BRPI0609792A2 - anticorpos contra ccr5 e usos dos mesmos - Google Patents

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Stefan Seeber
Michael Brandt
Ralf Schumacher
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Abstract

ANTICORPOS CONTRA CCR5 E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a CCR5 humano que compreende uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada variável compreende seqüências de CDR CDR1, CDR2 e CDR3 e sendo que CDR1 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N^ os^: 9,10, 11,12, sendo que CDR2 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N^ os: 13, 14,15, sendo que CDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N^ os^: 16,17, em que as ditas CDRs são selecionadas independentemente uma da outra, ou é uma variante quimérica, humanizadas ou um fragmento de dito anticorpo, possui propriedades vantajosas para o tratamento de doenças imunossupressivas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS CONTRA CCR5 E USOS DOS MESMOS".
A presente invenção refere-se a anticorpos contra CCR5, méto-dos para sua produção, composições farmacêuticas que contêm os ditosanticorpos, e usos dos mesmos.
No decorrer dos últimos anos surgiu uma crescente compreen-são dos mecanismos específicos que HIV-I utiliza para entrar nas célulasalvo. Isto facilitou os esforços para desenvolver fármacos que atacam etapasnão-contínuas neste processo. O primeiro fármaco para entrada alvo foi re-centemente aprovado para uso clínico (enfuvirtida, T20; Lazzarin, A., et al.,N. Engl J. Med. 348 (2003) 2186-2195). Enfuvirtida é um fármaco peptídicoque bloqueia a fusão em uma etapa subseqüente à ligação ao receptor dequimiocina.
A infecção pelo HIV-I é iniciada por interações entre a glicoprote-ína do envelope viral (Env) e um complexo receptor celular compreendido deCD4 mais um receptor de quimiocina (Pierson, T.C., and Doms, R. W., Im-muno. Lett. 85 (2003) 113-118; and Kilby, J.M., and Eron, J.J., N. Engl. J.Med. 348 (2003) 2228-2238). Env possui duas subunidades: a glicoproteínade superfície gp 120 que interage com os receptores CD4 celulares e que énão-covalentemente associada com a subunidade de transmembrana dovírus gp 41. Gp41 ancora gp 120 à membrana viral, e também é responsávelpela fusão. A ligação de gp 120 a CD4 sobre células inicia um processo dealteração adaptável que expõe ou cria um sítio de ligação que permite quegp 120 interaja com um receptor de quimiocina de superfície celular, o "co-receptor". Os receptores de quimiocina são sete receptores acoplados porproteína G de transmembrana (7 TM GPCRs) que normalmente transmitemsinais em resposta a quimiocinas, pequenas citocinas com quimiotático, fun-ções inflamatórias e outras.
Uma grande proporção de fármacos em uso clínico são dirigidosem outros 7TM GPCRs, e então marcar estas moléculas para bloquear aentrada viral é uma extensão do tipo mais bem sucedido de programas dedesenvolvimento de fármaco no passado. Isolamentos de HIV-I requeremque CD4 e um co-receptor entrem e infectem as células. O receptor CCR5de quimiocina CC é um co-receptor para cepas macrofagotrópicas (R5) eexerce uma função importante na transmissão sexual de HIV-I (Berger, E.A.,AIDS 11 (Suppl. A) (1997) S3-S16; Bieniasz, P.D., and Cullen, B.R., Fronti-ers in Bioscience 3 (1998) 44-58; Littman, D.R., Cell 93 (1998) 677-680).
CCR5 é usado pela maioria dos isolamentos primários de HIV-1e é fundamental para o estabelecimento e persistência de infecção. Ade-mais, a função de CCR5 é dispensável para saúde humana. Um alelo deCCR5 mutante, "CCR5 A 32", codifica uma proteína truncada, não-funcional(Samson, M., et al., Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M., et al, Science 273(1996) 1856-1862). Os indivíduos homozigotos para a mutação são despro-vidos de expressão de CCR5 e são fortemente protegidos de infecção peloHIV-1. Estes não demonstram nenhuma conseqüência observável no fenóti-po e são altamente resistentes à infecção pelo HIV trópico M, se os indiví-duos heterozigotos presentes apresentarem progressão da doença atrasada(Schwarz, M.K., and Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358).A falta de CCR5 refere-se à ausência de conseqüências adversas visíveis,provavelmente porque CCR5 é parte de uma rede de quimiocina altamenteredundante como receptor para a quimiocinas MIP 1a, MIP-1B e RANTES,que compartilham muitas funções de superposição, e a maioria destas pos-suem receptores alternativos (Rossi, D., and Zlotnik, A., Annu. Rev. Immu-nol. 18 (2000) 217-243). A identificação de CCR5 como um co-receptor deHIV-1 se baseou na capacidade de seus ligantes, MIP-1a, MIP-1B e RAN-TES para bloquear infecção por R5, porém não por R5X4 ou isolamentos deX4(Cocchi, F., etal., Science 270 (1995) 1811-1815).
CCR5 também é um receptor das quimiocinas "cluster" que sãoproduzidas principalmente durante respostas inflamatórias e controlam orecrutamento de neutrófilos (quimiocinas CXC) e macrófagos e subconjuntosde células T. (células Th1 e Th2 auxiliares T). As respostas de Th1 são tipi-camente aquelas que envolvem imunidade mediada por célula eficaz contravírus e tumores, por exemplo, se as respostas de Th2 forem consideradasessenciais em alergias. Portanto, os inibidores dos mesmos receptores dequimiocina podem ser úteis como imunomoduladores. Para respostas deTh1, as respostas muito ativas são reduzidas, por exemplo, em autoimuni-dade inclusive artrite reumatóide ou, para respostas de Th2, para diminuirataques de asma ou respostas alérgicas inclusive dermatite atópica, (Vide,por exemplo, Schols, D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller,A., and Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol 36 (2004) 35-38; Kazmierski,W.M., et al., Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, T.,Trends Immunol. 23 (2002) 347-351).
Os anticorpos contra CCR5 são, por exemplo, PRO 140 (Olson,W.C., et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155) and 2D7 (Samson, M., et al., J.Biol. Chem 272 (1997) 24934-24941). Os anticorpos adicionais são mencio-nados em US20040043033, US6610834, US20030228306,US20030195348, US20030166870, US20030166024, US20030165988,US20030152913, US20030100058, US20030099645, US20030049251,US20030044411, US20030003440, US6528625, US20020147147,US20020146415, US20020106374, US20020061834, US20020048786,US20010000241, EP1322332, EP1263791, EP1207202, EP1161456,EP1144006, WO2003072766, WO2003066830, WO2003033666,WO2002083172, WO0222077, WO0158916, WO0158915, WO0143779,WO0142308.
O objetivo da invenção é proporcionar novos anticorpos contraCCR5 que são principalmente usados como um agente terapêutico paraAIDS.
Sumário da Invenção
A invenção compreende um anticorpo que se liga a CCR5 carac-terizado pelo fato de que a seqüência de aminoácido de cadeia pesada vari-ável CDR3 de dito anticorpo é selecionada a partir do grupo que consistenas seqüências CDR3 de cadeia pesada SEQ ID Ne: 16 ou 17.
A invenção proporciona um anticorpo que se liga a CCR5, quecompreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve variável, caracterizadopelo fato de que a cadeia pesada variável compreende seqüências de CDRCDR1, CDR2 e CDR3 e sendo que CDR1 é selecionado a partir do grupoque consiste em SEQ ID N955: 9, 10, 11, 12, sendo que CDR2 é selecionadoa partir do grupo que consiste em SEQ ID N9S: 13, 14, 15, sendo que CDR3é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N95: 16,17, onde asditas CDRs são selecionadas independentemente uma da outra.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que a cadeia leve variável compreende seqüências deCDR CDR1, CDR2 e CDR3, e CDR1 é selecionado entre SEQ ID NeS: 18,19, 20, CDR2 é selecionado entre SEQ ID NQS: 21, 22, 23 e CDR3 é selecio-nado entre SEQ ID N953: 24 ou 25 onde as ditas CDRs são selecionadas in-dependentemente uma da outra.
O anticorpo é de preferência caracterizado pelo fato de que con-tém como CDRs de cadeia pesada os CDRs de SEQ ID N9: 1 e como CDRsde cadeia leve os CDRs de SEQ ID N-: 2, como CDRs de cadeia pesada asCDRs de SEQ ID N9: 3 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQ IDN9: 4, como CDRs de cadeia pesada as CDRs de SEQ ID N9: 5 e como C-DRs de cadeia leve as CDRs de SEQ ID N9: 6, como CDRs de cadeia pesa-da as CDRs de SEQ ID N9: 7 e como CDRs de cadeia leve as CDRs de SEQIDN9:8.
As seqüências de CDR podem ser determinadas de acordo coma definição padrão de Kabat et al., Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethes-da, MD (1991). As CDRs de SEQ ID N9: 1-8 são mostradas em SEQ ID N9:9-25.
As CDRs sobre cada cadeia são separadas por estrutura de aminoácidos.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que o dito anticorpo liga CCR5 e compreende uma regiãoleve e pesada variável independentemente selecionada a partir do grupo queconsiste em
a) o domínio variável de cadeia pesada (VH) definido por se-qüência de aminoácido SEQ ID N9: 1 e domínio variável de cadeia leve (VH)definido por SEQ ID N9:2;b) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID NQ: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID N9:4;
c) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID N9:5 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID N9:6;
d) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID N-:7 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID Ne:8;
ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada compreende umaseqüência de aminoacido independentemente selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID N-: 1, 3, 5 e 7.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que a região variável de cadeia leve compreende umaseqüência de aminoacido independentemente selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID N9: 2, 4, 6, e 8.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que as cadeias constantes são de origem humana. Taiscadeias constantes são bem conhecidas no estado da técnica e por exemplodescritas por Kabat (Vide, por exemplo, Johnson, G., and Wu, T.T., NucleicAcids Res. 28 (2000) 214-218). Por exemplo, uma região constante de ca-deia pesada humana útil compreende uma seqüência de aminoacido inde-pendentemente selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID Ne:26 e 27. Por exemplo, uma região constante de cadeia leve humana útilcompreende uma seqüência de aminoacido de uma região constante de ca-deia leve kappa de SEQ ID N9: 28. É adicionalmente preferido que o anticor-po é de origem murina e compreende a estrutura de seqüência variável deum anticorpo de camundongo de acordo com Kabat (Vide, por exemplo,Johnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218).
