BRPI0609876A2

BRPI0609876A2 - método para produzir estereoisÈmeros de monatina ou sal desta, composição compreendendo um precursor de r-monatina e enzimas d-aminotransferase e racemase

Info

Publication number: BRPI0609876A2
Application number: BRPI0609876-2A
Authority: BR
Inventors: Ellen Burke; Steven J Gort; Paula M Hicks; Sherry R Kollmann; Peter Luginbuhl; Sara C Mcfarlan; Toby Richardson; Fernando A Sanchez-Riera; Christopher Solheid; Lishan Zhao; Brian Brazeau; Souza Mervyn L De; David Weiner
Original assignee: Cargill Inc
Priority date: 2005-04-26
Filing date: 2006-04-26
Publication date: 2010-05-11
Also published as: JP2008538932A; CA2638896A1; ES2587572T3; AU2006341528A1; CN101365787A; CA2638896C; WO2007133184A3; EP2361976A2; CN101365787B; JP5336182B2; EP1883697A4; EP3168299A2; EP3168299A3; AU2006341528A8; EP2361976B1; EP2361976A3; WO2007133184A2; EP1883697A2

Abstract

MéTODO PARA PRODUZIR ESTEREOISÈMEROS DE MONATINA OU SAL DESTA, COMPOSIçãO COMPREENDENDO UM PRECURSOR DE R-MONATINA E ENZIMAS D-AMINO-TRANSFERASE E RACEMASE. A presente invenção refere-se a monatina e certos estereoisómeros de monatina, tais como R,R monatina e S,R monatina, bem como sais destes, que são produzidos utilizando polipeptídeos e vias biossintéticas. Estes polipeptídeos e vias biossintéticas também são úteis na produção de ácido g lutárico R-2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto, um intermediário que é formado em certas vias de síntese de monatina, incluindo algumas vias biossintéticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "POLIPEPTÍDEOSE VIAS BIOSSINTÉTICAS PARA A PRODUÇÃO DE ESTEREOISÔMEROSDE MONATINA E SEUS PRECURSORES"

Antecedentes da Invenção

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a polipeptídeos e vias biossintéticasque são úteis na produção de D-triptofano, indol-3-piruvato, ácido R-2-hidróxi-2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico (R-MP) e certos estereoisômeros de mona-tina, tais como, monatina R,R e S,R, e sais destas.

Antecedentes da Invenção

Monatina é um adoçante de alta intensidade que possui a fórmula química:

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Monatina inclui dois centros quirais que resultam em quatro con-figurações estereoisoméricas potenciais. A configuração R,R (o "estereoisô-mero R,R" ou "monatina R,R"); a configuração S,S (o "estereoisômero S,S"ou "monatina S,S"); a configuração R,S (o "estereoisômero R.S" ou "monati-na R,S"); e a configuração S,R (o "estereoisômero S,R" ou "monatina S,R").Como usado aqui, salvo estabelecido em contrário, o termo "monatina" éusado para se referir a composições que incluem todos quatro estereoisô-meros de monatina, sendo que as composições incluem qualquer combina-ção de estereoisômeros de monatina, (por exemplo, uma composição queinclui apenas os estereoisômeros de monatina R,R e S,S), bem como umaúnica forma isomérica.

Para propósitos desta descrição, a cadeia principal de monatinaserá numerada como ilustrado acima, com o carbono direta e covalentemen-te ligado ao grupo álcool que é identificado como o carbono na posição 2 e ocarbono direta e covalentemente ligado ao grupo amino que é identificadocomo o carbono na posição 4. Conseqüentemente, as referências neste do-cumento à monatina R,R, monatina S,S, monatina R,S e monatina S,R signi-ficam: monatina 2R.4R, monatina 2S.4S, monatina 2R,4S e monatina 2S.4R,respectivamente, salvo indicação em contrário.

Deve ser observado que na literatura, a cadeia principal de car-bono de monatina também foi numerada utilizando uma convenção alternati-va, com o carbono ligado ao grupo álcool que é o carbono na posição 4, e ocarbono ligado ao grupo amino que é o carbono na posição 2. Conseqüen-temente, por exemplo, as referências à monatina 2S.4R nesta descrição po-deriam ser as mesmas referências à monatina 2R,4S na literatura que utili-zam a convenção de numeração alternativa.

Ademais, devido a diversas convenções de nomenclatura, mo-natina é conhecida por inúmeros nomes químicos alternativos, inclusive: 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-ácido aminoglutárico; 4-amino-2-hidróxi-2-(1 H-indol-3-ilmetil)-ácido pentanodióico; 4-hidróxi-4-(3-indolilmetil)ácido glutâmi-co; e, 3-(1-amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)indol.

Certas formas isoméricas de monatina podem ser encontradasna casca de raízes da planta Schlerochiton ilicifolius localizada na Região deTransvaal na África do Sul. O Pedido de Patente Nos. U.S. 10/422.366 ("opedido '366"), 10/979.821 ("o Pedido '821"), e 11/114.922 ("o pedido '922"),que estão incorporados por meio deste à guisa de referência, descreve, interalia, polipeptídeos, vias e microorganismos para produção in vitro e in vivode monatina.

Breve Sumário da Invenção

Esta descrição proporciona, entre outras coisas, polipeptídeos evias biossintéticas que são úteis na produção de D-triptofano, indol-3-piruvato,ácido glutárico R-2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto (também referidos comomonatina R ácido R-alfa ceto, precursor de monatina-R, R-MP, e a formaalfa ceto de monatina) e certos estereoisômeros de monatina, tais como,monatina R,R e S,R, e seus sais. Os métodos incluem o uso de um ou maispolipeptídeos, e em particular, enzimas, tais como racemases (por exemplo,glutamato racemases, aspartato racemases e alanina racemases), D-amino-transferases de ampla especificidade (também chamadas de D-alanina ami-notransferases, D-aminoácido aminotransferases e D-aspartato aminotrans-ferases), L-aminotransferases (inclusive L-triptofano-aminotransferases,L-aminotransferases aromáticas, L-aspartato aminotransferases, e L-alanina-aminotransferases), aldolases (por exemplo, R-aldolases específicas), D-fenil-glicina aminotransferases (também chamadas de D-4-hidroxifenilglicina ami-notransferase), D-metionina aminotransferases, glutamato decarboxilases,aspartato decarboxilases e aspartato-4-decarboxilases para produzir compo-sições de monatina enriquecidas com as formas isomericas 4-R e/ou paraproduzir monatina R,R sem ter de utilizar quantidades estequiométricas desubstrato D-aminoácido como o doador de aminoácido para aminação MP.

Em uma tentativa de ser conciso, onde quer que os intermediá-rios/produtos sejam identificados no relatório descritivo e reivindicações (porexemplo, monatina ou precursor de monatina) como formados, o termo "e/ousais deste" deve ser entendido como incluído onde aplicável. Em outras pa-lavras, por exemplo, a frase "indol-3-piruvato é convertido em MP" deve serlida "indol-3-ácido pirúvico é convertido em MP e/ou sais deste". Um versadona técnica, na verdade, poderia avaliar que sob condições de reação mos-tradas os sais dos intermediários/produtos estão, na verdade, presentes outambém presentes.

De acordo com algumas modalidades, o método produz umacomposição de monatina onde o componente de monatina da composiçãoinclui apenas a forma R,R e S,R de monatina. O termo "apenas", quandousado para indicar que apenas certos isômeros são formados, salvo estabe-lecido em contrário, significa que a via poderia produzir apenas os isômerosidentificados se a racemização não for realizada. Conseqüentemente, o ter-mo "apenas" não deve ser interpretado como ausência de outros isômeros,porém particularmente um versado na técnica poderia entender que outrasformas isomericas podem estar presentes em uma quantidade relativamentepequena devido à racemização que pode ocorrer. De acordo com algumasmodalidades, o método produz uma composição de monatina onde o com-ponente de monatina da composição inclui apenas a forma R,R de monatina(desta maneira, significa exceto quando ocorre a racemização, resulta emoutras formas isoméricas).

Como usado aqui, a frase "composição de monatina" se refere auma composição que inclui um ou mais isômeros de monatina; o termo tam-bém pode se referir a uma composição que inclui apenas uma única formaisomérica de monatina e nada mais, dependendo do contexto.

Em algumas modalidades, de acordo com a presente invenção,um processo para produzir uma composição de monatina é proporcionado,isto inclui produzir indol-3-piruvato de L-triptofano, produzir ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto glutárico ("precursor de monatina" ou "MP") de indol-3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP. A reação de L-triptofano paraproduzir indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possui especifici-dade maior, atividade maior, ou ambas para L-triptofano como um substratodo que para R-MP, monatina R,R, ou ambos. De acordo com certas modali-dades, a reação de indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possuiatividade de R-aldolase específica e, conseqüentemente, produz R-MP. Deacordo com certas modalidades, uma enzima racemase é proporcionadapois pode facilitar a epimerização do aminoácido que é formado como umsubproduto da reação de transaminação de L-triptofano (ou que é formado apartir de outro aminoácido que é um subproduto da reação de triptofano) deuma forma isomérica para outra forma isomérica.

Em algumas modalidades de acordo com a invenção, um pro-cesso para produzir uma composição de monatina é proporcionado, isto in-clui produzir indol-3-piruvato a partir de L-triptofano, produzir ácido glutárico2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-ceto ("precursor de monatina" ou "MP") a partirde indol-3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP. A reação de L-tripto-fano para produzir indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima que possuiespecificidade maior, atividade maior, ou ambas para L-triptofano como umsubstrato do que para R-MP, monatina R,R, ou ambos, e a reação de MPpara formar monatina é facilitada por uma enzima, que é estereosseletiva deR-MP.

Deve ser observado que, onde faz-se referências a uma série dereações, tal como, nos parágrafos anteriores, a invenção não requer quecada etapa seja explicitamente realizada; é suficiente que as etapas possamser implicitamente realizadas. Em outras palavras, por exemplo, o processopara produzir uma composição de monatina, que inclui produzir indol-3-piru-vato a partir de L-triptofano, produzir ácido glutárico 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetill)-4-ceto ("precursor de monatina" ou "MP") a partir de indol-3-piru-vato, e produzir monatina a partir de MP, onde cada reação é facilitada poruma enzima apropriada, pode ser realizado ao combinar L-triptofano com asenzimas e ajustar as condições de modo que as reações enumeradas pos-sam ocorrer. Em tal caso, L-triptofano poderia reagir para produzir indol-3-piruvato, o indol-3-piruvato produzido a partir da reação de L-triptofano pode-ria reagir para formar MP, e o MP produzido a partir da reação de indol-3-piruvato poderia reagir para formar monatina. O processo também poderiaser realizado, à guisa de exemplo, ao proporcionar um composto que possaproduzir L-triptofano, sob condições adequadas para ocorrer a produção deL-triptofano e combinar aquele composto com enzimas capazes de facilitar asérie de reações estabelecida sob condições que poderiam ser adequadaspara que ocorram aquelas reações. Ainda como outro exemplo, o processopoderia ser realizado ao proporcionar um microorganismo geneticamenteengenheirado^para produzir monatina de acordo com a via descrita, e aoproporcionar condições apropriadas para ocorrer o processo de fermenta-ção. Por exemplo, um microorganismo, que produz naturalmente grandesquantidades de L-triptofano (ou D-triptofano) poderia ser geneticamente en-genheirado para produzir ou superproduzir uma ou mais das enzimas usa-das para facilitar as reações na via com monatina, e condições apropriadaspoderiam ser proporcionadas de modo que o microorganismo pudesse, des-ta forma, produzir monatina.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, proporciona-se um processo para produzir monatina, onde um substrato de ácido cc-cetoforma um L-aminoácido quando L-triptofano for convertido em indol-3-piruva-to, indol-3-piruvato reage para formar MP (que pode inclui tanto R-MP comoS-MP apesar de incluir, de preferência, apenas ou predominantementeR-MP), e o L-aminoácido reage para regenerar (também referido como "reci-clar") o substrato de ácido a-ceto quando R-MP for convertido em monatinaR,R. A reação de R-MP para formar monatina R,R é facilitada através deuma aminotransferase de estereoinversão tal como D-metionina aminotrans-ferase (EC 2.6.1.41) ou uma enzima derivada de uma D-fenilglicina amino-transferase.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, proporciona-se um processo para produzir uma composição de monatina, isto inclui pro-duzir D-triptofano a partir de L-triptofano, produzir indol-3-piruvato a partir deD-triptofano, produzir R-MP a partir de indol-3-piruvato, e produzir monatinaR,R a partir de R-MP. A produção do D-triptofano a partir do L-triptofano éfacilitada por triptofano racemase e equivalentes funcionais desta. Em certasmodalidades adicionais, as reações de D-triptofano para formar indol-3-piru-vato e de MP para formar monatina são facilitadas pela mesma enzima. Ain-da em outras modalidades adicionais, a reação de indol-3-piruvato é facilita-da por uma enzima que possui atividade de R-aldolase específica e, conse-qüentemente, R-MP é formado, e as reações de D-triptofano para formarindol-3-piruvato e de R-MP para formar monatina R,R são facilitadas pelamesma enzima.

Em outras modalidades de acordo com a invenção, descreve-seum método para produzir monatina R,R, ou um sal desta, que compreende,ou consiste essencialmente em, (a) produzir D-triptofano a partir de L-tripto-fano que utiliza uma triptofano racemase (a racemase deveria possuir ativi-dade limitada ou nenhuma atividade sobre monatina), (b) produzir indol-3-piruvato a partir de D-triptofano, (c) produzir precursor de monatina R a partirde indol-3-piruvato, e (d) produzir monatina-R.R a partir de precursor de mo-natina R.

Muito embora diversas modalidades sejam descritas, ainda ou-tras modalidades da presente invenção podem se tornar óbvias pelo versadona técnica a partir do relatório descritivo. Conforme pode ser entendido apartir da descrição neste, a invenção é capaz de incluir modificações em di-versos aspectos, sem que se abandone o espírito e escopo da presente in-venção. Conseqüentemente, os desenhos e descrição detalhada devem serinterpretados como ilustrativos em natureza e não restritivos.Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um fluxograma que mostra um exemplo de um pro-cesso enzimático para produzir monatina R,R a partir de L-triptofano de a-cordo com a invenção. Neste exemplo, o processo inclui utilizar uma L-amino-transferase (cujos exemplos incluem uma L-triptofano aminotransferase, eL-aminotransferase aromática, e L-aspartato aminotransferase, e uma L-ala-nina aminotransferase) na redução de L-triptofano que possui especificidadee/ou seletividade maior para L-triptofano como um substrato do que para R-MP e/ou uma L-aminoácido oxidase com atividade e/ou especificidade limi-tada para monatina R,R como um substrato.

A Figura 2 é um fluxograma que mostra um exemplo de outroprocesso para produzir monatina R,R de acordo com a invenção. Neste e-xemplo, o processo inclui utilizar uma enzima para converter R-MP em mo-natina que é estereosseletiva de R-MP.

A Figura 3 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R a partir de L-triptofano de acordocom a invenção. Neste exemplo, o processo inclui converter L-triptofano emD-triptofano utilizando uma triptofano racemase e utilizando um produto deD-aminoácido na reação acoplado à reação que forma indol-3-piruvato comoum substrato na reação acoplado à reação que forma monatina R,R.

A Figura 4 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R a partir de L-triptofano de acordocom a invenção. Neste exemplo, o processo inclui converter o L-aminoácidoformado na reação acoplado com a reação de L-triptofano em um D-amino-ácido; este D-aminoácido atua como um doador de amino para a reação on-de R-MP é convertido em monatina R,R.

A Figura 5 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R a partir de L-triptofano de acordocom a invenção. Neste exemplo, o processo inclui facilitar enzimaticamentea conversão de R-MP em monatina R,R que utiliza uma enzima de estéreo-inversão de modo que o L-aminoácido formado pela reação acoplado à rea-ção de L-triptofano possa ser usado como um substrato na reação acopladoao R-MP para reação de monatina R,R.

A Figura 6 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R de acordo com a presente inven-ção. Neste exemplo, o processo inclui reciclar o L-aminoácido produzido nareação que forma indol-3-piruvato com o D-aminoácido usado como um rea-gente com R-MP na reação que forma monatina R,R através de uma sériede reações de conversão.

A Figura 7 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R de acordo com a presente inven-ção. Neste exemplo, o processo inclui empurrar a reação de L-triptofano pa-ra frente (ou seja, conduzir a reação em direção à produção de indol-3-piruvato) ao converter o subproduto de L-aminoácido daquela reação emoutro produto. Neste exemplo, o subproduto de L-aminoácido L-aspartato éconvertido em L-alanina em uma reação irreversível utilizando uma descar-boxilase.

A Figura 8 é um fluxograma que mostra um exemplo ainda deoutro processo para produzir monatina R,R de acordo com a presente inven-ção. Neste exemplo, o processo inclui reciclar o subproduto de aminoácidoda reação de L-triptofano com o reagente de aminoácido da reação R-MPatravés de uma série de reações de conversão.

A Figura 9 (A e B) mostra o alinhamento de seqüência de ami-noácido de diversas D-aminoácido aminotransferases Bacillus publicado ("DA-ATs"). Os aminoácidos sublinhados indicam as regiões de homologia. Cincoiniciadores de PCR foram designados baseados nas regiões conservadas. Osiniciadores de PCR são como se segue: 5' GAAGACCGTGGTTATCAATTT 3'(SEQ ID NO:65) (iniciador direto, F1 como indicado na Figura 9A),5' GATGGTATTTACGAAGTAATC 3' (SEQ ID NO:66) (iniciador direto, F2como indicado na Figura 9A), 5' AGATTTAATATCACAACGTAAC 3' (SEQ IDNO:67) (iniciador reverso, R1 como indicado na Figura 9A), 5' GCCAAGTA-AAATTTAAGATTTA 3' (SEQ ID NO:68) (iniciador reverso, R2 como indicadona Figura 9A), 5' ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG 3' (SEQ ID NO:69) (inicia-dor reverso, R3 como indicado na Figura 9B).

A Figura 10 (A e B) mostra o alinhamento de seqüência de ami-noácido de duas novas DAATs de ATCC 4978 e ATCC 7063 com a DAATde B. sphaericus (clonada no Exemplo 18). Os aminoácidos não-homólogosestão sublinhados.

Descrição Detalhada da Invenção

Abreviações e Termos

As seguintes explicações de termos e métodos são proporciona-das para descrever melhor a presente revelação e guiar os versados na téc-nica na prática da presente revelação. Como usado aqui, "inclui" significa"compreende". Onde que o termo "inclui" seja usado, deve ser entendidoque "inclui, porém sem caráter limitativo" significa, de qualquer modo "é limi-tado a" é explicitamente estabelecido. Ademais, as formas no singular "um"ou "uma" ou "o" incluem referência no plural a menos que o contexto indiqueclaramente de outra maneira. Por exemplo, a referência a "compreende umaproteína" inclui uma ou uma pluralidade de tais proteínas, e referência a"compreende a célula" inclui referência a uma ou mais células e equivalentesdestas conhecidos pelos versados na técnica, e assim por diante. O termo"cerca de" abrange a faixa de erro experimental que ocorre em qualquermedida. Salvo estabelecido em contrário, todos os números de medida sãoestimados para possuir a palavra "cerca de" na frente destes se a palavra"cerca de" não for expressamente usada.

Substituição Conservativa: uma substituição de um aminoácidopor outro aminoácido em um polipeptídeo, tal substituição exerce pouco ounenhum impacto sobre a atividade do polipeptídeo. A substituição é conside-rada conservativa independente se os aminoácidos trocados parecerem es-trutural ou funcionalmente similares. Por exemplo, de forma ideal, um poli-peptídeo de triptofano aminotransferase que inclui uma ou mais substitui-ções conservativas mantém a atividade de triptofano. Um polipeptídeo podeser produzido para conter uma ou mais substituições conservativas ao mani-pular a seqüência de nucleotídeo que codifica aquele polipeptídeo que utili-za, por exemplo, procedimentos padrão tais como mutagênese sítio-dirigidaou PCR ou outros métodos conhecidos pelo versado na técnica.

Os exemplos não-limitativos de aminoácidos que podem sersubstituídos por um aminoácido original em uma proteína e que podem serobservados como substituições conservativas se houver pouco ou nenhumimpacto sobre a atividade do polipeptídeo incluem: Ala substituída por ser outhr; arg substituída por gln, his, ou lys; asn substituída por glu, gln, lys, his,asp; asp substituída por asn, glu, ou gln; cys substituída por ser ou ala; glnsubstituída por asn, glu, lys, his, asp, ou arg; glu substituída por asn, gln lys,ou asp; gly substituída por pro; his substituída por asn, lys, gln, arg, tyr; ilesubstituída por leu, met, vai, phe; leu substituída por ile, met, vai, phe; lyssubstituída por asn, glu, gln, his, arg; met substituída por ile, leu, vai, phe;phe substituída por trp, tyr, met, ile, ou leu; ser substituída por thr, ala; thrsubstituída por ser ou ala; trp substituída por phe, tyr; tyr substituída por his,phe, ou trp; e vai substituída por met, ile, leu.

Informações adicionais sobre as substituições conservativas po-dem ser encontradas, entre outros locais, em Ben-Bassat et al., J. Bacteriol.769:751-757, (1987); 0'Regan era/., Gene 77:237-251, (1989); Sahin-Tothet al., Protein Sei. 3:240-247, (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6:1321-1325, (1988); WO 00/67796 (Curd et al.) e em compêndios padrão de gené-tica e biologia molecular.

Derivado: Para propósitos do relatório descritivo e reivindica-ções, uma substância é "derivada" de organismo ou fonte se um ou mais dosseguintes for verdadeiro: 1) a substância está presente no organismo/fonte;2) a substância é removida do hospedeiro nativo; ou, 3) a substância é re-movida do hospedeiro nativo e é desenvolvida, por exemplo, por mutagêne-se.

Isolado: O termo "isolado" como usado aqui se refere a qualquersubstância removida de seu hospedeiro nativo; a substância não precisaexibir qualquer grau específico de pureza. Por exemplo "ácido nucléico iso-lado" se refere a um ácido nucléico naturalmente ocorrente que não é imedi-atamente contíguo com ambas as seqüências com as quais é imediatamentecontíguo (um sobre a extremidade 5' e um sobre a extremidade 3') no ge-noma naturalmente ocorrente do organismo a partir do qual este é derivado.Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode ser, sem caráter limitativo,uma molécula de DNA recombinante de qualquer comprimento, desde queuma das seqüências de ácido nucléico normalmente encontradas que flan-queiam imediatamente aquela molécula de DNA recombinante em um ge-noma naturalmente ocorrente seja removida ou retirada. Desta maneira, umácido nucléico isolado inclui, sem caráter limitativo, um DNA recombinanteque se apresenta como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA ouum fragmento de DNA genômico produzido por PCR ou tratamento de endo-nuclease de restrição) independente de outras seqüências bem como o DNArecombinante que é incorporado dentro de um vetor, um plasmídeo de repli-caçao autônoma, um vírus (por exemplo, um retrovírus, adenovírus, ou vírusherpes), ou dentro do DNA genômico de um procarioto ou eucarioto. Ade-mais, um ácido nucléico isolado pode incluir uma molécula de DNA recombi-nante que faz parte de uma seqüência de ácido nucléico híbrida ou de fusão.

O termo "isolado" como usado aqui com referência a ácido nu-cléico também inclui qualquer ácido nucléico naturalmente ocorrente, devidoao fato de as seqüências de ácido nucléico não-naturalmente ocorrente nãoserem encontradas na natureza e não possuírem seqüências imediatamentecontíguas em um genoma naturalmente ocorrente. Por exemplo, o ácido nu-cléico não-naturalmente ocorrente, tal como um ácido nucléico engenheiradoé considerado um ácido nucléico isolado. O ácido nucléico engenheiradopode ser feito utilizando técnicas de clonagem molecular comuns ou de sín-tese química de ácido nucléico. O ácido nucléico não-naturalmente ocorrenteisolado pode ser independente de outras seqüências, ou ser incorporadodentro de um vetor, um plasmídeo de replicaçao autônoma, um vírus (porexemplo, um retrovírus, adenovírus, ou vírus herpes), ou o DNA genômicode um procarioto ou eucarioto. Ademais, um ácido nucléico não-naturalmente ocorrente pode incluir uma molécula de ácido nucléico que fazparte de uma seqüência de ácido nucléico híbrida ou de fusão.

Um ácido nucléico que se encontra entre centenas a milhões deoutras moléculas de ácido nucléico, por exemplo, dentro de cDNA ou biblio-tecas genômicas, ou pedaços de gel que contêm uma digestão por restriçãode DNA genômico não deve ser considerado um ácido nucléico isolado.

Purificado: O termo "purificado" como usado aqui indica que oscontaminantes foram removidos da amostra de interesse. O termo "purifica-do" não requer pureza absoluta, porém de preferência, é planejado como umtermo relativo, salvo indicação em contrário pelo contexto. Desta maneira,por exemplo, um polipeptídeo purificado ou preparação de ácido nucléicopode ser um onde o polipeptídeo ou ácido nucléico em questão está em umaconcentração maior do que o polipeptídeo ou ácido nucléico poderia estarem seu ambiente natural dentro de um organismo ou em uma concentraçãomaior do que no ambiente a partir do qual este foi removido.

Aminotransferase de estereoinversão: Uma "aminotransferasede estereoinversão" é um polipeptídeo capaz de produzir de forma preferen-ciai ou seletiva um produto de aminoácido quiral (tal como, monatina) en-quanto utiliza um substrato de quiralidade oposta como o doador de amino.Por exemplo, uma aminotransferase de estereoinversão pode ser uma D-fenilglicina aminotransferase (também chamada de D-4-hidroxifenilglicinaaminotransferase) que utiliza de forma preferencial ou seletiva L-glutamatocomo um substrato para produzir monatina R,R. Exemplos não-limitativos deaminotransferases de estereoinversão incluem D-metionina aminotransfera-se (EC 2.6.1.41) e enzimas que possuem atividade de D-fenilglicina amino-transferase ou atividade de D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase.

Gene Complementar: Um "gene complementar" é um gene que,quando expresso, anula uma mutação em um organismo. Por exemplo, seum organismo possui uma mutação nula em um dos genes requeridos parasíntese de triptofano através da célula, um gene complementar poderia serum que, quando expresso, permite que a cepa se desenvolva sobre meiomínimo (ou seja, sem triptofano).

Enzima Estereosseletiva: Uma "enzima estereosseletiva" é umaenzima que possui especificidade maior e/ou atividade maior para um isôme-ro, quando comparada com a especificidade e/ou atividade para outro isô-mero. Por exemplo, uma enzima estereosseletiva é uma que possui especi-ficidade e/ou atividade maior para R-MP do que para S-MP. Em modalidadespreferidas, uma enzima estereosseletiva possui atividade limitada para umisômero quando comparada com outra. Atividade "limitada" se refere à ativi-dade que é minimamente ou não perceptível, por exemplo, como determina-do de acordo com experimentos proporcionados aqui. O Exemplo 6, por e-xemplo, identifica HEXAspCP9T/R122G como uma enzima com atividadelimitada sobre monatina S,S. O Exemplo 8 identifica S. meliloti TatA comooutra enzima com atividade limitada para S-MP. No Exemplo 18, a D-aminotransferase de B. halodurans possui seletividade maior para R-MPquando comparada com S-MP, resultando em estereopureza maior de mo-natina R,R. Também, o Exemplo 19 indica que DAT híbrida possui atividadelimitada sobre S-MP comparada com R-MP.

Homólogo: O termo "homólogo" como usado aqui indica queuma proteína ou um ácido nucléico apresenta um grau relativamente alto deidentidade de seqüência com uma seqüência de outra proteína ou ácido nu-cléico quando as duas seqüências forem alinhadas utilizando métodos pa-drão. Por exemplo, uma R-aldolase específica é homóloga à aldolase deSEQ ID NO:22 se a R-aldolase específica contiver pelo menos cerca de 50%de identidade^de seqüência com a aldolase de SEQ ID NO:22 quando asduas seqüências forem alinhadas utilizando métodos padrão.

Número EC: O número de classificação de enzima como atribuí-do por International Union of Biochemistry and Molecular Biology.Vias Biossintéticas para Produzir R.R e Outros Estereoisômeros de Monatina

Como descrito, inter alia, em WO 03/091396 A2 (ver, por exem-plo, Figuras 1 a 3 e 11 a 13), a monatina pode ser produzida a partir de trip-tofano através de uma via com múltiplas etapas que envolvem conversõesbiológicas (ou seja, facilitando a reação de um substrato a um produto comum polipeptídeo). Uma via descrita envolve converter biologicamente tripto-fano em indol-3-piruvato, converter biologicamente indol-3-piruvato em ácidoglutárico 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto ("MP"), e converter biologicamen-te MP em monatina. A via de biossíntese da presente invenção que é usadapara produzir monatina pode compreender, ou consistir essencialmente em,uma ou mais das seguintes etapas, mecanismos e/ou vias. As etapas, me-canismos e/ou vias descritas abaixo são consideradas simplesmente exem-plificativas.

Um método para produzir monatina, ou um sal desta, compreen-de (a) produzir indol-3-piruvato a partir de L-triptofano, (b) produzir precursorde monatina a partir do indol-3-piruvato, e (c) produzir monatina a partir doprecursor de monatina.

As enzimas úteis para converter triptofano em indol-3-piruvatoincluem elementos das classificações de enzima ("EC") 2.6.1.27, 1.4.1.19,1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, 2.6.1.21 e 3.5.1.-.

Estas classes incluem polipeptídeos tais como: triptofano aminotransferase,que converte L-triptofano e a-KG (ou seja, cc-cetoglutarato, também chama-do de 2-oxoglutarato) em indol-3-piruvato e L-glutamato; D-triptofano amino-transferase, que converte D-triptofano e um 2-oxoácido em indol-3-piruvato eum aminoácido; triptofano desidrogenase, que converte L-triptofano eNAD(P) em indol-3-piruvato e NH3 e NAD(P)H; D-aminoácido desidrogena-se, que converte D-aminoácidos e FAD em indol-3-piruvato e NH3 e FADH2;triptofano-fenilpiruvato transaminase, que converte L-triptofano e fenilpiruva-to em indol-3-piruvato e L-fenilalanina; L-aminoácido oxidase, que converteum L-aminoácido e H20 e 02 em um 2-oxoácido e NH3 e H202; D-aminoácido oxidase, que converte um D-aminoácido e H20 e 02 em um 2-oxoácido e NH3 e H202; e triptofano oxidase, que converte L-triptofano e H20e 02 em indol-3-piruvato e NH3 e H202. Estas classes também contêm tirosi-na aminotransferase (aromática), aspartato aminotransferase, D-aminoácido(ou D-alanina) aminotransferase, e ampla aminotransferase (múltiplos subs-tratos) que possuem múltiplas atividades de aminotransferase, algumas dasquais podem converter triptofano e um 2-oxoácido em indol-3-piruvato e umaminoácido. Ademais, estas classes incluem fenilalanina deaminases, quepodem converter triptofano em indol-3-piruvato e amônio na presença deágua.

A produção de indol-3-piruvato a partir de L-triptofano tambémpode ser facilitada por uma ou mais enzimas que possuem atividade maior,especificidade maior, ou ambas, para L-triptofano como um substrato do quetanto para MP como monatina. Exemplos de enzimas que possuem ativida-de maior e/ou especificidade maior para L-triptofano como um substrato doque tanto para MP como monatina incluem, porém sem caráter limitativo, L-triptofano aminotransferases, L-aminotransferases aromáticas, L-aspartatoaminotransferases, e L-aminoácido oxidases.

As enzimas úteis para converter indol-3-piruvato em MP incluemelementos de classes de enzima EC 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17, e 4.1.2.-. Es-tas classes incluem sintases/liases carbono-carbono, tais como, aldolasesque catalisam a condensação de dois substratos de ácido carboxílico. Aclasse de enzima EC 4.1.3.- se refere àquelas sintases/liases que formamligações carbono-carbono que utilizam substratos de oxoácido (tal como,indol-3-piruvato) como o eletrófilo, enquanto EC 4.1.2.- são sintases/liasesque formam ligações carbono-carbono que utilizam substratos de aldeído (talcomo, benzaldeído) como o eletrófilo. Por exemplo, KHG aldolase (EC4.1.3.16) e ProA aldolase (EC 4.1.3.17), são conhecidas por converter indol-3-piruvato e piruvato em MP. Embora aldolase ProA possa ser consideradapara identificar apenas a 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldolase derivadade Comamonas testosteroni, o termo ProA aldolase é usado para se referir aqualquer polipeptídeo com atividade de 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato aldo-lase, salvo estabelecido em contrário. Exemplos adequados de Pro aldola-ses incluem ProA Comamonas testosteroni (SEQ ID NO:1 (seqüência deácido nucléico), SEQ ID NO:2 (seqüência de aminoácido)) e ProA Sinorhizo-bium meliloti (Número de Acesso NCBI: CAC46344), ou enzimas que apre-sentam homologia a ProA Comamonas testosteroni (SEQ ID NO:1 (seqüên-cia de ácido nucléico), SEQ ID NO:2 (seqüência de aminoácido)) e/ou ProASinorhizobium meliloti (Número de Acesso NCBI: CAC46344). Por exemplo,as enzimas adequadas podem possuir pelo menos cerca de 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90%, 95% e/ou 99% de identidade de seqüência de amino-ácido com ProA Comamonas testosteroni (SEQ ID NO: 2) e/ou ProA Sino-rhizobium meliloti (Número de Acesso NCBI: CAC46344). MP também podeser gerado utilizando reações químicas, tais como, as condensações aldóli-cas.

As enzimas úteis para a conversão de MP em monatina incluemelementos das classes de enzima (EC): triptofano aminotransferases (2.6.1.27),triptofano desidrogenases (1.4.1.19), D-aminoácido desidrogenases (1.4.99.1),glutamato desidrogenases (1.4.1.2-4), fenilalanina desidrogenase (1.4.1.20),triptofano-fenilpiruvato transaminases (2.6.1.28), ou mais geralmente, ele-mentos da família de aminotransferase (2.6.1.-), tal como aspartato amino-transferase (EC 2.6.1.1), tirosina aminotransferase (aromática) (2.6.1.5),D-triptofano aminotransferase, ou D-alanina (2.6.1.21) aminotransferase (ve-ja, Figura 2 de WO 03/091396 A2). Esta reação também pode ser realizadautilizando reações químicas. A aminação de cetoácido (MP) é realizada poraminação redutiva utilizando amônia e cianoboroidreto de sódio. As Figuras11 a 13 de WO 03/091396 A2 mostram os polipeptídeos adicionais que po-dem ser usados para converter MP em monatina, bem como proporcionarrendimentos aumentados de monatina a partir de indol-3-piruvato ou tripto-fano.

O perfil de paladar de uma composição de monatina pode seralterado ao controlar a quantidade relativa dos diversos estereoisômeros demonatina na composição. A presente descrição proporciona vias e substân-cias para produzir composições de monatina com uma porcentagem deseja-da de monatina R,R e/ou monatina S,R.

A quiralidade dos compostos de monatina que é produzida porvias, tais como aquelas exemplificadas aqui, pode ser alterada tanto atravésde pH como através dos polipeptídeos usados para as conversões biológi-cas. Quando a monatina for formada utilizando uma via biossintética, o se-guinte pode ser considerado. Em uma reação biocatalítica, a quiralidade damonatina em carbono-2 (veja estrutura química acima) é determinada pelaenzima que converte indol-3-piruvato em MP. Múltiplas enzimas (por exem-pio, de EC 4.1.2.-, 4.1.3.-) podem converter indol-3-piruvato em MP. Destamaneira, alguém pode selecionar a enzima que forma o isômero desejado.

Alternativamente, a enantioespecificidade da enzima que converte indol-3-piruvato em MP pode ser modificada através do uso de evolução direta ouanticorpos catalíticos podem ser engenheirados para catalisar a reação de-sejada. Uma vez que MP é produzido (tanto de forma enzimática como porcondensação química), o grupo amino pode ser adicionado de forma estere-oespecífica. Tanto a configuração R como S de carbono-4 {veja, estruturaquímica anterior) pode ser gerada dependendo se uma D ou L- ácido amino-transferase aromática for usada. Muitas aminotransferases são específicaspara o L-isômero, entretanto, há D-triptofano aminotransferases em certasplantas (Kohiba and Mito, Proceedings of the 8th International Symposiumon Vitamin B6 and Carbonyl Catalysis, Osaka, Japan 1990). Ademais, D-ala-nina aminotransferases (EC 2.6.1.21), D-metionina-piruvato aminotransfera-ses (EC 2.6.1.41) e tanto (R)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase(EC 2.6.1.61), (S)-3-amino-2-metilpropanoato aminotransferase (EC 2.6.1.22),como D-fenilglicina aminotransferase foram identificadas. Certas aminotrans-ferases podem aceitar apenas o substrato para esta reação com uma confi-guração particular no carbono C2. Portanto, mesmo que a conversão em MPnão seja estereoespecífica, a estereoquímica do produto final pode ser con-trolada através da seleção apropriada de uma aminotransferase. Devido aofato de a reação ser reversível, o MP não-reagido (isômero indesejado) podeser reciclado fiovamente em seus constituintes e uma mistura racêmica deMP pode ser realizada.

Com referência agora às figuras, o seguinte deve ser observado.Os fluxogramas identificam exemplos de vias para produzir monatina, porémas vias mostradas sobre as figuras, e os métodos da invenção, não se limi-tam a nenhum método particular para praticar as vias, salvo estabelecido emcontrário. Por exemplo, as vias podem ser praticadas in vivo, in vitro, ou umacombinação destas.

Ademais, a prática de um método da invenção que utilize umaou mais vias descritas aqui não requer que cada componente identificado(por exemplo, reagentes e enzimas) seja explicitamente proporcionado peloprofissional; de preferência, é suficiente que os componentes, (ou fontes decomponentes), e condições de reação estejam presentes na composição (oucélula hospedeira) ou de outra maneira, disponível de modo que a via possaprosseguir de forma potencial. Em outras palavras, por exemplo, se uma fi-gura mostrar um processo para produzir uma composição de monatina, istoinclui produzir indol-3-piruvato a partir de L-triptofano, produzir ácido glutári-co 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetill)-4-ceto ("precursor de monatina" ou "MP") apartir de indol-3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP, onde cada rea-ção é facilitada por uma enzima apropriada, é observado que a prática da-quela via inclui combinar L-triptofano com a-cetoglutarato e enzimas conhe-cidas por facilitar as reações identificadas, e sob condições adequadas paracada reação ocorrer também sem proporcionar explicitamente indol-3-piruvato ou MP. Em tal caso, L-triptofano poderia reagir com a-cetoglutaratopara produzir indol-3-piruvato. Dependendo das condições e da enzima pro-porcionada, o indol-3-piruvato produzido a partir da reação de L-triptofanopode reagir para formar MP, e então dependendo das condições e da enzi-ma proporcionada, o MP produzido a partir da reação de indol-3-piruvatopode reagir para formar monatina.

Também deve ser observado que a prática de um método dainvenção que utilize uma ou mais vias descritas aqui não requer que o pro-fissional proporcione explicitamente os materiais de partida identificados ouenzimas, se tais materiais ou enzimas já estiverem, de outra maneira, pre-sentes ou disponíveis, ou capazes de ser sintetizadas a partir de uma subs-tância que já está presente ou disponível no meio de reação. Em outras pa-lavras, observa-se que a prática de qualquer via que identifica L-triptofanocomo um material de partida poderia incluir proporcionar um composto quepode produzir L-triptofano, sob condições adequadas para a produção deL-triptofano ocorrer e combinar aquele composto com enzimas capazes defacilitar a série de reações estabelecida sob condições que poderiam seradequadas para que aquelas reações ocorram. Como outro exemplo, tam-bém se observa que praticar a via identificada inclui proporcionar um micro-organismo geneticamente engenheirado para produzir monatina de acordocom a via descrita, e proporcionar condições apropriadas para o processo defermentação ocorrer. Por exemplo, um microorganismo, que produz natural-mente grandes quantidades de L-triptofano ou D-triptofano (veja, PatenteNo. U.S. 5.728.555) pode ser geneticamente engenheirado para produzir ousuperproduzir uma ou mais enzimas usadas para facilitar (catalisar) reaçõesna via com monatina, e condições apropriadas podem ser proporcionadas demodo que o microorganismo possa, dessa forma, produzir monatina.

Voltando-se agora para a Figura 1, o fluxograma mostrado es-quematicamente revela um processo de acordo com a invenção para fabri-car uma composição de monatina que inclui monatina R,R. Como mostradona Figura 1, a via total envolve uma reação de triptofano para formar indol-3-piruvato, uma reação de indol-3-piruvato para produzir MP, e uma reação deMP para produzir monatina, inclusive monatina R,R.

A Figura 1 ilustra adicionalmente permutações específicas destavia total, designadas para aumentar a produção da forma R,R de monatina àcusta das formas S,S, R,S e S,R de monatina. Em particular, a Figura 1 ilus-tra a modalidade onde: a enzima aminotransferase utilizada na reação deL-triptofano possui atividade e/ou especificidade maior para aquela reaçãoversus as reações de MP e monatina 4S ou possui atividade e/ou especifici-dade maior para L-triptofano do que para monatina 4R; a enzima que facilitaa reação de indol-3-piruvato é uma R-aldolase específica; e, a enzima quefacilita a reação de MP é uma D-enzima de ampla especificidade, de prefe-rência desenvolvida para funcionar de forma mais eficiente com o isômero Rde MP.

A Figura 1 também ilustra permutações particulares designadaspara tornar a produção de monatina R,R mais econômica. Por exemplo, naFigura 1 L-triptofano como oposto a D-triptofano ou combinações de L eD-triptofano é identificado como o material de partida. Embora a seleção daforma específica de triptofano não afete a quiralidade dos compostos de mo-natina fundamentais na composição de monatina (devido ao fato de a reaçãode triptofano formar indol-3-piruvato, que não possui quiralidade), algunspodem preferir utilizar L-triptofano como um material de partida pelo menosdevido ao fato de L-triptofano ser atualmente menos dispendioso e mais fa-cilmente obtenível do que D-triptofano.Concentrando-se agora na primeira reação mostrada na Figura1, quando triptofano for convertido em indol-3-piruvato qualquer um ou maisde alfa-cetoglutarato, oxaloacetato e/ou piruvato reage com o triptofano paraformar um aminoácido (glutamato, aspartato e alanina, respectivamente) eindol-3-piruvato. A Figura 1 mostra a modalidade onde o material de partidatriptofano é L-triptofano, e alfa-cetoglutarato, oxaloacetato e/ou piruvato produza forma L-isômero do aminoácido (por exemplo, L-glutamato, L-aspartato e/ouL-alanina, respectivamente).

