BRPI0611598A2

BRPI0611598A2 - novo sìtio de fosforilação de proteìnas cinase ativadas por mitógeno, proteìnas modificadas e aplicações

Info

Publication number: BRPI0611598A2
Application number: BRPI0611598-5A
Authority: BR
Inventors: Murga Montesinos; Mayor Menendez; Jurado Pueyo; Campo Muelas; Pedro Manuel; Sandra Peregrin Pedrique
Original assignee: Univ Madrid Autonoma
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2006-06-09
Publication date: 2010-09-21
Also published as: IL187969A0; MX2007015702A; AU2006289476A1; WO2007028430A1; EP1899461B1; EP1899461A1; CN101233228A; KR20080023729A; DE602006018735D1; RU2008100039A; US20080233097A1; ES2357681T3; CA2611191A1; JP2008545434A; ATE491023T1

Abstract

NOVO SìTIO DE FOSFORILAçAO DE PROTEíNAS CINASE ATIVADAS POR MITOGENO, PROTEìNAS MODIFICADAS E APLICAçõES. Foi identificado um novo sitio de fosforilação de proteínas cínase ativadas por mitógeno (MAPK) . As MAPKs fosforíladas no dito sítio de fosforílação podem ser utilizadas como marcador diagnóstico de patologías mediadas por MAPKs.

Description

"NOVO SÍTIO DE FOSFORILAÇÃO DE PROTEÍNAS CINASE ATIVADAS PORMITÓGENO, PROTEÍNAS MODIFICADAS E APLICAÇÕES"

Campo da Invenção

A invenção se refere a um novo sitio defosforilação de proteínas cinase ativadas por mitógeno (MAPK,Sigla do Inglês: Mitogen-Activated Protein Kinase) , às ditasMAPKs fosforiladas no dito sítio de fosforilação, assim como,às suas aplicações.

Antecedentes da Invenção

0 termo MAPK inclui três cascatas de cinases., ERK,JNK e p38, e suas respectivas isoformas-.-[Pearson G-. , et al.,2001, "Mitogen-activated protein , (MAP) . kinase pathways:Regulation and Physiological Functions"-, ..Endocrine Reviews22(2):153-183]. Os efeitos celulares mediados por estascinases são muito numerosos:e abrangem t.odo o. ciclo de vidade uma célula: crescimento, divisão, diferenciação,motilidade, respostas osmóticas, respostas ao estrêsse,inflamação, câncer, etc.

A detecção de um determinado estímulo extracelularse transmite a uma primeira cinase, denominada MAPKKK, cujadiana são as serinas e treoninas de outra cinase, MAPKK. Estafosforilação determina a ativação de MAPKK, fosforilandorestos de serina e treonina em uma tríade T-Xaa-Y (onde T étreonina, e é tirosina e Xaa é o resto de um aminoácido, talcomo, por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico,glutamina, glicina oo prolina) delimitada, chamada desegmento de ativação, que porta a diana final desta cascatatrimodular. MAPK é a cinase efeitora encarregada defosforilar em serina e treonina a numerosos substratos, taiscomo, fatores de transcrição, outras cinases, elementosestruturais, etc.

P38

A proteína p38 MAPK, ou p38, é uma enzima quepertence à família das cinases serina/treonina, quedesempenha um importante papel na resposta celular a sinaisde estrêsses externos, tais como,· luz ultravioleta, choqueosmótico, calor, etc. Por este motivo, esta proteína é tambémconhecida como proteína cinase ativada por estrêsse ou SAPK(do inglês, Strêss-Activated Protein Kinase). A p38 exerceseu papel regulador, controlando a expressão genética atravésda fosforilação e ativação de fatores :de transcrição deoutras cinases e também regulando a estabilidade deimportantes mensageiros de ARN.

Existem quatro isoformas de p38 que diferen em suadistribuição nos diferentes tecidos e na sua sensibilidadeaos distintos inibidores de p38, onde a mais estudada e,portanto, melhor conhecida, é a isoforma alfa, cuja ativaçãose tem observado em muitos tipos celulares (tanto de tecidohematopoiético como de tecido não hematopoiético) , através detratamento com um estímulo apropriado. Contudo, apesar destasdiferenças, todas as isoformas de p38 possuem um domínio deativação composto por 12 aminoácidos que contêm o segmento deativação Thr-Gly-Tyr, o qual é fosforilado por MKK6/MKK3,enzimas da família das cinases, que se encontram por cima dap38 na cascata de sinalização celular.A p38 se constitui em um regulador essencial dasfunções celulares que mediam a produção de citocinas e outrasmoléculas responsáveis pelo desenvolvimento de processosinflamatórios, participando em diferentes situaçõesfisiológicas induzidas por estrêsse celular, como é o caso dealgumas cardiopatias e fenômenos inflamatórios, e no controledo ciclo celular.

Durante vários anos, tem sido feita a análise daimplicação que a p38 tem no desenvolvimento ou evolução dediferentes doenças. A importância da ativação da p38 noestabelecimento e desenvolvimento de uma falha cardíaca jáfoi estabelecida. Foi observado uma ativação constitutivaatravés da contrição aórtica em modelos experimentais decamundongos e em um modelo de ratas hipertensas, com dietasaltas em quantidade de sal. Nos seres humanos, a p38 seencontra ativada no coração afetado por uma falha cardíacasecundária à doença coronária avançáda. A regulação daativação da p38 parece ser chave no desenvolvimento dapatologia cardíaca, já que em vários grupos foi observado umaredução da atividade da p38 em estados terminais de falhacardíaca no miocárdio humano e de ratos. 0 emprego deinibidores de p38 MAPK, também se encontra descrito no estadoda técnica, com a implicação da p38 MAPK em outras patologiasdiferentes de doenças cardíacas, tais como, doençasinflamatórias, pulmonares ou neuronais. Todas estaspatologias se caracterizam por apresentar a p38 em sua formaativa, quer dizer, com os restos Thrl80 e Tyrl82fosforilados.Por outro lado, se observou em pacientes comcâncer, que tanto a quimioterapia como a radioterapiaproduzem uma ativação da p38 que parece ser a responsávelpelo sinal que induz a morte das células tumorais.

A estratégia mais estendida no tratamento dasdiferentes doenças caracterizadas pela presença de p38 ativa,consiste na inibição farmacológica de sua atividade ou nainibição de sua ativação, como se menciona nos documentos depatentes WO 2005/032551, WO 2004/021988, EP1534282 ou CA24 974 48, em combinação com outros agentes terapêuticos.

GRKs

Os receptores acoplados a proteínas G (GPCR) mediamas ações de diversos mensageiros que desempenham um papelessencial na função do sistema cardiovascular ou do sistemainmune. Além de interagir com as proteínas Gheterotriméricas, os GPCR ativados interagem com cinases dereceptores acoplados a proteínas G (GRKs) e com as proteínasmoduladoras denominadas arrestinas. Baseados em similaresestruturais, os sete membros da família de GRKs (GRK1-7)foram classificados em quatro subfamílias, GRK1, GRK2/3,GRK4/5/6 e GRK7, onde GRK2/3 e GRK5/6 apresentam umadistribuição ubíqua no organismo. Contudo, não se conhece omecanismo que altera a sinalização por GPCRs e contribui parao desencadeamento e/ou progressão destas patologias.

Estas proteínas desempenham um papel chave narápida modulação da funcionalidade e na dinâmica intracelularde receptores, através da ativação por ligandos, além depermitirem o recrutamento e regulação de outras proteínascelulares, iniciando novas vias de sinalização, pelo que sãotanto moduladoras como componentes essenciais da transduçãode sinais mediada por GPCR. Os níveis e funcionalidads dealgumas GRKs estão alterados em situações patológicas, taiscomo, a falha cardíaca congestiva, a hipertrofia cardíaca, ahipertensão ou procesos inflamatórios, tais como, a artritereumatóide.

Por outro lado, se conhece o importante papel queas SAPKs representam no desenvolvimento de cardiomiopatias efalha cardíaca e que, a ativação seletiva de GPCRs promove aativação crônica dessas cinases em músculo cardíaco, sendoeste um passo essencial no desenvolvimento da falha cardíaca,a partir de uma hipertrofia ventricular.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra que a GRK2 fosforila diretamentea p38 in vitro.

A Figura IA mostra que a p38 se fosforila por meioda GRK2. A incubação da GRK2 recombinante purificada foifeita pelo sistema de Baculovirus (50 nM) , com 50 nM de p38recombinante (GST-p38) no tampão de fosforilação de p38(Hepesi 25 mM, pH 7,5, acetato de magnésio 10 mM, ATP 50 μΜ,[γ-32ρ] ATP 2000-3000 cpm/pmol) em um volume final de 40 \i~Ldurante 30 minutos, à temperatura de 30°C, sem ou comheparina (50 ng/^L), com o objetivo de se inibir a atividadede GRK2. Os controles de autofosforilação das cinases seefetivaram nas mesmas condições. A reação foi interrompidaatravés da adição de tampão de carga-SDS, depois, sesepararam as proteínas em um gel de poliacrilamida-SDS a 8% ese revelaram por auto-radiografia.

A Figura IB mostra que a GRK2 fosforila diretamentea p38 e não promove" sua autofosforilação. As reações defosforilação se efetivaram como foi indicado com relação àFigura IA. Os compostos de heparina e SB203580, inibidores deGRK2 e de p38, respectivamente, se utilizaram emconcentrações de dez vezes IC50/ para assegurar a completainibição de caminhos de cinases, isto é, numa concentração de1,5 μΜ para a heparina e de 0,5 μΜ para o composto SB203580.

Os substratos empregados foram MBP (14 μg por ponto) para ap38 e caseina (7,5 μg por ponto). A reação foi interrompidapor meio da adição de tampão de carga-SDS, depois, sesepararam as proteínas em um gel de poliacrilamida-SDS a 10%e se revelaram por auto-radiografia.

A Figura IC mostrã que a GRK2 nãõ. fosforila a p38em seu segmento de ativação. As reações de fosforilação foraminiciadas na ausência de ATP radiativo, nas condiçõesanteriormente descritas. Foram empregados 4 0 ng de MKK6cam(MKK6/MKK3, Upstate) para fosforilar a GST-p38 in vitro. Osanticorpos utilizados para, ou revelados através da separaçãoelectoforética reconhecem, no caso das proteínas superiores,a GRK2 e GST-p38 (Anticorpo anti-PF2, soro policlonal, geradono laboratório dos inventores, com anticorpos contra aproteína de fusão GST-PF2, onde PF2 é um fragmento C-terminalde GRK2). 0 anticorpo fosfoespecífico de T180/Y182 utilizadopara revelar o estado de ativação da p38 é da Cell Signaling.

A Figura ID mostra a dependência temporal dafosforilação da p38 por GRK2. a fosforilação se deixoutranscorrer nas mesmas condições descritas anteriormente,exceto com relação ao tempo de incubação, que, como estáindicado, variou de 0 a 90 minutos. Através de setas, émostrada a mobilidade de ambas as proteínas (GRK2 79,6 kDa;GST-p38 68 kDa). À direita são representados os dados obtidosatravés da quantificação por Cerenkov das bandas separadasdos géis.

Na Figura IE se apresentam os parâmetros cinéticosda fosforilação. Diante dos dados do separado D, se tomaram15 minutos da reação como período de tempo para determinar asconstantes cinéticas da fosforilação em condições develocidade inicial. As reações de fosforilação se efetivaramcomo já foi descrito, deixando a concentração de GRK2 fixa(25 nM) e variando a concentração de p38 de 12,5 a 400 nM. Areação foi interrompida por adição de tampão de carga-SDS, sesepararam as proteínas em um gel de poliacrilamida-SDS a 8%,se revelaram por auto-radiografia e se quantificaram porCerenkov. O gráfico foi feito com o programa Kaleidagraph,dotado de um algoritmo capaz de deduzir os parâmetroscinéticos: constante de Michaelis-Menten (Km = 79,56 nM) evelocidade máxima (Vmax = 0,9 nmol de PO43" incorporado por mgGRK2-1 minuto-1).

A Figura 2 mostra que GRK2 e p38 se associam deforma dependente da estimulação do receptor p2-adrenérgico(P2-AR).

Na Figura 2A: células HEK 293 foram transfectadastransitoriamente com os vetores pCDNA3-GRK2, pBC12BI-p2-AR epCDNA3-Flag-p38a (1 yg de cada ADN por p60). Após 48 horas datransfecção, e após uma abstinência em um meio sem soro por 2horas, as células foram estimuladas com o agonistaadrenérgico isoproterenol (ISO, 10 μΜ) durante 5 ou 10minutos ou não foram estimuladas (0 min ISO). Deste modo, ascélulas sem o receptor β2-ΑΚ sobrexpresso foram estimuladascom NaCl 0,5 M durante 15 minutos. As células foramsolubilizadas em um tampão adequado para a inmunoprecipitaçãocom o anticorpo M2 anti-Flag unido à agarose e após tomaralíquotas destes lisados (10 %) para controle desobreexpressão (quadros de lisados), se incubaram oscomplexos imunes durante toda a noite à temperatura de 4 °C.

As proteínas imunoprecipitadas (anti-Flag IP) foram novamentesuspensas em um tampão de ruptura de eletroforese e asproteínas unidas foram decompostas em um gel depoliacrilamida-SDS a 10%. Após a eletro-transferência, asproteínas foram detectadas com anti-p38 e com o anticorpocontra GRK2, anti-PF2 (quadro superior e inferior,respectivamente). Na Figura, se incluem ainda os controlesnegativos de imunoprecipitação (Cneg), na ausência de Flag-p38a e de estimulação com 10 μΜ de isoproterenol. Nos quadrosde lisados foram detectados, acima, GRK2 e, abaixo, o estadode ativação de p38 mediante o anticorpo anti-fosfo-p38 (verTabela I).

Figura 2B: em aproximações idênticas às descritasem 2A, se imunoprecipitaram as proteínas sobreexpressas com oanticorpo contra GRK2, anti-PF2, e se revelou com anti-p38 aco-imunoprecípitação desta em cada ponto de estimulação (0 e5 minutos de isoproterenol, quadro superior esquerdo). Nosquadros adjacentes se apresentam os controles de expressão deFlag-p38 (acima) e de GRK2 (abaixo) e a GRK2 totalimunoprecipitada '('quadro inferior esquerdo). Dê novo, sedetecta a associação entre ambas as proteínas, estimulada aos5 minutos de exposição com 10 μΜ de isoproterenol.

Figxira 2C: Desta vez, se introduziram nas célulasHEK293, somente os vetores que codificavam P2-AR e Flag-p38a,com o objetivo de assegurar que a GRK2 endógena era co-imunoprecipitada com uma quantidade total menor de p38 (0,5yg de ADN) . A associação máxima entre Flag-p38a e GRK2 seproduz aos 5 minutos de tratamento com isoproterenol 10 μΜ(ver quadros superior e inferior da esquerda). Os quadros dadireita confirmam a expressão de GRK2 (acima, anti-PF2) e dep38 (abaixo, anti-p38) nos lisados celulares.

Fignra 2D: em experimentos idênticos aos descritosno detalhe separado A, foi posto à prova a capacidade domutante cataliticamente inativo GRK2-K220R, de co-imunoprecipitar-se com Flag-p38. Os dois quadros superioresmostram, respectivamente, a co-imunoprecipitação das duasisoformas de GRK2 e a p38 imunoprecipitada totalmente. Osdois quadros de lisados atestam a sobreexpressão de GRK2 eGRK2-K220R (acima, anti-PF2), assim como, o estado deativação de Flag-p38 em cada ponto (abaixo, anti-fosfo-p38).Conforme foi descrito em A, se efetivaram controles deimunoprecipitação inespecífica (Cneg), do anticorpo M2, anti-Flag-agarose.

Na Figura 3 pode ser observado como GRK2 é capaz deatenuar a ativação de p38 por MKK6Cam-Figura 3A: se transfectaram transitoriamentecélulas HEK 293, espalhadas normalmente em placas demúltiplos poços de 6 ou de 12 poços (M6 ou M12), com pCDNAS-Flag-p38a, pCDNA3-MKK6Cam, e com quantidades crescentes dovetor pCDNA3-GRK2. Neste experimento, se empregaram placas M6e as quantidades de ADN introduzidas foram: 100 ng de Flag-p38, 100 ng de MKK6CftM, e de 0 a 1 ug de GRK2. Em todos ospontos se completou a quantidade total de ADN com pCEFL-EGFPe com pCDNA3 inativo, em sustitução a pCDNA3-MKK6Cam/ no casodo controle (CTRL). Após 48 horas, as células foram colhidase lisadas em um tampão M2. O quadro superior mostra a dose deGRK2 sobreexpressa. O estado de ativação da p38 foi avaliadocom anti-fosfo-p38, da Cell Signaling, e após desprender osanticorpos da primeira imunodetecção, se revelou com anti-p38total, da mesma casa comercial. Observa-se que para evitarsaturações pouco decompostas da revelação, se apresentamauto-radiografias muito levemente expostas.

Figura 3B: Duas culturas massivas de células EBNA293, estavelmente transfectadas com pCDNA3-GRK2 e que,portanto, sobrexpresam dois níveis diferentes de GRK2, setransfectaram com Flag-p38 e MKK6Cam- O procedimento foi feitoconforme descrito anteriormente em A para determinar o estadode ativação de Flag-p38. Além disso, se assegurou a corretaexpressão de MKK6Cam com o anticorpo anti-MKK6/SKK3, daUpstate Biotechnology.

Na Figura 4, os experimentos mostram que GRK2 reduza atividade catalítica de p38.

Figura 4A: Se transfectaram transitoriamentecélulas HEK 293, espalhadas em p60, com 0,5 μς de pCDNA3-Flag-p38a, 0,5 pg de pCDNA3-MKK6CAM (ou 0,5 pg de pCDNA3inativo no controle, CTRL) , e com 1' ou 2 pg do vetor pCDNA3-GRK2 (+), realizando cada ponto em duplicata. Os controles seefetivaram em paralelo, substituindo os μg de pCDNA3-GRK2 porpCEFL-EGFP (-) . Se completou a quantidade total de ADN compCDNA3 inativo. Após 48 horas, as células foram lisadas, setomaram alíquotas de lisados e foi imunoprecipitado dasmesmas Flag-p38. Os quadros indicados em A evidenciam asobreexpressão de GRK2 (anti-PF2) e de MKK6Cam (anti-ΜΚΚβ) , ea ativação de Flag-p38 (anti-fosfo-p38).

Figura 4B: Os imunoprecipitados foram lavados trêsvezes com 15 mL de tampão M2 e duas vezes com outros 15 mL detampão de fosforilação, sem ATP (NaF 15 mM, Hepes 25 mM, pH7,5 e acetato de magnésio 10 mM) . Na última lavagem,novamente foram suspensos os complexos imunes-agarose em 1 mLde tampão e se separou 10% de cada ponto (100 uL) paracontrolar a imunoprecipitação de Flag-p38 (quadro inserido nográfico do detalhe separado B) . Com Flag-p38imunoprecipitada, se efetivaram ensaios de cinase, utilizandocomo substrato o peptídeo APRTPGGRR (inicialmenteproporcionado pela Calbiochem e posteriormente sintètizadopelo Serviço de Química de Proteínas do CBMSO). As reações serealizaram em um volume final de 25 μL, em um tampão defosforilação composto de Hepes 25 mM, pH 7,5, acetato demagnésio 10 mM, NaF 15 mM, ATP 50 μΜ e [γ-32Ρ]ΑΤΡ 500-1000cpm/pmol e 2 mM do peptídeo substrato. Quando se especifica(+SB), se adicionou SB203580 à reação in vitro, numaconcentração final de 0,5 μΜ. A fosforilação foi deixadatranscorrer durante 30 minutos à temperatura de 30°C, após oque, se deteve; mediante adição de 15 μΐ de'* TCA a 30%. Asproteínas foram precipitadas por centrifugação (25 000 xg, 15minutos, 4°C) e se recuperou, de cada reação, o sobrenadanteque continha o peptideo fosforilado. Recortes quadrados (1 cmχ 1 cm) de papel Whatman P81 se impregnaram com o peptideo emsolução. Depois, foram deixados secar, foram lavados de formaabundante com ácido fosfórico 75 mM e se quantificou aradioatividade incorporada pelo peptideo adsorvido porCerenkov. Os níveis de atividade se referiram à fosforilaçãodo peptideo substrato por Flag-38, na ausência de MKK6Cam(CTRL).

Na Figura 5 se observa que a redução dos níveis deGRK2 permite uma maior ativação de p38 por MKK6Cam ín situ.Figura 5A: Foram transfectadas transitoriamente células HEK293, espalhadas em placas M6 com 150 ng de pCDNA3-Flag-p38a,50 ng de pCDNA3-MKK6CAM/· e com quantidades crescentes do vetorpCEFL-GRK2, anti-sentido (AS): de 0,5 pg - 2 μg ou as mesmasquantidades de pCEFL-EGFP, como controle (C) . Em todos ospontos se completou a quantidade total de ADN com o vetorpCEFL inativo. As células foram lisadas e se procedeu àimunodetecção da quantidade total de GRK2 (quadro superior,anti-PF2), à ativação de p38 (quadro intermediário, anti-fosfo-p38), e p38 total (quadro inferior, anti-p38N) em cadaponto. No gráfico são reconhecidos os dados procedentes doponto de 2 pg (de GFP e Anti-sentido) de um experimentorepresentativo. Os níveis de ativação de p38 em cada uma dasduas condições se referem a seus respectivos controles, semMKK6Cam·

Figura 5B: a ativação basal de p38 está moduladapela quantidade de GRK2. Placas M6 de células HEK 293 foramtransfectadas transitoriamente com 100 ng de pCDNA3-Flag-p38a, e com 0,5 μς - 2 μς de pCEFL-GRK2 anti-sentido ou depCEFL-EGFP. A quantidade total de ADN foi completada em cadaponto com pCEFL. Em seguida, se avaliou nestas condições, pormeio de eletro-transferência e imunodetecção, a quantidadetotal de GRK2 (anti-PF2, quadro superior), o estado deativação de p38 (quadro intermediário, anti-fosfo-p38, auto-radiografia sobreexposta durante a revelaçãoquimioluminescente), e p38 total (quadro inferior, anti-p38).No gráfico da parte inferior da Figura, foram compiladas asmédias (+ SEM) de dados procedentes de três experimentosindependentes, em duplicata. Para determinar a significância,se aplicou o estatístico do Teste t de Student bilateral, com*p<0,005.

