BRPI0610091B1 - Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (glp-2), composição farmacêutica, uso de um análogo de glp-2, e, kit terapêutico - Google Patents

Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (glp-2), composição farmacêutica, uso de um análogo de glp-2, e, kit terapêutico Download PDF

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glp
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gly2
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BRPI0610091-0A
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Yvette Miata Petersen
Kirsten Ebbehoj
Bjarne DUE LARSEN
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Zealand Pharma A/S
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Abstract

análogo de peptideo 2 tipo glucagon (glp-2) ou um sal ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, composição farmacêutica, uso de um análogo de glp-2, molécula de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, método para a produção do análogo de glp-2, uso de uma molécula de ácido nucleico, um vetor de expressão ou uma célula hospedeira, e, kit terapêutico são expostos análogos de glp-2 que compreendem uma ou mais substituições quando comparados a [hgly2]glp-2 e que apresentam atividade biológica in vivo aperfeiçoada e! ou estabilidade química aperfeiçoada, por exemplo quando avaliados em ensaios de estabilidade in vitro. de modo mais particular, os análogos de glp-2 preferidos, aqui expostos, compreendem substituições em uma ou mais posições 8, 16, 24 e/ou 28 da seqüência glp-2 do tipo selvagem, de modo opcional em combinação com outras substituições na posição 2 (como mencionado na introdução) e em uma ou mais das posições 3, 5, 7, 10 e 11, ei ou uma delação de um ou mais dos aminoácidos 31 a 33 e/ ou a adição de uma sequência de peptídeo de estabilização n-terminal ou c-terminal. os análogos são particularmente úteis para a profilaxia ou o tratamentos de distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino e para a melhora dos efeitos colaterais da quimioterapia.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a análogos de peptídeo-2-tipoglucagon (GLP-2) e a seu uso médico, por exemplo na profilaxia ou o tratamentos de distúrbio relacionados ao estômago e ao intestino, para melhorar os efeitos colaterais da terapia de quimioterapia e radiação.
Fundamentos da Invenção
[002] GLP é um peptídeo de 33 aminoácidos, liberado a partir doprocessamento pós-translacional de proglucagon nas células L enteroendócrinas do intestino e de regiões específicas do tronco cerebral. Ele é co-secretado junto com o peptídeo tipo glucagon (GLP-1), oxintomodulina e glicentina, em resposta à ingestão de nutrientes.
[003] O GLP-2 induz um crescimento significativo do epitélio damucosa intestinal do intestino delgado, através da estimulação da proliferação de células tronco nas criptas e através da inibição da apoptose nos vilos (Drucker et al. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A., 1996, 93: 7911-6). O GLP -2 também inibe o esvaziamento gástrico e a secreção de ácido gástrico (Wojdemann et al. J. Clin. Endocrinol. Metb. 1999, 84 : 2513 - 7), aumenta a função da barreira intestinal (benjamin et al.. Gut. 2000, 47 - 112-9), estimula o transporte de hexose através da regulação excessiva dos transportadores de glicose (Cheeseman, Am. J. Physiol. 1997, R 1965 -71), e aumenta o fluxo sanguíneo intestinal (Guan et al. Gastroenterology, 2003, 125, 136-47).
[004] O GLP-2 é ligado a um único receptor acoplado à proteína G,que pertence à família de secretina de glucagon da classe II (1). O receptor de GLP-2 foi apenas localizado no intestino delgado, cólon e estômago, sítios que são conhecidos como respondendo a GLP-2 (Yusta et al., Gastroenterology, 200, 119: 744-55). No entanto, a célula alvo para a estimulação do receptor de GLP-2 no trato gastrointestinal não está ainda esclarecida e os mediadores intracelulares a jusante, acoplados ao receptor de GLP-2, são ainda entendidos de modo deficiente.
[005] Os efeitos de GLP-2 específicos e benéficos demonstrados nointestino delgado levantaram muito interesse quanto ao uso de GLP-2 no tratamento da doença ou da lesão intestinal (Sinclair and Drucker, Physiolology 2005: 367-65). Além disso, foi demonstrado que GLP-1 evita ou reduz o dano epiteial à mucosa em um grande número de modelos pré- clínicos de lesão intestinal, incluindo a mucosite induzida através de quimioterapia, a lesão por perfusão de isquemia, a colite induzida por dextrano sulfato e os modelos genéticos de doença intestinal inflamatória (Sinclair and Drucker Physiology 2005 : 367 - 65).
[006] O GLP-2 é secretado como um peptídeo de 33 aminoácidoscom a sequência que se segue : H- His- Ala- Asp - Gly- Ser- Phe- Ser- Asp- Glu- Met- Asn- Thr- Ile- Leu- Asp- Asn- Leu- Ala -Ala- Arg- Asp- Phe- Ile- Asn- Trp- Leu- Ile- Gln- Ther - Lys- Ile- Thr - Asp- OH. Ele é prontamente clivado na Alanina (A) na posição 2 do terminal NH2 ao GLP-2 humano inativo (3-33) através da enzima DPP IV. Esta degradação enzimática rápida de GLP- 2 (1-33), em adição à eliminação renal, resulta em uma meia vida de cerca de 7 minutos para o peptídeo (Tavares et al., Am. J. Physiol. Metab., 278 : E 134 - E -139, 2000).
[007] A US 5. 994. 500 (Drucker et al.) descreve antagonistas doGLP-2 e seus efeitos sobre o crescimento do tecido gastrointestinal. É sugerido que os antagonistas sejam formulados como substâncias farmacêuticas a serem usadas no tratamento de hiperplasia, de modo a induzir a hipoplasia. Na US 5. 994. 500, a estruturado do GLP-2 de mamífero foi alterada através de mutações, tais que substituições e deleções.
[008] A US 6.184. 208, US 5.789. 379 e a US 6. 184. 201 expõeanálogos de GLP-2 e seus usos médicos. Os análogos são todos obtidos através de substituições e/ ou deleções do GLP-2 humano.
[009] DaCambra et a l. (Biochemistry 2000, 39, 8888-8894)descrevem determinantes estruturais para a atividade de GLP-2. Exemplos de tais determinantes são Phe6 e Thr5, que são referidos como cruciais para a ligação e a ativação de GLP-2.
[0010] Na WO 97/ 39031, o análogo de GLP-2, [Gly2] GLP-2 é exposto. Neste caso, a alanina na posição 2 foi substituída por glicina, de modo a tornar o peptídeo resistente à clivagem de DPP IV. É demonstrado que a substituição de alanina aumenta a estabilidade e a potência do peptídeo. O pedido de patente descreve como o análogo de GLP-2 pode ser usado contra as doenças associadas com a inflamação e a destruição da mucosa epitelial intestinal. Estas incluem a ressecção do intestino delgado ampla, a doença intestinal inflamatória, a mucosite induzida por quimioterapia e a lesão isquêmica.
[0011] O WO 02/066511 descreve análogos GLP-2 tendo um meia vida estendida in vivo e seu uso como medicamentos no tratamento de distúrbios gastrointestinais , tais como doenças de intestino inflamatório.
[0012] A WO 01/41779 descreve o uso de h[Gly2] GLP-2 como um tratamento prévio para inibir a apoptose induzida por quimioterapia e a promoção da sobrevivência celular.
[0013] Todas as referências aqui citadas são expressamente incorporadas, a título referencial, em sua totalidade.
[0014] O uso de GLP-2 ou de análogos de GLP-2 no tratamento de várias doenças foi proposto por muitos cientistas. No entanto, existe ainda uma necessidade quanto a análogos de GLP-2 estáveis e aperfeiçoados.Sumário da Invenção
[0015] De modo amplo, a presente invenção refere-se a análogos de GLP-2, que compreendem uma ou mais substituições quando comparados a GLP-2 do tipo selvagem, e que podem apresentar a propriedades de uma atividade biológica aperfeiçoada in vivo e/ ou de estabilidade química aperfeiçoada, por exemplo, conforme avaliada em ensaios de estabilidade in vitro. De modo mais particular, os análogos de GLP-2 preferidos da presente invenção compreendem substituições em uma ou mais das posições 8, 16, 24 e/ou 28 da sequência de GLP-2, opcionalmente em combinação com outras substituições na posição 2 (como mencionado na introdução) e em uma ou mais das posições 3, 5, 7, 10 e 11, e/ ou uma deleção de um ou mais dos aminoácidos correspondendo às posições 31 a 33 da sequência de GLP-2 do tipo selvagem e/ ou a adição de uma sequência de peptídeo de estabilização N- terminal ou C-terminal. Assim como provendo análogos de GLP-2, que podem apresentar atividade biológica e/ ou estabilidade química aperfeiçoada, a presente invenção também refere-se ao provimento de compostos que possuem atividade promotora do crescimento intestinal preferencial no intestino delgado comparada à do cólon e vice- versa, em particular através da inclusão da modificação em uma ou mais das posições Asp3 e/ ou Ser 8 e/ ou Asn 16 e/ ou Asn 24 e/ou Gln 28 de GLP-2 do tipo selvagem.
[0016] Deste modo, em um aspecto, a presente invenção provê um análogo de GLP-2, que é representado através da fórmula geral I:R1-Z1-His-X2-X3-Gly-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13- X14-X15-X16-X17-Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr- Lys-X31-X32-X33-Z2- R2em que:R1 é hidrogênio, alquila C1-4 (por exemplo, metila), acetila, formila, benzoíla ou trifluoroacetilaX2 é Gly, Ala ou SarX3 é Glu ou AspX5 é Ser ou ThrX6 é Phe ou ProX7 é Ser ou THr X8 é Asp ou SerX9 é Glu ou AspX10 é Met, Leu, Nle ou um aminoácido com substituição Met oxidativamente estávelX11 é Asn, Ala, Lys ou SerX12 é Thr ou LysX13 é Ile, Glu ou GlnX14 é Leu, Met ou IleX15 é Asp ou GluX16 é Asn ou AlaX17 é Leu ou GluX18 é Ala ou AibX19 é Ala ou ThrX20 é Arg ou LysX21 é Asp ou IleX24 é Asn, Ala ou GluX28 é Glan, Ala ou AsnX31 é Pro, Ile ou deletadoX32 é THr ou deletadoX33 é Asp, Asn ou deletadoR2 é NH2 ou OH;Z1 e Z2 são, independentemente, ausentes, ou uma sequência de peptídeos de unidades de 3-230 aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met e Orn;em que o análogo de GLP-2 compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir de :X é Ser e/ ou X16 é Ala e/ ou X24 é Ala e/ ou X28 é Ala;ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um derivado do mesmo.
[0017] Em uma modalidade adicional, a presente invenção provê um análogo de GP-2 representado pela fórmula geral II:Ri-Zi-His-Gly-X3-Gly-X5-Phe-X7-X8-Glu-X10-X11-Thr-Ile- Leu-Asp-X16-Leu-Ala-Ala- Arg-Asp-Phe- Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr- Lys-X31-X32-X33-Z2 -R2em que:R1 é hidrogênio, alquila C1-4 (por exemplo, metila), acetila, formila, benzoíla ou trifluoroacetilaX3 é Glu ou AspX5 é Ser ou ThrX7 é Ser ou ThrX8 é Asp ou SerX10 é Met, Leu, Nle, ou um aminoácido com substituição Met oxidativamente estávelX11 é Asn, Ala, Lys ou SerX24 é Asn, Ala, Lys, ou SerX24 é Asn ou AlaX28 é Gln ou AlaX31 é Pro ou deletadoX32 é Thr ou deletadoX33 é Asp ou deletadoR2 é NH2 ou OH;Z1 e Z2 são, independentemente, ausentes ou uma sequência de unidades de 3-20 aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met e Orn, em que o análogo de GLP-2 compreende uma ou mais substituições selecionadas a partir de:X8 é Ser e/ ou X16 é Ala e/ ou X24 é Ala e/ ou X28 é Ala; ou um sal farmaceuticamente aceitável ou um derivado do mesmo, em que X16 não é Ala, será Asn.
[0018] Em certas modalidades, em que Z1 está presente, R1 pode ser H, e quando Z2 está presente, R2 pode ser OH.
[0019] Em algumas modalidades da presente invenção, o análogo de GLP-2 apresenta pelo menos 60% de identidade de sequência de aminoácido para o tipo selvagem GLP-2 (1-33) tendo a sequência exposta na introdução do pedido, de modo mais preferido pelo menos 63% de identidade de sequência, de modo ainda mais preferido pelo menos 66% de identidade de sequência e de modo ainda mais preferido pelo menos 69% de identidade de sequência.
[0020] “O percentual (%) de identidade de sequência de aminoácido” com relação às sequências de polipeptídeo GLP-2, é definido como o percentual de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata, que são idênticos aos resíduos de aminoácido na sequência de GLP-2 do tipo selvagem, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, de modo a que seja alcançado um percentual de identidade de sequência máximo, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento da sequência pode ser executado por aquele versado na arte, usando técnicas bem conhecidas na arte, por exemplo usando software publicamente disponível, tais que os softwares BLAST, BLAST 2 ou Align, vide:
[0021] Altschul et al. (Methods in Enzymology, 266: 460 - 480 (1996);
[0022] http: //blast. Wustl/ edu/ blast/ README. html) ou Pearson et al. (Genomics, 46, 24, 36, 1997) e Http: molbiol. Soton. Ac. Uk/ compute/ align. Html para o programa Align.
[0023] O percentual de identidades de sequência aqui usados e de acordo com a presente invenção são determinados usando este programa e os seus ajustes de falha. De modo mais genérico, a pessoa versada na arte pode prontamente determinar os parâmetros apropriados para determinar o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para que seja alcançado ao alinhamento máximo em todas a extensão das sequências sedo comparadas.
[0024] Em algumas modalidades preferidas, os análogos do peptídeo GLP-2 representados pelas Fórmulas I, II ou III, compreendem substituições em mais do que uma das posições X8, X16, X24 e/ ou X28 e/ ou uma combinação destas substituições com outras substituições, de modo preferido aquelas nas posições X3, X5, X7, X10 e/ ou X11.
[0025] Exemplos de combinações de X8, X16, X24 e/ ou X28, que recaem dentro das Fórmulas I a III, incluem :Ser8, Ala16Ser8, Ala24Ser8, Ala28Ala16, Ala24Ala16, Ala28Ala24, Ala28Ser8, Ala16, Ala24Ser8, Ala16, Ala28Ser8,Ala24, Ala 28Ala16, Ala24, Ala28Ser8, Ala16, Ala24, Ala28
[0026] Exemplos de substituições nas posições X3, X5, X7, X10 e X11, que recaem dentro das fórmulas I a III, e que podem ser combinadas com uma substituição em uma ou mais das posições X8, X16, X24 e/ ou X28, incluem :Glu3, Leu10, Ala 11, 24Glu3, Thr5, Leu10, Ser11, Ala16, 24,28 Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16, 24, 28Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala16, 24, 28Glu3, Thr5, Ser8, 11, Leu10, Ala16, 24, 28Glu3, Thr5, Ser8, 11, Leu10, Ala16, 24, 28Glu3, Ser8, 11, Leu10, Ala16, 24, 18Glu3, Leu 10, Ser11, Ala16,24,28Glu3, Leu10, Lys11, Ala16, 24, 28Glu3, Thr5, Leu10, Ala11,16, 24, 28Glu3, Thr5, Leu10, Ala11, 16, 24,18, Ile21Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11, 16, 24, 28Glu3, Ser8, Leu10, Ala 11, 16,24, 28Glu3, Leu10, Ala11, 16,24, 28Thr7, Leu10, Ala11, 24Thr7, Leu 10, Lys11, Ala24,Thr7, Leu10, Ser11, Ala24Thr7, Leu10, Ser8,11, Ala24Thr7, Ser8, Leu 10, Ala11, 24Thr7, Ser8, Leu10, Lys11, Ala24Ser8, Leu10, Ala11, 24Lleu10, Ala24Leu10, Ala11, Ala24Leu10, Ala 11,24,28Leu10, Ala11, 16, 24, 28Leu10, Lys11, Ala24Leu10, Ser11, Ala24Leu10, Ser8, 11, Ala24ou uma deleção em uma ou mais das posições X31-X33, em combinação com uma alteração acima mencionada na posição 8, 16, 24 e/ ou 28.
[0027] Exemplos específicos dos compostos GLP-2 da presente invenção são expostos na descrição detalhada que se segue abaixo.
[0028] Assim como provendo análogos de GLP-2, que apresentam estabilidade química e atividade biológica aperfeiçoadas, a presente invenção refere-se também ao provimento de compostos, que possuem atividade de promoção de crescimento preferencial no intestino delgado, comparada ao cólon e vice-versa. Em particular, os experimentos aqui descritos mostram que a substituição nas posições Asp3 e/ ou Ser8 e/ ou Asn16 e/ ou Gln 28 de GLP-2 do tipo selvagem proporcionam um aumento preferencial do peso do intestino delgado quando administradas a animais de teste, comparados ao aumento da massa do cólon. Estas descobertas significam que os compostos exemplificados podem ser úteis no tratamento de condições, em que é vantajoso possuir um efeito de promoção do crescimento aumentado no intestino delgado, ao mesmo tempo em que é apresentado um menor efeito sobre o cólon e vice-versa.
[0029] Deste modo, os compostos que são preferidos para causar o crescimento do intestino delgado compreendem, d e modo típico, uma ou mais substituições nas posições 3, 8, 16 e/ ou 28 do GLP-2 do tipo selvagem. Tais compostos podem causar, de modo seletivo, um crescimento do intestino delgado preferivelmente que do cólon. Estes podem, portanto, ser usados para as condições que afetam ou relacionadas ao intestino delgado.
[0030] De modo preferido, tais compostos seletivos para o intestino delgado compreendem substituições em mais do que uma das posições X3, X7, X16, X24, X28, X31, X32 e/ ou X33. Deste modo, os compostos seletivos para o intestino delgado podem compreender mais do que uma das substituições X3 é Glu, X7 é Ser, X16 é Ala, X24 é Ala, X28 é Ala, X31 é Ile, X32 é Thr e X33 é Asp. Os resíduos de aminoácido nas posições X31, X32 e X33 podem ser opcionalmente deletados.
[0031] Compostos exemplificados, que estimulam, de modo preferencial, o crescimento epitelial no intestino delgado, incluem 1809, 1818, 1819, 1820, 1826, 1827, 1844, 1845, 1846, 1848, 1849, 1850, 1851, 1852, 1853, 1855, 1857, 1858, 1959.
[0032] Por outro lado, os compostos da presente invenção que não possuem tais modificações, por exemplo, que compreendem uma ou mais substituições nas posições 10, 11 e/ ou 24, podem ser preferidos para induzir o crescimento preferencial do cólon, de modo preferido que o do intestino delgado. Eles podem, deste modo, ser usados para o tratamento de condições que afetam ou relacionadas ao cólon.
[0033] Tais compostos seletivos para o cólon podem compreender mais do que uma das substituições nas posições X3, X8 e/ ou X24. Por exemplo, eles podem compreender mais do que uma substituição selecionada a partir de X3 é Asp, X8 é Asp e X24 é Ala. Os resíduos de aminoácido nas posições X31, X32 e X33 podem ser opcionalmente deletados.
[0034] Compostos exemplificados, que estimulam, de modo preferencial, o crescimento epitelial no cólon, incluem 1830, 1831, 1835, 1836, 1839, 1840, 1841, e 1843.
[0035] Compostos exemplificados sem o crescimento preferencial no intestino delgado ou no cólon: [Gly2] GLP-2 (isto é, molécula de referência), 1559, 1821, 1822, 1823, 1825, 1828, 1829, 1832, 1833, 1834, 1842, 1854.