Os anticorpos inibem uma ou mais funções de CCR5 humano,tal como ligante que se liga a CCR5, atividade de sinalização (por exemplo,ativação de uma proteína G de mamífero, indução de um aumento rápido etransitório na concentração de Ca2+ livre citosólico e/ou estimulação de umaresposta celular (por exemplo, estimulação de quimiotaxia, exocitose ou libe-ração de mediador inflamatório por leucócitos, ativação de integrina)).
Os anticorpos inibem a ligação de RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1beta e/ou HIV a CCR5 humano e inibem funções mediadas por CCR5 hu-mano, tipo trânsito dos leucócito, entrada de HIV dentro de uma célula, ati-vação de célula T, liberação de mediador inflamatório e/ou degranulação deleucócito.
O anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamente aCCR5 humano e inibe a fusão de HIV com uma célula alvo em uma análiseque compreende contactar o vírus, na presença de dita célula alvo, com oanticorpo em uma concentração eficaz para inibir a fusão de membrana en-tre o vírus e dita célula com um valor IC50 de 4,0 ug/ml ou menos.
O anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamente aCCR5 e inibe a fusão de membrana entre uma primeira célula que co-expressa CCR5 e polipeptídeos CD4 e uma segunda célula que expressauma proteína env de HIV com um valor IC50 de 1,5 ug/ml ou menos, de pre-ferência 0,3 ug/ml ou menos.
O anticorpo de acordo com a invenção de preferência não inibea ligação de quimiocina em uma análise de ligação a CCR1, CCR2, CCR3,CCR4, CCR6 e CXCR4 em uma concentração de anticorpo de até 100ug/ml.
Um anticorpo de acordo com a invenção de preferência não es-timula o aumento de Ca2+ intracelular, detectado em células de CHO queexpressam CCR5 e Galphalô em uma concentração de anticorpo de até 50ug/ml.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência de isó-topo humano lgG1, lgG2, lgG3 ou lgG4, por meio do qual lgG1 ou lgG4 sãopreferidos.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência de isó-topo lgG4, de preferência com mutação adicional S228P ou é de preferênciade isótopo lgG1, modificado na região de articulação em cerca de aa 220-240 entre CH1 e CH2 (Angal, S., et al, Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108)e/ou a segunda região interdomínio de cerca de aa 330 entre CH2 e CH3(numeração de acordo com Kabat, Vide, por exemplo, Johnson, G., and Wu,T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Tal modificação evita a funçãoefetora (ADCC e/ou CDC). A troca de classe IgG pode ser realizada por tro-ca das cadeias leves e pesadas constantes do anticorpo por cadeias leves epesadas de um anticorpo da classe desejada, tipo mutantes lgG1 ou lgG4.
Tais métodos são bem conhecidos no estado da técnica.
O anticorpo de acordo com a invenção é de preferência caracte-rizado pelo fato de que é de subclasse humana lgG1, que contém pelo me-nos uma mutação em L234 (leucina na posição de aminoácido 234), L235,D270, N297, E318, K320, K322, P331 e/ou P329 (numeração de acordo comíndice EU). De preferência o anticorpo é de tipo lgG1 humano que compre-ende mutações L234A (alanina em vez de leucina na posição de aminoácido234) e L235A.
A invenção refere-se, portanto, de preferência a anticorpos ca-racterizada pelo fato de que os ditos anticorpos se ligam a CCR5, contémuma parte Fc de origem humana e não se ligam a fator de complementohumano Clq e/ou ativa C3. De preferência, os anticorpos não se ligam a pelomenos um receptor Fcv humano.
A invenção proporciona adicionalmente linhas celulares de hibri-doma que produzem anticorpos monoclonais de acordo com a invenção. Aslinhas celulares de hibridoma preferidas de acordo com a invenção foramdepositadas com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu-ren GmbH (DSMZ), Germany. Os anticorpos obteníveis de ditas linhas celu-lares são modalidades preferidas da invenção.
Uma modalidade adicional da invenção refere-se a um anticorpoque se liga a CCR5, caracterizado pelo fato de que é produzido por linhacelular m<CCR5>Pz01.F3, m<CCR5>Pz04.1F6, m<CCR5>Pz03.1C5 oum<CCR5>Pz02.1CII. A seqüência dos polinucleotídeos contida nestes mate-riais depositados, bem como a seqüência de aminoácido dos polipeptídeoscodificados por estes, estão sendo controladas no caso de qualquer conflitocom as seqüências descritas no protocolo de seqüência.
O anticorpo de acordo com a invenção se liga a CCR5 humanoem competição com um anticorpo de uma linha celular selecionada a partirdo grupo que consiste em anticorpos A a E.
A invenção compreende adicionalmente uma molécula de ácidonucléico que codifica uma cadeia de anticorpo, uma cadeia variável ou umdomínio CDR desta de acordo com a invenção. Os polipeptídeos codificadossão capazes de se reunirem juntamente com uma outra respectiva cadeia deanticorpo para resultar em uma molécula de anticorpo contra CCR5 de acor-do com a invenção.
A invenção proporciona adicionalmente vetores de expressãoque contêm os ditos ácido nucléicos, e células hospedeiras que contêm taisvetores para a produção recombinante de tal anticorpo capaz de expressar odito ácido nucléico em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica.
A invenção compreende adicionalmente uma célula hospedeiraprocariótica ou eucariótica que compreende um vetor de acordo com a in-venção.
A invenção compreende adicionalmente um método para a pro-dução de um anticorpo humano recombinante de acordo com a invenção,caracterizado pelo fato de que expressa um ácido nucléico de acordo com ainvenção em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e recupera odito anticorpo de dita célula. A invenção compreende adicionalmente o anti-corpo obtenível por meio de tal método recombinante.
Os anticorpos de acordo com a invenção mostram benefíciospara pacientes necessitados de uma terapia de marcação de CCR5. Os an-ticorpos de acordo com a invenção possuem novas propriedades inventivasque causam benefício para um paciente que sofre de tal doença, especial-mente que sofre de imunossupressão, especialmente que sofre de infecçãopelo HIV.
A invenção proporciona adicionalmente um método para tratarum paciente que sofre de imunossupressão, especialmente que sofre deinfecção pelo HIV, que compreende administrar em um paciente diagnosti-cado com tal doença (e, portanto, está necessitado de tal terapia) uma quan-tidade eficaz de um anticorpo que se liga a CCR5 de acordo com a inven-ção. O anticorpo é administrado de preferência em uma composição farma-cêutica.
A invenção compreende adicionalmente o uso de um anticorpode acordo com a invenção para o tratamento de um paciente que sofre deimunossupressão e para a fabricação de uma composição farmacêutica deacordo com a invenção. Ademais, a invenção compreende um método paraa fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção.
A invenção compreende adicionalmente uma composição far-macêutica que contém um anticorpo de acordo com a invenção em umaquantidade farmaceuticamente eficaz, opcionalmente juntamente com umtampão e/ou um adjuvante útil para a formulação de anticorpos para propósi-tos farmacêuticos.
A invenção proporciona adicionalmente composições farmacêu-ticas que compreendem tais anticorpos em um veículo farmaceuticamenteaceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode ser incluí-da em um artigo ou kit de fabricação.
Descrição Detalhada da Invenção
O termo "anticorpo" abrange diversas formas de estruturas deanticorpo que incluem, porém sem caráter limitativo, os anticorpos totais,fragmentos de anticorpo. O anticorpo de acordo com a invenção é de prefe-rência um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico ou de forma adicionalanticorpo geneticamente engenheirado desde que as propriedades caracte-rísticas de acordo com a invenção sejam mantidas.
"Fragmentos de Anticorpo" compreendem uma parte de um anti-corpo de comprimento total, de preferência a região variável do mesmo oupelo menos a parte de ligação de antígeno do mesmo. Exemplos de frag-mentos de anticorpo incluem anticorpos bivalentes, moléculas de anticorpode cadeia única, imunotoxinas e anticorpos multiespecíficos formados a par-tir de fragmentos de anticorpo. Ademais, os fragmentos de anticorpo com-preendem polipeptídeos de cadeia única que possuem as características deuma cadeia VH, ou seja que são capazes de se reunirem juntamente comuma cadeia VL ou de uma cadeia VL que se liga a CCR5, ou seja, que sãocapazes de se reunirem juntamente com uma cadeia VH a um bolso de liga-ção de antígeno funcional e dessa forma proporciona-se a propriedade parainibir a fusão de membrana ou fusão de HIV com uma célula alvo.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpomonoclonal" como usado aqui referem-se a uma preparação de moléculasde anticorpo de uma única composição de aminoácido. O termo "anticorpoquimérico" refere-se a um anticorpo monoclonal que compreende uma regi-ão variável, ou seja, região de ligação, de camundongo e pelo menos umaparte de uma região constante derivada de uma fonte ou espécies diferen-tes, geralmente preparadas por técnicas de DNA recombinante. Os anticor-pos quimericos que compreendem uma região variável de camundongo euma região constante de humano são especialmente preferidos. Tais anti-corpos quimericos de camundongo/humano são o produto de genes de imu-noglobulina expressos que compreende segmentos de DNA que codificamas regiões variáveis de imunoglobulina de camundongo e segmentos deDNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina de humano. Ou-tras formas de "anticorpos quimericos" abrangidas pela presente invençãosão aquelas onde a classe ou subclasse foi modificada ou alterada daquelado anticorpo original. Tais anticorpos "quimericos" também são referidoscomo "anticorpos de classe alterada". Os métodos para produzir anticorposquimericos envolvem DNA recombinante convencional e técnicas de trans-fecção genética agora bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Morri-son, S.L, et al., Proc. Natl. Acad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Patent N28U.S. 5.202.238 e 5.204.244.
