ES2905545T3 - Proteínas de unión a calicreína plasmática - Google Patents

Proteínas de unión a calicreína plasmática Download PDF

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ES2905545T3 ES18185298T ES18185298T ES2905545T3 ES 2905545 T3 ES2905545 T3 ES 2905545T3 ES 18185298 T ES18185298 T ES 18185298T ES 18185298 T ES18185298 T ES 18185298T ES 2905545 T3 ES2905545 T3 ES 2905545T3
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Daniel J Sexton
Malini Viswanathan
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Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

Un ácido o ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (i) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (ii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (iii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (iv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (v) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** (vi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (vii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (viii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (ix) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (x) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xiii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xiv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xvi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL **(Ver fórmula)** (xvii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)** (xviii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de **(Ver fórmula)** y una secuencia VL de **(Ver fórmula)**

Description

descripción
Proteínas de unión a calicreína plasmática
Antecedentes
La calicreína plasmática es una serina proteasa. La precalicreína es el precursor de la calicreína plasmática.
Sumario
La calicreína plasmática es un componente de serina proteasa del sistema de contacto y una posible diana de fármacos para diferentes enfermedades inflamatorias, cardiovasculares, infecciosas (septicemia) y de oncología (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). El sistema de contacto se activa por cualquier factor XIIa tras la exposición a superficies extrañas o negativamente cargadas o sobre superficies de células endoteliales por prolilcarboxipeptidasas (FIGURA 1) (Sainz I.M. et al., Thromb Haemost 98, 77-83, 2007). La activación de la calicreína plasmática amplifica la coagulación intrínseca mediante su activación de factor XII de retroalimentación y potencia la inflamación mediante la producción del nonapéptido proinflamatorio bradiquinina. Como cininogenasa primaria en la circulación, la calicreína plasmática es ampliamente responsable de la generación de bradiquinina en la vasculatura. Una deficiencia genética en la proteína inhibidora de C1 (C1-INH), el principal inhibidor natural de la calicreína plasmática, conduce a angioedema hereditario (AEH). Los pacientes con AEH padecen ataques agudos de edema doloroso, frecuentemente precipitados por desencadenantes desconocidos (Zuraw B.L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Mediante el uso de agentes farmacológicos o estudios genéticos en modelos animales, el sistema calicreína plasmática-cinina (KKS plasmático) participa en diversas enfermedades.
El documento WO 2005/075665 describe una KLKB1 humana que se asocia con trastornos cardiovasculares, trastornos hormonales y del sistema endocrino, enfermedades metabólicas, enfermedades gastrointestinales y hepáticas, enfermedades inflamatorias, trastornos cancerosos, trastornos musculoesqueléticos, trastornos neurológicos y trastornos urológicos.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos inhibidores) son agentes terapéuticos útiles para una variedad de enfermedades y afecciones, por ejemplo, enfermedades y afecciones que implican la actividad de calicreína plasmática, debido a su alta potencia, especificidad y prolongada residencia en el suero. La alta potencia se puede traducir en eficacia y una baja dosificación de fármaco, y la alta especificidad puede reducir los efectos secundarios debido a la inhibición de serina proteasas inespecíficas relacionadas. En general, las serina proteasas de molécula pequeña no son tan específicas como los inhibidores de anticuerpos. La prolongada residencia en el suero puede permitir dosificación poco frecuente.
En algunos aspectos, la invención se refiere a una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática (por ejemplo, precalicreína plasmática humana y/o precalicreína plasmática de ratón), como se define en las reivindicaciones.
La invención proporciona un ácido o ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en:
(i) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EV QLLES GGGL V QPGGSLRLSC AAS GFTF SHYIMMWVRQ APGKGLEWV S GIY S S
GGITVYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVY Y CAYRRIGVPRRDE
FDIWGQGTMVTVS S
y una secuencia VL de
(ii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSS
GGITVYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C AYRRTGIPRRD A
FDIWGQGTMVTVS SASTKGPSVFPLAPS SKS
y una secuencia VL de
(iii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTIYADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVARGIAARSR
TSYFDYWGQGTLVTVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(iv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTI Y AD S VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARV ARGIAARSR
TSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSWPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QDIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQTPGQAPRLLIYGASS
RATGIPDRFSGTGY GTDFTLTISRLEPED Y GTYY CQQS SRTPWTF GQGTRVEIK;
(v) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTI YADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVARGIAARSR
TSYFDYWGQGTLVTVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(vi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTI YADS VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVARGIAARSR
TSYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTL
Q S GVPSRF S GS GS GTEFTLTIS SLQPEDF AT YY CQ QLNS YPLTF GGGTKVEIK;
(vii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPS
GGRTT Y AD S VKGRFTISRDN SKNTL YLQMNSLRAEDT AVYY C ARGGLLLWFRE
LKSNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRL
QSGVPSRLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR;
(viii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPS
GGRTT Y AD S VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARGGLLLWNRE
LKSNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRL
QSGVPSRLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR; (ix) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPS
GGRTTYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CARGGLLLWARE
LKSNYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRL
QSGVPSRLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR;
(x) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EYQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTIYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMVGQGIRGRSR
TSYFAQWGQGTLVTVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
ATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(xi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EV QLLESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFTFSD YMMAWVRQ APGKGLEWV S SIVPS
GGHTH Y AD S VKGRF TISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVARGIAARS
RTS YFD YWGQGTLVTVS S
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
AT GIPDRFS GS GS GTDFTLTISRLEPEDF AVYY CQ Q S SRTPWTF GQGTKVEIK;
(xii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTIYADS VKGRF TISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVAQGIAARSR
TSSVDQWGQGTLVTVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
AT GIPDRFS GS GS GTDFTLTISRLEPEDF AVYY CQ Q S SRTPWTF GQGTKVEIK;
(xiii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPS
GGHTI YADS VKGRF TISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C ARVAQGIS ARSR
TSYFDYWGQGTLVTVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQ SPGTLSLSPGERATLS CRTSQFVN SNYLAWYQQKPGQ APRLLIY GAS SR
AT GIPDRFS GS GS GTDFTLTISRLEPEDF AVYY CQ Q S SRTPWTF GQGTKVEIK;
(xiv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EV QLLESGGGLV QPGGSLRLSC AAS GFTF SHYIMMWVRQ APGKGLEWV S GIY S S
GGITVYADS VKGRF TISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C AWRRIGVPRRD S
FDMWGQGTMVTVSS
y una secuencia VL de
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLES
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMHWVRQAPGKGLEWVSSIYPSR
GMTWYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY CAYRRTGIPRRDA
FDIWGQGTMVTVSS
y una secuencia VL de
DIQMTQSPSTLSASYGDRYTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLES
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xvi) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
E V QLLES GGGL V QPGGSLRLSC AAS GFTF SHYIMMWVRQ APGKGLEWV S GIY S S
GGITVYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGVPRRDE
FDIWGQGTMVTVSS
y una secuencia VL de
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTTTCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLES
GVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xvii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYTMVWVRQAPGKGLEWVSYIYP
SGGATFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMGSYDYIWG
FYSDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QSALTQPPTVSVSPGQTARITCSGNKLGDKYVAWYQQKPGQSPMLVIYQDTKRP
SRVSERFSGSNSANTATLSISGTQALDEADYYCQAWDSSIVIFGGGTRLTVL;
y
(xviii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYRMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPS
GGRTVY AD S VKGRFTISRDN SKNTLYLQMN SLRAEDTAVYY C AKDKFEWRLLF
RGIGNDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
Figure imgf000005_0001
La invención proporciona además un vector o vectores que comprenden el ácido o ácidos nucleicos de la invención. La invención proporciona además una célula hospedadora que comprende el ácido o ácidos nucleicos de la invención o el vector o vectores de la invención.
La invención proporciona además un método para producir un anticuerpo que se une a la forma activa de la calicreína plasmática humana y no se une a la precalicreína humana, que comprende
cultivar la célula hospedadora de la invención en un medio de cultivo, para producir de esta manera el anticuerpo. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento y no se une a precalicreína plasmática.
La proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, Ml42-H08, X63-G06, X101-A01 (también denominadas en el presente documento DX-2922), X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo sitio que X101-A01 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo sitio que M162-A04 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo sitio que X63-G06 y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En ciertas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de: Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana). En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a dos, tres, cuatro o cinco (es decir, todos) los aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana) y, por ejemplo, no se une a precalicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana). En otros casos, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a dos, tres o cuatro (es decir, todos) los aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En un caso, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::LC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorila), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
En ocasiones, la divulgación caracteriza una proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento.
En ocasiones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína aislada comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera, en la que:
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento,
en la que la proteína se une a calicreína plasmática.
En ocasiones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En ocasiones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X63-G06 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X63-G06.
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de M162-A04 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de MJ162-A04.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11, y la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142- H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 (respectivamente). En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
y la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01. En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03. La proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína. En ocasiones, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; (g) una CDR de primate o región estructural de primate; (h) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (i) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (k) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (l) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (n) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); y (o) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR).
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 1,0,5 o 0,2 nM.
El anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras realizaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA VH::CH1, HsA::LC VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
En algunos aspectos, la divulgación caracteriza una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento, por ejemplo, que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición puede estar al menos 10, 20, 30, 50, 75, 85, 90, 95, 98, 99 o 99,9 % libre de otra especie de proteína. En una realización, la composición farmacéutica puede estar al menos 10, 20, 30, 50, 75, 85, 90, 95, 98, 99 o 99,9 % libre de fragmentos de la proteína de unión que no se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana) o se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana con una Ki,ap de 5000 nM o mayor.
En algunos aspectos, la divulgación permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón) al sujeto.
En algunas realizaciones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación en dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT. En otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra en combinación con otro tratamiento para el trastorno.
En algunas realizaciones, la proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En ciertas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
En otras realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor Xlla y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1,0,5 o 0,2 nM.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::LC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorila), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
La invención permite el uso de proteínas codificadas por los ácidos nucleicos de la invención, en un método de tratamiento o prevención de un trastorno asociado a calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto,
en el que la proteína se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón).
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación de dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %), al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para el trastorno.
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con un segundo agente seleccionado del grupo que consiste en ecallantide, un inhibidor de C1 esterasa, aprotinina, un inhibidor del receptor de bradiquinina B2 (por ejemplo, icatibant).
En algunos ejemplos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática.
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunos ejemplos, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
En algunos ejemplos, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 y la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 y/o la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01. En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína. En ocasiones, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; y (g) una CDR de primate o región estructural de primate.
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1.2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA VH::CH1, HsA::LC VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método de promoción de la cicatrización en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática de ratón) y, por ejemplo, no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína de ratón) al sujeto.
En algunas realizaciones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína de unión a calicreína descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína (por ejemplo, epi-Kal2) y/o una molécula pequeña (por ejemplo, AEBSF) descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se administra en combinación con otro tratamiento para la cicatrización.
En algunas realizaciones, la proteína descrita en el presente documento se selecciona del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X81-B01.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática compite con o se une al mismo epítope que X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana).
En ciertas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana). En otras realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman una región para el reconocimiento de sustrato: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1,0,5 o 0,2 nM.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA+VH::CH1, HSA::LC+VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorila), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por los ácidos nucleicos de la invención, en un método de promoción de la cicatrización en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para la cicatrización.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04, y/o
la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
La proteína inhibe calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X81-B01 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X81-B01.
En algunas realizaciones, la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena pesada son de X67-D03 y/o la una, dos o tres (por ejemplo, tres) regiones CDR del dominio variable de la cadena ligera son de X67-D03.
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 (respectivamente). En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X81-B01 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X81-B01.
En algunas realizaciones, la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de X67-D03 y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de X67-D03.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 y/o la cadena ligera de M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11 (respectivamente).
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X81-B01 y/o la cadena ligera de X81-B01. En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de X67-D03 y/o la cadena ligera de X67-D03. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática disminuye la producción de factor Xlla y/o bradiquinina en más de aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 85 %, aproximadamente 90 %, o aproximadamente 95 % en comparación con un patrón, por ejemplo, la producción de factor XIIa y/o bradiquinina en las mismas condiciones pero en ausencia de la proteína. En ocasiones, la proteína incluye una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; y (g) una CDR de primate o región estructural de primate.
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 o 0,2 nM.
En algunas realizaciones, el anticuerpo no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01, X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04 (respectivamente).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X81-B01. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X81-B01.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X81-B01.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X81-B01.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X81-B01 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X81-B01.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado de X67-D03. En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de X67-D03.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR de la cadena pesada de las CDR correspondientes de la cadena pesada de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En un ejemplo preferido, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada de la cadena pesada de X67-D03 y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera de las CDR correspondientes de la cadena ligera de X67-D03.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más, in vivo, por ejemplo, en seres humanos. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es una IgG, por ejemplo, una IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, que tiene un tiempo de residencia en suero de 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas o más in vivo, por ejemplo, en seres humanos.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora el tiempo de residencia en suero, por ejemplo, un resto descrito en el presente documento.
En otra realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser un Fab soluble (sFab).
En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1 ::HSA+LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA VH::CH1, HsA::LC VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate.
En una realización, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes y Pan paniscus (bonobos)), gorilas (Gorilla gorilla), gibones, monos, lemures, aye-ayes (Daubentonia madagascariensis) y tarseros.
En una realización, la proteína incluye regiones estructurales humanas, o regiones estructurales que son al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticas a regiones estructurales humanas.
En ciertas realizaciones, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En ciertas realizaciones, la proteína es capaz de unirse a una célula o tejido, por ejemplo, que expresa calicreína plasmática.
En una realización, la proteína se asocia físicamente con una nanopartícula, y se puede usar para guiar una nanopartícula a una célula o tejido que expresa calicreína plasmática.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método de tratamiento o prevención de artritis reumatoide en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que en la que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para artritis reumatoide. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método de tratamiento o prevención de gota en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para gota.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método de tratamiento o prevención de enfermedad intestinal en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para enfermedad intestinal. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de los ácidos nucleicos de la invención y/o proteínas asociadas en un método de tratamiento o prevención de mucositis oral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para mucositis oral.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de dolor neuropático en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para dolor neuropático. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de dolor inflamatorio en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para dolor inflamatorio. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína aislada (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de trombosis arterial o venosa en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para trombosis arterial o venosa.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de íleo posoperatorio en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para íleo posoperatorio. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de aneurisma aórtica en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para aneurisma aórtica. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de osteoartritis en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para osteoartritis.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de vasculitis en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para vasculitis.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de septicemia en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para septicemia.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular) en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular).
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia) en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia).
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de nefritis por lupus eritematoso sistémico en un sujeto, comprendiendo el método:
administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para nefritis por lupus eritematoso sistémico.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento o prevención de lesión por quemadura en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína (por ejemplo, anticuerpo, por ejemplo, anticuerpo humano) que comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera como se define en las reivindicaciones al sujeto, en el que la proteína se une a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína se administra en combinación con otro tratamiento para lesión por quemadura. En algunas realizaciones, la proteína inhibe calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
La secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada comprende el dominio variable de la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera comprende el dominio variable de la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunas realizaciones, la proteína comprende la cadena pesada de una proteína descrita en el presente documento y/o la cadena ligera de una proteína descrita en el presente documento.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de detección de calicreína plasmática en una muestra, comprendiendo el método: poner en contacto la muestra con una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento); y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática, si está presente.
En algunas realizaciones, la proteína incluye una marca detectable.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método para detectar calicreína plasmática en un sujeto, comprendiendo el método: administrar la proteína descrita en el presente documento a un sujeto; y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática en el sujeto, si está presente. Por ejemplo, la detección comprende obtener imágenes del sujeto.
En algunas realizaciones, la proteína incluye además una marca detectable.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención, en un método para modular la actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, en un método para tratar o prevenir un trastorno asociado con calicreína plasmática. El método incluye: poner en contacto calicreína plasmática con la proteína (por ejemplo, en un sujeto humano), para modular de esa manera la actividad de calicreína plasmática. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico/vasculitis y lesión por quemadura.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT. En otras realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de tratamiento de un trastorno asociado a calicreína plasmática, comprendiendo el método administrar, a un sujeto, la proteína en una cantidad suficiente para tratar un trastorno asociado a calicreína plasmática en el sujeto. El método puede incluir además proporcionar al sujeto una segunda terapia que es terapia para el trastorno asociado a calicreína plasmática, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico/vasculitis y lesión por quemadura.
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de obtención de imágenes de un sujeto. El método incluye administrar la proteína al sujeto y, por ejemplo, detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática en el sujeto, si está presente.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína no inhibe la actividad de calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática puede incluir una marca detectable (por ejemplo, un radionúclido o una marca detectable por IRM).
En algunas realizaciones, el sujeto tiene o se sospecha que tiene un trastorno asociado a calicreína plasmática. El método es útil, por ejemplo, para el diagnóstico de un trastorno asociado a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención en un método de obtención de imágenes de calicreína plasmática, por ejemplo, en un sujeto o muestra (por ejemplo, muestra de biopsia). El método incluye administrar la proteína, por ejemplo, al sujeto o la muestra, y detectar una interacción entre la proteína y la calicreína plasmática, si está presente.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína no inhibe la actividad de calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática puede incluir una marca detectable (por ejemplo, un radionúclido o una marca detectable por IRM).
En algunas realizaciones, el sujeto tiene o se sospecha que tiene un trastorno asociado a calicreína plasmática. El método es útil, por ejemplo, para el diagnóstico de un trastorno asociado a calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, el trastorno asociado a calicreína plasmática se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención para el tratamiento de un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, o lesión por quemadura; o para promover la cicatrización.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina) y la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
En algunos aspectos, la invención permite el uso de proteínas codificadas por ácidos nucleicos de la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico o lesión por quemadura; o para la fabricación de un medicamento para la cicatrización.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática reduce la coagulación aberrante asociada con el sistema de activación de contacto (es decir, sistema de activación intrínseca) en al menos 10 % como se mide por, por ejemplo, un ensayo de coagulación de APTT (por ejemplo, en al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 %, o incluso 100 % (es decir, sin coagulación aberrante detectable)).
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina).
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se exponen en los dibujos adjuntos y la descripción que sigue. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán aparentes en la descripción y dibujos y en las reivindicaciones.
Breve descripción de dibujos
La FIGURA 1 es una representación esquemática de la función de la calicreína plasmática (pCal) en la vía de coagulación intrínseca e inflamación.
La FIGURA 2 representa el efecto de M162-A04 sobre el edema en pata de rata inducido por carragenina. Se midió la inflamación de la pata por desplazamiento de agua.
La FIGURA 3 representa el efecto de M162-A04 sobre la hiperalgesia térmica inducida por carragenina. Se midió la latencia del dolor por el método de Hargreaves después de la inyección de carragenina.
La FIGURA 4 representa el alineamiento de la secuencia de ADN de la cadena ligera de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo descubierto usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a cualquier optimización de codones o retromutación a la línea germinal.
La FIGURA 5 representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo descubierto usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a retromutación a la línea germinal. Se diferencian un total de 11 entre el anticuerpo no retromutado a la línea germinal (X63-G06) y optimizado en codones (X81-B01) retromutado a la línea germinal.
La FIGURA 6 representa el alineamiento de la secuencia de ADN de la cadena pesada de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*), mientras que los espacios en blanco corresponden a bases cambiadas en X81-B01 debido a la optimización de codones.
La FIGURA 7 representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones (X81-B01) retromutadas a la línea germinal del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se conservan las posiciones indicadas con un asterisco (*). Los dos anticuerpos tienen la misma secuencia de aminoácidos en la cadena pesada.
La FIGURA 8A representa la competición de EPI-KAL2 por pCal de unión a X81-B01. Se capturó X81-B01 (IgG) en una superficie específica de fragmento anti-Fc humano de un chip CM5 BIACORE®. Se hizo circular pCal (100 nM) sobre la superficie en presencia (sensograma inferior en la figura) o ausencia de EPI-KAL2 1 pM (sensograma superior en la figura).
La FIGURA 8B representa la competición de EPI-KAL2 por pCal de unión a X67-D03. Se capturó X67-D03 (IgG) en una superficie específica de fragmento anti-Fc humano de un chip CM5 Biacore. Se hizo circular pCal (100 nM) sobre la superficie en presencia (sensograma inferior en la figura) o ausencia de EPI-KAL2 1 pM (sensograma superior en la figura).
La FIGURA 9 representa los resultados del mapeo de epítopes CLIPS para los anticuerpos indicados en la Tabla 12. Las FIGURAS 10A-10C representan el alineamiento ClustalW de secuencias de pCal de diferentes especies. Las posiciones indicadas por a "*" son posiciones conservadas entre, mientras que las posiciones indicadas indican sustituciones conservativas entre especies. Las posiciones indicadas por a "." tienen sustituciones no conservativas e n a l g u n a s e s p e c ie s . S e m o s t r ó q u e la s e x t e n s i o n e s d e a m in o á c id o s in d ic a d a s p o r e l s í m b o lo " @ " e s t a b a n a l t a m e n t e e x p u e s t a s a d i s o l v e n t e p o r c á l c u lo d e l á r e a s u p e r f i c i a l a c c e s i b le a l d i s o lv e n t e . L a s e x t e n s i o n e s d e lo s a m in o á c id o s in d ic a d a s p o r u n " " s e i d e n t i f i c a r o n c o m o p o s i b le s e p í t o p e s d e lo s a n t i c u e r p o s e n u m e r a d o s e n la T a b la 12. S e e n c o n t r ó p o r c á l c u lo d e l á r e a s u p e r f i c i a l a c c e s i b le a l d i s o l v e n t e q u e lo s a m in o á c id o s r e s a l t a d o s e n g r is e s t a b a n e n t e r r a d o s c u a n d o s e c o m p le ja r o n c o n u n i n h ib i d o r d e s i t i o a c t i v o d e d o m in io d e K u n i t z . L a s p o s i c i o n e s s u b r a y a d a s s o n lo s a m in o á c id o s q u e f o r m a n la t r i a d a c a t a l í t i c a ( H i s 434 , A s p 483 y S e r 578 , n u m e r a c ió n b a s a d a e n la s e c u e n c ia h u m a n a ) .
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L a F I G U R A 13 r e p r e s e n t a u n a n á l i s i s B io c o r e q u e m u e s t r a q u e D X - 2922 s e u n e a c a l i c r e í n a p l a s m á t i c a q u e s e u n e a c in in ó g e n o d e a lto peso m o le c u la r (H M W K ).
La F IG U R A 14 r e p r e s e n t a u n g r á f i c o q u e m u e s t r a la in h ib i c ió n d e e d e m a d e p e n d ie n t e d e la d o s i s p o r X 1 0 1 - A 0 1 e n e l e d e m a e n la p a t a d e r a t a i n d u c id o p o r c a r r a g e n i n a ( C P E ) e n r a t a s .
D e s c r i p c ió n d e t a l l a d a
D e f i n ic i o n e s
P o r c o m o d i d a d , a n t e s d e la d e s c r i p c ió n a d i c io n a l d e la p r e s e n t e i n v e n c ió n , s e d e f in e n a c o n t i n u a c ió n c ie r t o s t é r m in o s e m p le a d o s e n la m e m o r i a d e s c r ip t i v a , e j e m p lo s y r e i v i n d i c a c io n e s a d j u n t a s . O t r o s t é r m in o s s e d e f in e n c o m o a p a r e c e n e n la m e m o r i a d e s c r ip t i v a .
L a s f o r m a s e n s in g u la r " u n " , " u n a " , " e l " y " la " in c lu y e n r e f e r e n c ia s a l p l u r a l , a m e n o s q u e e l c o n t e x t o d i c t e c l a r a m e n t e d e o t r o m o d o .
E l t é r m in o " a g o n i s t a , " c o m o s e u s a e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , s e e n t i e n d e q u e s e r e f i e r e a u n a g e n t e q u e im i t a o r e g u l a p o r in c r e m e n t o ( p o r e j e m p lo , p o t e n c i a o c o m p le m e n t a ) la b i o a c t i v id a d d e u n a p r o t e í n a . U n a g o n i s t a p u e d e s e r u n a p r o t e í n a n a t u r a l o d e r i v a d o d e la m is m a q u e t i e n e a l m e n o s u n a b i o a c t i v id a d d e la p r o t e í n a n a t u r a l . U n a g o n is t a t a m b ié n p u e d e s e r u n c o m p u e s t o q u e a u m e n t a a l m e n o s u n a b i o a c t i v id a d d e u n a p r o t e í n a . U n a g o n i s t a t a m b ié n p u e d e s e r u n c o m p u e s t o q u e a u m e n t a la i n t e r a c c i ó n d e u n p o l i p é p t i d o c o n o t r a m o lé c u la , p o r e j e m p lo , u n p é p t i d o o á c i d o n u c l e ic o d ia n a .
" A n t a g o n i s t a " , c o m o s e u s a e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , s e e n t i e n d e q u e s e r e f i e r e a u n a g e n t e q u e r e g u l a p o r d i s m i n u c ió n ( p o r e j e m p lo , s u p r im e o in h ib e ) a l m e n o s u n a b i o a c t i v i d a d d e u n a p r o t e í n a . U n a n t a g o n i s t a p u e d e s e r u n c o m p u e s t o q u e in h ib e o d i s m i n u y e la i n t e r a c c i ó n e n t r e u n a p r o t e í n a y o t r a m o lé c u la , p o r e j e m p lo , u n p é p t i d o o s u s t r a t o e n z i m á t i c o d ia n a . U n a n t a g o n i s t a t a m b ié n p u e d e s e r u n c o m p u e s t o q u e r e d u c e la c a n t id a d d e p r o t e í n a e x p r e s a d a p r e s e n t e .
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C o m o s e u s a e n e l p r e s e n t e d o c u m e n t o , u n a " s e c u e n c ia d e d o m in io v a r i a b le d e i n m u n o g lo b u l i n a " s e r e f i e r e a u n a s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e p u e d e f o r m a r la e s t r u c t u r a d e u n d o m in io v a r i a b le d e in m u n o g lo b u l i n a d e f o r m a q u e u n a o m á s r e g io n e s C D R e s t é n s i t u a d a s e n u n a c o n f o r m a c ió n a d e c u a d a p a r a u n s i t io d e u n ió n a l a n t í g e n o . P o r ejemplo, la secuencia puede incluir toda o parte de la secuencia de aminoácidos de un dominio variable que existe de forma natural. Por ejemplo, la secuencia puede omitir uno, dos o más aminoácidos del extremo N o C, aminoácidos internos, puede incluir una o más inserciones o aminoácidos terminales adicionales, o puede incluir otras alteraciones. En una realización, un polipéptido que incluye la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina se puede asociar con otra secuencia de dominio variable de inmunoglobulina para formar un sitio de unión al antígeno, por ejemplo, una estructura que interacciona preferencialmente con calicreína plasmática.
La cadena VH o VL del anticuerpo puede incluir además toda o parte de una región constante de la cadena pesada o ligera, para así formar una cadena de inmunoglobulina pesada o ligera, respectivamente. En una realización, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en el que las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras están interconectadas por, por ejemplo, enlaces disulfuro. En las IgG, la región constante de la cadena pesada incluye tres dominios de inmunoglobulina, CH1, CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera incluye un dominio Cl . La región variable de las cadenas pesadas y ligeras contiene un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos normalmente median en la unión del anticuerpo a tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. Las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de tipos kappa o lambda. En una realización, el anticuerpo está glucosilado. Un anticuerpo puede ser funcional para la citotoxicidad dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por el complemento.
Una o más regiones de un anticuerpo pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las regiones variables pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, una o más de las CDR pueden ser humanas, por ejemplo, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, LC-CDR1, LC-CDR2 y/o LC-CDR3. Cada una de las CDR de la cadena ligera (LC) y/o cadena pesada (HC) puede ser humana. HC-CDR3 puede ser humana. Una o más de las regiones estructurales pueden ser humanas, por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4 de HC y/o LC. Por ejemplo, la región Fc puede ser humana. En una realización, todas las regiones estructurales son humanas, por ejemplo, derivadas de una célula somática humana, por ejemplo, una célula hematopoyética que produce inmunoglobulinas o una célula no hematopoyética. En una realización, las secuencias humanas son secuencias de la línea germinal, por ejemplo, codificadas por un ácido nucleico de la línea germinal. En una realización, los restos de la región estructural (FR) de un Fab seleccionado se pueden convertir en el tipo de aminoácido del resto correspondiente en el gen de la línea germinal de primate más similar, especialmente el gen de la línea germinal humana. Una o más de las regiones constantes pueden ser humanas o efectivamente humanas. Por ejemplo, al menos 70, 75, 80, 85, 90, 92, 95, 98 o 100 % de un dominio variable de inmunoglobulina, la región constante, los dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y/o CL1), o el anticuerpo entero, pueden ser humanos o efectivamente humanos.
Todo o parte de un anticuerpo se puede codificar por un gen de inmunoglobulina o un segmento del mismo. Genes de inmunoglobulina humana a modo de ejemplo incluyen los genes de la región constante kappa, lambda, alfa (IgA1 e IgA2), gamma (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), delta, épsilon y mu, así como los muchos genes de la región variable de inmunoglobulina. Las "cadenas ligeras" de la inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 25 KDa o aproximadamente 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de la región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de la región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud completa (aproximadamente 50 KDa o aproximadamente 446 aminoácidos) están similarmente codificadas por un gen de la región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de la región constante anteriormente mencionados, por ejemplo, gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos). La longitud de HC humana varía considerablemente debido a que HC-CDR3 varía desde aproximadamente 3 restos de aminoácido hasta más de 35 restos de aminoácido.
El término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo de longitud completa se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo de longitud completa que retienen la capacidad para unirse específicamente a una diana de interés. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo de longitud completa y que retienen la funcionalidad incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2 , un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de brazo único de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que les permite separarse como una única cadena de proteína en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes conocidas como Fv monocatenario (scFv). Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N25.260.203, 4.946.778 y 4.881.175; Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883.
Se pueden obtener fragmentos de anticuerpos usando cualquier técnica apropiada que incluye técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica. El término "anticuerpo monoespecífico" se refiere a un anticuerpo que muestra una única especificidad de unión y afinidad por una diana particular, por ejemplo, epítope. Este término incluye un "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" que, como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos de composición molecular única, independientemente de cómo se generó el anticuerpo.
Los anticuerpos "se retromutan a la línea germinal" invirtiendo uno o más aminoácidos no de la línea germinal en regiones estructurales a aminoácidos de la línea germinal correspondientes del anticuerpo, en tanto que retengan sustancialmente las propiedades de unión.
La constante de inhibición (Ki) proporciona una medida de la potencia del inhibidor; es la concentración de inhibidor requerida para reducir la actividad enzimática a la mitad y no depende de las concentraciones de enzima o sustrato.
La Ki aparente (Ki,ap) se obtiene a diferentes concentraciones de sustrato midiendo el efecto inhibidor de diferentes concentraciones de inhibidor (por ejemplo, proteína de unión inhibidora) sobre el grado de la reacción (por ejemplo, actividad enzimática); el ajuste del cambio en la constante de velocidad de pseudo-primer orden en función de la concentración de inhibidor a la ecuación de Morrison (Ecuación 1) da una estimación del valor de Ki aparente. Ki se obtiene a partir de la ordenada en el origen extraída de un análisis de regresión lineal de una representación de
Ki,ap frente a la concentración de sustrato.
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Ecuación 1
Donde v = velocidad medida; v0 = velocidad en ausencia de inhibidor; Ki,ap = constante de inhibición aparente; I = concentración de inhibidor total; y E = concentración enzimática total.
Como se usa en el presente documento, "afinidad de unión" se refiere a la constante de asociación aparente o Ka .
KA es el recíproco de la constante de disociación (KD). Una proteína de unión puede tener, por ejemplo, una afinidad de unión de al menos 105 , 106 , 107 , 108 , 109 , 1010 y 1011 M-1 por una molécula diana particular, por ejemplo, calicreína plasmática. La unión de mayor afinidad de una proteína de unión a una primera diana con respecto a una segunda diana se puede indicar por una mayor KA (o un valor numérico de KD más pequeño) para la unión de la primera diana que la KA (o valor numérico KD) para la unión de la segunda diana. En tales casos, la proteína de unión tiene especificidad por la primera diana (por ejemplo, una proteína en una primera conformación o imitan de la misma) con respecto a la segunda diana (por ejemplo, la misma proteína en una segunda conformación o mimético de la misma; o una segunda proteína). Las diferencias en la afinidad de unión (por ejemplo, para especificidad u otras comparaciones) puede ser al menos 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37,5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10.000 o
105 veces.
La afinidad de unión se puede determinar por una variedad de métodos que incluyen diálisis en equilibrio, unión en equilibrio, filtración en gel, ELISA, resonancia de plasmones superficiales o espectroscopía (por ejemplo, usando un ensayo de fluorescencia). Las condiciones a modo de ejemplo para evaluar la afinidad de unión son en tampón
HBS-P (HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, 0,005 % (v/v) de tensioactivo P20). Estas técnicas se pueden usar para medir la concentración de proteína de unión unida y libre en función de la concentración de proteína de unión (o diana). La concentración de proteína de unión unida ([Unida]) se relaciona con la concentración de proteína de unión libre ([Libre]) y la concentración de sitios de unión para la proteína de unión en la diana donde (N) es el número de sitios de unión por molécula diana por la siguiente ecuación:
[Unida] = N ■ [Libre] / ((1/Ka ) [Libre]).
No siempre es necesario hacer una determinación exacta de Ka , aunque, puesto que algunas veces es suficiente obtener una medición de afinidad cuantitativa, por ejemplo, determinada usando un método tal como análisis de ELISA o FACS, es proporcional a Ka , y así se pueden usar para comparaciones, tales como determinar si una mayor afinidad es, por ejemplo, 2 veces mayor, para obtener una medición de afinidad cualitativa, o para obtener una inferencia de la afinidad, por ejemplo, por actividad en un ensayo funcional, por ejemplo, un ensayo in v itro o in vivo.
El término "proteína de unión" se refiere a una proteína que puede interaccionar con una molécula diana. Este término se usa indistintamente con "ligando". Una "proteína de unión a calicreína plasmática" se refiere a una proteína que puede interaccionar con (por ejemplo, se une a) calicreína plasmática, e incluye, en particular, proteínas que interaccionan preferencial o específicamente con y/o inhiben la calicreína plasmática. Una proteína inhibe la calicreína plasmática si causa una disminución en la actividad de calicreína plasmática en comparación con la actividad de calicreína plasmática en ausencia de la proteína y en las mismas condiciones. En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto de aminoácido se sustituye por un resto de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de restos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).
Es posible que uno o más restos de aminoácidos de la región estructural y/o CDR de una proteína de unión incluyan una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones, o deleciones) con respecto a una proteína de unión descrita en el presente documento. Una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener mutaciones (por ejemplo, sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas o sustituciones de aminoácidos no esenciales), inserciones, o deleciones) (por ejemplo, al menos una, dos, tres, o cuatro y/o menos de 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 mutaciones) con respecto a una proteína de unión descrita en el presente documento, por ejemplo, mutaciones que no tienen un efecto funcional sobre la función de la proteína. Las mutaciones pueden estar presentes en regiones estructurales, CDR y/o regiones constantes. En ocasiones, las mutaciones están presentes en una región estructural. En ocasiones, las mutaciones están presentes en una CDR. En algunas realizaciones, las mutaciones están presentes en una región constante. Se puede predecir si una sustitución particular será o no tolerada, es decir, no afectará adversamente las propiedades biológicas, tales como la actividad de unión, por ejemplo, evaluando si la mutación es conservativa o por el método de Bowie, et al. (1990) Science 247:1306-1310.
Las secuencias de motivos para los biopolímeros pueden incluir posiciones que pueden ser aminoácidos variados. Por ejemplo, el símbolo "X" en dicho contexto se refiere generalmente a cualquier aminoácido (por ejemplo, cualquiera de los veinte aminoácidos naturales), a menos que se especifique de otro modo, por ejemplo, se refiere a cualquier aminoácido distinto de cisteína. También se puede indicar otros aminoácidos permitidos, por ejemplo, usando paréntesis y barras. Por ejemplo, "(A/W/F/N/Q)" significa que se permiten alanina, triptófano, fenilalanina, asparagina y glutamina en esa posición particular.
Una región variable de inmunoglobulina "eficazmente humana" es una región variable de inmunoglobulina que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos de la región estructural humana de forma que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Un anticuerpo "eficazmente humano" es un anticuerpo que incluye un número suficiente de posiciones de aminoácidos humanas de forma que el anticuerpo no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal.
Un "epítope" se refiere al sitio en un compuesto diana que es unido por una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo tal como un Fab o anticuerpo de longitud completa). En el caso en el que el compuesto diana sea una proteína, el sitio puede estar completamente compuesto de componentes de aminoácido, completamente compuesto de modificaciones químicas de aminoácidos de la proteína (por ejemplo, restos de glucosilo), o compuesto de combinaciones de los mismos. Los epítopes de solapamiento incluyen al menos un resto de aminoácido común, grupo glucosilo, grupo fosfato, grupo sulfato, u otra molecular característica.
Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) "se une al mismo epítope" que una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la primera proteína de unión se une al mismo sitio en un compuesto diana al que se une la segunda proteína de unión, o se une a un sitio que solapa (por ejemplo, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 % de solapamiento, por ejemplo, en términos de la secuencia de aminoácidos u otra característica molecular (por ejemplo, grupo glucosilo, grupo fosfato o grupo sulfato)) con el sitio al que se une la segunda proteína de unión. Una primera proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) "compite por la unión" con una segunda proteína de unión (por ejemplo, anticuerpo) si la unión de la primera proteína de unión a su epítope disminuye (por ejemplo, en 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, o más) la cantidad de la segunda proteína de unión que se une a su epítope. La competición puede ser directa (por ejemplo, la primera proteína de unión se une a un epítope que es el mismo que, o solapa con, el epítope unido por la segunda proteína de unión), o indirecta (por ejemplo, la unión de la primera proteína de unión a su epítope causa un cambio estérico en el compuesto diana que disminuye la capacidad de la segunda proteína de unión para unirse a su epítope).
Los cálculos de "homología" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos se usan indistintamente en el presente documento) se realizan del siguiente modo. Se alinean las secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir huecos en una o ambas de un primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos para el alineamiento óptimo y se pueden ignorar secuencias no homólogas para fines de comparación). El alineamiento óptimo se determina como la mejor puntuación usando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión de hueco de 4 y una penalización por hueco con desplazamiento de marco de 5. Entonces se comparan los restos de aminoácidos o nucleótidos en correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento, la "identidad" de aminoácidos o ácidos nucleicos es equivalente a la "homología" de aminoácidos o ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias.
En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al menos 50 %, incluso más preferentemente al menos 60 %, e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 % o 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia de referencia puede ser la longitud de la secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
Una región variable de inmunoglobulina "humanizada" es una región variable de inmunoglobulina que se modifica para incluir un número suficiente de posiciones de aminoácidos de la región estructural humana de forma que la región variable de inmunoglobulina no provoque una respuesta inmunogénica en un humano normal. Las descripciones de inmunoglobulinas "humanizadas" incluyen, por ejemplo, los documentos U.S. 6.407.213 y U.S.
5.693.762.
Como se usa en el presente documento, el término "se hibrida en condiciones de baja rigurosidad, media rigurosidad, alta rigurosidad, o condiciones de muy alta rigurosidad" describe condiciones para la hibridación y el lavado. La orientación para realizar reacciones de hibridación se puede encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Se describen métodos acuosos y no acuosos en esa referencia y se puede usar cualquiera. Las condiciones de hibridación específicas referidas en el presente documento son las siguientes: (1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en 6X cloruro sódico/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45 °C, seguido por dos lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados se pueden aumentar hasta 55 °C para las condiciones de baja rigurosidad); (2) condiciones de hibridación de media rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 60 °C; (3) condiciones de hibridación de alta rigurosidad en 6X SSC a aproximadamente 45 °C, seguido por uno o más lavados en 0,2X SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C; y (4) condiciones de hibridación de muy alta rigurosidad son fosfato de sodio 0,5 M, 7 % de SDS a 65 °C, seguido por uno o más lavados a 0,2X SSC, 1 % de SDS a 65 °C. Las condiciones de muy alta rigurosidad (4) son las condiciones preferidas y las que se deben usar, a menos que se especifique de otro modo. La divulgación incluye ácidos nucleicos que se hibridan con baja, media, alta o muy alta rigurosidad con un ácido nucleico descrito en el presente documento o con un complemento del mismo, por ejemplo, ácidos nucleicos que codifican una proteína de unión descrita en el presente documento. Los ácidos nucleicos pueden tener la misma longitud o estar dentro de 30, 20 o 10 % de la longitud del ácido nucleico de referencia. El ácido nucleico puede corresponder a una región que codifica una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina descrita en el presente documento.
Una "composición aislada" se refiere a una composición que se retira de al menos 90 % de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la composición aislada. Las composiciones producidas artificial o naturalmente pueden ser "composiciones de al menos" un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura en una base en peso-peso.
Una proteína "aislada" se refiere a una proteína que se retira de al menos 90 % de al menos un componente de una muestra natural de la que se puede obtener la proteína aislada. Las proteínas pueden ser "de al menos" un cierto grado de pureza si la especie o población de especies de interés es al menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 92, 95, 98 o 99 % pura en una base en peso-peso.
El término "modulador" se refiere a un polipéptido, ácido nucleico, macromolécula, complejo, molécula, molécula pequeña, compuesto, especie o similares (que existen de forma natural o que no existen de forma natural), o un extracto preparado a partir de materiales biológicos tales como bacterias, plantas, hongos, o células de animales o tejidos, que puede ser capaz de causar modulación. Los moduladores se pueden evaluar para su posible actividad como inhibidores o activadores (directa o indirectamente) de una propiedad funcional, actividad biológica o proceso, o combinación de ellos (por ejemplo, agonista, antagonista parcial, agonista parcial, agonista inverso, antagonista, agentes antimicrobianos, inhibidores de la infección o proliferación microbiana, y similares) por inclusión en ensayos. En dichos ensayos, se pueden cribar de una vez muchos moduladores. La actividad de un modulador puede ser conocida, desconocida o parcialmente conocida.
Un resto de aminoácido "no esencial" es un resto que se puede alterar de la secuencia no mutante del agente de unión, por ejemplo, el anticuerpo, sin suprimir o, más preferentemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que el cambio de un resto de aminoácido "esencial" da como resultado una sustancial pérdida de actividad.
Un "paciente", "sujeto" u "hospedador" (estos términos se usan indistintamente) que se va a ser tratar por el método objeto puede significar cualquiera de un animal humano o no humano.
Los términos "precalicreína" y "precalicreína plasmática" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la forma de zimógeno de la calicreína plasmática activa, que también se conoce como precalicreína. El término "previniendo" o "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que se prevenga al menos un síntoma de la enfermedad, es decir, se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) de manera que proteja al hospedador contra el desarrollo de la afección no deseada. "Prevenir" una enfermedad también se puede denominar "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".
Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente idéntica" (o "sustancialmente homóloga") se usa en el presente documento para referirse a una primera secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos que contiene un número suficiente de restos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, con una cadena lateral similar, por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservadas) a una segunda secuencia de aminoácidos o de ácidos nucleicos de forma que la primera y segunda secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos tengan (o codifiquen proteínas que tienen) actividades similares, por ejemplo, una actividad de unión, una preferencia de unión, o una actividad biológica. En el caso de anticuerpos, el segundo anticuerpo tiene la misma especificidad y tiene al menos 50 %, al menos 25 %, o al menos 10 % de la afinidad con respecto al mismo antígeno.
Las secuencias similares u homólogas (por ejemplo, al menos aproximadamente 85 % de identidad de secuencia) a las secuencias desveladas en el presente documento también son parte de la presente solicitud. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las regiones estructurales HC y/o LC (por ejemplo, FR 1, 2, 3 y/o 4 HC y/o LC) con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en las CDR HC y/o LC (por ejemplo, CDR1, 2 y/o 3 HC y/o LC) con una proteína de unión descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, una proteína de unión a calicreína plasmática puede tener aproximadamente 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor identidad de secuencia en la región constante (por ejemplo, CH1, CH2, CH3 y/o CL1) con una proteína de unión descrita en el presente documento.
Además, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácidos nucleicos se hibridan en condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente rigurosas), con el complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
La significación estadística se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica. Las pruebas estadísticas a modo de ejemplo incluyen: la prueba de la t de Student, la prueba no paramétrica de la U de Mann Whitney y la prueba estadística no paramétrica de Wilcoxon. Algunas relaciones estadísticamente significativas tienen un valor de P inferior a 0,05 o 0,02. Las proteínas de unión particulares pueden mostrar una diferencia, por ejemplo, en la especificidad o unión que es estadísticamente significativa (por ejemplo, valor de P < 0,05 o 0,02). Los términos "inducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "aumentar", "disminuir" o similares, por ejemplo, que indican diferencias cualitativas o cuantitativas distinguibles entre dos estados, pueden referirse a una diferencia, por ejemplo, una diferencia estadísticamente significativa, entre los dos estados.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" modula preferentemente un parámetro medible, por ejemplo, actividad de calicreína plasmática, en un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, por ejemplo, un parámetro asociado a enfermedad, se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en trastornos y afecciones humanas, por ejemplo, artritis reumatoide u mucositis oral. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro.
"Tratar" una enfermedad (o afección) en un sujeto o "tratar" un sujeto que tiene una enfermedad se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que se cure, alivie o disminuya al menos un síntoma de la enfermedad.
El término "prevenir" una enfermedad en un sujeto se refiere a someter el sujeto a un tratamiento farmacéutico, por ejemplo, la administración de un fármaco, de forma que al menos un síntoma de la enfermedad se prevenga, es decir, se administra antes de la manifestación clínica de la afección no deseada (por ejemplo, enfermedad u otro estado no deseado del animal hospedador) de manera que proteja al hospedador contra el desarrollo de la afección no deseada. "Prevenir" una enfermedad también se puede denominar "profilaxis" o "tratamiento profiláctico".
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.
Como se usa en el presente documento, el término "DX-2922" se usa Incambiablemente con el término "X101-A01". Otras variantes de este anticuerpo se describen a continuación.
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Proteínas de unión a calicreína plasmática
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser de longitud completa (por ejemplo, una IgG (por ejemplo, una IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (por ejemplo, IgA1, IgA2), IgD, y IgE) o pueden incluir solo un fragmento de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv. La proteína de unión puede incluir dos inmunoglobulinas de la cadena pesada y dos inmunoglobulinas de la cadena ligera, o puede ser un anticuerpo monocatenario. Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser proteínas recombinantes tales como anticuerpos humanizados, injertados en CDR, quiméricos, desinmunizados, o generados in vitro, y pueden incluir opcionalmente regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es un anticuerpo monoclonal.
En un aspecto, la divulgación caracteriza una proteína (por ejemplo, una proteína aislada) que se une a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina) e incluye al menos una región variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, la proteína incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena pesada (HC) y/o una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de la cadena ligera (LC). En una realización, la proteína se une a e inhibe calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina.
La proteína puede incluir una o más de las siguientes características: (a) una CDR humana o región estructural humana; (b) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una o más (por ejemplo, 1,2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (c) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una o más (por ejemplo, 1 , 2 o 3) CDR que son al menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idénticas a una CDR de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (d) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC es al menos 85, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (e) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC es al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % idéntica a un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); (f) la proteína se une a un epítope unido por una proteína descrita en el presente documento, o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento; (g) una CDR de primate o región estructural de primate; (h) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2 o 3 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (i) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (j) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5 o 6 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de HC descrito en el presente documento; (k) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR1 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR1 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (l) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR2 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3 o 4 aminoácidos de la CDR2 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento; (m) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC comprende una CDR3 que se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4 o 5 aminoácidos de la CDR3 de un dominio variable de LC descrito en el presente documento ; (n) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de LC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de LC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR); y (o) la secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de HC se diferencia en al menos un aminoácido pero en no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 aminoácidos de un dominio variable de HC descrito en el presente documento (por ejemplo, en general o en regiones estructurales o CDR).