[0036] Os compostos da invenção possuem também estabilidade química aumentada, por exemplo, contra a hidrólise ácida, oxidação e desaminação. Acredita-se que substituições nas posições X3 e/ ou X33 podem aperfeiçoar a estabilidade à hidrólise ácida. A substituição na posição X10 pode aperfeiçoar a estabilidade oxidativa. A substituição em uma ou mais das posições X11, X16 e/ ou X24 pode aumentar a estabilidade contra a desamidação. O análogo de GLP-2 da invenção pode, deste modo, exibir estabilidade aumentada contra a degradação em solução ácida, contra a desamidação, e/ ou contra a degradação oxidativa, em relação a Gly2-GLP-2.
[0037] De modo preferido, o análogo de GLP-2 mantém uma pureza observada em pelo menos 70% e relação à pureza inicial em pelo menos um dos testes de degradação descritos no Exemplo 7 abaixo. De modo adicional ou alternativo, ele pode manter uma pureza observada de pelo menos 60% com relação à pureza inicial em uma solução de HCl 0,1 M após 12 dias. De modo adicional ou alternativo, ele pode manter uma pureza observada de pelo menos 70% em relação à pureza inicial em uma solução e NH4HCO3 0, 1 M após 6 dias.
[0038] Em um outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, que compreende um análogo de GLP-2 como aqui definido, ou um sal ou derivado do mesmo, em mistura com um veículo. Em modalidades preferidas, a composição é uma composição farmaceuticamente aceitável e o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável. O análogo do peptídeo GLP-2 pode ser um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável do análogo de GLP-2.
[0039] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um análogo de GLP-2, como aqui definido, ou um sal do mesmo, para o uso em terapia.
[0040] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê o uso de um análogo de GLP-2, ou de um sal ou derivado do mesmo para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ ou a prevenção de distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino, tais que o tratamento de neonatos com a função intestinal comprometida, osteoporose, e condições mediadas por DPP- IV (dipeptidilpeptidase). A título de exemplo, os distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino incluem úlceras, gastrite, distúrbios digestivos, síndromes de má absorção, síndrome do intestino curto, síndrome de cul-de-sac, doença intestinal inflamatória, sapinho celíaco (por exemplo, aquele originário de enteropatia induzida por glúten ou doença celíaca), colite ulcerativa, síndrome intestinal irritável associada com diarréia, dano ao intestino delgado e síndrome do intestino curto.
[0041] Outras condições que podem ser tratadas com análogos de GLP-2 da invenção, ou para as quais os análogos de GLP-2 podem ser úteis a partir de um ponto de vista profilático ou terapêutico, incluem enterite devida à radiação, enterite infecciosa ou pós- infecciosa, e dano ao intestino delgado devido a agentes quimioterapêuticos tóxicos ou outros. Isto pode requerer a administração do análogo de GLP-2 antes de, simultaneamente com, ou seguindo-se a um curso de quimioterapia ou de terapia de radiação, de modo a reduzir os efeitos colaterais de quimioterapia, tais que diarréia, cólicas abdominais e vômitos, e reduzir o dano estrutural e funcional consequente do epitélio intestinal resultante a partir de quimioterapia ou de terapia de radiação.
[0042] A invenção também provê um kit terapêutico, que compreende uma droga quimioterapêutica para o câncer e uma análogo de GLP-2 da presente invenção, cada qual opcionalmente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os dois agentes terapêuticos podem ser embalados separadamente (por exemplo, em frascos separados) para a administração separada, ou eles podem ser providos na mesma composição. Deste modo a invenção ainda provê uma composição farmacêutica compreende uma droga quimioterapêutica para o câncer e um análogo de GLP-23 da presente invenção, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0043] Para pacientes tendo neoplasia da mucosa gastrointestinal, ou um risco aumentado de neoplasia da mucosa gastrointestinal, pode ser desejável selecionar um composto, de modo a reduzir o eliminar o risco de efeitos colaterais reduzidos, tais que a estimulação ou o agravamento da neoplasia da mucosa gastrointestinal. Por exemplo, quando da seleção de um composto para tratar um paciente com neoplasia do cólon (seja benigna ou maligna), ou em risco de desenvolve neoplasia do cólon, pode ser apropriado selecionar um composto que seja seletivo para o intestino delgado em relação ao cólon, do que um composto não- seletivo, ou um composto que seja seletivo para o cólon em relação ao intestino delgado.
[0044] Sob outros aspectos, a presente invenção provê o uso dos análogos de GLP-2 para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ ou a prevenção da má nutrição, por exemplo, condições tais que a síndrome de desperdício caquexia e anorexia.
[0045] Em um outro aspecto, a invenção provê uma molécula de ácido nucleico, que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um análogo de GLP-2, como aqui definido.
[0046] Em aspectos adicionais, a presente invenção provê um vetor de expressão, que compreende a sequência de ácido nucleico acima opcionalmente em combinação com sequências para dirigir a sua expressão, e células hospedeiras transformadas com os vetores de expressão. De modo preferido, as células hospedeiras são capazes de expressar e secretar o análogo de GLP- 2. Em ainda um outro aspecto, a presente invenção provê um método de produção do análogo de GLP-2, o método compreendendo cultivar as células hospedeiras sob condições adequadas para expressar o análogo de GLP-2 e purificar o análogo de GLP-2 assim produzido.
[0047] A invenção provê ainda um ácido nucleico da invenção, um vetor de expressão da invenção, ou uma célula hospedeira capaz de expressar e secretar um análogo de GLP-2 da invenção, para o uso em terapia. Será entendido que o ácido nucleico, o vetor de expressão e as células hospedeiras podem ser usados para o tratamento de quaisquer distúrbios aqui descritos, que podem ser tratados com os análogos de GLP- 2 em si mesmos. Referências a uma composição, que compreende um análogo de GLP-2 da invenção, ou a administração de um análogo de GLP-2 da invenção, devem, portanto, ser construídas de modo a abranger a administração de um ácido nucleico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção, exceto quando o contexto o requerer de outro modo.
[0048] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método de tratar uma distúrbio relacionado ao intestino e ao estômago em um paciente que esteja em necessidade do mesmo, através da administração de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, tal como aqui definido, ou um sal ou derivado do mesmo, ou um ácido nucleico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção. Exemplos de distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino são providos acima.
[0049] Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para tratamento ou prevenção de um efeito colateral de quimioterapia ou de terapia de radiação em um paciente que esteja em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, tal como aqui definido, ou um sal ou derivado do mesmo, ou um ácido nucleico, vetor de expressão ou célula hospedeira da invenção.
[0050] Em um aspecto adicional, a presente invenção provê um método para tratamento ou de prevenção de desnutrição, por exemplo, condições tais que a síndrome de desperdício caquexia ou anorexia, em um paciente que esteja em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, tal como definido neste, ou um sal ou derivado do mesmo, ou um ácido nucleico, vetor de expressão ou célula hospedeira de acordo com a invenção.
[0051] Modalidades da presente invenção serão agora descritas em maiores detalhes, por meio de exemplos e sem limitação com referência às figuras anexas.
Descrição das Figuras:
[0052] Figura 1: Exemplos de dados de dose- resposta completos de quatro compostos seletivos para o intestino delgado (compostos n°s 1846, 1855, 1848 e 1858) na massa do intestino delgado (SI) em camundongos C57BL. Os compostos foram administrados através de injeção subcutânea b.i.d., durante três dias, nas doses que se seguem : 0 (veículo), 5, 15, 45, 135 nmol/kg (n = 6/ grupo de dose). As respostas em cada nível de dose foram comparadas com as respostas obtidas no mesmo nível de dose em um camundongo tratado em par com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. De modo a corrigir as alterações no peso corpóreo (BW), as massa SI foi expressa em relação a BW (razão SI-BW) e a resposta de crescimento, em cada nível de dose, foi normalizada para a resposta observada com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLp-2. Os resultados demonstraram que, dentro da faixa de dose de 5-405 nmol/kg, as relações de dose - resposta de compostos seletivos para o intestino delgado 1846, 1855, 1848 e 1858 foram significativamente diferentes daquelas do composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2 (p< 0,05 em ANOVA de duas vias) e todos os quatro compostos estimularam o crescimento do intestino delgado com respostas máximas, que foram significativamente maiores do que [Gly2] GLP-2. Os valores são médias ± SEM. *: < 0,05 em relação à dose equimolar de [GLy2] GLP-2.
[0053] Figura 2: Exemplos de dados de dose resposta completos para compostos seletivos para o intestino delgado (compostos n°s 1846, 1855, 1848, 1858) no Índice de Sensibilidade do Intestino Delgado (SI) - para Cólon de camundongos em relação ao composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. Os compostos foram administrados através de injeção subcutânea b.i.d. durante três dias em camundongos C57BL, nas doses que se seguem: 0 (veículo), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/ kg (n= 6/ grupo de dose). As respostas em cada nível de dose foram comparadas com as respostas obtidas no mesmo nível de dose em camundongos tratados em par com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. O índice de sensibilidade SI- Cólon foi calculado como a massa de SI em relação à massa de cólon e o Índice de Sensibilidade em cada dose foi normalizado para a resposta observada com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. Os resultados demonstraram que dentro da faixa de dose de 5-405 mol/kg, as relações de dose- resposta dos compostos 1857 e 1820, seletivos para o intestino delgado, foram significativamente diferentes do composto de referência não- seletivo [Gly] GLP-2 (p< 0,05 em ANOVA de duas vias) e os compostos 1846, 1855 e 1949 demonstraram sensibilidade do intestino delgado máxima aumentada em relação a [Gly] GLP-2. Os valores são médias ± SEM *: P< 0,05 em relação à dose equimolar de [Gly]GLP-2.
[0054] Figura 3: Exemplos de dados de dose - resposta completos de compostos seletivos para o intestino delgado (compostos n°s 1857, 1849 e 1820 na massa do intestino delgado (SI) em camundongos C57BL. Os compostos foram administrados través de injeção subcutânea b.i.d. durante três dias, nas doses que se seguem : 0 (veículo), 5, 15, 45, 135, 405 nmol/ kg (N = 6/ grupo de dose). As respostas em cada nível de dose foram comparadas com as respostas obtidas no mesmo nível de dose em camundongos tratados em par com o composto de referência não- seletivo [GLy2]GLP-2. De modo a corrigir as alterações do peso corpóreo (BW), a massa Si foi expressa com relação a BW (razão SI-BW) e a resposta de crescimento de cada nível de dose foi normalizada para a resposta observada com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. Os resultados demonstraram que dentro da faixa de dose de 5-4-5 nmol/ kg, as relações de dose- resposta dos compostos seletivos para o intestino delgado 1857, 1849 e 1820 foram significativamente diferentes do composto de referência não seletivo [GLy2] GLP-2 (p< 0,05 em ANOVA de duas vias) e ambos os compostos estimularam o crescimento do intestino delgado com respostas máximas, que foram significativamente maiores do que [Gly2]GLP-2. Os valores são médias ± SEM. * : P< 0,05 em relação à dose equimolar de [Gly] GLP-2.
[0055] Figura 4: Exemplos de dados de dose- resposta completos dos três compostos seletivos para o intestino delgado (compostos n°s 1857, 1820 e 1849) sobre o Índice de Sensibilidade do Intestino Delgado (SI) - para - Cólon [Gly2] GLP-2. Os compostos foram administrados através de injeção subcutânea b.i. d., durante três dias, em camundongos C57BL nas doses que se seguem : 0 (veículo, 5, 15, 45, 135, 405 mmol/ kg (n = 6/ grupo de dose). As respostas em cada nível de dose são comparadas com as respostas obtidas no mesmo nível de dose em camundongos tratados em par com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. O Índice de Sensibilidade SI- Cólon foi calculado com a massa de SI em relação à massa de cólon e o Índice de Sensibilidade em cada nível de dose foi normalizado para a resposta observada com o composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2. Os resultados demonstraram que dentro da faixa de dose de 5-405 mmol/ kg, as relações de dose resposta dos compostos seletivos para o intestino delgado 1857, 1820 e 1849 foram significativamente diferentes do composto de referência não seletivo [Gly] GLP-2 (p< 0,05 em ANOVA de duas vias) e todos os três compostos demonstraram sensibilidade do intestino delgado máxima aumentada em relação à [Gly2] GLP-2. Os valores são médias ± SEM *: P < 0,05 relativa à dose equimolar de [Gly2] GLP-2.
[0056] Figura 5: Exemplos de dados de dose- resposta completos de um composto não- seletivo ([Gly2]GLP-2), e de um composto seletivo para o intestino delgado (Composto 1848), quanto à massa do estômago, cólon e intestino delgado. Os compostos foram administrados através da injeção subcutânea b.i. d., durante três dias, em camundongos C57BL nas doses que se seguem : (0) veículo, 5, 15, 45, 135, 405 nmol/ kg (n = 5/ grupos de dose). Os resultados demonstraram que, dentro da faixa de dose de 5-405 nmol / kg, [GLy2]GLP-2 produziu uma estimulação de crescimento dependente de dose no intestino delgado, cólon e estômago, enquanto que o Composto 1848 apenas produziu estimulação de crescimento dependente de dose no intestino delgado. Os valores são médias ± SEM. * : P < 0,05 em relação ao veículo.
[0057] Figura 6: O exemplo mostra que o efeito do composto 1846 (5, 15, 45, 135, 405 e 810 nmol/ kg, s.c., b.i.d.; n = 6 / grupo de dose) em A) razão em peso de intestino delgado para o corpo (SI- BW), e B) comprimento do intestino delgado (comprimento SI) em camundongos tratados com a droga citostática 5-Fluorouracila (5-FU). O composto 1846 foi administrado, durante 3 dias, antes de e durante 4 dias junto com 5-FU, 50 mg/kg, i.p., diariamente. A título referencial, [Gly2] GLP-2 (405 nmol/ kg) foi administrado a um grupo de animais. Os resultados a partir dos animais de controle tratados com o veículo (PBS) ou 5-FU isoladamente são também mostrados. O composto 1846 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por FU (massa do órgão reduzida e encurtamento) em camundongos C57BL. Os valores são médias ± SEM. * P< 0,05, em relação a 5-FU.
[0058] Figura 7: O exemplo mostra o efeito do composto 1848 (5, 15,45, 135, 405 e 810 nmol/ kg, s.c., b.i.d. n = 6/ grupo de dose) em A) razão em peso de intestino delgado para o corpo (SI-BW), e B) comprimento do intestino delgado (comprimento SI) em camundongos tratados com a droga citostática 5-Fluorouracila (5-FU). O composto 1848 foi administrado durante 3 dias antes de e durante 4 dias junto com 5-FU, 50 mg/ kg, i. p., diariamente. A título referencial, [GLy2]GLP-2 (405 nmol/ kg) foi fornecido a um grupo de animais. Os resultados a partir dos animais de controle tratados com o veículo (PBS) ou 5-FU isoladamente são também mostrados. O composto 1848 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por FU (massa do órgão reduzida e encurtamento) em camundongos C57BL e altas doses do composto 1848 foram mais eficazes do que [Gly2] GLP-2. Os valores são médias ± SEM. * P< 0,05, em relação a 5-FU. # P < 0,05, em relação a [Gly2] GLP-2.
[0059] Figura 8: O exemplo mostra o efeito do composto 1855 (5, 15,45, 135, e 405 nmol/ kg, s.c., b.i.d. n = 6/ grupo de dose) em A) razão em peso de intestino delgado para o corpo (SI-BW), e B) comprimento do intestino delgado (comprimento SI) em camundongos tratados com a droga citostática 5-Fluorouracila (5-FU). O composto 1855 foi administrado durante 3 dias antes de e durante 4 dias junto com 5-FU, 50 mg/ kg, i. p., diariamente. A título referencial, [GLy2]GLP-2 (405 nmol/ kg) foi fornecido a um grupo de animais. Os resultados a partir dos animais de controle tratados com o veículo (PBS) ou 5-FU isoladamente são também mostrados. O composto 1855 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por FU (massa do órgão reduzida e encurtamento) em camundongos C57BL e altas doses do composto 1855 foram mais eficazes do que [Gly2]GLP-2. Os valores são médias ± SEM. * P< 0,05, em relação a 5-FU. # P < 0,05, em relação a [Gly2] GLP-2.
[0060] Figura 9: O exemplo mostra o efeito do composto 1857 (5, 15,45, 135, e 405 nmol/ kg, s.c., b.i.d. n = 6/ grupo de dose) em A) razão em peso de intestino delgado para o corpo (SI-BW), e B) comprimento do intestino delgado (comprimento SI) em camundongos tratados com a droga citostática 5-Fluorouracila (5-FU). O composto 1857 foi administrado durante 3 dias antes de e durante 4 dias junto com 5-FU, 50 mg/ kg, i. p., diariamente. A título referencial, [GLy2]GLP-2 (405 nmol/ kg) foi fornecido a um grupo de animais. Os resultados a partir dos animais de controle tratados com o veículo (PBS) ou 5-FU isoladamente são também mostrados. O composto 1857 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por FU (massa do órgão reduzida e encurtamento) em camundongos C57BL e altas doses do composto 1857 foram mais eficazes do que [Gly2]GLP-2. Os valores são médias ± SEM. * P< 0,05, em relação a 5-FU. # P < 0,05, em relação a [Gly2] GLP-2.
[0061] Figura 10: O exemplo mostra os efeitos do composto 1846 (16, 80 e 400 nmol/ kg/ d; s.c., n = 6/ grupo de dose) em ratos Sprague- Dawley tratados com a droga citostática 5-Fluorouracila (5-FU). O composto 1846 foi administrado durante 3 dias antes de e durante 4 dias junto com 5-FU (75 mg / kg, i.p., diariamente). Os resultados foram comparados com respostas em animais de controle tratados com veículo (solução salina) ou 5- FU isoladamente. A solução salina e os controles 5-FU são também mostrados. O composto 1846 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por 5-FU (massa do intestino delgado reduzida e encurtamento intestinal em ratos). Os valores são médias ± SEM. * P < 0,05, em relação a 5-FU isoladamente.
[0062] Figura 11: Este exemplo ilustra o efeito terapêutico do composto 1846 sobre a diarréia induzida pelo tratamento com a droga citostática 5-fluorouracila (5-FU). Os ratos foram tratados com 5-FU durante 4 dias com uma dose diária de 75 mg/ kg (dias 1-4); (n- 40 ratos). Metade dos animais receberam tratamento adicional com o composto 1846 (400 nmol/ kg s.c., uma vez ao dia) durante os três últimos dias antes de (dias 3 a 1) e durante os 4 dias de tratamento com 5 -FU (dias 0 a 3). Os ratos foram observados duas vezes ao dia (de manhã e à noite) de modo a determinar se o animal havia tido diarréia e a severidade da diarréia foi classificada de acordo com esta escala : (0) sem diarréia; (1) manchamento fecal brando em torno do ânus; (2) manchamento fecal moderado nos membros traseiros e na cauda; e (3) manchamento fecal severo nos membros frontais e no abdômen. No dia 5, cerca de 70% dos ratos Sprague Dawley que haviam recebido 5-FU isoladamente haviam desenvolvido diarréia (Figura 11A), enquanto que apenas 0% dos ratos que foram tratados em conjunto com o composto 1846 desenvolveram diarréia (Figura 11 B). Os resultados indicam que o composto 1846 evita, de modo efetivo, a lesão do intestino delgado e, deste modo, o desenvolvimento de diarréia durante o tratamento citostático com 5-FU.
[0063] Figura 12: Este exemplo ilustra o efeito do composto 1846 sobre a altura da cripta- vilo epitelial (Figura 12 A) e a espessura muscular (Figura 12 B) e o jejuno (isto é, seção mediana do intestino delgado). Ratos Sprague Dawley foram tratados por via intravenosa com o composto 1846 (0, 62, 3, 41 ou 6,2 mg/ kg / dia) durante 5 dias (n = 6/ grupo de dose). Então os animais foram sacrificados e pequenas biópsias intestinais (1 cm) foram coletadas com 25 cm de afastamento a partir do esfíncter pilórico. As biópsias foram fixadas, embebidas em parafina, seccionadas e manchadas com hematoxilina e eosina. As seções manchadas foram examinadas sob um microscópio e a profundidade da cripta, a altura do vilo, e o comprimento da cripta- vilo e a espessura muscular foram medidos. Conforme ilustrado, o composto 1846 produziu aumentos dependentes de dose no comprimento da cripta- vilo no epitélio intestinal a partir do jejuno, mas não teve efeito sobre a espessura muscular do jejuno. Este resultado sugere que o composto 1846 exerce a sua ação proliferativa no intestino delgado através da estimulação do crescimento epitelial. Os valores são médias em ± SEM. * P< 0,05, em relação a veículos de controle (0 mg/ kg/ d).
