará con-jugado de Ed-analito para complementação com EA, produzindo um sinaldependente da quantidade de analito livre presente na amostra.Em uma modalidade preferida os ensaios acima descritos com-preendem uma etapa adicional de selecionar um composto de teste comuma atividade contra um distúrbio tromboembólico comparando as altera-ções no ensaio na presença e na ausência do composto de teste.

Como já descrito acima a proteína de Mst, em particular, a pro-teína de Mst 1 e/ou Mst 2, é uma proteína de Mst humana.

Em geral o composto de teste é fornecido na forma de uma bi-blioteca de compostos químicos. Para a triagem das bibliotecas de compos-tos químicos, é preferido o uso de ensaios de processamento alto que é co-nhecido à pessoa versada ou que está comercialmente disponível. De acor-do com a presente invenção o termo "biblioteca de compostos químicos"significa uma pluralidade de compostos químicos que foram montados dequaisquer de fontes múltiplas, incluindo moléculas quimicamente sintetiza-das e produtos naturais ou bibliotecas químicas combinatórias. Vantajosa-mente o método da presente invenção é realizado em um arranjo e/ou emum sistema de robótica por exemplo incluindo colocação robótica em placase um sistema robótico de transferência líquida, por exemplo usando microflu-ídicos, isto é estruturado com canais.

Preferivelmente, o composto de teste detectado é um inibidor deativação de plaquetas e/ou agregação de plaquetas, em particular o compos-to de teste detectado reduz o risco de formação de trombo e/ou coágulo san-güíneo.

Outra modalidade da presente invenção é direcionada a um mé-todo para produzir um medicamento para o tratamento de um distúrbio trom-boembólico, em que o método compreende as etapas de:

(a) realizar o método descrito acima,

(b) isolar um composto de teste detectado adequado para o tratamentode um distúrbio tromboembólico, e

(c) formular o composto de teste detectado com um ou mais veículosfarmaceuticamente aceitáveis ou substâncias auxiliares.

Preferivelmente o dito distúrbio tromboembólico é causado porativação e/ou agregação de plaquetas e em particular selecionado de umdistúrbio tromboembólico como descrito acima.

Para a produção de um medicamento o composto farmaceuti-camente composto ou seu sal farmaceuticamente aceitável é em uma formade dosagem farmacêutica em geral consistindo em uma mistura de ingredi-entes como veículos farmaceuticamente aceitável ou substâncias auxiliarescombinados para fornecer características desejáveis juntamente com ocomposto farmaceuticamente ativo.

A formulação em geral compreende pelo menos um veículo far-maceuticamente aceitável adequado ou substância auxiliar. Exemplos detais substâncias são água desmineralizada, solução salina isotônica, soluçãode Ringer, tampões, ácidos orgânicos ou inorgânicos e bases como tambémseus sais, cloreto de sódio, hidrogenocarbonato de sódio, citrato de sódio oufosfato de dicálcio, glicóis, um tal propileno glicol, ésteres como oleato deetila e laurato de etila, açúcares como glicose, sucrose e lactose, amidoscomo amido de milho e amido de batata, agentes solubilizantes e emulsifi-cantes como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato deetila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno gli-col, formamida de dimetila, óleos como óleo de amendoim, óleo de sementede algodão, óleo de milho, óleo de feijão-soja, óleo de rícino, ésteres de áci-do graxo sintético como oleato de etila, miristato de isopropila, adjuvantespoliméricos como gelatina, dextrana, celulose e seus derivados, albuminas,solventes orgânicos, agentes complexadores como citratos e uréia, estabili-zantes, como inibidores de protease ou de nuclease, preferivelmente aproti-nina, ácido e-aminocapróico ou pepstatina A, conservantes como álcool ben-zílico, inibidores de oxidação como sulfeto de sódio, ceras e estabilizantescomo EDTA. Agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revesti-mento, adoçantes, agentes de aroma e perfumantes, conservantes e antio-xidantes podem também estar presentes na composição. A solução de tam-pão fisiológico preferivelmente tem um pH de aproximadamente de 6,0-8,0,especialmente um pH de aproximadamente 6,8-7,8, em particular um pH deaproximadamente 7,4, e/ou uma osmolaridade de aproximadamente 200-400 miliosmol/litro, preferivelmente de aproximadamente 290-310 miliosmol/litro. O pH do medicamento é em geral ajustado usando um tampão orgânicoou inorgânico adequado, como, por exemplo, preferivelmente usando umtampão de fosfato, tampão de tris de (tris(hidroximetil)aminometano), tampãode HEPES (ácido [4-(2-hidroxietil)piperazino]etanossulfônico) ou tampão deMOPS (ácido 3-morfolino-1-propanossulfônico). A escolha do respectivotampão em geral depende da molaridade de tampão desejada. Tampão defosfato é adequado, por exemplo, para soluções de injeção e de infusão.Métodos para formular uns medicamentos como também veículo farmaceuti-camente aceitável adequado ou substância auxiliar são bem conhecidos aalguém versado na técnica. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis esubstâncias auxiliares são selecionados de acordo com a forma de dosagemprevalecente e composto identificado.

A composição farmacêutica pode ser fabricada por exemplo pa-ra administração oral, nasal, parenteral ou tópica. Administração parentalinclui administração subcutânea, intracutânea, intramuscular, intravenosa ouintraperitoneal.

O medicamento pode ser formulado como várias formas de do-sagem incluindo formas de dosagem sólidas para administração oral comocápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos, formas de dosagem líquidaspara administração oral como emulsões, microemulsões, soluções, suspen-sões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis, preparações injetá-veis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis, eformas de dosagem para administração tópica ou transdérmica como un-güentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplastos.

O nível de dose terapeuticamente específico eficaz para qual-quer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores incluindo aatividade do composto identificado, a forma de dosagem, a idade, peso docorpo e sexo do paciente, a duração do tratamento e como também fatoresconhecidos nas técnicas médicas.

A dose diária total dos compostos desta invenção administradasa um mamífero humano ou outro em doses simples ou divididas pode ser emquantidades, por exemplo, de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg peso docorpo ou mais preferivelmente de cerca de 50 a cerca de 75 mg/kg peso docorpo. Composições de dose simples podem conter tais quantidades ousubmúltiplos destas para compor a dose diária. Em geral, regimes de trata-mento de acordo com a presente invenção compreendem administração aum paciente em necessidade de tal tratamento de cerca de 10 mg a cercade 1000 mg do(s) composto(s) da presente invenção por dia em doses sim-ples ou múltiplas.

As seguintes Figuras, Seqüências de Tabelas e Exemplos expli-carão a presente invenção sem limitar o escopo da invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 - mostra a análise de gel de frações enriquecidas parafosfoproteínas.

Rota A: Plaquetas em repouso;

Rota B: Plaquetas estimuladas com trombina;

Setas indicam as posições onde os homólogos de Mst foramencontrados por identificação de LC-MS/MS. Nas bandas A e B, Sok1 foidetectado, enquanto os peptídeos para Mst1 e Mst2 foram identificados nabanda superior e inferior C (vide também Tabela 1).

Figura 2 - mostra um Exemplo para um espectro de MS/MS dopeptídeo específico para Mst1/2 AGNILLNTEGHAK listado na Tabela 1;

Figura 3 - mostra a expressão de Mst1 em extratos de testículose plaquetas humanas de doadores individuais.

Rota A: Testículos;

Rota B: Plaquetas em repouso;

Rota C: Plaquetas ativadas por trombina;

Extratos dos testículos e plaquetas humanas correspondendo a30 ug de proteína total foram separados por SDS-PAGE e proteínas foramtransferidas para membranas de nitrocelulose por western blot. Mst1 foi de-tectada usando um anticorpo específico.

Figura 4 - mostra a expressão de Mst2 em extratos de plaquetashumanas e testículos.Rota A: Testículos;

Rota B: Plaquetas em repouso;

Rota C: Plaquetas ativadas por trombina;

Extratos dos testículos e plaquetas humanas correspondendo a30 ug de proteína total foram separados por SDS-PAGE e as proteínas fo-ram transferidas para membranas de nitrocelulose por western blot. Mst2 foidetectada usando um anticorpo específico.

Figura 5 - mostra a expressão de Mst1 em extratos de váriostecidos humanos. 30 pg de proteína total de plaquetas, cérebro, cólon, cora-ção, rim, fígado, pâncreas, músculo do esqueleto, pele, testículos e timo fo-ram separados por SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para mem-branas de nitrocelulose por western blot. Mst1 foi detectada usando um anti-corpo específico.

Figura 6 - mostra a expressão de Mst2 em extratos de váriostecidos humanos. 30 ug de proteína total de plaquetas, cérebro, cólon, cora-ção, rim, fígado, pâncreas, músculo de esqueleto, pele, testículos e timo fo-ram separados por SDS-PAGE e as proteínas foram transferidas para mem-branas de nitrocelulose por western blot. Mst2 foi detectada usando um anti-corpo específico.

Figura 7 - resume os resultados de um ensaio de trombose depeixe-zebra transgênico in vivo e mostra que o choque de BC048033(Mst1/Mst2) afeta a agregação de trombócitos induzida por ADP. BC048033(Mst1/Mst2) é portanto importante para trombose em peixe-zebra.

O ensaio utilizou uma linhagem transgênica de peixe-zebra fluo-rescente trombócito-específica, gerada por Zygogen usando sua tecnologiade Z-Tag® patenteada para especificamente marcar trombócitos com proteí-nas fluorescentes de coral de recife verde. Amostras randomizadas, cegasde morfolinos anti-sentido foram injetadas em embriões de Z3 homozigotosde um estágio celular. Todas as amostras foram injetadas com equi-volume(4 nl_) em ovos de Z3 fertilizados onde o controle foi 0,2% de fenol vermelho,GPIIb foi 1,7 ng, P2Y12, um receptor de ADP, foi 1,7 ng, DAT (transportadorde dopamina) foi 1,7 ng e Mst1/2 foi 16,6 ng. Os embriões foram colocadosem incubadora a 28°C. Em 6dpf (dias pós-fertilização), as larvas desenvolvi-das foram injetadas com ADP (aproximadamente 90 pmols) na cavidade docoração. As larvas foram registradas ou como tendo qualquer ou nenhummovimento trombolítico. Os dados foram agrupados e ponderados. Pelo me-nos 60 larvas em pelo menos 6 experimentos independentes foram analisa-das para cada condição. Cada condição foi comparada às larvas falso-injetadas que foram tratadas com ADP. Significação estatística (* = p < 0,01,** = p < 0,001) foi observada para todas as amostras com respeito ao contro-le com exceção de DAT.