La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser una proteína aislada (por ejemplo, al menos 70, 80, 90, 95, o 99 % libre de otras proteínas). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática, o composición de la misma, se aísla de fragmentos de escisión de anticuerpos (por ejemplo, DX-2922 escindido) que son inactivos o parcialmente activos (por ejemplo, se unen a calicreína plasmática con una Ki,ap de 5000 nM o mayor) en comparación con la proteína de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática está al menos 70 % libre de dichos fragmentos de escisión de anticuerpos; en otras realizaciones, la proteína de unión está al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 99 % o incluso 100 % libre de fragmentos de escisión de anticuerpos que son inactivos o parcialmente activos.
La proteína que se une a calicreína plasmática puede además inhibir la calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana.
En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática no se une a precalicreína (por ejemplo, precalicreína humana y/o precalicreína murina), pero se une a la forma activa de calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína murina).
En ciertas realizaciones, la proteína se une en o cerca del sitio activo del dominio catalítico de calicreína plasmática, o un fragmento de la misma, o se une al epítope que solapa con el sitio activo de calicreína plasmática.
En algunos aspectos, la proteína se une al mismo epítope o compite por la unión con una proteína descrita en el presente documento.
En ocasiones, la proteína compite con o se une al mismo epítope que M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67-D03, X67- G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En algunas realizaciones, la proteína se une a (por ejemplo, posiciones en la calicreína plasmática correspondientes a) péptido CLIPS C1, C2, C3, C4, C5, C6, o C7, o más de uno de estos péptidos, por ejemplo, la proteína se une a C5 y C6. Los péptidos CLIPS C1-C7 son péptidos en la calicreína plasmática identificados por el mapeo de epítopes de CLIPS (véanse las FIGURAS 9 y 10A-10C). C1 corresponde a las posiciones 55-67 del dominio catalítico, C2 a las posiciones 81-94, C3 a las posiciones 101-108, C4 a las posiciones 137-151, C5 a las posiciones 162-178, C6 a las posiciones 186-197 y C7 a las posiciones 214-217 de calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína se une a un epítope mostrado en la Figura 9.
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos que forman la triada catalítica de calicreína plasmática: His434, Asp483 y/o Ser578 (numeración basada en la secuencia humana).
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de: Arg551, Gln553, Tyr555, Thr558 y/o Arg560 (numeración basada en la secuencia humana). En algunas realizaciones, la proteína de unión a calicreína plasmática se une a uno o más aminoácidos de: S478, N481, S525 y K526 (numeración basada en la secuencia de calicreína humana).
En algunas realizaciones, la proteína se une a uno o más aminoácidos de Ser479, Tyr563 y/o Asp585 (numeración basada en la secuencia humana).
La hendidura de sitio activo de la calicreína plasmática contiene tres aminoácidos que forman la triada catalítica (His434, Asp483 y Ser578) y dan como resultado la hidrólisis enzimática de sustrato unido (los restos de la triada catalítica están subrayados en la Figura 10). Se determinó que los péptidos seleccionados para el análisis por mapeo de epítopes de CLIPS estaban accesibles en la superficie y o bien forman o rodean la proximidad del sitio activo. El péptido C1 contiene el sitio activo histidina 434. El péptido C3 contiene el sitio activo aspartato 483. El péptido C6 contiene el sitio activo serina 578. Es posible que un anticuerpo se una a múltiples aminoácidos expuestos en la superficie que son discontinuos en la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, por análisis de CLIP, aparece que X81-B01 se une a los péptidos C2, C3, C5 y C6.
En algunas realizaciones, la proteína se une a un epítope que incluye uno o más aminoácidos del péptido C1, péptido C2, péptido C3, péptido C4, péptido C5, péptido C6 o péptido C7 de CLIPS.
En algunas realizaciones, la proteína se une a un epítope que incluye aminoácidos de al menos 2 péptidos CLIPS diferentes, por ejemplo, de al menos dos de péptido C1, péptido C2, péptido C3, péptido C4, péptido C5, péptido C6, o péptido C7.
La proteína puede unirse a calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana, con una afinidad de unión de al menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 y 1011 M-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kdis más lenta que 1 x 10-3, 5 x 10-4 s-1 o 1 x 10-4 s-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática humana con una Kas más rápida que 1 x 102, 1 x 103 o 5 x 103 M-1s-1. En una realización, la proteína se une a calicreína plasmática, pero no se une a calicreína de tejido y/o precalicreína plasmática (por ejemplo, la proteína se une a calicreína de tejido y/o precalicreína plasmática menos eficazmente (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) que se une a calicreína plasmática.
En una realización, la proteína inhibe la actividad de calicreína plasmática humana, por ejemplo, con una Ki inferior a 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 y 10-10 M. La proteína puede tener, por ejemplo, una CI50 inferior a 100 nM, 10 nM, 1, 0,5 o 0,2 nM. Por ejemplo, la proteína puede modular la actividad de calicreína plasmática, así como la producción de factor Xlla (por ejemplo, de factor XII) y/o bradiquinina (por ejemplo, de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La proteína puede inhibir la actividad de calicreína plasmática y/o la producción de factor Xlla (por ejemplo, de factor XII) y/o bradiquinina (por ejemplo, de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)). La afinidad de la proteína por la calicreína plasmática humana se puede caracterizar por una Kd inferior a 100 nm, inferior a 10 nM, inferior a 5 nM, inferior a 1 nM, inferior a 0,5 nM. En una realización, la proteína inhibe la calicreína plasmática, pero no inhibe la calicreína de tejido (por ejemplo, la proteína inhibe la calicreína de tejido menos eficazmente (por ejemplo, 5, 10, 50, 100 o 1000 veces menos o en absoluto, por ejemplo, en comparación con un control negativo) que inhibe la calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, la proteína tiene una constante de inhibición aparente (Ki,ap) inferior a 1000, 500, 100, 5, 1, 0. 5 o 0,2 nM.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática pueden ser anticuerpos. Los anticuerpos de unión a calicreína plasmática pueden tener sus secuencias del dominio variable de HC y LC incluidas en un único polipéptido (por ejemplo, scFv), o en diferentes polipéptidos (por ejemplo, IgG o Fab).
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63-G06, X101-A01 , X81-B01, X67-D03, X67- G04, DX-2922, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En una realización preferida, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08 X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29- D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene las regiones variables de anticuerpos de las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena pesada de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
La proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una región variable de anticuerpo de la cadena ligera de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01, X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09 y M145-D11.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas pesadas que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63-G06, X101-A01 , X81-B01 , X67-D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11 , M06-D09 y M35-G04.
En ocasiones, la proteína es un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo humano) que tiene una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena pesada y una o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) CDR de la cadena ligera seleccionadas de las CDR correspondientes del grupo de cadenas ligeras que consiste en M162-A04, M160-G12, M142-H08, X63G06, X101-A01 , X81-B01 , X67- D03, X67-G04, X115-B07, X115-D05, X115-E09, X115-H06, X115-A03, X115-D01, X115-F02, X115-G04, M29-D09, M145-D11, M06-D09 y M35-G04.
En una realización, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de la misma cadena de polipéptidos. En otro, las secuencias del dominio variable de HC y LC son componentes de diferentes cadenas de polipéptidos. Por ejemplo, la proteína es una IgG, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. La proteína puede ser Fab soluble. En otras implementaciones, la proteína incluye un Fab2', scFv, minicuerpo, fusión scFv::Fc, fusión Fab::HSA, fusión HSA::Fab, fusión Fab::HSA::Fab, u otra molécula que comprende el sitio de combinación del antígeno de una de las proteínas de unión en el presente documento. Las regiones VH y VL de estos Fab se pueden proporcionar como IgG, Fab, Fab2, Fab2', scFv, Fab PEGilado, scFv PEGilado, Fab2 PEGilado, VH::CH1::hSa LC, HSA::VH::CH1+LC, LC::HSA VH::CH1, HSA::Lc + VH::CH1, u otra construcción apropiada.
En una realización, la proteína es un anticuerpo humano o humanizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo humano, por ejemplo, todas las regiones estructurales humanas, o regiones estructurales al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a regiones estructurales humanas. En una realización, la proteína incluye un dominio Fc humano, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc humano.
En una realización, la proteína es un anticuerpo de primate o primatizado o es no inmunogénica en un humano. Por ejemplo, la proteína incluye una o más regiones estructurales de anticuerpo de primate, por ejemplo, todas las regiones estructurales de primate, o regiones estructurales al menos 85, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idénticas a regiones estructurales de primate. En una realización, la proteína incluye un dominio Fc de primate, o un dominio Fc que es al menos 95, 96, 97, 98 o 99 % idéntico a un dominio Fc de primate. "Primate" incluye seres humanos (H o m o sap iens), chimpancés (P an tro g lo d y te s y P an p a n is c u s (bonobos)), gorilas (G o rilla go rilla ), gibones, monos, lemures, aye-ayes (D a u b e n to n ia m a d a g a sca rie n s is ) y tarseros.
En algunas realizaciones, la afinidad del anticuerpo de primate por la calicreína plasmática humana se caracteriza por una KD inferior a 1000, 500, 100, 10, 5, 1, 0,5 nM, por ejemplo, inferior a 10 nM, inferior a 1 nM, o inferior a 0,5 nM.
En ciertas realizaciones, la proteína no incluye secuencias de ratones o conejos (por ejemplo, no es un anticuerpo murino o de conejo).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona el uso de proteínas (por ejemplo, proteínas de unión, por ejemplo, anticuerpos) (por ejemplo, las proteínas descritas en el presente documento) que se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana) e incluyen al menos una región variable de inmunoglobulina en métodos de tratamiento (o prevención) de un trastorno o afección asociado a calicreína plasmática. Por ejemplo, la proteína de unión a calicreína plasmática incluye una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada (HC) y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (LC). Se describen en el presente documento varias proteínas de unión a calicreína plasmática a modo de ejemplo.
La proteína de unión a calicreína plasmática puede ser una proteína aislada (por ejemplo, al menos 70, 80, 90, 95, o 99 % libre de otras proteínas).
La proteína de unión a calicreína plasmática puede inhibir además calicreína plasmática, por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina. En algunas realizaciones, se puede preferir que una proteína de unión a calicreína plasmática se una a tanto calicreína plasmática humana como a murina, ya que estos anticuerpos se pueden probar para eficacia en un modelo de ratón.
Calicreína plasmática
Las secuencias de calicreína plasmática a modo de ejemplo contra las que se pueden desarrollar proteínas de unión a calicreína plasmática pueden incluir secuencias de aminoácidos de calicreína plasmática humana, de ratón o rata, una secuencia que es 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a una de estas secuencias, o un fragmento de la misma, por ejemplo, de una secuencia proporcionada a continuación.
Se usó la secuencia de calicreína plasmática humana en selecciones y el cribado posterior se muestra a continuación (número de acceso NP_000883.2). La calicreína plasmática humana (86 kDa) que se usó se purificó de plasma humano y se activó con el factor XIIa por un proveedor comercial. El factor XIIa activa la precalicreína por escisión de la secuencia de polipéptidos en un único sitio (entre Arg371-Ile372, sitio de escisión marcado por "/" en la secuencia a continuación) para generar calicreína plasmática activa, que entonces consiste en dos polipéptidos unidos por disulfuro; una cadena pesada de aproximadamente 52 kDa y un dominio catalítico de aproximadamente 34 kDa [Colman and Schmaier, (1997) "Contact System: A Vascular Biology Modulator With Anticoagulant, Profibrinolytic, Antiadhesive, and Proinflammatory Attributes" Blood, 90, 3819-3843]
GCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSINDMEKRFGCFLKDSVTGTLPKV HRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKRCTSNIRCQFFSYATQTFHKAE YRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLAFSDVDVARVLTPDAFVCRTICT YHPNCLFFTFYTNVW KIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYSLLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFG GEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLRLSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRL CNTGDNSVCTTKTSTR/IVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCGGSLIGHQWVLTAAHCFDGLPLQDV
W R IY SG ILN LSDITKDTPFSQIKEII1HQNYKVSEGNHDIALIKLQ APLNYTEFQKPICLPSK GDTSTIYT NCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQRMVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKH NGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDGKAQMQSPA
Se ilustran a continuación las secuencias de aminoácidos de precalicreína humana, de ratón y rata, y las secuencias de ARNm que codifican las mismas. Las secuencias de precalicreína son las mismas que la calicreína plasmática, excepto que la calicreína plasmática activa (pCal) tiene la cadena de polipéptidos individual escindida en una única posición (indicada por "/") para generar dos cadenas. Las secuencias proporcionadas a continuación son las secuencias completas que incluyen las secuencias señal. Tras la secreción de las célula que la expresa, se espera que se retiren las secuencias señal.
C a lic re ín a p la s m á tic a h u m an a (A C C E S O : N P _ 000883.2 )
> gi|78191798|ref|NP_000883.2| precursor B1 de calicreína plasmática [Homo sapiens]
MILFKQATYFISLFATVSCGCLTQLYENAFFRGGDVASMYTPNAQYCQMRCTFHPRCLLFSFLPASSIND MEKRFGCFLKDSVTGTLPKVHRTGAVSGHSLKQCGHQISACHRDIYKGVDMRGVNFNVSKVSSVEECQKR CTSNIRCQFFSYATQTFHKAEYRNNCLLKYSPGGTPTAIKVLSNVESGFSLKPCALSEIGCHMNIFQHLA FSDVDVARVLTPDAFVCRTICTYHPNCLFFTFYTNVWKIESQRNVCLLKTSESGTPSSSTPQENTISGYS LLTCKRTLPEPCHSKIYPGVDFGGEELNVTFVKGVNVCQETCTKMIRCQFFTYSLLPEDCKEEKCKCFLR LSMDGSPTRIAYGTQGSSGYSLRLCNTGDNSVCTTKTSTRIVGGTNSSWGEWPWQVSLQVKLTAQRHLCG GSLIGHQW VLTAAHCFDGLPLQDVW RIYSGILNLSDITKDTPFSQIKEII1HQNYKVSEGNHDIALIKLQ APLNYTEFQKPICLPSKGDTSTIYTNCWVTGWGFSKEKGEIQNILQKVNIPLVTNEECQKRYQDYKITQR MVCAGYKEGGKDACKGDSGGPLVCKHNGMWRLVGITSWGEGCARREQPGVYTKVAEYMDWILEKTQSSDG KAQMQSPA
A R N m d e c a lic re ín a p la s m á tic a h u m an a (A C C E S O : N M _ 000892 )
> gi|78191797|ref|NM_000892.3| calicreína B de Homo sapiens, plasma (factor de Fletcher) 1 (KLKB1), ARNm
AGAACAGCTTGAAGACCGTTCATTTTTAAGTGACAAGAGACTCACCTCCAAGAAGCAATTGTGTTTTCAG AATGATTTTATTCAAGCAAGCAACTTATTTCATTTCCTTGTTTGCTACAGTTTCCTGTGGATGTCTGACT CAACTCTATGAAAACGCCTTCTTCAGAGGTGGGGATGTAGCTTCCATGTACACCCCAAATGCCCAATACT GCCAGATGAGGTGCACATTCCACCCAAGGTGTTTGCTATTCAGTTTTCTTCCAGCAAGTTCAATCAATGA CATGGAGAAAAGGTTTGGTTGCTTCTTGAAAGATAGTGTTACAGGAACCCTGCCAAAAGTACATCGAACA GGTGCAGTTTCTGGACATTCCTTGAAGCAATGTGGTCATCAAATAAGTGCTTGCCATCGAGACATTTATA AAGGAGTTGATATGAGAGGAGTCAATTTTAATGTGTCTAAGGTTAGCAGTGTTGAAGAATGCCAAAAAAG GTGCACCAGTAACATTCGCTGCCAGTTTTTTTCATATGCCACGCAAACATTTCACAAGGCAGAGTACCGG AACAATTGCCTATTAAAGTACAGTCCCGGAGGAACACCTACCGCTATAAAGGTGCTGAGTAACGTGGAAT CTGGATTCTCACTGAAGCCCTGTGCCCTTTCAGAAATTGGTTGCCACATGAACATCTTCCAGCATCTTGC GTTCTCAGATGTGGATGTTGCCAGGGTTCTCACTCCAGATGCTTTTGTGTGTCGGACCATCTGCACCTAT CACCCCAACTGCCTCTTCTTTACATTCTATACAAATGTATGGAAAATCGAGTCACAAAGAAATGTTTGTC TTCTTAAAACATCTGAAAGTGGCACACCAAGTTCCTCTACTCCTCAAGAAAACACCATATCTGGATATAG CCTTTTAACCTGCAAAAGAACTTTACCTGAACCCTGCCATTCTAAAATTTACCCGGGAGTTGACTTTGGA GGAGAAGAATTGAATGTGACTTTTGTTAAAGGAGTGAATGTTTGCCAAGAGACTTGCACAAAGATGATTC GCTGTCAGTTTTTCACTTATTCTTTACTCCCAGAAGACTGTAAGGAAGAGAAGTGTAAGTGTTTCTTAAG ATTATCTATGGATGGTTCTCCAACTAGGATTGCGTATGGGACACAAGGGAGCTCTGGTTACTCTTTGAGA TTGTGTAACACTGGGGACAACTCTGTCTGCACAACAAAAACAAGCACACGCATTGTTGGAGGAACAAACT CTTCTTGGGGAGAGTGGCCCTGGCAGGTGAGCCTGCAGGTGAAGCTGACAGCTCAGAGGCACCTGTGTGG AGGGTCACTCATAGGACACCAGTGGGTCCTCACTGCTGCCCACTGCTTTGATGGGCTTCCCCTGCAGGAT GTTTGGCGCATCTATAGTGGCATTTTAAATCTGTCAGACATTACAAAAGATACACCTTTCTCACAAATAA AAGAGATTATTATTCACCAAAACTATAAAGTCTCAGAAGGGAATCATGATATCGCCTTGATAAAACTCCA GGCTCCTTTGAATTACACTGAATTCCAAAAACCAATATGCCTACCTTCCAAAGGTGACACAAGCACAATT TATACCAACTGTTGGGTAACCGGATGGGGCTTCTCGAAGGAGAAAGGTGAAATCCAAAATATTCTACAAA AGGTAAATATTCCTTTGGTAACAAATGAAGAATGCCAGAAAAGATATCAAGATTATAAAATAACCCAACG GATGGTCTGTGCTGGCTATAAAGAAGGGGGAAAAGATGCTTGTAAGGGAGATTCAGGTGGTCCCTTAGTT TGCAAACACAATGGAATGTGGCGTTTGGTGGGCATCACCAGCTGGGGTGAAGGCTGTGCCCGCAGGGAGC AACCTGGTGTCTACACCAAAGTCGCTGAGTACATGGACTGGATTTTAGAGAAAACACAGAGCAGTGATGG AAAAGCTCAGATGCAGTCACCAGCATGAGAAGCAGTCCAGAGTCTAGGCAATTTTTACAACCTGAGTTCA AGTCAAATTCTGAGCCTGGGGGGTCCTCATCTGCAAAGCATGGAGAGTGGCATCTTCTTTGCATCCTAAG GACGAAAAACACAGTGCACTCAGAGCTGCTGAGGACAATGTCTGGCTGAAGCCCGCTTTCAGCACGCCGT AACCAGGGGCTGACAATGCGAGGTCGCAACTGAGATCTCCATGACTGTGTGTTGTGAAATAAAATGGTGA AAGATCAAAAAA
C a lio re ln a p la s m á tic a d e ra tón (A C C E S O : N P _ 032481.1 )
> gi|6680584|ref|NP_032481.11 calicreína B, plasma 1 [Mus musculus]
MILFNRVGYFVSLFATVSCGCMTQLYKNTFFRGGDLAAIYTPDAQYCQKMCTFHPRCLLFSFLAVTPPKE TNKRFGCFMKESITGTLPRIHRTGAISGHSLKQCGHQISACHRDIYKGLDMRGSNFNISKTDNIEECQKL CTNNFHCQFFTYATSAFYRPEYRKKCLLKHSASGTPTSIKSADNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHSA FADLNVSQVITPDAFVCRTICTFHPNCLFFTFYTNEW ETESQRNVCFLKTSKSGRPSPPIPQENAISGYS LLTCRKTRPEPCHSKIYSGVDFEGEELNVTFVQGADVCQETCTKTIRCQFFIYSLLPQDCKEEGCKCSLR LSTDGSPTRITYGMQGSSGYSLRLCKLVDSPDCTTKINARIVGGTNASLGEWPWQVSLQVKLVSQTHLCG GSIIGRQW VLTAAHCFDGIPYPDVW RIYGGILSLSEITKETPSSRIKELI1HQEYKVSEG NYDIALIKLQ TPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKEQGETQNILQKATIPLVPNEECQKKYRDYVINKQ MICAGYKEGGTDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCGRKDQPGVYTKVSEYMDWILEKTQSSDV RALETSSA
A R N m d e ca lic re ín a p la s m á tic a d e ra tón (A C C E S O : N M _ 008455.2 )
> gi|236465804|ref|NM_008455.2| calicreína B de Mus musculus, plasma 1 (Klkbl), ARNm AGACCGCCCTCGGTGCCATATTCAGAGGGCTTGAAGACCATCTTCATGTGAAGACTCCCTCTCCTCCAGA ACCACAACGTGACCATCCTTCCAGGATGATTTTATTCAACCGAGTGGGTTATTTTGTTTCCTTGTTTGCT ACCGTCTCCTGTGGGTGTATGACTCAACTGTATAAAAATACCTTCTTCAGAGGTGGGGATCTAGCTGCCA TCTACACCCCAGATGCCCAGTACTGTCAGAAGATGTGCACTTTTCACCCCAGGTGCCTGCTGTTCAGCTT TCTCGCCGTGACTCCACCCAAAGAGACAAATAAACGGTTTGGTTGCTTCATGAAAGAGAGCATTACAGGG ACTTTGCCAAGAATACACCGGACAGGGGCCATTTCTGGTCATTCTTTAAAGCAGTGTGGCCATCAAATAA GTGCTTGCCACCGAGACATATACAAAGGACTTGATATGAGAGGGTCCAACTTTAATATCTCTAAGACCGA CAATATTGAAGAATGCCAGAAACTGTGCACAAATAATTTTCACTGCCAATTTTTCACATATGCTACAAGT GCATTTTACAGACCAGAGTACCGGAAGAAGTGCCTGCTGAAGCACAGTGCAAGCGGAACACCCACCAGCA TAAAGTCAGCGGACAACCTGGTGTCTGGATTCTCACTGAAGTCCTGTGCGCTTTCGGAGATAGGTTGCCC CATGGATATTTTCCAGCACTCTGCCTTTGCAGACCTGAATGTAAGCCAGGTCATCACCCCCGATGCCTTT GTGTGTCGCACCATCTGCACCTTCCATCCCAACTGCCTTTTCTTCACGTTCTACACGAATGAATGGGAGA CAGAATCACAGAGAAATGTTTGTTTTCTTAAGACGTCTAAAAGTGGAAGACCAAGTCCCCCTATTCCTCA AGAAAACGCTATATCTGGATATAGTCTCCTCACCTGCAGAAAAACTCGCCCTGAACCCTGCCATTCCAAA ATTTACTCTGGAGTTGACTTTGAAGGGGAAGAACTGAATGTGACCTTCGTGCAAGGAGCAGATGTCTGCC AAGAGACTTGTACAAAGACAATCCGCTGCCAGTTTTTTATTTACTCCTTACTCCCCCAAGACTGCAAGGA GGAGGGGTGTAAATGTTCCTTAAGGTTATCCACAGATGGCTCCCCAACTAGGATCACCTATGGCATGCAG GGGAGCTCCGGTTATTCTCTGAGATTGTGTAAACTTGTGGACAGCCCTGACTGTACAACAAAAATAAATG CACGTATTGTGGGAGGAACAAACGCTTCTTTAGGGGAGTGGCCATGGCAGGTCAGCCTGCAAGTGAAGCT GGTATCTCAGACCCATTTGTGTGGAGGGTCCATCATTGGTCGCCAATGGGTACTGACAGCTGCCCATTGC TTTGATGGAATTCCCTATCCAGATGTGTGGCGTATATATGGCGGAATTCTTAGTCTGTCCGAGATTACGA AAGAAACGCCTTCCTCGAGAATAAAGGAGCTTATTATTCATCAGGAATACAAAGTCTCAGAAGGCAATTA TGATATTGCCTTAATAAAGCTTCAGACGCCCCTGAATTATACTGAATTCCAAAAACCAATATGCCTGCCT TCCAAAGCTGACACAAATACAATTTATACCAACTGTTGGGTGACTGGATGGGGCTACACGAAGGAACAAG GTGAAACGCAAAATATTCTACAAAAGGCTACTATTCCTTTGGTACCAAATGAAGAATGCCAGAAAAAATA CAGAGATTATGTTATAAACAAGCAGATGATCTGTGCTGGCTACAAAGAAGGCGGAACAGACGCTTGTAAG GGAGATTCCGGTGGCCCCTTAGTCTGTAAACACAGTGGACGGTGGCAGTTGGTGGGTATCACCAGCTGGG GTGAAGGCTGCGCCCGCAAGGACCAACCAGGAGTCTACACCAAAGTTTCTGAGTACATGGACTGGATATT GGAGAAGACACAGAGCAGTGATGTAAGAGCTCTGGAGACATCTTCAGCCTGAGGAGGCTGGGTACCAAGG AGGAAGAACCCAGCTGGCTTTACCACCTGCCCTCAAGGCAAACTAGAGCTCCAGGATTCTCGGCTGTAAA ATGTTGATAATGGTGTCTACCTCACATCCGTATCATTGGATTGAAAATTCAAGTGTAGATATAGTTGCTG AAGACAGCGTTTTGCTCAAGTGTGTTTCCTGCCTTGAGTCACAGGAGCTCCAATGGGAGCATTACAAAGA TCACCAAGCTTGTTAGGAAAGAGAATGATCAAAGGGTTTTATTAGGTAATGAAATGTCTAGATGTGATGC AATTGAAAAAAAGACCCCAGATTCTAGCACAGTCCTTGGGACCATTCTCATGTAACTGTTGACTCTGGAC CTCAGCAGATCTCAGAGTTACCTGTCCACTTCTGACATTTGTTTATTAGAGCCTGATGCTATTCTTTCAA GTGGAGCAAAAAAAAAAAAAAA
C a lic re ín a p la s m á tic a d e rata (A C C E S O : N P _ 036857 ,2 )
> gi|162138905|ref|NP_036857.2| calicreína B, plasma 1 [Rattus norvegicus]
MILFKQVGYFVSLFATVSCGCLSQLYANTFFRGGDLAAIYTPDAQHCQKMCTFHPRCLLFSFLAVSPTKE TDKRFGCFMKESITGTLPRIHRTGAISGHSLKQCGHQLSACHQDIYEGLDMRGSNFNISKTDSIEECQKL CTNNIHCQFFTYATKAFHRPEYRKSCLLKRSSSGTPTSIKPVDNLVSGFSLKSCALSEIGCPMDIFQHFA FADLNVSHW TPDAFVCRTVCTFHPNCLFFTFYTNEWETESQRNVCFLKTSKSGRPSPPIIQENAVSGYS LFTCRKARPEPCHFKIYSGVAFEGEELNATFVQGADACQETCTKTIRCQFFTYSLLPQDCKAEGCKCSLR LSTDGSPTRITYEAQGSSGYSLRLCKWESSDCTTKINARIVGGTNSSLGEWPWQVSLQVKLVSQNHMCG GSIIGRQW ILTAAHCFDGIPYPDVW RIYGGILNLSEITNKTPFSSIKELI1HQKYKM SEGSYDIALIKLQ TPLNYTEFQKPICLPSKADTNTIYTNCWVTGWGYTKERGETQNILQKATIPLVPNEECQKKYRDYVITKQ MICAGYKEGGIDACKGDSGGPLVCKHSGRWQLVGITSWGEGCARKEQPGVYTKVAEYIDWILEKIQSSKE RALETSPA
m e c a c re n a p a s m c a e ra a : _
> gi|162138904|ref|NM_012725.2| calicreína B de Rattus norvegicus, plasma 1 (Klkbl), ARNm TGAAGACTAGCTTCATGTGAAGACTCCTTCTCCTCCAGCAGCACAAAGCAACCATCCTTCCAGGATGATT TTATTCAAACAAGTGGGTTATTTTGTTTCCTTGTTCGCTACAGTTTCCTGTGGGTGTCTGTCACAACTGT ATGCAAATACCTTCTTCAGAGGTGGGGATCTGGCTGCCATCTACACCCCGGATGCCCAGCACTGTCAGAA GATGTGCACGTTTCACCCCAGGTGCCTGCTCTTCAGCTTCCTTGCCGTGAGTCCAACCAAGGAGACAGAT AAAAGGTTTGGGTGCTTCATGAAAGAGAGCATTACAGGGACTTTGCCAAGAATACACCGGACAGGGGCCA TTTCTGGTCATTCTTTAAAACAGTGTGGCCATCAATTAAGTGCTTGCCACCAAGACATATACGAAGGACT GGATATGAGAGGGTCCAACTTTAATATATCTAAGACCGACAGTATTGAAGAATGCCAGAAACTGTGCACA AATAATATTCACTGCCAATTTTTCACATATGCTACAAAAGCATTTCACAGACCAGAGTACAGGAAGAGTT GCCTGCTGAAGCGCAGTTCAAGTGGAACGCCCACCAGTATAAAGCCAGTGGACAACCTGGTGTCTGGATT CTCACTGAAGTCCTGTGCTCTCTCAGAGATCGGTTGCCCCATGGATATTTTCCAGCACTTTGCCTTTGCA GACCTGAATGTAAGCCATGTCGTCACCCCCGATGCCTTCGTGTGTCGCACCGTTTGCACCTTCCATCCCA ACTGCCTCTTCTTCACATTCTACACGAATGAGTGGGAGACGGAATCACAGAGGAATGTTTGTTTTCTTAA GACATCTAAAAGTGGAAGACCAAGTCCCCCTATTATTCAAGAAAATGCTGTATCTGGATACAGTCTCTTC ACCTGCAGAAAAGCTCGCCCTGAACCCTGCCATTTCAAGATTTACTCTGGAGTTGCCTTCGAAGGGGAAG AACTGAACGCGACCTTCGTGCAGGGAGCAGATGCGTGCCAAGAGACTTGTACAAAGACCATCCGCTGTCA GTTTTTTACTTACTCA TTGCTTCCCCAAGACTGCAAGGCAGAGGGGTGTAAATGTTCCTTAAGGTTATCC ACGGATGGCTCTCCAACTAGGATCACCTATGAGGCACAGGGGAGCTCTGGTTATTCTCTGAGACTGTGTA AAGTTGTGGAGAGCTCTGACTGTACGACAAAAATAAATGCACGTATTGTGGGAGGAACAAACTCTTCTTT AGGAGAGTGGCCATGGCAGGTCAGCCTGCAAGTAAAGTTGGTTTCTCAGAATCATATGTGTGGAGGGTCC ATCATTGGACGCCAATGGATACTGACGGCTGCCCATTGCTTTGATGGGATTCCCTATCCAGACGTGTGGC GTATATATGGCGGGATTCTTAATCTGTCAGAGATTACAAACAAAACGCCTTTCTCAAGTATAAAGGAGCT TATTATTCATCAGAAATACAAAATGTCAGAAGGCAGTTACGATATTGCCTTAATAAAGCTTCAGACACCG TTGAATTATACTGAATTCCAAAAACCAATATGCCTGCCTTCCAAAGCTGACACAAATACAATTTATACCA ACTGCTGGGTGACTGGATGGGGCTACACAAAGGAACGAGGTGAGACCCAAAATATTCTACAAAAGGCAAC TATTCCCTTGGTACCAAATGAAGAATGCCAGAAAAAATATAGAGATTATGTTATAACCAAGCAGATGATC TGTGCTGGCTACAAAGAAGGTGGAATAGATGCTTGTAAGGGAGATTCCGGTGGCCCCTTAGTTTGCAAAC ATAGTGGAAGGTGGCAGTTGGTGGGTATCACCAGCTGGGGCGAAGGCTGTGCCCGCAAGGAGCAACCAGG AGTCTACACCAAAGTTGCTGAGTACATTGACTGGATATTGGAGAAGATACAGAGCAGCAAGGAAAGAGCT CTGGAGACATCTCCAGCATGAGGAGGCTGGGTACTGATGGGGAAGAGCCCAGCTGGCACCAGCTTTACCA CCTGCCCTCAAGTCCTACTAGAGCTCCAGAGTTCTCTTCTGCAAAATGTCGATAGTGGTGTCTACCTCGC ATCCTTACCATAGGATTAAAAGTCCAAATGTAGACACAGTTGCTAAAGACAGCGCCATGCTCAAGCGTGC TTCCTGCCTTGAGCAACAGGAACGCCAATGAGAACTATCCAAAGATTACCAAGCCTGTTTGGAAATAAAA TGGTCAAAGGATTTTTATTAGGTAGTGAAATTAGGTAGTTGTCCTTGGAACCATTCTCATGTAACTGTTG ACTCTGGACCTCAGCAGATCACAGTTACCTTCTGTCCACTTCTGACATTTGTGTACTGGAACCTGATGCT GTTCTTCCACTTGGAGCAAAGAACTGAGAAACCTGGTTCTATCCATTGGGAAAAAGAGATCTTTGTAACA TTTCCTTTACAATAAAAAGATGTTCTACTTGGACTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
B ib lio te c a s d e p res en tac ió n
Una biblioteca de presentación es un conjunto de entidades; cada entidad incluye un componente de polipéptido accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente de polipéptido. El componente de polipéptido varía de manera que se representen diferentes secuencias de aminoácidos. El componente de polipéptido puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, desde tres aminoácidos hasta más de 300 aminoácidos. Una entidad de biblioteca de presentación puede incluir más de un componente de polipéptido, por ejemplo, las dos cadenas de polipéptidos de un sFab. En una implementación a modo de ejemplo, se puede usar una biblioteca de presentación para identificar proteínas que se unen a calicreína plasmática. En una selección, el componente de polipéptido de cada miembro de la biblioteca se sonda con calicreína plasmática (o fragmento de la misma) y si el componente de polipéptido se une a la calicreína plasmática, se identifica el miembro de la biblioteca de presentación, normalmente por retención sobre un soporte.
Se recuperan del soporte los miembros retenidos de la biblioteca de presentación y se analizan. El análisis puede incluir la amplificación y una selección posterior en condiciones similares o diferentes. Por ejemplo, se pueden alternar selecciones positivas y negativas. El análisis también puede incluir determinar la secuencia de aminoácidos del componente de polipéptido y la purificación del componente de polipéptido para caracterización detallada.
Se pueden usar una variedad de formatos para las bibliotecas de presentación. Ejemplos incluyen los siguientes.
P re s e n ta c ió n en fag o s : El componente de proteína normalmente se une covalentemente a una proteína de la cubierta del bacteriófago. El enlace resulta de la traducción de un ácido nucleico que codifica el componente de proteína fusionado con la proteína de la cubierta. El enlace puede incluir un conector peptídico flexible, un sitio de proteasa, o un aminoácido incorporado como resultado de la supresión de un codón de terminación. La presentación en fagos se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274:18218-30; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8 y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol.
23(3)344-8. Se puede cultivar y recoger el bacteriófago que presente el componente de proteína usando métodos estándares de preparación de fagos, por ejemplo, precipitación con PEG de medios de crecimiento. Después de la selección de fagos de presentación individuales, el ácido nucleico que codifica los componentes de proteína seleccionados se puede aislar de células infectadas con los fagos seleccionados o de los propios fagos, después de la amplificación. Se pueden recoger colonias o placas individuales, aislar el ácido nucleico y secuenciar.
O tro s fo rm a to s d e p re s e n ta c ió n . Otros formatos de presentación incluyen presentación basada en células (véase, por ejemplo, el documento WO 03/029456), fusiones de proteína-ácido nucleico (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 6.207.446), presentación de ribosomas (véase, por ejemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231 (1-2):119-35), y presentación periplásmica en E. c o li (J Immunol Methods. 2005 Nov 22; PMID: 16337958).
A rm a zo n e s . Los armazones útiles para la presentación incluyen: anticuerpos (por ejemplo, fragmentos Fab, moléculas Fv monocatenarias (scFv), anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de camélido y anticuerpos camelizados); receptores de linfocitos T; proteínas de MHC; dominios extracelulares (por ejemplo, repeticiones de fibronectina tipo III, repeticiones de EGF); inhibidores de la proteasa (por ejemplo, dominios de Kunitz, ecotina, BPTI, etc.); repeticiones de TPR; estructuras tri-lámina; dominios de dedos de cinc; proteínas de unión a ADN; particularmente proteínas de unión a ADN monomérico; proteínas de unión a ARN; enzimas, por ejemplo, proteasas (particularmente proteasas inactivadas), RNasa; chaperonas, por ejemplo, tiorredoxina y proteínas de choque térmico; dominios de señalización intracelular (tales como dominios SH2 y SH3); péptidos lineales y restringidos; y sustratos peptídicos lineales. Las bibliotecas de presentación pueden incluir diversidad sintética y/o natural. Véase, por ejemplo, el documento US 2004-0005709.
También se puede usar tecnología de presentación para obtener proteínas de unión (por ejemplo, anticuerpos) que se unen a epítopes particulares de una diana. Esto se puede hacer, por ejemplo, usando moléculas no diana de competición que carecen del epítope particular o se mutan dentro del epítope, por ejemplo, con alanina. Dichas moléculas no diana se pueden usar en un procedimiento de selección negativa como se describe a continuación, como moléculas de competición cuando se unen a una biblioteca de presentación a la diana, o como un agente de pre-elución, por ejemplo, para capturar en una disolución de lavado miembros de biblioteca de presentación de disociación que no son específicos para la diana.
S e le cc ió n ite ra tiva . En una realización preferida, se usa tecnología de bibliotecas de presentación en un modo iterativo. Se usa una primera biblioteca de presentación para identificar una o más proteínas de unión para una diana. Estas proteínas de unión identificadas se varían entonces usando un método de mutagénesis para formar una segunda biblioteca de presentación. Las proteínas de unión de mayor afinidad se seleccionan entonces de la segunda biblioteca, por ejemplo, usando condiciones de mayor rigurosidad o de unión y de lavado más competitivas.
En algunas implementaciones, la mutagénesis se dirige a regiones en la interfase de unión. Si, por ejemplo, las proteínas de unión identificadas son anticuerpos, entonces la mutagénesis se puede dirigir a las regiones CDR de las cadenas pesadas o ligeras como se describe en el presente documento. Además, la mutagénesis se puede dirigir a regiones estructurales cerca de o adyacentes a las CDR. En el caso de anticuerpos, la mutagénesis también se puede limitar a una o algunas de las CDR, por ejemplo, para hacer mejoras escalonadas precisas. Las técnicas de mutagénesis a modo de ejemplo incluyen: PCR propensa a error, recombinación, barajado de ADN, mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis en casete.
En un ejemplo de selección iterativa, se usan los métodos descritos en el presente documento para identificar en primer lugar una proteína de una biblioteca de presentación que se une a calicreína plasmática, con al menos una especificidad de unión mínima por una diana o una actividad mínima, por ejemplo, una constante de disociación en equilibrio por la unión de menos de 0,5 nM, 1 nM, 10 nM o 100 nM. Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas identificadas iniciales se usan como ácido nucleico molde para la introducción de variaciones, por ejemplo, para identificar una segunda proteína que tiene propiedades potenciadas (por ejemplo, afinidad de unión, cinética o estabilidad) con respecto a la proteína inicial.
S e le cc ió n de d is o c ia c ió n . Puesto que una velocidad de disociación lenta puede ser predictiva de alta afinidad, particularmente con respecto a interacciones entre polipéptidos y sus dianas, se pueden usar los métodos descritos en el presente documento para aislar proteínas de unión con una velocidad de disociación cinética deseada (por ejemplo, reducida) para una interacción de unión con una diana.
Para seleccionar proteínas de unión de disociación lenta de una biblioteca de presentación, la biblioteca se pone en contacto con una diana inmovilizada. La diana inmovilizada se lava entonces con una primera disolución que elimina las biomoléculas no específicamente o débilmente unidas. Entonces, las proteínas de unión unidas se eluyen con una segunda disolución que incluye una cantidad de saturación de diana libre o un anticuerpo monoclonal de competición de alta afinidad específico de diana, es decir, duplicados de la diana que no se unen a la partícula. La diana libre se une a biomoléculas que se disocian de la diana. La re-unión se previene eficazmente por la cantidad de saturación de diana libre con respecto a la concentración mucho más baja de diana inmovilizada.
La segunda disolución puede tener condiciones de disolución que son sustancialmente fisiológicas o que son rigurosas. Normalmente, las condiciones de disolución de la segunda disolución son idénticas a las condiciones de disolución de la primera disolución. Se recogen fracciones de la segunda disolución en orden temporal para distinguir fracciones tempranas de tardías. Las fracciones tardías incluyen biomoléculas que se disocian a una tasa más lenta de la diana que las biomoléculas en las fracciones tempranas.
Además, también es posible recuperar miembros de la biblioteca de presentación que siguen unidos a la diana, incluso después de la prolongada incubación. Éstos se pueden o bien disociar usando condiciones caotrópicas o bien se pueden amplificar mientras están unidos a la diana. Por ejemplo, se puede poner en contacto el fago unido a la diana con células bacterianas.
Selección o cribado de especificidad. Los métodos de cribado de bibliotecas de presentación descritos en el presente documento pueden incluir un proceso de selección o cribado que descarta miembros de bibliotecas de presentación que se unen a una molécula no diana. Ejemplos de molécula no diana incluyen estreptavidina en perlas magnéticas, agentes de bloqueo tales como albúmina de suero bovino, leche bovina no grasa, proteína de soja, cualquier anticuerpo monoclonal de captura o de inmovilización diana, o células no transfectadas que no expresan la diana.
En una implementación, se usa una denominada etapa de "selección negativa" para discriminar entre la diana y la molécula no diana relacionada y una molécula no diana relacionada, pero distinta. La biblioteca de presentación o un conjunto de la misma se pone en contacto con la molécula no diana. Se recogen los miembros de la muestra que no se unen a la no diana y se usan en selecciones posteriores para unirse a la molécula diana o incluso para selecciones negativas posteriores. La etapa de selección negativa puede ser antes o después de la selección de los miembros de biblioteca que se unen a la molécula diana.
En otra implementación, se usa una etapa de cribado. Después de que se aíslen los miembros de la biblioteca de presentación para la unión a la molécula diana, se prueba cada miembro de la biblioteca aislado para su capacidad para unirse a una molécula no diana (por ejemplo, una no diana enumerada anteriormente). Por ejemplo, se puede usar un cribado de ELISA de alto rendimiento para obtener estos datos. El cribado de ELISA también se puede usar para obtener datos cuantitativos por la unión de cada miembro de la biblioteca a la diana, así como para la reactividad de especies cruzadas con dianas relacionadas o subunidades de la diana (por ejemplo, calicreína plasmática) y también en condiciones diferentes tales como pH 6 o pH 7,5. Se comparan los datos de unión de no diana y diana (por ejemplo, usando un ordenador y software) para identificar miembros de la biblioteca que se unen específicamente a la diana.
O tras b ib lio te c a s d e e x p re s ió n a m o d o d e e je m p lo
Se pueden usar otros tipos de colecciones de proteínas (por ejemplo, bibliotecas de expresión) para identificar proteínas con una propiedad particular (por ejemplo, capacidad para unirse a calicreína plasmática), que incluyen, por ejemplo, matrices de anticuerpos de proteína (véase, por ejemplo, De Wildt et al. (2000) Nat. Biotechnol. 18:989-994), bibliotecas lambda gt11, bibliotecas de dos híbridos, etc.
B ib lio te c a s a m o d o d e e je m p lo
Es posible inmunizar un primate no humano y recuperar los genes de anticuerpo de primate que se pueden presentar en fago (véase más adelante). A partir de dicha biblioteca, se pueden seleccionar anticuerpos que se unen al antígeno usado en la inmunización. Véanse, por ejemplo, Vaccine. (2003) 22(2):257-67 o Immunogenetics. (2005) 57(10):730-8. Así, se podrían obtener anticuerpos de primate que se unen e inhiben la calicreína plasmática inmunizando un chimpancé o macaco y usando una variedad de medios para seleccionar o cribar los anticuerpos de primate que se unen e inhiben la calicreína plasmática. También se pueden preparar quimeras de Fab primatizados con regiones constantes humanas, véase Curr Opin Mol Ther. (2004) 6(6):675-83. "Los anticuerpos PRIMATIZADOS, genéticamente manipulados de mono macaco cinomolgo y componentes humanos son estructuralmente indistinguibles de los anticuerpos humanos. Por tanto, es menos probable que causen reacciones adversas en seres humanos, haciéndolos posiblemente aptos para el tratamiento crónico a largo plazo" Curr Opin Investig Drugs. (2001) 2(5):635-8.
Un tipo a modo de ejemplo de biblioteca presenta un conjunto diverso de polipéptidos, cada uno de los cuales incluye un dominio de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina. Son de interés las bibliotecas de presentación donde los miembros de la biblioteca incluyen dominios de inmunoglobina de primate o "primatizados" (por ejemplo, tales como de humano, primate no humano o "humanizados") (por ejemplo, dominios variables de inmunoglobina) o Fabs primatizados quiméricos con regiones constantes humanas. Se pueden usar las bibliotecas de dominios de inmunoglobina humanos o humanizados para identificar anticuerpos humanos o "humanizados" que, por ejemplo, reconocen antígenos humanos. Debido a que las regiones constantes y las regiones estructurales del anticuerpo son humanas, estos anticuerpos pueden evitar ellos mismos ser reconocidos y dirigidos como antígenos cuando se administran a seres humanos. Las regiones constantes también se pueden optimizar para reclutar funciones efectoras del sistema inmunitario humano. El proceso de selección por presentación in v itro supera la incapacidad de un sistema inmunitario humano normal de generar anticuerpos contra antígenos propios.
Una biblioteca de presentación de anticuerpos típica muestra un polipéptido que incluye un dominio VH y un dominio VL. Un "dominio de inmunoglobulina" se refiere a un dominio del dominio variable o constante de moléculas de inmunoglobulina. Los dominios de inmunoglobulina normalmente contienen dos hojas p formadas de aproximadamente siete cadenas p y un enlace disulfuro conservado (véase, por ejemplo, A. F. Williams and A. N.
Barclay, 1988, Ann. Rev. Immunol. 6:381 -405). La biblioteca de presentación puede presentar el anticuerpo como un fragmento Fab (por ejemplo, usando dos cadenas de polipéptidos) o un Fv monocatenario (por ejemplo, usando un única cadena de polipéptidos). También se pueden usar otros formatos.
Como en el caso de Fab y otros formatos, el anticuerpo presentado puede incluir una o más regiones constantes como parte de una cadena ligera y/o pesada. En una realización, cada cadena incluye una región constante, por ejemplo, como en el caso de un Fab. En otras realizaciones, se presentan regiones constantes adicionales.