O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos onde aestrutura ou "regiões determinantes de complementaridade" (CDR) foi modi-ficada para compreende as CDR de uma imunoglobulina de especificidadediferente como comparadas com aquelas da imunoglobulina de origem. Emuma modalidade preferida, CDR de camundongo são enxertadas dentro daregião de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo hu-manizado". Vide, por exemplo, Riechmann, L, et al., Nature 332 (1988) 323-327; and Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. As CDRs parti-cularmente preferidas correspondem àquelas que representam seqüênciasque reconhecem os antígenos observados acima para anticorpos quiméricose bifuncionais.
O termo "ligação a CCR5" como usado aqui refere-se à ligaçãoIas CHO que expressam CCR5). A ligação é obtida se o anticorpo gerar umarazão S/N (sinal/ruído) de 5 ou mais, de preferência 10 ou mais em umaconcentração de anticorpo de 100 ng/ml.
Um anticorpo de acordo com a invenção mostra uma ligação aomesmo epitopo de CCR5 conforme um anticorpo selecionado a partir dogrupo que consiste nos anticorpos A a E ou são inibidos na ligação a CCR5devido ao impedimento estérico de ligação. A ligação de epitopo é investiga-da utilizando mutação de alanina de acordo com o método descrito por Ol-son, W.C. et al., J. Virol. 73 (1999) 4145-4155 para mapeamento de epitopo.Uma redução de sinal de 75% ou mais mostra que o(s) aminoácido(s) modi-ficado(s) contribui/contribuem para o epitopo de dito anticorpo. A ligação aomesmo epitopo é obtida, se os aminoácidos que contribuem para o epitopodo anticorpo investigado e os aminoácidos que contribuem para o epitopo deanticorpo A, B, C, D ou E forem idênticos.
O anticorpo C, que mostra valores IC5o menores do que o anti-corpo 2D7 em análises de HIV, se liga a um epitopo que inclui aminoácidossobre o domínio ECL2 de CCR5 (Lee, B., et al., J. Biol. Chem. 274 (1999)9617-9626) que é diferente do epitopo reconhecido por anticorpo 2D7 (2D7se liga a aminoácidos K171 e E172 de ECL2A, porém não a aminoácidosECL2B 184-189). A ligação de epitopo a anticorpo C é considerada como20% para CCR5 mutante K171A ou E172A (se glu 172 for modificada paraala). A ligação de epitopo de 100% é definida como CCR5 tipo selvagem.Uma modalidade adicional da invenção é, portanto, um anticorpo que se ligaa CCR5 ao mesmo epitopo que o anticorpo C se liga.
O termo "estrutura molecular de quimiocina de sete transmem-branas" como usado aqui refere-se à estrutura natural, CCR5 mostra quandoestá posicionado na bicamada de membrana celular (veja, por exemplo, Op-permann, M., Cell. Sig. 16 (2004) 1201-1210). Conforme outros receptoresacoplados por proteína 1b G, CCR5 é composto de um domínio de terminal-N extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de terminal-Ccitoplasmático. O domínio de transmembrana consiste em sete segmentosde transmembrana hidrofóbica, ligados por três segmentos citoplasmáticos etrês extracelulares. O anticorpo de acordo com a invenção se liga a CCR5em sua estrutura molecular de quimiocina de sete transmembranas.
O termo "epitopo" refere-se a um determinante de proteína ca-paz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos geralmenteconsistem em agrupamentos de superfície quimicamente ativa de moléculastais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente possuemcaracterísticas estruturais tridimensionais específicas, bem como caracterís-ticas de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não-conformacionais são distinguidos pelo fato de que a ligação ao primeiro, po-rém não ao último, é perdida na presença de solventes de desnaturação. Depreferência, um anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamentea CCR5 nativo, porém não ao desnaturado. Tal anticorpo compreende depreferência CDR3 de cadeia pesada SEQ ID Ng: 17, e de preferência, alémdisso, CDRs de cadeia pesada SEQ ID NQ:10, 11, 12, 14 e/ou 15. De prefe-rência, tal anticorpo é anticorpo B, C, D ou E, ou compreende as regiões va-riáveis de anticorpo B, C, D ou E. De preferência, um anticorpo que se liga aCCR5 desnaturado é anticorpo A ou compreende as regiões variáveis deanticorpo A.
O termo "fusão de membrana" refere-se à fusão entre uma pri-meira célula que co-expressa CCR5 e polipeptídeos CD4 e uma segundacélula que expressa uma proteína env do HIV. A fusão de membrana é de-terminada por ensaio com gene repórter luciferase.
O termo "inibição de fusão de HIV com uma célula alvo" se refe-re à inibição de fusão de HIV com uma célula alvo medida em um ensaioque compreende contactar o vírus, na presença de dita célula alvo, com oanticorpo em uma concentração eficaz para inibir a fusão de membrana en-tre o vírus e a dita célula e medir a atividade de gene repórter luciferase.
O termo "molécula de ácido nucléico", como usado aqui, preten-de incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácidonucléico pode possuir cadeia simples ou cadeia dupla, porém de preferênciaconsiste em DNA de cadeia dupla.
A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), aregião variável de uma cadeia pesada (VH)) como usado aqui denota cadapar de cadeias leves e pesadas que está diretamente envolvido na ligaçãodo anticorpo ao antígeno. Os domínios de cadeias leves e pesadas possuema mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de es-trutura (FR) cujas seqüências são amplamente conservadas, conectadas portrês "regiões hipervariáveis" (ou regiões determinantes de complementarida-de, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação em folha-{5 eas CDRs podem formar alças que conectam a estrutura em folha-p. As C-DRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional atravésdas regiões de estrutura e formam juntamente com as CDRs da outra cadeiao sítio de ligação de antígeno. As regiões CDR3 de cadeia leve e pesada deanticorpo exercem uma função particularmente importante na especificidadede ligação/afinidade dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto,proporcionam um objetivo adicional da invenção.
Os termos "região hipervariável" ou "parte de ligação de antíge-no de um anticorpo" quando usados aqui referem-se aos resíduos de ami-noácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. Aregião hipervariável compreende resíduos de aminoácido das "regiões de-terminantes de complementaridade" ou "CDRs". "Estrutura" ou regiões "FR"são aquelas regiões de domínio variáveis em vez dos resíduos de regiãohipervariável como definido aqui. Portanto, as cadeias variáveis leves e pe-sadas de um anticorpo compreendem a partir de terminais N a C os domí-nios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Especialmente, CDR3 dacadeia pesada é a região que mais contribui para ligação de antígeno e defi-ne o anticorpo e o anticorpo de acordo com a invenção é caracterizado pelofato de que compreende em sua região variável de cadeia pesada a seqüên-cia CDR3 SEQ ID NQ:16 ou SEQ ID Ne:17. CDR e regiões FR são determi-nadas de acordo com a definição padrão de Kabat et al., Sequences of Pro-teins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Insti-tutes of Health, Bethesda, MD (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alçahipervariável".
Os termos "ácido nucléico" ou "molécula de ácido nucléico", co-mo usados aqui, pretendem incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA.Uma molécula de ácido nucléico pode ser de cadeia simples ou cadeia du-pla, porém de preferência consiste em DNA de cadeia dupla.
O ácido nucléico é "ligado de forma operável" quando este forcolocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico.
Por exemplo, DNA de uma pré-seqüência ou líder secretor é ligado de formaoperável ao DNA de um polipeptídeo se este for expresso como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensi-ficador é ligado de forma operável a uma seqüência de codificação se esteafetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é li-gado de forma operável a uma seqüência de codificação se este estiver po-sicionado para facilitar a tradução. Geralmente, "ligado de forma operável"significa que as seqüências de DNA que são ligadas são colineares, e, nocaso de um líder secretor, contíguas e em quadro de leitura. Entretanto, osintensificadores não precisam ser contíguos. A ligação é realizada por liga-ção em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os a-daptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordocom a prática convencional.
Como usado aqui, as expressões "célula", "linha celular", e "cul-tura celular" são usadas de forma intercambiável e todas tais designaçõesincluem progênie. Desta maneira, as palavras "transformantes" e "célulastransformadas" incluem a célula e culturas principais em questão derivadasdestas sem levar em consideração o número de transferências. Também éentendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica em teorde DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie varianteque possui a mesma função ou atividade biológica como analisado na célulaoriginalmente transformada está incluída.
Os "domínios constantes" não estão diretamente envolvidos naligação de um anticorpo a um antígeno, porém apresentam funções efetoras.Dependendo da seqüência de aminoácido da região constante de suas ca-deias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes:IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversos dos mesmos podem ser adicionalmentedivididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, e lgG4,lgA1 e lgA2. As regiões constantes de cadeia pesada que correspondem àsclasses diferentes de imunoglobulinas são chamada, a, õ, £, v e u, respecti-vamente. Os anticorpos de acordo com a invenção são de preferência detipo IgG.