Figura 8 - mostra exemplos para análises de FACS de plaquetasCD estimuladas com ristocetina: medição de FACS de plaquetas CD recom-binantes, retroviralmente infetadas expressando ou Mst1K59R mutante deMst1 negativo dominante fundido com GFP ("Mst1") ou GFP apenas ("GFP(controle)"). Mostrados são aumentos relativos ( %) dos valores de fluores-cência médios sobre os valores basais. A figura mostra a expressão de su-perfície dependente de agonista de CD41, CD62P (P-selectina) e CD40Lrespectivamente. A figura indica os resultados de 12 experimentos indepen-dentes feitos com plaquetas CD de 4 isolamentos independentes de mega-cariócitos com desvio-padrão. * p < 0,05.

Figura 9 - mostra o registro original das agregações quando in-duzidas por trombina. Traços de agregação representativos de plaquetas CDrecombinantes, retroviralmente infetadas ou expressando Mst1K59R para omutante de Mst1 negativo dominante fundidas com GFP ("mutante de DN")ou o controle de GFP apenas ("GFP") em resposta a 0,5 U/ml de trombina.

Figura 10 - mostra um ensaio de cinase de GST-Mst1 em condi-ções de tampão diferentes. Comparado com um controle de GST, a ativida-de de cinase mais alta de GST-Mst1, medida como consumo de ATP, foiobtida na presença de 2 mM de MnCb.

Figura 11 - mostra a curva de dose-resposta sigmoidal de estau-rosporina em atividade de Mst1 cinase. O efeito de cada dose foi testado emamostras triplicata. Estaurosporina poderia inibir completamente em um en-saio in vitro o consumo de ATP devido à atividade de MST1 cinase. O EC50derivado dos valores de melhor-ajuste foi 608,1 pM.

Figura 12 - mostra SEQ ID NO: 1, as seqüências de aminoácidode Mst 1 humana, em que em negrito o domínio de Mst 1 cinase é mostrado.Os aminoácidos sublinhados mostram os sítios de clivagem de caspase e osnúmeros indicam exemplos de mutações de ponto que não abolem a ativi-dade de Mst1 cinase.

DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

SEQ ID NO: 1 mostra a seqüência de aminoácido de Mst 1 humana(entrada de Swissprot Q13043);

SEQ ID NO: 2 mostra uma seqüência de nucleotídeo que codifica paraMst 1 humana (entrada de Genbank NM_006282);SEQ ID NO: 3 mostra a seqüência de aminoácido de Mst 2 humana(entrada de Swissprot Q13188);

SEQ ID NO: 4 mostra uma seqüência de nucleotídeo que codifica paraMst 2 humana (entrada de Genbank NM_006281);

SEQ ID NO: 5 mostra a Mst1 dominante-negativa humana: Mst1K59R

SEQ ID NO: 6 mostra o homólogo de Mst1 & Mst2 em peixe-zebra(entrada de NCBI AAH48033; seqüência de nucleotídeocorrespondendo a BC048033)

SEQ ID NOS: 7-10 mostra para SOK-1 e peptídeos Mst-específicos comolistados na Tab. 1

Tabela 1:

Peptídeos Mst-específicos que foram identificados em um método deFosfoproteômicos

<table>table see original document page 21</column></row><table>Tabela 2:

Padrão de expressão de mRNA de Mst1 humana e mRNA de Mst2 emvários tecidos humanos. mRNAs de Mst1 e Mst2 foram detectados porTA-PCR quantitativa (Taqman) usando preparadores específicos.

<table>table see original document page 22</column></row><table>EXEMPLOS

MATERIAL & MÉTODOS

Reaaentes:

Homogeneizados de tecido, fornecido em um tampão incluindoHEPES (pH 7,9), MgCI2, KCI, EDTA, Sucrose, Glicerol, deoxicolato de sódio,NP-40 e um coquetel de inibidores de protease foram comprados de "BioCatGmbH, Heidelberg". Anticorpos contra Mst1 e Mst2 foram obtidos de "CellSignaling Technology, Inc., Beverly, USA", "Santa Cruz Biotechnology, Inc.,Santa Cruz, USA" e "Upstate (distribuído por Biomol GmbH, Hamburgo)".

Isolamento e ativação de plaguetas para a análise de western blot:

Sangue recentemente tirado de doadores saudáveis foi colhidona fórmula de solução de ácido-citrato-dextrose A (ACD-A) (Fresenius He-mocare, Redmond, USA). O sangue foi centrifugado em temperatura ambi-ente durante 20 minutos a 150 g e plasma rico em plaquetas (PRP) restabe-lecido. 1 volume de solução de ACD-A foi adicionado a 9 volumes de PRP.Seguindo uma centrifugação adicional a 120 g durante 15 minutos, o PRP foitratado com 0,5 ug/ml de PgE1 (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) e as plaque-tas foram empelotados centrifugando 15 minutos a 360 g. Após ressuspen-são na solução de Tyrode (137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, 12 mM deNaHC03, 0,36 mM de NaH2P04, 1 mM de MgCI2) 10 mM de Hepes, 5,5 mMde Glicose, 0,1% de BSA, pH 7,4), plaquetas foram deixadas sem tratar outratadas com 1 U/ml de Trombina humana (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen)por 1 a 5 min em temperatura ambiente, e empelotadas a 360 g durante 15 minutos.

Análise de western blot:

Lisadas de SDS de plaquetas totais para análise de expressãode proteína por western blot foram preparados como seguindo: péletestrombolíticos, obtidos como descritos acima, foram ressuspensos em tampãode lise esfriada em gelo contendo 20 mM de Hepes, 100 mM de NaCI, 1%de SDS, 1 mM de Na3V04, 10 mM de NaF pH 7,4, 5 mM de EDTA e suple-mentado com coquetel de inibidor de protease Complete (Roche DiagnosticsGmbH, Mannheim). Os lisados foram enrolados no topo 20 min a 4°C antesde serem centrifugados 20 minutos a 4°C a 13000 RPM em uma microcentrí-fuga de bancada. Concentração de proteína do sobrenadante foi determina-da e 30 ug de proteínas foram resolvidas ou em um NuPAGE® a 4-12% (nocaso de análise de distribuição de tecido) ou um gel de NuPÁGE® a 10%(Invitrogen GmbH, Karlsruhe) e transferidas sobre uma membrana de nitro-celulose (Amersham Biosciences Europa GmbH, Friburgo). Para detecçãode Mst1 um anticorpo policlonal de coelho anti-Mst1 (Cell Signaling Techno-logy, Inc., Beverly, USA) ou um anticorpo policlonal de coelho anti-Mst1/Krs-2 (Upstate (distribuído por Biomol GmbH, Hamburgo) foram usados. Paradetecção de Mst2 o anticorpo policlonal de cabra Krs-1 (N-19) (Santa CruzBiotechnology, Inc., Santa Cruz, USA) foi usado. Brevemente, borrões forambloqueados em TBS-T (20 mM de Tris-CI pH 7,6, 137 mM de NaCI, 0,1% deTween 20 (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) contendo 5% de leite seco semgordura oscilando o/n a 4°C, e sondados com um dos anticorpos policlonaisde coelho anti-Mst1 ou com o anticorpo policlonal de cabra Krs-1 (N-19) emTBS-T contendo 5% de leite seco sem gordura. Após incubação com anti-corpos secundários conjugados com peroxidase (Jackson ImmunoResearchEurope Ltd., Cambridgeshire, UK e SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen), detec-ção foi executada incubando as membranas com o Substrato do Lumi-LightWestern Blotting de acordo com as instruções do fabricante (DiagnosticsRoche GmbH, Mannheim).

Enriquecimento de fosfoproteína:

Para enriquecimento seletivo kit de Purificação de Fosfoproteínade Qiagen foi usado como segue: sedimentos de plaquetas (em repou-so/ativadas por trombina) foram ressuspensos em 3 ml Tampão de Lise deQiagen (QLB) e centrifugados (30 min, 13000 x g). Concentração de proteí-na do sobrenadante foi determinada usando um kit de BCA (Perbio ScienceDeutschland GmbH, Bonn) e a concentração de proteína foi ajustada em 2,5mg/25 ml em QLB.

Após equilibrar a Coluna de Purificação de Fosfoproteína com 4ml de QLB, a solução de plaquetas foi aplicada ao topo da coluna em 2 por-ções. A fração através do fluxo foi colhida, e também 6 ml de QLB foram a-plicados para lavar a coluna. Após isso, 500 ul de Tampão de Elução de Qi-agen foram aplicados, e as frações de eluato foram colhidas. A elução foirepetida 4 vezes, resultando em 5 frações de eluato. Determinação da prote-ína foi feita para todas as frações colhidas, indicando a quantidade de prote-ína mais alta na fração 3.

Após precipitação de TCA, 30 ug de cada com respeito à fração3 (em repouso/ativada por trombina) foram carregados sobre um 1D-gel (In-vitrogen GmbH, Karlsruhe, Nupage (10%). Coloração coloidal de Coomassieblue foi executada de acordo com Roth (Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe).

Identificação da proteína

Digestão de proteína em gel: Bandas de proteína tingidas comCoomassie blue foram excisadas e cortadas em pedaços pequenos de cercade 1-2 mm3 em diâmetro. Remoção do fingimento foi feita lavando três vezespor 15-30 min em 100 ul de solução de lavagem (50% de acetonitrila/25 mMde NH4 HC03, pH 8,0). Os pedaços de gel foram secados adicionando 50 ulde acetonitrila; solução em excesso foi removida após cerca de 10 min. Pe-daços de gel são depois reidratados em 15 ul de solução de tripsina (5ug/ml) (rest., tipo proteômicos, Diagnostics Roche GmbH, Mannheim) e in-cubados a 37°C durante a noite em um forno de transmissão. Peptídeos fo-ram depois extraídos através de incubação com 30 ul de 50% de acetonitri-la/5% de TFA (três vezes). Os extratos de peptídeo foram agrupados, liofili-zados em uma centrífuga a vácuo e reconstituídos em 13 ul de TFA a 0,1%.

Análise de Nano-LC-MS/MS: Análises das amostras de peptídeoforam executadas em um sistema de nano-ESI-LC-MS/MS consistindo emum sistema de HPLC Último (LC Packings, Amsterdã) acoplado a um espec-trômetro de massa de LCQ Deka XP (Thermo Finnigan, San Jose). Um au-tocarregador de Famos (LC Packings, Amsterdã) foi usado para injetar umvolume de amostra de 13 ul. A amostra foi dessalgada em uma pré-colunade C18 (PepMap, i.d. 300 um, 5 mm de comprimento) usando um módulo deSwitchos (LC Packings, Amsterdã); carregamento e lavagem da amostracom 2% de acetonitrila/0,1% de ácido trifluoracético foram executados a umataxa de fluxo de 30 uL/min por 10 min. Uma nanocoluna de C18 (PepMap,i.d 75 um, 150 mm de comprimento, LC Packings, Amsterdã) foi usada paraseparar os peptídeos a uma taxa de fluxo de 200 nLVmin. A fase móvel con-sistiu em 2% de acetonitrila/0,1 % de ácido fórmico (solvente A) e 98% deacetonitrila/0,1% de ácido fórmico (solvente B). Um gradiente linear de 5%de B a 35% de B em 45 min, seguido por um aumento linear para 100% de Bem 10 min, alcançou elução do peptídeo.

