JPH08228778A - 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法 - Google Patents
新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法Info
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- JPH08228778A JPH08228778A JP7038527A JP3852795A JPH08228778A JP H08228778 A JPH08228778 A JP H08228778A JP 7038527 A JP7038527 A JP 7038527A JP 3852795 A JP3852795 A JP 3852795A JP H08228778 A JPH08228778 A JP H08228778A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
- C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 シュードモナス ｓｐ．(Pseudomonas sp.)
ＳＤ７０５株の染色体ＤＮＡより単離されたリパーゼ遺
伝子。該リパーゼ遺伝子を使用するリパーゼの製造方
法。 【効果】 該リパーゼ製造方法により、リパーゼを効率
良く生産出来る。
ＳＤ７０５株の染色体ＤＮＡより単離されたリパーゼ遺
伝子。該リパーゼ遺伝子を使用するリパーゼの製造方
法。 【効果】 該リパーゼ製造方法により、リパーゼを効率
良く生産出来る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は洗剤用、食品加工用、製
紙工業用、製油工業用等産業上有用な脂質分解酵素であ
る新規リパーゼ、それをコードする遺伝子およびそのヌ
クレオチド配列、該リパーゼの生産に関与するタンパク
質をコードする遺伝子およびそのヌクレオチド配列、そ
れらの遺伝子を含む組換えベクター、組換えベクターを
含む形質転換細胞、形質転換細胞を用いたリパーゼの製
造方法に関する。
紙工業用、製油工業用等産業上有用な脂質分解酵素であ
る新規リパーゼ、それをコードする遺伝子およびそのヌ
クレオチド配列、該リパーゼの生産に関与するタンパク
質をコードする遺伝子およびそのヌクレオチド配列、そ
れらの遺伝子を含む組換えベクター、組換えベクターを
含む形質転換細胞、形質転換細胞を用いたリパーゼの製
造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】リパーゼを生産する微生物としては、シ
ュードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Al
caligenes ）属、ムコール（Mucor ）属、キャンディダ
（Candida ）属、フミコーラ（Humicola）属、リゾムコ
ール（Rhizomucor）属などが知られている。これらの中
には遺伝子が取得されているものがいくつかあるが、な
かでもシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する微生
物のリパーゼ遺伝子が数多く取得されている。これまで
に知られているものとしては、シュードモナス・フラジ
（Pseudomonas fragi ）（特開昭62-228279 、特開平2-
190188）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas ce
pacia ）（特開平3-47079 、特開平3-87187 ）、シュー
ドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（EP26845
2）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseud
omonas pseudoalcaligenes ）（特開平3-500845）、シ
ュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginos
a）（EP334462）、シュードモナス・グルマエ（Pseudom
onas glumae）（Appl. Envir. Microbiol.(1992)58,373
8-3791 ）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudom
onas fluorescens ）（Appl. Envir. Microbiol.(1992)
58,1776-1779 ）がある。
ュードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Al
caligenes ）属、ムコール（Mucor ）属、キャンディダ
（Candida ）属、フミコーラ（Humicola）属、リゾムコ
ール（Rhizomucor）属などが知られている。これらの中
には遺伝子が取得されているものがいくつかあるが、な
かでもシュードモナス（Pseudomonas ）属に属する微生
物のリパーゼ遺伝子が数多く取得されている。これまで
に知られているものとしては、シュードモナス・フラジ
（Pseudomonas fragi ）（特開昭62-228279 、特開平2-
190188）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas ce
pacia ）（特開平3-47079 、特開平3-87187 ）、シュー
ドモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（EP26845
2）、シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseud
omonas pseudoalcaligenes ）（特開平3-500845）、シ
ュードモナス・アエルギノザ（Pseudomonas aeruginos
a）（EP334462）、シュードモナス・グルマエ（Pseudom
onas glumae）（Appl. Envir. Microbiol.(1992)58,373
8-3791 ）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudom
onas fluorescens ）（Appl. Envir. Microbiol.(1992)
58,1776-1779 ）がある。
【０００３】一部のシュードモナス（Pseudomonas ）属
細菌におけるリパーゼの生成には、リパーゼ構造遺伝子
下流の遺伝子領域がコードしているタンパク質が関与し
ていることが知られている。シュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepacia ）におけるリパーゼの生成には
宿主微生物の種類に関わらずこの下流領域遺伝子が必須
である（EP331376）。シュードモナス・グルマエ（Pseu
domonas glumae）の産するリパーゼは、宿主微生物の種
類に関わらずリパーゼの安定化効果を示すタンパク質が
この領域にコードされていることが知られている（EP46
4922）。一方シュードモナス・シュードアルカリゲネス
（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）では、ホモロガス
な宿主・ベクターを用いた系では生産量増大効果を示す
が、ヘテロロガスな宿主・ベクターを用いた系でのリパ
ーゼ生産にはこの下流領域遺伝子は必須ではない（EP33
4462）。またシュードモナス・フラジ（Pseudomonas fr
agi ）ではこの下流領域遺伝子は存在しない。
細菌におけるリパーゼの生成には、リパーゼ構造遺伝子
下流の遺伝子領域がコードしているタンパク質が関与し
ていることが知られている。シュードモナス・セパシア
（Pseudomonas cepacia ）におけるリパーゼの生成には
宿主微生物の種類に関わらずこの下流領域遺伝子が必須
である（EP331376）。シュードモナス・グルマエ（Pseu
domonas glumae）の産するリパーゼは、宿主微生物の種
類に関わらずリパーゼの安定化効果を示すタンパク質が
この領域にコードされていることが知られている（EP46
4922）。一方シュードモナス・シュードアルカリゲネス
（Pseudomonas pseudoalcaligenes ）では、ホモロガス
な宿主・ベクターを用いた系では生産量増大効果を示す
が、ヘテロロガスな宿主・ベクターを用いた系でのリパ
ーゼ生産にはこの下流領域遺伝子は必須ではない（EP33
4462）。またシュードモナス・フラジ（Pseudomonas fr
agi ）ではこの下流領域遺伝子は存在しない。
【０００４】リパーゼを洗剤に配合して被洗浄物に付着
した脂質を分解除去し洗浄効率を向上できることは従来
より知られている。この用途は、アンドレー（H.Andre
e）らによる「洗浄剤成分としてのリパーゼ」（Lipase
as detergent components）と題する報文（Journal of
Applied Biochemistry, 2, 218-229 (1980)）等に記載
されている。
した脂質を分解除去し洗浄効率を向上できることは従来
より知られている。この用途は、アンドレー（H.Andre
e）らによる「洗浄剤成分としてのリパーゼ」（Lipase
as detergent components）と題する報文（Journal of
Applied Biochemistry, 2, 218-229 (1980)）等に記載
されている。
【０００５】好ましい洗剤配合用のリパーゼは、洗濯液
中で充分にリパーゼ活性が機能するものである。通常の
洗濯条件では洗浄液のｐＨがアルカリ性領域にあるた
め、アルカリ性ｐＨで機能するリパーゼが求められる。
また、一般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較
的除去されやすいが、低温（６０℃以下）の洗浄では充
分に脂質汚れを除去できないことが知られている。従来
より主として低温洗濯が行われているわが国はもとよ
り、欧米においても洗濯温度は低温化する傾向にあり、
従って好ましい洗剤配合用リパーゼは、低温でも充分に
機能するものである。また、好ましい洗剤配合用リパー
ゼは界面活性剤等の洗剤成分や、多くの洗剤に含まれて
いるプロテアーゼや漂白剤存在下でも洗濯時に充分機能
を発揮しうるものである。さらに、好ましい洗剤配合用
リパーゼは、洗剤に配合した状態で保存するときにも共
存する洗剤含有成分に対して安定であるものである。
中で充分にリパーゼ活性が機能するものである。通常の
洗濯条件では洗浄液のｐＨがアルカリ性領域にあるた
め、アルカリ性ｐＨで機能するリパーゼが求められる。
また、一般に脂質汚れは高温高アルカリ条件下では比較
的除去されやすいが、低温（６０℃以下）の洗浄では充
分に脂質汚れを除去できないことが知られている。従来
より主として低温洗濯が行われているわが国はもとよ
り、欧米においても洗濯温度は低温化する傾向にあり、
従って好ましい洗剤配合用リパーゼは、低温でも充分に
機能するものである。また、好ましい洗剤配合用リパー
ゼは界面活性剤等の洗剤成分や、多くの洗剤に含まれて
いるプロテアーゼや漂白剤存在下でも洗濯時に充分機能
を発揮しうるものである。さらに、好ましい洗剤配合用
リパーゼは、洗剤に配合した状態で保存するときにも共
存する洗剤含有成分に対して安定であるものである。
【０００６】リパーゼを生産する微生物としては、シュ
ードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alca
ligenes ）属、アクロモバクター（Achromobacter ）
属、ムコール（Mucor ）属、キャンディダ（Candida ）
属、フミコーラ（Humicola）属、リゾムコール（Rhizom
ucor）属などが知られているが、これらの菌株から得ら
れる大部分のリパーゼはその至適ｐＨが中性から微アル
カリ性にあるため、アルカリ性の洗剤溶液中で充分にリ
パーゼが機能せず、また、洗剤溶液中での安定性も低
い。さらには、アクロモバクター（Achromobacter ）
属、ムコール（Mucor）属、キャンディダ（Candida ）
属、フミコーラ（Humicola）属の各リパーゼは、アニオ
ン性界面活性剤の存在下においてその活性を強く阻害さ
れる。
ードモナス（Pseudomonas ）属、アルカリゲネス（Alca
ligenes ）属、アクロモバクター（Achromobacter ）
属、ムコール（Mucor ）属、キャンディダ（Candida ）
属、フミコーラ（Humicola）属、リゾムコール（Rhizom
ucor）属などが知られているが、これらの菌株から得ら
れる大部分のリパーゼはその至適ｐＨが中性から微アル
カリ性にあるため、アルカリ性の洗剤溶液中で充分にリ
パーゼが機能せず、また、洗剤溶液中での安定性も低
い。さらには、アクロモバクター（Achromobacter ）
属、ムコール（Mucor）属、キャンディダ（Candida ）
属、フミコーラ（Humicola）属の各リパーゼは、アニオ
ン性界面活性剤の存在下においてその活性を強く阻害さ
れる。
【０００７】また、リパーゼを生産するシュードモナス
（Pseudomonas ）属に属する微生物としては、シュード
モナス・フラジ（Pseudomonas fragi ）、シュードモナ
ス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）、シュードモナ
ス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalca
ligenes ）、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomo
nas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレセンス
（Pseudomonas fluorescens ）などがあるが、これらの
菌株から得られる公知の酵素も前記の特性を満足するも
のではない。
（Pseudomonas ）属に属する微生物としては、シュード
モナス・フラジ（Pseudomonas fragi ）、シュードモナ
ス・セパシア（Pseudomonas cepacia ）、シュードモナ
ス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas pseudoalca
ligenes ）、シュードモナス・アエルギノザ（Pseudomo
nas aeruginosa）、シュードモナス・フルオレセンス
（Pseudomonas fluorescens ）などがあるが、これらの
菌株から得られる公知の酵素も前記の特性を満足するも
のではない。
【０００８】
【本発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、洗
剤用等の工業分野に用いられる優れた特性を示すリパー
ゼＳの提供にある。さらに、リパーゼＳをコードする遺
伝子およびそのヌクレオチド配列、リパーゼＳの生産に
関与するタンパク質をコードする遺伝子およびそのヌク
レオチド配列、かかる遺伝子を含む組換えベクター、か
かる組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、か
かる形質転換細胞よりリパーゼＳを製造する方法を提供
することにある。
剤用等の工業分野に用いられる優れた特性を示すリパー
ゼＳの提供にある。さらに、リパーゼＳをコードする遺
伝子およびそのヌクレオチド配列、リパーゼＳの生産に
関与するタンパク質をコードする遺伝子およびそのヌク
レオチド配列、かかる遺伝子を含む組換えベクター、か
かる組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、か
かる形質転換細胞よりリパーゼＳを製造する方法を提供
することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の目的
を達成するために、まずリパーゼＳの生産菌の１つであ
るシュードモナス属細菌であり、本出願人により工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、ブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管されたシュードモナス ｓ
ｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４７７２）より、リパーゼＳをコードする遺伝子お
よびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を宿主細
胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養した培養物中
にリパーゼＳが得られることを確認し、本発明を完成す
るに至った。
を達成するために、まずリパーゼＳの生産菌の１つであ
るシュードモナス属細菌であり、本出願人により工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託され、ブダペスト条
約に基づく国際寄託に移管されたシュードモナス ｓ
ｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−４７７２）より、リパーゼＳをコードする遺伝子お
よびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を宿主細
胞に導入し、得られた形質転換細胞を培養した培養物中
にリパーゼＳが得られることを確認し、本発明を完成す
るに至った。
【００１０】すなわち、本発明は以下のものを提供する
ものである。 １）配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子。 ２）配列番号２に記載されたリパーゼをコードするヌク
レオチド配列を含む遺伝子。 ３）配列番号３に記載されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子。 ４）配列番号４に記載されたリパーゼの生産に関与する
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝
子。 ５）シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌由来の前記
１）ないし４）記載の遺伝子。 ６）シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ
７０５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７２）由来の
前記１）ないし４）記載の遺伝子。
ものである。 １）配列番号１に記載されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子。 ２）配列番号２に記載されたリパーゼをコードするヌク
レオチド配列を含む遺伝子。 ３）配列番号３に記載されたアミノ酸配列をコードする
遺伝子。 ４）配列番号４に記載されたリパーゼの生産に関与する
タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝
子。 ５）シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌由来の前記
１）ないし４）記載の遺伝子。 ６）シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ
７０５株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７２）由来の
前記１）ないし４）記載の遺伝子。
【００１１】７）前記１）ないし６）に記載された遺伝
子のヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含むＤＮ
Ａ。 ８）前記３）ないし４）に記載された遺伝子のヌクレオ
チド配列の全部もしくは一部とハイブリダイズするＤＮ
Ａ。 ９）前記１）ないし４）に記載された遺伝子の少なくと
も１つを宿主微生物細胞内で発現するように宿主微生物
細胞内で複製可能なベクターに組み込んだ組換えＤＮ
Ａ。 １０）前記１）ないし４）に記載された遺伝子の少なく
とも１つを微生物染色体上に相同組換えによって組み込
んだ組換え染色体ＤＮＡ、 １１）前記９）に記載の組換えＤＮＡの少なくとも１つ
で形質転換された形質転換宿主微生物。 １２）前記１０）に記載の組換え染色体ＤＮＡのいずれ
か１つを含む形質転換微生物。 １３）微生物が大腸菌、シュードモナス属細菌、または
バチルス属細菌である前記１１）記載の形質転換微生
物。 １４）微生物がシュードモナス属細菌、またはバチルス
属細菌である前記１２）記載の形質転換微生物。 １５）微生物がシュードモナス・アルカリゲネス、シュ
ードモナス・シュードアルカリゲネス、シュードモナス
・メンドシナ、またはバチルス・ズブチリスである前記
１１）もしくは１２）記載の形質転換微生物。 １６）微生物がシュードモナス ｓｐ．ＳＤ７０５株
（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７２）、シュードモナ
ス・メンドシナ ＳＤ７０２株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−４２９１）、バチルス ＮＫＳ−２１株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−９３−１）、またはそれらの変異株であ
る前記１１）もしくは１２）記載の形質転換微生物。 １７）前記１１）ないし１６）に記載の形質転換宿主細
胞の少なくとも１つを培養してリパーゼを含む培養物を
得ることを特徴とするリパーゼの製造方法。
子のヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含むＤＮ
Ａ。 ８）前記３）ないし４）に記載された遺伝子のヌクレオ
チド配列の全部もしくは一部とハイブリダイズするＤＮ
Ａ。 ９）前記１）ないし４）に記載された遺伝子の少なくと
も１つを宿主微生物細胞内で発現するように宿主微生物
細胞内で複製可能なベクターに組み込んだ組換えＤＮ
Ａ。 １０）前記１）ないし４）に記載された遺伝子の少なく
とも１つを微生物染色体上に相同組換えによって組み込
んだ組換え染色体ＤＮＡ、 １１）前記９）に記載の組換えＤＮＡの少なくとも１つ
で形質転換された形質転換宿主微生物。 １２）前記１０）に記載の組換え染色体ＤＮＡのいずれ
か１つを含む形質転換微生物。 １３）微生物が大腸菌、シュードモナス属細菌、または
バチルス属細菌である前記１１）記載の形質転換微生
物。 １４）微生物がシュードモナス属細菌、またはバチルス
属細菌である前記１２）記載の形質転換微生物。 １５）微生物がシュードモナス・アルカリゲネス、シュ
ードモナス・シュードアルカリゲネス、シュードモナス
・メンドシナ、またはバチルス・ズブチリスである前記
１１）もしくは１２）記載の形質転換微生物。 １６）微生物がシュードモナス ｓｐ．ＳＤ７０５株
（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−４７７２）、シュードモナ
ス・メンドシナ ＳＤ７０２株（受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−４２９１）、バチルス ＮＫＳ−２１株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−９３−１）、またはそれらの変異株であ
る前記１１）もしくは１２）記載の形質転換微生物。 １７）前記１１）ないし１６）に記載の形質転換宿主細
胞の少なくとも１つを培養してリパーゼを含む培養物を
得ることを特徴とするリパーゼの製造方法。
【００１２】以下本発明について詳細に説明する。 （遺伝子の単離）本発明において、リパーゼをコードす
る遺伝子は、コロニーハイブリダイゼーションや平板培
地上でのクリアゾーンの形成といった公知の方法で染色
体ＤＮＡから単離することができる。すなわち、まず染
色体ライブラリーを作成する。次にリパーゼの全部また
は一部のアミノ酸配列が判っている場合には、その部分
に相当するオリゴヌクレオチドプローブを作製し、それ
を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行うことに
より、リパーゼをコードする遺伝子を単離することがで
きる。リパーゼのアミノ酸配列が全く判っていない場合
は、一般に微生物リパーゼにおいて保存性の高いことが
知られている活性中心残基近傍の配列に相当するオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用いることもできる。ま
たあるいは、２つの異なる保存性配列に相当するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、目的リパーゼ遺伝子を
もつ染色体を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより２つ
のプライマー間の配列を酵素的に合成することにより得
られた２本鎖ＤＮＡの双方をプローブとして用いること
ができる。
る遺伝子は、コロニーハイブリダイゼーションや平板培
地上でのクリアゾーンの形成といった公知の方法で染色
体ＤＮＡから単離することができる。すなわち、まず染
色体ライブラリーを作成する。次にリパーゼの全部また
は一部のアミノ酸配列が判っている場合には、その部分
に相当するオリゴヌクレオチドプローブを作製し、それ
を用いてコロニーハイブリダイゼーションを行うことに
より、リパーゼをコードする遺伝子を単離することがで
きる。リパーゼのアミノ酸配列が全く判っていない場合
は、一般に微生物リパーゼにおいて保存性の高いことが
知られている活性中心残基近傍の配列に相当するオリゴ
ヌクレオチドをプローブとして用いることもできる。ま
たあるいは、２つの異なる保存性配列に相当するオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとし、目的リパーゼ遺伝子を
もつ染色体を鋳型としてＤＮＡポリメラーゼにより２つ
のプライマー間の配列を酵素的に合成することにより得
られた２本鎖ＤＮＡの双方をプローブとして用いること
ができる。
【００１３】あるいは、リパーゼを産生しない細菌で染
色体ライブラリーを作製し、リパーゼの難溶性基質を含
む寒天上で平板培養する。リパーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を持つ細菌は、そのコロニーの周りの基質を
分解するためクリアゾーンを形成することによって選抜
できる。この方法によってもリパーゼをコードする遺伝
子を単離することができるが、いずれの方法でも良い。
色体ライブラリーを作製し、リパーゼの難溶性基質を含
む寒天上で平板培養する。リパーゼ遺伝子を含む染色体
ＤＮＡ断片を持つ細菌は、そのコロニーの周りの基質を
分解するためクリアゾーンを形成することによって選抜
できる。この方法によってもリパーゼをコードする遺伝
子を単離することができるが、いずれの方法でも良い。
【００１４】リパーゼの生産に関与するタンパク質をコ
ードする遺伝子は、リパーゼをコードする遺伝子の全部
あるいは３’側の一部をプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーションを行うことによりリパーゼ遺伝子の下
流のＤＮＡ断片として染色体ＤＮＡから単離することが
できる。
ードする遺伝子は、リパーゼをコードする遺伝子の全部
あるいは３’側の一部をプローブとしてコロニーハイブ
リダイゼーションを行うことによりリパーゼ遺伝子の下
流のＤＮＡ断片として染色体ＤＮＡから単離することが
できる。
【００１５】（宿主）得られた遺伝子を導入するための
宿主としては、その遺伝子が発現するものであればよ
く、例えばシュードモナス（Pseudomonas ）属細菌、エ
スシェリシア（Escherichia ）属細菌、バチルス（Baci
llus）属細菌等を用いることが出来る。シュードモナス
（Pseudomonas ）属細菌では、シュードモナス ｓｐ．
（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株（受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４７７２）もしくはその変異株、シュードモナ
ス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes ）、シ
ュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas
pseudoalcaligenes ）、シュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina ）が好ましい。より好ましく
は、シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ
７０５株もしくはその変異株、シュードモナス・メンド
シナ（Pseudomonas mendocina ）ＳＤ７０２株（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２９１）もしくはその変異株であ
る。
宿主としては、その遺伝子が発現するものであればよ
く、例えばシュードモナス（Pseudomonas ）属細菌、エ
スシェリシア（Escherichia ）属細菌、バチルス（Baci
llus）属細菌等を用いることが出来る。シュードモナス
（Pseudomonas ）属細菌では、シュードモナス ｓｐ．
（Pseudomonas sp. ）ＳＤ７０５株（受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４７７２）もしくはその変異株、シュードモナ
ス・アルカリゲネス（Pseudomonas alcaligenes ）、シ
ュードモナス・シュードアルカリゲネス（Pseudomonas
pseudoalcaligenes ）、シュードモナス・メンドシナ
（Pseudomonas mendocina ）が好ましい。より好ましく
は、シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ）ＳＤ
７０５株もしくはその変異株、シュードモナス・メンド
シナ（Pseudomonas mendocina ）ＳＤ７０２株（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−４２９１）もしくはその変異株であ
る。
【００１６】エスシェリシア（Escherichia ）属細菌で
は、大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。バチルス
（Bacillus）属細菌では、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis ）、バチルス・アミロリクファシエンス
（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニホ
ルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ファー
マス（Bacillus firmus ）、バチルス・レンタス（Baci
llus lentus ）、バチルス・アルカロフィラス（Bacill
us alcalophilus ）が好ましい。より好ましくは、バチ
ルス ｓｐ．（Bacillus sp.）ＮＫＳ−２１株（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）もしくはその変異株であ
る。
は、大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。バチルス
（Bacillus）属細菌では、バチルス・ズブチリス（Baci
llus subtilis ）、バチルス・アミロリクファシエンス
（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・リケニホ
ルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・ファー
マス（Bacillus firmus ）、バチルス・レンタス（Baci
llus lentus ）、バチルス・アルカロフィラス（Bacill
us alcalophilus ）が好ましい。より好ましくは、バチ
ルス ｓｐ．（Bacillus sp.）ＮＫＳ−２１株（受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）もしくはその変異株であ
る。
【００１７】（形質転換）得られたリパーゼ遺伝子とリ
パーゼの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を宿主菌に導入する。両遺伝子を同時に１つのベクター
に、染色体中に存在していたのと同様の配列になるよう
に連結するか、あるいは、それぞれを宿主細胞中で共存
できる２つのベクターに別々に連結する。
パーゼの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子
を宿主菌に導入する。両遺伝子を同時に１つのベクター
に、染色体中に存在していたのと同様の配列になるよう
に連結するか、あるいは、それぞれを宿主細胞中で共存
できる２つのベクターに別々に連結する。
