BRPI0609705A2

BRPI0609705A2 - emprego de classificadores de atividade genética para a classificação in vitro de perfis de expressão genética de pacientes com falência múltipla de órgãos infecciosa/não infecciosa

Info

Publication number: BRPI0609705A2
Application number: BRPI0609705-7A
Authority: BR
Inventors: Stefan Russwurm
Original assignee: Sirs Lab Gmbh
Priority date: 2005-03-21
Filing date: 2006-03-16
Publication date: 2010-04-20
Also published as: CN101146914A; US20090325152A1; WO2006100203A2; CA2602543C; CA2602543A1; ES2357853T3; EP1863928A2; US8236496B2; DE102005013013A1; WO2006100203A3; DE502006008908D1; ATE498694T1; EP1863928B1

Abstract

EMPREGO DE CLASSIFICADORES DE ATIVIDADE GENéTICA PARA A CLASSIFICAçãO IN VITRO DE PERFIS DE EXPRESSãO GENéTICA DE PACIENTES COM FALêNCIA MúLTIPLA DE ORGãOS INFECCIOSA/NãO INFECCIOSA. A presente invenção refere-se ao emprego de marcadores da atividade genética para classificação de pacientes que estão acometidos por uma falência múltipla de órgãos infecciosa ou não-infecciosa. Particularmente, a presente invenção refere-se a marcadores da atividade genética para classificação de pacientes como "nenhuma infecção sem falência múltipla de órgáos" ou como "acometidos de uma falência múltipla de órgáos não infecciosa", ou "acometidos de uma falência múltipla de órgáos infecciosa", sendo que o marcador da atividade genética são polinucleotídeos, que são escolhidos do grupo que consiste de: SEQ ID 1.1, SEQ ID 1.2, SEQ ID 1.3, SEQ ID 1.4, SEQ ID 1.5, SEQ ID 1.6, SEQ ID 1.7, SEQ ID 1.8, e SEQ ID 1.9 ou seqúências parciais das mesmas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EMPREGODE CLASSIFICADORES DE ATIVIDADE GENÉTICA PARA A CLASSIFICAÇÃO IN VITRO DE PERFIS DE EXPRESSÃO GENÉTICA DE PACIENTES COM FALÊNCIA MÚLTIPLA DE ÓRGÃOS INFECCIOSA/NÃO INFECCIOSA".

A presente invenção refere-se ao emprego de marcadores daatividade genética para classificação de pacientes acometidos de uma falên-cia múltipla de órgãos infecciosa ou não infecciosa.

A invenção refere-se, além disso, ao emprego desses classifica-dores de atividade genética como parâmetros de avaliação armazenados emdispositivos que são empregados para diagnose in vitro de pacientes comfalência múltipla de órgãos infecciosa ou não infecciosa. Além disso, a in-venção refere-se a um dispositivo para diagnose in vitro de pacientes aco-metidos de uma falência múltipla de órgãos infecciosa/não-infecciosa.

Além disso, a invenção refere-se ao emprego de marcado-res/classificadores da atividade genética para a classificação de perfis deexpressão genética de pacientes para avaliação dos efeitos da terapia comcompostos ativos contra a falência múltipla de órgãos infecciosa ou não in-fecciosa.

Apesar dos progressos na compreensão patofisiológica e do tra-tamento de suporte, a síndrome da disfunção múltipla de órgãos (MOFS) oua falência múltipla de órgãos (MOF), em pacientes em centros de medicinaintensiva, é a causa mais freqüente e crescente de morte no mundo todo. Asconseqüências desse desenvolvimento são, não apenas, consideráveis paraos próprios pacientes e têm, um efeito considerável nos custos dos serviçosmédicos e no progresso da medicina em muitos campos da medicina.

Denomina-se falência múltipla de órgãos a falha concomitanteou em seqüência de tempo rápida, de dois ou mais sistemas de órgãos vi-tais. A síndrome da disfunção múltipla de órgãos (MOFS) pressupõe o MOF[1] como insuficiência inicial de órgãos. Fala-se hoje de falência múltipla deórgãos quando dois ou mais órgãos, concomitantemente ou sucessivamen-te, apresentam perturbações funcionais, sendo que uma falência de órgãoscronicamente persistente deve ser excluída [2]. A prognose de MOF depen-de estreitamente do número dos sistemas de órgãos que tomam parte. Amortalidade no caso de falência de um órgão, nas primeiras 24 horas é de22%, após 7 dias de 41%. Na falência de três sistemas de órgãos a mortali-dade aumenta no primeiro dia para 80% e após 4 dias para 100% [3].

Para divisão clínica da gravidade de MOFS e MOF emprega-seregularmente o escore da falência múltipla dos órgãos (escore MOF) deGORIS et al. [4] ou alternativamente também o escore avaliação de falênciade órgãos (SOFA) relacionado à Sepsis [5]. O escore MOF permite umaclassificação rápida e clinicamente simples da função do órgão em três eta-pas. Um escore MOF > 4 é denominado na literatura clínica regularmenteMOF [6]. O escore SOFA é um sistema de pontos que estima os seguintessistemas orgânicos, com uma rápida avaliação clínica da função, respecti-vamente em quatro graus de dificuldade: respiração (pulmões), coagulação,fígado, sistema cardio-circulatório, sistema nervoso central e rins.