A tubulação capilar da nano-LC foi conectada à agulha de ele-tropulverização com um MicroTee (Upchurch Scientific, Inc., Oak Harbor,USA) onde uma voltagem de 1,2 kV foi aplicada. As agulhas de nanoeletro-pulverização foram tiradas de laboratório (Sutter Instruments Co., Novato,EUA, Modelo P-2000) dos vasos capilares de sílica fundidos (i.d. 25 um, o.d.280 um, Grom Chromatography GmbH, Rottenburg-Hailfingen) resultandoem um orifício de agulha de aproximadamente 3 um em diâmetro.

Análises espectrométricas de massa foram controladas pelosoftware de XCalibur (Thermo Finnigan, San Jose) usando aquisição depen-dente de dados no modo de íon positivo. A temperatura capilar de transfe-rência foi constantemente mantida a 180°C, a voltagem capilar e a lente dotubo compensados em 46 V e 55 V, respectivamente. Os peptídeos eluídosforam detectados da coluna em um primeiro evento de varredura em modode MS (m/z 500-2000, 3 microvarreduras, tempo de injeção máximo 50 ms),seguido por três eventos de varredura dependente de MS/MS de dados su-cessivos (largura de isolamento 3 Da, 4 microvarreduras, tempo de injeçãomáximo 400 ms, tempo de ativação 30 ms) para os três íons mais abundan-tes (acima de 5x105 contagens) usando uma energia de colisão relativa de35% (correspondendo aos ajustes de software XCalibur). Os parâmetros deexclusão dinâmica foram determinados como segue: "contagem da repeti-ção" 2, "duração da repetição" 0,5 min, "tamanho da lista de exclusão" 25,"largura da massa de exclusão" +/- 1,5 Da, "duração da exclusão" 1,50 min,nenhuma rejeição.

Espectrometria de massa: Dados de massa foram processadoscom SpectrumMill. Os parâmetros a seguir foram usados para converter osdados brutos em arquivos .pkl: nenhuma "modificação de cisteína", "marca-dor de seqüência mínima" > 1, "faixa de varredura" 1-9999 (tudo), "[M+H]+"500-4000 Da, "designação de carga de origem" força de encontro 1 a4/encontro max (z) 7/min MS S/N 25, "varreduras de fusão com a mesmaorigem" m/z +/-1 varredura (nenhuma fusão de espectros). Identificações deproteína foram obtidas pesquisando a base de dados de SwissProt enquantoa taxonomia foi restringida aos mamíferos. Pesquisas foram feitas com tole-râncias de igualamento +/- 1,5 Da e +/- 0,7 Da para a origem e as massasde fragmento, respectivamente. Um número máximo de 2 clivagens trípticasperdidas foi permitido. Um marcador de seqüência de peptídeo foi conside-rado seguro quando a identificação satisfez o conjunto de parâmetros a se-guir no filtro de validação: "contagem de proteína" > 8, "contagem de peptí-deo" > 8, "% SPI" > 70; além disso todos os espectros foram examinadosmanualmente.

Análises de peixe-zebra:

Para validação alvo no ensaio de trombose de marcador Z, mor-folinos anti-sentido projetados para reconhecer os primeiros 25 nucleotídeoscomeçando no sítio de começo translacional foram usados. Morfolinos foramencomendados de Gene Tools, Inc. Philomath, EUA e testados no ensaio detrombose de marcador Z. A concentração eficaz do morfolino foi avaliadainjetando várias concentrações, variando de 0,83 ng - 33,2 ng, de cadaconstrução de morfolino no estágio celular um de embriões de Z3. As 6 lar-vas de dpf que não exibiram nenhuma alteração adversa em desenvolvimen-to com respeito à concentração usada foram testadas para sua resposta aADP. Os embriões injetados foram colocados a 28°C até testados no ensaiode trombose. Aproximadamente 90 pmols de ADP foram injetados na cavi-dade do coração das larvas injetadas com morfolino. As larvas injetadas comADP foram observadas 5 min depois disso sob estereomicroscopia fluores-cente, e a presença ou ausência de movimento trombocítico foram avaliadase registradas.

Geração de plaquetas CD:

Plaquetas de camundongo transgênico expressando o mutantedominante-negativo de Mst1 foram geradas de acordo com Ungerer, M. et al.(2004) Circ. Res. 95, e36-e44.

Em resumo, as células de medula óssea murina foram colhidasfluxando os fêmures e tíbias dos camundongos. Células precursoras de me-gacariócitos de medula óssea recentemente isolada foram cultivadas sobcondições que permitem uma parte grande das células diferenciarem nosmegacariócitos. O cDNA para o mutante negativo dominante de Mst1,Mst1K59R, foi clonado no plasmídeo pLEGFP-C1 obtido de Clontech, Heidel-berg, Alemanha. GP2-293 humano, uma linhagem celular pantrópica de em-balagem retroviral, foi crescido em meio de Eagle modificado de Dulbecco(DMEM) com Glutamax (Invitrogen GmbH, Karlsruhe) suplementado com10% de soro de bezerro fetal (PAA, Coíbe, Alemanha), 1% de piruvato desódio, 100 mmol/L (Biochrom AG, Berlim), 1% de pen/strep (Biochrom AG,Berlim). Células de 3T3 de NIH foram mantidas em DMEM/Glutamax suple-mentado com 5% de soro de bezerro fetal. 24 horas antes da transfecção, ascélulas foram tendidas 1:2 em pratos de 150 mm. Transfecção foi executadaatravés de co-precipitação de fosfato de cálcio como disponível por Clontechcom cloroquina (50 mmol/L, SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen). 30 horas apóstransfecção, o vírus foi colhido a cada 24 horas por pelo menos 3 dias.

Após colheita o vírus e determinação da titulação viral, precurso-res de megacariócitos foram cultivados em placas de 48 cavidades emIMDM apenas com fator de células-tronco. Dois dias após isolamento, ascélulas foram infetadas com um MOI de 2 - 5 cfu/célula na presença de poli-breno (8 ug/mL) e dextrano de DEAE (1 mg/mL). Para experimentos de co-cultura, 6x106 células produtoras de GP2-293 transfeccionadas foram incu-badas com 1,5x106 megacariócitos isolados (2 dias após seu isolamento) napresença de 10 mL de IMDM, 10 mL de DMEM, Polibreno e dextrano deDEAE. Esta co-cultura foi incubada por 24 h a 37°C e o meio com os mega-cariócitos foi transferido para uma placa de 6 cavidades para cultivar por 4-6semanas. 36 horas após infecção ou após a iniciação da co-cultura, as célu-Ias receberam seu meio completo (Ungerer, M. et al. (2004) supra) e geneti-cina (380 ug/mL) para selecionar as células infectadas das não-infetadas.

Plaquetas derivadas da cultura foram colhidas através de centri-fugação e lavadas. Dependendo do respectivo protocolo, eles foram ativadospor 10 min com colágeno, trombina ou ristocetina. Os anticorpos para ca-mundongo CD41, CD-40L, CD61 e CD62P foram de Pharmingen, Leiden,Países Baixos. Expressão destes antígenos foi avaliada por análise deFACS, como descrito. Para experimentos de agregação, um agregômetroChrono-log 500 VS foi enchido com 300 ul de plasma rico em plaquetas ouuma mistura de 107 plaquetas CD/mL em tampão de Tyrode modificado con-tendo fibrinogênio (480 ug/mL) e CaCfe (2,5 mmol/L). Após adicionar o res-pectivo agonista, transmissão de luz foi registrada continuamente pelos 20minutos seguintes. As curvas induzidas foram detectadas por trombina napresença de 2 mmol/L de peptídeo inibidor de plasmina (GPRP).

Expressão das proteínas de GST-Mst em ensaio de bactérias e Mst cinase:

As seqüências de comprimento total do Mst1 e Mst2 humanasforam amplificadas por TA-PCR a partir de RNA de células de HeLa. De a-cordo com o manual de Invitrogen Gateway® Tecnhnology, os produtos dePCR gerados foram empregados em uma reação de recombinação de BPpara obter os clones de entrada. As seqüências foram subseqüentementetransferidas para pDEST15 para expressão bacteriana. Os vetores depDEST15-MST foram transformados na cepa de E. colide BL21-AI e cresci-dos em Ampicilina para seleção de transformante carregando o DNA de inte-resse. As colônias simples foram inoculadas em meio de LB contendo 100ug/ml de Ampicilina até que eles alcançassem a densidade de célula apro-priada. Elas foram depois induzidas por 2,5 h a 37°C com 0,2% de Arabino-se (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen). Ao término da indução, as bactériasforam lavadas em PBS esfriado em gelo e ressuspensas em tampão de lise(137 mM de NaCI, 2,7 mM de KCI, 10 mM de Na2HP04, 1,4 mM de KH2P04,5 mM de NaF, 3 mM de EDTA, pH 7,5 suplementado com 0,25% de TritonX-100, 0,25% de CHAPS, 1 mM de Na3V04 e inibidores de protease). Apósas bactérias terem sido de forma bem-sucedida lisadas através de umaprensa francesa, os lisados foram clareados centrifugando 30 minutos a20000 g a 4°C.

Proteínas recombinantes de GST foram purificadas dos lisadosclareados usando o Sistema de Purificação de Proteína MagneGST (Prome-ga GmbH, Mannheim) de acordo com o protocolo dos fabricantes.

Para determinar as condições ótimas para ensaio de cinase invitro (ensaio de consumo de ATP), 1 ug de proteínas de GST (proteínas deGlutationa-S-Transferase)-Mst foram incubadas com 2 ug de MBP (ProteínaBásica de Mielina) e 2 uM de ATP em tampão de cinase contendo 40 mM deHepes pH 7,5 suplementado com 10 mM de MgCI2 ou 2 mM de MnCI2. Alémdisso, avaliamos o efeito na atividade de cinase de 1 mM de DTT e/ou0,02% de BSA. As reações foram executadas durante 30 minutos a 32°C efeitas pela adição de 1 uM de Estaurosporina em Reagente de Monitoramen-to de ATP (Cambrex Bio Science Nottingham Ltd, Nottingham, UK) para me-dição bioluminescente do consumo de ATP comparado a um controle deGST.