【００１８】シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌以
外を宿主として用いる場合は、宿主中で発現するよう
に、その宿主で機能するプロモーター及びシグナル配列
とターミネーターの間に挿入するように連結する。遺伝
子を連結した組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換
する。２つの遺伝子を別々のベクターに連結した場合
は、リパーゼ遺伝子のみを含む組換えベクターのみを用
いて形質転換してもよいし、また、２つの組換えベクタ
ーで同時に形質転換してもよい。例えば、大腸菌を宿主
として用いる場合、pUC 系や、pACYC 系等のプラスミド
を用いることができる。バチルス（Bacillus）属細菌を
宿主として用いる場合は、pUB110や、pE194等のプラス
ミドを用いることができる。
外を宿主として用いる場合は、宿主中で発現するよう
に、その宿主で機能するプロモーター及びシグナル配列
とターミネーターの間に挿入するように連結する。遺伝
子を連結した組換えベクターを用いて宿主菌を形質転換
する。２つの遺伝子を別々のベクターに連結した場合
は、リパーゼ遺伝子のみを含む組換えベクターのみを用
いて形質転換してもよいし、また、２つの組換えベクタ
ーで同時に形質転換してもよい。例えば、大腸菌を宿主
として用いる場合、pUC 系や、pACYC 系等のプラスミド
を用いることができる。バチルス（Bacillus）属細菌を
宿主として用いる場合は、pUB110や、pE194等のプラス
ミドを用いることができる。
【００１９】シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌を
宿主として用いる場合は、RSF1010等のプラスミドを用
いることができる。これらによって遺伝子は宿主菌の染
色体外に安定に維持される。また、宿主菌内で複製でき
ない形のＤＮＡを用いて染色体内に組み込む方法によっ
て遺伝子を導入してもよい。
宿主として用いる場合は、RSF1010等のプラスミドを用
いることができる。これらによって遺伝子は宿主菌の染
色体外に安定に維持される。また、宿主菌内で複製でき
ない形のＤＮＡを用いて染色体内に組み込む方法によっ
て遺伝子を導入してもよい。
【００２０】（リパーゼの製造）シュードモナス（Pseu
domonas ）属細菌を宿主として用いた場合、リパーゼは
培養液中に分泌される。培養液からのリパーゼの分離精
製は、培養液に硫安を加え、リパーゼを粗分画し、透析
によって硫安を除去後、ＣＭセルロースカラムで分別す
ることによりＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で
単一なバンドになるまでリパーゼを精製できる。しか
し、リパーゼの生産、及び精製法は上記方法に限定され
るものではなく、他の方法でももちろん可能である。
domonas ）属細菌を宿主として用いた場合、リパーゼは
培養液中に分泌される。培養液からのリパーゼの分離精
製は、培養液に硫安を加え、リパーゼを粗分画し、透析
によって硫安を除去後、ＣＭセルロースカラムで分別す
ることによりＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で
単一なバンドになるまでリパーゼを精製できる。しか
し、リパーゼの生産、及び精製法は上記方法に限定され
るものではなく、他の方法でももちろん可能である。
【００２１】（リパーゼＳの性質）以上の方法により得
られるリパーゼＳは以下に挙げる性質を示す。 （１）作用 トリグリセリドに作用し、そのエステルを加水分解す
る。 （２）基質特異性 各種グリセリド、エステルなどを広範囲にわたり加水分
解する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ オリーブオイルを基質とし、ｐＨ−ｓｔａｔ法を使用
し、ｐＨ８〜１２の範囲で測定した場合の作用ｐＨが８
〜１２、至適ｐＨが約１０．７。 （４）作用温度及び至適温度 トリオレインエマルジョンを基質として、３０〜８０℃
の範囲で測定した場合の作用温度が３０〜８０℃、至適
温度が６０±５℃。 （５）洗剤成分による影響 プロテアーゼを含む各種洗剤溶液中で高い活性を有す
る。
られるリパーゼＳは以下に挙げる性質を示す。 （１）作用 トリグリセリドに作用し、そのエステルを加水分解す
る。 （２）基質特異性 各種グリセリド、エステルなどを広範囲にわたり加水分
解する。 （３）作用ｐＨ及び至適ｐＨ オリーブオイルを基質とし、ｐＨ−ｓｔａｔ法を使用
し、ｐＨ８〜１２の範囲で測定した場合の作用ｐＨが８
〜１２、至適ｐＨが約１０．７。 （４）作用温度及び至適温度 トリオレインエマルジョンを基質として、３０〜８０℃
の範囲で測定した場合の作用温度が３０〜８０℃、至適
温度が６０±５℃。 （５）洗剤成分による影響 プロテアーゼを含む各種洗剤溶液中で高い活性を有す
る。
【００２２】
【実施例】本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明
は以下の実施例に限定されるものではない。実施例１：染色体ＤＮＡの調製 シュードモナス ｓｐ．(Pseudomonas sp.) ＳＤ７０５
株をＬ培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム０．５％）に１０％炭酸ナトリウムを３
ｍｌ加え、ｐＨ９に調製した培地１０００ｍｌに植菌
し、３５℃で１晩培養後、遠心分離によって上清を除去
し、菌体を得た。これを０．４Ｍ塩化ナトリウム、１０
ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）８ｍｌに懸濁した。これにリゾチームとＲＮａｓｅ
Ａをそれぞれ終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／
ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間穏やかに振と
うし、更にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を終濃度
１％になるように加え、３７℃で３０分間穏やかに振と
うし、溶菌させた。その後、６０℃で１０分間加温し、
完全に可溶化させた。この溶液にＴＥ緩衝液（１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８））
で飽和させたフェノールを等量加え、穏やかに転倒混和
し、遠心分離によって上層の水層を回収することを３回
繰り返した。３回目に回収した水層に−２０℃に冷やし
たエタノールを３倍量加え、沈澱をプラスチック棒で巻
取った。この沈澱をエタノールでリンスした後、減圧乾
燥し、ＴＥ緩衝液１ｍｌに再溶解した。
は以下の実施例に限定されるものではない。実施例１：染色体ＤＮＡの調製 シュードモナス ｓｐ．(Pseudomonas sp.) ＳＤ７０５
株をＬ培地（ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、
塩化ナトリウム０．５％）に１０％炭酸ナトリウムを３
ｍｌ加え、ｐＨ９に調製した培地１０００ｍｌに植菌
し、３５℃で１晩培養後、遠心分離によって上清を除去
し、菌体を得た。これを０．４Ｍ塩化ナトリウム、１０
ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）８ｍｌに懸濁した。これにリゾチームとＲＮａｓｅ
Ａをそれぞれ終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／
ｍｌになるように加え、３７℃で３０分間穏やかに振と
うし、更にドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を終濃度
１％になるように加え、３７℃で３０分間穏やかに振と
うし、溶菌させた。その後、６０℃で１０分間加温し、
完全に可溶化させた。この溶液にＴＥ緩衝液（１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８））
で飽和させたフェノールを等量加え、穏やかに転倒混和
し、遠心分離によって上層の水層を回収することを３回
繰り返した。３回目に回収した水層に−２０℃に冷やし
たエタノールを３倍量加え、沈澱をプラスチック棒で巻
取った。この沈澱をエタノールでリンスした後、減圧乾
燥し、ＴＥ緩衝液１ｍｌに再溶解した。
【００２３】実施例２：染色体ＤＮＡライブラリーの作
製 染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した
後、アガロース電気泳動を行い、２〜１０ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１１８をＢ
ａｍＨＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理を行っ
た。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。これ
をＬ培地で培養した後、５０ｍＭ塩化カルシウムで処理
した大腸菌ＪＭ１０１株０．３ｍｌに加え、０℃で３０
分間インキュベートした後、Ｌ培地を１ｍｌになるよう
に加え、３７℃で１時間振とうした。これをアンピシリ
ン５０ｐｐｍを含むＬ平板培地に塗布し、３７℃で１晩
培養した。この結果、約１０００コロニーの形質転換体
を得た。
製 染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解した
後、アガロース電気泳動を行い、２〜１０ｋｂｐのＤＮ
Ａ断片を回収した。一方、プラスミドｐＵＣ１１８をＢ
ａｍＨＩで分解し、アルカリホスファターゼ処理を行っ
た。両者をＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。これ
をＬ培地で培養した後、５０ｍＭ塩化カルシウムで処理
した大腸菌ＪＭ１０１株０．３ｍｌに加え、０℃で３０
分間インキュベートした後、Ｌ培地を１ｍｌになるよう
に加え、３７℃で１時間振とうした。これをアンピシリ
ン５０ｐｐｍを含むＬ平板培地に塗布し、３７℃で１晩
培養した。この結果、約１０００コロニーの形質転換体
を得た。
【００２４】実施例３：オリゴヌクレオチドプローブの
作製 精製したリパーゼのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシ
ークエンサー Model 476A （アプライドバイオシステム
ズ社）で分析し、配列番号５に示す結果を得た。これに
基づいてＤＮＡ合成機で配列番号６に示すオリゴヌクレ
オチドプローブを合成した。これを、ECLTM3'-oligolab
elling and detection system （Amasham life science
社）を用いて標識した。
作製 精製したリパーゼのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシ
ークエンサー Model 476A （アプライドバイオシステム
ズ社）で分析し、配列番号５に示す結果を得た。これに
基づいてＤＮＡ合成機で配列番号６に示すオリゴヌクレ
オチドプローブを合成した。これを、ECLTM3'-oligolab
elling and detection system （Amasham life science
社）を用いて標識した。
【００２５】実施例４：リパーゼをコードする遺伝子の
単離 約１０００コロニーの形質転換体をＬ平板培地上に置い
たナイロンフィルター上で３７℃で１晩培養した。フィ
ルターを剥し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム １．５Ｍ塩
化ナトリウムに浸した濾紙上で１０分間溶菌させ、１．
５Ｍ 塩化ナトリウム １Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７）で浸した濾紙上で７分間、２回中和した。フィルタ
ーを８０℃２時間焼成し、０．５％ＳＤＳ／６×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム溶液。ｎ×ＳＳＣは１×ＳＳＣのｎ
倍の濃度の１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１５ｍＭクエン
酸ナトリウム溶液。）中で菌の残査を洗浄した。０．１
％ＳＤＳ／５×ＳＳＣ／５×Denhardts solution（0.1%
ficoll、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%BSA ）中でフ
ィルターのプレハイブリダイゼーションを６０℃で１時
間行った。同様の溶液中に上記の標識したオリゴヌクレ
オチドプローブを加え、フィルターのハイブリダイゼー
ションを６０℃で１晩行った。その後、フィルターを
０．１％ＳＤＳ／１×ＳＳＣで６０℃で１５分間、０．
１％ＳＤＳ／０．５×ＳＳＣで６０℃で１５分間洗浄し
た。これを、ECLTM3'-oligolabelling and detection s
ystem のプロトコルに従って検出した。
単離 約１０００コロニーの形質転換体をＬ平板培地上に置い
たナイロンフィルター上で３７℃で１晩培養した。フィ
ルターを剥し、０．５Ｍ水酸化ナトリウム １．５Ｍ塩
化ナトリウムに浸した濾紙上で１０分間溶菌させ、１．
５Ｍ 塩化ナトリウム １Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７）で浸した濾紙上で７分間、２回中和した。フィルタ
ーを８０℃２時間焼成し、０．５％ＳＤＳ／６×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１５ｍＭ
クエン酸ナトリウム溶液。ｎ×ＳＳＣは１×ＳＳＣのｎ
倍の濃度の１５０ｍＭ塩化ナトリウム／１５ｍＭクエン
酸ナトリウム溶液。）中で菌の残査を洗浄した。０．１
％ＳＤＳ／５×ＳＳＣ／５×Denhardts solution（0.1%
ficoll、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%BSA ）中でフ
ィルターのプレハイブリダイゼーションを６０℃で１時
間行った。同様の溶液中に上記の標識したオリゴヌクレ
オチドプローブを加え、フィルターのハイブリダイゼー
ションを６０℃で１晩行った。その後、フィルターを
０．１％ＳＤＳ／１×ＳＳＣで６０℃で１５分間、０．
１％ＳＤＳ／０．５×ＳＳＣで６０℃で１５分間洗浄し
た。これを、ECLTM3'-oligolabelling and detection s
ystem のプロトコルに従って検出した。
【００２６】このようなコロニーハイブリダイゼーショ
ンの結果、いくつかの陽性コロニーを得た。得られたコ
ロニーのうちの１つからプラスミドを回収し、制限酵素
ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ、ＳａｃＩとＸｂａＩで分解した
断片をアガロース電気泳動で分離して挿入断片の長さを
推定したところ、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られたこ
とが判った。このプラスミドｐＳ１を各種制限酵素で分
解し、制限酵素地図を作製した。さらにアガロースゲル
電気泳動で分離してナイロンフィルターに吸着させた。
コロニーハイブリダイゼーションと同様の手順でサザン
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、約４ｋｂ
ｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片および約２．７ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイズした。この結果よ
り、リパーゼＳをコードする遺伝子およびその生産に関
与するタンパク質をコードする遺伝子は約４ｋｂｐのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片および約２．７ｋｂｐのＥ
ｃｏＲＩ断片に含まれていると推定された。図１にｐＳ
１の制限酵素地図を示す。ここで、白矢印はリパーゼ遺
伝子、黒矢印はリパーゼの生産に関与する遺伝子、Ｐｌ
ａｃはｌａｃプロモーター、ｏｒｉは複製開始点、Ａｐ
r はアンピシリン耐性遺伝子を表わす。これらの断片を
回収し、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株））のＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位またはＥｃｏＲＩ部位にそ
れぞれ連結し、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換して、そ
れぞれのＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＳ１Ｓ、ｐＳ１
Ｅを得た。図２にｐＳ１Ｓ、図３にｐＳ１Ｅの制限酵素
地図を示す。図中の記号は図１と同じ。
ンの結果、いくつかの陽性コロニーを得た。得られたコ
ロニーのうちの１つからプラスミドを回収し、制限酵素
ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩ、ＳａｃＩとＸｂａＩで分解した
断片をアガロース電気泳動で分離して挿入断片の長さを
推定したところ、約７ｋｂｐのＤＮＡ断片が得られたこ
とが判った。このプラスミドｐＳ１を各種制限酵素で分
解し、制限酵素地図を作製した。さらにアガロースゲル
電気泳動で分離してナイロンフィルターに吸着させた。
コロニーハイブリダイゼーションと同様の手順でサザン
ハイブリダイゼーションを行った。その結果、約４ｋｂ
ｐのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片および約２．７ｋｂ
ｐのＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイズした。この結果よ
り、リパーゼＳをコードする遺伝子およびその生産に関
与するタンパク質をコードする遺伝子は約４ｋｂｐのＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ断片および約２．７ｋｂｐのＥ
ｃｏＲＩ断片に含まれていると推定された。図１にｐＳ
１の制限酵素地図を示す。ここで、白矢印はリパーゼ遺
伝子、黒矢印はリパーゼの生産に関与する遺伝子、Ｐｌ
ａｃはｌａｃプロモーター、ｏｒｉは複製開始点、Ａｐ
r はアンピシリン耐性遺伝子を表わす。これらの断片を
回収し、プラスミドｐＵＣ１１８（宝酒造（株））のＨ
ｉｎｄＩＩＩ−ＳａｃＩ部位またはＥｃｏＲＩ部位にそ
れぞれ連結し、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換して、そ
れぞれのＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＳ１Ｓ、ｐＳ１
Ｅを得た。図２にｐＳ１Ｓ、図３にｐＳ１Ｅの制限酵素
地図を示す。図中の記号は図１と同じ。
【００２７】実施例５：リパーゼ遺伝子のヌクレオチド
配列決定 プラスミドｐＳ１Ｅを用いて、Sangerのジデオキシ法
（Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.(1977) Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.,74,5463 ）でリパーゼＳをコードする
遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードす
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。すなわち、ダ
イデオキシターミネーターシーケンシングキット（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用い、ＤＮＡシークエン
サー Model370A （アプライドバイオシステムズ社）に
よってヌクレオチド配列を解析した。その結果、配列番
号２のようなリパーゼをコードするヌクレオチド配列お
よび配列番号４のようなリパーゼ生産に関与するタンパ
ク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を得た。そ
こから推定されるアミノ酸配列を配列番号１および配列
番号３で示す。
配列決定 プラスミドｐＳ１Ｅを用いて、Sangerのジデオキシ法
（Sanger,F.,Nicklen,S.,Coulson,A.R.(1977) Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA.,74,5463 ）でリパーゼＳをコードする
遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードす
る遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。すなわち、ダ
イデオキシターミネーターシーケンシングキット（アプ
ライドバイオシステムズ社）を用い、ＤＮＡシークエン
サー Model370A （アプライドバイオシステムズ社）に
よってヌクレオチド配列を解析した。その結果、配列番
号２のようなリパーゼをコードするヌクレオチド配列お
よび配列番号４のようなリパーゼ生産に関与するタンパ
ク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列を得た。そ
こから推定されるアミノ酸配列を配列番号１および配列
番号３で示す。
【００２８】実施例６：組換えベクターの構築および形
質転換体の作製 ｉ）大腸菌 リパーゼ遺伝子のＳＤ配列及び開始コドンを含む部分に
相当する配列の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が付加される
ような配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを化学合成
した。このオリゴヌクレオチドと市販のM13 primer RV
（宝酒造（株））の２つのオリゴヌクレオチドをプラス
ミドｐＳ１Ｅと混合し、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョン（ＰＣＲ）反応を行い、ＳＤ配列を含むリパーゼ遺
伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。この断片をＥｃｏＲＩ
で完全に分解後、アガロースゲル電気泳動で分画し、ア
ガロースゲル中より抽出精製した。プラスミドｐＵＣ１
１８をＥｃｏＲＩで完全に分解後、上記のように精製し
たＤＮＡ断片と混合し、T4DNA リガーゼによって連結反
応を行い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換し、アンピシ
リン耐性の形質転換体を選択した。これらの形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを抽出、精製、分析し、得られた
形質転換体が、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位にリ
パーゼ遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入され、ｌａｃプ
ロモーターの下流でリパーゼ遺伝子およびその生産に関
与するタンパク質をコードする遺伝子が発現されるプラ
スミドを保持していることを確認し、このプラスミドを
ｐＳＬ１とした。図４にｐＳＬ１の制限酵素地図を示
す。図中の記号は図１と同じ。
質転換体の作製 ｉ）大腸菌 リパーゼ遺伝子のＳＤ配列及び開始コドンを含む部分に
相当する配列の５’末端にＥｃｏＲＩ部位が付加される
ような配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを化学合成
した。このオリゴヌクレオチドと市販のM13 primer RV
（宝酒造（株））の２つのオリゴヌクレオチドをプラス
ミドｐＳ１Ｅと混合し、ポリメラーゼチェーンリアクシ
ョン（ＰＣＲ）反応を行い、ＳＤ配列を含むリパーゼ遺
伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。この断片をＥｃｏＲＩ
で完全に分解後、アガロースゲル電気泳動で分画し、ア
ガロースゲル中より抽出精製した。プラスミドｐＵＣ１
１８をＥｃｏＲＩで完全に分解後、上記のように精製し
たＤＮＡ断片と混合し、T4DNA リガーゼによって連結反
応を行い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換し、アンピシ
リン耐性の形質転換体を選択した。これらの形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを抽出、精製、分析し、得られた
形質転換体が、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位にリ
パーゼ遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入され、ｌａｃプ
ロモーターの下流でリパーゼ遺伝子およびその生産に関
与するタンパク質をコードする遺伝子が発現されるプラ
スミドを保持していることを確認し、このプラスミドを
ｐＳＬ１とした。図４にｐＳＬ１の制限酵素地図を示
す。図中の記号は図１と同じ。
【００２９】リパーゼ遺伝子の３’末端にＥｃｏＲＩ部
位が付加されるような配列番号８に示すオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。これと先に合成した配列番号７に
示すオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳ１Ｅと混合
し、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応
を行い、ＳＤ配列を含むリパーゼ遺伝子のみを含むＤＮ
Ａ断片を得た。この断片をＥｃｏＲＩで完全に分解後、
上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結、形質転換
し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位にリパーゼ遺伝
子のみを含むＤＮＡ断片が挿入され、ｌａｃプロモータ
ーの下流でリパーゼ遺伝子が発現されるプラスミドｐＳ
Ｌ２を保持する形質転換体を得た。図５にｐＳＬ２の制
限酵素地図を示す。図中の記号は図１と同じ。
位が付加されるような配列番号８に示すオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。これと先に合成した配列番号７に
示すオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳ１Ｅと混合
し、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応
を行い、ＳＤ配列を含むリパーゼ遺伝子のみを含むＤＮ
Ａ断片を得た。この断片をＥｃｏＲＩで完全に分解後、
上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結、形質転換
し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ切断部位にリパーゼ遺伝
子のみを含むＤＮＡ断片が挿入され、ｌａｃプロモータ
ーの下流でリパーゼ遺伝子が発現されるプラスミドｐＳ
Ｌ２を保持する形質転換体を得た。図５にｐＳＬ２の制
限酵素地図を示す。図中の記号は図１と同じ。
【００３０】ｉｉ）シュードモナス プラスミドｐＳ１ＳをＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで完全
に分解後、リパーゼ遺伝子およびその生産に関与するタ
ンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動で分画し、アガロースゲル中より抽出
精製した。プラスミドｐＭＦＹ４２をＨｉｎｄＩＩＩと
ＳａｃＩで完全に分解後、上記のように精製したＤＮＡ
断片と混合し、T4DNA リガーゼによって連結反応を行
い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換し、カナマイシン耐
性のコロニーを選択した。これらの形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを抽出、精製、分析し、ｐＭＦＹ４２のＨ
ｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩ切断部位の間にリパーゼ遺伝子
およびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＰ１を
得た。図６にｐＳＰ１の制限酵素地図を示す。ここで、
白矢印、黒矢印は図１と同じ。Ｋｍr はカナマイシン耐
性遺伝子、Ｔｃr はテトラサイクリン耐性遺伝子を表わ
す。
に分解後、リパーゼ遺伝子およびその生産に関与するタ
ンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をアガロ
ースゲル電気泳動で分画し、アガロースゲル中より抽出
精製した。プラスミドｐＭＦＹ４２をＨｉｎｄＩＩＩと
ＳａｃＩで完全に分解後、上記のように精製したＤＮＡ
断片と混合し、T4DNA リガーゼによって連結反応を行
い、大腸菌ＪＭ１０１株を形質転換し、カナマイシン耐
性のコロニーを選択した。これらの形質転換体よりプラ
スミドＤＮＡを抽出、精製、分析し、ｐＭＦＹ４２のＨ
ｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩ切断部位の間にリパーゼ遺伝子
およびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＰ１を
得た。図６にｐＳＰ１の制限酵素地図を示す。ここで、
白矢印、黒矢印は図１と同じ。Ｋｍr はカナマイシン耐
性遺伝子、Ｔｃr はテトラサイクリン耐性遺伝子を表わ
す。
【００３１】市販のM13 primer M4 （宝酒造（株））と
配列番号９に示すオリゴヌクレオチドの２つのオリゴヌ
クレオチドをプラスミドｐＳ１Ｓと混合し、ポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を行い、リパー
ゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を得た。この断片をＨｉ
ｎｄＩＩＩとＳａｃＩで完全に分解後、上記と同様にプ
ラスミドｐＭＦＹ４２と連結し、ｐＭＦＹ４２のＨｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｃＩ切断部位の間にリパーゼ遺伝子のみ
を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＰ２を得
た。図７にｐＳＰ２の制限酵素地図を示す。図中の記号
は図６と同じ。
配列番号９に示すオリゴヌクレオチドの２つのオリゴヌ
クレオチドをプラスミドｐＳ１Ｓと混合し、ポリメラー
ゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を行い、リパー
ゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を得た。この断片をＨｉ
ｎｄＩＩＩとＳａｃＩで完全に分解後、上記と同様にプ
ラスミドｐＭＦＹ４２と連結し、ｐＭＦＹ４２のＨｉｎ
ｄＩＩＩとＳａｃＩ切断部位の間にリパーゼ遺伝子のみ
を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＰ２を得
た。図７にｐＳＰ２の制限酵素地図を示す。図中の記号
は図６と同じ。
【００３２】プラスミドｐＳＰ１およびｐＳＰ２を用
い、シュードモナス ｓｐ．ＳＤ７０５株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４７７２）をエレクトロポーレーション
法により形質転換し、カナマイシン耐性のコロニーを選
択した。すなわち、まずＳＤ７０５株をｐＨ９に調整し
たＬ液体培地５ｍｌでＯＤ＝０．５まで生育させた後、
遠心分離により菌体を回収した。この菌体を滅菌水に懸
濁し、再び回収した後、０．５ｍｌの滅菌水に再懸濁し
た。この菌懸濁液にプラスミドＤＮＡを加え、電極付き
セルに移した後、高電圧電気パルスを与えた。その後、
菌懸濁液にｐＨ９のＬ液体培地を１ｍｌ加え、３７℃で
１時間振とう培養した後、カナマイシン５０ｐｐｍ及び
リパーゼの基質であるオリーブオイルのエマルジョンを
含むｐＨ９のＬ平板培地に塗布した。３５℃で１晩培養
し、生育したコロニーのうち、コロニーの回りにクリア
ゾーンを形成したものを選抜し、形質転換株を得た。
い、シュードモナス ｓｐ．ＳＤ７０５株（受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−４７７２）をエレクトロポーレーション
法により形質転換し、カナマイシン耐性のコロニーを選
択した。すなわち、まずＳＤ７０５株をｐＨ９に調整し
たＬ液体培地５ｍｌでＯＤ＝０．５まで生育させた後、
遠心分離により菌体を回収した。この菌体を滅菌水に懸
濁し、再び回収した後、０．５ｍｌの滅菌水に再懸濁し
た。この菌懸濁液にプラスミドＤＮＡを加え、電極付き
セルに移した後、高電圧電気パルスを与えた。その後、
菌懸濁液にｐＨ９のＬ液体培地を１ｍｌ加え、３７℃で
１時間振とう培養した後、カナマイシン５０ｐｐｍ及び