Como usado aqui o termo "parte Fc derivada de origem humana"indica uma parte Fc que é ou uma parte Fc de um anticorpo humano da sub-classe lgG4 ou uma parte Fc de um anticorpo humano da subclasse lgG1,lgG2 ou lgG3 que é modificada de tal maneira que nenhuma ligação de FcR(FcYRIHa) e/ou nenhuma ligação de C1q como definido abaixo possa serdetectada. Uma "parte Fc de um anticorpo" é um termo bem conhecido peloversado na técnica e definido sobre a base de clivagem por papaína de anti-corpos. Os anticorpos de acordo com a invenção contêm como parte Fc umaparte Fc derivada de origem humana e de preferência todas as outras partesdas regiões constantes de humano. De preferência a parte Fc é uma parteFc humana e especialmente preferida da subclasse lgG4 humana ou umaparte Fc modificada de subclasse lgG1 humana. As mais preferidas são aspartes Fc e regiões constantes de cadeia pesada mostradas em SEQ ID N9:26 e 27 , SEQ ID Ne: 26 com mutações L234A e L235A ou SEQ ID N9:27com mutação S228P.
Embora lgG4 mostre ligação de receptor Fc reduzida (FcYRMIa),os anticorpos de outras subclasses IgG mostram ligação forte. Entretanto,Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidrato Fc), Pro329 e 234,235, 236 e 237 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434, e His435são resíduos que também proporcionam, se alterados, ligação de FcR redu-zida (Shields, R.L, et al. J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., etal. FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al. Immunology 86 (1995)319-324; and EP 0307434). De preferência, um anticorpo de acordo com ainvenção está relacionado com a ligação de FcR de subclasse lgG4 ou desubclasse lgG1 ou lgG2 com uma mutação em S228, L234, L235 e/ou D265,e/ou contém a mutação PVA236. As mutações S228P, L234A, L235A,L235E e/ou PVA236 são preferidas. As mutações de lgG4 sobre S228P elgG1 sobre L234A + L235A são especialmente preferidas.
A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ativa-ção de complemento e ligação de C1q. Ao mesmo tempo em que a influên-cia de um anticorpo sobre o sistema de complemento depende de certascondições, a ligação a C1q é induzida por sítios de ligação definidos na parteFc. Tais sítios de ligação são conhecidos no estado da técnica e descritos,por exemplo, por Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Bru-nhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R.,et al., Nature 288 (1980) 338- 344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol.37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184;Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161- 12168; Morgan, A., et al., Im-munology 86 (1995) 319-324; and EP 0307434. Tais sítios de ligação são,por exemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329(numeração de acordo com índice EU de Kabat). Os anticorpos de subclas-se lgG1, lgG2 e lgG3 geralmente mostram ativação de complemento e liga-ção a C1q e C3, se lgG4 não ativar o sistema de complemento e se não ligaraC1qeC3.
A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga a C-CR5 e não se liga ao receptor Fc e/ou fator de complemento C1q. O anticor-po não obtém citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC). De preferência, este an-ticorpo é caracterizado pelo fato de que se liga a CCR5, contém uma"parteFc derivada de origem humana e não se liga a receptor Fc e/ou fator decomplemento C1q. Mais preferivelmente, este anticorpo é um anticorpo hu-mano ou humanizado ou um anticorpo depletado de antígeno de célula T,por exemplo, de acordo com WO 98/52976 e WO 00/34317. A ligação deC1q pode ser medida de acordo com Idusogie, E.E., et al., J. Immunol.164(2000) 4178-4184. Nenhuma "ligação de C1q" é encontrada se OD 492-405nm for inferior a 15% do valor da ligação de C1q humana para o anticorpocom parte Fc não-modificada (tipo selvagem) em uma concentração de anti-corpo de 8 ug/ml. ADCC pode ser medido como ligação do anticorpo aFcYRlHa humano sobre células NK humanas.
A ligação é determinada em uma concentração de anticorpo de20 ug/ml. "Nenhuma ligação FcR ou nenhum ADCC" refere-se a uma ligaçãode até 30% a FcYRMIa humano sobre células NK humanas em uma concen-tração de anticorpo de 20 ug/ml comparada com a ligação do mesmo anti-corpo de lgG1 humano (SEQ ID Ng:26).
Os anticorpos de acordo com a invenção incluem, além disso,tais anticorpos que possuem "modificações de seqüência conservadoras"(anticorpos variantes), modificações de seqüência de nucleotídeo e aminoá-cido que não afetam ou alteram as características mencionadas acima doanticorpo de acordo com a invenção. As modificações podem ser introduzi-das por técnicas padrão conhecidas, tais como, mutagênese sítio-dirigida emutagênese mediada por PCR. As substituições de aminoácido conservado-ras incluem aquelas onde o resíduo de aminoácido é substituído por um re-síduo de aminoácido que possui uma cadeia lateral similar. As famílias deresíduos de aminoácido que possuem cadeias laterais similares foram defi-nidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias lateraisbásicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas(por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polaresnão-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni-na, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não-polares (por exemplo,alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeiaslaterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeiaslaterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).Desta maneira, um resíduo de aminoácido não-essencial prognosticado emum anticorpo anti-CCR5 humano pode ser de preferência substituído poroutro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Um anti-corpo anti-CCR5 "variante", refere-se, portanto, no presente documento auma molécula que se difere em seqüência de aminoácido de uma seqüênciade aminoácido de anticorpo anti-CCR5 "de origem" em até dez, de preferên-cia de cerca de duas a cerca de cinco, adições, deleções e/ou substituiçõesem uma ou mais regiões variáveis da cadeia pesada fora do anticorpo deorigem CDR3. Cada outra região CDR compreende no máximo uma únicaadição, deleção e/ou substituição de amino. A invenção compreende um mé-todo para modificar a seqüência de aminoácido de CDR de um anticorpo deorigem que se liga a CCR5, caracterizado pelo fato de que seleciona umaCDR de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQID NQS: 1, 3, 5 e 7 e/ou uma CDR de cadeia leve de anticorpo selecionada apartir do grupo que consiste em SEQ ID NQS: 2, 4, 6 e 8, proporcionar umácido nucléico que codifica a dita seqüência de CDR de aminoácido inicial,modificar o dito ácido nucléico de modo que um aminoácido seja modificadoem CDR1 e cadeia pesada, um aminoácido é modificado em CDR2 de ca-deia pesada, 1-3 aminoácidos são modificados em CDR2 de cadeia leve, 1-3aminoácidos são modificados em CDR2 de cadeia leve, e/ou 1-3 aminoáci-dos são modificados em CDR3 de cadeia leve, expressar a dita seqüênciade aminoácido de CDR modificado em uma estrutura de anticorpo, calcularse o dito anticorpo se liga a CCR5 e selecionar a dita CDR modificada se oanticorpo se ligar a CCR5. De preferência, tais modificações são modifica-ções de seqüência conservadora.
As substituições de aminoácido podem ser realizadas por muta-gênese baseada na modelagem molecular como descrito por Riechmann, L,et al, Nature 332 (1988) 323-327 e Queen, C, et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA 86 (1989) 10029-10033.
Uma modalidade adicional da invenção consiste em um métodopara a produção de um anticorpo contra CCR5 que não se liga a receptorFcy e/ou C1q caracterizado pelo fato de que a seqüência de um ácido nu-cléico que codifica a cadeia pesada de um anticorpo tipo lgG1 humano quese liga a CCR5 é modificada de tal maneira que o dito anticorpo modificadonão se ligue a C1q e/ou receptor Fcy, sendo que o dito ácido nucléico modi-ficado e o ácido nucléico que codifica a cadeia leve de dito anticorpo sãoinseridos dentro de um vetor de expressão, sendo que o dito vetor é inseridoem uma célula hospedeira eucariótica, a proteína codificada é expressa erecuperada da célula hospedeira ou do sobrenadante. De preferência, o an-ticorpo é modificado por "mudança de classe", isto é, alteração ou mutaçãoda parte Fc (por exemplo, de mutação lgG1 para lgG4 e/ou lgG1/lgG4) depreferência, definida como lgG1v1 (PVA-236; GLPSS331 como especificadopor E233P; L234V; L235A; delta G236; A327G; A330S; P331S), lgG1v2(L234A; L235A) e lgG4v1 (S228P; L235E) e lgG4x (S228P).
A identidade ou homologia com relação à seqüência é definidaaqui como a porcentagem de resíduos de aminoácido na seqüência candida-ta que são idênticos aos resíduos de anticorpo de origem, após alinhar asseqüências e introduzir lacunas, se necessário, para atingir a identidade deseqüência de porcentagem máxima. Nenhuma das extensões, deleções ouinserções de terminal-N, terminal-C ou internas dentro da seqüência de anti-corpo devem ser interpretadas como afetando a identidade ou homologia deseqüência. A variante mantém a capacidade de se ligar a CCR5 humano e,de preferência, possui propriedades, que são superiores àquelas do anticor-po de origem. Por exemplo, a variante pode possuir efeitos colaterais redu-zidos durante o tratamento.
O anticorpo "de origem" no presente documento é um que é co-dificado por uma seqüência de aminoácido usada para a preparação da va-riante. De preferência, o anticorpo de origem possui uma região de estruturahumana e, se presente, possui região/regiões constante(s) de anticorpo hu-mano. Por exemplo, o anticorpo de origem pode ser um anticorpo humani-zado ou humano.
Os anticorpos de acordo com a invenção são, de preferência,produzidos por meios recombinantes. Tais métodos são bastante conheci-dos no estado da técnica e compreendem expressão de proteína em célulasprocarióticas e eucarióticas com isolamento subseqüente do polipeptídeo deanticorpo e geralmente purificação a uma pureza farmaceuticamente aceitá-vel. Para a expressão de proteína, os ácidos nucléicos que codificam cadei-as leves e pesadas ou fragmentos dos mesmos são inseridos dentro de ve-tores de expressão por métodos padrão. A expressão é realizada em célulashospedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas tipo células CHO, cé-lulas NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levedura, ou célu-las E. coli, e o anticorpo é recuperado das células (sobrenadante ou célulasapós lise).