Para avaliar o efeito da estaurosporina do inibidor de cinase nãoespecífico (SIGMA-ALDRICH, Taufkirchen) na atividade de Mst1 cinase, 1ug de proteína de GST-Mst1 foi pré-incubada durante 30 minutos a 32°Ccom diluições seriais de estaurosporina. Depois o ensaio de cinase foi exe-cutado como descrito acima. Cada determinação foi realizada em triplicata.O sucesso do tratamento foi determinado com base na diminuição em con-sumo de ATP comparado às amostras sem tratar.

RESULTADOS

Identificação inicial de Mst2 em plaquetas

Mst2 foi identificada aplicando a assim-chamada tecnologia dePST para membranas de plaqueta enriquecidas combinadas com um proce-dimento de designação de bioinformática experimental (Kuhn, K., (2003) J.Proteome Res 2, 598-609), Mst2 foi identificada usando este o LC-MS combase análise. Mst2 foi identificado por 6 PST's com confiança alta.Identificação de Mst cinases por um método de fosfoproteômicos

Para identificar proteínas sinalizadoras relacionadas, proteínasfosforiladas foram enriquecidas ou de plaquetas em repouso ou estimuladascom trombina usando meios de afinidade de IMAC de Qiagen. Frações con-tendo a maior parte da proteína eluída foram também separadas em 1Dgéis. Rotas inteiras foram depois cortadas em faixas e as proteínas contidasforam identificadas por digestão de tripsina em gel seguido por análise deLC-MS/MS. Mst cinases foram encontradas em várias localizações no gelcomo ilustradas na Figura 1 e Tabela 1. Além de Mst1 e Mst2 também SOK1como outro homólogo de Mst1 e 2 foi detectado (Fig 1 e Tabela 1). Esta é aprimeira vez que SOK1 foi identificado em plaquetas. SOK1 foi identificadoem duas bandas que migram em MW diferente, provavelmente devido à de-gradação proteolítica de SOK1.

Os dados de MS dão umas primeiras sugestões acerca das in-formações funcionais, visto que os peptídeos para Mst1 e Mst2 foram encon-trados apenas em extratos de plaquetas ativadas com trombina, que poderiaindicar uma fosforilação específica induzida por estímulo de Mst1 e/ou Mst2.Nestes experimentos, principalmente uma forma clivada por protease deMst1 e Mst2 com um peso molecular evidente de -35 kDa poderia ser identi-ficada.

Padrão de expressão para Mst1 e Mst2 em tecidos humanos

A distribuição de tecido de Mst1 e Mst2 em tecidos humanosdiferentes foi investigada primeiro por análises de Taqman.

De acordo com as análises de Taqman, mRNA de Mst1 é ex-pressado em níveis altos no cérebro humano, cérebro fetal e testículos (Ta-bela 2). Níveis de expressão médios foram encontrados na medula óssea,fígado fetal e timo. Em todos os outros tecidos mRNA de Mst1 estava abaixodo limite de detecção e portanto não expressou ou expressou apenas embaixo nível. Desse modo, Mst1 é expressa apenas em poucos tecidos. Emcontraste com Mst1, mRNA de Mst2 poderia ser detectado em níveis de ex-pressão altos apenas nos testículos. Como observado para Mst1, em todosos outros tecidos mRNA de Mst2 estava abaixo do limite de detecção e des-se modo não expressou ou expressou apenas em nível baixo (Tabela 2).

Plaquetas anucleadas contêm apenas pequenas quantidades demRNA em comparação com as células nucleadas. Além disso, mRNA isola-do das plaquetas é freqüentemente encontrado ser degradado mais emcomparação ao mRNA obtido das células nucleadas. Portanto, mRNA deplaqueta não foi incluído em nosso painel de Taqman, mas de preferênciaextratos de proteína e análise de western blot foram usados para avaliar osníveis de expressão de proteína de Mst1 e Mst2 em plaquetas e similarestecidos.

Mst1 e Mst2 são expressas em plaquetas humanas

Para verificar a expressão de Mst1 e Mst2 em plaquetas huma-nas, trombócitos de sangue total foram purificados de doadores individuaisem várias etapas (vide Material & Métodos). Por conseguinte, contaminaçãoatravés de outros tipos de célula como também através de componentes desoro poderiam ser evitadas. Extratos de célula total de péletes de plaquetaforam depois obtidos através de tampão de lise contendo SDS.

No nível de aminoácido Mst1 e Mst2 têm uma identidade de77,6%. Para discriminar entre eles por western blot, anticorpos cuja especifi-cidade tinha sido testada em proteínas recombinantes foram usados.

Considerando que a análise de Taqman tinha indicado níveis deexpressão muito altos de mRNA de Mst1 em testículos, extratos dos testícu-los humanos foram usados como controle positivo para a análise de expres-são de proteína de Mst1 por western blot.

Como mostrado na Figura 3, no nível de proteína Mst1 é ex-pressada de forma fraca também nos testículos, desse modo confirmandoem parte os resultados da análise de Taqman. Mst1 poderia ser detectadoclaramente muito em plaquetas humanas em níveis de expressão mais altosque nos testículos. Este resultado foi confirmado em vários doadores.

Em vista do fato que também mRNA de Mst2 é altamente ex-presso nos testículos como mostrado pelos resultados de Taqman (Tabela2), extratos de testículos humanos foram usados como controle positivo paraa análise de expressão de proteína Mst2 por western blot. Como mostradona Figura 4, Mst2 é expressado em testículos no nível de proteína, assimconfirmando os resultados da análise de Taqman. Além disso, Mst2 é ex-pressa também em plaquetas humanas em níveis comparáveis àqueles ob-servados nos testículos, mas mostrando um pouco da variabilidade depen-dente de doador em sua quantidade.Distribuição de tecido de Mst1 e Mst2

A distribuição de tecido de Mst1 e Mst2 em vários extratos detecidos humanos incluindo plaquetas foi investigada.

No nível de proteína, Mst1 é não-ambiguamente expressa emplaquetas, testículos e timo, com níveis de expressão mais altos constante-mente encontrados em plaquetas. Nos outros tecidos examinados, Mst1 nãoé expressa (Figura 5). Em algumas das amostras, e especialmente em có-lon, coração, rim e pele, uma banda adicional por volta de 50 kDa poderiaser detectada. A natureza não específica deste sinal foi verificada sondandoas mesmas amostras com um anticorpo Mst1-específico diferente (Upstate(distribuído por Biomol GmbH, Hamburgo): de acordo com o resultado mos-trado na figura 5, expressão de Mst1 poderia ser confirmada em plaquetas,testículos e timo, enquanto que nenhum sinal foi detectado em outros teci-dos (dados não mostrados). Em contraste com os resultados de Taqman(Tabela 2), Mst1 não é detectado no cérebro no nível de proteína.

No nível de proteína, Mst2 é expressada fortemente em váriostecidos incluindo testículos, timo, e pele (Figura 6). Meio para expressão for-te poderia ser detectado em plaquetas, rim e coração. Baixos níveis de ex-pressão foram observados no cólon, pâncreas e fígado (Figura 6).

Outra descoberta importante destas análises de distribuição detecido para Mst2 é que os resultados encontrados claramente no nível deproteína diferem daqueles encontrados no nível de mRNA onde a expressãode mRNA de Mst2 poderia ser apenas detectada em testículos (Tabela 2).

Validação funcional para Mst1 e Mst2 no Peixe-zebra

Um ensaio de trombose de peixe-zebra transgênico in vivo paratriagem do composto e para identificação e validação do alvo foi desenvolvi-do. No ensaio, trombócitos (equivalentes de peixe-zebra das plaquetas) comproteínas fluorescentes foram especificamente marcados. Um ensaio rela-cionado à trombose usando ADP como agonista de plaqueta foi desenvolvi-do usando marcador Z (Zygogen, LLC) injetando o agonista relevante nacavidade do coração dos embriões com marcador Z na linhagem de peixe-zebra de TG(GPIIb:G-RCFP)Z3 com plaquetas fluorescentes. Dois alvos deplaquetas conhecidos e validados, o receptor de GPIIb e o receptor deP2Y12, são conservados em peixe-zebra e seu papel na agregação de trom-bócitos induzida por ADP foi demonstrado usando a tecnologia de morfolinoanti-sentido rápida, assim validando o modelo de sistema de peixe-zebra.

A tecnologia anti-sentido baseada em morfolino foi empregada(Zygogen, LLC) para caracterizar Mst1 e Mst2 como genes alvos de trombo-se potenciais. Em contraste com a situação em ser humano, o genoma depeixe-zebra contém apenas um homólogo que representa ambas Mst1 eMst2. O produto de gene BC048033 (76,8% e 88,8% de identidade para

Mst1 e Mst2 humanas, respectivamente) representou o ortólogo de peixe-zebra completo. Outro gene homólogo potencial em peixe-zebra, BC045867,mostra um grau sem dúvida mais alto de similaridade para ainda outro ho-mólogo humano de Mst1 e Mst2, chamado Mst3 (Schinkmann, K. et al.(1997) J. Biol. Chem. 272, 28695-28703). BC045867 é conservado em -76%para Mst3 humana, mas apenas em ~ 45% e -47% para Mst1 e Mst2 huma-nas, respectivamente. Em contraste, BC048033 é conservado em Mst3 hu-mana apenas em -45%. Uma pesquisa na base de dados genômica de pei-xe-zebra do Sanger Center não identificou nenhum outro gene de peixe-zebra potencial para Mst1 ou Mst2, sugerindo que a presença de dois homó-logos (Mst1 e Mst2) no ser humano poderia representar um evento de dupli-cação de gene. Desse modo, usando tecnologia anti-sentido para eliminar aexpressão de peixe-zebra BC048033 a expressão de Mst1 e Mst2 foi abatidoem paralelo ao comparar à situação em ser humano.

Para validação do alvo no ensaio de trombose de marcador Z,morfolinos anti-sentido projetados para reconhecer os primeiros 25 nucleotí-deos começando no sítio de começo translacional foram mostrados ser efi-cazes. Portanto a terminação 5' para BC048033 foi determinada. Morfolinosforam encomendados de Gene Tools, Inc. Philomath, EUA e testados noensaio de trombose de marcador Z. O estudo de morfolino foi conduzido em2 fases. A primeira parte foi uma fase preliminar onde a concentração eficazde cada morfolino foi avaliada. Esta foi determinada injetando várias concen-trações, variando de 0,83 ng - 33,2 ng, de cada construção de morfolino noum estágio celular um de embriões de Z3. Para o morfolino de Mst1/Mst2,não foi observado nenhum efeito colateral adverso no desenvolvimento doembrião para as concentrações testadas. Abatimento do receptor de GPIIb edo receptor de P2Y12 foi usado como controles positivos para estes experi-mentos.