リパーゼの基質であるオリーブオイルのエマルジョンを
含むｐＨ９のＬ平板培地に塗布した。３５℃で１晩培養
し、生育したコロニーのうち、コロニーの回りにクリア
ゾーンを形成したものを選抜し、形質転換株を得た。
【００３３】シュードモナス・メンドシナ（Pseudomona
s mendocina ）ＳＤ７０２株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４２９１）のリパーゼ欠損株であるＬＤ９株を同様に
形質転換し、形質転換体を得た。なお、ＬＤ９株は、シ
ュードモナス・メンドシナＳＤ７０２株にＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを作用させ、リ
パーゼ基質を含む平板培地にまいて培養し、クリアゾー
ンを形成しない株を選択することにより取得した。
s mendocina ）ＳＤ７０２株（受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ
−４２９１）のリパーゼ欠損株であるＬＤ９株を同様に
形質転換し、形質転換体を得た。なお、ＬＤ９株は、シ
ュードモナス・メンドシナＳＤ７０２株にＮ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを作用させ、リ
パーゼ基質を含む平板培地にまいて培養し、クリアゾー
ンを形成しない株を選択することにより取得した。
【００３４】ｉｉｉ）バチルス 成熟リパーゼのＮ末端にＸｂａＩ部位が付加されるよう
な配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドを化学合成し
た。また、リパーゼの生産に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子の３’末端にＸｂａＩ部位が付加されるよ
うな配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを化学合成
した。これら２つのオリゴヌクレオチドをプラスミドｐ
Ｓ１Ｅと混合し、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）反応を行い、成熟型リパーゼ遺伝子およびそ
の生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を得た。この断片をＸｂａＩで完全に分解
後、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐ
ＵＣ１１８のＸｂａＩ切断部位に成熟型リパーゼ遺伝子
およびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＭ１を
得た。
な配列番号１０に示すオリゴヌクレオチドを化学合成し
た。また、リパーゼの生産に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子の３’末端にＸｂａＩ部位が付加されるよ
うな配列番号１１に示すオリゴヌクレオチドを化学合成
した。これら２つのオリゴヌクレオチドをプラスミドｐ
Ｓ１Ｅと混合し、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）反応を行い、成熟型リパーゼ遺伝子およびそ
の生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含む
ＤＮＡ断片を得た。この断片をＸｂａＩで完全に分解
後、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐ
ＵＣ１１８のＸｂａＩ切断部位に成熟型リパーゼ遺伝子
およびその生産に関与するタンパク質をコードする遺伝
子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＭ１を
得た。
【００３５】リパーゼのＣ末端にＸｂａＩ部位が付加さ
れるような配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドを化
学合成した。このオリゴヌクレオチドと配列番号１０に
示すオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳ１Ｅと混合
し、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応
を行い、成熟型リパーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を
得た。この断片をＸｂａＩで完全に分解後、上記と同様
にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ１１８のＸ
ｂａＩ切断部位に成熟型リパーゼ遺伝子およびその生産
に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片が挿入されたプラスミドｐＳＭ２を得た。
れるような配列番号１２に示すオリゴヌクレオチドを化
学合成した。このオリゴヌクレオチドと配列番号１０に
示すオリゴヌクレオチドをプラスミドｐＳ１Ｅと混合
し、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）反応
を行い、成熟型リパーゼ遺伝子のみを含むＤＮＡ断片を
得た。この断片をＸｂａＩで完全に分解後、上記と同様
にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ１１８のＸ
ｂａＩ切断部位に成熟型リパーゼ遺伝子およびその生産
に関与するタンパク質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ
断片が挿入されたプラスミドｐＳＭ２を得た。
【００３６】配列番号１３、１４に示すオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
をプラスミドｐＳＤＴ８１２（特開平１−１４１５９
６）と混合し、ポリメラーゼチェーンリアクション（Ｐ
ＣＲ）反応を行い、アルカリプロテアーゼのプロモータ
ー領域及びプレプロ配列の一部を含むＤＮＡ断片を得
た。この断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで完全に分解後、
上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ
１１８のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ切断部位の間にアルカリ
プロテアーゼのプロモーター領域及びプレプロ配列の一
部を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＡＰ１を
得た。
チドを化学合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
をプラスミドｐＳＤＴ８１２（特開平１−１４１５９
６）と混合し、ポリメラーゼチェーンリアクション（Ｐ
ＣＲ）反応を行い、アルカリプロテアーゼのプロモータ
ー領域及びプレプロ配列の一部を含むＤＮＡ断片を得
た。この断片をＥｃｏＲＩとＸｂａＩで完全に分解後、
上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ
１１８のＥｃｏＲＩとＸｂａＩ切断部位の間にアルカリ
プロテアーゼのプロモーター領域及びプレプロ配列の一
部を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＡＰ１を
得た。
【００３７】配列番号１５、１６に示すオリゴヌクレオ
チドを化学合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
をプラスミドｐＳＤＴ８１２と混合し、ポリメラーゼチ
ェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を行い、アルカリプ
ロテアーゼのターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を得
た。この断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解
後、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐ
ＵＣ１１８のＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間に
アルカリプロテアーゼのターミネーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が挿入されたプラスミドｐＡＰ２を得た。
チドを化学合成した。これら２つのオリゴヌクレオチド
をプラスミドｐＳＤＴ８１２と混合し、ポリメラーゼチ
ェーンリアクション（ＰＣＲ）反応を行い、アルカリプ
ロテアーゼのターミネーター領域を含むＤＮＡ断片を得
た。この断片をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで完全に分解
後、上記と同様にプラスミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐ
ＵＣ１１８のＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間に
アルカリプロテアーゼのターミネーター領域を含むＤＮ
Ａ断片が挿入されたプラスミドｐＡＰ２を得た。
【００３８】プラスミドｐＡＰ１をＥｃｏＲＩとＸｂａ
Ｉで切断し、アルカリプロテアーゼのプロモーター領域
及びプレプロ配列の一部を含むＤＮＡ断片を回収した。
また、プラスミドｐＡＰ２をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、アルカリプロテアーゼのターミネーター領域
を含むＤＮＡ断片を回収した。この２つの断片をプラス
ミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間にアルカリプロテアーゼ
のプロモーター領域、プレプロ配列の一部及びターミネ
ーター領域を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐ
ＡＰ３を得た。図８にｐＡＰ１、ｐＡＰ２、ｐＡＰ３の
構築過程を示す。ここで、Ｐａｐｒはアルカリプロテア
ーゼ遺伝子プロモーター、ｐｒｅはアルカリプロテアー
ゼプレ配列、ｐｒｏはアルカリプロテアーゼプロ配列、
ｔｅｒはアルカリプロテアーゼ遺伝子ターミネーターを
表わす。
Ｉで切断し、アルカリプロテアーゼのプロモーター領域
及びプレプロ配列の一部を含むＤＮＡ断片を回収した。
また、プラスミドｐＡＰ２をＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩ
で切断し、アルカリプロテアーゼのターミネーター領域
を含むＤＮＡ断片を回収した。この２つの断片をプラス
ミドｐＵＣ１１８と連結し、ｐＵＣ１１８のＥｃｏＲＩ
とＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間にアルカリプロテアーゼ
のプロモーター領域、プレプロ配列の一部及びターミネ
ーター領域を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐ
ＡＰ３を得た。図８にｐＡＰ１、ｐＡＰ２、ｐＡＰ３の
構築過程を示す。ここで、Ｐａｐｒはアルカリプロテア
ーゼ遺伝子プロモーター、ｐｒｅはアルカリプロテアー
ゼプレ配列、ｐｒｏはアルカリプロテアーゼプロ配列、
ｔｅｒはアルカリプロテアーゼ遺伝子ターミネーターを
表わす。
【００３９】プラスミドｐＳＭ１、プラスミドｐＳＭ２
をＸｂａＩで切断し、２つのリパーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を回収した。この２つの断片をそれぞれプラスミ
ドｐＡＰ３のＸｂａＩ部位に連結し、プラスミドｐＡＰ
４、プラスミドｐＡＰ５を得た。
をＸｂａＩで切断し、２つのリパーゼ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を回収した。この２つの断片をそれぞれプラスミ
ドｐＡＰ３のＸｂａＩ部位に連結し、プラスミドｐＡＰ
４、プラスミドｐＡＰ５を得た。
【００４０】プラスミドｐＡＰ４、プラスミドｐＡＰ５
をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２つのリパー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。この２つの断片
をそれぞれプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造
（株））と連結し、バチルス・ズブチリスＳＤ−８００
（特開平１−１４１５９６に記載の方法により作製した
プロテアーゼ低生産株）をプロトプラスト法により形質
転換した。テトラサイクリン耐性で、かつ、０．５％オ
リーブオイルエマルジョンを含む寒天培地で大きなクリ
アゾーンを作る形質転換株を選択し、これらの形質転換
体よりプラスミドＤＮＡを抽出、精製し、ｐＨＹ３００
ＰＬＫのＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間にア
ルカリプロテアーゼのプロモーター領域、プレプロ配列
の一部、成熟型リパーゼ遺伝子、または成熟型リパーゼ
遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードす
る遺伝子、及びアルカリプロテアーゼのターミネーター
領域を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＢ
１、ｐＳＢ２を得た。図９にｐＳＢ１、図１０にｐＳＢ
２の構築過程を示す。図中の記号は図１、図６、図８と
同じ。このプラスミドでバチルスＮＫＳ−２１株（受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）のプロテアーゼ欠損株
をプロトプラスト法により形質転換し、テトラサイクリ
ン耐性の形質転換株を選択した。なお、バチルスＮＫＳ
−２１株のプロテアーゼ欠損株は、バチルスＮＫＳ−２
１株にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを作用させ、スキムミルクを含む平板培地にまいて
培養し、クリアゾーンを形成しない株を選択することに
より取得した。
をＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、２つのリパー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。この２つの断片
をそれぞれプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（宝酒造
（株））と連結し、バチルス・ズブチリスＳＤ−８００
（特開平１−１４１５９６に記載の方法により作製した
プロテアーゼ低生産株）をプロトプラスト法により形質
転換した。テトラサイクリン耐性で、かつ、０．５％オ
リーブオイルエマルジョンを含む寒天培地で大きなクリ
アゾーンを作る形質転換株を選択し、これらの形質転換
体よりプラスミドＤＮＡを抽出、精製し、ｐＨＹ３００
ＰＬＫのＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ切断部位の間にア
ルカリプロテアーゼのプロモーター領域、プレプロ配列
の一部、成熟型リパーゼ遺伝子、または成熟型リパーゼ
遺伝子およびその生産に関与するタンパク質をコードす
る遺伝子、及びアルカリプロテアーゼのターミネーター
領域を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＳＢ
１、ｐＳＢ２を得た。図９にｐＳＢ１、図１０にｐＳＢ
２の構築過程を示す。図中の記号は図１、図６、図８と
同じ。このプラスミドでバチルスＮＫＳ−２１株（受託
番号ＦＥＲＭ ＢＰ−９３−１）のプロテアーゼ欠損株
をプロトプラスト法により形質転換し、テトラサイクリ
ン耐性の形質転換株を選択した。なお、バチルスＮＫＳ
−２１株のプロテアーゼ欠損株は、バチルスＮＫＳ−２
１株にＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニ
ジンを作用させ、スキムミルクを含む平板培地にまいて
培養し、クリアゾーンを形成しない株を選択することに
より取得した。
【００４１】実施例７：リパーゼの調製 ｉ）大腸菌 プラスミドｐＳＬ１およびｐＳＬ２を含む形質転換株
を、それぞれアンピシリン５０ｐｐｍを含むＬ液体培地
５ｍｌ中、３７℃で１晩振とう培養したものを３００ｍ
ｌの同培地に１％植菌し、３７℃で３時間振とう培養
し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭ加えてｌａｃプロモーター