O MOF transcorre clinicamente em três fases [7]:

1. Órgão em choque: O mecanismo patofisiológico iniciador éum déficit de perfusão das mais diferentes gêneses. Este fato ocorre em al-gumas horas e não deixa nenhum dano remanescente.

2. Disfunção orgânica: um déficit de perfusão duradoura nos

próximos dias leva ao surgimento de uma SIRS (Systemic InflammatoryResponse Syndrome, classificada segundo [8]) com edemas locais e danoscelulares. Essa fase é denominada síndrome de disfunção múltipla de ór-gãos (MODS).

3. Falência de órgãos: O déficit de perfusão que subsiste leva àestase no âmbito esplâncnico, com o que ocorre a superinfecção e translo-cação de endotoxinas no intestino. Isto leva a uma potencialização dos sin-tomas clínicos e ao quadro total da Sepsis. A partir da disfunção orgânicaocorre uma falência dos órgãos.

MODS e MOF são formadores de doença com uma patofisiolo-gia complicada. Até hoje as causas moleculares precisas da origem e com-plexidade da resposta hospedeira imunológico-inflamatória em infecção gra-ve e trauma, que podem levar a um início de um SI RS e às respectivas con-seqüências cardiocirculatórias, são apenas insuficientemente compreendi-das [9].

MODS e MOF tanto podem ter gêneses infecciológicas comotambém não-infecciológicas. MODS e MOF ocorrem regularmente comocomplicações clinicamente importantes em pacientes com Sepsis, após umchoque traumático, em pacientes no pós- operatório com o emprego da má-quina cardio-pulmonar, após transplantes de órgãos, entre vários outros (fi-gura 1). Um importante patomecanismo para o surgimento de MODS e MOFé o desenvolvimento de uma síndrome de inflamação sistêmica (SIRS, [8]).Processos patofisiológicos iniciados no quadro de uma SIRS envolvem nãoapenas componentes do sistema imunológico, mas prejudicam o sistemacardiocirculatório em todas as esferas e limitam-se não apenas à depressãomiocardial e à vasodilatação. As modificações cardio-circulatórias, sobretudonas esferas da micro circulação, formam o trecho final conjuntamente e re-sultam em uma hipoxia de tecido, que vale como importante fator na patogê-nese da falência múltipla dos órgãos.

A Figura 1 descreve em exemplos os mecanismos mais impor-tantes segundo a visão atual da origem de MODS e MOF [10]: Um sistemaimune superativo desempenha um papel central no surgimento de uma fa-lência múltipla de órgãos. Assim o endotélio, através da secreção de citoqui-nas e por transmissão de adesão de leucócitos, assume um papel chavecentral crescente. Nas células endoteliais as cascatas de transdução de si-nal são ativadas, as quais por fim levam à expressão e ativação de fatoresde transcrição.

O conhecimento ainda deficiente sobre o transcorrer na fase re-cente de MODS e MOF é o motivo pelo qual até hoje não existe nenhumdiagnóstico sensível/específico, que possa discriminar entre as causas in-fecciosas e as não infecciosas. Modernos biomarcadores e diagnósticos,doravante também no campo da expressão genética, podem levar ao diag-nóstico /reconhecimento precoce da falência múltipla de órgãos, assim comoà diferenciação entre causas infecciosas e não infecciosas de um MODS eMOF, apresentam informações diagnosticas essenciais e, além disso, repre-sentam uma importante contribuição para o esclarecimento dos mecanismospatofisiológicos de inflamações sistêmicas.

Os sintomas precoces clinicamente mais freqüentemente utiliza*dos, como febre, leucocitose, taquicardia e taquipnéia na diagnose de umMODS ou MOF assim como na diferenciação entre causas infecciosas enão-infecciosas de um MODS e MOF, são totalmente inespecíficos. Parâme-tros, que captam precocemente os distúrbios da microcirculação, como asmodificações no pH da mucosa do intestino [11] e o nível de lactato no leitocapilar [12,13], a ocorrência de uma insuficiência respiratória, cujas causasnão estão nos pulmões [2], o aumento da elastase dos leucócitos [14,15], aaltura no nível de neopterina [16], a ativação de leucóticos de núcleo poli-morfo e a altura no nível IL-6 [17], são apropriados como parâmetros preco-ces para o surgimento posterior de MODS e MOF, porém não podem darnenhuma contribuição para a diferenciação entre causas infecciosas e não-infecciosas de um MODS e MOF. Há, portanto, uma necessidade urgente denovos processos diagnósticos que devem aperfeiçoar a capacidade do es-pecialista em diferenciar precocemente MODS ou MOF não infecciosos deinfecciosos, e conduzir a tratamentos apropriados específicos.

Precisamente, a distinção entre causas infecciosas e não-infecciosas de um MODS e MOF é da maior importância na medicina, já queatravés de uma tal distinção podem ser empregados por exemplo antibióti-cos específicos, o que além de evitar efeitos colaterais pelo emprego de an-tibióticos não-específicos acarreta também uma grande economia de custos.