Os resultados destes experimentos que foram conduzidos cla-ramente como um estudo cego sugerem que Mst1/Mst2 sejam importantespara agregação de trombócitos ADP-induzida (Figura 7). Além disso, os mor-folinos GPIIb e P2Y12 como controles positivos foram eficazes neste estudocego (Figura 7). Como um controle negativo, um morfolino direcionado paratransportador de dopamina (DAT) foi usado. Este morfolino foi descobertoser eficaz em um modelo de doença neurodegenerativa (dados inéditos deZygogen). Como prognosticado, o morfolino de DAT não tiveram efeito naagregação de trombócitos ADP-induzida.

BC048033, o homólogo de Mst1/Mst2 em peixe-zebra foi o me-lhor gene candidato dentro deste estudo. A freqüência de seu efeito na a-gregação ADP-induzida foi maior que à observada para qualquer outro gene,incluindo os receptores de GPIIb e P2Yi2. Além disso, abatimento do genenão foi letal e não causou retardo no desenvolvimento das larvas de peixe-zebra. Isto pode ser uma indicação que haviam poucos, se algum, efeitoscolaterais aos fármacos que alvejam esta proteína, assim suportando seupotencial fortemente como gene alvo para o desenvolvimento de fármacosanti-trombóticos.

Validação funcional para Mst1 em plaquetas derivadas de cultura

Um sistema para a geração de plaquetas derivadas de cultura(CD) foi empregado de células precursoras de megacariócito que podem serusadas para a sobreexpressão de genes alvos e mutantes em plaquetas CDtransgênicas (Ungerer, M. et al. (2004) supra). Este sistema foi usado para avalidação de Mst1 em células precursoras de megacariócito de camundongoderivadas plaquetas CD. Um mutante dominante-negativo de Mst1, Mst1K59R,foi sobreexpressado em plaquetas derivadas de cultura (plaquetas CD) coma meta de investigar qualquer alteração na função destas plaquetas causadapela interferência resultante com a atividade de Mst1 nativo.

Sobreexpressão de Mst1K59R retroviralmente induzida não alte-rou a morfologia dos megacariócitos, nem das plaquetas CD protegidas,nem a expressão dos marcadores megacariócito-específicos comparados aGFP que apenas expressa células ou células de controle não-infectadas.Também os números das plaquetas CD resultantes foram similares àquelesnos outros grupos de plaquetas. As plaquetas CD expressando transgenegerado foram usadas para investigar a expressão dependente da ativaçãode receptores de superfície, o perfil de agregação e liberação de grânulodensa e alfa.

O recrutamento de superfície dos receptores de fibrinogênio a-pós estimulação do agonista foi testado por expressão investigatória deCD41 e CD61 em plaquetas CD. Como mostrado na Figura 8, inibição deMst1 pelo mutante dominante-negativo resultou em uma supressão marcadado recrutamento de superfície induzido por ristocetina de marcadores de ati-vação de receptor de fibrinogênio CD41. Resultados similares foram obser-vados para o recrutamento de superfície de CD61. CD40L foi usado comoum marcador para secreção de armazenamentos e grânulos de plaquetas, edesgranulação alfa foi testada estudando a translocação de superfície de P-selectina (CD62P). Recrutamento de superfície de CD40L como também deP-selectina foi significativamente reduzido nas plaquetas CD expressandoMst1K59R mutante de Mst1 dominante-negativo em resposta à ristocetina (Fi-gura 8).

Além disso, a agregação induzida por trombina foi inibida emplaquetas CD que expressam Mst1K59R (Figura 9). Similarmente, a agrega-ção induzida por ristocetina (0,8 mg/ml ristocetina) foi inibida em plaquetasCD expressando Mst1K59R.

Completamente, os resultados nas plaquetas mamíferas deriva-das de cultura já confirmam a relevância funcional demonstrada nos experi-mentos executados em peixe-zebra. Além disso, eles ressaltam o papel paraMst1 como um alvo novo para o desenvolvimento de fármacos que interferi-rão com ativação e agregação de plaquetas.Ensaio de Mst1 e Mst2 cinase in vitro

Para avaliar as condições adequadas para um ensaio de cinasein vitro finalizado para identificação de moduladores, a atividade in vitro dasproteínas de GST-Mst recombinantes expressas em bactérias foi testada emtampões diferentes. Como mostrado na Figura 10 para GST-Mst1, em todasas amostras contendo 2 mM de MnCI2 e independentemente da adição de 1mM de DTT ou 0,02% de BSA, observamos a redução mais alta no teor deATP desse modo correspondendo ao nível mais alto da atividade de cinase.Resultados similares foram obtidos para GST-Mst2, até mesmo se o consu-mo de ATP geral nunca alcançasse o grau observado para GST-Mst1, suge-rindo uma atividade de cinase inferior da proteína recombinante de GST-Mst2.

Após estabelecer ótimas condições de tampão para Mst1 e Mst2(40 mM de Hepes pH 7,5, 2 mM de MnCI2), investigamos o efeito da estau-rosporina de inibidor de cinase não específico na atividade de Mst1 cinase.O ensaio de GST-Mst1 cinase foi executado na presença de concentraçõesdiferentes de inibidor, variando de 1 uM a 244 pM. Como mostrado na Figura11, estaurosporina poderia inibir atividade de MST1, com um IC50 por voltade 600 pM, completamente.

Estes resultados mostram que foi possível otimizar as condiçõespara ensaio de Mst1 cinase. Além disso, tais condições foram de forma bem-sucedida aplicadas para investigar o efeito do estaurosporina de inibidor decinase, assim suportando a aplicação do ensaio para o uso como um ensaiode triagem in vitro para compostos que atuam como moduladores de ativida-de de Mst1 e/ou Mst2 de acordo com a presente invenção.Mapeamento de via com base em repórter

Sistema de célula com base repórter para mapear via foi estabe-lecido usando diferentes linhagens celulares e estimulações. Este ensaiopermite investigar o efeito de uma proteína sobreexpressa de interesse emvias endógenas. Medindo as perturbações na indução da luciferase do generepórter a jusante cuja expressão é dirigida por promotores específicos paravias, o envolvimento de uma proteína de interesse em uma via de transdu-ção de sinal específica pode ser avaliado.

Foi mostrado que, comparado a um vetor de controle não-induzido, sobreexpressão de Mst1 em células de HEK293T leva a uma ati-vação significativa dos promotores de AP-1, NF-kB e p53. Desse modo, serápossível usar um tal sistema onde Mst1 estiver sobreexpressado e um talpromotor induzível é usado para leitura para testar o efeito celular e eficiên-cia dos moduladores de atividade de Mst1.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> sanofi-Aventis Deutschland GmbH<120> USO DA PROTEÍNA DE MST PARA O TRATAMENTO DE UM DIS-TÚRBIO TROMBOEMBÓLICO

<130> DE2005/013

<150> 05006359.3

<151> 2005-03-23<160> 10

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 487

<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Glu Thr Vai Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys15 10 15

Leu Asp Glu Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu vai Phe Asp vai25 20 25 30

Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly ser Tyr Gly Ser vai Tyr Lys Ala lie35 40 45

His Lys Glu Thr Gly Gln lie vai Ala lie Lys Gln vai Pro vai Glu50 55 60

Ser Asp Leu Gln Glu lie lie Lys Glu lie ser lie Met Gln Gln Cys65 70 75 80

Asp Ser Pro His Vai vai Lys Tyr Tyr Gly ser Tyr Phe Lys Asn Thr85 90 95

Asp Leu Trp lie Vai Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser vai Ser Asp

100 105 110

lie lie Arg Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu lie Ala Thr115 120 125

lie Leu Gln Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg

130 135 140

Lys lie His Arg Asp lie Lys Ala Gly Asn lie Leu Leu Asn Thr Glu145 150 155 160

Gly His Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly vai Ala Gly Gln Leu Thr Asp165 170 175

Thr Met Ala Lys Arg Asn Thr vai lie Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala

180 185 190

Pro Glu vai lie Gln Glu lie Gly Tyr Asn cys vai Ala Asp lie Trp195 200 205

Ser Leu Gly lie Thr Ala lie Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr

210 215 220

Ala Asp lie His Pro Met Arg Ala lie Phe Met lie Pro Thr Asn Pro225 230 235 240

Pro Pro Thr Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp ser Asp Asn Phe Thr Asp245 250 255

Phe vai Lys Gln Cys Leu vai Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala

260 265 270

Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe vai Arg ser Ala Lys Gly vai Ser275 280 285

lie Leu Arg Asp Leu lie Asn Glu Ala Met Asp vai Lys Leu Lys Arg

290 295 300

Gln Glu Ser Gln Gln Arg Glu Vai Asp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser305 310 315 320

Glu Glu Asp Glu Met Asp ser Gly Thr Met vai Arg Ala vai Gly Asp325 330 335

Glu Met Gly Thr Vai Arg vai Ala ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn340 345Thr Met lie Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln

355 360vai lie Asn Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr370 375 380

Asp Glu Thr Met Gln Pro Ala Lys Pro Ser Phe Leu385 390 395

Gln Lys Glu Lys Glu Asn Gln lie Asn ser Phe Gly405 410Gly Pro Leu Lys Asn ser Ser Asp Trp Lys lie Pro420 425Tyr Glu Phe Leu Lys ser Trp Thr vai Glu Asp Leu

435 440Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Gln Glu lie Glu450 455 460

Lys Tyr Gln Ser Lys Arg Gln Pro lie Leu Asp Ala465 470 475

Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe485

<210> 2

<211> 1464<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 2

atggagacgg tacagctgag gaacccgccg cgccggcagc tgaaaaagtt ggatgaagat 60agtttaacca aacaaccaga agaagtattt gatgtcttag agaaacttgg agaagggtcc 120tatggcagcg tatacaaagc tattcataaa gagaccggcc agattgttgc tattaagcaa 180gttcctgtgg aatcagacct ccaggagata atcaaagaaa tctctataat gcagcaatgt 240gacagccctc atgtagtcaa atattatggc agttatttta agaacacaga cttatggatc 300

gttatggagt actgtggggc tggttctgta tctgatatca ttcgattacg aaataaaacg 360ttaacagaag atgaaatagc tacaatatta caatcaactc ttaagggact tgaatacctt 420cattttatga gaaaaataca ccgagatatc aaggcaggaa atattttgct aaatacagaa 480

