BRPI0610031A2

BRPI0610031A2 - polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo isolado, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo e para produzir um mutante de uma célula precursora, célula mutante, métodos para produzir uma proteìna, e para produzir um polinucleotìdeo, polinucleotìdeo, mutante, composição detergente, e, método para degradar biomassa contendo celulose e hemi-celulose

Info

Publication number: BRPI0610031A2
Application number: BRPI0610031-7A
Authority: BR
Inventors: Alfredo Lopez De Leon; Micheal Rey; Elena Vlasenko; Paul Harris; Hanshu Ding
Original assignee: Novozymes Inc
Priority date: 2005-04-27
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2010-05-18
Also published as: EP1877551B1; US7824884B2; US20080289067A1; DK1877551T3; ATE447013T1; CA2606475A1; WO2006116682A2; ES2336026T5; WO2006116682A3; EP1877551B2; US20110014707A1; CA2606475C; CN101253263B; EP1877551A2; CN101253263A; US8119857B2; ES2336026T3; DK1877551T4; DE602006010051D1

Abstract

POLIPEPTìDEO ISOLADO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, CéLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, MéTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTìDEO E PARA PRODUZIR UM MUTANTE DE UMA CéLULA PRECURSORA, CéLULA MUTANTE, METODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEìNA, E PARA PRODUZIR UM POLINUCLEOTìDEO, POLINUCLEOTìDEO MUTANTE, COMPOSIçãO DETERGENTE, E, MéTODO PARA DEGRADAR BIOMASSA CONTENDO CELULOSE E HEMI-CELULOSE. A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isolados tendo atividade de endoglicanase e polinucleotídeos isolados que codificam os polipeptídeos. A invenção também diz respeito a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeos assim como a métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Description

"POLIPEPTÍDEO ISOLADO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO,CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃORECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE,MÉTODOS PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO E PARA PRODUZIRUM MUTANTE DE UMA CÉLULA PRECURSORA, CÉLULAMUTANTE, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA E PARAPRODUZIR UM POLINUCLEOTÍDEO, POLINUCLEOTÍDEOMUTANTE, PLANTA TRANS GÊNICA, PARTE DE PLANTA OUCÉLULA VEGETAL, COMPOSIÇÃO DETERGENTE, E, MÉTODOPARA DEGRADAR BIOMASSA CONTENDO CELULOSE E HEMI-CELULOSE"

Declaração como para os Direitos às Invenções Feitas Sob Pesquisa eDesenvolvimento Patrocinados pelo Governo Federal

Esta invenção foi feita com apoio do Governo sob oSubcontrato NREL N° ZCO-30017-02, Prime Contract DE-AC36-98G010337outorgado pelo Departamento de Energia. O governo tem certos direitos nestainvenção.

Fundamentos da invenção

Campo da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglicanase e polinucleotídeos isolados que codificamos polipeptídeos. A invenção também diz respeito às construções de ácidonucleico, vetores e células hospedeiras que compreendem os polinucleotídeosassim como aos métodos para produzir e usar os polipeptídeos.

Descrição da Técnica Relacionada

A celulose é um polímero da glicose do açúcar simplescovalentemente ligada pelas ligações beta-1,4. Muitos microorganismosproduzem enzimas que hidrolisam glicanos ligados em beta. Estas enzimasincluem endoglicanases, celobioidrolases e beta-glicosidases. Asendoglicanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo-o ao ataque pelas celobioidrolases. As celobioidrolases seqüencialmenteliberam moléculas de celobiose das extremidades do polímero de celulose. Acelobioidrolase I é uma 1,4-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) aatividade da qual catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas nacelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo glicose ligado em beta--1,4, liberando celobiose das extremidades redutoras da cadeia. Acelobioidrolase II é uma 1,4-D-glicano celobioidrolase (E.C. 3.2.1.91) aatividade da qual catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas nacelulose, celotetriose ou qualquer polímero contendo glicose ligado em beta--1,4, liberando celobiose das extremidades não redutoras da cadeia. Acelobiose é um dímero ligado em beta-1,4 solúvel em água de glicose. Asbeta-glicosidases hidrolisam celobiose a glicose.

A conversão de matérias primas celulósicas em etanol tem asvantagens da pronta disponibilidade de grandes quantidades de matéria prima,o desejo de evitar queimar ou depositar em aterro sanitário os materiais e alimpeza do combustível de etanol. Madeira, resíduos agrícolas, safrasherbáceas e resíduos sólidos municipais têm sido considerados como matériasprimas para a produção de etanol. Estes materiais primariamente consistem decelulose, hemi-celulose e lignina. Uma vez que a celulose é convertida paraglicose, a glicose é facilmente fermentada pela levedura em etanol.

Kvesitadaze et ai, 1995, Applied Biochemistry eBiotechnology 50: 137-143, descrevem a isolação e as propriedades de umaendoglicanase termoestável a partir de uma cepa mutante termofílica deThielavia terrestris. Gilbert et al., 1992, Bioresource Technology 39: 147--154, descrevem a caracterização das enzimas presentes no sistema da celulosede Thielavia terrestris 255B. Breuil et al., 1986, Biotechnology Letters 8:-673-676, descrevem a produção e localização de celulases e beta-glicosidasesdas cepas de Thielavia terrestris 0464 e NRRL 8126.Seria uma vantagem na técnica identificar novasendoglicanases tendo propriedades melhoradas, tais como taxas de hidrólisemelhoradas, melhor estabilidade térmica, absorção reduzida para lignina e acapacidade para hidrolisar componentes não celulósicos da biomassa, taiscomo hemi-celulose, além de hidrolisar a celulose. As endoglicanases comuma ampla faixa de atividades colaterais sobre a hemi-celulose podem serespecialmente benéficas para melhorar o rendimento da hidrólise global desubstratos de biomassa ricos em hemi-celulose, complexos.

É um objetivo da presente invenção fornecer polipeptídeosmelhorados tendo atividade de endoglicanase e polinucleotídeos quecodificam os polipeptídeos.

Sumário da invenção

A presente invenção diz respeito a polipeptídeos isoladostendo atividade de endoglicanase selecionados do grupo que consiste de:

(a) um polipeptídeo que compreende uma seqüência deaminoácido que tenha pelo menos 60% de identidade com o polipeptídeomaduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 2;

(b) um polipeptídeo que é codificado por uma seqüência denucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência médiacom (i) o polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii)a seqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamento complementar de(i) ou (ii); e

(c) uma variante que compreende uma substituição, deleçãoe/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase,selecionado do grupo que consiste de:(a) um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelo menos 60% deidentidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2;

(b) um polinucleotídeo tendo pelo menos 60% de identidadecom o polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1; e

(c) um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menoscondições de estringência baixa com (i) o polipeptídeo maduro que codifica aseqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico quecompreende o polipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO:1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii).

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem osaminoácidos de 18 a 336 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência tem os nucleotídeos de 52 a1008 da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito a construções deácido nucleico, vetores de expressão recombinantes e células hospedeirasrecombinantes que compreendem os polinucleotídeos.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um tal polipeptídeo tendo atividade de endoglicanase quecompreendem: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinantecompreendendo uma construção de ácido nucleico que compreende umpolinucleotídeo que codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para aprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos de usar ospolipeptídeos tendo atividade de endoglicanase em detergentes e na conversãode celulose para glicose.

A presente invenção diz respeito ainda às construções de ácidonucleico que compreendem um gene que codifica uma proteína, em que ogene é operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpeptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 17da SEQ ID NO: 2, em que o gene é estranho para a seqüência de nucleotídeo.

Descrição Resumida das Figuras

As Figuras IA e 1B mostram a seqüência de cDNA e aseqüência de aminoácido deduzida de uma endoglicanase de Thielaviaterrestris NRRL 8126 (CEL7F) (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).

A Figura 2 mostra um mapa de restrição de pTter7F.

A Figura 3 mostra um mapa de restrição de pAlLol.

A Figura 4 mostra um mapa de restrição de pBANelO.

A Figura 5 mostra um mapa de restrição de pAlLo2.

A Figura 6 mostra um mapa de restrição de pAlLo22.

A Figura 7 mostra a conversão relativa de beta-glicano (1%p/v) depois de 2 horas de hidrólise no pH 5,5 e 60°C.

A Figura 8 mostra a conversão relativa de beta-glicano (1%p/v) depois de 24 horas de hidrólise no pH 5,5 e 60°C.

Definições

Atividade de endoglicanase: O termo "atividade deendoglicanase" é aqui definido como uma endo-l,4-beta-D-glicano 4-glicanoidrolase (E.C. No. 3.2.1.4) que catalisa a endoidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (tais comocarboximetil celulose e hidroxietil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 embeta-1,3 glicanos mistos tais como beta-D-glicanos ou xiloglicanos de cereal eoutro material vegetal contendo componentes celulósicos. Para os propósitosda presente invenção, a atividade de endoglicanase é determinada usando ahidrólise da carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento deGhose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268. Uma unidade de atividadede endoglicanase é definida como 1,0 mol de açúcares redutores produzidopor minuto a 50°C, pH 4,8.

Em um aspecto preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglicanase têm ainda atividade enzimáticacontra um ou mais substratos selecionados do grupo que consiste de xilano,xiloglicano, arabinoxilano, galactana, galactomanana, dextrano e quitina. Aatividade dos polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase nestes substratosde polissacarídeo é determinada como a quantidade relativa de coranteliberada de diferentes substratos tingidos com AZCL depois incubando ossubstratos (5 g por litro) com um polipeptídeo tendo atividade deendoglicanase da presente invenção (1 mg de proteína por g de substrato) por1 e 92 horas sem agitação no pH 5,0 (50 mM de acetato de sódio) e 50°C. Aliberação de corante foi determinada pela medição da absorbância a 590 nm.

Em um aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglicanase têm ainda atividade enzimáticacontra xilano. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos dapresente invenção tendo atividade de endoglicanase têm ainda atividadeenzimática contra xiloglicano. Em um outro aspecto mais preferido, ospolipeptídeos da presente invenção tendo atividade de endoglicanase têmainda atividade enzimática contra arabinoxilano. Em um outro aspecto maispreferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividade deendoglicanase têm ainda atividade enzimática contra galactana. Em um outroaspecto mais preferido, os polipeptídeos da presente invenção tendo atividadede endoglicanase têm ainda atividade enzimática contra galactomanana. Emum outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presente invenção tendoatividade de endoglicanase têm ainda atividade enzimática contra dextrano.

Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presente invençãotendo atividade de endoglicanase têm ainda atividade enzimática contraquitina. Em um outro aspecto mais preferido, os polipeptídeos da presenteinvenção tendo atividade de endoglicanase têm ainda atividade enzimáticacontra xilano, xiloglicano, arabinoxilano, galactana, galactomanana, dextranoe quitina.Os polipeptídeos da presente invenção têm pelo menos 20%,preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%,mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelomenos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% e ainda maispreferivelmente pelo menos 100% da atividade de endoglicanase dopolipeptídeo que consiste da seqüência de aminoácido mostrada como osaminoácidos de 18 a 336 da SEQ ID NO: 2.

Família 7 glicosídeo hidrolase ou Família GH7: Os termos"Família 7 glicosídeo hidrolase" ou "Família GH7" ou "CEL7F" são aquidefinidos como um polipeptídeo que cai dentro da Família 7 da glicosídeohidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, A classification of glycosylhydrolases based on amino-acid seqüence similarities, Biochem. J. 280: 309-316 e Henrissat B. e Bairoch A., 1996, Updating the seqüência-basedclassifícation of glycosyl hydrolases, Biochem. J. 316: 695-696.

Polipeptídeo isolado: O termo "polipeptídeo isolado" comoaqui usado refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado pelo SDS-PAGE.

Polipeptídeo substancialmente puro: O termo "polipeptídeosubstancialmente puro" indica aqui uma preparação de polipeptídeo quecontenha no máximo 10%>, preferivelmente no máximo 8%, maispreferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, maispreferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, aindamais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1%e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material depolipeptídeo com o qual o mesmo esteja naturalmente associado. É, portanto,preferido que o polipeptídeo substancialmente puro seja pelo menos 92%puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelomenos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, maispreferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97%)puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmentepelo menos 99%, o mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro e ainda maispreferivelmente 100% puro em peso do material de polipeptídeo total presentena preparação.

Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmenteem uma forma substancialmente pura. Em particular, é preferido que ospolipeptídeos estejam na "forma essencialmente pura", isto é, que apreparação de polipeptídeo seja essencialmente livre de outro material depolipeptídeo com o qual o mesmo esteja naturalmente associado. Isto pode serrealizado, por exemplo, pela preparação do polipeptídeo por meio de métodosrecombinantes bem conhecidos ou pelos métodos de purificação clássicos.

Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" ésinônimo com os termos "polipeptídeo isolado" e "polipeptídeo na formaisolada."

Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" é aquidefinido como um polipeptídeo tendo atividade de endoglicanase que está nasua forma final a seguir da tradução e quaisquer modificações pós-traducionais, tais como processamento de terminal N, truncagem de terminalC, glicosilação, etc.

Identidade: A relacionabilidade entre duas seqüências deaminoácido ou entre duas seqüências de nucleotídeo é descrita pelo parâmetro"identidade".

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de aminoácido é determinado pelo método Clustal(Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando o software LASERGENE®MEGALIGN® (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela deidentidade e os seguintes parâmetros de alinhamento múltiplo: Penalidade deintervalo de 10 e penalidade de comprimento de intervalo de 10. OsParâmetros de alinhamento aos pares são Ktuple = 1, penalidade de intervalo= 3, janela = 5 e diagonais = 5.

Para os propósitos da presente invenção, o grau de identidadeentre duas seqüências de nucleotídeo é determinada pelo método de Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipmano, 1983, Proceedings of the National Academy ofScience USA 80: 726-730) usando o software LASERGENE® MEGALIGN®(DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintesparâmetros de alinhamento múltiplo: Penalidade de intervalo de 10 epenalidade de comprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamentoaos pares são Ktuple = 3, penalidade de intervalo = 3 e janela = 20.

Fragmento de polipeptídeo: O termo "fragmento depolipeptídeo" é aqui definido como um polipeptídeo tendo um ou maisaminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila da SEQ ID NO: 2 ouuma seqüência homóloga desta, em que o fragmento tem atividade deendoglicanase. Preferivelmente, um fragmento contém pelo menos 270resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 285 resíduos deaminoácido e o mais preferivelmente pelo menos 300 resíduos de aminoácido,por exemplo, aminoácidos de 18 a 336 da SEQ ID NO: 2.

Subseqüência: O termo "subseqüência" é aqui definido comouma seqüência de nucleotídeo tendo um ou mais nucleotídeos deletados daextremidade 5' e/ou 3' da SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência homóloga desta,em que a subseqüência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividadede endoglicanase. Preferivelmente, uma subseqüência contém pelo menos 810nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 855 nucleotídeos e o maispreferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos.

Variante alélica: O termo "variante alélica" indica aquiqualquer de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmolocal cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através damutação e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. Asmutações de gene podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeocodificado) ou pode codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidoalteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeocodificado por uma variante alélica de um gene.

Polinucleotídeo isolado: O termo "polinucleotídeo isolado"como aqui usado refere-se a um polinucleotídeo que é pelo menos 20% puro,preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60%puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, o maispreferivelmente pelo menos 90% puro e ainda mais preferivelmente pelomenos 95% puro, como determinado pela eletroforese em agarose.

Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo"polinucleotídeo substancialmente puro" como aqui usado refere-se a umapreparação de polinucleotídeo livre de outros nucleotídeos estranhos ou nãodesejado e em um forma adequada para o uso dentro de sistemas de produçãode proteína geneticamente engendrada. Assim, um polinucleotídeosubstancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo8%>, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo5%>, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente nomáximo 1% e ainda mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outromaterial de polinucleotídeo com o qual o mesmo esteja naturalmenteassociado. Um polinucleotídeo substancialmente puro, entretanto, pode incluirque ocorrem naturalmente regiões 5' e 3' não traduzidas, tais comopromotores- e—terminadoresT—É—preferido—que—o—polinucleotídeo-substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelomenos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, maispreferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96%puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmentepelo menos 98% puro, o mais preferivelmente pelo menos 99% e ainda maispreferivelmente pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos dapresente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmentepura. Em particular, é preferido que os polinucleotídeos aqui divulgadosestejam na "forma essencialmente pura", isto é, que a preparação depolinucleotídeo esteja essencialmente livre de outro material depolinucleotídeo com o qual o mesmo esteja naturalmente associado. Aqui, otermo "polinucleotídeo substancialmente puro" é sinônimo com o termo"polinucleotídeo isolado" e "polinucleotídeo na forma isolada." Ospolinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética ou quaisquer combinações destes.

Polipeptídeo maduro que codifica a seqüência: O termo"polipeptídeo maduro que codifica a seqüência" é aqui definido como umaseqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendoatividade de endoglicanase.

cDNA: O termo "cDNA" é aqui definido como uma moléculade DNA que pode ser preparada pela transcrição reversa a partir de umamolécula de mRNA madura, combinada obtida de uma célula eucariótica. OcDNA carece de seqüências de intron que estão usualmente presentes noDNA genômico correspondente. O transcrito de RNA inicial, primário é umprecursor para o mRNA que é processado através de uma série de etapas antesde aparecer como mRNA maduro combinado. Estas etapas incluem aremoção de seqüências de intron por um processo chamado combinação. OcDNA derivado de mRNA carece, portanto, de quaisquer seqüências de

-----intron: —----------------------

Construção de ácido nucleico: O termo "construção de ácidonucleico" como aqui usado refere-se a uma molécula de ácido nucleico, defilamento único ou duplo, que é isolado de um gene que ocorre naturalmenteou que é modificado para conter segmentos de ácidos nucleicos em umamaneira que de outro modo não existiria na natureza. O termo construção deácido nucleico é sinônimo com o termo "cassete de expressão" quando aconstrução de ácido nucleico contém as seqüências de controle requeridaspara a expressão de uma seqüência codificadora da presente invenção.

Seqüência de controle: O termo "seqüências de controle" éaqui definido como incluindo todos os componentes, que são necessários ouvantajosos para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode sernativa ou estranha para a seqüência de nucleotídeo que codifica opolipeptídeo ou nativa ou estranha entre si. Tais seqüências de controleincluem, mas não são limitadas a, uma líder, seqüência de poliadenilação,seqüência propeptídica, promotor, seqüência de peptídeo de sinal eterminador de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem umpromotor e sinais de parada transcricionais e traducionais. As seqüências decontrole podem ser fornecidas com ligadores com o propósito de introduzirsítios de restrição específicos que facilitem a ligação das seqüências decontrole com a região codificadora da seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo.

Operavelmente ligado: O termo "operavelmente ligado" indicaaqui uma configuração em que uma seqüência de controle é colocada em umaposição apropriada em relação à seqüência codificadora da seqüência depolinucleotídeo tal que a seqüência de controle direcione a expressão daseqüência codificadora de um polipeptídeo.