Do mesmo modo também pode ser evitado assim: a realização nos pacien-tes de medidas diagnosticas penosas que consomem tanto tempo quantopessoal (por exemplo, transporte para CT/MRI) para identificação dos res-pectivos locais de infecção; a realização de diversos métodos microbiológi-cos (por exemplo, a análise de culturas de sangue que estão igualmente li-gadas à coleta de enorme quantidade de sangue); mas também a troca ar-riscada de todos os materiais plásticos ligados aos pacientes, tais como ca-téter de veias etc, são evitados na presença de MODS ou MOF não infec-ciosa. Vice-versa, a rápida identificação de causas infecciosas de um MODSou MOF assegura a introdução rápida de tais medidas e com isso a reduçãoda mortandade.

Progressos tecnológicos, particularmente o desenvolvimento datecnologia de microarranjo, capacitam o versado na técnica então a compa-rar 10000 ou mais genes e seus produtos genéticos concomitantemente. Oemprego de tais tecnologias de Microarranjo pode fornecer indícios do statusde saúde, mecanismos de regulação, metabolismo bioquímico e redes detransmissão de sinais. Os aperfeiçoamentos da compreensão de como umorganismo reage a infecções deveriam facilitar o desenvolvimento de moda-lidades de reconhecimento, diagnose e tratamento para doenças infeccio-sas.

Microarranjos provêm de "Southern blotting" [19], o que repre-senta o primeiro modo de iniciar a imobilização de moléculas de DNA emuma matriz sólida de um modo tridimensional. Os primeiros Microarranjosconsistiram em fragmentos de DNA, comumente com seqüência desconhe-cida, e foram colocados em uma membrana porosa (normalmente náilon)pontualmente.

Bibliotecas de cDNA, DNA genômico ou plasmídeos foram em-pregadas rotineiramente, e o material hibridizado foi marcado com um gruporadioativo [20-22].

Hoje em dia o emprego de vidro como substrato e fluorescênciapara detecção, juntamente com o desenvolvimento de novas tecnologiaspara a síntese e para a introdução dos ácidos nucléicos em densidades mui-to elevadas, permite miniaturizar arranjos de ácido nucléico com concomitan-te aumento da taxa de transferência de dados experimentais e do conteúdode informação [23-25].

Uma razão para a aplicabilidade da tecnologia de Microarranjofoi fornecida primeiramente por análises clínicas no campo da pesquisa decâncer. Aqui, perfis de expressão mostraram sua utilidade na identificaçãode atividades de genes ou grupos de genes individuais que se correlacionamcom determinados fenótipos clínicos [26]. Através da análise de diversasamostras, que provêm de indivíduos com ou sem leucemia aguda ou linfo-mas de célula B difusa, encontraram-se marcadores da expressão genética(RNA) e em seguida empregou-se esse tipo de câncer para classificaçãoclinicamente relevante [26,27]. Golub et al. verificaram que não podem serfeitas previsões confiáveis baseadas em quaisquer genes individuais, masque as previsões que se baseiam na modificação da transcrição de 53 genes(escolhidos dentre mais do que 6000 genes, que foram substituídos nos ar-ranjos) são muito similares [26].

Da WO 03/002763 sabe-se que a medição da expressão genéti-ca por meio de microarranjos pode ser empregada basicamente para a diag-nose da Sepsis e estados similares à Sepsis.

A empregabilidade básica dos perfis da expressão genética quepodem ser obtidos por exemplo por meio da técnica de microarrãnjo paradiagnóstico de SIRS, inflamações generalizadas, Sepsis e Sepsis grave estádescrita nos pedidos de patente alemães na reivindicação da presente in-venção DE 103 40 395.7, DE 103 36 511.7, DE 103 150 31.5 bem como 102004 009 952.9, aos quais é feita referência aqui quanto ao seu conteúdototal.

Sabe-se por Feezor et al. [28] que as atividades genéticas depacientes, que devido a seu tratamento cirúrgico desenvolveram um SIRScom síndrome de disfunção múltipla de órgãos (MODS), se diferenciam emcomparação com pacientes que sob as mesmas condições cirúrgicas de-senvolveram um SIRS sem MODS. Essas verificações entretanto não dãonenhuma infomação sobre a diferenciação entre MOF não infeccioso e MOFinfeccioso, já que não se constatou nenhuma infecção nos pacientes.

Para a classificação de perfis de expressão genética foram des-critos diversos métodos e sua aplicação para dados de expressão genética,como por exemplo análises da discriminação linear e quadrática, CompoundCovariant Predictor. Nearest Neiqhbor Classification, Classification trees ouSupport Vector Machines [26, 29, 30, 31, 32]. Uma visão geral sobre o em-prego de métodos de classificação para a análise de dados de expressãogenética é apresentada em [33].Alvo dos métodos de classificação é o desenvolvimento de fato-res de classificação multivariantes, que possibilitam uma previsão sobre apossibilidade de um novo conjunto de dados pertencer a uma classe. Comisso os pacientes podem ser classificados por meio de classificadores tendoem vista sua reação a um tratamento especial como por exemplo: respon-dentes e não-respondentes.

O desenvolvimento de classificadores transcorre em princípioem três etapas: 1. Escolha de características estatisticamente relevantes deum grande número de dados. Para a análise da expressão genética são es-colhidos, primeiramente por meio de testes univariantes entre diversas clas-ses, os genes estatisticamente relevantes, baseados em sua amostra deexpressão como características escolhidas. 2. A determinação dos classifi-cadores com o auxílio de diversos métodos para classificação em cujo final écolocado à disposição um conjunto de treinamento em classificadores. 3. Avalidação desses conjuntos de treinamento por meio de novos conjuntos detestes, não classificadores, dos perfis de expressão genética e a otimizaçãodo conjunto de treinamento.