350

Leu Gly Thr Met365

Met Lys Arg Arg

Glu Tyr Phe Glu400

Lys Ser vai Pró415

Gln Asp Gly Asp430

Gln Lys Arg Leu445

Glu lie Arg Gln

lie Glu Ala Lys480ggacatgcaa aacttgcaga ttttggggta gcaggtcaac ttacagatac catggccaag 540

cggaatacag tgataggaac accattttgg atggctccag aagtgattca ggaaattgga 600

tacaactgtg tagcagacat ctggtccctg ggaataactg ccatagaaat ggctgaagga 660

aagccccctt atgctgatat ccatccaatg agggcaatct tcatgattcc tacaaatcct 720

cctcccacat tccgaaaacc agagctatgg tcagataact ttacagattt tgtgaaacag 780

tgtcttgtaa agagccctga gcagagggcc acagccactc agctcctgca gcacccattt 840

gtcaggagtg ccaaaggagt gtcaatactg cgagacttaa ttaatgaagc catggatgtg 900

aaactgaaac gccaggaatc ccagcagcgg gaagtggacc aggacgatga agaaaactca 960

gaagaggatg aaatggattc tggcacgatg gttcgagcag tgggtgatga gatgggcact 1020

gtccgagtag ccagcaccat gactgatgga gccaatacta tgattgagca cgatgacacg 1080

ttgccatcac aactgggcac catggtgatc aatgcagagg atgaggaaga ggaaggaact 1140

atgaaaagaa gggatgagac catgcagcct gcgaaaccat cctttcttga atattttgaa 1200

caaaaagaaa aggaaaacca gatcaacagc tttggcaaga gtgtacctgg tccactgaaa 1260 aattcttcag attggaaaat accacaggat ggagáctacg agtttcttaa gagttggaca 1320

gtggaggacc ttcagaagag gctcttggcc ctggacccca tgatggagca ggagattgaa 1380

gagatccggc agaagtacca gtccaagcgg cagcccatcc tggatgccat agaggctaag 1440

aagagacggc aacaaaactt ctga 1464

<210> 3<211> 491<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 3

Met Glu Gln Pro Pro Ala Pro Lys ser Lys Leu Lys Lys Leu ser Glu15 10 15

Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu vai Phe Asp vai Leu Glu Lys20 25 30

Leu Gly Glu Gly Ser Tyr Gly ser vai Phe Lys Ala lie His Lys Glu35 40 45

Ser Gly Gln vai vai Ala lie Lys Gln vai Pro vai Glu ser Asp Leu50 55 60

Gln Glu lie lie Lys Glu lie ser lie Met Gln Gln Cys Asp Ser Pro65 70 75 80Tyr vai vai Lys Tyr Tyr Gly ser Tyr Phe Lys Asn Thr Asp Leu Trp

85 90 95

lie vai Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser Vai Ser Asp lie lie Arg100 105 110

Leu Arg Asn Lys Thr Leu lie Glu Asp Glu lie Ala Thr lie Leu Lys115 120 125

Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg Lys lie His

130 135 140

Arg Asp lie Lys Ala Gly Asn lie Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala145 150 155 160

Lys Leu Ala Asp Phe Gly vai Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Met Ala

165 170 175

Lys Arg Asn Thr vai lie Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu Vai180 185 190

lie Gln Glu lie Gly Tyr Asn Cys Vai Ala Asp lie Trp Ser Leu Gly195 200 205

lie Thr ser lie Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr Ala Asp lie

210 215 220

His Pro Met Arg Ala lie Phe Met lie Pro Thr Asn Pro Pro Pro Thr225 230 235 240

Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp ser Asp Asp Phe Thr Asp Phe vai Lys

245 250 255

Lys Cys Leu vai Lys Asn Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala Thr Gln Leu260 265 270

Leu Gln His Pro Phe lie Lys Asn Ala Lys Pro Vai Ser lie Leu Arg275 280 285

Asp Leu lie Thr Glu Ala Met Glu lie Lys Ala Lys Arg His Glu Glu

290 295 300

Gln Gln Arg Glu Leu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Ser Asp Glu Asp Glu305 310 315 320

Leu Asp Ser His Thr Met vai Lys Thr Ser Vai Glu Ser vai Gly Thr325 330 335Met Arg Ala Thr ser Thr Met Ser Glu Gly Ala Gln Thr Met lie Glu

340 345 350

His Asn Ser Thr Met Leu Glu Ser Asp Leu Gly Thr Met vai lie Asn355 360 365

Ser Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Gly Thr Met Lys Arg Asn Ala Thr370 375 380

Ser Pro Gln vai Gln Arg Pro ser Phe Met Asp Tyr Phe Asp Lys Gln385 390 395 400

Asp Phe Lys Asn Lys ser His Glu Asn Cys Asn Gln Asn Met His Glu405 410 415

Pro Phe Pro Met Ser Lys Asn vai Phe Pro Asp Asn Trp Lys vai Pro

420 425 430

Gln Asp Gly Asp' Phe Asp Phe Leu Lys Asn Leu Ser Leu Glu Glu Leu435 440 445

Gln Met Arg Leu Lys Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Arg Glu lie Glu450 455 460

Glu Leu Arg Gln Arg Tyr Thr Ala Lys Arg Gln Pro lie Leu Asp Ala465 470 475 480

Met Asp Ala Lys Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe485 490

<210> 4<211> 1476<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 4

atggagcagc cgccggcgcc taagagtaaa ctaaaaaagc tgagtgaaga cagtttgact 60aagcagcctg aagaagtttt tgatgtatta gagaagcttg gagaagggtc ttatggaagt 120gtatttaaag caatacacaa ggaatccggt caagttgtcg caattaaaca agtacctgtt 180gaatcagatc ttcaggaaat aatcaaagaa atttccataa tgcagcaatg tgacagccca 240tatgttgtaa agtactatgg cagttatttt aagaatacag acctctggat tgttatggag 300tactgtggcg ctggctctgt ctcagacata attagattac gaaacaagac attaatagaa 360gatgaaattg caaccattct taaatctaca ttgaaaggac tagaatattt gcactttatg 420agaaaaatac acagagatat aaaagctgga aatattctcc tcaatacaga aggacatgca 480

aaattggcag attttggagt ggctggtcag ttaacagata caatggcaaa acgcaatact 540

gtaataggaa ctccattttg gatggctcct gaggtgattc aagaaatagg ctataactgt 600

gtggccgaca tctggtccct tggcattact tctatagaaa tggctgaagg aaaacctcct 660

tatgctgata tacatccaat gagggctatt tttatgattc ccacaaatcc accaccaaca 720

ttcagaaagc cagaactttg gtccgatgat ttcaccgatt ttgttaaaaa gtgtttggtg 780

aagaatcctg agcagagagc tactgcaaca caacttttac agcatccttt tatcaagaat 840

gccaaacctg tatcaatatt aagagacctg atcacagaag ctatggagat caaagctaaa 900

agacatgacg aacagcaacg agaattggaa gaggaagaag aaaattcgga tgaagatgag 960

ctggattccc acaccatggt gaagactagt gtgggagagt gtggcaccat gcgggccaca 1020

agcacgatga gtgaaggggc ccagaccatg attgaacata atagcacgat gttggaatcc 1080

gacttgggga ccatggtgat aaacagtgag gatgaggaag aagaagatgg aactatgaaa 1140

agaaatgcaa cctcaccaca agtacaaaga ccatctttca tggactactt tgataagcaa 1200

gacttcaaga ataagagtca cgaaaactgt aatcagaaca tgcatgaacc cttccctatg 1260

tccaaaaacg tttttcctga taactggaaa gttcctcaag atggagactt tgactttttg 1320

aaaaatctaa gtttagaaga actacagatg cggttaaaag cactggaccc catgatggaa 1380

cgggagatag aagaacttcg tcagagatac actgcgaaaa gacagcccat tctggatgcg 1440

atggatgcaa agaaaagaag gcagcaaaac ttttga 1476

<210> 520 <211> 487<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 5

Met Glu Thr vai Gln Leu Arg Asn Pro Pro Arg Arg Gln Leu Lys Lys25 1 5 10 15

Leu Asp Glu Asp Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu vai Phe Asp vai

20 25 30

Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly ser Tyr Gly ser vai Tyr Lys Ala lie35 40 45

30 His Lys Glu Thr Gly Gln ile vai Ala lie Arg Gln vai Pro vai Glu50 55 60

Ser Asp Leu Gln Glu lie lie Lys Glu lie ser lie Met Gln Gln Cys65 70 75 80

Asp Ser Pro His vai vai Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr

85 90 95

Asp Leu Trp lie vai Met Glu Tyr Cys Gly Ala Gly Ser vai Ser Asp100 105 110

lie lie Arg Leu Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu lie Ala Thr

115 120 125

lie Leu Gln Ser Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg130 135 140

Lys lie His Arg Asp lie Lys Ala Gly Asn lie Leu Leu Asn Thr Glu145 150 155 160

Gly His Ala Lys Leu Ala Asp Phe Gly vai Ala Gly Gln Leu Thr Asp

165 170 175

Thr Met Ala Lys Arg Asn Thr vai lie Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala180 185 190

Pro Glu vai lie Gln Glu lie Gly Tyr Asn cys vai Ala Asp lie Trp

195 200 205

Ser Leu Gly lie Thr Ala lie Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr210 215 220

Ala Asp lie His Pro Met Arg Ala lie Phe Met lie Pro Thr Asn Pro225 230 235 240

Pro Pro Thr Phe Arg Lys Pro Glu Leu Trp Ser Asp Asn Phe Thr Asp

245 250 255

Phe vai Lys Gln Cys Leu vai Lys Ser Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala260 265 270

Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe vai Arg Ser Ala Lys Gly vai Ser

275 280 285

lie Leu Arg Asp Leu lie Asn Glu Ala Met Asp vai Lys Leu Lys Arg290 295 300

Gln Glu Ser Gln Gln Arg Glu vai Asp Gln Asp Asp Glu Glu Asn Ser305 310 315 320

Glu Glu Asp Glu Met Asp Ser Gly Thr Met vai Arg Ala vai Gly Asp325 330 335

Glu Met Gly Thr vai Arg Vai Ala Ser Thr Met Thr Asp Gly Ala Asn340 345 350

Thr Met lie Glu His Asp Asp Thr Leu Pro Ser Gln Leu Gly Thr Met355 360 365

vai lie Asn Ala Glu Asp Glu Glu Glu Glu Gly Thr Met Lys Arg Arg370 375 380

Asp Glu Thr Met Gln Pro Ala Lys Pro Ser Phe Leu Glu Tyr Phe Glu385 390 395 400

Gln Lys Glu Lys Glu Asn Gln lie Asn ser Phe Gly Lys Ser vai Pro405 410 415

Gly Pro Leu Lys Asn Ser Ser Asp Trp Lys lie Pro Gln Asp Gly Asp

420 425 430

Tyr Glu Phe Leu Lys Ser Trp Thr vai Glu Asp Leu Gln Lys Arg Leu435 440 445

Leu Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Gln Glu lie Glu Glu lie Arg Gln450 455 460