Seqüência codificadora: Quando aqui usado o termo"seqüência codificadora" significa uma seqüência de nucleotídeo, quediretamente especifica a seqüência de aminoácido do seu produto de proteína.Os limites da seqüência codificadora são no geral determinados por umamatriz de leitura aberta, que usualmente começa com o códon de partida ATGou códons de partida alternativos tais como GTG e TTG e termina com umcódon de parada tal como TAA, TAG e TGA. A seqüência codificadora podeser um DNA, cDNA ou seqüência de nucleotídeo recombinante.

Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer etapaenvolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitado a,transcrição, modificação pós transcricional, tradução, modificação póstraducional e secreção.

Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" é aquidefinido como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende umpolinucleotídeo que codifica um polipeptídeo da invenção e que éoperavelmente ligado aos nucleotídeos adicionais que fornecem a suaexpressão.

Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira", como aquiusado, inclui qualquer tipo de célula que é suscetível à transformação,transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ouvetor de expressão que compreende um polinucleotídeo da presente invenção.

Modificação: O termo "modificação" significa aqui qualquermodificação química do polipeptídeo que consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 2 ou uma seqüência homóloga desta assim como manipulaçãogenética do DNA que codifica este polipeptídeo. A modificação pode sersubstituições, deleções e/ou inserções de um ou mais aminoácidos assimcomo substituições de uma ou mais cadeias laterais de aminoácido.

Variante artificial: Quando aqui usado, o termo "varianteartificial" significa um polipeptídeo tendo atividade de endoglicanaseproduzida por um organismo que expressa uma seqüência de nucleotídeomodificada da SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência homóloga desta ou a regiãocodificadora madura desta. A seqüência de nucleotídeo modificada é obtidaatravés da intervenção humana pela modificação da seqüência de nucleotídeodivulgada na SEQ ID NO: 1 ou uma seqüência homóloga desta ou a regiãocodificadora madura desta.

Descrição Detalhada da Invenção

Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglicanase

Em um primeiro aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados que compreendem uma seqüência de aminoácido quetem um grau de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2 depelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelomenos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmentepelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda maispreferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95% eainda mais preferivelmente pelo menos 97%, 98% ou 99%, tendo atividade deendoglicanase (daqui em diante "polipeptídeos homólogos"). Em um aspectopreferido, os polipeptídeos homólogos têm uma seqüência de aminoácido quedifere em dez aminoácidos, preferivelmente em cinco aminoácidos, maispreferivelmente em quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente em trêsaminoácidos, o mais preferivelmente em dois aminoácidos e ainda maispreferivelmente em um aminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO:2.

Um polipeptídeo da presente invenção preferivelmentecompreende a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variantealélica desta; ou um fragmento desta que tem atividade de endoglicanase. Emum aspecto preferido, um polipeptídeo compreende a seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo compreende os aminoácidos de 18 a336 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmento destaque tem atividade de endoglicanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo compreende os aminoácidos de 18 a 336 da SEQ ID NO: 2. Emum outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste da seqüência deaminoácido da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou um fragmentodesta que tem atividade de endoglicanase. Em um outro aspecto preferido, umpolipeptídeo consiste da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2. Em umoutro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro daSEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, um polipeptídeo consiste dosaminoácidos 18 a 336 da SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica desta; ou umfragmento desta que tem atividade de endoglicanase. Em um outro aspectopreferido, um polipeptídeo consiste dos aminoácidos de 18 a 336 da SEQ IDNO: 2.

Em um segundo aspecto, a presente invenção diz respeito apolipeptídeos isolados tendo atividade de endoglicanase que são codificadospelos polinucleotídeos que hibridizam sob condições de estringência muitobaixa, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmentecondições de estringência média, mais preferivelmente condições deestringência média-alta, ainda mais preferivelmente condições de estringênciaalta e o mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i) aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (iii) uma subseqüência de (i) ou (ii)ou (iv) um filamento complementar de (i), (ii) ou (iii) (J. Sambrook, E. F.Fritsch e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2aedição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque). Uma subseqüência da SEQ IDNO: 1 contém pelo menos 100 nucleotídeos contíguos ou preferivelmentepelo menos 200 nucleotídeos contíguos. Além disso, a subseqüência podecodificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de endoglicanase.

Em um aspecto preferido, a seqüência codificadora do polipeptídeo madurotem os nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ ID NO: 1.

A seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou umasubseqüência desta, assim como a seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2ou um fragmento desta, podem ser usados para planejar uma sonda de ácidonucleico para identificar e clonar os polipeptídeos que codificam o DNAtendo atividade de endoglicanase a partir de cepas de gêneros ou espéciesdiferentes de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular,tais sondas podem ser usadas para a hibridização com o genoma ou cDNA dogênero ou espécie de interesse, seguindo os procedimentos de Southernblotting padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente nesselugar. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que aseqüência inteira, mas deve ter pelo menos 14, preferivelmente pelo menos25, mais preferivelmente pelo menos 35 e o mais preferivelmente pelo menos70 nucleotídeos no comprimento. É, entretanto, preferido que a sonda deácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos no comprimento. Porexemplo, a sonda de ácido nucleico podem ter pelo menos 200 nucleotídeos,preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelomenos 400 nucleotídeos ou o mais preferivelmente pelo menos 500nucleotídeos no comprimento, sondas ainda mais longas podem ser usadas,por exemplo, sondas de ácido nucleico que têm pelo menos 600 nucleotídeos,preferivelmente pelo menos 700 nucleotídeos, mais preferivelmente pelomenos 800 nucleotídeos ou o mais preferivelmente pelo menos 900nucleotídeos no comprimento. Sondas tanto de DNA quanto de RNA podemser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detectar o genecorrespondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina ou avidina). Taissondas são abrangidas pela presente invenção.

Uma biblioteca de DNA ou cDNA genômica preparada a partirde tais outros organismos, portanto, pode ser tríada quanto ao DNA quehibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglicanase. O genômico ou outro DNA a partir do qual taisoutros organismos podem ser separados pela eletroforese em gel de agaroseou poliacrilamida ou outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ouo DNA separado podem ser transferidos e imobilizados em nitrocelulose ououtro material carregador adequado. De modo a identificar um clone ou DNAque seja homólogo com a SEQ ID NO: 1 ou uma subseqüência desta, omaterial carregador é usado em um Southern blot.

Para os propósitos da presente invenção, a hibridização indicaque a seqüência de nucleotídeo hibridiza com uma sonda de ácido nucleicorotulada que corresponde à seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ IDNO: 1, a seqüência de DNA genômico que compreende a SEQ ID NO: 1, seufilamento complementar ou uma subseqüência desta, sob condições deestringência de muito baixas a muito altas. As moléculas às quais a sonda deácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usado, porexemplo, películas de raio X.

Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1. Em umoutro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico tem os nucleotídeos de 52 a1008 da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácidonucleico é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo daSEQ ID NO: 2 ou uma subseqüência desta. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, asonda de ácido nucleico é a seqüência codificadora do polipeptídeo maduroda SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleicoé a seqüência de polinucleotídeo contida no plasmídeo pTter7F que estácontida na E. coli NRRL B-30837, em que a seqüência de polinucleotídeodesta codifica um polipeptídeo tendo atividade de lipase. Em um outroaspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro contida no plasmídeo pTter7F que está contida na E. coliNRRL B-30837.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, as condições de estringência de muito baixas a muito altas sãodefinidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% deSDS, 200 )Lig/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado e25% de formamida para as estringências muito baixas e baixas, 35% deformamida para as estringências médias e média-altas ou 50% de formamidapara as estringências altas e muito altas, seguindo os procedimentos deSouthern blotting padrão idealmente por 12 a 24 horas.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos nocomprimento, o material carregador é finalmente lavado três vezes cada umapor 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% de SDS preferivelmente pelo menos a45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C(estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringênciamédia), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta),ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (estringência alta) e o maispreferivelmente pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que têm cerca de 15 nucleotídeos a cerca de70 nucleotídeos no comprimento, as condições de estringência são definidascomo lavagem de pré-hibridização, hibridização e pós-hibridização a cerca de5°C a cerca de 10°C abaixo da Tm calculada, usando o cálculo de acordo comBolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 48: 1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7,6, 6 mM deEDTA, 0,5% de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato desódio, 1 mM de fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM de ATP e 0,2 mg deRNA de levedura por ml seguindo os procedimentos de Southern blottingpadrão idealmente por 12 a 24 horas.

Para sondas curtas que têm cerca de 15 nucleotídeos a cerca de70 nucleotídeos no comprimento, o material carregador é lavado uma vez em6X SCC mais 0,1% de SDS por 15 minutos e duas vezes cada uma por 15minutos usando 6X SSC de 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada.Em um terceiro aspecto, a presente invenção diz respeito avariantes artificiais que compreendem uma substituição, deleção e/ou inserçãoconservativa de um ou mais aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou uma seqüênciahomóloga desta; ou o polipeptídeo maduro desta. Preferivelmente, asmudanças de aminoácido são de uma natureza menor, isto é substituições ouinserções de aminoácido conservativas que não afetam significantemente adobra e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um acerca de 30 aminoácidos; extensões de terminal amino ou carboxila pequenas,tais como um resíduo de metionina de terminal amino; um peptídeo ligadorpequeno de até cerca de 20 a 25 resíduos; ou uma extensão pequena quefacilite a purificação pela mudança da carga líquida ou uma outra função, talcomo um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio deligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão dentro dogrupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidosácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina easparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina),aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina) e aminoácidospequenos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). As substituições deaminoácido que no geral não alteram a atividade específica são conhecidas natécnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R. L. Hill, 1979, Em,The proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças que maishabitualmente ocorre são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly,Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Vai, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn,Leu/Ile, Leu/Vai, Ala/Glu e Asp/Gly.

Além dos 20 aminoácidos padrão, os aminoácidos não padrão(tais como 4-hidroxiprolina, 6-N-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico,isovalina e alfa-metil serina) podem ser substituídos no lugar de resíduos deaminoácido de um polipeptídeo do tipo selvagem. Um número limitado deaminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelocódigo genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos no lugarde resíduos de aminoácido. Os "aminoácidos não naturais" têm sidomodificados depois da síntese da proteína e/ou têm uma estrutura químicana(s) sua(s) cadeia(s) lateral(is) diferentes daquela dos aminoácidos padrão.Os aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados epreferivelmente, são comercialmente disponíveis e incluem ácido pipecólico,ácido tiazolidino carboxílico, desidroprolina, 3- e 4-metilprolina e 3,3-dimetilprolina.

Alternativamente, as mudanças de aminoácido são de umanatureza tal que as propriedades psicoquímica dos polipeptídeos sejamalteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácido podem melhorar aestabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade de substrato,mudar o pH ideal e outros.

Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo precursor podemser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, taiscomo mutagênese direcionada ao sítio ou mutagênese de varredura de alanina(Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnicamencionado em segundo lugar, as mutações de alanina individuais sãointroduzidas em cada resíduo na molécula e as moléculas mutantes resultantessão testadas quanto a atividade biológica (isto é, atividade de endoglicanase)para identificar resíduos de aminoácido que são críticos pára a atividade damolécula. Ver também, Hilton et ai, 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. Osítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode serdeterminada pela análise química da estrutura, como determinado por técnicastais como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétron ourotulação de fotoafinidade, em conjunção com a mutação de aminoácidos desítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al, 1992, Science 255:306-312; Smith et al, 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et ai,1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciaistambém podem ser deduzidas da análise de identidades com polipeptídeos queestejam relacionados a um polipeptídeo de acordo com a invenção.

As substituições de aminoácido individuais ou múltiplaspodem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese,recombinação e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento detriagem relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer,1988, Science 241: 5357; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podemser usados incluem PCR propensa a erro, demonstração de fago (por exemplo,Lowman et ai, 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente U.S. N° 5.223.409;WO 92/06204) e mutagênese direcionada à região (Derbyshire et ai, 1986,Gene 46: 145; Ner et ai, 1988, DNA 7: 127).

Os métodos de mutagênese/embaralhamento podem sercombinados com métodos de triagem de alto rendimento, automatizados paradetectar a atividade de polipeptídeos clonados, mutagenizados expressadospelas células hospedeiras (Ness et ai, 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeosativos podem ser recuperados das células hospedeiras e rapidamenteseqüenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem adeterminação rápida da importância de resíduos de aminoácido individuaisem um polipeptídeo de interesse e podem ser aplicados aos polipeptídeos deestrutura desconhecida.

O número total de substituições, deleções e/ou inserções deaminoácido do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2, tal como dosaminoácidos de 18 a 336 da SEQ ID NO: 2, é 10, preferivelmente 9, maispreferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente3, o mais preferivelmente 2 e ainda mais preferivelmente 1.Fontes de Polipeptídeos Tendo Atividade de Endoglicanase

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser obtido a partirde microorganismos de qualquer gênero. Para os propósitos da presenteinvenção, o termo "obtido a partir de" como aqui usado em conexão com umafonte dada deve significar que o polipeptídeo codificado por uma seqüênciade nucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma cepa em que a seqüência denucleotídeo da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeoobtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelularmente.

Um polipeptídeo da presente invenção pode ser umpolipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser umpolipeptídeo bacteriano gram positivo tal como um polipeptídeo de Bacillus,por exemplo, um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillusamiloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus coagulans,Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis ou Bacillus thuringiensis tendoatividade de endoglicanase; ou um polipeptídeo de Streptomyces tendoatividade de endoglicanase, por exemplo, um polipeptídeo de Streptomyceslividans ou Streptomyces murinus tendo atividade de endoglicanase; ou umpolipeptídeo bacteriano gram negativo, por exemplo, um polipeptídeo de E.coli ou um Pseudomonas sp. tendo atividade de endoglicanase.

Um polipeptídeo da presente invenção também pode ser umpolipeptídeo fungico e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura talcomo um polipeptídeo de Cândida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,Schizosaccharomyces ou Yarrowia tendo atividade de endoglicanase; ou maispreferivelmente um polipeptídeo fungico filamentoso tal como umpolipeptídeo de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Cryptococcus,Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora,Neocafflmastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces,Schizophillum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium ouTrichoderma tendo atividade de endoglicanase.

Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo deSaccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycesdiastaticus, Saccharomyces douglasfi, Saccharomyces kluyveri,Saccharomyces norbensis ou Saccharomyces oviformis tendo atividade deendoglicanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillusfumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans,Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium bactridioides, Fusariumcerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides,Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucormiehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicilliumpurpurogenum, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride tendo atividadede endoglicanase.

Em um outro aspecto preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielaviaalbopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora,Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielaviasetosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Thielavia terricola,Thielavia thermophila, Thielavia variospora ou Thielavia wareingfi tendoatividade de endoglicanase.

Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é umpolipeptídeo de Thielavia terrestris tendo atividade de endoglicanase e o maispreferivelmente um Thielavia terrestris NRRL 8126 tendo atividade deendoglicanase, por exemplo, o polipeptídeo da SEQ ID NO: 2 ou opolipeptídeo maduro desta.

Será entendido que para as espécies anteriormentemencionadas a invenção abrange os estados tanto perfeito quanto imperfeito eoutros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, independente donome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Aqueles habilitados na técnicafacilmente reconhecerão a identidade de equivalentes apropriados.

A cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao públicoem várias coleções de cultura, tais como a American Type Culture Collection(ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) e AgriculturalResearch Service Patent Culture Collection, Northern Regional ResearchCenter (NRRL).

Além disso, tais polipeptídeos podem ser identificados eobtidos a partir de outras fontes incluindo microorganismos isolados danatureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) usando as sondasmencionadas acima. As técnicas para isolar microorganismos de habitaisnaturais são bem conhecidos na técnica. O polinucleotídeo pode ser depoisobtido pela triagem de similaridade de uma biblioteca genômica ou de cDNAde um tal microorganismo. Uma vez que uma seqüência de polinucleotídeoque codifica um polipeptídeo foi detectada com a(s) sonda(s), opolinucleotídeo pode ser isolado ou clonado utilizando-se técnicas que sãobem conhecidas por aqueles de habilidade comum na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et ai., 1989, supra).

Os polipeptídeos da presente invenção também incluempolipeptídeos fundidos ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que um outropolipeptídeo é fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptídeo oufragmento desta. Um polipeptídeo fundido é produzido fundindo-se umaseqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) que codifica um outropolipeptídeo a uma seqüência de nucleotídeo (ou uma porção desta) dapresente invenção. As técnicas para produzir polipeptídeos de fusão sãoconhecidas no ramo e incluem ligar as seqüências codificadoras quecodificam os polipeptídeos de modo que elas estejam na matriz e que aexpressão do polipeptídeo fundido esteja sob o controle do(s) mesmo(s)promotor(es) e terminador(es).Polinucleotídeos

A presente invenção também diz respeito aos polinucleotídeosisolados que compreendem ou que consistem de uma seqüência denucleotídeo que codifica um polipeptídeo da presente invenção tendoatividade de endoglicanase.

Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende ou consiste da SEQ ID NO: 1. Em um outro aspecto maispreferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste da seqüênciacontida no plasmídeo pTter7F que está contido na E. coli NRRL B-30837. Emum outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste da região codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1.

Em um outro aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ouconsiste dos nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ ID NO: 1. Em um outroaspecto mais preferido, a seqüência de nucleotídeo compreende ou consiste daregião codificadora do polipeptídeo maduro contida no plasmídeo pTter7Fque está contido na E. coli NRRL B-30837. A presente invenção tambémabrange seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo quecompreende ou que consiste da seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2ou o polipeptídeo maduro desta, que diferem da SEQ ID NO: 1 ou aseqüência codificadora do polipeptídeo maduro desta em virtude dadegenerescência do código genético. A presente invenção também dizrespeito às subseqüências da SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos daSEQ ID NO: 2 que têm atividade de endoglicanase.

A presente invenção também diz respeito a mutantes depolinucleotídeo que compreendem pelo menos uma mutação na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a seqüênciade nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2. Emum aspecto preferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 18 a 336da SEQ ID NO: 2.

As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeoque codifica um polipeptídeo são conhecidas no ramo e incluem a isolação deDNA genômico, preparação de cDNA ou uma combinação destas. Aclonagem dos polinucleotídeos da presente invenção de tal DNA genômicopode ser efetuada, por exemplo, usando-se a reação da cadeia da polimerase(PCR) bem conhecida ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressãopara detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturaiscompartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et ai., 1990, PCR: A Guide toMethods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outrosprocedimentos de amplificação de ácido nucleico tais como a reação decadeia da ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação combase em seqüência de nucleotídeo (NASBA) podem ser usados. Ospolinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Thielavia ou umoutro organismo ou organismo relacionado e assim, por exemplo, podem seruma espécie alélica ou variante do polipeptídeo que codifica a região daseqüência de nucleotídeo.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosque compreendem seqüências de nucleotídeo que têm um grau de identidadecom a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 depelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 65%, mais preferivelmente pelomenos 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmentepelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, maispreferivelraente pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente pelo menos95% e o mais preferivelmente pelo menos 97% de identidade, que codificaum polipeptídeo ativo. Em um aspecto preferido, a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro tem os nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ ID NO: 1.