Na WO 2004/108957 em geral é descrita a classificação de bio-marcadores (ácidos nucléicos e seu emprego para a diagnose de SI RS ouda Sepsis. Uma classificação e/ou emprego de biomarcadores para a diag-nose de falência múltiplas de órgãos infecciosas e/ou não infecciosas não édescrita.

No pedido de patente alemão não previamente aberto à inspe-ção pública 102004 049897.041 são primeiramente indicados marcadores daatividade genética para distinção entre falência múltipla de órgãos infecciosae não infecciosa. Lá é descrito o emprego de 1297 genes diversos para adiagnose in vitro de pacientes que estão acometidos de uma falência múlti-pla de órgãos infecciosa ou não infecciosa.

A presente invenção parte do estado da técnica mostrado na DE102004049897.041 no qual, através de verificações específicas, verificou-seo perfil da expressão genética de amostras de pacientes cujas atividadesgenéticas são classificadoras para a diagnose in vitro para distinção de fa-lência múltipla de órgãos infecciosa e não-infecciosa.

Ponto de partida para a invenção descrita no presente pedido depatente é o reconhecimento de que podem ser agrupados, por meio de clas-sificadores da atividade genética, os perfis da expressão genética de pacien-tes com MOF infecciosos ou MOV não -infecciosos.

O emprego desses classificadores não é possível com os parâ-metros clínicos empregados até agora para diagnose, mas para a introduçãode uma terapia medicinal intensiva especializada é muito significativa.

A presente invenção tem como tarefa, através do emprego declassificadores da atividade genética entre pacientes não infectados comfalência múltipla de órgãos, diferenciar uma falência múltipla de órgãos nãoinfecciosa e uma falência múltipla de órgãos infecciosa.

A tarefa da invenção é solucionada através de marcadores daatividade genética de acordo com a reivindicação 1, um método para classi-ficação de pacientes de acordo com a reivindicação 5, um microarranjo deacordo com a reivindicação 7, e um dispositivo de acordo com a reivindica-ção 8.

A seguir empregou-se o termo "Controle ITS". para pacientesque foram tratados na medicina intensiva, nos quais entretanto nenhumainfecção pode ser comprovada e nenhuma falência múltipla de órgãos foidiagnosticada.

Particularmente a presente invenção refere-se ao emprego declassificadores da atividade genética através dos quais os perfis da expres-são genética, obtidos a partir de uma amostra invitro de pacientes, são clas-sificados em falência múltipla de órgãos não-infecciosa e infecciosa.

Além disso a presente invenção, sob emprego dos classificado-res que levam à terapia, serve para análise do decurso de pacientes acome-tidos de falência múltipla de órgãos de causas não-infecciosas e infecciosas.

Os classificadores da atividade genética de acordo com a inven-ção, além disso, são úteis como critério de inclusão ou exclusão de pacien-tes acometidos por uma falência múltipla de órgãos, de causa não-infecciosaou infecciosa, em estados clínicos das fases 2-4.Uma forma de modalidade preferida da invenção refere-se a co-locar à disposição classificadores da atividade genética para o processa-mento eletrônico posterior assim como para preparação de software para adescrição da prognose individual de um paciente, para propósitos de diag-nose e/ou sistemas de processamento de dados dos pacientes. Os classifi-cadores da atividade genética são empregados aqui como base para a ava-liação automática para verificação dos perfis de expressão genética em dis-positivos para diagnósticos in vitro. Os classificadores da expressão genéticasão fixados aqui como parâmetros de valor em um software, em um circuitointegrado, uma EPROM ou outras possibilidades técnicas conhecidas pelosversados na técnica para armazenamento de parâmetros de valor.

Uma outra forma de modalidade preferida da invenção consisteem um dispositivo que é empregado como parâmetro de valor armazenadoem classificadores da atividade genética armazenada, para possibilitar umdiagnóstico in vitro de pacientes com falência múltipla de órgãos não-infecciosa e infecciosa. Um tal dispositivo contêm, além dos classificadoresda atividade genética armazenados como parâmetros de valor, uma possibi-lidade de se comparar perfis de expressão genética não-classificados deamostras de pacientes com os classificadores da atividade genética arma-zenados e indicar o resultado resultante como informação técnica. A compa-ração pode ser realizada, por exemplo, por meio de processamento eletrôni-co dos parâmetros de valores transformados em sinais eletrônicos dos clas-sificadores da atividade genética com os sinais eletrônicos que foram obtidospelos perfis de expressão genética a serem verificados. O resultado finaldessa comparação consiste na classificação do perfil da expressão genéticaa ser verificado em uma das classes da falência múltipla de órgãos infeccio-sa ou falência múltipla de órgãos não-infecciosa. Como indicador técnicointeressam mostradores analógicos e/ou digitais como, por exemplo, siste-mas de escore (similares ao escore APACHE ou SOFA empregados no di-agnóstico in vitro) ou em sílica-géis, sinais acústicos ou outros processos deemprego conhecidos pelo versado na técnica.