Lys Tyr Gln ser Lys Arg Gln Pro lie Leu Asp Ala lie Glu Ala Lys465 470 475 480

Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe485

<210> 6<211> 492<212> PRT<213> Brachydunio rerio<400> 6

Met Glu His Ser vai Pro Lys Asn Lys Leu Lys Lys Leu Ser Glu Asp15 10 15

Ser Leu Thr Lys Gln Pro Glu Glu vai Phe Asp vai Leu Glu Lys Leu20 25 30

Gly Glu Gly ser Tyr Gly Ser vai Phe Lys Ala lie His Lys Glu Ser35 40 45Gly Gln vai vai Ala lie Lys Gln vai Pro vai Glu Ser Asp Leu Gln

50 55 60

Glu lie lie Lys Glu lie Ser lie Met Gln Gln Cys Asp ser Pro Tyr65 70 75 80

Vai Vai Lys Tyr Tyr Gly Ser Tyr Phe Lys Asn Thr Asp Leu Trp lie85 90 95

Vai Met Glu Tyr cys Gly Ala Gly Ser vai Ser Asp lie lie Arg Leu

100 105 110

Arg Asn Lys Thr Leu Thr Glu Asp Glu lie Ala Thr vai Leu Lys Ser115 120 125

Thr Leu Lys Gly Leu Glu Tyr Leu His Phe Met Arg Lys lie His Arg

130 135 140

Asp lie Lys Ala Gly Asn lie Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala Lys145 150 155 160

Leu Ala Asp Phe Gly vai Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Met Ala Lys165 170 175

Arg Asn Thr vai lie Gly Thr Pro Phe Trp Met Ala Pro Glu vai lie

180 185 190

Gln Glu lie Gly Tyr Asn Cys Vai Ala Asp lie Trp ser Leu Gly lie195 200 205

Thr Ser lie Glu Met Ala Glu Gly Lys Pro Pro Tyr Ala Asp lie His

210 215 220

Pro Met Arg Ala lie Phe Met lie Pro Thr Asn Pro Pro Pro Thr Phe225 230 235 240

Arg Lys Pro Glu His Trp ser Asp Asp Phe Thr Asp Phe vai Lys Lys245 250 255

Cys Leu Vai Lys Asn Pro Glu Gln Arg Ala Thr Ala Thr Gln Leu Leu

260 265 270

Gln His Pro Phe lie vai Gly Ala Lys Pro vai Ser lie Leu Arg Asp275 280 285

Leu lie Thr Glu Ala Met Asp Met Lys Ala Lys Arg Gln Gln Glu Gln290 295 300Gln Arg Glu Leu Glu Glu Asp Asp Glu Asn Ser Glu Glu Glu vai Glu305 310 315 320

Vai Asp ser His Thr Met Vai Lys Ser Gly Ser Glu Ser Ala Gly Thr325 330 335

Met Arg Ala Thr Gly Thr Met Ser Asp Gly Ala Gln Thr Met lie Glu340 345 350

His Gly Ser Thr Met Leu Glu Ser Asn Leu Gly Thr Met vai lie Asn355 360 365

Ser Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Leu Gly Ser Met Arg Arg Asn370 375 380

Pro Thr Ser Gln Gln lie Gln Arg Pro ser Phe Met Asp Tyr Phe Asp385 390 395 400

Lys Gln Asp Ser Asn Lys Ala Gln Glu Gly Phe Asn His Asn Gln Gln405 410 415

Asp Pro Cys Leu lie ser Lys Thr Ala Phe Pro Asp Asn Trp Lys vai420 425 430

Pro Gln Asp Gly Asp Phe Asp Phe Leu Lys Asn Leu Asp Phe Glu Glu435 440 445

Leu Gln Met Arg Leu Thr Ala Leu Asp Pro Met Met Glu Arg Glu lie450 455 460

Glu Glu Leu Arg Gln Arg Tyr Thr Ala Lys Arg Gln Pro lie Leu Asp465 470 475 480

Ala Met Asp Ala Lys Lys Arg Arg Gln Gln Asn Phe485 490

<210> 7<211> 17<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Peptideos<400> 7: Leu Ala Asp Phe Gly vai Ala Gly Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln lie

| 1 5 10 15

I Lys

' <210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Peptideos

<400> 8

Thr Leu lie Glu Asp Glu lie Ala Thr lie Leu Lys

10

<210> 9

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Peptideos

<400> 9

Ala Gly Asn lie Leu Leu Asn Thr Glu Gly His Ala Lys

1 5 10

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Peptideos

<400> 10

Ala Thr Ala Thr Gln Leu Leu Gln His Pro Phe vai Arg 1 5 10

SEQ ID NO: 1

METVQLRNPPRRQLKKLDEDSLTKQPEEVFDVLEKLGEGSYGSVYKAIHKETGQIVAIKQVPVESDLQEIIKEISIMQQCDSPHVVKYYGSYFKNTDLWIVMEYCGAGSVSDIIRLRNKTLTEDEIATILQSTLKGLEYLHFMRKIHRDIKAGNILLNTEGHAKLADFGVAGQLTDTMAKRNTVIGTPFWMAPEVIQEIGYNCVADIWSLGITAIEMAEGKPPYADIHPMRAIFMIPTNPPPTFRKPELWSDNFTDFVKQCLVKSPEQRATATQLLQHPFVRSAKGVSILRDLINEAMDVKLKRQESQQREVDQDDEENSEEDEMDSGTMVRAVGDEMGTVRVASTMTDGANTMIEHDDTLPSQLGTMVINAEDEEEEGTMKRRDETMQPAKPSFLEYFEQKEKENQINSFGKSVPGPLKNSSDWKIPQDGDYEFLKSWTVEDLQKRLLALDPMMEQEIEEIRQKYQSKRQPILDAIEAKKRRQQNFSEQ ID NO: 2

ATGGAGACGGTACAGCTGAGGAACCCGCCGCGCCGGCAGCTGAAAAAGTTGGATGAAGATAGTTTAACCAAACAACCAGAAGAAGTATTTGATGTCTTAGAGAAACTTGGAGAAGGGTCCTATGGCAGCGTATACAAAGCTATTCATAAAGAGACCGGCCAGATTGTTGCTATTAAGCAAGTTCCTGTGGAATCAGACCTCCAGGAGATAATCAAAGAAATCTCTATAATGCAGCAATGTGACAGCCCTCATGTAGTCAAATATTATGGCAGTTATTTTAAGAACACAGACTTATGGATCGTTATGGAGTACTGTGGGGCTGGTTCTGTATCTGATATCATTCGATTACGAAATAAAACGTTAACAGAAGATGAAATAGCTACAATATTACAATCAACTCTTAAGGGACTTGAATACCTTCATTTTATGAGAAAAATACACCGAGATATCAAGGCAGGAAATATTTTGCTAAATACAGAAGGACATGCAAAACTTGCAGATTTTGGGGTAGCAGGTCAACTTACAGATACCATGGCCAAGCGGAATACAGTGATAGGAACACCATTTTGGATGGCTCCAGAAGTGATTCAGGAAATTGGATACAACTGTGTAGCAGACATCTGGTCCCTGGGAATAACTGCCATAGAAATGGCTGAAGGAAAGCCCCCTTATGCTGATATCCATCCAATGAGGGCAATCTTCATGATTCCTACAAATCCTCCTCCCACATTCCGAAAACCAGAGCTATGGTCAGATAACTTTACAGATTTTGTGAAACAGTGTCTTGTAAAGAGCCCTGAGCAGAGGGCCACAGCCACTCAGCTCCTGCAGCACCCATTTGTCAGGAGTGCCAAAGGAGTGTCAATACTGCGAGACTTAATTAATGAAGCCATGGATGTGAAACTGAAACGCCAGGAATCCCAGCAGCGGGAAGTGGACCAGGACGATGAAGAAAACTCAGAAGAGGATGAAATGGATTCTGGCACGATGGTTCGAGCAGTGGGTGATGAGATGGGCACTGTCCGAGTAGCCAGCACCATGACTGATGGAGCCAATACTATGATTGAGCACGATGACACGTTGCCATCACAACTGGGCACCATGGTGATCAATGCAGAGGATGAGGAAGAGGAAGGAACTATGAAAAGAAGGGATGAGACCATGCAGCCTGCGAAACCATCCTTTCTTGAATATTTTGAACAAAAAGAAAAGGAAAACCAGATCAACAGCTTTGGCAAGAGTGTACCTGGTCCACTGAAAAATTCTTCAGATTGGAAAATACCACAGGATGGAGACTACGAGTTTCTTAAG AGTTGG AC AGTGG AGG ACCTTCAG AAG AGGCTCTTGG CCCTGG ACCCCATG ATGGAGCAGGAGATTGAAGAGATCCGGCAGAAGTACCAGTCCAAGCGGCAGCCCATCCTGGATGCCATAGAGGCTAAGAAGAGACGGCAACAAAACTTCTGASEQ ID NO: 3