[0064] Figura 13: Este exemplo ilustra o efeito do composto 1848 sobre úlceras do intestino delgado induzido através de indometacina. Ratos Sprague Dawley machos foram tratados com o veículo (solução salina; grupo 1) ou indometacina (7 mg/ kg, s.c., uma vez ao dia durante dois dias; grupos 2-7). Indometacina foi fornecida isoladamente (grupo 2) ou em combinação com prednisolona (10 mg /kg s.c.; grupo 3) ou com 8, 40, ou 200 nmol/ kg do composto 1848, s. c. uma vez dia (grupos 4-6). Finalmente, um grupo de ratos foi tratado com o tratamento combinado de prednisolona (10 mg/ kg s.c.) e o composto 1848, 200 nmol/ kg, s.c, uma vez ao dia (grupo 7). O tratamento com o composto 1848 foi iniciado 4 dias antes de indometacina e continuado durante os dois dias de tratamento com indometacina. No dia 3, os ratos foram sacrificados e após um período de 5 minutos, após o qual o intestino foi aberto ao longo da margem antimesentérica e suspenso em uma placa de polipropileno. Quaisquer conteúdos intestinais remanescentes foram cuidadosamente removidos com um par de tesouras. Após a fixação durante 24 horas em temperaturas ambiente, o tecido foi enxaguado em água Milli- Q e manchado superficialmente durante 20 minutos com Alcian Green 3 BX (Chroma) preparado como uma solução a 5% em 1 % de ácido acético (Bie & Berntsen). Após a remoção da solução de manchamento em excesso com água Milli-Q, a preparação do tecido foi transferida para álcool a 70% e analisada usando um estereomicroscópio com baixa ampliação. (x 7). Iniciando no piloro, o intestino delgado foi escaneado e a configuração (circular contra linear) e o tamanho (úlcera circular: diâmetro, úlceras lineares : comprimento x largura) das úlceras foi medido usando uma régua padrão (resolução : 0,5 mm). Uma úlcera foi definida como uma área, que carecia de superfície epitelial. Na cura de úlceras, apenas a área em que ainda faltava a superfície epitelial foi considerada como uma úlcera, mesmo se a estrutura do vilo estivesse ainda faltando em uma área maior. Toda a análise foi executada em um modo cego. Conforme ilustrado na Figura 13, a indometacina causou uma forte indução de úlceras intestinais (ulceração do intestino delgado total = 333 ± 21 mm2). O tratamento com prednisolona causou uma redução significativa na extensão de ulceração de aproximadamente 29%. O tratamento com o composto 1848 evitou a ulceração induzida com indometacina em um modo dependente de dose e na dose mais alta a ulceração total foi reduzida em quase 50% (178 ± 17 mm2). Esta resposta máxima para o composto 1846 foi maior do que o efeito de prednisolona e a adição de prednisolona em combinação com o composto 1848 em alta dose não produziu qualquer efeito adicional. Os resultados indiciam que o composto 1848 evita, de modo efetivo, a ulceração induzida por indometacina no intestino delgado. Os valores são médias ± SEM. * P < 0, 05 contra indometacina (grupo 2). # P < 0,05 contra prednisolona (grupo 3).
[0065] Figura 14: Este exemplo ilustra o efeito do composto 1848 sobre o conteúdo do intestino delgado de TNF- alfa em ratos com inflamação induzida através de indometacina no intestino delgado. Ratos Sprague - Dawley machos foram tratados com o veículo (solução salina; grupo 1) ou indometacina (7 mg/ kg, s. c, uma vez ao dia durante dois dias; grupos 2-7). A indometacina foi fornecida isoladamente (grupo 2) ou em combinação com prednisolona (10 mg/ kg, s. c; grupo 3) ou com 8, 40, ou 200 nmol/ kg do composto 1848 s.c., uma vez ao dia (grupos 4-6). Finalmente, um grupo de ratos foi tratado com o tratamento combinado de prednisolona (10 mg/ kg s.c.) e o composto 1848, 200 nmol / kg, s.c. uma vez ao dia (grupo 7). O tratamento com o composto 1848 foi iniciado 4 dias antes de indometacina e continuou durante os dois dais do tratamento com indometacina. No dia 3, os ratos foram sacrificados e mediante necropsia, a necropsia do intestino delgado foi dividida em três segmentos de igual comprimento correspondendo a 1) duodeno e jejuno proximal, 2) jejuno mediano e distal e 3) íleo. As amostras foram imediatamente congeladas em N2 líquido e armazenadas a - 80°C até a análise. A homogeneização e a extração da proteína celular a partir de segmentos do intestino delgado foi executada de acordo com o procedimento que se segue: Os segmentos de tecido foram pesados e adicionados a um volume de 1,5 ml por grama de tecido gelado de tampão de extração Tris- HCl (10 mM) (Sigma) e EDTA 1 mM (J. T. Baker), (pH 7,6) com 0,05% de azida sódica, 1 % de Tween- 80 (Fluka), fluoreto de fenilmetilsulfonila 2 mM (PMSF, Fluka) e 1 μg/ ml de cada um dos inibidores de protease aprotinina, leupeptina e pepstatina A(Roche Diagnostics). O tecido foi cortado em pequenos pedaços com um par de tesouras e homogeneizado três vezes durante 20 segundos (homogeneizador IKA Ultra Turrax T25, Janke & kunkel) a 9500 rpm, com resfriamento intermitente em gelo durante 30 segundos. O homogeneizado foi centrifugado a 20.000 x g durante 30 minutos a 4°C, o sobrenadante foi coletado e armazenado a 20°C, até a análise quanto a TNF- α. Pequenas extrações de proteína intestinal foram analisadas quanto a TNF-α, usando um kit ELISA comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante (kit ELISA Rat Tumor Necrosis Factor -α Ultra Sensitive, Biosource International Inc.). O ensaio possui uma unidade de detecção de 0,7 pg/ ml. As extrações de proteína foram analisadas quanto ao conteúdo de proteína total usando um ensaio comercialmente disponível (ensaio de proteína DC, Bio-Rad Laboratoires Ltd.). Níveis de tecido do intestino delgado de TNF- α foram expressos com relação à proteína total. O composto 1848 diminuiu, de modo significativo, os níveis do intestino delgado da citoquina proinflamatória TNF-α e este efeito foi mais acentuado no segundo proximal (primeiro 1/3 do intestino delgado). O composto 1848 foi mais eficaz do que prednisolona nos segmentos médio e proximal (segundo 1/3 do intestino delgado). De modo interessante, o composto 1848 suprimiu a inflamação do intestino delgado de modo mais efetivo do que prednisona e prednisona não teve efeito aditivo quando fornecida em combinação com o composto 1848. Estes resultados sugerem que o composto 1848 apresenta um potencial antiinflamatório acentuado sobre os processos de doenças que afetam o intestino delgado. Os valores são médias ± SEM. * P < 0,05 contra indometacina (grupo 2).
Descrição Detalhada da InvençãoDefinições
[0066] A não ser que especificado de outro modo, as definições que se seguem são providas para termos específicos, que são usados na descrição acima exposta.
[0067] Em toda a descrição e reivindicações, os códigos de uma letra e de três letras convencionais para aminoácidos naturais são usados, assim como os códigos de três letras geralmente aceitos para outros a-aminoácidos, tais que sarcosina (Sar), norleucina (Nle), e ácido alfa-aminoisobutírico (Aib). Todos os resíduos de aminoácido nos peptídeos da invenção são, de modo preferido, de configuração LK. No entanto, os aminoácidos de configuração D podem também estar presentes.
[0068] Os compostos preferidos da presente invenção possuem pelo menos uma atividade biológica de GLP-2, em particular causando o crescimento do intestino. Isto pode ser avaliado em ensaios in vivo, por exemplo como descritos nos exemplos, nos quais a massa do intestino, ou uma porção do mesmo é determinada após um animal de teste ter sido tratado ou exposto a um análogo de GLP-2.
[0069] Os análogos de GLP-2 da presente invenção possuem uma ou mais substituições de aminoácido, deleções, inversões ou adições comparadas com FLP-2 nativo e como acima definido. Esta definição também inclui os termos sinônimos similares de GLP-2 e/ ou agonistas de GLP-2. Além disso, o análogo da presente invenção pode, de modo adicional apresentar modificação química de um ou mais de seus grupos colaterais de aminoácido, átomos α- carbono, grupo amino terminal, ou grupo de ácido carboxílico terminal. Uma modificação química inclui, mas não está limitada, à adição de porções químicas, criação de novas ligações e remoção de porções químicas. As modificações nos grupos laterais do aminoácido incluem, sem limitação, a acilação de grupos lisina ε-amino, N-alquilação de arginina, histidina ou lisina, a alquilação de grupos de ácido carboxílico glutâmicos ou aspárticos, e a desamidação de glutamina ou asparagina. As modificações do amino terminal incluem, sem limitação, o desamino, alquila N- inferior, alquila N-di- inferior, e N- acila. As modificações do grupo carbóxi terminal incluem, sem limitação, a amida, a alquil amida inferior, a dialquil amida, e as modificações do éster alquílico inferior. De modo preferido, neste caso, alquila inferior é alquila C1-4. Além disso, um ou mais grupos laterais, ou grupos terminais, podem ser protegidos por grupos protetores, conhecidos daqueles de habilidade ordinária na química de peptídeos. O α- carbono de um aminoácido pode ser mono- ou di-metilado.
[0070] Quando eles estão presentes, aminoácido com substituição Met oxidativamente estável significa um que é selecionado a partir do grupo, que consiste de Met (O) (sulfóxido de metionina), Met (O) 2 (metionina sulfona), Val, Ile, Asn, Glx (Glu ou Gln), Tyr, Phe, Trp e, de modo preferido, Leu, Nle, Ala, Ser e Gly.
[0071] Deve ser entendido que os peptídeos da invenção podem ser também providos sob a forma de um sal ou outro derivado. Sais incluem os sais farmaceuticamente aceitáveis, tais que os sais de adição de ácido e os sais básicos. Exemplos dos sais de adição de ácido incluem sais de hidrocloreto, sais de citrato e sais de acetato. Exemplos de sais básicos incluem sais, em que o cátion é selecionado a partir de metais alcalinos, tais que sódio e potássio, metais alcalino terrosos, tais que cálcio, e íons de amônio + N (R3)3 (R4), em que R3 e R4 designam, de modo independente, alquila Ci-6 opcionalmente substituído, alquenila C2-6 opcionalmente substituído, arila opcionalmente substituído ou heteroarila opcionalmente substituído. Outros exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis são descritos em “Remington’s Pharmaceutical Sciences “, 17 a Edição. Ed. Alfonso R. Genaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, U. S. A., 1985 e edições mais recentes, e na Enciclopédia de Tecnologia Farmacêutica.
[0072] Outros derivados dos análogos de GLP-2 da invenção incluem complexos de coordenação com íons metálicos, tais que Mn2+ e Zn2+, ésteres tais que ésteres hidrolisáveis in vivo, bases ou ácidos livres, hidratos, pró- drogas ou lipídeos. Os ésteres podem ser formados entre grupos de ácido carboxílicos ou hidroxila, presentes no composto, e um ácido carboxílico apropriado ou parceiro de reação de álcool, usando técnicas bem conhecidas na arte. Derivados que como pró-drogas dos compostos são conversíveis in vivo ou in vitro em um dos compostos de origem. De modo típico, pelo menos uma das atividades biológicas do composto será reduzida na forma de pró- droga do composto, e pode ser ativada através da conversão da pró-droga, de modo a liberar o composto ou um metabólito do mesmo. Exemplos de pró- drogas incluem o uso de grupos de proteção, que podem ser removidos in situ, liberando o composto ativo, ou que servem para inibir a liberação da droga in vivo.
[0073] Quando presentes, Z1 e Z2, cada qual independentemente, representa uma sequência de peptídeo de 3020 ou 4-20 resíduos de aminoácido, por exemplo, na faixa de 4-15, de modo mais preferido na faixa de 4-10, em particular na faixa de 4-7 resíduos de aminoácido, por exemplo, 4, 5, 6 ou 7 resíduos de aminoácido, tal que 6 resíduos de aminoácido. Cada um dos resíduos de aminoácido nas sequências de peptídeo Z pode, de modo independente, ser selecionado a partir de Ala, Leu, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Met, Orn. De modo preferido, os resíduos de aminoácido são selecionados a partir de Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His, Orn, e Met, assim como aminoácidos que recaem dentro da fórmula I, tal como definido na WO 01/ 04156, por exemplo, Dbu (ácido 2,4- diaminobutírico) ou Dpr (ácido 2,3-diaminopropanóico), de modo mais preferido a partir de Glu, Lys, e Met, em especial de Lys. Os aminoácidos acima mencionados podem apresentar ou uma configuração D ou L, mas, de modo preferido, os aminoácidos acima possuem uma configuração L. De modo particularmente preferido, as sequências Z são sequências de quatro, cinco ou seis resíduos lisina consecutivos, e em particular de seis resíduos lisina consecutivos. Sequências Z exemplares são apresentadas na WO 01/ 04 156.
[0074] Em certas modalidades, Z1 está ausente. Em tais casos, Z2 pode ou estar presente ou ausente.
[0075] A presente invenção inclui os peptídeos que se seguem, descritos adicionalmente na seção experimental abaixo.
[0076] Análogo de GLP-2 Referencial:1559 H-[Gly2]hGLP-2-OHH-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWUQTKITD-OH
[0077] Exemplos de Análogo de GLP-2 da presente invenção1809 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2-(Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21810 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, AIa11,16,24,28, He21]hGLP-2(1-30)- (Lys)6-NH2 HGEGTFSDELATILDALAARIFIAWLIATK6-NH21811 [Gly2, Pro6, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2-NH2HGDGSPSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21812 [Gly2, Glu3, Leu10, Ala11 ,24]hGLP-2-NH2HGEGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH2 1813 [Gly2, Leu10, Ala11,16,24,28]hGLP-2-NH2 H- HGDGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21814 [Gly2, Leu10, Ala11 ,24,28]hGLP-2-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIATKITD-NH21815 [Gly2, Glu3, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2-NH2 H- HGEGSFSDELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21818 [Gly2, Ser8, Leu10, Ala11 ,24]hGLP-2(1 -3O)-K6-NH2 H- HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK5-NH21819 [Gly2, Leu 10, Ser11 , Ala24]hGLP-2(1 -3O)-K6-NH2 H- HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK5-NH21820 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Ala11 ,24]hGLP-2(1 -3O)-K6-NH2 H- HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21821 [Gly2, Leu10, Lys11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-Kβ-NH2 H- HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21822 [Gly2, Thr7, Leu10, Lys11, Ala24]hGLP-2(1 -3O)-K6-N H2 H- HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21823 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Lys11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-Ks-NH2 H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWUQTK6-NH21824 [Gly2, Thr7, Leu10, Ala11, 24]hGLP-2(1-30)-Ks-NH2 H- HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21825 [Gly2, Ser8, Leu10, Ala11 ,24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21826 [Gly2, Leu10, Ala24]hGLP-2-Ks-NH2 H-HGDGSFSDELNTILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH21827 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser11 , Ala24]hGLP-2(1 -3O)-K6-NH2 H- HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21828 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser8,11 , Ala24]hGLP-2(1 -3O)-K6-NH2 H- HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21829 [Gly2, Leu10, Ser8,11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-K6-NH2 H- HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK6-NH21830 [Gly2, Leu10, Ser11, Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21831 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21832 [Gly2, Thr7, Leu10, Ser8,11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21833 [Gly2, Leu10, Ser8,11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21834 [Gly2, Thr7, Ser8, Leu10, Ala11 ,24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21835 [Gly2, Leu10, Lys11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21836 [Gly2, Thr7, Leu10, Lys11 , Ala24]hGLP-2(1-30)-NH2 H- HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWUQTK-NH21839 [Leu10, Ala11 , Ala24]hGLP-2 (1-33J-K6-NH2 H-HGDGSFSDELATILDN LAARDFIAWLIQTKITDK6-NH21840 [Leu 10, Ala11 , Ala24]hGLP-2 (1-33)-NH2H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH21841 [Leu10, Ala11, Ala24]hGLP-2 (1-3O)-NH2 H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21842 [Thr7, Serδ, Leu10, Lys11 , Ala24]hGLP-2 (1-3O)-NH2 H- HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21843 [Thr7, Leu 10, Ala11 , Ala24]hGLP-2 (1-3O)-NH2 H- HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21844 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8.11 , Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)- (Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21845 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, SeM 1 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)- (Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKS-NH2 1846 [Gly2, Glu3, Ser8,11 , Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6- NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH21847 [Gly2, Glu3, Leu10, Ser11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6- NH2 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21848 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2(1-33)- (Lys)6-NH2 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21849 [Gly2, Giu3, Ser8, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6- NH2 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21850 [Gly2, Glu3, Leu10, Lys11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-(Lys)6- NH2 H-HGEGSFSDELKTI LDALAARDFIAWLIATKITDKS-NH21851 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Lys11, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)- (Lys)6-NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21852 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Lys11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH21853 [GIy2, Glu3, Thr5, Ser8,11 , Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)- NH2 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21854 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Ser11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H-HGEGTFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21855 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2(1-33)- NH2 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21856 [Gly2, Glu3, Ser8,11 , Leu10, Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H- HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKiTD-NH21857 [Gly2, Glu3, Leu10, Ser11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H- HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21858 [Gly2, Glu3, Ser8, Leu10, Ala11 ,16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H- HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21859 [Gly2, Glu3, Leu10, Lys11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)-NH2 H- HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21860 [Gly2, Glu3, Thr5, Leu10, Lys11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1-33)- NH2 H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH21861 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, Leu10, Lys11 , Ala16,24,28]hGLP-2(1- 33)-NH2 HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDOs compostos particularmente preferidos da presente invenção incluem os compostos 1834, 1846, 1846, 1848, 1849, 1855, 1857 e 1858.1834 H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH21847 H-HGEGSFSDELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDK6-NH2 1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKe-NHz 1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2 Estudos de Estabilidade
[0078] A pessoa versada na arte estará apta a designar os métodos apropriados (por exemplo, métodos quantitativos) para a detecção de produtos de degradação de análogos de GLP-2, por exemplo baseados naqueles descritos abaixo. A degradação pode ocorrer como oxidação, hidrólise e desamidação, dependendo da identidade e da posição dos aminoácidos em qualquer análogo de GLP-2, e condições como pH, solução e temperatura. Os compostos podem ser classificados de acordo com a estabilidade química, quando os compostos são incubados sob condições de estresse (isto é, em condições prováveis de causar a degradação) e subsequentemente analisados quanto ao conteúdo de peptídeo intacto remanescente. Em adição, o conhecimento obtido acerca de produtos de degradação principais, obtidos sob condições de estresse, será importante para qualquer desenvolvimento de método analítico posterior.
Ensaios Quantitativos para detectar análogos de GLP
[0079] A pessoa versada na arte será também capaz de designar métodos (por exemplo, métodos quantitativos) para a detecção de análogos de GLP em ambientes complexos ou soluções (por exemplo, plasma, urina, homogeneizados de tecido, homogeneizados de célula, saliva ou similar) de modo a investigar a absorção, a distribuição, o metabolismo e a excreção dos análogos de GLP após a administração a mamíferos ou como uma parte de estudos funcionais de sistemas de célula in vitro.