Las bibliotecas de anticuerpos se pueden construir por varios procesos (véanse, por ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30; Hoogenboom et al., 1998, Immunotechnology 4:1-20; Hoogenboom et al., 2000, Immunol. Today 21:371-378, y Hoet et al. (2005) Nat Biotechnol. 23(3):344-8. Además, los elementos de cada proceso se pueden combinar con los de otros procesos. Los procesos se pueden usar de forma que se introduzca variación en un único dominio de la inmunoglobulina (por ejemplo, VH o VL) o en múltiples dominios de la inmunoglobulina (por ejemplo, VH y VL). La variación se puede introducir en un dominio variable de inmunoglobulina, por ejemplo, en la región de una o más de CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 y/o FR4, con referencia a dichas regiones de cualquiera y ambos de los dominios pesados y variables de la cadena ligera. Por ejemplo, la(s) variación (variaciones) se pueden introducir en las tres CDR de un dominio variable dado, o en CDR1 y CDR2, por ejemplo, de un dominio variable de la cadena pesada. Es factible cualquier combinación. En un proceso, se construyen bibliotecas de anticuerpos insertando diversos oligonucleótidos que codifican CDR en las regiones correspondientes del ácido nucleico. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar usando nucleótidos o trinucleótidos monoméricos. Por ejemplo, Knappik et al., 2000, J. Mol. Biol. 296:57-86 describen un método de construcción de CDR que codifican oligonucleótidos usando síntesis de trinucleótidos y un molde con sitios de restricción manipulados para aceptar los oligonucleótidos.
En otro proceso, se inmuniza un animal (por ejemplo, un roedor) con calicreína plasmática. El animal se refuerza opcionalmente con el antígeno para estimular adicionalmente la respuesta. Entonces se aíslan células del bazo del animal, y se amplifica ácido nucleico que codifica los dominios VH y/o VL y se clona para la expresión en la biblioteca de presentación.
En otro proceso más, se construyen bibliotecas de anticuerpo a partir de ácido nucleico amplificado de genes de inmunoglobulina intactos de la línea germinal. El ácido nucleico amplificado incluye ácido nucleico que codifica el dominio VH y/o dominio VL. Las fuentes de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulina se describen más adelante. La amplificación puede incluir PCR, por ejemplo, con cebadores que se hibridan con la región constante, u otro método de amplificación.
Se pueden obtener dominios de inmunoglobulina que codifican ácido nucleico de las células inmunitarias de, por ejemplo, un primate (por ejemplo, un humano), ratón, conejo, camello o roedor. En un ejemplo, las células se seleccionan para una propiedad particular. Se pueden seleccionar linfocitos B en diversas etapas de madurez. En otro ejemplo, los linfocitos B son intactos.
En una realización, se usa citometría activada por fluorescencia (FACS) para clasificar linfocitos B que expresan moléculas de IgM, IgD o IgG unidas a la superficie. Además, se pueden aislar linfocitos B que expresan diferentes isotipos de IgG. En otra realización preferida, los linfocitos B o T se cultivan in vitro. Las células se pueden estimular in vitro, por ejemplo, cultivando con células nodrizas o añadiendo mitógenos u otros reactivos inmunomoduladores, tales como anticuerpos contra CD40, ligando de CD40 o CD20, miristato-acetato de forbol, lipopolisacárido bacteriano, concanavalina A, fitohemaglutinina o mitógeno de fitolaca.
En otra realización, las células se aíslan de un sujeto que tiene una enfermedad o afección descrita en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática.
En una realización preferido, las células han activado un programa de hipermutación somática. Las células se pueden estimular para experimentar mutagénesis somática de genes de inmunoglobulina, por ejemplo, mediante tratamiento con anticuerpos anti-inmunoglobulina, anti-CD40 y anti-CD38 (véase, por ejemplo, Bergthorsdottir et al., 2001, J. Immunol. 166:2228). En otra realización, las células son intactas.
Se puede aislar el ácido nucleico que codifica un dominio variable de inmunoglobulina de un repertorio natural siguiendo un método a modo de ejemplo. En primer lugar, se aísla ARN de la célula inmunitaria. Se separan ARNm de longitud completa (es decir, tapados) (por ejemplo, degradando ARN sin tapar con fosfatasa intestinal bovina). Entonces se retira la tapa con pirofosfatasa ácida de tabaco y se usa transcripción inversa para producir el ADNc. La transcripción inversa de la primera cadena (antisentido) se puede hacer en cualquier modo con cualquier cebador adecuado. Véase, por ejemplo, de Haard et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:18218-30. La región de unión del cebador puede ser constante entre diferentes inmunoglobulinas, por ejemplo, con el fin de transcribir de forma inversa diferentes isotipos de inmunoglobulina. La región de unión del cebador también puede ser específica para un isotipo particular de inmunoglobulina. Normalmente, el cebador es específico para una región que está 3' con respecto a una secuencia que codifica al menos una CDR. En otra realización, se pueden usar cebadores de poli-dT (y se pueden preferir para los genes de la cadena pesada).
Se puede ligar una secuencia sintética al extremo 3' de la hebra transcrita de forma inversa. Se puede usar la secuencia sintética como sitio de unión a cebador para la unión del cebador directo durante la amplificación por PCR después de la transcripción inversa. El uso de la secuencia sintética puede obviar la necesidad de usar un conjunto de cebadores directos diferentes para capturar completamente la diversidad disponible.
Entonces se amplifica el gen que codifica el dominio variable, por ejemplo, usando una o más rondas. Si se usan múltiples rondas, se pueden usar cebadores anidados para la elevada fidelidad. Entonces se clona el ácido nucleico amplificado en un vector de biblioteca de presentación.
M éto d o s d e c rib a d o se c u n d a rio
Después de seleccionar miembros de biblioteca candidatos que se unen a una diana, cada miembro de biblioteca candidato se puede analizar adicionalmente, por ejemplo, para caracterizar adicionalmente sus propiedades de unión para la diana, por ejemplo, calicreína plasmática. Cada miembro de biblioteca candidato se puede someter a uno o más ensayos de cribado secundarios. El ensayo puede ser para una propiedad de unión, una propiedad catalítica, una propiedad inhibidora, una propiedad fisiológica (por ejemplo, citotoxicidad, eliminación renal, inmunogenicidad), una propiedad estructural (por ejemplo, estabilidad, conformación, estado de oligomerización) u otra propiedad funcional. Se puede usar repetidamente el mismo ensayo, pero con condiciones variables, por ejemplo, para determinar el pH, sensibilidades iónicas o térmicas.
Según convenga, los ensayos pueden usar directamente un miembro de biblioteca de presentación, un polipéptido recombinante producido a partir del ácido nucleico que codifica el polipéptido seleccionado, o un péptido sintético sintetizado basándose en la secuencia del polipéptido seleccionado. En el caso de Fabs seleccionados, los Fab se pueden evaluar o se puede modificar y producir como proteínas de IgG intactas. Los ensayos a modo de ejemplo para las propiedades de unión incluyen los siguientes.
E L IS A . Se pueden evaluar proteínas de unión usando un ensayo de ELISA. Por ejemplo, cada proteína se pone en contacto con una placa de microtitulación cuya superficie inferior se ha recubierto con la diana, por ejemplo, una cantidad limitante de la diana. La placa se lava con tampón para retirar los polipéptidos no específicamente unidos. Entonces, se determina la cantidad de la proteína de unión unida a la diana sobre la placa sondando la placa con un anticuerpo que puede reconocer la proteína de unión, por ejemplo, una marca o porción constante de la proteína de unión. El anticuerpo se asocia con un sistema de detección (por ejemplo, una enzima tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante (HRP) que produce un producto colorimétrico cuando se proporcionan sustratos apropiados).
E n sa yo s d e u n ió n h o m o g én ea . Se puede analizar la capacidad de una proteína de unión descrita en el presente documento para unirse a una diana usando un ensayo homogéneo, es decir, después de que se añadan todos los componentes del ensayo, no se requieren manipulaciones adicionales de líquidos. Por ejemplo, se puede usar transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) como ensayo homogéneo (véase, por ejemplo, Lakowicz et al., patente de EE. UU. N° 5.631.169; Stavrianopoulos, et al., patente de EE. UU. N° 4.868.l03). Se selecciona una marca de fluoróforo sobre la primera molécula (por ejemplo, la molécula identificada en la fracción) de forma que su energía fluorescente emitida se pueda absorber por una marca fluorescente sobre una segunda molécula (por ejemplo, la diana) si la segunda molécula está en proximidad a la primera molécula. La marca fluorescente sobre la segunda molécula fluoresce cuando absorbe la energía transferida. Puesto que la eficiencia de transferencia de energía entre las marcas está relacionada con la distancia que separa las moléculas, se puede evaluar la relación espacial entre las moléculas. En una situación en la que la unión ocurre entre las moléculas, la emisión fluorescente de la marca de molécula 'aceptora' en el ensayo debe ser máxima. Se puede medir convenientemente un evento de unión que está configurado para monitorizar por FRET mediante medios de detección fluorométricos estándares, por ejemplo, usando un fluorímetro. Por valoración de la cantidad de la primera o segunda molécula de unión, se puede generar una curva de unión para estimar la constante de unión en equilibrio.
Otro ejemplo de un ensayo homogéneo es ALFASCREEN™ (Packard Bioscience, Meriden CT). ALFASCREEN™ usa dos perlas marcadas. Una perla genera oxígeno singlete cuando se excita por un láser. La otra perla genera una señal de luz cuando el oxígeno singlete difunde desde la primera perla y colisiona con ella. La señal solo se genera cuando las dos perlas están en proximidad. Se puede unir una perla al miembro de la biblioteca de presentación, la otra a la diana. Se miden las señales para determinar el grado de unión.
R e s o n a n c ia d e p la s m o n e s s u p e rfic ia le s (S P R ). Se puede analizar la interacción de proteína de unión y una diana usando SPR. SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) detecta interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes. Los cambios en la masa en la superficie de unión (indicativos de un evento de unión) del chip de BIA dan como resultado alteraciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmones superficiales (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se mide como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas. Los métodos para usar SPR se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N° 5.641.640; Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y los recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia).
Se puede usar la información de SPR para proporcionar una medida precisa y cuantitativa de la constante de disociación en equilibrio (Kd), y parámetros cinéticos, que incluyen Kas y Kdis, para la unión de una proteína de unión a una diana. Dichos datos se pueden usar para comparar diferentes biomoléculas. Por ejemplo, se pueden comparar proteínas seleccionadas de una biblioteca de expresión con proteínas identificadas que tienen alta afinidad por la diana o que tienen una Kdis lenta. Esta información también se puede usar para desarrollar relaciones estructuraactividad (SAR). Por ejemplo, se pueden comparar los parámetros cinéticos y de unión en equilibrio de versiones maduras de una proteína original con los parámetros de la proteína original. Se pueden identificar los aminoácidos de variante en posiciones dadas que se correlacionan con parámetros de unión particulares, por ejemplo, alta afinidad y lenta Kdis. Esta información se puede combinar con modelado estructural (por ejemplo, usando modelado de homología, minimización de energía, o determinación de la estructura por cristalografía de rayos X o RMN). Como resultado, se puede formular y usar un entendimiento de la interacción física entre la proteína y su diana para guiar otros procesos de diseño.
E n sa yo s c e lu la re s . Se pueden cribar las proteínas de unión para la capacidad para unirse a células que expresan transitoria o establemente y muestran la diana de interés sobre la superficie celular. Por ejemplo, se pueden marcar fluorescentemente las proteínas de unión a calicreína plasmática y se puede detectar la unión a calicreína plasmática en presencia de ausencia de anticuerpo antagonista por un cambio en la intensidad de fluorescencia usando citometría de flujo, por ejemplo, una máquina de FACS.
O tro s m é to d o s a m o d o d e e je m p lo p ara o b te n e r p ro te ín a s d e un ió n a c a lic re ín a p la s m á tic a
Además del uso de las bibliotecas de presentación, se pueden usar otros métodos para obtener una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, anticuerpo). Por ejemplo, se puede usar la proteína de calicreína plasmática o un fragmento de la misma como un antígeno en un animal no humano, por ejemplo, un roedor.
En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible manipular cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de los loci de Ig humana. Usando la tecnología de hibridomas, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales (mAb) específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XEnOm o Us E™, Green et al, 1994, Nat. Gen. 7: 13-21; documentos US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996, y la solicitud PCT N° PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.
En otra realización, se obtiene un anticuerpo monoclonal del animal no humano, y entonces se modifica, por ejemplo, se humaniza o desinmuniza. Winter describe un método de injerto en c Dr que se puede usar para preparar los anticuerpos humanizados (solicitud de patente de R.U. GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; la patente de EE. UU. N° 5.225.539. Todas las CDR de un anticuerpo humano particular se pueden sustituir con al menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR se pueden sustituir con CDR no humanas. Solo es necesario sustituir el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.
Se pueden generar anticuerpos humanizados reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están directamente implicadas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Los métodos generales para generar anticuerpos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207, por Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214, y por Queen et al., patentes de EE. UU. N° 5.585.089, 5.693.761 y 5.693.762. Los métodos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Están disponibles numerosas fuentes de tal ácido nucleico. Por ejemplo, se pueden obtener ácidos nucleicos de un hibridoma que produce un anticuerpo contra una diana predeterminada, como se ha descrito anteriormente. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado, o fragmento del mismo, se pueden clonar entonces en un vector de expresión apropiado.
R e d u cc ió n d e la in m u n o g e n ic id a d d e p ro te ín a s d e u n ió n a ca lic re ín a p la s m á tic a
Se pueden modificar las proteínas de unión a calicreína plasmática de inmunoglobulina (por ejemplo, proteínas de unión a calicreína plasmática de IgG o Fab) para reducir la inmunogenicidad. Se desea inmunogenicidad reducida en proteínas de unión a calicreína plasmática previstas para su uso como terapéuticos, ya que reduce la probabilidad de que el sujeto desarrolle una respuesta inmunitaria contra la molécula terapéutica. Las técnicas útiles para reducir la inmunogenicidad de proteínas de unión a calicreína plasmática incluyen deleción/modificación de los posibles epítopes de linfocitos T humanos y "retromutación a la línea germinal" de secuencias fuera de las CDR (por ejemplo, región estructural y Fc).
Se puede modificar un anticuerpo de unión a calicreína plasmática por deleción específica de epítopes de linfocitos T humanos o "desinmunización", por ejemplo, por los métodos desvelados en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, se analizan las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo para péptidos que se une a la clase II de MHC; estos péptidos representan los posibles epítopes de linfocitos T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epítopes de linfocitos T, se puede aplicar un enfoque de modelado informático denominado "reconocimiento del plegamiento de péptidos", y además, se pueden buscar en una base de datos de péptidos de unión de la clase II de MHC humano motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR de la clase II de MHC, y así constituyen los posibles epítopes de linfocitos T. Los posibles epítopes de linfocitos T detectados se pueden eliminar sustituyendo números pequeños de restos de aminoácidos en las regiones variables, o preferentemente, por sustituciones de un único aminoácido. Se hacen sustituciones conservativas en la medida de lo posible, frecuentemente pero no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común en esta posición en las secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana se desvelan en Tomlinson, I.A. et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al., 1995, Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al., 1992, J. Mol. Bio.
227:799-817. El directorio V BASE proporciona un directorio completo de secuencias de la región variable de inmunoglobulina humana (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R.U.). Después de la desinmunización se identifican cambios, se pueden construir ácidos nucleicos que codifican Vh y Vl por mutagénesis u otros métodos de síntesis (por ejemplo, síntesis d e novo , sustitución de casetes, etc.). Opcionalmente, se puede fusionar la secuencia variable mutagenizada con una región constante humana, por ejemplo, IgG1 humana o regiones constantes k .
En algunos casos, un posible epítope de linfocitos T incluirá restos que se conoce o predice que son importantes para la función del anticuerpo. Por ejemplo, los posibles epítopes de linfocitos T están normalmente inclinados hacia las CDR. Además, los posibles epítopes de linfocitos T pueden ocurrir en restos de la región estructural importantes para la estructura y unión del anticuerpo. Los cambios para eliminar estos posibles epítopes requerirán en algunos casos más escrutinio, por ejemplo, haciendo y probando cadenas con y sin el cambio. Cuando sea posible, los posibles epítopes de linfocitos T que solapan las CDR se eliminaron por sustituciones fuera de las CDR. En algunos casos, una alteración dentro de una CDR es la única opción, y así se deben probar variantes con y sin esta sustitución. En otros casos, la sustitución requerida para retirar un posible epítope de linfocitos T es en una posición de resto dentro de la región estructural que podría ser crítica para la unión del anticuerpo. En estos casos, se deben probar las variantes con y sin esta sustitución. Así, en algunos casos se diseñaron varias regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras desinmunizadas de variante y se probaron diversas combinaciones de cadena pesada / ligera con el fin de identificar el anticuerpo desinmunizado óptimo. La elección del anticuerpo desinmunizado final se puede hacer entonces considerando la afinidad de unión de las diferentes variantes conjuntamente con el grado de desinmunización, es decir, el número de posibles epítopes de linfocitos T que quedan en la región variable. Se puede usar la desinmunización para modificar cualquier anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo que incluye una secuencia no humana, por ejemplo, un anticuerpo sintético, un anticuerpo murino, otro anticuerpo monoclonal no humano, o un anticuerpo aislado de una biblioteca de presentación.
Los anticuerpo de unión a calicreína plasmática se "retromutan a la línea germinal" invirtiendo uno o más aminoácidos no de la línea germinal en regiones estructurales a aminoácidos de la línea germinal correspondientes del anticuerpo, mientras que se retienen sustancialmente las propiedades de unión. También se pueden usar métodos similares en la región constante, por ejemplo, en dominios de inmunoglobulina constantes.
Los anticuerpos que se unen a calicreína plasmática, por ejemplo, un anticuerpo descrito en el presente documento, se pueden modificar con el fin de hacer las regiones variables del anticuerpo más similares a una o más secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, un anticuerpo puede incluir una, dos, tres o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, en una región estructural, CDR, o región constante, para hacerla más similar a una secuencia de referencia de la línea germinal. Un método de retromutación a la línea germinal a modo de ejemplo puede incluir identificar una o más secuencias de la línea germinal que son similares (por ejemplo, las más similares en una base de datos particular) a la secuencia del anticuerpo aislado. Las mutaciones (al nivel de aminoácidos) se hacen entonces en el anticuerpo aislado, ya sea gradualmente o en combinación con otras mutaciones. Por ejemplo, se hace una biblioteca de ácidos nucleicos que incluye secuencias que codifican algunas o todas las posibles mutaciones de la línea germinal. Entonces se evalúan los anticuerpos mutados, por ejemplo, para identificar un anticuerpo que tiene uno o más restos adicionales de la línea germinal con respecto al anticuerpo aislado y que es todavía útil (por ejemplo, tiene una actividad funcional). En una realización, se introducen tantos restos de la línea germinal en un anticuerpo aislado como sea posible.
En una realización, se usa mutagénesis para sustituir o insertar uno o más restos de la línea germinal en una región estructural y/o región constante. Por ejemplo, un resto de la región estructural y/o región constante de la línea germinal puede ser de una secuencia de la línea germinal que es similar (por ejemplo, el más similar) a la región no variable que se modifica. Después de la mutagénesis, se puede evaluar la actividad (por ejemplo, unión u otra actividad funcional) del anticuerpo para determinar si el resto o restos de la línea germinal son tolerados (es decir, no suprimen la actividad). Se puede realizar mutagénesis similar en las regiones estructurales.
Se puede realizar en diferentes formas la selección de una secuencia de la línea germinal. Por ejemplo, se puede seleccionar una secuencia de la línea germinal si cumple un criterio predeterminado para selectividad o similitud, por ejemplo, al menos un cierto porcentaje de identidad, por ejemplo, al menos 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5 % de identidad. La selección se puede realizar usando al menos 2, 3, 5 o 10 secuencias de la línea germinal. En el caso de CDR1 y CDR2, identificar una secuencia similar de la línea germinal puede incluir seleccionar dicha secuencia. En el caso de CDR3, identificar una secuencia similar de la línea germinal puede incluir seleccionar dicha secuencia, pero puede incluir usar dos secuencias de la línea germinal que contribuyen por separado a la porción del extremo amino y la porción del extremo carboxi de la secuencia. En otras implementaciones se usan más de una o dos secuencias de la línea germinal, por ejemplo, para formar una secuencia consenso.
En una realización, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita en el presente documento, una secuencia relacionada del dominio variable tiene al menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 100 % de las posiciones de aminoácidos de CDR que no son idénticas a restos en las secuencias de CDR de referencia, restos que son idénticos a restos en posiciones correspondientes en una secuencia de la línea germinal humana (es decir, una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido nucleico de la línea germinal humana).
En una realización, con respecto a una secuencia del dominio variable de referencia particular, por ejemplo, una secuencia descrita en el presente documento, una secuencia del dominio variable relacionada tiene al menos 30, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de las regiones FR idénticas a la secuencia de FR de una secuencia de la línea germinal humana, por ejemplo, una secuencia de la línea germinal relacionada con la secuencia del dominio variable de referencia.
Por consiguiente, es posible aislar un anticuerpo que tiene actividad similar a un anticuerpo de interés dado, pero es más similar a una o más secuencias de la línea germinal, particularmente una o más secuencias de la línea germinal humana. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser al menos 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 99,5 % idéntico a una secuencia de la línea germinal en una región fuera de las CDR (por ejemplo, regiones estructurales). Además, un anticuerpo puede incluir al menos 1, 2, 3, 4 o 5 restos de la línea germinal en una región CDR, siendo el resto de la línea germinal de una secuencia de la línea germinal similar (por ejemplo, el más similar) a la región variable que se modifica. Las secuencias de la línea germinal de interés primario son secuencias de la línea germinal humana. La actividad del anticuerpo (por ejemplo, la actividad de unión como se mide por KA) puede estar dentro de un factor o 100, 10, 5, 2, 0,5, 0,1 y 0,001 del anticuerpo original.
Se han determinado las secuencias de la línea germinal de genes de inmunoglobina humana y están disponibles de varias fuentes, que incluye INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM® (IMGT), y el directorio V BASE (compilado por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R.U.).
Las secuencias de referencia de la línea germinal a modo de ejemplo para Vkappa incluyen: O12/O2, O18/O8, A20, A30, L14, L1, L15, L4/18a, L5/L19, L8, L23, L9, L24, L11, L12, O11/O1, A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, A27, A11, L2/L16, L6, L20, L25, B3, B2, A26/A10 y A14. Véase, por ejemplo, Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-3.
Una secuencia de referencia de la línea germinal para el dominio variable de HC se puede basar en una secuencia que tiene estructuras canónicas particulares, por ejemplo, 1-3 estructuras en los bucles hipervariables H1 y H2. Las estructuras canónicas de bucles hipervariables de un dominio variable de inmunoglobulina se pueden deducir de su secuencia, como se describe en Chothia et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:799-817; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol.
227:776-798); y Tomlinson et al., 1995, EMBO J. 14(18):4628-38. Las secuencias a modo de ejemplo con una estructura 1-3 incluyen: DP-1, DP-8, DP-12, DP-2, DP-25, DP-15, DP-7, DP-4, DP-31, DP-32, DP-33, DP-35, DP-40, 7-2, hv3005, hv3005f3, DP-46, DP-47, DP-58, DP-49, DP-50, DP-51, DP-53 y DP-54.
P ro d u c c ió n d e p ro te ín a s
Se pueden usar métodos estándares de ácido nucleico recombinante para expresar una proteína que se une a calicreína plasmática. Generalmente, se clona una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína en un vector de ácido nucleico de expresión. Por supuesto, si la proteína incluye múltiples cadenas de polipéptidos, cada cadena se puede clonar en un vector de expresión, por ejemplo, los mismos vectores o diferentes, que se expresan en las mismas células o diferentes.
P ro d u c c ió n d e a n tic u e rp o s . Se pueden producir algunos anticuerpos, por ejemplo Fabs, en células bacterianas, por ejemplo, células de E. c o li (véase por ejemplo, Nadkarni, A. et al., 2007 Protein Expr Purif 52(1 ):219-29). Por ejemplo, si el Fab se codifica por secuencias en un vector de presentación en fagos que incluye un codón de terminación supresible entre la entidad de presentación y una proteína de bacteriófago (o fragmento de la misma), el ácido nucleico del vector se puede transferir a una célula bacteriana que no puede suprimir un codón de terminación. En este caso, el Fab no se fusiona con la proteína del gen III y se secreta en el periplasma y/o medio.
Los anticuerpos también se pueden producir en células eucariotas. En una realización, los anticuerpos (por ejemplo, scFv) se expresan en una célula de levadura tal como P ich ia (véanse, por ejemplo, Powers et al., 2001 , J. Immunol. Methods. 251 : 123-35; Schoonooghe S. et al, 2009 BMC Biotechnol. 9:70; Abdel-Salam, hA. et al, 2001 Appl Microbiol Biotechnol 56(1 -2): 157-64; Takahashi K. et al, 2000 Biosci Biotechnol Biochem 64(10):2138-44; Edqvist, J. et al., 1991 J Biotechnol 20(3):291 -300), H a n se u la o S acch a ro m yces . Un experto en la técnica puede optimizar la producción de anticuerpos en levadura optimizando, por ejemplo, las condiciones de oxígeno (véanse, por ejemplo, Baumann K., et al. 2010 BMC Syst. Biol. 4: 141), osmolaridad (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2010 BMC Genomics 11:207), temperatura (véase, por ejemplo, Dragosits, M. et al., 2009 J Proteome Res. 8(3): 1380-92), condiciones de fermentación (véase, por ejemplo, Ning, D. et al. 2005 J. Biochem. and Mol. Biol. 38(3): 294-299), cepa de levadura (véase, por ejemplo, Kozyr, AV et al. 2004 Mol Biol (Mosk) 38(6): 1067-75; Horwitz, AH. et al, 1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85(22): 8678-82; Bowdish, K. et al. 1991 J Biol Chem 266(18): 11901-8), expresión en exceso de proteínas para potenciar la producción de anticuerpos (véase, por ejemplo, Gasser, B. et al., 2006 Biotechol. Bioeng. 94(2):353-61), nivel de acidez del cultivo (véase, por ejemplo, Kobayashi H., et al, 1997 FEMS Microbiol Lett 152(2):235-42), concentraciones de sustratos y/o iones (véase, por ejemplo, Ko JH. et al., 2996 Appl Biochem Biotechnol 60(1 ):41 - 8). Además, se pueden usar sistemas de levadura para producir anticuerpos con una semivida prolongada (véase, por ejemplo, Smith, BJ. et al. 2001 Bioconjug Chem 12(5):750-756),
En una realización preferida, los anticuerpos se producen en células de mamífero. Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos de clon o fragmentos de unión al antígeno de los mismos incluyen ovario de hámster chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, como se describe en Kaufman y Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601 621), líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NS0 y células SP2, células COS, células HEK 293T (J. Immunol. Methods (2004) 289(1-2):65-80), y una célula de un animal transgénico, por ejemplo, un mamífero transgénico. Por ejemplo, la célula es una célula epitelial mamaria.
En algunas realizaciones, se producen proteínas de unión a calicreína plasmática en un sistema de planta o libre de células (véase, por ejemplo, Galeffi, P., et al., 2006 J Transl Med 4:39).
Además de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el dominio de inmunoglobulina diversificado, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores de selección. El gen marcador de selección facilita la selección de células hospedadoras en las que el vector se ha introducido (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Por ejemplo, normalmente el gen marcador de selección confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores de selección preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospedadoras d h f r con selección/amplificación con metotrexato) y el gen n e o (para selección con G418).
En un sistema a modo de ejemplo para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en células CHO d h f r por transfección mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno operativamente a elementos reguladores potenciadores / promotores (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento promotor del potenciador de CMV / regulador de AdMLP o un elemento regulador del potenciador de SV40 / promotor de AdMLP) para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección / amplificación con metotrexato. Se cultivan las células hospedadoras transformantes seleccionadas para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y se recupera anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas estándares de biología molecular para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, se pueden aislar algunos anticuerpos por cromatografía de afinidad con una matriz acoplada a proteína A o proteína G.
Para los anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de producción de anticuerpos puede producir anticuerpos en los que está glucosilada la región Fc. Por ejemplo, el dominio Fc de moléculas de IgG está glucosilado en la asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio para la modificación con oligosacáridos de tipo biantenario. Se ha demostrado que se requiere esta glucosilación para funciones efectoras mediadas por receptores de Fcg y el complemento C1q (Burton y Woof, 1992, Adv. Immunol. 51 : 1-84; Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163:59-76). En una realización, el dominio Fc se produce en un sistema de expresión de mamífero que glucosila apropiadamente el resto correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc también puede incluir otras modificaciones postraduccionales eucariotas.
También se pueden producir anticuerpos por un animal transgénico. Por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5.849.992 describe un método de expresión de un anticuerpo en la glándula mamaria de un mamífero transgénico. Se construye un transgén que incluye un promotor específico de la leche y ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo de interés y una secuencia señal para la secreción. La leche producida por las hembras de dichos mamíferos transgénicos incluye, secretada en ella, el anticuerpo de interés. El anticuerpo se puede purificar de la leche, o para algunas aplicaciones, se usa directamente.
C a ra c te r iza c ió n d e p ro te ín a s d e un ió n a c a lic re ín a p la s m á tic a
C Iso (c o n c e n tra c ió n in h ib id o ra al 50 % ) y C E so (c o n c e n tra c ió n e fic a z al 50 % ). Dentro de una serie o grupo de proteínas de unión, las que tienen menores valores de CI50 o CE50 se consideran inhibidores más potentes de calicreína plasmática que las proteínas de unión que tienen mayores valores de CI50 o CE50. Las proteínas de unión a modo de ejemplo tienen un valor de CI50 inferior a 800 nM, 400 nM, 100 nM, 25 nM, 5 nM o 1 nM, por ejemplo, como se mide en un ensayo in v itro para la inhibición de la actividad de calicreína plasmática cuando la calicreína plasmática es a 2 pM.
Las proteínas de unión a calicreína plasmática también se pueden caracterizar con referencia a la actividad de los eventos de señalización de factor XII y HMWK (cininógeno de alto peso molecular), por ejemplo, la producción de factor Xlla y/o bradiquinina.
Las proteínas de unión también se pueden evaluar para la selectividad hacia calicreína plasmática. Por ejemplo, se puede ensayar una proteína de unión a calicreína plasmática para su potencia hacia calicreína plasmática y se puede determinar un panel de calicreínas y un valor de CI50 o valor de CE50 para cada calicreína. En una realización, un compuesto que demuestra un bajo valor de CI50 o valor de CE50 para la calicreína plasmática, y un mayor valor de CI50 o valor de CE50 , por ejemplo, al menos 2, 5 o 10 veces mayor, para otra calicreína dentro del panel de prueba se considera que es selectivo hacia calicreína plasmática.
Se puede realizar un estudio farmacocinético en rata, ratones o mono con proteínas de unión a calicreína plasmática para determinar la semivida de calicreína plasmática en el suero. Asimismo, el efecto de la proteína de unión se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal para una enfermedad (por ejemplo, edema inducido por carragenina en la pata trasera de la rata (Winter et al. Proc Soc Exp Biol Med. 1962;111:544-7)), para su uso como un terapéutico, por ejemplo, para tratar una enfermedad o afección descrita en el presente documento, por ejemplo, un trastorno asociado a calicreína plasmática.
C o m p o s ic io n e s fa rm a c é u tic a s
Se pueden usar las proteínas (por ejemplo, proteínas de unión) que se unen a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática humana y/o calicreína plasmática murina) y, por ejemplo, incluyen al menos una región variable de inmunoglobulina en los métodos de tratamiento (o prevención) de una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática. Las proteínas de unión pueden estar presentes en una composición, por ejemplo, una composición farmacéuticamente aceptable o composición farmacéutica, que incluye una proteína de unión de calicreína plasmática, por ejemplo, una molécula de anticuerpo u otro polipéptido o péptido identificado que se une a calicreína plasmática, como se describe en el presente documento. La proteína de unión a calicreína plasmática se puede formular junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas incluyen composiciones terapéuticas y composiciones de diagnóstico, por ejemplo, composiciones que incluyen proteínas de unión a calicreína plasmática marcadas para la obtención de imágenes in vivo, y composiciones que incluyen proteínas de unión a calicreína plasmática marcadas para el tratamiento (o prevención) de una enfermedad asociada a calicreína plasmática.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye todos y cada uno de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión), aunque también se contemplan vehículos adecuados para inhalación y administración intranasal. Dependiendo de la vía de administración, la proteína de unión a calicreína plasmática se puede recubrir en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan inactivar el compuesto.
Una sal farmacéuticamente aceptable es una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M., et al., 1977, J. Pharm. Sci. 66:1-19). Ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína, y similares.
Las composiciones pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como disoluciones líquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma puede depender del modo de administración previsto y aplicación terapéutica. Muchas composiciones están en forma de disoluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las usadas para administración de seres humanos con anticuerpos. Un modo de administración a modo de ejemplo es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una realización, la proteína de unión a calicreína plasmática es adecuada para administración por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, la proteína de unión a calicreína plasmática es adecuada para administración por inyección intramuscular o subcutánea.
Las expresiones "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral", como se usan en el presente documento, significan modos de administración distintos de administración enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intrarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intrarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal, e infusión. La composición se puede formular como una disolución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para la alta concentración de fármaco. Se pueden preparar disoluciones inyectables estériles incorporando la proteína de unión en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de componentes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros componentes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado a vacío y liofilización que da un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional de una disolución previamente esterilizada por filtración del mismo. La fluidez apropiada de una disolución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de la dispersión y usando tensioactivos. Se puede provocar la absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Se puede administrar una proteína de unión a calicreína plasmática mediante una variedad de métodos, aunque para muchas aplicaciones, la vía/modo de administración preferido es la inyección intravenosa o infusión. Por ejemplo, para aplicaciones terapéuticas, la proteína de unión a calicreína plasmática se puede administrar por infusión intravenosa a una tasa inferior a 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m2 o 7 a 25 mg/m2. La vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que protegerá el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etilenoacetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Están disponibles muchos métodos para la preparación de tales formulaciones. Véanse, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., 1978, Marcel Dekker, Inc., New York.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos. Por ejemplo, en una realización, una composición farmacéutica desvelada en el presente documento se puede administrar con un dispositivo, por ejemplo, un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, una bomba, o implante.
En ciertas realizaciones, se puede formular una proteína de unión a calicreína plasmática para garantizar la apropiada distribución in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos desvelados en el presente documento crucen la BHE (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más restos que son selectivamente transportados en células u órganos específicos, así potencian la administración de fármaco dirigida (véase, por ejemplo, V.V. Ranade, 1989, J. Clin. Pharmacol. 29:685).
Las pautas posológicas se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar con el tiempo varias dosis divididas o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parentales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación puede venir impuesta por y directamente dependiente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y (b) las limitaciones inherentes en la materia del mezclado de dicho compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.
Un intervalo no limitante a modo de ejemplo para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de una proteína de unión (por ejemplo, un anticuerpo) desvelada en el presente documento es 0,1-20 mg/kg, más preferentemente 1 -10 mg/kg. Se puede administrar un anticuerpo anti-calicreína plasmática, por ejemplo, por infusión intravenosa, por ejemplo, a una tasa de inferior a 30, 20, 10, 5 o 1 mg/min para alcanzar una dosis de aproximadamente 1 a 100 mg/m<2> o aproximadamente 5 a 30 mg/m2. Para proteínas de unión más pequeñas en peso molecular que un anticuerpo, las cantidades apropiadas pueden ser proporcionalmente inferiores. Los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que va a aliviarse. Para un sujeto particular, se pueden ajustar pautas posológicas específicas con el tiempo según la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones.
Las composiciones farmacéuticas desveladas en el presente documento pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de una proteína de unión a calicreína plasmática desvelada en el presente documento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad de la proteína para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" modula preferentemente un parámetro medible, por ejemplo, niveles de anticuerpos IgG circulantes en un grado estadísticamente significativo o al menos aproximadamente 20 %, más preferentemente en al menos aproximadamente 40 %, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente 60 %, y todavía más preferentemente en al menos aproximadamente 80 % con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para modular un parámetro medible, por ejemplo, un parámetro asociado a enfermedad, se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en trastornos y condiciones humanas, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para modular un parámetro in vitro.
Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de o en una fase más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será inferior a la cantidad terapéuticamente eficaz.
E s ta b iliza c ió n v re ten c ió n
En una realización, una proteína de unión a calicreína plasmática se asocia físicamente con un resto que mejora su estabilización y/o retención en circulación, por ejemplo, en sangre, suero, linfa, u otros tejidos, por ejemplo, en al menos 1,5, 2, 5, 10 o 50 veces. Por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática se puede asociar a un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como poli(óxidos de alquileno) o poli(óxidos de etileno). Los polímeros adecuados variarán sustancialmente en peso. Se pueden usar los polímeros que tienen pesos moleculares promedios en número que varían desde aproximadamente 200 hasta aproximadamente 35.000 (o aproximadamente 1.000 a aproximadamente 15.000, y 2.000 a aproximadamente 12.500). Por ejemplo, se puede conjugar una proteína de unión a calicreína plasmática con un polímero soluble en agua, por ejemplo, polímeros de polivinilo hidrófilos, por ejemplo, poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Una lista no limitante de dichos polímeros incluye homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, copolímeros de los mismos, y copolímeros de bloque de los mismos, a condición de que se mantenga la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque.
También se puede asociar una proteína de unión a calicreína plasmática a una proteína transportadora, por ejemplo, una albúmina de suero, tal como una albúmina de suero humano (véase, por ejemplo, Smith, BJ. et al., 2001 Bioconjug Chem 12(5): 750-756). Por ejemplo, se puede usar una fusión traduccional para asociar la proteína transportadora con la proteína de unión a calicreína plasmática.
También se puede modificar una proteína de unión a calicreína plasmática como un derivado de HESilación. Los procesos para la HESilación de una proteína de unión a calicreína plasmática utilizan hidroxietilalmidón para modificar la proteína. La HESilación de una proteína puede prolongar la semivida en circulación de la proteína y también reducir la eliminación renal.
K its
Se puede proporcionar en un kit una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento, por ejemplo, como un componente de un kit. Por ejemplo, el kit incluye (a) una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, una composición (por ejemplo, una composición farmacéutica) que incluye una proteína de unión a calicreína plasmática, y, opcionalmente (b) material informativo. El material informativo puede ser material descriptivo, de instrucciones, de comercialización u otro material que se refiere a un método descrito en el presente documento y/o al uso de una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, para un método descrito en el presente documento.
El material informativo del kit no se limita en su forma. En un ejemplo, el material informativo puede incluir información sobre la producción del compuesto, peso molecular del compuesto, concentración, fecha de caducidad, información del lote o sitio de producción, etc. En un ejemplo, el material informativo se refiere al uso de la proteína de unión para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos y afecciones, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática.
En un ejemplo, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática en un modo adecuado para realizar los métodos descritos en el presente documento, por ejemplo, en una dosis adecuada, forma farmacéutica o modo de administración (por ejemplo, una dosis, forma farmacéutica o modo de administración descrito en el presente documento). En otro ejemplo, el material informativo puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática a un sujeto adecuado, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano que tiene, o en riesgo de, un trastorno o afección descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad o afección asociada a calicreína plasmática. Por ejemplo, el material puede incluir instrucciones para administrar una proteína de unión a calicreína plasmática a un paciente con un trastorno o afección descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática. El material informativo de los kits no se limita en su forma. En muchos casos, el material informativo, por ejemplo, instrucciones, se proporciona en formato impreso, pero también puede estar en otros formatos, tales como material legible por ordenador.
Se puede proporcionar una proteína de unión a calicreína plasmática en cualquier forma, por ejemplo, forma líquida, seca o liofilizada. Se prefiere que una proteína de unión a calicreína plasmática esté sustancialmente pura y/o estéril. Cuando una proteína de unión a calicreína plasmática se proporciona en una disolución líquida, la disolución líquida es preferentemente una disolución acuosa, prefiriéndose una disolución acuosa estéril. Cuando una proteína de unión a calicreína plasmática se proporciona como forma seca, la reconstitución es generalmente mediante la adición de un disolvente adecuado. El disolvente, por ejemplo, agua estéril o tampón, se puede proporcionar opcionalmente en el kit.
El kit puede incluir uno o más recipientes para la composición que contiene una proteína de unión a calicreína plasmática. En algunos ejemplos, el kit contiene recipientes separados, divisores o compartimentos para la composición y material informativo. Por ejemplo, la composición puede estar contenida en una botella, vial o jeringa, y el material informativo puede estar contenido en asociación con el recipiente. En otros ejemplos, los elementos separados del kit están contenidos dentro de un único recipiente sin dividir. Por ejemplo, la composición está contenida en una botella, vial o jeringa que tiene unida a la misma el material informativo en forma de una etiqueta. En algunos ejemplos, el kit incluye una pluralidad (por ejemplo, un envase) de recipientes individuales, conteniendo cada uno una o más formas farmacéuticas unitarias (por ejemplo, una forma farmacéutica descrita en el presente documento) de una proteína de unión a calicreína plasmática. Por ejemplo, el kit incluye una pluralidad de jeringas, ampollas, envases de lámina o envases alveolados, conteniendo cada uno una dosis unitaria única de una proteína de unión a calicreína plasmática. Los recipientes de los kits pueden ser impermeables al aire, resistentes al agua (por ejemplo, impermeables a cambios en la humedad o evaporación) y/u opacos a la luz.
El kit incluye opcionalmente un dispositivo adecuado para administración de la composición, por ejemplo, una jeringa, inhalante, cuentagotas (por ejemplo, cuentagotas para los ojos), hisopo (por ejemplo, un hisopo de algodón o hisopo de madera), o cualquiera de dicho dispositivo de administración. En un ejemplo, el dispositivo es un dispositivo implantable que dispensa dosis medidas de la proteína de unión. La divulgación también caracteriza un método para proporcionar un kit, por ejemplo, combinando los componentes descritos en el presente documento.
T ra ta m ie n to s
Las proteínas que se unen a calicreína plasmática, por ejemplo, como se describen en el presente documento, tienen utilidades terapéuticas y profilácticas, particularmente en sujetos humanos. Estas proteínas de unión se administran a un sujeto para tratar, prevenir y/o diagnosticar una variedad de trastornos y afecciones, que incluyen, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática, o incluso a células en cultivo, por ejemplo, in v itro o e x vivo. Por ejemplo, estas proteínas de unión se pueden usar para modificar los efectos de la calicreína plasmática liberada de células en cultivo (Lilla et al., J Biol Chem. 284(20): 13792-13803 (2009)). El tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz para aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o afectar el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición hacia el trastorno. El tratamiento también puede retardar la aparición, por ejemplo, prevenir la aparición, o prevenir el deterioro de una enfermedad o afección.
Como se usa en el presente documento, una cantidad de un agente de unión diana eficaz para prevenir un trastorno, o una cantidad profilácticamente eficaz del agente de unión, se refiere a una cantidad de un agente de unión diana, por ejemplo, una proteína de unión a calicreína plasmática, por ejemplo, un anticuerpo anti-calicreína plasmática descrito en el presente documento, que es eficaz, tras la administración de dosis única o múltiple al sujeto, para prevenir o retrasar el hecho de la aparición o reaparición de un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento, por ejemplo, una enfermedad asociada a calicreína plasmática.
Los métodos de administración de proteínas de unión a calicreína plasmática y otros agentes también se describen en "Composiciones farmacéuticas". Las dosificaciones adecuadas de las moléculas usadas pueden depender de la edad y peso del sujeto y el fármaco particular usado. Las proteínas de unión se pueden usar como agentes competitivos para inhibir, reducir una interacción no deseable, por ejemplo, entre calicreína plasmática y su sustrato (por ejemplo, factor XII o HMWK). La dosis de la proteína de unión a calicreína plasmática puede ser la cantidad suficiente para bloquear 90 %, 95 %, 99 % o 99,9 % de la actividad de calicreína plasmática en el paciente, especialmente en el sitio de enfermedad. Dependiendo de la enfermedad, esto puede requerir 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 o 10,0 mg/kg. Para una IgG que tiene una masa molecular de 150.000 g/mol (dos sitios de unión), estas dosis corresponden a aproximadamente 18 nM, 180 nM, 540 nM, 1,08 pM y 1,8 pM de sitios de unión para un volumen de 5 l de sangre.
En ocasiones, las proteínas de unión a calicreína plasmática se usan para inhibir una actividad (por ejemplo, inhiben al menos una actividad de calicreína plasmática, por ejemplo, reducen la producción de factor XIIa y/o bradiquinina) de calicreína plasmática, por ejemplo, in vivo. Las proteínas de unión se pueden usar por sí mismas o conjugadas a un agente, por ejemplo, un fármaco citotóxico, enzima de citotoxina, o radioisótopo. Este método incluye: administrar la proteína de unión sola o unida a un agente (por ejemplo, un fármaco citotóxico), a un sujeto que requiere tal tratamiento. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas de unión a calicreína plasmática que no inhiben su s ta n c ia lm e n te la c a lic re ín a p la sm á tica pa ra a d m in is tra r n a n o p a rtícu la s q u e co n tie n e n ag en te s , ta le s co m o tox in as , a cé lu la s o te jid o s aso c ia d o s a c a lic re ín a p la sm á tica , p o r e je m p lo , pa ra tra ta r un tra s to rn o aso c ia d o a ca lic re ín a p la sm á tica .
D eb ido a q u e las p ro te ínas de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica reco no cen las cé lu la s q u e exp re sa n ca lic re ín a p la sm á tica y p u ed en un irse a cé lu la s q u e es tá n aso c ia d a s con (p o r e jem p lo , en p ro x im id ad de o e n tre m e zc la d a s con ) un tra s to rn o o a fe cc ión aso c ia d o a c a lic re ín a p lasm á tica , las p ro te ínas de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se p u ed en u sa r pa ra in h ib ir u n a ac tiv ida d (p o r e je m p lo , in h ib ir al m en os u n a ac tiv ida d de c a lic re ín a p lasm á tica , po r e je m p lo , re d u c ir la p ro du cc ión de fa c to r X IIa y /o b ra d iq u in in a ) de cu a lq u ie ra de d ich a s cé lu la s e in h ib ir la en fe rm e d a d a so c ia d a a ca lic re ín a p lasm á tica . El re d u c ir la ac tiv ida d de c a lic re ín a p la sm á tica pu ede in h ib ir in d ire c ta m e n te cé lu la s q u e p u ed en se r d e p e n d ie n te s de la ac tiv ida d de ca lic re ín a p la sm á tica pa ra e l d e sa rro llo y /o la p ro g re s ión de un tra s to rn o aso c ia d o a ca lic re ín a p lasm á tica .
L a s p ro te ín a s de un ión se pu ed en u s a r pa ra a d m in is tra r un a g en te (po r e jem p lo , c u a lq u ie ra d e una va rie d a d de fá rm a c o s c ito tó x ic o s y te ra p é u tico s ) a cé lu la s y te jid o s do n d e e s tá p re se n te la c a lic re ín a p lasm á tica . Los a g e n te s a m odo de e je m p lo in c luyen un co m p u e s to que e m ite rad iac ión , m o lécu las de p lan tas , o rig e n fú n g ico o bac te riano , p ro te ín a s b io ló g icas , y sus m ezc las . Los fá rm a co s c ito tó x ico s p u ed en s e r fá rm a co s c ito tó x ico s q u e ac túan in tra ce lu la rm e n te , ta le s co m o to x in a s , e m iso re s de rad ia c ión de in te rva lo co rto , p o r e je m p lo , e m iso re s a de a lta e n e rg ía de in te rva lo co rto .
P ara d ir ig ir cé lu la s q u e e xp re sa n ca lic re ín a p la sm á tica , se pu e d e u s a r un s is te m a de p ro fá rm aco . P o r e je m p lo , se c o n ju g a una p rim e ra p ro te ín a d e un ión con un p ro fá rm a co q u e se a c tiva so lo cu a n d o es tá en e s tre ch a p ro x im id ad con un a c tiv a d o r de p ro fá rm a co . El a c tiv a d o r de p ro fá rm a co se c o n ju g a con una s e g u n d a p ro te ín a de un ión, p re fe re n te m e n te u n a qu e se une a un s itio no c o m p e tid o r en la m o lé cu la d ian a . Si se unen do s p ro te ínas de un ión a s itio s d e un ión co m p e tid o re s o no co m p e tid o re s , se pu e d e d e te rm in a r p o r e n sa yo s d e un ión co m p e tit iva co n ve n c io n a le s . Los pa res de fá rm a c o -p ro fá rm a c o a m odo de e je m p lo se d e sc rib e n en B la ke ly e t a l., (1996 ) C a n ce r R esea rch , 56 :3287 3292.