A Figura 6 demonstra que somente a p38, com seusdeterminantes.estruturais inteiros, é substrato de GRK2.

Figura 6A: a partir de bactérias transformadas comos plasmídeos pGEX2T- p38a, pGEX4T-Mxi2 e pGEX4T-Mxi2A17, sepurificaram as proteínas de fusão com GST (retângulo pretonos esquemas das proteínas): p38a, Mxi2 e Μχί2Δ17. Asisoformas Mxi2 foram utilizadas na maneira de mutantestruncados no terminal-C, para idealizar demarcar o sítio defosforilação de GRK2. A GRK2 recombinante foi incubada (200nM) com 0,5 μg de cada uma das proteínas de fusão, em umtampão de fosforilação (Hepes 25 mM, pH 7,5, acetato demagnésio 10 mM, ATP 50 μΜ, [γ-32Ρ]ΑΤΡ 2000-3000 cpm/pmol),durante 30 minutos à temperatura de 30°C. A heparina foiincluída (150 nM) como inhibidor específico de GRK2. Asreações foram interrompidas mediante adição de um tampão deruptura com SDS. As amostras foram decompostas SDS-PAGE 8%.

Com o objetivo de garantir a inclusão de quantidadesidênticas de proteína, primeiro, as mesmas foram visualizadasno gel por tingimento com Azul de Coomassie (CBB) . Emcontinuação, o gel foi seco e foi detectada a radioatividadeincorporada às proteínas (32P) .

Figura 6B: a proteína truncada GST-280-360p38 foigerada, correspondente aos 80 últimos aminoácidos de p38a,mediante o sistema de Gateway da Invitrogen. Ensaios defosforilação foram feitos com Μχί2Δ17, como terminal-N dep38, 280-360 p38 como terminal-C e com p38a inteira nasmesmas condições indicadas no detalhe separado A. Afosforilação foi detectada por auto-radiografia (32P) e,concomitantemente, foram feitos controles por meio de Westernblot, com o anticorpo anti-GST, da quantidade de proteínautilizada nos ensaios. Claramente se observa a presença daproteína GST-280-360p38, que não resulta fosforilada, STD,com migração de porteínas padrões de peso molecular.

A Figura 7 mostra que a GRK2 fosforila a p38 em umúnico resíduo.

Figura 7A: através de eletroforese bidimensionalfoi analisada a fosforilação de p38 por GRK2 e se deixoutranscorrer nas mesmas condições descritas anteriormente. Areação foi interrompida por adição de um tampão de carga paraiseletro-enfoque. A primeira dimensão eletroforética tinha umgradiente de anfólitos de pH 3 a 10. A segunda dimensão foidecomposta mediante um gel de poliacrilamida a 8%. É mostradopor meio de setas a mobilidade de ambas as proteínas (GRK279,6 kDa; GST-p38 68 kDa).

Figura 7B: amostras procedentes de um ensaio defosforilação não radioativo foram corridas em um geldestinado à seqüenciação proteômica. 0 gel foi retirado paravisualizar as bandas, e a correspondente à GST-p38 foiseparada do gel e submetida à digestão tríptica. Os peptídeosresultantes foram analisados por MALDI-TOF. É apresentada aampliação da zona do espectro de massa obtida, onde sedetectou o peptídeo fosforilado (massa correspondente a1.954.330), apenas presente na amostra procedente dafosforilação por GRK2.

A Figura 8 demonstra que GRK2 fosforila a p38 em umúnico resíduo. Com os dados obtidos em MALDI-TOF (modeloAutoflex, da Broker), se chegou à identificação de umpeptídeo tríptico, candidato de portar a fosforilação:LTDDHVQFLIYQILR. Para corroborar estes indícios, a amostrafoi decomposta por HPLC-ESI-IT " (modelo Deca-XP, da Thermo-Finnigan), trabalhando em modo SIM (monitorização de ionsisolados), de maneira que o analizador apenas irá fragmentaro peptídeo candidato. Às massas peptídicas reconhecíveis, foiatribuída a sua série (denominada bn ou Yrrnr em função dotranscurso da fragmentação). No espectro inferior, procedenteda amostra fosforilada, se encontra uma massa correspondenteà série Abs (no disco laranja) indicativa da fosforilação natreonina presente no peptideo analisado. Dessa forma, seidentificou a massa total do peptideo (dentro do quadro ovalamarelo) em ambos os casos. Na janela em miniatura inseridana parte direita da Figura, se recolhe a informação sobre aelução diferencial, da coluna de HPLC, do mesmo peptideoprocedente da amostra fosforilada e com controle. Dado a suamaior característica hidrofílica, o peptideo fosforilado eluialguns décimos de segundo antes.

A Figura 9 mostra que os mutantes de p38 T123A eT123D não são fosforilados por GRK2 in vitro.

Figura 9A: os mutantes foram confeccionadosmediante mutagênese dirigida às proteínas p38T123A ep38T123D, fundidas com GST, nos plasmídeos de expressãoprocariótica pGEX2T. Foi ensaiado nas condições já descritasde fosforilação, a capacidade das proteínas recombinantesGST-p38T123A e GST-p38T123D de serem substratos de GRK2, emcomparação com a proteína silvestre GST-p38WT e com asconcentrações finais indicadas na Figura. Os quadrossuperiores são representativos da fosforilação obtida (32P) eos quadros inferiores mostram, por WB anti-p38N, a quantidadede proteína recombinante utilizada nos ensaios.

Figura 9B: mostra o esquema representativo de p38a,onde se ressaltam características funcionais, como a extensãode domínio cinase, a ubicação dentro do mesmo do segmento deativação TGY e da seqüência LTDD hipoteticamente regulada porGRK2. Se destaca também o motivo CD, inicialmente contido eminvólucro, na regulação da associação de substratos eativadores.

A Figura 10 demonstra que a treonina 123 é umresíduo altamente conservado,·ubicado na superfície exterior'do sulco de rotulamento com ativadores e substratos de p38.

Os alinhamentos múltiplos que se apresentam foramconfeccionados através do progama ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/ClustalX/), pelo Dr. Perdiguero.

Os guias introduzem descontinuidades (gaps) para ajustar oalinhamento. Com letra roxa sobre fundo amarelo, se ressaltamos resíduos idênticos entre todas as isoformas, com fundoazul e fundo verde se indicam as substituições conservativas,conforme sua maior ou menor distribução, respectivamente,entre as proteínas alinhadas. Sobre fundo branco, se deixamos aminoácidos não conservados. Na base de cada alinhamentomúltiplo se indica o consenso (consensus) e mediante elipsesroxas se destaca a zona da treonina 123, sinalizada, alémdisso, na comparação de seqüências da parte inferior com umaseta.

A Figura 11 revela que o mutante p38T123D não éativável por MKK6cam e carece de atividade de cinase sobreATF2 in vitro.

Figura 11A: Foram realizados ensaios defosforilação (Hepes 25 mM, pH 7,5, acetato de magnésio 10 mM,NaF 15 mM, 50 μΜ ATP e [γ-32Ρ]ΑΤΡ 1000-2000 cpm/pmol) , invitro, com as proteínas de fusão GST-p38WT, GST-p38T123A eGST-p38T123D (150 nM) como substratos de fosforilação deMKK6Cam (40 ng) recombinante (Upstate Biotechnology). Asreações foram deixadas transcorrer à temperatura de 30°Cdurante 30 minutos e se separaram as proteínas em géis SDS-PAGE a 8%. Foi visualizada através de tingimento com Azul deCoomassie a quantidade de p38 em cada ponto. Na continuação,se determinou a radioatividade incorporada em cada isoformade p38. A auto-radiografia (32P) mostra um experimentorepresentativo de três ensaios independentes, efetivados emduplicata.

Figura 11B: Nestes mesmos ensaios, se avalioutambém a capacidade de GST-p38WT, GST-p38T123A e GST-p38T123Dativadas por MKK6Cam de fosforilar 2 μg de GST-ATF2. A auto-radiografia representativa (32P) do controle de GST-ATF2total é acompanhada (Azul de Coomassie).

A Figura 12 mostra que a treonina 123 de p38 énecessária para sua correta atividade catalítica sobre osubstrato MEF2A.

Figura 12A: Foram feitas fosforilações in vitro comas proteínas de fusão indicadas na Figura, na presença (+) ouausência (-) de MKK6Cam (40 ng) recombinante e 2 μg de GST-MEF2A. 0 ensaio foi deixado transcorrer durante 30 minutos.

As proteínas foram separadas em SDS-PAGE a 8%, tingidas comCBB e foi revelada a radioatividade incorporada (32P) . Sãoapresentados quadros de um experimento representativo dostrês ensaios realizados independentemente.

Figura 12B. Foi avaliada a atividade basal das trêsproteínas de fusão de p38, na ausência do ativador MKK6Cam,nas já descritas condições. É apresentada uma auto-radiograf ia representativa, após ampla exposição.

A Figura 13 mostra que o mutante de p38 T123D seativa menos que a p38 silvestre por MKK6Cam, in situ. Nosexperimentos de sobreexpressão análogos aos descritosanteriormente, foram transfectadas células HEK293, espalhadasem M6 e sempre em duplicata, com: 150 ng de pCDNA3-Flag-p38aWT, ou pCDNA3-Flag-p38a T123D e 50 ng de pCDNA3-MKK6Cam, (opCDNA3 inativo) . Foi avaliada a ativação das p38 com oanticorpo anti-fosfo-p38. Para cada uma das duas isoformasfoi referida a ativação por MKK6Cam à situação basal, obtendo-se um determinado nivel de ativação. Foi estabelecido 100% deativação, como a ativação de p38a WT em cada experimento.

Foram mostrados dados (± SEM) de três experimentosindependentes. Foi realizada o Teste T de Student, bilateral,e se obteve: *p<0,0001. Os quadros da direita (Western blot)são ilustrativos de um dos experimentos.

A Figura 14 mostra que o mutante' T123D da p38 nãose une aos substratos e não se associa com, ou não éfosforilado por, MKK6. A GST-p38 purificada e seus mutantesT123 (300 nM) foram incubados na presença de MKK6 purificada(3 nM) ou com uma cola de histidinas MAPKAPK2 (MK2, 20 nM) emum ensaio de precipitação (pull down) com GST como controlenegativo. As proteínas sedimentadas foram reveladas medianteum ensaio de Western blot, utilizando anticorpos anti-ΜΚΚβ,anti-histidina (para His-MK2) ou anti-GST (para quantidadestotais de GST-p38s). Em todos os quadros, os resultados sãorepresentativos de 3 experimentos independentes realizados emduplicata.

A Figura 15 mostra como a GRK2 reduz adiferenciação de fibroblastos a adipócitos, de mododependente de p38. Foram confeccionadas linhas 3T3L1estavelmente transfectadas com pCDNA3-GRK2 e pCDNA3-GRK2K220R. São incluídos controles de expressão de"' GRK2(anti-GRK2), obtidos nas linhas celulares, em comparação aosníveis em 3T3L1. As células foram submetidas ao tratamentopadrão de diferenciação e no dia 15 do tratamento, as célulasforam fixadas com formol e tingidas com Oil Red, corantelipofílico que se une às gorduras acumuladas pelosadipócitos. As células com fenótipo adipocítico (em roxo),foram contabilizadas em microscópio, em um total de 25campos. São mostradas fotografias representativas de doisexperimentos independentes, em duplicata. Assim, se incluiuma foto das células 3T3L1, isentas da estimulaçâo cominsulina durante o proceso de diferenciação (controle). Nográfico, se reflete o recanto de adipócitos (± SEM) nestesexperimentos. Foi feito o Teste T de Student, bilateral, paracada linha estável, com relação às células 3T3L1 e se obteve*p<0,0001. Em paralelo, foram efetuados controles dadependência de p38, mediante tratamento farmacológico comSB203580 10 μΜ.

A Figura 16 representa o reconhecimento peloanticorpo anti-fosfo-Thrl23 da p38 imunoprecipitada, a partirde cultura de células humanas e a fosforilação da p38 porGRK2, in vitro.

Figura 16A: As células HEK293 foram transfectadascom vetores de expressão para Flag-p38alfa de camundongo eGRK2 ou sua mutante inativa (GRK2-K220R) . As células foramcultivadas durante 16 horas sem soro, antes da lise. Foiimunoprecipitado (IPP) flag-p38 mediante um anticorpo anti-flag (M2) e, após eletroforese e transferêcia, foi detectadaa proteína fosforilada na Thrl23 através do ensaio de WesternBlot (WB), com um anticorpo específico purificado em colunasde afinidade (P-p38-T123, diluição 1:200). Foi revelada amesma membrana com anti-p38 total (p38) e outra membranacorrespondente às proteínas contidas nos extratos celularesantes da imunoprecipitação (Lisados) , com um anti-GRK2 436-689(GRK2).

Figura 16B: Foi apenas incubada GST-p38 (50 nM), comGRK2 purificada (150 nM) ou com 4 0 ng de MKK6CAmconstitutivamente ativa em um tampão de fosforilação, napresença de ATP não marcado radiativamente, durante 30minutos, a uma temperatura de 30°C. 0 quadro superior foimostrado com um anticorpo policlonal frente à Thrl23 de p38,na forma fosforilada. 0. quadro intermediário mostra aincubação com o anticorpo fosfoespecífico dos restosThrl80/Tyrl82 de p38 (Anti-Pp38) e na revelação inferior seutilizou um anticorpo contra p38 total.

A Figura 17 mostra que um anticorpo anti-fosforeconhece a p38 fosforilada por GRK2 na treonina 123, já queo mutante T123A de p38 não é reconhecido nessas condições.GST-p38wt e GST-p38T123A (70 nM) foram incubadasindividualmente, com GRK2 purificada (25 nM) ou com MKK6CAMreombinante (2 ng) . Foi adicionada heparina (100 ng/μΐ,) , uminibidor específico de GRK2, onde indicado. A fosforilaçãodas proteínas GSTp38 foi analisada por meio de um ensaioWestern blot com um anticorpo anti-fosfo-T123 e o GST-p38total com o anticorpo anti-GST. Os dados são representativosde 3 experimentos independentes.

A Figura 18 mostra os níveis de ativação da p38 e desecreção de TNF, em resposta ao lipolissacarideo demacrófagos, extraído de ratos parcialmente deficientes emGRK2. Foram isolados macrófagos peritoneais procedentes deratos C57BL/6 silvestrês (+/+) ou hemizigotos para GRK2( + /-) . Depois de submetê-los à ausência de estimulaçãodurante 2 horas, se adicionou ao meio de cultura olipopolissacarídeo bactériano (LPS: 0,5 μg/mL) durante 16horas. Foi quantificada a produção de citocinas inflamatórias(TNFa), mediante um kit comercial de ELISA (Bioutrak, daAmersham). Para confirmar a dependência deste processo daatividade p38, se utilizou SB203580 (30 μΜ) , 30 minutos antesde se adicionar LPS. São mostradas as médias +SD de 10 ratosprocessados em 4 experimentos independentes. Os dadoscorrespondem à secreção de TNFa, derivada de 106 células porpoço de M24. *; p<0,005 (conforme 0 Teste T de Student).

Descrição Detalhada da Invenção

Em um aspecto, a invenção se correlaciona com umaproteína MAPK, a qual, em certas ocasiões, é identificadanesta descripção como "proteína MAPK da invenção",selecionada entre:

a) uma proteína MAPK que compreende um resto fosforiladoem um sítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da ditaproteína MAPK, ou um fragmento da dita proteína quecompreende o dito resto fosforilado, onde:dito sitio de fosforilação diferente é o resto detreonina na posição 123 (Thrl23) da p38, isoforma a,de camundongo, ou um resto de um aminoácidosuscetível de fosforilação posicionalmenteeqüivalente em outra proteína MAPK, tal como sedefine por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos, e

a fosforilação no dito sítio de fosforilaçãodiferente, impede a ativação da dita proteína MAPK etambém sua atividade com relação a seus substratos; e

b) uma proteína MAPK que compreende uma carga negativaou um resto volumoso em um sítio de fosforilação, ou na áreaque envolve o dito sítio de fosforilação, que é diferente dosítio ou sítios de fosforilação presentes no segmento deativação da dita proteína MAPK, ou um fragmento da ditaproteína que compreende o dito resto fosforilado, onde:

o dito sítio de fosforilação diferente é o resto detreonina na posição 123 (Thrl23) da p38, isoforma a,de camundongo, ou um resto de um aminoácidosuscetível de fosforilação posicionalmenteeqüivalente em outra proteína MAPK, tal como sedefine por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos, e

a introdução da dita carga negativa ou do dito restovolumoso no dito sítio de fosforilação, ou na áreaque envolve o dito sítio de fosforilação, impede aativação da dita proteína MAPK e também sua atividadecom relação a seus substratos.Conforme aqui usado, o termo "posicionalmenteeqüivalente" se refere à posição de um aminoácido de uma!proteína MAPK que, por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos de proteínas MAPK, corresponde à Thrl23 de p38,isoforma a, de camundongo.

O termo "proteína MAPK" inclui as proteínas cinasesERK, JNK e p38, assim como, suas respectivas isoformas, dequalquer espécie. Informações sobre as ditas cinases e suasfunções, assim como, sobre seus efeitos celulares, podem serencontradas na revisão efetuada por Pearson e outros [PearsonG., et al., 2001, "Mitogen-activated protein (MAP) kinasepathways: Regulation and Physiological Functions", EndocrineReviews 22 (2):153-183] . Informações sobre as seqüências deaminoácidos das ditas proteínas MAPK podem ser encontradas embases de dados apropriadas, conhecidas pelos especialistasversados na técnica (por exemplo, Swissprot, NCBI, etc). Ascinases MAPK se encontram amplamente distribuídas entre asdiferentes espécies e sua estrutura principal está amplamenteconservada entre os diferentes membros das diferentesfamílias (ERK, JNK e p38).

As proteínas MAPK se caracterizam, entre outrascoisas, pela existência de um segmento de ativação quecompreende pelo menos um resto suscetível de ser fosforiladopela cinase apropriada.

Em uma realização em particular da invenção, o ditosegmento de ativação compreende a tríade de aminoácidos defórmula (I):

Thr-Xaa-Tyr (I)onde:

- Thr é treonina,

- Tyr é tirosina, e

- Xaa é o resto de um aminoácido.

Numa realização em particular, Xaa é o resto de umaminoácido selecionado dentre ácido aspártico, ácidoglutâmico, glutamina, glicina e prolina.

No caso particular da p38 de mamífero, isoforma a,o segmento de ativação compreende a tríade de aminoácidos defórmula (I) nas posições 180-182 de sua seqüência deaminoácidos.

Em outra realização em particular, o dito segmentode ativação compreende a tríade de aminoácidos de fórmula(II) :

Ser-Glu-Gly (II)

Onde:

- Ser é serina,

- Glu é ácido glutâmico, e

- Gly é glicina.

Numa realização da presente invenção, a proteínaMAPK da invenção se seleciona dentre as cinases ERK, JNK ep38. De modo ilustrativo, em uma realização em particular, adita proteína MAPK da invenção é uma p38. A cinase p38 seencontra amplamente distribuída entre as diferentes espéciese sua estrutura principal está amplamente conservada (Figura10) . Em uma realização em particular, a dita p38 é uma p38,em quaisquer de suas isoformas (α, β, γ, ou δ), de mamífero,por exemplo, de ser humano, roedor, etc. Em uma realizaçãoconcreta, a dita p38 é a isoforma α da p38 de camundongo (Musmusculus) , cuja seqüência de aminoácidos se mostra na SEQ IDNO: 1 (GenBank, número de Acesso P47811).

Os presentes inventores encontraram, de formasurpreendente, que a fosforilação de uma proteína MAPK em umsítio suscetível de fosforilação diferente do sítio ou sítiosde fosforilação presentes no segmento de ativação da ditaproteína MAPK, é capaz de inibir a ativação da dita proteínaMAPK, ativação esta, como conhecido, transcorre através dafosforilação dos restos suscetíveis de fosforilação (porexemplo, treonina ou tirosina) presentes no dito segmento deativação, por exemplo, concretamente, na dita tríade deaminoácidos que se fez referência anteriormente.

De fato, os estudos realizados pelos presentesinventores demonstraram que a fosforilação de um resto detreonina na posição 123 (Thrl23) da p38 de camundongo,isoforma a, impede a fosforilação dos restos de treonina etirosina presentes nas posições 180 e 182, respectivamente,da tríade de aminoácidos de fórmula (I), presente no segmentode ativação da dita p38. Como conseqüência disto, a p38 nãopode ser ativada e, portanto, não pode desempenhar sua funçãona cascata de transdução de sinais, o que pode resultar deespecial utilidade no tratamento daquelas doenças onde estáimplicada a ativação da dita MAPK na cascata de sinalização celular.

0 especialista versado na técnica entenderá que nãoapenas a fosforilação no dito novo sítio de fosforilação,como também a introdução de uma carga negativa ou de um restovolumoso no dito novo sítio de fosforilação, ou na área queenvolve o dito sítio, pode também provocar o efeito deinpedir a ativação de uma proteína MAPK e sua atividade comrelação a seus substratos.

Portanto, a invenção ensina a existência de um novosítio de fosforilação presente em uma proteína MAPK, onde odito sítio de fosforilação é diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da ditaproteína MAPK, tal como, a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou, então, um resto de um aminoácido suscetívelde fosforilação posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e, além disso, apresenta umaparticularidade de que, uma vez fosforilado, é capaz deinibir a ativação da dita proteína MAPK.

A localização concreta do dito sítio defosforilação diferente pode variar, dependendo da proteínaMAPK em questão (ERK, JNK o p38), da isoforma e da espécie doanimal, embora não varie sua função de impedir a ativação daproteína MAPK em questão, após a sua fosforilação (ou após aintrodução de uma carga negativa ou de um resto volumoso nodito sítio de fosforilação ou na área que envolve o ditosítio), nem sua correspondência ou equivalência posicionai.