Como mostrado na Figura 1, uma abordagem para aumentar aprodução de monatina R,R envolve facilitar a reação de L-triptofano comuma enzima que possui especificidade maior, atividade maior, ou ambaspara triptofano como oposto a MP ou monatina, e facilita a reação de MPcom uma D-enzima específica. Como mostrado em WO 03/091396 A2, cer-tas enzimas podem facilitar a reação de triptofano para produzir indol-3-piruvato, bem como a reação de aminação de MP para produzir monatina. Ouso de uma L-aminotransferase na etapa de aminação cria um centro quiralS na posição C-4 de monatina, enquanto que o uso de uma D-enzima criaum centro quiral D na posição C-4 de monatina. Desta maneira, no caso on-de uma L-aminotransferase, que facilita a reação de triptofano, também éativa na reação de MP, monatina R,S e S,S pode ser formada, dependendoda forma de MP presente. Ademais, certas outras enzimas-as L-aminoácidooxidases podem não só facilitar a reação de triptofano com indol-3-piruvato,como também podem possuir uma atividade secundária para a degradaçãode monatina R,R. De acordo com algumas modalidades, esta atividade se-cundária de 4R é reduzida ou eliminada. Uma atividade secundária de oxi-dase sobre formas 4S de monatina poderia reduzir ou minimizá-las a partirdo produto final e poderiam ser desejadas dependendo da composição finaldesejada. Conseqüentemente, quanto maior for a especificidade e/ou ativi-dade da L-enzima selecionada para triptofano versus o MP ou monatina,maior será a quantidade de R,R e S,R produzidas versus monatina S,S eR,S.

As enzimas adequadas para a reação de triptofano, de acordocom a modalidade ilustrada na Figura 1, incluem: L-aminotransferases capa-zes de facilitar uma reação de L-triptofano para formar indol-3-piruvato, eque possuem especificidade maior para a reação sobre a reação de R-MPpara formar isômeros 4S de monatina; e, L-aminoácido oxidases capazes defacilitar uma reação de L-triptofano para formar indol-3-piruvato, e que pos-suem especificidade e/ou atividade maior para aquela reação versus a rea-ção de isômeros 4R de monatina para formar MP, e equivalentes funcionaisde qualquer um dos anteriores. Mais especificamente, exemplos não limitati-vos de enzimas adequadas podem ser selecionados a partir de L-triptofanoaminotransferases (EC 2.6.1.27) e tirosina aminotransferases (aromáticas)(EC 2.6.1.5) e L-aminoácido oxidases (EC 1.4.3.2), e mutantes derivados deenzimas que possuem atividade de aspartato aminotransferase.

O Exemplo 6 identifica uma enzima específica, um polipeptídeoHEXaspC mutante que inclui uma substituição de Pro 9 por Tyr e uma substi-tuição de Arg 122 por Gly útil para facilitar as reações de L-triptofano e oc-KG,oxaloacetato, piruvato, ou combinações destes para formar indol-3-piruvatoe L-glutamato, L-aspartato e L-alanina, respectivamente. Outra enzima es-pecífica que possui atividade "limitada" é TatA, L-triptofano aminotransferasede S. meliloti. Outras enzimas adequadas para a reação de triptofano de a-cordo com modalidades preferidas da via mostrada na Figura 1 incluem a-quelas com as seguintes características: uma enzima que transamina MPem razão 1/10 ou menor que a razão de L-triptofano como no Exemplo 6 ouuma enzima quando usada com uma racemase, como no Exemplo 9, queproduz mais que 90% dos isômeros 4R de monatina.

Exemplos de enzimas que não possuem um alto grau de especi-ficidade para a conversão de L-triptofano em indol-3-piruvato comparadacom a conversão de MP em monatina incluem: HEXAspC (Exemplo 6), ami-notransferase de ampla especificidade Leishmania major (WO 03/091396A2), a aminotransferase TatA de Porcine (WO 03/091396 A2) e Rhodobactersphaeroides (Exemplo 9). Estas enzimas podem ser, entretanto, desenvolvi-das, por exemplo, através de mutagênese para ter atividade limitada de R-MP e/ou monatina R,R versus triptofano.Concentrando-se agora na segunda reação identificada na Figu-ra 1, a seleção de enzima para facilitar (ou catalisar) a reação de indol-3-piruvato para que MP influencie a quantidade relativa de monatina R,R ver-sus a monatina S,R produzida. Em geral, quando maior for a quantidade re-lativa de R-MP versus S-MP produzido, maior será a quantidade relativa demonatina R,R versus monatina S,R produzida (quando a D-enzima facilita areação de MP com monatina). As enzimas úteis neste aspecto incluem qual-quer enzima que produz uma proporção de R-MP:S-MP maior do que aquelaproduzida através da reação de indol-3-piruvato e piruvato quando facilitadapor uma entre a aldolase E. coli KHG (Genbank Número de Acesso No.AAC74920.1), a aldolase KHG Bacillus (Genbank Número de Acesso No.CAB14127.1) ou a aldolase ProA Comamonas testosteroni (SEQ ID NO:1(seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO:2 (seqüência de aminoácido)).Desta maneira, se for desejado produzir de forma preferencial R-MP, uma oumais enzimas capazes de produzir quantidades maiores de R-MP com rela-ção a S-MP podem ser usadas. Quando uma composição de monatina, quepossui a forma R,R de monatina apenas como seu componente de monati-na, for desejada, uma enzima que produz seletivamente R-MP como opostoa S-MP (uma "R-enzima específica") deveria ser usada. Exemplos de R-enzimas específicas, que podem ser usadas para produzir seletivamente R-MP como oposto a S-MP, são então aldolase de SEQ ID NO:22 e aldolaseHMG Sinorhizobium meliloti, como mostrado no Exemplo 3.

A Figura 1 identifica a modalidade particular onde uma R-aldolaseespecífica facilita a reação de indol-3-piruvato e piruvato para formar R-MP.

Também observa-se, entretanto, o uso de aldolases para a reação de indol-3-piruvato e piruvato que produzem, de preferência, R-MP, bem como aldo-lases que produzem uma proporção de R-MP:S-MP maior do que é produzi-da por qualquer uma entre a aldolase KHG E. coli (Genbank Número deAcesso No. AAC74920.1), a aldolase KHG Bacillus (Genbank Número deAcesso No. CAB14127.1) ou a aldolase ProA Comamonas testosteroni (SEQID NO:1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO:2 (seqüência de amino-ácido)). Ademais, também observa-se que indol-3-piruvato pode reagir comuma fonte C3 diferente (por exemplo, serina ou cisteína) para formar R-MPe, conseqüentemente, outras enzimas (por exemplo, outras liases ou sinta-ses) podem facilitar tal reação. Outros substratos que são facilmente conver-tidos em piruvato (tal como, oxaloacetato) também podem ser usados. OExemplo 3 proporciona fontes de enzimas aldolase que pode produzir deforma preferencial ou seletiva R-MP ou produzir uma proporção de R-MP:S-MP maior do que é produzida através da reação de indol-3-piruvato e piruva-to quando facilitada por qualquer uma entre a aldolase KHG E. coli (Gen-bank Número de Acesso No. AAC74920.1), a aldolase KHG Bacillus (Gen-bank Número de Acesso No. CAB14127.1) ou a aldolase ProA Comamonastestosteroni (SEQ ID NO:1 (seqüência de ácido nucléico), SEQ ID NO:2 (se-qüência de aminoácido)), tal como, a aldolase de SEQ ID NO:22. O Exemplo5 também proporciona métodos de triagem para identificar tais enzimas.

Também observa-se que as enzimas, que produzem de forma preferencialou seletiva R-MP ou produzem mais R-MP do que qualquer uma entre a al-dolase KHG E. coli (Genbank Número de Acesso No. AAC74920.1), a aldo-lase KHG Bacillus (Genbank Número de Acesso No. CAB14127.1) ou a al-dolase ProA Comamonas testosteroni (SEQ ID NO:1 (seqüência de ácidonucléico), SEQ ID NO:2 (seqüência de aminoácido)^ podem ser desenvolvi-das a partir dê aldolases conhecidas ou encontradas na natureza. Qualquertécnica conhecida para desenvolver enzimas, por exemplo, para aperfeiçoaruma característica desejada, tal como, para aumentar a atividade de umaenzima em um substrato como comparada com a enzima tipo selvagem po-de ser usada. Os Exemplos 4, 5, 6, 7, 9, 10 e 11 proporcionam algumas téc-nicas para desenvolver enzimas.

Concentrando-se agora na última etapa da via identificada naFigura 1, a reação de R-MP para formar monatina R,R é mostrada para serfacilitada por uma D-aminotransferase de ampla especificidade, por exem-plo, D-alanina aminotransferase (EC 2.6.1.21, também conhecida como s D-aminoácido aminotransferase ou D-aspartato aminotransferase) ou uma D-aminoácido desidrogenase. Como discutido acima, a conversão de MP emmonatina é uma reação de aminação, que cria um centro quiral no carbonoC-4 de monatina. Quando a forma quiral R for desejada na posição C-4, asenzimas que devem ser usadas produzem centros quirais "R" em aminoáci-dos. As enzimas exemplificativas não limitativas incluem: uma D-alanina-aminotransferase derivada de Bacillus (Exemplos 15 a 18), inclusive a D-alanina-aminotransferase derivada de Bacillus halodurans (Exemplo 18) euma aminotransferase modificada de cadeia ramificada que teve a estereo-especficidade modificada (Exemplo 7).

Outra enzima exemplificativa inclui uma D-aminotransferase hí-brida. A D-aminotransferase híbrida pode conter elementos estruturais deduas aminoácido aminotransferases diferentes. A D-aminotransferase híbri-da pode ser então adicionalmente desenvolvida (por exemplo, através demutagênese ou engenharia recombinante) para desempenho aperfeiçoadona conversão de MP em monatina. Um exemplo de tal D-aminotransferasehíbrida é mostrado no Exemplo 19. A D-aminotransferase híbrida ilustradano Exemplo 19 incluiu elementos de uma D-aminotransferase de B. spaerí-cus e uma D-aminotransferase de G. stearothermophilus. A monatina R,R foiproduzida utilizando esta D-aminotransferase (Exemplo 19).

O Exemplo 2 também ilustra a produção de monatina R,R queutiliza diversas D-aminotransferases.

De acordo com algumas modalidades, a D-aminotransferasepossui especificidade maior, atividade maior, ou ambas para R-MP como umsubstrato, do que indol-3-piruvato. Em certas outras modalidades, a D-aminotransferase possui atividade limitada para indol-3-piruvato como umsubstrato. As enzimas com tais características podem ser desenvolvidas oumodificadas a partir de enzimas existentes, por exemplo, como mostrado noExemplo 6.

Também, em algumas modalidades, a reação de R-MP paraformar monatina R,R pode ser facilitada por uma D-aminoácido desidroge-nase. O Exemplo 20 ilustra a produção de monatina R,R a partir de R-MPque utiliza uma D-aminoácido desidrogenase (D-AADH-101 a 108, BioCa-talytics). Estas D-aminoácido desidrogenases podem ser adicionalmente de-senvolvidas (por exemplo, através de mutagênese ou engenharia recombi-nante) para desempenho aperfeiçoado.

A Figura 2 mostra outra estratégia para marcar a produção demonatina R,R. Enquanto que na modalidade da Figura 1, a aldolase usadana reação de indol-3-piruvato para formar R-MP influencia a proporção deR,R:S,R formada, na modalidade da Figura 2, a D-enzima que facilita a con-versão de MP em monatina influencia a proporção de R,R:S,R formada. Deacordo com a modalidade da Figura 2, uma enzima não-estereoespecíficapode ser usada para facilitar a conversão de indol-3-piruvato em MP, e con-seqüentemente, tanto S-MP como R-MP pode ser formado. Para obter umaproporção desejada de monatina R,R para monatina S,R, uma D-enzima éselecionada (ou desenvolvida) com estereosseletividade apropriada de R-MP versus S-MP. Quando for desejada uma composição de monatina quepossui a forma R,R de monatina apenas como seu componente de monati-na, uma enzima que facilita de forma seletiva a reação de R-MP com mona-tina como oposto a S-MP com monatina poderia ser preferida. Por exemplo,a D-aminotransferase de Bacillus halodurans (Exemplo 18) e a D-amino-transferase híbrida que contém elementos estruturais tanto de Bacillus s-phaericus como Geobacillus stearothermophilus (Exemplo 19) podem serutilizadas como a enzima que facilita de forma seletiva a reação de R-MPcom monatina.

A Figura 3 ilustra outra via alternativa para a produção de com-posições enriquecidas em monatina R,R. A via da Figura 3 é uma modifica-ção da via da Figura 1. Na via mostrada na Figura 3, indol-3-piruvato é pro-duzido de forma indireta, em vez de direta, de L-triptofano. Mais especifica-mente, L-triptofano é convertido em D-triptofano, e D-triptofano é então con-vertido em indol-3-piruvato. O Exemplo 4 ilustra a produção de monatina R,Ra partir de L-triptofano que utiliza uma triptofano racemase.

A conversão de of L-triptofano em D-triptofano pode ser facilita-da por uma triptofano racemase ou equivalente funcional desta. O Exemplo4 proporciona fontes potenciais de triptofano racemases e métodos de tria-gem para identificar tais enzimas. O Exemplo 4 descreve exemplos de tripto-fano racemases que são capazes de converter L-triptofano em D-triptofano.Estas triptofano racemases podem ser adicionalmente desenvolvidas (porexemplo, através de mutagênese ou engenharia recombinante) para desem-penho aperfeiçoado.

Exemplos não limitativos de triptofano racemases incluem homó-logos ou mutantes de aminoácido racemases (EC 5.1.1.-), por exemplo, se-rina racemase, onde os homólogos ou mutantes são capazes de converterL-triptofano em D-triptofano. Exemplos não limitativos de fontes a partir dasquais a aminoácido racemase pode ser derivada incluem microorganismos,tais como, Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacil-lus sphaericus, Bacillus halodurans, Geobacillus stearothermophilus, Bacilluslicheniformis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Schizosaccaroycespombe, Bacillus cereus, Enterococcus gallinarum, Pediococcus pentosa-ceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, Aquifexpyrophilus, Lactobacilli, Streptococcus, Anabaena sp., Pseudomonas striata,Lentinus edodes, Scapharca brouhtonii Desulfurococcus sp., Thermococcussp., e Pseudomonas striata. Exemplos não limitativos adicionais de fontes apartir das quais a aminoácido racemase pode ser derivada incluem bicho-da-seda, cérebro de rato, ou cérebro de camundongo. Estas aminoácido race-mases podem ser desenvolvidas (por exemplo, através de mutagênese ouengenharia recombinante) para desempenho aperfeiçoado na conversão deL-triptofano em D-triptofano.

Exemplos não limitativos de fontes potenciais a partir das quaisas triptofano racemases adequadas podem ser derivadas incluem: microor-ganismos, tais como, Pseudomonas, por exemplo, Pseudomonas chlorora-phis (Pseudomonas aurereofaciens) (ATCC15926), e Burkholderia pyrrocina(ATCC15958). Exemplos não limitativos adicionais de fontes potenciais apartir das quais triptofano racemases adequadas podem ser derivadas inclu-em plantas, por exemplo, plantas de tabaco, tal como, Nicotiana tabacum,plantas de trigo, tal como, Triticum aestivum, beterrabas, tomates e Sclero-chiton ilicifolius.

A via mostrada na Figura 3 possui certos benefícios, inclusiveaqueles mesmo quando monatina R,R for o produto desejado, a mesma en-zima pode ser usada para a reação que produz indol-3-piruvato conformepara a reação que produz monatina como um produto. Ou seja, na via ilus-trada na Figura 1, uma L-aminotransferase (ou L-enzima adequada) facilita areação que produz indol-3-piruvato, porém uma D-aminotransferase facilita areação que produz monatina. Em contrapartida, na via da Figura 3, uma cer-ta D-aminotransferase que facilita a reação que produz indol-3-piruvato,também pode facilitar a reação que produz monatina. Conseqüentemente,nas vias de acordo com a Figura 3, D-aminotransferases de ampla especifi-cidade podem ser preferidas quando há um desejo de utilizar a mesma en-zima para a reação que forma indol-3-piruvato conforme para a reação queforma monatina. Em contrapartida, nas vias de acordo com as Figuras 1, 2,4, 6, 7 e 8 a produção de monatina pode ser mais eficiente quando uma D-aminotransferase for selecionada possuindo atividade e/ou especificidadelimitada para indol-3-piruvato como comparado com R-MP.

Outro benefício da via esquematicamente representada na Figu-ra 3 é que o produto de aminoácido da reação acoplada à reação que pro-duz indol-3-piruvato agora pode ser usado como um substrato na reaçãoacoplada à reação que produz monatina. Ou seja, na via ilustrada na Figura1, L-triptofano reage para produzir indol-3-piruvato and e ao mesmo tempooxaloacetato.^alfa-cetoglutarato e/ou piruvato reagem para produzir um L-aminoácido. Devido ao fato de a reação de R-MP para formar monatina seracoplada com uma reação que utiliza um D-aminoácido como um substrato,o L-aminoácido da reação que forma indol-3-piruvato não é, sob as condi-ções mostradas, reciclado para uso na reação acoplada à reação de R-MP.

Ao contrário, na via ilustrada na Figura 3, a reação de D-triptofano para for-mar indol-3-piruvato é acoplada a uma reação que forma um produto de D-aminoácido, tal D-aminoácido pode ser reciclado para uso na reação aco-plada à reação de R-MP. Isto permite que alguém utilize quantidades não-estequiométricas de aceitador de amino na etapa um e o doador de aminona etapa 3 é produzido na etapa 1.

As Figuras 4 e 5 ilustram modificações adicionais da via mostra-da na Figura 1. Estas modificações são dirigidas para reciclar o produto deaminoácido formado através da reação acoplada com a reação de transami-nação de L-triptofano com o reagente de aminoácido da reação acoplada àreação de MP com monatina.

Retornando para a Figura 4, a reciclagem é realizada ao propor-cionar uma enzima que pode facilitar a conversão de um L-aminoácido emum D-aminoácido e vice-versa. Mais especificamente, onde, como mostradona Figura 4, oc-KG reage para formar L-glutamato quando L-triptofano reagirpara formar indol-3-piruvato, uma glutamato racemase (EC 5.1.1.3) ou equi-valente funcional que é proporcionado pode facilitar a conversão de L-gluta-mato em D-glutamato e vice-versa. Em tal caso, o L-glutamato formado co-mo um produto juntamente com a produção de indol-3-piruvato é parcial-mente removido devido à sua conversão em D-glutamato, e o D-glutamatoformado partir da conversão de L-glutamato fica então disponível como umsubstrato para a reação acoplada à reação de MP com monatina. De formasimilar, o a-KG formado na reação de D-glutamato fica disponível como umsubstrato para a reação acoplada à reação de L-triptofano com indol-3-piruvato.

Exemplos não limitativos de fontes potenciais a partir das quaisuma glutamato racemase pode ser derivada incluem Pediococcus pentosa-ceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, E. coli,Aquifex pyrophilus, and Bacillus subtilis. Mais especificamente (também nãolimitativos), a glutamato racemase pode ser expressa a partir de um ácidonucléico tal como gene de Pediococcus pentaosaceus murl (Genbank Nú-mero de Acesso No. L22789), ou glutamato racemase de Lactobacillus brews.

Onde oxaloacetato reagir para formar L-aspartato quando L-tripto-fano reagir para formar indol-3-piruvato, uma aspartato racemase (EC5.1.1.13) ou equivalente funcional pode ser proporcionada para converterL-aspartato em D-aspartato. Em tal caso, o L-aspartato que é formado namesma reação que produz indol-3-piruvato é parcialmente removido devidoà sua conversão em D-aspartato, e o D-aspartato fica então disponível comoum substrato para a reação acoplada à reação de MP com monatina. Deforma similar, o oxaloacetato formado na reação de D-aspartato fica disponí-vel para atuar como um substrato para a reação acoplada à reação deL-triptofano com indol-3-piruvato.

Exemplos não limitativos de enzimas adequadas que possuematividade de aspartato racemase incluem ASPR-101 (BioCatalytics, Inc., 129N. Hill Ave, Suite 103, Pasadena, CA 91106-1955) e homólogos ou mutantesde uma aminoácido racemase (EC 5.1.1.-) que são capazes de facilitar aconversão de L-aspartato em D-aspartato.

Exemplos não limitativos de fontes potenciais a partir das quaisaspartato racemases podem ser derivadas incluem: Desulfurococcus, Ther-mococcus, bivalve mollusk Scapharca brouhtonii, Acinetobacter, Agrobacte-rium, Archaeoglobus, Bacillus, Bordetella, Bradyrhizobium, Brevibacterium,Burkholderia, Campylobacter, Cândida, Caulobacter, Clostridium, Desulfito-bacterium, Desulfotalea, Enterococcus, Erwinia, Escherichia, Ferroplasma,Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Mannheimia, Medicago, Mesorhizobi-um, Methanococcus, Methanosarcina, Oceanobacillus, Oenococcus, Pedio-coccus, Polaribacter, Pseudomonas, Pyrococcus, Ralsonia, Shigella, Sino-rhizobium, Salmonella, Sphingomonas, Streptococcus, Thermoanaerobacter,Vibrio, Wolinella, Xanthomonas, Xanthobacter, Yersinia e Zymomonas.

Onde piruvato reagir para formar L-alanina quando L-triptofanoreagir para formar indol-3-piruvato, uma alanina racemase ou equivalentefuncional pode ser proporcionada para converter L-alanina em D-alanina. Emtal caso, a L-alanina que é formada na mesma reação que produz indol-3-piruvato é removida devido à sua conversão em D-alanina, e a D-alaninaformada a partir da conversão de L-alanina fica então disponível para atuarcomo um substrato para a reação acoplada à reação de MP com monatina.De forma similar, o piruvato formado na reação de D-alanina fica disponívelpara a reação se acoplar à reação de L-triptofano com indol-3-piruvato.

Exemplos não limitativos de alanina racemases adequadas in-cluem A8936 (Sigma, PO Box 14508, St. Louis, MO, 63178) e alanina race-mase de Geobacillus stearothermophilus como descrito no Exemplo 4.

Exemplos não limitativos de fontes potenciais a partir das quaisa alanina racemase pode ser derivada incluem: Brucella abortus, Strepto-coccus faecalis Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Bacillus subtilis,Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholerae, Schizosaccaroyces pombe, Ba-cillus cereus e Lentinus edodes.

Os Exemplos 9 e 12 ilustram o uso das racemases acima, seuimpacto sobre o aumento da proporção do produto de monatina desejado, eproporcionam fontes potenciais para as enzimas racemase.

Retornando para a Figura 5, uma aminotransferase de estereo-inversão é usada para facilitar a reação de R-MP com monatina. Embora,tipicamente, a reação de R-MP (ou S-MP) para formar monatina R,R (oumonatina S,R) é acoplada à reação de um D-aminoácido, uma aminotransfera-se de estereoinversão pode facilitar as reações acopladas de R-MP (ou S-MP)para formar monatina R,R (ou monatina S,R) que utiliza um L-aminoácido.Desta maneira, o produto de L-aminoácido da reação de L-triptofano amino-transferase pode ser usado como um substrato para a transaminação de MPcom monatina, e o produto (ou seja, oxaloacetato, piruvato, e/ou oc-KG) dareação acoplada à reação de MP com monatina pode ser usado como ummaterial de partida para a reação acoplada à reação de L-triptofano com in-dol-3-piruvato. Exemplos não limitativos de aminotransferases de estereoin-versão que podem ser usados incluem mutantes derivados de D-fenilglicinaaminotransferase (EC 2.6.1.72, também conhecida como D-4-hidroxifenilgli-cina aminotransferase), D-metionina aminotransferase (EC 2.6.1.41, tambémconhecida como D-met-aminotransferase e D-metionina-piruvato amino-transferase), e homólogos destas. Exemplos não limitativos de fontes poten-ciais a partir das quais os mutantes de D-fenilglicina aminotransferase po-dem ser derivados incluem Pseudomonas, tais como, Pseudomonas putidaLW-4 e Pseudomonas stutzeri ST-201. Exemplos não limitativos de fontespotenciais a partir das quais a D-metionina aminotransferase pode ser deri-vada incluem couve-flor e amendoim.

Os Exemplos 10 e 11 proporcionam juntamente fontes potenci-ais de enzimas de estereoinversão, e métodos para fabricar tais enzimas. Osexemplos também proporcionam métodos de triagem para identificar taisenzimas. Foi observado que tais enzimas podem ser desenvolvidas a partirde enzimas de estereoinversão conhecidas ou encontradas na natureza.Como um exemplo não limitativo, a aminotransferase de estereoinversãopode ser um homólogo ou mutante de uma D-aminoácido aminotransferaseou um homólogo ou mutante de uma aminoácido racemase (EC 5.1.1.-).

As Figuras 6 e 7 também ilustram modificações na via da Figura1. As vias ilustradas nas Figuras 6 e 7 proporcionam métodos para puxar asreações de equilíbrio para frente (ou seja, em direção de produção de mona-tina) ao remover o subproduto da reação de reação com uma reação irrever-sível e em alguns casos proporcionando o substrato para a reação de MP.

Retornando para a Figura 6, a via mostrada remove o produto deL-aminoácido da reação acoplada à reação de triptofano ao converter omesmo em um L-aminoácido diferente e CO2, e então proporciona um subs-trato para a reação acoplada à reação de MP ao converter o L-aminoácidorecentemente formado em um D-aminoácido. Especificamente, L-triptofano émostrado para reagir ao lado de oxaloacetato para formar indol-3-piruvato eL-aspartato. Um aspartato 4-descarboxilase (EC 4.1.1.12) ou equivalentefuncional é usado para facilitar a conversão de L-aspartato em L-alanina edióxido de carbono, e uma enzima com atividade de alanina racemase é u-sada para facilitar a conversão de L-alanina em D-alanina, tal D-alanina po-de servir como um doador de amino para a conversão de R-MP em monati-na.

Retornando para a Figura 7, a via mostrada ilustra métodos adi-cionais para remover o produto de L-aminoácido da reação acoplada à rea-ção de triptofano. As modalidades, conforme apresentadas nas figures, pro-duzem um subproduto(s) que está indisponível para reagir na direção rever-sa, por exemplo, devido à volatilidade (por exemplo, dióxido de carbono) oupor conversão espontânea em um produto final não reativo. Um exemplo detal abordagem inclui modalidades onde a-KG reage ao lado de L-triptofanopara produzir L-glutamato, e, se desejado, uma glutamato descarboxilase(EC 4.1.1.15) ou equivalente funcional pode ser proporcionado para facilitara conversão de L-glutamato em 4-aminobutanoato (com dióxido de carbonocomo um subproduto). Exemplos não limitativos de fontes potenciais a partirdas quais a L-glutamato descarboxilase pode ser derivada incluem: Clostri-dium perfringens, C. welchii, ou E. coli.

Outro exemplo de tal abordagem para conduzir a reação de trip-tofano para a frente (na direção de produção de monatina) inclui reaçõesonde oxaloacetato é utilizado como um co-substrato na reação que utiliza L-triptofano e onde o oxaloacetato é convertido em L-aspartato; se desejado,uma aspartato descarboxilase (EC 4.1.1.11) ou equivalente funcional podeser proporcionado para facilitar a conversão de L-aspartato em p-alanina(com dióxido de carbono como um subproduto).

Retornando para a Figura 8, a via mostrada ilustra ainda méto-dos adicionais para converter o produto de L-aminoácido da reação acopla-da à reação de triptofano com um substrato para a reação acoplada à rea-ção de MP. Especificamente, onde a-KG é utilizado na mesma reação queL-triptofano, e onde a-KG forma L-glutamato, uma enzima com atividade deL-alanina aminotransferase e piruvato pode ser proporcionada, onde a enzi-ma de L-alanina aminotransferase facilita a reação de piruvato e L-glutamatopara formar L-alanina. Uma alanina racemase ou equivalente funcional tam-bém pode ser proporcionada para facilitar a conversão da L-alanina em D-alanina, tal D-alanina pode ser usada como um substrato juntamente comMP para formar monatina e piruvato. Veja Exemplo 12.

Implicitamente descrito nas vias de biossíntese acima, e nas re-ações descritas nos Exemplos abaixo, estão misturas que contêm um oumais compostos e/ou enzimas requeridos na via de biossíntese para produ-zir monatina, inclusive monatina R,R, ou precursor de monatina, inclusiveprecursor de monatina R.

Para a produção in vitro, qualquer ou todas as vias biossintéticasdescritas aqui ou etapas individuais nas vias descritas aqui podem ser con-duzidas em solução in vitro ou in vivo, em uma célula hospedeira, em sérieou em paralelo. Quando o método da invenção utilizar uma ou mais reaçõesque são realizadas in vitro, a reação biossintética que é realizada in vitro po-de ser realizada ao combinar os ingredientes desejados para a(s) rea-ção(ões) por mistura em um meio de reação aquoso ou solução. A misturade reação assim formada é mantida durante um período de tempo suficientepara o(s) produto(s) desejado(s) ser(em) sintetizado(s).

Adicionalmente, a atividade de uma ou mais enzimas pode seraumentada através do uso contínuo de cofatores durante a purificação deuma ou mais enzimas. Por exemplo, incluindo piridoxal-5'-fosfato quando apurificação de D-alanina aminotransferase B. sphaericus resultar em ativida-de aumentada (Exemplo 14).

Quando uma ou mais reações nas vias da invenção forem reali-zadas in vitro, qualquer ou todas as enzimas utilizadas nas vias biossintéti-cas descritas aqui podem ser opcionalmente imobilizadas sobre um suportesólido. Exemplos de tais suportes sólidos incluem aqueles que contêm epóxi,aldeído, quelantes, ou grupos amina primária. Exemplos específicos de su-portes sólidos adequados incluem, porém sem caráter limitativo, Eupergit® C(Rohm and Haas Company, Philadelphia, PA) contas de resina e SEPABE-ADS® EC-EP (Resindion). O Exemplo 21 ilustra a imobilização de D-alaninaaminotransferase B. sphaericus sobre contas de resina Eupergit® C. O E-xemplo 22 ilustra a imobilização de aldolase ProA Sinorhizobium meliloti so-bre contas de resina Eupergit® C. A produção de monatina R,R que utilizaestas enzimas imobilizadas é mostrada no Exemplo 23.

As reações individuais mostradas nas vias biossintéticas descri-tas aqui podem ser facilitadas (catalisadas) através de uma única enzima ouatravés de uma mistura de múltiplas enzimas que atuam ao mesmo tempo.

Os métodos da invenção podem ser usados para fabricar umacomposição de monatina que contém uma porcentagem desejada de mona-tina R,R, ou uma porcentagem mínima desejada de monatina R,R. Além dasetapas de reação descritas acima, uma etapa de reação específica pode sercatalisada por mais de uma enzima, por exemplo, uma mistura de enzimas,de modo que a composição ou preparação resultante contenha uma porcen-tagem desejada de monatina R,R, inclusive, por exemplo, uma porcentagemmínima desejada de monatina R,R, ou uma porcentagem máxima desejadade monatina R,R. Alternativamente, a monatina feita através de duas viasengenheiradas separadas de acordo com os métodos da invenção pode sercombinada para produzir uma composição ou preparação que contém talporcentagem desejada de monatina R,R.

Quando uma enzima de uma classe designada de enzimas forutilizada como um exemplo, espera-se que uma enzima com pelo menoscerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%, 85%, 87%, 90%,91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% de homologia tambémpossa ser utilizada naquela reação. Por exemplo, uma R-aldolase específicacom pelo menos cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 82%,85%, 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% dehomologia à aldolase de SEQ ID NO:22 poderia ser utilizada em qualqueruma das vias descritas acima para produzir monatina R,R.

Adicionalmente, quando uma enzima de uma classe designadade enzimas for utilizada como um exemplo, espera-se que um fragmentodaquela enzima que possui a mesma atividade também possa ser utilizadonaquela reação. Por exemplo, um fragmento da aldolase de SEQ ID NO:22que também funcionada como uma aldolase poderia ser utilizada em qual-quer uma das vias descritas acima para produzir monatina R,R.

A monatina que é produzida utilizando um ou mais polipeptídeosou vias biossinteticas descritos aqui, consiste geralmente em pelo menoscerca de 0,5 a 30% de monatina R,R, por peso da monatina total produzida.Em outras modalidades, a monatina produzida utilizando um ou mais poli-peptídeos ou vias biossinteticas descritos aqui, é maior do que 30% de mo-natina R,R; por peso da monatina total produzida; por exemplo, a monatinaR,R é 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% damonatina total produzida. Alternativamente, diversas quantidades de duas oumais preparações de monatina podem ser combinadas para resultar em umapreparação que é uma porcentagem desejada de monatina R,R. Por exem-plo, uma preparação de monatina que é 30% de monatina R,R pode sercombinada com uma preparação de monatina que é 90% de monatina R,R;se quantidades iguais de 30% e 90% de preparações de monatina R,R sãocombinadas, a preparação de monatina resultante poderia ser 60% de mo-natina R,R.

A monatina, ou um intermediário (inclusive precursor de monati-na), produzida utilizando um ou mais polipeptídeos ou vias biossintéticasdescritas aqui, podem ser purificados a partir dos compostos da reação. Emuma modalidade, a monatina ou intermediário, tal como precursor de mona-tina, pode ser purificada simplesmente ao remover a substância que serápurificada a partir da preparação de enzima onde esta foi sintetizada.

Em outras modalidades, o intermediário, precursor de monatinaou monatina é purificado a partir de uma preparação onde este foi sintetiza-do de modo que a composição ou preparação "purificada" resultante consis-ta em pelo menos cerca de 5 a 60% de monatina por peso de compostosorgânicos totais. Em outra modalidade, a monatina ou intermediário, tal co-mo, um precursor de monatina, pode ser purificado a um grau de pureza depelo menos cerca de 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% por peso de compostosorgânicos totais.

A monatina ou o intermediário (inclusive precursor de monatina),produzida utilizando um ou mais polipeptídeos ou vias biossintéticas descri-tas aqui, pode ser purificada a partir dos componentes da reação através dequalquer método conhecido por um versado na técnica. Em uma modalida-de, a monatina ou intermediário pode ser purificada como descrito no Exem-plo 13. Otimamente, a monatina ou intermediário purificado pode ser repeti-damente recristalizada até o grau desejado de pureza ser atingido.

Exemplos

Exemplo 1

Detecção de Monatina. Triptofano. Alanina e Glutamato

Este exemplo descreve métodos usados para detectar a presen-ça de monatina, triptofano e glutamato. Este também descreve um métodopara a separação e detecção dos quatro estereoisômeros de monatina.

Análise de Monitoramento de reação múltipla ("MRM") LC/MS/MS de Mona-tina e Triptofano

As análises de misturas de monatina e triptofano derivadas dereações bioquímicas in vitro ou in vivo foram realizadas utilizando um ins-trumento para cromatografia líquida associada a espectrometria de massaem tandem (LC/MS/MS) Waters/Micromass que inclui uma cromatografialíquida Waters 2795 com um monitor de absorvência de Arranjo de Fotodio-do (PDA) Waters 996 instalado em série entre o cromatógrafo e um espec-trômetro de massa triplo Micromass Quattro Ultima. As separações LC foramfeitas utilizando uma coluna de cromatografia de fase reversa Xterra MS C8,2,1 mm x 250 mm a 40 °C. A fase móvel LC consiste em A) água que con-tém 0,05% (v/v) de ácido trifluoroacético e B) metanol que contém 0,05%(v/v) de ácido trifluoroacético.

A eluição com gradiente era linear a partir de 5% B a 35% B, 0 a4 min, linear a partir de 35% B a 60% B, 4 a 6,5 min, linear a partir de 60% Ba 90% B, 6,5 a 7 min, isocrática a 90% B 7 a 11 min, linear a partir de 90% Ba 95% B, 11 a 12 min, linear a partir de 95% B a 5% B, 12 a 13 min, com umperíodo de reequilíbrio de 2 min entre as séries. A taxa de fluxo era 0,25mUmin, e a absorvência de PDA foi monitorada a partir de 200 nm a 400nm. Todos os parâmetros de ESI-MS foram otimizados e selecionados ba-seados na geração de íons moleculares protonados ([M + H]+) dos analisa-dos de interesse, e produção de íons fragmentos característicos. Os seguin-tes parâmetros instrumentais foram usados para análise de Monitoramentode Reação Múltipla LC/MS/MS (MRM) de monatina e triptofano: Capilar: 3,5kV; Cone: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de fon-te: 100 °C; Temperatura de Dessolvatação: 350 °C; Gás de Dessolvatação:500 L/h; Gás do cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 12,0; Altaresolução de massa (Q1): 12,0; Energia de íon: 0,2; Entrada: -5 V; Energiade colisão: 8; Saída: 1V; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resoluçãode massa (Q2): 15; Energia de íon (Q2): 3,5; Multiplicador: 650. Cinco tran-sições MRM específicas de monatina de pai para filha são usadas para de-tectar especificamente monatina em reações in vitro e in vivo. As transiçõesmonitoradas são 293,1 para 158,3, 293,1 para 168,2, 293,1 para 211,2,293,1 para 230,2, e 293,1 para 257,2. O triptofano é monitorado com a tran-sição MRM de 204,7 para 146,4. Para quantificação padrão interna de mo-natina e triptofano, quatro padrões de calibração que contêm quatro propor-ções diferentes de cada analisado de d5-triptofano e d5-monatina, são anali-sados. Estes dados são submetidos a uma análise de mínimos quadradoslineares para formar uma curva de calibração para monatina e triptofano. Acada amostra adiciona-se uma quantidade fixa de d5-triptofano e d5-monatina (d5-monatina foi sintetizada a partir de d5-triptofano de acordo comos métodos de WO03/091396 A2), e as proporções de resposta (monati-na/d5-monatina; triptofano/d5-triptofano) usadas em conjunto com as curvasde calibração descritas acima para calcular a quantidade de cada analisadonas misturas.

Medida de Massa Precisa de Monatina.

A análise de MS de alta resolução foi realizada utilizando umespectrômetro de massa quadrupolo híbrido/por tempo de vôo de AppliedBiosystems-Perkin Elmer Q-Star. A massa medida de monatina protonadautilizou triptofano como um padrão de calibração de massa interna. A massacalculada de monatina protonada, baseada na composição elementarCi4H17N205 é 293,1137. A monatina produzida que utiliza o processo bioca-talítico descrito nos Exemplos 2 e 3 mostrou uma massa medida de293,1144. Isto se trata de um erro de medida de massa menor que 2 partespor milhão (ppm"), que proporciona prova conclusiva da composição ele-mentar de mènatina produzida de forma enzimática.

Medida Quiral LC/MS/MS ("MRM") de Monatina

A determinação da distribuição de estereoisômero de monatinaem reações in vitro e in vivo foi realizada por derivatização com 1 -fluoro-2-4-dinitrofenil-5-L-alanina amida ("FDAA"), seguida por medida MRM LC/MS/MSde fase reversa.

Derivatização de Monatina com FDAA

A 50 [d. de amostra ou padrão foram adicionados 200 uL de umasolução de 1 % de FDAA em acetona. Quarenta jxL de 1,0 M de bicarbonatode sódio foram adicionados, e a mistura incubada durante 1 h a 40 °C commistura ocasional. A amostra foi removida e resfriada, e neutralizada com 20jiL de 2,0 M de HCI (mais HCI pode ser requerido para efetuar a neutraliza-ção de uma mistura biológica tamponada). Após desgaseificação ser conclu-ida, as amostras estavam prontas análise por LC/MS/MS.Monitoramento de Reação Múltipla LC/MS/MS para a Determinação da Dis-tribuição de Estereoisômero de Monatina em Reações in vitro e in vivo.

As análises foram realizadas utilizando a instrumentação LC/MS/MSdescrita acima. As separações de LC capazes de separar todos os quatro este-reoisômeros de monatina (especificamente monatina-FDAA) foram realiza-das sobre uma coluna de cromatografia de fase reversa Phenomenex Luna2,0 x 250 mm (3 um) C18 a 40 °C. A fase móvel de LC consiste em A) águaque contém 0,05% (massa/volume) de acetato de amônio e B) acetonitrila. Aeluição era isocrática em 13% B, 0 a 2 min, linear a partir de 13% B em 30%B, 2 a 15 min, linear a partir de 30% B a 80% B, 15 a 16 min, isocrática em80% B 16 a 21 min, e linear a partir de 80% B a 13% B, 21 a 22 min, com umperíodo de reequilíbrio de 8 min entre as séries. A taxa de fluxo era 0,23mL/min, e a absorvência de PDA foi monitorada a partir de 200 nm a 400nm. Todos os parâmetros de ESI-MS foram otimizados e selecionados ba-seados na geração de íons moleculares desprotonados ([M - H]") de monati-na-FDAA, e produção de íons fragmento característicos.

Os seguintes parâmetros instrumentais foram usados para análi-se LC/MS de monatina no modo de íon negativo ESI/MS: Capilar: 2,0 kV;

Cone: 25 V; Hex 1: 10 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de fonte:100°C; Temperatura de Dessolvatação: 350 °C; Gás de Dessolvatação: 500L/h; Gás de cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 12,0; Alta resolu-ção de massa (Q1): 12,0; Energia de íon: 0,2; Entrada: -5V; Energia de Coli-são: 20; Saída: 1V; Baixa resolução de massa (Q2): 12; Alta resolução demassa (Q2): 12; Energia iônica (Q2): 3,0; Multiplicador: 650. Três transiçõesespecíficas de monatina-FDAA de pai para filha são usadas para detectarespecificamente monatina-FDAA em reações in vitro e in vivo. As transiçõessão 543,6 para 268,2, 543,6 para 499,2, e 543,6 para 525,2. A identificaçãode estereoisômeros de monatina-FDAA se baseia no tempo de retençãocromatográfica como comparado com estereoisômeros de monatina sintéti-cos purificados, e dados espectrais de massa.Cromatoarafia Líquida com Detecção de Fluorescência Pós-Coluna de Ami-noácidos que Incluem Glutamato e Alanina

A cromatografia líquida com detecção de fluorescência pós-coluna para a determinação de glutamato em reações in vitro e in vivo foi realizada sobre um sistema LC Waters 2690 ou equivalente combinado com um detector de triagem de fluorescência Waters 474, e um módulo de reação pós-coluna Waters. As separações de LC foram realizadas sobre uma coluna de troca iônica carregada com Interação-Sódio a 60 °C. A fase móvel A era tampão Na 328 Pickering (Pickering Laboratories, Inc.; Mountain View,CA). A fase móvel B era tampão Na 740 Pickering. A eluição com gradiente era a partir de 0% B a 100% B, 0 a 20 min, isocrática em 100% B, 20 a 36 min, e linear a partir de 100% B a 0% B, 36 a 37 min, com pelo menos um período de reequilíbrio de 8 min entre as séries, dependendo da matriz de amostra. A taxa de fluxo da fase móvel era 0,5 mL/min. A taxa de fluxo dasolução de derivatização pós-coluna OPA era 0,5 mL/min. Os ajustes de detector de fluorescência eram EX 338 nm e Em 425 nm. A norleucina foi empregada como um padrão interno para a análise. A identificação de aminoá-cidos se baseou nos dados de tempo de retenção cromatográfica para padrões purificados.