Las p ro te ín a s de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ed en u s a r d ire c ta m e n te in v ivo pa ra e lim in a r las cé lu la s que e xp re sa n an tíg e n o m ed ia n te c ito to x ic id a d na tu ra l d e p e n d ie n te de co m p le m e n to (C D C ) o c ito to x ic id a d c e lu la r d e p e n d ie n te d e a n ticu e rp o (A D C C ). Las p ro te ín a s d e un ión d e s c rita s en el p re se n te d o c u m e n to pu ed en in c lu ir el d o m in io e fe c to r de un ión al co m p le m e n to , ta l co m o las p o rc io n e s Fc de IgG 1, -2, o -3 o c o rre sp o n d ie n te s a las p o rc io n e s de IgM q u e se unen al co m p le m e n te . En o ca s io n e s , u n a p o b lac ió n de cé lu la s d ia n a se tra ta e x v ivo con un a g en te de un ión d e sc rito en e l p re se n te d o cu m e n to y cé lu la s e fe c to ra s ap ro p ia d a s . El tra ta m ie n to pu e d e se r c o m p le m e n ta d o m ed ia n te la ad ic ió n de co m p le m e n to o sue ro q u e co n tie n e co m p le m e n to . A de m ás , se pu ede m e jo ra r la fa g o c ito s is d e cé lu la s d ia n a recu b ie rtas con u n a p ro te ín a d e un ión d e s c rita en e l p re se n te d o cu m e n to un ie n d o p ro te ínas de l co m p le m e n to . En o ca s io n e s , cé lu la s d ia n a recu b ie rtas con la p ro te ín a de un ión que inc luye un d o m in io e fe c to r de un ión al c o m p le m e n to se lisan p o r el co m p le m e n to .
Los m é tod os de a d m in is tra c ió n de p ro te ín a s de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se d e sc rib e n en "C o m p o s ic io n e s fa rm a cé u tica s ". Las d o s ifica c io n e s ad e cu a d a s de las m o lé cu la s usa da s d e p e n d e rá n de la ed ad y pe so de l su je to y el fá rm a c o p a rtic u la r usado . Las p ro te ín a s de un ión se pu eden u sa r co m o ag e n te s c o m p e tit ivo s pa ra in h ib ir o red uc ir un a in te racc ión no d e sea b le , po r e je m p lo , e n tre un a g en te na tu ra l o p a to ló g ico y la ca lic re ín a p lasm á tica .
La p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pued e u s a r pa ra a d m in is tra r m acro y m ic ro m o lé cu las , p o r e jem p lo , un gen en la cé lu la p a ra fin e s de te ra p ia g é n ica en e l e n d o te lio o e p ite lio y d ir ig ir so lo los te jid o s qu e exp re sa n la c a lic re ín a p lasm á tica . Las p ro te ín a s de un ión se pu ed en u sa r pa ra a d m in is tra r u n a v a rie d a d de fá rm a co s c ito tó x ico s q u e in c luye n fá rm a co s te ra p é u tico s , un c o m p u e s to q u e e m ite rad ia c ión , m o lécu las de p lan tas , o rig e n fú n g ic o o ba c te ria n o , p ro te ín a s b io ló g ica s y sus m ezc las . Los fá rm a c o s c ito tó x ic o s p u ed en s e r fá rm a co s c ito tó x ico s que ac tú an in tra ce lu la rm e n te , ta le s co m o e m iso re s de rad ia c ión de in te rva lo co rto , que inc luyen , p o r e je m p lo , e m iso re s a de a lta e n e rg ía de co rto in te rva lo , co m o se d e sc rib e n en e l p re se n te d o cum e n to .
En e l c a so d e to x in a s d e po lip ép tido , se pu eden u sa r té c n ic a s de ác ido nu c le ico re co m b in a n te pa ra c o n s tru ir un ác ido nu c le ico que c o d ifica la p ro te ín a de un ión (po r e jem p lo , a n ticu e rp o o fra g m e n to de un ió n al a n tíg e n o de l m ism o) y la c ito to x in a (o un c o m p o n e n te de p o lip é p tid o de la m ism a ) co m o fu s io n e s tra d u cc io n a le s . El ác ido nu c le ico re co m b in a n te se e xp re sa e n tonce s , p o r e jem p lo , en cé lu la s y se a ís la el p o lip é p tid o de fu s ió n cod ifica do .
A lte rn a tiva m e n te , la p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ede a co p la r a e m iso re s de rad ia c ión de a lta en e rg ía , p o r e je m p lo , un rad io isó top o , ta l co m o 131I, un e m is o r y que, cu a n d o se lo ca liza en un s itio , d a com o resu lta d o u n a d e s tru cc ió n de va rio s d iá m e tro s ce lu la res . V éa se , p o r e jem p lo , S .E . O rder, "A n a lys is , R esu lts , and Fu tu re P rosp ec tive o f th e T h e ra p e u tic U se o f R a d io la be led A n tib o d y in C a n ce r T he ra py", M on o c lo n a l A n tib o d ie s fo r C a n c e r D e tection and T herapy , R .W . B a ldw in e t al. (eds.), pp 303 316 (A cad em ic P ress 1985). O ra d io isó to p o s a d e cu a d o s in c luyen e m iso re s a, ta le s co m o 212Bi, 213Bi y 211At, y e m iso re s b, ta le s co m o 186Re y 90Y. A dem ás, ta m b ié n se pu ed e u s a r 177Lu co m o ta n to un a g en te de o b te n c ió n de im á ge nes co m o c ito tóx ico .
La ra d io in m u n o te ra p ia (R IT) u sa n d o a n ticu e rp o s m arca do s con 131I, 90Y y 177Lu e s tá en in te nsa in ves tig ac ió n c lín ica . E x is ten d ife re n c ia s s ig n ifica tiva s en las ca ra c te rís tica s fís ica s de e s to s tres nú c lid os y, co m o resu ltado , la e lecc ió n del radionúclido es muy crítica con el fin de administrar la máxima dosis de radiación a un tejido de interés. Las partículas de mayor energía beta de 90Y pueden ser buenas para los tumores de gran masa. Las partículas de energía beta relativamente baja de 131I son ideales, pero in v ivo la deshalogenación de moléculas radioyodadas es una desventaja importante para la internalización del anticuerpo. A diferencia, 177Lu tiene partícula beta de baja energía con solo el intervalo de 0,2-0,3 mm y suministra dosis de mucha menos radiación a la médula ósea en comparación con 90Y. Además, debido a la semivida física más larga (en comparación con 90Y), los tiempos de residencia son mayores. Como resultado, se pueden administrar mayores actividades (más cantidades de mCi) de agentes marcados con 177Lu con dosis de comparativamente menos radiación a la médula ósea. Ha habido varios estudios clínicos que investigan el uso de anticuerpos marcados con 177Lu en el tratamiento de diversos cánceres. (Mulligan T et al., 1995, Clin. Canc. Res. 1: 1447-1454; Meredith RF, et al., 1996, J. Nucl. Med. 37:1491-1496; Alvarez RD, et al., 1997, Gynecol. Oncol. 65:94-101).
E n fe rm e d a d e s v a fe c c io n e s a m o d o d e e je m p lo
Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento es útil para tratar (o prevenir) una enfermedad o afección en la que la actividad de calicreína plasmática participa, por ejemplo, en una enfermedad o afección descrita en el presente documento, o para tratar (o prevenir) uno o más síntomas asociados a la misma. En ocasiones, la proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, calicreína plasmática que se une a IgG o Fab) inhibe la actividad de calicreína plasmática.
Los ejemplos de tales enfermedades y afecciones que se puede tratar (o prevenir) por una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento incluyen: artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, enfermedad espinal degenerativa con estenosis del conducto vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorio, aneurisma aórtica, osteoartritis, vasculitis, edema, angioedema hereditario, edema cerebral, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación inducida por dispositivos de asistencia ventricular o prótesis endovasculares, traumatismo craneoencefálico o edema cerebral peritumoral, septicemia, evento isquémico agudo de la arteria cerebral media (ACM) (accidente cerebrovascular), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico y lesión por quemadura. Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento también se puede usar para promover la cicatrización. Una proteína de unión a calicreína plasmática descrita en el presente documento también se puede usar como tratamiento de oncología por mecanismos que incluyen, pero no se limitan a, bloqueo de la producción de bradiquinina pro-angiogénica.
Se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene un trastorno en el que participa la actividad de calicreína plasmática, tratando así (por ejemplo, mejorando o corrigiendo un síntoma o característica de un trastorno, ralentizando, estabilizando y/o deteniendo la progresión de la enfermedad) el trastorno.
La proteína de unión a calicreína plasmática se puede administrar en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática es la cantidad que es eficaz, tras la administración de dosis únicas o múltiples a un sujeto, en tratar un sujeto, por ejemplo, curar, aliviar, mitigar o mejorar al menos un síntoma de un trastorno en un sujeto a un grado más allá del esperado en ausencia de tal tratamiento. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición puede variar según factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición es compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una dosificación terapéuticamente eficaz modula preferentemente un parámetro medible, favorablemente, con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para afectar (por ejemplo, inhibir) un parámetro medible se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en un trastorno humano.
Las pautas posológicas se pueden ajustar para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se pueden administrar un único bolo, se pueden administrar con el tiempo varias dosis divididas o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parentales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación, como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
A rtritis re u m a to id e
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria crónica autoinmunitaria que causa la inflamación de las articulaciones y dolor y normalmente da como resultado la destrucción de las articulaciones. La AR generalmente sigue una evolución recidivante/remitente, con "crisis" de actividad de la enfermedad intercaladas con remisiones de los síntomas de la enfermedad. La AR se asocia con varios trastornos inflamatorios adicionales, que incluyen síndrome de Sjogren (sequedad de los ojos y de la boca causada por inflamación de las glándulas lacrimales y salivares), pleuritis (inflamación de la pleura que causa dolor al respirar profundo y toser), nódulos reumatoides (sitios nodulares de inflamación que se desarrollan dentro de los pulmones), pericarditis (inflamación del pericardio que causa dolor al recostarse o inclinarse hacia adelante), síndrome de Felty (esplenomegalia y leucopenia observadas conjuntamente con AR, que hace que el sujeto sea propenso a infección) y vasculitis (una inflamación de los vasos sanguíneos que puede bloquear la circulación sanguínea). La calicreína plasmática participa en la artritis reumatoide.
Los síntomas de la AR activa incluyen fatiga, falta de apetito, febrícula, dolores musculares y articulares, y rigidez. La rigidez muscular y articular son normalmente más notables por la mañana y después de periodos de inactividad. Durante las crisis, las articulaciones se vuelven frecuentemente rojas, hinchadas, dolorosas y sensibles, generalmente como consecuencia de sinovitis.
El tratamiento para la artritis reumatoide implica una combinación de medicaciones, descanso, ejercicios de estiramiento articular y protección articular. Se usan dos clases de medicaciones en el tratamiento de la artritis reumatoide: "fármacos de primera línea" antiinflamatorios y "fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad" (FARME). Los fármacos de primera línea incluyen AINE (por ejemplo, aspirina, naproxeno, ibuprofeno y etodolaco) y cortisona (corticosteroides). Los FARME, tales como el oro (por ejemplo, sales de oro, tioglucosa de oro, tiomalato de oro, oro oral), metotrexato, sulfasalazina, D-penicilamina, azatioprina, ciclofosfamida, clorambucilo y ciclosporina, leflunomida, etanercept, infliximab, anakinra y adalimumab, e hidroxicloroquina, promueven la remisión de la enfermedad y previenen la destrucción articular progresiva, pero no son agentes antiinflamatorios. La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas o mejora o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de AR) de la artritis reumatoide administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene AR. Se proporcionan además métodos de tratamiento de AR administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, con al menos un "fármaco de primera línea" antiinflamatorio (por ejemplo, un AINE y/o cortisona) y/o un FARME. La divulgación también proporciona métodos de prevención de artritis reumatoide o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar AR (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con AR o una predisposición genética a la misma).
Se proporcionan además métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas) de los trastornos asociados a la artritis reumatoide (síndrome de Sjogren, pleuritis, nódulos reumatoides pulmonares, pericarditis, síndrome de Felty y vasculitis) administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene AR.
Las escalas útiles para evaluar la AR y los síntomas de la AR incluyen, por ejemplo, la escala de gravedad de la artritis reumatoide (RASS; Bardwell et al., (2002) R h e u m a to lo g y 41 (1):38-45), el índice de salud específico de artritis SF-36 (ASHI; Ware et al., (1999) M ed. Care. 37(5 Suppl):MS40-50), las escalas de medición del impacto de la artritis o las escalas de medición del impacto de la artritis 2 (AIMS o AIMS2; Meenan et al. (1992) A rth r it is R heum . 35(1 ):1-10); el cuestionario de evaluación de la salud de Stanford (HAQ), HAQII, o HAQ modificado (véase, por ejemplo, Pincus et al. (1983) A rth r it is R heum . 26(11):1346-53).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de artritis reumatoide, tales como artritis inducida por colágeno (CIA), que se induce, normalmente en roedores, por inmunización con colágeno de tipo II autólogo o heterólogo en adyuvante (Williams et al. Methods Mol Med. 98:207-16 (2004)).
G ota
La gota es una afección que resulta de cristales de ácido úrico que se depositan en los tejidos del cuerpo. La gota se caracteriza por una sobrecarga de ácido úrico en el cuerpo y ataques recurrentes de inflamación articular (artritis). La gota crónica puede conducir a depósitos de coágulos duros de ácido úrico en y alrededor de las articulaciones, función renal reducida y cálculos renales. La gota se relaciona frecuentemente con una anomalía heredada en la capacidad del cuerpo para procesar el ácido úrico. El ácido úrico es un producto de descomposición de las purinas, que son parte de muchos alimentos. Una anomalía en la manipulación del ácido úrico puede causar ataques de artritis dolorosa (ataque de gota), cálculos renales y bloque de los túbulos filtradores del riñón con cristales de ácido úrico, que conducen a insuficiencia renal. Algunos pacientes pueden solo desarrollar elevados niveles de ácido úrico en sangre (hiperuricemia) sin tener artritis o problemas renales.
Los síntomas de la gota incluyen, por ejemplo, dolor insoportable e inesperado, inflamación, rojez, calor y rigidez en el pie afectado u otras partes del cuerpo, y febrícula.
Los tratamientos para la gota incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), colchicina y glucocorticoides orales, glucocorticoides intrarticulares administrados por una inyección articular, inhibidores de xantina oxidasa (por ejemplo, alopurinol, febuxostat), uricosúricos (por ejemplo, probenecid, EDTA), urato oxidasas (por ejemplo, pegloticasa), bicarbonato sódico y dieta pobre en purinas.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas o el empeoramiento de) de la gota administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene gota. Se proporcionan además métodos de tratamiento de la gota administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un AINE, una colchicina, un glucocorticoide oral, un glucocorticoide intrarticular administrado mediante una inyección articular, un inhibidor de xantina oxidasa (por ejemplo, alopurinol, febuxostat), un uricosúrico (por ejemplo, probenecid, EDTA), una urato oxidasa (por ejemplo, pegloticasa), bicarbonato sódico y/o dieta pobre en purinas. La divulgación también proporciona métodos de prevención de la gota o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar gota (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con gota o una predisposición genética a la misma).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de gota, véase, por ejemplo, Reginato y Olsen, Curr Opin Rheumatol. 19(2): 134-45 (2007) y referencias citadas en su interior.
E n fe rm ed ad in te s tin a l (E li)
La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es un grupo de afecciones inflamatorias del intestino grueso y, en algunos casos, el intestino delgado. Las principales formas de la EII son la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa (CU). Están otras formas de EII que representan muchos menos casos: colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por exclusión, síndrome de Behget, colitis infecciosa y colitis indeterminada. La principal diferencia entre la enfermedad de Crohn y la CU es la localización y la naturaleza de los cambios inflamatorios. La enfermedad de Crohn puede afectar cualquier parte del tubo gastrointestinal, desde la boca hasta el ano (lesiones salteadas), aunque la mayoría de los casos empiezan en el íleon terminal. La colitis ulcerosa, a diferencia, está restringida al colon y el recto. Microscópicamente, la colitis ulcerosa está restringida a la mucosa (revestimiento epitelial del intestino), mientras que la enfermedad de Crohn afecta toda la pared intestinal. Finalmente, la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa están presentes con manifestaciones extraintestinales (tales como problemas del hígado, artritis, manifestaciones de la piel y problemas oculares) en diferentes proporciones.
Los síntomas de EII incluyen dolor abdominal, vómitos, diarrea, rectorragia, pérdida de peso, aumento de peso y diversas molestias o enfermedades asociadas (artritis, pioderma gangrenosa, colangitis esclerosante primaria). El diagnóstico generalmente es por colonoscopia con biopsia de lesiones patológicas. Raramente se puede hacer un diagnóstico definitivo o de enfermedad de Crohn o de colitis ulcerosa debido a idiosincrasias en la presentación. En este caso, se puede hacer un diagnóstico de colitis indeterminada.
El tratamiento para EII, dependiendo del nivel de gravedad, puede requerir inmunosupresión para controlar los síntomas. Se pueden usar inmunosupresores tales como azatioprina, metotrexato o 6-mercaptopurina. Más comúnmente, el tratamiento de EII requiere una forma de mesalamina. Frecuentemente, se usan esteroides para controlar las crisis de la enfermedad y fueron una vez aceptables como fármaco de mantenimiento. Se han usado biológicos, tales como infliximab, para tratar pacientes con enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa. Casos graves pueden requerir cirugía, tal como resección intestinal, estricturoplastia o una colostomía o ileostomía temporal o permanente. Los tratamientos médicos alternativos para EII existen en diversas formas, sin embargo, tales métodos se concentran en controlar la patología subyacente con el fin de evitar exposición esteroidea prolongada o extirpación quirúrgica. Normalmente, el tratamiento empieza administrando fármacos, tales como prednisona, con efectos antiinflamatorios altos. Una vez se controla satisfactoriamente la inflamación, el paciente se cambia normalmente a un fármaco más ligero, tal como asacol -una mesalamina- para mantener la enfermedad en remisión. Si no es satisfactorio, se puede o no puede administrar una combinación de los fármacos inmunosupresores anteriormente mencionados con una mesalamina (que también puede tener un efecto antiinflamatorio), dependiendo del paciente.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, estabilización o eliminación de uno o más síntomas de) de EII administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene EII. Se proporcionan además métodos de tratamiento de EII administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un inmunosupresor (por ejemplo, azatioprina, metotrexato, 6-mercaptopurina), una mesalamina, un esteroide y/o infliximab. La divulgación también proporciona métodos de prevención de EII o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar EII (por ejemplo, un sujeto que tiene un miembro de su familia con EII o una predisposición genética a la misma).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de EII, véanse, por ejemplo, aquellos descritos en la patente de EE. UU. N° 6.114.382, documento WO 2004/071186, y referencias citadas en su interior.
M u co s itis o ral
La mucositis oral es la inflamación dolorosa y ulceración de las membranas mucosas en la boca, normalmente como un efecto adverso del tratamiento de quimioterapia y radioterapia para el cáncer.
Los síntomas de la mucositis oral incluyen, por ejemplo, úlceras, eritema periférico, sensación de ardor acompañada por enrojecimiento, dificultad para habla, comer, o incluso abrir la boca, y disgeusia (alteración en la percepción del sabor).
El tratamiento para la mucositis oral incluye higiene bucal (enjuague bucal con sal, GELCLAIR®, CAPHOSOL®, MUGARD®), palifermina (un factor de crecimiento de queratinocitos humano), citocinas y otros modificadores de la inflamación (por ejemplo, IL-1, IL-11, TGF-beta3), complementación de aminoácidos (por ejemplo, glutamina), vitaminas, factores estimulantes de colonias, crioterapia y terapia con láser.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas, o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de mucositis) de la mucositis oral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene mucositis oral. Se proporcionan además métodos de tratamiento de mucositis oral administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, higiene bucal (enjuague bucal con sal, GELCLAIR®, CAPHOSOL®, MUGARD®), palifermina (un factor de crecimiento de queratinocitos humano), una citocina y/o un modificador de la inflamación (por ejemplo, IL-1, IL-11, TGF-beta3), una complementación de aminoácidos (por ejemplo, glutamina), una vitamina, un factor estimulante de colonias, crioterapia y terapia con láser. La divulgación también proporciona métodos de prevención de mucositis oral o un síntoma de la misma administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar mucositis oral (por ejemplo, un sujeto que ha recibido o está recibiendo quimioterapia o radioterapia).
Las escalas útiles para evaluar la mucositis oral incluyen la puntuación de toxicidad oral de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Handbook for reporting results of cancer treatment. Geneva, Switzerland: World Health Organization; 1979:15-22), los criterios de toxicidad común del Instituto Nacional del Cáncer (NCI-CTC) para mucositis oral (Criterios de toxicidad común del Instituto Nacional del Cáncer. Versión 2.0, 1 de junio de 1999, Sonis et al., Cancer. 85:2103-2113 (1999)) y la escala de evaluación de mucositis oral (OMAS).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de mucositis oral, tales como un modelo animal de oral mucositis inducida por un régimen de acondicionamiento de trasplante de células madre hematopoyéticas (Chen et al., Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 42(11):672-6 (2007)).
D o lo r n e u ro p á tic o
El dolor neuropático es un estado de dolor crónico complejo que normalmente va acompañado por lesión de tejido. Con el dolor neuropático, las propias fibras nerviosas se pueden dañar, ser disfuncionales o lesionar. Estas fibras nerviosas dañadas envían señales incorrectas a otros centros de dolor. El impacto de la lesión de las fibras nerviosas incluye un cambio en la función nerviosa tanto en el sitio de lesión como las áreas alrededor de la lesión. Los síntomas de dolor neuropático incluyen, por ejemplo, dolor fulgurante y de ardor y hormigueo y entumecimiento. Los tratamientos para el dolor neuropático incluyen, por ejemplo, medicaciones (por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) (por ejemplo, ALEVE®, MOTRIN®, o morfina), fármacos anticonvulsivos y antidepresivos) y dispositivos invasivos o implantables (por ejemplo, estimulación eléctrica).
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas o estabilización de la puntuación del sujeto en una escala de dolor) de dolor neuropático administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene dolor neuropático. Se proporcionan además métodos de tratamiento de dolor neuropático administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un tratamiento no quirúrgico ((por ejemplo, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) (por ejemplo, ALEVE®, MOTRIN®, o morfina), un anticonvulsivo y/o un fármaco antidepresivo) y/o un dispositivo invasivo o implantable (por ejemplo, estimulación eléctrica). La divulgación también proporciona métodos de prevención de dolor neuropático o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar dolor neuropático (por ejemplo, un sujeto que ha sufrido una lesión de tejido).
Las escalas útiles para la evaluación del dolor neuropático incluyen, por ejemplo, la escala de clasificación del dolor de Wong-Baker FACES (Fundación de la escala de clasificación del dolor Wong-Baker FACES), la escala analógica visual (VAS) (Huskisson, J. Rheumatol. 9 (5): 768-9 (1982)), el cuestionario de dolor de McGill (MPQ) (Melzack, dolor 1 (3): 277-99 (1975)), la escala diferencial del descriptores (DDS) (Gracely y Kwilosz, Pain 35 (3): 279-88 (1988)), la escala de dolor de Faces - revisada (FPS-R) (Hicks et al., Pain 93 (2): 173-83 (2001)), el cuadro numérico de 11 puntos (BS-11) (Jensen et al., Clin J Pain 5 (2): 153-9 (1989)), la escala de clasificación numérica (NRS-11) (Hartrick et al., Pain Pract 3 (4): 310-6 (2003)), el índice de dolor con dolorímetro (DPI) (Hardy et al., (1952). Pain Sensations and Reactions. Baltimore: The Williams & Wilkins Co.) y el inventario breve del dolor (BPI) (Cleeland and Ryan Ann. A cad . M ed. S ingap. 23 (2): 129-38 (1994)).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de dolor neuropático, véanse, por ejemplo, aquellos descritos en Martin et al., Methods Mol Med. 84:233-42 (2003) y referencias citadas en su interior.
D o lo r in flam ato rio
El dolor inflamatorio se causa por un ataque tal como heridas por penetración, quemaduras, frío extremo, fracturas, artritis, afecciones autoinmunitarias, estiramiento excesivo, infecciones y vasoconstricción hasta la integridad de tejidos a un nivel celular. Durante la inflamación, una compleja interacción neuro-inmunitaria da como resultado la hiperalgesia primaria, en la que un gran intervalo de moléculas inflamatorias que incluyen prostaglandinas y bradiquinina inducen y mantienen la sensibilidad nociceptora alterada.
Los tratamientos para el dolor inflamatorio incluyen, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideo (AINE) y corticosteroides.
La divulgación proporciona métodos de tratamiento (por ejemplo, mejora, reducción o eliminación de uno o más síntomas de) de dolor inflamatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto que tiene o que se sospecha que tiene dolor inflamatorio. Se proporcionan además métodos de tratamiento de dolor inflamatorio administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) en combinación con una segunda terapia, por ejemplo, un fármaco antiinflamatorio no esteroideo (AINE) y/o un corticosteroide. La divulgación también proporciona métodos de prevención de dolor inflamatorio o un síntoma del mismo administrando una proteína de unión a calicreína plasmática (por ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática) a un sujeto en riesgo de desarrollar dolor inflamatorio (por ejemplo, un sujeto que ha experimentado un ataque, por ejemplo, tal como una herida por penetración, una quemadura, frío extremo, una fractura, artritis, una afección autoinmunitaria, estiramiento excesivo o infección).
Las escalas útiles para la evaluación de dolor inflamatorio incluyen, por ejemplo, la escala de clasificación del dolor de Wong-Baker FACES (Wong-Baker FACES Pain Rating Scale Foundación), la escala analógica visual (VAS) (Huskisson, J. Rheumatol. 9 (5): 768-9 (1982)), el cuestionario de dolor de McGill (MPQ) (Melzack, Pain 1 (3): 277­ 99 (1975)), la escala diferencial del descriptores (DDS) (Gracely y Kwilosz, Pain 35 (3): 279-88 (1988)), la escala de dolor de Faces - revisada (FPS-R) (Hicks et al., Pain 93 (2): 173-83 (2001)), cuadro numérico de 11 puntos (BS-11) (Jensen et al., Clin J Pain 5 (2): 153-9 (1989)), la escala de clasificación numérica (NRS-11) (Hartrick et al., Pain Pract 3 (4): 310-6 (2003)), el índice de dolor con dolorímetro (DPI) (Hardy et al., (1952). Pain Sensations and Reactions. Baltimore: The Williams & Wilkins Co.) y el inventario breve del dolor (BPI) (Cleeland and Ryan A nn . A cad . M ed. S ingap. 23 (2): 129-38 (1994)).
La orientación para la determinación de la dosificación que suministra una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión a calicreína plasmática se puede obtener de modelos animales de dolor inflamatorio tal como un modelo animal de dolor inflamatorio crónico (Wilson et al., Eur J Pain. 10(6):537-49 (2006)) y un modelo de dolor inflamatorio e hiperalgesia (Ren y Dubner, ILAR J.40(3):111-118 (1999)).
E ste n o s is d e l c o n d u c to ve rte b ra l
La estenosis del conducto vertebral es una afección médica en la que el conducto vertebral estrecha y comprime la médula espinal y los nervios. Esto es normalmente debido a la común manifestación de la degeneración espinal que ocurre con el envejecimiento. También se puede causar algunas veces por hernia de disco espinal, osteoporosis o un tumor. La estenosis del conducto vertebral puede afectar la columna cervical, torácica o lumbar. En algunos casos, puede estar presentes en los tres sitios en el mismo paciente.
Los síntomas de la estenosis del conducto vertebral incluyen, por ejemplo, dolor o calambre en las piernas, dolor irradiado de espalda y cadera, dolor en el cuello y los hombros, pérdida de equilibrio y pérdida de la función o de la vejiga (síndrome de la cola de caballo).
Los tra ta m ie n to s pa ra la e s te n o s is de l c o n d u c to v e rte b ra l in c luyen , p o r e jem p lo , tra ta m ie n to s no q u irú rg ico s (por e je m p lo , te ra p ia fís ica , fá rm a co s a n tiin fla m a to r io s no e s te ro id e o s (A IN E ) (po r e jem p lo , asp irin a , ib up ro feno e in d o m e ta c in a ), a n a lg é s ico s (po r e je m p lo , a ce ta m in o fe n o ), su lfa to de co n d ro itin a , g lu co sa m in a , rep oso o ac tiv idad res trin g id a , o rtes is do rsa l o co rsé , in ye cc io n e s e p id u ra le s de e s te ro id e s (p o r e jem p lo , co rtico s te ro id e )) y c iru g ía (po r e je m p lo , la m in e c to m ía d e sco m p re s iva , la m in e c to m ía y fus ión ).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os d e tra ta m ie n to (po r e jem p lo , m e jo ra , red ucc ión o e lim in a c ió n d e uno o m ás s ín to m a s de ) de la e s te n o s is de l c o n d u c to ve rte b ra l a d m in is tra n d o un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que t ie n e o q u e se so sp e ch a que tie n e es te n o s is de l c o n d u c to ve rte b ra l. S e p ro p o rc io n a n ad em á s m é tod os de tra ta m ie n to de la es te n o s is de l c o n d u c to v e rte b ra l a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , po r e je m p lo , un tra ta m ie n to no q u irú rg ico (po r e je m p lo , te ra p ia fís ica y /o un fá rm a co a n tiin fla m a to rio no e s te ro id e o (A IN E ) (po r e jem p lo , asp irin a , ib up ro feno o in d o m e ta c in a ), un a n a lg é s ico (po r e jem p lo , a ce ta m in o fe n o ), su lfa to de co n d ro itin a , g lu co sa m in a , rep oso o ac tiv ida d res trin g id a , una o rte s is do rsa l o co rsé , una inyecc ió n e p id u ra l de e s te ro id e s (p o r e jem p lo , c o rtico s te ro id e ) y /o c iru g ía (po r e je m p lo , la m in e c to m ía d e sco m p re s iva , la m in e c to m ía y /o fu s ió n ). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ve n c ió n de la e s te n o s is de l co n d u c to ve rte b ra l o un s ín to m a d e la m ism a a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a d e un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r la e s te n o s is de l c o n d u c to v e rte b ra l (po r e jem p lo , un su je to qu e tie n e d e g e n e ra c ió n esp in a l).
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pued e o b te n e r de m od e los an im a le s de e s te n o s is de l co n d u c to ve rte b ra l, ta le s co m o un m ode lo de e s te n o s is lu m b a r de l c o n d u c to v e rte b ra l (S ek igu ch i e t a l., S p ine 29, 1105-1111 (2004 )).
T ro m b o s is a rte ria l v v e n o s a
La tro m b o s is a rte ria l es la fo rm a c ió n de un tro m b o d e n tro de una a rte ria . En la m a yo ría de los caso s , la tro m b o s is a rte ria l s igue a rup tu ra de l a te rom a, y se d e n o m in a , p o r tan to , a te ro trom bo s is .
La tro m b o s is a rte ria l e s tá a so c ia d a con va rio s tra s to rn o s , q u e in c luye a cc id e n te ce re b ro v a s c u la r e in fa rto de m ioca rd io . En el acc id e n te ce re b ro v a s c u la r tro m b ó tico , se fo rm a un tro m b o (coá gu lo de san g re ) no rm a lm e n te a lre d e d o r de p laca s a te ro sc le ró tica s . P uesto que e l b loq ueo de la a rte ria es g ra d u a l, la ap a ric ión de a cc ide n tes ce re b ro va scu la re s tro m b ó tic o s s in to m á tico s es m ás lenta. El acc id e n te ce re b ro v a s c u la r tro m b ó tic o se pu ede d iv id ir en dos ca te g o ría s - e n fe rm e d a d de va so s g ra n d e s y e n fe rm e d a d de va so s pequ eñ os . La p r im e ra a fe c ta va so s ta le s co m o las c a ró tid a s in te rnas , v e rte b ra l y e l p o líg o n o de W illis . La ú ltim a pued e a fe c ta r a va so s m ás pe qu eñ os ta le s co m o las ra m ifica c io n e s de l po líg o n o de W illis . El in fa rto de m io ca rd io (IM ) se ca u sa p o r un in fa rto (m ue rte de te jido d e b id o a isquem ia ), fre cu e n te m e n te d e b id o a la o b s tru cc ió n de la a rte ria co ro n a ria p o r un tro m b o . El IM pu e d e llega r rá p id a m e n te a s e r m orta l su no se rec ibe rá p id a m e n te tra ta m ie n to m éd ico de u rgenc ias .
La tro m b o s is ve n o s a es un co á g u lo de san g re qu e se fo rm a d e n tro de una ven a . Si se rom pe un tro zo de un coá gu lo de san g re fo rm a d o en u n a ven a , se pu e d e tra n s p o rta r al lado d e re ch o de l co ra zón , y de sd e a llí a los p u lm o nes . Un tro zo de tro m b o que es tra n s p o rta d o de e s ta fo rm a e s un a e m b o lia y e l p ro ce so de fo rm a c ió n de un tro m b o q u e llega a s e r e m b ó lico se d e n o m in a u n a tro m b o e m b o lia . U na e m b o lia qu e se a lo ja en los p u lm o n e s es una e m b o lia p u lm o n a r (EP). Un é m b o lo p u lm o n a r es u n a a fe cc ión m uy g ra ve qu e pu ed e s e r m orta l si no se reco no ce y tra ta ráp id am en te .
Las tro m b o s is ve n o sa s s u p e rfic ia le s pu ed en c a u s a r m o lestia , pe ro g e n e ra lm e n te no ca u sa c o n se cu e n c ia s g ra ves , a d ife re n c ia de las tro m b o s is v e n o sa s p ro fu n d a s (TV P ) q u e se fo rm a n en las ve n a s p ro fu n d a s de las p ie rn as o en las ve n a s pé lv icas . Las e m b o lia s s is té m ica s de o rigen v e n o so pu eden o c u rr ir en p a c ie n tes con un de fe c to sep ta l a u r ic u la r o v e n tricu la r, a tra vé s de l cua l pu ede p a s a r un é m b o lo al a p a ra to a rticu la r. D icho e ve n to se llam a e m b o lia pa rad ó jica .
La p re ven c ión de tro m b o s is a rte ria l y /o v e n o s a in c luye m e d ica c io n e s (p o r e jem p lo , a n tico a g u la n te s (p o r e jem p lo , he pa rina ), a sp ir in a y v ita m in a E) y m é to d o s m e cá n ico s (po r e je m p lo , b o m b a s m e cá n ica s pa ra las p ie rn a s (m ed ias de co m p re s ió n neum á tica )).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , m e jo ra , red ucc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s de ) de la tro m b o s is a rte ria l y /o v e n o s a a d m in is tra n d o un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tica m e n te e fica z d e u n a p ro te ín a d e un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que t ie n e o que se so sp e ch a que t ie n e tro m b o s is a rte ria l y /o ven osa . S e p ro p o rc io n a n ad em á s m é tod os de tra ta m ie n to de tro m b o s is a rte ria l y /o v e n o s a a d m in is tra n d o un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con una s e g u n d a te ra p ia , po r e jem p lo , un a n tico a g u la n te (po r e jem p lo , hepa rina ), a sp ir in a y /o v ita m in a E y /o un m é todo m ecá n ico (po r e je m p lo , u n a b o m b a m e cá n ica pa ra las p ie rn as (m ed ias de c o m p re s ió n neum á tica ). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de la tro m b o s is a rte ria l y /o v e n o s a o un s ín to m a de la m ism a a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , una ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e sa rro lla r tro m b o s is a rte ria l y /o v e n o s a (po r e je m p lo , un su je to q u e h a su fr id o un a cc id e n te c e re b ro v a s c u la r o in fa rto d e m io ca rd io ).
L a o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z d e una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu e d e o b te n e r de m od e los an im a le s de tro m b o s is a rte ria l o ven osa , ta le s co m o un m od e lo de tro m b o s is a rte ria l de do b le in se rc ión (G o m e z -Jo rg e e t a l., J. V asc. Inter. Rad. 9 (4 ): 633 -638 (1998 ), un m od e lo de tro m b o s is v e n o s a en ra ta con c o n d ic io n e s de flu jo ba jo en la c o rrie n te s a n g u ín e a v e n o sa (F red rich et a l., B lood C o ag u l F ib rino lys is . 5 (2 ):243 -8 (1994)), y un m ode lo c a n in o p a ra tro m b o s is v e n o s a y e m b o lia p u lm o n a r e sp o n tá n e a (F risb ie l, S p ina l C ord 43, 635 -639 (2005)).
íleo p o s o p e ra to rio
E l íleo p o so p e ra to rio es u n a p a rá lis is te m p o ra l d e una po rc ión d e los in te s tino s no rm a lm e n te d e s p u é s d e u n a c iru g ía ab d o m in a l. El íleo p o so p e ra to rio ocu rre co m ú n m e n te d u ra n te 24 a 72 ho ras d e sp u é s de la c iru g ía ab do m ina l.
Los s ín to m a s de íleo p o so p e ra to rio inc luyen , p o r e je m p lo , m o le s tia a b do m ina l m o d e ra d a y d ifu sa , e s tre ñ im ie n to , d is te n s ió n ab d o m in a l, ná use as o vó m ito s , fa lta de d e fe ca c ió n y /o fla tu le n c ia , y e ru c to s e xce s ivo s .
Los tra ta m ie n to s pa ra e l íleo p o so p e ra to rio in c luyen , p o r e je m p lo , nil po r os (N P O o "n a d a p o r la boca") ha s ta q u e el son id o p e ris tá ltico se o ig a de la au scu lta c ió n de l á re a d o n d e se e n c u e n tra e s ta po rc ión , succ ión na sog ás trica , a lim e n ta c io n e s p a re n te ra le s y m e d ica c io n e s (p o r e je m p lo , la c tu lo sa y e ritro m ic in a ).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , m e jo ra , red ucc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s de ) de íleo p o so p e ra to rio a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to q u e tie n e o q u e se so sp e ch a q u e t ie n e íleo po so p e ra to rio . Se p ro p o rc io n a n ad e m á s m é to d o s de tra ta m ie n to de íleo po so p e ra to rio a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en c o m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , p o r e je m p lo , nil p o r os, succ ión nasog ás trica , a lim e n ta c io n e s p a re n te ra le s y /o u n a m ed ica c ión (p o r e je m p lo , la c tu lo sa y /o e ritro m ic in a ). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é to d o s de p re ven c ión de l íleo p o so p e ra to rio o un s ín to m a de l m ism o a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , un a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a d e un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo d e d e s a rro lla r íleo p o so p e ra to rio (po r e jem p lo , un su je to que ha te n id o c iru g ía a b do m ina l).
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z d e una p ro te ín a d e un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ede o b te n e r d e m od e los an im a le s de íleo p o so p e ra to rio , ta le s co m o un m od e lo pa ra in ve s tig a r íleo p o so p e ra to rio con tra n s d u c to re s con e x te n s ó m e tro en ra tas d e sp ie rta s (H uge e t al. J S urg Res. 74 (2 ):112-8 (1998)).
A n e u ris m a a ó rtica
U n a a n e u rism a a ó rtica es un té rm in o g e n e ra l pa ra c u a lq u ie r in flam a c ión (d ila ta c ión o an e u rism a ) d e la ao rta , que n o rm a lm e n te re p re se n ta una de b ilid a d su b ya ce n te en la pa red de la ao rta en e sa loca lizac ión . Los tip o s de a n e u rism a s aó rticas inc luyen a n e u rism a de la ra íz aó rtica , a n e u rism a aó rtica to rá c ica , a n e u rism a aó rtica a b do m ina l y a n e u rism a a ó rtica to ra co a b d o m in a l.
Las a n e u rism a s aó rticas m ás in ta c tas no p ro du cen s ín tom a s . A m ed id a que se ag ran dan , los s ín to m a s de la a n e u rism a a ó rtica inc luyen , p o r e jem p lo , an s ie dad o sen sac ión de es trés , ná useas o vó m ito s , p ie l sudorosa , fre c u e n c ia c a rd ía c a ráp ida , d o lo r a b do m ina l, se pued e d e s a rro lla r d o lo r d e esp a lda , d o lo r d e las p ie rn as o e n tu m e c im ie n to , e r ite m a no do so (le s io n e s en las p ie rn as n o rm a lm e n te e n co n tra d a s ce rca de la reg ión de l to b illo ), y un a v o z ron ca a m e d id a q u e se e s tira e l ne rv io la rín ge o recu rren te izq u ie rdo q u e se rp e n te a a lre d e d o r de l a rco de la ao rta . U na vez se rom p e u n a a n e u rism a , pued e c a u s a r d o lo r g ra ve y u n a fu e rte h e m o rra g ia in te rna , y es m orta l en a u se n c ia de tra ta m ie n to ráp ido.
Los tra ta m ie n to s pa ra la a n e u rism a aó rtica inc luyen , p o r e jem p lo , m ed ica c ion es , tra ta m ie n to q u irú rg ico y tra ta m ie n to e n d o va scu la r. Las a n e u rism a s m ás p e q u e ñ a s que no están en a lto rie sgo de ro tu ra se pu ed en tra ta r con fá rm a co s p a ra tra ta r la h ipe rte ns ió n a rte ria l, ta le s co m o b e ta -b lo q u e a n te s ; o d o x ic ic lin a p a ra la inh ib ic ión de la m e ta lo p ro te in a sa -9 de m atriz . El tra ta m ie n to q u irú rg ico n o rm a lm e n te im p lica a b rir la po rc ión d ila ta d a de la ao rta y la in se rc ió n de un tu b o de p a rche s in té tico (D acron o G ore -tex). El tra ta m ie n to e n d o va scu la r, co m o u n a a lte rn a tiva m ín im a m e n te in va s iva a la rep a ra c ión d e c iru g ía ab ie rta , im p lica la c o lo ca c ió n d e un a p ró te s is e n d o v a s c u la r m ed ia n te un a té c n ic a p e rcu tá n e a (n o rm a lm e n te m ed ia n te las a rte rias fe m o ra le s ) en la po rc ión e n fe rm a de la ao rta . La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín tom a s de ) de a n e u rism a a ó rtica a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e jem p lo , un a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que t ie n e o que se so sp e ch a q u e tie n e a n e u rism a aó rtica . S e p ro p o rc io n a n ad e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de a n e u rism a aó rtica a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ió n a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , p o r e je m p lo , una m ed ica c ión (po r e je m p lo , un fá rm a c o p a ra tra ta r h ipe rte ns ió n a rte ria l (po r e jem p lo , un b e ta -b lo q u e a n te ) o do x ic ic lin a ), c iru g ía y /o un tra ta m ie n to e n d o va scu la r. La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de la a n e u rism a a ó rtica o un s ín to m a de la m ism a a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , una ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r a n e u rism a a ó rtica (po r e jem p lo , un su je to q u e tie n e h ipe rte ns ió n a rte ria l).
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pu e d e o b te n e r de un m ode lo an im a l de a n e u rism a aó rtica , p o r e jem p lo , un m od e lo de ra ta de a n e u rism a a ó rtica a b d o m in a l u sa n d o u n a co m b in a c ió n de in fus ión in tra lu m in a l de e la s ta s a y e xp o s ic ió n e x tra lu m in a l a c lo ru ro de ca lc io (T a n a ka e t al. J V asc S urg . 50 (6 ):1423 -32 (2009)).
Q s te o a rtritis
La os te o a rtr itis , ta m b ié n co n o c id a co m o a rtritis d e g e n e ra tiva , se c a ra c te r iza p o r la ro tu ra y p é rd id a eve n tu a l de l c a rtíla g o de u n a o m ás a rticu la c io n e s . La o s te o a rtr it is o cu rre cu a n d o el c a rtíla g o q u e a m o rtig u a los e x tre m o s de los h u eso s en las a rticu la c io n e s se d e te r io ra con el tie m p o . La su p e rfic ie lisa de l c a rtíla g o se v u e lv e áspera , ca u sa n d o irritac ión . Si e l c a rtíla g o se d e sg a s ta co m p le ta m e n te , se da ñ a rá n los ex tre m o s de los huesos. La o s te o a rtr itis co m ú n m e n te a fe c ta a las m anos, p ies, c o lu m n a ve rte b ra l y a rticu la c io n e s p o rta d o ra s de g ran peso, ta le s co m o las c a d e ra s y las rod illas.
Los s ín tom a s de la o s te o a rtr it is in c luyen , p o r e jem p lo , do lo r, d o lo r con la pa lp ac ió n , rig idez, p é rd id a de fle x ib ilid a d , sen sac ión in so p o rta b le y e sp o lo n e s óseos.
Los tra ta m ie n to s pa ra la o s te o a rtr it is inc luyen , p o r e je m p lo , m ed id as c o n se rva tiva s (po r e je m p lo , reposo , reducc ión de peso , te ra p ia f ís ic a y o cu p a c io n a l) y m e d ica c io n e s (po r e je m p lo , a ce ta m in o fe n o , c re m a s pa ra el a liv io de l d o lo r a p lica d a s a la p ie l sob re las a rticu la c io n e s (po r e je m p lo , ca p sa ic in a , sa lic ina , sa lic ila to de m e tilo y m en to l), fá rm a co s a n tiin fla m a to rio s no e s te ro id e o s (A IN E ) (p o r e je m p lo , asp irina , ibup ro feno , n a b u m e to n a y n a p ro xeno ) e in h ib id o res de C o x-2.
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e jem p lo , es ta b iliza c ió n , red ucc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín tom a s o e s ta b iliza c ió n de la pu n tu a c ió n del su je to en un a e sca la de os te o a rtr itis ) de la os te o a rtr it is a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to qu e tie n e o q u e se so sp e ch a q u e tie n e os te o a rtr it is . Se p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de o s te o a rtr it is a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te ra p ia , p o r e jem p lo , u n a m ed id a co n s e rv a tiv a (po r e jem p lo , reposo , red ucc ión de peso , te ra p ia fís ic a y /o o c u p a c io n a l) y /o u n a m ed ica c ión (p o r e je m p lo , a ce ta m in o fe n o , u n a c re m a tó p ic a p a ra el a liv io de l do lo r, un A IN E (po r e jem p lo , asp irina , ibup ro feno , n a b u m e to n a o n a p ro xeno ) y /o un in h ib id o r de C ox-2. La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ve n c ió n de la o s te o a rtr it is o un s ín to m a de la m ism a ad m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r o s te o a rtr it is (po r e jem p lo , un su je to que ha te n id o u n a les ión a rticu la r).
Las e sca la s ú tile s pa ra la e va lu a c ió n de la o s te o a rtr it is inc luyen , p o r e jem p lo , la p u n tua c ió n de l resu ltad o de les ión de rod illa y o s te o a rtr it is (K O O S ; R oos e t al. (1998 ) J. O rthop . S po rts Phys. Ther. 28 (2 ):88 -96 ), e l índ ice de o s te o a rtr it is de las U n ive rs id a d e s de O n ta rio occ id e n ta l y M cM a s te r (W O M A C ; R oos e t al. (2003 ) H ea lth Q ua l. Life O u tco m e s 1 (1 ):17), y la e sca la g e ne ra l de sa lud de l fo rm u la r io co rto de 36 p u n tos (S F -36 G H S ), a s í co m o o tras h e rra m ie n ta s de e va lu a c ió n c o n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu e d e o b te n e r de un m od e lo an im a l de os te o a rtr it is , p o r e jem p lo , inyecc ió n de m o n o -yo d o a ce ta to (M IA ) en la a rticu la c ió n fe m o ro tib ia l de roe do res q u e p ro m u e ve la p é rd id a de c a rtíla g o a rtic u la r s im ila r al o b se rva d o en o s te o a rtr it is hu m an a (G uzm an e t al. T ox ico l P a tho l. 31 (6 ):619 -24 (2003)), y co rte tra n sve rsa l de l ligam e n to c ru za d o a n te rio r (A C L) en ca n in o s pa ra in d u c ir o s te o a rtr it is (F ife y B ran d t J C lin Invest. 84 (5 ): 1432 -1439 (1989)).