Em uma forma de modalidade preferida esse dispositivo possibi-lita, além disso, também a preparação de perfis de expressão genética paracomparação com os classificadores da atividade genética armazenados. A-qui esse dispositivo consiste de um módulo para a preparação de amostrasoriundas das amostras de pacientes obtidas in vitro, um módulo para a hibri-dização das amostras dos pacientes com sondas de atividade genética quesão derivadas dos classificadores da atividade genética, um módulo para aleitura dos sinais de hibridização, Um outro módulo para a análise da ima-gem dos sinais de hibridização lidos, um módulo que possibilita a composi-ção automática com os classificadores da atividade genética armazenadaassim como um módulo que possibilita a indicação da comparação resultan-te. Está claro para o versado na técnica que, dependendo do grau de auto-matização do dispositivo, nem todos os módulos no dispositivo precisam serunidos. Exemplos de dispositivos que hoje já possibilitam um ajuste automá-tico/semi- automático dos perfis de expressão doméstica são o Light Cyclerda Fábrica Roche, o Smart Cycler da Fábrica Cepheid ou o sistema AP daFábrica Clondiag Chip Technologies.

Além disso está claro para o versado na técnica que, além desseprocesso descrito neste pedido de patente para preparação dê perfis de ex-pressão genética por meio de Microarranjo-Technologie, também podem serempregados outros processos para a análise da expressão genética diferencial.

Os classificadores da atividade genética de acordo com a inven-ção também podem ser empregados para preparação de sistemas especiais"in silico" e/ou para modelagem "in silico" de vias celulares de transporte desinais.

Como classificadores da atividade genética de acordo com apresente invenção são empregados genes e/ou fragmentos de genes, quesão escolhidos do grupo que consiste em SEQ ID 1.1 até SEQ ID I.9, assimcomo fragmentos de gene deles com pelo menos 5-2000, de preferência 20-200, mais preferentemente 20-80 nucleotídeos.

Essas seqüências da SEQ ID 1.1 até a SEQ ID I.9 são abrangi-das no âmbito da presente invenção e estão no protocolo de seqüência indi-cado, que abrange a seqüência 9, que assim é constituinte da descrição dapresente invenção descrita em detalhes. O protocolo de seqüência é assimconstituinte da divulgação da invenção. Esse protocolo de seqüência contêmuma geração das seqüências individuais de SEQ ID 1.1 até SEQ ID I.9 com onúmero de acesso ao banco genético n° (entrada na Internet porhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Aqui podem ser empregados igualmente análogos sintéticospassíveis de hibridização das sondas listadas.

O emprego de mutantes de inserção, mutantes de deleção oumutantes para troca de nucleotídeos das seqüências de SEQ ID 1.1 até SEQID I.9 para os propósitos da presente invenção é igualmente cogitável, desdeque essas mutações não modifiquem essencialmente o comportamento dehibridização das seqüências para o propósito da presente invenção. Referin-do-nos aos marcadores da atividade genética, então tais mutações estãoabrangidas.

Em uma outra forma de modalidade dos classificadores da ativi-dade genética com as SEQ ID 1.1 até SEQ ID .1:9 para a classificação dosperfis de expressão genética das amostras dos pacientes com falência múl-tipla de órgãos infecciosa ou não infecciosa de acordo com a Tabela 1 estáligada a regras de escolha lógicas.

Tabela 1: Regras de escolha para a classificação do controle IST, MOV in-feccioso ou não infeccioso

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* Atividade genética super expressa, * atividade genética não expressa

Uma outra forma de modalidade da invenção é caracterizadapelo fato de que os genes ou fragmentos de genes listados na reivindicação1 e/ou as seqüências derivadas de seus RNA são substituídas pelos análo-gos sintéticos, aptâmeros assim como ácidos peptídeonucléicos.

Uma outra forma de modalidade da invenção é caracterizadapelo fato de que as amostras são escolhidas de: líquidos do corpo, particu-larmente sangue, licores, urina, líquido proveniente de ascite, líquido semi-nal, saliva, líquido proveniente de punção; conteúdo celular ou uma misturadeles.

Uma outra forma de modalidade da invenção é caracterizadapelo fato de que amostras celulares opcionalmente são submetidas a umtratamento lítico, para liberar seu teor celular.

Está claro para o versado na técnica que as características indi-viduais da invenção apresentadas nas reivindicações sem limitação sãocombináveis à vontade umas com as outras.

Como classificadores da atividade genética no sentido da inven-ção estão todas as seqüências de DNA, seqüências parciais, derivadas eanálogos sintéticos (por exemplo ácidos peptídeo nucléicos, PNA). A descri-ção da invenção referente à determinação da expressão genética no campodo RNA não apresenta nenhuma limitação, mas apenas um exemplo de em-prego.

A descrição da invenção relativa ao sangue apresenta apenasuma modalidade como exemplo da presente invenção. Como líquidos bioló-gicos no sentido da invenção estão compreendidos todos os líquidos do cor-po do homem.

Outras vantagens e características da presente invenção ocor-rem devido à descrição de um exemplo de execução, assim como por meiodo desenho.

A figura 1 mostra o percurso patológico da falência múltipla deórgãos, partindo de diferentes estados medicinais.