As proteínas MAPK que contêm o dito sítio de fosforilação comas características de posição e funcionalidade mencionadasanteriormente são incluídas dentro do âmbito da presenteinvenção. Portanto, a proteína MAPK da invenção, não apenasinclui a proteína p38, isoforma a, de camundongo, fosforiladana Thrl23, como suas proteínas ortólogas, quer dizer,proteínas que procedem de um gene ancestral comum, quedesempenham a mesma função nas diferentes espécies, assimcomo, suas isoformas e as outras cinases (ERK e JNK)incluídas dentro do grupo das proteínas MAPK,independentemente de qual sítio de fosforilação se encontrana dita localização (Thrl23) ou em outra posição diferente, eo aminoácido fosforilado seja um aminoácido diferente datreonina.

Adicionalmente, a proteína MAPK da invenção tambéminclui uma proteína MAPK modificada, a qual tem uma carganegativa ou um resto volumoso no novo sítio de fosforilaçãoou na área que envolve o dito sítio, por exemplo, umaproteína p38 de camundongo, isoforma a, que contém uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23, ou na área queenvolve o dito sítio e, também, suas proteínas ortólogas,assim como, suas isoformas e as outras cinases (ERK e JNK)incluídas no grupo de proteínas MAPK, independentemente se acarga negativa ou o resto volumoso estiver na ditalocalização (Thrl23) ou em outra posição diferente e se oaminoácido modificado for um aminoácido diferente datreonina. Exemplos ilustrativos, não-limitativos, de cargasnegativas que podem ser introduzidas no novo sítio defosforilação, ou na área que envolve o dito sítio, conforme ainvenção, serão evidentes para um especialista versado natécnica, por exemplo, qualquer molécula ou composto capaz deproporcionar uma carga negativa, por exemplo, um peptídeo queleva um grupo fosfato, sendo o dito peptídeo capaz de se unirao dito sítio de f osforilação, ou à área que o envolve, eimitar o efeito da fosforilação no dito sitio. Exemplosilustrativos, não-limitativos, de restos volumosos que podemser introduzidos no novo sítio de fosforilação, ou na áreaque envolve o dito sítio, conforme a invenção, serãoevidentes para um eepecialista versado na técnica, porexemplo, qualquer molécula, por exemplo, um peptídeo ou umcomposto de baixo peso molecular, capaz de se unir ao ditosítio de fosforilação, ou à área que o envolve, e imitar oefeito da fosforilação nesse sítio; embora os inventores nãodesejem estar vinculados por nemhuna teoria, se acredita queo dito resíduo volumoso pode ocasionar uma troca deconformação na proteína MAPK, o que impede a ativação da ditaproteína MAPK e também sua atividade com relação a seussubstratos. Tal como aqui se utiliza, a expressão "na áreaque envolve o (novo) sítio de fosforilação" significa umaregião em volta do sítio de fosforilação, na qual umamodificação introduzida nela por meio de uma carga negativaou de um resto volumoso impede a ativação da dita proteínaMAPK e também sua atividade com relação a seus substratos.

Ensaios adequados para determinar o efeito de impedir ouinibir a ativação de uma proteína MAPK e sua atividade comrelação a seus substratos podem ser encontrados no Exemploque acompanha a presente descrição; em conseqüência, a ditainformação pode ser utilizada pelo expecialista versado natécnica para identificar a dita "área que envolve o sítio defosforilação".Em uma outra realização em particular da invenção,a proteína MAPK da invenção é um fragmento de uma proteínaMAPK que compreende um resto fosforilado em um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação da dita proteína MAPK,onde, como já mencionado anteriormente, o dito sítio defosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no dito sítio defosforilação diferente impede a ativação da dita proteínaMAPK.

A extensão do dito fragmento pode variar dentro deum amplo intervalo, por exemplo, entre 3 e 30 restos deaminoácidos, tipicamente, entre 5 e 25 restos de aminoácidos,preferivelmente, entre 10 e 20 restos de aminoácidos. Nãoobstante, case desejado, o dito fragmento pode conter ummaior número de restos de aminoácidos. Vantajosamente, o ditofragmento compreende um epítopo de uma proteína MAPK conformea invenção. Numa realização em particular, o dito fragmentocompreende a SEQ ID NO: 2, correspondente ao epítopoQKLpTDDHVQFLIY, onde "pT" representa o resto de Thrl23fosforilado e o resto das letras indica a notação dosaminoácidos, com base no código de uma única letra, da cinasep38, isoforma a, de camundongo. 0 dito epítopo se encontraaltamente conservado ao largo da evolução, pelo que a ditaSEQ ID NO: 2 pode ser considerada como uma seqüênciaconsenso do dito epitopo, entre as proteínas ortólogas de p38das diferentes espécies.

Em outra realização em particular, a proteína MAPKconforme a invenção é um fragmento de uma proteína MAPK quecompreende uma carga negativa ou um resto volumoso em umsítio de fosforilação (ou na área que envolve o dito sítio)que é diferente do sítio ou sítios de fosforilação presentesno segmento de ativação da dita proteína MAPK, onde, como jámencionado anteriormente, o dito sítio de fosforilaçãodiferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou umresto de um aminoácido suscetível de fosforilaçãoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK, tal comose define por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos, e dita modificação (carga negativa ou restovolumoso) no dito sítio de fosforilação diferente, impede aativação da dita proteína MAPK. A extensão do dito fragmentopode variar dentro de um amplo intervalo, por exemplo, entre3 e 30 restos de aminoácidos, tipicamente, entre 5 e 25restos de aminoácidos, preferivelmente, entre 10 e 20 restosde aminoácidos. Não obstante, caso desejado, o ditofragmento, pode conter um maior número de restos deaminoácidos. Vantajosamente, o dito fragmento compreende umepitopo de uma proteína MAPK da invenção.

São conhecidas numerosas patologias nas quais estãoimplicadas a ativação de MAPK. De um modo ilustrativo, não-limitativo, é conhecida a relação existente entre diferentesdoenças e a p38 na forma ativa, quer dizer, fosforilada nosrestos de fosforilação presentes no segmento de ativação, porexemplo, nos restos de Thrl80 e Tyrl82 da p38, isoforma a, demamífero (camundongo) . Portanto, o fato de que se podeimpedir a ativação da MAPK (impedindo a fosforilação nossítios de fosforilação presentes no segmento de ativação daMAPK) por fosforilação de ou por introdução de uma carganegativa ou de um resto volumoso no novo sítio defosforilação, ou na área que envolve o dito novo sítio defosforilação das ditas MAPK, identificada na presenteinvenção (por exemplo, a fosforilação na Thrl23 impede afosforilação nos restos de Thrl80 e Tyrl82 de p38, isoformaa, de mamífero (camundongo) ), e também o fato de que afosforilação ou a introdução de uma carga negativa ou de umresto volumoso na Thrl23 ou na área que envolve a Thrl23podem impedir o rotulamento e atividade da p38 com relaçãoaos seus substratos, tem importantes implicações biológicasque resultam de utilidade, entre outras possíveis aplicações,no diagnóstico de uma patologia mediada por uma MAPK na formaativa, ou para determinar o risco ou predisposição de umsujeito a desenvolver a dita patologia, ou para avaliar oumonitorar o efeito de uma terapia administrada a um sujeitoque apresenta a dita patologia, ou para analisar o estado ougravidade e/ou a evolução da dita patologia, assim como, naidentificação de compostos potencialmente úteis para otratamento da dita patologia. Neste sentido, a proteína MAPKda invenção pode desempenhar um destacado papel.

0 termo "sujeito", conforme aqui usado, incluiqualquer membro de uma espécie animal, incluindo o serhumano; de modo ilustrativo, o dito sujeito pode ser ummamífero, tal como um ser humano, um animal doméstico, umroedor, etc., preferivelmente, um homem ou mulher de qualqueridade e raça.

A expressão "patologia mediada por uma MAPK naforma ativa", tal como aqui se utiliza, inclui qualquerpatologia na qual intervém ou desempenha algum papel uma MAPKna forma ativa, quer dizer, fosforilada nos restos defosforilação presentes no segmento de ativação. Exemplosilustrativos, não-limitativos, da dita patologia mediada poruma MAPK na forma ativa incluem câncer, assim como, asdoenças cardíacas, infecciosas, neuronais, pulmonares einflamatórias. Exemplos ilustrativos, não-limitativos, daditas doenças incluem, infarto do miocárdio, hipertrofia,hipertensão, miocardite, lesões causadas por angioplastia,disfunções miocárdicas, infecções causadas por vírus oubactérias, morte neuronal e de outros tipos celulares, doençade Alzheimer, psoríase, artrite reumatóide, neuriteautoimune, doença de Crohn, câncer (carcinomas, leucemias,linfomas, sarcomas, etc.), formação de trombos, resposta aagentes quimioterapéuticos e radioterapéuticos, resposta àisquemia/reperfusão, etc.

Portanto, a proteína MAPK da invenção é umaproteína útil como marcador de diagnóstico ou depredisposição de um sujeito a desenvolver uma patologiamediada por uma MAPK na forma ativa, por exemplo, câncer ouuma doença cardíaca, infecciosa, nervosa, neuronal, pulmonarou inflamatória. Pelo fato de que a presença de MAPK na formaativa está associada com as patologias mediadas por MAPKs nasformas ativas acima mencionadas, a identificação da proteínaMAPK da invenção seria indicativa de um menor risco oupredisposição a desenvolver a dita patologia, já que afosforilação no sítio de fosforilação identificado napresente invenção, ou a introdução de uma carga negativa oude um resto volumoso no dito sítio de fosforilação ou na áreaque envolve o dito sítio, impediria a ativação da dita MAPK.

Em uma realização em particular, a dita proteína MAPK dainvenção é uma proteína p38 de mamífero fosforilada em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da dita p38 demamífero, por exemplo, uma p38 de mamífero fosforilada emThr123, ou um fragmento da dita proteína que compreende odito resto fosforilado.

Numa realização em particular, a invençãoproporciona um método in vitro para analisar o risco oupredisposição de um sujeito a desenvolver uma patologiamediada por uma MAPK na forma ativa, que compreende:

a) detectar e/ou quantificar o nível de uma proteínaMAPK da invenção em uma amostra biológica procedente do ditosujeito; e

b) comparar o dito nível com o de uma amostra decontrole,

onde uma redução no dito nível relativo ao da amostra decontrole é indicativo de risco do sujeito desenvolver a ditapatologia mediada por uma MAPK na forma ativa.

Praticamente, qualquer amostra biológica procedentedo sujeito a se estudar pode ser utilizada, por exemplo,sangue, soro, plasma, tecido, etc. A dita amostra pode serobtida por métodos convencionais. A amostra de controle é umaamostra procedente de sujeitos que não padecem da ditapatologia mediada por uma MAPK na forma ativa e incluivalores de referência ou valores basais.

A detecção e/ou quantificação do nivel(concentração) da dita proteína MAPK da invenção, pode serdeterminada por métodos convencionais conhecidos pelosespecialistas versados na técnica, por exemplo, mediantemétodos imunoquímicos (vistos mais adiante).

Dessa forma, a proteína MAPK da invenção pode serutilizada para avaliar ou monitorizar o efeito de uma terapiaadministrada a um sujeito, o qual apresenta a dita patologiamediada por uma MAPK na forma ativa, por exemplo, câncer ouuma doença cardíaca, infecciosa, nervosa, neuronal, pulmonarou inflamatória. Nesse sentido, um tratamento que impeça aativação da MAPK, por exemplo, fosforilando no sítio defosforilação identificado na presente invenção, permitiriaanalisar o efeito de uma terapia administrada a um sujeitoque apresenta a dita patologia e, em caso de não resultareficaz, modificar o tratamento ou projetar uma terapiapersonalizada. Numa realização em particular, a dita proteínaMAPK da invenção é uma proteína p38 de mamífero fosforiladaem um sítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da dita p38 demamífero, por exemplo, uma p38 . de mamífero fosforilada emThrl23, ou um fragmento da dita proteína que compreende odito resto fosforilado.A proteína MAPK da invenção também pode serutilizada para analisar o estado ou gravidade e/ou a evoluçãoda dita patologia mediada por uma MAPK na forma ativa, porexemplo, câncer ou uma doença cardíaca, infecciosa, nervosa,neuronal, pulmonar ou inflamatória. Nesse sentido, aidentificação de uma proteína MAPK da invenção seriaindicativa de uma melhor evolução desse tipo de patologia.

Numa realização em particular, a dita proteína MAPK dainvenção é uma proteína p38 de mamífero fosforilada em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da dita p38 demamífero, por exemplo, uma p38 de mamífero fosforilada emThrl23, ou um fragmento da dita proteína que compreende odito resto fosforilado.

Numa realização em particular, a invençãoproporciona um método in vitro para avaliar ou monitorar oefeito de uma terapia administrada a um sujeito que apresentaa dita patologia mediada por uma MAPK na forma ativa, ou paraanalisar o estado ou gravidade e/ou a evolução da ditapatologia mediada por uma MAPK na forma ativa, quecompreende:

b) comparar o dito nível com o de uma amostra decontrole procedente do mesmo sujeito.

A comparação entre ambos os níveis será indicativada eficácia do tratamento e/ou da evolução da patologia. Porcausa disso, neste caso, a amostra de controle é uma amostrado própio sujeito, antes de administrar ao mesmo o tratamentoou em períodos posteriores à administração do tratamento,para analisar a eficácia do mesmo e a evolução da patologia.

A etecção e/ou quantificação do nível(concentração) da dita proteína MAPK da invenção pode serdeterminada por métodos convencionais conhecidos pelosespecialistas versados na técnica, por exemplo, mediantemétodos imunoquímicos (vistos mais adiante).

A proteína MAPK da invenção também pode serutilizada para identificar compostos potencialmente úteispara o tratamento da dita patologia mediada por uma MAPK naforma ativa, por exemplo, câncer ou uma doença cardíaca,infecciosa, nervosa, neuronal, pulmonar ou inflamatória.

Nesse sentido, podem ser utilizados no tratamento das ditasdoenças cardíacas, infecciosas, nervosas, neuronais,pulmonares ou inflamatórias, compostos que impeçam a ativaçãoda dita MAPK; dessa forma, para o tratamento do câncer, podemser utilizados compostos que desfosforilem a MAPK dainvenção, já que a ativação das ditas MAPKs após submissão deum sujeito à quimioterapia ou radioterapia, produz um sinalque induz a morte das células tumorais. Numa realização emparticular, a dita proteína MAPK da invenção é uma proteínap38 de mamífero fosforilada em um sítio de fosforilaçãodiferente do sítio ou sítios de fosforilação presentes nosegmento de ativação da dita p38 de mamífero, por exemplo,uma p38 de mamífero fosforilada em Thrl23, ou um fragmento dadita proteína que compreende o dito resto fosforilado, ou umaproteína p38 que tem um composto unido à Thrl23 ou à área queenvolve a Thrl23 e imita a presença da carga negativa de umfosfato ou um resto volumoso na "Thrl23 ou na área que envolvea Thrl23.

Numa realização em particular, a invençãoproporciona um método in vitro para identificar um compostopotencialmente útil para o tratamento de patologias mediadaspor proteínas MAPK, que compreende:

a) por em contato o composto candidato com uma proteínaMAPK, e

b) detectar a fosforilação da dita proteína MAPK em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítiosde fosforilação presentes no segmento de ativação dadita proteína MAPK, e

c) analisar se o dito sítio de fosforilação (i) é aThrl23 da p38, isoforma a, de camundongo (no caso daproteína MAPK utilizada ter sido a dita proteína),ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação posicionalmente equivalente em outraproteína MAPK, tal como se define por alinhamentomúltiplo de seqüências de aminoácidos, e se (ii) afosforilação no dito sítio de fosforilaçãodiferente, impede a ativação da dita proteína MAPK;

ou, alternativamente,

i) por em contacto o composto candidato (por exemplo,um composto capaz de fosforilar a dita proteínaMAPK ou um composto que imita o efeito da ditafosforilação) com uma proteína MAPK;ii) detectar a fosforilação da dita proteína MAPK em umsítio de fosforilação do segmento de ativação dadita proteína MAPK, para medir o· efeito do compostocandidato sobre a ativação da proteína MAPK, oudetectar o efeito de imitar a dita fosforilaçãosobre a dita proteína MAPK, para medir o efeito docomposto candidato sobre a ativação da MAPK;

iii) analisar a atividade da dita proteína MAPK napresença do composto candidato com relação a seussubstratos, para avaliar a possível inibição dorotulamento e/ou atividade da proteína MAPK comrelação a seus substratos, na presença de umcomposto competidor; e

iv) analisar (i) se o dito sítio de fosforilação naThrl23 da proteína p38, isoforma a, de camundongo(no caso da proteína MAPK utilizada ter sido a ditaproteína) é afetado pelo composto candidato, e (ii)se a fosforilação no dito sítio de fosforilaçãoimpede a ativação da dita proteína MAPK.

0 composto candidato pode ser, numa realização emparticular, um composto capaz de fosforilar uma proteína MAPK(por exemplo, uma cinase, etc.) ou um composto que imita oefeito da dita fosforilação, em contato com uma proteínaMAPK.

0 composto competidor pode ser, em uma realização emparticular, um composto capaz de fosforilar uma proteína MAPK(por exemplo, uma cinase, etc.).

A fosforilação de uma proteína pode ser determinadapor meio de qualquer método convencional conhecido pelosespecialistas versados na técnica. São conhecidos diversosensaios para determinar o estado de fosforilação de umaproteína, ou o resto de aminoácido que se encontrafosforilado em uma determinada proteína, como, por exemplo,os ensaios de atividade da cinase in vitro, utilizando ATPmarcado radioativamente; a eletroforese bidimensional dasproteínas assim fosforiladas e marcadas (que permite analisarquantos restos de aminoácidos estão fosforilados em umaproteína); espectrometria de massa da proteína previamentepurificada, cujo estado de fosforilação se quer medir;mutagênese dirigida, seguida de ensaio de atividade de cinasein vitro, com as proteínas purificadas; análise de fosfo-peptídeos, que implica na separação em duas dimensões de umaproteína fosforilada, após a digestão por tripsina ou, omenos complicado tecnicamente, o ensaio de Western blot, quecontempla o emprego de anticorpos contra a dita proteína, quereconhecem de maneira específica o resto de aminoácido ou oepítopo da proteína que se encontra fosforilado. As técnicaspara detectar restos fosforilados em proteínas são amplamenteconhecidas pelos especialistas versados na técnica e estãodisponibilizadas no estado da técnica.

Numa realização em particular, a dita proteína MAPKé uma cinase p38, tal como, uma p38 de mamífero, e afosforilação se efetiva no resto de Thrl23 presente na ditap38 de mamífero, isoforma a.

Em outro aspecto, a invenção se correlaciona com umcomposto capaz de se unir a uma proteína MAPK da invenção,e/ou capaz de detectar a dita proteína MAPK da invenção. Numarealização em particular, o dito composto é um anticorpocapaz de se unir e/ou detectar a dita proteína MAPK dainvenção.

Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo"pretende incluir tanto os anticorpos quiméricos ourecombinantes, como os anticorpos monoclonais e anticorpospoliclonais ou fragmentos proteolíticos dos mesmos, taiscomo, fragmentos, Fab ou F(ab')2, etc. Além disso, o ADN quecodifica para a região variável do anticorpo pode serinserido em outros anticorpos para produzir, deste modo,anticorpos quiméricos. Os anticorpos de cadeia sensível(scFv) podem ser polipeptídeos compostos por cadeiassensíveis, que possuem a capacidade própia de um anticorpo deunião a um antígeno e que compreendem um par de seqüências deaminoácidos homólogas ou análogas às regiões variáveis dascadeias curtas e pesadas de uma imunoglobulina (união VH-VLou scFv). Os polipeptídeos análogos às regiões variáveis dascadeias curtas e pesadas de um anticorpo podem se unir, casodesejado, através de um polipeptídeo de união. Métodos para aprodução de anticorpos são amplamente conhecidos pelosespecialistas versados na técnica e estão disponibilizados noestado da técnica.

De modo ilustrativo, o anticorpo proporcionado pelapresente invenção é um anticorpo capaz de se unir e/oudetectar um epítopo presente na dita proteína MAPK dainvenção. Numa realização em particular, a dita proteína MAPKda invenção é uma proteína p38 de mamífero, fosforilada em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da dita p38 demamífero, por exemplo, uma p38 de mamífero fosforilada emThrl23, ou um fragmento da dita proteína que compreende odito resto fosforilado. Numa realização concreta, o ditoanticorpo é capaz de se unir a um epítopo compreendido em umfragmento da cinase p38 de mamífero, compreendendo o ditofragmento, um resto de Thrl23 fosforilado, ou um restoposicionalmente equivalente (correspondente) em outrasproteínas MAPK. Em outra realização concreta, o ditoanticorpo é um anticorpo capaz de se unir ao epítopo quecompreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, epítopo altamente conservado ao largo da evolução, peloque a dita SEQ ID NO: 2 pode ser considerada como umaseqüência de consenso do dito epítopo entre as proteínashomólogas de p38 das diferentes espécies.