V a s c u litis
La va s c u lit is se re fie re a un g ru p o h e te rog én eo de tra s to rn o s que se c a ra c te r iza p o r d e s tru cc ió n in fla m a to ria de va s o s san gu ín eo s . S e pueden a fe c ta r ta n to las a rte ria s co m o las ven as . La lin fa n g itis se c o n s id e ra a lg u n a s ve ce s un t ip o de vascu lit is . La v a s cu lit is es p r in c ip a lm e n te d e b id a a la m ig rac ión de le uco c itos y e l d a ñ o resu ltan te . La va s c u lit is se pued e c la s if ic a r p o r la ca u sa sub ya ce n te , la lo ca lizac ión de los va so s a fe c ta dos , o el t ip o o ta m a ñ o de los va so s san gu ín eo s . La v a s cu lit is e s tá a so c ia d a con va rio s tra s to rn o s y a fe cc io n e s ad ic io na le s , p o r e jem p lo , e n fe rm e d a d de K aw asak i, e n fe rm e d a d de B ehget, p o lia rte ritis nodosa , g ra n u lo m a to s is de W e g e n e r, c rio g lo b u lin e m ia , a rte ritis de T a ka ya su , s ín d ro m e de C h u rg -S tra u ss , a rte ritis de cé lu la s g ig a n te s (a rte ritis tem po ra l), p ú rp u ra de H e n o ch -S ch o n le in , e n fe rm e d a d e s reu m á tica s (p o r e jem p lo , a rtritis re u m a to id e y lupus e rite m a to so s is tém ico ), c á n c e r (po r e jem p lo , lin fom as), in fe cc io n e s (po r e je m p lo , he pa titis C), e xp o s ic ió n a p ro d u c to s q u ím ico s y fá rm a co s (po r e jem p lo , a n fe tam in as , co ca ín a y v a cu n a s a n tica rb u n co sa s q u e co n tie n e n e l an tíg e n o p ro te c to r de l ca rb u n co co m o c o m p o n e n te p rim ario ).
Los s ín to m a s de la v a s cu lit is in c luyen , p o r e jem p lo , f ieb re , p é rd id a de peso , pú rp u ra p a lp ab le , livedo re ticu la r, m ia lg ia o m ios itis , a rtra lg ia o a rtritis , m o n o n e u ritis m ú ltip le , ce fa le a , a cc ide n te ce re b ro va scu la r, a cú feno s , ag u d e za v isu a l reduc ida , p é rd id a v isu a l ag ud a , in fa rto de m ioca rd io , h ipe rte ns ió n , ga n g re n a , he m o rra g ia s na sa les, to s con sangre , in filtrad os pu lm o na re s , d o lo r a b do m ina l, heces con sangre , p e rfo ra c io n e s y g lo m e ru lo n e frit is .
Los tra ta m ie n to s pa ra la v a s cu lit is inc luyen , po r e jem p lo , m e d ica c io n e s re la c io n a d a s con co rtiso n a (p o r e jem p lo , p re d n iso n a ) y fá rm a co s in m u n o su p re so re s (po r e je m p lo , c ic lo fo s fa m id a ).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os d e tra ta m ie n to (po r e jem p lo , es ta b iliza c ió n , red ucc ión o e lim in a c ió n d e uno o m ás s ín to m a s o e s ta b iliza c ió n de la pu n tu a c ió n de l su je to en u n a e sca la de v a scu lit is ) de va s c u lit is ad m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e jem p lo , un a ca n tid a d te ra p é u tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to q u e t ie n e o que se so sp e ch a q u e t ie n e vascu lit is . S e p ro p o rc io n a n ad em á s m é tod os de tra ta m ie n to de va s c u lit is a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con una s e g u n d a te ra p ia (po r e jem p lo , u n a m ed ia c ión re la c io n a d a con co rtis o n a (p o r e jem p lo , p re d n iso n a ) y /o un fá rm a co in m u n o s u p re s o r (po r e je m p lo , c ic lo fo s fa m id a )). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ve n c ió n de la va s c u lit is o un s ín to m a de la m ism a a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d p ro filá c tic a m e n te e fica z d e u n a p ro te ín a d e un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en rie sgo de d e s a rro lla r v a s cu lit is (po r e jem p lo , un su je to qu e ha te n id o e n fe rm e d a d de K aw asak i, e n fe rm e d a d de B ehget, p o lia rte rit is nodosa , g ra n u lo m a to s is de W e g e n e r, c r io g lo b u lin e m ia o a rte ritis de T akaya su , etc .).
La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (p o r e je m p lo , e s ta b iliza c ió n , red ucc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín tom a s o e s ta b iliza c ió n de la p u n tua c ió n de l su je to en u n a e s c a la de v a scu lit is ) de v a s cu lit is a so c ia d a con lupus e rite m a to so s is té m ico a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que tie n e o que se so sp e ch a q u e tie n e v a scu lit is a so c ia d a con lupus e rite m a to so s is tém ico . Se p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de la v a s cu lit is a so c ia d a con lupus e rite m a to so s is té m ico a d m in is tra n d o un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la s m á tic a (po r e jem p lo , u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z d e una p ro te ín a d e un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con un a s e g u n d a te ra p ia , po r e je m p lo , u n a m ed ica c ión re la c io n a d a con co rtis o n a (po r e je m p lo , p re d n iso n a ) y /o un fá rm a co in m u n o su p re so r (po r e jem p lo , c ic lo fo s fa m id a ).
S e p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to (po r e jem p lo , m e jo ra , e s ta b iliza c ió n o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s) de un tra s to rn o aso c ia d o a la va s c u lit is (en fe rm ed ad de K aw asak i, e n fe rm e d a d de B ehget, po lia rte ritis no do sa , g ra n u lo m a to s is de W e g e n e r, c rio g lo b u lin e m ia , a rte ritis de T akaya su , s ín d ro m e de C h u rg -S tra u ss , a rte ritis de cé lu la s g ig a n te s (a rte ritis te m p o ra l), p ú rp u ra de H e n o ch -S ch o n le in , e n fe rm e d a d e s re u m á tica s (po r e jem p lo , a rtr itis re u m a to id e y lupus e r ite m a to so s is tém ico ), c á n c e r (po r e je m p lo , lin fom as), in fe cc io n e s (po r e je m p lo , hepa titis C), e x p o s ic ió n a p ro d u c to s q u ím ico s y fá rm a co s (po r e jem p lo , a n fe tam in as , c o c a ín a y v a cu n a s a n tica rb u n co sa s que co n tie n e n e l an tíg e n o p ro te c to r de l ca rb u n co co m o c o m p o n e n te p rim a rio ) a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la s m á tic a (po r e jem p lo , u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z d e una p ro te ín a d e un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to qu e t ie n e o q u e se so sp e ch a q u e t ie n e un tra s to rn o aso c ia d o a la vascu lit is . La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é todos de p re ven c ión de un tra s to rn o a so c ia d o a la v a s cu lit is o un s ín to m a de l m ism o a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r un tra s to rn o a so c ia d o a la vascu lit is .
Las e sca la s ú tile s p a ra la e va lu a c ió n de la o s te o a rtr it is inc luyen , p o r e jem p lo , la pu n tu a c ió n de ac tiv id a d de va scu lit is de B irm ingh am (Bv AS) ve rs ió n 3 (M u kh tya r e t al. A nn R heum Dis. 68 (12 ): 1827 -32 (2009 )), a s í co m o o tras h e rra m ie n ta s d e e va lu a c ió n co n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n p a ra la d e te rm in a c ió n d e la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z d e una p ro te ín a d e un ión a c a lic re ín a p la s m á tic a se p u e d e o b te n e r d e un m od e lo an im a l de v a scu lit is , vé a n se , p o r e jem p lo , aq u e llo s d e sc rito s en K atz e t al., C lin R ev A lle rg y Im m uno l. 35(1 -2): 11 -8 (2008 ) y re fe re nc ias c ita d a s en su in te rio r.
T ra u m a tis m o c ra n e o e n c e fá lic o
El tra u m a tis m o c ra n e o e n c e fá lic o se re fie re a tra u m a tis m o a la cab eza , que pued e o pu ed e no in c lu ir les ión al ce re b ro . Los tip o s de tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico inc luyen co n m o c ió n , h e m a to m a ep id u ra l, h e m a to m a subdu ra l, co n tu s ió n c e re b ra l y les ión axona l d ifusa .
Los s ín to m a s de l tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico inc luyen , p o r e jem p lo , com a , con fus ió n , so m n o le n c ia , ca m b io de p e rso n a lid a d , c o n vu ls io n e s , ná use as y vó m ito s , ce fa le a y un in te rva lo de luc idez , d u ra n te el que un p a c ie n te p a rece c o n sc ie n te so lo p a ra d e te r io ra rs e d e sp u é s , fu g a d e líqu id o ce fa lo rra q u íd e o , de fo rm id a d o d e p re s ió n v is ib le en la c a b e z a o cara , un o jo que no se pued e m o ve r o se d e s v ía ha c ia un lado pued e in d ic a r q u e un hu eso fa c ia l ro to es tá p e lliz ca n d o un ne rv io que in e rva los m úscu lo s de l o jo , he ridas o c a rd e n a le s sob re el cu e ro ca b e llu d o o la cara , fra c tu ra s de la base de l c ráneo , u n a h e m o rra g ia su b cu tá n e a sob re e l m asto ide , he m o tím p a n o , r in o rre a y o to rre a de líqu id o c e fa lo rra q u íd e o .
Los tra ta m ie n to s pa ra el tra u m a tism o c ra n e o e n c e fá lic o inc luyen , po r e jem p lo , c o n tro la r la e le v a d a p res ión in tra c ra n e a l (po r e jem p lo , se d ac ión , pa ra lizan te s , d e riva c ió n de líqu ido c e fa lo rra q u íd e o ), c ra n ie c to m ía d e sco m p re s iva , c o m a p o r ba rb itú rico s , so luc ió n sa lin a h ip e rtó n ica e h ipo te rm ia .
La d ivu lg ac ión p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e jem p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s o e s ta b iliza c ió n de la p u n tua c ió n de l su je to en u n a e s c a la de tra u m a tis m o c ra n e o e n ce fá lico ) de tra u m a tis m o c ra n e o e n c e fá lic o a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to q u e tie n e o q u e se so sp e ch a que t ie n e tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico . S e p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de tra u m a tis m o c ra n e o e n c e fá lic o a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , una ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con una s e g u n d a te ra p ia , po r e jem p lo , co n tro la r la e le v a d a p re s ió n in tra c ran ia l (po r e jem p lo , sed ac ión , un p a ra liza n te y/o de riva c ió n de líqu ido c e fa lo rra q u íd e o ), c ra n ie c to m ía d e sco m p re s iva , c o m a p o r ba rb itú rico s , so luc ió n sa lina h ip e rtó n ica y /o h ipo te rm ia . La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é to d o s de p re ven c ión de l tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico o un s ín to m a de l m ism o ad m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico (po r e je m p lo , un su je to q u e p a rtic ip a rá en u n a ac tiv ida d p e lig ro sa o d e p o rte de con tac to ).
Las e sca la s ú tile s pa ra e va lu a r tra u m a tis m o c ra n e o e n ce fá lico y s ín to m a s de l tra u m a tism o c ra n e o e n c e fá lic o inc luyen , p o r e je m p lo , la e s c a la de co m a de G la s g o w (T e a sd a le y Jen ne tt, La nce t 13 ;2 (7872 ):81 -4 (1974)), a s í co m o o tras h e rra m ie n ta s de e va lu ac ió n c o n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n pa ra la de te rm in a c ió n de la do s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pued e o b te n e r de m od e los a n im a le s de tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico , vé a n se , p o r e jem p lo , los d e sc rito s en C e rnak, N euroR x. 2 (3 ): 410 -422 (2005 ) y re fe re nc ias c ita d a s en su in te rio r. E d em a c e re b ra l
El e d e m a de l ce re b ro (ed em a ce re b ra l) es un exce so de acu m u la c ió n de a g u a en los e sp a c io s in tra ce lu la re s y/o e x tra ce lu la re s de l ce re b ro . Los tip o s de e d e m a c e re b ra l in c luyen , po r e je m p lo , e d e m a c e re b ra l va so g é n ico , e d em a ce re b ra l c ito tó x ico , e d e m a ce re b ra l o sm ó tico y e d e m a ce re b ra l in te rs tic ia l.
El e d e m a ce re b ra l v a s o g é n ic o es d e b ido a u n a ro tu ra de las e s tre ch a s u n io n e s e n d o te lia le s q u e co n s titu ye n la b a rre ra h e m a to e n ce fá lica (B H E ). E sto pe rm ite n o rm a lm e n te que p ro te ín a s in tra va scu la re s e xc lu id a s y líqu ido p e ne tre n en el e sp a c io e x tra c e lu la r de l p a ré n q u im a ce re b ra l. U na ve z los c o n s titu ye n te s de l p la sm a c ruza n la BHE, se e x tie n d e e l e d e m a ; es to pu e d e s e r b a s ta n te ráp ido y g e n e ra liza d o . A m e d id a q u e e n tra a g u a en la m a te ria b lan ca , se m ue ve e x tra ce lu la rm e n te a lo la rgo de los fa s c íc u lo s y ta m b ié n pu ede a fe c ta r la m a te ria g ris . Este tipo de e d e m a se o b se rva en resp u e s ta a tra u m a tism o , tu m o re s , in flam a c ión fo ca l, e s ta d io s ta rd ío s de isq u e m ia ce re b ra l y e n c e fa lo p a tía h ipe rte ns iva . A lg u n o s de los m e ca n ism o s que co n trib u ye n a una d is fu n c ió n de la B H E son : ro tu ra f ís ic a p o r h ipe rte n s ió n o tra u m a tism o arte ria l, libe rac ión fa c ilita d a p o r tu m o r de co m p u e s to s d e s tru c tivo s va so a c tivo s y e n d o te lia le s (po r e jem p lo , ác ido a ra q u id ó n ico , n e u ro tra n sm iso re s exc ita d o re s , e ico sa n o id e s , b ra d iqu in in a , h is ta m in a y rad ica les lib res). A lg u n a s de las su b ca te g o ría s e sp e c ia le s de l e d e m a v a so g é n ico inc luyen : e d e m a ce re b ra l h id ro s tá tico , e d e m a ce re b ra l de c á n c e r ce re b ra l, e d e m a ce re b ra l de las a ltu ras.
El e d e m a ce re b ra l c ito tó x ico es d e b id o a la pe rtu rb a c ió n en e l m e ta b o lism o c e lu la r da nd o co m o resu ltad o el in a d e cu a d o fu n c io n a m ie n to de la b o m b a de sod io y p o tas io en la m e m b ra n a c e lu la r de la g lía . C o m o resu ltad o ex is te , re tenc ión c e lu la r de sod io y agua . El e d e m a c ito tó x ico se o b se rva con d ive rsa s in to x ica c io n e s (d in itro fe no l, tr ie tile s ta ñ o , he xa c lo ro fe n o , iso n ia z id a ), en s ín d ro m e de Reye, h ip o te rm ia g ra ve , isq u e m ia te m p ra n a , en ce fa lo p a tía , a cc id e n te c e re b ro v a s c u la r te m p ra n o o h ipox ia , pa ro ca rd ía co , s e u d o tu m o r ce re b ra l y to x in a s ce re b ra les .
El e d e m a c e re b ra l o sm ó tico ocu rre cu a n d o el p la sm a se d iluye p o r el e xce s ivo c o n su m o de a g u a (o h ipo na trem ia ), s ín d ro m e de la sec re c ió n in a p ro p ia d a de ho rm o n a a n tid iu ré tica (S IA D H ), hem od iá lis is , o la ráp id a red ucc ión de la g lu c o s a en san g re en e l e s ta do h ip e rg lu cé m ico h ip e ro s m o la r (H H S ), con an te rio rid a d ac ido s is no ce tó s ica h ip e ro s m o la r (H O N K ) y la o sm o la lid a d ce re b ra l s u p e ra la o sm o la lid a d en sue ro c re a n d o una p res ión anorm a l.
El e d e m a ce re b ra l in te rs tic ia l ocu rre en h id ro cé fa lo o b s tru c tivo . E sta fo rm a de e d e m a es d e b id a a la ro tu ra de la b a rre ra de líqu ido c e fa lo rra q u íd e o ce re b ra l (L C R )-ce re b ro d a n d o co m o resu ltad o flu jo tra n s -e p e n d im a rio de LC R, qu e pe rm ite que el LC R p e ne tre en el ce re b ro y se e x tie n d a en e l e sp a c io e x tra c e lu la r de la m a te ria b lanca .
Los s ín tom a s de l e d e m a c e re b ra l (po r e je m p lo , e d e m a ce re b ra l p e ritu m o ra l) in c luyen , p o r e je m p lo , ce fa lea , pé rd ida de c o o rd in a c ió n (a tax ia ), d e b ilid a d y d ism in u c ió n de los n ive les de co n o c im ie n to que in c luyen de so rie n ta c ió n , p é rd id a de m em oria , a lu c in a c io n e s , co m p o rta m ie n to ps icó tico y com a .
Los tra ta m ie n to s pa ra e l e d e m a ce re b ra l (po r e jem p lo , e d e m a ce re b ra l pe ritu m o ra l) in c luyen , p o r e jem p lo , m e d ica c io n e s (po r e jem p lo , d e xa m e ta so n a , m an ito l, d iu ré tico s ) y d e sco m p re s ió n q u irú rg ica .
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s de ) de e d e m a ce re b ra l (po r e jem p lo , pe ritu m o ra l e d e m a c e re b ra l) a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to qu e tie n e o q u e se so sp e ch a q u e tie n e e d e m a ce re b ra l (po r e je m p lo , e d e m a ce re b ra l pe ritum o ra l). Se p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de e d e m a ce re b ra l (p o r e jem p lo , e d e m a ce re b ra l p e ritu m o ra l) a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) en c o m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , p o r e je m p lo , un a m ed ica c ión (po r e je m p lo d e xa m e ta so n a , m an ito l y /o d iu ré tico s ) y /o d e sco m p re s ió n q u irú rg ica . La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de l e d e m a ce re b ra l o un s ín to m a de l m ism o a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en rie sgo de d e s a rro lla r e d e m a ce re b ra l (p o r e jem p lo , un su je to al q u e se le ha d ia g n o s tica d o un tu m o r ce re b ra l).
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pued e o b te n e r de m od e los a n im a le s de e d e m a ce re b ra l, p o r e jem p lo , un m od e lo de ra ta de e m b o lia ce re b ra l en e l que la rec ircu la c ió n se pu ed e in tro d u c ir en e l á re a isq u é m ica (K o izum i e t al., Jpn J S tro ke 8: 1-8 (1986)).
S e p tic e m ia
La s e p tice m ia es una a fe cc ión m éd ica g ra ve q u e se c a ra c te r iza p o r un e s ta do in fla m a to rio de c u e rp o e n te ro y la p re se n c ia de un a in fecc ión co n o c id a o p re sun ta . E sta re sp u e s ta in m u n o ló g ica se pu e d e c a u s a r p o r m ic ro b io s en la sangre , o rina , pu lm o nes , p ie l, u o tro s te jid o s y pu ed e c o n d u c ir a a c tiva c ió n g e n e ra liz a d a de p ro te ínas de fa se aguda, q u e a fec tan e l s is te m a de l co m p le m e n to y las v ía s de la co a g u la c ió n , q u e e n to n ce s ca u sa n d a ñ o a la va scu la tu ra , a s í co m o a los ó rg an os . Los d ife re n te s n ive le s de s e p tice m ia in c luyen s índ ro m e de re sp u e s ta in fla m a to ria s is té m ica (S IR S ), s e p tice m ia (S IR S en re sp u e s ta a un p ro ce so in fe cc io so c o n firm a d o ), s e p tice m ia g ra ve (se p tice m ia con d is fu n c ió n o rg án ica , h ipo pe rfus ión , o h ipo te n s ió n ) y ch o q u e sé p tico (se p tice m ia con h ipo te ns ió n a rte ria l re frac ta ria o a n o m a lía s de la h ipo pe rfus ión a p e sa r de reh id ra tac ió n a d ecu ad a ).
Los s ín to m a s de la s e p tice m ia in c luyen , p o r e je m p lo , s ín to m a s g e n e ra le s re la c io n a d o s con la in fecc ión , in flam a c ión a g u d a p re se n te en to d o e l cue rpo , h ip o te rm ia o fieb re , ta q u ica rd ia , ta q u ip n e a o h ip o ca p n ia d e b id a a h ipe rven tila c ió n , le uco pen ia , leuco c itos is , b a n d e m ia y d is fu n c ió n o rg á n ica (po r e je m p lo , pu lm ón , ce re b ro , h ígado , riñón y /o co ra zón ). Los tra ta m ie n to s p a ra la s e p tice m ia inc luyen , po r e jem p lo , an tib ió tico s , fá rm a c o s v a so p re so re s , insu lina , co rtico s te ro id e s , d ro tre c o g in a a lfa , d re n a je q u irú rg ico de a c u m u la c io n e s de líqu id o in fec tado , sus titu c ió n de líqu ido y so p o rte a p ro p ia d o pa ra la d is fu n c ió n o rg á n ic a (po r e jem p lo , he m o d iá lis is en in su fic ie n c ia renal, v e n tila c ió n m ecá n ica en d is fu n c ió n pu lm o na r, tra n s fu s ió n de h e m o d e riva d o s , y te ra p ia con fá rm a co s y líqu id os pa ra in su fic ie n c ia c ircu la to ria ). S e pu e d e u s a r la te ra p ia d ir ig id a a ob je tivo s te m p ra n o s (E G D T ), un e n fo q u e s is te m á tico a la reh id ra tac ió n , pa ra tra ta r s e p tice m ia g ra ve y ch o q u e sép tico .
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín tom a s o e s ta b iliza c ió n de la p u n tua c ió n de l su je to en u n a e s c a la de se p tice m ia ) de la se p tice m ia a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ió n a c a lic re ín a p la sm á tica (p o r e jem p lo , un a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to q u e tie n e o qu e se so sp e ch a q u e t ie n e sep ticem ia . Se p ro p o rc io n a n ad em á s m é tod os de tra ta m ie n to de s e p tice m ia a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con una s e g u n d a te ra p ia , p o r e jem p lo , un a n tib ió tico , un fá rm a co va so p re so r, in su lina , un co rtico s te ro id e , d ro tre c o g in a alfa , d re n a je q u irú rg ico de a cu m u la c io n e s de líqu ido in fec tado , sus titu c ión de líqu ido , un so p o rte a p ro p ia d o pa ra la d is fu n c ió n o rg á n ic a (po r e jem p lo , he m o d iá lis is en in su fic ie n c ia renal, v e n tila c ió n m ecá n ica en d is fu n c ió n pu lm o na r, tra n s fu s ió n de h e m o d e riva d o s y/o te ra p ia con fá rm a co s y líqu idos p a ra in su fic ie n c ia c ircu la to ria ) y /o te ra p ia d ir ig id a a o b je tivo s te m p ra n o s (E G D T). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ve n c ió n de la s e p tice m ia o un s ín to m a de la m ism a a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en rie sgo de d e s a rro lla r s e p tice m ia (p o r e je m p lo , un su je to al que se le ha d ia g n o s tica d o una in fecc ión ).
Las e sca la s ú tiles pa ra e v a lu a r la s e p tice m ia y los s ín to m a s de la s e p tice m ia in c luyen , p o r e jem p lo , la e s c a la de s e p tice m ia de B a ltim o re (M ee k e t al. J B u rn C a re R ehabil. 12 (6 ):564 -8 (1991)), a s í co m o o tra s h e rra m ie n ta s de e v a lu a c ió n c o n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ede o b te n e r de m od e los an im a le s de se p tice m ia , vé a n se , po r e je m p lo , los d e sc rito s en la pa te n te de EE. UU. N° 6.964.856 , y B uras e t al. N a t R ev D rug D iscov. 4 (10 ):854 -65 (2005 ) y re fe re nc ias c ita d a s en su in te rio r.
E ve n to is q u é m ic o a g u d o d e la a rte r ia c e re b ra l m e d ia (A C M ) (A c c id e n te c e re b ro v a s c u la r)
Un e ve n to isq ué m ico ag u d o de la a rte ria c e re b ra l m e d ia (A C M ) (a cc id e n te ce re b ro va scu la r) es la p é rd id a q u e se d e s a rro lla ráp id a m e n te de la (s) fu n c ió n (e s ) ce re b ra l(e s ) d e b ido a a lte rac ión en e l riego sa n g u ín e o al ce re b ro d e b ido a isq u e m ia (fa lta de sum in is tro de g lu co sa y o x íg eno ) ca u sa d a p o r tro m b o s is (p o r e jem p lo , tro m b o s is ven osa ), e m b o lia o h ip o p e rfu s ió n s is tém ica . C o m o resu ltado , e l á rea de l ce re b ro a fe c ta d a es in cap az de fu n c io n a r, que co n d u ce a in cap ac id ad pa ra m o ve r una o m ás e x tre m id a d e s en un lado de l cue rpo , in cap ac id ad pa ra e n te n d e r o p la n te a r un a co n ve rsa c ió n , o in ca p a c id a d pa ra v e r un lado de l c a m p o v isu a l. Un a cc ide n te c e re b ro v a s c u la r es una u rg e n c ia m éd ica y pued e c a u s a r d a ñ o ne u ro ló g ico pe rm an en te , co m p lica c io n e s y /o m uerte .
Los s ín to m a s de l e ve n to isq ué m ico ag u d o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te ce re b ro v a s c u la r) inc luyen , p o r e je m p lo , he m ip le jia , sen sac ión red u c id a y de b ilid a d m u scu la r de la ca ra , e n tu m e c im ie n to , reducc ión en la sen sac ión sen so ria l o v ib ra to ria , o lo r, sabor, au d ic ión o v is ió n a lte ra d o s (to ta l o pa rc ia l), ca íd a de l pá rp a d o (p tos is ) y de b ilid a d de los m úscu lo s o cu la res , d ism in u c ió n de los re fle jos , p ro b lem as de e q u ilib rio y n is tagm o , a lte ra c ió n de la resp irac ión y la fre c u e n c ia ca rd ía ca , de b ilid a d en el m úscu lo e s te rn o c le id o m a s to id e o con in cap ac id ad pa ra g ira r la c a b e za ha c ia un lado, de b ilid a d en la le ng ua (in cap ac id ad p a ra sa ca r y /o m o ve rla de lado a lado), a fas ia , ap rax ia , de fe c to de l c a m p o v isu a l, dé fic its de m em oria , he m in a tenc ión , p e n sa m ie n to d e so rg a n iza d o , co n fus ió n , g e s tos h ip e rse xu a le s , an o so g n o s ia , p ro b le m a s pa ra ca m in a r, a lte rac ión de la c o o rd in a c ió n de l m ov im ien to , y v é rtig o y/o de se q u ilib rio .
El tra ta m ie n to pa ra e l e ve n to isq ué m ico ag ud o de la a rte ria c e re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te c e re b ro va scu la r) inc luye , p o r e je m p lo , tro m b ó lis is (po r e je m p lo , a c tiv a d o r tis u la r de l p la sm in ó g e n o (tP A )), tro m b e c to m ía , a n g io p la s tia e im p lan tac ió n de p ró te s is e n d o va scu la r, h ip o te rm ia te ra p é u tic a y m e d ica c io n e s (po r e jem p lo , asp irina , c lo p id o g re l y d ip ir id a m o l).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e jem p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s o e s ta b iliza c ió n de la pu n tu a c ió n de l su je to en u n a e sca la de a cc id e n te c e re b ro va scu la r) de l e ve n to isq ué m ico ag u d o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te c e re b ro va scu la r) a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to q u e t ie n e o q u e se so sp e ch a qu e t ie n e e ve n to isq ué m ico agud o de la a rte ria ce re b ra l m e d ia (A C M ) (a cc id e n te ce re b ro va scu la r). S e p ro po rc ion an a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de eve n to isq ué m ico ag u d o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te ce re b ro va scu la r) a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a se g u n d a te ra p ia , p o r e je m p lo , tro m b ó lis is (po r e jem p lo , a c tiva d o r t is u la r de l p la sm in ó g e n o (tP A )), tro m b e c to m ía , a n g io p la s tia e im p lan tac ió n de p ró te s is e n d o va scu la r, h ipo te rm ia te ra p é u tic a y /o u n a m ed ica c ión (po r e jem p lo , asp irina , c lo p id o g re l y d ip ir id a m o l). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de l e ve n to isq ué m ico agud o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te c e re b ro va scu la r) o un s ín to m a de l m ism o a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a can tida d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r e ve n to isq ué m ico ag u d o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (a cc id e n te ce re b ro va scu la r) (po r e je m p lo , un su je to q u e ha su fr id o h ipo pe rfus ión s is tém ica ).
Las e sca la s ú tile s pa ra e va lu a r el e ve n to isq ué m ico ag ud o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (acc ide n te c e re b ro va scu la r) y los s ín tom a s de l e ve n to isq ué m ico ag ud o de la a rte ria ce re b ra l m e d ia (A C M ) (acc ide n te c e re b ro va scu la r) inc luyen , p o r e je m p lo , la c la s ifica c ió n de l p ro ye c to de acc id e n te c e re b ro v a s c u la r de la com u n idad de O xfo rd (O C S P , ta m b ié n co n o c id o s co m o la c la s ifica c ió n de B am fo rd u O xfo rd ) (B am fo rd e t al., L a nce t 337 (8756): 1521 -6 (1991 )), y T O A S T (T ria l o f O rg 10172 in A cu te S troke T re a tm e n t) (A dam s e t a l., S tro ke 24 (1): 35-41 (1993)). La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ed e o b te n e r de m od e los an im a le s de e ve n to isq ué m ico ag udo de la a rte ria ce re b ra l m e d ia (A C M ) (acc ide n te c e re b ro va scu la r), véa nse , po r e je m p lo , los d e sc rito s en B eech e t a l., B ra in Res 895 : 18 -24 (2001), B uchan e t a l., S troke 23 (2): 273 -9 (1992 ), C a rm icha e l, N e u ro R x 2: 396 -409 (2005), C hen et a l., S troke 17 (4): 738 -43 (1986), D ittm a r e t a l., S troke 34: 2252 -7 (2003), D ittm a r e t a l., J N e u ro sc i M e tho ds 156: 50 (2006 ), G e rrie ts e t al., J N eurosc i M e thods 122: 201-11 (2003), G e rrie ts e t a l., S tro ke 35: 2372 -2377 (2004 ), G raham e t al., C o m p M ed 54: 486 -496 (2004), K o izum i e t al., Jpn J S tro ke 8: 1-8 (2004 ), Lo n g a et a l., S troke 20 (1): 84-91 (1989 ), M a yze l-O reg , M agn R eson M ed 51: 1232 -8 (2004), S ch m id -E ls a e s s e r e t a l., S troke 29 (10): 2162 -70 (1989), T a m u ra e t al., J C e reb B lood F low M etab 1: 53 -60 (1981), W a tso n e t a l., A nn N euro l 17: 497 -504 (1985 ) y Z han g et a l., J C e reb B lood F low M etab 17: 123-35 (1997).
R e es ten o s is
La re e s te n o s is es la rem a n ife s ta c ió n de la e s te nos is , un e s tre c h a m ie n to de un va s o sa n g u ín e o , qu e co n d u ce a c ircu la c ió n sa n g u ín e a res trin g id a . La re e s te n o s is no rm a lm e n te se re fie re a una a rte ria u o tro va s o sa n g u ín e o g ra nd e q u e se ha es tre ch a d o , rec ib ido tra ta m ie n to pa ra lim p ia r e l b lo q u e o ta l co m o a n g iop las tia , y p o s te r io rm e n te se ha vu e lto a ree s tre cha r. S e pued e d e fin ir co m o un a red ucc ión en la c ircu n fe re n c ia de la luz de 50 % o m ás, y tu vo una a lta ta s a de in c id e n c ia (25 -50 % ) en pa c ie n tes q u e se hab ían so m e tid o a a n g io p la s tia con g lob o , n e ces ita nd o la m a yo ría de los p a c ie n te s a n g io p la s tia ad ic io na l en e l p lazo de 6 m eses.
Los tra ta m ie n to s pa ra la re e s te n o s is inc luyen , p o r e jem p lo , a n g io p la s tia ad ic io n a l si la re e s te n o s is ocu rre sin una p ró te s is e n d o v a s c u la r o en c u a lq u ie r e x tre m o de u n a p ró te s is e n d o va scu la r, a n g io p la s tia re p e tid a e in se rc ión de o tra p ró te s is e n d o v a s c u la r de n tro de la o rig in a l si la re e s te n o s is ocu rre d e n tro de una p ró te s is e n d o va scu la r, p ró tes is e n d o va scu la re s q u e e luye n fá rm a co , b ra q u ite ra p ia y rad iac ión in tra co ro na ria .
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s de) de re e s te n o s is (po r e je m p lo , d e s p u é s de a n g io p la s tia ) a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de un a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to qu e tie n e o que se so sp e ch a q u e t ie n e ree s te no s is (po r e je m p lo , d e sp u é s de a n g iop las tia ). S e p ro p o rc io n a n a d e m á s m é to d o s de tra ta m ie n to de re e s te n o s is (po r e je m p lo , d e sp u é s de an g iop las tia ) a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con una s e g u n d a te ra p ia , po r e jem p lo , a n g io p la s tia si la re e s te n o s is o cu rre sin una p ró te s is e n d o v a s c u la r o en c u a lq u ie r e x tre m o de u n a p ró te s is e n d o va scu la r, a n g io p la s tia re p e tid a e in se rc ión de o tra p ró te s is e n d o v a s c u la r d e n tro de la o rig in a l si la re e s te n o s is o cu rre d e n tro de u n a p ró te s is e n d o va scu la r, un a p ró te s is e n d o v a s c u la r e lu ye fá rm a co , b ra q u ite ra p ia y /o rad iac ión in tra co ro na ria . La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ve n c ió n de la re e s te n o s is o un s ín to m a de la m ism a ad m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e s a rro lla r re e s te n o s is (po r e je m p lo , un su je to q u e ha te n id o es te nos is ).
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e su m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ed e o b te n e r de m od e los an im a le s de ree s te no s is , vé a n se , po r e je m p lo , los d e sc r ito s en las p a te n te s de EE. UU. N° 5.304.122 y 6.034.053 , y K a n to r e t al., C a rd io va sc R ad ia t Med.
1 (1 ):48 -54 (1999), y re fe re nc ias c ita d a s en su in te rio r.
N e fritis p or Iu p u s e r ite m a to s o s is té m ico
La ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is té m ico es una in flam a c ión de l riñón c a u s a d a po r lupus e r ite m a to so s is tém ico (LE S ), u n a e n fe rm e d a d a u to in m u n ita r ia c ró n ica de te jid o co n ju n tivo . El LE S se pued e a s o c ia r a v a scu lit is q u e son tra s to rn o s c a ra c te r iza d o s p o r la d e s tru cc ió n in fla m a to ria de los va so s san gu ín eo s .
Los s ín tom a s de la ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is té m ico inc luye n , p o r e je m p lo , s ín tom a s g e n e ra le s de en fe rm e d a d rena l, a u m en to de peso , h ipe rte ns ió n a rte ria l, o rin a e s p u m o s a m ás o s c u ra e in flam a c ión a lre d e d o r de los o jos, p ie rn as , to b illo s o dedos .
Los tra ta m ie n to s pa ra la ne fritis p o r lupus e r ite m a to s o s is té m ico in c luyen , p o r e jem p lo , te ra p ia con e s te ro id e s (po r e je m p lo , c o rtico s te ro id e s ), q u im io te ra p ia (po r e je m p lo , c ic lo fo s fa m id a , aza tiop rina , m ico fe n o la to m o fe tilo , o c ic lo sp o rin a ) y a g e n te s in m u n o su p re so re s (po r e jem p lo , m ico fe n o la to m o fe tilo y c ic lo fo s fa m id a in tra ven osa ).
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e je m p lo , es ta b iliza c ió n , reducc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín tom a s o e s ta b iliza c ió n de la pu n tu a c ió n del su je to en un a e sca la de lupus) de la ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is té m ico a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , una can tidad te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que tie n e o que se sosp ech a qu e tie n e ne fritis po r lupus e r ite m a to s o s is tém ico . S e p ro p o rc io n a n a d e m á s m é to d o s de tra ta m ie n to de ne fritis po r lupus e rite m a to so s is té m ico a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ió n a ca lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , p o r e jem p lo , te ra p ia con es te ro id e s (po r e jem p lo , un c o rtico s te ro id e ), q u im io te ra p ia (p o r e jem p lo , c ic lo fo s fa m id a , aza tio p rin a , m ico fe n o la to m o fe tilo y /o c ic lo sp o rin a ) y /o un a g en te in m u n o s u p re s o r (po r e jem p lo , m ico fe no la to m o fe tilo y /o c ic lo fo s fa m id a in tra ven osa ). La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de la ne fritis po r lupus e rite m a to so s is té m ico o un s ín to m a de la m ism a a d m in is tra n d o una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica (p o r e je m p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en rie sgo de d e s a rro lla r ne fritis po r lupus e rite m a to so s is té m ico (po r e jem p lo , un su je to al q u e se le ha d ia g n o s tica d o lupus o un su je to que tie n e un m ie m b ro de su fa m ilia con lupus o u n a p re d isp o s ic ió n g e n é tic a al m ism o).
Las e sca la s ú tile s pa ra e v a lu a r la ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is tém ico y los s ín tom a s de la ne fritis p o r lupus e r ite m a to s o s is tém ico inc luyen , po r e jem p lo , la c la s ifica c ió n de la O rg a n iza c ió n M un d ia l de la S a lud (O M S ) b a sa d a en la b io p s ia (W een ing e t al., J. A m . S oc. N eph ro l. 15 (2): 241 -50 (2004)), a s í com o o tra s h e rra m ie n ta s de e v a lu a c ió n c o n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pu e d e o b te n e r de m od e los a n im a le s de ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is tém ico , vé a n se , p o r e jem p lo , los d e sc rito s en la p a ten te de EE. UU. N° 7.26.5261 , P eng, M e tho ds M ol M ed.
102 :227 -72 (2004), y re fe re n c ia s c ita d a s en su in te rio r.
L es ió n p or q u e m a d u ra v c ic a tr iza c ió n
U na les ión po r q u e m a d u ra es un t ip o de les ión que se pued e c a u s a r p o r ca lo r, e le c tr ic id a d , p ro d u c to s q u ím icos , luz, rad ia c ión o fr icc ió n . S e pu ed en d a ñ a r m úscu lo , hueso , v a so sa n g u ín e o , te jid o d é rm ico y e p id é rm ico con d o lo r p o s te r io r d e b id o a u n a p ro fu n d a les ión a los ne rv ios . D e pe nd ien do de la lo ca lizac ión a fe c ta d a y e l g ra d o de g ra ve d a d , u n a v íc tim a de u n a q u e m a d u ra pued e e x p e rim e n ta r un am p lio n ú m ero de c o m p lic a c io n e s p o s ib le m e n te m orta les q u e in c luyen cho qu e , in fecc ión , d e se q u ilib rio de e le c tro lito s y d isne a . En las le s ion es p o r q u e m a d u ra , el d a ñ o a la e p id e rm is y los e le m e n to s d é rm ico s es e l resu ltad o de va r io s a ta que s c la ve q u e se pu ed en d iv id ir en a ta q u e s in ic ia le s (p o r e jem p lo , les ión p o r ca lo r, le s ión in fla m a to ria p o r m ed ia do re s , les ión in d u c id a p o r isq ue m ia ) y d ife rid os . El e xce so de c a lo r ca u s a la ráp id a d e sn a tu ra liza c ió n de las p ro te ín a s y d a ñ o cé lu la . G ran pa rte de l da ño al te jido , p o r e je m p lo , en la q u e m a d u ra de su b su p e rfic ie pe rfu n d id a , se pued e c a u s a r po r m ed ia d o re s tó x ico s de la in flam a c ión (po r e je m p lo , o x id a n te s y /o p ro te a sa s ) q u e se ac tiva n con la qu em a du ra . El c o n su m o de o x íg e n o de la he rid a p o r los n e u tró filo s pued e co n d u c ir a h ipo x ia de te jido . O cu rre tro m b o s is v a s c u la r sup e rfic ia l in s ta n tá n e a ju n to con m ue rte c e lu la r de l a ta que p o r c a lo r y ca u sa isq u e m ia y a d e m á s d a ñ o de te jido . La les ión d ife r id a d e sp u é s de l d a ñ o in ic ia l p o r c a lo r y po r m e d ia d o re s inc luye , p o r e je m p lo , in flam a c ión c a u s a d a p o r te jid o ne u ró tico , b a c te ria s sob re la sup e rfic ie , ag en te s tó p ic o s c a ú s tico s y e xu d a d o su p e rfic ia l; y d a ñ o co n tin u a d o a cé lu la s v ia b le s y nuevo c re c im ie n to de te jid o p o r exce so de ac tiv ida d p ro te o lít ica de la he rid a y la libe rac ión de ox ida n tes .
Los tra ta m ie n to s de la les ión p o r q u e m a d u ra inc luyen , p o r e jem p lo , líqu idos in tra ven osos , ap ós ito s , ab o rd a je de l d o lo r (po r e je m p lo , a n a lg é s ico s (po r e je m p lo , ib up ro feno y a ce ta m in o fe n o ), na rcó tico s y a n e s té s ico s loca les), in h ib id o re s de los m e d ia d o re s in flam a to rios , y an tib ió ticos .
La d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a m é tod os de tra ta m ie n to (po r e jem p lo , es ta b iliza c ió n , red ucc ión o e lim in a c ió n de uno o m ás s ín to m a s o e s ta b iliza c ió n de la pu n tu a c ió n de l su je to en una e s c a la de q u e m a d u ra ) de u n a les ión po r q u e m a d u ra y /o p ro m oc ió n de la c ica tr iza c ió n a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d te ra p é u tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to que t ie n e o q u e se so sp e ch a q u e t ie n e u n a les ión p o r qu em a d u ra . S e p ro p o rc io n a n a d e m á s m é tod os de tra ta m ie n to de u n a les ión po r q u e m a d u ra a d m in is tra n d o u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a can tida d te ra p é u tic a m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ) en co m b in a c ió n con u n a s e g u n d a te rap ia , p o r e je m p lo , líqu ido in tra ven oso , un após ito , ab o rd a je de l d o lo r (po r e jem p lo , un a n a lg é s ico (po r e jem p lo , ib up ro feno y a ce ta m in o fe n o ), un na rcó tico y un a n e s té s ico loca l), un in h ib id o r de los m ed ia d o re s in flam a to rios y un an tib ió tico . La d ivu lg a c ió n ta m b ié n p ro p o rc io n a m é tod os de p re ven c ión de las le s ion es p o r q u e m a d u ra o un s ín to m a de las m ism a s a d m in is tra n d o un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica (po r e je m p lo , u n a ca n tid a d p ro filá c tica m e n te e fica z de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ) a un su je to en riesgo de d e sa rro lla r le s ion es p o r q u e m a d u ra (p o r e jem p lo , un su je to cu ya ocu p a c ió n c re a un riesgo de u n a les ión p o r q u e m a d u ra , p o r e jem p lo , bo m b e ro o coc ine ro ).
Las e sca la s ú tiles pa ra e v a lu a r las q u e m a d u ra s y los s ín to m a s de las q u e m a d u ra s inc luyen , p o r e jem p lo , e sca la s de q u e m a d u ra s p o r g ra do s , p o r e s p e s o r y p o r á re a su p e rfic ia l de l cue rpo to ta l (T B S A ) (M ee k e t al. J B u rn C a re R ehab il.
12 (6 ):564 -8 (1991 )), a s í co m o o tra s h e rra m ie n ta s de e va lu a c ió n co n o c id a s en la técn ica .
La o rie n ta c ió n pa ra la d e te rm in a c ió n de la d o s ifica c ió n q u e s u m in is tra u n a ca n tid a d te ra p é u tic a m e n te e fica z de una p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pu ede o b te n e r de m od e los an im a le s de qu em a d u ra , ta le s co m o un m od e lo de q u e m a d u ra p o rc in a (S in g e r y M cC la in , M e tho ds M ol M ed. 78 :107 -19 (2003), u n a m od e lo de o ve ja de les ión té rm ic a (Jonkam e t a l., S hock, 28 :704 -709 (2007)), un m od e lo de c o n e jo de les ión té rm ic a (N w aria ku e t al., B u rns, 22 :324 -327 (1996 )) y un m od e lo de ra tón de he rid a p o r q u e m a d u ra (S teve nson e t a l., M e tho ds M ol M ed.
78 :95 -105 (2003)).
T e ra p ia s d e co m b in a c ió n
S e pued e a d m in is tra r un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica d e sc rita en e l p re se n te do cu m e n to , p o r e jem p lo , un an ticu e rp o co n tra a n tica lic re ín a p lasm á tica , p o r e je m p lo , un Fab o IgG a n ti-ca lic re ín a p la sm á tica , en co m b in a c ió n con una o m ás de las o tras te ra p ia s pa ra tra ta r un a e n fe rm e d a d o a fe cc ión a so c ia d a a u n a ac tiv id a d de ca lic re ín a p lasm á tica , p o r e jem p lo , un a e n fe rm e d a d o a fe cc ión d e s c rita en el p re se n te do cu m e n to . P o r e jem p lo , u n a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica se pued e u sa r te ra p é u tic a o p ro filá c tica m e n te con c iru g ía , o tro Fab o IgG a n ti­ c a lic re ín a p la sm á tica (po r e jem p lo , o tro Fab o IgG d e sc rita en e l p re se n te d o cu m e n to ), o tro in h ib id o r de ca lic re ín a p la sm á tica , un in h ib id o r de pép tido , o in h ib id o r de m o lé cu la pe qu eñ a . E jem p los de in h ib id o re s de ca lic re ín a p la sm á tica qu e se pu ed en u s a r en la te ra p ia de co m b in a c ió n con u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica d e s c rita en e l p re se n te d o cu m e n to in c luyen los in h ib id o res de c a lic re ín a p la sm á tica d e sc rito s en, po r e je m p lo , los d o cu m e n to s W O 95 /21601 o W O 2003 /103475.
S e p u ed en u sa r uno o m ás in h ib id o re s de ca lic re ín a p la sm á tica en co m b in a c ió n con u n a o m ás p ro te ín a s de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica d e sc rita s en el p re se n te do cu m e n to . P o r e je m p lo , la c o m b in a c ió n pu e d e d a r co m o resu ltado un a d o s is m ás ba ja de l in h ib id o r q u e se neces ita , de fo rm a que se reduzcan los e fe c to s secu nd a rio s .