A produção recombinante de anticorpos é bem conhecida noestado da técnica e descrita, por exemplo, nos artigos de análise de Makri-des, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al, ProteinExpr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000)151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Os anticorpos podem estar presentes em todas as células, emum lisato celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancial-mente pura. A purificação é realizada para eliminar outros componentes ce-lulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ouproteínas celulares, por meio de técnicas padrão, inclusive tratamento alcali-no/SDS, padrão de bandas CsCI, cromatografia em coluna, eletroforese emgel de agarose, e outras técnicas bem conhecidas. Vide Ausubel, F., et al.,ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley In-terscience, New York (1987).
A expressão em células NSO é descrita, por exemplo, por Bar-nes, LM., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; e Barnes, LM., et al.,Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transitória é descrita, porexemplo, por Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clona-gem de domínios variáveis é descrita por Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad.Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA89 (1992) 4285-4289; and Norderhaug, L, et al., J. Immunol. Methods 204(1997) 77-87. Um sistema de expressão transitória preferido (HEK 293) édescrito por Schlaeger, E.-J., e Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999)71-83 e por Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.
O ácido nucléico é "ligado de forma operável" quando este forcolocado em uma relação com outra seqüência de ácido nucléico. Por e-xemplo, DNA de uma pré-seqüência ou líder secretor é ligada de forma ope-rável ao DNA de um polipeptídeo se esta for expressa como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensi-ficador é ligado de forma operável a uma seqüência codificante se este afe-tar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é ligadode forma operável a uma seqüência codificante se esta for posicionada parafacilitar a tradução. Geralmente, "ligado de forma operável" significa que asseqüências de DNA que são ligadas são contíguas, e, no caso de um lídersecretor, contíguas e em quadro de leitura. Entretanto, os intensificadoresnão precisam ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios derestrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligan-tes de oligonucleotídeo sintéticos são usados de acordo com a prática con-vencional.
Os anticorpos monoclonais são adequadamente separados domeio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina con-vencionais tais como, por exemplo, Sepharose proteína-A, cromatografia emhidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. ODNA e RNA que codificam os anticorpos monoclonais são facilmente isola-dos e colocados em seqüência utilizando procedimentos convencionais. Ascélulas de hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA e RNA. Umavez isolado, o DNA pode ser inserido dentro de vetores de expressão, quesão então transfectados dentro de tais células hospedeiras, tais como, célu-las HEK 293, células CHO, ou células de mieloma que de outra forma nãoproduzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorposmonoclonais recombinantes nas células hospedeiras.
As variantes de seqüência de aminoácido de anticorpo CCR5humano são preparadas ao introduzir alterações de nucleotídeo apropriadasdentro do DNA de anticorpo, ou por síntese peptídica. Tais modificações po-dem ser realizadas, entretanto, apenas em uma faixa muito limitada, por e-xemplo, como descrito acima. Por exemplo, as modificações não alteram ascaracterísticas de anticorpo tais como isotipo IgG e ligação de epitopo, po-rém podem aperfeiçoar o rendimento da produção recombinante, estabilida-de de proteína ou facilitar a purificação.
Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação apropriada do anticorpo anti-CCR5 também pode ser substituí-do, geralmente com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da mo-lécula e impedir a reticulação anormal. De modo oposto, a(s) liga-ção/ligações de cisteína pode/podem ser adicionadas ao anticorpo para a-perfeiçoar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmen-to de anticorpo tal como um fragmento Fv).
Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o pa-drão de glicosilação original do anticorpo. Por alteração entende-se deletaruma ou mais porções de carboidrato encontradas no anticorpo, e/ou adicio-nar um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.A glicosilação de anticorpos é tipicamente ligada por N. Ligada por N se refe-re à ligação da porção de carboidrato na cadeia lateral de um resíduo deasparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido que não prolina, são as seqüên-cias de reconhecimento para ligação enzimática da porção de carboidrato nacadeia lateral de asparagina. Desta maneira, a presença de cada uma des-tas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosila-ção potencial. A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenien-temente realizada ao alterar a seqüência de aminoácido de modo que estacontenha uma ou mais seqüências de tripeptídeo descritas acima (para sí-tios de glicosilação ligada por N).
As moléculas de ácido nucléico que codificam variantes de se-qüência de aminoácido de anticorpo anti-CCR5 são preparadas por meio deuma variedade de métodos conhecida na técnica. Estes métodos incluem,porém sem caráter limitativo, isolamento de uma fonte natural (no caso devariantes de seqüência de aminoácido naturalmente ocorrentes) ou prepara-ção por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio dirigida), muta-gênese por PCR e mutagênese cassete de uma variante previamente prepa-rada ou uma versão não-variante de anticorpo anti-CCR5 humanizado.
Outro tipo de modificação covalente envolve acoplar química ouenzimaticamente glicosídeos no anticorpo. Estes procedimentos são vanta-josos pois não requerem produção do anticorpo em uma célula hospedeiraque é capaz de glicosilação ligada por N ou O. Dependendo do modo deacoplamento usado, o(s) açúcar/açúcares pode/podem ser ligado(s) a (a)arginina e histidina, (b) grupos carboxila livre, (c) grupos sulfidril livre taiscomo aqueles de cisteína, (d) grupos hidroxila tais como aqueles de serina,treonina, ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáticos tais como aqueles defenilalanina, tirosina, ou triptofano ou (f) o grupo amida de glutamina. Estesmétodos estão descritos em WO 87/05330, e em ApHn, J.D., e Wriston, J.C.Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. 4 (1981) 259-306.
A remoção de qualquer porção de carboidrato presente sobre oanticorpo pode ser realizada química ou enzimaticamente. A deglicosilaçãoquímica requer a exposição do anticorpo ao composto de ácido trifluorome-tanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na cli-vagem da maior parte ou todos os açúcares que não o açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa o anticorpointacto. A deglicosilação química é descrita por Sojahr, H.T., and Bahl, O.P.,Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57 e por Edge, A.S., et al. Anal. Bio-chem. 118 (1981) 131-137. A clivagem enzimática de porções de carboidratosobre anticorpos pode ser realizada através do uso de uma variedade deendo- e exo- glicosidases como descrito por Thotakura, N.R., e Bahl, O.P.,Meth. Enzymol. 138 (1987) 350- 359.
Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreendeligar o anticorpo a um entre uma variedade de polímeros não-protéicos, porexemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, na formaestabelecida na Patente N93 U.S. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337.
As regiões variáveis de cadeia pesada e leve reconstruídas sãocombinadas com seqüências de promotor, iniciação de tradução, regiãoconstante, 3' não-traduzida, poliadenilação, e terminação de transcrição paraformar constructos de vetor de expressão. Os constructos de expressão decadeia pesada e leve podem ser combinados dentro de um único vetor, co-transfectados, transfectados em série, ou separadamente transfectados den-tro das células hospedeiras que são então fundidos para formar uma únicacélula hospedeira que expressa ambas cadeias.
A invenção compreende adicionalmente o uso de um anticorpode acordo com a invenção para o diagnóstico de susceptibilidade a AIDS invitro, de preferência, por meio de uma análise imunológica que determina aligação entre CCR5 solúvel de uma amostra de plasma humano (TsimanisT., Immunology Letters 96 (2005) 55-61) e o anticorpo de acordo com a in-venção. A expressão de CCR5 possui uma correlação com o avanço da do-ença, e pode ser usada para identificar indivíduos com baixo ou alto risco desusceptibilidade a AIDS. Para propósitos de diagnóstico, os anticorpos oufragmentos de ligação de antígeno podem ser marcados ou não-marcados.Tipicamente, as análises diagnosticas envolvem detectar a formação de umcomplexo resultante da ligação de um anticorpo ou fragmento a CCR5.
Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma com-posição, por exemplo, uma composição farmacêutica que contém um ouuma combinação de anticorpos monoclonais, ou a parte de ligação de antí-geno do mesmo, da presente invenção, formulada juntamente com um veí-culo farmaceuticamente aceitável.
Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" incluiqualquer e todos os solventes, meio de dispersão, coberturas, agentes anti-bacterianos e anti-fungosos, agentes isotônicos e de retardo de absorção, esimilares que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo éadequado para injeção ou infusão.
Uma composição da presente invenção pode ser administradapor uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será avaliadopelo versado na técnica, a rota e/ou modo de administração irá variar de-pendendo dos resultados desejados.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções oudispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação de soluçõesou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tal meio e agentes para substân-cias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Além de água, o veí-culo pode ser, por exemplo, uma solução salina tamponada isotônica.
Independentemente da rota de administração selecionada, oscompostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hi-dratada adequada, e/ou nas composições farmacêuticas da presente inven-ção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveisatravés de métodos convencionais conhecidos na técnica.
Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas compo-sições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados para obteruma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para obter a resposta tera-pêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administraçãoparticular, sem que sejam tóxicos ao paciente. O nível de dosagem selecio-nado irá depender de uma variedade de fatores farmacocinéticos inclusiveda atividade das composições particulares da presente invenção emprega-da, ou o éster, sal ou amida desta, da rota de administração, tempo de ad-ministração, a taxa de excreção do composto particular que é empregada,outros farmacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com ascomposições particulares empregadas, da idade, do sexo, peso, condição,saúde geral e história médica pregressa do paciente que está sendo tratado,e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.