[0080] Em uma modalidade, um ensaio quantitativo pode ser baseado em anticorpos desenvolvidos contra os análogos de GLP, ou fragmentos dos mesmos. Os anticorpos obtidos a partir dos animais imunizados podem ser usados para ensaios quantitativos. Em um exemplo, um ELISA de sanduíche direto pode ser preparado usando um primeiro anticorpo com afinidade de uma parte da molécula imobilizada em uma placa com vários reservatórios. A amostra é então aplicada aos reservatórios e o análogo de GLP é capturado no primeiro anticorpo. O análogo de GLP capturado é então reconhecido por um segundo anticorpo com afinidade para outra parte do análogo de GLP. O segundo anticorpo pode ser rotulado com uma enzima (peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina ou beta-galactosidase) ou um radioisótopo. A quantidade de análogo de GLP capturada pode ser então detectada através da adição de um substrato colorimétrico ou através da contagem direta da radioemissão ou através de cintilação. De modo alternativo, a quantidade de análogo de GLP capturado pode ser detectada, de modo indireto, através da adição de um anticorpo rotulado com afinidade para o segundo anticorpo. A concentração na amostra pode ser estimada a partir da resposta obtida a partir de uma curva padrão externa contendo quantidades conhecidas do análogo de GLP. De modo alternativo, os anticorpos podem ser usados para preparar um imunoensaio competitivo direto, em que um anticorpo específico para o análogo de GLP é imobilizado em uma placa com vários reservatórios e a amostra é incubada nos reservatórios com uma concentração previamente definida de análogo de GLP rotulado. O rótulo pode ser uma enzima, um fluoróforo, um radioisótopo ou biotina, e detectada usando, por exemplo, substratos (por exemplo, colorimétrico fluorométrico ou quimioluminescente), específico para as enzimas, cintilação ou avidina ligada a uma enzima, seguido pela detecção, tal como acima descrito. A quantidade de análogo de GLP rotulado ligado pode ser detectada através de um método apropriado e a concentração de análogo de GLP presente na amostra derivada a partir da resposta obtida a partir de uma curva padrão externa, tal como acima descrito.
[0081] Em uma outra modalidade, um ensaio quantitativo pode ser baseado em metodologia de espectroscopia de massa em série com cromatografia líquida. Em um tal ajuste, a resposta a partir de um fragmento específico para o análogo de GLP a ser estudado é monitorada mediante a fragmentação do composto de origem, induzida pela colisão com um gás inerte (He ou Ar). Antes da fragmentação, os componentes da amostra podem ser separados através de cromatografia de fase reversa ou a amostra pode ser diretamente injetada no espectrômetro de massa. Se apropriado, a amostra pode ser submetida a um tratamento prévio (isto é, adição de inibidores de protease, precipitação de proteína, extração de fase sólida, extração através de imunoafinidade, etc. A concentração do análogo de GLP presente na amostra derivada a partir da resposta obtida a partir de uma curva padrão externa, tal como acima descrito, potencialmente após a correção da resposta, usando um padrão interno similar ao análogo de GLP a ser estudado.
Geração de anticorpos específicos
[0082] Anticorpos específicos contra os análogos de GLP ou fragmentos dos mesmos podem ser induzidos em mamíferos e purificados a partir do soro. Os análogos ou fragmentos de GLP podem ser usados diretamente com um adjuvante para imunizar coelhos, camundongos ou outros mamíferos, ou os análogos de GLP ou fragmentos dos mesmos podem ser quimicamente ligados a uma molécula de veículo (isto é, hemocianina de limpeto,ovalbumina, albumina, etc.) e injetada junto com um adjuvante. As injeções podem ser repetidas com intervalos de 2-4 semanas durante períodos estendidos, de modo a aperfeiçoar a afinidade e a seletividade dos anticorpos. Anticorpos policlonais podem ser coletados diretamente a partir do soro. De modo a obter anticorpos monoclonais, as células B isoladas a partir de animais imunizados, de modo preferido a partir de camundongos, devem ser fundidas com células de tumor, de modo a formar um anticorpo que produza hidribomas. A varredura e a seleção dos clones e anticorpos apropriados pode ser executada através do uso ou de análogos de GLP imobilizados ou de peptídeos do mesmo, seguido pela detecção com a anticorpos rotulados. De modo alternativo, a triagem e a seleção podem ser baseadas em anticorpos imobilizados, seguidas pela detecção com análogos de GLP rotulados ou fragmentos dos mesmos. Em todos os casos, o rótulo pode ser um radioisótopo, uma enzima, um fluoróforo ou biotina e detectado usando, por exemplo, substratos (por exemplo, colorimétrico, fluorométrico, ou quimioluminescente) específicos para as enzimas, cintilação ou avidina ligada a uma enzima, seguido por detecção, conforme descrito.
Síntese de Análogos de GLP-2
[0083] É preferido sintetizar os análogos da invenção através da síntese de peptídeo em fase sólida ou em fase líquida. Neste contexto, faz-se referência à WO 98/ 11125 e, dentre outros, a Fields GB et al., 2002, “Principles and practice of solid-phase peptide synthesis”. Em: Synthetic Peptides (2a Edição) e os Exemplos no mesmo.
[0084] Deste modo, os análogos de GLP-2 podem ser sintetizados de um número de modos incluindo, por exemplo, um método que compreende :(a) sintetizar o peptídeo por meio de síntese de peptídeo em fase sólida ou em fase líquida, e recuperar o peptídeo sintético assim obtido; ou(b) quando o peptídeo é constituído através de aminoácidos de ocorrência natural, expressar um construto de ácido nucleico, que codifica o peptídeo em uma célula hospedeira e recuperar o produto de expressão a partir da cultura da célula hospedeira; ou(c) quando o peptídeo é constituído por aminoácidos de ocorrência natural, efetuar a expressão in vitro sem célula de um construto de ácido nucleico, que codifica o peptídeo e recupera o produto de expressão; ou uma combinação dos métodos (a), (b) e (c), de modo a obter fragmentos do peptídeo, subsequentemente ligando os fragmentos para a obtenção do peptídeo, e recuperando o peptídeo.
[0085] Deste modo, para alguns análogos da invenção, pode ser vantajoso empregar técnicas de engenharia genética. Este pode ser o caso quando o peptídeo é suficientemente grande (ou produzido como um construto de fusão) e quando o peptídeo apenas inclui aminoácidos de ocorrência natural, que podem ser transferidos a partir de RNA para organismos vivos.
[0086] Para o propósito de tecnologia genética recombinante, os fragmentos de ácido nucleico, que codificam os peptídeos da invenção são produtos químicos importante. Portanto, um outro aspecto da presente invenção provê uma molécula de ácido nucleico que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um análogo de GLP-2 da invenção, em que o peptídeo compreende aminoácidos de ocorrência natural. Os fragmentos de ácido nucleico da invenção são ou fragmentos de DNA ou de RNA.
[0087] Os fragmentos de ácido nucleico da invenção serão normalmente inseridos em vetores adequados para formar vetores de expressão ou de clonagem, que portam os fragmentos de ácido nucleico da invenção; tais novos vetores constituem também parte da invenção. Detalhes referentes à construção destes vetores da invenção serão discutidos no contexto de células transformadas e de microorganismos abaixo. Os vetores podem, dependendo do propósito e do tipo de aplicação, estar sob a forma de plasmídeos, fagos, cosmídeos, minicromossomos, ou vírus, mas também o DNA nu, que apenas é expresso, de modo transiente, em certas células é m vetor importante. Vetores de clonagem e de expressão (vetores de plasmídeo) da invenção são capazes de replicação autônoma, deste modo propiciando altos números de cópia com o propósito de expressão de alto nível ou replicação de alto nível para a clonagem subsequente.
[0088] O esboço geral de um vetor da invenção compreende as seguintes características na direção 5’ ^ 3’ e em uma ligação operável: um promotor para dividir a expressão do fragmento de ácido nucleico da invenção, opcionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo líder possibilitando a secreção (para a fase extracelular ou, quando aplicável, ao interior do periplasma) de um peptídeo líder para o uso múltiplo, por exemplo secreção combinada, etiqueta de purificação e desbaste enzimático, de modo a corrigir o peptídeo ou a integração ao interior da membrana do fragmento de polipeptídeo, do fragmento de ácido nucleico que codifica o peptídeo da invenção, e opcionalmente de uma sequência de ácido nucleico que codifica um terminador. Quando da operação com vetores de expressão em cepas do produtor ou linhagens celulares, é para propósitos de estabilidade genética da célula transformada preferida que o vetor, quando introduzido no interior de uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira.
[0089] Os vetores da invenção são usados para transformar as células hospedeiras de modo a produzir o peptídeo modificado da invenção. Tais células transformadas, que constituem também parte da invenção, podem ser células cultivadas ou linhagens celulares usadas para a propagação dos fragmentos de ácido nucleico e de vetores da invenção, ou usadas para a produção recombinante dos peptídeos da invenção.
[0090] Células transformadas preferidas da invenção são microorganismos, tais que bactérias (tais que a espécie Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacillus (por exemplo, Bacillus subtilis), Salmonella, ou Mycobacterium (preferivelmente não-patogênico, por exemplo M. bovis BCG), leveduras (tais que Saccharomyces cerevisiae), e protozoários. De modo alternativo, as células transformadas são derivadas a partir de um organismo multicelular, isto é, ele pode ser uma célula fúngica, uma célula de inseto, uma célula de planta, ou uma célula de mamífero. Além disso, células derivadas a partir de um ser humano podem ser interessantes, vide a discussão das linhagens celulares e dos vetores abaixo. Para os propósitos de clonagem e/ ou de expressão otimizada, é preferido que a célula transformada seja capaz de replicar o fragmento de ácido nucleico da invenção. As células que expressam o fragmento nucleico são modalidades úteis preferidas da invenção; elas podem ser usadas para a preparação em pequena escala ou em grande escala dos peptídeos da invenção.
[0091] Quando da produção do peptídeo da invenção por meio de células transformadas, é conveniente, embora não seja essencial, que o produto de expressão seja ou exportado ao interior do meio de cultura ou carregado sobre a superfície da célula transformada.
[0092] Quando uma célula de produtor eficaz tiver sido identificada, é preferido, com base na mesma, estabelecer uma linhagem celular estável, que porta o vetor da invenção e que expressa o fragmento de ácido nucleico que codifica o peptídeo. De modo preferido, esta linhagem celular estável secreta ou porta o peptídeo da invenção, deste modo facilitando a purificação do mesmo.
[0093] De modo geral, vetores de plasmídeo que contêm o replicon e as sequências de controle, que são derivados a partir da espécie compatível com a célula hospedeira, são usados em conexão com os hospedeiros. O vetor porta, de modo ordinário, um sítio de replicação, assim como sequências de marcação, que são capazes de prover a seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é transformado, de modo típico, usando pNR322 (mas existem numerosos outros plasmídeos) um plasmídeo derivado da espécie E. coli (vide, por exemplo, Bolivar et al., 1977). O plasmídeo pBR322 contém genes para a resistência à ampicilina e à tetraciclina e provê, deste modo, meios fáceis para a identificação das células transformadas. O plasmídeo pBR, ou outro plasmídeo microbiano ou fago precisa também conter, ou ser modificado para conter, promotores, que são usados pelo microorganismo procariótico para a expressão.
[0094] Aqueles promotores mais comumente usados na construção de DNA recombinante procariótico incluem a β-lactamase (penicilinase) e sistemas de protor de lactose (Chang et al., 1978; Itakura et al., 1977; Goeddel et al, 1979) e um sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., 1979; EP 0 036 776 A). Embora estes sejam os mais usualmente usados, outros promotores icrobianos foram descobertos e utilizados e detalhes referentes a suas sequências de nucleotídeo foram publicados, permitindo com que aquele versado na arte possa ligá-los, de modo funcional, com vetores de plasmídeo (Siebwenlit et al., 1980).
[0095] Em adição a procariotos, micróbios eucarióticos, tais que culturas de levedura, podem ser também usados, e além disso, o promotor deve ser capaz de orientar a expressão. Saccharomyces cerevisiae, ou levedura de padaria comum, é o mais comumente usado dentre os microorganismos eucarióticos, embora um número de outras linhagens esteja usualmente disponíveis. Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, é usualmente usado (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Este plasmídeo já contém o gene trpl, que provê um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura, que não possui a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC N° 44076 ou PEP4-1 (Jones, 1977). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira de levedura provê então um ambiente efetivo para detectar a transformação através do crescimento na ausência de triptofano.
[0096] Sequências de promoção adequadas em vetores de levedura incluem os promotores para 3-fosfonoglicerato quinase (Hitzman et al. 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., 1968; Holland et al., 1978), tais que enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfofructoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase. Na construção de plasmídeos de expressão adequados, ss sequências de terminação associadas com estes genes estão também ligadas no vetor de expressão 3’ da sequência que se deseja expressar de modo a prover a poliadenilação do mRNA e terminação.
[0097] Outros promotores, que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada pelas condições de crescimento são a região do promotor para a álcool desidrogenase 2, isocitocroma C, fosfatase ácida, enzimas degradantes associadas com o metabolismo de nitrogênio, e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase antes mencionada, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Qualquer vetor de plasmídeo contendo um promotor compatível com levedura, origem de replicação e sequências de terminação é adequado.
[0098] Em adição a microrganismos, culturas de células derivadas a partir de microrganismos multicelulares podem ser também usadas como hospedeiros. Em princípio, qualquer tal cultura celular é operável, seja a partir de uma cultura de vertebrado ou de invertebrado. No entanto, o interesse maior tem sido em células de vertebrado e a propagação de vertebrados em cultura (cultura de tecido) tem se tornado um procedimento de rotina nos anos recentes (Tissue Culture, 1973). Exemplos de tais linhagens celulares de hospedeiro úteis são as células VERO e HeLa, linhagens celulares de ovários de criceto chinês (CHO), e W138, BHK, COS- 7 293, células Spodoptera frugiperda (SF) (comercialmente disponíveis como sistemas de expressão completa a partir de, entre outros, Protein Sciences, 1000 Research Parkway, Meridien, CT 06450, U. S. A. e de Invitrogen), a linhagem celular D. melanogaster S2, disponível de Invitrogen, PO Box 2312, 9704 CH Gronigen, The Netherlands, e linhagens celulares MDCK.
[0099] Vetores de expressão para tais células incluem, de modo ordinário (se necessário) uma origem de replicação, um promotor localizado na frente do gene a ser expressado, junto com quaisquer sítios de ligação de ribossoma necessários, sítios de emenda de DNA, sítio de poliadenilação, e sequências de terminador transcricionais.
[00100] Para o uso em células de mamífero, as funções de controle nos vetores de expressão são frequentemente providas pelo material viral. Por exemplo, promotores comumente usados são derivados a partir de polioma, Adenovírus 2, e, de modo mais frequente, Simian Virus 40 (SV40). Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são particularmente úteis, porque são ambos facilmente obtidos a partir do vírus como um fragmento, que também contém a origem viral de SV40 de replicação (Fiers et al., 1978). Fragmentos de SV40 menores ou maiores podem ser também usados, contanto que seja incluída a sequência de aproximadamente 250 bp, que se estende a partir do sítio HidIII em direção ao sítio BGII, localizado na origem viral de replicação. Além disso, é também possível, e muitas vezes desejável, utilizar o promotor ou as sequências de controle normalmente associadas com a sequência genética desejada, contanto que tais sequências de controle sejam compatíveis com os sistemas de célula hospedeira.
[00101] Uma origem de replicação pode ser provida, ou pela construção do vetor para incluir uma origem exógena tal que derivada de SV40 ou de outro viral (por exemplo, Polyoma, Adeno, VSV, BPV) ou pode ser provida pelo mecanismo de replicação cromossômico da célula hospedeira. Se o vetor for integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último é, muitas vezes, suficiente.
[00102] De modo a obter rendimentos satisfatórios em um processo de produção recombinante, pode ser vantajoso preparar os análogos como proteínas de fusão, seja pela fusão do peptídeo a um parceiro de fusão, que pode servir como uma etiqueta de afinidade (para a facilidade de purificação) e / ou pelo fato de possuir múltiplas repetições do peptídeo. Estes métodos requerem a presença de um sítio de clivagem adequado para uma peptidase, mas aquele versado na arte saberia como adaptar os construtos genéticos subjacentes.
[00103] Após a preparação recombinante, os peptídeos da invenção podem ser purificados através de métodos geralmente conhecidos na arte, incluindo a cromatografia de vários estágios (troca iônica, exclusão de tamanho e técnicas de afinidade cromatográficas).
[00104] De modo alternativo, os peptídeos que compreendem aminoácidos de ocorrência natural podem ser preparados em sistema isentos de célula in vitro. Isto é em especial efetivo em casos, em que os peptídeos poderiam ser tóxicos para as células hospedeiras putativas. Deste modo, a presente invenção também contempla o uso de translação/ expressão in vitro isenta de célula, de modo a preparar os peptídeos da invenção. Neste contexto, faz-se referência a kits de translação in vitro comercialmente disponíveis, e à documentação técnica de, por exemplo, Ambion Inc., 2130 Woodward, Austin, TX 78744-1832, USA.
[00105] Finalmente, os métodos disponíveis podem, naturalmente, ser combinados de modo a preparar análogos semi- sintéticos. Em um tal arranjo, os fragmentos de peptídeo são preparados usando pelo menos 2 estágios ou métodos separados, seguidos pela ligação dos fragmentos, de modo a obter o produto de peptídeo final.
Composições Farmacêuticas e Administração
[00106] Os análogos de GLP-2 da presente invenção, ou sais ou derivados do mesmo, podem ser formulados como composições farmacêuticas preparadas para o armazenamento ou administração, e que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo GLP-2 da presente invenção, ou um sal ou derivado do mesmo, em um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00107] A quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da presente invenção irá depender da via de administração, do tipo de animal sendo tratado, e das características físicas do mamífero específico sob consideração. Estes fatores e a sua relação para determinar esta quantidade são bem conhecidos daqueles versados nas artes médicas. Esta quantidade e o método de administração podem ser adaptados de modo a que seja alcançada a eficácia ótima, de modo a fornecer o peptídeo ao intestino grosso, mas irá depender de fatores, tais que peso, dieta, medicação concorrente e outros fatores, bem conhecidos daqueles versados nas artes médicas.
[00108] Está dentro da invenção prover uma composição farmacêutica, em que o análogo de GLP-2, ou um sal do mesmo, está presente em uma quantidade eficaz para tratar distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino.
[00109] Sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da invenção tendo uma porção ácida podem ser formados suando bases orgânicas e inorgânicas. Sais adequados, formados com bases, incluem sais metálicos, tais que sais de metais alcalinos ou alcalino terrosos, por exemplo sais de sódio, potássio ou magnésio; sais de amônia e sais de amina orgânica, tais que aqueles formados com morfolina, tiomorfolina, piperidina, pirrolidina, uma mono-, di- ou tri- alquilamina inferior (por exemplo, etil-terc-butil-, dietil-, diisopropil-, trietil- tributil- ou dimetilpropilamina), ou uma alquilamina mono-, di- ou triidróxi inferior (por exemplo, mono-, di- ou trietanolamina). Sais internos podem ser também formados. De modo similar, quando o composto da presente invenção contém uma porção básica, os sais podem ser formados usando ácidos orgânicos e inorgânicos. Por exemplo, podem ser formados sais a partir dos ácidos que se seguem: acético, propiônico, láctico, cítrico, tartárico, succínico, fumárico, maleico, malônico, mandélico, málico, ftálico, clorídrico, bromídrico, fosfórico, nítrico, sulfúrico, metanossulfônico, naftalenossulfônico, benzenossulfônico, toluenossulfônico, e canforsulfônico, assim como outros ácidos farmaceuticamente aceitáveis conhecidos. Sais de adição de aminoácido podem ser também formados com aminoácidos, tais que lisina, glicina ou fenilalanina.