Detecção de Le D-Aminoácidos por LC/MS/MS

As amostras que contêm uma mistura de L e D-aminoácidos, tais como triptofano, glutamato e aspartato de experimentos de reação bioquímica primeiramente foram tratadas com ácido fórmico para desnaturar a proteína. A amostra foi então centrifugada e filtrada através de um filtro de seringa de náilon de 0,45 um antes da análise por LC/MS/MS. A identificação de L e D-aminoácidos se baseou no tempo de retenção e detecção seletiva de massa. A separação de LC foi realizada utilizando o sistema de cromatografia líquida Waters 2690 e uma coluna de cromatografia ASTEC 2,1 mm x 250 mm Chirobiotic TAG com temperatura de coluna ajustada a 45° C.

A fase móvel de LC A e B consistiam em 0,25% de ácido acético e 0,25% de ácido acético em metanol respectivamente. A eluição isocrática de 60% de fase móvel A e 40% de B com taxa de fluxo de 0,25 ml/min foi ajustada paraglutamato; enquanto 30% de fase móvel A e 70% de B com taxa de fluxo de 0,3 ml/min foi ajustada para aspartato e triptofano.

O sistema de detecção para análise de L e D-aminoácidos incluía um detector de Arranjo de Fotodiodo (PDA) Waters 996 e um espectrôme-tro de massa triplo quadrupolo Micromass Quattro Ultima. O PDA, que varre de 195 a 350 nm, foi colocado em série entre o sistema de cromatografia e o espectrômetro de massa. Os parâmetros para espectrômetro de massa triplo quadrupolo Micromass Quattro Ultima que opera em modo de ionização por electrospray positivo (+ESI) foram ajustados da seguinte forma: Capilar: 3,0kV; Cone: 20 V; Hex 1: 15 V; Abertura: 1 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de fonte: 100°C; Temperatura de Dessolvatação: 350 °C; Gás de dessolvatação: 530 L/h; Gás de Cone: 30 L/h; Baixa resolução de massa Q1: 12,5; Alta resolução de massa Q1: 12,5; Energia de íon 1: 0,2; Entrada: -5; Colisão: 8; Saída 1: 10; Baixa resolução de massa Q2: 12,5; Alta resolução de massaQ2: 12,5; Energia de íon 2: 0,5; Multiplicador: 650 V. Os experimentos MS/MS com modo de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM) foram ajustados para monitorar seletivamente as transições de reação de 204,70 para 146,50, 147,8 para 84,2, 147,8 para 102,1, 134,00 para 74,30 e 134,00 para 88,2. A quantificação de ácidos triptofano, glutamato e aspartato se baseianas respostas de sinal de m/z= 146,5, m/z= 102,1, e m/z= 88,2 respectivamente.

Produção de Monatina e Precursor de Monatina ("MP") para Padrões e para Análises

Produção de Monatina 25 Uma mistura racêmica de monatina R,R e S,S foi sinteticamenteproduzida como descrito na Patente No. U.S. 5.128.482.

A monatina R,R e S,S foi separada por uma etapa de derivatiza-ção e hidrólise. Brevemente, a mistura racêmica de monatina foi esterificada,o grupo amino livre foi bloqueado com Cbz, uma lactona foi formada, e a lactona S,S foi seletivamente hidrolisada utilizando uma enzima protease imobilizada. A monatina também pode ser separada como descrito em Bas-soli, A. etal., Eur. J. Org. Chem., 8:1652-1658, (2005).Produção de MP

R-MP foi produzido através da transaminação de monatina R,R que utiliza D-aminotransferase de ampla faixa AT-103 (BioCatalytics) em 0,1 M de tampão fosfato de potássio, que utiliza piruvato de sódio como o aceitador de amino. S-MP foi produzido através da transaminação de monatina S,S que utiliza L-aminotransferase AT-102 (BioCatalytics) em 0,1 M de tampão fosfato de potássio, que utiliza piruvato de sódio como o aceitador de amino. Ambas as reações foram realizadas a 30°C e em um pH de aproximadamente 8,0 a 8,3, durante aproximadamente 20 horas. Ambos os compostos foram purificados utilizando escala preparativa de HPLC com uma resina hidrofóbica de Rohm and Haas (Philadelphia, PA) (XAD®1600), eluin-do em água. As amostras que contêm mais de 90% de pureza de precursor de monatina foram coletadas e secas por congelamento.

Exemplo 2

Produção de Monatina a partir de lndol-3-Piruvato

A transaminase AT-103 fazia parte de uma biblioteca adquirida junto a BioCatalytics (Pasadena, CA) e a enzima foi testada para produção de monatina em reações acopladas que utilizam a aldolase ProA de C. tes-tosteroni. A aldolase foi preparada como descrito em WO 03/091396 A2. AT-103 é uma Djrtransaminase de ampla especificidade (EC 2.6.1.21) de uma espécie Bacillus que requer um D-aminoácido (tal como, D-glutamato, D-aspartato ou D-alanina) como o doador de aminoácido. As enzimas e componentes/substratos adicionais foram diretamente adicionados ao tampão de reação proporcionado no kit, este continha 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, 100 mM de doador de amino, e 0,1 mM de piridoxal-5'-fosfato ("PLP"). A um ml_ de tampão de reação foram adicionados: 4 mg de indol-3-piruvato, 20 mg de piruvato, aproximadamente 50 ug de ProA proporcionados em um extrato celular, 1 uL de 2 M de MgCI2, e 2 mg de enzima aminotransferase. As reações foram realizadas em duplicata. As reações foram incubadas durante a noite a 30°C com agitação suave (100 rpm). As amostras foram filtradas e submetidas a análise por LC/MS/MS de fase reversa como descrito no Exemplo 1. Os resultados indicaram que aproxima-damente 370 ug/mL de monatina foram produzidos utilizando a enzima AT-103. Os resultados foram adicionalmente analisados para determinar proporções de S,R/R,S versus monatina R,R/S,S, sobre a base das áreas pico dos dois grupos de estereoisômero que se resolvem durante a separação cromatográfica. Da monatina total produzida por AT-103, 69% era monatina R,R/S,S em comparação com os isômeros misturados. Esta enzima é homóloga à enzima DAT Bacillus subtilis descrita em WO 03/091396 A2, que é conhecida por possuir uma ampla especificidade para D-aminoácidos. A análise quiral foi realizada utilizando a metodologia de FDAA descrita no E-xemplo 1, esta verificou que a D-aminotransferase estava produzindo predominantemente monatina R,R, e alguma montina S,R conforme esperado. Os experimentos de transaminação adicionais com monatina S,S ou monatina R,R e oc-cetoglutarato como substratos verificaram que a enzima BioCa-talytics era altamente seletiva para a configuração-D no carbono 4, conformeesperado. Nestes experimentos, nenhum glutamato foi detectado na reação com monatina S,S e a-cetoglutarato como substratos.

Para reduzir a quantidade de monatina S,S ou monatina R,S produzida como subprodutos em reações acopladas com AT-103 (a D-transa-minase de ampla faixa) e a aldolase ProA, a aldolase foi purificada utilizando cartuchos His-Bind, seguindo os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl). A enzima purificada não deve conter, de preferência, atividades de L-aminotransferase do tipo selvagem que podem estar presentes em extratos celulares (tais como, as atividades de E. coli AspC ou TyrB nativas). O eluente His-Bind foi dessalinizado para remover imidazol utilizando colunas PD-10 (G25 Sephadex, Amersham-Pharmacia) e foi eluído em 50 mM de Tris-CI, pH 7. Os experimentos foram realizados em duplicata em um volume de 1 ml_ e continham 100 mM de tampão Tris-CI, pH 7,8, 50 ug de aldolase ProA, 4 mg de indol-3-piruvato, 1 ou 2 mg de D-aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 2 mM de MgCI2, 3 mM de fosfato de potássio, 0,1 mM de PLP, e 14,7 mg de D-glutamato. Os tubos foram incubados a 309C com agitação suave. Os pontos de tempo de duas horas foram obtidos e imediatamente congelados a -20°C. O pH foi ajustado em duas horas de 5 a entre7 a 8 utilizando NaOH, e as análises foram incubadas durante a noite. As amostras foram filtradas e analisadas para monatina como descrito no E-xemplo 1. As amostras de duas horas não possuíam quantidades detectá-veis de monatina, provavelmente devido ao baixo pH. As amostras durante a noite continham aproximadamente 190 ng/mL de monatina quando 1 mg de D-aminotransferase foi usado, e aproximadamente 84% era monatina R,R e 16% era monatina S,R. Quando 2 mg de D-aminotransferase foram usados, 540 ng/mL de monatina foram produzidas, aproximadamente 71% era monatina R,R.

Experimentos similares foram conduzidos utilizando tampão de Aminotransferase Biocatalytics, que continha 100 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 0,1 mM de PLP, e 100 mM de D-glutamato. O indol-3-piruvato sólido e D-aminotransferase foram adicionados como descrito acima. A aldolase ProA (50 |jg), MgCI2, e 50 mM de piruvato foram adicionados a partir de so-luções estoque. Estas análises foram tratadas como descrito acima, embora nenhum ajuste de pH seja requerido neste caso. Um controle negativo foi feito apenas com a enzima e tampão fornecidos por BioCatalytics, que não contêm monatina. Os resultados experimentais são mostrados na Tabela 1. Tabela 1: Produção de Monatina a partir de lndol-3-Piruvato em TampãoFosfato É

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A produção de monatina em tampão fosfato é claramente maior do que aquela em sistemas tamponados com Tris.

Para comparar as atividades de DAT B. subtilis clonado de WO 03/091396 A2 com a enzima de BioCatalytics (AT-103) análises adicionaisforam feitas. O gene dat B. subtilis também foi subclonado em pET30a para remover His-6 tag. A enzima não marcada e marcada foi produzida em BL21(DE3), como descrito em WO 03/091396 A2. Os extratos celulares foram feitos e as análises totais de proteína foram feitas para estimar a concentração de proteína como anteriormente descrito. As reações de um ml_ em duplicata foram feitas contendo: 500 pg de D-aminotransferase, 50 ug de aldolase ProA, 100 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 3 mM de MgCI2, 4 mg de indol-3-piruvato, 200 mM de piruvato de sódio, 7,35 mg (50 mM) de D-glutamato, e 0,1 mM de PLP. As amostras foram incubadas a 30QC durante 1 hora, 2 horas, e durante a noite, e foram filtradas para análise por LC/MS/MS. As amostras continham apenas os estereoisômeros S,R e R,R de monatina, como determinado pelo protocolo de derivatização FDAA descrito no Exemplo 1. Os resultados estão resumidos na Tabela 2 abaixo. A % de RR foi determinada por áreas pico que foram separadas por cromatografia de fase reversa.

Tabela 2: Comparação de Enzimas D-Aminotransferase

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A remoção de HIS-6 tag aparece para aperfeiçoar a atividade da D-aminotransferase de B. subtilis; entretanto, o homólogo de D-aminotransferase de BioCatalytics possuía claramente a atividade mais alta. Isto tam-bém mostrou maior preferência de substrato para o precursor de monatina R. Os tempos de incubação aumentados surgem para reduzir o excesso e-nantiomérico de monatina R,R que é produzida.

Devido ao fato de as enzimas de D-aminotransferase Bacillus terem uma preferência por piruvato como um aceitador de amino, e D-alani-na como um doador de amino, esperava-se que D-alanina pudesse ser utilizada como o doador de amino para conversão de MP em monatina com resultados similares ou melhores. As reações de um ml_ em duplicata foram feitas contendo: 500 ug de D-aminotransferase, 50 ug de aldolase ProA purificada, 100 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 3 mM de MgCI2, 4 mg de in-dol-3-piruvato, 100 mM de piruvato de sódio, 25 mM de D-glutamato ou D-alanina, e 0,1 mM de PLP. As amostras foram incubadas durante 2 horas, e tratadas como acima antes da análise. Quando D-alanina for usada como o doador de amino, níveis ligeiramente maiores de monatina foram produzidos(23 versus 21 ppm) conforme esperado. Adicionalmente, espera-se que altas concentrações de piruvato possam inibir a etapa de transaminação, dosando, desta maneira, em quantidades menores de piruvato com o tempo podem aperfeiçoar a taxa total de produção de monatina. Alguém pode observar a partir dos dados acima que embora metade do piruvato seja usadaneste caso cqmparado com a tabela acima, significativamente mais monatina foi produzida. Embora aldolases ProA na literatura fossem relatadas para produzir principalmente enatiômeros S de produtos de condensação de al-dol, a aldolase ProA usada neste estudo produz claramente uma alta porcentagem de R-MP e em análises acopladas produz até 92% de monatinaR,R. A alta porcentagem de monatina R,R não se deve à seletividade de D-aminotransferase, como mostrado no Exemplo 19.

Exemplo 3

Produção Monatina R.R a partir de D-Triptofano

Os seguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação: aproximadamente 60 ug de aldolase ProA C. testosteroni (fornecida em extratos celulares, como descrito em WO 03/091396 A2), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano, 0,5 mg de D-aminotransferase de BioCatalytics (AT-103), 100mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5 ou 100 mM de tampão acetato de sódio pH 8, 0,05 mM de PLP, 3 mM de fosfato de potássio (apenas para as reações de acetato), e 10 mM de oc-cetoglu-tarato. Os experimentos foram realizados em duplicata, com controles negativos onde nenhuma aldolase foi adicionada. As amostras foram incubadas durante a noite (20 horas) a 30-C com agitação suave. O pH real das amostras de acetato de sódio era aproximadamente 5, enquanto o pH final das amostras tamponadas de fosfato era aproximadamente 7. Nenhuma das al-dolases pareceu ter atividade significativa em pH 5; a amostra que contém aldolase ProA estava ligeiramente acima do controle negativo, porém provavelmente não acima do erro experimental. Em fosfato de potássio, a aldolase ProA produziu 73,4 ppm de monatina com uma proporção de R,R:S,R d 1,7:1 (-63% de R,R de D-triptofano).

Devido ao fato de as enzimas D-aminotransferase Bacillus terem uma preferência por piruvato como um aceitador de amino, e D-alanina como um doador de amino, esperava-se que a adição de alfa-cetoglutarato fosse desnecessária quando se produz monatina R,R ou S,R a partir de D-triptofano. O experimento acima foi repetido (em 100 mM de tampão fosfato de potássio) utilizando aldolase ProA purificada (50 a 60 ug), e um tempo de incubação de 2,5 horas. Os experimentos em duplicata foram realizados, com e sem alfa-cetoglutarato. Quando 10 mM de alfa-cetoglutarato forem adicionados, 56,1 ppm de monatina foram formados utilizando D-triptofano como o substrato (79,5% de R,R, 20,5% de S,R). Quando alfa-cetoglutarato for omitido, 102,5 ppm de monatina foram formados (79% de R,R, 21% de S,R).

Comparação de produção total de monatina e distribuição isomérica de aldo-lases HMG a partir de Sinorhizobium meliloti, C. testosteroni, e a aldolase de SEQ IP NO:22.

A transaminase AT-103 (uma D-aminotransferase de ampla especificidade) foi adquirida junto a BioCatalytics (Pasadena, CA) e esta enzima ou a enzima recombinante de B. sphaericus produzida no Exemplo 18 foi usada em reações acopladas com aldolases HMG para produzir monatina apartir de D-triptofano e piruvato como descrito no Pedido Publicado U.S. No. 2005282260.

A aldolase HMG de C. testosteroni (ProA) e S. meliloti foi purificada como descrito na Publicação No. U.S. 20040063175 e WO 03091396 A2. Para produzir quantidades de teste da aldolase de SEQ ID NO:22, 50 ml_ de uma cultura foi desenvolvida em meio Luria-Bertani ("LB") que contém ampicilina (100 ug/mL), em um OD60o de aproximadamente 0,5. A cepa que contém a construção SEQ ID NO:21 foi induzida com 200 ug/L de anidrote-traciclina. As células foram desenvolvidas 5 horas pós-indução, e extratoscelulares foram preparados de acordo com os protocolos do fabricante (No-vagen, Bugbuster reagent). Benzonuclease e inibidor de protease também foram adicionados. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separadas sobre uma Estação de Eletroforese Automática Experion BioRad Laboratories e analisadas para expressão de concentração e porcentagem utilizando o software Experion versão 1.1.98.0. A aldolase de SEQ ID NO:22 foi usada como uma enzima bruta (não purificada) para as reações abaixo.

Os seguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação: aproximadamente 50 ug de aldolase, 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano, 0,5 mg de D-aminotransferase purificada B. sphaericus, 200 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, e 0,05 mM de PLP. Os experimentos foram realizados em duplicata, com controles negativos onde nenhuma aldolase foi adicionada. As amostras foram incubadas durante 1 hora e durante a noite (18 horas) a 309C com agitação suave. Pequenas quantidades de monatina (< 0,5 ppm) são produzidas sem aldolase em rea-ções durante a noite, devido a reações não-enzimáticas catalisadas por magnésio e fosfato. Aqueles valores foram subtraídos dos números mostrados abaixo, e os resultados médios são mostrados. Os únicos estereoisôme-ros detectados quando se produz monatina utilizando estes métodos são R,R e S,R. A porcentagem de R,R é listada abaixo, e foi determinada porárea pico de LC de fase reversa.Tabela 3: Monatina Total Produzida a partir de D-Triptofano e % de R,R

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A amostra de 18 horas da aldolase de SEQ ID NO:22 também foi analisada para distribuição estereoisomérica através do método de derivatizaçao de FDAA listado no Exemplo 1, isto produziu um resultado de 94,9% de monatina R,R e 5,1% de monatina S,R. A aldolase de SEQ ID NO:22 possui uma enantioespecificidade maior para a produção de R-MP como comparado com aldolases HMG de C. testosteroni e S. meliloti.

Os mesmos experimentos foram feitos, em conjunto, utilizando L-triptofano como o substrato de partida e acoplando as aldolases com L-aminotransferase HexAspC de ampla especificidade e produzida e purificada como descrito no Pedido Publicado No. U.S. 2005282260. Estas reações deveriam produzir principalmente monatina S,S e monatina R,S. As reações também foram suplementadas com 10 mM de alfa-cetoglutarato como o a-ceitador de amino para transaminação de L-triptofano. Novamente, a média dos resultados em duplicata é calculada abaixo para monatina total (subtraindo níveis antecedentes sem aldolase presente), e a porcentagem de monatina S,S é mostrada baseada na área pico de LC de fase reversa. Em alguns casos, devido ao fato de as aldolases serem totalmente R-específicas e produzirem pouca monatina total, as estimativas de fase reversa de distribuição estereoisomérica são menos precisas devido a alguma redução no pico de triptofano que pode co-eluir com o pico de monatina S,S/R,R. As tendências ainda são informativas em comparação com especificidade-R das aldolases. Os resultados de análises adicionais que utilizam o método de derivatizaçao de FDAA são mostrados entre parênteses para diversas amostras, e são mais precisos. Os números totais de monatina acima deaproximadamente 400 ppm são maiores do que a faixa linear da escale dos padrões usada para quantificar os resultados, então são resultados qualitativos. A aldolase ProA de C. testosteroni produz tipicamente 95 a 100% de monatina S,S, como mostrado no Pedido Publicado No. U.S. 2005282260.

Tabela 4: Monatina Total Produzida a partir de L-Triptofano e % de S,S

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Alguém pode observar que a R-especificidade da aldolase deSEQ ID NO:22 é bastante alta comparada com o desempenho de enzima ProA. Esta R-especificidade é também refletida na baixa % de monatina S,S produzida, apesar do alto grau de especificidade da aminotransferase He-xAspC para S-MP nestas reações. Novamente, a aldolase HMG S. meliloti cai entre a aldolase ProA C. testosteroni e a aldolase de SEQ ID NO:22 em termos de especificidade-R, baseados nos níveis de monatina S,S produzida. Os números totais de monatina, quando se compara produção de monatina S,S com monatina R,R, não sãoindicativos da atividade de aldolase. AD-aminotransferase é menos ativa do que HexAspC para reações de tran-saminação de MP, particularmente nas concentrações de MP que estão presentes nestas reações.

Para comparação adicional da aldolase de SEQ ID NO:22 com a enzima ProA de C. testosteroni, proporções variadas de D-aminotransferasepara aldolase foram utilizadas em reações que começam com D-triptofano (nenhuma amostra em duplicata para estes experimentos). As reações foram realizadas como descrito acima. Para estas reações onde a concentração de aldolase foi mantida constante, aproximadamente 50 ug de aldolase foram usados. Para reações onde a quantidade de D-aminotransferase foimantida constante, 0,5 mg foi usado. Para a concentração de 2 e 10 mg/mLde D-aminotransferase, enzima liofilizada foi usada. Para as duas concentrações mais altas de D-aminotransferase, foram realizadas duplicatas.

Tabela 5. Efeito de Concentração de D-Aminotransferase sobre a Produção de Monatina R,R

<table>table see original document page 51</column></row><table>Tabela 5. -continuação-

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Para níveis de monatina acima de 400 ppm, os resultados nãoestão na faixa linear da curva padrão e se tratam apenas de valores aproximados. A quantidade máxima de monatina R,R produzida, quando apropria-5 damente diluída, era aproximadamente 1100 ppm. A análise estereoisoméri-ca de FDAA foi realizada para a aldolase de SEQ ID NO:22 com 10 mg/mL de amostras de D-aminotransferase. Em duas horas, a amostra continha 98,5% de monatina R,R. Em 17 horas, a amostra continha 95,9% de monatina R,R. A aldolase de SEQ ID NO:22 produziu altas porcentagens de mona-tina R,R, mesmo após longos períodos de incubação e utilizando grandes quantidades de aminotransferase. Se D-aminotransferase adequada for fornecida, a aldolase de SEQ ID NO:22 produz tanta monatina total quanto a aldolase ProA de C. testosteroni, indicando uma atividade específica similar. Tabela 6. Efeito de Concentração de Aldolase sobre a Produção de Monati-na R,R

<table>table see original document page 52</column></row><table>Tabela 6. -continuação-

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Quando a concentração de aldolase variar, não ocorre tanto au-

mento na monatina total. A porcentagem de R,R diminui com o tempo e também com a concentração de aldolase, particularmente quando a D-aminotransferase for limitada.

Para examinar adicionalmente a especificidade-R da aldolases testada, experimentos foram realizados começando com L-triptofano e aminotransferase HexAspC, que foi produzida e purificada como descrito no Pedido Publicado No. U.S. 2005282260. HexAspC mostra uma forte seletividade de transaminação de S-MP versus R-MP, desta maneira, as porcentagens acima de 50% de monatina R,S indicam uma aldolase altamente este-reoespecífica. Dez mM de alfa-cetoglutarato foram fornecidos como um acei-tador de amino; entretanto, em altas concentrações, piruvato também é utilizado pela L-aminotransferase. Nestas reações, tipicamente apenas monatina S,S e R,S monatina são produzidas dentro dos limites de detecção do protocolo de derivatização de FDAA.Tabela 7. Efeito de Concentração de L-Aminotransferase sobre a Produção de Monatina S,S

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 8. Efeito de Concentração de Aldolase sobre a Produção de Monatina S,S

<table>table see original document page 54</column></row><table>Tabela 8. -continuação-

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Para aldolases que são altamente R-específicas, tal como, SEQ

ID NO:22, menos monatina total é produzida e ao aumentar a quantidade de aldolase aumenta-se a monatina total (bem como, % de S,S). Estas aldolases produzem menos substrato S-MP, o substrato preferido para a L-aminotransferase usada. Para enzimas que são menos R-específicas, tal como, ProA, aumentar a aldolase não melhora significativamente a produção de monatina total ou % de monatina S,S. Ao aumentar a quantidade de L-aminotransferase adicionada reduz-se a porcentagem de monatina S,S produzida.

A atividade e especificidade da aldolase de SEQ ID NO:22 foi adicionalmente estudada em dois sistemas de tampão-100 mM de fosfato de potássio, conforme acima, e 100 mM de ácido 3-(N-morfolino) propanossul-fônico ("MOPS") (com 3 mM de fosfato de potássio). As análises foram realizadas como acima, utilizando 1 mg/ml de D-aminotransferase AT-103 e 50 mM de D-triptofano. Os experimentos foram realizados em duplicata durante4,5 horas. A aldolase de SEQ ID NO:22 produziu 116 ppm de monatina e 99,1% de monatina R,R em fosfato de potássio (método de derivatização de FDAA). Em MOPS, a aldolase de SEQ ID NO:22 produziu 75,5 ppm de monatina, e 96,2% era monatina R,R. Os níveis anteriores de monatina produzida em MOPS, sem a aldolase de SEQ ID NO:22, eram significativamente maiores, e a porcentagem de R,R era menor com MOPS, mesmo nos controles. É possível que a seletividade e atividade de D-aminotransferase sejam afetadas pela presença do MOPS.

Subclonaaem de SEQ ID NO:21

O gene da aldolase de SEQ ID NO:21 foi recebido de DiversaCorp. SEQ ID NO:21 era parte de uma biblioteca ambiental que foi rastreada por Diversa Corp. para genes da aldolase. Entretanto, o gene da aldolase de SEQ ID NO:21 pode ser reconstruído através de qualquer método conhecido por um versado na técnica. Por exemplo, o gene da aldolase de SEQ ID NO:21 pode ser reconstruído utilizando métodos de PCR de montagem, como descrito nos Exemplos 10, 18 e 19.

Os seguintes iniciadores foram usados para amplificar por PCR o gene da aldolase (SEQ ID NO:21): 5'-gaggagctcgagtcagacgtatttcagtcctttttc-3' (SEQ ID NO:23) e 5'-agaagacatatgatttatcagccggggac-3' (SEQ ID NO:24).

O produto de; PCR resultante foi digerido com Xho\ e Nde\ para corte nos lados que foram engenheirados nos iniciadores. O fragmento foi purificado com gel (QIAquick Gel extraction Kit (Qiagen, Velencia, CA)) e ligado (utilizando ligase de DNA T4) com pET28b que foi digerido com Xho\ e Nde\ e purificado com gel. A ligação foi transformada em células quimicamentecompetentes TOP10F'. As colônias que se desenvolveram sobre as placas foram separadas em insertos e diversos isolados com insertos foram submetidos à análise de seqüência de DNA (Agencourt, Beverly, MA).

Purificação da Aldolase de SEQ ID NO.22

Os clones da aldolase confirmados foram transformados tantoem BL21 (DE3) como em BL21 (DE3) pLysS. As culturas noturnas desenvolvidas com o antibiótico apropriado foram diluídas em meio fresco (tipicamente 1:100) e desenvolvidas em um OD6oo -0,6 com aeração a 37°C. Asculturas foram então induzidas com 1 mM de tiogalacatosida de isopropril ("IPTG") e deslocadas a 30°C (com aeração) e a incubação continuou durante a noite. As células foram colhidas por centrifugação. O pélete de célula foi tipicamente submetido a uni ciclo de congelamento/descongelamento para auxiliar na lise celular. O pélete de célula foi lisado em BugBuster e Benzoa-se (Novagen, Madison, Wl) (de acordo com o protocolo do fabricante). Os resíduos celulares foram removidos por centrifugação. O extrato de proteína bruta foi aplicado em uma coluna HisBind (Novagen, Madison, Wl) que foi preparada de acordo com o protocolo do fabricante. A coluna foi lavada e a proteína foi eluída de acordo com o protocolo do fabricante. A proteína purificada foi dessalinizada com colunas PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ). O tampão usado para a troca era 50 mM de fosfato de potássio pH 7,5, 100 mM de NaCI, 4 mM de MgCI2. A proteína purificada foi concentrada com concentradores centrífugos Amicon (Millipore, Billerica, MA).

Exemplo 4

(1) Triptofano Racemase

A monatina R,R foi produzida utilizando D-aminotransferase e uma aldolase quando D-triptofano for usado como o material de partida (E-xemplo 3). No entanto, L-triptofano pode ser um material de partida preferido por diversas razões. Por exemplo, L-triptofano pode ser menos dispendioso e mais facilmente disponível do que D-triptofano. Esta descrição revela diversos métodos para obter uma triptofano racemase ativa. Os rendimentos de monatina R,R são aperfeiçoados utilizando uma aldolase R-específica, ou seja, uma aldolase que de forma preferencial ou seletiva produz R-MP. As Figuras 1 e 2 ilustram métodos para produzir monatina R,R estereoisomeri-camente enriquecida a partir de L-triptofano que utiliza uma triptofano racemase, uma D-aminotransferase e uma aldolase R-específica.

Uma seleção de uma triptofano racemase foi criada ao construir uma cepa que requer uma racemase ativa para desenvolvimento. Um auxotrofo triptofano necessita de uma fonte de L-triptofano quando desenvolvido sobre meio mínimo. O fornecimento do meio com D-triptofano é uma maneira de selecionar uma racemase que converte D-triptofano em L-triptofano.Os auxotrofos triptofano foram testados para desenvolvimento sobre meio mínimo fornecido com D-triptofano. As cepas, CAG18455 e CAG18579 de Coli Genetic Stock Center e NRRL12264 (também HpA~,XDE3 lisogenizado, e curado de seu plasmídeo), não se desenvolveram quando fornecidas com D-triptofano, porém se desenvolveram quando fornecidas com L-triptofano. E. coli pode ser usada como um organismo hospedeiro, porém outros organismos hospedeiros também podem ser usados, tais como, levedura, outras bactérias, ou outros organismos eucarióticos. Um auxotrofo triptofano (especificamente NRRL12264 (também HpA~, XDE3 lisogenizado e curado de seu plasmídeo)) irá se desenvolver sobre D-triptofano quando este for transformado por uma D-aminotransferase. Isto confirma a capacidade de E. coli transportar D-triptofano para dentro da célula.

Salcher e Lingens descreveram a presença de uma triptofano racemase em Pseudomonas aurereofaciens (ATCC15926). Salcher, O., and Lingens, F., J. Gen. Microbiol. 727:465-471 (1980). A triptofano racemase também foi descrita em diversas plantas inclusive tabaco, beterrabas, tomate, e trigo e a enzima parece ser induzida por condições de estresse osmóti-co ou secura. A triptofano racemase pode exercer uma função em Sclerochi-ton ilicifolius na via de produção de monatina nativa. Para isolar esta atividade de racemase, uma biblioteca de expressão é construída a partir de ATCC15926 (ou outro organismo com atividade de triptofano racemase) e a biblioteca é transformada no auxotrofo triptofano. Uma cepa que é selecionada irá se desenvolver utilizando D-triptofano como a fonte de triptofano. Um método similar também é usado para separar diversas cepas com race-mases conhecidas para procurar uma racemase com atividade sobre D-triptofano. Exemplos de racemases que podem possuir atividade sobre D-triptofano incluem alanina, serina, e glutamato racemases. Yoshimura T., and Esaki, N., "Amino Acid Racemases: Functions and Mechanisms," Journal of Bioscience and Bioengineering 96, 103-109, (2003).

A alanina racemase é dependente de PLP e foi clonada a partir de Salmonella typhimurium (gene dadB). Outras fontes de alanina racemases são Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibriocholerae, Schizosaccaroyces pombe, e Bacillus cereus. Um cogumelo basi-diomiceto, Lentinus edodes, também contém uma alanina racemase de ampla atividade.

A serina racemase também é dependente de PLP e é encontrada em Eucariotos (por exemplo, bicho-da-seda, cDNA de cérebro de rato, cérebro de camundongo), bem como em bactérias (Enterococcus gallinarum).

A glutamato racemase é independente de PLP e foi clonada a partir de Pediococcus pentosaceus, Bacillus pumilus, Lactobacillus fermenti, Lactobacillus brevis, E. coli, Aquifex pyrophilus, e Bacillus subtilis. Algumasglutamato racemases são muito específicas e, conseqüentemente, mesmo aspartato, asparagina, e glutamina de aminoácidos estruturalmente similares podem não ser substratos para a enzima.

As aspartato racemases também existem e são independentes de PLP. As aspartato racemases são encontradas em cepas Lactobacilli,Streptococcus, e algumas arqueobactérias, tais como, cepas Desulfurococ-cus e Thermococcus. O molusco bivalve Scapharca brouhtonii também contém uma aspartato racemase.

Outras racemases encontradas na literatura incluem aminoácido racemase (EC 5.1.1.10) de Anabaena sp. e Pseudomonas striata, prolinaracemase, e fenilalanina racemase multifuncional. As epimerases ou racemases relacionadas também estão sendo testadas. As racemases potenciais são testadas para garantir que estas não sejam D-triptofano aminotransfera-ses. A triagem de racemases potenciais é feita por análise de seqüência e/ou uma análise de enzima. Este método de triagem para seleção de umatriptofano racemase também é usado em outras bactérias ou arqueobactérias onde a triptofano racemase foi descrita, bem como em bibliotecas de cDNA eucariótico que foram construídas de tal maneira que permita a expressão.

As enzimas que passam no teste como uma triptofano racemase são separadas para atividade sobre monatina como descrito no Exemplo 8. Idealmente, alguém obtém uma enzima que é muito específica para triptofano e possui pouca ou nenhuma atividade de racemase sobre monatina.Uma triptofano racemase também pode ser desenvolvida e/ou aperfeiçoada (através de mutagênese ou engenharia recombinante) a partir de uma racemase, transaminase, ou epimerase existente. Adicionalmente, devido ao fato de as estruturas de cristal para alanina aminotransferases (e outras aminotransferases) serem conhecidas, estas podem ser usadas como uma base para mutagênese baseada em estrutura racional. O processo descrito acima é usado como uma seleção inicial para atividade de triptofano racemase e como uma triagem para atividade aperfeiçoada.

(2)Bibliotecas de Triptofano Racemase

Construção de Bibliotecas:

Burkholderia pyrrocina (ATCC15958) e Pseudomonas chlorora-phis (ATCC15926) foram obtidas a partir de American Type Culture Collecti-on. Estas se desenvolveram como recomendado por ATCC e o DNA genô-mico foi preparado de acordo com o método descrito em Mekalanos, J.J., "Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae", Cell 35:253-263, (1983). O DNA genômico foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3AI. Fragmentos de 1 a 3 Kbp foram purificados com gel utilizando um Kit de Extração por Gel Qiagen QIAquick (Valencia, CA). O DNA purificado foi ligado em pTrc99a (Amersham, Piscataway, NJ) que foi digerido com Barrúf e purificado como acima. A ligação foi feita em temperatura ambiente com incubação durante a noite utilizando uma proporção molar 3:1 de inserto para vetor. A biblioteca ligada foi transformada em células quimi-camente competentes TOP10F' (Invitrogen, Carlsbad, CA) e semeadas sobre meio LB com 100ug/ml de ampicilina. Após a incubação durante a noite das placas de transformação, as colônias foram raspadas nas placas, lavadas com meio LB líquido e um pélete de célula de tamanho apropriado foi minipreparado utilizando um kit de minipreparação Qiagen QIAquick (Valencia, CA). Aproximadamente 30.000 colônias foram agrupadas e mini-preparadas.

O plasmídeo agrupado foi transformado em CAG18455 (trpC83:: Tn70, /p/7-7) ou CAG18579 (trpC::Jn10kan, rph-1). Ambas as cepas são au-xotrofos triptofano, então estas não irão se desenvolver sobre meio mínimoM9 (Difco) a menos que o meio seja fornecido com triptofano. Os transfor-mantes foram semeados sobre meio mínimo M9 fornecido com D-triptofano. Isto seleciona uma cepa que pode converter D-triptofano em L-triptofano.

Antes da transformação da biblioteca, as cepas foram testadas para desenvolvimento sobre meio mínimo com L ou D-triptofano. As cepas foram testadas para desenvolvimento sobre meio mínimo fornecido com D-triptofano e nenhum desenvolvimento foi observado. Ambas as cepas se desenvolveram sobre meio idêntico fornecido com L-triptofano em vez de D-triptofano. Adicionalmente, um derivado de curada do plasmídeo operon triptofano, lisogenizado com XDE3, e deletado de //p/A, além das outras mutações cromossomicamente codificadas {serB, AtrpED, tnaA2, aroP)) foi transformado por uma D- aminotransferase específica de Bacillus subtilis (WO 03/091396). A cepa NRRL12264 não poderia se desenvolver sobre meio mínimo fornecido com D-triptofano, porém se desenvolveram sobre meio idêntico fornecido com L-triptofano em vez de D-triptofano. A expressão da D-aminotransferase foi conduzida pelo promotor T7. A cepa transformada foi capaz de se desenvolver sobre meio mínimo M9 fornecido com D-triptofano.

As colônias que se desenvolveram sobre meio de D-triptofanosão separadas. O plasmídeo é isolado e re-transformado na cepa de origem (CAG18455 ou CAG18579) para confirmar que o desenvolvimento sobre meio de D-triptofano é dependente do plasmídeo e não sobre uma mutação de hospedeiro. A seqüência de nucleotídeo dos plasmídeos que complementam a auxotrofia de triptofano foi analisada. Os clones que são determinadospara conter um gene de triptofano racemase são adicionalmente analisados.

A triptofano racemase de outras fontes de tecido fica isolada de maneira similar. Há informações na literatura de atividade de triptofano racemase tanto nas células de cultura de tecido de tabaco (Nicotiana tabacum L. var. Wisconsin 38) (Miura, G.A., and Mills, S.E., "The conversion of D-triptofano to L-triptofano in cell cultures of tobacco", Plant Physiol. 47:483-487, (1974)) como em extratos de proteína bruta de trigo (Triticum aestivum) (Rekoslavskaya, N.I., et ai., "Synthesis and physiological function of D-triptofano during wheat germination", Russian J. Plant Physiol. 44:196-203, (1997)). Uma biblioteca de expressão de cDNA é realizada a partir de tecido, como descrito na literatura, e a biblioteca de expressão é usada para transformar um auxotrofo triptofano como descrito acima.

Poderia ser esperado que, se as mesmas cepas forem usadas e as mesmas condições de crescimento forem reproduzidas como descrito na literatura, a enzima com atividade de triptofano racemase poderia ser isolada ou o mRNA poderia ser isolado e uma biblioteca de expressão de cDNA que poderia ser preparada pode conter uma seqüência de codificação para uma enzima com atividade de triptofano racemase. Por exemplo, certas etapas de crescimento ou certos componentes intermediários podem ser requeridos para induzir a produção celular de uma enzima com atividade de triptofano racemase.

(3 Análise de Triptofano Racemase

Os clones que são identificados como possuindo potencialmente uma triptofano racemase são transformados em uma cepa de of E. coli co-mumente usada para expressão de proteínas recombinantes, tal como, BL21. As células são desenvolvidas em caldo LB em uma densidade óptica em 600 nm de 0,4 a 0,6. A expressão de direção de promotor da racemase é induzida comJPTG (0,1 mM de concentração final). Após a indução, as células são capacitadas para expressar a proteína durante 1 a 3 horas a 37°C (com aeração). As células são colhidas e lisadas por prensa francesa, soni-cação, ou por meio químico (tal como, BugBuster (Novagen)). As células lisadas são centrifugadas para remover os resíduos celulares. O extrato clarificado é diretamente usado em análises.

Quantidades variadas de extrato são adicionadas a uma solução de modo que a concentração final seja 50 mM de fosfato de potássio (pH 7,0) e 2 mM de L-triptofano. Piridoxal-5'-fosfato é adicionado a uma concentração final de 10 u,M. As amostras são incubadas e então analisadas por LC/MS. A presença de um pico de D-triptofano, quando apenas L-triptofano for usado como um substrato, indica um resultado positivo. A concentração de D-triptofano deveria aumentar com o aumento de tempo até o equilíbrioser atingido, e a taxa também deveria aumentar com a concentração de proteína até a concentração de enzima ser alta o suficiente, ou seja, não é mais saturada com substrato. D-triptofano também pode ser convertido em L-triptofano, como acima.

Um gene complementar pode codificar uma D-aminotransferase.

Esta reação de transaminação requer um alfa-cetoácido, tal como, a-cetoglutarato, oxaloacetato, ou piruvato como um aceitador de amino. Estes compostos provavelmente estarão presentes em um extrato celular, geralmente em pequenas quantidades. Estes compostos podem ser removidos utilizando uma coluna de dessalinização PD-e a análise ainda pode ser realizada em um extrato bruto. Também, um gene complementar também pode codificar uma D-aminoácido oxidase ou D-aminoácido desidrogenase. Estas enzimas também requerem cofatores e co-substratos que podem ser removidos por uma coluna de dessalinização PD-10. A atividade de triptofano ra-cemase é purificada utilizando cromatografia em coluna convencional. Por fim, o quadro aberto de leitura identificado como uma triptofano racemase potencial é clonado em um vetor de expressão com um marcador de afinidade. A triptofano racemase potencial é então purificada por cromatografia de afinidade. Em cada caso a proteína purificada é usada em análises de enzima essencialmente como descrito acima.

(4) Engenharia Genética Reversa de Triptofano Racemase

A triptofano racemase pode ser purificada tanto a partir de fontes microbianas como de plantas por meio de técnicas de purificação de proteína convencionais, inclusive fracionamento com sulfato de amônio e cromatografia em coluna convencional. Uma vez que a proteína foi purificada de modo que uma mancha possa ser isolada sobre um gel 2-D, técnicas de mi-croseqüenciamento de peptídeo ou seqüênciamento de aminoácido tipo Edman convencional são utilizadas (na internet, veja "gol-gi.harvard.edu/microchem7 para descrições dos protocolos e equipamento tipicamente usado para este tipo de trabalho). Em alguns casos, entretanto, a seqüência de genoma do organismo não pode ser usada como uma fonte da proteína para a purificação de proteína, pois ao fato de tal seqüência ain-da não ter sido determinada. Nesta situação, o primeiro conjunto de iniciado-res degenerados pode ser designado baseado na seqüência disponível dorelativo mais próximo conhecido da fonte de proteína. A degeneração dePCR e "genome walking" pode ser então realizada de acordo com os proto-colos estabelecidos para isolar a seqüência de codificação de triptofano ra-cemase.

(5) Clonagem de Alanina Racemase a partir de Geobacillus stearothermo-phillus

A alanina racemase (SEQ ID NO:41) de Geobacillus stearothermo-phillus foi clonada. O DNA genômico de G. stearothermophilus (ATCC12980D)foi adquirido a partir de ATCC (Manassas, VA). Os seguintes iniciadores foramusados para amplificar o gene de alanina racemase de G. stearothermo-philus: 5'-atggacgagtttcaccgcga-3' (SEQ ID NO:25) e 5'-ttatgcatcgcttcatccgc-3' (SEQ ID NO:26). O produto de PCR foi ligado a pCR-Blunt-TOPO utili-zando o kit de clonagem por PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen, Carlsbad,CA). Os clones corretos foram confirmados por seqüenciamento (Agencourt,Beverly, MA). Um clone correto foi usado como modelo em uma reação PCRsubseqüente.