の発現を誘導し、さらに４時間振とう培養した。この培
養物を遠心分離し、上清をとり、リパーゼ溶液を調製し
た。
を、それぞれアンピシリン５０ｐｐｍを含むＬ液体培地
５ｍｌ中、３７℃で１晩振とう培養したものを３００ｍ
ｌの同培地に１％植菌し、３７℃で３時間振とう培養
し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭ加えてｌａｃプロモーター
の発現を誘導し、さらに４時間振とう培養した。この培
養物を遠心分離し、上清をとり、リパーゼ溶液を調製し
た。
【００４２】ｉｉ）シュードモナス プラスミドｐＳＰ１およびｐＳＰ２を含む形質転換株
を、それぞれツイーン８０を１％含有し、ｐＨ９に調整
したリパーゼ生産培地３００ｍｌ中で３５℃、１４時間
振とう培養し、培地中にリパーゼを分泌生産させた。こ
の培養物を遠心分離し、上清をとり、リパーゼ溶液を調
製した。さらに、これを硫安分画し、透析によって硫安
を除去後、ＣＭセルロースカラムにて処理し、ＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動的に単一になるまで精製し
た。
を、それぞれツイーン８０を１％含有し、ｐＨ９に調整
したリパーゼ生産培地３００ｍｌ中で３５℃、１４時間
振とう培養し、培地中にリパーゼを分泌生産させた。こ
の培養物を遠心分離し、上清をとり、リパーゼ溶液を調
製した。さらに、これを硫安分画し、透析によって硫安
を除去後、ＣＭセルロースカラムにて処理し、ＳＤＳポ
リアクリルアミド電気泳動的に単一になるまで精製し
た。
【００４３】ｉｉｉ）バチルス プラスミドｐＳＢ１およびｐＳＢ２を含む形質転換株
を、カゼイン１％、肉エキス１％、およびポリペプトン
１％を含み、炭酸ナトリウムでｐＨ７．５に調整した培
地３００ｍｌ中で３５℃、６６時間振とう培養し、培地
中にリパーゼを分泌生産させた。この培養物を遠心分離
し、上清をとり、リパーゼ溶液を調製した。
を、カゼイン１％、肉エキス１％、およびポリペプトン
１％を含み、炭酸ナトリウムでｐＨ７．５に調整した培
地３００ｍｌ中で３５℃、６６時間振とう培養し、培地
中にリパーゼを分泌生産させた。この培養物を遠心分離
し、上清をとり、リパーゼ溶液を調製した。
【００４４】実施例８：リパーゼの活性 大腸菌およびシュードモナスの培養物から得たリパーゼ
溶液の活性を測定した。活性測定はトリオレイン−ポリ
ビニルアルコール（ＰＶＡ）エマルジョンを基質とする
測定法を用いて実施した。具体的には以下の方法により
行った。リパーゼ溶液０．１ｍｌ、１ｍＭ塩化カルシウ
ムを含み、１００ｍＭ ε−アミノカプロン酸、１００
ｍＭビストリス（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕イミノ
トリス〔ヒドロキシメチル〕メタン）および１００ｍＭ
ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸）からなる混合液を水酸
化ナトリウムでｐＨ調整した緩衝液（ｐＨ８．０）０．
４ｍｌ、およびトリオレインエマルジョン０．５ｍｌか
らなる混合液を共栓付き試験管で３７℃で１０分加温し
て反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸０．２ｍｌを用
いて反応を停止させた。ここで、トリオレインエマルジ
ョンとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）２％水
溶液（ポバールＰＶＡ１１７（クラレ社）：ポバールＰ
ＶＡ２０５（クラレ社）＝９：１（Ｗ／Ｗ））１０ｍｌ
に２．５ｇのトリオレインを加え、ホモジナイズしたも
のを用いた。反応停止後、ｎ−ヘキサン２ｍｌ、イソプ
ロピルアルコール２ｍｌ、蒸留水１ｍｌを加え激しく撹
拌し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬＣ−Ｆ
ＩＤ法（Minagawaら、Lipids, 18, 732(1983)）でオレ
イン酸を定量した。活性の単位は１分間に１マイクロモ
ルのオレイン酸を生成する酵素量を１ユニット（１Ｕ）
とした。
溶液の活性を測定した。活性測定はトリオレイン−ポリ
ビニルアルコール（ＰＶＡ）エマルジョンを基質とする
測定法を用いて実施した。具体的には以下の方法により
行った。リパーゼ溶液０．１ｍｌ、１ｍＭ塩化カルシウ
ムを含み、１００ｍＭ ε−アミノカプロン酸、１００
ｍＭビストリス（ビス〔２−ヒドロキシエチル〕イミノ
トリス〔ヒドロキシメチル〕メタン）および１００ｍＭ
ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−
３−アミノプロパンスルホン酸）からなる混合液を水酸
化ナトリウムでｐＨ調整した緩衝液（ｐＨ８．０）０．
４ｍｌ、およびトリオレインエマルジョン０．５ｍｌか
らなる混合液を共栓付き試験管で３７℃で１０分加温し
て反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸０．２ｍｌを用
いて反応を停止させた。ここで、トリオレインエマルジ
ョンとしては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）２％水
溶液（ポバールＰＶＡ１１７（クラレ社）：ポバールＰ
ＶＡ２０５（クラレ社）＝９：１（Ｗ／Ｗ））１０ｍｌ
に２．５ｇのトリオレインを加え、ホモジナイズしたも
のを用いた。反応停止後、ｎ−ヘキサン２ｍｌ、イソプ
ロピルアルコール２ｍｌ、蒸留水１ｍｌを加え激しく撹
拌し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬＣ−Ｆ
ＩＤ法（Minagawaら、Lipids, 18, 732(1983)）でオレ
イン酸を定量した。活性の単位は１分間に１マイクロモ
ルのオレイン酸を生成する酵素量を１ユニット（１Ｕ）
とした。
【００４５】それぞれの形質転換体から得たリパーゼ溶
液（培養上清）の活性を、ＳＤ７０５株の活性を１００
としたときの相対値で表１に示した。リパーゼ遺伝子を
導入した全ての形質転換体でリパーゼ活性の発現が認め
られたが、リパーゼの生産に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド
を含む形質転換体では、リパーゼ遺伝子のみを含む形質
転換体よりもリパーゼ活性の発現量が多く、この遺伝子
がリパーゼの生産量増大に効果があることが判った。
液（培養上清）の活性を、ＳＤ７０５株の活性を１００
としたときの相対値で表１に示した。リパーゼ遺伝子を
導入した全ての形質転換体でリパーゼ活性の発現が認め
られたが、リパーゼの生産に関与するタンパク質をコー
ドする遺伝子を含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミド
を含む形質転換体では、リパーゼ遺伝子のみを含む形質
転換体よりもリパーゼ活性の発現量が多く、この遺伝子
がリパーゼの生産量増大に効果があることが判った。
【００４６】
【表１】
【００４７】実施例９：リパーゼの活性 バチルスの培養物から得たリパーゼの活性を測定した。
活性測定はｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰ
Ｐ）を基質とした測定法で以下の方法で行った。ｐＮＰ
Ｐを２ｍｇ／ｍｌになるようにイソプロピルアルコール
に溶かした。このｐＮＰＰ溶液と１００ｍＭビシン緩衝
液（Bicine buffer ）（ｐＨ８．０）を１：１０の割合
で混ぜ、基質溶液とした。基質溶液０．５ｍｌにリパー
ゼ溶液０．０２ｍｌを加え、室温で１〜１０分間反応さ
せた後、１Ｎ塩酸を０．２ｍｌ加えて反応を止め、分光
光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性の単位は
１分間に４０５ｎｍの吸光度を１上昇する酵素量を１ｐ
ＮＰＰユニット（１ｐＵ）とした。それぞれの形質転換
体から得たリパーゼの活性を表２に示した。
活性測定はｐ−ニトロフェニルパルミテート（ｐＮＰ
Ｐ）を基質とした測定法で以下の方法で行った。ｐＮＰ
Ｐを２ｍｇ／ｍｌになるようにイソプロピルアルコール
に溶かした。このｐＮＰＰ溶液と１００ｍＭビシン緩衝
液（Bicine buffer ）（ｐＨ８．０）を１：１０の割合
で混ぜ、基質溶液とした。基質溶液０．５ｍｌにリパー
ゼ溶液０．０２ｍｌを加え、室温で１〜１０分間反応さ
せた後、１Ｎ塩酸を０．２ｍｌ加えて反応を止め、分光
光度計で４０５ｎｍの吸光度を測定した。活性の単位は
１分間に４０５ｎｍの吸光度を１上昇する酵素量を１ｐ
ＮＰＰユニット（１ｐＵ）とした。それぞれの形質転換
体から得たリパーゼの活性を表２に示した。
【００４８】
【表２】
【００４９】
【発明の効果】本発明のリパーゼ遺伝子により、本発明
に関わるリパーゼ、すなわちリパーゼＳの生産および改
変が容易になる。また、本発明のリパーゼの生産に関与
するタンパク質をコードする遺伝子により、リパーゼＳ
の生産を増大することができ、経済上有利にリパーゼを
提供することができる。
に関わるリパーゼ、すなわちリパーゼＳの生産および改
変が容易になる。また、本発明のリパーゼの生産に関与
するタンパク質をコードする遺伝子により、リパーゼＳ
の生産を増大することができ、経済上有利にリパーゼを
提供することができる。
【００５０】
配列番号：1 配列の長さ：288 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ） 株名：SD705 配列 Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Ile Val Leu Thr 1 5 10 15 His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Leu Leu Gly Val Asp Tyr Trp Tyr 20 25 30 Gly Ile Pro Ser Ala Leu Arg Lys Asp Gly Ala Thr Val Tyr Val Thr 35 40 45 Glu Val Ser Gln Leu Asp Thr Ser Glu Ala Arg Gly Glu Gln Leu Leu 50 55 60 Thr Gln Val Glu Glu Ile Val Ala Ile Ser Gly Lys Pro Lys Val Asn 65 70 75 80 Leu Phe Gly His Ser His Gly Gly Pro Thr Ile Arg Tyr Val Ala Ala 85 90 95 Val Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Gly Ala Pro His 100 105 110 Lys Gly Ser Ala Thr Ala Asp Phe Ile Arg Gln Val Pro Glu Gly Ser 115 120 125 Ala Ser Glu Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu 130 135 140 Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Pro Gln Asn Ser Leu 145 150 155 160 Gly Thr Leu Glu Ser Leu Asn Ser Glu Gly Ala Ala Arg Phe Asn Ala 165 170 175 Arg Phe Pro Gln Gly Val Pro Thr Ser Ala Cys Gly Glu Gly Asp Tyr 180 185 190 Val Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly Thr Ser Pro Leu 195 200 205 Thr Asn Val Leu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Leu Gly Ala Thr Ser Leu 210 215 220 Thr Phe Gly Phe Glu Ala Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser 225 230 235 240 Arg Leu Gly Met Val Ile Arg Asp Asn Tyr Arg Met Asn His Leu Asp 245 250 255 Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr Ser Ile Phe Glu Thr Ser Pro 260 265 270 Val Ser Val Tyr Arg Gln Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Ala Gly Leu 275 280 285
【００５１】配列番号：2 配列の長さ：864 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ） 株名：SD705 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..864 特徴を決定した方法：E 配列 TTC GGC TCC TCG AAC TAC ACC AAG ACC CAG TAC CCG ATC GTC CTG ACC 48 Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Ile Val Leu Thr 1 5 10 15 CAC GGC ATG CTC GGT TTC GAC AGC CTG CTT GGA GTC GAC TAC TGG TAC 96 His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Leu Leu Gly Val Asp Tyr Trp Tyr 20 25 30 GGC ATT CCC TCA GCC CTG CGT AAA GAC GGC GCC ACC GTC TAC GTC ACC 144 Gly Ile Pro Ser Ala Leu Arg Lys Asp Gly Ala Thr Val Tyr Val Thr 35 40 45 GAA GTC AGC CAG CTC GAC ACC TCC GAA GCC CGA GGT GAG CAA CTG CTG 192 Glu Val Ser Gln Leu Asp Thr Ser Glu Ala Arg Gly Glu Gln Leu Leu 50 55 60 ACC CAA GTC GAG GAA ATC GTG GCC ATC AGC GGC AAG CCC AAG GTC AAC 240 Thr Gln Val Glu Glu Ile Val Ala Ile Ser Gly Lys Pro Lys Val Asn 65 70 75 80 CTG TTC GGC CAC AGC CAT GGC GGG CCT ACC ATC CGC TAC GTT GCC GCC 288 Leu Phe Gly His Ser His Gly Gly Pro Thr Ile Arg Tyr Val Ala Ala 85 90 95 GTG CGC CCG GAT CTG GTC GCC TCG GTC ACC AGC ATT GGC GCG CCG CAC 336 Val Arg Pro Asp Leu Val Ala Ser Val Thr Ser Ile Gly Ala Pro His 100 105 110 AAG GGT TCG GCC ACC GCC GAC TTC ATC CGC CAG GTG CCG GAA GGA TCG 384 Lys Gly Ser Ala Thr Ala Asp Phe Ile Arg Gln Val Pro Glu Gly Ser 115 120 125 GCC AGC GAA GCG ATT CTG GCC GGG ATC GTC AAT GGT CTG GGT GCG CTG 432 Ala Ser Glu Ala Ile Leu Ala Gly Ile Val Asn Gly Leu Gly Ala Leu 130 135 140 ATC AAC TTC CTT TCC GGC AGC AGT TCG GAC ACC CCA CAG AAC TCG CTG 480 Ile Asn Phe Leu Ser Gly Ser Ser Ser Asp Thr Pro Gln Asn Ser Leu 145 150 155 160 GGC ACG CTG GAG TCA CTG AAC TCC GAA GGC GCC GCA CGG TTT AAC GCC 528 Gly Thr Leu Glu Ser Leu Asn Ser Glu Gly Ala Ala Arg Phe Asn Ala 165 170 175 CGC TTC CCC CAG GGG GTA CCA ACC AGC GCC TGC GGC GAG GGC GAT TAC 576 Arg Phe Pro Gln Gly Val Pro Thr Ser Ala Cys Gly Glu Gly Asp Tyr 180 185 190 GTG GTC AAT GGC GTG CGC TAT TAC TCC TGG AGC GGC ACC AGC CCG CTG 624 Val Val Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Ser Trp Ser Gly Thr Ser Pro Leu 195 200 205 ACC AAC GTA CTC GAC CCC TCC GAC CTG CTG CTC GGC GCC ACC TCC CTG 672 Thr Asn Val Leu Asp Pro Ser Asp Leu Leu Leu Gly Ala Thr Ser Leu 210 215 220 ACC TTC GGT TTC GAG GCC AAC GAT GGT CTG GTC GGA CGC TGC AGC TCC 720 Thr Phe Gly Phe Glu Ala Asn Asp Gly Leu Val Gly Arg Cys Ser Ser 225 230 235 240 CGG CTG GGT ATG GTG ATC CGC GAC AAC TAC CGG ATG AAC CAC CTG GAC 768 Arg Leu Gly Met Val Ile Arg Asp Asn Tyr Arg Met Asn His Leu Asp 245 250 255 GAG GTG AAC CAG ACC TTC GGG CTG ACC AGC ATC TTC GAG ACC AGC CCG 816 Glu Val Asn Gln Thr Phe Gly Leu Thr Ser Ile Phe Glu Thr Ser Pro 260 265 270 GTA TCG GTC TAT CGC CAG CAA GCC AAT CGC CTG AAG AAC GCC GGG CTC 864 Val Ser Val Tyr Arg Gln Gln Ala Asn Arg Leu Lys Asn Ala Gly Leu 275 280 285