Numa outra realização em particular, o ditocomposto capaz de se unir a uma proteína MAPK da invenção éum composto que se une à dita proteína MAPK no novo sítio defosforilação identificado na presente invenção (quer dizer, aThrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou um resto de umaminoácido posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos] , ou na área que envolve o ditosítio, provocando o dito composto uma fosforilação reduzidada proteína MAPK no segmento de ativação e, por meio disso,impedindo a sua ativação e/ou atividade sobre seussubstratos, por exemplo, um composto que introduz uma carganegativa ou um resto volumoso no dito sítio de fosforilaçãou, então, na área que envolve o dito sitio. Exemploslustrativos, não-limitativos, do dito composto, incluem:

(i) um composto capaz de se unir à região de rotulamento("docketing") da p38 e capaz de imitar a introduçãode uma carga negativa (por exemplo, um grupofosfato) na dita região, por exemplo, a introduçãode uma carga negativa ou de um resto volumoso naThrl23 (ou na área que a envolve) da p38, isoformaa, de camundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ou naárea que envolve a dita Thr 123, impede a ativaçãoda dita proteína MAPK; ou

(ii) um composto capaz de se unir à região derotulamento da p38 e capaz de imitar a introdução deuma carga negativa (por exemplo, um grupo fosfato)na dita região, por exemplo, a introdução de umacarga negativa ou de um resto volumoso na Thrl23 (ouna área que a envolve) da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ou naárea que envolve a dita Thr 123, impede a atividadeda dita proteína MAPK com relação a seus substratos.Em outro aspecto, a invenção se correlaciona com oemprego do dito composto, capaz de se unir a uma proteínaMAPK da invenção e/ou capaz de detectar a dita proteína MAPKda invenção, para analisar o risco ou predisposição de umsujeito a desenvolver uma patologia mediada por uma MAPK naforma ativa, ou para avaliar ou monitorar o efeito de umaterapia administrada a um sujeito que apresenta a ditapatologia, ou para analisar o estado ou gravidade e/ou aevolução da dita patologia, assim como, na identificação decompostos potencialmente úteis para o tratamento da ditapatologia.

Em outro aspecto, a invenção se correlaciona com umvetor, um adiante vetor da invenção, que compreende:

(i) uma seqüência de ácido nucléico que codifica umcomposto que fosforila um sítio de fosforilaçãodiferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteínaMAPK, onde o dito sítio de fosforilação diferente éa Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou umresto de um aminoácido suscetível de fosforilaçãoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no ditosítio de fosforilação diferente impede a ativaçãoda dita proteína MAPK; ou

(ii) uma seqüência de ácido nucléico que codifica umcomposto que impede a fosforilação de um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK; ou

(iii) um composto que fosforila um sitio defosforilação diferente do sitio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK, onde dito sítio de fosforilaçãodiferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetívelde fosforilação posicionalmente equivalente emoutra proteína MAPK, tal como se define poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos,e a fosforilação em dito sítio de fosforilaçãodiferente impede a ativação da dita proteína MAPK;ou

(iv) um composto que impede a fosforilação em um sítiode fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK.

Numa realização em particular, a dita proteína MAPKé uma cinase p38 de mamífero e a fosforilação tem lugar em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da dita p38 demamífero, por exemplo, na Thrl23 de uma p38 de mamífero.

O vetor da invenção pode ser um vetor viral ou umvetor não-viral, os quais são conhecidos pelos especialistasversados na técnica, e podem ser utilizados em terapia, porexemplo, em terapia genética.Numa realização em particular, o vetor da invençãocompreende uma seqüência de ácido nucléico que codifica umcomposto que fosforila um sítio de fosforilação diferente dosítio ou sítios de fosforilação presentes no segmento deativação de uma proteína MAPK, onde o dito sítio defosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação posicionalmente eqüivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no dito sítio defosforilação diferente impede a ativação da dita proteínaMAPK ou, então, um composto que fosforila o dito sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteína MAPK, ondeo dito sítio de fosforilação diferente é a Thrl23 da p38,isoforma a, de camundongo, ou um resto de um aminoácidosuscetível de fosforilação, posicionalmente eqüivalente emoutra proteína MAPK, tal como se define por alinhamentomúltiplo de seqüências de aminoácidos, e a fosforilação nodito sítio de fosforilação diferente impede a ativação dadita proteína MAPK. A fosforilação no dito sítio defosforilação diferente produz a inibição da atividade da ditaproteína MAPK, pelo que o dito vetor da invenção pode serútil para o tratamento de patologias mediadas por MAPKs naforma ativa.

Numa outra realização em particular, o vetor dainvenção compreende uma seqüência de ácido nucléico quecodifica um composto que impede a fosforilação de um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteína ΜΔΡΚ, ou umcomposto que impede a fosforilação do dito sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteína ΜΔΡΚ, talcomo, por exemplo, um inibidor de uma cinase, tal como uminibidor da cinase GRK2, ou então, uma fosfatase, a qualdesfosforila o dito sítio de fosforilação. Ao impedir afosforilação do dito sítio de fosforilação, pode se promovera ativação da proteína MAPK, o que pode ser particularmenteinteressante para o tratamento do câncer, onda a existênciade proteínas MAPKs na forma ativa, após submeter um sujeito aradioterapia ou quimioterapia, conduz a morte de célulastumorais. Portanto, neste caso, o vetor da invenção pode serútil para o tratamento de patologias mediadas por MAPKs naforma ativa, em particular, do câncer.

Numa realização concreta do vetor da invenção, ocomposto que fosforila um sítio de fosforilação diferente dosítio ou sítios de fosforilação presentes no segmento deativação de uma proteína MAPK é uma cinase, ou um fragmentoda mesma funcionalmente ativo, capaz de desempenhar a funçãoprópia da dita cinase, por exemplo, a cinase GRK2 ou umfragmento funcionalmente ativo da mesma, que, como se divulgana presente invenção, fosforila o resto de Thrl23 presentenuma p38 de mamífero, tal como, a p38 de camundongo, do tipoisoforma a.Em outro aspecto, a invenção se correlaciona comuma composição farmacêutica, a qual compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz de:

(i) um composto que fosforila um sitio de fosforilaçãodiferente do sitio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteínaMAPK, onde o dito sítio de fosforilação diferente éa Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou umresto de um aminoácido suscetível de fosforilaçãoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no ditosítio de fosforilação diferente impede a ativação dadita proteína MAPK; ou

(ii) um composto que imita a fosforilação em um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK, onde o dito sítio de fosforilaçãodiferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetívelde fosforilação, posicionalmente equivalente emoutra proteína MAPK, tal como se define poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, ea fosforilação no dito sítio de fosforilaçãodiferente impede a ativação da dita proteína MAPK;ou

(iii) um composto que impede a fosforilação em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítiosde fosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína ΜΔΡΚ; ou

(iv)- um vetor da invenção; ou

(v) um composto capaz de se unir a uma proteína MAPK dainvenção, que se une à dita proteína MAPK no novosítio de fosforilação identificado na presenteinvenção, ou na área que envolve o dito sítio, odito composto provocando uma fosforilação reduzidada proteína MAPK no segmento de ativação e, por meiodisso, impede sua ativação e/ou atividade comrelação a seus substratos, por exemplo, um compostoque introduz uma carga negativa ou um resto volumosono dito sítio de fosforilação ou, então, na área queenvolve o dito sítio; ou

(vi) um composto capaz de se unir à região derotulamento da p38 e capaz de imitar a introdução deuma carga negativa (por exemplo, um grupo fosfato)na dita região, por exemplo, a introdução de umacarga negativa ou de um resto volumoso na Thrl23 (ouna área que a envolve) da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ou naárea que envolve a dita Thr 123, impede a ativaçãoda dita proteína MAPK; ou(vii) um composto capaz de se unir à região de

rotulamento da p38 e capaz de imitar a introdução deuma carga negativa (por exemplo, um grupo fosfato)na dita região, por exemplo, a introdução de umacarga negativa ou de um resto volumoso na Thrl23 (ouna área que a envolve) da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ou naárea que envolve a dita Thr 123, impede a atividadeda dita proteína MAPK com relação a seus substratos,junto com, opcionalmente, um veículofarmaceuticamente aceitável.

Numa realização em particular, a composiçãofarmacêutica da invenção compreende um composto que fosforilaum sítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK, tal como, uma cinase, ou um fragmento da mesmafuncionalmente ativo, capaz de desempenhar a função própia dadita cinase, por exemplo, a cinase GRK2, ou um fragmentofuncionalmente ativo da mesma. A dita cinase fosforila aThrl23 de uma p38 de mamífero.

Numa outra realização em particular, a composiçãofarmacêutica da invenção compreende um composto que impede afosforilação em um sítio de fosforilação diferente do sítioou sítios de fosforilação presentes no segmento de ativaçãode uma proteína MAPK.

Numa outra realização em particular, a composiçãofarmacêutica da invenção compreende um vetor da invenção.

Para sua administração na prevenção e/ou tratamentode uma patologia mediada por uma MAPK na forma ativa, oscompostos ativos (incluindo os vetores) são formulados em umacomposição farmacêutica apropriada, numa quantidadeterapeuticamente efetiva, junto com um ou mais veículos,adjuvantes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Exemplos de composições farmacêuticas incluemqualquer composição sólida (por exemplo, comprimidos,cápsulas, grânulos, etc.) ou líquida (por exemplo, soluções,suspensões, emulsões, etc.) para administração por qualquervia de administração apropriada, por exemplo, oral,subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, etc., tipicamente,por via oral, devido ao carater geralmente crônico da doençaa ser tratada.

Numa realização em particular, as ditas composiçõesfarmacêuticas podem se apresentar numa forma farmacêutica deadministração por via oral, ou então em forma sólida oulíquida. Exemplos ilustrativos de formas farmacêuticas deadministração por via oral incluem, comprimidos, cápsulas,granulados, soluções, suspensões, etc., e podem conter osexcipientes convencionais, tais como, aglutinantes,diluentes, desintegrantes, lubrificàntes, umectantes, etc., epodem ser preparadas por métodos convencionais. Ascomposições farmacêuticas também podem ser adaptadas paraadministração parenteral, em forma de, por exemplo, soluções,suspensões ou produtos Iiofilizados, esterilizados, na formade uma dosagem apropriada; neste caso, as ditas composiçõesfarmacêuticas incluirão excipientes adequados, tais como,tampões, tensoativos, etc. Em qualquer caso, os excipientesserão escolhidos em função da forma farmacêutica deadministração selecionada.

Uma revisão das diferentes formasfarmacêuticas de administração de fármacos e de suapreparação pode ser encontrada no livro "Tratado de FarmaciaGalénica", de C. Fauli e Trillo, 10a. Edição, 1993, Luzán 5,S.A. de Edições.

Em geral, a quantidade terapeuticamente efetiva docomposto (ou vetor) a ser administrado dependerá, entreoutros fatores, do sujeito que irá ser tratado, da gravidadeda patologia que padece o dito sujeito, da forma deadministração escolhida, etc. Por este motivo, as dosesmencionadas na presente invenção devem ser consideradasapenas como orientações para o especialista versado natécnica, este devendo ajustar as doses em função dasvariáveis citadas anteriormente. Não obstante, a composiçãofarmacêutica da invenção pode ser administrada uma ou maisvezes ao dia, por exemplo, 1, 2, 3 ou 4 vezes ao dia, em umaquantidade típica total diária compreendida entre 25 e 75mg/kg/dia.

A composição farmacêutica da invenção pode serutilizada junto com outros fármacos adicionais, úteis naprevenção e/ou tratamento das ditas patologias mediadas porMAPKs na forma ativa, para proporcionar uma terapia decombinação. Os ditos fármacos adicionais podem fazer parte damesma composição farmacêutica ou, alternativamente, podem serproporcionados em forma de uma composição separada, paraadministração simultânea ou não à composição farmacêuticaproporcionada pela presente invenção.

Em outro aspecto, a invenção se correlacionacom o emprego de:

(i) um composto que fosforila um sitio de fosforilaçãodiferente do sitio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteínaMAPK, onde o dito sítio de fosforilação diferente éa Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou umresto de um aminoácido suscetível de fosforilaçãoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no ditosítio de fosforilação' diferente impede a ativaçãoda dita proteína MAPK; ou

(ii) um composto que imita a fosforilação em um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK, onde o dito sítio defosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoformaα, de camundongo, ou um resto de um aminoácidosuscetível de fosforilação, posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, tal como sedefine por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos, e a fosforilação no dito sítio defosforilação diferente impede a ativação da ditaproteína MAPK; ou

(iii) um composto que impede a fosforilação em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítiosde fosforilação presentes no segmento de ativaçãode uma proteína MAPK; ou

(iv) um vetor da invenção; ou

(v) um composto capaz de se unir a uma proteína MAPK dainvenção, que se une à dita proteína MAPK no novosítio de fosforilação identificado na presenteinvenção, ou na área que envolve o dito sítio, odito composto provocando uma fosforilação reduzidada proteína MAPK no segmento de ativação e, pormeio disso, impede sua ativação e/ou atividade comrelação a seus substratos, por exemplo, um compostoque introduz uma carga negativa ou um restovolumoso no dito sítio de fosforilação ou, então,na área que envolve o dito sítio; ou

(vi) um composto capaz de se unir à região derotulamento da p38 e capaz de imitar a introduçãode uma carga negativa (por exemplo, um grupofosfato) na dita região, por exemplo, a introduçãode uma carga negativa ou de um resto volumoso naThrl23 (ou na área que a envolve) da p38, isoformaa, de camundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ouna área que envolve a dita Thr 123, impede aativação da dita proteína MAPK; ou

(vii) um composto capaz de se unir à região derotulamento da p38 e capaz de imitar a introduçãode uma carga negativa (por exemplo, um grupofosfato) na dita região, por exemplo, a introduçãode uma carga negativa ou de um resto volumoso naThrl23 (ou na área que a envolve) da p38, isoformaa, de camundongo, ou um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do ditocomposto no dito sítio de fosforilação Thrl23, ouna área que envolve a dita Thr 123, impede aatividade da dita proteína MAPK com relação a seussubstratos,

na elaboração de uma composição farmacêutica para otratamento de uma patologia mediada por MAPKs na forma ativa.

Numa realização em particular, "ò dito composto quefosforila um sítio de fosforilação diferente do sítio ousítios de fosforilação presentes no segmento de ativação deuma proteína MAPK, é uma cinase, ou um fragmento da mesmafuncionalmente ativo, capaz de desempenhar a função própia dadita cinase, por exemplo, a cinase GRK2, ou um fragmentofuncionalmente ativo da mesma, que fosforila a Thrl23 da p38,isoforma a, de mamífero (camundongo).

Em outro aspecto, a invenção se correlaciona com umkit que compreende uma proteína MAPK da invenção, ou umcomposto capaz de se unir e/ou detectar a dita proteína MAPKda invenção, conforme mencionado anteriormente.

Numa realização em particular, o kit proporcionadopela oresente invenção pode ser utilizado no diagnóstico deuma patologia mediada por uma MAPK na forma ativa, ou paradeterminar o risco ou predisposição de um sujeito adesenvolver a dita patologia, ou para avaliar ou monitorar oefeito de uma terapia administrada a um sujeito que apresentaa dita patologia, ou para analisar o estado ou gravidade e/oua evolução da dita patologia, assim como, na identificação decompostos potencialmente úteis para o tratamento da ditapatologia.

Numa realização concreta, a dita proteína MAPK éuma cinase p38 de mamífero, fosforilada na Thrl23 de uma p38de mamífero, isoforma a.

Em outro aspecto, a invenção se correlaciona com ummétodo de tratamento de uma patologia mediada por uma MAPK naforma ativa, cujo método compreende administrar a um sujeitoem necessidade de tratamento uma composição farmacêuticaproporcionada pela plresente invenção.

O exemplo seguinte ilustra a presente invenção, nãolimitando de nenhum modo o alcance da mesma.

Exemplo

Fosforilação da Thrl23 da proteína p38 mediante a enzima GRK2

I. Materiais e Métodos

Produtos

Todos os reagentes e produtos utilizados são degrau analítico. Cloretos de sódio, cálcio, amônio, manganês emagnésio, fosfatos de sódio e de potássio, carbonatos desódio, hidróxido de sódio, acetato de sódio, sacarose, uréia,Tris, formaldeído, paraformaldeido, glicina, ácido acéticoglacial, ácido clorídrico, metanol, etanol, butanol eglicerol foram supridos pela Merck. ATP (trifosfato deadenosina), fluoreto de sódio, ácido desoxicólico, EDTA(ácido etilendiaminotetraacético), EGTA (ácido etilenglicolbis(2-aminoetilenéter)-N-N-N'-N'-tetraacético) , β-mercaptoetanol, DTT (ditiotreitol), heparina, ortovanadatosódico, DMSO (dimetilsulfóxido), roxo Ponceau, HEPES (ácidoN-(2-hidroxietil)piperazin-N'-2-etanossulfônico), Nonidet P-40, Triton x-100, Tween-20, aprotinina, inibidor de tripsina,azida sódica, Proteína A-Sepharose, foram supridos pelaSigma. PMSF (fluoreto de fenil-metil-sulfonila) , benzamidina,glutationa reduzida, BSA (albumina de soro bovino) e osantibióticos ampicilina e canamicina, assim como, o IPTG(isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido), foram obtidos daRoche. TEMED (Ν,Ν,Ν,N-tetrametil-etilendiamina), SDS (dodecilsulfato sódico), perssulfato de amônio, azul de broraofenol,azul de Coomassie, padrões protéicos pretendidos de pesomolecular conhecido, papel de nitrocelulose e o reagente deBradford foram proporcionados pela Bio-Rad. 0 reagente deFolin-Ciocalteau foi obtido da Panreac e o TCA (ácidotricloroacético) da Carlo-Erba. O isótopo radioativo [γ-32Ρ]ATP foi proporcionado pela Amersham Biosciences e a misturade marcação metabólica [35S] metionina-cisteina foi supridapela New England Nuclear.

Construções e Plasmideos Empregados

Foram utilizados neste tópico os seguintesplasmideos:

GRKs

- a construção de pCMV-GRK3 de rato foi cedida pela Dra. S.Cotecchia, da Universidade Dausanne, Suiça.

as construções pCDNA3-GRK2 bovina, pCDNA3-GRK2-K220Rbovina, pCDNA3-GRK5 foram cedidas pelo Laboratório do Dr. J.L. Benovic, da Universidade Thomas Jefferson, Filadélfia,Estados Unidos.

- a construção pCEFL-ADNc anti-sentido de GRK2 foi enviadapela Dra. C. Shayo.

Módulo de MAPK p38

- o mutante constitutivamente ativo pCDNA3-MKK6D(E) (pCDNA3-MKK6D (Glu): MKK6S207E/T211E foi proporcionado pelo Dr. J. M.Redondo, do Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa(Madrid), que, além disso, facilitou a construção pCDNA3-Flag-p38a de camundongo e do vetor de expressão procarióticopGEX2T- ρ38α.

- os vetores pGEX4T-Mxi2 e pGEX4T-Mxi2A17, destinados àprodução de proteínas de fusão com GST, foram doados pelosDrs. P. Crespo e V. Sanz, da Universidade de Cantabria.

Outros

- o vetor inativo pCDNA3 é da Invitrogen.

- o plasmídeo pCEFL-EGFP foi proporcionado pela Dra. C. Murga(Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa).

- a construção pBC12BI-p2-AR foi cedida pela Dra. A. Ruiz-Gómez (Centro de Biologia Molecular Severo Ochoa).

- o mutante Raf-lYY340/34IDD foi proporcionado pelo Dr. A. S.Dhillon, Beatson Institute for Câncer Research, Glasgow, U.K.

- pTrcHisB foi obtido da Invitrogen.

Culturas Celulares

Linhas Celulares Establecidas

Foram utilizadas diversas linhas celularesestablecidas: as células HEK293 (rim embrionário humano)foram obtidas da Invitrogen, as células COS-7 (células de rimde macaco verde) e as células Sf9 (Spodoptera frugiperda) ,foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection). Ascélulas HEK2 93 e COS-7 cresceram em uma membrana sobre placasindividuais P-100, P-60 (Falcon) ou placas de múltiplos poçosΜβ, M12 ou M24 (Falcon, Costar) , no meio Eagle Modificadopela Dulbecco (DMEM), suplementado com glutamina 2 mM, sorofetal de bezerro a 10%, e uma mistura de antibióticos(gentamicina (50 pg/mL), estreptomicina (0,01%) e penicilinaG (0,063%) ) .

Do mesmo modo, foram empregadas duas culturasmassivas de expressão estável de GRK2, geradas a partir decélulas EBNA (derivada de HEK e transfectada com um plasmideoque codifica o ""antígeno EBNA) e do vetor pCDNA3-GRK2, comresistência à neomicina, razão pela qual foram cultivadas napresença de geneticina (200 pg/mL) (neomicina G418,Calbiochem).

A linha celular preadipocitica 3T3-L1, obtida daATCC, assim como, as linhas estáveis geradas a partir damesma, foram mantidas no médio DMEM, suplementado comglutamina e antibióticos e com 10% de soro de bezerroneonatal {new born calf serum, NCS). Em seguida, se adicionougeneticina (750 μg/mL) às populações estavelmentetransfectadas com pCDNA3-GRK2 e com pCDNA3-K220R. Ascondições de diferenciação com adipócitos são detalhadas maisadiante.

Todos estes tipos celulares foram incubados àtemperatura de 370C em uma atmosfera umidifiçada com 5-7% deCO2.

As células Sf9 cresceram em suspensão, numadensidade de 3xl05 células/mL, com agitação a 150 rpm, ou namembrana em placas P-100 ou P-150, no meio da Grace (Gibco) ,suplementado com 10% de soro fetal de bezerro e gentamicina(50 pg/ml), à temperatura de 27°C, sem atmosfera de CO2-

Foram obtidas culturas primárias de macrófagosmurinos e as mesmas foram mantidas utilizando protocolosconvencionais. Essencialmente, ratos C57BL/6 GRK2 +/+ e + /-,de 3 meses de idade, gentilmente doados pelo Dr. Marc Caron(Duke University, Carolina do Norte, USA) foram injetadosintraperitonealmente com tioglicolato sódico (1 mL) . Quatrodias depois, foram isolados macrófagos peritoneais medianteuma lavagem intraperitoneal com 15 mL de PBS. Foram separadasum milhão de células por poço sobre uma placa M12, e deixadasaderir em um meio RPMI, suplementado com 0,5% de soro fetalde bezerro (FCS), depois, lavadas de forma intensa. Osmacrófagos resultantes foram estimulados durante 16 horas àtemperatura de 37 0C em uma câmara umidif içada com asconcentrações determinadas de LPS de E. coli (Sigma) no meioRPMI, com 0,5% de FCS.