Os seguintes iniciadores foram usados para amplificar a alaninaracemase: 5^-ataataggatcctcatccgcggccaacggcg-3' (SEQ ID NO:27) e5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3' (SEQ ID NO:28). Oproduto de PCR foi digerido com as enzimas de restrição Kpn\ e BamH\. Es-tas enzimas são cortadas em locais que foram engenheirados nos iniciado-res. O produto de PCR digerido foi purificado com gel e ligado a pTrc99a quefoi digerido com Kpn\ e BamH\ e, subseqüentemente, purificado com gel. Aligação foi transformada em células quimicamente competentes TOP10F' esemeadas sobre LB semeado fornecido com 50 fig/ml de canamicina. Osisolados foram separados em insertos e diversos isolados com um insertoforam confirmados possuindo a seqüência correta (SEQ ID NO:40) por aná-lise de seqüência (Agencourt, Beverly, MA).

A construção de pTrc99a/alanina racemase foi submetida à Mu-tagênese Sítio-Dirigida ("SDM") que utiliza o kit de Mutagênese Sítio-DirigidaQuick-Change Multi Stratagene (La Jolla, CA). Os iniciadores mutagênicoseram os seguintes:

5'-gccggacgacacgcacattnnkgcggtcgtgaaggcgaacgcc-3' (SEQ ID NO:29),

5'-gtgaaggcgaacgcctatggannkggggatgtgcaggtggcaagg-3' (SEQ ID NO:30),

5'-cctcccgcctggcggttgccnnkttggatgaggcgctcgctttaa-3' (SEQ ID NO:31),

5'-caaccaggcgaaaaggtgagcnnkggtgcgacgtacactgcgcag-3' (SEQ ID NO:32),

5'-gatcgggacgattccgatcggcnnkgcggacggctggctccgccg-3' (SEQ ID NO:33),

5'-gccatttggaaacgatcaacnnkgaagtgccttgcacgatcag-3' (SEQ ID NO:34)

(n = qualquer nucleotídeo e k = g ou t).

Os resíduos de mutagênese foram selecionados por análise daestrutura de cristal existente de alanina racemase G. stearothermophilus.Grandes resíduos de aminoácido localizados entre 5 e 10 Á do sítio ativoforam selecionados.

Todos os seis iniciadores foram usados na reação SDM comoorientado no protocolo do fabricante. A reação SDM foi transformada em XL-10Gold de acordo com o protocolo do fabricante. A reação de transformação foisemeada sobre meio LB suplementado com 100 jig/ml de ampicilina. O cal-do LB foi adicionado às placas e as colônias foram raspadas nas placas. Ascélulas resuspensas foram capacitadas para se desenvolver a 37°C durantediversas horas e os plasmídeos foram minipreparados utilizando o kit de mi-nipreparação QIAquick. A biblioteca mutagenizada resultante foi então usadapara transformar o auxotrofo triptofano CAG18455. A transformação foi se-meada sobre meio mínimo M9 que foi suplementado com glicose, elemen-tos-traço, vitaminas, 100 |ig/ml de ampicilina, 100 u.M de IPTG, e 3 mM deD-triptofano. Após vários dias de incubação a 37°C, as colônias se desen-volveram. Estas colônias foram inoculadas em LB (100 |ig/ml de ampicilina).Estes plasmídeos foram isolados destes isolados e foram retransformadosem CAG18455. As células retransformadas foram semeadas sobre LB quecontém 100 u.g/ml de ampicilina. Depois de as colônias isoladas serem for-madas, estas foram inoculadas em meio de D-triptofano M9, como descritoacima. Todas as colônias pareceram se desenvolver, indicando que o de-senvolvimento ocorreu devido à versão mutagenizada da racemase. Ne-nhum desenvolvimento das células de controle foi observado.

Diversos isolados foram analisados para atividade in vitro. Ascélulas estavam se desenvolvendo em um OD6oo aproximadamente 0,6 einduzidas com 100 jiM de IPTG. As células foram incubadas a 37°C duranteum adicional de duas horas e foram colhidas por centrifugação. Os péletesde célula foram armazenados a -80°C até o uso no dia seguinte. Os péletesde célula foram descongelados sobre isopor contendo gelo. As células foramdivididas com reagente de lise celular BugBuster (amina primária livre) eBenzoase (Novagen). Os resíduos celulares foram removidos por centrifuga-ção (-10,000 x g durante 30 minutos a 4 °C). O sobrenadante foi preservadocomo o extrato celular bruto.

O tampão de análise continha 50 mM de fosfato de potássio (pH8,0), 10 nM de fosfato piridoxal, 0,01% de B-mercaptoetanol, e 50 mM de Dou L-triptofano. 200 jiL de extrato foram adicionados por ml_ de análise. Asamostras foram congeladas representando um ponto de tempo 0, bem co-mo, pontos de tempo de 30 minutos e durante a noite. As amostras foramdilatadas, filtradas, e transferidas para SRC para análise.

Tabela 9: Resultados de Análise Partindo de L-Triptofano

<table>table see original document page 66</column></row><table>

Tabela 10: Resultados de Análise Partindo de D-Triotofano <table>table see original document page 66</column></row><table>

A seqüência de DNA do gene racemase neste isolado foi deter-minada (SEQ ID NO:42) e foi observado que o isolado apresentou três mu-tações. As mutações no isolado de proteína correspondente são como sesegue: M35C, F66E, e Y354A (SEQ ID NO:43). Uma mutação adicional(P197L) foi encontrada neste mutante. Esta á uma mutação espontânea enão faz parte da mutagênese sítio-dirigida.

A racemase mutagenizada foi clonada em pET30 para expressão epurificação. Os seguintes iniciadores foram usados para amplificar por PCR ogene racemase da construção pTrc99a:

5'-gggaaaggtaccgaggaataataaatggacgagtttcaccgcg-3 (SEQ ID NO:35) e 5'-gcggcgccatggacgagtttcaccgcg-3' (SEQ ID NO:36). O produto de PCR foi di-gerido com Nco\ e BamH\, purificado com gel, e ligado a pET30 que foi dige-rido com Nco\ e BamH\ e, subseqüentemente, purificado com gel. A ligaçãofoi transformada em células quimicamente competentes TOP10 (Invitrogen,Carlsbad, CA). Os isolados da transformação foram separados em insertos.Os plasmídeos com um inserto foram submetidos a seqüenciamento (Agen-court, Beverly, MA). Os isolados com a seqüência correta foram transforma-dos em BL21 ADE3 ou BL21 ADE3 pLysS para expressão e purificação. Anova construção é designada racemase pET30Trp.

(6) Purificação de Triptofano Racemase

Uma cultura noturna com a construção de racemase pET30Trpfoi subcultivada em meio fresco LB com os antibióticos apropriados (50(ig/ml de canamicina e 20 fig/ml de cloranfenicol) e se desenvolveu em umOD6oo ~0,6 (37°C com aeração). A expressão foi induzida com 100 |iM deIPTG e a incubação continuou a 37°C com aeração durante 2 horas. As cé-lulas foram colhidas por centrifugação e armazenadas a -80°C até o uso. Opélete de célula foi descongelado sobre isopor contendo gelo e as célulasforam lisadas utilizando Reagente de Lise Celular de Amina Livre PrimáriaBugBuster e Benzoase Nuclease (Novagen, Madison, Wl). Os resíduos celu-lares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi usado como oextrato de proteína bruto. O extrato de proteína bruto foi filtrado utilizandoum filtro de seringa de 0,45 fim e aplicado a uma coluna HisBind (Novagen,Madison, Wl) que foi pré-equilibrada de acordo com as instruções do fabri-cante. A coluna foi lavada e a proteína foi eluída como orientado no protoco-lo do fabricante. A proteína purificada foi dessalinizada com uma coluna PD-10 (GE Healthcare, Piscataway, NJ) utilizando 50 mM de fosfato de potássiopH 8,0, 10 nM de piridoxal-5'-fosfato ("PLP") como o eluente. A proteínadessalinizada foi concentrada utilizando concentradores centrífugos Amicon(Millipore, Billerica, MA). A alanina racemase tipo selvagem foi purificadacomo descrito acima.

(7) Análise de Triptofano Racemase

A racemase purificada foi testada em diversas análises. Em umaanálise, a produção de peróxido de hidrogênio por uma D-aminoácido oxida-se foi usada como um sistema de detecção. O substrato de D-triptofano paraa oxidase foi produzido a partir de L-triptofano através da enzima racemaseisolada como descrito neste Exemplo. A análise inclui 0, 1, 10, 25, 50, 100,200 ug de enzima por análise, 50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 |j.Mde PLP, 50 mM de L-triptofano. As análises foram incubadas 1 hora a 37°C.Após a incubação, 100 mg/ml de D-aminoácido oxidase (AOD-101 BioCa-talytics, Pasadena, CA) e 0,5 mM de FAD foram adicionados à mistura dereação. A geração de peróxido de hidrogênio foi medida utilizando o kit dereagente Amplex Red (Molecular Probes, Eugene, OR) e um FluorômetroPerkin Elmer HTS 7000 Plus BioAssay Reader (Wellesley, MA). Os dados deanálise estão resumidos nas Tabelas 11 e 12 abaixo:

Tabela 11: Curva Padrão

<table>table see original document page 68</column></row><table>

Tabela 12: Resultados de Análise

<table>table see original document page 68</column></row><table>Tabela 12: -continuação-

Concentração de Proteína (pg/análise) Wild-type Racemase (Leitura de Fluorômetro) Racemase Mutante (leitura de fluorômetro)

10 4149 10543

25 4239 21177

50 3141 30465

100 3160 39068

200 2370 35163

Os resultados da análise indicam que a racemase mutante é re-querida para a produção de peróxido de hidrogênio. A quantidade de peróxi-do de hidrogênio produzido aumentou quando a quantidade da racemasemutante adicionada foi aumentada.

A atividade da racemase (tipo selvagem e mutante) sobre alani-na foi analisada. O tampão de reação continha: 100 mM de fosfato de potás-sio pH 8,0, 10 (iM de PLP, 50 mM de L-alanina, 12 |ig/mL de racemase tiposelvagem ou 94 |ig/ml de racemase mutante. As reações foram interrompi-das com 1 volume de 0,5 M de ácido fórmico e analisadas por LC/MS/MSutilizando uma coluna Quirobiótica como descrito no Exemplo 1.

Os dados de análise estão resumidos na Tabela 13 abaixo.

Tabela 13

<table>table see original document page 69</column></row><table>

A racemase modificada surge para manter a atividade sobre osubstrato original, alanina.

A atividade da racemase modificada foi testada utilizando umentre L-triptofano, D-triptofano, L-alanina, e D-alanina como o substrato. Otampão de reação continha: 100 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 uJvlde PLP, 50 mM de substrato, 94 u.g/ml de racemase mutante. As reaçõesforam interrompidas com 1 volume de 0,5 M de ácido fórmico e analisadascomo descrito no Exemplo 1. As análises com alanina como o substrato fo-ram incubadas em temperatura ambiente (~22°C) e as análise com triptofa-no como o substrato foram incubada a 37°C. Os resultados estão resumidosna Tabela 14 abaixo.

Tabela 14

<table>table see original document page 70</column></row><table>

A enzima racemase trabalha em ambas as direções e mantém aatividade tipo selvagem.

A racemase mutante foi testada sobre diversos substratos. Aenzima usada na análise foi purificada como anteriormente discutido. Ascondições de análise são as seguintes:

50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 uJvl de PLP, 25 mM desubstrato, 40 |ig/ml de racemase mutante. As reações foram interrompidascom 1 volume de 2 M de ácido fórmico e analisadas como descrito no E-xemplo 1. As análises foram incubadas a 37°C. Os resultados (em ppm deD-isômero produzido a partir do L-isômero) estão resumidos na Tabela 15abaixo (nd = nenhum detectado).Tabela 15

<table>table see original document page 71</column></row><table>

É provável que esta racemase irá racemizar outros aminoácidosalém daqueles testados aqui.

Embora a racemase modificada pareça possuir atividade sobreuma grande variedade de aminoácidos, não parece que esta seja qualqueratividade de racemase sobre monatina. A enzima usada na análise foi purifi-cada como anteriormente discutido. As condições de análise são as seguin-tes: 100 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10 |xM de PLP, 50 mM de mona-tina, 1 mg/ml de racemase mutante. As análises foram incubada a 37°C. Asanálises foram analisadas por derivatização de FDAA como descrito no E-xemplo 1. Os resultados da análise são mostrados na Tabela 16 abaixo.

Tabela 16 :

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Mesmo após 18 horas não houve conversão aparente de mona-tina S,S em monatina S,R ou de monatina R,R em monatina R,S utilizando aracemase mutante.A enzima ideal possui atividade sobre triptofano, porém poucaou nenhuma atividade sobre outros aminoácidos ou compostos tipo aminoá-cido, particularmente monatina. Se a enzima possuir atividade significativasobre monatina, a enzima pode ser mutagenizada para reduzir a atividadesobre monatina e/ou glutamato, enquanto mantém a atividade de triptofanoinalterada ou em um nível alto o suficiente para que a enzima seja útil emprodução de monatina. As técnicas que podem ser usadas para mutagêneseincluem, porém sem caráter limitativo, PCR passível de erro, mutagênesesítio-dirigida, modelagem para identificar marcações de mutagênese sítio-dirigida (sítios que podem estar envolvidos em ligação de substrato), passa-gem através de cepas mutagênicas, e embaralhamento de DNA.

(8) Produção de Monatina Triptofano Racemase

Os seguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação:aproximadamente 50 ug de aldolase de SEQ ID NO:22, 16 mg/mL de tripto-fano racemase purificada, 4 mM de MgCI2, 50 mM de L-triptofano, 0,5 mg deD-aminotransferase (purificada a partir de Bacillus sphaericus como descritono Exemplo 14), 100 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfatode potássio pH 7,5, e 0,05 mM de PLP. Devido ao fato de o piruvato ser umde amino aceitável para a D-aminotransferase de ampla especificidade, oc-cetoglutarato não foi usado. Um controle foi incluído onde D-triptofano era osubstrato de partida e nenhuma racemase estava incluída. As amostras foramincubadas 2 horas ou durante a noite (20 horas) a 30QC com agitação suave.As amostras foram analisadas como descrito no Exemplo 1. Os resultados daanálise são mostrados abaixo na Tabela 17 (nd = nenhum detectado).

Tabela 17

<table>table see original document page 72</column></row><table>

A Tabela 17 mostra a produção de monatina R,R que utiliza umatriptofano racemase para converter o substrato de L-triptofano em D-triptofano. A produção de monatina R,R a partir de D-triptofano, sem utilizara triptofano racemase, foi utilizada como um controle. A porcentagem demonatina R,R produzida é quase a mesma tanto com L como D-triptofanocomo o material de partida. Este resultado indica que a racemase não possuiatividade detectável para catalisar a racemização de monatina R,R.

(9) Isolamento das Alterações Chave de Aminoacido

Diversos revertantes da alanina racemase mutagenizada foramcriados. Os revertantes foram feitos por mutagênese sítio-dirigida utilizandoo Kit de Mutagênese Dirigida por Mútiplos Sítios QuikChange (Stratagene, LaJolla, CA) como anteriormente descrito utilizando os seguintes iniciadores:5'-gccatttggaaacgatcaactatgaagtgccttgcacgatcag-3' (SEQ ID NO:37)5'-ctcccgcctggcggttgccttcttggatgaggcgctcgctttaag-3' (SEQ ID NO:38)5'gccggacgacacgcacattatggcggtcgtgaaggcgaacgcc-3' (SEQ ID NO:39)

Os iniciadores foram usados individualmente, e em combinação,em uma tentativa de realizar seis possíveis combinações das três mutaçõesem posições 35, 66, e 354 (a numeração está baseada em ATCC 12980 de-rivado de seqüência de aminoacido). Diversas combinações das mutaçõesforam criadas e testadas para atividade de triptofano racemase. As condi-ções de análise eram as seguintes: 50 mM de fosfato de potássio pH 8,0, 10u,M de PLP, 30 mM de L-Triptofano, 100 \ig/m\ de enzima. As análises foramincubadas a 37°C durante o período de tempo especificado. As amostrasforam analisadas como descrito no Exemplo 1.

Os resultados das análises estão resumidos na Tabela 18 abaixo (nd = não detectado).

Tabela 18

<table>table see original document page 73</column></row><table>Tabela 18 -continuação-

<table>table see original document page 74</column></row><table>

Lista de Mutação:

MF1: N41S (mutação espontânea), P197L, Y354AMF2: F66E, P197L, Y354AMY1: M35C, F66E, P197LRacemase mutagenizada: M35C, F66E, P197L, Y354A

Os resultados indicam que a mutação Y354A é requerida paraatividade sobre triptofano. Quando esta mutação estava ausente não houveatividade detectável sobre triptofano.

Uma alanina racemase pode ser adicionalmente convertida emuma racemase de ampla especificidade por métodos aleatórios, tais como,PCR mutagênica, passagem através de cepas mutagênicas, ou outros mé-todos conhecidos pelo versado na técnica. Uma evolução mais concentradada alanina racemase pode ser focalizada sobre resíduos de sítio ativo, inclu-sive Lys129, Met134, e os resíduos inclusive e entre Gly283 e Trp288 (nu-meração a partir de Geobacillus stearothermophilus).

Exemplo 5

Método de Seleção para Triagem de Piruvato Aldolases em E. coli Recombi-nante

Muitos dos processos descritos nos Exemplos 4(5), 9 e 10(3,), emostrados nas Figuras 1 a 9, irão trabalhar de forma ótima com uma aldola-se que produz de forma preferencial R-MP a partir de indol-3-piruvato e piru-vato. Portanto, os métodos são descritos para isolar e testar clones que con-têm ácido nucléico que codifica uma aldolase que produz de forma preferen-ciai R-MP. As cepas de Escherichia coli que requerem suplementação depiruvato quando desenvolvidas sobre meio mínimo M9 com ribose como afonte de carbono foram anteriormente descritas. Ponce, E., et ai, "Cloning ofthe two piruvate kinase isoenzymes structural genes from Escherichia coli:The relative roles of these enzymes in piruvate biosynthesis", J. Bacteriol.777:5719-5722, (1995). O genótipo relativo da cepa é: LpykA àpykF. O no-caute duplo foi gerado pelo método de Datsenko e Wanner, Proceed. A/aí/.Acad. Sei. USA 97:6640-6645, (2000). Estas cepas podem formar uma basepara uma separação de aldolase de geração de piruvato e para separar screenaldolases que são mais ativas sobre um estereoisômero específico de mona-tina, um estereoisômero particular de precursor de monatina, ou um análogo demonatina ou precursor de monatina. Um análogo de precursor de monatinainclui compostos que foram identificados como substratos de aldolases ProAou aldolases KHG, tais como, 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato, 4-carbóxi-4-hidróxi-2-oxoadipato 4-hidróxi-4-metil-2-oxoadipato, ou outros compostosricos em carboxila que são convertidos em piruvato em uma reação de aldol.Um exemplo de um análogo de monatina que pode ser usado é ácido glutâ-mico 4-hidróxi-4-metil, que pode ser facilmente transaminado a 4-hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato (um substrato de ProA) por aminotransferases nativasem uma célula de teste.

Clonagem

Os seguintes iniciadores foram usados para gerar o nocaute pykA:

5'-ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACAAAAATCGTTACCACGTTAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO:3) e

5'-CTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAGTAGAACCCACGGTACCATA TGA-ATATCCTCCTTAG-3' (SEQ ID NO:4).

Os seguintes iniciadores foram usados para gerar o nocaute pykF.

5'-AGGACGTGAACAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCGCTCGGTACCAGCATATGAATATCCTCCTTAG-3' (SEQ ID NO:5) e

5'-ATGAAAAAGACCAAAATTGTTTGCACCATCGGACCGAAAACCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO:6).

Uma reação de PCR foi realizada tanto com pKD3 quanto compKD4 como modelo utilizando protocolos padrão. O produto de PCR foi ele-troporado em uma cepa de E. coli que expressa o sistema de recombinaçãohomóloga lambda red. O produto de PCR possuía homologia a pykA ou pykFefoi recombinado no cromossomo naqueles sítios. Quando o cruzamento du-pio ocorreu, a progênie resultante transportava um gene deletado pykA oupykFe um marcador de resistência a antibiótico. Os genes deletados com osmarcadores de resistência a antibiótico foram transduzidos em uma cepa E.coli (MG 1655) utilizando técnicas de transdução padrão P1.

Análises de Cepa

O duplo nocaute foi testado para desenvolvimento sobre meiomínimo (sais M9) (Difco) suplementado com solução vitamínica de Balch,solução de elemento-traço de Balch modificada (Balch, W.E., era/., "Metha-nogens: reevaluation of a unique biological group", Microbiol. Rev. 43:260-296, (1979)), e 0,4% de D-ribose. Nenhum crescimento foi observado nomutante duplo a menos que 5 mM de piruvato também sejam incluídos nomeio. MG 1655 tipo selvagem se desenvolveu sobre o meio acima tanto napresença como ausência de piruvato. O nocaute duplo foi testado para de-senvolvimento sobre o meio mínimo descrito acima suplementado com 0,4%de glicose em vez de ribose. O desenvolvimento sobre este meio foi similaràquele observado com a cepa tipo selvagem. Com este meio, piruvato podeser gerado a partir de glicose através do produto de gene ptsl (a enzima dosistema de fosfotransferase que fabrica piruvato a partir de fosfoenolpiruvatoe transfere o fosfato para glicose). A cepa de nocaute duplo também foi tes-tada para desenvolvimento utilizando o meio como descrito acima suplemen-tado com 0,4% de L-arabinose ou 0,4% de D-xilose em vez de ribose. Piru-vato não é gerado do desenvolvimento sobre estes substratos que contêm 5carbonos (não-PTS). O nocaute duplo não se desenvolveu sob estas condi-ções a menos que seja suplementado com 5 mM de piruvato, enquanto acepa tipo selvagem se desenvolveu normalmente tanto na presença comoausência de piruvato.

O gene de aldolase proA de Comamonas testosteroni descritono Exemplo 2 de WO 03/091396 A2 (clonado em pET30 Xa/LIC) e o operongene aspC/proA descrito no Exemplo 3 de WO 03/091396 A2 (clonado empET30 Xa/LIC e pET32) foram sub-clonados em pBAD-TOPO utilizando o kitde expressão pBAD TOPO TA (Invitrogen).

A expressão do(s) gene(s), nestas construções, é regulada pelopromotor araBAD induzível. Na presença de arabinose (por exemplo, 0,4%)e IPTG, o(s) gene(s) é/são expresso(s). A menos que suplementado compiruvato ou uma fonte de piruvato, a cepa não irá se desenvolver sobre meiomínimo. O meio pode ser suplementado com monatina, precursor de mona-tina, ou um análogo de monatina ou precursor de monatina. As faixas típicasde substrato usadas na literatura são 0,5 a 5 mM. A aldolase ProA pode, porexemplo, converter o precursor de monatina em piruvato e indol-3-piruvatoque proporciona à cepa uma fonte de piruvato e permite o desenvolvimentosobre meio mínimo com 0,4% de arabinose. A construção que expressa tan-to genes proA como aspC pode converter monatina no precursor de monati-na e o precursor de monatina em piruvato e indol-3-piruvato. Adicionalmente,a aminotransferase pode converter indol-3-piruvato em L-triptofano e com-plementar um auxotrofo triptofano. Este sistema é usado para examinar al-dolases e para examinar aldolases que são mais ativas sobre um estereoi-sômero específico de monatina, um estereoisômero específico de precursorde monatina, ou um análogo de monatina ou precursor de monatina. Porexemplo, se a evolução direta for realizada sobre qualquer uma das aldola-ses descritas no Exemplo 2 de WO 03/091396 A2, uma análise de placa queutiliza meio que contém tanto precursor de monatina R como S é usada paracomparar a enantioespecificidade da enzima mutante resultante. Se o de-senvolvimento ocorrer sobre as placas que contêm precursor de monatina Re pouco ou nenhum desenvolvimento ocorrer sobre a placa que contém pre-cursor de monatina S, a aldolase possui uma especificidade de substratosque contêm a quiralidade-R no sítio de reação.

As placas de meio mínimo M9 foram feitas contendo 1x de solu-ção vitamínica de Balch e solução de elemento-traço modificada de Balch.Balch, W.E., et ai, "Methanogens: reevaluation of a unique biological group".Microbiol. Rev. 43:260-296, (1979). Glicose ou arabinose foi incluída como afonte de carbono (0,4% p/v) e as placas foram suplementadas tanto com 5mM de monatina (mistura racêmica R,R; S,S) que foi dissolvida em 20 mMde tampão fosfato de potássio (pH 8,0) como com um volume igual de tam-pão fosfato de potássio sem monatina. O desenvolvimento está resumido naTabela 20 abaixo.

TABELA 20

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Espera-se que a triagem possa ser otimizada ao controlar osníveis de ProA e AspC, aumentar a absorção de monatina, utilizar precursorde monatina no lugar de monatina (neste caso, a aminotransferase não pre-cisaria estar presente), ou utilizar um análogo menos hidrofóbico de monati-na, tal como aquele descrito acima. Os métodos para aumentar a absorçãode monatina incluem adição de misturas de aminoácido, adição de aminoá-cidos específicos, e o uso de detergentes, antibióticos, análogos de antibióti-co, ou enzimas que ajudam a permeabilizar a parede celular, e adição deuma pequena quantidade de piruvato para permitir o desenvolvimento nocaso de a aldolase não poder proporcionar piruvato o suficiente para supor-tar o desenvolvimento. Nonapeptídeo de polimixina B (Dixon and Chopra,Antimicrobial àAgents and Chemotherapy 29:781-788 (1986)) e microcistinaRR (Dixon, et ai, FEMS Microbiology Letters 230:167-170 (2004)) foramdescritos como agentes que permeabilizam a membrana externa de E. coli.

Espera-se que outros sistemas/plasmídeos de promotor possamser usados neste sistema de triagem com resultados equivalentes. Exemplosincluem sistemas de promotor T7, e promotores induzíveis IPTG, tais como,tac e lac.

Os genes aspC e proA foram clonados no vetor de expressãopTrc99a (Amersham, Piscataway, NJ). O vetor resultante foi transformadonos auxotrofos triptofano CAG18455 ou CAG18579 (veja, Exemplo 4 paradescrições das cepas). Os transformantes foram semeados sobre meio mí-nimo M9 com 0,1 mM de IPTG e 5 mM de monatina. Após 3 dias a 37°C, ascepas com os plasmídeos operon formaram colônias, enquanto as cepas deorigem não pareceram se desenvolver. Adicionalmente, o desenvolvimentofoi dependente da presença de IPTG que indica que a expressão do operonfoi requerida para desenvolvimento. Neste estudo de complementação, ooperon aspC/proA formou MP a partir de monatina e indol-3-piruvato a partirde MP. O indol-3-piruvato poderia ser então convertido em L-triptofano per-mitindo que auxotrofos triptofano se desenvolvam sobre meio mínimo M9.

Diversos organismos potenciais podem possuir a R-aldolase es-pecífica e podem ser testados como descrito acima. A presença de monatinaR,R foi detectada em sobrenadantes de cultura de Corynebacterium glutami-cum. Isto sugere a presença de uma enzima que é capaz de fabricar precur-sor de monatina R. Adicionalmente, a presença de múltiplos isômeros demonatina foi detectada em extratos livres de célula de Sinorhizobium melotiutilizando cromatografia de fase reversa, novamente indicando a possívelpresença de uma aldolase ou aminotransferase capaz de fabricar um este-reoisômero R de precursor de monatina.

Pseudomonas straminea (Pseudomonas ochraceae NGJI), Sino-rhizobium meliloti, Sphingomonas sp. LB126, Arthrobacter keyseri12B, cepaC092 Yersinia pestis, Bradyrhizobium japonicum str. USDA 110, Sphingo-monas (Pseudomonas) paucimobilis, Yersinia pestis KIM, Ralstonia metalli-durans CH34, Yersinia pseudotuberculosis IP 32953, Rhizobium leguminosa-rum biovar viciae rhiz23g02-p1 k_1009_341 (Sanger Institute), Novosphingo-bium aromaticivorans DSM 12444, Pseudomonas putida KT2440, Magne-tospirillum magnetotacticum MS-1, Rhodopseudomonas palustris CGA009,Xanthomonas campestris ATCC-33913, Xanthomonas axonopodis citri 306,e Streptomyces avermitilis MA-4680 possuem homólogos que foram desco-bertos por análise BLAST utilizando proA (Comamonas testosteroni) como omodelo. Veja, Pedido No. U.S. 20050282260. Estes organismos pode serusados como uma fonte de DNA e testados na triagem mencionada acima.

Os organismos capazes de se desenvolver sobre ácido gálico,ácido siríngico, protocatecuato, ftalato, paraidroxibenzoato, e fluoreno podempossuir uma aldolase que pode fabricar monatina e possuir potencial para oexame mencionado acima. Os seguintes organismos metabolizam protoca-tecuato através da via 4,5-dioxigenase e podem possuir uma aldolase quepode ser de utilidade: Bordetella bronchiseptica RB50, Bordetella paraper-tussis 12822, Klebsiella pneumoniae MGH78578, Magnetospirillum magneto-tacticum MS-1, Rhodopseudomonas palustris CGA009, Sphingomonas aro-maticivorans F199, Xanthomonas axonopodis citri 306, Xanthomonas cam-pestris ATCC 33913.

E os seguintes organismos degradam protocatecuato através davia 3,4 dioxigenase e possuem uma aldolase que pode ser de utilidade: es-pécies Acinetobacter calcoaceticus ADP1, Acinetobacter ATCC 33305,ADP1, Agrobacterium tumefaciens C58, Azotobacter vinelandii AvOP, Brady-rhizobium japonicum str. USDA 110, Bradyrhizobium japonicum tr. USDA438, Brucella abortus, Brucella melitensis 16M, Brucella melitensis suis1330, Burkholderia cepacia J2315, Burkholderia fungorum LB400, Burkhol-deria pseudomallei K96243, Corynebacterium efficiens YS-314, Corynebac-terium glutamicum ATCC-13032, Mesorhizobium loti MAFF303099, Myco-bacterium avium subsp. paratuberculosis str. k10, Pseudomonas aeruginosaPAOI, Pseudomonas fluorescens Pf0-1, Pseudomonas fluorescens SBW25,Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas syringae pv. tomato str.DC3000, Ralstonia solanacearum, cepa I24 Rhodococcus sp. (IG-15), Sino-rhizobium mejiloti 1021, Streptomyces avermitilis MA-4680, Streptomycescoelicolor A3 (2), Xanthomonas axonopodis citri 306, Xanthomonas campes-/nsATCC-33913.

Exemplo 6

Mutagênese Sítio-Diriqida de HEXAspC

Síntese Experimental

Um hexamutante de E. coli AspC (HEXaspC) foi considerado porpossuir melhor atividade como comparado com AspC para a produção demonatina S,S, como descrito no Exemplo 6 de WO 03/091396 A2. HEX (nú-mero de acesso:/AHFA gi:127190) contém as seguintes mutações de AspC(numeração E. coli): V35L, K37Y, T43I, N64L, T104S, e N285S. Baseado naanálise estrutural e relatórios de literatura (Rothman, S., and Kirsch, J., J.Mol. Biol. 327:593-608, (2003); Rothman, S., et ai, Protein Science 73:763-772, (2004)), mais 5 mutantes foram criados com o objetivo de aumentar aatividade cinética com relação aos substratos utilizados na via de produçãode monatina: L-triptofano, S-MP, ou ambos. Dois dos mutantes aumentaramas taxas de transaminação tanto de triptofano como monatina S,S. Dois dosmutantes mostraram uma estereoseletividade aumentada para a formaçãode monatina S,S embora um fosse menos estereosseletivo. Baseado nisto,espera-se que uma D-aminotransferase de ampla especificidade de Bacillussp. com mutações similares possa ser útil como a D-aminotransferase nasvias de monatina R,R mostradas na Figura 3, e descritas no Exemplo 4(4).

Um dos mutantes (HEXaspCP9T/R122G) aumentou a atividade de transa-minação de L-triptofano, porém a atividade na produção de monatina S,S outransaminação de monatina S,S reduziu significativamente. Desta maneira,espera-se que esta enzima seja útil na primeira etapa das vias de produçãode monatina R,R mostradas nas Figuras 1, 2, 4, 5, 6, 7, e 8 e descritas nos

Exemplos 9 e "[0(3). Em geral, uma aminotransferase que possui atividadesimilar àquela de AspC sobre L-triptofano, e atividade limitada sobre R-MP eS-MP, poderia ser útil para o processo mostrado nas Figuras 1, 2, 4, 5, 6, 7 e8.

Métodos e Materiais

O gene HEX clonado em pUC19 foi proporcionado pelo Profes-sor J. F. Kirsch (Department of Molecular and Cell Biology, University of Cali-fórnia, Berkeley, Berkeley, CA 94720-3206) e usado como o modelo para aclonagem do gene em pET23a. Veja, Onuffer, J.J., and Kirsch, J.F., "Rede-sign of the: substrate specificity of Escherichia coli aspartate aminotransfera-se to that of Escherichia coli tyrosine aminotransferase by homology mode-ling and site-directed mutagenesis", Protein Science 4:1750-1757 (1995).Veja também, NCBI úmero de acesso 1 AHF_A Gl:1127190 (seqüência deaminoácido HEX). Os seguintes iniciadores foram designados para clonar ogene HEX no vetor pET23a (Novagen, Madison, Wl):

Iniciadores HEXaspC:

N term: 5'-GCGGAACATATGTTTGAGAACATTACCGCC-3'(SEQ ID NO:7);C term: 5'-ATAACCGGATCCTTACAGCACTGCCACAATCG-3' (SEQ IDN0:8).

O seguinte protocolo de PCR foi usado para amplificação de ge-ne: Em 100 mL de reação, 50 ng de modelo de DNA, 1,0 uM de cada inicia-dor, 0,2 mM de cada dNTP, 1 U Pfu Turbo Polymerase (Stratagene; LaJolla,CA), e 1X de tampão Pfu clonado foram adicionados. O programa de ther-mocycler utilizou uma partida a quente de 94°C durante 5 minutos; seguidopor 25 ciclos de uma etapa de desnaturação a 94 °C (30 seg), uma etapa deanelamento a 55°C (1 min), uma etapa de extensão a 72°C (2 min), e porfim, uma etapa de acabamento a 72°C (7 min). O produto de PCR purificadofoi digerido com enzimas de restrição BamH\ e A/cfel (New England Biolabs).

O produto de PCR foi ligado a pET23a que também foi digerido com A/cfel efíamHI, utilizando o kit de ligação rápida de DNA Roche. As ligações dessa-linizadas foram eletroporadas em células DH10B E. coli utilizando um siste-ma Bio-Rad Gene Pulser II, de acordo com os protocolos do fabricante. AMinipreparação de DNA foi preparada utilizando um kit Qiagen Spin Miniprepe foi usada como um modelo para reações de mutagênese. O plasmídeo foitransformado em células Bl_21 E coli (DE3) de acordo com os protocolos dofabricante (Novagen).

O resíduo de triptofano na posição 130 foi considerado importan-te para interações de empilhamento com o anel piridoxila, porém tambémparece ser uma fonte de congestionamento estérico com o substrato de pre-cursor de monatina S ("S-MP"), baseado nas observações de modelagem deproteína. Portanto, um aminoácido com uma cadeia lateral hidrofobica menor(fenilalanina) foi usado para substituir o triptofano. O restante das mutaçõesse baseou nos dados cinéticos na literatura, embora novas combinações demutações desejadas sejam criadas. Todas as mutações em HEXaspC, coma exceção de W130F, foram feitas utilizando o kit Multi-Change de Quik-Change seguindo as instruções do fabricante. A mutação W130F foi feitautilizando o kit QuikChange de Stratagene de acordo com as instruções dofabricante com a única exceção da temperatura de extensão para reação dePCR que foi reduzida para 66eC. Os iniciadores do kit multi-change foramdesignados utilizando a ferramenta de desenho de iniciador multi-kit Quik-Change em <www.stratagene.com>, exceto para os iniciadores de única mu-tação W130F.

As seqüências de iniciador são listadas na Tabela 21 abaixo:

Tabela 21

Iniciador_Seqüência (5' to 3')_

aspCWI 30F_backward CGCTCTTATGGTTCGGTTTGCTTGGGTTGCTCACCC(SEQ ID N0:9)

aspCWI 30FJorward GGGTGAGCAACCCAAGCTTTCCGAACCATAAGAGCG(SEQIDNO.10)

R122G-13 CAAAAAATACCAGCGTTAAGGGAGTGTGGGTGAG-CAACC

(SEQ ID NO:11)

P9T_4a CATTACCGCCGCTACTGCCGACCCGATTC(SEQIDN0:12)

I68V-1a CACCAAAAATTACCTCGGCGTAGACGGCATCCCTGA-ATT

(SEQIDN0:13)

T156Aa TGATGCGGAAAATCACGCTCTTGACTTCGATGCAC

(SEQ ID N0:14)

a Indica um iniciador que foi modificado por 5' fosforilaçãoExpressão de Genes Mutantes HEXaspC e Análise de Atividade EnzimáticaAs culturas líquidas (5 ml_) de Sistema 2 de Auto-indução Nova-gen Durante a noite Express® (Catálogo # 71366-3; soluções 1-6) foram ino-culadas a partir de placas frescas ou estoques de glicerol congelados dasseguintes cepas:

E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCpET23a

E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCW130FpET23a

E. coli BL21 (DE3)::H EXaspCT 156ApET23a

E. coli BL21 (DE3):: HEXaspCP9T/T156ApET23a

E. coli BL21 (DE3)::HEXaspCP9T/R122GpET23a

E. coli BL21 (DE3):: H EXaspCR122GÍT156ApET23a

As culturas foram incubadas a 379C em 230 rpm durante 6 a 8 h.OD6oo de cada cultura foi determinado e o volume de cultura necessário paraobter um OD6oo de 0,03 a 0,05 em 25 ml_ foi calculado. Os volumes calcula-dos de cada cultura líquida foram transferidos para frascos que contêm 25ml_ do mesmo meio. O Sistema de Auto-indução 2 Durante a noite Express®é um meio completo, quimicamente definido para expressão de alto nívelcom sistemas de expressão induzíveis por IPTG que utiliza lactose como oagente de indução e não requer monitoramento de desenvolvimento celular.

As culturas Durante a noite Express foram incubadas a 309C com agitaçãoem 230 rpm durante 18 h. As células foram colhidas por centrifugação e la-vadas uma vez com 50 mM de MOPS frio, pH 7,0. As células foram entãolisadas utilizando Reagente de Extração Bugbuster™ (amina livre primária)(Novagen Catalog #70923-3) que contém 1 uL/mL de benzonase nuclease(Novagen Catalog #70746-3), 5 uL/mL de Conjunto para Coquetel Inibidor deProtease II (Novagen Catalog #539132) e 0,33 u/10 mL de r-Lisozima (No-vagen Catalog #71110-3) seguindo o protocolo recomendado de Novagen.

Após incubação a 25°C durante 15 min com agitação suave, os resíduoscelulares de cada suspensão foram peletados por centrifugação em 21.000gdurante 15 min a 4 °C. O sobrenadante foi cuidadosamente decantado e a-nalisado como o extrato livre de células. As frações de corpo de inclusãoforam isoladas ao suspender as frações de resíduo celular em 30% de Rea-gente de Extração Bugbuster™ (amina livre primária), centrifugar em 21.000x g durante 10 min; suspender os péletes centrifugados em 10% de Reagen-te de Extração Bugbuster™ (amina livre primária), centrifugar novamentepara isolar os péletes lavados.

Os extratos livres de células e frações de corpo de inclusão fo-ram analisados para expressão protéica por SDS-PAGE em 4 a 15% de géisde gradiente (Bio-Rad # 161-1104). Para as amostras de extrato celular, vin-te microgramas de proteína adequada foram carregados em cada pista degel (pré-misturados com 1X de tampão de carregamento de proteína e a-quecidos a 95-C durante 5 min). As frações de corpo de inclusão foram dis-solvidas em 1X de tampão de carregamento de proteína (0,2 mL), aquecidasdurante 10 min a 959C e 5 uL de cada solução foram carregados por pista degel. A quantidade de cada mutante HEX em comparação com a proteínatotal solúvel carregada dentro de cada pista foi calculada por análise de in-tensidade de faixa utilizando a ferramenta 1D-gel Labworks Biolmaging(UVP, Inc. Upland, CA), e está relatada na Tabela 22 abaixo:

Tabela 22

<table>table see original document page 85</column></row><table>

A análise dos géis mostrou que o mutante HEXaspCR122A/T156Afoi a única proteína encontrada em quantidades substanciais como corpos deinclusão. A proteína HEXaspCP9T/T156A forneceu o nível mais alto de ex-pressão, aproximadamente 90% melhor que a proteína HEXaspC. Em con-trapartida, as proteínas W130F, T156A e P9T/R122G foram expressas emconcentrações menores do que HEXaspC.

A atividade das proteínas mutantes HEXaspC para a produçãode monatina S,S foi medida utilizando as seguintes condições de reação:Cada 1 ml_ de reação continha 50 mM de TAPS, pH 8,2, 4 mM de MgCI2, 3mM de fosfato de sódio, pH 8,0, 200 mM de piruvato de sódio (pH ajustadopara 8), 5 mM de a-cetoglutarato (pH ajustado para 8), 50 mM de triptofano,0,05 mM de piridoxal 3-fosfato, 50 ug/mL de aldolase ProA (adicionados co-mo um extrato celular) e concentrações variadas (aproximadamente 50 e500 ug/mL) de aminotransferase (adicionadas como um extrato livre de célu-Ias). Água desaerada foi usada para preparar as soluções de estoque e paraajustar o volume das misturas de reação para 1,0 ml_. O fosfato piridoxal foiadicionado antes da adição das enzimas. Os tubos de reação foram incuba-dos a 309C com agitação suave durante 4 h. As amostras (0,01 ml_) foramremovidas em 1, 2, e 4 h após a adição das enzimas, filtradas, e analisadaspor LC/MS/MS, como descrito no Exemplo 1. A produção de monatina foinormalizada baseada na quantidade de aminotransferase presente nas reações.

Sob as condições destas análises, HEXaspC e HEXaspCT156Aproduziram o máximo de monatina total por mg de aminotransferase enquanto aproteína P9T/R122G produziu o mínimo, seguida por HEXaspCW130F. As en-zimas HEXaspCW130F e P9T/R122G mostraram a maior estereosseletivi-dade para S-MP (mais que 98% de monatina S,S), mesmo quando altasconcentrações de enzima forem usadas (mais que 300 ug/mL). A porcenta-gem de produto de monatina of S,S diminuiu para menos que 90% nas rea-ções enzimáticas que contêm a enzima P9T7T156A em alta concentração.Os outros mutantes mostraram uma estereoseletividade de produto muitosimilar àquela do mutante HEXaspC original (aproximadamente 95% de mo-natina S,S). A análise do produto da reação que contém a enzima HEXaspCque utiliza o reagente de derivatização de FDAA descrito no Exemplo 1 mos-trou que o segundo estereoisômero formado é monatina R,S.