A modificação de uma seqüência de nucleotídeo que codificaum polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese depolipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo"substancialmente similar" ao polipeptídeo refere-se às formas que nãoocorrem naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir emalgum modo engendrado do polipeptídeo isolado da sua fonte nativa, porexemplo, variantes artificiais que diferem na atividade específica,termoestabilidade, pH ideal ou semelhante. A seqüência variante pode serconstruída com base na seqüência de nucleotídeo apresentada como a regiãoque codifica o polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, por exemplo, umasubseqüência desta e/ou pela introdução de substituições de nucleotídeo quenão dão origem a uma outra seqüência de aminoácido do polipeptídeocodificado pela seqüência de nucleotídeo, mas que corresponde ao uso decódon do organismo hospedeiro pretendido para a produção da enzima oupela introdução de substituições de nucleotídeo que podem dar origem a umaseqüência de aminoácido diferente. Para uma descrição geral de substituiçãode nucleotídeo, ver, por exemplo, Ford et ai, 1991, Protein Expression andPurification2: 95-107.

Estará evidente àqueles habilitados na técnica que taissubstituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função damolécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos deaminoácido essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo isolado da invenção e portanto preferivelmente não submetidoà substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentosconhecidos na técnica, tais como mutagênese direcionada ao sítio oumutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells,1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica mencionada em segundo lugar,mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado namolécula e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividadede endoglicanase para identificar resíduos de aminoácido que são críticos paraa atividade da molécula. Os sítios de interação de enzima substrato tambémpodem ser determinados pela análise da estrutura tridimensional comodeterminada por tais técnicas como análise de ressonância magnética nuclear,cristalografia ou rotulação por fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et ai,1992, Science 255: 306-312; Smith et ai, 1992, Journal of Molecular Biology224: 899-904; Wlodaver et ai, 1992, FEBS Letters 309: 59-64).

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados que codificam um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizamsob condições de estringência muito baixa, preferivelmente condições deestringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência média,mais preferivelmente condições de estringência média-alta, ainda maispreferivelmente condições de estringência alta e o mais preferivelmentecondições de estringência muito altas com (i) a seqüência codificadora dopolipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômicoque compreende a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 1 ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); ou variante alélicas esubseqüências deste (Sambrook et ah, 1989, supra), como aqui definido. Emum aspecto preferido, a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro temos nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito a polinucleotídeosisolados obtidos (a) pela hibridização de uma população de DNA sobcondições de estringência muito baixas, baixas, médias, média-altas, altas oumuito altas com (i) a seqüência codificadora do polipeptídeo maduro da SEQID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreende a seqüênciaI codiflcadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1 ou (iii) um filamentocomplementar de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, quecodifica um polipeptídeo tendo atividade de endoglicanase. Em um aspectopreferido, a seqüência codiflcadora do polipeptídeo maduro tem osnucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ ID NO: 1.

Construções de Ácido Nucleico

A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um polinucleotídeo isolado da presenteinvenção operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle quedirecionam a expressão da seqüência codiflcadora em uma célula hospedeiraadequada sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

Um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo dapresente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos parafornecer a expressão do polipeptídeo. A manipulação da seqüência depolinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ounecessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar asseqüências de polinucleotídeo que utilizam os métodos de DNA recombinantesão bem conhecidas no ramo.

A seqüência de controle pode ter uma seqüência promotoraapropriada, uma seqüência de nucleotídeo que é reconhecida por uma célulahospedeira para a expressão de um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. A seqüência promotora contém seqüênciasde controle transcricional que medeiam a expressão do polipeptídeo. Opromotor pode ser qualquer seqüência de nucleotídeo que mostre atividadetranscricional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes,truncados e híbridos e podem ser obtidos a partir dos genes que codificam ospolipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterologos paraa célula hospedeira.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção,especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotoresobtidos do operon lac de E. coli, gene da agarase (dagA) de Streptomycescoelicolor, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, gene da alfa-amilase (amil) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica(amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da alfa-amilase (amyQ) deBacillus amiloliquefaciens, gene da penicilinase (penP) de Bacilluslicheniformis, genes xilA e xilB de Bacillus subtilis e gene da beta-lactamaseprocariótica (VillaKamaroff et ai, 1978, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75: 3727-3731), assim como o promotor tac(DeBoer et ai, 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA80: 21-25). Outros promotores são descritos em "Useful proteins fromrecombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e emSambrook et ai, 1989, supra.

Os exemplos de promotores adequados para direcionar atranscrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em umacélula hospedeira fungica filamentosa são promotores obtidos a partir dosgenes para a TAKA amilase de Aspergillus oryzae, proteinase aspártica deRhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilaseestável a ácido de Aspergillus niger, glicoamilase (glaA) de Aspergillus nigerou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina deAspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae,acetamidase de Aspergillus nidulans, amiloglicosidase de Fusariumvenenatum (WO 00/56900), Fusarium venenatum Dada (WO 00/56900),Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), protease equivalente a tripsinade Fusarium oxysporum (WO 96/00787), beta-glicosidase de Trichodermareesei, celobioidrolase I de Trichoderma reesei, celobioidrolase II deTrichoderma reesei, endoglicanase I de Trichoderma reesei, endoglicanase IIde Trichoderma reesei, endoglicanase III de Trichoderma reesei,endoglicanase IV de Trichoderma reesei, endoglicanase V de Trichodermareesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei,beta-xilosidase de Trichoderma reesei, assim como o promotor NA2-tpi (umhíbrido dos promotores dos genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillusniger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae); e promotores destasmutantes, truncados e híbridos.

Em um hospedeiro de levedura, os promotores úteis sãoobtidos a partir dos genes para a enolase (ENO-1) de Saccharomycescerevisiae, galactoquinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcooldesidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/ GAP)de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) deSaccharomyces cerevisiae, metalotionina (CUP1) de Saccharomycescerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outrospromotores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas porRomanos et ai, 1992, Yeast 8: 423-488.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüênciaterminadora de transcrição adequada, uma seqüência reconhecida por umacélula hospedeira para terminar a transcrição. A seqüência terminadora éoperavelmente ligada ao terminal 3' da seqüência de nucleotídeo que codificao polipeptídeo. Qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeirade escolha pode ser usada na presente invenção.

Os terminadores preferidos para as células hospedeirasfilamentosas fungicas são obtidos a partir dos genes para a TAKA amilase deAspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase deAspergillus nidulans, alfa-glicosidase de Aspergillus niger e proteaseequivalente a tripsina de Fusarium oxysporum.

Os terminadores preferidos para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para a enolase de Saccharomycescerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae egliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outrosterminadores úteis para as células hospedeiras de levedura são descritas porRomanos et ai, 1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência líderadequada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para atradução pela célula hospedeira. A seqüência líder é operavelmente ligada aoterminal 5' da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo. Qualquerseqüência líder que seja funcional na célula hospedeira de escolha pode serusada na presente invenção.

Os líderes preferidos para as células hospedeiras füngicafilamentosa são obtidos a partir dos genes para a TAKA amilase de triosefosfato isomerase de Aspergillus oryzae e Aspergillus nidulans.

Os líderes adequados para as células hospedeiras de levedurasão obtidos a partir dos genes para a enolase (ENO-1) de Saccharomycescerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfade Saccharomyces cerevisiae e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

A seqüência de controle também pode ser uma seqüência depoliadenilação, uma seqüência operavelmente ligada ao terminal 3' daseqüência de nucleotídeo e que, quando transcrita, é reconhecida pela célulahospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNAtranscrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que seja funcional na célulahospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.

As seqüências de poliadenilação preferidas para as célulashospedeiras fungica filamentosa são obtidas a partir dos genes para a TAKAamilase de Aspergillus oryzae, glicoamilase de Aspergillus niger, antranilatosintase de Aspergillus nidulans, protease equivalente a tripsina de Fusariumoxysporum e alfa-glicosidase de Aspergillus niger.

As seqüências de poliadenilação úteis para as célulashospedeiras de levedura são descritas por Guo e Shermano, 1995, MolecularCellular Biology 15: 5983-5990.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de peptídeo de sinal que codifica uma seqüência de aminoácidoligada ao terminal amino de um polipeptídeo e direciona o polipeptídeocodificado no caminho secretor da célula. A extremidade 5' da seqüênciacodificadora da seqüência de nucleotídeo pode inerentemente conter umaregião codificadora de peptídeo de sinal naturalmente ligada na matriz deleitura de tradução com o segmento da região codificadora que codifica opolipeptídeo secretado. Alternativamente, a extremidade 5' da seqüênciacodificadora pode conter uma região codificadora de peptídeo de sinal queseja estranha para a seqüência codificadora. A região codificadora de peptídeode sinal estranha pode ser requerida onde a seqüência codificadora nãocontém naturalmente uma região codificadora de peptídeo de sinal.Alternativamente, a região codificadora de peptídeo de sinal estranha podesimplesmente substituir a região codificadora de peptídeo de sinal natural demodo a realçar a secreção do polipeptídeo. Entretanto, qualquer regiãocodificadora de peptídeo de sinal que direcione o polipeptídeo expressado nocaminho secretor de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretado emum meio de cultura, pode ser usado na presente invenção.

As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras bacteriana são as regiões codificadoras de peptídeo desinal obtidas a partir dos genes para a amilase maltogênica de Bacülus NCIB11837, alfa-amilase de Bacülus stearothermophilus, subtilisina de Bacilluslicheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, proteases neutras deBacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) e Bacillus subtilis prsA.Outros peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993,Microbiological Reviews 57: 109-137.

As regiões codificadoras de peptídeo de sinal eficazes para ascélulas hospedeiras fúngicas filamentosas são as regiões codificadoras depeptídeo de sinal obtidas a partir dos genes para TAKA amilase deAspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glicoamilase deAspergillus niger, proteinase de aspártica de Rhizomucor miehe, celulase deHumicola insolens, endoglicanase V de Humicola insolens e lipase deHumicola lanuginosa.

Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal tem osaminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2. Em um outro aspecto preferido, aregião codificadora de peptídeo de sinal tem os nucleotídeos de 1 a 51 da SEQID NO: 1 que codifica os aminoácidos de 1 a 17 da SEQ ID NO: 2.

Os peptídeos de sinal úteis para as células hospedeiras delevedura são obtidos a partir dos genes para o fator alfa de Saccharomycescerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiõescodificadoras de peptídeo de sinal úteis são descritas por Romanos et ah,1992, supra.

A seqüência de controle também pode ser uma regiãocodificadora de propeptídeo que codifica uma seqüência de aminoácidoposicionada no terminal amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultanteé conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zimogênio emalguns casos). Um propolipeptídeo é no geral inativo e pode ser convertido aum polipeptídeo ativo maduro pela clivagem catalítica ou autocatalítica dopropeptídeo a partir do propolipeptídeo. A região codificadora de propeptídeopode ser obtida a partir dos genes para a protease alcalina de Bacillus subtilis(aprE), protease neutra de Bacillus subtilis (nprT), fator alfa de

Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei elacase de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836).

Onde as regiões tanto de peptídeo de sinal quanto depropeptídeo estão presentes no terminal amino de um polipeptídeo, a regiãode propeptídeo é posicionada contígua ao terminal amino de um polipeptídeoe a região de peptídeo de sinal é posicionada contígua ao terminal amino daregião de propeptídeo.

Também pode ser desejável adicionar seqüências regulatóriasque possibilitem a regulagem da expressão do polipeptídeo em relação aocrescimento da célula hospedeira. Os exemplos de sistemas regulatórios sãoaqueles que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado emresposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de umcomposto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticosincluem os sistemas operadores lac, tac e trp. Em levedura, o sistema ADH2ou sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor deTAKA alfa-amilase, o promotor da glicoamilase de Aspergillus niger e opromotor da glicoamilase de Aspergillus oryzae podem ser usados comoseqüências reguladoras. Outros exemplos de seqüências reguladoras sãoaquelas que possibilitam a amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos,estes incluem o gene da diidrofoliato redutase que é amplificado na presençade metotrexato e os genes da metalotioneína que são amplificados com metaispesados. Nestes casos, a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeoseria operavelmente ligada com a seqüência reguladora.

Vetores de Expressão

A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes que compreendem um polinucleotídeo da presenteinvenção, um promotor e sinais de parada transcricionais e traducionais. Osvários ácidos nucleicos e seqüências de controle descritos aqui podem serunidos entre si para produzir um vetor de expressão recombinante que podeincluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ousubstituição da seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo em taissítios. Alternativamente, uma seqüência de nucleotídeo da presente invençãopode ser expressada pela inserção da seqüência de nucleotídeo ou umaconstrução de ácido nucleico que compreenda a seqüência em um vetorapropriado para a expressão. Na criação do vetor de expressão, a seqüênciacodificadora está localizada no vetor de modo que a seqüência codificadoraesteja operavelmente ligada com as seqüências de controle apropriadas para aexpressão.

O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor(por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientementesubmetido aos procedimentos de DNA recombinantes e podem realizar aexpressão da seqüência de nucleotídeo. A escolha do vetor tipicamentedependerá da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual ovetor deva ser introduzido. Os vetores podem ser plasmideos lineares oucirculares fechados.

O vetor pode ser um vetor que replica autonomamente, isto é,um vetor que exista como uma entidade extracromossômica, a replicação doqual é independente da replicação cromossômica, por exemplo, umplasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossoma ou umcromossoma artificial. O vetor pode conter qualquer meio para garantir aauto-replicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quandointroduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado juntocom o(s) cromossoma(s) no qual ele foi integrado. Além disso, um vetor ouplasmídeo individuais ou dois ou mais vetores ou plasmideos que juntoscontêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira ou umtransposon pode ser usado.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umou mais marcadores selecionáveis que permitem a seleção fácil de célulastransformadas, transfectadas, transduzidas ou células semelhantes. Ummarcador selecionável é um gene, o produto do qual fornece resistência abiocida ou viral, resistência aos metais pesados, prototrofia aos auxótrofos eoutros.

Os exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são osgenes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis ou marcadores queconferem resistência a antibiótico tal como resistência a ampicilina,canamicina, cloranfenicol ou tetraciclina. Os marcadores adequados para ascélulas hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3,TRP1 e URA3. Os marcadores selecionáveis para o uso em uma célulahospedeira fungica filamentosa incluem, mas não são limitados a, amdS(acetamidase), argB (ornitina carbamoiltransferase), bar (fosfmotricinaacetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase),pyrG (orotidina-5'-fosfato descarboxilase), sC (sulfate adeniltransferase) etrpC (antranilato sintase), assim como equivalentes destes. Preferidos para ouso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillusnidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm umelemento ou elementos que permitem a integração do vetor no genoma dacélula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente dogenoma.

Para a integração no genoma da célula hospedeira, o vetorpode contar com a seqüência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeoou qualquer outro elemento do vetor para a integração no genoma pelarecombinação homóloga ou não homólogo. Alternativamente, o vetor podeconter seqüências de nucleotídeo adicionais para direcionar a integração pelarecombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em uma localizaçãoou localizações exatas no(s) cromossoma(s). Para aumentar a probabilidadede integração em uma localização exata, os elementos integracionais devempreferivelmente conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como100 a 10.000 pares de base, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base e omais preferivelmente 800 a 10.000 pares de base, que têm um alto grau deidentidade com a seqüência alvo correspondente para realçar a probabilidadede recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquerseqüência que seja homóloga com a seqüência alvo no genoma da célulahospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências denucleotídeo não codificadoras ou codificadoras. Por outro lado, o vetor podeser integrado no genoma da célula hospedeira pela recombinação nãohomóloga.

Para a replicação autônoma, o vetor pode compreender aindauma origem de replicação que possibilite que o vetor replique autonomamentena célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquerreplicador plasmídico que medeie a replicação autônoma que funcione emuma célula. O termo "origem de replicação" ou "replicador plasmídico" éaqui definido como uma seqüência de nucleotídeo que possibilite que umplasmídeo ou vetor replique in vivo.

Os exemplos de origens bacterianas de replicação são asorigens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 epACYC184 que permitem a replicação na E. coli e pUBUO, pE194,pTA1060 e pAIVl 111 permitindo a replicação em Bacillus.

Os exemplos de origens de replicação para o uso em umacélula hospedeira de levedura são a origem de 2 mícron de replicação, ARS1,ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3 e a combinação de ARS4 e CEN6.

Os exemplos de origens de replicação úteis em uma célulafungica filamentosa são AMAI e ANSI (Gems et ai, 1991, Gene 98: 61-67;Cullen et ai, 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883).A isolação do gene AMAI e a construção de plasmídeos ou vetores quecompreendem o gene podem ser realizadas de acordo com os métodosdivulgados na WO 00/24883.

Mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser inserida na célula hospedeira para aumentar a produção doproduto de gene. Um aumento no número de cópia do polinucleotídeo podeser obtido integrando-se pelo menos uma cópia adicional da seqüência nogenoma da célula hospedeira ou pela inclusão de um gene marcadorselecionável amplificável com o polinucleotídeo onde as células contendocópias amplificadas do gene marcador selecionável e por meio deste cópiasadicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas cultivando-se ascélulas na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritosacima para construir os vetores de expressão recombinantes da presenteinvenção são bem conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (ver, porexemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Células hospedeiras

A presente invenção também diz respeito a células hospedeirasrecombinantes, que compreendem um polinucleotídeo da presente invenção,que são vantajosamente usadas na produção recombinante dos polipeptídeos.Um vetor que compreende um polinucleotídeo da presente invenção éintroduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor seja mantidocomo um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômicoauto-replicante como descrito mais no princípio. O termo "célula hospedeira"abrange qualquer progênie de uma célula precursora que não é idêntica àcélula precursora devido às mutações que ocorrem durante a replicação. Aescolha de uma célula hospedeira em um grau maior dependerá do gene quecodifica o polipeptídeo e da sua fonte.

A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular,por exemplo, um procariota ou um microorganismo não unicelular, porexemplo, um eucariota.

Os microorganismos unicelulares úteis são células bacterianastais como bactérias gram positivas incluindo, mas não limitadas a, uma célulade Bacillus, por exemplo, Bacillus alkalophilus, Bacillus amiloliquefaciens,Bacülus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans,Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis e Bacillus thuringiensis; ou umStreptomyces célula, por exemplo, Streptomyces lividans e Streptomycesmurinus ou bactérias gram negativas tais como E. coli e Pseudomonas sp. Emum aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacilluslentus, Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus ou Bacillussubtilis. Em um outro aspecto preferido, a célula de Bacillus é um Bacillusalcalofílico.

A introdução de um vetor em uma célula hospedeirabacteriana, por exemplo, pode ser efetuada pela transformação de protoplasto(ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen,1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 ou Dubnau e Davidoff-Abelson,1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), eletroporação (ver, porexemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751) ouconjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thorne, 1987, Journal ofBacteriology 169: 5771-5278).