[00110] Como é evidente para aquele versado na arte média, uma “quantidade terapeuticamente eficaz “ dos peptídeos ou composições farmacêuticas da presente invenção irá variar dependendo da idade, do peso e da espécie mamífera sendo tratada, dos compostos particulares empregados, do modo particular de administração e dos efeitos desejados e da indicação terapêutica. Como estes fatores e a sua relação para a determinação desta quantidade são bem conhecidos nas artes médicas, a determinação dos níveis de dosagem terapeuticamente efetivos, a quantidade necessária para que seja alcançado o resultado desejado de prevenção e/ ou tratamento de doenças relacionadas ao estômago e intestino aqui descritos, assim como outras indicações médicas aqui expostas, estarão dentro do âmbito da pessoa habilitada.
[00111] Como aqui usado, “uma quantidade terapeuticamente eficaz” é uma que reduz os sintomas de uma determinada condição ou patologia, e de modo preferido, que normaliza das respostas fisiológicas em um indivíduo com a condição ou patologia. A redução de sintomas ou normalização de respostas fisiológicas pode ser determinada usando métodos de rotina na arte e pode variar com uma determinada ou patologia. Em um aspecto, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais análogos de GLP-2 ou composição farmacêutica, que compreende um ou mais dos análogos de GLP- 2 é uma quantidade que restaura um parâmetro fisiológico mensurável para substancialmente o mesmo valor (de modo preferido dentro de + 30%, de modo mais preferido dentro de + 20%, e de modo ainda mais preferido, a dentro de 10% do valor) do parâmetro em um indivíduo sem a condição de patologia.
[00112] Em uma modalidade da invenção, a administração dos compostos ou composição farmacêutica da presente invenção é iniciada em níveis de dosagem mais baixos, os níveis de dosagem sendo aumentados até que o efeito desejado de prevenir/tratar a indicação médica relevante, tal que doenças relacionadas ao estômago e ao intestino seja alcançado. Isto iria definir uma quantidade terapeuticamente eficaz. Para os peptídeos da presente invenção, de modo isolado ou como parte de uma composição farmacêutica, tais doses podem estar ente cerca de 0,01 mg/ kg e 100 mg/ kg de peso corpóreo, tal que entre cerca de 0,01 mg/ kg e 10 mg/ kg de peso corpóreo, por exemplo entre 10-100 μg/ kg de peso corpóreo.
[00113] Para o uso terapêutico, o análogo de GLP-2 selecionado é formulado com um veículo que é farmaceuticamente aceitável e é apropriado para fornecer o peptídeo através da via de administração selecionada. Para o propósito da presente invenção, as vias parenterais periféricas incluem as vias intravenosas, intramusculares, subcutâneas, e intraperitoniais de administração. Certos compostos usados na presente invenção podem ser também conduzidos para a administração através das vias oral, retal, nasal, ou vias respiratórias inferiores. Estas são as vias assim denominadas não- parenterais. A presente composição farmacêutica compreende um análogo de GLP-2 da invenção, ou um sal ou derivado da mesma e um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adequados são aqueles convencionalmente usados com drogas à base de peptídeo, tais que diluentes, excipientes e os similares. Veículos farmaceuticamente aceitáveis para o uso terapêutico são bem conhecidos na arte farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing CO. (A. R. Gennaro Edit., 1985). Por exemplo, solução salina estéril e solução salina tamponada com fosfato em pH fisiológico ou ligeiramente ácido podem ser usadas. Os agentes tamponantes de pH podem ser fosfato, citrato, acetato, tris/ hidroximetil) aminometano (TRIS), N- ácido tris (hidroximetil) metil-3- aminopropanossulfônico (TAPS), bicarbonato de amônio, dietanolamina, histidina, que é um tampão preferido, arginina, lisina, ou acetato ou misturas dos mesmos. Faixas de tampão preferidas são pH de 4-8, pH de 6,5-8, de modo mais preferido pH de 7-7, 5. Conservantes, tais que para, meta e orto- cresol, metil e propil parabeno, fenol, álcool benzílico, benzoato de sódio, ácido benzóico, benzoato de benzila, ácido sórbico, ácido propanóico, ésteres do ácido p-hidroxibenzóico podem ser providos na composição farmacêutica. Estabilizadores, prevenção de oxidação, desamidação, isomerização, racemização, ciclização, hidrólise de peptídeo, tais que, por exemplo, ácido sórbico, metionina, triptofano, EDTA, asparagina, lisina, arginina, glutamina e glicina podem ser providos na composição farmacêutica. Estabilizadores, prevenção de agregação, fibrilação e precipitação, tais que dodecil sulfato de sódio, polietileno glicol, carboximetil celulose, ciclodextrina podem ser providos na composição farmacêutica. Modificadores orgânicos para a solubilização ou a prevenção e agregação, tais que etanol, ácido acético, acetato e sais dos mesmos podem ser providos na composição farmacêutica. Formadores de isotonicidade, tais que sais, por exemplo cloreto de sódio ou, de modo mais preferido, carboidratos, por exemplo dextrose, manitol, lactose, trealose, sacarose ou misturas dos mesmos podem ser providos na composição farmacêutica.
[00114] Detergentes, tais que Tween 20, Tween 80, SDS, poloxâmeros, por exemplo Pluronic F-68, Pluronic F-127, podem ser providos na composição farmacêutica. Corantes e até mesmo agentes aromatizantes podem ser providos na composição farmacêutica. Em uma outra modalidade, um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável do análogo de peptídeo GLP-2 é provido. Agentes de suspensão podem ser também usados.
[00115] Modificadores orgânicos, tais que etanol, butanol terciário, 2- propanol, etanol, glicerol, prolietileno glicol podem ser providos na formulação farmacêutica para a liofilização de um produto liofilizado. Agentes de formação de massa e formadores de isotonicidade, tais que um sal, por exemplo cloreto de sódio, carboidratos, por exemplo dextrose, manitol, lactose, trealose, sacarose e misturas dos mesmos, aminoácidos, por exemplo glicina, glutamato, ou excipientes, tais que cisteína, lecitina ou albumina de soro humano, ou misturas dos mesmos podem ser providos na composição farmacêutica para a liofilização.
[00116] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas e usadas como comprimidos, cápsulas ou elixires para a administração oral; supositórios para a administração retal; de modo preferido soluções estéreis ou pó estéril ou suspensões para a administração injetável; e os similares. A dose e o método de administração podem ser adaptados de modo a que alcancem a eficácia ótima, mas irão depender de fatores tais que o peso, dieta, medicação concorrente e outros fatores, que aqueles de habilidade nas artes médicas irão reconhecer.
[00117] Quando a administração deve ser parenteral, tal que intravenosa e subcutânea, por exemplo, em uma base diária, composições farmacêuticas injetáveis podem ser preparadas em formas convencionais, seja como soluções aquosas ou suspensões; formas sólidas, liofilizadas, adequadas para a reconstituição imediatamente antes do uso ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões.
[00118] Diluentes para a reconstituição do produto liofilizado podem ser um tampão adequado a partir da lista acima, água, solução salina, dextrose, manitol, lactose, trealose, sacarose, lecitina, albumina, glutamato de sódio, hidrocloreto de cisteína; ou água para injeção com a adição de detergentes, tais que Tween 20, Tween 80, poloxâmeros, por exemplo pluronic F-68 ou pluronic F-127, polietileno glicol, e ou com a adição de conservantes, tais que para -, meta- e orto-cresol, metil e propil parabeno, fenol, álcool benzílico, benzoato de sódio, ácido benzóico, benzoato de benzila, ácido sórbico, ácido propanóico, ésteres do ácido p-hidroxibenzóico, e/ ou com a adição de um modificador orgânico, tal que etanol, ácido acítico, ácido cítrico, ácido láctico ou sais dos mesmos.
[00119] Em adição, se desejado, as composições farmacêuticas injetáveis podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não- tóxicas, tais que agentes de umectação, ou agentes de tamponamento do pH. Preparações para o aumento da absorção (por exemplo, lipossomas, detergentes e ácidos orgânicos) podem ser utilizadas.
[00120] Em uma modalidade da invenção, os compostos são formulados para a administração através de infusão, por exemplo quando usados como suplementos nutricionais líquidos para pacientes em terapia de nutrição parenteral total (por exemplo, neonatos, ou pacientes que sofrem de caquexia ou anorexia), ou através de injeção, por exemplo, por via subcutânea, intraperitonial ou intravenosa, e são, deste modo, utilizados como soluções aquosas em forma estéril e isenta de pirogênio e opcionalmente tamponados a um pH fisiologicamente tolerável, por exemplo um pH fisiológico ou ligeiramente ácido. A formulação para a administração intramuscular pode ser baseada em soluções ou suspensões em óleo de planta, por exemplo, óleo de canola, óleo de milho ou óleo de soja. Estas formulações à base de óleo podem ser estabilizadas por meio de antioxidantes, por exemplo, BHA (hidroxianisol butilado) e BHT (hidroxitolueno butilado).
[00121] Deste modo, os presentes compostos podem ser administrados em um veículo, tal que água destilada ou em solução salina, solução salina tamponada com fosfato, soluções de dextrose a 5%, ou óleos. A solubilidade do análogo de GLP-2 pode ser aumentada, se desejado, através da incorporação de um agente de aumento da solubilidade, tais que detergentes e emulsificantes.
[00122] O portador ou veículo aquoso pode ser suplementado para o uso como substâncias injetáveis com uma quantidade de gelatina que serve para depositar o análogo de GLP-2 no ou próximo ou sítio de injeção, para a sua liberação lenta ao sítio de ação desejado. Agentes de formação de gel alternativos, tais que o ácido hialurônico, podem ser também úteis como agentes de depósito.
[00123] Em uma modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. L- histidina dissolvida em água, de modo a obter concentrações finais de a partir de 0,5 mM a 300 mM, de modo preferido de 3 a 200 mM, de modo mais preferido de 20 a 100 mM;b. manitol para obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM; ec. ácido acético para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,05 a 100 mM, de modo mais preferido de 0,5 a 50 mM na solução.
[00124] A quantidade apropriada de composto terapêutico é adicionada de modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml. O pH sendo ajustado para um pH final de 4 a 8, de modo preferido de 6,5 a 7,5, de modo mais preferido de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, filtrada de modo estéril e distribuída ao interior de alíquotas apropriadas, em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é adicionalmente processada, conforme o caso, para um produto líquido ou para um produto liofilizado.
[00125] Em uma outra modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. L-histidina dissolvida em água para a obtenção de concentrações finais de a partir de 0,5 mM a 300 mM, de modo preferido de 3 a 200 mM, de modo mais preferido de 20 a 100 mM de L-histidina;b. L-Arginina de modo a obter até 200 mM, de modo preferido de 0,5 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM;c. manitol, de modo a obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM; ed. ácido acético para a obtenção de até 200 mM, de modo preferido de 0,05 a 100 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM: e
[00126] A quantidade apropriada do composto terapêutico é adicionada de modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml.
[00127] O pH é ajustado para o pH final de 4 a 8, de modo preferido de 6,5 a 7,5, de modo mais preferido de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, é filtrada de modo estéril e distribuída ao interior de alíquotas apropriadas em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é processada, de modo adicional, conforme o caso, para um produto líquido ou para um produto liofilizado.
[00128] Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. L-histidina dissolvida em água para a obtenção de concentrações finais de até 200 mM, de modo preferido de 3 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM de L-histidina;b. L- arginina para a obtenção de até 200 mM, de modo preferido de 0,5 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM;c. manitol para obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM; ed. ácido acético para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,05 a 100 mM, de modo mais preferido de 0,5 a 50 mM na solução.
[00129] A quantidade apropriada do composto terapêutico é adicionada de modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml, o pH sendo ajustado para um pH final de 4 a 8, de modo preferido de 6,5 a 7, 5, de modo mais preferido de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, filtrada de modo estéril e dispensada em alíquotas apropriadas, em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é adicionalmente processada, conforme o caso, para um produto líquido ou liofilizado.
[00130] Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. L-histidina dissolvida em água para obter concentrações finais de a partir de 0,5 a 300 mM, de modo preferido de 3 a 200 mM, de modo mais preferido de 20 a 100 mM de L-histidina;b.L-arginina para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,5 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM;c. manitol para obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM; ed. ácido acético para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,05 a 100 mM, de modo mais preferido de 0,5 a 50 mM em solução.
[00131] A quantidade apropriada de composto terapêutico é adicionada de modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml, o pH sendo ajustado para o pH final de 4 a 8, de modo preferido de 6,5 a 7,5, de modo ainda mais preferido de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, filtrada de modo estéril e distribuída ao interior de alíquotas apropriadas, em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é adicionalmente processada, conforme o caso, para um produto líquido ou para um produto liofilizado.
[00132] Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. L- histidina dissolvida em água para obter concentrações finais de até 200 nM, de modo preferido de 3 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM de L-histidina;b. L- Arginina para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,5 a 100 mM, de modo mais preferido de 5 a 50 mM;c. manitol para obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM: ed. ácido acético para obter até 200 mM, de modo preferido de 0,05 a 100 mM, de modo mais preferido de 0,5 a 50 mM em solução.
[00133] A quantidade apropriada de composto terapêutico é adicionada e modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml, o pH sendo ajustado para um pH final de 4 a 8,m de modo preferido de 6,5 a 7,5, e modo mais preferido de 6, 7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, filtrada de modo estéril e distribuída ao interior de alíquotas apropriadas, em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é adicionalmente processada, conforme o caso, para um produto líquido ou um produto liofilizado.
[00134] Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a formulação compreende:a. N-acetato dissolvido em água para obter concentrações finais de até 200 mM, de modo preferido de 0,5 a 100 mM, de moldo mais preferido de 5 a 50 mM de L- histidina;b. manitol para obter até 350 mM, de modo preferido de 30 a 300 mM, de modo mais preferido de 100 mM a 230 mM.
[00135] A quantidade apropriada de composto terapêutico sendo adicionada de modo a obter concentrações de a partir de 1 a 100 mg/ml, de modo preferido de 5 a 50 mg/ ml, de modo mais preferido de 10 a 30 mg/ ml, o pH sendo ajustado para um pH final de 4 a 8, de modo preferido de 6,5 a 7,5, de modo ainda mais preferido de 6,7 a 7,3. A solução resultante é ajustada para o peso objetivado, filtrada de modo estéril e distribuída ao interior de alíquotas apropriadas, em frascos para o uso farmacêutico. A formulação é adicionalmente processada, conforme o caso, para um produto líquido ou para um produto liofilizado.
[00136] Os análogos de GLP-2 da invenção podem ser também formulados sob a forma de um dispositivo de implantação para a administração estendida e sustentada do análogo do peptídeo GLP-2. Tais formulações de liberação sustentada podem estar sob a forma de um adesivo posicionado externamente sobre o corpo. Exemplos de formulações de liberação sustentada incluem compósitos de polímeros biocompatíveis, tais que poli(ácido láctico), poli(ácido láctico-co-glicólico), metil celulose, ácido hialurônico, ácido siálico, silicato, colágeno, lipossomas, e os similares. As formulações de liberação sustentada podem ser de interesse particular quando e desejável produzir uma alta concentração local de um análogo de GLP-2 da invenção.
[00137] O análogo de GLP-2 pode ser utilizado sob a forma de um frasco ou ampola enchido de modo estéril contendo uma quantidade intestinotrópica do peptídeo, seja em quantidades de dose unitária ou de doses múltiplas. O frasco ou ampola pode conter o análogo de GLP-2 e o veículo desejado, como uma formulação pronta para a administração. De modo alternativo, o frasco ou ampola pode conter o peptídeo de GLP-2 em uma forma, tal que uma forma liofilizada, adequada para a reconstituição em um veículo adequado, tal que água estéril ou solução salina tamponada com fosfato.
[00138] Como uma alternativa para formulações injetáveis, o análogo de GLP-2 pode ser formulado para a administração através de outras vias. Formas de dosagem orais, tais que comprimidos, cápsulas e os similares, podem ser formulados de acordo com a prática farmacêutica padrão. De acordo com a presente invenção, o análogo de GLP-2 é administrado de modo a tratar os indivíduos que iriam se beneficiar a partir do crescimento do tecido do intestino delgado.
[00139] Formas de dosagem nasais podem ser formuladas com a adição de agentes de intensificação, tais que Quitosano ou detergentes, tais que Tween 20, Tween 80, Poloxâmeros, por exemplo Pluronic F-68, Pluronic F127, Brij 35, Brij 72, Cremophor EL.
[00140] Os compostos de peptídeo da presente invenção podem ser usados isoladamente, ou em combinação com compostos tendo um efeito antiinflamatório. Sem estarmos limitados pepla teoria é considerado que tal tratamento combinado pode reforçar os efeitos de tratamento benéficos dos presentes análogos de peptídeo.
[00141] O regime e a dosagem terapêutica mais apropriados para o tratamento do paciente irão, naturalmente, variar com a doença ou a condição a serem tratados, e de acordo com o peso do paciente e outros parâmetros. Sem desejarmos estar limitados por qualquer teoria particular, é esperado que doses, na faixa de μg/ kg, e a duração mais curta ou mais longa ou frequência de tratamento pode produzir resultados terapeuticamente úteis, tais que um aumento estatisticamente significativo, em particular na massa do intestino delgado. Em alguns casos, o regime terapêutico pode incluir a administração de doses de manutenção, apropriadas para a prevenção da regressão do tecido que ocorre após cessar o tratamento inicial. Os tamanhos de dosagem e o regime de dose mais apropriados para o uso humano podem ser guiados através dos resultados obtidos através da presente invenção, e podem ser confirmados em ensaios clínicos apropriadamente planejados.
[00142] Uma dosagem eficaz e o protocolo de tratamento podem ser determinados através de meios convencionais, partindo de uma baixa dose em animais laboratoriais e então aumentando a dosagem ao mesmo tempo em que os efeitos são monitorados, e variando, de modo sistemático, também o regime de dosagem. Numerosos fatores podem ser levados em consideração por um clínico quando da determinação de uma dosagem ótima para um determinado paciente. Tais considerações são conhecidas da pessoa versada na arte.
[00143] Uma dose humana de um peptídeo GLP-2 de acordo com a invenção pode, em uma modalidade, ser de cerca de 10 μg/ kg de peso corpóreo / dia a cerca de 10 mg/ kg/ dia, de modo preferido de cerca de 50 μg/ kg/ dia a cerca de 5 mg/ kg/ dia, e de modo mais preferido de cera de 100 μg/ kg/ dia a 1 mg/ kg/ dia.
Condições Médicas
[00144] Os peptídeos da presente invenção são úteis como um agente farmacêutico para prevenir ou tratar um indivíduo que sofra de distúrbios gastrointestinais, incluindo o trato gastrointestinal superior do esôfago, através da administração de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal do mesmo, tal como aqui descrito. Os distúrbios relacionados ao estômago e ao intestino incluem úlceras de qualquer etiologia (por exemplo, úlceras de peptídeo, úlceras induzidas por droga, úlceras relacionadas a infecções ou outros patógenos), distúrbios de digestão, síndromes de má absorção, síndrome do intestino curto, síndrome de cul-de-sac, doença intestinal inflamatória, sapinho celíaco (por exemplo, originário de enteropatia induzida por glúten ou doença celíaca), sapinho trópico, sapinho hipogamaglobulinêmico, enterite, colite ulcerativa, dano ao intestino delgado, diarréia / mucosite induzida por quimioterapia (CID).
[00145] Como acima mencionado, de modo geral, indivíduos que iriam obter benefício da massa do intestino delgado aumentada e consequente e/ ou manutenção da estrutura e função da mucosa do intestino delgado normal, são candidatos para o tratamento com os presentes análogos de GLP-2.