Análise de Atividade de Triptofano e Monatina Aminotransferase

Os mutantes foram testados para atividade de transaminaçãoutilizando monatina S,S e L-triptofano como substratos. A atividade de ami-notransferasejfoi medida após a formação do co-produto da reação, gluta-mato, por HPLC com derivatização pós-coluna OPA como descrito no E-xemplo 1. A mistura de reação continha, em 1,0 mL, 100 mM de tampãoHEPPS, pH 8,0, 20 mM de alfa-cetoglutarato, 0,08 mM de fosfato piridoxal,25 mM de triptofano ou monatina S,S, e enzima (fornecida como 2,5 mg deproteína em extratos celulares). Todos os componentes, exceto a enzima,foram misturados ao mesmo tempo. A enzima foi adicionada para iniciar areação e a solução de reação foi incubada a 30°C (agitação suave) durante90 min. As reações foram realizadas em duplicata, com controles negativosonde nenhuma enzima foi adicionada. A reação foi interrompida pela adiçãode 10% de ácido fórmico (concentração final), a mistura foi centrifugada em21.000 rpm, e o sobrenadante foi cuidadosamente removido e filtrado. Osdados foram corrigidos para níveis anteriores de glutamato e para a diluiçãoda adição de ácido para precipitar as proteínas, então normalizados pelaquantidade de aminotransferase mutante adicionada. Quando triptofano foiutilizado como um substrato, HEXaspC produziu 13,0 mM de glutamato pormg de aminotransferase por hora. A atividade relativa, expressa como umaporcentagem, dos mutantes é conforme se segue: HEXaspCW130F (156%),HEXaspCT156A (151%), HEXaspCP9T/T156A (63,7%), HEXaspCP9T/R122G(116%), e HEXaspCR122G/T156A (107%). Quando monatina S,S foi utilizadacomo um substrato, HEXaspC produziu 7,43 mM de glutamato por mg deaminotransferase por hora. A atividade relativa, expressa como uma por-centagem, dos mutantes é como se segue: HEXaspCW130F (113%), HEXaspCT156A (87,7%), HEXaspCP9TyT156A (67,3%), HEXaspCP9T/R122G(11,2%), e HEXaspCR122G/T156A (114%).

O mutante HEXaspCP9T/R122G aumentou a atividade paraconversão de triptofano em indol-3-piruvato, porém reduziu a atividade paratransaminação de monatina S,S. A proporção de atividade de triptofano paramonatina era 18,2 em comparação com 1,75 de HEXaspC, tornando esteum candidato desejado para a produção de monatina R,R utilizando vias querequerem uma L-aminotransferase, tal como aquelas descritas nos Exem-plos 9 e 10(2). Como tal, HEXaspCP9T/R122G é um exemplo de uma ami-notransferase com atividade limitada sobre monatina S,S, bem como, MP.

A maior parte das mutações aperfeiçoou a atividade de L-tripto-fano, porém apenas dois mutantes aumentaram a atividade tanto com relação aL-triptofano como monatina S,S (HEXaspCW130F e HEXaspCR122G/T156A).Devido ao fato de 25 mM de substrato serem usados nestas análises, asenzimas foram mais provavelmente saturadas e a atividade é um reflexo dekcat das enzimas. Entretanto, sob as condições em que as análises de produ-ção de monatina S,S foram realizadas, descritas acima, é improvável que aconcentração de S-MP seja suficiente para saturar a enzima, desta maneiranão há aumento total na produção de monatina S,S, pois o aumento em kcaté deslocado por um aumento em Km. Foi relatado, para substratos similares,que algumas das mutações aumentaram kcat, porém também aumentaramKm aparente do substrato de aminoácido. Se concentrações crescentes desubstratos forem usadas, espera-se que estes dois mutantes possam pro-porcionar um benefício nas taxas de produção de monatina S,S em compa-ração com HEXaspC. A mutação HEXaspCT156A parece possuir taxas detransaminação de triptofano aumentadas sem apresentar um efeito significa-tivo sobre a taxa de transaminação de MP sob as condições acima para aprodução de monatina S,S.

Ao comparar as estruturas de HEXaspC e uma das enzimas deD-aminotransferase Bacillus sp. (veja, por exemplo, Sugio, S, et al., Bioche-mistry 34:9661-9669, (1995)), as mutações W130F, R122G, T156A, e HEXde AspC poderiam ser mapeadas em resíduos correspondentes na estruturade D-aminotransferase. Espera-se que mutações similares na D-aminotrans-ferase de ampla especificidade aperfeiçoem a produção total de monatinaR,R, como descrito no Exemplo 3. Por exemplo, a funcionalidade proporcio-nada por triptofano 130 em AspC é substituída em D-aminotransferases Ba-cillus por ligação de hidrogênio entre as cadeias laterais de serinas 179 a181 e glutamato 166 (esquema de numeração YM-1). Para diminuir o con-gestionamento esférico, o glutamato poderia ser modificado por um resíduo deaspartato. Algumas D-aminotransferases possuem um resíduo de treonina naposição 179, estas poderiam aumentar o congestionamento estérico e devemser evitadas. A enzima B. sphaericus possui uma alanina em vez de serinana posição 181, que também pode reduzir o congestionamento estérico.

Informações adicionais de estudos de aspartato aminotransfera-se podem ser aplicadas nas D-aminotransferase também. Enquanto a enzi-ma AspC possui uma arginina no sítio ativo que interage com a cadeia late-ral de substratos de dicarboxilato, a D-aminotransferase possui um alça deSer240 a Ser243. As cadeias laterais de Ser240, Thr242, e Ser243 se dire-cionam para a mesma direção e formam uma bolsa (pocket) com o grupohidroxila de Ser180 que proporciona uma superfície para que tanto substra-tos não-polares como polares possam interagir. Ser180 está envolvido naligação de PLP; entretanto, para aperfeiçoar a atividade de uma D-aminotransferase com R-MP, alguém pode modificar os resíduos Ser240,Thr242, ou Ser243 para aceitar substratos maiores ou para favorecer ossubstratos negativamente carregados. Por exemplo, Thr242 pode ser modifi-cada para Ser para reduzir o comprimento de cadeia lateral. Um dos resí-duos pode ser modificado para lisina ou arginina, tal como, Ser243. Os resí-duos (numeração YM-1) Val30-Val36 estão localizados em uma cadeia betaatravés do sítio ativo da D-aminotransferase, e também são importantes pa-ra atividade. Tyr31, Val33, Glu32, e Lys35 são consideradas para direcionar-se para o sítio ativo. Tyr31, Glu32, e Val33 são invariantes em todos os ho-mólogos de Bacillus. Ro, et ai, FEBS Lett 398:141-145, (1996)) Val33 muta-genizada para Ala e obteve uma eficiência catalítica ligeiramente aumentadapara transaminação de alfa-cetoglutarato e uma eficiência catalítica significa-tivamente aperfeiçoada para substratos mais volumosos (menos congestio-namento estérico). Em alguns homólogos, Lys35 é substituída por Arg, po-rém se o congestionamento estérico for uma preocupação, o resíduo Lyspode ser preferido. As valinas 34 e 36 também são preferidas sobre substitu-ições conservativas, tal como, isoleucina, novamente devido ao menor con-gestionamento estérico de moléculas grandes, tal como, MP. Devido ao fatode a nova D-aminotransferase ("4978") descrita nos Exemplos 15 e 16 apre-sentar atividade maior do que a enzima B. sphaericus e DAT híbrido no E-xemplo 19 é a escolha óbvia para reações de metagênese adicionais. Asidéias acima,, baseadas na análise de estrutura de cristal de D-aminotrans-ferase YM-1, podem ser aplicadas na D-aminotransferase de cepa ATCC4978. A numeração acima é um aminoácido menor do que o aminoácidocorrespondente na seqüência de proteína 4978.

Exemplo 7

Uso de Aminotransferases de Cadeia Ramificada ("BCAT") na Produção de Monatina

AT-102 e AT-104 são L-transaminases de cadeia ramificada (EC2.6.1.42) que foram adquiridas junto a BioCatalytics (Pasadena, CA). As en-zimas foram testadas para atividade de transaminação utilizando substratosde monatina S,S e R,R que foram quimicamente produzidos. As reações fo-ram realizadas em um volume total de 0,5 mL, e realizadas em duplicata. Asanálises continham 50 mM de Tris pH 7,8, 0,08 mM de PLP, 10 mM deoc-cetoglutarato ("a-KG"), 5 mM de monatina, e 1 mg/mL de enzima amino-transferase. Os controles negativos não continham enzima aminotransferaseexógena. As amostras foram incubadas durante 2 horas a 30SC em agitaçãoa 100 rpm. As amostras foram filtradas e a análise por LC/MS/MS, comodescrito no Exemplo 1, foi realizada para verificar os níveis de glutamato. Osníveis de glutamato deveriam se correlacionar de forma estequiométrica coma produção de MP. Quando R,R foi usado como o substrato de reação, ní-veis muito baixos de glutamato estavam presentes nos controles negativos.AT-104 produziu um pouco mais de glutamato do que os controles negati-vos, indicando um baixo nível de atividade com o substrato de monatina R,R(um D-aminoácido). Ambas as L-aminotransferases de cadeia ramificadamostraram atividade sobre monatina S,S. AT-102 produziu 102 ug/mL deglutamato e AT-104 produziu 64 ug/mL de glutamato. Para comparação,uma aminotransferase de ampla especificidade (AT-101, também de BioCa-talytics) produziu 75 ug/mL sob estas condições. A alta atividade com umaaminotransferase de cadeia ramificada é, de certa forma, inesperada devidoao fato de a monatina possuir mais similaridades estruturais a aminoácidosdicarboxílicos e aminoácidos aromáticos que normalmente servem comosubstratos de ampla especificidade ou aspartato aminotransferases. Entre-tanto, devido à cadeia principal de ácido glutâmico de monatina, muitas dasaminotransferases que podem utilizar glutamato como um doador de amino,também podem possuir atividade sobre monatina.

Produção de Monatina a partir de lndol-3-Piruvato utilizando BCAT

AT-102 e AT-104 foram testados para a produção de monatinaem reações acopladas utilizando a aldolase ProA de C. testosteroni (produ-zida como descrito em WO 03091396 A2). As enzimas e componen-tes/substratos adicionais foram diretamente adicionados ao tampão de rea-ção proporcionado no kit, este continha 100 mM de tampão fosfato de potás-sio pH 7,5, 100 mM de L-glutamato, e 0,1 mM de PLP. A um mL de tampãode reação foram adicionados: 4 mg de indol-3-piruvato, 20 mg de piruvato,aproximadamente 50 ug de ProA proporcionado em um extrato celular, 1 uL2 M de MgCI2, e 2 mg de enzima aminotransferase que será testada. Todasas reações foram realizadas em duplicata, e uma reação de controle negati-vo foi realizada sem adição de aminotransferase adicional. Um controle posi-tivo (AT-101) foi utilizado para comparação; esta enzima é uma L-aminotransferase de ampla especificidade. A produção anterior de monatinase deve a aminotransferases nativas de E. coli presentes no extrato celularda enzima ProA recombinante. As reações foram incubadas durante a noitea 30eC com agitação suave (100 rpm). As amostras foram filtradas e subme-tidas à análise por LC/MS/MS de fase reversa como descrito no Exemplo 1.Os resultados são apresentados na Tabela 23 abaixo.

Tabela 23

<table>table see original document page 91</column></row><table>

As aminotransferases AT-102 e AT-104 produziram claramentemais monatina do que o controle negativo e eram cerca de 50 a 60% tãoativas quanto o controle positivo.

A enzima aminotransferase de cadeia ramificada de E. colifoiestudada a fundo e as estruturas de cristal foram analisadas em detalhe.Okada, K., et ai, (1997) J. Biochem (Tokyo) 727:637-641, (1997). A enzimapossui uma dobra total e homologia de seqüência significativa similar a en-zimas D-aminotransferase Bacillus, tais como aquelas mencionadas nos E-xemplos 2, 3 e 6. Ademais, as enzimas BCAT e as D-aminotransferases deBacillus são os dois únicos tipos de aminotransferases dependentes de PLPque mostram estereoespecificidade para adição de face re de hidrogênio aPLP. Yoshimura, T., et ai, J. Am. Chem. Soe. 7 75:3897-3900, (1993). BCAT éconsiderada a única enzima onde o substrato de alfa-aminoácido é ligadocom seu grupo carboxila sobre o mesmo lado que o grupo fosfato, permitin-do que enzima possuam uma dobra e mecanismo similar à D-aminotransfe-rases enquanto ainda mantém a especificidade de L-aminoácidos. Peisach,D., et ai, Biochemistry 37:4958-4967, (1998). Considera-se que a L-especi-ficidade de BCAT surge do fato de que as cadeias laterais de aminoácidopolar da D-aminotransferase que posiciona o grupo alfa-carboxila do subs-trato são substituídas por resíduos não-polares em BCAT. Espera-se que setodos, ou alguns, destes resíduos forem modificados pelos aminoácidos cor-respondentes da D-aminotransferase de Bacillus, uma pessoa poderia con-verter a BCAT em uma D-aminotransferase específica. As seguintes muta-ções podem ser feitas na BCAT de E. coli (numeração baseada no númerode acesso gi:14719463): Phe37 para Tyr, VaM 10 para His, Met108 para Arg.

Outras substituições de aminoácido polar poderiam ser feitas nestes sítiostambém, para adaptar o sítio ativo de enzima para aceitar grandes substra-tos de ácido dicarboxílico como descrito no Exemplo 6. Tyr165 pode precisarser convertida em Leu também, para refletir a interação de PLP da D-amino-transferase; Tyr96 (para Phe), Arg41, e Arg98 também podem precisar sermodificadas para impedir a ligação do grupo alfa carboxila na orientação in-correta na enzima BCAT. Trp127 também pode ser modificada para Tyr parareduzir a probabilidade de as cadeias laterais hidrofóbicas se ligarem emuma configuração pro-S; Tyr32 e Tyr130 podem interagir com L-glutamatono sítio ativo de BCAT e podem ser modificadas para aminoácidos negati-vamente carregados para minimizar esta interação. Goto, M., et ai, Bioche-mistry 42:3725-3733, (2003); Okada, K., Biochemistry 40:7453-7463, (2001).

Devido ao fato de tanto as enzimas D-aminotransferase como aaminotransferase de cadeia ramificada possuírem atividade na produção demonatina, espera-se que a BCAT possa ser convertida em uma D-amino-transferase com atividade na produção de monatina R,R, enquanto propor-ciona outra possível enzima D-aminotransferase que será utilizada nos es-quemas de reação descritos em muitos dos Exemplos. Baseado nos resulta-dos acima, é possível que a enzima AT-104 já apresente alguma atividadecom relação a configurações de D-amino de monatina.

Clonagem e Mutapênese de Aminotransferase de Cadeia Ramificada de Ba-cillus

Bacillus licheniformis contém uma aminotransferase de cadeiaramificada putativa que está mais estritamente relacionada com D-amino-transferases do que a aminotransferase de cadeia ramificada de E. coli. Aatividade de D-transaminação foi analisada, e mutagenizada baseada nosresíduos de sítio ativo previsto mencionados acima da BCAT de E. coli.

Cepa

B. licheniformis (número ATCC 14580) se desenvolveu sobreÁgar Nutriente a 30°C durante a noite. Os grupos de colônias foram coloca-dos em 100 uL de água estéril e aquecidos durante 10 minutos a 95°C, paradividir as células. Três uL foram usados em amplificações subseqüentes deReação em Cadeia da Polimerase (PCR).

Protocolo de Reação de Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram designados para o gene B. licheniformis(915 bp) para clonagem em vetores pET 28b e pET 30a (Novagen, Madison,Wl) e pTRC99a (GE Healthcare Life Sciences), utilizando os sítios Ncol eSall. A construção pET30 contém uma marcação His e marcação S de N-terminal, enquanto o constructo pET 28 não está marcado.Iniciadores de bcat B. licheniformis:

N term 5'-GGTTAAGGCCATGGGGGACCAGAAAGACCA-3' (SEQ IDNO:44); e C term: 5'-GGCCTTCCGTCGACTCAGCTGACACTTAAGCT -3'(SEQ ID NO:45)

A região de codificação foi amplificada utilizando o seguinte pro-tocolo de PCR. Em 50 ^iL de uma reação, 3 u.L de modelo, 1 uM de cadainiciador, 0,4 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polimerase de Alta Fidelidade Ex-pand, e 1X tampão Expand® (Roche, Indianapolis, IN) com Mg foram usa-dos. O programa thermocycler usado incluiu uma partida a quente a 96°Cdurante 5 minutos, seguido por 30 repetições das seguintes etapas: 94°Cdurante 30 segundos, 50°C durante 1 minuto e 45 segundos, e 72°C durante2 minutos e 15 segundos. Após 30 ciclos, a amostra foi mantida a 72°C du-rante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Produtos de PCR puros do ta-manho correto foram obtidos (aproximadamente 900 bp).

Clonagem

O produto de PCR foi purificado e digerido com Sall e Ncol emtampão Sall (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores digeridos(pET28, pET30, e pTRC99a) e os insertos foram purificados utilizando o Kitde Extração com Gel Qiagen QIAquick. As ligações foram feitas utilizando oKit de Ligação Rápida de DNA da Roche (Roche) e purificadas. As ligaçõesforam transformadas em DH10B Escherichia coli utilizando uma cubeta de0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser II, como descrito no manual deeletroporação Bio-Rad. As células foram permitidas para se recuperar em900 jxL de meio SOC durante 30 minutos a 37°C a 225 rpm. As células foramsemeadas sobre placas ágar-LB que contêm canamicina (25 ng/ml_). O DNAde plasmídeo foi purificado utilizando o kit spin miniprep Qiagen e separadonos insertos corretos por digestão por restrição com Sall e Ncol. As seqüênciasde plasmídeos que pareceram possuir o inserto correto foram verificadas porseqüenciamento de DNA de terminação de cadeia didesóxi em Agencourt Bi-oScience Corporation (Beverly, MA). O seqüenciamento verificou a seqüên-cia de codificação encontrada em número de acesso NCBI CP000002 Gl56160984 2851268..2850354, que produz uma proteína com seqüência deaminoácido como listado no número de acesso AAU24468G 1:52004526.

Expressão Genética e Análises

O DNA de plasmídeo (vetores pET) foi transformado em hospe-deiro de expressão E. coli expression BL21(DE3) (Novagen, Madison, Wl)para constructos em vetores pET. As culturas se desenvolveram e os plas-mídeos foram isolados utilizando o kit Qiagen miniprep, e analisados por di-gestão por restrição para confirmar identidade. A indução foi tipicamente rea-lizada em meio LB que contêm canamicina (50 |ig/mL). As células se desen-volveram em um OD600 de 0,4 a 0.8 a 379C e induzidas com 0,1 mM deIPTG (isopropila tiogalacatosida) e experimentadas em 3 a 4 horas após aindução. Os extratos celulares foram preparados de acordo com o protocoloque acompanha o reagente Novagen BugBuster® (com benzonase nucleasee coquetel de inibidor de protease completo Roche adicionado). Altos níveisde proteína solúvel foram obtidos no peso molecular previsto, como julgadopor SDS-PAGE. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram separa-das por SDS-PAGE.

Os extratos celulares foram analisados para atividade de D-amino-transferase após a produção de alanina a partir de piruvato (ou glutamato apartir de alfa-cetoglutarato) e D-triptofano utilizando o seguinte protocolo. Asreações de um ml_ em duplicata foram tipicamente realizadas em 100 mM detampão fosfato de potássio (pH 7,5), 50 uM de fosfato piridoxal, 25 mM depiruvato de sódio, e 50 mM de D-triptofano. As reações foram iniciadas pelaadição de extratos livres de células ou enzima purificada e foram incubadas15 minutos durante a noite a 30QC, com leve agitação. Aproximadamente omesmo nível de D-aminotransferase foi adicionado (tipicamente cerca de 0,5mg) em cada análise para propósitos comparativos, e AT-103 (BioCatalytics)foi geralmente usada como uma enzima de comparação. O ácido fórmico foiadicionado a uma concentração final de dois por cento para parar a reação,e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. As reações de controlesem proteína adicionada também foram realizadas. Os pontos de tempo zerotambém foram usados como controles negativos. Alanina e glutamato foramdetectados utilizando derivatização OPA como descrito no Exemplo 1. A a-minotransferase de cadeia ramificada possuía baixos níveis de atividade deD-aminotransferase em comparação com as enzimas AT-103 e B. sphaericus.

A aminotransferase de cadeia ramificada também foi testadapara capacidade de produzir monatina a partir de D-triptofano (como no E-xemplo 3), po/ém não pareceu possuir atividade sob as condições testadas.

O constructo pTRC99a foi transformado em células eletrocompe-tentes CAG18455 de E. coli, que são auxotróficas para produção de triptofa-no. As células se desenvolveram em meio mínimo M9 com vitaminas de Bal-ch com 100 mg/L de L-triptofano, 0,4% de glicose, e cloreto de cálcio. Ascélulas não foram capazes de se desenvolver sem L-triptofano. A indução foitestada em 10,100 e 1000 uM de IPTG, em um OD600 de 0,4 durante 4,5horas. As bandas no MW correto eram visíveis em SDS-PAGE. O plasmídeofoi mutagenizado utilizando o Kit de Mutagênese Dirigida por Múltiplos SítiosQuikChange® (Stratagene). Os iniciadores na Tabela 24 abaixo foram designados como descrito pelo fabricante.Tabela 24

<table>table see original document page 96</column></row><table>Tabela 24 -continuação-

<table>table see original document page 97</column></row><table>As mutações de aminoácido se basearam na estrutura de crystalBCAT de E. coli e a numeração na tabela acima serve para a proteína de E.coli. A numeração das mutações de DNA se baseia no gene bcat de B. li-cheniformis.

Os iniciadores foram diluídos em 0,1 mg/mL e aproximadamente100 ng de cada iniciador de oligonucleotídeo foram tipicamente usados em50 uL de reação de mutagênese, concentrações proporcionalmente maioresforam usadas para iniciadores grandes. Para iniciadores de oligonucleotídeoque estavam competindo essencialmente por anelamento na mesma regiãomodelo, às vezes uma soma de 100 ng foi usada para todo o grupo de inici-adores naquela região. Duzentos nanogramas de modelo (B. lich bcat empTRC99a) foram usados na reação, com 5 uL de 10X tampão QuikChange,2 uL de dNTPs, e 2 uL da mistura de enzima. Os produtos de amplificaçãoforam tratados com endonuclease de restrição Dpn\ (Stratagene) (2 uL) du-rante 2 horas a 37QC, e transferidos para um tubo de parede grossa de 1,5mL para precipitação de etanol. A mistura de reação ressuspensa (concen-trada) foi transformada (2,5 uL) em células XL10-Gold Ultracomp induzidasno kit QuikChange. Diversas colônias foram mini-preparadas e seqüenciadaspara garantir que as mutações fossem aleatórias e para estimar o nível mu-tagênese obtido. As colônias foram ressuspensas a partir da placa e mini-preparações volumosas foram feitas. O DNA de minipreparação foi entãotransformado na cepa de auxotrofo triptofano, e semeado sobre meio míni-mo (com IPTG) descrito acima ou utilizando meio mínimo que contém D-triptofano como a única fonte de nitrogênio. Um segundo e terceiro ciclo demutagênese foi realizado sobre as mini-preparações volumosas utilizandoiniciadores que não pareceram se incorporar bem nos ciclos anteriores. Emcada etapa, as colônias que se desenvolveram rapidamente sobre o meiomínimo (colônias maiores) foram retidas para análise adicional. Os mutantesmostrados na Tabela 25 abaixo foram isolados das placas de seleção. Emalguns casos estes mesmos mutantes surgiram sobre o meio de seleçãomais de uma vez.Tabela 25

<table>table see original document page 99</column></row><table>

Os constructos de mutante foram induzidos para fabricar a prote-ína recombinante em meio LB, e os extratos celulares foram preparados co-mo descrito acima. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram sepa-radas sobre uma Estação de Eletroforese Automática BioRad LaboratoriesExperion e analisadas para concentração e porcentagem de expressão utili-zando o Software Experion versão 1.1.98.0. Níveis muito baixos de proteínarecombinante solúvel foram observados; desta maneira, a quantificação dabanda de interesse não foi possível. As análises foram feitas para testar atransaminação de D-triptofano como descrito acima utilizando 50 a 250 uLde extratos celulares. Os clones 4, 6, 28, e 32 foram analisados utilizandotanto alfa-cetoglutarato e piruvato como o aceitador de amino, e incubadospor 2 horas" e durante a noite a 30°C. Os níveis anteriores de alani-na/glutamato presentes a partir dos extratoscelulares foram subtraídos. Pa-ra as análises com 5-1 e 5-2, as concentrações de proteína estimadas pelosoftware Experion das BCATs eram 275,1 ng/ul para a enzima tipo selva-gem, 409,3 ng/ul para BCAT 5-1, e 148,2 ng/ul para BCAT 5-2. Os resulta-dos das análises são mostrados nas Tabelas 26-28 abaixo.

Tabela 26 Inserir tabela

<table>table see original document page 99</column></row><table>Tabela 26 -continuação-

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Tabela 27 <table>table see original document page 100</column></row><table>

Tabela 29 <table>table see original document page 100</column></row><table>

É evidente que como a maioria das L-aminotransferases, as en-zimas têm uma preferência por alfa-cetoglutarato comparado com piruvatopor aceitador de amino. Todos os mutantes não possuíam atividade de D-aminotransferase, conforme possuía a origem de tipo selvagem. Não ficouclaro se a enzima tipo selvagem possuía mais ou menos atividade de D-aminotransferase, pois a quantificação exata da proteína BCAT de extratoscelulares não foi possível. Entretanto, espera-se que as enzimas mutantespossuam menos atividade de L-aminotransferase do que o tipo selvagem;desta maneira a proporção de taxa de D para L-transaminação está sendoaperfeiçoada. A mutagênese continuada poderia proporcionar uma enzimaalternativa em vias para monatina.

Exemplo 8

Clonagem, Expressão, e Teste de Glutamato e Aspartato Racemases

Este exemplo descreve os métodos usados para clonar e testarenzimas de aminoácido racemase, que podem ser usadas para interconver-são entre L-glutamato e D-glutamato (ou L e D-aspartato ou L e D-alanina).Glutamato, aspartato, ou alanina racemases são úteis em uma via biossinté-tica para produzir monatina R,R quando uma etapa naquela via produzir umL-aminoácido (por exemplo, L-glutamato, L-aspartato, ou L-alanina) e outraetapa na via consome um D-aminoácido (por exemplo, D-glutamato, D-aspartato, ou D-alanina). A Figura 4 ilustra uma via biossintética para produ-zir monatina R,R a partir de L-triptofano utilizando uma L-triptofano amino-transferase específica, uma R-aldolase específica, uma D-aminotransferasee glutamato (ou aspartato ou alanina) racemase.

Os genes foram clonados nos vetores pET28 e pET30 para ge-rar tanto proteínas não marcadas como proteínas de fusão com HIS6-Tag/T7-Tags N-terminal cliváveis. As proteínas resultantes foram purificadasutilizando cromatografia de afinidade de metal imobilizada.

Síntese Experimental

Os genes que codificam glutamato racemases (EC 5.1.1.3) apartir de Lactobacillus brevis (Genbank Número de Acesso No. D29627, se-qüência de ácido nucléico), e Pediococcus pentosaceus (murl gene) (Gen-bank Número de Acesso No. L22789) foram clonados e expressos em E.coli. Os extratos foram testados para atividade em conversão de L-glutamatoem D-glutamato e D-glutamato em L-glutamato. A enzima de aspartato ra-cemase BioCatalytics (EC 5.1.1.13) também foi testada para interconversãoentre L e D-aspartato.

Isolamento de DNA Genômico para Clonagem

O DNA genômico de L brevis genomic (ATCC 8287D) foi obtidoa partir da American Type Culture Collection. P. pentosaceus (ATCC 25745)se desenvolveu a 37°C em caldo MRS de in lactobacilli MRS e 2 ml foramusados para isolamento de DNA genômico utilizando o método de Mekala-nos, J.J., "Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae",Ce//35:253-263, (1983).

Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram designados com 5' sítios de restrição e res-saltos para clonagem nos vetores pET 28 e pET30 (Novagen, Madison, Wl).

Iniciadores de glutamato racemase L. brevis:

N term: 5'-GCGGCGCCATGGAAAATGATCCGATTGGTCTAATG -3' (SEQ IDNO:15),e

C term: 5'-GCGGCGGTCGACGCAATTACAATTGTGTTTGTC-3' (SEQ ID NO: 16).

Iniciadores de glutamato racemase P. pentosaceus:

N term: 5'- GCGGCGCCATGGATGTATGTATAATTTTATTTAG -3' (SEQ ID NO:17),e

C term: Õ^GCGGCGGTCGACAAATTTCATTATTCATTCTAATTT -3' (SEQ IDNO:18).

O gene derivado de L. brevis foi amplificado utilizando o seguinteprotocolo de PCR. Em 50 ui. de uma reação, 0,150 |ng de modelo, 1,6 uM decada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 2,8 U de Expand High Fidelity® Poly-merase (Roche, Indianapolis, IN), 0,5 U de polimerase Pfu (Stratagene, LaJolla, CA) e 1X tampão Expand® com Mg foram usados. O programa ther-mocycler usado incluiu uma partida a quente a 96°C durante 3 minutos, 8repetições das seguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 52°C durante45 segundos, e 72°C durante 2 minutos, seguidas por 22 repetições das se-guintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 45 segundos, e72°C durante 2 minutos. Após as 22 repetições, a amostra foi mantida a72°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Este protocolo PCRproduziu um produto de -830 bp, como julgado por comparação com mar-cadores de tamanho de DNA markers.

O gene derivado de P. pentosaceus foi amplificado utilizando oseguinte protocolo PCR. Em 50 uL de uma reação, 0,15 |j.g de modelo, 1,6uM de cada iniciador, 0,4 mM de cada dNTP, 2,8 U Expand High Fidelity®Polymerase, 0,5 U de polymerase Pfu e 1X tampão Expand® com Mg foramusados. O programa thermocycler usado incluiu uma partida a quente a96°C durante 3 minutos, seguida por 8 repetições das seguintes etapas:94°C durante 30 segundos, 37°C durante 45 segundos, e 72°C durante 2minutos, seguido por 8 repetições das seguintes etapas: 94°C durante 30segundos, 45°C durante 45 segundos, e 72°C durante 2 minutos, seguidopor 14 repetições das seguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 55°Cdurante 45 segundos, e 72°C durante 2 minutos. Após as 14 repetições, aamostra foi mantida a 72°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C.

Este protocolo PCR produziu um produto de -840 bp, como julgado porcomparação com marcadores de tamanho de DNA.

Clonagem

Os produtos PCR foram purificados com gel a partir de 0,8% degéis agarose-TAE utilizando o kit de extração de gel Qiagen (Valencia, CA).Os produtos PCR foram quantificados utilizando um espectrofotômetroSmartSpec 3000®. Os produtos foram digeridos com enzimas de restriçãoNcol e Sall seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante (New En-gland Biolabs, Beverly, MA) e purificados com gel a partir de 0,8% de géisagarose-TAE utilizando o kit de extração de gel Qiagen. Os vetores pET28 epET30 foram preparados por digestão com enzimas de restrição Ncol e Sall,seguidos por tratamento com fosfatase alcalina de camarão e purificação apartir de 0,8% de géis agarose-TAE utilizando o kit de extração de gel Qia-gen.

Os vetores digeridos e insertos foram ligados utilizando o Kit deLigação de DNA Rapid® (Roche, Indianapolis, IN). Aproximadamente 50 ngde inserto tratado, 100 ng de vetor tratado (proporção molar de 3 para 1 deinserto para vetor), 5 U de ligase DNA T4 (incluído com o Kit de Ligação deDNA Rapid®, e 1X tampão de ligação foram incubados durante 5 minutos emtemperatura ambiente. As reações de ligação foram purificadas utilizando oKit de Purificação de Produto de PCR Altamente Puro (Roche) e foram usa-das para transformar células eletrocompetentes DH10B E. coli (Invitrogen,Carlsbad, CA). Dez ^iL de cada reação ligação foram adicionados a 40 \iL decélulas DH10B e foram transformados por eletroporação utilizando BioRadGene Pulser II sob as seguintes condições: 2,5 kV, 25 |a.F, 200 ohm em umacubeta de 0,2 cm. As células foram permitidas para se recuperar em 1 ml_ deSOC em temperatura ambiente durante 1 hora a 37°C com agitação a 225rpm. As células foram semeadas sobre as placas LB que contêm canamicina(50 fig/mL).

O DNA de plasmídeo foi purificado a partir dos transformantesresultantes utilizando o kit spin miniprep spin Qiagen e separado nos inser-tos corretos por digestão por restrição com Nco\ e Sa/I. As seqüências deplasmídeos que parecem possuir o inserto correto foram verificadas por se-qüencialmente de DNA de terminação de cadeia didesóxi.

Expressão Genética e Análises

O DNA de plasmídeo, verificado por análise de seqüência, foisubclonado em BL21(DE3) hospedeira de expressão E. coli (Novagen, Ma-dison, Wl). As culturas se desenvolveram e os plasmídeos foram isoladosutilizando o kit de minipreparação Qiagen, e analisadas por digestão por res-trição para confirmar a identidade.

A indução em BL21(DE3) foi inicialmente realizada com glutama-te racemases de L. brevis e P. pentosaceus tanto nos vetores pET28 (nãomarcados) como pET 30 (marcados com histidina). Um estudo temporal foirealizado com culturas desenvolvidas em 250 mL de LB que contém cana-micina (50 mg/L) em um OD6oo de 0,5 a 0,6 e induzidas com 100 mM deIPTG (isopropila tiogalacatosida) e experimentadas em 0 e 3 horas após aindução. As células de 600 |iL (0 hora) e 275 \± (3 horas) foram ressuspensasem 40 |iL de tampão sulfato de dodecil sódico que contém 2-mercaptoetanol, eaquecidas a 95°C durante 10 minutos, e resfriadas. As alíquotas destas a-mostras de proteína celular totais foram analisadas por SDS-PAGE utilizan-do 4 a 1 5% de gel de gradiente.

Os extratos celulares também foram preparados a partir de cul-turas de 3 horas ao suspender os péletes de célula de 5 ml_ de cultura em0,625 mL de reagente Novagen BugBuster®que contém 0,625 |j,L de benzo-nase nuclease e 3 ul de conjunto de coquetel de inibidor de protease #3(Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) em temperatura ambientedurante 20 minutos com agitação suave, e centrifugação a 16.000 x g pararemover resíduos celulares. Os sobrenadantes (extratos celulares) foramcarregados sobre 4 a 15% de géis de gradiente para análise das proteínassolúveis de célula.

As amostras de 3 horas de glutamato racemase L brevis e glu-tamate racemase P. pentosaceus clonadas mostraram tanto proteína totalcomo solúvel que correspondiam ao tamanho correto (aproximadamente 31kDa). O produto de gene pET30 de L. brevis (marcado com histidina) foi su-perexpresso em um nível maior do que, e também mais solúvel (>20% deproteína solúvel) do que, o produto de gene pET 28 de L. brevis (não marca-do), bem como os produtos de gene de P. pentosaceus em ambos vetores.O produto de gene P. pentosaceus mostrou superexpressão e solubilidadeiguais nos vejores pET28 e pET30, que era significativamente menor queaquela observada no produto de gene pET30 de L. brevis.

As células das culturas induzidas (250 mL) foram centrifugadase lavadas uma vez com 0,85% de NaCI. Os péletes de célula foram ressus-pensas em 5 ml_/g de peso de célula úmida de reagente BugBuster® (Nova-gen) que contém 5 \iUrr\L de conjunto de coquetel de inibidor de protease #3(Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) e 1 jiL/mL de benzonasenuclease. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente durante20 minutos sobre agitador orbital. O resíduo celular insolúvel foi removidopor centrifugação em 16.000 X g durante 20 minutos a 4°C.

Os extratos celulares foram analisados para atividade de gluta-mato racemase utilizando o seguinte protocolo. As reações de 400 uL foramrealizadas em 10 mM de fosfato de potássio (pH 8,0), 0,2 mM de ditiotreitol("DTT"), e 10 mM de L-glutamato ou D-glutamato. As reações foram inicia-das pela adição de 20-100 uL de extratos livres de células e foram incuba-das em temperatura ambiente. As alíquotas de amostra foram obtidas duran-te um curso de tempo de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos e 1hora (as amostras de zero minuto serviram como reações de controle). 2 Mde ácido fórmico (25 uL) foram adicionados em cada alíquota de amostra de40 uL para interromper a reação e a proteína precipitada ser removida porcentrifugação. Os sobrenadantes foram removidos e congelados a -80°C atéestes serem analisados por LC/MS/MS.

Os resultados de análise de extratos celulares de indução depET30 com 100 mM de IPTG (3 horas) demonstraram que as enzimas de L.brevis (Genbank Número de Acesso BAA06106.1 Gl:468450) e P. pentosa-ceus (Genbank Número de Acesso AAA16761.1 Gl:349029) possuem níveissignificativos de atividade de racemase sobre ambos os isômeros de gluta-mato. A racemase de P. pentosaceus (20 uL de extratos celulares) atingiu oequilíbrio entre L e D-glutamato em 10 a 20 minutos começando com cadasubstrato. A enzima de L. brevis (20 uL de extratos celulares) também atin-giu o equilíbrio em aproximadamente 20 minutos.

Uma enzima aspartato racemase parcialmente purificada (cata-log # ASPR-101) adquirida junto a BioCatalytics, Inc. (Pasadena, CA) foi a-nalisada para atividade sobre L-aspartato e D-aspartato utilizando um proto-colo similar àquele acima. A enzima comercial mostrou atividade de racema-se sobre ambos isômeros. Utilizando 0,5 a 1 mg de enzima, atingiu-se equi-líbrio em 20 a 60 minutos.

Todas as três racemases (glutamato racemase L brevis, P. glu-tamato racemase pentosaceus e aspartato racemase BioCatalytics tambémforam analisadas para atividade sobre monatina S,S utilizando o seguinteprotocolo. As reações de 400 uL foram realizadas em 10 mM de fosfato depotássio (pH 8,0), 0,2 mM de DTT, e 10 mM de monatina S,S. As reaçõesforam iniciadas pela adição de extratos livres de células (L brevis e P. pen-tosaceus) ou enzima purificada (aspartato racemase BioCatalytics) e foramincubadas em temperatura ambiente. As alíquotas de amostra foram obtidasdurante um curso de tempo de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutose 1 hora (as amostras de zero minuto serviram como reações de controlebem como amostras sem enzima). 2 M de ácido fórmico (25 uL) foram adi-cionados em cada alíquota de amostra de 40fxL para interromper a reação ea proteína precipitada ser removida por centrifugação. Os sobrenadantesforam removidos e congelados a -80°C até que estes sejam analisados porLC/MS/MS (Exemplo 1). Nenhuma redução na concentração de monatinaS,S foi observada com o tempo, nem ocorreu nenhum aumento na monatinaS,R (inicialmente presente como <5% de subproduto contaminante, mesmono controle sem enzima). Portanto, nenhuma das racemases analisadasmostrou atividade com relação a monatina.

Exemplo 9

Produção de Monatina R,R a partir de L-Triptofano UtilizandoAlanina, Glutamato, ou Aspartato Racemases

Este exemplo descreve métodos para produzir monatina R,Restereoisomericamente enriquecida a partir de L-triptofano utilizando umaL-triptofano aminotransferase (L-tirosina, ou aromática), aldolase ProA, alanina,glutamato ou aspartato racemase, e uma D-aminoácido aminotransferase deampla especificidade. A Figura 5 é um diagrama que ilustra a via. Esta abor-dagem à produção de monatina R,R estereoisomericamente enriquecidarequer uma enzima para a etapa 1 que possui baixa atividade na produçãode monatina de precursor de monatina (MP). Baseado nos resultados ante-riores, utilizou-se os produtos de gene tatA de Sinorhizobium meliloti e Rho-dobacter sphaeroides descritos no Exemplo 1 de WO 03/091396 A2.

Materiais e Métodos

As glutamato racemases de L brevis e P. pentosaceus foramproduzidas em E. coli como descrito no Exemplo 8. Em alguns casos, a ver-são marcada His6 destas enzimas foi purificada utilizando cartuchos His-Bind900 de acordo com os protocolos do fabricante (Novagen, Madison, Wl) e foidessalinizada para remover imidazol utilizando colunas PD-10 (G25 Sepha-dex, Amersham-Pharmacia). As enzimas foram eluídas em 25 mM de fosfatode potássio pH 8,0. Aspartato racemase (ASPR-101) e D-aminotransferase(AT-103) foram adquiridas junto a BioCatalytics, Inc., alanina racemase foiadquirida junto a Sigma (St. Louis, MO) (número de catálogo A8936). Tirosi-na aminotransferases (aromáticas) de dS. meliloti e R. sphaeroides forampreparadas como descrito no Exemplo 1 de WO 03/091396 A2. AldolaseProA de Comamonas testosteronitol preparada como descrito no Exemplo 4de WO 03/091396 A2. As análises de proteína totais foram feitas utilizando aAnálise de Proteína Bio-Rad de acordo com os protocolos do fabricante(Hercules, CA).

Redução em Quantidade de Monatina S.S Produzida utilizando Racemases

As misturas de reação (1 mL de volume, realizadas em duplicata)continham 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCI2,0,05 mM de piridoxal 5'-fosfato ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mMde a-cetoglutarato ou oxaloacetato de sódio, aproximadamente 280 ug/mLde TatA de S. meliloti fornecidos em um extrato celular, 1 mg/mL de D-aminotransferase BioCatalytics (AT-103), 100 uL/ml_ de extrato celular deglutamate racemase ou 1 mg/mL de aspartato racemase, e aproximadamen-te 100 ug/mL de aldolase ProA proporcionado como um extrato celular. Otriptofano sólido foi adicionado em uma concentração de 10,2 mg/ml. Oscontroles negativos não continham racemase. As amostras foram incubadasa 30QC (agitação a 250 rpm) durante 1 hora, 2 horas, ou durante a noite. Asamostras foram centrifugadas para remover o precipitado, filtrado de seringa,e armazenadas a -809C antes da análise de monatina utilizando o métodopor LC/MS/MS descrito no Exemplo 1.