MEQPPAPKSKLKKLSEDSLTKQPEEVFDVLEKLGEGSYGSVFKAIHKESGQVVAIKQVPVES

DLQEIIKEISIMQQCDSPYVVKYYGSYFKNTDLWIVMEYCGAGSVSDIIRLRNKTLIEDEIA

TILKSTLKGLEYLHFMRKIHRDIKAGNILLNTEGHAKLADFGVAGQLTDTMAKRNTVIGTPF

WMAPEVIQEIGYNCVADIWSLGITSIEMAEGKPPYADIHPMRAIFMIPTNPPPTFRKPELWS

DDFTDFVKKCLVKNPEQRATATQLLQHPFIKNAKPVSILRDLITEAMEIKAKRHEEQQRELE

EEEENSDEDELDSHTMVKTSVESVGTMRATSTMSEGAQTMIEHNSTMLESDLGTMVINSEDE

EEEDGTMKRNATSPQVQRPSFMDYFDKQDFKNKSHENCNQNMHEPFPMSKNVFPDNWKVPQD

GDFDFLKNLSLEELQMRLKALDPMMEREIEELRQRYTAKRQPILDAMDAKKRRQQNF

SEQ ID NO: 4

ATGGAGCAGCCGCCGGCGCCTAAGAGTAAACTAAAAAAGCTGAGTGAAGACAGTTTGACTAAGCAGCCTGAAGAAGIIIIIGATGTATTAGAGAAGCTTGGAGAAGGGTCTTATGGAAGTGTATTTAAAGCAATACACAAGGAATCCGGTCAAGTTGTCGCAATTAAACAAGTACCTGTTGAATCAGATCTTCAGGAAATAATCAAAGAAATTTCCATAATGCAGCAATGTGACAGCCCATATGTTGTAAAGTACTATGGCAGTTATTTTAAGAATACAGACCTCTGGATTGTTATGGAGTACTGTGGCGCTGGCTCTGTCTCAGACATAATTAGATTACGAAACAAGACATTAATAGAAGATGAAATTGCAACCATTCTTAAATCTACATTGAAAGGACTAGAATATTTGCACTTTATGAGAAAAATACACAGAGATATAAAAGCTGGAAATATTCTCCTCAATACAGAAGGACATGCAAAATTGGCAGATTTTGGAGTGGCTGGTCAGTTAACAGATACAATGGCAAAACGCAATACTGTAATAGGAACTCCATTTTGGATGGCTCCTGAGGTGATTCAAGAAATAGGCTATAACTGTGTGGCCGACATCTGGTCCCTTGGCATTACTTCTATAGAAATGGCTGAAGGAAAACCTCCTTATGCTGATATACATCCAATGAGGGCTAIIIIIATGATTCCCACAAATCCACCACCAACATTCAGAAAGCCAGAACTTTGGTCCGATGATTTCACCGATTTTGTTAAAAAGTGTTTGGTGAAGAATCCTGAGCAGAGAGCTACTGCAACACAACTTTTACAGCATCCTTTTATCAAGAATGCCAAACCTGTATCAATATTAAGAGACCTGATCACAGAAGCTATGGAGATCAAAGCTAAAAGACATGACGAACAGCAACGAGAATTGGAAGAGGAAGAAGAAAATTCGGATGAAGATGAGCTGGATTCCCACACCATGGTGAAGACTAGTGTGGGAGAGTGTGGCACCATGCGGGCCACAAGCACGATGAGTGAAGGGGCCCAGACCATGATTGAACATAATAGCACGATGTTGGAATCCGACTTGGGGACCATGGTGATAAACAGTGAGGATGAGGAAGAAGAAGATGGAACTATGAAAAGAAATGCAACCTCACCACAAGTACAAAGACCATCTTTCATGGACTACTTTGATAAGCAAGACTTCAAGAATAAGAGTCACGAAAACTGTAATCAGAACATGCATGAACCCTTCCCTATGTCCAAAAACGTTTTTCCTGATAACTGGAAAGTTCCTCAAGATGGAGACTTTGACIIIIIGAAAAATCTAAGTTTAGAAGAACTACAGATGCGGTTAAAAGCACTGGACCCCATGATGGAACGGGAGATAGAAGAACTTCGTCAGAGATACACTGCGAAAAGACAGC

CCATTCTGGATGCGATGGATGCAAAGAAAAGAAGGCAGCAAAACTTTTGA

SEQ ID NO: 5

METVQLRNPPRRQLKKLDEDSLTKQPEEVFDVLEKLGEGSYGSVYKAIHKETGQIVAIRQVPVESDLQEIIKEISIMQQCDSPHVVKYYGSYFKNTDLWIVMEYCGAGSVSDIIRLRNKTLTEDEIATILQSTLKGLEYLHFMRKIHRDIKAGNILLNTEGHAKLADFGVAGQLTDTMAKRNTVIGTPFWMAPEVIQEIGYNCVADIWSLGITAIEMAEGKPPYADIHPMRAIFMIPTNPPPTFRKPELWSDNFTDFVKQCLVKSPEQRATATQLLQHPFVRSAKGVSILRDLINEAMDVKLKRQESQQREVDQDDEENSEEDEMDSGTMVRAVGDEMGTVRVASTMTDGANTMIEHDDTLPSQLGTMVINAEDEEEEGTMKRRDETMQPAKPSFLEYFEQKEKENQINSFGKSVPGPLKNSSDWKIPQDGDYEFLKSWTVEDLQKRLLALDPMMEQEIEEIRQKYQSKRQPILDAIEAKKRRQQNF

SEQ ID NO: 6

MEHSVPKNKLKKLSEDSLTKQPEEVFDVLEKLGEGSYGSVFKAIHKESGQVVAIKQVPVESD

LQEIIKEISIMQQCDSPYVVKYYGSYFKNTDLWIVMEYCGAGSVSDIIRLRNKTLTEDEIATVLKSTLKGLEYLHFMRKIHRDIKAGNILLNTEGHAKLADFGVAGQLTDTMAKRNTVIGTPFW

MAPEVIQEIGYNCVADIWSLGITSIEMAEGKPPYADIHPMRAIFMIPTNPPPTFRKPEHWSD

DFTDFVKKCLVKNPEQRATATQLLQHPFIVGAKPVSILRDLITEAMDMKAKRQQEQQRELEE

DDENSEEEVEVDSHTMVKSGSESAGTMRATGTMSDGAQTMIEHGSTMLESNLGTMVINSDDE

EEEEDLGSMRRNPTSQQIQRPSFMDYFDKQDSNKAQEGFNHNQQDPCLISKTAFPDNWKVPQDGDFDFLKNLDFEELQMRLTALDPMMEREIEELRQRYTAKRQPILDAMDAKKRRQQNF

SEQ ID NO 7

LADFGVAGQLTDTKQIK

SEQ ID NO 8

TLIEDEIATILKSEQ ID NO 9

AGNILLNTEGHAK

SEQ ID NO 10

ATATQLLQHPFVR

Claims (29)

1. Uso da proteína de Mst ou uma seqüência de nucleotídeoque codifica para a proteína de Mst para a produção de um medicamentopara o tratamento de um distúrbio tromboembólico.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a proteína deMst é selecionada de Mst 1 e/ou Mst 2.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a proteí-na de Mst é uma proteína de Mst humana.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, em que a seqüênciade aminoácido da proteína de Mst 1 humana é a seqüência de aminoácidoda SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido da proteína de Mst 2 huma-na é a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3.

5. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que a seqüênciade nucleotídeo que codifica para Mst 1 humana é a seqüência de nucleotí-deo da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de nucleotídeo que codifica para Mst 2humana é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4.

6. Uso da proteína de Mst ou uma seqüência de nucleotídeoque codifica para a proteína de Mst para a descoberta de um modulador deproteína de Mst como um medicamento para o tratamento de um distúrbiotromboembólico.

7. Uso de acordo com a reivindicação 6, em que a proteína deMst é selecionada de Mst 1 e/ou Mst 2.

8. Uso de acordo com a reivindicação 6, em que a proteína deMst é uma proteína de Mst humana.

9. Uso de acordo com a reivindicação 8, em que a seqüênciade aminoácido da proteína de Mst 1 humana é a seqüência de aminoácidoda SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido da proteína de Mst 2 huma-na é a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3.

10. Uso de acordo com a reivindicação 6, em que a seqüênciade nucleotídeo que codifica para Mst 1 humana é a seqüência de nucleotí-deo da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de nucleotídeo que codifica para Mst 2humana é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4.

11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que a proteína de Mst ou uma seqüência de nucleotídeo que codificapara a proteína de Mst é colocada em contato com um composto de teste ea influência do composto de teste na proteína de Mst é medida ou detectada.

12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o distúrbio tromboembólico é causado por ativação e/ou agregação de plaquetas.

13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que o distúrbio tromboembólico é selecionado de infarte do miocár-dio, angina instável, síndromes coronárias agudas, doença de artéria coro-nária, restenose, acidente vascular cerebral, ataques isquêmicos transitórios,embolia pulmonar, disfunção ventricular esquerda, prevenção secundária decomplicações vasculares clínicas em pacientes com doenças cardiovascula-res e/ou cerebrovasculares, aterosclerose e/ou co-medicação para interven-ções vasculares, em particular acidente vascular cerebral, infarte do miocár-dio, aterosclerose e/ou restenose.

14. Método de triar um modulador da proteína de Mst ou a se-qüência de nucleotídeo que codifica para a proteína de Mst, em que o méto-do compreende as etapas de:(a) contatar uma proteína de Mst ou a seqüência de nucleotí-deo que codifica para a proteína de Mst em um ensaio selecionado de umensaio relacionado à trombose, um ensaio de cinase e/ou ensaio de sistemacelular com base em repórter com um composto de teste, e(b) medir ou detectar a influência do composto de teste na proteína de Mst.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o en-saio relacionado à trombose é um ensaio de agregação de trombócitos.

16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, em queadicionalmente compreende a etapa de:(c) selecionar um composto de teste com uma atividade contraum distúrbio tromboembólico comparando as alterações no ensaio na pre-sença e na ausência do composto de teste.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 16, em que a proteína de Mst é selecionada de Mst 1 e/ou Mst 2.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 17, em que a proteína de Mst é uma proteína de Mst humana.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, em que a seqüên-cia de aminoácido da proteína de Mst 1 humana é a seqüência de aminoáci-do da SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido da proteína de Mst 2 hu-mana é a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 3.

20. Uso de acordo com a reivindicação 14, em que a seqüên-cia de nucleotídeo que codifica para Mst 1 humana é a seqüência de nucleo-tídeo da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de nucleotídeo que codifica para Mst 2humana é a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 4.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 20, em que o composto de teste é fornecido na forma de uma bibliotecade compostos químicos.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 21, em que o método é realizado em um arranjo.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 22, em que o método é realizado em um sistema de robótica.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 23, em que o método é um método de triagem de rendimento alto docomposto de teste.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 a 24, em que o composto de teste detectado é um inibidor de ativação deplaquetas e/ou agregação de plaquetas.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-14 e 15, em que o composto de teste detectado reduz o risco para formaçãode trombo e/ou coágulo sangüíneo.

27. Método para produzir um medicamento para o tratamentode um distúrbio tromboembólico, em que o método compreende as etapasde:(a) realizar o método como definido em qualquer uma das rei-vindicações 14 a 26,(b) isolar um composto de teste detectado adequado para otratamento de um distúrbio tromboembólico, e(c) formular o composto de teste detectado com um ou maisveículos farmaceuticamente aceitáveis ou substâncias auxiliares.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 27, em que o distúrbio tromboembólico é causado por ativação e/ouagregação de plaquetas.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 28, em que o distúrbio tromboembólico é selecionado de infarte do mio-cárdio, angina instável, síndromes coronárias agudas, doença de artéria co-ronária, restenose, acidente vascular cerebral, ataques isquêmicos transitó-rios, embolia pulmonar, disfunção ventricular esquerda, prevenção secundá-ria de complicações vasculares clínicas em pacientes com doenças cardio-vasculares e/ou cerebrovasculares, aterosclerose e/ou co-medicação paraintervenções vasculares, em particular acidente vascular cerebral, infartaçãodo miocárdio, aterosclerose e/ou restenose.