Exemplo de Execução

Verificação para criar e validar classificadores da atividade gené-tica para classificação de perfis de expressão genética de amostras de paci-entes em uma das classes: controle de ITS, falência múltipla de órgãos in-fecciosa ou falência múltipla de órgãos não-infecciosa.Medição da expressão genética diferencial como base para o conjunto detreinamento:

Para a medição da expressão genética diferencial para diferen-ciação entre causas infecciosas e não infecciosas de uma falência múltiplade órgãos foram realizadas verificações das amostras de sangue de 57 pa-cientes no total, que foram tratados em centros cirúrgicos de tratamento in-tensivo (CTI). Os dados da expressão genética totais formaram a base paracriação do conjunto de treinamento dos classificadores da atividade genética.

Foram retiradas amostras do sangue de 31 pacientes, que de-senvolveram um MOF infeccioso [classificado segundo 8], no quadro de suaestadia no centro de medicina intensivo.

Além disso retirou-se amostras de sangue de 26 pacientes queno quadro de sua estadia no centro de medicina intensivo desenvolveramum MOF não infeccioso [classificado segundo 8].

Além disso retirou-se amostras de sangue de 18 pacientes, queforam tratados no decorrer de sua estadia no centro de medicina intensiva (aseguir controles ITS).

Como amostras de referência serviram o RNA total das linhascelulares SIG-M5.

Características escolhidas dos três grupos de pacientes são a-presentadas na Tabela 2. Assim, dados sobre idade, sexo, e o escore SOFAse tornam medidas para a função dos sistemas orgânicos. Igualmente o ní-vel de proteína do plasma de procalcitonina (PCT) e CRP assim como o nú-mero dos leucócitos dos pacientes são indicados.

Todas as amostras dos pacientes foram co-hibridizadas com aamostra referência respectivamente em um Microarranjo .Tabela 2: Dados dos grupos de Pacientes

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* p < 0.05

Descrição Experimental:

Após a retirada do sangue, o RNA total das amostras foi isoladocom emprego de um kit de RNA do sangue PAXGen, de acordo com as ins-truções do fabricante (Qiagen).

Cultivo celular

Para o cultivo celular (amostras de controle) foram utilizadas 19culturas criocelulares (SIGM5) (congeladas em nitrogênio líquido). As célulasforam respectivamente inoculadas com 2 ml de meio Iscove (Biochrom AG)completado com 20% de soro fetal de bezerro (FCS). As culturas celularesforam em seguida incubadas por 24 horas a 37° C sob 5% de C02 em pla-cas com 12-cavidades. Depois disso o teor de 18 cavidades foi dividido em 2partes respectivamente com iguais volumes, de modo que no final estavam àdisposição 3 placas do mesmo formato (no total 36 cavidades). O cultivo foiem seguida conduzido ainda por 24 horas sob as mesmas condições. Emseguida a isto, as culturas resultantes de 11 cavidades de cada placa foramreunidas© centrifugadas (1000 x g, 5 min, temperatura ambiente). O resíduofoi rejeitado e o pélete celular foi dissolvido em 40 ml do meio acima men-cionado. Esses 40 ml de células dissolvidas foram divididas em dois cestosde 250 ml em partes iguais e, após adicionar 5 ml do meio acima menciona-do, foram novamente incubadas. Dos restantes 2 ml das duas placas rema-nescentes foram introduzidos 80 ul em cavidades vazias de placas iguaisque logo antes foram preparadas com 1 ml do meio acima. Após 48 horas deincubação apenas uma das placas com 12 cavidades foi processada comose segue: de cada cavidade foram retirados 500 ul e combinados. Os 6 mlresultantes deles foram introduzidos em um frasco de 250 ml que continhacerca de 10 ml de meio fresco. Essa mistura foi centrifugada a 1000 g por 5minutos à temperatura ambiente e dissolvida em 10 ml do meio acima men-cionado. A contagem celular subseqüente produziu o seguinte resultado: 1,5x 107 células por ml, 10 ml de volume total, número total de células: 1,5 x108. Já que a contagem celular ainda não foi suficiente, 2,5 ml da suspensãocelular acima mencionada foi introduzida em uma frasco de 250 ml (75 cm2)(no total 4 frascos). Após 72 horas de tempo de incubação respectivamente20 ml de meio fresco foi introduzido no frasco. Após as 24 horas de incuba-ção subseqüentes ocorreu a contagem celular como acima descrita, queproduziu um número celular total de 3,8 x 108 células. Para se obter a conta-gem celular desejada de 2 x 106 células, as células foram ressuspensas em4 frascos. Após um tempo de incubação de 24 horas as células foram centri-fugadas e lavadas duas vezes com solução tampão de fosfato sem Ca2+ eMg2+ (Biochrom AG).

O isolamento do RNA total ocorre por meio de kits NucleoSpinRNA L (Machery&Nagel) correspondendo aos dados do fabricante. O proce-dimento acima descrito foi repetido até que fosse obtido o número celularrequisitado. Isto foi exigido para que fosse atingida a quantidade requisitadade 6 mg de RNA, o que corresponde a uma eficácia de cerca de 600 ug deRNA por 108 células.

Transcrição Reversa / Marcação / Hibridização

Após a retirada do sangue isolou-se o RNA total das amostras com emprego de kits PAXGene do RNA do sangue (PreAnalytiX) de acordocom as instruções do fabricante e verificou-se sua qualidade. De cada amos-tra reuniu-se 10 ug de RNA total em alíquotas e juntamente com 10 ug doRNA total das células de SIGM5, foram reescritos como RNA referência aoDNA (cDNA) complementar por meio transcriptase reversa (superscript II(Invitrogen)) e o RNA em seguida é removido por hidrólise alcalina do prepa-rado. No preparado de reação uma parte de dTTP é substituída por dUTPaminoalquila (AA-dUTP), para mais tarde possibilitar a ligação do corantefluorescente ao cDNA.