[00146] Condições particulares, que podem ser tratadas com o análogo de GLP-2 incluem as várias formas de sapinho, que incluem o sapinho celíaco, que resulta a partir de uma reação tóxica para alfa-gliadina a partir do calor e que pode ser um resultado de enteropatia induzida por glúten ou doença celíaca, e é marcado por uma perda significativa de vilos do intestino delgado; o sapinho tropical, que resulta a partir da infecção e é marcado pelo achatamento parcial dos vilos; sapinho hipogamaglobulinêmico, que é observado de modo usual em pacientes com imunodeficiência variável comum ou hipogamabulinemia e é marcado por um decréscimo significativo no peso do vilo. A eficácia terapêutica do tratamento com o análogo e GLP-2 pode ser monitorada pela biópsia entérica, de modo a examinar a morfologia do vilo, a avaliação bioquímica de absorção de nutriente, através do ganho de peso do paciente ou através da melhora dos sintomas associados com estas condições.
[00147] Outras condições, que podem ser tratadas com os análogos de GLP-2 da invenção, ou para as quais os análogos de GLP-2 podem ser úteis profilaticamente, incluem, em adição à enterite por radiação acima mencionada, enterite infecciosa e pós- infecciosa, e dano ao intestino delgado devido a agentes de câncer- quimioterapêuticos ou tóxicos.
[00148] Os análogos de GLP-2 podem ser também usados para o tratamento de desnutrição, por exemplo caquexia e anorexia.
[00149] Uma modalidade particular da invenção refere-se ao uso dos presentes peptídeos para a prevenção e/ou tratamento de disfunção e dano intestinal. Tal dano e disfunção é um efeito colateral bem conhecido do tratamento de câncer quimioterapia. A administração de quimioterapia está associada, de modo frequente, com os efeitos colaterais indesejáveis relacionados ao sistema gastrointestinal, tais que mucosite, diarréia, translocação bacteriana, má absorção, cólicas abdominais, sangramento gastrointestinal e vômitos. Estes efeitos colaterais são consequências clínicas do dano estrutural e funcional do epitélio intestinal e, com frequência, tornam necessário diminuir a dose e a frequência da quimioterapia. A administração dos presentes agonistas de peptídeo GLP-2 pode aumentar o efeito trófico nas criptas intestinais e prover rapidamente novas células para substituir o epitélio intestinal danificado, seguindo-se à quimioterapia. O último objetivo alcançado pela administração dos presentes peptídeos é o de reduzir a morbidez relacionada ao dano gastrointestinal de pacientes submetidos ao tratamento de quimioterapia, ao mesmo tempo em que criam um regime quimioterápico ótimo para o tratamento do câncer. O tratamento profilático ou terapêutico pode ser provido, de acordo com a presente invenção, a pacientes que estejam sendo submetidos ou que estejam prestes a ser submetidos à terapia de radiação.
[00150] As células tronco da mucosa do intestino delgado são particularmente suscetíveis aos efeitos citotóxicos da quimioterapia, devido à sua rápida taxa de proliferação (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632 -7). O dano induzido pela quimioterapia à mucosa do intestino delgado é clinicamente muitas vezes referida como a mucosite gastrointestinal e é caracterizada por prejuízos de barreira e de absorção do intestino delgado. Por exemplo, foi demonstrado que, os agentes quimioterapêuticos amplamente usados, 5-FU, irinotecano e metotrexato inibem a apoptose, conduzindo o vilo à atrofia e hiperplasia da cripta no intestino delgado de roedores (Keefe et al., Gut 47: 632 - 7, 2000; Gibson et al., J. Gastroenterol. Hepatol. Sep.; 18 (9): 1095 - 1100, 2003: Tamaki et al., J. Int. Med. Res. 31 (1) : 6-16, 2003). Foi demonstrado que os agentes quimioterapêuticos aumentam a apoptose nas criptas intestinais em 24 horas após a administração e subsequentemente diminuem a área do vilo, o comprimento da cripta, a contagem mitótica por cripta, e a altura do enterócito três dias após a quimioterapia em humanos (Keefe et al., Gut 2000; 47: 632 -7). Deste modo, as alterações estruturais no intestino delgado conduzem diretamente à disfunção intestinal e, em alguns casos, à diarréia.
[00151] A mucosite gastrointestinal após a quimioterapia de câncer é um problema crescente, que é essencialmente não- tratável uma vez estabelecido, embora ele, de modo gradual, apresente remissão. Os estudos conduzidos com as drogas de câncer citostáticas 5-FU e irinotecano demonstraram que a quimioterapia eficaz com estas drogas afeta, de modo predominante, a integridade estrutural e a função do intestino delgado, enquanto que o cólon é menos sensível e responde principalmente com a formação de muco aumentada (Gibson et al., J. Gastroentretol. Hepatol. Sep.; 18 (9) : 1095 - 1100, 2003; Tamaki et al., J. Int. Med. Res. 31 (1) 6-16, 2003).
[00152] Os novos análogos de GLP-2 da presente invenção podem ser úteis na prevenção e/ ou tratamento da lesão gastrointestinal e efeitos colaterais dos agentes quimioterapêuticos. Esta aplicação terapêutica potencialmente importante pode ser aplicada a agentes quimioterapêuticos correntemente usados, mas que não estão limitados a: 5-Fu, Altretamina, Bleomicina, Bussulfano, Capecitabina, Carboplatina, Carmustina, Cloroambucil, Cisplatina, Cladribina, Crisantaspase, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorubicina, Docetaxel, Doxorubicina, Epirubicina, Etoposídeo, Fludarabina, Doxorubicina, Leucovorina, Lomustina, Melfalano, Mercaptopurina, Mesna, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Permetrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Estreptozocina, Tegafur-uracila, Temozolomida, Tiotepa, Tioguanina/ Tioguanina, Topotecano, Treossulfano, Vinblastina, Vincristina, Vindesina, Binorelbina, Bleomicina, Bussulfano, Capecitabina, Carboplatina, Carmustina, Clorambucil, Cisplatina, Caldribina, Crisantaspase, Ciclofosfamida, Citarabina, Dacarbazina, Dactinomicina, Daunorubicina, Docetaxel, Doxorubicina, Epirubicina, Etoposídeo, Fludarabina, Fluorouracila, Gemcitabina, Hidroxicarbamida, Idarubicina, Ifosfamida, Irinotecano, Lipossomal doxorubicina, Leucovorina, Lomustina, Melfalano, Mercaptopurinas, Metotrexato, Mitomicina, Mitoxantrona, Oxaliplatina, Paclitaxel, Permetrexed, Pentostatina, Procarbazina, Raltitrexed, Estreptozocina, Tegafur-uracila, Temozolomida, Tiotepa, Tioguanina / Tioguanina, Topotecano, Treossulfano, Vinblastina, Vincristina, Vindesina e Vinorebina.
[00153] É considerado que os presentes peptídeos podem ser empregados em um método para tratamento de neonatos através da administração de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal do mesmo. Complicações com a alimentação de neonatos devido à falta de desenvolvimento do intestino e podem ser superados através do uso dos presentes agonistas de peptídeo.
[00154] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para tratamento de condições mediadas por DPP-IV (dipeptidilpeptidase -IV) através da administração a um paciente que esteja em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou um sal do mesmo. Tais doenças incluem condições, nas quais a enzima DPP- IV é superexpressada.
[00155] A composição farmacêutica pode, em uma modalidade, ser formulada de modo a causar uma baixa liberação do referido análogo de GLP- 2, ou um sal ou derivado do mesmo, tal como acima descrito.
[00156] É considerado que os presentes peptídeos podem ser empregados em um método para tratamento de neonatos através da administração de uma quantidade eficaz de GLP-2, ou de um sal do mesmo. Complicações com a alimentação de neonatos devido à falta de desenvolvimento do intestino podem ser superadas através do uso dos presentes agonistas de peptídeo.
[00157] Em uma outra modalidade, a invenção descreve um método para o tratamento de condições mediadas por DPP- IV (dipeptidilpeptidase - IV) através da administração a um paciente, que esteja em necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz de um análogo de GLP-2, ou de um sal do mesmo. Tais doenças incluem condições, nas quais a enzima DPP-IV é superexpressada.
EXEMPLOS:
[00158] Os exemplos que se seguem são providos de modo a ilustrar os aspectos preferidos da invenção e não têm a intenção de limitar o escopo da invenção.
Síntese de Peptídeo GeralAparelho e estratégia sintética
[00159] Os peptídeos foram sintetizados em batelada em um vaso de polietileno equipado com uma carga de polipropileno para a filtração usando 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc) como um grupo de proteção N-α-amino e grupos de proteção comuns adequados para as funcionalidades de cadeia lateral.Solventes
[00160] O solvente DMF (N,N- dimetilformamida, Riedel -de -Haen, Alemanha) foi purificado através da passagem de uma coluna compactada com uma resina de troca catiônica forte (ácido forte Lewatit S 100 MB/ H, Bayer Ag, Leverkusen, Alemanha) e analisado quanto a aminas livres anes do uso através da adição de 3,4-diidro-3-hidróxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH) dando origem a uma cor amarela (Dhbt-OH-ânion) se aminas livres estiverem presentes. O solvente DCM (diclorometano, grau analítico, Riedel-de-Haen, Alemanha) foi usado diretamente, sem purificação. Acetonitrila (grau HPLC, Lab- Scan, Dublin, Irlanda), foi usado diretamente, sem purificação.
Aminoácidos
[00161] Aminoácidos protegidos com Fmoc foram adquiridos de Advanced Chem Tech (ACT) em formas protegidas por cadeia lateral adequadas.
Reagentes de Acoplamento
[00162] O reagente de acoplamento diisopropilcarbodiimida (DIC) foi adquirido de Reidel-de Haen, Alemanha.
Suportes Sólidos
[00163] Os peptídeos foram sintetizados em resinas TentaGel S 0,22 - 0,31 mmmol/ g. TentaGel S- Ram, TentaGel S RAM - LYs (Boc) Fmoc (polímeros Rapp, Alemanha) foram usados em casos em que um peptídeo amidado C-terminal foi preferido, enquanto que TentaGel S PHB, TentaGel S PHB Lys (Boc) Fmoc foram usados quando um ácido carboxílico livre C- terminal foi preferido.
Catalisadores e outros reagentes
[00164] Diisopropiletilamina (DIEA) foi adquirida de Aldrich, Alemanha, piperidina e piridina de Riedel-de-Haen, Frnakfurt, Alemanha, 3,4-diidro-3-hidróxi-4-oxo-1,2,3-benzotriazina (Dhbt-OH), 1- hidroxibenzotriazol (HOBt) (HOAt) foram obtidos de Fluka, Suíça. O anidrido acético foi obtido de Fluka.
Procedimentos de Acoplamento
[00165] Os aminoácidos foram acoplados como os ésteres HObt ou HOAt gerados in situ, produzidos a partir de aminoácidos N-a- protegidos e HObt ou HOAt através de DIC em DMF. As acilações foram verificadas através do teste de ninidrina, executado a 80 °C, de modo a evitar a desproteção de Fmoc durante o teste (Larsen, B. D. and Holm., A. Int. J. Peptide Protein Res. 43, 1994, 1-9).
Desproteção do grupo de proteção N-α-amino (Fmoc)
[00166] A desproteção do grupo Fmoc foi executada através de tratamento com 20% de piperidina em DMF (1 x 5 e 1 x 10 minutos), seguida por lavagem com DMF (5 x 15 ml, 5 minutos cada) até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição de Dhbt-OH do DMF drenado. Acoplamento dos ésteres de HOBt
[00167] 3 equivalentes do aminoácido N-α-aminoprotegido foram dissolvidos em DMF, junto com 3 equivalentes de HOBt e 3 equivalentes de DIC e então adicionados à resina.
Clivagem de peptídeo a partir da resina com ácido
[00168] Os peptídeos foram clivados a partir das resinas através de tratamento com 95% de ácido trifluoroacético (TFA, Riedel-de-Haen, Frankfurt, Alemanha) água v/v ou com 95% de TFA e 5% de etanoditiol v/v, em temperatura ambiente durante 2 horas. As resinas filtradas foram lavadas com 95% de TFA- água e os filtrados e as lavagens evaporados sob pressão reduzida. O resíduo foi lavado com éter e secado por congelamento a partir de ácido acético- água. O produto secado por congelamento bruto foi analisado através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e identificado através de espectroscopia de massa (MS).
Síntese de peptídeo em batelada em resina TentaGel (PEG- PS)
[00169] Resina TentaGel (1 g, 0, 23-0,24 mmol/g) foi colocada em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração. A resina foi intumescida em DMF (15 ml), e tratada com 20% de piperidina em DMF, de modo a remover o grupo Fmoc inicial, seja no agente de ligação TentaGel S RAM ou no primeiro aminoácido na resina TentaGel S RAM-Lys (Boc)Fmoc. A resina foi drenada e lavada com DMF até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição de Dhbt-OH ao DMF drenado. Os aminoácidos de acordo cm a sequência foram acoplados como os ésteres de HObt protegidos com Fmoc previamente formados (3 equivalentes) tal como acima descrito. Os acoplamentos foram continuados durante 2 horas, a não ser que especificado de outro modo. A resina foi drenada e lavada com DMF (5 x 15 ml, 5 minutos cada) de modo a remover o reagente em excesso. Todas as acilações foram verificadas pelo teste de ninidrina, tal como acima descrito. Após completada a síntese, o peptídeo - resina foi lavado com DMF (3 x 15 ml, 5 minutos cada), DCM (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e finalmente éter dietílico (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e secado in vacuo. O peptídeo foi clivado a partir da resina, como antes descrito, e o produto do peptídeo bruto foi analisado e purificado, tal como abaixo descrito.
Condições de HPLC
[00170] A análise de HPLC gradiente foi executada usando um sistema Hewlett Packard HP 1100 HPLC, que consiste de uma Bomba Quaternária HP 1100, um Coletor de Amostras HP 1100, um Termostato de Coluna HP 1100 e um Detector de Comprimento de Onda Múltiplo HP 1100. O Chemstation Hewlett Packard para software LC (rev. A. 0601) foi usado para o controle de instrumentos e para a aquisição de dados. As colunas que se seguem e o sistema de tampão HPLC foram usados:
[00171] Coluna: VYDAC 238TP5415, C-18, 5 mm, 300 Â, 150 x 4,6 mm.
[00172] Tampões: A : 0,1% TFA m MQV; B: 0,085% de RFA, 10% MQV, 90% MeCN.
[00173] Gradiente : 0-1,5 min 0% B1,5-25 min 50% B25-30 min 100% B30-35 min 100% B35-40 min 0% B
[00174] Fluxo 1 ml/ min, temperatura do forno 40°C, detecção UV : I = 215 nm.
Purificação por HPLC do peptídeo bruto
[00175] Os produtos do peptídeo bruto foram purificados na Workstation PerSpetive BioSystems VISION. O software VISION 3.0 foi usado para o controle de instrumentos e a aquisição de dados. Foroam usados a coluna que se segue e o sistema de tampão de HPLC:
[00176] Coluna: Kromasil KR 100 Â, 10 mm C-8, 250 x 50,8 mm.
[00177] Sistema de Tampão: Tampões: A : 0,1 % TFA em MQV; B: 0,085% TFA, 10% MQV, 90 % MeCN.
[00178] Gradiente: 0-37 min. 0-40% B
[00179] Fluxo: 3 5 ml/ min, detecção UV : I+ 215 nm e 280 nm.
Espectroscopia de Massa
[00180] Os peptídeos foram dissolvidos em metanol super gradiente (Labscan, Dublin, Irlanda), água milli- Q (Millipore, Bedford, MA) e ácido fórmico (Merck, Darmstadt, Alemanha)(50 : 50 : 0,1 v/v/v) para fornecer concentrações de entre 1 e 10 mg/ ml. As soluções de peptídeo (20 ml) foram analisadas em modo de polaridade positivo através de ESI-TOF-MS usando um espectômetro de massa LCT (Micromass, Manchester, UK), acurácia de +/ - 0,1 m/z.
Procedimento sintético geral
[00181] Em todas as sínteses, resina TentaGel-S-Ram seca (1 g, 0, 22 - 0,31 mmol/g) foi colocada em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração. A resina foi intumescida em DMF (15 ml), e tratada com 20% de piperidina em DMF de modo a assegurar a presença de grupos amino não-protonados na resina. A resina foi drenada e lavada com DMF até que nenhuma cor amarela pudesse ser detectada após a adição de Dhbt ao DMF drenado. Os aminoácidos de acordo com a sequência foram acoplados como os ésteres de HObt protegido com Fmoc previamente formados (3 equivalentes), tal como acima descrito. Os acoplamentos foram continuados durante 2 horas, a não ser que especificado de outro modo. A resina foi drenada e lavada com DMF (5 x 15 ml, 5 minutos cada) de modo a remover o reagente em excesso. Todas as acilações foram verificadas pelo teste de ninidrina, executado a 80°C. Após completada a síntese, o peptídeo - resina foi lavado com DMF (3 x 15 ml, 5 minutos cada), DCM (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e finalmente com éter dietílico (3 x 15 ml, 1 minuto cada) e secado in vacuo. O peptídeo foi então clivado a partir da resina, como acima descrito, e secado por congelamento. Após a purificação usando o HPLC preparativo, tal como acima descrito, o produto do peptídeo foi coletado e a identidade do peptídeo foi confirmada através de S-MS. Este procedimento foi usado para a síntese de todos os peptídeos adicionalmente exemplificados abaixo.
Compostos Sintetizados
[00182] Usando as técnicas acima, os compostos 1809 a 1861 e o composto de referência 1559 (H- [Gly2] hGLP-2-OH) foram sintetizados usando os métodos acima descritos (Tabela 1).Tabela 1: Compostos Sintetizados
Figure img0001
Exemplo 1 : Síntese do Composto 1846H-His-Gly-Glu-Gly -Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr -Ile-Leu-Asp- Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys-Ile-Thr- Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 em TentaGel S RAM-Lys (Boc)Fmoc.
[00183] TentaGel S RAM -LYs (Boc)Fmoc Seco (0,24 mmol/ g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração e tratado como descrito sob “batchwise peptide Synthesis on TentaGel resin” até acabar o acoplamento de Histidina N- terminal. Todos os acoplamentos foram continuados durante a noite. As acilações foram verificadas como precedentemente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N- terminal, o peptídeo foi clivado a partir da resina, tal como acima descrito. Após a purificação usando HPLC preparativo, tal como precedentemente descrito, 28,8 mg do produto do peptídeo foram coletados com uma pureza superior a 90% e a identidade do peptídeo foi confirmada através de MS (verificado M 4315, 38, calculado M 4315, 41).Exemplo 2: Síntese do Composto 1848
[00184] H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp - Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys- Ile-Thr-Asp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2 em TentaGel S RAM-Lys (Boc)Fmoc.
[00185] TentaGel S RAM -Lys(Boc)Fmoc seco (0,24 mmol/ g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração e tratado como descrito sob “ batchwise peptide Synthesis on TentaGel resin “ até o final do acoplamento de Histidina N-terminal. Todos os acoplamentos foram continuados durante a noite. As acilações foram verificadas como precedentemente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N- terminal, o peptídeo foi clivado a partir da resina, tal como acima descrito. Após a purificação usando HPLC preparativo, tal como precedentemente descrito, 230 mg do produto do peptídeo foram coletados com uma pureza superior a 90% e a identidade do peptídeo foi confirmada através de MS (verificado M 4313, 63, calculado M 4313, 45).Exemplo 3: Síntese do Composto 1855
[00186] H-His-Gly-Glu-Gly-Ser-Phe-Ser-Ser-Glu-Leu-Ser-Thr-Ile- Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys- Ile-Thr-Asp-NH2 em TentaGel S RAM-Asp (OtBu)Fmoc.
[00187] TentaGel S RAM -Lys(OtBu)Fmoc seco (0,2 mmol/ g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração e tratado como descrito sob “ batchwise peptide Synthesis on TentaGel resin “ até o final do acoplamento de Histidina N- terminal. Todos os acoplamentos foram continuados durante a noite. As acilações foram verificadas como precedentemente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N- terminal, o peptídeo foi clivado a partir da resina, tal como acima descrito. Após a purificação usando HPLC preparativo, tal como precedentemente descrito, 27,3 mg do produto do peptídeo foram coletados com uma pureza superior a 96 % e a identidade do peptídeo foi confirmada através de MS (verificado M 3547, calculado M 3546, 84).Exemplo 4: Síntese do Composto 1857
[00188] H-His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-ser-Ser-Glu-Leu-Ala-Thr-Ile- Leu-Asp-Ala-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Ile-Ala-Thr-Lys- Ile-Thr-Asp-NH2 em TentaGel S RAM-Asp (OtBu)Fmoc.