【００５２】配列番号：3 配列の長さ：335 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ） 株名：SD705 配列 Met Lys Pro Leu Ile Tyr Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp His Leu Ser Thr Pro Ala Pro Ser Pro Ser Ser Ala Ser Pro 20 25 30 Ala Pro Pro Gln Val Ser Ser Glu Lys Pro Ala Thr Ala His Met Asp 35 40 45 Leu Thr Arg Pro Val Ala Arg Ser Thr Asp Gln His Leu Pro Ala Ser 50 55 60 Leu Arg Asp Thr Asp Val Asp Gly Gln Leu Glu Val Asp Ala Gln Gly 65 70 75 80 Asn Leu Val Ile Ser Asp Gln Leu Arg His Leu Phe Asp Tyr Phe Phe 85 90 95 Ser Thr Val Gly Glu Gln Ser Phe Glu Gln Ala Ser Thr Gly Ile Arg 100 105 110 Asp Tyr Leu Ala Ser Gln Leu Arg Glu Pro Ala Leu Gly Gln Ala Leu 115 120 125 Asp Leu Leu Asp Arg Tyr Ile Asn Tyr Lys Thr Glu Leu Val Glu Leu 130 135 140 Glu Arg Arg Phe Pro Met Val Thr Glu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Arg 145 150 155 160 Glu Asp Ala Val Gln Arg Leu Arg Ala Ser Leu Phe Asn Ala Gln Glu 165 170 175 His Ala Ala Phe Phe Ala Ser Glu Glu Val Tyr Asn Gln Phe Thr Leu 180 185 190 Glu Arg Leu Ala Ile Leu His Asp Pro Ser Leu Asp Pro Gln Asp Lys 195 200 205 Ala Glu Arg Ile Glu Arg Leu Arg Glu Gly Leu Pro Asp Glu Leu Gln 210 215 220 Gln Leu Leu Val Pro Gln Leu His Leu Thr Leu Arg Gln Gln Thr Gln 225 230 235 240 Gln Leu Leu Glu Gln Gly Ala Glu Pro Glu Gln Leu Arg Gln Leu Arg 245 250 255 Leu Asn Leu Val Gly Pro Gln Ala Thr Glu Arg Leu Glu Ala Leu Asp 260 265 270 Arg Gln Arg Ser Glu Trp Asp Gln Arg Leu Ser Gly Phe Asn Arg Glu 275 280 285 Arg Gln Ala Ile Ile Ser Gln Pro Gly Leu Ala Asp Ser Asp Lys Gln 290 295 300 Ala Ala Ile Glu Ala Leu Leu His Glu Gln Phe Ser Glu His Glu Arg 305 310 315 320 Leu Arg Val Ser Ser Leu Leu Gly Leu Asp Ser Arg Ala Glu Arg 325 330 335
【００５３】配列番号：4 配列の長さ：1005 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ） 株名：SD705 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..1005 特徴を決定した方法：E 配列 ＡＴＧ ＡＡＧ ＣＣＧ ＣＴＧ ＡＴＴ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＣＴ ＴＴＧ
ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ４８ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＣＣＣ
ＡＧＣ ＣＣＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ ＴＣＡ ＣＣＡ ９６ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ２０ ２５
３０ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ
ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ １４４ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ ３５ ４０
４５ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＣＣ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＣＧ １９２ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＡＧ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＧＣ ２４０ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ ６５ ７０
７５ ８０ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ２８８ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ８５
９０ ９５ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＡＧ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ３３６ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ １００ １０５
１１０ ＧＡＣ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ３８４ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ １１５ １２０
１２５ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＧＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ
ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ４３２ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ １３０ １３５
１４０ ＧＡＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＡＧ
ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ４８０ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ １４５ １５０
１５５ １６０ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＣＣ
ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ５２８ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｕ １６５
１７０ １７５ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＴＴ ５７６ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １８０ １８５
１９０ ＧＡＧ ＣＧＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＣＣＧ
ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ６２４ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ １９５ ２００
２０５ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＧＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＡＡ
ＧＧＧ ＣＴＡ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＡＡ ６７２ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ２１０ ２１５
２２０ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＣＴＧ
ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ７２０ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＣＧ
ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＧＣ ７６８ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ ２４５
２５０ ２５５ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＣＣ
ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ８１６ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ２６０ ２６５
２７０ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ
ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＧＧ ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＧＣ ＧＡＡ ８６４ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ ２７５ ２８０
２８５ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＧＧ
ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ９１２ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｎ ２９０ ２９５
３００ ＧＣＣ ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＡＧ
ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＡＧ ＣＡＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ９６０ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＴＣ
ＧＡＴ ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＧＡＡ ＣＧＣ １００５ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ ３２５
３３０ ３３５
ＣＴＴ ＣＴＴ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ４８ Ｍｅｔ Ｌｙｓ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ ＧＧＣ ＴＧＧ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＧＣ ＡＣＧ ＣＣＧ ＧＣＡ ＣＣＣ
ＡＧＣ ＣＣＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＣＣ ＴＣＡ ＣＣＡ ９６ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｐｒｏ ２０ ２５
３０ ＧＣＧ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ＧＡＡ ＡＡＡ
ＣＣＴ ＧＣＣ ＡＣＧ ＧＣＴ ＣＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ １４４ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｍｅｔ Ａｓｐ ３５ ４０
４５ ＣＴＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＣＣＧ ＧＴＧ ＧＣＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＣＣ
ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＣＣ ＴＣＧ １９２ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｓｅｒ ５０ ５５
６０ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＡＴ ＡＣＣ ＧＡＣ ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＧＣ ＣＡＧ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＴＣ ＧＡＣ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＧＣ ２４０ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｇｌｎ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ａｓｐ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｙ ６５ ７０