Após a purificação do preparado de reação o cDNA das amos-tras e do controle com os corantes fluorescentes Alexa 647 e Alexa 555 sãocòvalentemente marcados e hibridizados em um Microarranjo da FirmaSIRS-Lab. Em um microarranjo empregado encontram-se 5308 polinucleotí-deos imobilizados com um comprimento de 55 - 70 pares de base, que res-pectivamente representam um gene humano e locais de controle para asse-gurar a qualidade. Um Microarranjo divide-se em 28 subarranjos com ummarcador de 15x15 manchas.

A hibridização e a lavagem ou secagem subseqüente foi realiza-da na estação de hibridização de HS 400 (Tecan) segundo dados do fabri-cante por mais de 10,5 horas a 42 °C. A solução de hibridização empregadaconsiste nas respectivas amostras das respectivas amostras rotuladas decDNA, 3,5x SSC (1x SSC contem 150 mM de cloreto de sódio e 15 mM decitrato de sódio), laurilsulfato de sódio 0,3% (VA/) 25% de formamida (VA/) ecada 0,8 ug de ul-1 cot-1 DNA, levedura t-RNA e poli-A RNA. A lavagemsubseqüente dos Microarranjos foi realizada com o seguinte programa àtemperatura ambiente: a cada 90 segundos lavagem com solução tampãode lavagem 1 (2x SSC, 0,03% laurilsulfato de sódio), com solução tampãode lavagem 2 (1x SSC) e em seguida com solução tampão de lavagem 3(0,2x SSC). Depois disso os Microarranjos foram secos sob um fluxo de ni-trogênio sob uma pressão de 0,75 mPa (2,5 bar) a 30°C por mais de 150segundos.

Após a hibridização os sinais de hibridização dos Microarranjosforam lidos com um scanner GenePix 4000B (Axon) e as proporções da ex-pressão dos gene expressos diferenciadas determinadas com o SoftwareGenePix Pro 4.0 (Axon).Avaliação:

Para a avaliação determinou-se a intensidade média de umamancha como o valor mediano do Spotpixel correspondente.

Correção do erro sistemático:

A correção do erro sistemático ocorreu segundo o preparado dereação de Huber et al. [34]. Assim, o aditivo e o bias multiplicativo de ummicroarranjo foi estimada dentro de um Microarranjo de 70% das amostrasgenéticas disponíveis. Para todos os outros cálculos os sinais foram trans-formados por meio de arco senohiperbólico.

Para a análise foram calculadas as proporções dos sinais dasamostras dos pacientes contra o controle geral. Isto é, para o ne j de gene dopaciente ne n o cálculo produziu o valor Gj,n = arcsinh(Scy5(j,n)) - arcsi-nh(Scy3(j,n)), sendo que [SCy3(j,n), SCy5(j,n)] denomina o par de sinal cor-respondente. Caso para um paciente um local não tenha sido avaüável (porexemplo manchas no quadro escaneado), então o respectivo valor foi carac-terizado como "valor ausente" não disponível.

Comparação Estatística:

Para a comparação foram empregados Teste de Student duplosem amostras duplas por gene. Ambas as amostras continha os valores degrupos de pacientes com MOF infeccioso ou MOF não infeccioso. Para aescolha dos genes expressos diferenciados avaliou-se o correspondentevalor p. Para o grupo de genes selecionados o valor p correspondente foimenor do que 0,05.Tabela 3: Atividades genéticas siqnificantemente aumentadas nas amostrasde Pacientes com MOV infeccioso, em comparação às atividades genéticasde Pacientes com MOV não infeccioso.

<table>table see original document page 19</column></row><table><table>table see original document page 20</column></row><table><table>table see original document page 21</column></row><table><table>table see original document page 22</column></row><table><table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table><table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table><table>table see original document page 44</column></row><table><table>table see original document page 45</column></row><table><table>table see original document page 46</column></row><table><table>table see original document page 47</column></row><table><table>table see original document page 48</column></row><table><table>table see original document page 49</column></row><table><table>table see original document page 50</column></row><table><table>table see original document page 51</column></row><table><table>table see original document page 52</column></row><table><table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table><table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table>3 denominados Cmin e Cmax) e genes com comportamento típico e robustoextraído da expressão genética por classe de pacientes.Testaqem dos classificadores da atividade genética em perfis de expressãogenética ainda não classificados (Conjunto de Teste)

Os classificadores da atividade genética fixados foram testadospor meio de regras de escolha definidas em um conjunto de teste no total de190 amostras de expressão genética ainda não classificadas dos controlesITS (56), pacientes com MOF não-infeccioso (75) ou pacientes com MOFinfeccioso (59) e validados por meio de dados clínicos.

Para tanto foram escolhidos perfis de expressão genética de pa-cientes que foram clinicamente diagnosticados como controle ITS, ou MOFnão infeccioso, ou MOF infeccioso.