Transfecções

As transfecções transitórias das células HEK293 eCOS-7 se efetivaram em placas P-100 ou P-60, numa confluênciaentre 70 e 80%, pelo método de Lipofectamina/PLUS,(Invitrogen). Embora tenham se empregados protocolosalternativos de transfecção com reagentes como Fugene(Roche), JetPei (Poly Transfection) ou Escort-II (Sigma), oprocedimento mais utilizado foi o de lipofectamina.

Resumidamente, um dia antes da transfecção, foram plaqueadas1,5 χ IO6 células (HEK293) por P-60 ou, de formacorrelacionada, um número de células proporcional àsuperfície da placa empregada. A partir deste ponto, osprotocolos se referem a uma placa P-60. No dia seguinte, foipreparada uma mistura (1) de ADN plasmídico de alta pureza(isolado em colunas de afinidade supridas pela Quiagen e re-suspenso em água MilliQ estéril), (3-5 yg no caso de P-60),reagente PLUS (8 pL para P-60) e OPTIMEM (Gibco, BRL) , (250yL para P-60), que foi incubada por 15 minutos à temperaturaambiente. Em cada experimento se adiciona uma quantidade devetor inativo necessária (em geral, pCDNA3) para manterconstante a quantidade total de ADN por placa. Paralelamente,e em outro tubo, se mistura (2) a lipofectamina (12 pL paraP-60) com OPTIMEM (250 pL para P-60) e que é igualmenteincubada. Transcorridos 15 minutos, se misturam em proporçõesiguais (1) e (2), incubando-se o preparado por mais 15minutos e, finalmente, vertendo-se sobre as placas (misturade reação final: 0,5 mL para P-60), que previamente foramcobertas com OPTIMEM (2 mL por P-60). As células sãoincubadas a 370C no meio de transfecção durante 3 horas e nofinal deste tempo se retira o meio de transfecção,substituindo-se pelo meio DMEM suplementado com soro a 10%.No dia seguinte, se troca o meio por um meio fresco e sedeixa que as células se recuperem, pelo menos durante 24horas antes de processar a cultura para o experimento. Emgeral, os tratamentos e a re-coleta e Iise das células seefetivam nas 48 horas da transfecção.

GRK2 e p38MAPK

Nos experimentos de associação de GRK2 e Flag-p38ase empregou uma relação de 1:1:1 de GRK2 (o GRK2-K220R) ,Flag-p38a, e receptor p2-adrenérgico (geralmente 1 \iq de cadapor p60).

Nos ensaios de sobreexpressão de doses crescentesde GRK2, foram transfectadas células HEK293, espalhadasnormalmente em placas de múltiplos poços de 6 ou de 12 (M6 ouM12) com pCDNA3-Flag-p38a, pCDNA3-MKK6Cam, e com quantidadescrescentes do vetor pCDNA3-GRK2 (indicadas nas Figuras).Geralmente, para uma M6 se utilizam 100 ng de Flag-p38a, 100ng de MKK6CAMf e de 0 a 1 pg de GRK2. Em todos os pontos secompletava a quantidade total de ADN com pCEFL-EGFP e compCDNA3 inativo, em sustitução de pCDNA3-MKK6Cam, no caso dospontos de controle.

Nas transfecções de ADN anti-sentido de GRK2, emplacas de múltiplos poços M 6, as quantidades de ADNutilizadas foram algo diferentes: 150 ng de pCDNA3-Flag-p38a,50 ng de pCDNA3-MKK6Cam, e, de 0,5 yg a 2 pg do vetor pCEFL-GRK2 anti-sentido (AS), ou as mesmas quantidades de pCEFL-EGFP. Em todos os pontos se completou a quantidade total deADN com o vetor pCEFL inativo.

Nos ensaios de sobreexpressão análogos, foramtransfectadas transitoriamente as células em M6 e sempre emduplicata, com: 150 ng de pCDNA3-Flag-p38a WT, ou pCDNA3-Flag-p38a T123D e 50 ng de pCDNA3-MKK6CAM, (ou pCDNA3inativo).

A expressão transitória das diferentes proteínas seconfirmou por análise dos lisados celulares (aproximadamente10% do volume total do lisado celular) por imunodetecção,após eletroforese (Western blot) com anticorpos específicos,como se especifica em cada caso.

Tratamentos celulares

Os tratamentos de estimulação das célulastransfectadas transitoriamente se efetivaram em todos oscasos nas 48 horas da transfecção. Após a estimulação com osdiferentes agentes, as células foram lavadas em tampão defosfato salino (PBS) frio e foram colhidas com a ajuda de umraspador. O tampão de Iise no qual se recolhem as células,depende da imunoprecipitação específica que irá se realizar(ver detalhe separado da imunoprecipitação).

A estimulação de células HEK293 com isoproterenol(Sigma), 10 μΜ, se efetivou a uma temperatura de 37°C em ummeio de cultura sem soro. Nestes experimentos, foram mantidasas células sem soro (abstinência) durante umas 2 horas antesda estimulação, com o objetivo de minimizar os estímulosprocedentes de compostos presentes no soro.

A estimulação com NaCl 0,5 M (Merck) se realizoudurante 15 minutos na incubadora de células.

Diferenciação de Adipócitos

A cultura das células se realiza com o meio DMEM a10%, de soro NCS. Contudo, todo o proceso de diferenciaçãoque explicado em seguida se fará em um meio com soroempobrecido AXC (resina de intercâmbio iônico), mediantesucessivas adsorções do soro fetal de bezerro a uma resina deintercâmbio aniônico e a carvão ativo. O soro AXC foiproporcionado pelo serviço de cozinha do Instituto deInvestigações Biomédicas. As células são cultivadas até a suaconfluência e são plaqueadas (5 χ IO5 em P-100) no meio DMEM-10% AXC, suplementado com 4 μΜ de biotina (Sigma) . No diaseguinte, se substitui o meio por um meio fresco. As célulassão deixadas crescer durante três dias, mas, até que alcancemde novo a confluência, no dia que se denomina "0". No dia 0da diferenciação, as células são cultivadas em um meio quecontém: dexametasona, 0,5 μΜ (Sigma), 3-isobutil-l-metilxantina, 0,5 mM (IMBX, de Sigma) e insulina 1 μΜ(Sigma), onde permanecem por mais três dias. No dia 3 sesubstitui o meio deste tratamento iniciador da adipogênese,pelo meio DMEM-10% AXC, suplementado com 4 μΜ de biotina einsulina 1 μΜ, o qual irá transcorrer no resto dadiferenciação, fazendo-se a substituição do meio a cada trêsdias. A partir do dia 6 e até o 15, se analizou aadipogênesis por médio de tingimento com Oil Red, coranteroxo de composição lipofilica que se une às gotas de gorduraque os adipócitos acumularam em seu citoplasma. Para isto, sefixam as células com formol (formaldeido a 3,7%) durante 5minutos e se lavam com PBS frio. Depois, se incuba com umasolução previamente filtrada 60:40 (v/v) de Oil Red(dissolvida em isopropanol 0,2% p/v) e água. Em seguida, selava de forma abundante com PBS e se visualizam as células emum microscópio óptico. Então, se procede à recontagem dascélulas em um total de 25 campos por cada placa experimental.

Geração de Mutantes

Mutantes Pontuais

A maioria dos mutantes foram gerados mediante oprotocolo de mutagênesis dirigido de QuickChange, daStratagene. Resumidamente, foram feitos os oligos mutagênicosantiparalelos, que, a seguir, são descritos para cada mutanteem particular, com os quais se efetivou a reação em cadeiapor polimerase (PCR) em um termociclador (Gene Amp® 9700, daApplied Biosystems), empregando como polimerase termoestávelPfu. Os vetores inteiramente amplificados foram dirigidos comDpnI para eliminar o ADN ou molde parental e o produto dadigestão se transformou em bactérias competentes, a partirdas quais se pôde comprovar a incorporação da mutação, porseqüenciação no SIDI (Serviço Interdepartamental deInvestigação) com oligonucleótidos cevadores específicos decada tipo de plasmideo (Sp6, T7, T3, ou os específicos para aseqüenciação de proteínas clonadas em vetores pGEX).

p38T123A

- oligo FWD: 5' GTG AAG TGC CAG AAG CTG GCC GAC GAC CAC GTTCAG 3' (SEQ ID NO: 3);

- oligo REV: 5' CTG AAC GTG GTC GTC GGC CAG CTT CTG GCA CTTCAC 3' (SEQ ID NO: 4);

Os produtos PCR mutagênica se seqüenciarão com osoligonucleotídeos cevadores SP6 e T7, que flanqueiam a ORF(marco aberto de leitura) de p38 em pCDNA3 ou com osoligonucleotídeos específicos para a seqüenciação da série deplasmídeos pGEX, da Amersham.

p38T123D

- oligo FWD: 5' GTG AAG TGC CAG AAG CTG GAC GAC GAC CAC GTTCAG 3' (SEQ ID NO: 5);

- oligo REV: 5' CTG AAC GTG GTC GTC GTC CAG CTT CTG GCA CTTCAC 3' (SEQ ID NO: 6);

Mutantes Truncados

A proteína truncada GST-280-360p38 foi gerada deforma correspondente aos 80 últimos aminoácidos de p38a,utilizando o sistema de Gateway, da Invitrogen. Estepolivalente método de clonagem, mediante recombinases,permite a expressão da proteína ou do fragmento protéico deinteresse em um grande número de plasmídeos para hóspedes,tanto eucarióticos, como procarióticos, e com variadosepítopos. São juntados esquemas explicativos das etapas quese seguiram: geração do vetor de entrada (entry clone) eobtenção do plasmideo de expressão com GST.

Em primeiro lugar, foi necessário o modelo dosoligonucleotideos que permitissem incorporar as seqüênciasattB, branco das recombinases, flanqueando a região da ORF dep38a que se quer traduzir. Se denominam GTW, de Gateway. Emnegrito, se destaca a seqüência que depois será reconhecidapela recombinase BP. 0 oligo GTW-FWD foi feito de maneira queo primeiro aminoácido de p38 a traduzir (Ala 281, sublinhadona seqüência nucleotidica) estivesse em fase com a seqüênciaattBl. 0 oligo GTW-REV incorpora o códon de terminação datradução (também sublinhado). Na PCR, se utilizou o plasmideopGEX2T-p38a como molde.

- oligo GTW-FWD: 5' GGG GAC AAG TTT GTA CAA AAA AGC AGG CTTCGC TGT CGA CCT ACT GGA GAA GAT G 3' (SEQ ID NO: 7);

- oligo GTW-REV: 5'GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTCTCA GGA CTC CAT TTC TTC TTG GTC 3' (SEQ ID NO: 8);

A clonagem do produto da PCR, de 240 pb no vetorpDONOR™201, se realizou mediante a reação BP-clonase(durante pelo menos 1 hora, à temperatura de 25°C),consistente na recombinação, mediada pelas seqüências attB,do produto da PCR com o vetor pDONOR. A reação se detém, aose adicionar Proteinase-K durante 10 minutos, a umatemperatura de 37°C. 0 ADN, produto da recombinação, seutiliza para transformar bactérias DH5a, que sãoselecionadas com canamicina.Em seguida, foi escolhido o plasmídeo de destino:pDEST15 que garante a expressão procariótica da proteína noclonado, como fusão, em fase, desde as seqüências derecombinação, a GST. (Também, se introduziu o fragmento determinal-C de p38 no plasmídeo de expressão eucarióticapDEST27, porém, os ditos resultados foram omitidos). A reaçãoLR-clonase se realiza utilizando o clone de entrada (pDONOR-280-360p38) e o vetor: pDEST15 linearizado, incubando-se coma mistura enzimática LR-clonase durante 1 hora a umatemperatura de 25°C. A reação se detém incubando-se a amostracom Proteinase-K, durante 20 minutos à temperatura de 370C eo ADN obtido, após pertinente comprovação por seqüenciaçãocom os oligos attB, se utilizou para transformar bactériasBL21, a partir das quais se purificou a construção GST-280-360 p38.

Subclonagens de ADN

Para a expressão e purificação de MAPKAPK2 (MK2)com uma cola de histidina de terminal-C, se obteve oplasmídeo pFtx5-MK2DNl, deletado numa região rica em prolinado extremo terminal-N, de modo a se obter uma expressão maisestável, através da provisão do Dr. Phil Cohen (University ofDundee, Escócia, UK) e se utilizou como molde em uma reaçãopor cadeia de polimerase (PCR), utilizando os iniciadores:5' GGG GCC ATG GTC TVAG TCC GGC C 3' (SEQ ID NO: 9); e5' CCCC CTC GAG GTG GGC CAG AGC CGC AGC 3' (SEQ ID NO: 10) .

0 produto foi subclonado em NcoI-XhoI (em negrito)no vetor pTrcHis2B (Invitrogen).Proteínas e Peptídeos Recombinantes Purificados

A MEKK6/MEKK3 ativada foi proporcionada pelaUpstate. A purificação de GRK2 se efetivou pela Dra. A. Ruiz-Gómez, a partir de células Sf9 infectadas com construções deGRK2 em baculovirus.

A rodopsina se purifica a partir de retinas bovinasconforme métodos convencionais. Assim, é obtida umapreparação na qual a rodopsina supõe mais de 90% da proteína(evidenciado por tingimento com azul de Coomassie).

As proteínas de fusão GST-p38, GST-ATF2, GST-MEF2A,GST-Mxi2, GST-MxiA17 e GST-280-360p38, GST-p38T123A ep38Tl23D se purificaram conforme métodos padrões quedescreveremos resumidamente: se transformam as ditasconstruções em bactérias E. coli e se induz a sua expressãocom IPTG. As bactérias se sedimentam e são lisadas em Tris-HCl, 10 mM, pH 8, Triton X-IOO a 1%, lisozima, 2 mg/mL einibidores de proteases, após o que o lisado bacteriano sesonifica e clarifica. Em seguida, se introduz na colunaglutationa-Sepharose4B® (Amersham Biosciences) e se passadurante um mínimo de 3 horas, lavando-se a columna com PBS edepois, se eluindo as proteínas com Tris-HCl, 50 mM, pH 8,glutationa reduzida, 5 mM (Sigma). A pureza é comprovada e aconcentração das proteínas é obtida em géis desnaturalizantesde poliacrilamida-SDS. A origem dos plasmídeos que codificamestas proteínas se especifica no detalhe separadoanteriormente, ou se são de geração própia, se consigna deonde procede.

Os substratos específicos de p38, como MBP(proteína basica de mielina) ou PHAS-I (proteína fosforiladapor calor e ácido, estável, regulada por insulina) foramobtidos da Sigma e da Stratagene, respectivamente. O peptídeoAPRTPGGRC, descrito como substrato específico de MAPKsutilizado em reações de fosforilaçâo com a cinase p38, foisintetizado pelo Serviço Proteômico do CBMSO. A dissoluçãofoi feita numa concentração final de 0,5 mM, em Tris 20 mM,em pH 7,6.

A determinação de proteínas se realizou pelo métodode Bradford ou pelo método de Lowry e outros, utilizandoalbumina de soro bovino como padrão para construir a retapadrão.

Eletroforese

Eletroforese em géis de poliacrilamida-SDSGéis Unidimensionais

Foram utilizados géis de poliacrilamida-SDS,conforme o método descrito por Laemmli, cujas percentagens deacrilamida-bisacrilamida variaram entre 7 e 12%, em função daresolução requerida pelo experimento. Como padrões de pesomolecular foram empregadas as proteínas: miosina (200 kDa) ,β-galactosidase (116,25 kDa), fosforilase B (97,4 kDa),albumina de soro bovino (66,2 kDa), ovoalbumina (45 kDa),anidrase carbônica (31 kDa), inibidor de tripsina de soja (21kDa) e lisozima (14 kDa) (Rainbow Markers, da Bio-Rad) . Emalguns casos, os géis foram tingidos com azul de Coomassie.Após decompor as proteínas, o gel pode ser submetido à auto-radiografia, caso as proteínas estejam marcadas com [γ-32PJATP, ou à fluorografia, caso as proteínas estejammarcadas com [35S]-metionina. Em ambos os casos, se requeruma etapa de fixação em metanol:acético (50:10), durante 20minutos. Nas marcações metabólicas, freqüentemente, serecorreu à amplificação do sinal, incubando-se durante 20minutos com Amplify (Amersham) para, depois, secar o gel eexpô-lo com uma pelicula de raios X, Agfa Curix RP2 de 100NIF.

Géis Bidimensionais

Com o objetivo de analisar o número de resíduos dosubstrato da fosforilação por GRK2 em p38, se incubaram ambasas proteínas nas condições de reação que são especificadasadiante. As fosfo-proteínas resultantes foram decompostas emgéis bidimensionais. 0 isoeletro-enfoque ou primeira dimensãoeletroforética foi produzido se utilizando uma misturaresolutiva de anfólitos (BioRad), de faixa final de pH de 3-10, em um gel de acrilamida/bisacrilamida a 4%, com uréia, 8M. Em certas ocasiões, a primeira dimensão se realizou demaneira alternativa, empregando-se as tiras previamenteespalhadas da Biorad (IPG Strips, de faixa de pH 3-10). Asegunda dimensão foi efetivada em um gel a 8% (SDS-PAGE) e asfosfo-proteínas foram detectadas por auto-radiografia.

Eletroforese de Ácidos Nucléicos em Géis de Agarose-TAE

A separação de fragmentos de ADN se realizou emgéis de agarose de desenvolvimento horizontal, 0,8-1%. 0tampão de eletroforese utilizado foi TAE (Tris-acético 40 mM,EDTA 2 mM) e o tampão de carga das amostras foi glicerol a50%, EDTA 1 mM, azul de bromofenol a 0,4% e azul de xileno a0,4%. Os padrões de peso molecular foram os fragmentos dadigestão enzimática com HindIII dos fagos e Φ29 (supridospelo Serviço de Fermentação do Centro de Biologia Molecular).

Seqüenciação Proteômica

A determinação da ubicação da modificação pós-traducional de interesse, foi realizada pelo ServiçoProteômico do Nódulo UAM (Universidade Autônoma de Madrid) daRed Cardiovascular, englobado dentro do Serviço Proteômico doCentro de Biologia Molecular Severo Ochoa(http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt_Servicio_Pagina.aspx?IdServicio=29&IdObjeto=118).

As amostras foram separadas eletroforeticamente(SDS-PAGE a 8%) e o gel é tingido, prestando-se especialatenção nas etapas de manipulação, para minimizar ascontaminações com queratinas, que são proteínas muitoabundantes no entorno. As faixas a analisar são recortadas dogel de poliacrilamida e são submetidas à digestão tríptica(tripsina da Promega).

A mistura de peptídeos trípticos é analisada porMALDI-TOF: (Sigla do Inglês: Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization - Time of Flight, modelo Autoflex, daBroker). Em resumo, as espécies peptídicas são adsorvidas porcristalização em uma matriz, após o que, e mediante aincidência de pulsos curtos de um laser, são desunidas naforma protonada. Este método de ionização da amostra estáacoplado a um analizador de tempo de saque. Com efeito, ospeptídeos monocarregados adquirem uma energia cinéticaproporcional à sua massa e "são sacados" por um tubo vazioaté se chocar com o detector. Uma pequena fração (0,5 μΐι) dosobrenadante da digestão foi analisada diretamente em umespectrômetro de massa, do tipo MALDI-TOF, modelo Autoflex,da Bruker, equipado com refletor, empregando DHB (ácido 2,5-diidroxibenzóico) como matriz e uma superfície Anchor-Chip(Bruker) como porta-amostras. 0 espectro obtido correspondefinalmente aos peptideos separados em função da relaçãomassa-carga (m/z). Os espectros de fragmentação de GST-p38 ede GST-p38 fosforilada por GRK2 foram quantificados e seencontrou um peptídeo candidato.

Para corroborar neste aspecto, as amostras foramsubmetidas a outro tipo de análise espectrométrica, quepermite a obtenção de espectros de fragmentação (MS/MS) depeptideos individuais: ionização por eletrospray, acoplada àmarcha iônica (ElectroSpray/Mass Spectrometry - Ionic TrampES/MS-IT, modelo Deca-XP, da Thermo-Finnigan, San José,Califórnia, USA) . Antes da ionização e pelo fato desta poderser efetuada em um capilar, quer dizer, com amostraslíquidas, o peptídeo candidato foi separado (previamente"suspeito" pelo método de MALDI-TOF), mediante RP-HPLC(cromatografía líquida de alta pressão em fase reversa). Foiempregada uma coluna de 180 μπι de diâmetro interno (0,18 mm χ150 mm, BioBasic 18 RP Column, da Thermo-Keystone) em ümfluxo de 1,5 pL/m em modo de micro-spray com uma interface"metal needle-kit" (Thermo-Finnigan), com um gradiente de 5%a 60% de solvente B, para a eluição (90 minutos) dospeptideos. A cromatografia está acoplada ao espectrômetro demassa de marcha iônica. Neste proceso de fragmentação, asamostras são submetidas a um intenso campo elétrico, tendocomo resultado a geração de gotas carregadas, que, apósevaporação do solvente, acabam emitindo ions correspondentesaos peptideos da mistura da amostra. Estes podem estarmultiprotonados, preferivelmente, no extremo terminal-N e nosresíduos de histidina, arginina e lisina. O analizador demarcha iônica gera um campo elétrico tridimensional, quepermite separar os ions procedentes da ionização poreletrospray. Assim, finalmente, se obtém um espectro defragmentação ou espectro MS/MS que, ao trabalhar "em modoSIM" (Monitoração de Ions Isolados), se limita ao espectro defragmentação do peptídeo candidato. As amostras serãoanalisadas em um modo de alta sensibilidade ou modo "SIM",monitorando-se as seguintes m/z: 937,51 e 977,51. Apósrealizar uma suposição teórica das séries de fragmentação dopeptídeo, "supostamente" fosforilado, se atribuem váriosfragmentos das séries "b e y" ao espectro obtido.

Imuno-protocolos

Na Tabela I são apresentados os anticorpos primáriosutilizados.