S e pu ed e a d m in is tra r un a p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica d e sc rita en e l p re se n te d o cu m e n to en co m b in a c ió n con u n a o m ás te ra p ia s a c tu a le s pa ra tra ta r una e n fe rm e d a d o a fe cc ión a so c ia d a a ca lic re ín a p la sm á tica , q u e in c luyen , pe ro no se lim itan a, las ac tu a le s te ra p ia s pa ra tra ta r e l tras to rn o , p o r e je m p lo , una te ra p ia ac tu a l p a ra a rtritis reu m a to ide , go ta , e n fe rm e d a d in tes tina l, m uco s itis ora l, d o lo r ne u ro pá tico , d o lo r in flam a to rio , e n fe rm e d a d esp in a l d e g e n e ra tiv a con e s te n o s is de l c o n d u c to ve rteb ra l, tro m b o s is a rte ria l o ve n o sa , íleo po so p e ra to rio , a n e u rism a aó rtica , os te o a rtr it is , vascu lit is , tra u m a tism o c ra n e o e n ce fá lico o e d e m a ce re b ra l pe ritu m o ra l, sep ticem ia , e ve n to isq ué m ico agud o de la a rte ria ce re b ra l m ed ia (A C M ) (acc ide n te ce re b ro va scu la r), re e s te n o s is (po r e jem p lo , d e s p u é s de an g io p la s tia ), ne fritis p o r lupus e rite m a to so s is tém ico , les ión po r qu em a d u ra , o c ica tr iza c ió n . P o r e je m p lo , la in h ib ic ión de pC a l es un n o ved oso m e ca n ism o p a ra tra ta r la e n fe rm e d a d y, p o r tan to , p o d ría p ro p o rc io n a r e fe c to s que son s in é rg ico s o a d itivo s con o tros a g e n te s te ra p é u tico s . P o r e je m p lo , u n a p ro te ína d e s c rita en el p re se n te d o cu m e n to q u e inh ibe la ca lic re ín a p la sm á tica o q u e inh ibe un e ve n to ag ua s ab a jo de la ac tiv ida d de c a lic re ín a p la sm á tica ta m b ié n se pu ed e u sa r en c o m b in a c ió n con o tro tra ta m ie n to pa ra u n a en fe rm e d a d a so c ia d a a c a lic re ín a p lasm á tica , ta l co m o c iru g ía o ad m in is tra c ió n de un se g u n d o agen te , p o r e jem p lo , co m o se d e sc rib e en el p re se n te do cu m e n to . P o r e jem p lo , el se g u n d o a g en te pu ede in c lu ir eca lla n tid e , un in h ib id o r de C1 e s te ra sa (po r e je m p lo , C IN R Y Z E ™ ), a p ro tin in a (T R A S Y LO L ® ), un in h ib id o r de l re ce p to r de b ra d iq u in in a B2 (po r e je m p lo , ica tib a n t (FiRAZYR®)).
El té rm in o "co m b in a c ió n " se re fie re al uso de los dos o m ás a g e n te s o te ra p ia s pa ra tra ta r al m ism o pa c ie n te , en el qu e e l uso o la acc ión de los ag en te s o te ra p ia s se so lap an en e l t iem p o . Los ag en te s o te ra p ia s se pueden a d m in is tra r al m ism o tie m p o (po r e jem p lo , co m o una ú n ica fo rm u la c ió n q u e se a d m in is tra a un pa c ie n te o co m o dos fo rm u la c io n e s se p a ra d a s a d m in is tra d a s s im u ltá n e a m e n te ) o s e cu e n c ia lm e n te en c u a lq u ie r o rden . Las a d m in is tra c io n e s se cu e n c ia le s son ad m in is tra c io n e s q u e se a d m in is tra n en tie m p o s d ife ren te s . El t ie m p o en tre la a d m in is tra c ió n de un a g en te y o tro a g en te pued e s e r m inu tos , ho ras, d ía s o sem a na s . El uso de u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica d e s c rita en el p re se n te d o cu m e n to ta m b ié n se pu e d e u sa r pa ra re d u c ir la d o s ifica c ió n de o tra te rap ia , p o r e jem p lo , p a ra re d u c ir los e fe c to s s e cu n d a rio s a so c ia d o s a o tro a g en te q u e se a d m in is tra . P or c o n s ig u ie n te , una co m b in a c ió n pued e in c lu ir a d m in is tra r un s e g u n d o a g en te a una d o s ifica c ió n al m en os 10, 20, 30 o 50 % m ás ba ja que la q u e se usa ría en a u se n c ia de la p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p lasm á tica .
El se g u n d o a g en te o te ra p ia ta m b ié n pu e d e s e r o tro ag en te pa ra u n a te ra p ia a so c ia d a a c a lic re ín a p lasm á tica . E jem p los no lim itan te s de o tro tra ta m ie n to pa ra un a e n fe rm e d a d o a fe cc ión a so c ia d a a c a lic re ín a p la sm á tica in c luyen , p o r e jem p lo , eca lla n tid e , un in h ib id o r de C1 e s te ra sa (po r e je m p lo , C IN R Y Z E ™ ), a p ro tin in a (T R A S Y LO L ® ), un in h ib id o r de l re ce p to r de b ra d iq u in in a B2 (po r e jem p lo , ica tiba n t (F IR A Z Y R ® )) o u n a s e g u n d a p ro te ín a de un ión d e s c rita en el p re se n te do cu m e n to .
U n a te ra p ia de co m b in a c ió n pued e in c lu ir a d m in is tra r un a g en te q u e red uce los e fe c to s se cu n d a rio s de o tras te ra p ia s . El a g en te pu e d e se r un a g en te q u e red uce los e fe c to s se cu n d a rio s de un tra ta m ie n to de en fe rm e d a d a so c ia d a a ca lic re ín a p lasm á tica . P or e je m p lo , pa ra e n fe rm e d a d e s in flam a to rias , un in h ib id o r de pC a l po d ría se r el ah o rro de e s te ro id e s . P o r tan to , p o d ría h a b e r s in e rg ia con un in h ib id o r de T N F -a lfa pa ra tra ta r in flam a c ión o un b lo q u e a n te de V E G F pa ra tra ta r c á n c e r y /o a n g iogé ne s is .
U s o s d e d ia g n ó s tic o
U na p ro te ín a que se une a c a lic re ín a p la sm á tica d e s c rita en e l p re se n te d o cu m e n to pu ed e te n e r u tilid a d e s de d ia g n ó s tico in v itro e in vivo. S e pu e d e u sa r u n a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica d e s c rita en el p re sen te d o cu m e n to (po r e je m p lo , u n a p ro te ín a que se une o se une e inh ibe c a lic re ín a p lasm á tica ), po r e jem p lo , pa ra la o b te n c ió n de im á ge nes in vivo, p o r e je m p lo , d u ra n te el tra n scu rso de un tra ta m ie n to p a ra un a e n fe rm e d a d o a fe cc ión en la q u e la c a lic re ín a p la sm á tica es activa , p o r e jem p lo , u n a e n fe rm e d a d o a fe cc ión d e sc rita en el p re sen te do cu m e n to , o en el d ia g n ó s tico de una e n fe rm e d a d o a fe cc ión d e s c rita en el p re se n te do cu m e n to .
En un asp ec to , la d ivu lg a c ió n p ro p o rc io n a un m é tod o de d ia g n ó s tico p a ra la d e te cc ió n de la p re se n c ia de ca lic re ín a p la sm á tica , in v itro o in v ivo (po r e jem p lo , o b tenc ión de im á g e n e s in v ivo en un su je to ). El m é tod o pu e d e in c lu ir lo c a liz a r c a lic re ín a p la sm á tica d e n tro de un su je to o d e n tro de una m u e s tra de un su je to . Con resp ec to a la e va lu a c ió n de m uestras , e l m é tod o pu ed e inc lu ir, p o r e je m p lo : (i) p o n e r en co n ta c to u n a m ue s tra con p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica ; y (ii) d e te c ta r la lo ca liza c ió n de la p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica en la m uestra .
T a m b ié n se pu ede u s a r un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica pa ra d e te rm in a r e l n ive l cu a lita tivo o cu a n tita tivo de e xp re s ió n de c a lic re ín a p la sm á tica en u n a m uestra . El m é tod o ta m b ié n pued e in c lu ir p o n e r en co n ta c to una m u e s tra de re fe re n c ia (po r e je m p lo , una m u e s tra de con tro l, p o r e jem p lo , un con tro l ne ga tivo ) con la p ro te ín a de un ión , y d e te rm in a r u n a e va lu a c ió n c o rre s p o n d ie n te de la m u e s tra de re fe re nc ia . U na d ife re n c ia (po r e jem p lo , a u m en to ), p o r e je m p lo , u n a d ife re n c ia e s ta d ís tic a m e n te s ig n ifica tiva , en la fo rm a c ió n de l c o m p le jo en la m u e s tra o su je to con respec to a la m u e s tra de con tro l o su je to pued e se r in d ica tiva de la p re se n c ia de ca lic re ín a p la sm á tica en la m uestra . En o ca s io n e s , la p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica no re a cc io n a de fo rm a c ru za d a con o tra p ro te ín a de ca lic re ín a , ta l co m o c a lic re ín a de te jid o y /o con p re ca lic re ín a p lasm á tica . P or e je m p lo , la p ro te ín a de un ión se une a o tra p ro te ín a de c a lic re ín a o a p re ca lic re ín a 5 a 10 ve ce s m en os b ien (o in c luso m enos b ien ) que se une a c a lic re ín a p lasm á tica . P o r e jem p lo , la p ro te ín a de un ión pued e un irse a ca lic re ín a p la sm á tica con u n a KD de ~ 10 -50 pM , m ie n tra s q u e se une a c a lic re ín a de te jid o y /o p re ca lic re ín a a ~ 10 nM.
La p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica se pu ede m a rca r d ire c ta o in d ire c ta m e n te con u n a s u s ta n c ia de te c ta b le pa ra fa c ilita r la d e te cc ió n de l an ticu e rp o un id o o sin un ir. Las su s ta n c ia s d e te c ta b le s ad e cu a d a s in c luyen d ive rsa s en z im a s , g ru po s p ro s té ticos , m a te ria le s flu o re sce n te s , m a te ria le s lu m in isce n te s y m a te ria le s rad iac tivos .
Se puede detectar la formación de complejos entre la proteína de unión a calicreína plasmática y la calicreína plasmática evaluando la proteína de unión unida a la calicreína plasmática o la proteína de unión no unida. Se pueden usar ensayos de detección convencionales, por ejemplo, un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica de tejido. Además de marcar la proteína de unión a calicreína plasmática, la presencia de calicreína plasmática se puede ensayar en una muestra por un inmunoensayo de competición que utiliza patrones marcados con una sustancia detectable y una proteína de unión a calicreína plasmática no marcada. En un ejemplo de este ensayo, se combinan la muestra biológica, los patrones marcados y la proteína de unión a calicreína plasmática y se determina la cantidad de patrón marcado unido a la proteína de unión no marcada. La cantidad de calicreína plasmática en la muestra es inversamente proporcional a la cantidad de patrón marcado unido a la proteína de unión a calicreína plasmática.
Se pueden preparar proteínas marcadas con fluoróforos y cromóforos. Debido a que los anticuerpos y otras proteínas absorben luz que tiene longitudes de onda de hasta aproximadamente 310 nm, se deben seleccionar restos fluorescentes que tengan absorción sustancial a longitudes de onda superiores a 310 nm y preferentemente superiores a 400 nm. Se describen una variedad de agentes fluorescentes y cromóforos adecuados por Stryer, 1968, Science 162:526 y Brand, L. et al., 1972, Annu. Rev. Biochem. 41:843-868. Las proteínas se pueden marcar con grupos cromóforos fluorescentes mediante procedimientos convencionales, tales como los desvelados en las patentes de EE. UU. N° 3.940.475, 4.289.747 y 4.376.110. Un grupo de agentes fluorescentes que tiene varias de las propiedades deseables descritas anteriormente es los colorantes de xanteno, que incluyen las fluoresceínas y las rodaminas. Otro grupo de compuestos fluorescentes son las naftilaminas. Una vez marcada con un fluoróforo o cromóforo, la proteína se puede usar para detectar la presencia o localización de la calicreína plasmática en una muestra, por ejemplo, usando microscopía fluorescente (tal como microscopía confocal o con deconvolución).
A n á lis is h is to ló g ico . Se puede realizar inmunohistoquímica usando las proteínas descritas en el presente documento. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo, el anticuerpo se puede sintetizar con una marca (tal como una marca de purificación o de epítope), o se puede marcar detectablemente, por ejemplo, conjugando una marca o grupo de unión a marca. Por ejemplo, se puede unir un quelante al anticuerpo. El anticuerpo se pone entonces en contacto con su preparación histológica, por ejemplo, una sección fijada de tejido que está sobre un portaobjetos de microscopio. Después de una incubación para la unión, la preparación se lava para retirar el anticuerpo sin unir. Entonces se analiza la preparación, por ejemplo, usando microscopía, para identificar si el anticuerpo se une o no a la preparación.
Por supuesto, el anticuerpo (u otro polipéptido o péptido) puede estar sin marcar en el momento de la unión. Después de la unión y el lavado, el anticuerpo se marca con el fin de hacerlo detectable.
M a tric e s d e p ro te ín a . La proteína de unión a calicreína plasmática también se puede inmovilizar sobre una matriz de proteína. La matriz de proteína se puede usar como una herramienta de diagnóstico, por ejemplo, para cribar muestras médicas (tales como células aisladas, sangre, sueros, biopsias, y similares). Por supuesto, la matriz de proteína también puede incluir otras proteínas de unión, por ejemplo, que se une a calicreína plasmática o a otras moléculas diana.
Los métodos de producción de matrices de polipéptidos se describen, por ejemplo, en De Wildt et al., 2000, Nat. Biotechnol. 18:989-994; Lueking et al., 1999, Anal. Biochem. 270:103-111; Ge, 2000, Nucleic Acids Res. 28, e3, I-VII; MacBeath y Schreiber, 2000, Science 289:1760-1763; documentos WO 01/40803 y WO 99/51773A1. Los polipéptidos para la matriz pueden ser aplicados a alta velocidad, por ejemplo, usando aparatos robóticos comercialmente disponibles, por ejemplo, de Genetic MicroSystems o BioRobotics. El sustrato de la matriz puede ser, por ejemplo, nitrocelulosa, plástico, vidrio, por ejemplo, vidrio modificado en la superficie. La matriz también puede incluir una matriz porosa, por ejemplo, acrilamida, agarosa, u otro polímero.
Por ejemplo, la matriz puede ser una matriz de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en De Wildt, arriba. Las células que producen las proteínas se pueden cultivar sobre un filtro en un formato de matriz. Se induce la producción de polipéptidos, y los polipéptidos expresados se inmovilizan en el filtro en la localización de la célula. Se puede poner en contacto una matriz de proteínas con una diana marcada para determinar el grado de unión de la diana a cada polipéptido inmovilizado. La información sobre el grado de unido en cada dirección de la matriz se puede almacenar como un perfil, por ejemplo, en una base de datos informática. La matriz de proteína se puede producir por duplicado y usar para la comparación de perfiles de unión, por ejemplo, de una diana y una no diana.
F A C S (C ito m e tr ía d e flu jo a c tiv a d a p or f lu o re s c e n c ia ). Se puede usar la proteína de unión a calicreína plasmática para marcar células, por ejemplo, células en una muestra (por ejemplo, una muestra de paciente). La proteína de unión también se une (o se puede unir) a un compuesto fluorescente. Entonces, las células se pueden clasificar usando citometría activada por fluorescencia (por ejemplo, usando un citómetro disponible de Becton Dickinson Immunocitometry Systems, San Jose CA; véanse también las patentes de EE. UU. N° 5.627.037; 5.030.002; y 5.137.809). A medida que las células pasan a través del citómetro, un haz de láser excita el compuesto fluorescente mientras que un detector cuenta las células que pasan a través y determina si un compuesto fluorescente está unido o no a la célula detectando la fluorescencia. Se puede cuantificar y analizar la cantidad de marca unid a cada célula para caracterizar la muestra.
El c itó m e tro ta m b ié n pu ed e d e s v ia r la cé lu la y se p a ra r cé lu la s un idas p o r la p ro te ín a de un ión de las cé lu la s no un id as p o r la p ro te ín a de un ión . S e pu eden c u ltiv a r y /o ca ra c te r iz a r las cé lu la s sep a ra das .
O b te n c ió n d e im ág e n e s in v iv o . T a m b ié n se c a ra c te r iza un m é tod o de d e tecc ió n de la p re se n c ia de ca lic re ín a p la sm á tica q u e e x p re s a te jid o s in vivo. El m é tod o in c luye (i) a d m in is tra r a un su je to (po r e je m p lo , un p a c ie n te que tien e , p o r e jem p lo , un a e n fe rm e d a d o a fe cc ión a so c ia d a a ca lic re ín a p la sm á tica ) un a n ticu e rp o a n ti-ca lic re ín a p lasm á tica , c o n ju g a d o con un m a rca d o r d e te c ta b le ; (ii) e x p o n e r el su je to a un m ed io pa ra d e te c ta r d icho m a rca d o r d e te c ta b le a la ca lic re ín a p la sm á tica que e xp re sa te jid o s o cé lu la s . P or e jem p lo , se ob tie n e n im á ge nes de l su je to , p o r e jem p lo , p o r RM N u o tro s m ed io s to m o g rá fico s .
Los e je m p lo s de m arcas ú tiles pa ra la o b te n c ió n de im á ge nes de d ia g n ó s tico inc luyen ra d io m a rca s ta le s co m o 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C y 188Rh, m a rca s flu o re s c e n te s ta le s co m o flu o re s c e ín a y rod am in a , m arcas ac tivas de re so n a n c ia m a g n é tica nuc lear, isó to po s e m iso re s de p o s itro n e s d e te c ta b le s p o r un e q u ip o de to m o g ra fía de em is ión de p o s itro n e s ("P E T"), a g e n te s q u im io lu m in is c e n te s ta le s co m o luc ife rina , y m a rca d o re s e n z im á tico s ta le s co m o p e ro x id a sa o fo s fa ta sa . T a m b ié n se p u ed en e m p le a r los e m iso re s de rad ia c ión de in te rva lo co rto , ta le s com o los isó to po s d e te c ta b le s p o r son da s de d e te c to r de in te rva lo co rto . La p ro te ín a se pu e d e m a rca r con d icho s rea c tivos ; p o r e je m p lo , vé a se W e n se l and M ea res, 1983, R a d io im m u n o im a g in g and R a d io im m u n o th e ra p y , E lsev ie r, N e w Y ork , p a ra té c n ic a s re fe re n tes al ra d io m a rca d o de a n ticu e rp o s y D. C o lc h e r e t a l., 1986, M eth . E nzym o l. 121: 802 -816.
La p ro te ín a de un ión se puede m a rca r con un isó to po rad ia c tivo (ta l co m o 14C, 3H, 35S, 125I, 32P, 131I). S e pued e u sa r u n a p ro te ín a de un ión ra d io m a rca d a pa ra p ru e b a s de d ia g n ó s tico , p o r e jem p lo , un e n sa yo in vitro. La ac tiv idad e s p e c ífic a de un a p ro te ín a de un ión iso tó p ica m e n te m a rca d a d e p e n d e de la sem iv ida , la p u re za iso tó p ica de la m a rca rad iac tiva , y có m o la m a rca se in co rp o ra en el an ticue rpo .
En e l ca so de u n a p ro te ín a de un ió n rad io m a rcad a , la p ro te ín a de un ión se a d m in is tra al pa c ie n te , se lo ca liza en las cé lu la s qu e llevan e l a n tíg e n o con e l q u e rea cc io na la p ro te ín a de un ión , y se de te c ta o "se ob tie n e n im á g e n e s" in v ivo u sa nd o té cn ica s c o n o c id a s ta le s co m o e sca n e o ra d io n u c le a r usando , p o r e jem p lo , u n a g a m m a c á m a ra o to m o g ra fía de em is ión . V éase , p o r e je m p lo , A .R . B radw e ll e t al., "D e ve lo p m e n ts in A n tib o d y Im ag ing ", M onoc lona l A n tib o d ie s fo r C a n ce r D e tection and T he ra py , R .W . B a ldw in e t a l., (eds.), pp 65 85 (A ca d e m ic P ress 1985). A lte rn a tiva m e n te , se pu e d e u s a r un e s c á n e r de to m o g ra fía tra n sa x ia l de em is ió n de po s itron es , ta l co m o el d e s ig n a d o Pet VI lo ca lizad o en e l La b o ra to rio N a c ion a l de B roo kha ven , do n d e la ra d io m a rca e m ite p o s itro n e s (po r e je m p lo , 11C, 18F, 15O y 13N).
A g e n te s d e c o n tra s te d e IR M . La im agen p o r re so n a n c ia m a g n é tica (IR M ) u sa RM N pa ra v is u a liz a r ca ra c te rís tica s in te rna s de l su je to v ivo , y es ú til pa ra e l p ro nó s tico , d ia g n ó s tico , tra ta m ie n to y c iru g ía . S e pued e u s a r IRM sin co m p u e s to s tra za d o re s rad ia c tivos p o r el ob v io be ne fic io . A lg u n a s té cn ica s de IRM se resu m en en el d o cu m e n to E P A -0 502 814. G e n e ra lm e n te , se usan las d ife re n c ia s re lac io na da s con las c o n s ta n te s de l t ie m p o de re la jac ión T1 y T 2 de los p ro to n e s de ag ua en d ife re n te s e n to rn o s pa ra g e n e ra r un a im agen. S in em b a rg o , es ta s d ife re n c ia s pu ed en se r in su fic ie n tes p a ra p ro p o rc io n a r im á ge nes n ítid as de a lta reso luc ión .
Las d ife re n c ia s en es ta s co n s ta n te s de l t ie m p o de re la jac ión se p u ed en p o te n c ia r p o r a g e n te s de con tra s te . Los e je m p lo s de d ich o s a g e n te s de co n tra s te in c luye n va rio s a g e n te s m ag né ticos , a g e n te s p a ra m a g n é tico s (que p r in c ip a lm e n te a lte ran T1 ) y fe rro m a g n é tico s o su p e rp a ra m a g n é tico s (que p r in c ip a lm e n te a lte ran la re sp u e s ta T2). S e pu ed en u s a r q u e la to s (po r e je m p lo , q u e la to s de E D TA , D T P A y N TA ) pa ra u n ir (y re d u c ir la to x ic id a d ) de a lgu nas su s ta n c ia s p a ra m a g n é tica s (po r e jem p lo , Fe+3, Mn+2, Gd+3). O tro s a g e n te s pu ed en e s ta r en fo rm a de p a rtícu las , po r e je m p lo , m enos de 10 m m a a p ro x im a d a m e n te 10 nM de d iá m e tro ). Las p a rtícu la s pu eden te n e r p ro p ie d a d e s fe rro m a g n é tica s , a n tife rro m a g n é tica s o s u p e rp a ra m a g n é tica s . Las pa rtícu las p u ed en inc lu ir, p o r e je m p lo , m ag n e tita (Fe3OC4), Y-Fe2O3, fe rr ita s , y o tro s co m p u e s to s m in e ra les m a g n é tico s de e le m e n to s de tra n s ic ió n . Las pa rtícu las m a g n é tica s pu ed en inc lu ir: uno o m ás c ris ta le s m a g n é tico s con y s in m a te ria l no m ag né tico . El m a te ria l no m a g né tico pued e in c lu ir p o lím e ro s s in té tico s o n a tu ra les (ta les co m o S ep ha rose , d e x tra no , de x trina , a lm idó n y s im ila res .
La p ro te ín a de un ión a ca lic re ín a p la sm á tica ta m b ié n se pued e m a rca r con un g ru p o in d ica d o r que co n tie n e el á to m o de 19F a c tivo pa ra RM N, o una p lu ra lid ad de d ich o s á to m o s en la m ed id a en q u e (i) su s ta n c ia lm e n te to d o s los á to m o s de f lú o r na tu ra lm e n te a b u n d a n te s sean e l isó to po de 19F y, así, su s ta n c ia lm e n te to d o s los co m p u e s to s que co n tie n e n f lú o r sean ac tivo s p a ra RM N ; (ii) m uchos co m p u e s to s p o lif lu o ra d o s q u ím ica m e n te ac tivo s ta le s com o a n h íd rid o tr if lu o ro a c é tic o están c o m e rc ia lm e n te d isp o n ib le s a c o s te re la tiva m e n te ba jo ; y (iii) se han e n co n tra d o m é d ica m e n te ace p ta b le s m uchos co m p u e s to s flu o ra d o s pa ra su uso en se re s hu m an os ta le s co m o los p o lié te res p e rflu o ra d o s u tiliza d o s pa ra lle va r o x íg e n o co m o su s titu c io n e s de h e m og lob in a . D espués de d e ja r d icho t ie m p o pa ra la in cub ac ió n , se lle va a cab o u n a IRM de c u e rp o e n te ro u sa nd o un apa ra to ta l co m o uno de los d e sc rito s p o r Pykett, 1982, Sci. A m . 246 :78 88 pa ra lo ca liza r y o b te n e r im á ge nes de te jid o s qu e exp re sa n ca lic re ín a p lasm á tica .
Los siguientes ejemplos proporcionan ilustración adicional y no son limitantes.
E jem p lo s
EJEMPLO 1:
Los presentes inventores han descubierto varios inhibidores de anticuerpo y agentes de unión de calicreína plasmática (pCal). Los más potentes de éstos se han caracterizado adicionalmente y se muestra que tienen constantes de inhibición aparente (Ki,ap) < 10 nM, son inhibidores de pCal específicos con respecto otras serina proteasas probadas y no se unen a precalicreína. Las secuencias de aminoácidos de las CDR para los inhibidores y los agentes de unión se muestran en las T a b la s 1 y 2 , respectivamente.
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
A b re v ia tu ra s usa da s : "T /B " es la señ a l de E L IS A o b te n id a usa nd o la "d ia n a " (ca lic re ín a p la sm á tica b io tin ila da ) d iv id id a en tre la señ a l de E L IS A de l " fon do " (e s tre p ta v id in a ); am b as de las cu a le s se recu b rie ron sob re p laca s de m ic ro titu la c ió n . "nd" es no d e te rm in a d o . El s ím b o lo "q " se re fie re al cod ón de te rm in a c ió n s u p re s ib le á m b a r (TA G ), q u e se tra d u ce co m o g lu ta m in a (Q ) en ce p a s de E. c o li ta le s c o m o las c é lu la s TG1 qu e se usa ron p a ra e xp re sa r los fra g m e n to s Fab.
S e m ue s tra n a co n tin u a c ió n las se cu e n c ia s de a m in o á c id o s de l d o m in io v a r ia b le de la c a d e n a lig e ra (LC ) y ca d e n a p e sa d a (H C ) de in h ib id o re s de a n ticu e rp o s pC a l
M 6-D 09 LC
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EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYYMVWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGITVY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDK WAVMPPYYYY AMDVWGQGTT 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 7-B 04 LC
QSALTQPASV SG S P G Q S IT I SCTGTNSDVG NYNLVSWYQQ HPGEAPKLLI YEVNKRPSGV 60
SNRFSGSKSG NTASLTISGL QAEDEADYLC CSYAGNRNFY VFGAGTKVTV L 111
M 7-B 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYSMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTNY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHT AARPFYYYYM DVWGKGTTVT 120
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140
M 7 -E 07 LC
QSELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SK RPSG IPER 60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTGVFGGG TKLTVL 106
M 7 -E 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 8-A 09 LC
QCELTQPPSE SVSPGQTANI TCSGDKLGNK YAYWYQQKPG QSPVLVIYQD NNRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAI DEANYYCQAW DSRTWFGGG TKLTVL 10 6
M 8-A 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYFMLWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTVY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAA SPVRNYYYYG MDVWGQGTTV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 10 - F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI SVYLNWYQHK PGKAPKLLIY GASNLQFGVP 60
SRFSGSGYGT D FTLTISSLQ PEDFATYHCQ QTFSLFTFGG GTKVEIK 107
M 10 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYNMNWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGETNY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG GAYRNNWWGG FDIWGLGTMV 120
TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 10 -H 05 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSSYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGSGSG TDFTLTISRL EPEDFAVYYC QQYGSSPFTF GPGTKVDIK 109
M 10 -H 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWVRQA PGKGLEWVSS IRPSGGGTVY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGGF IAARWYYFDY WGQGTLVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 12-D 05 LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG Q SPILVIYQD TKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL 106
M 12-D 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 27 -E 05 LC
QSELTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YACWYQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTGVFGGG TKLTVL 106
M 27 -E 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGFTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARTE GPLSWGYGMD VWGQGTTVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 28 -B 11 LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDQLGDK YVGWYQQKPG Q SPILVIYQD TKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTHTV DEAHYYCQAW DTSTAGFGGG TKLTVL 106
M 28 -B 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSR IYPSGGWTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAREG LLWFGENAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 29 -D 09 LC
QSALTQPPTV SVSPGQTARI TCSGNKLGDK YVAWYQQKPG QSPMLVIYQD TKRPSRVSER 60 FSGSNSANTA TLSISGTQAL DEADYYCQAW DSSIV IFGGG TRLTVL 106
M 29 -D 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMVWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGATFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMGS YDYIWGFYSD HWGQGTLVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 29 -E 09 LC
QYELTQPPSV SVSPGQTATI TCSGDNLGNK YNSWYQQKPG QSPLLVIYQD TKRPSAIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DGNWFGGGT KLTVL 105
M 29 -E 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYEMGWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGGTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARNP QYSGYDRSLS DGAFDIWGQG 120 TMVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKS 144
M 35-G 04 LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP 60 ARFSGSGSGT D FTLTISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK 110
M 35-G 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120 GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 145 M 38 - F 02 LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGEKLGDK YVSWYQQKPG QSPSLVICED SR R PSG IPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGAQPM DEADYYCQAW DSSTAIFGPG TKVTVL 106
M 38 - F 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYMMVWVRQA PGKGLEWVSY IYSSGGHTVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL FLYDFWSKGA FDIWGQGTMV 120 TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 41-A 11 LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IK R P S G IP E R 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL 107
M 41-A 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120 GTMVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 145
M 73 -D 06 LC
QSELTQPPSA SETPGQRVTI SCSGSSSNIG SNTVSWFQQL PGSAPRLLIY NDHRRPSGVP 60 DRFSGSKSGT SASLVISGLQ SQDEADYYCS AWDDSLNGVV FGGGTKLTVL 110
M 73 -D 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYEMYWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGPTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAKGT PKWELLLRSI YIENAFDIWG 120 QGTMVTVSSA STKGPSVFPL APSSKS 146
M 76-D 01 LC
QDIVMTQTPP SLPVNPGEPA S ISC R SSQ SL SDDGNTYLDW YLQRPGQSPQ LL1HTLSYRA 60 SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQGTHWP PTFGQGTKVE IK 112
M 76-D 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYAMHWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGRTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATDS SGSPNPLFDY WGQGTLVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSPKS 138
M 110 -C 12 LC
QDIQMTQSPL SLSVTPGEPA S IS C R S S L S L LHSNGYNYLD WYVQRPGQSP QLLMYLSSTR 60 ASGVPDRFSG SGSGTDFTLE ISRVEAEDVG VYYCMQPLET PPTFGGGTKV E IK 113
M 110 -C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYEMDWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARER RSSSRARYYY GMDVWGQGTT 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 137 - E 12 LC
QSVLIQPPSV SGIPGQRVTI SCSGNNSNFG SNTVTWYQQL PGTAPKLLIY SDSRRPSGVP 60 DRFSGSRSDT SASLAISGLQ SEDEAEYHCA AWDDSLNGVF GGGTKLTVL 109
M 137 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYRMQWVRQA PGKGLEWVSV IVPSGGNTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG PGSSIAARRA PTGYYGMDVW 120 GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKS 147
M 142 -H 08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T IT C R A SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 M 142 -H 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
M 145 -D 01 LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQSV SSYLAWYQQK PGQAPRLLIY DASNRATGIP 60 ARFSGSGSGT D FTL T ISSLE PEDFAVYYCQ QRSNWPRGFT FGPGTKVDIK 110
M 145 -D 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMSWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGSTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG SSDYAWGSYR RPYYFDYWGQ 120 GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 145
M 145 -D 11 LC
QSVLTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWYQQRPG QSPVLVIYQD IK R P S G IP E R 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSPNARVFGS GTKVTVL 107
M 145 -D 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYRMSWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDK FEWRLLFRGI GNDAFDIWGQ 120 GTMVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKS 145
M 146 - E 12 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASGDI GNALGWYQQK PGKAPRLLIS DASTLQSGVP 60 LRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PEDFATYYCL QGYNYPRTFG QGTKLEIR 108
M 146 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYIMHWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGLTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREF ENAYHYYYYG MDVWGQGTTV 120 TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 152 -A 12 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSYLSWYQQR PGKAPNLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ Q S IS IP R T F G QGTKVEVK 108
M 152 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYFMGWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGSTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREG PPYSSGWYRG LRQYHFDYWG 120 QGTLVTVSSA STKGPSVFPL APSSKS 146
M 160 -G 12 LC
QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIY AASTLQSGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PEDFATYYCQ QLNSYPLTFG GGTKVEIK 108
M 160 -G 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 161 -C 11 LC
QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YVSWYQQRPG QSPVLVIYQD TKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAV DEADYYCQAW DSSTYVFGGG TKVTVL 1 06
M 161 -C 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYAMKWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGVTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE DYSSSWYSRR FDYYYGMDVW 120 GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP LAPSSKS 147
M 162 -A 04 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 162 -A 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
X 67 - B 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - B 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWSRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - C 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWMRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - C 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - C 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWGRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -D 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -D 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWNRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - E 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - E 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWDRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 67 - F 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWQRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWTRELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -G 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -G 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWARELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -H 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60
SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWERELKS NYFDYWGQGT 120
LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
N ota : X 81-B 01 es una IgG re tro m u ta d a s a la lín e a g e rm in a l d e r iv a d a de X 63 -G 06 qu e se m u e s tra en la T a b la 7.
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A b re v ia tu ra s usa da s : "T /B " es la señ a l de E L IS A o b te n id a usa nd o la "d ia n a " (ca lic re ín a p la sm á tica b io tin ila da ) d iv id id a en tre la señ a l de E L IS A de l " fon do " (e s tre p ta v id in a ); am b as de las cu a le s se recu b rie ron sob re p laca s de m ic ro titu la c ió n . "nd" es no d e te rm in a d o . El s ím b o lo "q " se re fie re al cod ón de te rm in a c ió n s u p re s ib le á m b a r (TA G ), q u e se tra d u ce co m o g lu ta m in a (Q ) en ce p a s de E. c o li ta le s c o m o las c é lu la s TG1 qu e se usa ron p a ra e xp re sa r los fra g m e n to s Fab.
S e m u es tra n a c o n tin u a c ió n las s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s de l d o m in io v a ria b le d e la ca d e n a lig era (L C ) y c a d e n a p esa d a (H C ) d e a g e n te s d e u n ió n d e a n tic u e rp o s pC al.
M 6 -A 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDSV T ISC R A SQ SI SMYLNWYQHK PGKAPKLLIY GTSSLQSGVP 60
SRFSGSGPGG TD FT L TISSL QPEDFATYYC QQSYSAPWTF GQGTKVEIK 109
M6-A06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYQMTWVRQA PGKGLEWVSG IWPSGGFTDY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVS TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKS 136
M 6-A08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQRI SFYLNWFQQK PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PKDFGTYYCQ QTFSTPNTFG QGTKLEIK 108
M 6-A08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMQWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD YGGKGGAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 6-D03 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTLWTFG QGTKVEIK 108
M 6-D03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYFMGWVRQA PGKGLEWVSV IGSSGGWTSY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVS TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKS 136
M 6-D08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYqQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDSATYYCQ QSYTRWTFGQ GTKVEIK 107
M 6-D08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RY HMVWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGWTNY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAREM ATIAGQFDPW GQGTLVTVSS 120
ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 6-G05 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI STYLNWYQLK PGKAPKLLIY NAFSMERGVP 60
STISGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYTTPTTFG QGTKVEIK 108
M 6-G05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYRMVWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTAY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA VGIGDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 8-C 04 LC
QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGDK YTSWHQQKPG QSPVLVIYQD SKRPSGIPER 60
FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAW DSSTVFGGGT RLTVL 105
M 8-C 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYPMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGLTSY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARLF YGSGSVGFEY WGQGTLVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 8-D05 LC
QDIQMTQSPS FVSASVGDRV TITCRASQDI SSWLVWYQQK PGKGPKLLIY DASNLQSGVP 60 SRFSGGGSGT H FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QADGFPLTFG GGTKVEMK 108
M 8-D05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYNMNWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGFTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL DLGILDYWGQ GTLVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 8 -E 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTLMYTF GQGTKLEIK 109
M 8 -E 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYFMTWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGMTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDS YSSSWFDIWG QGTMVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 8-G 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDTV TITCRASQGV SYYLAWFQQK PGKAPKSLIY GASSLQSGVP 60 SKFSGSGSGT V FTL T ISSLQ PDDFATYYCQ QYNTYPPTFG QGTRLDIK 108
M 8-G 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYEMLWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGYTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARSF SGFGEIDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M8-H04 LC
QDIQMTQSPS SLSASIGDRV TITCRASQYI STYLNWYEQK PGKAPKLLIY GTSSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT E F S L T IS S L Q PEDFATYYCQ QSFTTPFTFG QGTKLEIK 108
M8-H04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYWMGWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGWTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARDD EIAAGGAFDI WGQGAMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 9-A03 LC
QDIQMTQSPS SLSASLGDRV TITCRASQNI DIYLNWYQQT PGKAPKLLIY GAYNLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFGTYYCQ QSYGTPVFGQ GTKLEIK 107
M 9-A03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYFMMWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGYTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREV AGTYAFDIWG QGTMVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 9-A08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TVTCRASQRI STYLNWYQQK PGKAPKLLIS GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PDDFATYYCQ QSYNTPRTFG QGTKVEIR 108
M 9-A08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYEMWWVRQA PGKGLEWVSY IGSSGGSTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTGGN SSSFDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M9-C08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSISIYVNWYQQK PGKAPNLLIF AASSLQRGVP 60 SRFSGSGSGA DFTLTISSLQ PEDFATYYCQQSFSTPLTFG GGTKVEIK 108
M 9-C 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYGMVWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGLTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVD YTGDGLGYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 9-C 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLNWYQQK PGNAPNLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ ESYSTLFTFG PGTTVEIK 108
M 9-C 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYPMQWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGMTFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTREV GAAGFAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 9-D 08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TLTCRASRTI SFYLNWYQQK AGKAPELLIY GGSSLHSGVP 60 SRFSGSGSGT DFSLTISNLQ PEDIAVYYCQ QSFSSPWTFG QGTKVEIK 108
M 9-D 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYKMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTNY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRGS PWGDDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 9 -E 04 LC
QDIQMIQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SGYLNWYQQR SGKAPKLLIF AASNLQTGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTINNLQ PEDFATYYCQ QSHTPPKTFG PGTKVDIK 108
M 9 -E 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYDMMWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGMTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDQ VAAAAIDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 9 -F 08 LC
QDIQMTqSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPYTF GQGTKLEIK 109
M 9 -F 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYAMTWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGFTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARAS GSYLDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 9 -F 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SKFSGSGSGT DYTLTISSLQ PEDFATYYCQ QTYTTPWTFG QGTKVEIK 108
M 9 -F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYPMGWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGMTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD WNVGMDVWGQ GTTVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 9 -F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI NTYLNWYQQK PGKAPKVL1H AASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPYTFG QGTKLEVR 108 M 9 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYDMEWVRQA PGKGLEWVSS IS P S G G S T IY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARQG LLTAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 9-G08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSY STPITFG GGTKVEIK 108
M 9-G08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYTMLWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGFTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVD TAMAMIDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 9-H02 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV I IT C R A S R S I ATYLNWYQQK PGKAPNLLIF GASTLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTISDLQ PEDFATYYCQ QSFSDPYTFG QGTNLEMK 108
M 9-H02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYMMIWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGVTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGT VGASDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 9-H03 LC
QYELTQAPSV SVAPGQTASI TCSGDKLGNR YTSWYQQKPG QSPVLVIFQD NKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAM DEADYYCQAL DSNTYVFGTG TKVTVL 106
M 9-H03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WY SMGWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGYTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP GVSYYYYGMD VWGQGTTVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M9-H04 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTRLEIK 108
M9-H04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AY TMWWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGSTFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARTY DSSAGEVDYW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 10-A 03 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQRI SFYLNWFQQK PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PKDFGTYYCQ QTFSTPNTFG QGTKLEIK 108
M 10-A 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYPMQWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD YGGKGGAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 10-A 12 LC
QDIQMTQSPL SLSAFVGDRV TITCRASRDI SVYLNWYQLK SGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTITSLQ PEDFATYYCQ Q SY SIPFTFG GGTKVETK 108
M 10-A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYLMHWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGFTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT DYGMDVWGQG TTVTVSSAST 120 KGPSVFPLAP SSKS 134
M 10 -B 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDGV TITCRA SQ SI STYLNWYQQR PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ REDFATYYCQ QSFSTPWTFG QGTRVEIK 108
M 10 -B 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYEMSWVRQA PGKGLEWVSR IWPSGGVTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LqMNSLRAED TAVYYCTRTS ITTVGMDVWG QGTTVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 10 -C 11 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SIYLNWYQQK PEKA PK LLIF AASTLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTISNLQ PEDFATYYCQ Q SH SIPPTFG LGTKVEVK 108
M 10 -C 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MY PMMWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGMTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED MAVYYCARVA GSSDAFDIWG QGTMVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 10-D 11 LC
QDIQMTQSPL SLPVTPGEPA SISC R SSQ SL LHSNGYNYLD WYLQKPGQSP QLLIYLGSNR 60 ASGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQT PLTFGPGTKV HIK 113
M 10-D 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AY PMNWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGNTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCALGY LGYWGQGTLV TVSSASTKGP 120 SVFPLAPSSK S 131
M 10 -E 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI STYLNWYQQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFTIYYCQ QSYSDPYTFG QGTKLDIK 108
M 10 -E 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYRMFWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGPTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREY PSTYYFDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 10 - F 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQTI DDDLIWYQQK PGRAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTITSLQ PEDFATYYCQ QSYNIPRTFG QGTKLESK 108
M 10 - F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMMWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGFTRY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCAKDI YYYNWGPSHY FDSWGQGTLV 120 TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 10 -G 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDSV TITCRA SQ SI SGYINWYQQK AGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT H FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYVSYPFTFG PGTKVDIK 108
M 10 -G 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYGMQWVRQA PGKGLEWVSS IRSSGGATRY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDG YYDSSGYPDY WGQGTLVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138 M11-A10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV AITCRASQSIDTYLNWYQQK PGKAPKLLIY DASNLEIGVP 60 SRFSGSGSGT DFTFIINSLQ PEDVATYYCQHYLYAPYSFG QGTKLEIK 108 M 11-A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYWMMWVRQA PGKGLEWVSG IGSSGGFTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKGS YSDYGVFESW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 11 -E 01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108 M 11 -E 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYEMYWVRQA PGKGLEWVSG IGSSGGMTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAREQ PGIAALQFWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 11 -E 04 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SIYLTWYQHR PGKAPNLLIY GAATLQTGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTIRGLQ PEDFATYYCQ QTFSLPRTFG QGTKLEIK 108 M 11 -E 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYHMNWVRQA PGKGLEWVSG IVSSGGVTFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARIT TVTTGGAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138 M 11 -E 05 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDTV T IT C R T S Q T I NNYLNWYQQR PGEAPKVLIY ATHTLESGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTIGSLQ PEDFATYYCQ QSFAFPYTFG QGTKVEIT 108 M 11 -E 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMGWVRQA PGKGLEWVSW IYFGGLTTYA 60 DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCARLGG PLDAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135 M 11 -E 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASIGDRV TISC R A SR G I GTYLNWYQQH AGKAPKLLIR AASSLETGVP 60 PRFSGSGSGT D FTLTISSLQ SDDFATYYCQ ESFTNVYNFG QGTKLEIK 108 M 11 -E 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYAMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGFTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARGG WLAGGELLNW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 11 -G 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R TSQ G I NHYLNWYQQK PGKAPKILVF AASELQTGVP 60 SRFSGTGSGT SYTLTITSLQ PEDVATYYCQ QTYTSPYTFG QGTKLEVK 108 M 11 -G 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYNMTWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGGTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDT GFWSADAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138 M 11-G 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV SITC R A SQ TI SVYVNWYQHK SGQAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYFCQ Q SY SIPFTFG GGTDVQIR 108 M 11-G 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYPMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGFTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREE QQGGFDYWGQ GTLVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 12-A 08 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T ITCRA SQ SI SRYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASTLETGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTITTLQ PEDFVIYYCQ QSYSTPYTFG QGTKLEIK 108
M 12-A 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYYMGWVRQA PGKGLEWVSW IVSSGGLTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARTT VTTGDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 12 -B 04 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQGI RNDLGWYQHK PGKAPKLLIY AASILQSGVP 60 SRFSGTASGT D FTLTISSLQ PEDFATYFCL QDYEYPLTFG GGTKLDIK 108
M 12 -B 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYSMYWVRQA PGKGLEWVSR IRPSGGGTVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDP LYSSGDVWGQ GTTVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 12 -C 09 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T ITCRA SQ SI GIYLNWYHQK PGKAPNLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PGDFATYYCQ HSYSTPFTFG GGTKVEIK 108
M 12 -C 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMVWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGFTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASMN LGGGDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 12 -C 10 LC
QSALTQPPSV SVSPGQTASI TCSGDKLGEK YVSWYQQKPG Q SPV W IY Q D NKRPSGIPER 60 FSGSNSGNTA TLTISGTQAV DEADYYCQAW DSYTWFGGG SKLTVLGQPK 110
M 12 -C 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYEMHWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGKTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL KWGGRGSPDW YFDLWGRGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 12-D 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T ITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG GGTKVEIK 108
M 12-D 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYPMDWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGWTNY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATDT SGSYLGFDYW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 12 -E 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV SITC R A SQ SI STYLNWYQHK PGKAPTLLIY GAFSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFALTISSLQ PEDFATYYCQ QSHSTPPTFG QGTRVEIK 108
M 12 -E 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYKMLWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGLTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARAP WFGELGMDVW GQGTTVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 27-A 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SAYLNWYQQK PGKAPQLLMY GVGSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYFCQ QGYTTPVTFG GGTKVEIK 108 M 27-A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYRMDWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGLTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGW APGGDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 27 -B 01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPYTFG QGTKLEIK 108 M 27 -B 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYTMWWVRQA PGKGLEWVSS IS S S G G IT FY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARSA DTAMGGAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138 M 27 -B 12 LC
QYELTQPPAV SVSPGQTATI TCSGDKLGDE YAAWYQQKPG QSPVLVIYQD RKRPSGIPER 60 FSGSNFGNTA TLTITGTQVM DEADYYCQAW GKRNWFGGG TKLTVL 106 M 27 -B 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WY QMMWVRQA PGKGLEWVSS ISPSG G IT EY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR SSGWYYYGMD VWGQGTTVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 27 -E 03 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPRTFG QGTKVEIK 108 M 27 -E 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYMMHWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGWTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARLV AGLDAFDIWG QGTMVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 27 -F 04 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108 M 27 -F 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMTWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGQTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTTEY GDYGGGFDPW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 27 -F 11 LC
QDIQMTQSPS FLSASVGDRV TITCRASQGI SSYLAWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYNTLRTFG PGTKVDLK 108 M 27 -F 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYHMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGATMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCARDG YHYGDYTYFQ HWGQGTLVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M27-G01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRASQSISTYLNWYQQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFTIYYCQQSYSDPYTFG QGTKLDIK 108 M 27-G 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYRMFWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGPTMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREY PSTYYFDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 27-G 04 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQR I SYYLTWYQQK PGKVPKLLIY AASSLESGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTISNLQ PEDFATYYCQ QAFSTPFTFG GGTKVEIK 108 M 27-G 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYYMVWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGQTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAREA ISSSSFDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 27 -G 09 LC
QDIQMTQSPS SVSASVGDRI T IT C R T R Q SI SNYLNWYQQK PG E P P K L L IF AASSLQSGVP 60 SRFSGSGTGT E FT L T ISS L Q PEDLAIYYCQ QSYDIPFTFG QGTKLEIK 108 M 27 -G 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYDMAWVRQA PGKGLEWVSY IVSSGGFTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTTWA GWIAAADYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 27-H 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SNYLNWYQQK PGKAPKFLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTL SISSL Q PEDFATYYCQ QSYSTPQTFG QGTKVEMK 108 M 27-H 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYQMAWVRQA PGKGLEWVSV IYSSGGYTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARHN WNDGAFDIWG QGTMVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 28-A 01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTLTFGG GTKVEIK 107 M 28-A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMHWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGYTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL SNGDDVFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 28 -C 03 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI NFYLNWYQQK PGKAPKLLIY VASSLESGVP 60 SRFSGSASGT E FT L T ISS L Q PEDFATYYCL QSYSAPYTFG QGTKVEIT 108 M 28 -C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYQMGWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCTRGS PWGDDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 28-D 02 LC
QDIqMTQSPS SLSASEGDMV T IT C R T S R R I GTYLNWYQQK PGKAPKLLIY GASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTVSSLQ PEDVGTYYCQ QSFSSPWTFG PGTKVEIK 108 M 28 -D 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGGTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCATSS GWLGDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 28 -D 12 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI ATYLNWYQQK PGRAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFVGGGSGS G THFTLTISS LQPEDFATYY CQQSYSTRET FGQGTKVEIK 110
M 28 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYTMHWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGPTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TATYYCARDG SGSYLGFDYW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 28 -E 01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SKFSGSGSGT DYTLTISSLQ PEDFATYYCQ QTYTTPWTFG QGTKVEIK 108
M 28 -E 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYPMGWVRQA PGKGLEWVSR ISSSGGMTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDD WNVGMDVWGQ GTTVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 28 -E 11 LC
QDIQMTQSPS SVSASVGDRV TINCRASQDI SNWLAWYQQK PGKAPNLLIY AASSLQTGAP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFGTYVCQ QSYSLPWTFG LGTKVEVR 108
M 28 -E 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYDMTWVRQA PGKGLEWVSG ISSSG G V TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARTY YYDSSGYADA FDIWGQGTMV 120 TVSSASTKGP SVFPLAPSSK S 141
M 28 - F 01 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI NTYLNWYQQK PGKAPKVL1H AASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPTFG QGTKVEIK 108
M 28 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYLMHWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGYTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARPG GLDAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120 TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 28 - F 05 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPLTFG GGTKVEIK 108
M 28 - F 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYIMWWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGYTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAMYYCAREL EGLGGFDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 28 - F 07 LC
QDIQMTQSPS SVSASVGDRV TITCRASQGI SSWLAWYQQK PGKAPKLLIY ATSGLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QAKSFPLTFG GGTRVEIK 108
M 28 - F 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYTMYWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDH LSSWYGGFFD YWGQGTLVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 29 -C 07 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTRYTFG QGTKLEIK 108
M 29 -C 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYDMMWVRQA PGKGLEWVSV ISSSGGNTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARES SGLYYFDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 29-D 10 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDTV SITC R A SQ SI TIYLNWYQHK PGKAPNLLIY GASNLHSGVP 60 SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYDTPLTFG GGTKVEIK 108
M 29-D 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYPMYWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGPTPY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARWA DYGGSLDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 29 -E 02 LC
QSVLTQPPSV SEAPRQRVTI SCSGSSSNIG NNAVSWYQQL PGKAPKLLIY YDDLLPSGVS 60 DRFSGSKSGT SASLAISGLR SEDEADYYCA AWDDSLNGFV FGTGTKVTVL 110
M 29 -E 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RY PMMWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGDTFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASGD DYLWEAAVYW GQGTLVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 29-G 08 LC
QDIQMTQSPA TLSASPGETV TLSCRASQNI GNDVAWYRQR PGQAPRLL1H HASTRAYGIP 60 ARLRGSGSAT E FT L T IT S L E PEDFAIYYCQ QFYDWPAHTF ALGTRLEIKR 110
M 29-G 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYHMWWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGFTFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDY YYDSSGYSPL GYWGQGTLVT 120 VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140
M 29-G 10 LC
QDIQMTQSPS SLSSSVGDSA TITCRA SQ SI SIYLNWYQQK PGKAPKILIY GASQLESGVP 60 SRFSGSGSGT DFTLTVSGLQ PEDFATYWCQ QSYNVPYTFG QGTKLEIK 108
M 29-G 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS FYKMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGSTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDR VDLGYLDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136
M 74-A 07 LC
QDIQMTQSPS SLSASVRDRV TITCRTSQNI NTYLNWYYQA PGRAPKLLIF GVSSLHRGVS 60 SRFSGSGDGT E FT LT ISS L Q PEDIGTYFCQ QSYSSPWTFG QGTKVEIK 108
M 74-A 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYLMMWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGYTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVS TAVADNDYWG QGTLVTVSSA 120 STKGPSVFPL APSSKS 136 M 76 -F 02 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQTI DNYLHWYQQK PGKAPKVL1H DASSLQSGVP 60
PRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYDTPQYTF GQGTKLEIK 109
M 76 -F 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYDMNWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGQTMY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARQP MISAFDIWGQ GTMVTVSSAS 120
TKGPSVFPLA PSSKS 135
M 76-G 02 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPPWTF GQGTKVEIK 109
M 76-G 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYAMWWVRQA PGKGLEWVSY ISSSGGFTSY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARYR VGVAATDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKS 136
M76 —G 06 LC
QDIQMTQSPS SLSASVRDRV TITCRA SQ SI STYLNWYQQK PGEAPKLLVF AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLSISSLQ PEDFATYYCQ QSYSTPHTFG QGAKVEIK 108
M76 —G 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYIMHWVRQA PGKGLEWVSW IYPSGGWTEY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA PGVGAIDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKS 136
M 76-H 02 LC
QDIQMTQSPS SLSASEGDRV TITCRASQDI SVYLNWYQMK SGKAPKLLIY GGASLQSGVP 60
ARFSGSGYGT DFTLTITDLR PEDFATYYCQ QSYSLPFTFG GGTKVEIK 108
M 76-H 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYWMQWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGPTKY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARPS GSYGDAFDIW GQGTMVTVSS 120
ASTKGPSVFP LAPSSKS 137
M 77 -C 07 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRASQNI SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT D FTLTISSLQ PEDFATYSCQ QSYSTPRTFG QGTKVEIK 108
M 77 -C 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYIMGWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGFTMY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARES SGVAAPDYWG QGTLVTVSSA 120
STKGPSVFPL APSSKS 136
M 77-H 04 LC
QDIQMTQSPL SLPVTPGEPA SISC R SSQ SL LHSRGYNYLD WYLQKPGQSP QLLIYLGSNR 60
ASGVPDRFSG SGSGTDFTLK ISRVEAEDVG VYYCMQALQR RTFGQGTKLE IK 112
M 77-H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYTMIWVRQA PGKGLEWVSG IRSSGGGTRY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAKDG SRYSYGSIYY YYGMDAWGQG 120
TTVTVSSAST KGPSVFPLAP SSKS 144
E JE M P L O 2: in h ib id o re s d e p artid a d e a n tic u e rp o s
S e se le cc io n a ro n a n ticu e rp o s co m o in h ib id o re s de p a rtid a de ca lic re ín a p la sm á tica b a sá n d o se en la co n s ta n te de inh ib ic ión ap a re n te (Ki,ap), e sp e c ific id a d con resp ec to a la a u se n c ia de inh ib ic ión de o tra s se r in a p ro te asa s , inh ib ic ión de la g e n e ra c ió n de b ra d iq u in in a y a u s e n c ia de un ión a p re c a lic re ín a p la sm á tica (T ab la 3 ). La ca lic re ín a p la sm á tica c irc u la en el p la sm a c o m o un z im ó g e n o in ac tivo (p re ca lic re ín a ) a una co n ce n tra c ió n de a p ro x im a d a m e n te 500 nM. Los a n ticu e rp o s que se un ie ron a p re ca lic re ín a se pued en v o lv e r in a cce s ib le s ha c ia la in h ib ic ión de ca lic re ín a p la s m á tic a a c tiva y p o d rían a u m e n ta r su s ta n c ia lm e n te la d o s is in v ivo re q u e rid a pa ra la e fica c ia . P o r tan to , se usó un e n sa yo de re so n a n c ia de p la sm o n e s su p e rfic ia le s (S P R ) pa ra id e n tifica r a n ticu e rp o s q u e no se unen a p re ca lic re ín a (da tos no m os trad os ). E spe c íficam en te , se ca p tu ra ro n IgG h u m an as (X 81 -B 01 , M 162 -A 04 (R 84 -H 05 ); M 160 -G 12 (R 84 -D 02 ); y M 142 -H 08 ) en un c h ip C M 5 usa n d o una su p e rfic ie a n ti-F c h u m a n a y 100 nM de ca lic re ín a p la s m á tic a o p re ca lic re ín a 100 nM o 500 nM. La p re c a lic re ín a se tra tó con a p ro tin in a -S e p h a ro se p a ra re tira r la c a lic re ín a p la s m á tic a activa . La p re ca lic re ín a u sa da p a ra X 81-B 01 se c a m b ió de tam pó n en la p re p a ra c ió n e xa c ta de tam pó n de e le c tro fo re s is S P R (so luc ió n sa lin a ta m p o n a d a con H E P E S ) p a ra e v ita r el d e sp la za m ie n to de l índ ice de re fracc ión q u e se o b se rvó con los o tro s tres a n ticu e rp o s q u e se p ro ba ron : M 162 -A 04 (R 84 -H 05 ); M 160 -G 12 (R 84 -D 02 ); y M 142-H 08.