A maior parte das amostras continha >95% de monatina S,S,devido às quantidades de L-aminotransferase nativa presentes nos extratoscelulares. Entretanto, as amostras que continham racemase possuíam umaquantidade reduzida de monatina total como um resultado das enzimas ra-cemase que tornam L-glutamato menos disponível para transaminação deMP. Sem racemase, a monatina a 1545 a 2355 ppm (predominantementeS,S) foi produzida durante o curso de tempo. Com as racemases presentes,apenas 340-879 ppm (enzima de L. brevis), 444-531 ppm (enzima de P. pen-tosaceus), e monatina a 506-1460 ppm (aspartato racemase) foram produzi-das. Estes dados indicam que as racemases estão ativas nas condições dereação requeridas para produzir monatina. Para reduzir a formação de monati-na S,S de enzimas de extrato celular, tais como, aspartato aminotransferases,experimentos adicionais foram realizados com enzimas purificadas e uma pro-porção maior de enzimas D-aminotransferase para L-aminotransferase.Conversão de L-triptofano em Isômeros de Contêm 4-fí de Monatina

Os experimentos acima foram repetidos utilizando aproximada-mente 54 ug de L-aminotransferase purificada (tanto TatA de S. meliloti co-mo R. sphaeroides), 1 mg de aspartato aminotransferase (BioCatalytics), 1mg de D-aminotransferase, 5mM de oxaloacetato como o aceitador de ami-no, e 75 ug de aldolase purificada. As reações foram realizadas em duplicatacom um tempo de amostragem de 2 horas e um tempo de incubação notur-no. Os controles negativos foram feitos com L-aminotransferase de S. melilo-ti, porém sem racemase. Além da quantificação pico de monatina R,R/S,S eS,R/R,S baseada na cromatografia de fase reversa, a porcentagem de cadaestereoisômero foi determinada utilizando a técnica de derivatização deFDAA descrita no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 29abaixo.

Tabela 29

<table>table see original document page 109</column></row><table>109

Tabela 29 -continuação-

<table>table see original document page 110</column></row><table>

Claramente, a presença da racemase aumentou a quantidadetotal de monatina produzida quando TatA de S. meliloti foi usada como aenzima para transaminação de L-triptofano. Os níveis de monatina aumenta-ram a partir de uma media de 6,4 a 16,5 ppm na análise de duas horas, e apartir de 41-73 ppm na análise durante a noite. Adicionalmente, a porcenta-gem de R,R formada aumentou de cerca de 1% a tanto quanto 58% ao utili-zar a enzima racemase. O estereoisômero S,R de monatina, outro adoçantepotente, era o outro componente principal, que aumenta quase de 0, noscontroles negativos, a 31%. TatA de R. sphaeroides possuía claramentemais atividade sobre S-MP do que a L-transaminase de S. meliloti, demons-trando a importância de se possuir uma enzima que tem uma alta especifici-dade de substrato para L-triptofano como comparado com MP quando isô-meros 4-R de monatina são os produtos desejados. Com cerca de 10% damonatina total que é 4S no ponto de tempo de duas horas, TatA de S. me//-loti poderia ser considerado possuindo uma atividade limitada sobre MP.

Os experimentos foram repetidos com TatA purificado de S. me-liloti (54 ug) e glutamato racemase de L. brevis. Quando glutamato racemasepurificada for usada, aproximadamente 64 ug foram usados por 1 mL de re-ação. Os extratos celulares que contêm a glutamato racemase também fo-ram testados e 1,4 mg de proteína solúvel foi usado. Um controle negativosem racemase foi utilizado novamente e todas as amostras foram realizadasem duplicata. Os resultados são mostrados na Tabela 30 abaixo.

Tabela 30

<table>table see original document page 111</column></row><table>

Novamente, é claro que a adição da racemase aumenta a mona-tina total produzida a partir de L-triptofano, bem como aumenta as quantida-des relativas de isômeros que contêm 4R de monatina como comparadocom monatina S,S. O uso de aldolase purificada, racemase, e L-aminotrans-ferase aumenta bastante a capacidade de controlar a formação de estereoi-sômero desejada. A proporção de L para D aminotransferase também é umamaneira de se manipular a estereoquímica do produto final.

Quando se compara os resultados mostrados nas Tabelas 1 e 2no Exemplo 2, com os resultados com condições de reação similares àscondições acima, alguém pode observar que aproximadamente 7 a 29 ppmde monatina foram formados a partir de indol-3-piruvato e as porcentagensde monatina R,R formadas eram aproximadamente 51 a 90%. Utilizar a as-partato racemase aumentou a quantidade total de monatina produzida para16 a 78 ppm de monatina, com % de R,R de aproximadamente 40 a 58%.Adicionalmente, uma matéria-prima mais estável e menos dispendiosa(L-triptofano) foi utilizada. No Exemplo 3, aproximadamente 73 ppm de mo-natina foram produzidos a partir de D-triptofano em uma proporção deR,R:S,R de aproximadamente 1,7:1. A quantidade total de isômeros 4R era>80% da monatina total. Devido ao fato de tanto monatina R,R como mona-tina R,S serem adoçantes potentes (>1000 vezes mais doce do que sacaro-se), a capacidade de enriquecer estes isômeros, sem a necessidade desubstratos de D-aminoácido dispendiosos, é importante.

Espera-se que a disponibilidade de uma aldolase não-específicaou R-específica poderia aumentar a taxa de reação, bem como aumentar aporcentagem de monatina R,R formada. Veja, Exemplo 5. Embora a aldola-se ProA de C. testosteroni usada nestas análises seja relatada para favore-cer predominantemente substratos na configuração S para reações de fis-são, esta aldolase Pro A produz claramente R-MP. Desta maneira, as aldo-lases que produzem mais preferivelmente MP na configuração R podem aju-dar a gerar porcentagens ainda maiores de monatina R,R. Adicionalmente,espera-se que encontrar uma L-triptofano aminotransferase com atividadeainda inferior para a produção de monatina também possa reduzir a quanti-dade de monatina S,S e R,S formada. Finalmente, podem ser feitos aperfei-çoamentos na enzima D-aminotransferase, ou enzimas alternativas D-aminotransferase podem ser usadas, estas poderiam aumentar a especifici-dade de substrato em R-MP versus S-MP. Isto também poderia aumentar aformação do produto R,R, se assim desejado.

Os experimentos de aspartato racemase foram repetidos paracomparar a atividade de aldolase R-seletiva de SEQ ID NO:22 com a ativi-dade da aldolase ProA de C. testosteroni. Aproximadamente 50 ug deL-aminotransferase purificada (S. melilotiTatA), 1 mg de aspartato racemase(BioCatalytics), 1 mg de D-aminotransferase (AT-103, BioCatalytics), 5 mMde oxaloacetato como o aceitador de amino, e 50 ug da aldolase purificadaapropriada. As reações foram realizadas em duplicata e incubadas durante anoite a 30°C. A porcentagem de cada estereoisômero foi determinada utili-zando a técnica de derivatização FDAA descrita no Exemplo 1. Os resulta-dos são mostrados abaixo na Tabela 31.

Tabela 31

<table>table see original document page 113</column></row><table>

A distribuição de ProA C. testosteroni de isômeros é compatívelcom os experimentos anteriores acima, enquanto que quando a aldolase R-seletiva de SEQ ID NO:22 for usada, a porcentagem de R,R é muito maior,quantidades indetectaveis de S,S são formadas, e a quantidade de monatinaS,R é menor.

Como descrito nos Exemplos 2 e 3, D-alanina pode servir comoo doador de amino para transaminação de MP em monatina. Muitas L-aminotransferases possuem a capacidade de utilizar piruvato como um acei-tador de amino de certa forma e produzem L-alanina. Devido ao fato de asreações mencionadas acima utilizarem altas concentrações de piruvato, éprovável que algum piruvato seja convertido em L-alanina. Por exemplo, du-rante a transaminação de L-triptofano, a enzima HexAspC descrita no E-xemplo 6 foi considerada para converter 10 a 18% de piruvato (50 a 200 mMde concentrações iniciais) em L-alanina em 2 horas se alfa-cetoglutarato es-tiver ausente. A enzima mostrou uma preferência por 10 dobras de alfa-cetoglutarato quando ambos os aceitadores de amino estiverem presentesem altas concentrações (>50 mM). AspC (descrito em WO 03/091396 A2)também produziu alguma L-alanina a partir de piruvato. Portanto, esperava-se que alguém pudesse omitir a adição de alfa-cetoglutarato ou oxaloacetatonas reações acima e utilizar uma alanina racemase (EC 5.1.1.1) em vez deglutamato ou aspartato racemase.

As enzimas alanina racemase, primeiramente, foram identifica-das em Brucella abortus e Streptococcus faecalis. Marr, AG., and Wilson,P.W., Arch. Biochem. Biophys., 49:424-433, (1954); Wood, W.A., e Gunsa-lus, I.C., J. Biol. Chem. 790:403-416, (1951). O gene dadB em Salmonellatyphimurium foi identificado como a fonte de atividade de alanina racemase ediversas centenas de homólogos podem ser encontradas em bancos de da-dos genômicos. Outras fontes conhecidas de atividade de alanina racemasesão Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cho-lerae, Schizosaccaroyces pombe, e Bacillus cereus. Um cogumelo basidio-miceto, Lentinus edodes, também contém uma alanina racemase de amplaatividade. Um homólogo termoestável de Bacillus stearothermophilus estádisponível para compra junto a Sigma-AIdrich (catálogo # A8936)e foi imobi-lizado para aplicações comerciais. Inagaki, K., Biochemistry 25: 3268 (1986).

Produção de Monatina com Alanina Racemase

A produção de monatina foi testada utilizando aldolase ProA deC. testosteroni. Aproximadamente 50 ug de L-aminotransferase purificada(S. meliloti TatA), 1 mg de D-aminotransferase (AT-103, BioCatalytics), piru-vato como o aceitador de amino, 50 ug de aldolase purificada, e 70 |ig dealanina racemase adquirida junto a Sigma (St. Louis, MO) (número de catá-logo A8936). As reações foram realizadas em duplicata e incubadas durantea noite. A porcentagem de cada estereoisômero foi determinada utilizando atécnica de derivatização de FDAA descrita no Exemplo 1. Os controles semracemase foram incluídos. Os resultados estão mostrados na Tabela 32 a-baixo.Tabela 32

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Havia monatina R,R com três dobras a mais no ponto de tempode uma hora quando alanina racemase estava presente comparada com aamostra sem alanina racemase. Este resultado mostra que é possível pro-duzir monatina R,R utilizando alanina racemase. A porcentagem de monati-na R,R produzida poderia ser aperfeiçoada utilizando uma aldolase que pro-duz seletivamente precursor de monatina R, uma L-aminotransferase quenão funciona ou possui atividade limitada sobre precursor de monatina R euma D-aminotransferase que não funciona ou possui atividade limitada so-bre indol-3-piruvato.

Exemplo 10

D-fenilqlicina Aminotransferase (D-4-Hidroxifenilglicina Aminotransferase)

Como mostrado na Figura 3, uma aminotransferase de estereo-inversão é útil em uma via biossintética para a produção de monatina. Porexemplo, uma D-fenilglicina aminotransferase ou mutante desta poderia produ-zir monatina R,R a partir de R-MP com L-glutamato como o doador de amino.(1) Síntese de PCR de P. stutzeri 4 D-hidroxifenilglicina Aminotransferase deIniciadores de Olioonucleotídeo

Este exemplo descreve métodos que foram usados para sinteti-zar 4 D-hidroxifenilglicina aminotransferase, uma enzima de estereoinversãoque pode ser usada para converter precursor de monatina R em monatinaR,R utilizando L-glutamato como o doador de amino.

Desenho de Iniciador

A seqüência publicada (Genbank Número de Acesso. AY319935,seqüência de ácido nucléico; Genbank Número de Acesso AAQ8290, seqüên-cia de proteína) de 4 D-hidroxifenilglicina aminotransferase Pseudomonasstutzeri (4 D-HPG AT) foi usada como um modelo para desenho de iniciadorde PCR. Alternativamente, a 4-D-hidroxifenilglicina aminotransferase dePseudomonas putida, (CAD42450 (proteína), AX467211 (nucleotídeo)) éusada como um modelo de seqüência. Um total de 34 iniciadores diretos e35 iniciadores reversos foi desenhado; os iniciadores diretos e reversos eram20 pares de base de sobreposição de 40-mers de compartilhamento. Ade-mais, 2 iniciadores externos foram desenhados com 5' sítios de restrição eressalto para clonagem nos vetores pET 28 e pET30 (Novagen, Madison, Wl).

Iniciadores externos P. stutzeri 4 D-HPG AT: N term (com Nde\Site):

5'-GGCCGGCATATGTCGATCCTTAACGACTACAAACGT -3' (SEQ ID NO:19), e Cterm (com sítio Xho\):

5'-GGAAGGCTCGAGTCATGATTGGTTTCCAGACAAATT-3' (SEQ ID NO:20).Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase

A seqüência de gene de P. stutzeri foi amplificada utilizando osseguintes protocolos. A reação de PCR primária de 100 |iL incluiu 0,05 uMde cada um dos 69 iniciadores internos, 0,4 mM de cada dNTP, 10 U de Po-limerase rTth XL (Roche, Indianapolis, IN), 0,625 U de polimerase Pfu (Stra-tagene, La Jolla, CA), 1X tampão XL e 1 mM Mg(OAc)2. O programa ther-mocycler usado incluiu uma partida a quente a 94°C durante 3 minutos, 15repetições das seguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 42°C durante30 segundos, e 68°C durante 15 segundos, seguido por 10 repetições dasseguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos, e68°C durante 30 segundos, seguido por 10 repetições das seguintes etapas:94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, e 68°C durante 1minuto e 15 segundos. Após o final de 10 ciclos, a amostra foi mantida a68°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Este protocolo de PCRproduziu um esfregaço de produto a -0,5 kb sobre 0,8% de gel agarose TAE.

A reação secundária de PCR foi preparada utilizando a reaçãoprimária de PCR como modelo. A reação secundária de PCR de 100 fxL in-cluiu 2,5 jliL da reação primária de PCR, 0,5 uM de cada um dos 2 iniciado-res externos (com sítios de restrição Nde\ e Xho\), 0,4 mM de cada dNTP, 10U de Polimerase xTth XL, 0,625 U de polimerase Pfu, 1X tampão XL e 1 mMde Mg(OAc)2. O programa thermocycler usado inclui uma partida a quente a94°C durante 3 minutos, 10 repetições das seguintes etapas: 94°C durante30 segundos, 52°C durante 30 segundos, e 68°C durante 1 minuto e 30 se-gundos, seguido por 15 repetições das seguintes etapas: 94°C durante 30segundos, 60°C durante 30 segundos, e 68°C durante 1 minuto e 30 segun-dos. Após as 15 repetições, a amostra foi mantida a 68°C durante 7 minutose então armazenada a 4°C. Este protocolo de PCR produziu uma faixa deproduto distintiva a ~1,4 kb sobre 0,8% de gel agarose TAE.

O produto de PCR foi purificado com gel a partir de 0,8% de gelagarose TAE utilizando o kit de extração por gel Qiagen (Valencia, CA). Oproduto foi clonado TOPO e transformado em células TOP 10 de acordocom o protocolo do fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). O DNA de plasmí-deo foi purificado a partir das transformantes resultantes utilizando o kit spinminiprep Qiagen e separado nos insertos corretos por digestão por restriçãocom Nde\ e Xho\. As seqüências de plasmídeos que parecem possuir o in-serto correto foram verificadas por seqüenciamento de DNA de terminaçãode cadeia didesóxi com iniciadores diretos M13 e Reversos M13 universais.Dos 10 clones seqüenciados, todos possuíam pelo menos uma mutação daseqüência desejada. O melhor clone possuía uma única mutação de par debase que resultou em uma alteração de aminoácido. A seqüência deste clo-ne foi corrigida utilizando o protocolo de Mutagênese QuickChange de acor-do com as recomendações do fabricante (Stratagene, La Jolla, CA).

O clone TOPO corrigido foi digerido com enzimas de restriçãoNde\ e Xho\ seguindo os protocolos recomendados pelo fabricante (New En-gland Biolabs, Beverly, MA) e purificado com gel a partir de 0,8% de gel aga-rose TAE utilizando o kit de extração por gel Qiagen. Os vetores pET 28 epET 30 foram preparados por digestão com enzimas de restrição Nde1 eXho1, seguidos por tratamento com fosfatase alcalina de camarão e purifica-ção a partir de 0,8% de géis agarose TAE utilizando o kit de extração por gel Qiagen.

Os vetores e inserto digeridos foram ligados utilizando o Kit deLigação NEB Quick (Beverly, MA). Aproximadamente 50 ng de inserto trata-do, 100 ng de vetor tratado (proporção molar de 3 para 1 de inserto para ve-tor), 5 U de ligase DNA T4, e 1X tampão de ligação foram incubados durante5 minutos em temperatura ambiente. A mistura de ligação foi transformadaem células quimicamente competentes TOP10F (Invitrogen). As células fo-ram permitidas para se recuperar em 0,25 mL de SOC em temperatura am-biente durante 1 hora a 37°C com agitação a 225 rpm. As células foram se-meadas sobre placas LB que contêm canamicina (50 [ig/mL). O DNA deplasmídeo foi purificado a partir das transformantes resultantes utilizando okit spin miniprep Qiagen e separado nos insertos corretos por digestão porrestrição com Nde\ e Xho\.

Expressão Genética e Análises

O DNA de plasmídeo foi transformado em hospedeiro de ex-pressão E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, Wl). As culturas se desen-volveram e osplasmídeos foram isolados utilizando o kit de minipreparaçãoQiagen e analisados por digestão por restrição para confirmar a identidade.

A indução em BL21(DE3) foi realizada com D-4-hidroxifenilgli-cina aminotransferase P. stutzeri tanto em vetores pET 28 (marcados comhistidina) como pET 30 (não marcados). Um estudo temporal foi realizadocom culturas desenvolvidas em 250 mL de LB que contém canamicina (50mg/L) em um OD6oo de 0,5 a 0,6, induzidas com 100 mM de isopropila tioga-lacatosida ("IPTG") e experimentadas a 0 e 3 horas após a indução. Um vo-lume apropriado de células de 0 hora e 3 horas foi ressuspenso em 40 (iL detampão sulfato de dodecil sódico que contém 2-mercaptoetanol, aquecido a95°C durante 10 min, e resfriado. As alíquotas destas amostras totais de pro-teína celular foram analisadas por SDS-PAGE utilizando 4 a 15% de gel degradiente.

Os extratos celulares também foram preparados a partir das cul-turas de 3 horas ao suspender péletes de célula de 5 mL de cultura em0,625 mL de reagente Novagen BugBuster®que contém 0,625 uL de benzo-nase nuclease e 3 jiL de conjunto de coquetel de inibidor de protease #3(Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA) em temperatura ambientedurante 20 minutos com agitação suave e centrifugaçao a 16.000 x g pararemover os resíduos celulares. Os sobrenadantes (extratos celulares) foramcarregados sobre 4 a 15% de géis de gradiente para análise das proteínassolúveis celulares. Quando observada, a proteína foi purificada utilizandocartuchos His-Bind 900 de acordo com os protocolos do fabricante (Nova-gen, Madison, Wl) e foi dessalinizada para remover imidazol utilizando colu-nas PD-10 (G25 Sephadex, Amersham-Pharmacia).

(2) Isolamento de Organismos com D-Fenilqlicina Aminotransferase ("DPGAT")

Os organismos do tipo Pseudomonas e gêneros similares, comuma D-fenilglicina aminotransferase de estéreo inversão (também chamadade D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase) são isolados da seguinte manei-ra. As amostras de solo são incubadas sobre placas de petri com o seguintemeio: (por litro) 15 g de ágar, 3,4 g de KH2P04, 3,55 g de Na2HP04, 0,2 g deMgS04-7H20, 8 mg de CaCI2-2H20, 10 mg de extrato de levedura, 1 ml1000x de solução de elementos traço (Balch, W.E., et ai, "Methanogens:reevaluation of a unique biological group", Microbiol. Rev. 43:260-296,(1979)), e 1 g de D-fenilglicina (D-4-hidroxifenilglicina).

Os isolados são testados por PCR na presença de uma amino-transferase de estereoinversão (os iniciadores são designados a partir de D-fenilglicina aminotransferases conhecidas) ou são adicionalmente enriqueci-dos na presença de uma aminotransferase de estereoinversão como se se-gue: os isolados das placas poderiam se desenvolver em meio líquido comoacima, sem o ágar, a 30°C com agitação sobre um OD6oo de cerca de 1,0.

As células foram colhidas por centrifugaçao e lavadas duas vezes com0,85% de NaCI. Uma amostra de 10 mg (peso úmido) foi suspensa em 1 mlde tampão fosfato de potássio (pH 7,0) e 5 mM de D-fenilglicina ou D-4-hidroxifenilglicina. 15 mM de ácido (aminoóxi)acético neutralizado foram adi-cionados a amostras em duplicata preparadas como descrito acima. O con-sumo de D-fenilglicina (ou D-4-hidroxiglicina) é medido por HPLC.

Os isolados capazes de degradar D-fenilglicina (ou D-4-hidro-xifenilglicina), porém fazem isto em uma velocidade mais lenta na presençade ácido (aminooxi)acético, são selecionados para análise adicional. Os iso-lados são testados, por PCR, na presença de uma aminotransferase de es-tereoinversão (os iniciadores são designados a partir de D-fenilglicina amino-transferases conhecidas).

A presença da aminotransferase de estereoinversão é confirma-da ao desenvolver uma cultura em um meio líquido como descrito acima,colher as células e fabricar um extrato bruto livre de células ("CFE") e testara atividade de enzima D-fenilglicina aminotransferase ou D-4-hidroxifenil-glicina. O CFE é adicionado a uma mistura de reação com as seguintes con-centrações finais: 0,1 M de ácido 3-(cicloexilamino)-1-propanossulfônico("CAPS") (pH 9,5), 60 mM de L-glutamato (sal sódico), 5 mM de benzo-ilformato ou 4-hidroxibenzoato e 50 uM de PLP.

A reação reversa é medida ao adicionar CFE a uma mistura dereação com as seguintes concentrações: 50 mM de fosfato de potássio (pH7,0), 60 mM de D-fenilglicina ou D-4-hidroxifenilglicina, 5 mM de a-cetoglu-tarato, e 50 uM de PLP. As análises são incubadas a 35eC e as alíquotassão obtidas em pontos de tempo e paradas por ebulição durante 2 minutos.O produto será quantificado pelo método de HLPC de Gil-Av, E., et ai, "Re-solution of underivatized amino acids by reversed phase chromatography", J.Am. Chem. Soe, 702:5115-5117, (1980), ou pelo métodos descritos noExemplo 1 voltados para a medida de formação de glutamato.

Como uma alternativa para métodos baseados em PCR, a D-fenil-glicina aminotransferase de estereoinversão é purificada a partir da bactériaisolada por técnicas de purificação de proteína convencionais, inclusive fra-cionamento de sulfato de amônio, e cromatografia em coluna convencional.

Uma vez que a proteína foi purificada a um grau razoável, as técnicas demicrosseqüenciamento de peptídeo ou seqüenciamento de aminoácido tipoEdman convencional são utilizadas (veja http://golgi.harvard.edu/microchem/para descrições dos protocolos e equipamento usado para este tipo de tra-balho). Os iniciadores degenerados são designados baseados na seqüênciadisponível a partir do relativo mais próximo conhecido da fonte de proteína.A degeneração de PCR e genome walking pode ser então realizada de a-cordo com os protocolos estabelecidos para isolar a seqüência de codifica-ção de D-fenilglicina de estereoinversão.

(3) Produção de Monatina DPGAT

D-hidroxifenilglicina aminotransferases, como descrito em (1) e(2) acima, são usadas em extratos brutos de proteína livres de células, oupurificadas como descrito em (1) acima. As tirosina aminotransferases (aro-máticas) S. meliloti e R. sphaeroides são preparadas como descrito no E-xemplo 1 de WO 03/091396 A2. A aldolase ProA Comamonas testosteroni épreparada como descrito no Exemplo 4 de WO 03/091396 A2. As análisesde proteína totais são feitas utilizando a Análise de Proteína Bio-Rad de a-cordo com os protocolos do fabricante(Hercules, CA).

As misturas de reação (1 mL de volume, realizadas em duplica-ta) contêm 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCI2,0,05 mM de 5'-fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mMde a-cetoglutarato de sódio, aproximadamente 280 ug/mL de TatA S. melilotifornecidos em um extrato celular, 100 uL/mL de extrato celular de D-hidroxifenilglicina aminotransferase ou 1 mg/mL de D-hidroxifenilglicina ami-notransferase purificada, e aproximadamente 100 ug/mL de aldolase ProAproporcionada como um extrato celular. O triptofano sólido é adicionado emuma concentração de 10,2 mg/ml. Os controles negativos são realizadossem D-hidroxjfenilglicina aminotransferase. As amostras são incubadas a30eC com agitação suave durante ~1 hora ou durante a noite. As amostrassão centrifugadas para remover o precipitado, filtradas por seringa, e arma-zenadas a -80QC antes da análise de monatina utilizando o métodoLC/MS/MS: descrito no Exemplo 1.

D-hidroxifenilglicina aminotransferases com atividade aperfeiço-ada para produção de monatina são feitas utilizando técnicas de mutagêne-se conhecidas pelo versado na técnica, inclusive: PCR mutagênica, passa-gem através de cepas mutagênicas, mutagênese sítio-dirigida, PCR passívelde erro, ou por métodos, tal como, embaralhamento de DNA ou outras tec-nologias de evolução dirigida. As D-hidroxifenilglicina aminotransferases a-perfeiçoadas são selecionadas por desenvolvimento sobre meio mínimo commonatina R,R como a fonte de nitrogênio. Inicialmente, a seleção se baseiano desenvolvimento, porém à medida que as aminotransferases aperfeiçoa-das são selecionadas, a triagem se baseia na taxa de desenvolvimento. Ouseja, as células com versões modificadas do gene se desenvolvem e o geneé expresso em meio mínimo com monatina R,R como a fonte de nitrogênio.

As taxas de desenvolvimento das células com as versões modificadas dogene são comparadas com a versão não modificada. Aquelas células comuma taxa de desenvolvimento mais rápida são selecionadas e a aminotrans-ferase é adicionalmente analisada. A D-hidroxifenilglicina aminotransferasepode ser adicionalmente mutagenizada até a atividade desejada ser obtida.

(4) Análise de PPG AT

A versão não marcada com His de DPGAT foi expressa comodescrito em (1) acima e os extratos foram usados nas análises. As análisesforam realizadas e incluíram 100 mM de fosfato de potássio pH 7,0, 60 mMde D-fenilglicina, 5 mM de a-cetoglutarato, e 50 de fosfato piridoxal-5'.

As análises foram iniciadas ao adicionar 100 \ú- de extrato, preparadas comodescrito acima neste exemplo, por ml de volume de análise. As amostrasforam obtidas em diversos pontos de tempo (0, 1, 2, 5, 10, 30, 60, e 120 mi-nutos) e foram paradas com um volume igual de 2 M de ácido fórmico. Umaamostra também foi obtida após incubação durante a noite (-1200 minutos).

As amostras foram analisadas para produção de glutamato através do méto-do OPA descrito no Exemplo 1. Os resultados estão resumidos na Tabela 33abaixo.

Tabela 33

<table>table see original document page 122</column></row><table>Tabela 33 -continuação-

<table>table see original document page 123</column></row><table>

A enzima possui claramente alguma atividade sobre a D-fenil-glicina. A atividade de enzima também foi testada sobre monatina R,R. Aanálise foi realizada como descrito acima e monatina R,R foi incluída emuma concentração de 60 mM. Os resultados estão indicados abaixo na Tabela 34.

Tabela 34

<table>table see original document page 123</column></row><table>

Não pareceu haver nenhuma atividade detectável sobre monati-na R,R. Entretanto, espera-se que os métodos aleatórios ou SDM nesta par-te (3) deste Exemplo possam ser utilizados para aperfeiçoar a atividade detransaminação sobre monatina R,R ou R-MP. Por exemplo, a cristalização eanálise preliminar da enzima de P. stutzeriforam realizadas. Kongsaeree, P.,et ai, Acta Cryst. D53953-954, (2003). Uma vez que a estrutura é publica-da, experimentos de ancoragem podem ser realizados utilizando o software,tal como, Accelrys, para determinar quando os congestionamentos estéricosou repulsão iônica podem impedir que a monatina R,R se ligue ao sítio deligação de substrato de D-hidroxifenilglicina. D-hidroxifenilglicina é aminoáci-do um tanto grande, conforme monatina R,R. Ambos os compostos possuemregiões hidrofóbicas e grupo hidroxila. Modificações podem ser feitas na bol-sa de ligação, como descrito no Exemplo 6, para tornar a enzima mais re-ceptível a substratos de ácido dicarboxílico. Por exemplo, um resíduo próxi-mo do segundo grupo carboxila pode ser modificado para uma base, tal co-mo, arginina. Adicionalmente, o gene P. putida descrito na parte (1) e os ge-nes adicionais que podem ser isolados como descrito em (2) podem ser u-sados como modelos para embaralhamento de gene. Adicionalmente, o ge-ne P. stutzeri montado neste Exemplo pode ser mutagenizado utilizandoembaralhamento de oligonucleotídeo ou outros métodos de mutagenêse a-leatórios, e separado como descrito em (3) acima.

Exemplo 11

Descoberta de um Gene de D-Metionina Aminotransferase

Antecedentes

D-metionina-piruvato aminotransferase (EC 2.6.1.41) é conside-rada outro exemplo, embora raro, de uma transaminase de estereoinversão.

Esta enzima catalisa a conversão reversível de D-metionina e piruvato emL-alanina e 4-metiltio-2-oxobutanoato. Oxaloacetato, fenilpiruvato, 2-oxobuti-rato, 2-oxovalerato, 2-oxoeptanoato, glioxilato, e oxoglutarato também po-dem servir como aceitadores de amino.

A transaminação de D ou L metionina é considerada parte deuma via para produção de etileno em plantas superiores (couve-flor, tomate,maçã, caule de ervilha, banana, amendoim), bem como em microorganismosdo solo {Escherichia coli, Pseudomonas pisi, Pseudomonas aeruginosa, Ba-cillus mycoides, Acinetobacter calcoaceticus, Aeromonas hydrophila B12E,Rhizobium trifolii N2P7, Penicillium digitatum, Saccharomyces cerevisiae,Corynebacterium D7F). Billington, D.C., et ai, Biochem J. 782:827-836,(1978). Em bactérias, L-metionina é tipicamente usada como o substrato nosestudos de produção de etileno e enzimas de ampla especificidade, tais co-mo, TyrB ou AspC de E coli são considerados responsáveis pela transami-nação. Entretanto, Primrose, S.B., J. Gen. Microbiol. 95:159-65, (1976) ePrimrose, S.B., J. Gen. Microbiol. 98:519-528, (1977) mostrou que a cepa E.coli SPA O (University of Warwick culture collection) produziu quase tantoetileno de D-metionina quanto de L-metionina em culturas de lote. Devido aofato de nenhuma D-aminotransferase de ampla especificidade ter sido identi-ficada em E. coli, uma possível explicação poderia ser que a D-aminoácidodesidrogenase E. coli (codificada pelo gene dadA) converte a D-metioninaem 4-metiltio-2-oxobutanoato. Também é possível que haja uma metioninaracemase em E. coli; entretanto, nenhuma tal enzima foi descrita na literatra.

Ao contrário de E. coli, em pequenas flores de couve-flor (prepa-rações de extrato mitocondrial) a produção de sementes de amendoim ger-minantes foi maior quando D-metionina e piruvato foram fornecidos ao extra-to de enzima como comparado com L-metionina e piruvato. Mapson, L.W., eta/., Biochem J. 7 75:653-661, (1969); Durham, J.I., et ai, Phytochemistry72:2123-2126, (1973). Portanto, a possibilidade de uma combinação de me-tionina racemase e uma L-aminotransferase não é sustentada pelos dados.A atividade de desidrogenase foi excluída por diálise de extratos celulares decouve-flor; nenhum NAD estava presente nas misturas de análise. A ativida-de de oxidase foi orientada visto que nenhum consumo de oxigênio foi ob-servado e não houve exigência de FAD. A D-metionina aminotransferase detecidos de amendoim foi purificada, se mostrou dependente sobre PLP, e semostrou independente de atividade de L-metionina aminotransferase. Háuma possibilidade que estas D-metionina-piruvato aminotransferases real-mente produzam D-alanina como um subproduto (similar às enzimas de Ba-cillus descritas nos Exemplos 2 e 3) e que as células contenham alanina ra-cemase para reciclar a D-alanina novamente para L-alanina (ou um doadorde amino análogo). Em cada caso, a descoberta da D-aminotransferase deampla especificidade de plantas superiores é vantajosa para o desenvolvi-mento de processos que produzem monatina R,R ou monatina S,R.

Síntese Experimental

A D-metionina aminotransferase é parcialmente purificada a par-tir de pequenas flores de couve-flor e embriões de amendoim germinantesutilizando protocolos de cromatografia padrão e um sistema Pharmacia AK-TA Explorer. As seqüências de proteína de proteínas homólogas são deter-minadas por técnicas de impressão digital por LC/MS/MS e pesquisa debancos de dados realizada por aparelho Harvard Microchemistry. As regiõesde codificação dos genes de planta são clonadas a partir de uma bibliotecade cDNA utilizando protocolos de PCR padrão ou por síntese do gene comodescrito no Exemplo 10(7).

Alternativamente, as bibliotecas de expressão de cDNA são cons-truídas (Stratagene, La Jolla, CA) a partir de tecido de couve-flor ou semen-tes de amendoim desenvolvidas na presença de D-metionina (e produção deetileno). As bibliotecas são transformadas em auxotrofos de metionina E. colia partir de E. coli Genetic Stock Center (Yale) tais como, cepas RC519 ouAB1931. Os plasmídeos de cepas capazes de se desenvolver sobre meiomínimo que contém D-metionina contêm a região de codificação de interes-se (veja, Exemplo 4( 1), uma técnica de triagem análoga).

Uma vez que as regiões de codificação de interesse são obtidase são expressas em uma cepa de laboratório E. coli padrão, os produtos degene resultantes podem ser usados em análises para produzir monatinaR,R, como descrito no Exemplo 10(3), em vez da D-hidroxifenilglicina amino-transferase, com a exceção de que o pH é 7,5 (o pH ótimo para a amino-transferase). Se a D-metionina aminotransferase possuir uma exigência es-trita de substratos doadores de D-aminoácido, a enzima pode ser usada pa-ra formar monatina R,R como descrito no Exemplo 2 e 3. O gene pode sermutagenizado e separado para atividade aperfeiçoada como descrito no E-xemplo10(3).Métodos

Isolamento de Couve-flor

Quatrocentos gramas de pequenas flores de couve-flor recente-mente colhidas são extraídos com 400 ml_ de uma solução de sacaro-se/tampão a 4-C (0,4 M de sacarose e 0,1 M de tampão fosfato de sódio pH7,4) alternando enxágüe e mistura utilizando um misturador. Os resíduoscelulares são removidos por filtração com gaze de algodão e a solução re-sultante é centrifugada a 40.000 x g durante 30 minutos a 4QC. O materialsólido (que contém organelas mitocondriais) é ressuspenso em 20 mL de 10mM de tampão fosfato de sódio pH 7,4 e as enzimas são extraídas com 200mL de acetona fria (-309C). A suspensão é recentrifugada e o precipitado éseco utilizando um Savant Speed Vac. O material sólido é dissolvido em 10mM de tampão fosfato de sódio pH 7,4 e a acetona residual é removida utili-zando uma coluna PD-10.

A atividade de aminotransferase é analisada por incubação dapreparação de enzima com 5 mM de D-metionina, 1 mM de piruvato, 0,05mM de PLP e 2 mM de EDTA em 0,1 M de tampão fosfato de sódio pH 7,4.As análises são realizadas a 259C durante 16 horas. O 4-metiltio-2-oxobu-tanoato é medido por formação do derivado de 2,4-dinitrofenilidrazona, utili-zando LC/MSl (m/z de 328) e metodologia similar descrita no Exemplo 1.Uma solução de 0,4% (p/v) de 2,4-dinitrofenilidrazina em 2M de ácido sulfú-rico é preparada e um meio volume é adicionado à mistura de análise após aincubação. A mistura é misturada com agitação suave a 309C durante 30minutos e o precipitado é coletado por centrifugação e analisado por LC/MS.

As frações de proteína separadas por técnicas cromatográficas padrão sãoanalisadas para atividade de maneira similar, porém o co-produto alanina émedido pela técnica de derivatização pós-coluna OPA descrita no Exemplo 1.Isolamento de Amendoim ÍArachia hypoqea L cv. Starr)

A enzima D-metionina aminotransferase de embrião de amendo-im germinante homogeneizado (menos os cotilédones) é purificada de acor-do com o método de Durham, J.I., et ai, Phytochemistry 12:2123-2126,(1973). Os agentes de redução são usados durante a preparação de extra-tos brutos para estabilizar as enzimas e os resíduos celulares são removidospor centrifugação a 33.000 x g. Uma fração de sulfato de amônio de 35 a50% é adicionalmente purificada por incubação em baixa temperatura e porremoção das proteínas no precipitado. O sobrenadante é adicionalmentefracionado utilizando acetona. Os grupos ativos são então adicionalmentepurificados por cromatografia de filtração em gel (Sephadex 200 G.E. Heal-thcare, Piscataway, NJ).

Visto que as frações de proteína se tornaram enriquecidas coma proteína de transaminase, eletroforese 2D em gel é utilizada para separara enzima de interesse para microseqüenciamento. Após elucidação de regi-ões de codificação homólogas em seqüências de planta depositadas emNCBI, a proteína D-aminotransferase é produzida de forma recombinante emEscherichia coli utilizando técnicas de biologia molecular padrão. Espera-seque os extratos celulares de pequenas flores de couve-flor ou sementes deamendoim ou enzimas homólogas recombinantemente produzidas possamser usados na produção de monatina R,R como descrito no Exemplo 10(3)(se for uma transaminase de estereoinversão) ou Exemplos 2 e 3 (se foruma D-aminotransferase de ampla especificidade).

Exemplo 12

L-Alanina Aminotransferase/Alanina Racemase/D-Alanina Aminotransferase

A Figura 8 ilustra a via biossintética para a produção de monatinaR,R estereoisomericamente enriquecida de L-triptofano utilizando L-amino-ácido aminotransferases (tais como, L-aminotransferases aromáticas, L-ala-nina-aminotransferases e/ou L-triptofano-aminotransferases), uma aldolase

R-específica, uma alanina racemase e uma D-alanina aminotransferase.

Uma aminotransferase específica de triptofano é descrita no E-xemplo 6. Alternativamente, tirosina aminotransferases (aromáticas) S. meli-loti e R. sphaeroides são preparadas como descrito no Exemplo 1 de WO03/091396 A2. Aldolase ProA Comamonas testosteroni é preparada comodescrito no Exemplo 4 de WO 03/091396 A2. As análises totais de proteínasão feitas utilizando Bio-Rad Protein Assay de acordo com os protocolos dofabricante (Hercules, CA). A alanina racemase é adquirida junto a Sigma (St.Louis, MO) (número de catálogo A8936). D-alanina aminotransferase é adqui-rida junto a BioCatalytics (Pasadena, CA) (número de catálogo AT-103).

L-alanina aminotransferases são amplamente distribuídas emeucariotos, bactéria, e arqueobactéria. Os seguintes organismos foram iden-tificados (baseados na homologia de seqüência) como contendo uma L-ala-nina aminotransferase (EC 2.6.1.2): Arabidopsis thaliana, Ashbya gossypii,Azotobacter vinelandii, Bifidobacterium longum, Caenorhabditis elegans,Cândida albicans, Cândida glabrata, Chlamydomonas reinhardtii, Cryptococ-cus neoformans, Debaryomyces hansenii, Homo sapiens, Hordeum vulgare,Kluyveromyces lactis, Magnaporthe grisea, Medicago truncatula, Mus mus-culus, Neurospora crassa, Oryza sativa, Phanerochaete chrysosporium, Pi-nus taeda, Pseudomonas putida, Pyrococcus abyssi, Pyrococcus furiosus,Pyrococcus horikoshii, Rattus non/egicus, Saccharomyces cerevisiae, Schi-zosaccharomyces pombe, Takifugu rubripes, Trypanosoma cruzi, Vibrio cho-lerae, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus, Yarrowia lipolytica, e Zeamays. Adicionalmente, muitas aminotransferases possuem atividade de ala-nina aminotransferase de baixo nível e dados altos níveis de L-glutamato epiruvato podem converter estas em L-alanina e cc-cetoglutarato. Uma enzimacom baixa atividade é aperfeiçoada com técnicas de mutagênese padrão,tais como, PCR passível de erro e passagem através de cepas mutagênicas,ou por técnicas de evolução dirigida. O gene de uma L-alanina aminotransfe-rase é clonado utilizando seqüências publicamente disponíveis para dese-nhar iniciadores e utilizando técnicas padrão para amplificar, clonar, expres-sar e purificar o gene/enzima.

As misturas de reação (1 mL de volume, realizadas em duplica-ta) contêm 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 8), 2 mM de MgCI2,0,05 mM de fosfato piridoxal 5' ("PLP"), 200 mM de piruvato de sódio, 5 mMde a-cetoglutarato, aproximadamente 280 ug/mL de TatA S. meliloti forneci-dos em um extrato celular (ou outra L-triptofano aminotransferase específica)(como no Exemplo 4 seção (5), 100 |ig de uma L-alanina aminotransferase,100 uL/mL de extrato celular alanina racemase ou 1 mg/mL de alanina ra-cemase purificada (Sigma), aproximadamente 280 ug/mL de uma D-alaninaaminotransferase de ampla especificidade fornecidos em um extrato celular(Exemplos 15 e 18 possuem exemplos de D-aminotransferases que poderi-am trabalhar nesta reação) e aproximadamente 100 ug/mL de aldolase ProAproporcionados como um extrato celular. O triptofano sólido é adicionado emuma concentração de 10,2 mg/ml. Os controles negativos são preparadossem alanina racemase. As amostras são incubadas a 309C com agitaçãosuave durante ~1 hora ou duante a noite. As amostras são centrifugadaspara remover o precipitado, filtradas por seringa, e armazenadas a -809Cantes da análise de monatina utilizando o método de LC/MS/MS descrito no

Exemplo 1.

Exemplo 13

Purificação de Monatina R.R a partir de uma Mistura de Reação Enzimática

O produto, monatina R,R, foi purificado a partir da seguinte mis-tura de reação. Em 0,33 litro, 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 8,2, 4mM de MgCI2, 0,05 mM de fosfato piridoxal ("PLP"), 200 mM de piruvato desódio, e 50 mM de D-triptofano foram misturados em temperatura ambienteem uma garrafa de vidro de 500 ml_ até o triptofano ser dissolvido. O líquidofoi ruborizado com nitrogênio durante diversos minutos e então 3,0 mg/mLde D-transaminase de ampla faixa Biocatalytics, Inc. (Pasadena, CA) (catá-logo # AT-103) e 0,1 mg/mL de aldolase purificada de SEQ ID NO:22 foi adi-cionado. A mistura de reação foi suavemente agitada em temperatura ambi-ente. A aldolase foi purificada como descrito no Exemplo 3. As alíquotas adi-cionais de 50 mM de D-triptofano foram adicionadas como um sólido, 15 ho-ras e 22 horas após a mistura ser inicialmente preparada. O volume superior(head space) foi lavado com nitrogênio após cada adição. O triptofano totaladicionado não foi dissolvido, porém a concentração foi mantida em cerca de50 mM. Após 40 horas, o triptofano sólido restante foi filtrado. A análise damistura de reação por cromatografia líquida e detecção por fluorescênciapós coluna (ver Exemplo 1) mostrou que a concentração de triptofano nasolução era 49 mM e a concentração de monatina era 3,9 mM.