[00189] TentaGel S RAM -Lys(OtBu)Fmoc seco (0,2 mmol/ g, 1 g) foi colocado em um vaso de polietileno equipado com um filtro de polipropileno para a filtração e tratado como descrito sob “ batchwise peptide Synthesis on TentaGel resin “ até o final do acoplamento de Histidina N- terminal. Todos os acoplamentos foram continuados durante a noite. As acilações foram verificadas como precedentemente descrito. Após completada a síntese e a desproteção do grupo Fmoc N- terminal, o peptídeo foi clivado a partir da resina, tal como acima descrito. Após a purificação usando HPLC preparativo, tal como precedentemente descrito, 39,3 mg do produto do peptídeo foram coletados com uma pureza superior a 94 % e a identidade do peptídeo foi confirmada através de MS (verificado M 3544,88 calculado M 3544, 86).Exemplo 5: Síntese do Composto 1846 A (sal de acetato)
[00190] Troca de contra- íon de trifluoroacetato para acetato do Composto 1846
[00191] O produto de peptídeo sintético purificado do composto 1846 é isolado como um sal de trifluoroacetato, devido à presença do ácido trifluoroacético (0,1 % v/v) nos tampões d e HPLC, usados para a purificação do produto de peptídeo sintético bruto.
[00192] De modo a trocar o contra-íon de trifluoroacetato pelo acetato, uma solução de peptídeo foi passada através de uma coluna compactada com resina de troca iônica de base forte no acetato (Dowex 1 x 8). 365 mg do Composto 1 são dissolvidos em 40 ml de água. A solução é passada através de uma coluna contendo 40 ml de resina de troca iônica de base forte no acetato (Dowex 1 x 8; capacidade 1,33 meq/ ml resina). A resina é então lavada com 4 x 30 ml de água e o eluado é coletado e liofilizado resultando em 312 mg de sal de acetato com uma pureza de acordo com a análise de HPLC de 97%.Exemplo 6. Síntese do Composto 1848b C (sal de cloreto)
[00193] A troca de contra- íon de trifluoroacetato (Tfa) para cloreto (CI-) do Composto 1848.
[00194] 100 mg do Composto 1 foram dissolvidos em 50 ml do ácidoclorídrico 0,1 M e a solução resultante foi liofilizada. O remanescente foi dissolvido em 50 ml de água e novamente liofilizado resultando em 80 mg do sal de cloreto com uma pureza de acordo com HPLC de 93%.Exemplo 7 - Teste de Estabilidade Química
[00195] Os análogos de GLP-2 foram dissolvidos em água purificada e subsequentemente diluídos em soluções contendo HCL, NaOH, H2O2 ou NH4HCO3. As soluções foram incubadas a 40°C de modo a produzir os produtos de hidrólise, desamidação e oxidação. As amostras foram analisadas através de RP-HPLC e o percentual do composto intacto remanescente foi determinado como uma medida para a estabilidade relativa. Os produtos de degradação principais foram identificados, através de tentativa, por LC-MS. Os peptídeos usados estão relacionados na Tabela 3.Tabela 2. Análogos de GLP-2 testados e comparados quanto à estabilidadequímica
Figure img0002
[00196] O composto ZP 1559, Gly2- GLP-2, foi usado como umareferência para outros análogos de GLP-2 testados. Nos análogos de GLP-2, as posições em que a sequência difere do composto de referência ZP 1559 são apresentadas em negrito. As sequências estão relacionadas na Tabela 3.
[00197] Os compostos estão relacionados como pares, de acordo com as suas sequências e com e sem a extensão K6 C-terminal.Tabela 3. Sequências de Gly2-GLP-2 e análogos de GLP-2
Figure img0003
[00198] As substâncias químicas usadas no experimento estão relacionadas na Tabela 4.Tabelas 4. Substâncias químicas e reagentes usados para os procedimentos analíticos
Figure img0004
[00199] A água foi primeiramente desmineralizada a uma resistência de > 18MQcm e então passada através de um sistema Milli-Q (Millipore, Bedford, USA). A água purificada Milli-Q (MQW) foi finamente conduzida através de um filtro estéril de 0,22 μm (Millipak 40 Gamma Gold, Millipore).
[00200] Os análogos de GLP-2 testados e a referência Gly2- GLP-2, ZP 1559, foram dissolvidos em água e subsequentemente diluídos em soluções contendo HCl, NaOH, H2O2 ou NH4HCO3. As amostras foram incubadas a 40°C para gerar os produtos de hidrólise, desamidação e oxidação, respectivamente. Os produtos foram analisados através de RP- HPLC quanto à pureza do pico principal original através de LC-MS para a confirmação da identidade através da massa do pico principal e dos produtos de degradação principais.Preparação de soluções de estresse:HCl 0,2 M : 4 ml MQW e 1 ml de HCl 1 MNaOH 0,02 M: 4 ml MQW e 1 ml de NaOH 0,1 MNH4HCO3, pH 8: 0, 79 g de NH4HCO3 foram dissolvidosem 50 ml de MQW.1% de H2O2: 5,8 ml de MQW e 0,2 ml de 30% deH2O2.
Soluções da Amostra:
[00201] Os análogos de GLP-2 foram primeiramente dissolvidos em MQW a uma concentração de 4 mg/ ml e então adicionalmente diluídos nas soluções de estresse em uma razão de 1:1 (por exemplo, 125 μl mais 125 μl). As concentrações finais foram de 2 mg/ ml dos análogos de GLP-2 para condições de estresse com HCl 0,1 M, NaOH 0,01 M, NH4HCO3 e 0, 5% de H2O2, respectivamente.
[00202] As soluções foram incubadas a 40°C no escuro e então diluídas com o Eluente A, a uma concentração de 0,5 mg/ ml (adição de 750 μl) antes das análises por RP- HPLC e por LC-MS.Tabela 5. Condições para o teste de estresse
Figure img0005
RP-HPLC
[00203] As análises de RP- HPLC foram executadas em um sistema deHPLC da série Agilent 1100, sob o controle da ChemStation (software de Revisão A. 08. 0 3 [847]]) de Agilent Technologies, Inc. Os dados brutos e os resultados da integração de pico foram depositados no servidor ChemStoreC/S através do uso do software de Revisão B001. 03 de Agilent Technologies.Tabela 6. Método de RP-HPLC
Figure img0006
LC-MS
[00204] As análises de LC-MS foram executadas em um instrumentode HPLC de Agilent Technologies 1100, que consiste de um desgaseificador em linha, bomba de gradiente quaternária, um auto coletor, um forno de coluna, um detector de UV. O instrumento de HPLC possuía uma interface com um espectômetro de massa Micromass LCT (ESI-TOF), sob o controle do software Masslynx 3.5, de MicroMass, UK. Tabela 7. O método de LC-MS
Figure img0007
[00205] Os resultados são apresentados na Tabela 9 como a pureza do composto medida através de RP- HPLC após a incubação sob condições de estresse. Esta pureza é uma medida para o composto intacto após a incubação em soluções de estresse, em relação à pureza medida em T = 0. Estes resultados não levam em consideração os produtos de degradação ocultos, não observados por este método de RP-HPLC analítico.
[00206] Os produtos de degradação principais nas amostras de teste de estresse foram identificados através de tentativa pelo método LC-MS. Quaisquer isômeros para os compostos de origem e produtos de degradação menores não foram observados através deste método deste método de LC-MS analítico. As identificações por tentativa estão relacionadas nas Tabelas 11 a 15.
[00207] Os análogos de GLP-2 testados estão relacionados como pares de acordo com as suas sequências com e sem a extensão K6 C-terminal.Tabela 9. Pureza observada dos compostos de teste após incubação sobcondições de estresse
Figure img0008
Figure img0009
[00208] Os resultados para os compostos incubados em NaOH não estão relacionados, porque não pôde ser observada diferença na estabilidade. Os produtos de degradação e o pico principal possuem todos a mesma massa através de análise de LC-MS; estes compostos foram provavelmente racemizados ao longo do tempo. Os resultados na Tabela 9 mostram que os análogos de GLP-2 testados, de modo geral, são quimicamente mais estáveis do que a referência Gly2- GLP-2, ZP 1559.
[00209] Durante a hidrólise, os análogos de GLP-2 testados são mais estáveis do que a referência Gly2- GLP-2, ZP 1559, exceto quanto ao ZP1820 e ZP 1834. Isto se deve principalmente ao aminoácido Asp na posição 3. Glu preferivelmente a Asp pode minimizar a clivagem entre o aminoácido 3 e 4 Asp-Gly. Os outros análogos ZP GLP-2 testados possuem aproximadamente a mesma estabilidade e com uma tendência a uma estabilidade ligeiramente mais alta para os compostos sem K6 C-terminal, ZO 1855, Zp 1857 e ZP 1858. Esta diferença é explicada pelo aminoácido na posição 33 Asp. No composto sem K6 C-terminal, este aminoácido é C-terminal e uma clivagem entre o aminoácido 32 e 33 Tyr-Asp ocorre de modo mais lento do que para uma clivagem entre o aminoácido 33 e 34 Asp-Lys. A diferença na estabilidade se deve ao Asp e não ao K6 C-terminal.
[00210] Sob as condições de oxidação acelerada (H2O2, vide Tabela 10 e 13), os análogos de GLP-2 testados são muito mais estáveis do que a referência Gly2- GLP-2, ZP 1559. Isto se deve provavelmente à oxidação de Met na posição 10 em ZP 1559. Uma exceção é ZP 1855 e outros estudos serão necessários para explicar isto.
[00211] A estabilidade sob condições que promovem a desamidação (NH4HCO3), os análogos de GLP-2 testados são mais estáveis do que a referência Gly2-GLP-2, ZP 1559. Isto se deve provavelmente à sítios de desamidação severa em ZP 1559, Asn na posição 11, 16 e 24, que não estão presentes nas sequências para os análogos de GLP-2 testados.Identificação por tentativa de produtos de degradação principais através de LC-MSTabela 10. Sítios de clivagem principais em análogos de ZP GLP-2 e a referência ZP-1559
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Soluções estressadas por HClTabela 11. Análogos de GLP-2 incubados 12 dias a 40oC em HCl 0,1 M.
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na = não disponível, não foi calculado ou sugerido MW teórico.** A diferença e massa é o MW medido a partir do MW teórico para o pico principal ou para o composto sugerido.
[00212] Os resultados na Tabela 12 mostram que o peso molecular medido para os análogos de GLP-2 testados e a referência Gly2 -GLP-2, ZP 1559, correspondem ao peso molecular teórico.
[00213] Os produtos de degradação mais abundantes são a clivagem entre os aminoácidos 3 e 4; Asp e Gly em ZP 1559, ZP 1820 e ZP 1834. Quanto a compostos ZP 1846, ZP 1848 e ZP 1849, que são produtos de degradação com K6 C-terminal, correspondendo a uma perda de K6 C- terminal (Lys6) na posição 33-39, foram detectados. Quanto a compostos ZP 1855 e ZP 1857, que são produtos de degradação sem K6 C-terminal, correspondendo a uma perda de Asp C-terminal na posição 33, foram detectados.
[00214] Os produtos de degradação secundários detectados foram clivagem entre os aminoácidos 15 e 16 (Asp e Asn ou Asp e Ala), aminoácidos 4 e 5 (Gly e Ser), aminoácidos 21 e 22 (Asp e Phe).Soluções estressadas por H2O2Tabela 12. Análogos de GLP-2 incubados 3 dias a 40oC em 0,5 % de H2O2
Figure img0013
na = não disponível, não foi calculado ou sugerido MW teórico.* A diferença de massa é o MW medido a partir do MW teórico para o pico principal.
[00215] Os resultados na Tabela 13 mostram que o peso molecular medido para os análogos de GLP-2 testados e a referência Gly2 -GLP-2, ZP 1559, correspondem ao peso molecular teórico. Para ZP 1559, um produto de degradação principal com um MW de + 16, é observado que seria provavelmente os produtos oxidados de Met na posição 10. Quando a ZP 1820 e ZP 1834, é observado um produto de degradação principal com um Da de + 18. Eles poderiam ser provavelmente uma perda de água no precursor para uma desamidação. Em adição, os produtos secundários com MW de -2 Da são observados e poderiam ser desamidação em dois sítios. Produtos secundários com MW de + 16 Da são observados em todos os compostos e poderiam ser, provavelmente, a oxidação de Trp. Para os compostos ZP 1855, ZP 1857 e ZP 1858, que são todos sem K6 C-terminal, são detectados produtos de degradação com MW de - 137 Da e - 65 DA, correspondendo a uma perda de His na posição 1 e um produto de degradação não identificado, respectivamente.Soluções estressadas por NaOHTabela 13. Análogos de GLP-2 incubados durante 3 dias a 40°C em NaOH 0,01 M
Figure img0014
na = não disponível, não foi calculado ou sugerid o MW teórico.* A diferença de massa é o MW medido a partir do MW teórico para o pico principal.
[00216] As análises de LC-MS apresentam o mesmo peso molecular em todos os picos para cada composto. Isto significa que os produtos de degradação mais abundantes são provavelmente a racemização da forma L para D de um ou mais dos aminoácidos na sequência. O pico principal pode então ocultar um ou vários produtos racemizados, deste modo não tendo sido detectado peptídeo intacto ou pureza residual. Não puderam ser detectados produtos de degradação principais a partir da clivagem.Soluções estressadas por NH4HCO3Tabela 14. Análogos de GLP-2 incubados durante 6 dias a 40°C emNH4HCO3, pH 8
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na = não disponível, não foi calculado ou sugerido MW teórico* A diferença de massa é o MW medido a partir do MW teórico para o pico principal.
[00217] Os resultados na Tabela 14 mostram que o peso molecular medido para os análogos de GLP-2 testados e a referência Gly2- GLP-2, ZP 1559, correspondem a o MW teórico. Para ZP 1559, os produtos de degradação secundários com um MW de + 1Da são observados, os quais poderiam ser, de modo provável, produtos desamidados. Quanto a ZP 1820, ZP 1834 e ZP 1846, produtos de degradação secundários, com o mesmo MW que para o composto principal, são observados. Eles poderiam, de modo provável, ser produtos racemizados ou de desamidação. No entanto, a resolução MS do presente instrumento não foi adequada para confirmar ou rejeitar isto. Em adição, estes produtos poderiam estar presentes nos outros compostos, mas não detectados, pois eles poderiam estar oculatos sob o pico principal.
[00218] Todos os análogos de GLP-2 presentes testados apresentam melhor estabilidade química, comparados com o composto de referência GLy2 - GLP-2; 1559, sob condições de estresse para hidrólise, oxidação e desamidação. Os compostos 1820 e 1834 são menos estáveis do que os seis candidatos remanescentes, devido à hidrólise ácida. A estabilidade química mais alta foi observada quando o aminoácido A3 foi Glu em vez de Asp.
[00219] Não foi observada diferença significativa na estabilidade química dos seis candidatos remanescentes, exceto quanto a uma estabilidade ligeiramente melhor sem K6, o que é devido, principalmente, a um sítio estável após Asp, e à perda de - K6 em candidatos tendo -K6 C-terminal.Exemplo 8. Varredura quanto a efeitos de crescimento intestinal dos compostos em camundongos X57BL.
[00220] A capacidade dos presentes compostos para estimular o crescimento intestinal foi determinada em camundongos machos C 57BL. A grupos individuais de camundongos (n=6) foram fornecidos 30 nmol/ kg de cada composto, s. c, duas vezes ao dia, durante dez dias consecutivos. Para propósitos comparativos, a outros grupos de animais foram administrados ou uma dose equimolar de [Gly2] GLP-2 ou um veículo (solução salina tamponada com fosfato, pH 7, 4) no mesmo regime de dosagem. Vinte e quatro horas após a última dose de composto ter sido administrada, os camundongos foram sacrificados e o intestino delgado (do piloro ao ceco) e o cólon (intestino distal ao ceco) foram esvaziados e pesados. De modo a corrigir a ligeira diferença no peso corpóreo (BW), a massa orgânica do intestino delgado (SI) e do cólon foram expressas em relação a BW. O composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2 foi relatado como sendo capaz de estimular o crescimento gastrointestinal, tanto no esôfago, estômago, intestino delgado e cólon e de modo a avaliar as diferenças no padrão de crescimento induzido pelos compostos, o índice de sensibilidade do intestino delgado -cólon do composto X foi calculado como:(SI/ Cólon) x (SI/ Cólon)[Gly2] GLP-2 %
[00221] Os compostos com uma sensibilidade de intestino delgado - cólon superior ou igual a 1, 05 foram considerados relativamente seletivos para o intestino delgado (Tabela 15).
[00222] Os compostos com uma sensibilidade de intestino delgado- cólon menor do que ou iguala 0,95 foram considerados como relativamente seletivos para o cólon (Tabela 15).
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Resultados:
[00223] Os efeitos do crescimento intestinal dos presentes compostos de acordo com a invenção foram determinados com base na capacidade dos peptídeos para aumentar a massa de SI em um modo dependente de dose em relação ao efeito de doses equimolares do composto de referência não- seletivo [Gly2] GLP-2.
[00224] As descobertas a partir deste estudo demonstram que as variantes de GLP-2 tendo substituições de aminoácido nas posições 8, 16, 24 e/ ou 28 da sequência de GLP-2 do tipo selvagem apresentaram atividade biológica aumentada, comparada a [Gly2]GLP-2 em camundongos C57BL.Exemplo 9. Efeito de dose- resposta de compostos selecionados sobre o crescimento intestinal em camundongos C57BL
[00225] 1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 e 1857 foramselecionados como os compostos principais, pois estes compostos aumentaram a massa do intestino delgado em relação a [Gly2] GLP-2 (Exemplo 8, como aumentaram a estabilidade química em relação a [Gly2] GLP-2 sob condições de estresse (Exemplo 7. O efeito de dose- resposta de 1820, 1855, ZP 1846, 1858, 1849, 1848 e 1857 sobre a massa do intestino delgado foi determinado em camundongos C57BL machos. Aos grupos individuais (n= 6) dos camundongos foram administrados 5, 15, 45, 135 ou 405 nmol/ kg de cada composto, s.c., duas vezes ao dia, durante três dias consecutivos. Para propósitos comparativos, a outros grupos de animais foram administradas doses equimolares de [Gly2]GLP- 2 ou de veículo (solução salina tamponada com fosfato, pH 7, 4) no mesmo regime de dosagem entre quatro horas após a última dose de composto ter sido administrada, os camundongos foram sacrificados e o intestino delgado (do piloro ao ceco, esvaziado e pesado, de modo a determinar o efeito sobre a massa do intestino delgado.Resultados:
[00226] O efeito de 1820, 1855, 1846, 1858, 1849, 1848 e 1857 sobre a massa do intestino delgado, em relação ao efeito do composto de referência, [Gly] GLP-2 é mostrado nas Figuras 1-5. Em cada uma das doses testadas, o efeito de [Gly2]GLP-2 sobre o intestino delgado foi padronizado em 100%. Os efeitos do crescimento intestinal dos compostos 1820, 185, 1846, 1858, 1849, 1848 e 1857 de acordo com a invenção foram determinados com base na capacidade dos peptídeos para aumentar, em um modo dependente de dose, a massa do SI em relação ao efeito de doses equimolares de [Gly2] GLP-2. Com base nestas descobertas, podemos concluir que os análogos de GLP-2 contendo 8 substituições (G2, E3, T5, L10, A11, A16, A24, A28 com relação a GLP-2 1809) dão origem a um aumento significativo no peso do intestino delgado, comparado a camundongos tratados com [Gly2] GLP-2.