De los a n ticu e rp o s e n u m e ra d o s en la T a b la 3, so lo M 142 -H 08 inh ibe la c a lic re ín a p la sm á tica h u m a n a con una K¡,ap su b n a n o m o la r. S in em b a rg o , cu a n d o M 142 -H 08 se p ro du jo co m o u n a IgG, se en co n tró que se e sc in d ió en la C D R 3 de la ca d e n a pe sad a . P or co n s ig u ie n te , los p re se n te s in ven to res d e c id ie ro n rea liza r dos en fo q u e s p a ra m e jo ra r la a fin id ad : 1) m ad u ra c ión p o r a fin id a d de M 162 -A 04 y M 160 -G 12 usando u n a n o ve d o sa fo rm a de b a ra ja d o de ca d e n a s lige ras d e n o m in a d o R O LIC (op tim izac ión rá p id a de ca d e n a s lige ras , p o r la e xp res ión in g le sa R apid O p tim iza c ió n o f L igh t C ha ins) (véanse , p o r e jem p lo , los d o cu m e n to s W O 2009 /102927 y uS 2009 -0215119 ); y 2) o p tim iza c ió n de se cu e n c ia s de M 142 -H 08 con el fin de p re ve n ir la esc is ión de la IgG que o cu rre m ie n tra s que se re tie ne las p ro p ie d a d e s de un ión e in h ib id o ra s de M 142-H 08.
T a b la 3. in h ib id o re s d e a n tic u e rp o s d e a lto ra n g o d e pC al a n te s d e la m a d u ra c ió n p or a fin id a d u o p tim izac ió n d e s e c u e n c ia s
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000101_0002
E JE M P L O 3: S e c u e n c ia O p tim iza c ió n d e M 142 -H 08
De los a n ticu e rp o s e n u m e ra d o s en la T a b la 3 , so lo M 142 -H 08 in h ib e pC a l h u m a n a con u n a Ki,ap su b n a n o m o la r. S in e m b a rg o , cua n d o M 142 -H 08 se p ro d u jo co m o u n a IgG , se e n co n tró q u e se e sc in d ía en la C D R 3 de la c a d e n a pesada . S e e n co n tró p o r e s p e c tro m e tría de m asa s qu e M 142 -H 08 se e sc in d ía d e sp u é s de la a rg in in a en la se c u e n c ia "W F R " de la s e cu e n c ia de H C -C D R 3 (G G L L L W F R E L K S N Y F D Y ). E s ta esc is ió n sug ie re q u e u n a p ro te a sa de las cé lu la s usa da s p a ra e x p re s a r el a n ticu e rp o (tan to c é lu la s C H O com o 293 T de riñón hu m an o ) esc inde e n z im á tica m e n te el an ticu e rp o en un ún ico s itio esp ec ífico . Los p re se n te s in ve n to re s m u ta ron la s e c u e n c ia de HC-C D R 3 de M 142 -H 08 con el fin de id e n tifica r su s titu c io n e s de a m in o á c id o s q u e p re v in ie ra n la e sc is ión de la IgG que o cu rre m ie n tra s se re tie ne las p ro p ie d a d e s de un ión e in h ib id o ra s de M 142 -H 08. E xp e rie n c ia p re v ia con a n ticu e rp o s s im ila rm e n te "a co rta d o s " sug ir ie ron q u e ce n tra rse s im p le m e n te en la po s ic ió n P1 o rig in a l (sub s itio 1 de p ro teasa , vé a se la T a b la 4 ) puede no se r s u fic ie n te p a ra id e n tifica r a n ticu e rp o s que re tie ne n p o ten te inh ib ic ión de la en z im a d ia n a m ie n tras que no se aco rta n p o r una p ro te a sa de la cé lu la ho spe da do ra . Por tan to , los p re se n te s in ve n to re s c re a ro n una p e q u e ñ a b ib lio te ca de m u ta c io n e s p u n tu a le s in d iv id u a le s en la reg ión a lre d e d o r de l s itio de e sc is ión con el fin de id e n tifica r va r ia n te s de M 142 -H 08 qu e no son aco rta da s , pe ro son to d a v ía po te n te s in h ib id o re s de pC a l. Los p re se n te s in ve n to re s se re fie ren a es ta b ib lio te c a com o la b ib lio te c a "C D R 3 p o r d iseñ o ". La p e q u e ñ a b ib lio te ca se co n s tru yó usa nd o un c e b a d o r de P C R que co n tie n e el cod ón a le a to riza d o N N K en cu a lq u ie ra de l s itio P3, P2, P1 o P 1 '. Esto d a com o re su lta d o u n a p e q u e ñ a b ib lio te ca d o n d e c a d a una de las 4 p o s ic io n e s pu ed e co n te n e r c u a lq u ie ra de los 20 a m in o á c id o s (20 20 20 20 = 80 m ie m bros ). U sa nd o PCR , e s ta b ib lio te ca se c lo nó en la s e cu e n c ia de Fab de M 142 -H 08 en el v e c to r p M id 21 , q u e es un v e c to r de fa g é m id o pa trón .
T a b la 4. S e c u e n c ia s d e c e b a d o re s
Figure imgf000101_0003
(continuación)
Figure imgf000102_0002
Por secuenciación de ADN, los presentes inventores recuperaron 61 de los posibles 80 anticuerpos ( T a b la 5 ). Estos anticuerpos se produjeron como fragmentos Fab en pequeña escala (~20 pg) y se probaron para la inhibición contra pCal humana en un ensayo de escisión por proteasa in v itro usando Pro-Phe-Arg-aminometilcumarina como el sustrato de péptido sintético. Los Fab que se encontró que eran inhibidores de pCal humana se subclonaron en el vector pBRHlf de los presentes inventores (un vector para la expresión transitoria de IgG en células 293T) para la conversión en anticuerpos IgG1 humana de longitud completa. Entonces se expresaron cinco anticuerpos en células 293T y se purificaron por cromatografía en proteína A Sepharose. Los anticuerpos se analizaron por SDS-PAGE para determinar que los mutantes inhibidores no se escinden por la(s) proteasa(s) de la célula hospedadora (datos no mostrados). Los anticuerpos escindidos (559A-X67-G05, 559A-X67-H01, 559A-X67-G09) tuvieron una banda adicional que migró entre el marcador de 38 y 49 kDa de peso molecular. Esta banda está ausente en los anticuerpos 559A-X67-H04 y 559A-X67-D03, que indica que estos anticuerpos están intactos.
Se determinaron valores de Ki,ap por cinética enzimática de estado estacionario para aquellos que se mostró por SDS-PAGE que no se habían escindido ( T a b la 5 ). De forma interesante, la posición P2 fue la única posición donde las sustituciones de aminoácidos dieron inhibidores de anticuerpos intactos de pCal. De las 14 mutaciones diferentes que se recuperaron en la posición P3 ( T a b la 5 ), solo se encontró que un mutante (W a L) era un inhibidor de pCal como un Fab, pero posteriormente se mostró que estaba acortado como una IgG. Ninguna de las 16 mutaciones diferentes en la posición P1 ( T a b la 5 ) se encontró que fuera inhibidores de pCal. Se encontró que ocho de las 15 mutaciones diferentes en la posición P1' eran inhibidores de pCal como un Fab, pero todas se acortaron como una IgG. Por consiguiente, solo las mutaciones en la posición P2 condujeron a inhibidores de anticuerpo, que no se acortaron durante expresión. De las 16 mutaciones diferentes que se recuperaron en la posición P2 ( T a b la 5 ), se encontró que ocho mutantes eran un inhibidor de pCal como un Fab, pero se mostró posteriormente que se acortaron como una IgG. Se encontró que cuatro mutantes en la posición P2 tenían valores de Ki,ap subnanomolares: X67-G04 (F a A), X67-C03 (F a M), X67-F01 (F a Q) y X67-D03 (F a N). El anticuerpo con la mayor potencia es X67-D03 (Ki,ap = 0,1 nM). Los dos anticuerpos mostrados en la T a b la 6 no se escindieron cuando se expresaron como IgG y se encontró que inhibieron pCal con una Ki,ap subnanomolar.
Se muestran en las F IG U R A S 4 y 5, respectivamente, el ADN y el alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de las versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones retromutadas a la línea germinal (X81-B01) del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC. Se muestran en las F IG U R A S 6 y 7, respectivamente, el ADN y el alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de las versiones no retromutadas a la línea germinal (X63-G06) y optimizadas en codones retromutadas a la línea germinal (X81-B01) del mismo anticuerpo usando maduración por afinidad ROLIC.
T a b la 5. S e c u e n c ia s d e H V -C D R 3 o b te n id a s d e la b ib lio te c a "C D R 3 p or d is e ñ o " *
Figure imgf000102_0001
(continuación)
Figure imgf000103_0001
(continuación)
Figure imgf000104_0001
S e m u es tra n a co n tin u a c ió n las s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s d e l d o m in io v a ria b le d e la c a d e n a lig era (L C ) y c a d e n a p e s a d a (H C ) d e a n tic u e rp o s pC al co n H C -C D R 3 d is e ñ a d a s .
X68-E07 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPIDNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQQSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - E 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLAFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - E 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLCFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -A 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -A 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLDFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - E 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - E 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLEFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -A 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLGFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -D 11 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -D 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLKFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - E 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - E 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLLFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - F 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - F 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLMFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -D 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -D 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLPFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLQFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X68-G01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -G 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLRFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -G 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -G 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNILY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLSFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 - F 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 - F 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLTFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 68 -H 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 68 -H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLVFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -G 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -G 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWARELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -G 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -G 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWCRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - E 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 67 - E 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWDRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -H 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWERELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 - E 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 - E 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFAELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 - B 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 - B 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFCELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 -D 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 -D 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFEELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 -H 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 -H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFFELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 -H 02 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 -H 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMHSLRAED TAVYYCARGG LLLWFGELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 - C 11 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 - C 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFHELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 -A 07 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 -A 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFKELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 - C 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 - C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFLELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 -G 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 -G 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFMELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 - F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFPELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X 66 - E 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 66 - E 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFQELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X69-D08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -D 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRALKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - B 02 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - B 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRCLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - C 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - C 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - D 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - D 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRGLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 -D 02 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -D 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRHLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 -A 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRKLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - F 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 69 - F 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRLLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - B 08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - B 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRNLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 -A 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRPLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 -A 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -A 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRQLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - E 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - E 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRRLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - F 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRSLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - F 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRTLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - C 12 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRVLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 - E 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 - E 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRWLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 69 -H 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 69 -H 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFRYLKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 - F 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFSELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 -H 11 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 -H 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFTELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 - C 02 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRA SQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 - C 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFVELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143 X66-F09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV TITCRASQPI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 - F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFWELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 66 -G 08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 66 -G 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWFYELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - C 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - C 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWGRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - B 04 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - B 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWKRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - G 09 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - G 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWLRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - C 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWMRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -D 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT DFTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108 X 67 -D 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWNRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - B 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - B 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWPRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - F 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWQRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -G 05 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -G 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWRRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - B 03 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - B 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWSRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - F 10 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWTRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 -H 01 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 -H 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWWRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
X 67 - F 08 LC
QDIQMTQSPS SLSAFVGDRV T ITCRA SQ PI DNYLNWYHQK PGKAPKLLIY AASRLQSGVP 60 SRLSGSGFGT D FTLTISSLQ PEDFGNYYCQ QSYTVPYTFG GGTKVEIR 108
X 67 - F 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS AYSMIWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGRTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARGG LLLWYRELKS NYFDYWGQGT 120 LVTVSSASTK GPSVFPLAPS SKS 143
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
S e m u es tra n a c o n tin u a c ió n las s e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s de l d o m in io v a ria b le d e la ca d e n a lig era (L C ) y c a d e n a p esad a (H C ) d e in h ib id o re s d e a n tic u e rp o s m a d u ra d o s p o r a fin id a d d e pC al d e s c u b ie rto s u san d o r o l i c
X 59 - C 07 LC
QDIQMTQSPS SLSASVGDRV TVTCRAGRSI STYVNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSRSGT D FTLTISSLQ PEDFATYYCQ QSQSTPYTFG QGTKLEVK 108
X 59 - C 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X 60 -D 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRASQIV SSRYLAWYQQ RPGQAPRLLI YGAASRATGI 60
PDRFSGSGSG T D FT L TISSL QAEDFATYYC QQTYSSPFTF GQGTKMEIK 109
X 60 -D 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X 63 - G 06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
X 63 - G 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X 63 -G 10 LC
QDIQMTQSPD SLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SNYLNWYQQK PGKAPKLLIY AASSLQSGVP 60
SRFSGSGSGT DFTLTISGLQ PEDFASYYCQ QSYTSPYTFV QGTKLEIKRT 110
X 63 -G 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X 64 - F 04 LC
QDIQMTQSPA TLSLSPGERA TLSCRASQIV SSNYLAWYQQ KPGQAPRLLI YGASNRATGI 60
PDRFSGSGSG T E F T L T IS S L QSEDFAIYYC QQSFNIPYTF GQGTRVDIK 109
X 64 - F 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
X 81-B 01 es la IgG re tro m u ta d a a la lín e a g e rm in a l p ro d u c id a en la ve rs ió n de c é lu la s H E K 293 T de l Fab X 63 -G 06 , co m o se in d ica a n te rio rm e n te .
X 101-A 01 (tam b ién d e n o m in a d o D X -2922) es la IgG re tro m u ta d a a la lín e a g e rm in a l p ro d u c id a en la ve rs ió n de c é lu la s C H O de l Fab X 63 -G 06
E JE M P L O 4: M a d u ra c ió n por a fin id a d
A d e m á s de o p tim iz a r la s e cu e n c ia de l an ticu e rp o aco rta do (M 142 -H 08 ), los p re se n te s in ve n to re s ta m b ié n rea liza ron m ad u ra c ió n p o r a fin id ad en do s de los a n ticu e rp o s id e n tifica d o s po r p re se n ta c ió n en fa g o s (M 162 -A 04 y M 160-G 12 ). A m b o s de es to s a n ticu e rp o s in h ib en pC a l h u m a n a con p o te n c ia n a n o m o la r de un so lo d íg ito , pa rece n e sp e c ífico s p a ra pC a l y no se unen a p re ca lic re ín a (T a b la 3 ). Los p re se n te s in ve n to re s rea liza ron en p r im e r lu ga r u n a no ve d o sa fo rm a de b a ra ja d o de ca d e n a s lige ra s d e n o m in a d o R O LIC (o p tim iza c ió n rá p id a de c a d e n a s lige ras, p o r la exp res ión in g le sa R ap id O p tim iza c ió n o f L igh t C h a in s) en M 162 -A 04 y M 160 -G 12 (véanse , po r e jem p lo , los d o cu m e n to s W O 2009 /102927 y US 2009 -0215119 ). A p a rtir de l c rib a d o de los a n ticu e rp o s d e scu b ie rto p o r R O LIC , los p re se n te s in ve n to re s id en tifica ron un a n ticu e rp o con p o te n c ia su b n a m o la r (X 63 -G 06 ) q u e co m p a rtió la m ism a ca d e n a pe sad a q u e M 160 -G 12. Los p re se n te s in ve n to re s co n s tru ye ro n e n to n ce s b ib lio te ca s de m a d u ra c ió n p o r a fin id ad e n riq u e c id a s en H V -C D R 3 b a sa d a s en las se cu e n c ia s de C D R 3 en M 162 -A 04 y X 63 -G 06 (d e sc rita s a co n tin u a c ió n ).
M ad u ra c ió n po r a fin id a d po r R O LIC . Los p re se n te s in ve n to re s usa ron R O LIC p a ra m a d u ra r p o r a fin id ad los do s e je m p lo s de la T a b la 3 que no se e sc in d ie ro n (M 162 -A 04 y M 160 -G 12 ). E ste p ro ce so id en tificó un an ticu e rp o que inh ibe pC a l con u n a Ki,ap s u b n a n o m o la r (T ab la 7 ). X 63 -G 06 inh ibe pC a l con una Ki,ap de a p ro x im a d a m e n te 0 ,4 nM co m o un fra g m e n to Fab. C u an do es te a n ticu e rp o se co n v irtió en u n a IgG q u e se re tro m u ta a la líne a g e rm in a l y se o p tim izó en la s e cu e n c ia pa ra la e xp re s ió n de cé lu la s C H O (X 81 -B 01 ), se e n co n tró q u e in h ib ía pC al con u n a Ki,ap de a p ro x im a d a m e n te 0 ,2 nM.
E J E M P L O 5: M ad u rac ió n por a fin id a d d e C D R 1 /2 y C D R 3 d e la c a d e n a p esad a
Los p re se n te s in ven to res usa ron do s e s tra te g ia s a d ic io n a le s de m ad u ra c ión p o r a fin id ad pa ra id e n tifica r an ticu e rp o s a lta m e n te p o te n te s ba sá n d o se en dos e je m p lo s de in h ib id o re s p a re n ta le s de a n ticu e rp o s d ife re n te s : M 162 -A 04 y X 63 -G 06. Un e n fo q u e e ra g e n e ra r b ib lio te ca s que ba ra ja ro n las C D R 1 /2 de HC de do s e je m p lo s de in h ib id o res p a re n ta le s de an ticu e rp o d ife re n te s (M 162 -A 04 y X 63 -G 06 ) co n tra la d ive rs id a d ad ic io n a l de C D R 1 /2. O tro en fo q u e fu e c re a r b ib lio te ca s e n riq u e c id a s en C D R 3 de la ca d e n a p e sa d a ba sá n d o se en e s to s e jem p los .
Los 82 a n ticu e rp o s que se d e scu b rie ro n ba sá n d o se en m e jo ras en M 162 -A 04 d e b ido a m o d ifica c io n e s en c u a lq u ie ra de la reg ión C D R 1 /2 y C D R 3 se m ue s tra n en la T a b la 8. El c r ib a d o de in h ib ic ión con an ticu e rp o 10 nM (com o fra g m e n to s Fab) reve ló que hubo 33 a n ticu e rp o s que in h ib ie ron la ac tiv ida d de pC a l m ás de 90 % . S e m ostró que va rio s a n ticu e rp o s e ran in h ib id o re s su b n a n o m o la re s de pC a l hum ana .
Los 62 a n ticu e rp o s q u e se d e scu b rie ro n b a sa d o s en m e jo ras en X 63 -G 06 d e b id o a m od ifica c io n e s en c u a lq u ie ra de la reg ión C D R 1 /2 y C D R 3 se m ue s tra n en la T a b la 9. El c rib a d o de in h ib ic ión con a n ticu e rp o 10 nM (com o fra g m e n to s Fab) reve ló q u e hubo 24 a n ticu e rp o s qu e in h ib ie ron la ac tiv ida d de pC a l m ás de 90 % . S e m ostró que va rio s a n ticu e rp o s e ran in h ib id o re s su b n a n o m o la re s de pC a l hum ana .
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Figure imgf000122_0001
S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s del d o m in io v a ria b le d e la c a d e n a lig era (L C ) y ca d e n a p esa d a (H C ) d e a n tic u e rp o s pC al o b te n id o s d e b ib lio te c a s d e m a d u ra c ió n por a fin id a d e n riq u e c id a s en C D R 1 /2 y C D R 3 b as a d a s en M 162 -A 04
M 195 -A 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -A 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYMMMWVRQA PGKGLEWVSG ISSSGGHTDY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 -A 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYMMMWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGYTVY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 -B 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -B 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYLMWWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTHY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 -B 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -B 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYWMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGQTYY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120
SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 -C 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS MYQMFWVRQA PGKGLEWVSS ISPGGGTQYA 60
DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120
SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 195 -D 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60
SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYGMFWVRQA PGKGLEWVSG IGPSGGPTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 - E 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS YYIMFWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGYTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 195 - F 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 - F 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYVMMWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGVTAY 60 AiDSVKGR-FTI SR.DNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPPJRDAíFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 0195 -G 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 195 -G 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMMWVRQA PGKGLEWVSS IWPSGGTTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 196 - C 06 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 196 - C 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSRGMTWY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 196 -D 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 196 -D 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMHWVRQA PGKGLEWVSV IGPSG GITLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 196 -D 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 196 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMRWVRQA PGKGLEWVSV IYPSGGQTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 196 -G 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 196 -G 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYSMDWVRQA PGKGLEWVSR IYSSGGGTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 196 -H 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 196 -H 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYVMWWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGDTHYA 60 DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 197 -A 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMIWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGNTSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -A 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -A 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMQWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGKTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -A 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -A 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -C 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYDMLWVRQA PGKGLEWVSY IVSSGGLTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 - E 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYTMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTQY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 - F 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYHMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTGY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 - F 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 - F 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMFWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGVTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -G 10 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -G 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYAMRWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGKTWY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -G 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -G 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYAMVWVRQA PGKGLEWVSS IYPSG GITTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -H 10 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -H 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGKTNY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 197 -H 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 197 -H 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYNMIWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -A 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYTMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTPY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -A 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMIWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGATEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -A 06 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMHWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGPTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -A 07 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RY QMHWVRQA PGKGLEWVSW ISPSG G ITG Y 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -A 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYMMQWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGTTYA 60 DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138
M 198 -A 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -A 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYFMSWVRQA PGKGLEWVSS IRSSGGPTWY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - B 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - B 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMTWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGSTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -B 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -B 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS KYSMAWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -C 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYSMSWVRQA PGKGLEWVSG ISPSGGETSY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -C 05 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -C 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYKMYWVRQA PGKGLEWVSV IGPSGGATFY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - C 06 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - C 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYFMHWVRQA PGKGLEWVSY IYPSGGMTEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - C 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 - C 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMYWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGWTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -C 10 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -C 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYMGMNWVRQ APGKGLEWVS SIVPSGGWTQ 60 YADSVKGRFT ISRDNSKNTL YLQMNSLRAE DTAVYYCAYR RTGIPRRDAF DIWGQGTMVT 120 VSSASTKGPS VFPLAPSSKS 140
M 198 -D 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS LYVMYWVRQA PGKGLEWVSY IVPSGGPTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - E 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - E 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMYWVRQA PGKGLEWVSY IRPSGGNTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - E 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - E 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMNWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGRTRY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - E 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - E 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYSMYWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGLTWY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 - F 04 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - F 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMWWVRQA PGKGLEWVSS IRPSGGITKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 198 - F 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 - F 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYSMWWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGMTEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 198 - F 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 - F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYNMHWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGMTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 198 - F 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 - F 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYTMMWVRQA PGKGLEWVSS IWSSGGQTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 198 -G 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 -G 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYTMVWVRQA PGKGLEWVSW IYSSRANYAD 60 SVKGRFTISR DNSKNTLYLQ MNSLRAEDTA VYYCAYRRTG IPRRDAFDIW GQGTMVTVSS 120 ASTKGPSVFP LAPSSKS 137 M 198 -G 07 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 -G 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMTWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGQTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 198 -H 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 198 -H 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS PYNMYWVRQA PGKGLEWVSW IVPGGVTKYA 60 DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT AVYYCAYRRT GIPRRDAFDI WGQGTMVTVS 120 SASTKGPSVF PLAPSSKS 138 M 198 -H 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -H 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYDMYWVRQA PGKGLEWVSS IGPSGGPTAY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 198 -H 09 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 198 -H 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYLMIWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGPTEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 199 -A 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 199 -A 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 199 -A 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 199 -A 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 199 -B 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 199 -B 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDAFD NWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 -A 10 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 200 -A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 -B 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 200 -B 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFD SWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 -D 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 200 -D 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAWRR IGVPRRDSFD MWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 - E 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 200 - E 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDAFD NWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 - F 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 200 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR MGIPRRNAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 200 -H 07 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 200 -H 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRNAFD NWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 201 -A 06 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 201 -A 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDVFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 201 -A 07 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 201 -A 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDEFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 201 - F 11 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 201 - F 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGIPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 201 -H 06 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 201 -H 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 201 -H 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 201 -H 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDALD NWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 202 - A 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 202 - A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 202 -A 04 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 202 -A 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR KGIPRRDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 202 -A 08 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T ITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107 M 202 -A 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRWDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139 M 202 -A 10 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGIPRRDSFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -A 12 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYQR TGVPRRDSFN IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -B 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -B 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -B 04 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -B 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR SGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 - C 01 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 - C 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -C 02 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT LT ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -C 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR PGVPRRDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -C 0 9 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITCRA SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -C 0 9 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -D 0 9 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -D 0 9 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR IGVPRRDSFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 - E 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 - E 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGIPRRDAFE IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -E 0 6 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -E 0 6 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR RGVPRRDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 - F 0 6 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 - F 0 6 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAYRR TGVPRWDAFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -G 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -G 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDSFE IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -H 03 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV TITC R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -H 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRWDDFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
M 202 -H 05 LC
QDIQMTQSPS TLSASVGDRV T IT C R A SQ SI SSWLAWYQQK PGKAPNLLIY KASTLESGVP 60 SRFSGSGSGT E FT L T ISS L Q PDDFATYYCQ QYNTYWTFGQ GTKVEIK 107
M 202 -H 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYIMMWVRQA PGKGLEWVSG IYSSGGITVY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAFRR TGVPRRDVFD IWGQGTMVTV 120 SSASTKGPSV FPLAPSSKS 139
Figure imgf000136_0001
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
S e c u e n c ia s d e a m in o á c id o s del d o m in io v a ria b le d e la c a d e n a lig era (L C ) y ca d e n a p esa d a (H C ) d e a n tic u e rp o s pC al o b te n id o s d e b ib lio te c a s d e m a d u ra c ió n por a fin id a d e n riq u e c id a s en C D R 1 /2 y C D R 3 b as a d a s en X 63 -G 06.
M 203 -A 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 203 -A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NY LMAWVRQA PGKGLEWVSW IVPSGGYTEY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 203 -A 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 203 -A 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMIWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGQTTY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 204 -A 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 204 -A 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMTWVRQA PGKGLqWVSY ISPSGGLTSY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 204 - E 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 204 - E 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYMMqWVRQA PGKGLEWVSY IGPSGGKTDY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -A 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -A 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYLMAWVRQA PGKGLEWVSG IVSSGGRTLY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -A 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -A 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYDMIWVRQA PGKGLEWVSY ISSSGGFTRY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -B 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -B 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYDMIWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGGTTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -C 11 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -C 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS QYMMMWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGSTLY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -D 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -D 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS TYKMqWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGPTNY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -E 11 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -E 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYTMGWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGKTDY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 - F 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 - F 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SqQMVWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGNTYY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 205 -H 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 205 -H 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYTMQWVRQA PGKGLqWVSY ISPSGGYTGY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 205 -H 08 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 205 -H 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMMWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTqY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 -A 06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 206 -A 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS NYMMGWVRQA PGKGLqWVSS ISPSGGLTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 -B 10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 206 -B 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYLMAWVRQA PGKGLEWVSS IYPSGGWTKY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 -C 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 206 -C 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS qYMMVWVRQA PGKGLEWVSS IYSSGGNTPY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 -E 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 206 -E 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMMWVRQA PGKGLEWVSV ISPSGGQTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 - F 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 206 - F 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYMMVWVRQA PGKGLEWVSR IS P S G G P T IY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 206 - F 09 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 206 - F 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS VYMMSWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGSTTY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 206 -H 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 206 -H 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS EYMMVWVRQA PGKGLEWVSR ISPSGGTTEY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 206 -H 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 206 -H 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYMMVWVRQA PGKGLEWVSS IS P S G G Y T Iq 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 206 -H 05 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 206 -H 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS GYKMqWVRQA PGKGLEWVSS ISPSGGITMY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 206 -H 08 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 206 -H 08 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS DYMMAWVRQA PGKGLEWVSS IVPSGGHTHY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 207 -A 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 207 -A 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGISARSRTS CFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 207 -A 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 207 -A 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TALYYCARVA RGIAARSRTI NLDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 207 -A 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 207 -A 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR SFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 207 -C 05 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
R 0121 - D 02 = M 0207 - C 05 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS YFDKWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -A 10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -A 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS qFDHWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -B 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -B 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FFDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 - C 06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 - C 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FIDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -D 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARLA RGIAARSRTS YqDIWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -E 10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -E 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGISARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 - F 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 - F 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS FFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 - F 10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 - F 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -G 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -G 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIADRSRTS YSDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -G 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -G 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 208 -H 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 208 -H 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIASRSRTR YCDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 209 -B 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -B 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIVARSRTS NFDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -B 09 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -B 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIVARSRTS YLHqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -B 11 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDR.FSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC n■ ^ n /^ / Qkx Qkx 1x5x Tx D XT VaI <. T X t Xt GQGTRVEIK 109
M 209 -B 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YIDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -C 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M2u 9 - C 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAYRRRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -C 11 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -C 11 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAMVG QGIRGRSRTS YFAqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -C 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGH TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS qLDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142 M 0209 -D 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -D 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGITARSRTS YFDDWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -D 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -D 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVG RGIAARSRTS FFDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -D 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -D 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCATVA RGIAARSRTS YFDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -E 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -E 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTI LLDqWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -E 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -E 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARqA RGIAARSRTS YFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 - F 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 - F 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDqWSQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -G 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TD FTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 209 -G 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSGGHTIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA qGISGRSRLS YVDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -G 07 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -G 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YFDTWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -H 03 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -H 03 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIAARSRTT qFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -H 07 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -H 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARqRTS YYDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 209 -H 09 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 209 -H 09 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTV YFDHWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -A 06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -A 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60 ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS qFDYWGQGTL 120 VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -B 02 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60 PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109 M 210 -B 02 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASVA RGIAARSRTS YFNqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -C 12 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -C 12 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA QGIAARSRTS SVDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -G 04 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -G 04 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA TGIVARSRTR YFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -G 10 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -G 10 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTS YLDFWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -H 01 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -H 01 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRNS qQDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -H 06 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -H 06 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YFDYWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
M 210 -H 07 LC
QDIQMTQSPG TLSLSPGERA TLSCRTSQFV NSNYLAWYQQ TPGQAPRLLI YGASSRATGI 60
PDRFSGTGYG TDFTLTISRL EPEDYGTYYC QQSSRTPWTF GQGTRVEIK 109
M 210 -H 07 HC
EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS HYLMTWVRQA PGKGLEWVSY ISPSG G H TIY 60
ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVA RGIAARSRTR YFDqWGQGTL 120
VTVSSASTKG PSVFPLAPSS KS 142
E JE M P L O 6: P ru eb a in v iv o d e M 162 -A 04 (IgG ) y X 101-A 01
S e han im p lica do p re v ia m e n te b ra d iq u in in a y o tra s c in in a s b io a c tiva s en e d e m a in du c ido po r c a rra g e n in a y do lo r in fla m a to rio (S h a rm a J .N . e t al. (1998 ) In fla m m o p h a rm a co lo g y 6, 9 -17 ; A san o M. e t al. (1997 ) B r J P ha rm aco l 122, 1 436 -1440 ; De C a m po s R.O . e t al. (1996 ) E ur J P ha rm aco l 316 , 277 -286 ). La c a lic re ín a p la sm á tica y la c a lic re ín a 1 de te jid o son las d o s c in in o g e n a sa s p rim a ria s en m a m ífe ro s (S ch m a ie r A .H . (2008 ) Int Im m u n o p h a rm a co l 8, 161 ­ 165). S e p ro bó M 162 -A 04 (M 162 -A 4 ) (IgG ), un in h ib id o r e sp e c ífico de ca lic re ín a p lasm á tica , p a ra d e te rm in a r si se ría e fica z en el e d e m a in d u c id o p o r c a rra g e n in a . El d ise ñ o de l e s tu d io se exp on e b re ve m e n te en la T a b la 10. La v ía de a d m in is tra c ió n (R O A ) p a ra el ve h ícu lo (P B S ), el a n ticu e rp o y el co n tro l p o s itivo ( in d o m e ta c in a ) e ra in tra p e rito n e a l (IP ) y se a d m in is tró 30 m in u tos an tes de la inyecc ió n de c a rra g e n in a (0,1 m l de u n a d iso lu c ió n al 2 % de c a rra g e n in a ). Es e v id e n te de la F IG U R A 2 qu e las do s is de a n ticu e rp o a 10 m g/kg y su p e rio re s fu e ro n ig ua lm en te de e fica ce s en re d u c ir e l e d e m a in du c ido p o r ca rra g e n in a que el con tro l po s itivo (in do m e tac in a ). S in e m b a rg o , el a n ticu e rp o no fu e e fica z en re d u c ir la h ip e ra lg e s ia té rm ic a in d u c id a p o r c a rra g e n in a (F IG U R A 3 ). El m o tivo pa ra la d iso c ia c ió n e n tre la e fic a c ia en e l e d e m a y la h ip e ra lg e s ia no son ob v io s , pe ro pu e d e s e r d e b id o a d ife re n c ia s en la b io a c tiv id a d de d ife re n te s m e ta b o lito s de c in ina . L ys -d e sA rg 9 -b ra d iq u in in a es el a g o n is ta m ás po te n te de l rece p to r de B 1 , qu e se c ree q u e e s tá p r in c ip a lm e n te im p lica do en la h ip e rse n s ib ilid a d al d o lo r (L e e b -L u n d b e rg L .M e t al. (2005 ) P ha rm aco l R ev 57, 27 -77 ). Este m e tab o lito de c in in a se g e n e ra p o r la c a lic re ín a 1 de te jido , no la ca lic re ín a p la sm á tica (S ch m a ie r A .H . (2008 ) Int Im m u n o p h a rm a co l 8 ,161 -165 ). E sta d ife re n c ia en la ge n e ra c ió n de c in in a y la a c tiva c ió n de l re ce p to r de b ra d iq u in in a resu lta n te pued e e x p lic a r el in e sp e ra d o d e sa co p la m ie n to de e d e m a e h ip e ra lg e s ia en es te m ode lo .
T a m b ié n se p ro bó o tro in h ib id o r de l a n ticu e rp o pC a l X 101-A 01 en el m ode lo de C P E u sa n d o e l d ise ñ o de l e s tu d io m o s tra d o en la T a b la 10B. Los d a to s o b te n id o s en la F igu ra 14 m uestran que X 101-A 01 inh ib ió el e d e m a de un m od o d e p e n d ie n te de la do s is ha s ta un g ra d o q u e es co m p a ra b le al de l co n tro l po s itivo ( in do m e tac in a ).
T a b la 10A . D ise ñ o d e e d e m a en la p a ta in d u c id o p or c a rra g e n in a d e l e s tu d io p ara p ro b a r M 162 -A 04
Figure imgf000149_0001
T a b la 10B. D iseño d e e d e m a en la p a ta in d u c id o p or c a rra g e n in a d e l e s tu d io p ara p ro b a r X 101 -
Figure imgf000149_0003
E JE M P L O 7: E va lua c ión de in h ib id o res de a n ticu e rp o s s e le cc io n a d o s de ca lic re ín a p la sm á tica
La e v a lu a c ió n de a n ticu e rp o s o p tim iza d o s s e le cc io n a d o s (X 81-B01 y X 67 -D 03 ) se m ue s tra en la T a b la 11. N ingún an ticu e rp o tie n e po s ib le de sa m id a c ió n , iso m eriza c ió n o su p u e s to s s itio s de ox ida c ión .
T a b la 11
Figure imgf000149_0002
(con tinu ac ió n )
Figure imgf000150_0001
E JE M P L O 8: M apeo de e p íto p e s
S e inves tig ó la reg ión de pC a l un id a p o r a n ticu e rp o s an ti-p C a l se le cc io n a d o s u sa nd o va rio s m é todos . En p rim e r luga r, se usa ron e n sa yo s de co m p e tic ió n pa ra d e te rm in a r si los a n ticu e rp o s co m p itie ro n pa ra un irse a pC a l con in h ib id o re s d ir ig id o s al s itio a c tivo co n o c id o s . En seg un do lugar, los a n ticu e rp o s se a g ru p a ro n seg ún si e ran in h ib id o re s o so lo a g e n te s de un ión a pC al. En te rc e r lugar, se in ves tig a ron e p íto p e s u sa nd o pé p tid o s s in té tico s y e s tru c tu ra s p e p tíd ica s ba sa d a s en la se cu e n c ia y e s tru c tu ra tr id im e n s io n a l de pC a l. E stas e s tru c tu ra s p e p tíd ica s se d e n o m in a n "C L IP S " (pé p tid o s q u ím ica m e n te u n id os en a rm a zo n e s ) y la p ru e b a se rea lizó p o r u n a e m p re s a de s e rv ic io s p o r ho no ra rio lla m a d a P epscan .
En cu a rto luga r, se p ro ba ron a n ticu e rp o s pa ra su ca p a c id a d pa ra in h ib ir pC a l de o tra s e sp ec ies , ad em á s de la hum ana , do nd e se ha d e te rm in a d o la se cu e n c ia de am in o á c id o s de pC a l con e l fin de id e n tifica r a m in o á c id o s que pu ed en e x p lic a r las d ife re n c ia s en in h ib ic ión .
E n sa yo s d e co m p e tic ió n
U sa nd o un e n sa yo B IA C O R E ® S P R , se p ro b a ro n los a n ticu e rp o s de in te rés pa ra la co m p e tic ió n con un in h ib id o r de s itio a c tivo c o n o c id o de pC al. E P I-K A L2 es un p o ten te in h ib id o r de s itio s ac tivo s (Ki,ap = 0,1 nM ) de pC a l y un in h ib id o r de d o m in io s de K un itz b a sa d o en e l p r im e r d o m in io de l in h ib id o r de la v ía de fa c to r t is u la r (M ark land (1996) Ite ra tive o p tim iza tio n o f h ig h -a ffin ity p ro te a s e in h ib ito rs us ing p h a g e d isp lay . 2. P la sm a ka llik re in and th rom b in . B io che m is try . 35 (24 ):8058 -67 ). Los d o m in io s de K un itz son in h ib id o re s de s itio s ac tivos co n o c id o s de se rina p ro te asa s , ta le s co m o pC al.
La se cu e n c ia de E P I-K A L2 es:
FAMHSFCAFKAPDGPCAA^flPRffFFNIFTROCEEF^YGflCfiGNONRPESL EECKKMCTRD
(los a m in o á c id o s en cu rs iva son los que se d ife re n c ia n de T F P I)
C o m o se m u e s tra en las F IG U R A S 8 A -8 B , los a n ticu e rp o s X 81-B 01 y X 67 -D 03 co m p itie ro n pa ra un irse a pC a l en p re se n c ia o E P I-K A L2. Este resu ltad o in d ica q u e e s to s a n ticu e rp o s o b ien se unen en la p ro x im id a d de l s itio a c tivo o c a m b io s a lo s té rico s en la c o n fo rm a c ió n de l co m p le jo p C a l-E P I-K A L 2 p re v ie n e n la un ión de l an ticue rpo .