O produto de monatina foi purificado utilizando duas etapas decromatografia de troca. A solução de reação filtrada foi, primeiramente, apli-cada a uma coluna de resina BioRad AG50W-X8 (140 ml_; capacidade deligação de .1,7 meq/mL). A coluna foi lavada com 2 x 150 mL de H20 e entãoeluída com 1 M de NH4OH (1 x 450 mL, seguida por 3 x 150 mL). As fraçõesde NH4OH foram combinadas, neutralizadas com HCI e sucessivamente fil-tradas através de filtros de microfibra de vidro Whatman (Maidstone, En-gland) e Gelman Sciences (Ann Arbor, Ml) filtros de 0,45 um. A solução clari-ficada foi então ultrafiltrada utilizando uma célula agitada de ultrafiltraçãoAmicon (Millipore; Billerica, MA) (Modelo 8200) com um YM100 (MWCO 100kDa). O filtrado da ultrafiltração foi evaporado em aproximadamente 160 mLutilizando um rotoevaporador com um banho de água morna. O líquido foinovamente clarificado por filtração através de filtros de microfibra de vidro.

A solução resultante foi aplicada a uma coluna 1 L Fast FlowDEAE Sepharose (Amersham Biosciences) anteriormente convertida na for-ma de bicarbonato por lavagem com 0,5 L 1 M de NaOH, H20, e 1,0 M debicarbonato de amônio, pH 8,3, seguido por uma lavagem adicional utilizan-do H20. A solução foi carregada em < 2 mLVmin e a coluna foi lavada comágua a 3 a 4 mL/min até a absorvência a 280 nm ser <1. A monatina R,R foieluída com 50 mM de bicarbonato de amônio, pH 8,3 (2,5 L). Esta fração foievaporada utilizando um rotoevaporador com um banho de água morna. Oxarope resultante foi incubado a 4QC durante diversos dias até cristais seformarem. Os cristais foram coletados, lavados com 100% de etanol frio esecos em um dessecador a vácuo (0,38 g).

A análise do produto sólido de pureza isomérica que utiliza deriva-tização de FDAA, seguida por monitoramento de reação múltipla LC/MS/MS,(veja Exemplo 1) mostrou que a amostra era 96,3% de monatina R,R e 3,7%de monatina S,R.

A amostra também foi analisada para pureza com relação a ou-tros compostos orgânicos que utilizam o método de monatina total (veja E-xemplo 1). A absorção de UV foi examinada de 200 a 500 nm utilizando umdetector de Arranjo de Fotodiodo. Baseado nas áreas pico integradas, a mo-natina é responsável por 96,1% da área (inclusive tanto picos R,R comoS,R).A análise da amostra por cromatografia líquida e detecção defluorescência pós-coluna mostrou que a composição de aminoácido da a-mostra era 98,8% de monatina com quantidades traço de triptofano (1,2%) ealanina (0,02%).

A análise elementar foi realizada em Midwest Microlab, LLC (In-dianapolis, IN). Esta análise indicou que a amostra continha 1% de materialnão-combustível (inorgânico) por peso, e resíduos de amônio e bicarbonato.

Exemplo 14

Aperfeiçoamento de Retenção de Atividade de D-Aminotransferase Durantea Purificação

Procedimento Padrão para a Purificação de H/Sç-D-alaniria Aminotransfera-se B. sphaericus

Partindo de uma placa de cultura fresca (LB ágar com 50 ng/ml_ decanamicina) de BL21(DE3)::B. sphaericus dat pET30a (Exemplo 18), as célulasse desenvolveram em 5 mL de caldo Luria-Bertani ("LB") com 50 |j.g/ml decanamicina, a 37°C e 225 rpm durante 3 a 5 horas. Subseqüentemente, acultura foi transferida a 0,25% (v/v) para frascos que contêm soluções 1-6 deNovagen Durante a noite Express System II (EMD Bioscience, Madison, Wl)mais 50 |ig/ml_ de canamicina. As células se desenvolveram a 379C e 225rpm durante a noite (16 a 18 horas). Quando OD6oo era aproximadamente8,0, as células foram colhidas por centrifugação em uma centrífuga Beckman(Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16,25 a 10.000 rpm durante 10 minu-tos. O pélete de célula foi lavado com 50 mM EPPS de tampão frio (pH 8,2),e as células foram the centrifugadas novamente. O pélete de célula lavadofoi colhido e usado imediatamente ou congelado a -80°C até necessário pa-ra purificação.

Para preparar o extrato livre de células que contém a proteínaHISe-D-alanina aminotransferase B. sphaericus (HIS6-BsphDAT), as célulasforam suspensas em 3 a 4 volumes de 50 mM de EPPS, pH 8,2 e então di-vididas utilizando um homogeneizador Microfluidics (Newton, MA) (3 passesa 138.000 Kpa (20.000 psi)), mantendo a temperatura da suspensão abaixode 159C. Todas as etapas de purificação subseqüentes foram realizadas a49C. O extrato celular foi centrifugado durante 15 minutos a 15.000 x g pararemover os resíduos celulares. O sobrenadante foi decantado e usado ime-diatamente ou congelado a -809C. Uma alíquota do extrato livre de célulasfoi aplicada tanto em colunas HIS-Bind Novagen (catálogo # 70971-4) comoem uma coluna de resina Chelating Sepharose® Fast Flow GE Healthcare(Piscataway, NJ) (forma de níquel (II)) (em uma proporção de 1,2 a 1,5 v/v)que foi anteriormente equilibrada com 50 mM de EPPS, pH 8,2, que contém200 mM de cloreto de sódio. Após carregar a amostra, a coluna foi sucessi-vamente lavada/eluída com 3 a 5 volumes do tampão de equilíbrio, 3 a 5volumes do tampão de equilíbrio que contém 25 mM e imidazol, 3 a 5 volu-mes do tampão de equilíbrio que contém 100 mM de imidazol e 3 a 5 volu-mes do tampão de equilíbrio que contém 500 mM de imidazol. A proteínaHIS6-BsphDAT foi eluída na última semana. A lavagem de 500 mM de imi-dazol foi concentrada 2 - 10X com dispositivos de filtro centrífugo Centricon-70 ou Ultra-15 Amicon (Billerica, MA) (MWCO 10 kDa). O imidazol e cloretode sódio foram removidos por passagem através de colunas de dessaliniza-ção descartáveis GE Healthcare PD10 anteriormente equilibradas com 50mM de EPPS, pH 8,2, que contém 50 nM de PLP.

A concentração de proteína da solução dessalinizada foi deter-minada utilizando o kit de análise Pierce BCA (Rockford, IL). A pureza decada fração e o nível de expressão na fração de extrato livre de células fo-ram determinados utilizando um sistema de chip microcapilar ExperionPro260 Bio-Rad (Hercules, CA) ou por SDS-PAGE com 4 a 15% de géis degradiente. Tipicamente, este procedimento produz mais de 300 mg de enzi-ma (de 600 ml_ de cultura Durante a noite Express II que é -90% pura comojulgado pelo software Experion. As alíquotas (1-5 ml_) da enzima purificadaforam armazenadas a -80°C até o uso.

Procedimento Aperfeiçoado

O extrato livre de células foi preparado como descrito acima. Aproteína His6-BsphDAT foi similarmente purificada com as seguintes altera-ções: todos os tampões usados para divisão de célula e purificação de prote-ína continham 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8, com 50 jjJVI de PLP. Aproteína foi purificada exclusivamente com resina Chelating SepharoseFast Flow GE Healthcare (forma de níquel (II)).

Análise de Atividade

A formação de indol-3-piruvato e alanina a partir de triptofano epiruvato foi analisada utilizando a enzima preparada por ambos procedimen-tos de purificação. As misturas de reação continham 100 mM de fosfato depotássio, pH 7,8, 0,05 mM de fosfato piridoxal, 100 mM de piruvato de sódio,40 mM de D-triptofano, e 0,03 a 0,1 mg/mL de enzima purificada. O triptofa-no foi adicionado como um sólido. Todos os componentes exceto a enzimaforam misturados uns com os outros e incubados a 30°C até o triptofano serdissolvido. A enzima foi então adicionada e a solução de reação foi incubadaem temperatura ambiente. Em pontos tempo predeterminados, as reaçõesforam experimentadas e as amostras imediatamente armazenadas em geloe diluídas para análise de alanina pelo método de cromatografia líquida edetecção de fluorescência pós-coluna descrito no Exemplo 1. A Tabela 34abaixo lista a atividade específica das preparações de enzima como a con-centração de alanina formada por mg de enzima por minuto.

Tabela 34: Efeito de Procedimento de Purificação Aperfeiçoado sobre Atividade Enzimática

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Os resultados mostrados na Tabela 34 indicam que o uso defosfato piridoxal durante o processo de purificação resultou em uma ativida-de aumentada.

Exemplo 15

Clonagem de Duas Novas D-Aminoácido Aminotransferases Bacillus

Diversas D-Aminoácido Aminotransferases Bacillus (EC 2.6.1.21,também conhecidas como D-alanina aminotransferase ou D-aspartato ami-notransferase) foram produzidas de forma recombinante para uso em análi-se acopladas para a produção de monatina R,R, como descrito no Exemplo18. Estas enzimas são homólogas à D-aminotransferases anteriormentedescritas para a produção de monatina (Publicação No. U.S. 20040063175 ePublicação No. U.S. 2005282260). Uma abordagem usada para a seleçãode cepas que poderiam ser candidatas que contêm novas D-aminoácido a-minotransferases ("DAATs") era examinar a lista de cepas B. sphaericus de-positada em ATCC e analisar algumas que foram anteriormente depositadassob nomes de espécies diferentes. Os seguintes organismos foram ordena-dos a partir de ATCC: ATCC 4978 - Bacillus sphaericus originalmente depo-sitada como Bacillus rotans e ATCC 7063 - Bacillus sphaericus originalmen-te depositada como Bacillus serositidis e ATCC 21538 - Bacillus sphaericusoriginalmente depositada como Bacillus circulans. As seqüências de proteínaDAAT conhecidas de Bacillus sphaericus, Bacillus halodurans, Geobacillusstearothermophilus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, and Bacillus lichenifor-mis foram alinhadas para obter as regiões de seqüência que foram conser-vadas nas diversas proteínas DAAT. Os iniciadores foram designados nasregiões de conservação de seqüência de proteína e usados para amplifica-ção por reações em cadeia da polimerase ("PCR") de seqüências de geneDAAT das cepas ATCC mencionadas acima.

Cinco iniciadores de PCR foram designados baseados nas regi-ões conservadas em alinhamento de seqüências DAAT de Bacillus publica-das (veja alinhamento na Figura 9).Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram designados como mencionado acima ba-seados as regiões conservadas em um alinhamento de DAATs. As seqüên-cias de Iniciador de Oligonucleotídeo estão indicadas abaixo:

5' GAAGACCGTGGTTATCAATTT 3' (SEQ ID NO:65) (iniciador direto),

5' GATGGTATTTACGAAGTAATC 3' (SEQ ID NO:66) (iniciador direto),

5' AGATTTAATATCACAACGTAAC 3' (SEQ ID NO:67) (iniciador reverso),

5' GCCAAGTAAAATTTAAGATTTA 3'(SEQ ID NO:68) (iniciador reverso),

5' ATTTGCTGGGTGCGTATAAAG 3' (SEQ ID NO:69) (iniciador reverso).

Tamanhos esperados de fragmentos de PCR baseados no alinhamento decombinações de iniciador com DAATs conhecidas: SEQ ID NO:65 e SEQ IDNO:67 - aproximadamente 380 bp, SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:68 - apro-ximadamente 395 bp, SEQ ID NO:65 e SEQ ID NO:69 - aproximadamente534 bp, SEQ ID NO:66 e SEQ ID NO:67 - aproximadamente 336 bp, SEQ IDNO:66 e SEQ ID NO:68 - aproximadamente 346 bp, SEQ ID NO:66 e SEQID NO:69 - aproximadamente 510 bp.

As combinações dos iniciadores acima foram usadas para PCRde colônia a partir das seguintes cepas ATCC: ATCC 4978 -- Bacillus sphae-rícus, originalmente depositada como Bacillus rotans; ATCC 7063 -- Bacillussphaericus, originalmente depositada como Bacillus serositidis; e ATCC21538 - Bacillus sphaericus, originalmente depositada como Bacillus circulans.

As três cepas mencionadas acima se desenvolveram sobre ágarnutriente a 30-C. Uma única colônia foi separada das placas e resuspensaem 25 uL de água destilada estéril. As células foram lisadas a 969C durante10 minutos. A PCR foi realizada como se segue: por 50 uL de reação, 5 uLde células lisadas, 0,8 uL de cada iniciador, 2 uL de dNTPs, 0,8 uL de Poli-merase de Alta Fidelidade Expand (Roche, Indianapolis, IN) e 1X tampãoExpand® foram adicionados. Uma partida quente de 3 minutos foi realizada a94eC, seguida por 15 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 40°C durante 45segundos, e 72°C durante 2 minutos. Mais quinze ciclos foram realizadoscom uma temperatura de anelamento aumentada de 45°C. Por fim, uma e-tapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 72°C. Di-versas combinações de iniciador forneceram tamanhos de produto de PCResperados para as cepas acima. Os produtos de PCR foram clonados utili-zando o kit de clonagem Zero Blunt TOPO® conforme os protocolos do fabri-cante (Invitrogen) e seqüenciados por seqüenciamento de DNA de termina-ção em cadeia de didesóxi em Agencourt BioScience Corporation (Beverly,MA). As seqüências tanto no nível de DNA como aminoácido foram alinha-das com a seqüência de DAAT B. sphaericus. As seqüências de DAAT/DATválidas foram obtidas a partir de todas as três cepas, ATCC 4978, ATCC7063 e ATCC 21538. Duas cepas específicas, ATCC 4978 e ATCC 7063forneceram produtos de PCR que quando traduzidos produziram seqüênciasde proteína com alterações de resíduo de aminoácido distintas quando com-parados com a seqüência de D-aminotransferase B. sphaericus.

Genome walking foi realizado para obter as seqüências de genecompletas para as cepas ATCC 4978 e ATCC 7063. A cepa ATCC 4978 sedesenvolveu em caldo nutriente a 30°C. A cepa ATCC 7063 se desenvolveuem ágar nutriente. O DNA genômico foi preparado a partir de cada cepa uti-lizando o Kit Gentra (Gentra Systems, Minneapolis, MN) conforme os proto-colos do fabricante. Quatro bibliotecas foram construídas para cada cepaconforme os protocolos do fabricante (BD GenomeWalker® Universal Kit,Clontech, www.Clontech.com). Os iniciadores específicos de gene foramdesignados como os protocolos do fabricante GenomeWalker® baseados emseqüências obtidas utilizando combinações de iniciador conservadas (vejaacima), permitindo que algumas centenas de pares de base homólogos seforam subseqüentemente usados com iniciadores adaptadores GenomeWal-ker® para PCR de seqüências a montante e a jusante para completar DATORFS.

As seqüências de iniciador de oligonucleotídeo específico degene estão indicadas abaixo:

4978 DAT GSP1 a montante 5' GACATGCTCCTCCGCTGTAAATAATTCACC 3'(SEQ ID NO:70)

4978 DAT GSP1 a jusante 5' CCCTGGTGATGAAGTGAAGCCAGTATTAAC 3'(SEQIDNO:71)

4978 DAT GSP2 a montante 5' ATCGCCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3' (SEQID NO:72)

4978 DAT GSP2 a jusante 5' ACGTCCCGTAGCAAACTTTGAAAAAGGTGT 3'(SEQ ID NO:73)

7063 DAT GSP1 a montante 5' TGCATAGAATCGGTCGATATGTTCAGTAGC 3'(SEQ ID NO:74)

7063 DAT GSP1 a jusante 5' GCGGAGAAACGATTACAGAAGGTTCTTCAA 3'(SEQ ID NO:75)

7063 DAT GSP2 a montante 5' GTCACCAAATTGATAACCACGGTCTTC 3' (SEQID NO:76)

7063 DAT GSP2 A jusante 5' GGTGTACTTTATACGCACCCAGCAAAT 3' (SEQ IDNO:77)

Seqüências de iniciador de oligonucleotídeo adaptador:

AP1 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3' (SEQ ID NO:78)

AP2 5' ACTATAGGGCACGCGTGGT 3' (SEQ ID NO:79)

As PCRs primárias GenomeWalker® foram realizadas como sesegue: por 50 uL de reação, 2,5 uL de biblioteca de DNA, 2 uL de cada inici-ador (AP1 (SEQ ID NO:78) e o GSP1 apropriado), 1,5 uL de dNTPs, 1X XLde tampão de PCR, 1 mM de acetato de magnésio, e 1 uL de polimeraseRTTH (Roche, Indianapolis, IN) foram adicionados. Uma partida a quente de 3minutos foi realizada a 94QC, seguida por 10 ciclos de 94°C durante 30 se-gundos, 55°C durante 30 segundos, e 68°C durante 1 minuto. Mais vinte ci-clos foram realizados com uma temperatura de anelamento reduzida de48°C. Por fim, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante seteminutos a 68°C. As PCRs secundárias Genome Walker® foram realizadascomo se segue: por 50 uL de reação, 1,0 uL (de uma diluição de 1:50) dareação de PCR primária, 2 uL de cada iniciador (AP2 (SEQ ID NO:79) e oGSP2 apropriado), 1,5 uL de dNTPs, 1X XL de tampão PCR, 1 mM de ace-tato de magnésio, e 1 uL de polimerase RT™ foram adicionados. Uma parti-da a quente de 3 minutos foi realizada a 94eC, seguida por 10 ciclos de 94°Cdurante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, e 68°C durante 1 minuto.Mais quinze ciclos foram realizados com uma temperatura de anelamentoreduzida de 48°C. Por fim, uma etapa de extensão de cadeia foi realizadadurante sete minutos a 68°C.

Diversas bibliotecas forneceram produtos de PCR que variam detamanho de -200 bp a ~1,5 Kb. Os produtos de PCR foram clonados TOPO(como acima) e seqüenciados por seqüenciamento de DNA de terminaçãode cadeia de didesóxi em Agencourt BioScience Corporation (Beverly, MA);estas novas seqüências foram alinhadas com seqüências iniciais obtidasutilizando combinações de iniciador conservadas e códons de iniciação eterminação foram identificados. Desta maneira, ORFs completos de DAATforem obtidos. Novos pares de iniciador foram designados (com sítios derestrição para clonagem) baseados nas seqüências de DAAT completa es-pecífica em PCR o gene DAAT total de cepas ATCC 4978 e 7063 individualmente.

As Seqüências de Iniciador de Oligonucleotídeo estão indicadasabaixo:

ATCC4978DAATNde1 F 5' GGCCTTGGCATATGAGTTATAGCTTATGGAATGACC3' (SEQ ID NO:80)

ATCC4978DAATBamH1R 5' GGCCTTAAGGATCCTTATGCGCGAATACCTTTTGGG3'(SEQIDNO:81)

ATCC7063DAATNde1F 5' GGCCTTGGCATATGAGCTACACTTTATGGAATGA 3'(SEQ ID NO:82)

ATCC7063DAATBamH1R2a 5' GGCCAAGGATCCGCTACCCACTAATCATTAGA3'(SEQ ID NO:83)

As regiões de codificação dos genes DAAT ATCC 4978 e ATCC7063 foram amplificadas utilizando o seguinte protocolo de PCR. Em umareação de 50 uL, 3 illL de DNA genômico, 0,8 uL de cada iniciador, 2 uL dedNTPs, 0,8 uL de Polimerase de Alta Fidelidade Expand (Roche, Indianapo-lis, IN), 1X tampão Expand® com Mg, e 0,2 uL de polimerase Pfu (Stratage-ne, La Jolla, CA) foram adicionados. O programa thermocycler usado incluiuuma partida a quente 94°C durante 3 minutos, seguido por 8 repetições dasseguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 50°C durante 30 segundos, e72°C durante 90 segundos. Vinte e dois ciclos subseqüentes foram realiza-dos com uma temperatura de anelamento de 58°C. Por fim, uma etapa deextensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 72°C. Os produtosde PCR puros do tamanho correto (aproximadamente 850 bp) foram obtidose ambas as cepas.

Os produtos de PCR de genes DAAT ATCC 4978 e ATCC 7063foram purificados utilizando o kit de purificação por PCR Qiagen QIAquick(Valencia, CA), e digeridos com Nde\ e BamH\ em tampão BamH\ (New En-gland Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores digeridos Nde\ e BamH\ (pET28 epET30) e inserto foram purificados utilizando o Kit de Extração por Gel Qia-gen QIAquick. As ligações foram feitas utilizando o Kit de Ligação Rápida deDNA Roche (Roche) e purificadas utilizando o kit de purificação por PCRQIAquick. As ligações foram transformadas em DH10B Escherichia coli utili-zando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad Gene Pulser II comodescrito no manual de eletroporação Bio-Rad. As células foram permitidaspara se recuperar em 900 \± de meio SOC durante 30 minutos a 37°C a 225rpm. As células foram semeadas sobre placas ágar LB que contêm canami-cina (50 |ng/mL). O DNA de plasmídeo foi purificado utilizando o kit spin mi-niprep Qiagen e separado nos insertos corretos por PCR e digestão por res-trição com Nde\ e BamHl. As seqüências de plasmídeos que parecerampossuir o inserto correto foram verificadas por seqüenciamento de DNA determinação de cadeia didesóxi em Agencourt BioScience Corporation (Be-verly, MA). As análises de seqüência verificaram a seqüência de codificaçãode genes DAAT a partir de ATCC 4978 e ATCC 7063, estas produziram asseqüências de DNA de SEQ ID NO:84 (seqüência de DNA DAAT ATCC4978) e SEQ ID NO:85 (seqüência de DNA de ATCC 7063 DAAT) e a se-qüência de aminoácido de SEQ ID NO:86 (seqüência de aminoácido DAATATCC 4978) e SEQ ID NO:87 (seqüência de aminoácido DAAT ATCC 7063).

Os alinhamentos das novas DAATs de ATCC 4978 e ATCC7063 com a DAAT B. sphaericus (clonada no Exemplo 18) são mostrados naFigura 10.

Foram obtidas novas D-aminotransferases a partir de cepasATCC 4978 e ATCC 7063 com seqüências de proteína que possuem alteraçõesde resíduo de aminoácido distintas quando comparadas com a D-aminotrans-ferase B. sphaericus. As DAATs de ATCC 4978 e ATCC 7063 possuem a-penas 72% e 67% identidade com a DAAT de B. sphaericus (ATCC 10208).Embora ambas as cepas estejam atualmente listadas como B. sphaericus noATCC, estas foram depositadas como B. rotans e B. serositidis. Baseadonos alinhamentos de seqüência e nas diferenças sublinhadas entre estasduas novas DAATs e a DAAT de B. sphaericus, inúmeros resíduos candida-tes que são identificados podem ser avaliados por sua função (individual-mente ou em combinação) no aumento de atividade de DAAT para biossín-tese de monatina R,R, nestas, bem como outras seqüências de DAAT.

Exemplo 16

Expressão Genética e Análises de Proteínas DAAT ATCC 4978 e ATCC 7063

As novas DAATs de ATCC 4987 e ATCC 7063, como descritono Exemplo 15, (em vetores pET) foram transformadas no hospedeiro deexpressão BL21(DE3) E. coli expression (Novagen, Madison, Wl). As cultu-ras se desenvolveram utilizando os protocolos descritos acima e os plasmí-deos foram isolados utilizando o kit de minipreparação Qiagen e analisadospor digestão por restrição, como descrito acima, para confirmar a identidadede plasmídeo.

A indução do gene DAAT foi tipicamente realizada em meio LBque contém canamicina (50 ug/mL). As células se desenvolveram em umOD6oo de 0,4-0,8 a 37QC, induzidas com 0,1 mM de IPTG (tiogalacatosida deisopropila) e experimentadas em 3 a 4 horas após a indução. Os extratoscelulares foram preparados de acordo com o protocolo que acompanha oreagente Novagen BugBuster® (com benzonase nuclease e coquetel de ini-bidor de protease completo Roche adicionados). As proteínas solúveis foramobtidas no peso molecular previsto, como julgado por SDS-PAGE, tanto paraprodutos de gene ATCC 4978 como ATCC 7063 em vetores pET. Níveismais altos de proteína solúvel foram observados utilizando construções semmarcadores His (pET 30). As proteínas solúveis nos extratos celulares foramseparadas sobre uma Estação de Eletroforese Automática BioRad Laborato-ries Experion (Hercules, CA) e analisadas para concentração e porcentagemde expressão utilizando o Software Experion versão 1.1.98.0.

Os extratos de proteína de células com construções não-marcadas(pET30) foram analisados para atividade de D-aminotransferase seguindo aprodução de alanina a partir de piruvato e D-triptofano (ou monatina R,R)utilizando o seguinte protocolo. As reações em duplicata de 500 uL foram,salvo especificação em contrário abaixo, realizadas em 100 mM de tampãofosfato de potássio (pH 7,5), 80 uM de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvatode sódio, e 50 mM de D-triptofano ou monatina R,R. As reações foram inici-adas através da adição de extratos livres de células (4978 ou 7063) ou en-zima purificada (B. sphaericus) e foram incubadas 15 minutos a 2 horas a309C, com leve agitação. Aproximadamente o mesmo nível de proteína totalfoi adicionado (1,0 mg), salvo especificação em contrário abaixo, em cadaanálise para propósitos comparativos. A aminotransferase purificada de B.sphaericus (ATCC número 10208) foi usada como uma enzima comparativa.Ácido fórmico foi adicionado a uma concentração final de dois porcento parainterromper a reação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação.As reações de controle sem proteína adicionada também foram realizadas.Alanina foi detectada utilizando derivatização OPA como descrito no Exem-pio 1. A média dos resultados das reações em duplicata é mostrada nas Ta-belas 35 e 36 abaixo.

Tabela 35: Atividade de Transaminação de D-Aminotransferases de ATCC4978 e ATCC 7063 (15 min)

<table>table see original document page 142</column></row><table>

Tabela 36: Atividade de Transaminação de D-Aminotransferases de ATCC4978 e ATCC 7063 (2 Horas)

<table>table see original document page 142</column></row><table>

Desta maneira, foi mostrado que D-aminoácido aminotransfera-ses de ATCC 4978 e ATCC 7063, de fato, possuíam atividade de D-aminotransferase e possuem a capacidade de formar monatina R,R. A ativi-dade da DAAT de ATCC 4978 era maior do que aquela observada em DAATde ATCC 7063. A comparação quantitative entre 4978 e B. sphaericus nãopôde ser feita uma vez que 4978 não foi purificado.Exemplo 17

Produção de Monatina R.R utilizando a DAAT de ATCC 4978

A aminotransferase de ATCC 4978 também foi testada para ca-pacidade de produzir monatina a partir de D-triptofano (como no Exemplo 3).

Os seguinte foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação: aproxima-damente 50 ug de aldolase (aldolase ProA C. testosteroni ou a aldolase deSEQ ID NO:22, purificada), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano (forneci-do como sólido), 1,0 mg de D-aminotransferase, 100 mM de piruvato de só-dio, 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, e 0,05 mM de PLP. Osexperimentos foram realizados em duplicata, com controles negativos ondenenhuma aminotransferase foi adicionada. As amostras foram incubadasdurante diversos períodos de tempo a 309C com agitação suave. Os únicosestereoisômeros detectados quando se produz monatina utilizando estesmétodos são R,R e S,R. A monatina total e porcentagem de monatina R,Rque foram detectadas como descrito no Exemplo 1 estão listadas nas Tabe-las 37 a 39 abaixo. Os resultados mostrados em cada uma das Tabelas 37 a39 é o valor médio de reações em duplicata.

Tabela 37: Comparação de D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC4978 para a Produção de Monatina

<table>table see original document page 143</column></row><table>Tabela 38: Comparação de D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC4978 para a Produção de Monatina

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Tabela 39: Comparação de D-Aminotransferases de B. sphaericus e ATCC4978 para a Produção de Monatina

<table>table see original document page 144</column></row><table>

Desta maneira, foi mostrado que a D-aminoácido aminotransfe-rase de ATCC 4978 possui a capacidade de formar monatina R,R. A ativida-de da DAAT de ATCC 4978, quando se compara a produção total de mona-tina em termos de mg de monatina por grama de proteína, era maior do queaquela observada em DAAT de B. sphaericus. O uso de uma aldolase R-específica de SEQ ID NO:22 aumentou claramente a porcentagem de mona-tina R,R formada em comparação com a quantidade de monatina total pro-duzida.

Exemplo 18

Clonagem de D-Aminoácido Aminotransferases Publicadas de Bacillus

Diversas D-aminoácido aminotransferases de Bacillus (EC 2.6.1.21,também conhecidas como D-alanina aminotransferase ou D-aspartato amino-transferase) foram produzidas de forma recombinante para uso em análisesacopladas para a produção de monatina R,R. Estas enzimas são homólogasàs D-aminotransferases anteriormente descritas para a produção de monati-na (Publicação No. U.S. 20040063175 e Publicação No. U.S. 2005282260).

Cepas

B. sphaericus (ATCC número 10208) e B. licheniformis (ATCC10716) se desenvolveram sobre Ágar Nutriente a 30°C durante a noite. Osgrupos de colônias foram colocados em 100 uL de água estéril e aquecidasdurante 5 minutos a 95°C, para dividir as células. Três uL foram usados emamplificações subseqüentes por Reação em Cadeia da Polimerase ("PCR").

O DNA genômico foi ordenado para B. halodurans (ATCC número BAA-125D) e ressuspenso em água a uma concentração de 100 ng/uL. O DNAgenômico de Bacillus cereus (ATCC números 1-987D e 14579D) foi ordena-do para clonagem também.

Protocolo de Reação em Cadeia da Polimerase

Os iniciadores foram designados pelo gene de B. sphaericus datpara clonagem em vetores pET 28b e pET 30a (Novagen, Madison, Wl), uti-lizando os sítios Nco\ e BamHl. A construção de pET30 contém um marca-dor His e marcador S N-terminal, enquanto a construção de pET 28 não émarcada.

Iniciadores de Bacillus sphaericus dat:

N term: 5'-GATATACCATGGCATACTCATTATGGAATG-3' (SEQ ID NO:88)e C term: 5'-GTTATCGGATCCTTAGGCATTAATTGAAATTG-3' (SEQ IDNO:89).

Os iniciadores de B. licheniformis e iniciadores de B. haloduransforam designados para clonagem em vetores pET 28b e pET 30a utilizandoos sítios Nde\ e BamHl. As construções de pET30 estavam não marcadasneste caso, enquanto que as construções de pET 28 contêm um pequenomarcador his N-terminal.

Iniciadores de B. licheniformis dat:

N term 5'-GGCCGGTTCATATGAAAGTTC I I I I IAACGGC (SEQ ID NO:90)e C term: 5'- CCTTCCGGATCCTTAAACCGTTTTGGCTGTCT-3' (SEQ IDNO:91)Iniciadores de B. halodurans:

N term 5'-GATATACATATGGATTATTGCCTTTACCAA-3' (SEQ ID NO:92) eC term: 5'-GAATCCGGATCCTCACTGCTTCATCGCTGTTTG-3' (SEQ IDNO:93)

Os iniciadores foram designados pelas seqüências de codifica-ção de B. cereus. Um conjunto de iniciadores produziu a seqüência listadaem NCBI como acesso AE016877 gi:29899096 5138634... 5139506 (873bp). Um conjunto de iniciadores produziu um produto com um adicional de12 bp a montante, similar ao número de acesso NCBI daí previsto de B. thu-ringiensis AE017355 gi:49328240 4965653... 4966537 (885 bp). Ambos osconjuntos foram designados com Nde\ para a região N-terminal e o sítio derestrição de BamH\ para a região C-terminal. Os iniciadores foram designa-dos para clonagem em clonagem pBAD-TOPO TA.

Iniciadores de B. cereus:

N term 5'-TAAGAGGAATAACATATGGCATACGAAAGATTT-3' (SEQ IDNO:94) e C-term 5'-GAATTCGGATCCTTAAGAAGATGACATATTGG-3'(produto de PCR mais curto) (SEQ ID NO:95)

N term 5-TAAGAGGAATAACATATGGGATCGAAATTGGCA-3' (produto dePCR mais longo) (SEQ ID NO:96)

As regiões de codificação dos genes de B. sphaericus, B. halo-durans, e B. licheniformis dat foram amplificadas utilizando o seguinte proto-colo de PCR. Em uma reação de 50 |j.L, 3 uL de modelo (2 u,L de DNA ge-nômico), 1,6 uM de cada iniciador, 0,25 mM de cada dNTP, 3,5 U de Polime-rase de Alta Fidelidade Expand (Roche, Indianapolis, IN), e 1X tampão Ex-pand® com Mg foram usados. O programa thermocycler usado incluiu umapartida a quente a 94°C durante 3 minutos, seguido por 8 repetições dasseguintes etapas: 94°C durante 30 segundos, 52°C durante 30 segundos, e72°C durante 2 minutos. Vinte e dois ciclos subseqüentes foram realizadoscom uma temperatura de anelamento de 58°C. Após 30 ciclos a amostra foimantida a 72°C durante 7 minutos e então armazenada a 4°C. Os produtosde PCR puros do tamanho correto foram obtidos (aproximadamente 850 bppara o gene dai).Geobacillus stearothermophilus dat (número de acesso J04460gi:142541), que codifica a proteína de número de acesso AAA22252 (gi:142542)foi construído utilizando técnicas de montagem de PCR. A fonte deste ge-ne/proteína é geralmente descrita como Bacillus sp., espécies termoestáveisde Bacillus, ou Bacillus YM-1. O processo de montagem é o seguinte: 43oligonucleotídeos (40 mers) foram ordenados a partir de IDT baseado naseqüência de gene acima e sua seqüência de DNA complementar, com 20sobreposições de pares de base entre as cadeias senso e anti-senso. Osiniciadores foram diluídos a 250 uM em água e 5 uL de cada iniciador foimisturado juntamente em um tubo microfuge. A PCR foi realizada como sesegue: por 100 uL de reação, 1,5 uL do grupo de iniciador, 4 uL de dNTPs,1X XL tampão PCR, 1 mM de acetato de magnésio, 2 uL de polimerase rTth(Roche, Indianapolis, IN), e 0,25 uL de polimerase Pfu (Stratagene, La Jolla,CA) foram adicionados. Uma partida a quente de 3 minutos foi realizada a94QC, seguida por 15 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 40°C durante 30segundos, e 68°C durante 15 segundos. Mais dez ciclos foram realizadoscom uma temperatura de anelamento aumentada de 44°C e um tempo deextensão de 30 segundos (a 68°C). Mais dez ciclos foram realizados emuma temperatura de anelamento de 48°C e um tempo de extensão de 75segundos. Por fim, uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durantesete minutos a 68°C. Uma PCR secundária foi realizada utilizando os se-guintes iniciadores, designados para clonagem com Nde\ (N-term) e BamH\(C-term):

N-term-5'- GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACC-3' (SEQ IDNO:97) e C-term-5'- TTGGAACCGGATCCTTATATATGAAGCGGTTTTGG-3'(SEQ ID NO:98)

A PCR continha por 100 uL, 2,5 uL da reação primária, 0,4 uL decada iniciador, 3 uL de dNTPs, 1X XL tampão PCR, 1 mM de acetato demagnésio, 2 uL de polimerase rTth, e 0,25 uL de polimerase Pfu. Uma parti-da a quente de 3 minutos foi realizada a 94QC, seguida por 10 ciclos de 94°Cdurante 30 segundos, 42°C durante 30 segundos, e 68°C durante 90 segun-dos. Mais quinze ciclos foram realizados com uma temperatura de anela-mento aumentada de 48°C, e por fim, uma etapa de extensão de cadeia foirealizada durante sete minutos a 68°C. Uma terceira reação de PCR foi rea-lizada utilizando o modelo da segunda PCR, e utilizando as mesmas condi-ções que a segunda reação de PCR. Um produto de aproximadamente 900bp ficou visível sobre um gel agarose.

Clonagem

O produto de PCR de DAT B. sphaericusío\ purificado utilizandoo kit de purificação por PCR Qiagen QIAquick (Valencia, CA) e digerido comBamH\ e Nco\ em tampão BamHI (New England Biolabs, Ipswich, MA). Osvetores digeridos (pET28 e pET30) e o inserto foram purificados utilizando oKit de Extração por Gel Qiagen QIAquick. As ligações foram realizadas utili-zando o Kit de Ligação Rápida de DNA Roche (Roche) e purificadas utili-zando o kit de purificação por PCR QIAquick PCR. As ligações foram trans-formadas em DH10B de Escherichia coli utilizando uma cubeta de 0,2 cm eum sistema Bio-Rad Gene Pulser II como descrito no manual de eletropora-ção Bio-Rad. As células foram permitidas para se recuperar em 900 \iL demeio SOC durante 30 minutos a 37°C a 225 rpm. As células foram semea-das sobre placas ágar LB que contêm canamicina (25 |ig/mL). O DNA deplasmídeo foi purificado utilizando o kit spin miniprep Qiagen e separado nosinsertos corretos por digestão por restrição com BamHI e Nco\. As seqüên-cias de plasmídeos que pareceram possuir o inserto correto foram verifica-das por seqüenciamento de DNA de terminação de cadeia didesóxi em A-gencourt BioScience Corporation (Beverly, MA). O seqüenciamento verificoua seqüência de codificação encontrada em NCBI número de acessoAF081278 Região: 134..985 (gi: 3513754), que produz uma proteína comseqüência de aminoácido como listado no número de acesso AAC33964 (gi:3513755).

Os produtos de PCR de DAT B. licheniformis DAT (-850 bp) eG. stearothermophilus foram purificados com gel e clonados utilizando o kitde clonagem Zero Blunt TOPO® conforme os protocolos do fabricante (Invi-trogen). Os plasmídeos foram transformados em células quimicamente com-petentes TOP10 para triagem inicial. O DNA de plasmídeo foi separado pordigestão por restrição e as seqüências foram verificadas para combinar aseqüência de codificação encontrada em NCBI. Para B. licheniformis, a se-qüência combinou a região U26947 de número de acesso 247..1098 (gi:857560), que produz uma proteína com uma seqüência de aminoácido comolistado no número de acesso P54692 (gi: 1706292), com a exceção de umamutação silenciosa na posição 429 de A a G. Para G. stearothermophilus, aseqüência combinou o número de acesso listado acima. As regiões de codi-ficação foram subclonadas por digestão por restrição (Nde\/BamH\), ligadasnos vetores pET, e transformadas em células eletrocompetentes DH10B pa-ra amplificação.

O produto de PCR de DAT B. halodurans foi purificado com gel edigerido com Nde\ e BamH\ e ligado em vetores pET 28 e pET 30 como acima.

A amplificação do vetor foi realizada em células DH10B. O DNA de minipre-paração foi separado por PCR e a seqüência foi verificada. A seqüência de ge-ne pode ser encontrada no número de acesso NC_002570 (gi:57596592)2934903..2935754 que codifica uma proteína com a seqüência de aminoáci-do listada no número de acesso NP_243677 (gi:15615374).

As seqüências de codificação de B. cereus foram amplificadasutilizando um protocolo de PCR típico e clonadas de acordo com os protoco-los do fabricante (Invitrogen).

Expressão Genética e Análises

O DNA de plasmídeo foi subclonado em hospedeiro de expres-são BL21(DE3) de E. coli expression (Novagen, Madison, Wl) para construc-tos em vetores pET. As culturas se desenvolveram e os plasmídeos foramisolados utilizando o kit de minipreparação Qiagen, e analisados por diges-tão de restrição para confirmar a identidade. A indução foi tipicamente reali-zada em meio LB que contém canamicina (50 |ug/ml_). As células se desen-volveram em um OD60o de 0,4 a 0,8 a 37QC, induzidas com 0,1 mM de IPTG(tiogalacatosida de isopropila) e experimentadas a 3 a 4 horas após a indu-ção. Os extratos celulares foram preparados de acordo com o protocolo queacompanha o reagente Novagen BugBuster® (com benzonase nuclease ecoquetel de inibidor de protease Roche completa adicionados). Altos níveisde proteína solúvel foram obtidos no peso molecular previsto, como julgadopor SDS-PAGE, para ambos produtos de gene B. halodurans, ambos produ-tos de gene B. sphaericus, ambos produtos de gene G. stearothermophilus,e produto de gene B. licheniformis não marcado. Para reações onde a prote-ína purificada foi usada, os produtos de gene marcados com His foram puri-ficados utilizando cartuchos His-Bind seguindo os protocolos do fabricante(Novagen, Madison, Wl). As frações eluentes foram dessalinizadas sobrecolunas PD-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) e eluídas em 25 a100 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,5. As análises totais de proteí-na foram feitas utilizando o kit Pierce BCA, e a porcentagem de expressãofoi estimada a partir de SDS-PAGE. Alternativamente, as proteínas solúveisnos extratos celulares foram separadas sobre uma Estação de EletroforeseAutomática BioRad Laboratories Experion e analisadas para concentração eporcentagem de expressão utilizando o Software Experion versão 1.1.98.0.

Os constructos pBAD-TOPO que contêm os genes de B. cereus foram ex-pressas como recomendado por Invitrogen, porém os níveis de expressãodas DAATs foram tais que a proteína recombinante não pôde ser distinguidadas outras proteínas durante a análise de SDS-PAGE.

Os extratos celulares foram analisados para atividade de D-ami-notransferas% seguindo a produção de alanina de piruvato e D-triptofano (oumonatina R,R) utilizando o seguinte protocolo. As reações em duplicata deum mL foram tipicamente realizadas em 100 mM de tampão fosfato de po-tássio (pH 7,5), 50 uM de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvato de sódio, e 50mM de D-triptofano ou monatina R,R. As reações foram iniciadas através daadição de extratos livres de células ou enzima purificada e foram incubadas15 minutos durante a noite a 30eC, com leve agitação. Aproximadamente omesmo nível de D-aminotransferase foi adicionado (tipicamente em torno de0,5 mg) em cada análise para propósitos comparativos. AT-103 (BioCataly-tics) foi usado como um controle positivo (ou comparação). Ácido fórmico foiadicionado a uma concentração final de dois porcento para interromper areação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. As reaçõesde controle, sem a proteína adicionada, também foram realizadas. Pontos detempo zero também foram usados como controles negativos. Alanina foi de-tectada utilizando derivatização OPA como descrito no Exemplo 1.