A invenção compreende o uso dos anticorpos de acordo com ainvenção para o tratamento de um paciente que sofre de imunossupressão,tal como imunossupressão em um paciente com síndromes da imunodefici-ência tal como AIDS, em um paciente que se submete à terapia com radia-ção, quimioterapia, terapia para doença autoimune ou outras terapias medi-camentosas (por exemplo, terapia com corticosteróide), que causa imunos-supressão, GvHD ou HvGD (por exemplo, após a transplantação). A inven-ção também compreende um método para o tratamento de um paciente quesofre de tal imunossupressão.
A invenção proporciona adicionalmente um método para a fabri-cação de uma composição farmacêutica que compreende uma quantidadeeficaz de um anticorpo de acordo com a invenção juntamente com um veícu-lo farmaceuticamente aceitável e o uso do anticorpo de acordo com a inven-ção para tal método.
A invenção proporciona adicionalmente o uso de um anticorpode acordo com a invenção em uma quantidade eficaz para a fabricação deum agente farmacêutico, de preferência, juntamente com um veículo farma-ceuticamente aceitável, para o tratamento de um paciente que sofre de imu-nossupressão.
Os seguintes exemplos, referências e listagem de seqüência sãoproporcionados para auxiliar no entendimento da presente invenção, cujoescopo verdadeiro está estabelecido nas reivindicações em anexo. Entende-se que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabelecidos semque se abandone o espírito da invenção.
Deposição de Anticorpo
<table>table see original document page 27</column></row><table>
Descrição das Seqüências
SEQ ID Nõ: 1 <CCR5>Pz01.F3 cadeia principal, domínio variável
SEQ ID N9: 2 <CCR5>Pz01 .F3 cadeia leve, domínio variável
SEQ ID N9: 3 <CCR5>Pz02.1C11 cadeia principal, domínio variável
SEQ ID N9: 4 <CCR5>Pz02.1C11 cadeia leve, domínio variável
SEQ ID N9: 5 <CCR5>Pz03.1C5 cadeia principal, domínio variável
SEQ ID N9: 6 <CCR5>Pz03.1C5 cadeia leve, domínio variável
SEQ ID N9: 7 <CCR5>F3.1H12.2E5 cadeia principal, domínio variável
SEQ ID N9: 8 <CCR5>F3.1H12.2E5 cadeia leve, domínio variável
SEQ ID N9: 9 Cadeia pesada CDR1
SEQ ID N9:10 Cadeia pesada CDR1
SEQ ID N9:11 Cadeia pesada CDR1SEQ ID N9:12 Cadeia pesada CDR1
SEQIDN9:13 Cadeia pesada CDR2
SEQ ID N9:14 Cadeia pesada CDR2
SEQ ID N9:15 Cadeia pesada CDR2
SEQ ID N9:16 Cadeia pesada CDR3
SEQ ID N9:17 Cadeia pesada CDR3
SEQ ID N9:18 Cadeia leve CDR1
SEQ ID NQ:19 Cadeia leve CDR1
SEQ ID N9:20 Cadeia leve CDR1
SEQ ID N9:21 Cadeia leve CDR2
SEQ ID Ne:22 Cadeia leve CDR2
SEQ ID N9:23 Cadeia leve CDR2
SEQ ID N9:24 Cadeia leve CDR3
SEQ ID NQ:25 Cadeia leve CDR3
SEQ ID N9:26 Região constante de cadeia pesada y1
SEQ ID N9:27 Região constante de cadeia pesada y4
SEQ ID N9:28 Região constante de cadeia leve k
Nomenclatura de Anticorpo <CCR5>Pz01 .F3: Anticorpo A SEQ ID N9: 1, 2
<CCR5>Pz02.1C11: Anticorpo B SEQ ID N9: 3, 4
<CCR5>Pz03.1 C5 : Anticorpo C SEQ ID N9: 5, 6
<CCR5>F3.1H12.2E5: Anticorpo D SEQ ID N9: 7, 8
<CCR5>Pz04.1F6: Anticorpo E
Descrição das Figuras
Figura 1: análise de fusão de CCR5, comparação de 2D7 e anticorpo B
Figura 2: ELISA-célula de CCR5, comparação de 2D7 e anticorpos B e C
Exemplo 1
Produção de anticorpos monoclonais em CCR5 humano
a) Imunização de camundongos
Os camundongos Balb/c fêmeas receberam uma imunizaçãointraperitoneal básica com 107 células que expressam CCR5 (CHO ou L1.2)juntamente com adjuvante CFA (adjuvante completo de Freund). Esta é se-guida por uma imunização intraperitoneal adicional após 4-6 semanas no-vamente com as mesmas 107 células que expressam CCR5 juntamente comIFA (adjuvante incompleto de Freund). Posteriormente, cada camundongo éadministrado novamente com 107 células que expressam CCR5 (CHO ouL1.2) em PBS em intervalos de 4-6 semanas. Subseqüentemente, as últimasimunizações são realizadas novamente com até 107 células que expressamCCR5 ou de forma intravenosa utilizando 2x106 células que expressam C-CR5 no 3o ou 4o dia antes da fusão.
b) Fusão e clonagem
As células esplênicas dos camundongos imunizados de acordocom a) são fundidas com células de mieloma de acordo com Galfre, Me-thods in Enzymology 73, 1981, 3. Cerca de 1 x 108 células esplênicas docamundongo imunizado são misturadas com aproximadamente o mesmonúmero de células de mieloma (P3X63-Ag8-653, ATCC CRL 1580), fundidase cultivadas subseqüentemente em meio HAZ (100 mmol/l hipoxantina, 1ug/ml de azaserina em RPMI 1640 + 10% de FCS). Após 10 dias as culturasprimárias são testadas para produção de anticorpo específico. As culturasprimárias que apresentam uma reação positiva com CCR5 em ELISA e ne-nhuma reação cruzada com células de origem não-transfectadas, são clona-das em placas de cultura celular de 96 cavidades por meio de diluição limi-tada ou um classificador de células ativadas por fluorescência. As linhas ce-lulares depositadas foram obtidas desta maneira.
c) Produção recombinante de anticorpos
Os vetores para expressão de um anticorpo quimérico, que con-siste em regiões constantes humanas ligadas a regiões variáveis murinas,podem ser construídos como se segue. Dois vetores de expressão de cadeiapesada quiméricos são construídos consistindo em VH de camundongo anti-CCR5 ligada a regiões constantes lgG1 humano e lgG4 humano no vetor deexpressão pSVgpt. Um vetor de cadeia leve quimérico é construído consis-tindo em VH de camundongo anti-CCR5 ligado a C Kappa humano no vetorde expressão pSVhyg. seqüência de flanqueamento 5 inclusive o peptídeode sinal líder, íntron líder e o promotor de imunoglobulina murina, e seqüên-cia de flanqueamento 3 inclusive o sítio de junção e a seqüência de íntron éintroduzida utilizando os vetores VH-PCR1 e VK-PCR1 como modelos. Osvetores de expressão de cadeia pesada e leve são co-transfectados dentrode células NSO (ECACC NQ 85110503, um mieloma de camundongo produ-tor de não-imunoglobulina). Os clones de célula transfectada são examina-dos para produção de anticorpo humano por ELISA para IgG humano.
Exemplo 2
Construção de plasmídeos de expressão para lqG1 e lqG4 anti-CCR5 (vari-ante) mutante
Os plasmídeos de expressão que codificam cadeias pesadas v1e y4 anti-CCR5 mutante podem ser criados por mutagênese sítio-dirigidados plasmídeos de expressão do tipo selvagem que utilizam o Kit para mu-tagênese sítio-dirigida QuickChange® (Stratagene) e estão descritos na ta-bela 1. Os aminoácidos estão numerados de acordo com a numeração EU[Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 63 (1969) 78-85; Kabat,E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIHPublication Ne 91 -3242 (1991)].Tabela 1:
<table>table see original document page 31</column></row><table>
Explicação de mutações: S228P significa que serina na posiçãode aminoacido Kabat 228 é alterada para prolina.
Exemplo 3
Análise de Fusão Célula-Célula
No 1o dia, as células HeLa que expressam gp160 (2 x 104 célu-las/50 ul/cavidade) foram semeadas em uma placa microtítulo 96 branca emmeio DMEM suplementado com 10% de FCS e 2 ug/ml de doxiciclina. No 2odia, 100 ul de amostra de sobrenadante ou controle de anticorpo por cavida-de são adicionados em uma placa de microtítulo 96 transparente. Então 100ul que contém 8 x 104 CEM-NKr-Luc células em suspensão em meio sãoadicionados e incubados 37°C. O meio de cultura celular HeLa é aspirado daplaca de 96 cavidades, 100 ul entre 200 ul de anticorpo/mistura CEM-NKr-Luc são adicionados e incubados durante a noite a 37°C. No 3o dia, 100ul/cavidade de substrato de ensaio de Luciferase Bright-GIo® (1,4-ditiotreitole ditionita de sódio; Promega Corp. USA) são adicionados e a luminescênciaé medida após um mínimo de 15 min de incubação em RT.
Materiais:
As células Hela-R5-16 (linha celular para expressar gp160 HIVmediante indução de doxiciclina) são cultivadas em meio DMEM que contémnutrientes e 10% de FCS com 400 ug/ml de G418 e 200 ug/ml de Higromici-na B.
CEM.NKR-CCR5-LUC (Número de Catálogo: 5198) é uma linhade célula T disponível a partir de NIH AIDS Research & Reference ReagentProgram McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA.