A célula hospedeira também pode ser um eucariota, tal comouma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.

Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula20 fungica. "Fungos" como aqui usado inclui o filo Ascomycota, Basidiomycota,Chytridiomycota e Zygomycota (como definido por Hawksworth et ai, Em,Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CABInternational, University Press, Cambridge, UK) assim como o Oomycota(como citado em Hawksworth et ai, 1995, supra, página 171) e todos osfungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fungica éuma célula de levedura. "Levedura" como aqui usado inclui a leveduraascosporogênica (Endomycetales), levedura basidiosporogênica e levedurapertencente aos Fungos Imperfeitos (Blastomycetes). Visto que a classificaçãode levedura pode mudar no futuro, para o propósito desta invenção, leveduradeve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner,F. A., Passmore, S. M. e Davenport, R. R., eds, Soe. App. Bacteriol.Symposium Series N2 9, 1980).

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula de Cândida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia,Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia.

Em um aspecto mais preferido, the célula de levedurahospedeira é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomycescerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii,Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis ou Saccharomycesoviformis. Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira delevedura é uma célula Kluyveromyces lactis. Em um outro aspecto maispreferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula Yarrowia lipolitica.

Em um outro aspecto mais preferido, a célula hospedeirafungica é uma célula fungica filamentosa. "Fungo filamentoso" inclui todas asformas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido porHawksworth et ai, 1995, supra). Os fungos filamentosos são no geralcaracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose,glicano, quitosano, manana e outros polissacarídeos complexos. Ocrescimento vegetativo é pelo alongamento hifal e o catabolismo de carbono éobrigatoriamente aeróbico. Ao contrário, o crescimento vegetativo pelasleveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é pelo brotamento de um talounicelular e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeirafungica filamentosa é uma célula de Acremonium, Aspergillus,Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Coprinus, Coriolus,Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor,Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium,Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophillum, Talaromyces,Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes ou Trichoderma.

Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira fúngicafilamentosa é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Fusarium bactridioides,Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusariumgraminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusariumnegundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum,Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides ouFusarium venenatuma. Em um outro aspecto mais preferido, a célulahospedeira fóngica filamentosa é uma célula Bjerkandera adusta,Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea,Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa,Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Coprinus cinereus,Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei,Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum,Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielaviaachromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielaviaaustraleinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora,Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielaviasubthermophila, Thielavia terrestris, Thielavia terricola, Thielaviathermophila, Thielavia variospora, Thielavia wareingii, Trametes villosa,Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma longibrachiatum,Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As células fungicas podem ser transformadas por um processoque envolve a formação de protoplasto, transformação dos protoplastos eregeneração da parede celular em uma maneira conhecida por si. Osprocedimentos adequados para a transformação de células hospedeiras deAspergillus e Trichoderma são descritos na EP 238 023 e Yelton et al., 1984,Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Osmétodos adequados para transformar espécies de Fusarium são descritos porMalardier et al, 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. As leveduraspodem ser transformadas usando os procedimentos descritos por Becker eGuarente, Em Abelson, J. N. e Simon, M. I., editores, Guide to YeastGenetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal ofBacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75: 1920.

Métodos de Produção

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a)cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem é capaz de produzir opolipeptídeo, sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b)recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gêneroThielavia. Em um aspecto mais preferido, a célula é Thielavia terrestris. Emum aspecto mais preferido, a célula é Thielavia terrestris NRRL 8126.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a)cultivar uma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção, que compreendem: (a)cultivar uma célula hospedeira sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende uma seqüência denucleotídeo mutante que compreende pelo menos uma mutação na seqüênciacodificadora do polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 1, em que a seqüênciade nucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2 e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspectopreferido, o polipeptídeo maduro tem os aminoácidos de 18 a 336 da SEQ IDNO: 2.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células sãocultivadas em um meio nutriente adequado para a produção do polipeptídeousando métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode sercultivada pelo cultivo em frasco agitado e fermentação em escala pequena ouescala grande (incluindo fermentações contínuas, por batelada, retroalimentadas ou de estado sólido) em fermentadores de laboratório ouindustriais realizada em um meio adequado e sob condições que permitamque o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meionutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e saisinorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Os meiosadequados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem serpreparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, emcatálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo ésecretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamentedo meio. Se o polipeptídeo não é secretado no meio, o mesmo pode serrecuperado de lisados celulares.

Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodosconhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estesmétodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, aformação de um produto enzimático ou o desaparecimento de um substratoenzimático. Por exemplo, um ensaio de enzima pode ser usado paradeterminar a atividade do polipeptídeo como aqui descrita.

O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodosconhecidas na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado domeio nutriente pelos procedimentos convencionais incluindo, mas nãolimitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização,evaporação ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadospor uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, masnão limitado a, cromatografia (por exemplo, troca iônica, de afinidade,hidrofóbica, cromatofocalização e por exclusão de tamanho), procedimentoseletroforético (por exemplo, a focalização isoelétrica preparativa),solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com sulfato de amônio),SDS-PAGE ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J. C. Janson eLars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter ospolipeptídeos substancialmente puros.

Plantas

A presente invenção também diz respeito a uma plantatransgênica, parte de planta ou célula vegetal que foram transformadas comuma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividadede endoglicanase da presente invenção de modo a expressar e produzir opolipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo podem serrecuperado da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou partede planta contendo o polipeptídeo recombinante podem ser usadas como taispara melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorar ovalor nutricional, palatabilidade e propriedades reológicas ou para destruir umfator antinutritivo.

A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) oumonocotiledônea (uma monocot). Os exemplos de plantas monocot sãogramas, tais como a grama dos prados (grama azul, Poa), gramas forrageirastais como Festuca, Lolium, grama temperada, tal como Agrostis e cereais, porexemplo, trigo, aveias, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

Os exemplos de plantas dicot são tabaco, legumes, tais comotremoços, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja e plantascrucíferas (família Brassicaceae), tais como couve-flor, semente de colza e oorganismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.

Os exemplos de partes de plantas são haste, calo, folhas, raiz,frutas, sementes e tubérculos assim como os tecidos individuais quecompreendem estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima,tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos de célula vegetalespecíficos, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndria, vacúolos,peroxissomas e citoplasma também são considerados ser uma parte da planta.

Além disso, qualquer célula vegetal, qualquer que seja a origem do tecido, éconsiderada ser uma parte da planta. Do mesmo modo, partes de planta taiscomo tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização dainvenção são também considerados partes de planta, por exemplo, embriões,endospermas, aleurona e revestimentos de semente.

Também incluídos dentro do escopo da presente invençãoestão a progênie de tais plantas, partes de planta e células vegetais.

A planta ou célula vegetal transgênicas que expressam umpolipeptídeo da presente invenção podem ser construídos de acordo commétodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula vegetal éconstruída pela incorporação de uma ou mais construções de expressão quecodificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeirovegetal ou genoma de cloroplasto e propagando a planta ou célula vegetalmodificadas resultantes em uma planta ou célula vegetal transgênica.

A construção de expressão é convenientemente umaconstrução de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo da presente invenção operavelmente ligado comseqüências reguladoras apropriadas requeridas para a expressão da seqüênciade nucleotídeo na planta ou parte da planta de escolha. Além disso, aconstrução de expressão pode compreender um marcador selecionável útilpara identificar células hospedeiras nas quais a construção de expressão foiintegrada e as seqüências de DNA necessárias para a introdução daconstrução na planta em questão (o último depende do método de introduçãode DNA a ser usado).

A escolha de seqüências reguladoras, tais como as seqüênciaspromotoras e terminadoras e opcionalmente as seqüências de sinal ou trânsitoé determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como opolipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene quecodifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ouindutível ou pode ser específico de desenvolvimento, estágio ou tecido e oproduto de gene pode ser alvejado a um tecido específico ou parte de plantatal como sementes ou folhas. As seqüências reguladoras são, por exemplo,descritas por Tague et al, 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para a expressão constitutiva, o promotor de 35S-CaMV, daubiquitina 1 do milho e da actina 1 do arroz podem ser usada (Franck et al,1980, Cell 21: 285-294, Christensen et al, 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al, 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicosde órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de depósito dearmazenagem tal como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards &Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303) ou de tecidos de depósitometabólico tal como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico de semente tal como os promotores daglutelina, prolamina, globulina ou albumina do arroz (Wu et al, 1998, Plantand Cell Physiology 39: 885-889), um promotor da Vicia faba da leguminaB4 e o gene da proteína de semente desconhecida de Vicia faba (Conrad etal, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de umaproteína de corpo oleoso de semente (Chen et al, 1998, Plant and CellPhysiology 39: 935-941), o promotor napA da proteína de armazenagem daBrassica napus ou qualquer outro promotor específico de semente conhecidona técnica, por exemplo, como descrito na WO 91/14772. Além disso, opromotor pode ser um promotor específico de folha tal como o promotor rbcsdo arroz ou tomate (Kyozuka et al, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, opromotor do gene da adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra eHiggins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93) ou o promotor do genealdP do arroz (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674) ou um promotor indutível por ferimento tal como o promotor pin2 dabatata (Xu et al, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588). Do mesmomodo, o promotor pode ser indutível pelos tratamentos abióticos tais comotemperatura, seca ou alterações na salinidade ou induzido pelas substânciasexogenamente aplicadas que ativam o promotor, por exemplo, etanol,estrogênios, hormônios vegetais tais como etileno, ácido abscísico e ácidogiberélico e metais pesados.

Um elemento realçador de promotor também pode ser usadopara se obter a expressão mais alta de um polipeptídeo da presente invençãona planta. Por exemplo, o elemento realçador de promotor pode ser um intronque é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al, 1993, supra,divulga o uso do primeiro intron do gene da actina 1 do arroz para realçar aexpressão.

O gene marcador selecionável e qualquer outras partes daconstrução de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis natécnica.

A construção de ácido nucleico é incorporada no genomavegetal de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica,incluindo a transformação mediada por Agrobacterium, transformaçãomediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partícula,transformação biolística e eletroporação (Gasser et al, 1990, Science 244:1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al, 1989,Nature 338: 274).

Presentemente, a transferência de gene mediada porAgrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotstransgênicos (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, PlantMolecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usada para transformarmonocots, embora outros métodos de transformação sejam freqüentementeusados para estas plantas. Presentemente, o método de escolha para gerarmonocots transgênicos é o bombardeamento de partícula (partículas de ouroou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA transformador) de calosembrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162;Vasil et ai, 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo paraa transformação de monocots está fundamentado na transformação deprotoplasto como descrito por Omirulleh et ai, 1993, Plant MolecularBiology 21: 415-428.

Seguindo a transformação, os transformantes tendoincorporado a construção de expressão são selecionados e regenerados emplantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.Freqüentemente o procedimento de transformação é planejado para aeliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nasgerações seguintes usando-se, por exemplo, a co-transformação com duasconstruções de T-DNA separadas ou excisão específica de sítio do gene deseleção por uma recombinase específica.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um polipeptídeo da presente invenção que compreende: (a) cultivaruma planta transgênica ou uma célula vegetal que compreenda umpolinucleotídeo que codifique um polipeptídeo tendo atividade deendoglicanase da presente invenção sob condições condutivas para aprodução do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.Remoção ou Redução da Atividade de Endoglicanase

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir um mutante de uma célula precursora, que compreende romper oudeletar uma seqüência de polinucleotídeo ou uma porção desta, que codificaum polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante produzirmenos do polipeptídeo do que a célula quando cultivadas sob as mesmascondições.

A célula mutante pode ser construída reduzindo-se oueliminando-se a expressão de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpolipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos natécnica, por exemplo, inserções, rompimentos, substituições ou deleções. Emum aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo é inativada. A seqüência denucleotídeo a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a regiãocodificadora ou uma parte desta essencial para a atividade de ou um elementoregulador requerido para a expressão da região codificadora. Um exemplo deuma tal seqüência reguladora ou de controle pode ser uma seqüênciapromotora ou uma parte funcional desta, isto é, uma parte que é suficientepara afetar a expressão da seqüência de nucleotídeo. Outras seqüências decontrole para a modificação possível incluem, mas não são limitadas a, umaseqüência líder, de poliadenilação, seqüência de propeptídeo, seqüência depeptídeo de sinal, terminador de transcrição e ativador transcricional.

A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada submetendo-se a célula precursora à mutagênese e selecionandoquanto as células mutantes em que a expressão da seqüência de nucleotídeofoi reduzida ou eliminada. A mutagênese, que pode ser específica oualeatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutanizadorfísico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotídeo adequado ousubmetendo-se a seqüência de DNA à mutagênese gerada pela PCR. Alémdisso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinaçãodestes agentes mutagenizadores.

Os exemplos de um agente mutagenizador físico ou químicoadequados para o presente propósito incluem irradiação de ultravioleta (UV),hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metilhidroxilamina, ácido nitroso, sulfonato de etil metano (EMS), bissulfito desódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.

Quando tais agentes são usados, a mutagênese é tipicamenterealizada incubando-se a célula precursora a ser mutagenizada na presença doagente mutagenizante de escolha sob condições adequadas e triagem e/ouseleção para mutantes celulares que exibem expressão reduzida ou nenhumado gene.

A modificação ou inativação da seqüência de nucleotídeo podeser realizada pela introdução, substituição ou remoção de um ou maisnucleotídeos no gene ou um elemento regulador requerido para a suatranscrição ou tradução. Por exemplo, os nucleotídeos podem ser inseridos ouremovidos de modo a resultar na introdução de um códon de parada, aremoção do códon de início ou uma mudança na matriz de leitura aberta. Talmodificação ou inativação podem ser realizadas pela mutagênese direcionadaao sítio ou mutagênese gerada pela PCR de acordo com métodos conhecidosna técnica. Embora, em princípio, a modificação possa ser realizada in vivo,isto é, diretamente na célula que expressa a seqüência de nucleotídeo a sermodificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro comoexemplificado abaixo.

Um exemplo de um modo conveniente para eliminar oureduzir a expressão de uma seqüência de nucleotídeo por uma célula éfundamentado em técnicas de substituição de gene, deleção de gene ourompimento de gene. Por exemplo, no método do rompimento de gene, umaseqüência de ácido nucleico que corresponda à seqüência de nucleotídeoendógena é mutagenizada in vitro para produzir uma seqüência de ácidonucleico defeituosa que é depois transformada na célula precursora paraproduzir um gene defeituoso. Pela recombinação homóloga, a seqüência deácido nucleico defeituosa substitui a seqüência de nucleotídeo endógena. Podeser desejável que a seqüência de nucleotídeo defeituosa também codifica ummarcador que possa ser usado para a seleção de transformantes em que aseqüência de nucleotídeo foi modificada ou destruída. Em um aspectoparticularmente preferido, a seqüência de nucleotídeo é rompida com ummarcador selecionável tal como aqueles aqui descritos.

Alternativamente, a modificação ou inativação da seqüência denucleotídeo pode ser realizada pelas técnicas de anti-sentido ou RNAiestabelecidas usando uma seqüência complementar à seqüência denucleotídeo. Mais especificamente, a expressão da seqüência de nucleotídeopor uma célula pode ser reduzida ou eliminada pela introdução de umaseqüência complementar à seqüência de nucleotídeo do gene que pode sertranscrita na célula e é capaz de hibridização para o mRNA produzido nacélula. Sob condições que permitam que a seqüência de nucleotídeo de anti-sentido complementar hibridize ao mRNA, a quantidade de proteínatraduzível é assim reduzida ou eliminada.

A presente invenção diz respeito ainda a uma célula mutantede uma célula precursora que compreende um rompimento ou deleção de umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo ou uma seqüência decontrole desta, que resulta na célula mutante produzir menos do polipeptídeoou no polipeptídeo comparado com a célula precursora.

As células mutantes deficientes em polipeptídeo assim criadassão particularmente úteis como células hospedeiras para a expressão depolipeptídeos homólogos e/ou heterólogos. Portanto, a presente invenção dizrespeito ainda a métodos para produzir um polipeptídeo homólogo ouheterólogo que compreendem: (a) cultivar a célula mutante sob condiçõescondutivas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Otermo "polipeptídeos heterólogos" é aqui definido como polipeptídeos quenão são nativos para a célula hospedeira, uma proteína nativa em que asmodificações foram feitas para alterar a seqüência nativa ou uma proteínanativa cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de umamanipulação da célula hospedeira pelas técnicas de DNA recombinante.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglicanase pela fermentação de uma célula que produz tantoum polipeptídeo da presente invenção assim como o produto de proteína deinteresse pela adição de uma quantidade eficaz de um agente capaz de inibir aatividade de endoglicanase para o caldo de fermentação antes, durante oudepois que a fermentação tenha sido completada, recuperar o produto deinteresse do caldo de fermentação e opcionalmente submetendo-se o produtorecuperado para outra purificação.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir um produto de proteína essencialmente livre deatividade de endoglicanase pelo cultivo da célula sob condições permitindo aexpressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante a umtratamento de pH e temperatura combinados de modo a reduzir a atividade deendoglicanase substancialmente e recuperar o produto do caldo de cultura.Alternativamente, o tratamento de pH e temperatura combinados pode serrealizado em uma preparação de enzima recuperada do caldo de cultura. Otratamento de pH e temperatura combinados pode opcionalmente ser usadoem combinação com um tratamento com um inibidor de endoglicanase.

De acordo com este aspecto da invenção, é possível removerpelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelomenos 85%), ainda mais preferivelmente pelo menos 95% e o maispreferivelmente pelo menos 99% da atividade de endoglicanase. A remoçãocompleta da atividade de endoglicanase pode ser obtida pelo uso destemétodo.

O tratamento de pH e temperatura combinados épreferivelmente realizado a um pH na faixa de 2 a 3 ou 10 a 11 e umatemperatura na faixa de pelo menos 75 a 85°C por um período suficiente detempo para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, de 1 a 3 horas ésuficiente.

Os métodos usados para o cultivo e purificação do produto deinteresse podem ser realizados pelos métodos conhecidas na técnica.

Os métodos da presente invenção para produzir um produtoessencialmente livre de endoglicanase é de interesse particular na produção depolipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fungicas tais comoenzimas. A enzima pode ser selecionada, por exemplo, de uma enzimaamilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulítica,oxidorredutase ou enzima que degrada a parede da célula vegetal. Osexemplos de tais enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase,amiloglicosidase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase,cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease, esterase,galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, glicose oxidase, glicosidase,haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase,liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase,fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase,transglutaminase ou xilanase. As células deficientes em endoglicanasetambém podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interessefarmacêutico tais como hormônios, fatores de crescimento, receptores eoutros.

Será entendido que o termo "polipeptídeos eucarióticos" incluinão apenas polipeptídeos nativos, mas também aqueles polipeptídeos, porexemplo, enzimas, que foram modificadas pelas substituições, deleções ouadições de aminoácido ou outras de tais modificações para realçar a atividade,termoestabilidade, tolerância ao pH e outros.

Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a umproduto de proteína essencialmente livre de atividade de endoglicanase que éproduzido por um método da presente invenção.

Composições

A presente invenção também diz respeito às composições quecompreendem um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, ascomposições são enriquecidas em um tal polipeptídeo. O termo"enriquecidas" indica que a atividade de endoglicanase da composição foiaumentada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.

A composição pode compreender um polipeptídeo da presenteinvenção como o componente enzimático principal, por exemplo, umacomposição de mono-componente. Alternativamente, a composição podecompreender atividades enzimáticas múltiplas, tais como umaaminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase,quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, desoxirribonuclease,esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase, glicoamilase, alfa-glicosidase,beta-glicosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase,oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase,polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ouxilanase. A(s) enzima(s) adicionais pode(m) ser produzida(s), por exemplo,por um microorganismo pertencente ao gênero Aspergillus, preferivelmenteAspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillusniger ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusariumbactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusariumculmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusariumheterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusariumreticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusariumsarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusariumtrichothecioides ou Fusarium venenatum; Humicola, preferivelmenteHumicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma,preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichodermalongibrachiatum, Trichoderma reesei ou Trichoderma viride.

As composições de polipeptídeo podem ser preparadas deacordo com métodos conhecidas na técnica e podem estar na forma de umacomposição líquida ou uma composição seca. Por exemplo, a composição depolipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. Opolipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordocom métodos conhecidos na técnica.

Os exemplos são dados abaixo de usos preferidos dascomposições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição depolipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição éusada podem ser determinadas com base nos métodos conhecidos na técnica.

Usos

A presente invenção também é direcionada aos métodos parausar os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase ou composiçõesdestas.

Degradação de Biomassa para Monossacarídeos, Dissacarídeos e Polissacarídeos

Os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase e célulashospedeiras da presente invenção, podem ser usadas na produção demonossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos como matérias primasquímicas ou de fermentação da biomassa para a produção de etanol, plásticosou outros produtos ou intermediários. Os polipeptídeos tendo atividade deendoglicanase podem estar na forma de um caldo de fermentação bruto comou sem as células removidas ou na forma de uma preparação de enzima semi-purificada ou purificada. Alternativamente, uma célula hospedeira da presenteinvenção pode ser usada como uma fonte do polipeptídeo tendo atividade deendoglicanase em um processo de fermentação com a biomassa.

A biomassa pode incluir, mas não é limitada a, fontes demadeira, resíduo sólido municipal, papel residual e resíduos de safra (ver, porexemplo, Wiselogel et al, 1995, em Handbook on Bioethanol (Charles E.Wymano, editor), pp. 105-118, Tailor & Francis, Washington D.C.; Wymano,1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistryand Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al, 1999, Recent Progress inBioconversion of Lignocellulosics, em Advances in BiochemicalEngineering/ Biotechnology, T. Scheper, editor geral, Volume 65, pp. 23-40,Springer-Verlag, Nova Iorque).

O polissacarídeo predominante na parede da célula primária debiomassa é a celulose, a segunda mais abundante é a hemi-celulose e aterceira é a pectina. A parede celular secundária, produzida depois que acélula parou de crescer, também contém polissacarídeos e é fortalecida pelalignina polimérica covalentemente reticulada para hemi-celulose. A celulose éum homopolímero de anidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-D-glicano linear,enquanto que as hemi-celuloses incluem uma variedade de compostos, taiscomo xilanos, xiloglicanos, arabinoxilanos e mananas em estruturasramificadas complexas com um espectro de substituintes. Embora no geralpolimorfa, a celulose é encontrada em tecido vegetal primariamente comouma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glicano paralelas. Nas hemi-celuloses usualmente o hidrogênio liga-se à celulose, assim como a outrashemi-celuloses, que ajuda a estabilizar a matriz de parede celular.

Três classes principais de glicoidrolases são usadas pararomper a biomassa celulósica:

(1) As "endo-l,4-beta-glicanases" ou 1,4-beta-D-glicano-4-glicanoidrolases (EC 3.2.1.4), que atuam aleatoriamente sobre substratos de1,4-beta-glicano solúveis e insolúveis.(2) As "exo-1,4-beta-D-glicanases" incluindo tanto as 1,4-beta-D-glicano glicoidrolases (EC 3.2.1.74), que liberam D-glicose a partir de1,4-beta-D-glicanos e hidrolisam D-celobiose lentamente e celobioidrolases(1,4-beta-D-glicano celobioidrolases, EC 3.2.1.91), que liberam D-celobiosedos 1,4-beta-glicanos.

(3) As "beta-D-glicosidases" ou beta-D-glucosídeoglicoidrolases (EC 3.2.1.21), que atuam para liberar unidades de D-glicose apartir de celobiose e celodextrinas solúveis, assim como uma série deglicosídeos.

Estas três classes de enzimas trabalham juntassinergisticamente resultando na descristalização e hidrólise eficientes dacelulose nativa a partir da biomassa para produzir açúcares redutores.

Os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase da presenteinvenção podem ser usados em conjunção com as enzimas mencionadasacima para degradar ainda mais o componente de celulose do substrato debiomassa, (ver, por exemplo, Brigham et ai, 1995, em Handbook onBioethanol (Charles E. Wymano, editor), pp. 119-141, Tailor & Francis,Washington D.C.; Lee, 1997, Journal of Biotechnology 56: 1-24).

O etanol pode ser produzido pela degradação enzimática debiomassa e conversão dos sacarídeos liberados ao etanol. Este tipo de etanol éfreqüentemente aludido como bioetanol ou biocombustível. Este pode serusado como um aditivo de combustível ou diluente em misturas a partir demenos do que 1% e até 100% (um substituto de combustível).

Composições Detergentes

Os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase da presenteinvenção podem ser adicionados a uma composição detergente e assim setornar um componente desta.

A composição detergente da presente invenção pode ser, porexemplo, formulada como uma composição detergente de lavagem de roupasa mão ou em máquina incluindo uma composição de aditivo de lavar roupasadequada para o pré tratamento de tecidos tingidos e uma composiçãoamaciante de tecido adicionada ao enxágüe ou formulada como umacomposição detergente para o uso nas operações de limpeza de superfíciedura doméstica geral ou formuladas para operações de lavagem de louçamanual ou em máquina.

Em um aspecto específico, a presente invenção fornece umaditivo de detergente que compreende os polipeptídeos tendo atividade deendoglicanase da presente invenção. O aditivo de detergente assim como acomposição detergente podem compreender uma ou mais outras enzimas taiscomo uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carboidrase, celulase,pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo,uma lacase e/ou peroxidase.

No geral as propriedades dos componentes enzimáticos devemser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é, pH ideal,compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.)e os componentes enzimáticos devem estar presentes em quantidades eficazes.

Proteases: As proteases adequadas incluem aquelas de origemanimal, vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Mutantesquimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Aprotease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease,preferivelmente uma protease microbiana alcalina ou uma proteaseequivalente à tripsina. Os exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas,especialmente aquelas derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo,subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168(descrita na WO 89/06279). Os exemplos de protease equivalentes a tripsinassão tripsina (por exemplo, de origem porcina ou bovina) e a proteaseFusarium descrita na WO 89/06270 e WO 94/25583.

Os exemplos de proteases úteis são as variantes descritas naWO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 e WO 98/34946, especialmenteas variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27,36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235e274.

As enzimas de protease comercialmente disponíveis preferidasincluem Alcalase®, Savinase®, Primase®, Duralase®, Esperase® e Kannase®(Novozymes NS), Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Properase®, Purafect®,Purafect OxP®, FN2® e FN3® (Genencor International Inc.).

Lipases: As lipases adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ouengendrados de proteína são incluídos. Os exemplos de lipases úteis incluemlipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H.lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito na EP 258 068 e EP 305 216 ou deH. insolens como descrito na WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, porexemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia(EP 331 376), P. stutzeri (GB 1.372.034), P. fluorescens, Pseudomonas sp.cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al,1993, Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus(JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).

Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelasdescritas na WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.

As lipases comercialmente disponíveis preferidas incluemLipolase®, Lipex® e Lipolase Ultra® (Novozymes NS).

Amilases: As amilases adequadas (a e/ou (3) incluem aquelasde origem bacteriana ou fungica. Mutantes quimicamente modificados ouengendrados de proteína são incluídos. As amilases incluem, por exemplo, a-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacilluslicheniformis, descrita em mais detalhes na GB 1.296.839.

Os exemplos de amilases úteis são as variantes descritas naWO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 e WO 97/43424, especialmenteas variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15,23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243,264,304, 305, 391, 408 e 444.

As amilases comercialmente disponíveis são Duramil®,Termamil®, Fungamil® e BAN® (Novozymes A/S), Rapidase® e Purastar® (daGenencor International Inc.).

Celulases: As celulases adequadas incluem aquelas de origembacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ouengendrados de proteína são incluídos. As celulases adequadas incluemcelulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium,Thielavia, Acremonium ou Trichoderma por exemplo, as celulases fungicasproduzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila eFusarium oxysporum divulgadas na Patente U.S. N° 4.435.307, Patente U.S.Ne 5.648.263, Patente U.S. N° 5.691.178, Patente U.S. N2 5.776.757 e WO89/09259.

As celulases especialmente adequadas são as celulasesalcalinas e neutras tendo benefícios de cuidado com as cores. Os exemplos detais celulases são celulases descritas na EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes decelulase tais como aquelas descritas na WO 94/07998, EP 0 531 315, Patente U.S. N- 5.457.046, Patente U.S. N° 5.686.593, Patente U.S. Ns 5.763.254,WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.

As celulases comercialmente disponíveis incluem Celluclast®,Celluzyme® e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase® e Puradax HA®(Genencor International Inc.) e KAC-500(B)® (Kao Corporation).Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases adequadasincluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou füngica. Os mutantesquimicamente modificados ou engendrados de proteína são incluídos. Osexemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, porexemplo, de C. cinereus e variantes destes como aquelas descritas na WO93/24618, WO 95/10602 e WO 98/15257.

As peroxidases comercialmente disponíveis incluemGuardzyme® (Novozymes A/S).

O(s) componente(s) enzimático(s) pode(m) ser incluído(s) emuma composição detergente pela adição de aditivos separados contendo umaou mais enzimas ou pela adição de um aditivo combinado que compreendetodas estas enzimas. Um aditivo de detergente da presente invenção, isto é,um aditivo separado ou um aditivo combinado, podem ser formulados, porexemplo, como um granulado, líquido, pasta fluida, etc. As formulações deaditivo de detergente preferidas são granulados, em particular granulados nãoempoáveis, líquidos, em particular líquidos estabilizados ou pastas fluidas.

Os granulados não empoáveis podem ser produzidos, porexemplo, como divulgado nas Patentes U.S. N2 4.106.991 e 4.661.452 e podeopcionalmente ser revestido pelos métodos conhecidas na técnica. Osexemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido deetileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos moleculares médios de 1000 a20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de oxido de etileno;álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos decarbono e em que existem de 15 a 80 unidades de oxido de etileno; álcooisgraxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Osexemplos de materiais de revestimento formadores de película adequadospara a aplicação pelas técnicas de leito de fluido são dadas na GB 1483591.As preparações de enzima líquidas, por exemplo, podem ser estabilizadas pelaadição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar,ácido lático ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Asenzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgadona EP 238,216.

A composição detergente da presente invenção pode estar emqualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, umgrânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso,tipicamente contendo até 70% de água e de 0 a 30% de solvente orgânico ounão aquoso.

A composição detergente compreende um ou mais tensoativos,que podem ser não iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/oucatiônicos e/ou zwitteriônicos. Os tensoativos estão tipicamente presentes emum nível de 0,1% a 60% em peso.

Quando nesse ponto incluído o detergente usualmente conteráde cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico tal comoalquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefinsulfonato, alquil sulfato (sulfato deálcool graxo), etoxissulfato álcool, alcanossulfonato secundário, éster metílicode ácido alfa-sulfo graxo, ácido alquil- ou alquenilsuccínico ou sabão.

Quando nesse ponto incluído o detergente usualmente conteráde cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico tal comoetoxilato álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosídeo, oxido dealquildimetilamino, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado,monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de poliidróxi alquilaou derivados de N-acil N-alquila de glicosamina ("glicamidas").

O detergente pode conter de 0 a 65% de um formador dedetergente ou agente de complexação tal como zeólito, difosfato, trifosfato,fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácidoetilenodiaminotetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil-ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos dispostos em camadas (porexemplo, SKS-6 da Hoechst).O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Osexemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli(etileno glicol),álcool polivinílico, poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinil-imidazol),policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros do ácidomaleico/acrílico e metacrilato de laurila/copolímeros de ácido acrílico.

O detergente pode conter um sistema de branqueamento quepode compreender uma fonte de H202 tal como perborato ou percarbonatoque podem ser combinados com um ativador de branqueamento que formeperácido tal como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato.Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreenderperoxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida ou sulfona.

O(s) componente(s) enzimático(s) da composição detergenteda presente invenção pode(m) ser estabilizado(s) usando agentes deestabilização convencionais, por exemplo, um poliol tal como propileno glicolou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático, ácido bórico ou umderivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático ou umderivado de ácido fenil borônico tal como o ácido 4-formilfenil borônico e acomposição pode ser formulada como descrito, por exemplo, na WO92/19709 e WO 92/19708.

O detergente também pode conter outros ingredientesdetergentes convencionais tais como condicionadores de tecido incluindoargilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma, agentes anticorrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira,corantes, bactericidas, abrilhantadores óticos, hidrótropos, inibidores demanchamento ou perfumes.

Nas composições detergentes qualquer componenteenzimático, em particular os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanaseda presente invenção, podem ser adicionados em uma quantidade quecorresponde de 0,01 a 100 mg de proteína enzimática por litro de líquido delavagem, preferivelmente de 0,05 a 5 mg de proteína enzimática por litro delíquido de lavagem, em particular de 0,1 a 1 mg de proteína enzimática porlitro de líquido de lavagem.

Os polipeptídeos tendo atividade de endoglicanase da presenteinvenção podem ser adicionalmente incorporados nas formulaçõesdetergentes divulgadas na WO 97/07202 que é aqui incorporada comoreferência.

Peptídeo de sinal

A presente invenção também diz respeito às construções deácido nucleico que compreendem um gene que codificam uma proteínaoperavelmente ligada a uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpeptídeo de sinal que compreende ou que consiste dos aminoácidos de 1 a 17da SEQ ID NO: 2, que permitem a secreção da proteína em um meio decultura, em que o gene é estranho à seqüência de nucleotídeo.

Em um aspecto preferido, a seqüência de nucleotídeocompreende os nucleotídeos de 1 a 51 da SEQ ID NO: 1. Em um outroaspecto preferido, a seqüência de nucleotídeo consiste dos nucleotídeos de 1 a51 da SEQ ID NO: 1.

A presente invenção também diz respeito a vetores deexpressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes quecompreendem tais construções de ácido nucleico.

A presente invenção também diz respeito a métodos paraproduzir uma proteína que compreende: (a) cultivar uma tal célula hospedeirarecombinante sob condições adequadas para a produção da proteína; e (b)recuperar a proteína.

A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célulahospedeira. O termo "proteína" não é aqui intencionado a se referir a umcomprimento específico do produto codificado e, portanto, abrange peptídeos,oligopeptídeos e proteínas. O termo "proteína" também abrange dois ou maispolipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínastambém incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinaçãode seqüências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas de pelo menosduas proteínas diferentes em que uma ou mais podem ser heterólogas ounativas para a célula hospedeira. As proteínas incluem ainda variaçõesalélicas e engendradas que ocorrem naturalmente das proteínas mencionadasacima e proteínas híbridas.

Preferivelmente, a proteína é um hormônio ou variante deste,enzima, receptor ou porção deste, anticorpo ou porção deste ou repórter. Emum aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidorredutase, transferase,hidrolase, liase, isomerase ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, aproteína é uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase,catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase,desoxirribonuclease, esterase, alfa-galactosidase, beta-galactosidase,glicoamilase, alfa-glicosidase, beta-glicosidase, invertase, lacase, lipase,manosidase, mutanase, oxidase, enzima pectinolítica, peroxidase, fitase,polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ouxilanase.

O gene pode ser obtido de qualquer procariótico, eucarióticoou outra fonte.

A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplosque não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção.

Exemplos

Materiais

Os produtos químicos usados como tampões e substratosforam produtos comerciais de grau pelo menos reagente.

Os géis de SDS-PAGE, tampão de carga e tampão decondução foram obtidos da Invitrogen/Novex (Carlsbad, CA). A tripsinamodificada grau de seqüenciamento foi da Princeton Separations (Aldelphia,NJ). As manchas de proteína de BioSafe Commassie Blue G250 foramobtidas da BioRad Laboratories (Hercules, CA).

Cepas

A cepa Aspergillus oryzae Jal250 (WO 99/61651) foi usadapara a expressão de um polipeptídeo de Thielavia terrestris tendo atividade deendoglicanase. Thielavia terrestris NRRL cepa 8126 foi usada como a fontede um gene para um polipeptídeo da Família 7F tendo atividade deendoglicanase.

Meios

As placas de PDA foram compostas por litro de 39 gramas deágar de dextrose de batata.

O meio NNCYP foi composto por litro de 5,0 g de NH4NO3,0,5 g de MgS04.7H20, 0,3 g de CaCl2, 2,5 g de ácido cítrico, 1,0 g de BactoPeptona, 5,0 g de extrato de levedura, 1 ml de metais traço COVE e K2HP04suficiente para se obter um pH final de aproximadamente 5,4.

O meio NNCYPmod foi composto por litro de 1,0 g de NaCl,5,0 g de NH4NO3, 0,2 g de MgS04.7H20, 0,2 g de CaCl2, 2,0 g de ácidocítrico, 1,0 g de Bacto Peptona, 5,0 g de extrato de levedura, 1 ml de soluçãode metais traço COVE e K2HP04 suficiente para se obter o pH final deaproximadamente 5,4.

A solução de metais traço COVE foi composta por litro de0,04 g de Na2B4O7.10H2O, 0,4 g de CuS04.5H20, 1,2 g de FeS04.7H20, 0,7 gde MnS04.H20, 0,8 g de Na2Mo02.2H20 e 10 g de ZnS04.7H20.

As placas LB foram compostas por litro de 10 g de triptona, 5g de extrato de levedura, 5 g de cloreto de sódio e 15 g de Bacto Ágar.

O meio MDU2BP foi composto por litro de 45 g de maltose, 1g de MgS04.7H20, 1 g de NaCl, 2 g de K2HS04, 12 g de KH2P04, 2 g deuréia e 500 ul de metais traço AMG, o pH foi ajustado para 5,0 e depoisesterilizado em filtro com uma unidade de filtração de 0,22 fim.Os metais traço AMG foram compostos por litro de 14,3 g deZnS04.7H20, 2,5 g de CuS04.5H20, 0,5 g de NiCl2.6H20, 13,8 g deFeS04.7H20, 8,5 g de MnS04.7H20 e 3 g de ácido cítrico.