As aminotransferases também foram testadas para sua capaci-dade de produzir monatina a partir de D-triptofano (como no Exemplo 3). Osseguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação: aproximada-mente 50 a 100 ug de aldolase (tipicamente aldolase ProA de C. testostero-ni, purificada), 4 mM de MgCI2, 50 mM de D-triptofano (fornecido como sóli-do), 0,5 a 2 mg de D-aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 100mM de tampão fosfato de sódio pH 7,5, e 0,05 mM de PLP. Os experimentosforam realizados em duplicata, com controles negativos onde nenhuma ami-notransferase foi adicionada. As amostras foram incubadas 1 hora, 2 horas,e durante a noite (17 a 20 horas) a 309C com agitação suave. Os únicos es-tereoisômeros detectados quando se produz monatina utilizando estes mé-todos são R,R e S,R. A porcentagem de R,R está listada abaixo, e foi deter-minada por área pico LC de fase reversa. Os resultados da atividade detransaminação de D-aminotransferases de B. sphaericus, B. licheniformis, eB. halodurans após 1 hora são mostrados na Tabela 40 abaixo. Os dadosforam normalizados para 0,5 mg da D-aminotransferase por mL.

Tabela 40: Atividade de Transaminação de D-Aminotransferases de B. s-phaericus, B. licheniformis, e B. halodurans

<table>table see original document page 151</column></row><table>

A produção de monatina utilizando D-aminotransferases de B.sphaericus, B. licheniformis, e B. halodurans é mostrada na Tabela 41 abai-xo. Cada reação continha aproximadamente 90 u.g de ProA C. testosteroni.Os dados da monatina total produzida foram normalizados para o uso de 0,5mg da D-aminotransferase.Tabela 41: Comparação de D-Aminotransferases de B. sphaerícus, B. liche-niformis, e B. halodurans para a Produção de Monatina

<table>table see original document page 152</column></row><table>

A D-aminotransferase de B. sphaerícus (não marcada) apresen-tou a atividade mais alta para a produção de monatina a partir de D-triptofano, porém a enzima de B. halodurans apresentou seletividade maiorde R-MP versus S-MP do que as outras enzimas, resultando em estereopu-reza maior de monatina R,R. Os extratos celulares de B. cereus não possuí-am quantidades detectáveis de atividade sob as condições testadas, emboraos genes não tenham sido expressos nos hospedeiros selecionados.

A DAT de G. stearothermophilus (não marcada, que se expres-sou melhor) foi analisada como acima e comparada com a DAT purificada deB. sphaerícus DAT e AT-103 (BioCatalytics). Os resultados são mostradosnas Tabelas 42 e 43 abaixo. A atividade de transaminação de D-aminotransferase de G. stearothermophilus, AT-103, e B. sphaerícus foi tes-tada utilizando 0,5 mg de D-aminotransferase por ml_ (Tabela 42).Tabela 42: Atividade de Transaminação de D-Aminotransferases (Purifica-das) de G. stearothermophilus, AT-103, e B. sphaericus

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Tabela 43: Comparação de G. stearothermophilus, AT-103, e B. sphaericus(purificadas) para Produção de Monatina Total

<table>table see original document page 153</column></row><table>

A enzima nativa de G. stearothermophilus é claramente menosativa para transaminação de monatina do que as enzimas de AT-103 e B.sphaericus.

Exemplo 19

Criação de uma D-Aminotransferase Híbrida

Diversas D-aminoácido aminotransferases de Bacillus foramdescritas nos Exemplos 18 e 15. Embora a enzima de G. stearothermophiluspossuísse baixa atividade de transaminação sobre monatina, causando me-nos monatina total a ser produzida a partir de D-triptofano, esta ainda possu-ía elementos estruturais de interesse e é uma enzima termoestável. Portan-to, uma proteína híbrida foi criada entre a enzima de atividade maior {B. s-phaericus) e a enzima de Geobacillus.

Montagem de seqüência de codificação de DAT híbrida

A seqüência de proteína alvo que foi designada é SEQ IDNO:99. SEQ ID NO.100, a seqüência de codificação que corresponde à SEQID NO:99, foi designada baseada no uso de códon de E. coli.

A DAT híbrida foi construída utilizando técnicas de montagem dePCR. O processo de montagem é o seguinte: 43 oligonucleotídeos (40 mers)foram ordenados a partir de IDT baseado na seqüência de gene acima e suaseqüência de DNA complementar, com 20 sobreposições de pares de baseentre as cadeias senso e anti-senso. Os iniciadores foram diluídos a 250 uMem água e 5 uL de cada iniciador foram misturados juntamente em um tubomicrofuge. A PCR foi realizada como se segue: por 100 uL de reação, 1,5 uLdo grupo de iniciador, 4 uL de dNTPs, 1X XL tampão PCR, 1 mM de acetatode magnésio, 2 uL de polimerase Tth (Roche, Indianapolis, IN), e 0,25 pL depolimerase Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) foram adicionados. Uma partida aquente de 3 minutos foi realizada a,94sC, seguida por 15 ciclos de 94°C du-rante 30 segundos, 40°C durante 15 segundos, e 68°C durante 30 segun-dos. Mais dez ciclos foram realizados com uma temperatura de anelamentoaumentada de 44°C e um tempo de anelamento aumentado de 30 segun-dos. Mais dez ciclos foram realizados em uma temperatura de anelamentode 48°C e um tempo de extensão de 75 segundos. Por fim, uma etapa deextensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 68°C. Uma PCRsecundária foi realizada utilizando os seguintes iniciadores, designados paraclonagem com /Vetei (N-term) and BamH\ (C-term):

N-term-5'-GGCCTTGGCATATGGGATACACTTTATGGAATGACCA -3' (SEQ IDNO:101)e

C-term-5'-TTGGAACCGGATCCTTAGCTGTTAAGGCTCAGTGGAA-3'(SEQ ID NO:102)

A PCR continha por 100 uL, 2,5 uL da reação primária, 3 uL dedNTPs, 1X XL tampão PCR, 1mM de acetato de magnésio, 2 uL de rTth, e0,25 uL de polimerase Pfu. Uma partida a quente de 3 minutos foi realizadaa 94QC, seguida por 10 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 42°C durante30 segundos, e 68°C durante 75 segundos. Mais quinze ciclos foram reali-zados com uma temperatura de anelamento aumentada de 48°C, e por fim,uma etapa de extensão de cadeia foi realizada durante sete minutos a 68°C.

Um produto de aproximadamente 850 bp se tornou visível sobre um gel aga-rose.

Clonagem

O produto de PCR foi purificado com gel utilizando o Kit de Ex-tração por Gel Qiagen QIAquick (Valencia, CA), e clonado utilizando o kit declonagem Zero Blunt TOPO® conforme os protocolos do fabricante (Invitro-gen). Os plasmídeos foram transformados em células quimicamente compe-tentes TOP10 para triagem inicial por PCR. O DNA de plasmídeo foi separa-do por digestão de restrição e a seqüência de DNA foi verificada.

As minipreparações de plasmídeo foram digeridas com BamH\ eNde\ (New England Biolabs, Ipswich, MA). Os vetores digeridos (pET28 epET30) e inserto foram ligados utilizando o Kit de Ligação Rápida de DNARoche (Roche) e purificados utilizando o Kit de Purificação de Produto dePCR High-Pure Roche. As ligações foram transformadas em DH10B de Es-cheríchia coli utilizando uma cubeta de 0,2 cm e um sistema Bio-Rad GenePulser II como descrito no manual de eletroporação Bio-Rad. As células fo-ram permitidas para se recuperar em 900 \iL de meio SOC durante 30 minu-tos a 37°C a 225 rpm. As células foram semeadas sobre placas ágar LB quecontêm canamicina (25 u.g/ml_). O DNA de plasmídeo foi purificado utilizandoo kit spin miniprep Qiagen e separado nos insertos corretos por digestão porrestrição com BamH\ e Nde\.

Expressão Genética e Análises

O DNA de plasmídeo foi transformado em hospedeiro de expressãoBL21(DE3) de E. colide acordo com os protocolos do fabricante (Novagen, Ma-dison, Wl). As culturas se desenvolveram e os plasmídeos foram isoladosutilizando o kit de minipreparação Qiagen e analisados por PCR para confir-mar a identidade. A indução foi realizada em meio LB que contém canamici-na (50 u.g/mL). As células se desenvolveram em um OD6oo de 0,5 a 37eC,induzidas com 0,1 mM de IPTG (tiogalacatosida de isopropila) e experimen-tadas a 3 horas após a indução. Os extratos celulares foram preparados deacordo com o protocolo que acompanha o reagente Novagen BugBuster®(com benzonase nuclease e coquetel de inibidor de protease completo Ro-che adicionados). Altos níveis de proteína total foram obtidos no peso mole-cular previsto, como julgado por SDS-PAGE, para ambos os produtos degene. Entretanto, os níveis solúveis de proteína eram inferiores. A versãonão marcada do produto de gene foi melhor expressa e foi analisada comoum extrato celular. As proteínas solúveis nos extratos celulares foram sepa-radas sobre uma Estação de Eletroforese Automática BioRad Laboratories

Experion e analisadas para concentração e porcentagem de expressão utili-zando o Software Experion versão 1.1.98.0, para normalizar a quantidade deD-aminotransferase usada em análises comparativas.

Os extratos celulares foram analisados para atividade de D-amino-transferase seguindo a produção de alanina de piruvato e D-triptofano (oumonatina R,R) utilizando o seguinte protocolo. As reações em duplicata deum ml_ foram realizadas em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5),50 uM de fosfato piridoxal, 25 mM de piruvato de sódio, e 50 mM de D-tripto-fano ou monatina R,R (salvo observação em contrário). As reações foraminiciadas através da adição de extratos livres de células ou enzima purificadae foram incubadas 15 minutos durante a noite a 30QC, com leve agitação.Aproximadamente o mesmo nível de D-aminotransferase foi adicionado (0,5mg) em cada análise para propósitos comparativos (salvo observação emcontrário). AT-103 (BioCatalytics) ou D-aminotransferase de B. sphaericus(Exemplo 18) foi usada como uma enzima comparativa. Ácido fórmico foiadicionado a uma concentração final de dois porcento para interromper areação e a proteína precipitada foi removida por centrifugação. As reaçõesde controle sem a proteína adicionada também foram realizadas. Os pontosde tempo zero também foram usados como controles negativos. Alanina foidetectada utilizando a derivatização pós-coluna OPA como descrito no Exem-plo 1. Os resultados das reações utilizando 0,5 mg de D-aminotransferasepor 1 ml_ de volume de reação são mostrados na Tabela 44 abaixo.

Tabela 44: Atividade de Transaminação de D-Aminotransferases de B. s-phaericus (purificadas), G. stearothermophilus, e Híbridas

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As aminotransferases também foram testadas para sua capaci-dade de produzir monatina a partir de D-triptofano (como no Exemplo 3). Osseguintes foram adicionados por 1 ml_ de mistura de reação: aproximada-mente 50 a 100 ug de aldolase ProA purificada de C. testosteroni, 4 mM deMgCl2, 50 mM de D-triptofano (fornecido como sólido), 0,5 a 2 mg de D-aminotransferase, 200 mM de piruvato de sódio, 100 mM de tampão fosfatode potássio pH 7,5, e 0,05 mM de PLP. Os experimentos foram realizadosem duplicata, com controles negativos onde nenhuma aminotransferase foiadicionada. As amostras foram incubadas 1 hora, 2 horas, e durante a noite(17 a 20 horas) a 30QC com agitação suave. Os únicos estereoisômeros de-tectados quando se produz monatina utilizando estes métodos eram R,R eS,R. A porcentagem de R,R é listada na Tabela 45 abaixo, e foi determinadapor área pico LC de fase reversa. Em baixas concentrações de monatina, aporcentagem de R,R não é tão precisa conforme julgado por área pico R-PLC. Portanto, algumas das amostras foram adicionalmente analisadas pelométodo de derivatização de FDAA descrito no Exemplo 1. Os números da-queles resultados são mostrados na tabela entre parênteses.

Tabela 45: Comparação de DAT de G. stearothermophilus, Híbrida e B. s-phaericus (purificada) para Produção de Monatina Total

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A DAT híbrida fábrica mais monatina do que a enzima de G. ste-arothermophilus, embora a taxa de transaminação de monatina da DAT hí-brida seja menor. É possível que sob as condições para produção de mona-tina (onde há baixas concentrações de MP), a Híbrida se apresenta melhorpossivelmente devido a um Km inferior. Também, a DAT Híbrida produz umaporcentagem maior de R,R do que cada enzima de origem. A enzima parecepossuir uma ênantiosseletividade maior de R-MP do que as enzimas de ori-gem. As mesmas análises foram realizadas (tempo de incubação de 4 ho-ras) utilizando a aldolase de Sinorhizobium descrita no Exemplo 3 com aDAT Híbrida. A DAT Híbrida produziu quantidades similares de monatinacomo acima, porém utilizando a aldolase alternativa, produziu 95% de R,R(de acordo com a derivatização de FDAA), como oposto a 80% com a aldo-lase ProA de C. testosteroni.

A DAT híbrida também foi testada para atividade de transamina-ção de R-MP versus S-MP (produzida como descrito no Exemplo 1). As aná-lises de duas horas e durante a noite foram conduzidas a 309C utilizando 10mM de R-MP ou S-MP, 50 mM de D-alanina, 100 mM de fosfato de potássiopH 7,5, 0,5 mg/mL de D-aminotransferase, e 50 uM de PLP. Os experimen-tos foram realizados em duplicata e os níveis anteriores de monatina dasamostras de MP foram reduzidos. As proporções de monatina produzida decada substrato estão relatadas am cada D-aminotransferase na Tabela 46abaixo. Tendências similares foram observadas quando as proporções depiruvato (produzido) foram registradas graficamente. É evidente que a DATHíbrida é mais seletiva para R-MP do que D-aminotransferase de AT-103,que não parece ser seletiva.

Tabela 46: Comparação de DAT Híbrida e AT-103 para Transam inação deS-MP e R-MP

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Em uma tentativa de aperfeiçoar adicionalmente a atividade deDAT Híbrida, a mutagênese sítio dirigida foi realizada. Os iniciadores foramdesignados como sugerido no Kit de Mutagênese Dirigida por Múltiplos Sí-tios QuikChange (Stratagene). Dois mutantes diferentes foram criados: DATHíbrida 2 e DAT Híbrida 3. A DAT Híbrida 2 inclui uma mutação na posiçãode aminoácido 153 de alanina para arginina e uma deleção de serina 181. Amutação de alanina para arginina foi designada para ajudar a coordenar osegundo grupo carboxila no substrato de precursor de monatina, como foiobservado estar presente na L-aminotransferase de AspC. A deleção de se-rina foi uma tentativa de remover algum congestionamento esférico de modoque a maior molécula de precursor de monatina possa alcançar o sítio ativomais facilmente. A DAT Híbrida 3 contém uma deleção de serinas 180-182,substituídos por uma arginina. Dois mutantes adicionais foram criados, estespossuem apenas a mutação de ala 153 para arg ou a deleção de serina,respectivamente. Todos os três mutantes que continham deleções não for-maram proteínas solúveis, embora estes se superexpressem em concentra-ções muito altas. Evidentemente, é importante não remover estruturalmenteaminoácidos nesta região. O mutante ala153arg não produziu monatina sobas condições testadas (como acima). Há uma quantidade considerável decongestionamento estérico próximo à posição 153 que poderia tornar maisdifícil o ajuste do substrato de precursor de monatina sem as deleções naregião 180-182. Espera-se que a mutação das serinas para aminoácidosmenores, tal como, glicina ou alanina, possa aperfeiçoar a atividade comrelação ao precursor de monatina, particularmente quando combinada com amutação ala153arg.

Exemplo 20

Uso de Enzimas D-Aminoácido Desidroqenase Comercialmente DisponíveisD-aminoácido desidrogenases faziam parte de uma bibliotecaadquirida junto a BioCatalytics (Pasadena, CA).

Interconversão entre MP e Monatina

A aminação de MP para formar monatina pode ser catalisadapor aminotransferases ou por desidrogenases que requerem um co-fator deredução, tal como, NADH ou NADPH. Estas reações são reversíveis e po-dem ser medidas em cada direção. A direcionalidade quando utiliza umaenzima desidrogenase pode ser amplamente controlada pela concentraçãode sais de amônio.

Conversão de Monatina em MP (precursor de monatina) utilizando Desidro-genases Comercialmente Disponíveis

A determinação oxidativa de monatina foi monitorada seguindo oaumento na absorvência a 340 nm, visto que NAD+ foi convertida na NADHcromofórica.

A mistura de análise continha 100 mM de bicarbonato de sódio,pH 9, 10 mM de NAD+, 20 mg/mL de D-aminoácido desidrogenase (D-AADH-101-a 108, BioCatalytics), e 50 mM de monatina R,R (sal monopotás-sico) em 0,2 mL. A análise foi realizada, em duplicata, em uma placa de mi-crotiter UV-transparente, com incubação a 309C. As absorvências de pontofinal foram medidas utilizando um leitor de placa Molecular Devices Spec-traMax Plus. Os controles negativos foram realizados sem a adição de enzi-ma. A alteração na absorvência de reações noturnas foi a seguinte: nenhumcontrole de enzima, 0,05; D-AADH-101, 0,865; D-AADH-102, 1,075; D-AADH-103, 0,94; D-AADH-104, 0,335; D-AADH-105, 0,78; D-AADH-106,0,745; D-AADH-107, 0,925; e D-AADH-108, 1,06.Produção de Monatina a partir de MP Utilizando Desidroaenases

R-MP usado como um substrato para esta análise foi produzidopela transaminação de R,R utilizando D-aminotransferase de ampla faixa deAT-103 (BioCatalytics) em tampão fosfato de potássio, utilizando piruvatocomo o aceitador de amino. S-MP foi produzido pela transaminação de mo-natina S,S utilizando L-aminotransferase de AT-102 (BioCatalytics) em tam-pão fosfato de potássio, utilizando 2-oxog luta rato como o aceitador de ami-no. Ambos os compostos foram purificados utilizando escala de HPLC pre-parativa.

A mistura de análise continha 200 mM de formato de amônio, 50mM de fosfato de potássio pH 7,5, 5 mM de NADH, 20 mg/mL de D-aminoácidodesidrogenase (D-AADH-101 a 108, BioCatalytics), e 10 mM de MP (sal depotássio) em 0,25 ml_. À metade das análises, 2 mg/mL de formato desidro-genase ("FDH") foram adicionados (FDH-101, BioCatalytics, 4,8 U/mg). Asamostras foram incubadas durante 16 horas a 309C. As amostras foram ana-lisadas para monatina utilizando LC/MS/MS e a distribuição isomérica foideterminada utilizando o método de FDAA descrito no Exemplo 1. Os níveisanteriores do não controle de D-aminoácido desidrogenase foram subtraídospara explicar a contaminação de monatina presente no MP.

Para a produção de monatina R,R de R-MP, a atividade de en-zima era a seguinte: D-AADH-103 > D-AADH-101 > D-AADH-107 > D-AADH106 > D-AADH-108 > D-AADH-105. A quantidade de monatina gerada de D-AADH 102 era muito baixa e D-AADH-104 não pareceu produzir monatinade R-MP. Aproximadamente 43 ppm de monatina R,R foi produzido por D-AADH-103 durante a reação na ausência de formato desidrogenase. A adi-ção de FDH aperfeiçoou a produção de monatina de todas as enzimas queapresentaram atividade. Os aperfeiçoamentos variaram de monatina superi-or de 2,4 dobra para monatina superior de 10,1 dobras (D-AADH-103). D-AADH-103 produziu aproximadamente 434 ppm de monatina R,R.

Quando S-MP foi usado como o substrato de reação e a produ-ção de monatina S,R foi seguida, a atividade de enzima foi a seguinte: D-AADH-106 > D-AADH-107 > D-AADH-105 > D-AADH-101 > D-AADH-102 >D-AADH-103 > D-AADH-108. D-AADH-104 não pareceu produzir monatinaS,R nas análises. Aproximadamente 15 ppm de monatina S,R foi gerado porD-AADH-106, 26 ppm quando enzima FDH também foi usada.

Produção de Monatina a partir de lndol-3-Piruvato

A produção de monatina a partir de indol-3-piruvato e piruvato,utilizando enzimas aminoácido desidrogenase BioCatalytics acopladas coma aldolase de SEQ ID NO:22, foi analisada sob as seguintes condições: 1mg/mL de enzima desidrogenase, 10 mM de NADH , 500 ug/mL de aldolase(purificada), 50 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5, 4 mM de MgCI2,20 mg/mL de indol-3-piruvato, 200 mM de formato de amônio, e 200 mM depiruvato foram incubados a 30QC a 100 rpm durante 20 horas. Os controlesnegativos não continham enzima aminoácido desidrogenase. Os experimen-tos foram realizados em duplicata. Nenhuma das desidrogenases pareceuproduzir quantidades quantificáveis de monatina a partir de indol piruvato epiruvato (como medido por LC/MS/MS e descrito no Exemplo 1) em compa-ração com os controles negativos. Entretanto, grandes quantidades de ala-nina e triptofano foram produzidas. Espera-se que ao aumentar a proporçãode aldolase para desidrogenase possa aperfeiçoar a produção de monatina.

Espera-se também que abordagens de evolução dirigida possam ser usadaspara aperfeiçoar a proporção de atividade de aminação redutiva sobre MPversus piruvato e indol-3-piruvato.

Exemplo 21

Imobilizacão de D-Alanina Aminotransferase de B. sphaericus

A D-alanina Aminotransferase de Bacillus sphaericus foi purifi-cada como a proteína marcada com HIS6, conforme descrito no Exemplo 14.

A enzima foi imobilizada sobre contas de resina Eupergit® C deacordo com o procedimento de Mateo, C, et ai, Biotechnology Progress78:629-634, (2002). A enzima purificada (4 ml_ em 6,0 mg/mL) foi dialisadaem 0,4 L de 0,5 M de fosfato de potássio, pH 7,8 utilizando um Pierce Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette (7K MWCO; catálogo # 66370; Rockford, IL) du-rante 1 hora em temperatura ambiente. O tampão foi alterado e a diálisecontinuou durante 1 hora. O fosfato piridoxal ("PLP") foi adicionado a umaconcentração final de 0,05 mM e a solução resultante foi misturada com 0,2g de resina Eupergit® C adquirida junto a Sigma-AIdrich (Fluka catálogo#46115; St. Louis, MO). A suspensão de resina-enzima foi incubada emtemperatura ambiente com mistura suave durante a noite. As contas de resi-na foram separadas da solução de enzima por centrifugação a 4000 x g du-rante 5 minutos. O sobrenadante foi removido e a resina foi lavada com 3x3mL de 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 que contém 0,05 mM de PLP.A mistura foi centrifugada a 3000 x g durante 5 minutos entre as lavagens. Aquantidade de proteína ligada à resina foi determinada medindo a quantida-de de proteína em cada sobrenadante e subtraindo a soma da quantidadeoriginal de proteína que será imobilizada. As concentrações de proteína fo-ram medidas utilizando um Kit de Análise de Proteína Pierce BCA® com al-bumina de soro bovino como o padrão (catálogo #23225; Rockford, IL). Ascontas de enzima imobilizadas lavadas finalmente foram suspensas em 4mL de 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 que contém 0,05 mM de PLP.Os grupos de epóxi não-reagidos das contas de enzima imobilizadas forambloqueados por incubação com 1,9 M de alanina em temperatura ambientecom mistura suave. Após 24 horas, as contas foram lavadas, como descritoacima, para remover o excesso de alanina e, finalmente, resuspensas em100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 que contém 0,05 mM de PLP. A con-centração final de enzima imobilizada foi de 118 mg de proteína por g deconta de resina.

Exemplo 22

Imobilizacão de Aldolase ProA de S. meliloti

A aldolase HMG de Sinorhizobium meliloti {"proA") foi purificadacomo a proteína marcada com HIS6 utilizando um procedimento similar à-quele descrito no Exemplo 14 para D-alanina aminotransferase marcadacom HIS6 de B. sphaericus.

Partindo de uma placa de cultura nova (ágar LB com 50 ug/mLde canamicina) de BL21 (DE3)::S. meliloti proA pET30(Xa/LIC), as células sedesenvolveram em 5 ml de caldo Luria-Bertani ("LB") com 50 ng/ml de ca-namicina, a 37°C e 225 rpm durante a noite. Subseqüentemente, a culturafoi transferida a 0,5 a 0,6% (v/v) em frascos que contêm 800 ml_ de caldo LBcom 50 ug/ml de canamicina. As células se desenvolveram a 379C e 225rpm até o OÜ6oo atingir 0,6 a 0,7. A expressão genética foi induzida pela adi-ção de 0,2 mM de IPTG. As culturas foram adicionalmente incubadas a 30QCdurante 4 horas a 225 rpm e então colhidas por centrifugação em uma cen-trífuga Beckman (Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16,25 a 10.000 rpmdurante 10 minutos. O pélete de célula foi lavado uma vez com 50 mM detampão frio EPPS, pH 8,2, e as células foram centrifugadas novamente. Opélete de célula lavado foi colhido e usado imediatamente. Para preparar oextrato livre de células que contém a proteína aldolase proA HIS6 de S. meli-loti (HISe-SmelproA), as células foram suspensas em 3 a 4 volumes de 50mM de EPPS, pH 8,2, que contém 100 mM de NaCI, e então divididas utili-zando um homogeneizador Microfluidics (Newton, MA) (3 passes a 138,000KPa (20.000 psi)), mantendo a temperatura da suspensão abaixo de 159C.

Todas as etapas de purificação subseqüentes foram realizadas a 4QC. O ex-trato celular foi centrifugado durante 15 minutos a 15.000 x g para removeros resíduos celulares. As alíquotas do extrato livre de célula, sendo que ca-da uma contém entre 15 e 20 mg de proteína solúvel, foram aplicadas emcolunas HIS-Bind Novagen (catálogo # 70971-4) que foram anteriormenteequilibradas com o tampão Bind Novagen. As colunas foram lavadas com 2x 10 mL do tampão Bind Novagen e 1 x 10 ml_ do tampão Wash Novagendiluído 1:1 com o tampão Bind. HIS6-SmelproA foi eluído com 5 mL do tam-pão Elute Novagen de cada coluna. As frações de eluição de cada colunaforam combinadas e concentradas 2X com dispositivos de filtro centrífugoUltra-15 Amicon (Billerica, MA) (MWCO 10 kDa). O tampão foi trocado porpassagem através de colunas de dessalinização PD10 GE Healthcare des-cartáveis (catálogo #17-0851-01) anteriormente equilibradas com 50 mM deEPPS, pH 8,2, que contém 100 mM de NaCI.

A concentração de proteína da solução dessalinizada foi deter-minada utilizando o Kit de Análise de Proteína Pierce BCA® (catálogo#23225; Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão nafração de extrato livre de células foram determinados por SDS-PAGE comum sistema minigel Bio-Rad Protean II (Hercules, CA) e 4 a 15% de géis degradiente. Tipicamente, este procedimento produziu cerca de 60 a 70 mg deenzima de 3200 mL de cultura em LB com uma pureza de -90%. As alíquo-tas (1 a 5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80°C até o uso.

A enzima foi imobilizada sobre contas de resina Eupergit® C deacordo com o procedimento de Mateo, C, era/., (2002) Biotechnology Pro-gress 75:629-634, (2002) e como descrito no Exemplo 21 para a D-alaninaaminotransferase de B. sphaericus, exceto que 4 mM de cloreto de magné-sio estavam presentes no tampão durante a imobilização em vez de 0,05mM de PLP. Após o bloqueio com glicina, a enzima imobilizada lavada foisuspense em 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8 que contém 4 mM decloreto de magnésio. A concentração final de aldolase ProA de S. meliloti erade 52 mg de proteína por grama de conta de resina.

Exemplo 23

Produção de Monatina R.R Utilizando Enzimas Imobilizadas

A D-alanina aminotransferase marcada com HIS6 de B. sphaeri-cus e a aldolase proA marcada com HIS6 de R. meliloti foram purificadas eimobilizadas como descrito nos Exemplos 21 e 22.

As soluções de 50 mM de piruvato de sódio, 40 mM de D-triptofano, 4 mM de MgCI2) e 50 uM de PLP em 100 mM de fosfato de potás-sio, pH 7,8 foram preparadas em tubos de polipropileno de 15 mL com tam-pas de rosca. À cada uma destas soluções foram adicionadas ambas as en-zimas imobilizadas a um volume final de 4 mL. As suspensões resultantesforam incubadas em temperatura ambiente com mistura suave durante até24 horas. O progresso de cada reação foi seguido por análises HPLC e/ouLC-MS, ao medir D-triptofano, D-alanina, monatina R,R, e ácido pirúvico. Apureza isomérica do produto de monatina foi determinada utilizandoLC/MS/MS quiral. Todos os métodos analíticos estão descritos no Exemplo1. Os resultados típicos de experimentos que utilizam enzimas imobilizadassão mostrados na Tabela 47 abaixo. As análises da pureza isomérica damonatina formada durante a reação mostraram que o produto das reaçõesenzimáticas estava entre 74 e 80% de R,R.Tabela 47: Produção de Monatina R,R Utilizando Enzimas Imobilizadas

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Claims

1. Método que compreende produzir monatina ou sal desta a-través de uma via que compreende produzir indol-3-piruvato de L-triptofano,que produz precursores de monatina ("MP") incluindo pelo menos o precur-sor de R-monatina ("R-MP") do indol-3-piruvato, e produz a monatina a partirdo precursor de monatina, onde a monatina inclui pelo menos R,R monatina,e onde a produção do indol-3-piruvato do L-triptofano é facilitada ou uma oumais enzimas que possuem atividade maior, especificidade maior, ou am-bas, para L-triptofano do que para o precursor de monatina, a monatina, ouambos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as ditas umaou mais enzimas são selecionadas a partir de uma aminotransferase de L-triptofano, uma aminotransferase L-aromática, uma aminotransferase de L-aspartato, uma oxidase de L-aminoácido, e combinações destes.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as ditas umaou mais enzimas são selecionadas a partir de Sinorhizobium meliloti TatA,HEXAspCP9T/R122G, e combinações destes.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, onde as ditas umaou mais enzimas possuem atividade limitada, especificidade limitada, ouambas para o precursor de monatina, a monatina, ou ambos.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, onde a dita produ-ção de R,R monatina de dito precursor de R-monatina é facilitada por umaou mais enzimas selecionadas a partir de uma D-aminotransferase e umadesidrogenase de D-aminoácido.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, onde a dita D-aminotransferase é selecionada a partir de uma D-aminotransferase de Ba-cillus halodurans, uma D-aminotransferase híbrida, uma D-aminotransferasede Geobacillus stearothermophilus, uma D-aminotransferase de Bacillus II-cheniformis, uma D-aminotransferase de ATCC 4978, uma D-aminotrans-ferase de ATCC 7063, um aminotransferase de cadeia ramificada de Bacilluslicheniformis que possui atividade de D-aminotransferase, e homólogos des-tas.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a dita D-aminotransferase de Bacillus halodurans compreende uma seqüência deaminoácido registrada em número de acesso NP-243677, ou um homólogodesta.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a dita amino-transferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis que possui ativi-dade de D-aminotransferase é selecionada a partir de uma aminotransferasede cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação correspon-dente a E. coli F37Y, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacilluslicheniformis com uma mutação correspondente a E. coli Y96F, uma amino-transferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutaçãocorrespondente a E. coli Y165L, uma aminotransferase de cadeia ramificadade Bacillus licheniformis com uma mutação correspondente a E. coli L127K,uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis comuma mutação correspondente a E. coli R98Y, uma aminotransferase de ca-deia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação correspondentea E. coli L108R, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus li-cheniformis com uma mutação correspondente a E. coli L110H, uma amino-transferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutaçãocorrespondente a E. coli L127Y, uma aminotransferase de cadeia ramificadade Bacillus licheniformis com uma mutação correspondente a E. coli R41K, ehomólogos destas.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a dita D-ami-notransferase híbrida é SEQ ID NO:99, ou um homólogo desta.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a dita D-ami-notransferase de ATCC 4978 é SEQ ID NO:86, ou um homólogo desta.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, onde a dita D-ami-notransferase de ATCC 7063 é SEQ ID NO:87, ou um homólogo desta.

12. Método de acordo com a reivindicação 5, onde a dita D-ami-notransferase é purificada na presença de piridoxal-5'-fosfato.

13. Método de acordo com a reivindicação 5, onde a dita desidro-genase de D-aminoácido é selecionada a partir de D-AADH-101, D-AADH-102,D-AADH-103, D-AADH-105, D-AADH-106, D-AADH-107, D-AADH-108, ehomólogos destes.

14. Método de acordo com a reivindicação 4, onde a dita R,Rmonatina produzida é pelo menos cerca de 60%, por peso, de monatina totalproduzida.

15. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a produçãode dito precursor de monatina de indol-3-piruvato é facilitada por uma oumais enzimas que possuem atividade da aldolase R-específica.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, onde as ditasuma ou mais enzimas que possuem atividade da aldolase R-específica éuma aldolase selecionada a partir de aldolase de Sinorhizobium melilotiHMG, a aldolase de SEQ ID NO:22, e homólogos destas.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o métodocompreende adicionalmente pelo menos uma etapa de purificação, onde adita R,R monatina é purificada a um grau de pureza de pelo menos cerca de 60%, em peso de compostos orgânicos totais.

18. Método de acordo com a reivindicação 5, onde as ditas umaou mais enzimas selecionadas a partir de uma D-aminotransferase e umadesidrogenase de D-aminoácido possuem atividade maior, especificidademaior, ou ambas para o precursor de R-monatina do que para monatina deácido S-alfa-ceto ou indol-3-piruvato.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, onde as ditasuma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma D-aminotransferase euma desidrogenase de D-aminoácido possuem atividade limitada, especifici-dade limitada, ou ambas para monatina de ácido S-alfa-ceto ou indol-3-piru-vato.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, onde as ditasuma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma aminotransferase deL-triptofano, uma aminotransferase L-aromática, uma aminotransferase deL-aspartato, e uma oxidase de L-aminoácido possuem atividade limitada,especificidade limitada, ou ambas para o precursor de monatina, a monatina,ou ambos, e dita uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma D-ami-notransferase e uma desidrogenase de D-aminoácido possuem atividadelimitada, especificidade limitada, ou ambas para a monatina de ácido S-alfaceto.

21. Método que compreende: produzir R,R monatina ou sal destaatravés de uma via que compreende produzir D-triptofano a partir de L-tripto-fano, produzir indol-3-piruvato de D-triptofano, produzir precursor de R-mona-tina a partir de indol-3-piruvato, e produzir R,R-monatina a partir de pre-cursor de R-monatina; onde a produção do D-triptofano a partir do L-tripto-fano é facilitada por uma ou mais enzimas selecionadas a partir de uma ra-cemase de triptofano, uma racemase que possui a atividade de uma race-mase de triptofano, e combinações destas.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, onde a dita race-mase que possui a atividade de uma racemase de triptofano é derivada deuma racemase de alanina, uma racemase de glutamato, ou uma racemasede aspartato.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, onde a dita race-mase que possui a atividade de uma racemase de triptofano é selecionada apartir de uma racemase de alanina de SEQ ID NO:43, uma racemase de a-lanina correspondente a SEQ ID NO:41 com uma mutação M35C, uma ra-cemase de alanina correspondente a SEQ ID NO:41 com uma mutaçãoF66E, uma racemase de alanina correspondente a SEQ ID NO:41 com umamutação Y354A, uma racemase de alanina correspondente a SEQ ID NO:41com uma mutação P197L, e homólogos destas.

24. Método de acordo com a reivindicação 21, onde a produçãodo indol-3-piruvato a partir do D-triptofano é facilitada por uma ou mais en-zimas e a produção da R,R monatina a partir do precursor de R-monatina éfacilitada pelas mesmas uma ou mais enzimas que facilitam a produção daR,R monatina a partir do precursor de R-monatina.

25. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o métodocompreende adicionalmente uma reação acoplada ao L-triptofano onde umsubstrato de ácido alfa-ceto é convertido em um D-aminoácido correspon-dente.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, onde o dito subs-trato de ácido alfa-ceto é um ou mais substratos selecionados a partir dealfa-cetoglutarato, oxaloacetato, e piruvato que é convertido em um ou maisprodutos correspondentes selecionados a partir de L-glutamato, L-aspartato,L-alanina, respectivamente; onde, o dito produto correspondente é converti-do em um D-aminoácido correspondente selecionado a partir de D-gluta-mato, D-aspartato, e D-alanina, respectivamente, utilizando uma racemasepara facilitar a conversão para o D-aminoácido.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, onde a dita race-mase é selecionada a partir de uma racemase de alanina, uma racemase deglutamato, e uma racemase de aspartato.

28. Método de acordo com a reivindicação 27, onde a dita race-mase de alanina é selecionada a partir de um homólogo termoestável deuma racemase de alanina de Bacillus stearothermophilus e uma racemase dealanina de Geobacillus stearothermophilus, a dita racemase de glutamato éselecionada a partir de uma racemase de glutamato L. brevis e uma racema-se de glutamato P. pentosaceus, e a dita racemase de aspartato é ASPR-101de BioCatalytics.

29. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a produçãoda R,R monatina a partir do precursor de R-monatina é facilitada por umaaminotransferase de estereoinversão.

30. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreendeadicionalmente produzir L-glutamato a partir de alfa-cetoglutarato quandoL-triptofano reagir para formar indol-3-piruvato, e produzir 4-aminobutanoatoa partir do L-glutamato utilizando uma descarboxilase de glutamato.

31. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreendeadicionalmente produzir L-aspartato a partir de oxaloacetato quando L-tripto-fano reagir para formar indol-3-piruvato e produzir beta-alanina a partir doL-aspartato utilizando uma descarboxilase de aspartato.

32. Método de acordo com a reivindicação 1, que compreendeadicionalmente produzir L-aspartato a partir de oxaloacetato quando o L-tripto-fano reagir para formar indol-3-piruvato, produzir L-alanina a partir do L-aspar-tato que utiliza uma 4-descarboxilase de aspartato, e produzir D-alanina apartir da L-alanina utilizando uma racemase de alanina.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, onde a R,R mo-natina é formada a partir do precursor de R-monatina através de reação deprecursor de R-monatina com a D-alanina.

34. Método de acordo com a reivindicação 1, onde o métodocompreende adicionalmente:(a) produzir L-glutamato através de reação de alfa-cetoglutarato,onde a dita reação de alfa-cetoglutarato é acoplada à reação de L-triptofano;(b) produzir L-alanina através de reação de dito L-glutamatocom piruvato utilizando uma aminotransferase de L-alanina; e,(c) produzir D-alanina a partir de L-alanina utilizando uma race-mase de alanina, onde a dita R,R monatina é produzida a partir de precursorde R-monatina através de uma reação de transaminação de dito precursorde R-monatina com dita D-alanina.

35. Método de acordo com a reivindicação 2, onde as ditas umaou mais enzimas são imobilizadas sobre um suporte sólido.

36. Método para produzir monatina, ou um sal desta, que com-preende reagir D-triptofano e uma ou mais D-aminotransferases seleciona-das a partir de uma D-aminotransferase de Bacillus halodurans, uma D-ami-notransferase híbrida, uma D-aminotransferase de Geobacillus stearother-mophilus, uma D-aminotransferase de Bacillus licheniformis, uma D-amino-transferase de ATCC 4978, uma D-aminotransferase de ATCC 7063, e ho-mólogos destas.

37. Método de acordo com a reivindicação 36, onde pelo menoscerca de 75% de monatina produzida é R,R monatina.

38. Método para produzir monatina, ou um sal desta, que com-preende reagir o precursor de monatina e uma ou mais D-aminotransferasesselecionadas a partir de uma D-aminotransferase de Bacillus halodurans,uma D-aminotransferase híbrida, uma D-aminotransferase de Geobacillusstearothermophilus, uma D-aminotransferase de Bacillus licheniformis, umaD-aminotransferase de ATCC 4978, uma D-aminotransferase de ATCC-7063, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformisque possui atividade de D-aminotransferase, e homólogos destas.

39. Método que compreende purificar uma D-aminotransferasena presença de piridoxal-5'-fosfato.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, onde a dita D-ami-notransferase é uma aminotransferase de D-alanina de Bacillus sphaericus.

41. Composição que compreende precursor de R-monatina,L-triptofano, um D-aminoácido e uma ou mais enzimas que possuem ativi-dade maior, especificidade maior, ou ambas, para L-triptofano do que paraprecursor de monatina ou para monatina.

42. Composição de acordo com a reivindicação 41, onde as di-tas uma ou mais enzimas são selecionadas a partir de uma aminotransfera-se de L-triptofano, uma aminotransferase L-aromática, uma aminotransfera-se de L-aspartato, e uma oxidase de L-aminoácido.

43. Composição de acordo com a reivindicação 41, onde as di-tas uma ou mais enzimas consistem em uma aminotransferase de estereo-in versão.

44. Composição de acordo com a reivindicação 41, onde a ditacomposição compreende adicionalmente uma enzima selecionada a partirde uma D-aminotransferase e uma desidrogenase de D-aminoácido.

45. Composição de acordo com a reivindicação 41, onde a ditacomposição compreende adicionalmente uma ou mais enzimas que possu-em atividade da aldolase R-específica.

46. Composição de acordo com a reivindicação 41, onde a ditacomposição compreende adicionalmente uma ou mais enzimas seleciona-das a partir de uma racemase de alanina, uma racemase de glutamato, euma racemase de aspartato.

47. D-aminotransferase híbrida, que compreende SEQ ID NO:99,ou um homólogo desta.

48. D-aminotransferase de ATCC 4978, que compreende SEQID NO:86, ou um homólogo desta.

49. D-aminotransferase de ATCC 7063, que compreende SEQID NO:87, ou um homólogo desta.

50. Aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheni-formis que possui atividade de D-aminotransferase selecionada a partir deuma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis comuma mutação correspondente a E. coli F37Y, uma aminotransferase de ca-deia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação correspondentea E. coli Y96F, a aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheni-formis com uma mutação correspondente a E. coli Y165L, uma aminotrans-ferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação cor-respondente a E. coli L127K, uma aminotransferase de cadeia ramificada deBacillus licheniformis com uma mutação correspondente a E. coli R98Y, umaaminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com umamutação correspondente a £ coli L108R, uma aminotransferase de cadeiaramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação correspondente a E.coli L110H, uma aminotransferase de cadeia ramificada de Bacillus licheni-formis com uma mutação correspondente a E. coli L127Y, uma aminotrans-ferase de cadeia ramificada de Bacillus licheniformis com uma mutação cor-respondente a E. coli R41K, e homólogos destas.

51. Racemase que compreende SEQ ID NO:43, ou um homólo-go desta. i

52. D-aminotransferase purificada na presença de piridoxal-5'-fosfato, onde a dita D-aminotransferase apresenta atividade aperfeiçoadaquando comparada com a mesma D-aminotransferase não purificada napresença de piridoxal-5'-fosfato.