Tipo de Célula: CEM.NKR-CCR5 (Cat. Ne 4376) foi transfectada (eletropora-ção) para expressar o gene da luciferase sob o controle transcripcional deHIV-2 LTR e propagado em RPMI 1640 que contém 10% de soro fetal bovi-no, 4 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina e 0,8 mg/ml de sulfato degeneticina (G418). Características de Crescimento: células de linfóide re-dondas, morfologia não muito variável. As células crescem em suspensãocomo células únicas, que podem formar pequenos grumos. Clivagem 1:10duas vezes por semana. Características Especiais: Expressar atividade deapós a transativação de HIV-2 LTR. Adequado para injeção com isolamentosde HIV primários, para neutralização e análises de sensibilidade ao fármaco(Spenlehauer, C, et al., Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., et al., J. Vi-rol. 73 (1999) 8966-8974). A linha celular foi obtida através de NIH AIDS Re-search and Reference Reagent Program, NIAID, NIH from Drs. John Mooreand Catherine Spenlehauer. Tampão de ensaio de Liciferase Bright-GIo(Promega Corp. USA, Part N9 E2264B) substrato de ensaio de LiciferaseBright-GIo® (Promega Corp. USA, part N9 EE26B)
Resultados:
Resultados de anticorpo B são mostrados na Figura 1.
Os valores IC50 são 0,38 ug/ml para anticorpo C, 0,79 ug/ml paraanticorpo B, e 7,0 ug/ml para anticorpo A. Os valores IC5o também são, porexemplo, medidos no ensaio PhenoSenseHIV (ViroLogic, Inc. USA) utilizan-do a cepa JRCSF. Os valores IC5o são 0,16 ug/ml para anticorpo C, 0,17ug/ml para anticorpo B, 0,82 ug/ml para anticorpo A e 1,4 ug/ml para anti-corpo 2D7.
Exemplo 4
Análise Antiviral com vírus vivo
PBMCs são preparados a partir de creme leucocitário isoladopor centrifugação densidade-gradiente utilizando Lymphoprep®(NycomedPharma AG, Oslo, Norway). As células de quatro doadores diferentes forammisturadas, estimuladas durante 1 dia com PHA e subseqüentemente culti-vadas em meio RPMI que contém 1% de penicilina/estreptomicina, 1% deglutamax, 1% de piruvato de sódio, 1% de aminoácidos não-essenciais e10% de FBS, durante dois dias na presença de 5 U/ml IL-2.
100.000 PBMC em 50 ul são adicionados a 100 ul de uma solu-ção de anticorpo (diluição em série variada entre 0,006-17,5 ug/ml, em meioRPMI suplementado e infectado com 250 TCID50 de NLBal (cepa NL4.3(Adachi, A., et al., J. Virol. 59 (1986) 284- 291) com env de BaL (gp120)) oualternativamente JRCSF (0'Brien, W.A., et al., Nature 348 (1990) 69-73) emum volume de 50 ul. A mistura é incubada durante 6 dias a 37°C em incuba-dora de C02. O sobrenadante foi colhido e subseqüentemente diluído 1:50com 5U/ml IL-2 de meio RPMI suplementado.
A medida de p24 é realizada por ELISA HIV-I p24 (Perkin-Elmer,USA). As amostras são então neutralizadas e transferidas para cavidades demicroplaca que são cobertos com um anticorpo monoclonal altamente espe-cífico para HIV-I p24. O anticorpo monoclonal imobilizado captura HIV-I p24.As amostras de cultura celular não requerem interrupção e são adicionadasdiretamente nas cavidades de microplaca cobertos com anticorpo monoclo-nal. O antígeno capturado é complexado com anticorpo policlonal biotiniladoem HIV-I p24, seguido por um conjugado de estreptavidina-HRP (peroxidasede rábano-silvestre). O complexo resultante é detectado por incubação comorto-fenilenodiamina-HCI (OPD) que produz uma cor amarela que é direta-mente proporcional à quantidade de HIV-I p24 capturada. A absorvância decada cavidade de microplaca é determinada utilizando um leitor de micropla-ca e calibrado contra a absorvância de um antígeno padrão HIV-I p24 oucurva padrão. Os resultados são mostrados na tabela 2.
Tabela 2:
<table>table see original document page 34</column></row><table>
Exemplo 5
ELISA Célula CCR5
20.000 células CHO que expressam de forma recombinanteCCR5 são semeadas por placa de 96 cavidades, e incubadas durante a noi-te a 37°C. Posteriormente, o meio é aspirado e 40 ul de meio fresco são adi-cionados. 10 pi de anticorpo em meio diluído são adicionados e incubadosduas horas a 4°C. O meio é aspirado, 100 ul de Glutardialdeído (c = 0,05%em PBS) são adicionados e incubados 10 minutos em temperatura ambien-te. Após lavar 3x com 200 ul de PBS, 50 ul de anticorpo de detecção 1(1.000 diluídos em ELISA de bloqueio) são adicionados e incubados duashoras em temperatura ambiente. 50 ul de 3,3',5,5'-Tetrametilbenzidina(TMB) são adicionados e a reação é interrompida após 7 min. A DensidadeÓptica é medida em 450 nm (versus 620 nm).Primeiro anticorpo : Pharmingen 2D7 (CD 195; Cat. Nr. 555990)ou anticorpo B/C
Segundo anticorpo:: Anticorpo de detecção (conjugado de anti-corpo contra IgG murino e POD; Biorad, Ne 170-6516, 1:1000 diluído)
Meio: HAM's F- 12 ou GIBCO com Glutamax, 10% de FCS, 200ug/ml de Higromicina (Roche Diagnostics GmbH, DE)
ELISA de Bloqueio: Roche Diagnostics GmbH, DE Ne 1112589,10%(v/v) solução em água, 1/10 diluída em PBS
TMB: Roche Diagnostics GmbH, DE N9 1432559, solução parauso
Os resultados são mostrados na Figura 2.
Exemplo 6
Potencial de CCR5 Mabs para se ligar a FcvRIHa em células NK
Para determinar a capacidade dos anticorpos da invenção de seligarem a FcYRIIIa (CD16) em células Destruidoras Naturais (NK), as CélulasMononucleares Sangüíneas Periféricas (PBMCs) são isoladas e incubadascom 20 ug/ml de anticorpo e anticorpos de controle na presença ou ausênciade 20 ug/ml de um anticorpo de camundongo de bloqueio em FcvRIHa (anti-CD 16, clone 3G8, RDI, Flanders, NJ), para verificar a ligação através deFcYRIIIa.
Como controles negativos, lgG2 e lgG4 humanos (The BindingSite), que não se ligam a FcvRIHa, são usados. lgG1 e lgG3 humano (TheBinding Site) são incluídos como controles positivos para ligação deFcYRIIIa. Os anticorpos ligados em células NK são detectados por análise deFACS utilizando um anticorpo CD56 anti-humano de camundongo marcadopor PE (marcador de superfície de célula NK) (BD Biosciences Pharmingen,San Diego, CA) em combinação com um anticorpo (Fc) IgG anti-humanoF(ab)2 de cabra marcado por FITC (Fc) (Protos Immunoresearch, Burlinga-me, CA). A ligação máxima (Bmax) é determinada em uma concentração deanticorpo de 20 ug/ml. O anticorpo de controle (lgG4 humano) mostra até30% de Bmax comparado com 100% de Bmax para lgG1 humano. Conse-qüentemente, "nenhuma ligação de FcYRIIIa ou nenhum ADCC" significa emuma concentração de anticorpo de 20 ug/ml um valor de Bmax de até 30%comparado com lgG1.