Imunodetecção após eletroforese ("Imunoblot ou Western blot")As amostras para a análise (proteínas purificadas,lisados ou frações subcelulares, etc.) são decompostas emgéis de poliacrilamida-SDS, junto com os padrões de pesomolecular comercial (Bio-Rad). As proteínas assim separadasse transferem para um filtro de nitrocelulose (Transblot, daBio-Rad) mediante transferência líquida em tampão decarbonato (Na2CO3 3 mM, NaHCO3 10 mM, 20% metanol, pH~10)durante 75 minutos (a 50 V, no caso de géis de 12 χ 14 cm,utilizando Trans-Blot Cell, da Bio-Rad, ou então a 30 V,durante 120 minutos). Após tingir a membrana de nitrocelulosecom roxo Ponceau, se incuba durante toda a noite àtemperatura de 4 0C em um meio TBS (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5,NaCl 150 mM) suplementado com leite em pó desnatado (Molico)a 5% ou BSA a 5%, com o objetivo de bloquear os possíveissítios de união inespecífica. Após descartar o meio debloqueio, a membrana é colocada em contacto com o anticorpocorrespondente, diluído (Tabela I) em TBS-BSA 1%. Antes de seincubar com o segundo anticorpo (anti-imunoglobulina decoelho unido a peroxidase, quando o primeiro anticorpo forpoliclonal, e anti-imunoglogulina de camundongo para osanticorpos monoclonais; ambos da Nordic Immunology) diluído1:50.000, se lava a membrana três vezes (3 χ 10 minutos) comTBS-Tween 20, a 0,15%. Finalmente, para a revelação seutiliza um método quimioluminescente, em que a peroxidasecatalisa a oxidação do substrato luminol na presença de H2C>2(ECL, Amersham). A quantificação se realiza por densitometriaa laser das películas expostas (Molecular Dynamics 300A,Computing Densitometer).

Foi gerado soro anti-fosfo-Thrl23p38 policlonal emcoelhos, procedente da Pacific Immunology, utilizando opeptídeo QKLpT DDHVQ FLIYC, da proteína p38a de camundongo,como imunógeno, e, posteriormente, se purificou mediante duasetapas em série, através de colunas de afinidade de peptídeoe anti-fosfo peptídeo. 0 anticorpo anti-His foi adquirido daSigma.Determinação da atividade de p38 e de ERK

A determinação do grau de atividade de p38 e de ERKtransfectadas, promovida pelos diferentes estímulosativadores se realizou por um método de imunodetecção. Foramutilizados anticorpos específicos que reagem somente com aforma fosforilada e ativada destas cinases (anti-fosfop38 eanti-fosfoERKs, respectivamente (ver descrição na tabela deanticorpos).

As células HEK293, são geralmente submetidas àabstinência (meio sem soro) de duração variável: de 2 horas,no caso da p38, e toda a noite, no caso da ERK, seestimularam e, após o processamento dos lisados celulares, seefetivou a imunodetecção das fosfoproteínas com os anticorposfosfo-específicos dos segmentos de ativação de ambas asproteínas. Após a revelação desta primera imunodetecção, oscomplexos imunes foram despreendidos com o tampão: SDS a 2%,β-mercaptoetanol 100 mM, Tris HCl 62,5 mM, pH 6,7 e seprocedeu à reincubação das membranas com os anticorpos anti-p38 ou anti-ERK totais. A quantificação das bandas serealizou em um densitômetro a laser. Em todos os casos, osvalores obtidos para as bandas detectadas com o anticorpoanti-fosfo-proteína se normalizaram em relação à quantidadetotal de p38 ou ERK expressas nas células. Desta forma serepresenta o aumento de estimulação das diferentes cinasescom relação às condições basais. Em alguns casos, entretanto,dado o risco de interferência do primeiro revelado nosegundo, se avaliou a ativação mediante densitometria de duasmembranas diferentes, reveladas separadamente, uma com oanticorpo fosfo-específico e a outra com o anticorpo contra aproteína total.

Imunoprecipitação

As amostras ou lisados celulares totais irão sersubmetidos à imunoprecipitação se diluem em diferentestampões suplementados com inibidores de proteases (STISoybean Tripsin Inhibitor) e benzamidina 100 yg/mL, PMSF 200pg/mL e aprotinina 10 μg/mL). Os tampões irão variar conformeo anticorpo utilizado em cada caso, como se especifica emseguida. Em todos os casos, após deixar a Iise transcorrerdurante um mínimo de 1 hora a 4 0Cf em agitação, as amostrasserão centrifugadas (24000 xg) e se tomarão frações(aproximadamente de 10%) para confirmar a expressão deproteínas específicas. À amostra restante foi adicionado BSA(500 yg por p60) e a quantidade de anticorpo correspondenteem cada caso. Todas as imunoprecipitações se desenvolveram àtemperatura de 40C durante toda a nite. No dia seguinte, seadicionaram 30 yL a 50% de proteína A-Sepharose (Sigma) ou aproteína G-Sepharose (Zymed), conforme o anticorpo tenha sidopoliclonal ou monoclonal, respectivamente, e se incubou a 4°Cdurante mais 90 minutos. Esta etapa foi omitida quando osanticorpos estavam covalentemente unidos às resinas, em cujocaso se adicionou 5-10 yL da "imuno-resina". Se recolheram oscomplexos imunes por centrifugação e, após descartar osobrenadante, se lavaram 3-5 vezes (800 xg, 5 minutos) com10-15 mL de um tampão de lavagem.Quando o destino dos imunoprecipitados eram reaçõesde fosforilação, estas se lavaram mais duas vezes (2 χ 10-15mL) com o tampão de incubação da mesma, sem ATP.

As proteínas imunoprecipitadas foram novamentesuspensas em um tampão de ruptura de eletroforese e,geralmente, foram fervidas durante 5 minutos, para depoisintroduzir toda a amostra em um gel de poliacrilamida-SDS, depercentajem adequada.

Tampão RIPA (Sigla do Inglês: " radioimmunoprecipitationassay")

Este tampão de solubilização foi amplamenteutilizado, especialmente nas imunoprecipitações das GRKs:NaCl 300 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, Nonidet P-40 2%, ácidodesoxicólico 1%, e SDS 0,2%.

Tampão de Imunoprecipitação "M2 anti-flag"

Para as imunoprecipitações com o anticorpo M2 anti-flag, as células foram colhidas em: tampão de fosfato sódico10 mM, pH 7,4 (preparado a partir de soluções matriz deNaHPO4 e NaH2PO4 0,1 Μ) , NaCl 150 mM e 1% de n-dodecil-β-Ο-maldósido. Após a lise, se completa até 300 (por placa

p60) com o tampão salino composto de Tris-HCl 20 mM; NaCl 150mM e inibidores de protease. Finalmente, os lavados dosimunoprecipitados são feitos no tampão composto por: Tris-HCl50 mM, pH 7,5, MgCl2 20 mM, 1% Tritón X-I00, EDTA 1 mM, MgCl21 mM, NaF 15 mM, Pirofosfato 20 mM.

Experimentos de Precipitação ("pull-down")As proteínas GST, GST-p38wt, GST-p38T123A e GST-p38T123Dforam expressas em bactérias e isoladas utilizandoGlutationa-Sefarose 4B (GE-Amersham), conforme osprocedimentos convencionais (Murga, C. et al., "High affinitybinding of beta-adrenergic receptor kinase to microsomalmembranes; Modulation of the activity of bound kinase byheterotrimeric G protein ativation"; J. Biol. Chem. 271, 985-994 (1996)). His-MAPKAPK2 foi purificado utilizando umaresina Probond (Invitrogen), seguindo as indicações dofabricante. MKK6Cam foi comprado da Upstate Biotech. Aquantidade de proteínas detalhada na legenda de cada figurase incubou em um tampão de unão (Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl0,25 M, MgCl2 10 mM, NaF 5 mM e 0,5% de BSA) durante 30minutos a 30°C, com agitação constante. Se adicionou ATP (50μΜ) para precipitar MAPKAPK2. Os precipitados foram lavados 3vezes (10 mL) com o mesmo tampão contendo 0,5% de TritonXlOO. Os complexos precipitados foram decompostos medianteSDS-PAGE e foram revelados mediante o procedimento de WesternBlot.

Ensaios de Fosforilação

Fosforilação in vitro de Proteínas RecombinantesFosforilação de p38 por GRK2

Foram incubadas GST-p38 e GRK2 recombinantes (ambaseqüimolares, a 25-150 nM, salvo nos experimentos de cálculodos parâmetros cinéticos e nos que se especificam) no tampãode fosforilação de p38 (Hepes 25 mM, pH 7,5, acetato demagnéesio 10 mM, ATP 50 μΜ, [γ-32Ρ] ATP 2000-3000 cpm/pmol)em um volume final de 40 μΐϋ. Normalmente, as reações defosforilação se deixam transcorrer durante 30 minutos a umatemperatura de 30°C. No caso das eletroforeses bidimensionaisou das amostras destinadas à seqüênciaçãO proteômica, areação perdura até 1 ou 2 horas.

Os compostos de heparina e SB203580 (Calbiochem),inibidores de GRK2 e de p38, respectivamente, se utilizaramem concentrações de dez vezes da IC5o, para assegurar acompleta inibição de caminhos das cinases, isto é, a 1,5 μΜpara a heparina e a 0,5 μΜ para o SB. Os substratosempregados foram MBP (14 μς por ponto) ou PHAS-I, a umaconcentração final de 25 ng/μΐ, para p38 e caseina (7,5 μg porponto) para GRK2.

O processamento das amostras após interrupção dafosforilação é idêntico aos casos anteriores, salvo que adecomposição das proteínas se faz em um gel (SDS-PAGE) a 8%.

As proteínas de fusão, a GST, p38a, Mxi2, Μχί2Δ17 e280-360 p38 (0,5 μg de cada uma delas) se incubaram com GRK2recombinante (200 nM), em um tampão de fosforilação (Hepes 25mM, pH 7,5, acetato de magnésio 10 mM, ATP 50 μΜ, [γ-32Ρ] ATP2000-3000 cpm/pmol) durante 30 minutos, a uma temperatura de30°C. A heparina foi incluída (150 nM) como inibidorespecífico de GRK2. As reações foram interrompidas através daadição de um tampão de ruptura com SDS. As amostras foramdecompostas em SDS-PAGE a 8%. Com o objetivo de garantir ainclusão de quantidades idênticas de proteína, primeiro sevisualizaram as mesmas no gel por tingimento com Azul deCoomassie. Em seguida, o gel foi seco e se detectou aradioatividade incorporada nas proteínas (32P).Os mutantes pontuais de p38 no hipotético sitio defosforilação por GRK2 (T123) foram gerados e purificados comodescrito anteriormente e foram submetidos à fosforilação porGRK2 no tampão de fosforilação de p38 (Hepes 25 mM, pH 7,5,acetato de magnésio 10 mM, ATP 50 μΜ, [γ-32Ρ] ATP 2000-3000cpm/pmol), em um volume final de 40 pL. A concentração foivariada em relação à (10-80 nM) de GRK2 e das isoformas dep38, tal como se resume nas Figuras.

Fosforilação de p38 por MKK6cm

Foram realizados ensaios de fosforilação (Hepes 25mM, pH 7,5, acetato de magnésio 10 mM, NaF 15 mM, ATP 50 μΜ e[γ-32Ρ]ΑΤΡ 1000-2000 cpm/pmol) in vitro, com as proteínas defusão GST-p38 WT, GST-p38 T123A e GST-p38 T123D (150 nM) comosubstratos de fosforilação de MKK6Cam (40 ng) recombinante(Upstate Biotechnology) . Como nos casos anteriores, asreações se deixaram transcorrer a uma temperatura de 30°Cdurante 30 minutos e se separaram as proteínas em géis SDS-PAGE a 8%. Com o objetivo de garantir a inclusão nos ensaiosde quantidades idênticas de proteínas p38, as mesmas foramvisualizadas nos géis por tingimento com Azul de Coomassie.Em seguida, se determinou a radioatividade incorporada emcada isoforma de p38.

Fosforilação do Peptídeo APRTPGGRR por p38

A partir de células HEK293, são imunoprecipitadasFlag-p38alpha com M2Anti-Flag-agarose. Os imunoprecipitadossão lavados três vezes com 10-15 mL de tampão M2 e duas vezescom outros tantos volumes de tampão equilibrado dafosforilação (NaF 15 mM, Hepes 25 mM. pH 7,5 e acetato demagnésio 10 mM). Na última lavagem, novamente se suspendem oscomplexos imunes-agarose em 1 mL de tampão e se separa 10% de"cada ponto (100 μΐ,) para controlar a imunoprecipitação deFlag-p38. Com a Flag-p38 imunoprecipitada restante seefetivam ensaios de cinase, utilizando como substrato opeptideo APRTPGGRR. As reações se realizaram em um volumefinal de 25 μ]1, em um tampão de fosforilação composto porHepes 25 mM, pH 7,5, acetato de magnésio 10 mM, NaF 15 mM,ATP 50 μΜ e [γ-32Ρ]ΑΤΡ 500-1000 cpm/pmol e 1-2 mM do peptideosubstrato. Quando se especifica, se adiciona SB203580 àreação in vitro, a uma concentração final de 0,5 μΜ. Se deixatranscorrer a fosforilação durante 30 minutos a umatemperatura de 30°C, após o que se interrompe mediante adiçãode 15 yL de TCA a 30%. As proteínas são precipitadas porcentrifugação (25.000 xg, 15 minutos, 4°C) e se recupera, decada reação, o sobrenadante que contém o peptideofosforilado. Recortes quadrados (1 cm χ 1 cm) de papelWhatman P81 são impregnados com o peptideo em solução.

Depois, são deixados secar e são lavados de forma abundantecom ácido fosfórico 75 mM e, finalmente, se quantifica aradioatividade incorporada pelo peptideo adsorvido, atravésde quantificação da radiação de Cerenkov. A atividade da p38sobre este peptideo se refere, em cada caso, à radioatividadebasal (o fundo) que se detecta nos pontos correspondentessomente ao peptideo.

Fosforilação de substratos de ATF2 e MEF2A por p38

As formas de ATF2 e MEF2A unidas à GST foramutilizadas para comprovar a atividade catalítica de GST-p38.Na maioria dos casos, se empregaram 2 yg de GST-ATF2 ou GST-MEF2A, de produção própria. As condições de fosforilação sãoas mesmas que as expostas nos casos anteriores. Não obstante,em outras ocasiões, conforme descrito de forma pertinente nasFiguras, se empregaram 0,2 yg de substrato e se deixoutranscorrer a reação de fosforilação somente durante 15minutos.

Comparações de Seqüências

Alinhamentos dos Ortólogos e Isoformas de p38

Os alinhamentos múltiplos que são apresentadosforam feitos com o programa ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/Biolnfo/ClustalX/) e ajustados manualmentemediante a introdução de descontinuidades (gaps) pelo Dr.Perdiguero, do Centro Nacional de Investigações Oncológicasde Madrid.

Tratamento Matemático e Estadistico dos Dados

Os experimentos se realizaram, no mínimo, duasvezes e, em geral, os pontos se duplicaram ou triplicaram. Osdados são expressos por meio de desvio padrão da média(±SEM).

Para os cálculos das constantes cinéticas dasreações enzimáticas, se assumiu o comportamento de Michaelis-Menten das cinases. Os gráficos foram feitos com o programa"Kaleidagraph", dotado de um algoritmo capaz de deduzir osparâmetros cinéticos: constante de Michaelis-Menten (Km) evelocidade máxima (Vmax=Vo (nmol de PO43" incorporado.mg deenzima^minuto"1)A análise estatística se realizou mediante o "TesteT de Student bilateral" (de duas colas) e n-1 graus deliberdade, onde a hipótese nula é que não existe diferençasignificativa entre a situação ou condição cuja significânciaestatística queremos determinar e a situação controle oubasal. O valor correspondente à probabilidade do cumprimentoda hipótese nula (p) obtido em cada caso variou de p<0,001 oup<0,0001, como se apresenta detalhado nas Figuras.

II. RESULTADOS

Interrelações funcionais entre GRK2 e p38MAPK.p38 se fosforila por GRK2

Os perquisadores da presente invenção estudaram osmecanismos que regem a modulação da atividade de GRK2 e suaexpressão por MAPK, dada à implicação preponderante de GRK2 eseus receptores substratos, tanto na fisiología cardíaca,como na etiologia das doenças cardiovasculares, comohipertensão, deficiência cardíaca congestiva ou angina dopeito; e dada à conhecida importância do módulo de p38 MAPKno desenvolvimento do miocárdio e sua posteriorfuncionalidade. Existe uma correlação inversa entre os níveisaumentados de GRK2 e a inativação da p38 na deficiênciacardíaca congestiva. Além disso, os níveis de GRK2 sãodiminuídos em doenças de índole inflamatória, como porexemplo, a artrite reumatóide.

Por todas estas evidências, se decidiu proceder oestudo das possíveis interações entre GRK2 e p38. A primeiraaproximação experimental constou de ensaios de fosforilaçãode ambas as proteínas. Na Figura 1, quadro A, se mostra que aGRK2 fosforila a p38. Para descartar a possibilidade de quese tratou de uma autofosforilação de p38 promovida de algumamaneira pela presença de GRK2, se incluiu nos ensaios defosforilação a heparina (16 ng/pL), amplamente empregada comoinibidor de GRK2, tendo antes se certificado que que esta nãoafetará a atividade catalitica de p38. Neste mesmo quadro sedemonstra que a inibição da atividade catalitica de GRK2 levaa uma menor fosforilação de p38, pelo que diretamente, aatividade Ser/Thr cinase de GRK2 é a responsável da marcaradioativa incorporada em GST-p38. Estes experimentos foramcompletados com controles negativos de fosforilação de GSTpor GRK2 e com o escrutínio da zona de união entre a porçãoGST e a ORF de p38.

Uma recente publicação descrive a autofosforilaçãoda p38 estimulada por sua interação com TABl e parademonstrar que este não é o caso da invenção, se incluiu ocomposto de piridinilimidazol SB203580, inibidor competitivo,pelo ATP específico da p38, em ensaios de fosforilação. Noquadro B da Figura 1, se mostra o efeito do inibidor SB203580sobre a atividade catalitica da p38, sobre um substratogenérico desta como MBP (proteína básica de mielina). Dadoque a atividade basal da p38a é insignificante, não seobserva uma grande fosforilação da MBP e ainda assim, sedetecta a inibição por SB203580. Os dois sulcos seguintesinformam que o piridinilimidazol não afeta a atividade cinasede GRK2. Finalmente, as duas últimas trilhas da auto-radiografia mostram que não é a capacidade autofosforilativada p38 que se potência na presença de GRK2. A conclusão finaldestes experimentos descritos é que a p38 se fosforila invitro por GRK2.

Para comprovar que a fosforilação não estava tendolugar nos resíduos fosforiláveis pelas cinases (MAPKK)ativadoras de p3, como MKK3 e MMK6, as reações defosforilação se realizaram a frio (quer dizer, sem [γ-32Ρ] -ATP) e a imunodetecção empregando o anticorpo fosfoespecificode Anti-P-p38 (Figura 1, seção C) . Este anticorpo reconheceos epítopos fosforilados na seqüência da treonina 180 ou natirosina 182 da p38. Como se observa no quadro inferior,apenas a presença da proteína recombinante MKK6 dá lugar aoreconhecimento de fosfo-p38 pelo mencionado anticorpo. Noquadro superior, são reveladas as proteínas totais com umanticorpo anti-GRK2 que reconhece a GST (para ver GST-p38).Estes experimentos demonstran que GRK2 fosforila a p38 em umresíduo diferente da T180.

GRK2 Fosforila a p38 de Forma Rápida e com Alta Afinidade

O estudo dos parâmetros cinéticos da reação mostraque estes são indicativos da possibilidade de que a reaçãotenha lugar in vivo. A Figura 1 versa sobre a caracterizaçãocinética da fosforilação. Inicialmente, se realizaramexperimentos de curso temporal (quadro D) , nos quais secomprova que a fosforilação é rápidamente detectada (aos 5minutos), estimando-se um tempo médio de 15 minutos paraalcançar 50% da fosforilação máxima. GRK2 é uma cinaseeclética, capaz de fosforilar numerosos substratos nãoparticulados, como tubulinas, sinucleínas, e fosducinas. Aafinidade que GRK2 exibe por seus substratos é variável.Assim, a Km para as sinucleinas e para as β-tubulinas,dependendo dos subtipos de ambas, está em torno de 1-2 μΜ. Nocaso da p38, o valor da Km=80 nM (ver tabela da Figura 1,quadro E) está mais próximo ao descrito para outrossubstratos fisiológicos de GRK2, como a fosducina e aproteína similar à fosducina (PhD e PhLP, Km entre 40-100 nMou os receptores m2-muscarínicos. Os valores deestequiometria achados em pelo menos três quantificações porCerenkov, oscilaram entre 0,4-0,8 mol Pi/mol p38, o quemostra a existência de um sítio de fosforilação por GRK2.

GRK2 e p38 Interagem Dependentemente do Agonista.

A GRK2 interage com diversas proteínas implicadastanto na sinalização como no tráfico celular. Assim, a GRK2interage com Gaq, PI3Ka e γ, clatrina, GIT (GRK

Interacting protein) e caveolina, além de outras moléculas,de cuja interação resulta a modulação de sua atividade (comofosfolipídeos, Ca2+-calmodulina, cinases, etc.)· A GRK2 é umacinase modular e sua atividade catalítica está reprimida porinterações intramoleculares entre seus diferentes domínios.

Dessa forma, para ver sua capacidade de associação com a p38,se promoveu a aquisição de sua conformação ativa mediante aestimulação de receptores 32AR, sendo a ativação da p38, porcausa disso, escassa. Foram empregadas células HEK293,transfectadas transitoriamente com os plasmídeos codificantesdo receptor P2AR, Flag-p38 e GRK2. Após submeter as células auma abstinência noturna, foi feita a estimulação com oagonista isoproterenol, a uma concentração de 10 μΜ. Nestascondições, a imunoprecipitação da p38 traz consigo a detecçãoda cinase GRK2 nos imunoprecipitados, e este efeito seobserva potenciado por estimulação do receptor P2AR (Figura2, quadro A) . Tal como se mostra nos diferentes detalhesseparados que compõem a Figura 2, a máxima associação seobtém aos cinco minutos de exposição ao isoproterenol. Poroutro lado, se observa que a associação entre ambas ascinases não é mandatória da estimulação do P2AR, posto que seco-imunoprecipitam também em condições basais (0 minuto). Noquadro A, se incluem os controles de arraste inespecifico(Cneg) da imunoprecipitação anti-Flag, e a constatação de queoutro estimulo notório de p38 (NaCl) não desencadeia estaassociação. Finalmente, se apresentam os níveis de ativaçãoda p38 sob estas condições. Estes revelam, primeiro, que aativação da p38 por isoproterenol não é muito forte e,segundo, que a ativação é tanto menor quanto mais se une àGRK2.