O meio SOC foi composto de 2% de triptona, 0,5% de extratode levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl2 e 10 mM deMgS04, esterilizado pela autoclavagem e depois adicionados à glicoseesterilizada em filtro a 20 mM.

O meio de congelamento foi composto de 60% de SOC e 40%de glicerol.

O meio 2X YT foi composto por litro de 16 g de triptona, 10 gde extrato de levedura, 5 g de NaCl e 15 g de Bacto ágar, esterilizado pelaautoclavagem.

Exemplo 1: Construção de biblioteca de cDNA de rótulos de seqüênciaexpressada (EST)

Thielavia terrestris NRRL 8126 foi cultivada em 50 ml demeio NNCYPmod suplementado com 1% de glicose em um frasco de 250 mla 45°C, 200 rpm por 24 horas. Uma alíquota de dois ml da cultura líquida de24 horas foi usada para semear um frasco de 500 ml contendo 100 ml de meioNNCYPmod suplementado com 2% de Sigmacell-20 (Sigma Chemical Co.,St. Louis, MO). A cultura foi incubada a 45°C, 200 rpm por 3 dias. Osmicélios foram colhidos por filtração através de um funil de Buchner com umpré filtro de fibra de vidro (Nalgene, Rochester NY), lavados duas vezes com10 mM de Tris-HCl-1 mM de EDTA pH 8 (TE) e rapidamente congelados emnitrogênio líquido.

O RNA total foi isolado usando os seguintes métodos. Osmicélios congelados de Thielavia terrestris NRRL 8126 foram cultivados emum triturador de café elétrico. O material triturado foi misturado 1:1 v/v com20 ml de Fenazol (Ambion, Inc., Austin, TX) em um tubo Falcon de 50 ml.Uma vez que os micélios foram colocados em suspensão, eles foram extraídoscom clorofórmio e três vezes com uma mistura de fenol-clorofórmio-álcoolisoamílico 25:24:1 v/v/v. A partir da fase aquosa resultante, o RNA foiprecipitado pela adição de 1/10 volume de acetato de sódio 3 M pH 5,2 e 1,25volume de isopropanol. O RNA precipitado foi recuperado pela centrifiigaçãoa 12.000 x g por 30 minutos a 4°C. A pelota final foi lavada com etanol a70% frio, secada ao ar e recolocada em suspensão em 500 ml de água tratadacom pirocarbonato de dietila (DEPC-água).

A qualidade e quantidade do RNA purificado foi avaliada comum Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Inc., Paio Alto, CA).

O mRNA poliadenilado foi isolado de 360 ug de RNA total com a ajuda deum Kit Poli (a) Purist Magnetic (Ambion, Inc., Austin, TX) de acordo com asinstruções do fabricante.

Para criar a biblioteca de cDNA, um Kit CloneMiner®(Invitrogen, Carlsbad, CA) foi utilizado para construir uma bibliotecadirecional que não requer o uso da clonagem de enzima de restrição, por meiodeste reduzindo o número de clones quiméricos e tendência de tamanho.

Para garantir o sucesso da síntese do primeiro filamento docDNA, duas reações foram realizadas em paralelo com duas concentraçõesdiferentes de mRNA (2,2 e 4,4 ug de poli(a)+ mRNA). As amostras demRNA foram misturadas com um iniciador Biotina-attB2-01igo(dt) (KitCloneMiner®, Invitrogen, Carlsbad, CA), IX tampão do primeiro filamento(Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 ul de ditiotreitol 0,1 M (DTT), 10 mM de cadadNTP e água a um volume final de 18 e 16 ul, respectivamente. As misturasde reação foram cuidadosamente misturadas e depois 2 e 4 ul de transcriptasereversa SuperScript® (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram adicionados eincubados a 45°C por 60 minutos para sintetizar o primeiro filamentocomplementar.

Para a síntese do segundo filamento, para cada reação doprimeiro filamento foram adicionados 30 ul de 5X tampão do segundofilamento (Invitrogen, Carlsbad, CA), 3 ul de cada dNTPlO mM, 10 unidadesde DNA ligase de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA), 40 unidades de DNApolimerase I de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) e 2 unidades de RNase HE. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um volume total de 150 ul. As misturasforam depois incubadas a 16°C por duas horas. Depois da incubação de duashoras, 2 ul de T4 DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) foramadicionados a cada reação e incubados a 16°C por 5 minutos para criar umcDNA abruptamente terminado. As reações de cDNA foram extraídas comuma mistura de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico 25:24:1 v/v/v eprecipitada na presença de 20 ug de glicogênio, 120 ul de acetato de amônio5 M e 660 ul de etanol. Depois da centrifugação a 12.000 x g por 30 minutosa 4°C, as pelotas de cDNA foram lavadas com etanol a 70% frio, secadas sobvácuo por 2 a 3 minutos e recolocadas em suspensão em 18 ul de DEPC-água.

Para cada amostra de cDNA recolocada em suspensão foram adicionados 10ul de 5X tampão adaptado (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 ug de adaptadorattBl (Invitrogen, Carlsbad, CA) mostrado abaixo, 7 ul de DTT 0,1 M e 5unidades de T4 DNA ligase (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Filamento de topo adaptador attB 1:5 '-TCGTCGGGGACAACTTTGTACAAAAAAGTTGG-3' (SEQIDNO: 3)

Filamento de fundo adaptador attB 1:3'-CCCCTGTTGAAACATGTTTTTTCAACCp-5' (SEQ ID NO: 4)

As reações de ligação foram incubadas durante a noite a 16°C.os adaptadores em excesso foram removidos pela cromatografia de exclusãode tamanho em 1 ml de resina Sephacril® S-500 HR (Amersham Biosciences,Piscataway, NJ). As frações de coluna foram coletadas de acordo com asinstruções do Kit CloneMiner® e as frações 3 a 14 foram analisadas com umBioanalisador Agilent para determinar a fração na qual os adaptadores attBlcomeçaram a eluir. Esta análise mostrou que os adaptadores começaram aeluir em torno da fração 10 ou 11. Para a primeira biblioteca as frações de 6 a11 foram reunidas e para a segunda biblioteca as frações 4 a 11 foramreunidas.

A clonagem do cDNA foi realizada pela recombinação deDNA homólogo de acordo com o protocolo Gateway System (Invitrogen,Carlsbad, CA) usando a BP Clonase® (Invitrogen, Carlsbad, CA) como arecombinase. Cada reação de recombinação BP Clonase® conteveaproximadamente 70 ng de cDNA flanqueado com attB, 250 ng depDONR®222, 2 ul de tampão 5X BP Clonase®, 2 jllI de tampão TE e 3 ul deBP Clonase®. Todos os reagentes foram obtidos da Invitrogen, Carlsbad, CA.As reações de recombinação foram incubadas a 25°C durante a noite.

As reações de recombinação BP inativadas por calor foramdepois divididas em 6 alíquotas e eletroporadas em células eletrocompetentesElectroMax® DHIOB (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando um BioRad GenePulser II (BioRad, Hercules, CA) com os seguintes parâmetros: Voltagem: 2,0kV; Resistência: 200 Q; e Capacidade: 25 uF. As células eletroporadas foramrecolocadas em suspensão em 1 ml de meio SOC e incubadas a 37°C por 60minutos com agitação constante a 200 rpm. Depois do período de incubação,as células transformadas foram reunidas e misturadas 1:1 com meio decongelamento. Uma alíquota de 200 ul foi removida para a titulação dabiblioteca e depois o resto de cada biblioteca foi aliquotada em criofrascos de1,8 ml (Wheaton Science Products, Millville, NJ) e armazenados congeladosa-80°C.

As diluições em quatro séries de cada biblioteca forampreparadas: 1/100, 1/1000, 1/104, 1/105. De cada diluição 100 ul foramplaqueados em placas LB de 150 mm suplementadas com 50 ug decanamicina por ml e incubadas a 37°C durante a noite. O número de colôniasem cada placa de diluição foram contadas e usadas para calcular o númerototal de transformantes em cada biblioteca.

A primeira biblioteca mostrou ter 5,4 milhões de clonesindependentes e a segunda biblioteca mostrou ter 9 milhões de clonesindependentes.

Exemplo 2: Preparação de direcionador e seqüenciamento de nucleotídeode clones de cDNA

As alíquotas de ambas as bibliotecas foram misturadas eplaqueadas em placas LB de 25 x 25 cm suplementadas com 50 \xg decanamicina por ml. as colônias individuais foram dispostas em série sobreplacas de 96 reservatórios contendo 100 ul de LB suplementado com 50 ugde canamicina por ml com a ajuda de um Genetix QPix Robot (Genetix Inc.,Boston, MA). Quarenta e cinco placas de 96 reservatórios foram obtidas paraum total de 4320 clones individuais. As placas foram incubadas durante anoite a 37°C com agitação a 200 rpm. Depois da incubação, 100 ul de glicerola 50% estéril foram adicionados a cada reservatório. Os transformantes foramreplicados com a ajuda de uma ferramenta de 96 pinos (Boekel, Feasterville,PA) em placas de microcultura secundária, de 96 reservatórios de cavidadeprofunda (Advanced Genetic Technologies Corporation, Gaithersburg, MD)contendo 1 ml de Magnificent Broth® (MacConnell Research, San Diego,CA) suplementado com 50 ug de canamicina por ml em cada reservatório. Asplacas de microtítulo primárias foram armazenadas congeladas a -80°C. Asplacas de cavidade profunda secundárias foram incubadas a 37°C durante anoite com agitação vigorosa a 300 rpm em um agitador rotativo. Para impedirderramar e contaminação cruzada e para permitir aeração suficiente, cadaplaca de cultura secundária foi coberta com uma almofada de polipropileno(Advanced Genetic Technologies Corporations, Gaithersburg, MD) e umacobertura de cavidade de microtitul adora plástica. O DNA plasmídico foipreparado com um MWG Robot-Smart 384 (MWG Biotech Inc., High Point,NC) e Montage Plasmide Miniprep Kits (Millipore, Billerica, MA).

As reações de seqüenciamento foram realizadas usando aquímica terminadora de Big-Dye® (Applied Biosystems, Inc., Foster City,CA) (Giesecke et al, 1992, Journal of Virology Methods 38: 47-60) e uminiciador de seqüenciamento Ml3 Avançado (-20) mostrado abaixo. 5'-GTAAAACGACGGCCAG-3' (SEQ ID NO: 5)

As reações de seqüenciamento foram realizadas em umformato de 384 reservatórios com um Robot-Smart 384 (MWG Biotech Inc.,High Point, NC) e remoção de terminador com Kits Millipore MultiScreenSeq384 Seqüencing Clean-up (Millipore, Billerica, MA). As reaçõescontiveram 6 jllI de DNA plasmídico e 4 ul de mistura master deseqüenciamento contendo 2 ul de tampão de seqüenciamento 5x (Millipore,Billerica, MA), 1 ul de terminador Big-Dye® (Applied Biosystems, Inc.,Foster City, CA), 1,6 pmoles de iniciador M13 Avançado e 1 ul de água. Oseqüenciamento do DNA de passagem única foi realizado com umSeqüenciador de DNA Automatizado ABI PRISM Modelo 3700 (AppliedBiosystems, Foster City, CA).

Exemplo 3: Análise de dados de seqüência de DNA de clones de cDNAChamada de base, designação de valor de qualidade e corte devetor foram realizados com a ajuda do software PHRED/PHRAP (Universityof Washington, Seattle, WA). A análise em grupos dos ESTs foi realizadacom um Parcel Transcript Assembler v. 2.6.2. (Paracel, Inc., Pasadena, CA).

A análise da formação de grupo de EST indicou 395 grupos independentes.

A análise de homologia de seqüência das seqüências ESTmontadas contra a base de dados PIR foi realizada com o programa Blastx(Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410) em um grupo Linux de 32nodos (Paracel, Inc., Pasadena, CA) usando a matriz BLOSUM 62 (Henikoff,1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919). Dos 395 grupos, 246tiveram acertos blast para genes conhecidos nas bases de dados de proteínapublicas e 149 não tiveram nenhum acerto significante contra estas bases dedados. Entre estes 246 genes, 13 tiveram acertos contra homólogos bemcaracterizados de genes de glicosil hidrolase.Exemplo 4: Identificação de clones de cDNA que codificam umaendoglicanase da Família 7 (CEL7F)

Um clone de cDNA que codifica uma endoglicanase daFamília 7 (CEL7F) foi inicialmente identificado pela sua identidade com aproteína EG-1 da endoglicanase da Família 7 de Trichodermalongibrachiatum (NREF NF00756647). Esta análise indicou que as duasproteínas foram 44% idênticas ao nível da proteína em um trecho de 113aminoácidos (339 pares de base). Depois desta identificação inicial o cloneTter08C4 foi recuperado da placa de estoque congelada original e riscadosobre uma placa LB suplementada com 50 ug de canamicina por ml. A placafoi incubada durante a noite a 37°C e no dia contíguo uma colônia única daplaca foi usada para inocular 3 ml de LB suplementado com 50 ug decanamicina por ml. A cultura líquida foi incubada durante a noite a 37°C e oDNA plasmídico foi preparado com um BioRobot 9600 (QIAGEN, Inc.,Valencia, CA). O DNA plasmídico do clone Tter08C4 foi seqüenciado maisuma vez com a química do terminador Big-Dye® como descrita acima,usando o Ml3 avançado e um iniciador Poli-T mostrado abaixo paraseqüenciar a extremidade 3' do clone.

5'_TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3' (SEQ ID NO: 6)

onde V = G, A, C e N = G, A, C, T

A análise de homologia Blastx da informação de seqüênciaindicou que a proteína codificada pelo clone Tter08C4 foi similar à proteínaEG1 de Trichoderma reesei (NREF NF00494331). Estas proteínas foram 46%idênticas em um trecho de 365 aminoácidos.

A análise da seqüência de proteína deduzida do cloneTter08C4 com o programa Interproscan (Zdobnov e Apweiler, 2001,Bioinformatics 17: 847-8) mostrou que o gene contido na assinatura deseqüência das proteínas da Família 7. Esta assinatura de seqüência conhecidacomo o padrão Pfam PF00840 (Bateman et ai, 2002, Nucleic Acids Research30: 276-280) foram encontrados 18 aminoácidos do aminoácido de partidal metionina confirmando que o clone Tter08C4 codifica uma endoglicanase daI Família 7.

A seqüência de cDNA (SEQ ID NO: 1) e a seqüência deaminoácido deduzida (SEQ ID NO: 2) da endoglicanase de Thielaviaterrestris são mostradas nas Figuras IA e 1B. O clone de cDNA codifica umpolipeptídeo de 336 aminoácidos. O teor de%G+C do clone de cDNA do geneé 67,5% e da região codificadora da proteína madura (nucleotídeos de 55 a1011 da SEQ ID NO: 1) é 67,5%. Usando o programa de software SignalP(Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), um peptídeo de sinal de 17resíduos foi prognosticado. A proteína madura prognosticada contém 319aminoácidos com uma massa molecular de 33,3 kDa.

Um alinhamento comparativo de seqüências da Família 7 deendoglicanase foi determinada pelo método Clustal W (Higgins, 1989, supra)usando o software LASERGENE® MEGALIGN® (DNASTAR, Inc.,Madison, WI) com uma tabela de identidade e os seguintes parâmetros dealinhamento múltiplo: Penalidade de intervalo de 10 e penalidade decomprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento aos pares foramKtuple = 1, penalidade de intervalo = 3, janela = 5 e diagonais = 5. Oalinhamento mostrou que a seqüência de aminoácido deduzida do geneCEL7F de Thielavia terrestris maduro compartilha 46,7% de identidade coma seqüência de aminoácido deduzida da região catalítica do gene daendoglicanase I de Trichoderma reesei (NREF NF00494331, UniprotQ5BMS5) e 44,9% de identidade com a seqüência de aminoácido deduzida dogene da endoglicanase I de Trichoderma reesei de tamanho natural (NREFNF00494331, Uniprot Q5BMS5). A análise do alinhamento das regiõescatalíticas destas proteínas mostrou que a CEL7F endoglicanase de Thielaviaterrestris perdeu pelo menos três motivos de seqüência separados que sãoconservados em todos os outros membros conhecidos da Família 7 de glicosilhidrolase a partir de fungos. Dois destes consistem de mais do que dezresíduos de aminoácido e contêm resíduos altamente conservados que nãoestão presentes na CEL7F endoglicanase de Thielavia terrestris.

Uma vez que a identidade do clone Tter08C4 foi confirmada,uma alíquota de 0,5 ul de DNA plasmídico deste clone, designado pTter7F(Figura 2), foi transferido em um frasco de células TOP10 da E. coli(Invitrogen, Carlsbad, CA), suavemente misturadas e incubadas em gelo por10 minutos. As células foram depois submetidas a choque térmico a 42°C por30 segundos e incubadas mais uma vez em gelo por 2 minutos. As célulasforam recolocadas em suspensão em 250 ul de meio SOC e incubadas a 37°Cpor 60 minutos com agitação constante (200 rpm). Depois do período deincubação, duas alíquotas de 30 ul foram plaqueadas sobre placas de LBsuplementadas com 50 jag de canamicina por ml e incubadas durante a noite a37°C. No dia contíguo uma colônia única foi escolhida e riscada sobre trêscriofrascos de 1,8 ml contendo cerca de 1,5 ml de LB agarose suplementadacom 50 ug de canamicina por ml. Os frascos foram selados com PetriSeal®(Diversified Biotech, Boston MA) e depositados com o Agricultural ResearchService Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815University Street, Peoria, Illinois, 61604, como NRRL B-30802, com umadata de depósito de 11 de abril de 2005.