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US 2003/0099645
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US 4,179,337
US 4,301,144
US 4,496,689
US 4,640,835US 4,670,417
US 4,791,192
US 5,202,238US 5,204,244
US 6,528,625
US 6,610,834
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WO 2002/083172
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WO 2003/066830
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<130> 23010
<150> EP 05007138.0<151> 2004-04-01<160> 28
<170> Versão de Patente 3.2
<210> 1
<211> 119<212> PRT<213> camundongo<400> 1
Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Prõ Gly Gly15 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Vai
35 40 45
Ala Ser lie Ser Thr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Vai Arg
50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn lie Leu Tyr Leu65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Thr
85 90 95
Arg Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser115
<210> 2<211> 114<212> PRT<213> camundongo<400> 2
Asp lie Vai Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Vai Ser Vai Gly
15 10 15
Glu Lys Vai Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg
20 25 30
Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Vai
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr65 70 75 80
lie Ser Ser Vai Lys Ala Glu Asp Leu Thr Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln85 90 95Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie100 105 110
<211> 117<212> PRT<213> camundongo<400> 3
Gln Vai Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Vai Arg Pro Ser Gln1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Pro Leu Gly Vai Phe
20 25 30
Gly Vai His Trp Vai Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45
Gly Vai lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met50 55 60
Ser Arg Leu Arg lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Vai Phe Phe65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala85 90 95
Lys Vai Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Vai lie Vai Ser Ser115
<210> 4
<211> 108<212> PRT<213> camundongo<400> 4
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15Glu Thr Vai Thr lie Thr Cys Arg Ser Ser Gly Asn lie His Gly Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Vai
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn Asn Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly lie Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg100 105
<210> 5<211> 117<212> PRT<213> camundongo<400> 5
Gln Vai Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Vai Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Pro Leu Gly lie Phe
20 25 30
Gly Vai His Trp Vai Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Vai lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Vai Phe Phe65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Vai Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser100 105 110Vai lie Vai Ser Ser115
<210> 6<211> 108<212> PRT<213> camundongo<400> 6
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly
15 10 15
Glu Thr Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Gly Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Vai
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg100 105
<210> 7<211> 117<212> PRT<213> camundongo<400> 7
Gln Vai Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Vai Arg Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Pro Leu Gly Thr Phe
20 25 30
Gly Vai His Trp Vai Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Vai lie Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Vai Phe Phe65 70 75 80
Arg Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Vai Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Vai lie Vai Ser Ser115
<210> 8<211> 108<212> PRT<213> camundongo<400> 8
Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly
1 5 10 15
Glu Thr Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gly Asn lie His Gly Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Vai
35 40 45
Tyr Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys lie Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg100 105
<210> 9<211> 5<212> PRT<213> camundongo<400> 9
Thr Tyr Ala Met Ser
1 5 <210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 10Vai Phe Gly Vai His
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT<213> camundongo
<400> 11
lie Phe Gly Vai His1 5<210> 12<211> 5
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 12
Thr Phe Gly Vai His
1 5
<210> 13<211> 16<212> PRT<213> camundongo <400> 13
Ser lie Ser Thr Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Vai Arg Gly<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 14
Vai lie Trp Lys Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 15
Vai lie Trp Arg Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met Ser1 5 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 16
Gly Arg Gly Asp Arg Gly Asp Leu Phe Gly Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 17
Vai Asn Leu Ala Asp Ala Met Asp Tyr1 5
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> camundongo<400> 18
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Arg Gly Asn Gln Met Asn Tyr Leu15 10 15
Ala
<210> 19<211> 11<212> PRT<213> camundongo<400> 19
Arg Ser Ser Gly Asn lie His Gly Tyr Leu Ala
15 10
<210> 20
<211> 11
<212> PRT <213> camundongo
<400> 20
Arg Ala Ser Gly Asn lie His Gly Tyr Leu Ala1 5 10
<210> 21 <211> 7
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 21
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser í 5
<210> 22
<211> 7
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 22
Asn Thr Lys Ala Leu Ala Glu1 5<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 23
Asn Thr Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 24
Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> camundongo
<400> 25
Gln His His Tyr Asp Leu Pro Arg Thr
15
<210> 26
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Vai His Thr50
Leu Ser Ser Vai65
Tyr lie Cys AsnLys Vai Glu Pro100
Pro Ala Pro Glu115
Lys Pro Lys Asp130
Vai Vai Vai Asp145
Tyr Vai Asp Gly
Glu Gln Tyr Asn180
His Gln Asp Trp195
Lys Ala Leu Pro210
Gln Pro Arg Glu225
Leu Thr Lys Asn
Pro Ser Asp lie260
Asn Tyr Lys Thr275
Leu Tyr Ser Lys290
Phe Pro Ala Vai55
Vai Thr Vai Pro70
Vai Asn His Lys85
Lys Ser Cys Asp
Leu Leu Gly Gly120
Thr Leu Met lie135
Vai Ser His Glu150
Vai Glu Vai His165
Ser Thr Tyr Arg
Leu Asn Gly Lys200
Ala Pro lie Glu215
Pro Gln Vai Tyr230
Gln Vai Ser Leu245
Ala Vai Glu Trp
Thr Pro Pro Vai280
Leu Thr Vai Asp295
48
Leu Gln Ser Ser60
Ser Ser Ser Leu75
Pro Ser Asn Thr90
Lys Thr His Thr105
Pro Ser Vai Phe
Ser Arg Thr Pro140
Asp Pro Glu Vai155
Asn Ala Lys Thr170
Vai Vai Ser Vai185
Glu Tyr Lys Cys
Lys Thr lie Ser220
Thr Leu Pro Pro235
Thr Cys Leu Vai250
Glu Ser Asn Gly265
Leu Asp Ser Asp
Lys Ser Arg Trp300
Gly Leu Tyr Ser
Gly Thr Gln Thr80
Lys Vai Asp Lys95
Cys Pro Pro Cys110
Leu Phe Pro Pro125
Glu Vai Thr Cys
Lys Phe Asn Trp160
Lys Pro Arg Glu175
Leu Thr Vai Leu190
Lys Vai Ser Asn205
Lys Ala Lys Gly
Ser Arg Asp Glu240
Lys Gly Phe Tyr255
Gln Pro Glu Asn270
Gly Ser Phe Phe285
Gln Gln Gly AsnVai Phe Ser305
Gln Lys Ser
<210> 27<211> 327<212> PRT<213> Homo<400> 27Ala Ser Thr1
Ser Thr Ser
Phe Pro Glu35
Gly Vai His50
Leu Ser Ser65
Tyr Thr Cys
Arg Vai Glu
Glu Phe Leu115
Asp Thr Leu130
Asp Vai Ser145
Gly Vai Glu
49
Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr310 315 320
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330
sapiens
Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
5 10 15
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr20 25 30
Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
40 45Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
55 60Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
70 75 80
Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys
85 90 95
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro100 105 110
Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
120 125Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai
135 140Gln Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp150 155 160
Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe165 170 175Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys225 230 235 240
Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Vai Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys325
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu
15 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai
50 55Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu65 70Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu85
Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg100
Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser60
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
75 80Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
90 95Gly Glu Cys105

Claims (13)

1. Ligação de anticorpo a CCR5, caracterizada pelo fato de quea seqüência de aminoacido de cadeia pesada variável CDR3 de dito anticor-po é selecionada a partir do grupo que consiste nas seqüências CDR3 decadeia pesada SEQ ID Ne: 16 ou 17.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que compreende uma região pesada e leve variável independen-temente selecionada a partir do grupo que consiste ema) o domínio variável de cadeia pesada (VH) definido por se-qüência de aminoacido SEQ ID Ne: 1 e domínio variável de cadeia leve (VH)definido por SEQ ID NQ:2;b) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID Ne: 3 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID Ne:4;c) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID Ng:5 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID Ne:6;d) o domínio variável de cadeia pesada definido por seqüênciade aminoacido SEQ ID NQ:7 e o domínio variável de cadeia leve definido porSEQ ID Ne:8;ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-do pelo fato de que o dito anticorpo é produzido por linhas celulares de hibri-doma m<CCR5>Pz01.F3, m<CCR5>Pz04.1F6, m<CCR5>Pz03.1C5 ou m<CCR5>Pz02.1C11.
4. Anticorpo, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracteri-zado pelo fato de que o dito anticorpo é de isotipo lgG4 humano ou é de iso-tipo lgG1 humano, o dito lgG1 é opcionalmente modificado na região de arti-culação em aa 220-240 entre CH1 e CH2 e/ou a segunda região inter-domínio de aa 330 entre CH2 e CH3.
5. Linhas celulares de hibridoma m<CCR5>Pz01.F3,m<CCR5>Pz04.1F6, m<CCR5>Pz03.1C5 ou m<CCR5>Pz02.1C11.
6. Composição farmacêutica que contém um anticorpo, comodefinido nas reivindicações 1 a 4, em uma quantidade farmaceuticamenteeficaz.
7. Uso de um anticorpo, como definido nas reivindicações 1 a 4,para a fabricação de uma composição farmacêutica.
8. Método para a fabricação de uma composição farmacêuticaque compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticor-po, como definido nas reivindicações 1 a 4.
9. Ácido nucléico que codifica um polipeptídeo capaz de se reu-nir juntamente com a respectivamente outra cadeia de anticorpo definidaabaixo, se o dito polipeptídeo for tantoa) uma cadeia pesada de anticorpo que compreende como se-qüências de CDR CDR1, CDR2 e CDR3 e sendo que CDR1 é selecionado apartir do grupo que consiste em SEQ ID N-s: 9, 10, 11, 12, sendo que CDR2é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID N9S: 13, 14, 15,sendo que CDR3 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ IDN9S: 16,17b) uma cadeia leve variável de cadeia leve de anticorpo quecompreende como seqüências CDR CDR1, CDR2 e CDR3, e CDR1 é sele-cionado entre SEQ ID NeS: 18, 19, 20, CDR2 é selecionado entre SEQ IDNgS: 21, 22, 23 e CDR3 é selecionado entre SEQ ID N98: 24, 25,em que as ditas CDRs são selecionadas independentementeuma da outra.
10. Método para o tratamento de um paciente que sofre de umadoença imunossupressiva, caracterizado pelo fato de que administra no pa-ciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, como defi-nidas nas reivindicações 1 a 4.
11. Método para modificar a seqüência de CDR de um anticorpode origem que se liga a CCR5, caracterizado pelo fato de que uma CDR decadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NQS: 1, 3, 5 e 7 e/ou uma CDR de cadeia leve de anticorpo selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NgS: 2, 4, 6 e 8, proporciona um ácido nucléi-co que codifica a dita seqüência de CDR de aminoácido, modifica o dito áci-do nucléico em que um aminoácido é modificado em CDR1 de cadeia pesa-da, um aminoácido é modificado em CDR2 de cadeia pesada, 1-3 aminoáci-dos são modificados em CDR1 de cadeia leve, 1-3 aminoácidos são modifi-cados em CDR2 de cadeia leve, e/ou 1-3 aminoácidos são modificados emCDR3 de cadeia leve, expressa a dita seqüência de aminoácido de CDRmodificada em uma estrutura de anticorpo, mede se o dito anticorpo se liga aCCR5 e selecionar a dita CDR modificada se o anticorpo se ligar a CCR5.
12. Método para a produção de um anticorpo que se liga a C-CR5 que não se liga a receptor Fcv e/ou C1q, caracterizado pelo fato deque, a seqüência de um ácido nucléico que codifica a cadeia pesada de umanticorpo tipo lgG1 humano que se liga a CCR5 é modificada de tal maneiraque o dito anticorpo modificado não se ligue a C1q e/ou receptor Fcv, sendoque o dito ácido nucléico modificado e o ácido nucléico que codifica a cadeialeve de dito anticorpo são inseridos dentro de um vetor de expressão, sendoque o dito vetor é inserido em uma célula hospedeira eucariótica, a proteínacodificada é expressa e recuperada da célula hospedeira ou do sobrenadante.
13. Anticorpo que se liga a CCR5 que não se liga a receptor Fcye/ou C1q, caracterizado pelo fato de que, o dito anticorpo é de tipo lgG1 humano.
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