７５ ８０ ＡＡＴ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＴＴ ＴＣＣ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＧＣ
ＣＡＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＧＡＣ ＴＡＴ ＴＴＣ ＴＴＣ ２８８ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ
Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｈｅ ８５
９０ ９５ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＴＣ ＧＧＣ ＧＡＡ ＣＡＧ ＴＣＧ ＴＴＣ ＧＡＧ
ＣＡＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＡＣＣ ＧＧＴ ＡＴＣ ＣＧＣ ３３６ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｈｅ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ａｒｇ １００ １０５
１１０ ＧＡＣ ＴＡＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＡＡ
ＣＣＧ ＧＣＴ ＣＴＧ ＧＧＴ ＣＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ３８４ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｌｅｕ １１５ １２０
１２５ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＧＣ ＴＡＴ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ
ＡＡＧ ＡＣＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＡ ＣＴＧ ４３２ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ
Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｌｅｕ １３０ １３５
１４０ ＧＡＧ ＣＧＡ ＣＧＣ ＴＴＣ ＣＣＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＡＧ
ＣＴＧ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＧＴ ＧＣＣ ＣＧＴ ４８０ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ａｒｇ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ｇｌｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ １４５ １５０
１５５ １６０ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＣＣ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＧＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＣＣ
ＡＧＣ ＣＴＧ ＴＴＣ ＡＡＣ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＡＧ ５２８ Ｇｌｕ Ａｓｐ Ａｌａ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｌａ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｇｌｕ １６５
１７０ １７５ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＧＡＧ
ＧＴＣ ＴＡＴ ＡＡＣ ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＣＴ ＣＴＴ ５７６ Ｈｉｓ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｇｌｕ
Ｖａｌ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ｌｅｕ １８０ １８５
１９０ ＧＡＧ ＣＧＴ ＣＴＧ ＧＣＧ ＡＴＡ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＡＣ ＣＣＧ
ＴＣＧ ＣＴＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＣＡＧ ＧＡＣ ＡＡＧ ６２４ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ
Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｌｙｓ １９５ ２００
２０５ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＧＧ ＡＴＣ ＧＡＡ ＣＧＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＧＡＡ
ＧＧＧ ＣＴＡ ＣＣＣ ＧＡＣ ＧＡＧ ＴＴＧ ＣＡＡ ６７２ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｕ
Ｇｌｙ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ ２１０ ２１５
２２０ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＣＧ ＣＡＡ ＴＴＡ ＣＡＣ ＣＴＧ
ＡＣＣ ＣＴＧ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＡＧ ７２０ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ
Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｎ ２２５ ２３０
２３５ ２４０ ＣＡＧ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＣＡＡ ＧＧＣ ＧＣＣ ＧＡＧ ＣＣＧ
ＧＡＡ ＣＡＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＣＡＡ ＴＴＧ ＣＧＣ ７６８ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ａｒｇ ２４５
２５０ ２５５ ＣＴＧ ＡＡＣ ＣＴＧ ＧＴＣ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＡＣＣ
ＧＡＡ ＣＧＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＡＣ ８１６ Ｌｅｕ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｔｈｒ
Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｓｐ ２６０ ２６５
２７０ ＣＧＣ ＣＡＧ ＣＧＣ ＡＧＣ ＧＡＡ ＴＧＧ ＧＡＴ ＣＡＧ ＣＧＣ
ＣＴＧ ＡＧＣ ＧＧＧ ＴＴＣ ＡＡＴ ＣＧＣ ＧＡＡ ８６４ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ａｒｇ
Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ａｒｇ Ｇｌｕ ２７５ ２８０
２８５ ＣＧＧ ＣＡＧ ＧＣＧ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＧＣ ＣＡＧ ＣＣＧ ＧＧＧ
ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＡＣ ＡＧＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＡＧ ９１２ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｌｅｕ Ａｌａ Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｇｌｎ ２９０ ２９５
３００ ＧＣＣ ＧＣＧ ＡＴＴ ＧＡＧ ＧＣＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＧＡＧ
ＣＡＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＡＧ ＣＡＴ ＧＡＧ ＣＧＧ ９６０ Ａｌａ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ
Ｇｌｎ Ｐｈｅ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ａｒｇ ３０５ ３１０
３１５ ３２０ ＣＴＧ ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＣＴＧ ＧＧＡ ＣＴＣ
ＧＡＴ ＡＧＣ ＣＧＣ ＧＣＣ ＧＡＡ ＣＧＣ １００５ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｌｅｕ
Ａｓｐ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ａｌａ Ｇｌｕ Ａｒｇ ３２５
３３０ ３３５
【００５４】配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 起源 生物名：シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas sp. ） 株名：SD705 配列 Phe Gly Ser Ser Asn Tyr Thr Lys Thr Gln Tyr Pro Ile Val Leu Thr 1 5 10 15 His Gly Met Leu Gly Phe Asp Ser Leu Leu 20 25
【００５５】配列番号：６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AACTACACNA AGACNCAGTA 20
【００５６】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGGAATTCA GGACTCGCAT TATGCGCAAC 30
【００５７】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTGAATTCA GAGCCCGGCG TTCTTCAGGC 30
【００５８】配列番号：９ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 TTTGAGCTCA GAGCCCGGCG TTCTTCAGGC 30
【００５９】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＡＡＴＣＴＡＧＡＴ ＴＣＧＧＣＴＣＣＴＣ ＧＡＡ
ＣＴＡＣＡＣＣ ３０
ＣＴＡＣＡＣＣ ３０
【００６０】配列番号：１１ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCTCTAGAC TAGCGTTCGG CGCGGCTATC 30
【００６１】配列番号：１２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 CCCTCTAGAT CAGAGCCCGG CGTTCTTCAG 30
【００６２】配列番号：１３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡ ＴＡＣＧＡＡＴＴＡＡ ＡＧＴ
ＴＧＡＡＡＧＣ ３０
ＴＧＡＡＡＧＣ ３０
【００６３】配列番号：１４ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 AAATCTAGAG TTGAAACCAA TTAAGTACTC 30
【００６４】配列番号：１５ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GGGTCTAGAT CCCTAAGGAT GTACTGGATG 30
【００６５】配列番号：１６ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ＴＴＴＡＡＧＣＴＴＡ ＧＡＡＡＣＴＣＡＡＣ ＴＧＴ
ＣＡＣＡＧＴＧ ３０
ＣＡＣＡＧＴＧ ３０
【図１】プラスミドｐＳ１の制限酵素地図。
【図２】プラスミドｐＳ１Ｓの制限酵素地図。
【図３】プラスミドｐＳ１Ｅの制限酵素地図。
【図４】プラスミドｐＳＬ１の制限酵素地図。
【図５】プラスミドｐＳＬ２の制限酵素地図。
【図６】プラスミドｐＳＰ１の制限酵素地図。
【図７】プラスミドｐＳＰ２の制限酵素地図。
【図８】プラスミドｐＡＰ１、ｐＡＰ２、ｐＡＰ３の構
築。
築。
【図９】プラスミドｐＳＢ１の構築。
【図１０】プラスミドｐＳＢ２の構築。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 貴家 潤治 千葉県千葉市緑区大野台１丁目１番１号 昭和電工株式会社総合研究所内
Claims (17)
- 【請求項１】 配列番号１に記載されたアミノ酸配列を
コードする遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号２に記載されたリパーゼをコー
ドするヌクレオチド配列を含む遺伝子。 - 【請求項３】 配列番号３に記載されたアミノ酸配列を
コードする遺伝子。 - 【請求項４】 配列番号４に記載されたリパーゼの生産
に関与するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を
含む遺伝子。 - 【請求項５】 シュードモナス（Pseudomonas ）属細菌
由来の請求項１ないし４記載の遺伝子。 - 【請求項６】 シュードモナス ｓｐ．（Pseudomonas
sp. ）ＳＤ７０５株由来の請求項１ないし４記載の遺伝
子。 - 【請求項７】 請求項１ないし６に記載された遺伝子の
ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含むＤＮＡ。 - 【請求項８】 請求項３ないし４に記載された遺伝子の
ヌクレオチド配列の全部もしくは一部とハイブリダイズ
するＤＮＡ。 - 【請求項９】 請求項１ないし４に記載された遺伝子の
少なくとも１つを宿主微生物細胞内で発現するように宿
主微生物細胞内で複製可能なベクターに組み込んだ組換
えＤＮＡ。 - 【請求項１０】 請求項１ないし４に記載された遺伝子
の少なくとも１つを微生物染色体上に相同組換えによっ
て組み込んだ組換え染色体ＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項９に記載の組換えＤＮＡの少な
くとも１つで形質転換された形質転換宿主微生物。 - 【請求項１２】 請求項１０に記載の組換え染色体ＤＮ
Ａのいずれか１つを含む形質転換微生物。 - 【請求項１３】 微生物が大腸菌、シュードモナス属細
菌、またはバチルス属細菌である請求項１１記載の形質
転換微生物。 - 【請求項１４】 微生物がシュードモナス属細菌、また
はバチルス属細菌である請求項１２記載の形質転換微生
物。 - 【請求項１５】 微生物がシュードモナス・アルカリゲ
ネス、シュードモナス・シュードアルカリゲネス、シュ
ードモナス・メンドシナ、またはバチルス・ズブチリス
である請求項１１もしくは１２記載の形質転換微生物。 - 【請求項１６】 微生物がシュードモナス ｓｐ．ＳＤ
７０５株、シュードモナス・メンドシナ ＳＤ７０２
株、バチルス ＮＫＳ−２１株、またはそれらの変異株
である請求項１１もしくは１２記載の形質転換微生物。 - 【請求項１７】 請求項１１ないし１６に記載の形質転
換宿主細胞の少なくとも１つを培養してリパーゼを含む
培養物を得ることを特徴とするリパーゼの製造方法。
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