Exemplo 5: Construção de vetor de expressão pAlLo2

O vetor de expressão pAlLol foi construído pela modificaçãode pBANeô (Patente U.S. N2 6.461.837), que compreende um híbrido dospromotores a partir do genes para a alfa-amilase neutra de Aspergillus niger etriose fosfato isomerase Aspergillus oryzae (promotor NA2-tpi), seqüênciaterminadora da amiloglicosidase de Aspergillus niger (terminador AMG) egene da acetamidase de Aspergillus nidulans (amdS). Todas as etapas demutagênese foram verificadas pelo seqüenciamento usando a química doterminador Big-Dye® como descrita. A modificação de pBANeó foi realizadaeliminando-se primeiro três sítios de restrição Nco I nas posições de 2051,2722 e 3397 pares de base do marcador de seleção amdS pela mutagênesedirecionada ao sítio. Todas as mudanças foram planejadas para serem"silenciosas" deixando a seqüência de proteína real do produto de gene amdSinalterada. A remoção destes três sítios foi realizada simultaneamente com umKit de Mutagênese Direcionada ao Sítio in vitro GeneEditor® (Promega,Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante usando os seguintesiniciadores (o nucleotídeo sublinhado representa a base mudada):AMDS3NcoMut (2050): 5'-GTGCCCCATGATACGCCTCCGG-3' (SEQ IDNO: 7)

AMDS2NcoMut (2721): 5 '-GAGTCGTATTTCCAAGGCTCCTGACC-3'(SEQ ID NO: 8)

AMDS INcoMut (3396): 5 '-GGAGGCCATGAAGTGGACCAACGG-3'(SEQ ID NO: 9)

Um plasmídeo que compreende todas as três mudanças deseqüência esperadas foi depois submetido à mutagênese direcionada ao sítio,usando um Kit de Mutagênese Direcionada ao Sítio QuickChange®(Stratagene, La Jolla, CA), para eliminar o sítio de restrição Nco I naextremidade do terminador AMG na posição 1643. Os seguintes iniciadores(o nucleotídeo sublinhado representa a base mudada) foram usados para amutagênese:

Iniciador superior para mutagenizar a seqüência terminadora AMG: 5'-CACCGTGAAAGCCATGÇTCTTTCCTTCGTGTAGAAGACCAGACAG-3' (SEQ IDNO: 10)

Iniciador inferior para mutagenizar a seqüência terminadora AMG: 5'-CTGGTCTTCTACACGAAGGAAAGAGCATGGCTTTCACGGTGTCTG-3' (SEQ IDNO: 11)

A última etapa na modificação de pBANeó foi a adição de umnovo sítio de restrição Nco I no começo do poliligador usando um Kit deMutagênese Direcionada ao Sítio QuickChange® e os seguintes iniciadores(os nucleotídeos sublinhados representam as bases mudadas) para produzir pAlLol (Figura 3).

Iniciador Superior para mutagenizar o promotor NA2-tpi: 5'-CTATATACACAACTGGATTTAÇÇATGGGCCCGCGGCCGCAGATC-3'(SEQIDNO:12)

Iniciador Inferior para mutagenizar o promotor NA2-tpi: 5'-GATCTGCGGCCGCGGGCCCATGGTAAATCCAGTTGTGTATATAG-3'(SEQIDNO: 13)

O gene amdS de pAlLol foi trocado com o gene pirG deAspergillus nidulans. O plasmídeo pBANelO (Figura 4) foi usado como umafonte para o gene pirG como um marcador de seleção. A análise da seqüênciade pBANelO mostrou que o marcador pirG foi contido dentro de umfragmento de restrição Nsi I e não contém os sítios de restrição Nco I ou PacI. Visto que o amdS também é flanqueado pelos sítios de restrição Nsi I àestratégia para comutar o marcador de seleção foi uma simples troca defragmentos de restrição Nsi I. O DNA plasmídico de pAlLol e pBANelO foidigerido com a enzima de restrição Nsi I e os produtos purificados pelaeletroforese em gel de agarose. O fragmento Nsi I de pBANelO contendo ogene pirG foi ligado à cadeia principal de pAlLol para substituir o fragmentode DNA de Nsi I original contendo o gene amdS. Os clones recombinantesforam analisados pela digestão de restrição para determinar que eles tiveram oinserto correto e também a sua orientação. Um clone com o gene pirGtranscrito na direção anti-horária foi selecionado. O novo plasmídeo foidesignado pAlLo2 (Figura 5).

Exemplo 6: Clonagem do gene da endoglicanase da Família CEL7F emum vetor de expressão de Aspergillus oryzae

Dois iniciadores de oligonucleotídeo sintético, mostradosabaixo, foram planejados para amplificar pela PCR a matriz de leitura abertade tamanho natural de EST Tter08C4 de Thielavia terrestris que codifica umaendoglicanase da Família CEL7F. Um Kit de Clonagem na Fusão (BDBiosciences, Paio Alto, CA) foi usado para clonar o fragmento diretamenteem pAlLo2.

Iniciador Avançado Em Fusão:

5' -ACTGGATTACC ATG ACCCTACGGCTCCCTGTC ATC A-3' (SEQIDNO: 14)

Iniciador Reverso Em Fusão:

5 -TCACCTCTAGTTAATTAACTAGTTCTTCGTGGTAGACC-3' (SEQIDNO: 15)

As letras em negrito representam a seqüência codificadora. Aseqüência remanescente contém a identidade de seqüência comparada com ossítios de inserção de pAlLo2.

Cinqüenta picomoles de cada um dos iniciadores acima foramusados em uma reação de PCR contendo 50 ng de pTterllC9 DNA, IXtampão de Amplificação Pfx (Invitrogen, Carlsbad, CA), 6 ul de 10 mM demistura of dATP, dTTP, dGTP e dCTP, 2,5 unidades de Pfx DNA PolimerasePlatinum (Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 ul de MgS04 50 mM e 5 ul de 10Xsolução realçadora pCRx (Invitrogen, Carlsbad, CA) em um volume final de50 ul. Um Eppendorf Mastercycler 5333 (Eppendorf Scientific, Inc.,Westbury, NY) foi usado para amplificar o fragmento programado para umciclo a 98°C por 2 minutos; e 35 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 65°Cpor 30 segundos e 68°C por 1,5 minuto. Depois dos 35 ciclos, a reação foiincubada a 68°C por 10 minutos e depois esfriada a 10°C até processadaadicionalmente. Um produto de reação de PCR de 1,4 kb foi isolado em umgel de agarose GTG a 0,8% (Cambrex Bioproducts One Meadowlands PlazaEast Rutherford, New Jersey 07073) usando 40 mM de tampão base de Tris-acetato de sódio 20 mM-EDTA dissódico 1 mM (TAE) e 0,1 u.g de brometode etídio por ml. A faixa de DNA foi visualizada com a ajuda de um DarkReader® (Clare Chemical Research, Dolores, CO) para evitar mutaçõesinduzidas por UV. A faixa de DNA de 1,4 kb foi excisada com uma lâmina debarbear descartável e purificada com um copo giratório Ultrafree-DA(Millipore, Billerica, MA) de acordo com as instruções do fabricante.

O vetor pAlLo2 foi linearizado pela digestão com Nco I e PacI. O fragmento foi purificado pela eletroforese em gel e ultrafiltração comodescrito acima. A clonagem do fragmento de PCR purificado no vetor pAlLo2linearizado e purificado foi realizado com um Kit de Clonagem In-Fusion(BD Biosciences, Paio Alto, CA). A reação (20 ul) conteve IX Tampão In-Fusion (BD Biosciences, Paio Alto, CA), IX BSA (BD Biosciences, PaioAlto, CA), 1 jul de enzima In-Fusion (diluída 1:10) (BD Biosciences, PaioAlto, CA), 100 ng de pAlLo2 digerida com Nco I e Pac I e 50 ng do produtode PCR CEL7F purificado de Thielavia terrestris. A reação foi incubada natemperatura ambiente por 30 minutos. Uma amostra de 2 ul da reação foiusada para transformar células XL10 SoloPac® Gold da E. coli (Stratagene,La Jolla, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Depois do períodode recuperação, duas alíquotas de 100 ul da reação de transformação foramplaqueadas em placas 2X YT de 150 mm suplementado com 100 ug deampicilina por ml. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Umconjunto de oito clones putativos recombinantes foi selecionadoaleatoriamente das placas de seleção e o DNA plasmídico foi preparado decada um usando um BioRobot 9600. Os clones foram analisados pela digestãode restrição com Xho I. Dois clones que tiveram o padrão de digestão derestrição esperado foram depois seqüenciados para confirmar que não houvemutações no inserto clonado. O Clone #1 foi selecionado e designadopAlLo22 (Figura 6).

Exemplo 7: Expressão do gene da endoglicanase da Família CEL7FThielavia terrestris em Aspergillus oryzae JAL250

Protoplastos de Aspergillus oryzae Jal250 (WO 99/61651)foram preparados de acordo com o método de Christensen et al, 1988,Bio/Technology 6: 1419-1422. Cinco microgramas de pAlLo22 (assim comopA!Lo2 como um controle de vetor) foram usados para transformarprotoplastos de Aspergillus oryzae JAL250.

A transformação de Aspergillus oryzae Jal250 com pAlLo2produziu cerca de 50 transformantes. Oito transformantes foram isolados emplacas de PDA individuais e incubados por cinco dias a 34°C.

As placas de esporo confluentes foram lavadas com 5 ml de0,01% de Tween 80 e a suspensão de esporo foi usada para inocular 25 ml demeio MDU2BP em 125 ml frascos de agitação de vidro. As culturas detransformante foram incubadas a 34°C com agitação constante a 200 rpm. Noquinto dia após a inoculação, as culturas foram centrifugadas a 6000 x g eseus sobrenadantes coletados. Cinco ul de cada sobrenadante forammisturados com um volume igual de 2X tampão de carga (10% de R-mercaptoetanol) e carregados em um gel de SDS-PAGE de 1,5 mm de 8% a16% de Tris-Glicina e tingido com Simply Blue SafeStain (Invitrogen,Carlsbad, CA). Os perfis de SDS-PAGE dos caldos de cultura mostraram queseis dos oito transformantes tiveram uma nova faixa de proteína deaproximadamente 40 kDa. O transformante número 7 foi selecionado paraestudos adicionais e designado Jal250AlLo22 de Aspergillus oryzae.

Exemplo 8: Culturas em frasco agitado grandes de Aspergillus oryzaeJal250AlLo22

Esporos de Aspergillus oryzae Jal250AlLo22 foramespalhados sobre uma placa de PDA e incubadas por cinco dias a 34°C. Aplaca de esporo confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de 0,01% deTween 80 para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão deesporo foi depois usada para inocular 500 ml de meio MDU2BP em umfrasco de Fernbach de dois litros. A cultura de transformante foi incubada a34°C com agitação constante (200 rpm). No quinto dia após a inoculação, ocaldo de cultura foi coletado pela filtração em uma unidade de filtração deNáilon de 75 mm, 500 ml com um tamanho de poro de 0,45 um com um préfiltro de fibra de vidro. Uma amostra de 5 ul do caldo foi analisada pela SDS-PAGE como descrito acima para confirmar que o padrão de proteína foi omesmo como aquele obtido antes. Uma vez que o caldo mostrou conter afaixa de proteína de 40 kDa, o caldo foi submetido à caracterizaçãoenzimática.

Exemplo 9: Caracterização da CEL7F endoglicanase de Thielaviaterrestris

O caldo de Jal250AlLo22 de Aspergillus oryzae descrito noExemplo 8 foi filtrado através de um filtro de 0,22 um de tamanho de poro(Millipore, Billerica, MA), concentrado usando uma célula agitada Amiconequipada com uma membrana PM 10 (Millipore, Billerica, MA) edessalinizada usando uma coluna Econo-Pac 10DG (BioRad Laboratories,Hercules, CA).

O caldo de Aspergillus oryzae Jal250 (apenas o vetor), comoum controle negativo, foi tratado do mesmo modo como acima.

Os substratos tingidos usados para avaliar a especificidade desubstrato da CEL7F endoglicanase de Thielavia terrestris incluíram: AZCL-arabinoxilano (trigo), AZCL-P-glicano, AZCL-dextrano, AZCL-HE-celulose,AZCL-galactana da batata, AZCL-galactomanana (Alfarroba), AZCL-xilano(vidoeiro), AZCL-xiloglicano (Megazyme, Bray, Irlanda) e Quitina Azure(Sigma, St Louis, MO).

Os ensaios de atividade foram realizados em placas de 96reservatórios profundos (Axygen Scientific, Union City, CA) seladas por umselador de placa (ALPS-300, Abgene, Epsom, UK). Oitocentos ul dossubstratos acima (6,25 g por litro de acetato de sódio 50 mM pH 5,0) foramtransferidos em cada reservatório da placa de 96 reservatórios profundos,seguido por 180 ul de acetato de sódio 50 mM pH 5,0 e 20 ul de solução deCEL7F endoglicanase Thielavia terrestris (0,25 g/L) para iniciar as reações.

A concentração de substrato e a carga de enzima na mistura de reação finalforam 5 g por litro e 1 mg de enzima por g de substrato, respectivamente. Ocaldo de Jal250 de Aspergillus oryzae foi testado junto com o caldo de CEL7endoglicanase de Thielavia terrestris sob as mesmas condições, servindocomo um controle negativo. As reações foram incubadas a 50°C sem mistura.

Antes da amostragem, as placas de reservatório profundo foram centrifugadasem uma centrífuga de placa (Sorvall RT7, Global Medicai Instrumentation,Ramsey, MN) a 3000 rpm por 5 minutos. Uma amostra de 150 ui dosobrenadante foi transferida em uma placa de filtração de 96 reservatórios(tamanho de poro de 0,45 um, Millipore, Billerica, MA), submetida à vácuo eo filtrado foi coletado. Uma amostra de 100 ul do filtrado foi transferida emuma outra placa de 96 reservatórios e a absorbância a 590 nm foi medidausando um Spectra MAX340 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

Depois de incubações em 1 hora e 92 horas, o corante liberadodos substratos tingidos diferentes pela CEL7F endoglicanase de Thielaviaterrestris (depois de subtrair o corante liberado pelo Jal250 de Aspergillusoryzae) é mostrado na Tabela 1 como valores de 590 nm relativos.Tabela 1. A59o nm relativa depois de incubar endoglicanase de Thielaviaterrestris com substratos tingidos diferentes por 1 hora e 92 horas a 50°C, pH5,0.

<table>table see original document page 84</column></row><table>

AX: AZCL-arabinoxilano PG: AZCL-P-glicanoDex: AZCL-dextrano HEC: AZCL-HE-celuloseGal: AZCL-galactana de batata GM: AZCL-galactomananaXly: AZCL-xilano XG: AZCL-xiloglicano

A CEL7F endoglicanase de Thielavia terrestris possuiuatividade contra AZCL-P-glicano e AZCL-HE-celulose depois de 1 hora. ACEL7F endoglicanase de Thielavia terrestris também mostrou atividade sobresubstratos tingidos com arabinoxilano, xilano e xiloglicano e baixa atividadesobre o substrato tingido com galactomanana depois de uma incubação de 92horas.

Exemplo 10: Hidrólise de forragem de milho pré tratada com a CEL7Fendoglicanase de Thielavia terresíris

A forragem de milho foi pré tratada no U.S. Department ofEnergy National Renewable Energy Laboratory (NREL) usando ácidosulfúrico diluído. As seguintes condições foram usadas para o pré tratamento:0,048 g de ácido sulfúrico / g de biomassa seca a 190°C e 25% p/p de sólidossecos por volta de 1 minuto. Os sólidos insolúveis em água na forragem demilho pré tratada (PCS) conteve 52% de celulose, 3,6% de hemi-celulose e29,8% de lignina. Celulose e hemi-celulose foram determinadas por umahidrólise de ácido sulfúrico de dois estágios com análise subseqüente deaçúcares pela cromatografia líquida de alto desempenho usando oProcedimento Analítico Padrão NREL #002. A lignina foi determinadagravimetricamente depois de hidrolisar as frações de celulose e hemi-celulosecom ácido sulfúrico usando o Procedimento Analítico Padrão NREL #003.

Antes da hidrólise enzimática, o PCS foi lavado com um grande volume deágua duplamente destilada até que o pH fosse mais alto do que 4,0 e foidepois peneirado através de uma peneira de malha 100 e autoclavado a 121°Cpor 30 minutos.

A hidrólise de PCS foi conduzida em placas de 96reservatórios profundos, (Axygen Scientific, Union City, CA) selado por umselador de placa (ALPS-300, Abgene, Epsom, UK), com um volume dereação total de 1,0 ml. A hidrólise de PCS (10 mg/ml em tampão de acetatode sódio 50 mM pH 5,0) foi realizado usando 1,25 mg de CEL7Fendoglicanase de Thielavia terrestris (preparada como descrita no Exemplo 9).por grama de PCS. O caldo de Jal250 de Aspergillus oryzae (preparado comodescrito no Exemplo 9) foi conduzido como um controle. A hidrólise de PCSfoi realizada a 50°C, pH 5,0. As reações foram conduzidas em duplicatas e asalíquotas foram tiradas durante o curso da hidrólise. As reações de hidrólisede PCS foram interrompidas misturando-se uma alíquota de 20 ul de cadahidrolisado com 180 ul de NaOH 0,11 M (reagente de interrupção). Asdiluições em série apropriadas foram geradas para cada amostra e o teor deaçúcar redutor determinado usando um ensaio da hidrazida do ácido para-hidroxibenzóico (PHBAH, Sigma, St. Louis, MO) adaptado para um formatode microplaca de 96 reservatórios como descrito abaixo. Em resumo, umaalíquota de 90 ul de uma amostra apropriadamente diluída foi colocada emuma microplaca de fundo cônico de 96 reservatórios. As reações foraminiciadas pela adição de 60 ul de 1,5% (p/v) de PHBAH em NaOH a 2% paracada reservatório. As placas foram aquecidas descobertas a 95°C por 10minutos. As placas foram deixadas esfriar até a temperatura ambiente (RT) e50 ul de H20 destilada adicionados a cada reservatório. Uma alíquota de 100ul de cada reservatório foi transferida a uma placa de 96 reservatórios defundo chato e a absorbância a A4i0 nm medida usando uma SpectraMaxMicroplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os padrões deglicose (0,1 a 0,0125 mg/ml diluídos com 0,4% de hidróxido de sódio) foramusados para preparar uma curva padrão para traduzir os valores de A4ionmobtidos em equivalentes de glicose. Os equivalentes resultantes foram usadospara calcular a porcentagem de conversão de PCS celulose para cada reação.O grau de conversão da celulose para açúcar redutor (conversão,%) foicalculado usando a seguinte equação:

Conversão (o/o) = RS (mg/mi) * 100 * 162 / (Celulose (mg/mi) * 180)= RS (mg/mi) * 100 / (Celulose (mg/ml)* 1,111)

Nesta equação, RS é a concentração de açúcar redutor emsolução medida em equivalentes de glicose (mg/ml) e o fator 1,111 reflete opeso ganho na conversão da celulose para glicose.

A hidrólise de PCS pela CEL7F endoglicanase de Thielaviaterrestris (1,25 mg/g de PCS) produziu uma conversão de celulose de 2,1%depois de 120 horas. Jal250 Aspergillus oryzae (1,25 mg/g de PCS) produziumenos do que 1% de conversão depois de 120 horas.

Exemplo 11: Hidrólise de beta-glicano solúvel de cevada pelaendoglicanase de Thielavia terrestris

A Cel7F endoglicanase de Thielavia terrestris foi testada naforma do caldo, de Jal250AlLo22 de Aspergillus oryzae descrita no Exemplo8. O caldo foi concentrado e trocado para acetato de sódio 50 mM pH 5,0usando o filtro centrífugo Centricon Plus-20 com membrana depoliétersulfona Biomax-5 (5000 NMWL) da Millipore (Bedford, MA). Ocaldo de Jal250 de Aspergillus oryzae (vetor sozinho) foi tratado da mesmamaneira como acima.

A concentração de proteína nas soluções de enzima foideterminada usando o ensaio de microplaca do Ácido Bicinconínico (BCA)de acordo com as instruções do fabricante para um Kit de Reagente de Ensaiode Proteína de BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL).

As diluições de enzima foram preparadas frescas antes de cadaexperimento a partir das soluções de enzima de estoque, que foramarmazenadas a -20°C.