Foram realizados experimentos de imunoprecipitação"recíproca", quer dizer, no mesmo sistema celular, porém,empregando anticorpos anti-GRK2 para detectar a p38 nosimunoprecipitados. No detalhe separado B se observou que ap38 e a GRK2 interagem de maneira dependente de agonista (5minutos de isoproterenol). Foi comprovado, ver a secção C,que diminuindo a concentração de GRK2, se continuavapermutando unida à Flag-p38. De novo, se encontrou uma uniãopotenciada aos 5 minutos de estimulação pelo agonista doβ 2 AR.

Na secção D, se examinou a capacidade da p38 de co-imunoprecipitar-se com o mutante catalíticamente inativo deGRK2, K220R. Pode ser observado como a niveis de expressãosimilares de GRK2-K220R e de GRK2-WT (ver o terceiro quadro),o mutante não apenas é capaz de associar-se em maior grau ap38, como também sua interação parece independente doestimulo P2AR.

A Sobreexpressão de GRK2 Reduz a Capacidade da p38 de serAtivada pela cinase MKK6.

Foi colocada à prova a interface entre a p38 e umade suas ativadoras mais comuns, a MKK6. Com o objetivo dedelimitar e cercear possíveis ativações cruzadas, se empregouo mutante constitutivamente ativo desta MAPKK, o mutanteMKK6CAM. Na Figura 3, no detalhe separado A são incluídos unsquadros representativos de experimentos de transfecçãotransitória em células HEK293, nos quais se sobreexpresamdoses crescentes de plasmideo pCDNA3-GRK2 (completando semprea quantidade de ADN total com pCDNA3-GFP), junto com Flag-p38e MKK6CAM. Se observa que a ativação da p38 dependente deMKK6CAM diminuía mais, quanto mais quantidade de GRK2 seexpressava nas células.

A sobreexpressão permitia assegurar aavaliação do resultado das mesmas células. Certamente, aotomar somente a imunodetecção de Flag-p38, se selecionam ascélulas transfectadas (e, portanto, submetidas aos efeitos deGRK2 e MKK6CAM) e se deixam dado os efeitos do resto. Poroutro lado, nestas células resultava difícil se detectar emtodas as ocasiões a p38 endógena. Foram utilizadas algumascélulas que expressam quantidades fixas de GRK2, duaspopulações de HEK293 que expressam estavelmente diferentesquantidades de GRK2, introduzindo transitoriamente os ADNsque codificam Flag-38 e MKK6CAM (ou seu controle). Osresultados são apresentados na seção B e mostram que, nestesistema, de novo se observa uma diminução da capacidade dap38 de ser ativada por MKK6CAM.

A Sobreexpressão de GRK2 Reduz a Atividade Cinase da p38sobre um Peptideo-Substrato

Em seguida, foi realizado um teste da atividadecatalitica de uma p38 submetida tanto ao estimulo de seuativador MKK6CAM, como ao de doses crescentes de GRK2 sobreum substrato exógeno. Para isto, as células HEK293 foramdeixadas em um meio com soro durante os dias de esperarequeridos para que tenha lugar a sobreexpressão ótima; aconseqüência disso é que a GRK2 podia estar sendo estimuladapor fatores presentes no soro, como LPA, etc. cujos sinaissão provenientes dos GPCRs. As células são recolhidas e apartir da imunoprecipitação das mesmas, a cinase Flag-p38 éreconhecida pelo anticorpo monoclonal anti-flag, unido a umaresina de agarose. Em cada ponto (sempre em duplicata), sereservou uma fração do imunoprecipitado para comprovar aquantidade do mesmo por imunodetecção, (ver o quadro inseridono detalhe separado B da Figura 4). Os imunoprecipitados,lavados repetidas vezes, são testados então em uma reação defosforilação sobre o substrato peptidico APR. Este peptideo,denominado assim pelos três primeiros aminoácidos de suaseqüência, corresponde aos resíduos 94 a 102 de MBP e foramutilizados anteriormente para testar a atividade de MAPK,pelo fato de possuírem o consenso de fosforilação destasenzimas. Na secção A se incluem os controles de lisados queindicam tanto a quantidade da expressão de GRK2 como o estadode ativação que a p38 alcança nessas condições. A análise dodetalhe separado B permite emitir diferentes conclusões. Aprimeira é que a atividade catalitica da p38 imunoprecipitadase correlaciona, em cada ponto, com seu respectivo estado deativação, revelado com o anticorpo anti-fosfo p38 em A e quese caracteriza por ser atenuada pela sobreexpressão de GRK2.

A segunda é que, Flag-p38 submetida a estímulos presentes nosoro do meio de cultura exibe também uma atividade cataliticadesprezível em relação ao peptídeo-substrato APR. Estesníveis foram tomados como referência para a quantificaçãográfica. Cabe destacar, finalmente, que a fosforilação dopeptídeo APR era estritamente dependente da p38, dado a suaostensiva inibição por SB 203580.

A redução dos Níveis de GRK2 Repercute em uma maior Ativaçãoda p38 por MKKGcm.

Com o objetivo de avaliar os resultados anteriores,os experimentos recíprocos são analisados, quer dizer, se aGRK2 está influindo negativamente na atuação da p38.

Independentemente de sua atividade cinase sobre GPCRs, aredução dos níveis de GRK2 deveria permitir um maior sinalanti-fosfo-p38 no mesmo contexto, a saber, por MKK6cam- Foramempregadas células HEK293 para realizar transfecçõestransitórias de quantidades crescentes de ADN anti-sentido(AS) contra GRK2 (Figura 5 A, esquerda) cujo controle emparalelo são as mesmas quantidades do plasmídeo que codificaa GFP (C). Na Figura se apresentam os quadros de umexperimento representativo. Nos níveis de GRK2 como média, seobtém de 20-50% de diminução, em função da dosagem de ADNempregada. Estes dados corroboran o inferido dos experimentosanteriores de sobreexpressão de GRK2, a saber, que com umamenor quantidade de GRK2 nas células, a p38 é capaz de sofreruma maior ativação por MKK6Cam- Se junta uma estimativagráfica representativa deste efeito (Figura 5 A, direita). Osníveis de ativação da p38 (anti-fosfo-p38/anti-p38) sereferem a sua ativação basal, em cada situação: tanto demaior redução de GRK2 (AS), como de GFP (C, controle).

Nestes mesmos experimentos se avalia a ativação deFlag-p38 em condições basais. A ativação em repouso, querdizer, sem MKK6Cam/ da p38a isolada pode ser escassa. Épossível se chegar à determinação por imunodetecção, deixandoamplas exposições durante o revelado quimioluminescente(referido como "sobreexposição" na Figura 5, detalhe separadoB). Assim, tal como se pode observar, o perfil de ativaçãoda p38 em condições de não co-transfecção de MKK6Cam emula oda p38 submetida à ativação deste mutante constitutivamenteativo. Conforme a eliminação de uma das variáveis, a saber, asobreexpressão de MKK6Cam que redunda numa inconstanteativação da p38, os dados de ativação basal da p38 influiídospela presença de maiores ou menores níveis de GRK2 total sãomais quantitativos. Assim, são mostrados na parte inferior daFigura os dados provenientes da quantificação da ativação deFlag-p38a sem MKK6Cam- Condicionando em cada ponto de ADNanti-sentido a ativação da p38 ao controle paralelo de GFP,se obtém uma acentuada tendência da p38 ser melhor substratode seus ativadores celulares, quanto menor for a presença deGRK2 (Figura 5, gráfico do detalhe separado Β) . Asignificância indicada mediante um asterisco se refere,portanto, que no teste estatístico T de Student, se obteve umvalor de p<0,05 em cada ponto de ADN anti-sentido comparadocom seu respectivo controle de GFP.

A Localização do Sítio de Fosforilação por GRK2 em p38mediante Construções Truncadas Revela a Implicação deDeterminantes Estruturais Terciários na Interacção p38-GRK2.

Mxi2 é uma variante de processamento alternativo dep38, cujo terminal-C difere do da p38a. Mxi2 é uma proteínainicialmente isolada em experimentos de duplo híbrido, porinterrelacionamento com a proteína Max. Dos aminoácidos 1 a280 é idêntica a p38a, porém ostenta um terminal-C de 17restos completamente diferentes (ver esquemas na Figura 6) .Foram empregados além de Mxi2, o mutante truncado ΜχίΔ17,(que corresponde exatamente a ρ38αΔ80) para determinar sealgumas das serinas ou treoninas do terminal-C de p38 eram asdianas de fosforilação de GRK2. Foram obtidas as proteínas defusão, por métodos padrões de purificação de proteínas e setestou, comparando com p38a, sua capacidade de ser substratode GRK2 (Figura 6, detalhe separado A), com quantidadescomparáveis de p38a, Mxi2 e ΜχίΔ17, estas duas últimas nãosendo fosforiladas por GRK2. Além disso, os projetos defosforilação que se distinguem em Mxi2 e ΜχίΔ17 são maistênues que os correspondentes à fosforilação de p38a napresença de heparina. Na Figura, se incluem também controlesde autofosforilação de cada uma destas cinases.A partir desses resultados se determinou a geraçãoe purificação dos 80 últimos aminoácidos da seqüência dep38a, fundidos, novamente à GST. Esta construção se elaboroumediante o protocolo de mutagênese de QuickChange, eposterior inclusão do fragmento de ADN que codificava o GST-280-360p38a no sistema polivalente de Gateway.Surpreendentemente, após purificar a proteína de fusão etestá-la em relação à GRK2, não se obteve rastro algum defosforilação. Estes resultados são apresentados no detalheseparado B da Figura 6. Em tal figura, se observa como comuma quantidade muito maior de GST-280-360 p38a que de GST-ΜχίΔΐ7 e de GST-p38a (WB anti-GST, quadro inferior), não seobtém nenhuma fosforilação das duas primeiras e sim da última.

A partir destes dados, se infere que se necessitamdeterminantes estructurais presentes na proteína p38aWT, eausentes nas suas partes truncadas e terminais-N e C, para orecohecimento e posterior fosforilação por GRK2.

GRK2 Fosforila a p38 em um Único Resíduo

Após constatar a inadequação das aproximaçõesanteriores para determinar o resíduo fosforilado por GRK2, sebuscou o resíduo por técnicas proteômicas. Para se certificarque a estequiometria calculada correspondia a um único sítiode fosforilação, os ensaios de fosforilação de GRK2 e p38sofreram resolução mediante eletroforeses bidimensionais,cujo resultado se mostra no detalhe separado A da Figura 7.Na primeira eletroforese se aproveita a troca do pontoisoelétrico das proteínas em conseqüência da incorporação dofosforilo, enquanto na segunda, estas se separam em função desua massa, conforme o método de rotina SDS-PAGE. Apenas noquadro correspondente à fosforilação, na presença de GRK2, sepode observar uma intensa banda radioativa correspondente àGST-p38. Desse modo, se distinguem neste quadro traçosdifusos de 32P, indicativos da autofosforilação múltipla deGRK2.

No Serviço Proteômico do Nodo UAM da RedCardiovascular, englobado dentro do Serviço Proteômica doCentro de Biologia Molecular Severo Ochoa(http://www.cbm.uam.es/mkfactory.esdomain/webs/CBMSO/plt Servicio Pagina.aspx?IdServicio=2 9&IdObjeto=I18), se identificoua modificação pós-traducional. Quantificando os espectros defragmentação de GST-p38 e de GST-p38 fosforilada por GRK2,após a digestão triptica e espectrometria de massa pelométodo de MALDI-TOF, se observou a existência, na amostrafosforilada, de um peptideo cuja massa podia corresponder àde outro peptideo, detectado em caminhos de amostras, de maisde 80 Da. Com efeito, se percebe a presença minoritária,porém exclusiva, da amostra submetida à fosforilação porGRK2, deste peptideo, modificado pós-traducionalmente com umgrupo fosfato (1954,330=1874,32 6+80). Se inclui nesta Figura(seção B da Figura 7) a ampliação da zona do espectro, naqual se detectaram rastros deste suposto portador dafosforilação, proporcionando-se a Figura inteira no itemseparado de Materiais e Métodos. A análise detalhada doespectro de massa permitiu a identificação do peptideocandidato, fruto da digestão com tripsina: LTDDHVQFLIYQILR.Para corroborar este aspecto, se separou o peptídeocandidato por HPLC e se realizou uma análise espectrométricamais fina: ionização por eletrospray acoplada à marcha iônica(ES/MS-IT), monitorando isoladamente o ion correspondente aopeptideo anteriormente citado. Os resultados mostramprimeiramente a informação procedente da cromatografialiquida de alta pressão no que concerne ao tempo de eluiçãodo peptideo monitorado em ambas as amostras. Se observa umprogresso na saida, no caso do peptideo procedente dafosforilação por GRK2, originado pelo fundamento dacromatografia, que separa os peptideos por hidrofobicidade,deixando os mesmos mais retidos e menos polares.

Em segundo lugar, se apresentam os espectros afragmentação de ambos os peptideos e a atribuição das sériesaos picos obtidos. Esta análise permitiu identificar atreonina do peptideo candidato LTDDHVQFLIYQILR como aportadora da fosforilação. Na Figura 8, se destacam emamarelo os picos correspondentes à masa total do peptideo emsuas diferentes espécies, em caminhos de amostras e emlaranja, o pico de 938,3 Da, correspondente à espéciediferencial entre o espectro da amostra fosforilada e a nãofosforilada.

A conclusão final das aproximações espectrométricase proteômicas foi que a fosforilação de GRK2 sobre p38 seproduz na treonina 123 da seqüência de p38a.

A mutação da treonina 123 de p38a impede a fosforilação GRK2

Com o objetivo de verificar a localização doresíduo diana da fosforilação por GRK2, se geraram doismutantes de ρ38α na T123. O mutante ρ38αΤ123Δ representa aforma de p38 não fosforilável por GRK2, enquanto que omutante p38aT123D, pela carga negativa do aspártico, aextensão de sua cadeia lateral, imita a formaconstitutivamente fosforilada da treonina 123. Se purificaramas proteínas de fusão GST-p38aT123A e GST-p38aT123D e sesubmeteram à fosforilação por GRK2, levando sempre comocontrole a proteína p38aWT (Figura 9, detalhe separado A) .Tanto sob concentrações de substrato baixas como eqüimolarescom relação à cinase, se confirma que nenhum dos doismutantes é substrato de GRK2, ratificando a identidade datreonina 123 como substrato da dita fosforilação. Na seção Ada Figura, se incluem também os controles de quantidade dep38 total quantificados por imunodetecção com um anticorpoanti-p38. Em B, se inclui um esquema em escala,representativo de p38a (número de acesso da base de dadosSwiss-Prot Q16539, www.expasy.org), onde cabe destacar seugrande domínio cinase, que envolve quase a proteína inteira.Ao final da proteína, se ubica uma pequena região, denominadaCD, (Common Docking) que constitui o domínio de ancoramentocomum, tanto de substratos como de ativadores de p38 e quefoi visto como meio de reconhecimento proteína-proteína nafamília das MAPK. A análise do cristal de p38 junto compeptídeos procedentes de MKK3 e de MEF2A, permitiu corrigir eafinar a descrição deste sulco de ancoramento.

A Treonina 123 é um Resíduo Sumamente Conservado entre Isoformas e entre EspéciesNa Figura 10, são mostrados dois alinhamentos dasseqüências de diferentes proteínas p38, feitos pelospresentes inventores. No quadro superior se comparou asisoformas α das p38 (MK14 nas bases de dados Swiss-Prot) dediferentes espécies: Cyprinus carpio (carpa comun,MKl4A_CYPCA: Q90336), Drosophila melanogaster (mosca dafruta, MK14A_DR0ME: 062618), Xenopus laevis (Râ de unhasafricana, MK14_XENLA: P47812), Pan troglodytes (chimpanzé,MK14_PANTR: Q95NE7), Canis familiaris (cachorro, MK14_CANFA:002812), Homo sapiens (ser humano, MK14_HUMAN: Q16539), Musmusculus (camundongo, MK14_M0USE: P47811) e Rattus norvegicus(ratazana, MK14_RAT: P70618). Se utiliza um simples código decores que diferencia os aminoácidos idênticos entre osortólogos de p38 (amarelo), de aminoácidos muito conservadose idênticos ao do consenso (azul), de aminoácidos muitoconservados equivalentes ao do consenso (verde). 0 resto deresíduos não conservados permanece em branco. As regiões nasquais uma maior variabilidade é permitida são precisamente asexteriores ao domínio cinase da p38, entre as que se cabedestacar, a zona do terminal-C, onde se ubica o domínio CD,cujos aminoácidos ácidos permitem, devido ao estabelecimentode interações eletrostáticas com aminoácidos básicos desubstratos, ativadores e desativadores, o reconhecimentodestes.

Mediante uma elipse roxa se destaca a ubicação daT123 na seqüência de todas as p38a alinhadas. Não apenas atreonina 123 está presente em quase todas as isoformas, peloque quando não aparece, se encontra uma serina, igualmentefosforilável, em seu lugar. Além disso, a região deflanqueamento de aminoácidos ácidos que se supõe constituir oconsenso de fosforilação por GRK2 está conservada em todosos ortólogos.

Em seguida, se estudou se a regulação descritapelos presentes inventores podia ser comum a todas as quatroisoformas pré-eminentes da p38, a saber α, β, γ, e δ. Paraisso, se alinharam as zonas que compreendem os resíduos 120 a140 das isoformas de p38 de leveduras: HOGl de Candidaalbicans (Q92207), HOGl de Saccharomyces cerevisiae (P32485),Styl de Sehizosaceharomyces pombe (Q09892); as isoformas e dep38 de ser humano, de camundongo, de ratazana e de râafricana (isoformas MK12 no alihamento, P53778, 008911,Q63538, P47812); isoformas δ de p38 de ser humano, dechimpanzé, de camundongo e de ratazana (isoformas MK13:015264, Q9N272, Q9Z1B7 e Q9WTY9 respectivamente, noalinhamento); as duas isoformas de p38 de drosófila(MKl4_DR0ME, 062618 e 061443), as isoformas β de ser humano(β2 difere da inicialmente isolada β, a qual carece dainserção, por processamento alternativo, de oito aminoácidospresentes nesta.

A isoforma β é minoritária e difícil deisolar, por isso, somente se identifica a forma β com avariante β2) e de camundongo (MK11: Q105759, Q9WUI1); efinalmente as isoformas α (MK14) de Xenopus, de Cyprinus(isoforma MK14A antes incluída na comparativa e isoformaMK14B, Q9I958) de chimpanzé, de cachorro, de homem, decamundongo e de ratazana, anteriormente alinhadas. Resulta ochamamento para a alta conservação das seqüências entre todaselas, inclusive as procedentes de leveduras. Com relação àtreonina em questão (T123 de p38a humana) , pode-se dizer quese encontra conservada em vertebrados - e incluso emmetazoos-, assim como, os aminoácidos circundantes, entre osquais se encontram os resíduos ácidos DeE. Assim, incluso,se o alinhamento sofre uma interrupção à altura justo desteresíduo, segue estando conservado nas isoformas δ de p38. Aúnica isoforma das incluídas neste alinhamento que carece deuma serina ou treonina em um contexto homólogo é a ρ38γhumana.

A Fosforilação de p38 por GRK2 Diminui tanto a AtividadeCatalitica de p38 sobre seus Substratos como a Capacidade deser Substrato de MKK6

Nas Figuras 11 e 12 se reúnem os experimentos queforam idealizados para determinar quais conseqüênciasfuncionais podia ter a fosforilação de GRK2 sobre a T123 dep38. O primeiro que se estudou foi se a fosforilação de GRK2sobre p38 diminuiria a ativação desta por MKK6Cam in vitro.Nos quadros que modelam A na Figura 11, se apresentam osresultados, em duplicata, obtidos em experimentos defosforilação de MKK6CAm sobre GST-p38 e os mutantes GST-p38T123A e GST-p38T123D. Em quantidades similares deproteínas recombinantes (Azul de Coomassie) , GST-p38T123D émuito pior substrato de MKK6Cam que as outras duas p38 (32P) .

Em seguida se estudou se esta capacidade diminuídapor parte de GST-p38T123D de ser fosforilada por MKK6CAm secorrelacionava com uma diminuição de sua atividade catalíticain vitro. Para isto, foram feitos alguns testes defosforilação que, devido à indetectável atividade basal deGST-p38, requeriam a inclusão da cinase ativadora MKK6Cam- Naparte B da Figura 11, se provou a capacidade de GST-p38WT edos dois mutantes GST-p38T123A e GST-p38T123D de 'fosforilarum substrato conhecido se p38, como é ATF2, previamentepurificado como proteína de fusão em GST. Assim, em cadareação de fosforilação, se incluem substrato, MAPK e MAPKK.Se mostra um experimento representativo (32P), onde os pontosestão em duplicata, assim como, seu respectivo controle dequantidades de proteína (Azul de Coomassie). Assim, estestestes revelam que p38Tal23D carece da mínima atividadecatalítica sobre GST-ATF2, enquanto que ρ38α e ρ38Τα123Α ofosforilam de maneira análoga.