Se na comparação seguinte com o conjunto de treino padrãoamostra de expressão a ser classificado foi encontradas dentro do conjuntode treino e com os limites de expressão dos classificadores da atividade ge-nética correspondente definidos por regras de seleção, (com concomitanteconformidade das regras de escolha), o padrão amostra de expressão a serclassificado foi designado dentro da classe correspondente.

Da Tabela 5 é visível a filiação dos conjuntos de teste às classescorrespondentes. Conseqüentemente 86% dos controles ITS, 80% dos paci-entes com falência múltipla de órgãos não infecciosa, assim como 63% dospacientes com falência múltipla de órgãos infecciosa são classificados corre-tamente na respectiva classe.Tabela 5: Fração percentual de 190 perfis de expressão genética a seremclassificados nas classes de controle ITS, MOF não infeccioso e MOF infec-cioso.

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Com isso os classificadores da atividade genética são empregá-veis juntamente com as regras de escolha para a invenção.

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Claims

1. Marcadores da atividade genética para classificação de paci-entes como "nenhuma infecção e sem falência múltipla dos órgãos", "acome-tidos por uma falência múltipla de órgãos não infecciosa" ou "acometido comfalência múltipla de órgãos infecciosa", sendo que os marcadores da ativida-de genética são polinucleotídeos, que são escolhidos do grupo que consistede: SEQ ID 1.1, SEQ IDJ.2, SEQ ID I.3, SEQ ID I.4, SEQ ID I.5, SEQ ID I.6,SEQ ID 1.7, SEQ ID I.8, e SEQ ID I.9 ou suas seqüências parciais.

2. Marcadores da atividade genética de acordo com a reivindica-ção 1, nos quais as seqüências parciais possuem um comprimento de 5--2000, de preferência 20-200, particularmente preferido 20-80 nucleotídéos.

3. Marcadores da atividade genética de acordo com a reivindica-ção 1-2, caracterizado pelo fato de queuma super expressão da SEQ ID 1.1 e uma subexpressão deSEQ ID I.3 ou uma superexpressão de SEQ ID I.2 e uma subexpressão deSEQ ID I.4 mostram a classificação "nenhuma infecção e sem falência múlti-pla de órgãos";uma superexpressão da SEQ ID I.3 e uma subexpressão daSEQ ID I.6 ou uma superexpressão da SEQ ID I.4 e uma subexpressão daSEQ ID I.5 mostram a classificação "falência múltipla de órgãos não infec-ciosa"uma superexpressão da SEQ ID I.5 e uma subexpressão daSEQIDI.7ou uma superexpressão da SEQ ID 1.8 e uma subexpressão daSEQ ID I.9 mostram a classificação "falência múltipla de órgãos infecciosa".

4. Marcadores da atividade genética de acordo com a reivindica-ção 1-3, caracterizado pelo fato de que as seqüências de polinucleotídeosou as seqüências parciais de polinucleotídeos são substituídas pelo menosparcialmente por análogos sintéticos, aptâmeros e/ou ácidos peptídeonucléi-cos.

5. Processo para classificação de pacientes que estão acometi-dos de uma falência múltipla de órgãos infecciosa ou não infecciosa, respec-tivamente, compreendo as seguintes etapas:isolamento da mRNA de uma amostra de pacientes;marcação de mRNA com uma unidade detectável;colocação em contacto do mRNA marcado com os marcadoresda atividade genética de acordo com a reivindicação 1, de modo que osmarcadores da atividade genética individuais se apresentam, também apósa etapa de colocação em contacto, separados uns dos outros;lavagem dos marcadores da atividade genética hibridizantes;estimulação da unidade detectável, de modo que essa emita um sinal;escolha dos sinais de hibridização para cada marcador de ativi-dade genética individual e comparação com uma amostra de referência deum paciente saudável, em queuma superexpressão da SEQ ID 1.1 e uma subexpressão daSEQ ID I.3 ou uma superexpressão da SEQ ID I.2 e uma subexpressão daSEQ ID 1.4 indica a classificação "nenhuma infecção e sem falência múltiplade órgãos";uma superexpressão da SEQ ID I.3 e uma subexpressão daSEQ ID I.6 ou uma superexpressão da SEQ ID I.4 e uma subexpressão daSEQ ID I.5 indica a classificação "falência de órgãos não infecciosa"; euma superexpressão da SEQ ID I.5 e uma subexpressão daSEQ ID I.7 ou uma superexpressão da SEQ ID I.8 e uma subexpressão daSEQ ID I.9 indicam a classificação "falência múltipla de órgãos infecciosa".

6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a amostra de líquidos do corpo do paciente abrange particular-mente sangue, licor, urina, líquido da ascites, líquido seminal, saliva, líquidoproveniente de punção, conteúdo celular ou uma mistura dos mesmos.

7. Microarranjo compreendendo o marcador da atividade genética como definido na reivindicação 1 -4.

8. Dispositivo para classificação de pacientes com falência múltipla de órgãos infecciosa ou não infecciosa, compreendendo:um módulo para a preparação das amostras de amostras de pa-cientes pesadas in vitro, um módulo para a hibridização das amostras dospacientes com sondas de atividade genética, que são derivadas de classificadores da atividade genética,um módulo para a escolha dos sinais de hibridização,um módulo para a análise de imagens dos sinais lidos da hibridi-zação,um módulo, que possibilita a comparação automática com classi-ficadores da atividade genética armazenados de pacientes saudáveis eum módulo, que possibilita a leitura da comparação resultante.