A atividade da Cel7F endoglicanase de Thielavia terrestrissobre beta-glicano solúvel da cevada (viscosidade do meio, 230 kDa,Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Irlanda) foi determinada no pH5,5 (acetato de sódio 50 mM com 0,02% de azida de sódio) e 60°C. Osresultados foram comparados com aqueles para Cel7B (EGI) endoglicanasede Trichoderma reesei. A Cel7B (EGI) endoglicanase de Trichoderma reeseirecombinante pode ser preparada de acordo com Takashima et al, 1998,Journal of Biotechnology 65: 163-171.

A concentração inicial de beta-glicano nas reações de hidrólisefoi de 1,0% (p/v). Reações de um ml foram conduzidas sem agitar em Placasde 96 reservatórios profundos de Eppendorf (1,2 ml, VWR Scientific, WestChester, PA). As enzimas foram usadas em três cargas de proteína, 0,05, 0,1 e0,2 mg por g de glicano. Nas reações de controle, as endoglicanases foramsubstituídas com 50 mM de acetato de sódio pH 5,5 contendo 0,02% de azidade sódio (controle de tampão) ou com caldo de Jal250 de Aspergillus oryzaeconcentrado e trocado no tampão não contendo nenhuma enzimarecombinantemente expressada (controle de Jal250).

As alíquotas foram removidas das reações de hidrólise em 2horas e 24 horas, diluídas com água deionizada e analisadas quanto aosaçúcares redutores usando o ensaio da hidrazida do ácido p-hidróxi-benzóico(PHBAH) como descrito no Exemplo 10. A conversão relativa de beta-glicano como uma função da carga de proteína em dois tempos de incubação,2 horas e 24 horas, é mostrada nas Figuras 7 e 8, respectivamente. Aconversão relativa é mostrada como uma porcentagem de conversão obtidadepois da hidrólise de 24 horas de beta-glicano pela Cel7F endoglicanase deThielavia terrestris (0,2 mg de proteína por g de glicano).

A Cel7F endoglicanase de Thielavia terrestris mostrouconversão mais alta de beta-glicano do que a Cel7B endoglicanase deTrichoderma reesei e continuou a produzir novos grupos finais redutores alémdo tempo de 2 horas de incubação. Ao contrário, a Cel7B endoglicanase deTrichoderma reesei quase não mostrou nenhum aumento adicional naconcentração de açúcar redutor depois de 2 horas de hidrólise.

Depósito de Material Biológico

O seguinte material biológico foi depositado sob os termos doTratado de Budapest com a Agricultural Research Service Patent CultureCollection, Northern Regional Research Center, 1815 University Street,Peoria, Illinois, 61604 e dado o seguinte número de acesso:

Depósito Número de Acesso Data de Depósito

pTter7F de E. coli NRRL B-30837 11 de abril de 2005A cepa foi depositada sob as condições que garante que oacesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patentea uma pessoa determinada pelo Representante de Patentes e Marcas a serdesignado para isto sob 37 C.F.R. §1,14 e 35 U.S.C. §122. O depósitorepresenta uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósitoestá disponível como requerido pelas leis de patente estrangeiras em paísesem que as contrapartes do pedido objeto ou a sua progênie são depositados.

Entretanto, deve ser entendido que a disponibilidade de um depósito nãoconstitui uma licença para praticar a invenção objeto em detrimento dosdireitos de patente outorgados pela ação governamental.

A invenção descrita e aqui reivindicada não deve ser limitadano escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, visto que estes aspectossão pretendidos como ilustrações de diversos aspectos da invenção. Pretende-se que quaisquer aspectos equivalentes estejam dentro do escopo destainvenção. De fato, várias modificações da invenção além daquelas mostradase descritas aqui tornar-se-ão evidentes àqueles habilitados na técnica a partirda descrição precedente. Pretende-se também que tais modificações caiamdentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presentedivulgação incluindo as definições controlarão.

Várias referências são aqui citadas, as divulgações das quaissão incorporadas por referência em suas totalidades.<table>table see original document page 90</column></row><table>

INDICAÇÕES RELACIONADAS A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO(Regra PCT 13 to)

<table>table see original document page 90</column></row><table>

Forma PCT/RO/134 (Julho de 1992)LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

<110> Wiyi/0%Y®&& , Inc..

<I20> Polipeptideos tendo atividade de endoglicanase epolinucleotideos que codificam os mesmos.

<130> 10802.204-^0

<150> 60/675,€01

<151> 2005-04-27

<160> X5

<170> Patentlo versioíi 3.2

<2I0> 1

<2Xl> 1011<2.12>

<213> Th-ieXávía terrestris

<4ÓÓ> 1

atgaccctàc ggotceefegt eatcagcctg ctggcctçgç: tggcagcãgg cgccgtcgtc 60

gtocçacggg cggagtttca ccgacttgga ãatgcacgac cfcccgggggc 120

tgcgtgcagc agaacaceag ^gfccgtccfcg gaeçgtgaçfe. cgaagtacgc cgcacãííâge 1S0

gccggctcgc ggacggaatc ggattaegçg gcaatgggag tgtcçâçttc gggcaa&gcc 240

gtgacgctgt âcçacta.cgt caagaccaac ggc:áee;Cteg tccccgcfetc gccgcgcãto 300

fcacctcctgg gcgcgga£gg dãagtacgtg ctteatggacc tcctoaa!oca ggagcfcgtcg 360

gtggacgtcg aefct.ctcggc gctgccgtga ggçgagaacg gggcctt-Ctã cetgtceg&g 420

atggcggcgg acgggcgggg cgaegegggg gcgggcgacg ggtaçtgcga cgcgcagtgc 4:80

oagggctàCt gctgcaacga gatggacatc ctcg^ggçca actcgatggc gacggcoatg 540

âcgcçgçacc cgtgcaaggg c&acaacegc faccgcagcg gctgcggcta caaeçcgtac soo

gccagcggdc agegeggGtt ctaogggcoc ggcaagãcgg -tcgac&cgag caagcccttc 660

açcgtcgfca cgcagttcge cgceagcggc ggcaagc&ga cccagatçaç ccgcaagtac 720

atccaga^cg geegggagat eggcggegge ggcaocatct ccagctgcgg dtçcgagtct 7BÔ

txgaegggeg gcetgaccgg catgggcgag gegefeggggc gcggaaeggfc getggççatg 340

agcatctgga acg&egcggG ccaggagatg gcatggctcg atgccggcaa caacggccct 900

tgçgceagfcg gccagggcag ceçgtecgte atfceagfcegc agcatccega cacçeacgtc 960

gtctfcctçca acatcaggtg gggcgac&tc gggtctaccá cgaagaacta g 1011

<2I0> 2<21i> 336*212> PRT<2X3> Thielavia terrestris

<400> 2

Mtofe Thr Leu Arg Leu Pro Vai Jle Ser Leu Leu Ala ser &eu Ala. Ala1 5 10 1S

Gly Ala Vai Vá! Vai. Pro Arg Ala Glu Phe His Prõ Pro £eu Pro Thr20 25 30

Tzp Lys Cys Hr Thr Ser <&y Gly Cys Vai Qln Gl.n Asn Thr Ser Vãl35 40 45

Vai Leu Asp Arg Asp Ser Lys *ryr Ala Ala His Ser Ala Gly Sêr Arg50 S-5 60

Tiir Glu Ser Asp Tyr Ala Ala Met Gly Vai Ser Thr Ser Gly Asn Ala65 70 75 B0

Yal Tbr Lçu Tyr His Tyr Vai Lys Thr Asn Gly Thr- Leu Vai Pro AlaÔS £0 55

Ser Pro Ar^ He Tyr Leu Leu Gly Ala Asp Gly Lys Tyr vai Leu Met

100 105 110

Asp Leu Leu Asn Gln Glu teu Ser Vai Asp Vai Asp phe Sêr Ala Leu.115 120 123

Pro Cys Gly Glu Asn Gly Ala Phe Tyr teu Séx Glu Het Ala Ala. mp130 135 140

Gly Arg Gly Asp Ala Gly Ala Gly &&p Gly Tyr QyB Asp Ala. Qln çya145 150 155 3.60

Gln Gly Tyr cys Cys Ase Glu Ket .Asp lie Leu Glu Ala Asn Ser Met165 170 115

Ala Thr Ala Hat Thr Pro His Pro Cys Lys Gly Asm Asn Cys Asp Arg

iao ies 190

Ser Gly Cys Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Ser Gly Glu Arg Gly Fhe Tyr195 200 205

Gly Pro Gly Lys Thr Vai h&p Ifer Sêr Lye Pro Phe -Ehr Vai Vai Thr210 2X5 220ti-tn Püe Ala Aia ser Gly Gly Lys225 23 0

Leu Thr Gln Ile Thr Arg: I^ys Tyx235 240

lio Gln Asn Gly Arg Glu Il.e Gly243

Gly Gly Gly Tht Ile Ser Ser Cyg250 25S

Gly ser Glu Ser Ser Thr Gly Gly260

teu Thr Gly Met Gly Glu Ala L*u26S 270

Gly Arg Gly Met Vai L<su Ala. Met275 280

Ser lie Trp iV3á Asp Ala Ala Gln285

G1& Met Ala Trp .Xatstfc Asp Ala Gly2.90 295

Ã&if Asin Gly Pr o €y& Ala Ser Gly309

Gln Gly ser i?ro Ser Vai ll€ 01 &305 aio

Ser Gln Hiç Pro Asp Thr SI a Vai315 320

Vai Mie Ser Asa Ile Arg Trp Gly325

Asp Xle Gly Ser Thr Thr Lys a&xi330 335

<21D> 3<211:> 32<212.3f DNA

<-213> Esclierichia coli<40Q> 3

tagtcgggga caactttgta caaaaaagtt gg 32

<21Ò> 4

<211> 27

<2X2> JDHA

<213> Bscherichiâ. coii

<2I0> 5<23Ll> 16

<2i:2> TMK

<2i.3> Iso&ericíiia coli<400> 5

gtaoaacgac ggecag

<21<h> €

<21.1> 25

<2i.2> tm&

<21.3> BschsricMa coli

<400> £

cccctgtfega aacatgtttt fetdâacc

27<22D>

<2 21 > mí^ c_t e&c.urè

<222> (25>..(25)

<223> H ^ A.r Cp QR, T

<4Q0> 6

tttttttttt tfcfcttttttt tttvn 25

<2lG> 7<211> 22<212> DNA

<2i3> Aspergillue xtidulatte<400> 7

gtgccccatg ataogtctcc 99 22

*21Ô> B<2M> 26<212> DNA

<2i3> Aspergillue ni#wlans<400> 0

gagtcgtatt tccaaggcta ctgacc .26

<210> 9<21l> 24<212> BNA

<213> Aspergillús nidulâ&s<4QÜ> 9

■gg-aggccaípg «agtggacaa açgg 24:

<210> 10<2ll> 4S<21,2> £MA

<213> Aspergillus niger<4Q0> 10

cacogtgaaa gccatgctct titccttcgfeg* tãgaagacca gacag 45

<210> II<211> 45<212> QNA

<213> ÃÊ'pérgiIIus niger<400> II

ctggtcttct aca.09aag.ga aagagcatgg ctttcacggt gtctg 45

<âiq> 12

<211> 44

<2Xt> DÍSA

<213> AspérgilXus fciger<400> 12

ctat-âtãcac- a&Êtgga.tfct accatgggcc egcggccgca g-atc 4-4

<2I0> 13<2il> 44

<21J> Âapârgili^is niger<400> 13

gatctgcggc egsgggccca tggtaaafccc agttgtgtat afcag 44

<210> 14<c211> 36<;-212> DNA

<211> Thielavia terirestris<4GÜ> 14

a.ct00âttac catgacccta cggctccctg tcasca 36

<210> 15

<211> 3$

<212> DNA

<213> Ttiielâ.viã terregtsris

<40Õ> 1S

fccscctcfeag- ttaattaact ^gttctt.cgt ggtagacc

3a

Claims

1. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que tematividade de endoglicanase, selecionado do grupo que consiste de:(a) um polipeptídeo que compreenda uma seqüência deaminoácido que tenha pelo menos 60 % de identidade com o polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2;(b) um polipeptídeo que é codificado por um polinucleotídeoque hibridiza sob pelo menos condições de estringência média com (i) opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii); e(c) uma variante que compreenda uma substituição, deleçãoe/ou inserção conservativa de um ou mais aminoácidos do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 60 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 65 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 70 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 75 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 80 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 85 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 90 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácido que tenha pelomenos 95 % de identidade com o polipeptídeo maduro da SEQ ID NO: 2.

10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 2, ou um fragmento desta tendo atividade de endoglicanase.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 2.

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2.

13. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que consiste da SEQ ID NO: 2, ou um fragmentodesta tendo atividade de endoglicanase.

14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato de que consiste da SEQ ID NO: 2.

15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que consiste do polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2.

16. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob pelo menos condições de estringência média com (i) opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii).

17. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob pelo menos condições de estringência média-alta com (i) opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii).

18. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que é codificado por um polinucleotídeo quehibridiza sob pelo menos condições de estringência alta com (i) opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii).

19. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é codificado pelo polinucleotídeo contido noplasmídeo pTter7F que está contido na E. coli NRRL B-30837.

20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma variante que compreendeuma substituição, deleção e/ou inserção conservativa de um ou maisaminoácidos dos aminoácidos 18 a 336 da SEQ ID NO: 2.

21. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeomaduro é os aminoácidos 18 a 336 da SEQ ID NO: 2.

22. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeomaduro que codifica a seqüência tem os nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ IDNO: 1.

23. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 22, caracterizado pelo fato de que ainda têm atividadeenzimática contra um ou mais substratos selecionados do grupo que consistede xilano, xiloglicano, arabinoxilano, 1,4-galactano, galactomanano, dextranoe quitina.

24. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de quecompreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 23.

25. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma mutação nopolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, em que aseqüência de nucleotídeo mutante codifica o polipeptídeo maduro da SEQ IDNO: 2.

26. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende o polinucleotídeo como definido nas reivindicações 24 ou 25operavelmente ligado a uma ou mais seqüências de controle que direcionam aprodução do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.

27. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 26.

28. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 26.

29. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 23, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula, que na sua forma do tipo selvagem écapaz de produzir o polipeptídeo, sob condições condutivas para a produçãodo polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

30. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 23, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma célula hospedeira que compreenda umaconstrução de ácido nucleico que compreende uma seqüência de nucleotídeoque codifica o polipeptídeo sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

31. Método para produzir um mutante de uma célulaprecursora, caracterizado pelo fato de que compreende romper ou deletar umaseqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 23, que resulta na produção domutante menos do polipeptídeo do que da célula precursora.

32. Célula mutante, caracterizada pelo fato de ser produzidapelo método como definido na reivindicação 31.

33. Célula mutante de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que compreende ainda um gene que codifica umaproteína nativa ou heteróloga.

34. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula mutante como definida emreivindicação 33 sob condições condutivas para a produção da proteína; e (b)recuperar a proteína.

35. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que éobtido pela (a) hibridização de uma população de DNA sob condições deestringência média com (i) o polipeptídeo maduro que codifica a seqüência daSEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNA genômico que compreende opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) umfilamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo dehibridização, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de endoglicanase.

36. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que é obtido pela (a) hibridização de umapopulação de DNA sob condições de estringência média-alta com (i) opolipeptídeo maduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) aseqüência de DNA genômico que compreende o polipeptídeo maduro quecodifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementarde (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo de hibridização, que codifica umpolipeptídeo tendo atividade de endoglicanase.

37. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que é obtido pela (a) hibridização de umapopulação de DNA sob condições de estringência alta com (i) o polipeptídeomaduro que codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, (ii) a seqüência de DNAgenômico que compreende o polipeptídeo maduro que codifica a seqüência daSEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de (i) ou (ii); e (b) isolaro polinucleotídeo de hibridização, que codifica um polipeptídeo tendoatividade de endoglicanase.

38. Polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 35 a 37, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeomaduro que codifica a seqüência tem os nucleotídeos de 52 a 1008 da SEQ IDNO: 1.

39. Método para produzir um polinucleotídeo compreendendouma seqüência de nucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) introduzir pelo menos uma mutação no polipeptídeo maduroque codifica a seqüência da SEQ ID NO: 1, em que a seqüência denucleotídeo mutante codifica um polipeptídeo que consiste do polipeptídeomaduro da SEQ ID NO: 2; e (b) recuperar o polinucleotídeo que compreendea seqüência de nucleotídeo mutante.

40. Polinucleotídeo mutante, caracterizado pelo fato de que éproduzido pelo método como definido na reivindicação 39.

41. Método para produzir um polipeptídeo, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar uma célula que compreende opolinucleotídeo mutante como definido na reivindicação 40 que codifica opolipeptídeo sob condições condutivas para a produção do polipeptídeo; e (b)recuperar o polipeptídeo.

42. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato deque compreende um gene que codifica uma proteína operavelmente ligada auma seqüência de nucleotídeo que codifica um peptídeo de sinal quecompreende ou que consiste dos aminoácidos 1 a 17 da SEQ ID NO: 2, emque o gene é estranho à seqüência de nucleotídeo.

43. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fatode que compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 42.

44. Célula hospedeira recombinante, caracterizada pelo fato deque compreende a construção de ácido nucleico como definida nareivindicação 42.

45. Método para produzir uma proteína, caracterizado pelofato de que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante comodefinida na reivindicação 44 sob condições condutivas para a produção daproteína; e (b) recuperar a proteína.

46. Método para produzir o polipeptídeo como definido emqualquer uma das reivindicações de 1 a 23, caracterizado pelo fato de quecompreende: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula vegetal quecompreendam um polinucleotídeo que codifique um polipeptídeo tendoatividade de endoglicanase sob condições condutivas para a produção dopolipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

47. Planta transgênica, parte de planta ou célula vegetal,caracterizada pelo fato de que foi transformada com um polinucleotídeo quecodifica o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações de-1 a 23.

48. Composição detergente, caracterizada pelo fato de quecompreende o polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 23 e um tensoativo.

49. Método para degradar biomassa contendo celulose e hemi-celulose, caracterizado pelo fato de que compreende tratar a biomassa comuma quantidade eficaz do polipeptídeo como definido em qualquer uma dasreivindicações de 1 a 23 e recuperar a biomassa degradada.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que ainda compreende tratar a biomassa com uma quantidadeeficaz de endo-l,4-beta-glicanase, exo-l,4-beta-D-glicanase e/ou beta-D-glicosidase.

51. Método para degradar biomassa contendo celulose e hemi-celulose, caracterizado pelo fato de que compreende tratar a biomassa comuma célula hospedeira como definida na reivindicação 28 e recuperar abiomassa degradada.

52. Método de acordo com a reivindicação 51, caracterizadopelo fato de que ainda compreende tratar a biomassa com uma quantidadeeficaz de endo-l,4-beta-glicanase, exo-l,4-beta-D-glicanase e/ou beta-D-glicosidase.