Se decidiu corroborar os dados com um substratomais específico de p38, pois ATF2 é também fosforilado porJNK. Se purificou GST-MEF2A, por ter sido recentementecristalizado junto à p38, assim como, por ser um substratopreferido de p38. Na Figura 12 se reúnem os testes realizadoscom este substrato. 0 detalhe separado A garante as deduçõesanteriores, a saber, a atividade de p38Tal23D sobre MEF2Aestá completamente abolida, enquanto que o mutante p38Tal23Aconserva a capacidade de fosforilar este substrato. Seobserva, além disso, que a fosforilação é acompanhada de umatroca correlativa de mobilidade do substrato GST-MEF2A,detectado por tingimento com Azul de Coomassie. É freqüenteque a hiperfosforilação de uma proteína redunde em uma trocade sua mobilidade eletroforética, apreciavelmente inclusa emgéis desnaturalizantes de poliacrilamida e SDS. Após analisaros testes de fosforilação em conjunto, pode ser observado,além disso, que o mutante p38Tal23A, caso seja corretamentefosforilado por MKK6Cam> exibe uma atividade cinase reduzidafrente aos dois substratos que foram comprovados. Se decidiudividir um pouco mais este efeito diferencial entre p38Tal23Ae p38aWT, para o qual os pesquisadores se fixaram em suarespectiva atividade basal, quer dizer, na ausência da cinaseativadora MKK6 e frente à MEF2A (Figura 12, detalhe separadoΒ). A atividade basal da p38 pode ser avaliada em condiçõesde suficiente substrato e ampla exposição e se pode comprovarque sendo os mutantes na T123, possuem menor atividadecatalitica basal que a cinase silvestre. p38Tal23A secomporta como o término médio entre p38aWT e p38Tal23D. Assimposto, o mutante p38Tal23A, em condições enzimáticas maisrestritivas (10 vezes menos substrato e 15 minutos defosforilação; quadro C da Figura 12), apresenta maiordiferença catalitica com relação à p38aWT do que osexperimentos iniciais indicavam.

O Mutante p38T123D apresenta Menor Capacidade de se Ativarpor MKK6Cam in si tu

Os resultados, que paralelamente expõem umaexplicação coerente aos dados iniciais em células HEK293, secorroboraram neste mesmo sistema. Antes, se gerou por PCR omutante pCDNA3-Flag-p38T123D de expressão eucariótica. Assimposto, seguindo aproximações experimentais análogas às desobreexpressão ou redução de GRK2 em HEK293, se transfectouFlag-p38WT e Flag-p38T123D junto com o ativador MKK6Cam- 0gráfico da Figura 13 ilustra, comparando em cada experimento,a ativação de Flag-p38T123D (frente à sua ativação basal) coma ativação de Flag-p38WT, uma notável redução da mesma. Aativação de p38T123D nas células é menos provável que a dacinase - silvestre. Se incluem, dessa modo, nesta Figura,quadros ilustrativos das imunodetecções que proporcionavamestes experimentos.

Na Figura 14, a união dos substratos (MK2) eativadores (MKK6) a p38 ou seus mutantes em T123 é analizadamediante um ensaio de união in vitro, utilizando proteínaspurificadas. Tal como se mostra, a capacidade do mutanteT123D para associar-se à MK2 ou à MKK 6 está severamentereduzida em relação a do mutante T123A ou à da proteína tiposilvestre.

GRK2 Regula Negativamente a Diferenciação Induzida porInsulina da linha pré-adipocitica 3T3-L1

A linha pré-adipocítica 3T3- Ll se utilizou comomodelo celular que permitira estudar a regulação da p38 porGRK2. Estes fibroblastos apresentam a interessanteparticularidade de que, submetidos a determinados estímulos,entre os quais se destaca a insulina, adquirem, ao final deum tratamento de aproximadamente duas semanas, um fenótipoadipocítico. Esta diferenciação é fácilmente distinguívelpela acumulação de gotas de gordura que se tingem com umcorante roxo lipofílico e que chegam a ocupar a práticatotalidade do citoplasma das 3T3-L1.

Uma das funções fisiológicas da p38, diferente damais ortodoxa resposta ao estresse celular, é seu papel noprocesso de diferenciação. No caso concreto dos fibroblastos3T3L1, foi demonstrada a implicação da p38 em tanto e emquanto a diferenciação em adipócitos se bloqueia por SB203580e a presença de MKK6Cam é suficiente para isso. Os fatores detranscrição C/EBP (CCAAT/enhancer-binding protein) e PPARy(peroxisome proliferator-activated receptor γ) , cujaexpressão varia no transcurso da diferenciação, parecemsubmetidos à regulação pela p38. Mais concretamente, C/EBP βé suposto de ser fosforilado por p38, que por sua vez, estáativa somente nas etapas iniciais da diferenciação; o quepromoveria a posterior expressão de PPARy e dos marcadoresadipociticos que se encontram abaixo de seu controle.

Para investigar o efeito que GRK2 poderia ter nadiferenciação adipocitica de 3T3L1, se geraram linhasestavelmente transfectadas com os plasmideos pCDNA3-GRK2 epCDNA3-GRK2K220R, que são resistentes à neomicina. Depois dapertinente comprovação de que os níveis de GRK2 estavam emefeito de sobreexpressão em ambos os casos, em comparação coma linha 3T3-L1 (janela inserida no gráfico da Figura 15), seprocedeu ao desencadeamento da diferenciação conforme oprotocolo padrão. As células 3T3-L1, na ausência de estímuloslipogênicos, têm um saudável aspecto de fibroblastos (fotocorrespondente ao controle em 3T3-L1) que se converteclaramente em um fenótipo adipocítico, como atestam as gotaslipídicas roxas e a morfologia redonda que estas célulasadquirem (foto + insulina nas 3T3-L1). No caso das estáveisde GRK2, o número de adipócitos por campo é visivelmentemenor que no caso dos fibroblastos com níveis endógenos destacinase. E no que se refere às células 3T3L1-K220R, o efeitoadipogênico é sustancialmente maior que das células controle.GRK2 inibe, assim, a aquisição da morfologia adipociticamediada por insulina, enquanto que K220R a estimula. Alémdisso, este efeito é dependente de p38, pois a adição doinibidor farmacológico SB203580 reverte toda a adipogênese.

Mais ainda, quando se reservavam como controles internos doexperimento placas sem submeter aos tratamentosdiferenciadores, as estáveis de K220R sofriam muito maisconversão espontânea em adipócitos que as outras células. Nográfico da direita, se representa a recontagem do número deadipócitos por campo em cada uma das três linhas celulares.Se entende por campo, uma zona visualizada com o microscópioótico em cada plOO o p60. Em cada placa, se contabilizavamnormalmente até um total de uns 25 campos aleatórios. Asignificância dos dados se calculou mediante o Teste T deStudent (p<0,001) para dados emparelhados (cada linha celularestável comparada com a 3T3-L1).

Os dados das Figuras 16 e 17 conduzem à conclusãode que um anti-soro policlonal frente a um peptideo de p38fosforilado em Thrl23 é capaz de reconhecer a proteína p38fosforilada in vitro por GRK2, porém não por MKK6 em outrosrestos, e que este reconhecimento é específico para o restoThrl23, já que o mutante T123A não é imunodetectado por esseanti-soro. Também, esta sobreexpressão de GRK2 pode promoverum incremento na imunodetecção deste epítopo, por esteanticorpo, sinal de que está reduzida quando um mutante GRK2inativo (K220R) está sobreexpresso.Tabela 1

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Claims

1. Proteína MAPK (sigla do Inglês, Mitogen-Activated Protein Kinase - Proteína Cinase Ativada porMitógeno), caracterizada pelo fato de ser selecionadadentre:a) uma proteína MAPK que compreende um resto fosforiladoem um sítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da ditaproteína MAPK, ou um fragmento da dita proteína quecompreende o dito resto fosforilado, em que:- o dito sítio de fosforilação diferente é o resto detreonina na posição 123 (Thrl23) da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação, posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, ea fosforilação no dito sítio de fosforilaçãodiferente, impede a ativação da dita proteína MAPK e tambémsua atividade com relação a seus substratos; eb) uma proteína MAPK que compreende uma carga negativa ouum resto volumoso em um sítio de fosforilação, ou na áreaque envolve o dito sítio de fosforilação, que é diferentedo sítio ou sítios de fosforilação presentes no segmento deativação da dita proteína MAPK, ou um fragmento da ditaproteína que compreende o dito resto fosforilado, em que:- o dito sítio de fosforilação diferente é o resto detreonina na posição 123 (Thrl23) da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, tal como se define por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e- a introdução da dita carga negativa ou do dito restovolumoso no dito sítio de fosforilação, ou na área queenvolve o dito sítio de fosforilação, impede a ativação dadita proteína MAPK e também sua atividade com relação aseus substratos.

2. Proteína, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a dita proteína MAPK éselecionada entre as proteínas cinase ERK, JNK e p38, esuas respectivas isoformas, de qualquer espécie.

3. Proteína, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita proteína MAPK é ap38 de um mamífero.

4. Proteína, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a dita proteína MAPK é ap38, isoforma a, de camundongo e tem a seqüência deaminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1.

5. Proteína, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a dita proteína MAPKcompreende um segmento de ativação selecionado dentre:- um segmento de ativação que compreende a tríade deaminoácidos de fórmula (I):<formula>formula see original document page 110</formula>onde:- Thr é treonina,- Tyr é tirosina, e- Xaa é o resto de um aminoácido, preferencialmente, de umaminoácido selecionado dentre ácido aspártico, ácidoglutâmico, glutamina, glicina e prolina; e- um segmento de ativação que compreende a tríade deaminoácidos de fórmula (II):Ser-Glu-Gly (II)onde:- Ser é serina,- Glu é ácido glutâmico, e- Gly é glicina.

6. Proteína, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de compreender a seqüência deaminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

7. Uso de uma proteína, de acordo com areivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito usoocorre no diagnóstico de uma patologia mediada por uma MAPKna forma ativa, ou para determinação do risco oupredisposição de um sujeito desenvolver a dita patologia,ou para avaliação ou monitoramento do efeito de uma terapiaadministrada a um sujeito que apresenta a dita patologia,ou para analisar o estado ou gravidade e/ou evolução dadita patologia, assim como, para identificação de compostospotencialmente úteis para o tratamento da dita patologia.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a dita patologia mediada poruma MAPK na forma ativa compreende câncer e doençascardíacas, doenças infeciosas, neuronais, pulmonares einflamatórias.

9. Método, in vitro, para detectar em um sujeitouma patologia mediada por uma MAPK na forma ativa, ou paraanalisar o risco ou predisposição de um sujeito adesenvolver uma patologia mediada por uma MAPK na formaativa, caracterizado pelo fato de compreender:a) detectar e/ou quantificar o nível de uma proteína MAPK,de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, em umaamostra biológica proveniente do dito sujeito; eb) comparar o dito nível com o de uma amostra de controle,onde uma redução no dito nível em relação à amostra decontrole, é indicativo de risco do sujeito desenvolver adita patologia mediada por uma MAPK na forma ativa.

10. Método, in vitro, para avaliar ou monitorar oefeito de uma terapia administrada a um sujeito queapresenta a dita patologia mediada por uma MAPK na formaativa, ou para analisar o estado ou gravidade e/ou aevolução da dita patologia mediada por uma MAPK na formaativa, caracterizado pelo fato de compreender:a) detectar e/ou quantificar o nível de uma proteína MAPK,de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, em umaamostra biológica proveniente do dito sujeito; eb) comparar o dito nível com o de uma amostra de controleprocedente do mesmo sujeito.

11. Método, in vitro, para identificar umcomposto potencialmente útil para o tratamento depatologias mediadas por proteínas MAPK na forma ativa,caracterizado pelo fato de compreender:a} colocar em contato o composto candidato com uma proteínaMAPK, eb) detectar a fosforilação da dita proteína MAPK em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação da ditaproteína MAPK, ec) analisar se o dito sítio de fosforilação (i) é a Thrl23da p38, isoforma a, de camundongo, no caso da proteína MAPKutilizada tenha sido a dita proteína, ou então um resto deum aminoácido suscetível de fosforilação posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e se(ii) a fosforilação no dito sítio de fosforilaçãodiferente, impede a ativação da dita proteína MAPK;ou, alternativamente,i) colocar em contato um composto candidato,selecionado dentre um composto capaz de fosforilar a ditaproteína MAPK, ou um composto que imita o efeito da ditafosforilação, com uma proteína MAPK;ii) detectar a fosforilação da dita proteína MAPK emum sítio de fosforilação do segmento de ativação da ditaproteína MAPK para medir o efeito do composto candidatosobre a ativação da proteína MAPK, ou detectar o efeito deimitar a dita fosforilação sobre a dita proteína MAPK paramedir o efeito do composto candidato sobre a ativação da MAPK;iii) analisar a atividade da dita proteína MAPK napresença do composto candidato com relação a seussubstratos para avaliar a possível inibição da ação e/ouatividade da proteína MAPK sobre seus substratos napresença de um composto competitivo; e(iv) analisar (i) se o dito sítio de fosforilação naThrl23 da proteína p38, isoforma a, de camundongo (caso aproteína MAPK utilizada tenha sido a dita proteína) éafetado pelo composto candidato, e (ii) se a fosforilaçãono dito sítio de fosforilação impede a ativação da ditaproteína MAPK.

12. Composto, caracterizado pelo fato de sercapaz de se unir a uma proteína MAPK, de acordo comquaisquer das reivindicações 1 a 6, e/ou ser capaz dedetectar a dita proteína MAPK, de acordo com quaisquerreivindicações 1 a 6.

13. Composto, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o dito composto é:- um anticorpo; ou- um composto capaz de se unir a uma proteína MAPK, deacordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, que se une àdita proteína MAPK na Thrl23 da proteína p38, isoforma a,de camundongo, ou a um resto de um aminoácidoposicionalmente equivalente em outra proteína MAPK,conforme definido por alinhamento múltiplo de seqüências deaminoácidos, e a asociação do dito composto no dito sítiode fosforilação Thrl23 provoca uma fosforilação reduzida daproteína MAPK no segmento de ativação e, por isso, impedesua ativação e/ou sua atividade em relação a seussubstratos; ou- um composto capaz de se unir à região de ação da p38e capaz de imitar a introdução de uma carga negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23 ou na área que aenvolve, da p38, isoforma a, de camundongo, ou um resto deum aminoácido posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, conforme definido por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do dito compostono dito sítio de fosforilação Thrl23, ou na área queenvolve a dita Thr 123, impede a ativação da dita proteínaMAPK; ou- um composto capaz de se unir à região de ação da p38e capaz de imitar a introdução de uma carga negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23 ou na área que aenvolve, da p38, isoforma a, de camundongo, ou um resto deum aminoácido posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, conforme definido por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do dito compostono dito sítio de fosforilação Thrl23, ou na área queenvolve a dita Thr 123, impede a atividade da dita proteínaMAPK com relação a seus substratos.

14. Composto, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é umanticorpo capaz de se unir ao epítopo que compreende aseqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2.

15. Uso do dito composto, de acordo com quaisquerdas reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de queo dito uso ocorre para analisar o risco ou predisposição deum sujeito desenvolver uma patologia mediada por uma MAPKna forma ativa, ou para avaliar ou monitorar o efeito deuma terapia administrada a um sujeito que apresenta a ditapatologia, ou para analisar o estado ou gravidade e/ouevolução da dita patologia, assim como, para identificaçãode compostos potencialmente úteis para o tratamento da ditapatologia.

16. Vetor, caracterizado pelo fato decompreender:(i) uma seqüência de ácido nucléico que codifica umcomposto que fosforila um sitio de fosforilação diferentedo sitio ou sítios de fosforilação presentes no segmento deativação de uma proteína MAPK, onde o dito sítio defosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou um resto de um aminoácido suscetível defosforilação posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, conforme definido por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a fosforilação no dito sítiode fosforilação diferente impede a ativação da ditaproteína MAPK; ou(ii) uma seqüência de ácido nucléico que codifica umcomposto que impede a fosforilação de um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteína MAPK; ou(iii) um composto que fosforila um sítio defosforilação diferente do sítio ou sítios de fosforilaçãopresentes no segmento de ativação de uma proteína MAPK,onde o dito sítio de fosforilação diferente é a Thrl23 dap38, isoforma a, de camundongo, ou um resto de umaminoácido suscetível de fosforilação posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e afosforilação no dito sítio de fosforilação diferente impedea ativação da dita proteína MAPK; ou(iv) um composto que impede a fosforilação em um sítiode fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK.

17. Composição farmacêutica, caracterizada pelofato de compreender uma quantidade terapeuticamente efetivade:(i) um composto que fosforila um sítio de fosforilaçãodiferente do sítio ou sítios de fosforilação presentes nosegmento de ativação de uma proteína MAPK, onde o ditosítio de fosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoformaa, de camundongo, ou um resto de um aminoácido suscetívelde fosforilação posicionalmente equivalente em outraproteína MAPK, conforme definido por alinhamento múltiplode seqüências de aminoácidos, e a fosforilação no ditosítio de fosforilação diferente impede a ativação da ditaproteína MAPK; ou(ii) um composto que imita a fosforilação em um sitiode fosforilação diferente do sitio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK, onde o dito sítio de fosforilação diferenteé a Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou um restode um aminoácido suscetível de fosforilação posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e afosforilação no dito sítio de fosforilação diferente impedea ativação de dita proteína MAPK; ou(iii) um composto que impede a fosforilação em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK; ou(iv) um vetor, de acordo com a reivindicação 16; ou(v) um composto capaz de se unir a uma proteína MAPK,de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, que seune à dita proteína MAPK na Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou em um resto de um aminoácido posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e aassociação do dito composto ao dito sítio de fosforilaçãoThrl23 provoca uma fosforilação reduzida da proteína MAPKno segmento de ativação. e, por meio disso, impede suaativação e/ou atividade com relação a seus substratos; ou(vi) um composto capaz de se unir à região de ação dap38 e capaz de imitar a introdução de uma carga negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23, ou na área que aenvolve, da p38, isoforma a, de camundongo, ou um resto deum aminoácido posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, conforme definido por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do dito compostono dito sítio de fosforilação Thrl23, ou na área queenvolve a dita Thr 123, impede a ativação da dita proteínaMAPK; ou(vii) um composto capaz de se unir à região de ação dap38 e capaz de imitar a introdução de uma carga negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23 da p38, isoforma a,de camundongo, ou um resto de um aminoácido posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e aassociação do dito composto no dito sítio de fosforilaçãoThrl23 impede a atividade da dita proteína MAPK em relaçãoa seus substratos,junto com, opcionalmente, um veículo farmaceuticamenteaceitável.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de compreender uma cinase.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 18,caracterizada pelo fato de que a cinase é a cinase GRK2 ouum fragmento ativo da mesma.

20. Uso de:(i) um composto que fosforila um sítio de fosforilaçãodiferente do sítio ou sítios de fosforilação presentes nosegmento de ativação de uma proteína MAPK, onde o ditosítio de fosforilação diferente é a Thrl23 da p38, isoformaa, de camundongo, ou um resto de um aminoácido suscetívelde fosforilação posicionalmente equivalente em outraproteína MAPK, conforme definido por alinhamento múltiplode seqüências de aminoácidos, e a fosforilação no ditosítio de fosforilação diferente impede a ativação da ditaproteína MAPK; ou(ii) um composto que imita a fosforilação em um sítiode fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK, onde o dito sítio de fosforilação diferenteé a Thrl23 da p38, isoforma a, de camundongo, ou um restode um aminoácido suscetível de fosforilação posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e afosforilação no dito sítio de fosforilação diferente impedea ativação da dita proteína MAPK; ou(iii) um composto que impede a fosforilação em umsítio de fosforilação diferente do sítio ou sítios defosforilação presentes no segmento de ativação de umaproteína MAPK; ou(iv) um vetor, de acordo com a reivindicação 16; ou(v) um composto capaz de se unir a uma proteína MAPK,de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, que seune à dita proteína MAPK na Thrl23 da p38, isoforma a, decamundongo, ou em um resto de um aminoácido posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e aassociação do dito composto ao dito sitio de fosforilaçãoThrl23 provoca uma fosforilação reduzida da proteína MAPKno segmento de ativação e, por meio disso, impede suaativação e/ou atividade com relação a seus substratos; ou(vi) um composto capaz de se unir à região de ação dap38 e capaz de imitar a introdução de uma carga, negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23, ou na área que aenvolve, da p38, isoforma a, de camundongo, ou um resto deum aminoácido posicionalmente equivalente em outra proteínaMAPK, conforme definido por alinhamento múltiplo deseqüências de aminoácidos, e a associação do dito compostono dito sítio de fosforilação Thrl23, ou na área queenvolve a dita Thr 123, impede a ativação da dita proteínaMAPK; ou(vii) um composto capaz de se unir à região de ação dap38 e capaz de imitar a introdução de uma carga negativa nadita região, introduzindo o dito composto uma carganegativa ou um resto volumoso na Thrl23 da p38, isoforma a,de camundongo, ou um resto de um aminoácido posicionalmenteequivalente em outra proteína MAPK, conforme definido poralinhamento múltiplo de seqüências de aminoácidos, e aassociação do dito composto no dito sítio de fosforilaçãoThrl23 impede a atividade da dita proteína MAPK com relaçãoa seus substratos,caracterizado que o dito uso ocorre na elaboração de umacomposição farmacêutica para o tratamento de uma patologiamediada por MAPKs na forma ativa.

21. Kit, que compreende uma proteína MAPK, deacordo com quaisquer das reivindicações 1 a 6, ou umcomposto capaz de se unir e/ou detectar a dita proteínaMAPK, de acordo com quaisquer das reivindicações 12 a 14.

22. Kit, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o dito kit é de utilidadepara o diagnóstico de uma patologia mediada por uma MAPK naforma ativa, ou para determinar o risco ou predisposição deum sujeito a desenvolver a dita patologia, ou para avaliarou monitorar o efeito de uma terapia administrada a umsujeito que apresenta a dita patologia, ou para analisar oestado ou gravidade e/ou a evolução da dita patologia,assim como, na identificação de compostos potencialmenteúteis para o tratamento da dita patologia.

23. Kit, de acordo com as reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a dita proteína MAPK éuma cinase p38 de mamífero, fosforilada na Thrl23 de umap38 de mamífero, isoforma a.