[00227] De modo particular, a substituição de Asp3 por Glu e de Asn16 por Ala e de Gln28 por Ala efetuam um aumento no peso do intestino delgado, em um modo seletivo, comparado ao do cólon (1839 ou 1840), em comparação com 1809). Deste modo, a substituição dos três aminoácidos Asp3, Asn16 e Gln28 resulta em um aumento eletivo do peso do intestino delgado em relação à massa do cólon.
[00228] Além disso, a substituição do Asp8 por Serina resulta em um aumento adicional na seletividade, deste modo resultando em um aumento suplementar no peso do intestino delgado, sem afetar, de modo significativo, o peso do cólon (1818, 1820, 1844, 1846, 1848, 1849, 1852, 1853, 1855, 1858).
[00229] As Figuras 1 a 4 mostram os resultados dos experimentos, nos quais o efeito de dose- resposta dos compostos exemplificados 1846, 1855, 1848, 1857, 1849 sobre a razão SI-BW para cólon- BW é mostrada em relação ao composto de referência [Gly2] GLP-2. Em cada uma das doses testadas, o efeito de [Gly2]GLP-2 sobre a massa do intestino delgado é padronizado em 100%. Todos os compostos exemplificados compartilham modificações nas posições 8, 16 e/ ou 28 e apresentam seletividade aumentada de modo a causar o crescimento do intestino delgado em relação ao cólon.Exemplo 10 - Efeito de dose- resposta de 1846, 1848, 1855 e 1 857 sobre a atrofia do intestino delgado em camundongos que receberam 5-FU
[00230] A rápida taxa de proliferação das células tronco do intestino delgado, as torna um alvo suscetível para os efeitos citotóxicos dos agentes quimioterapêuticos usados em terapias contra o câncer. Em consequência disto, o uso clínico do agente quimioterapêutico 5-fluorouracila (5-FU) está associado, de modo frequente, com a lesão do intestino delgado (atrofia e diarréia em pacientes com câncer). Foi previamente demonstrado que a administração i.p. de 50 mg/ kg de 5-FU uma vez ao dia, durante quatro dias, induz atrofia do intestino delgado significativa em camundongos C57BL. O efeito dos compostos principais 1846, 1848, 1855 e 1857 sobre a atrofia do intestino delgado induzida por 5-FU, uma vez ao dia, durante quatro dias, induz atrofia do intestino delgado significativa em camundongos C57BL. 1846, 1848, 1855 ou 1857 foram administrados, duas vezes ao dia, durante três dias, antes de 5-FU e durante quatro dias, junto com a administração de 5- FU. Os compostos principais foram administrados, cada qual, em cinco doses diferentes (5, 15, 45, 135 e 405 nmol/kg), que foram previamente demonstradas como estimulando, de modo efetivo o crescimento do intestino delgado em camundongos saudáveis (Exemplo 9). Para propósitos comparativos, um grupo de animais foi tratado com 405 nmol/kg [Gly2]GLP- 2. De modo a determinar o efeito de 5-FU sobre o intestino delgado, a um grupo de animais foi fornecido 5-FU isoladamente e deixado sem tratamento (controles 5-FU) e a outro grupo de animais foi administrado apenas o veículo (controles PBS).Resultados:
[00231] 5-FU induziu um decréscimo significativo no comprimento de SI-BW e de SI em camundongos C57BL, em relação aos controles PBS. O efeito de dose- resposta de 1846, 1848, 1855 ou 1857 sobre o comprimento de SI-BW e de SI em camundongos que receberam 5-FU é apresentado nas Figuras 6 a 9. O efeito de 405 nmol/ kg de [Gly2]GLP-2 é também mostrado. 1846, 1848, 1855 ou 1857 evitaram, em um modo dependente de dose, a atrofia de SI induzida por 5-FU e mantiveram SI- BW em níveis similares aos controles PBS. ZP 1848, ZP 1855 e ZP 1857, administrados em uma dose equimolar, foram significativamente mais eficazes do que 405 nmol/ kg [Gly2] GLP-2 sobre SI-BW. 1848 e 1857 foram significativamente mais eficazes do que 405 nmol/ kg de [Gly2] GLP-2 sobre o comprimento de SI.Exemplo 11. Efeito de dose resposta de 1846 sobre a atrofia do intestino delgado e diarréia em ratos SD que receberam 5-FU
[00232] O efeito do candidato clínico, 1846, sobre a atrofia e diarréia do intestino delgado induzida por 5-FU foi investigada em ratos SD. Foi previamente demonstrado que a administração i.p. de 75 mg/kg de 5-FU, uma vez ao dia, durante quatro dias, induz atrofia do intestino delgado significativa e diarréia em ratos SD. 1846 (16, 80 e 400 nmol/ kg/ d; n= 20 ratos/ grupo de dose) foi administrado, duas vezes ao dia durante três dias antes de 5-FU e durante quatro dias, junto com a administração de 5-FU. Os controles 5-FU e os controles PBS foram incluídos no estudo. Vinte e quatro horas após a última dose de 1846 Ter sido administrada, um subconjunto de animais foi sacrificado de modo a determinar o efeito de 1846 sobre a atrofia do intestino delgado. De modo a determinar o efeito de 1846 sobre a diarréia, todos os animais foram observados duas vezes ao dia (de manhã e à noite), durante o período de dosagem e durante um período adicional de seis dias. Em cada período de observação, foi atribuído a cada animal uma classificação (0, sem diarréia), 1 (brando) manchamento fecal em torno do ânus, 2 (moderado), manchamento fecal nos membros traseiros e na cauda e 3 (severo) manchamento fecal nos membros dianteiros e no abdômen) que indicaram se o animal havia ou não tido diarréia e a severidade da diarréia.Resultados:
[00233] 5-FU induziu um decréscimo significativo no comprimento de SI-BW e de SI e induziu diarréia em ratos SD, em relação aos controles PBS. O efeito de dose- resposta de 1846 sobre 5-FU induziu a atrofia do intestino delgado e diarréia e é mostrado nas Figuras 10 e 11. 1846 evitou a atrofia do intestino delgado induzida por 5-FU em um modo dependente de dose e manteve o comprimento de SI-NW e de SI em níveis similares aos controles. Na dose mais alta administrada (400 nmol/ kg), 1846 diminuiu a incidência e a severidade da diarréia em ratos que receberam 5-FU.Exemplo 12. Efeito de dose- resposta de 1846 sobre o comprimento da cripta- vilo e a espessura molecular no intestino delgado de ratos SD.
[00234] O efeito do candidato clínico, 1846, sobre o comprimento da cripta- vilo e a espessura muscular de ratos SD foi investigado. 1846 (0, 62, 3,41 ou 6,2 mg/ kg/ dia, n= 6 ratos/ grupo de dose) foi administrado como um bolo i.v., uma vez ao dia, durante cinco dias consecutivos. Vinte e quatro horas após a última dose ter sido administrada, os ratos foram sacrificados e uma biópsia de 1 cm foi extraída a partir do jejuno (30 cm distal da junção duodenal gástrica) e a partir do íleo (30 cm próxima a partir da junção ileocecal) para o processamento histológico.Resultados:
[00235] O efeito de dose- resposta de 1846 sobre o comprimento da cripta- vilo e a espessura muscular no jejuno e no íleo é apresentada na Figura 12. 1846 aumentou, em um modo dependente de dose, o comprimento da cripta- vilo no jejuno e a espessura muscular no íleo.Exemplo 13: Efeito de 1848 sobre os marcadores da inflamação do intestino delgado em um modelo induzido por indometacina de doença de Crohn
[00236] A doença de Crohn é uma doença crônica, que causa a inflamação episódica do intestino delgado. O efeito de 1848 do análogo de GLP-2 sobre a inflamação do intestino delgado em um modelo de doença de Crohn induzido por indometacina foi investigado. Demonstramos previamente que a administração de indometacina (s.c., uma vez ao dia durante 2 dias) induz a inflamação do intestino delgado caracterizada através de ulcerações e aumenta a citoquina pró- inflamatória, o fator alfa de necrose de tumor (TNF-α). De modo a determinar o efeito de ZP 1848 sobre a ulceração, 1848 (8, 40 e 200 nmol/ kg, s.c, duas vezes ao dia (9:00 e 16:00) foi administrado durante 4 dias antes da primeira dose de indometacina e durante um período adicional de dois dias, junto com a indometacina. O corticosteróide, prednisolona (10 mg/ kg, p.o) foi usado como um controle positivo, pois os corticosteróides são comumente usados no tratamento da inflamação ativa em doença de Crohn. Em adição, foi administrado a um grupo de animais tanto 1848 (200 nmol/ kg) e prednisolona, de modo a determinar os efeitos de um tratamento combinado. Vinte e quatro horas após a última dose de 1 848 ter sido administrada, os animais foram sacrificados e o intestino delgado foi suavemente varrido até que limpo e fixado. De modo a determinar a extensão da ulceração, o intestino foi aberto por corte ao longo da margem antimesentérica, suspenso em uma placa de polipropileno e manchado superficialmente com Alcian Green 3 BX. Iniciando no piloro, o intestino delgado foi escaneado e a forma (circular contra linear) e o tamanho (úlceras circulares : diâmetro, úlceras lineares : comprimento x largura) de todas as úlceras foram medidas usando uma régua padrão (resolução : 0, 5 mm). Uma úlcera foi definida como uma área que carecia de superfície epitelial. Finalmente, a área total danificada foi calculada para cada animal através da soma das áreas de todas as úlceras individuais.
[00237] De modo a determinar o efeito de 1848 sobre as concentrações de TNF-α no intestino delgado, 1848 e indometacina foram administrados, tal como acima descrito. No sacrifício, embora o intestino delgado tenha sido separado em três segmentos de igual comprimento (próximo, médio e distal), as concentrações de TNF -α foram medidas em cada um dos segmentos individuais, usando um kit ELISA comercialmente disponível.Resultados:
[00238] A indometacina causou uma forte indução das úlceras do intestino delgado, comparada ao grupo de controle (extensão estimada de ulceração de 333 ± 21 mm2 contra 10 mm2. O efeito de 1846 sobre a extensão de ulceração estimada (mm2) á apresentado na Figura 13. O tratamento com 1848 (8 nmol/ kg, 40 nmol/kg e 200 nmol/ kg, reduziu, de modo significativo, a extensão de ulceração (230 ± 12 mm2, 216 ± 17 mm2, e 178 ± 17 mm2, respectivamente p, 0,001 contra indometacina). Na dose mais alta (200 nmol/kg) o uso de ZP 18848 foi mais efetivo do que o controle positivo, prednisolona (p < 0,05).
[00239] A indometacina causou um aumento nos níveis de tecido de aproximadamente 2-9 vezes de TNF-α no segmento proximal (97 ± 14 pg/mg de proteína) comparado aos animais de controle (34 ± 7 pg/mg de proteína, p < 0,05 contra indometacina). O efeito de 1846 sobre as concentrações de TNF-α do intestino delgado é apresentado na Figura 14. O tratamento com 1848 (8, 40, ou 200 nmol/ kg), reduziu, de modo significativo, os níveis de TNF- α (45 ± 14 pg/ mg de proteína, 44 ± 9 pg/ mg de proteína e 45 ± 7 pg/ mg de proteína, respectivamente), sem diferença significativa entre as 3 doses.
[00240] A indometacina causou um aumento de aproximadamente 3,2 vezes nos níveis de tecido de TNF- α no segmento médio (108 ± 9 pg/ mg de proteína) comparado aos animais de controle (34 ± 6 pg/mg de proteína, p < 0,05 contra indometacina). 1848 (40 ou 200 nmol/kg) reduziu, de modo significativo, os níveis de TNF-α, respectivamente, p < 0,05 contra indometacina).
[00241] A indometacina causou um aumento de aproximadamente 1,7 vezes nos níveis de tecido de TNF-α no segmento distal (75 ± 5 pg/ mg de proteína comparado aos animais de controle (45 ± 3 pg / mg de proteína, p < 0,05 contra indometacina). 1848 apresentou um efeito inibidor sobre os níveis de TNF-α no segmento distal, mas o efeito foi menos pronunciado comparado aos outros segmentos. Prednisolona isoladamente não afetou, de modo significativo, os níveis de tecido de TNF-α em todos ou 3 segmentos, mas a administração de prednisolona aperfeiçoou o efeito inibidor de 1848 (200 nmol/ kg) sobre os níveis de TNF-α exclusivamente no segmento distal.Exemplo 14
[00242] Formulação de ZP1846, 10 mg/ml em Histidina, Manitol e Formulação de Acetato1. Encher 800 ml (WFI) de água em um béquer de 1 litro2. Pesar 13, 964 g de L-histidina em um béquer e adicionar ao béquer de 1 litro3. Pesar 32, 200 g de Manitol em um béquer e adicionar ao béquer de 1 litro4. Adicionar 629 μl de 100% de ácido acético diretamente ao interior do béquer de 1 litro ou pesar 12, 58 g de uma solução de ácido acético a 5% (p/v) e adicionar ao béquer.6. Encher aproximadamente 950 ml.7. Medir o pH e ajustar o pH para 6,9-7,0 com 10% de ácido acético ou Histidina 0,25 M, se necessário8. Pesar 11, 312 g da Substância da Droga (conteúdo de peptídeo 88, 4% e adicionar ao béquer.9. Encher 1,015 kg (= aproximadamente 1000 ml) e medir o pH, a osmolaridade e a densidade.10. Filtrar de modo estéril a formulação através de dois filtros estéreis conectados em série.11. Dispensar a formulação em alíquotas de 0,5 ml em uma bancada LAF ao interior de frascos farmaceuticamente aprovados.12. Colocar parcialmente as tampas em secagem por congelamento antes de carregá-las a um liofilizador, que tenha sido esterilizado e previamente resfriado a 4° C.13. Um ciclo de liofilização é executado durante 40,5 horas, consistindo de congelamento, recozimento, e de fases de secagem primária e de secagem secundária. Os frascos foram tampados sob nitrogênio enquanto que na câmara de liofilização.14. Os frascos são classificados e as vedações superiores e os prendedores são aplicados.Exemplo 15
[00243] Formulação de ZP 1846, 10 mg/ ml em histidina, arginina, manitol e trealose1. Encher 800 ml (WFI) de água em um béquer de 1 l2. Pesar 6, 206 g de L-histidina em um béquer e adicionar ao béquer de 1 l3. Pesar 3, 484 g de L-Arginina em um béquer e adicionar ao béquer de 1 l4. Pesar 33, 46 g de Manitol em um béquer e adicionar ao béquer de 1 l5. Pesar 11,16 g de Trealose em um béquer e adicionar ao béquer de 1 l6. Encher aproximadamente 950 ml7. Medir o pH e ajustar o pH para 6,9 - 7,0 com 10% de ácido acético ou Histidina 0, 25 M, se necessário.8. Pesar 11, 312 g da Substância da Droga (conteúdo de peptídeo 88, 4 %) e adicionar ao béquer9. Encher 1,015 kg (= aproximadamente 1000 ml) e medir o pH, a osmolaridade e a densidade. 10. Filtrar de modo estéril a formulação através de dois filtros estéreis conectados em série.11. Dispensar a formulação em alíquotas de 0, 5 ml em uma bancada LAF ao interior de frascos de 2 ml aprovados farmaceuticamente.12. Colocar parcialmente as tampas em secagem por congelamento antes de carregá-las ao interior de um liofilizador que tenha sido esterilizado ou previamente resfriado a 4°C.13. Um ciclo de liofilização é executado durante 40,5 horas, consistindo de congelamento, recozimento e de fases de secagem primária e secundária. Os frascos são tampados sob nitrogênio enquanto que na câmara de liofilização.14. Os frascos são classificados e as vedações superiores e os prendedores são aplicados.
[00244] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunção com as modalidades exemplares acima descritas, muitas modificações e variações equivalente serão evidentes para aqueles versados na arte, quando fornecidas nesta exposição. Deste modo, as modalidades exemplares da invenção expostas são consideradas como ilustrativas e não como limitativas. Várias alterações nas modalidades descritas podem ser introduzidas sem que haja afastamento do espírito e do escopo da invenção. Todos os documentos aqui citados são expressamente incorporados a este a título referencial.

Claims (23)

1. Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (GLP-2), caracterizado pelo fato de que é:1846 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (GLP-2), caracterizado pelo fato de que é:1848 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2; ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (GLP-2), caracterizado pelo fato de que é:1844 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2;1849 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2;1852 H-HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAWLIATKITDKKKKKK-NH2;1853 H-HGEGTFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2;1855 H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2;1857 H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2;1858 H-HGEGSFSSELATILDALAARDFIAWLIATKITD-NH2;ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
4. Análogo de peptídeo 2 tipo glucagon (GLP-2) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um análogo de GLP-2 como definido em uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal do mesmo, em mistura com um veículo.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o análogo de GLP-2 é um sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é formulada como um líquido adequado para administração por injeção ou infusão, ou que é formulada para causar liberação lenta do referido análogo de GLP-2.
8. Uso de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de um distúrbio relacionado ao estômago e ao intestino.
9. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e intestino é úlceras, gastrite, distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome do intestino curto, síndrome cul-de-sac, doença inflamatória intestinal, canal celíaco (por exemplo, decorrente de enteropatia induzida por glúten ou doença celíaca), sapinho tropical, sapinho hipogamaglobulinêmico, enterite, enterite regional (doença de Crohn), colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável associada à diarreia, lesão do intestino delgado ou síndrome do intestino curto.
10. Uso de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e ao intestino é enterite por radiação, enterite infecciosa ou pós-infecciosa ou danos no intestino delgado devido a agentes tóxicos ou outros quimioterápicos.
11. Uso de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de um efeito colateral da quimioterapia ou tratamento com radiação.
12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o efeito colateral é diarreia, cãibras ou vômitos abdominais devido à quimioterapia ou dano estrutural e funcional do epitélio intestinal resultante de quimioterapia ou radioterapia.
13. Uso de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de função intestinal comprometida em condições neonatais, osteoporose ou mediada por DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV).
14. Uso de um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma condição que envolve desnutrição.
15. Uso de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a condição que envolve desnutrição é caquexia ou anorexia.
16. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento e/ou prevenção de distúrbios relacionados ao estômago e intestinos, tratamento e/ou prevenção de um efeito colateral da quimioterapia ou tratamento com radiação ou tratamento da função intestinal comprometida em condições neonatais, osteoporose ou mediadas por DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV).
17. Análogo de GLP-2 para uso em um método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e intestino é úlceras, gastrite, distúrbios da digestão, síndromes de má absorção, síndrome do intestino curto, síndrome cul-de-sac, doença inflamatória intestinal, canal celíaco (por exemplo, decorrente de enteropatia ou doença celíaca induzida por glúten), sapinho tropical, sapinho hipogamaglobulinêmico, enterite, enterite regional (doença de Crohn), colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável associada à diarreia, lesão do intestino delgado ou síndrome do intestino curto.
18. Análogo de GLP-2 para uso em um método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o distúrbio relacionado ao estômago e intestino é enterite por radiação, enterite infecciosa ou pós-infecciosa ou danos no intestino delgado devido a substâncias tóxicas ou outras quimioterapêuticas agentes.
19. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de um efeito colateral de quimioterapia ou radioterapia.
20. Análogo de GLP-2 para uso em um método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o efeito colateral é diarreia, cãibras ou vômitos abdominais devido à quimioterapia ou dano estrutural ou funcional do epitélio intestinal resultante de quimioterapia ou radiação terapia.
21. Análogo de GLP-2 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser para uso em um método de tratamento da função intestinal comprometida em condições neonatais, obesidade, osteoporose ou mediada por DPP-IV (dipeptidilpeptidase-IV).
22. Kit terapêutico, caracterizado pelo fato de que compreenden um medicamento de quimioterapia para câncer e um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, opcionalmente em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
23. Composição farmacêutica, caracterizado pelo fato de que compreende um medicamento de quimioterapia para câncer e um análogo de GLP-2 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
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