A g e n te s de un ió n d e a n ticu e rp o s fre n te a in h ib id o re s
C o m o se m u e s tra en las T ab la s 1 y 2, to d o s los a n ticu e rp o s ún ico s d e scu b ie rto s p o r la p re se n ta c ió n en fa g o s se ca ra c te riza ro n co m o o b ien in h ib id o res de pC al o a g e n te s de un ión , pe ro no in h ib id o res . Los a n ticu e rp o s qu e inh iben la ac tiv ida d de pC a l o b ien se unen ce rc a de l s itio a c tivo e im p iden las in te ra cc io n e s de su s tra to s (in h ib id o res com p e tit ivo s ), o b ien se unen le jos de l s itio ac tivo e inducen c a m b io s a lo s té rico s en la e s tru c tu ra de l s itio ac tivo (in h ib id o re s no co m p e tit ivo s ). Es po co p ro b a b le qu e los a n ticu e rp o s que se unen , pe ro no inh iben pC al, se unan ce rca de l s itio a c tivo y p u ed an un irse al d o m in io no ca ta lítico (es dec ir, e l d o m in io de m an zan a ). La T a b la 12 c la s ifica a n ticu e rp o s s e le cc io n a d o s co m o o b ien in h ib id o re s o a g e n te s de un ió n d e pC a l. T a m b ié n se m u e s tra en la T a b la 12 pa ra los an ticu e rp o s e n u m e ra d o s , es un a d e m o n s tra c ió n de si rea cc io nan o no de fo rm a c ru z a d a con pC a l de ratón co m o in h ib id o re s y si se unen o no a p re ca lic re ína .
T a b la 12. P ro p ie d a d e s d e u n ió n d e a n tic u e rp o s a n ti-p O a l s e le c c io n a d o s
Figure imgf000150_0002
(con tinu ac ió n )
Figure imgf000151_0001
C 1 -C 7 : p é p tid o s en pC al id en tificado s p o r e l m ap eo de e p íto p e s de C L IP S (véa nse las F IG U R A S 9 y 10 A -10 C ). C1 co rre sp o n d e a las p o s ic io n e s 55 -67 de l d o m in io ca ta lítico , C 2 a las p o s ic io n e s 81 -94 , C3 a las po s ic io n e s 101-108 , C 4 a las po s ic io n e s 137-151 , C 5 a las p o s ic io n e s 162-178 , C 6 a las po s ic io n e s 186-197 y C 7 a las po s ic io n e s 214 ­ 217.
M a p e o d e e p íto p e s u sa nd o C L IP S
S e p ro ba ron los 11 an ticu e rp o s an ti-p C a l e n u m e ra d o s en la T a b la 12, m ás un c o n tro l nega tivo (A2) pa ra la un ión a 5000 C L IP S (pé p tid os q u ím ica m e n te un idos sob re a rm a zo n e s ) s in té tico s d ife re n te s p o r P ep scan co m o se de sc rib e m ás ad e la n te en las se cc io n e s M É T O D O S DE C L IP . E ste an á lis is co n d u jo a la id en tificac ió n de reg io nes de pé p tido en pC a l que es p ro b a b le que sean una pa rte de l e p íto p e de a n ticu e rp o p a ra c a d a uno de los a n ticu e rp o s p ro ba dos (F IG U R A 9 ).
M É T O D O S D E C L IP S
S e s in te tiza ro n pé p tid o s linea le s y C L IP S b a sá n d o se en la s e c u e n c ia de a m in o á c id o s de la p ro te ín a d ia n a usando q u ím ic a e s tá n d a r de Fm oc y se d e sp ro te g ie ro n u sa nd o ác ido tr if lu ó r ico com o e lim in a d o re s . Los pé p tid o s res trin g id os se s in te tiza ro n sob re a rm a zo n e s q u ím ico s con el fin de la re co n s tru cc ió n de e p íto p e s c o n fo rm a c io n a le s , usando te c n o lo g ía de pé p tid o s q u ím ica m e n te un id os sob re a rm a zo n e s (C L IP S ) (T im m e rm a n et al. (2007). P or e jem p lo , se s in te tiza ro n los pé p tid o s de un so lo bu c le q u e co n te n ía n u n a d ic is te ín a , q u e se c ic ló tra ta n d o con alfa , a lfa '-d ib ro m o x ile n o y se v a r ió el ta m a ñ o de l buc le in tro d u c ie n d o res tos de c is te ín a a se p a ra c ió n va ria b le . Si es ta ban p re se n te s o tra s c is te ín a s a p a rte de las c is te ín a s rec ién in tro du c ida s , se su s titu ye ro n p o r a lan ina . Las ca d e n a s la te ra le s de las m ú ltip le s c is te ín a s en los pé p tid o s se a co p la ron a m o lde s de C L IP S re a cc io n a n d o sob re ta r je ta s de P E P S C A N de p o lip ro p ile n o con fo rm a to de ta r je ta de c réd ito (455 fo rm a to s de p é p tid o /ta rje ta ) con un a d iso lu c ió n 0 ,5 m M de m o lde de C L IP S ta l co m o 1 ,3 -b is (b ro m o m e til)b e n ce n o en b ica rb o n a to de a m o n io (20 m M , pH 7 ,9 )/a ce to n itrilo (1 :1 (v /v )). Las ta r je ta s se a g ita ro n su a ve m e n te en la d iso lu c ió n d u ra n te 30 a 60 m in u tos m ien tras q u e se cub rie ro n c o m p le ta m e n te en d iso lu c ió n . F ina lm en te , las ta r je ta s se lava ron a m p lia m e n te con exce so de H 2 O y se son ica ron en ta m p ó n de ro tu ra que c o n te n ía 1 p o r c ie n to de SD S /0 ,1 p o r c ie n to de b e ta -m e rca p to e ta n o l en PBS (pH 7 ,2 ) a 70 °C d u ra n te 30 m inu tos , se g u id o p o r so n ica c ió n en H 2 O d u ra n te o tro s 45 m inu tos . S e p ro bó la un ión de an ticu e rp o a c a d a p é p tid o en un E L IS A b a sad o en P E P S C A N . Las ta r je ta s de p o lip ro p ile n o de fo rm a to de ta r je ta de c ré d ito de 455 po c illo s q u e co n ten ían los p é p tid o s co va le n te m e n te u n id os se in cub a ron con d iso lu c ió n de a n ticue rpo p rim ario , p o r e jem p lo , q u e c o n s is tía en 1 m ic ro g ra m o /m l d ilu id a en d iso lu c ió n de b lo q u e o llam ad a S Q (4 % de sue ro de cab a llo , 5 % de o vo a lb ú m in a (p/v) en PBS/1 % de T w ee n o d ilu id a en PBS p o r e je m p lo , 20 % de S Q ) d u ra n te la noche . D e spu és de lavar, los p é p tid o s se in cub a ron con una d iluc ión 1 /1000 de p e ro x id a sa de c o n e jo a n ti-a n ticu e rp o h u m an o o p e ro x id a sa de ca b ra -a n ti-F a b hu m an o d u ra n te u n a ho ra a 25 °C. D e spués de lavar, se añ ad ie ro n el sus tra to de p e ro x id a sa s u lfo n a to de 2 ,2 '-a z in o -d i-3 -e tilb e n z o tia z o lin a (A B TS ) y 2 m ic ro litros de 3 p o r c ie n to de H2 O 2. D e spu és de una hora, se m id ió el d e sa rro llo de co lo r. El d e sa rro llo de c o lo r se cu a n tif icó con u n a cá m a ra con d isp o s itivo de ca rg a a co p la d a (C C D ) y un s is te m a de p ro ce sa m ie n to de im á g e n e s (com o se d e sc rib ió en p r im e r lu g a r en S lo o ts tra e t al., 1996).
C á lcu lo d e da tos
D atos sin p ro cesa r: D e ns id ad ó p tica (un id ade s a rb itra ria s de DO)
Los d a to s sin p ro ce sa r son va lo re s óp tico s o b te n id o s p o r u n a cá m a ra de C C D . Los va lo re s va ría n p rin c ip a lm e n te d e sd e 0 ha s ta 3000 , u n a e sca la lo g a rítm ica s im ila r a 1 a 3 de un le c to r de E L IS A e s tá n d a r de p laca s de 96 poc illos . P rim e ro , la cá m a ra de C C D hace u n a fo to de la ta r je ta an tes de la co lo ra c ió n de la p e ro x id a sa y luego o tra v e z una fo to d e sp u é s de la co lo ra c ió n de pe ro x id a sa . E stas do s fo to s se res tan e n tre s í da nd o co m o resu ltad o los d a to s que se de n o m in a n d a to s sin p ro cesa r. É stos se cop ia n en la ba se de da tos P ep lab tm. E n to nces se cop ia n los va lo re s en e xce l y e s te a rch ivo se m arca co m o a rch ivo de d a to s sin p ro cesa r. Se pe rm ite u n a m a n ip u la c ió n de seg u im ien to . A lg u n a s ve ce s un po c illo co n tie n e u n a b u rb u ja de a ire da n d o co m o resu lta d o un v a lo r po s itivo fa lso , las ta r je ta s se in spe cc ion an m a n u a lm e n te y c u a lq u ie r v a lo r ca u sa d o po r u n a b u rb u ja de a ire se p u n tú a co m o 0.
N o rm a lm e n te , los e n sa yo s no se hacen p o r d u p lica d o (so lo tra s pe tic ión de l c lien te ). Las p ru e b a s p o r d u p lica d o son n o rm a lm e n te m uy s im ila re s . A d e m á s , el co n ju n to de d a to s de m iles de pé p tid o s co n tie n e m uch os pé p tid o s q u e son s im ila re s , a s í los resu ltad os nu n ca se basan en e l re co n o c im ie n to de un pép tido , s ino en fa m ilia s de pé p tid os s im ila re s . Si uno o a lg u n o s pé p tid o s no se unen , o p re sen ta n un ión m ás ba ja , en un e xp e rim e n to du p licad o , n o rm a lm e n te no se a tr ib u ye a u n a m ap eo de e p íto p e s d ife ren te .
T im m e rm a n e t al. (2007). F unc tiona l reco ns truc tio n and syn th e tic m im ic ry o f a co n fo rm a tio n a l e p ito p e us ing C L IP S ™ te ch n o lo g y . J. M ol. R ecogn it. 20 :283 -99
S lo o ts tra e t al. (1996). S truc tu ra l asp ec ts o f a n tib o d y -a n tig e n in te rac tio n reve a led th ro u g h sm a ll random pe p tide lib ra ries , M o le cu la r D ivers ity , 1 ,87 -96.
E JE M P L O 9: A n á lis is de s e cu e n c ia s de pC al de d ife re n te s esp e c ie s
T o d a las s e cu e n c ia s d isp o n ib le s de pC a l se o b tu v ie ro n de ba ses de d a to s p ú b lica s y se a lin e a ro n u sa nd o C lu s ta lW y las reg io nes se resa lta ro n ba sá n d o se en la acce s ib ilid a d de l d iso lve n te , e l co n ta c to con un in h ib id o r de K un itz de s itio a c tivo y los pé p tid o s id e n tifica d o s po r a n á lis is de C L IP S (F IG U R A S 10 A -10 C ). S e o b tu vo p la sm a c itra d o de c a d a u n a de e s ta s e sp e c ie s y se a c tivó u sa nd o un a c tiva d o r de p re ca lic re ín a co m e rc ia lm e n te d isp o n ib le (de E nzym e R esea rch La b o ra to rie s ) según las in s tru cc io n e s de l fa b rica n te . E n to nces se m id ió la ac tiv ida d de la c a lic re ín a en c a d a u n a de las m u e s tra s en p re se n c ia o a u se n c ia de X 81 -B 01.
Se e n co n tró q u e X 81-B 01 in h ib ió pC a l de to d a s las e sp ec ies , e xce p to pC al de ce rd o . P uesto q u e el an á lis is de C L IP S id e n tifica cu a tro p é p tid o s de pC a l a los q u e se une X 81-B 01 - C 2 (p o s ic io n e s 81 -94 ), C 3 (p o s ic io n e s 101 ­ 108), C 5 (p o s ic io n e s 162-178) y C 6 (p o s ic io n e s 186-197) - se e xa m in a ro n las d ife re n c ia s en la se cu e n c ia de pC a l de ce rd o que c o rre sp o n d e n a es to s p é p tid o s pa ra id e n tifica r po s ib les ca m b io s de a m in o á c id o s q u e e xp lica n la fa lta de inh ib ic ión de pC a l de ce rd o p o r X 81 -B 01. Los pé p tid o s C2 y C 3 e s tá n p ró x im o s en la s e c u e n c ia y am b os son a lta m e n te s im ila re s en s e cu e n c ia e n tre las d ife re n te s e sp ec ies . S in em b a rg o , e x is te u n a d ife re n c ia en la pos ic ión 479. T oda s las esp ec ies , e xce p to ce rdo , ran a y pe rro , tie n e n u n a se rin a en la po s ic ió n 479. La s e c u e n c ia de pC a l de ran a y pe rro t ie n e un a a la n in a y u n a tre o n in a en la po s ic ió n 479 , resp e c tiva m e n te ; am b as de las cu a le s se c o n s id e ra n su s titu c io n e s co n s e rv a tiv a s pa ra una se rina . A d ife ren c ia , la se cu e n c ia de pC a l de ce rd o tie n e una le u c in a en la po s ic ió n 479, q u e es una sus titu c ión c o n s id e ra b le m e n te m en os co n s e rv a tiv a pa ra una se rina . El pé p tid o C 5 en pC a l de ce rd o es a lta m e n te s im ila r a las s e cu e n c ia s de las o tra s e sp ec ies . S in em b a rg o , en la po s ic ió n 563, so lo en la pC a l de ce rd o e s tá p re se n te u n a h is tid in a (ne g rita en la F IG U R A 10 C ). E sta po s ic ió n en to d a s las o tras e sp ec ies , e xce p to rana, es u n a tiro s in a . En la pC a l de rana, q u e se inh ibe p o r X 81 -B 01 , e s ta po s ic ió n es u n a tre o n in a . El p é p tid o C 6 en pC a l de ce rd o es o tra ve z a lta m e n te s im ila r a las o tra s secu en c ias . S in em b a rg o , so lo en la s e cu e n c ia de pC al de ce rd o es la po s ic ió n 585 un g lu ta m a to (en n e g rita en la F IG U R A 10 C ). En to d a s las o tra s e sp ec ies , e s ta po s ic ió n es un a sp a rta to . Este an á lis is pu e d e in d ica r res tos p o s ib le m e n te c rítico s en pC a l que in te ra cc io n a n con X 81 -B 01.
E JE M P L O 10: E nsa yos in v itro e in v ivo pa ra e v a lu a r la e fic a c ia de un a p ro te ín a de un ión a c a lic re ín a p lasm á tica .
U n ión a p re e a lie re ín a fre n te a o a lie re ín a : Se puede demostrar experimentalmente la ventaja de un anticuerpo inhibidor de pCal que no se une a precalicreína con respecto a un anticuerpo que se une a precalicreína. Por ejemplo, se puede diseñar un experimento in v itro para comparar la potencia de un inhibidor de anticuerpo contra pCal que no se une a precalicreína (por ejemplo, DX-2922) con uno que se une a precalicreína (por ejemplo, M6-D09) usando el ensayo del tiempo de coagulación de plasma tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT). El ensayo de APTT induce la coagulación en plasma mediante la adición de un reactivo que activa específicamente el componente del sistema de contacto de la vía de coagulación intrínseca, de la que participa la actividad de pCal. Se conoce bien en la bibliografía que la inhibición de pCal o que una deficiencia genética en pCal conduce a aPPT prolongada (véase, por ejemplo, Morishita, H., et al., Thromb Res, 1994. 73 (3-4): p. 193-204; Wynne Jones, D., et al., Br J Haematol, 2004. 127 (2): p. 220-3). Se puede realizar un experimento in v itro para medir el efecto de enriquecer plasma humano citrado con diferentes concentraciones de cualquiera de M6-D09 o DX-2922 sobre los tiempos de coagulación observados inducidos usando reactivos de APTT comercialmente disponibles y un analizador de la coagulación (Tabla 13). Se espera que la CE50 observada para la prolongación de APTT de M6-D09 sea significativamente superior a la de DX-2922 debido a la unión de M6-D09 a la precalicreína de alta concentración (~500 nM) en la muestra de plasma normal. La eficacia del anticuerpo inhibidor de pCal como se demuestra por el prolongado APTT soporta el posible uso terapéutico del anticuerpo en el tratamiento o la prevención de enfermedad cardiovascular asociada a la aberrante formación de coágulos, tal como se puede observar en aterosclerosis, accidente cerebrovascular, vasculitis, aneurisma y pacientes implantados con dispositivos de asistencia ventricular.
Tabla 13: Diseño del estudio para medir el efecto de inhibidores de anticuerpos de pCal sobre APTT
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E fic a c ia en un m o d e lo d e ra ta d e e d e m a : También se puede realizar un experimento in v ivo para demostrar el aumento de potencia de un anticuerpo inhibidor de pCal que no se une a precalicreína. El modelo de edema en la pata inducido por carragenina (CPE) de edema en ratas es un modelo de farmacología común. Se tratará un grupo de ratas con dosis crecientes de M6-D09 y DX-2922 por inyección intraperitoneal (IP) antes de inyectar carragenina (por ejemplo 0,1 ml de una disolución al 10 % p/v) en las patas de las ratas (Tabla 14). Se espera que DX-2922 sea más eficaz en reducir la inflamación de la pata observada que M6-D09. La eficacia del anticuerpo respalda el uso terapéutico del anticuerpo en diversas enfermedades inflamatorias que están asociadas con cualquier inflamación (por ejemplo, angioedema hereditario, edema inducido por accidente cerebrovascular, edema cerebral) o inflamación mediada por bradiquinina y dolor (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino).
Tabla 14: Diseño del estudio para observar el efecto de inhibidores de anticuerpos sobre CPE
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(con tinu ac ió n )
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M ed ic ió n d e la s e m iv id a : S e d e te rm in a rá n las p ro p ie d a d e s fa rm a c o c in é tic a s de D X -2922 en ra tas y m onos c in o m o lg o s en un d ise ñ o de l e s tu d io b re ve m e n te e xp u e s to en la T a b la 15. El sue ro se reco g e rá en los m o m e n tos in d ica do s tra s la inyecc ión IV de D X -2922. S e d e te rm in a rá la co n ce n tra c ió n de D X -2922 p o r E L IS A y se re p re se n ta rá fre n te al t ie m p o con el fin de o b te n e r p a rá m e tro s fa rm a c o c in é tic o s (e lim in a c ió n , se m iv id a , v o lu m e n de d is tr ib u c ió n , e tc .). Se e s p e ra q u e D X -2922 te n g a u n a s e m iv id a s u p e rio r a 5 d ía s en m on os c in o m o lg o s que a u m e n ta rá a u n a s e m iv id a s u p e rio r a 7 d ía s en se re s hum anos.
T a b la 15: Un e s tu d io fa rm a c o c in é tic o de in h ib id o r de c a lic re ín a p la sm á tica pC a l a d m in is tra d o p o r las v ías in tra ve n o sa y s u b c u tá n e a a m on os c in om o lgo s .
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E JE M P L O 11: M apeo de e p íto p e s u sa nd o m u ta c io n e s de a m in o á c id o s de pC al
B a sá nd ose en los e s tu d io s de m ap eo de e p íto p e s d e sc rito s en e l p re se n te d o cu m e n to en e l E jem p lo 8, los p re se n te s in ven to res in sp e cc io n a ro n e l m od e lo tr id im e n s io n a l p u b lica d o en la base de d a to s de p ro te ín a s R C S B (d isp o n ib le en in te rne t en rcsb .o rg ; pdb cod e 2A N Y ) y se iden tificó una co le cc ió n de co n ju n to s am in o á c id o s en bu c le s a cce s ib le s a la sup e rfic ie ce rca de l s itio a c tivo e n z im á tico q u e los p re se n te s in ven to res razo na ron que pod rían in te ra c c io n a r con la un ión de l a n ticu e rp o da nd o co m o resu ltad o la in h ib ic ión e n z im á tica . E stos am ino ác id os se su s titu ye ro n p o r a la n in a y e l d o m in io ca ta lítico de c a d a uno de los m u tan tes se exp re só en P ich ia p a s to r is con u n a fu s ió n de m arca H is y se p u rif icó p o r IM AC . S e s in te tiza ro n cu a tro m u tan tes de pC a l m u ta n te s d ife re n te s y se p ro ba ron :
M u tan te 1: S e m u ta ron los am in o á c id o s S 478, N 481 , S 525 y K 526 de la se cu e n c ia de c a lic re ín a hu m an a (N° de acce so N P _ 00883.2 ) a a lan ina . S e d e te rm in ó q u e e s to s a m in o á c id o s e s ta ban im p lica do s en el re co n o c im ie n to de sus tra to (sub s itio S3).
M u tan te 2: S e m u ta ron los res tos de a m in o á c id o s R551, Q 553, Y 555, T 558 y R 560 de la s e cu e n c ia de ca lic re ín a h u m a n a (N° de acce so N P _ 00883.2 ) a a lan ina . S e d e te rm in ó q u e es to s res tos pa rtic ip a b a n en el re co n o c im ie n to de sus tra to de s itio a c tivo (sub s itio S1 ’).
M u tan te 3: S e m u ta ro n los a m in o á c id o s D 572, K 575 y D 577 de la se cu e n c ia de c a lic re ín a hu m a n a (N° de acceso N P _ 00883.2 ) a a lan ina . E stos res tos de a m in o á c id o s pa rtic ip an en el re co n o c im ie n to de sus tra to (sub s itio S 1 ’) M u tan te 4: S e m u ta ro n los a m in o á c id o s N 395 , S 397 y S 398 de la s e cu e n c ia de ca lic re ín a hu m a n a (N° de acce so N P _ 00883.2 ) a a lan ina . E stos res tos es tá n d is ta le s de l s itio a c tivo de ca lic re ín a p lasm á tica .
T res de los 4 m u ta n te s (M u tan te 1 ,2 y 4) tie n e n ac tiv id a d s im ila r a la de l d o m in io ca ta lítico no m u tan te de pC a l. Las su s titu c io n e s de a m in o á c id o s en el M u tan te 3 d ie ro n un a p ro te ín a in ac tiva q u e no fu e re co n o c id a en los e n sa yo s de un ión S P R (B ia co re ) p o r n ing uno de los a n ticu e rp o s an ti-pC a l p robados .
Los a n ticu e rp o s p ro ba dos pa ra la in h ib ic ión de los m u ta n te s 1, 2 y 4 se m ue stra n en e l p re se n te d o cu m e n to en la T a b la 16. B a sá n d o se en los va lo re s de Ki,ap m ed id os pa ra los a n ticu e rp o s en e l G ru p o 1 (es de c ir, los an ticu e rp o s q u e inh iben pC a l hu m a n a y de ra tón , pe ro no se unen a p re ca lic re ín a ), es e v id e n te q u e es te g ru p o de a n ticu e rp o s se une al e p íto p e en pC a l q u e co n tie n e los am in o á c id o s q u e se m u ta ro n en e l M u ían te 2, pe ro no de p e n d ía n de restos m u ta d o s en los M u tan tes 1 o 4. A d e m á s , la in te racc ión de p ro te ínas de un ión a c a lic re ín a p la sm á tica X 81 -B 01 /X 101 -A 01 /D X -2922 y e l d e riva d o m a d u ra d o po r a fin id ad X 115 -B 07 con c a lic re ín a se a fe c ta a d ve rsa m e n te p o r las s u s titu c io n e s en el M u tan te 1. P ara un e je m p lo de las d ife re n c ia s en la ca p a c id a d de los a n ticu e rp o s pa ra un irse a p re ca lic re ín a , vé a n se , p o r e jem p lo , la F igu ra 11a y 11B, q u e c o m p a ra pa ra p re ca lic re ín a la un ión de D X -2922 (G rupo 1) con la de M 6-D 09 (G rupo 3).
Los a n ticu e rp o s en el G rupo 2 (es de c ir, los que inh iben pC a l hum ana , no pC a l de ra tón y no se unen a p re ca lic re ín a ) no e s tu v ie ro n s ig n ifica tiva m e n te a fe c ta d o s p o r los a m in o á c id o s m u tados , qu e in d ica q u e hacen co n ta c to con a m in o á c id o s a lte rna tivos . Es p ro b a b le q u e los a n ticu e rp o s de l G rupo 2 se unan ce rc a de l s itio activo , ya q u e fue ro n in cap aces de un irse a pC a l co m p le ja d o con un d o m in io de K un itz (E P I-K A L2 ), que se sab e q u e se unen en e l s itio a c tivo de una se rin a p ro te asa . A d e m á s , uno de los a n ticu e rp o s en el G rupo 2 (M 145 -D 11 ) es s im ila r a a q ue llo s en el G ru p o 1 p o r q u e es in cap az de u n ir pC al en un e n sa yo de B ia co re qu e se in ac tiva con el in h ib id o r s u ic id a A E B S F (c lo rh id ra to de flu o ru ro de 4 -(2 -a m in o e til)b e n ce n o su lfo n ilo ), q u e es una in h ib id o r co va le n te de m o lé cu la p e q u e ñ a de se rin a p ro te a sa s de tipo tr ip s in a (F igu ra 12). S in em b a rg o , el o tro an ticu e rp o (M 29 -D 09 ) as ig n a d o al G rupo 2 fu e ca p a z de un irse a pC a l in a c tiva d a con A E B S F , que in d ica que se pu ed e u n ir a un e p íto pe d ife re n te de M 145 -D 11 a p e sa r de c o m p a rtir p ro p ie d a d e s de un ión s im ila res .
Los a n ticu e rp o s en el G rupo 3 in h ib ie ron pC al h u m an a y de ra tón , pe ro se un ie ron a p re ca lic re ín a . U no de es to s an ticu e rp o s , M 6-D 09 , fue in cap az de un irse a pC al in a c tiva d a p o r E P I-K A L2 o A E B S F , qu e in d ica que es te g ru p o de in h ib id o re s de pC a l in te ra cc io n a con am in o á c id o s a lte rn a tivo s ce rc a de l s itio ac tivo . La Ki,ap pa ra M 6-D 09 au m en tó a p ro x im a d a m e n te 5 ve ce s hac ia el M u tan te 2 (es de c ir, d ism in u yó la p o te n c ia de M 6-D 09).
E JE M P L O 12: M ad u ra c ión p o r a fin idad
A d e m á s de la m ad u ra c ión po r a fin id ad d e s c rita en el p re se n te d o cu m e n to en los E jem p los 4 y 5, q u e im p licó la o p tim iza c ió n de la ca d e n a lige ra , los p re se n te s in ve n to re s in te n ta ro n o p tim iz a r a d e m á s la a fin id ad con b ib lio teca s q u e va ría n los a m in o á c id o s en las reg io nes C D R 1, C D R 2 y C D R 3 de la ca d e n a p e sa d a va ria b le de do s an ticu e rp o s an ti-p C a l p a re n ta le s d ife ren te s . A m b o s de los a n ticu e rp o s s e le cc io n a d o s pa ra la o p tim iza c ió n ad ic io na l (X 63 -G 06 y M 162 -A 04 ) p re sen ta n p ro p ie d a d e s d e se a b le s pa ra el d e sa rro llo ad ic io n a l co m o in h ib id o r de an ticu e rp o te ra p é u tico de c a lic re ín a p la sm á tica ; in c luye nd o las p ro p ie d a d e s : a) inh ib ic ión co m p le ta de ca lic re ín a p la sm á tica h u m a n a y de ro e d o r y b) n in g u n a un ión a p re ca lic re ín a . En a lg u n a s rea liza c io nes , la inh ib ic ión c o m p le ta de pC a l hu m a n a es e se n c ia l pa ra b lo q u e a r la ac tiv ida d de c a lic re ín a p la sm á tica en los usos de en fe rm ed ad . La in h ib ic ión de pC a l de ro e d o r fa c ilita e l d e sa rro llo p re c lín ico q u e in c luye e v a lu a c ió n de la to x ic id a d . La fa lta de un ión a p re ca lic re ín a es una p ro p ieda d a lta m e n te d e se a b le p a ra un an ticu e rp o in h ib id o r de pC a l pa ra m a x im iza r la b io d isp o n ib ilid a d de l an ticu e rp o te ra p é u tico hac ia la d ia n a de pC a l a c tiva y pa ra re d u c ir p o s ib le m e n te la do s is req u e rid a pa ra la e ficac ia .
S e rea lizó m ad u ra c ión p o r a fin id ad u sa nd o 4 b ib lio te ca s de p re se n ta c ió n en fa g o s d ife re n te s . P ara ca d a a n ticue rpo p a ren ta l (po r e jem p lo , I62 -A 04), se co n s tru yó una b ib lio te ca qu e c o n te n ía p o s ic io n e s de a m in o á c id o s v a ria d a s en ta n to CDR1 co m o C D R 2 de la ca d e n a pesada . S e co n s tru yó un a b ib lio te ca ad ic io n a l pa ra c a d a uno de los dos a n ticu e rp o s p a re n ta le s en los q u e se va ria ro n las po s ic io n e s en la C D R 3 de la ca d e n a pesada . C a d a u n a de es to s 4 b ib lio te ca s de p re se n ta c ió n en fa g o s se s e le cc io n ó (in m u n o p u rificó ) con ca n tid a d e s d e c re c ie n te s de pC al a c tiva en c a d a ron da p o s te r io r con el fin de o b te n e r a n ticu e rp o s de a lta a fin idad . P ara m in im iza r la ap a ric ió n de un ión a p re ca lic re ín a en el an ticu e rp o se le cc io n a d o , se ag o ta ro n in ic ia lm e n te las b ib lio te ca s de sa lid a en p re ca lic re ín a in m ov iliza da . D e spués de c r ib a r co m o fra g m e n to s Fab, los p re sen te s in ven to res d e scu b rie ro n los an ticue rpos m a d u ra d o s p o r a fin idad m os tra d o s en la T a b la 16 (es dec ir, los a n ticu e rp o s con e l n ú m ero de id en tificac ió n que e m p ie za con “X 115 ”).
S e e n co n tró que cu a tro a n ticu e rp o s d e scu b ie rto s (X 115 -B 07 , X 115 -D 05 , X 115 -E 09 y X 115 -H 06 ) q u e de riva n de l an ticu e rp o p a ren ta l D X -2922 (tam b ién c o n o c id o co m o X 63 -G 06 co m o un fra g m e n to Fab, X 81-B 01 com o una IgG p ro d u c id a en cé lu la s 293T , o X 101 -A01 co m o u n a IgG p ro d u c id a en cé lu la s C H O ) e ran p o te n te s in h ib id o re s de pC a l. P ara la c o m p a ra c ió n , se m u e s tra la se cu e n c ia de am in o á c id o s de D X -2922. Es e v id e n te que tre s de los an ticue rpos m a d u ra d o s p o r a fin id ad (X 115-B 07 , X 115-E 09 y X 115-H 06 ) co n tie n e n m u ta c io n e s en H v-C D R 3 ; m ie n tras qu e X 115-D05 t ie n e H v -C D R 1 /C D R 2 d ife re n te . C u a tro o tros a n ticu e rp o s d e scu b ie rto s (X 115-F 02 , X 115 -A 03 , X 115-D 01 y X 115 -G 04 ) de riva n de l an ticu e rp o p a ren ta l M 162 -A 04. Los 8 a n ticu e rp o s m a d u ra d o s p o r a fin id ad no se unen a p re ca lic re ína .
T a b la 16: R esum en de las c o n s ta n te s de inh ib ic ión de a n ticu e rp o s an ti-p C a l m ad u ra dos p o r a fin id ad (K i,ap ) en el d o m in io ca ta lítico de pC a l no m u tan te y los M u tan tes 1 ,2 y 4 a
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(con tinu ac ió n )
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M e d ic io n e s d e K,ap e n e q u il ib r io . Se m id ie ron las c o n s ta n te s de in h ib ic ión a p a re n te (va lo res de K¡,ap) po r p re in cu b a c ió n de d iso lu c io n e s de e n z im a e in h ib id o r an tes de in ic ia r las re a cc io n e s con sus tra to . S e p re in cu b a ro n la e n z im a y el in h ib id o r d u ra n te 2 ho ras a 30 °C en una p la ca de 96 po c illo s a ñ a d ie n d o 10 pl de 10X d iso lu c ió n de e n z im a y 10 pl de 10X d iso lu c io n e s de in h ib id o r a 70 pl de tam pó n de reacc ión . Las rea cc io n e s se in ic ia ron m ed ia n te la ad ic ió n de 10 pl de 10X re se rva co n c e n tra d a de sus tra to , y se m o n ito riza ro n a 30 °C en un le c to r de p la ca s de flu o re s c e n c ia con las lo ng itude s de o n d a de e xc ita c ió n y de em is ión e s ta b le c id a s a 360 nm /460 nm, re sp e c tiva m e n te . S e ad qu ir ie ron los d a to s c in é tico s po r el a u m e n to en la flu o re sce n c ia , y las ta sa s in ic ia le s p a ra ca d a co n d ic ió n se re p re se n ta ro n c o n tra la co n ce n tra c ió n de in h ib id o r to ta l. Los d a to s se a ju s ta ro n a la s ig u ie n te e cu ac ión p a ra in h ib id o re s de un ión fue rte s :
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D onde A = ta sa in ic ia l o b s e rv a d a a ca d a co n ce n tra c ió n de in h ib id o r; Ao = ta s a in ic ia l o b s e rv a d a en a u s e n c ia de in h ib id o r; Ainh = ta s a in ic ia l o b se rva d a p a ra el co m p le jo de in h ib id o r e n z im á tico ; Inh = co n ce n tra c ió n de in h ib id o r; E = co n ce n tra c ió n e n z im á tic a to ta l ( tra ta d a co m o un p a rá m e tro p ro p u e s to ); y Ki,ap = co n s ta n te de in h ib ic ión en eq u ilib rio ap a re n te .
G ru p o s d e in h ib id o r e s d e a n t ic u e r p o . Los a n ticu e rp o s en el G rupo 1 inh iben pC a l hu m a n a y de ratón , pe ro no se unen a p re ca lic re ína . Los a n ticu e rp o s en el G rupo 2 inh iben pC a l hum an a , pe ro no de ra tón , y no se unen a p re ca lic re ín a . Los a n ticu e rp o s en el G rupo 3 inh iben la pC a l h u m a n a y de ra tón pe ro se unen a p re ca lic re ína .
A n á l is is d e c o m p e t ic ió n B ia c o r e c o n u n a n t ic u e r p o c o n tr a c a l ic r e ín a a m o d o d e e je m p lo , e p i-K a l2.
E p i-K a l2 es un in h ib id o r de a n ticu e rp o s de c a lic re ín a que a c tú a u n ié ndo se al s itio ac tivo de c a lic re ín a (pa ra la s e c u e n c ia vé a se el E jem p lo 8). El a n á lis is de co m p e tic ió n B ia co re se usa en el p re se n te d o cu m e n to co m o un e n sayo p a ra d e te rm in a r si un a n ticu e rp o c o n tra c a lic re ín a de p ru e b a se une al m ism o s itio qu e ep i-K a l2 y se e va lú a m id ien do la co m p e tic ió n (po r e jem p lo , d e sp la za m ie n to ) en tre ep i-K a l2 y el an ticu e rp o de p ru e b a p a ra un irse al s itio ac tivo .
Se in m o v ilizó IgG e s p e c ífic a a n ti-F c h u m an o de c a b ra o IgG a n ti-F a b h u m an o po r a co p la m ie n to de a m in a en un ch ip se n so r C M 5 a d e n s id a d e s de in m o v iliza c ió n de a p ro x im a d a m e n te 5000 UR. S e ca p tu ra ro n los a n ticu e rp o s an ti-pC a l o sF ab sob re sus su p e rfic ie s re sp e c tiva s in ye c ta n d o una d iso lu c ió n 50 nM de IgG /sF ab d u ra n te 1-2 m in u to s a 5 a p l/m in . S e in yec ta ro n pC a l hu m a n a (100 nM ) o c o m p le jo de pC a l h u m a n a -e p -ka l2 (hpK a l 100 nM qu e se hab ía p re in cu b a d o con ep i-ka l2 1 pM d u ra n te 1 ho ra a te m p e ra tu ra a m b ie n te ) sob re las IgG c a p tu ra d a s o sF ab d u ra n te 5 m in u to s a 20 -50 p l/m in seg u ido po r un a fase de d iso c ia c ió n de 5 -10 m inu tos . Las re sp u e s ta s de un ión se reg is tra ron al fina l de la fase de a so c ia c ión . Se c o n s id e ra ro n IgG o sF ab an ti-pC a l qu e co m p e tía n con ep i-ka l2 p a ra un irse a pC a l hu m a n a si la un ión de l c o m p le jo p C a l-e p i-ka l2 a los a n ticu e rp o s a n ti-p C a l e ra s ig n ifica tiva m e n te re d u c id a (> 70 % ) en c o m p a ra c ió n con un a in yecc ió n de hpK a l so lo . La sup e rfic ie de l ch ip se n so r se reg en e ró con un pu lso de g lic in a 10 m M a pH 1,5 a un cau da l de 100 p l/m in . Las m e d ic io n e s se rea liza ron a 25 °C u sa nd o H B S -P (H E P E S 10 m M a pH 7,4 , N aC l 150 m M y 0 ,005 % de te n s io a c tivo P20) co m o ta m p ó n de e le c tro fo re s is . Los re su lta d o s del an á lis is de co m p e tic ió n B iaco re p a ra ep i-K a l2 se m ue stra n en el p re se n te d o cu m e n to en las F igu ras 11A y 11B.
A n á l is is d e c o m p e t ic ió n B ia c o r e c o n e l in h ib id o r c a l ic r e ín a d e m o lé c u la p e q u e ñ a , A E B S F .
A E B S F (es dec ir, c lo rh id ra to de flu o ru ro de 4 -(2 -a m in o e til)b e n c e n o s u lfo n ilo ) es un in h ib id o r de m o lé cu la p e q u e ñ a de ca lic re ín a . S e usa en el p re se n te d o cu m e n to el an á lis is de c o m p e tic ió n B ia co re pa ra d e te rm in a r si un a n ticu e rp o de p ru e b a se une al m ism o s itio (o un s itio de so la p a m ie n to ) u tilizad o po r A E B S F p a ra la in h ib ic ión de ca lic re ín a .
Se in m o v ilizó IgG e s p e c ífic a a n ti-F c h u m an o de c a b ra o IgG a n ti-F a b h u m an o po r a co p la m ie n to de a m in a en un ch ip se n so r C M 5 a d e n s id a d e s de in m o v iliza c ió n de a p ro x im a d a m e n te 5000 UR. S e c a p tu ra ro n IgG o sF ab an ti-pC a l sob re sus su p e rfic ie s re sp e c tiva s in ye c ta n d o una d iso lu c ió n 50 nM de Ig G /sF a b d u ra n te 1-2 m in u tos a 5 a p l/m in . Se in yec ta ro n pC a l h u m a n a (100 nM ) o c o m p le jo de pC a l h u m a n a -A E B S F (hpK a l 100 nM qu e se h a b ía p re tra ta d o con A E B S F 1 m M d u ra n te 1 ho ra a te m p e ra tu ra am b ie n te ) sob re las IgG o sF ab c a p tu ra d o s d u ra n te 5 m in u to s a 20 ­ 50 p l/m in seg u id o po r un a fase de d iso c ia c ió n de 5 -10 m inu tos . Las re sp u e s ta s de un ión se reg is tra ro n al fina l de la fa se de a so c ia c ión . S e co n s id e ra ro n IgG o sF ab an ti-pC a l que co m p e tía n con A E B S F p a ra un irse a pC a l h u m a n a si la un ión de l c o m p le jo pC a l-A E B S F a los a n ticu e rp o s an ti-pC a l e ra s ig n ifica tiva m e n te re d u c id a (> 70 % ) en c o m p a ra c ió n con un a inyecc ión de hpK a l so lo . La sup e rfic ie de l ch ip se n so r se reg en e ró con un pu lso de g lic in a 10 m M a pH 1,5 a un cau da l de 100 p l/m in . Las m e d ic io n e s se rea liza ron a 25 °C usando H B S -P (H E P E S 10 m M a pH 7,4, N aC l 150 m M y 0 ,005 % de te n s io a c tivo P20) co m o ta m p ó n de e le c tro fo re s is . Los re su lta d o s de l an á lis is de co m p e tic ió n B ia co re p a ra A E B S F se m ue stra n en el p re se n te d o cu m e n to en la F igu ra 12.
Lo s ig u ie n te son las s e cu e n c ia s p a ra las reg io nes v a ria b le s de la c a d e n a lig e ra (LV) y reg io nes va r ia b le s de la c a d e n a p e sa d a (H V) p a ra 8 a n ticu e rp o s an ti-pC a l m a d u ra d o s po r a fin id a d a m odo de e jem p lo
55 9A-M0029-DO 9 -L V
QSALTQPPTVSVSPGQTARITCSGNKLGDKYVAWYQQKPGQSPMLVIYQDTKRPSRVSERFSGSNSANTAT LSISGTQALDEADYYCQAWDSSIVIFGGGTRLTVL
559 A - M 0145 - D 11 - L V
QSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYTSWYQQRPGQSPVLVIYQDIKRPSGIPERFSGSNSGNTAT LTISGTQAMDEADYYCQAWDSPNARVFGSGTKVTVL
55 9A -M 0162 -A 0 4 -LV
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK
5 59 A - X 0101 -A O 1 -LV
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK
55 9 A - X 0115 -AO 3 -L V
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - B 07 - L V
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - D 01 - L V
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - D 05 - L V
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - E 09 - L V
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - F 02 - L V
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - G 04 - L V
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEF TLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK
559 A - X 0115 - H 06 - L V
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTD FTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK
559 A - M 0006 - D 09 - L V
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRNYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASTLQSGVPARFSGSGSGTDF TLTISSLQPEDFATYYCQQLSGYPHTFGQGTKLEIK
5 59A-M0035 - G 04 - L V
QDIQMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPRGFTFGPGTKVDIK
559 A - M 0029 - D 09 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYTMVWVRQAPGKGLEWVSYIYPSGGATFYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMGSYDYIWGFYSDHWGQGTLVTVSS
559 A - M 0145 - D 11 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYRMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGRTVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDKFEWRLLFRGIGNDAFDIWGQGTMVTVSS
5 59 A -M 0162 -A 04 -HV
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWGQGTMVTVSS
5 59 A - X 0101 -A O 1 -HV
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLVTVSS
55 9 A - X 0115 -AO 3-H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAWRRIGVPRRDSFDMWGQGTMVTVSS
559 A - X 0115 - B 07 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMVGQGIRGRSRTSYFAQWGQGTLVTVSS
559 A - X 0115 - D 01 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMHWVRQAPGKGLEWVSSIYPSRGMTWYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWGQGTMVTVSS
559 A - X 0115 - D 05 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMAWVRQAPGKGLEWVSSIVPSGGHTHYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLVTVSS
559 A - X 0115 - E 09 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGIAARSRTSSVDQWGQGTLVTVSS
55 9 A - X 0115 - F 02 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVSS
559 A - X 0115 - G 04 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGVPRRDEFDIWGQGTMVTVSS
559 A - X 0115 - H 06 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGISARSRTSYFDYWGQGTLVTVSS
559 A - M 0006 - D 09 - H V
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSFYYMVWVRQAPGKGLEWVSVIYPSGGITVYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDKWAVMPPYYYYAMDVWGQGTTVTVSS
5 59A-M0 O 35 -GO 4 -HV
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYHMSWVRQAPGKGLEWVSVISPSGGSTKYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGSSDYAWGSYRRPYYFDYWGQGTLVTVSS
5 59A -M 0029 -D O 9 LV
CAGAGCGCTTTGACTCAGCCACCCACAGTGTCTGTGTCCCCAGGACAGACAGCCAGGATCACCTGCTCTGG AAATAAATTGGGGGATAAATATGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGTCCCCTATGTTGGTCATCT ATCAAGATACTAAGCGCCCCTCAAGAGTTTCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGCGAATACAGCCACT CTGTCCATCAGCGGGACCCAGGCTCTGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGCAGCATTGT GATCTTCGGCGGAGGGACCAGGCTGACCGTCCTA
55 9 A -M 0145 - D I 1 LV
CAGAGCGTCTTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCCGTGTCTCCAGGACAGACAGCCAGCATCACCTGCTCTGG AGATAAATTGGGGGATAAATATACTTCCTGGTATCAGCAGAGGCCAGGCCAGTCCCCTGTATTGGTCATCT ATCAAGATATCAAGCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACAGCCACT
CTGACCATCAGCGGGACCCAGGCTATGGATGAGGCTGACTATTACTGTCAGGCGTGGGACAGTCCCAATGC GAGGGTCTTCGGATCTGGGACCAAGGTCACCGTCCTA
55 9A -M 0162 -A 04 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCG GGCCAGTCAGAGTATCAGTAGTTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGA TCTATAAGGCGTCTACTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTC ACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATACTTATTG GACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA
55 9 A -X 0101 -A O 1 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
5 59 A -X 0115 -AO 3 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9 A -X 0115 -BO 7 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9 A -X 0115 -DO 1 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9 A -X 0115 -DO 5 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
55 9 A -X 0115 -EO 9 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
5 59 A -X 0115 - F 02 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC
ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
55 9 A -X 0115 -GO 4 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCCTCCACCCTGTCCGCCTCTGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCG GGCCTCCCAGTCCATCTCCAGCTGGCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGA TCTACAAGGCCAGCACCCTGGAATCCGGCGTGCCCTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAGTTC ACCCTGACCATCAGCTCCCTGCAGCCCGACGACTTCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTACAACACCTACTG GACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAAATCAAG
559 A -X 0115 -H 06 LV
GAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCTGGCACCCTGTCTCTGTCTCCCGGCGAGAGAGCCACCCTGTCCTGCCG GACCTCCCAGTTCGTGAACTCCAACTACCTGGCTTGGTATCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCCTAGACTGC TGATCTACGGCGCCTCTTCCAGAGCCACCGGCATCCCTGACCGGTTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGAC TTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAACCTGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTCCTCCCGGAC CCCTTGGACCTTTGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAG
5 59A -M 0006 -D O 9 LV
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCG GGCAAGTCAGAGTATTCGCAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAACCTCCTGA TCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCAGCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTC ACTCTCACTATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAGTGGTTACCC CCACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAA
559 A -M 0035 -G 04 LV
CAAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCC TCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGAC TTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTG GCCTCGCGGATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA
5 59A -M 0029 -D O 9 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC TTCCGGATTCACTTTCTCTTGGTACACTATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG TTTCTTATATCTATCCTTCTGGTGGCGCTACTTTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGATGGGTTCATATGATTACATTTGGGGATTTTATAGTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCA CCGTCTCAAGC
55 9A -M 0145 - D I 1 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC TTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACCGTATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG TTTCTTCTATCTATCCTTCTGGTGGCCGTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGAAAGATAAGTTCGAGTGGAGGTTATTATTTCGCGGGATTGGAAATGATGCTTTTGATATCTGGG GCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCAAGC
55 9A -M 0162 -A 04 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC TTCCGGATTCACTTTCTCTCATTACATTATGATGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG TTTCTGGTATCTATTCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGTACCGCCGGACTGGGATTCCAAGAAGAGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCA CCGTCTCAAGC
55 9 A -X 0101 -A O 1 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGTCTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGCCAGGCTCCTGGCAAGGGCCTCGAATGGG TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACTCCCTGAGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGGGTGGCCAGAGGAATCGCCGCCAGGTCCCGGACCTCCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACCGTGTCCTCC
55 9 A -X 0115 -AO 3 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTTACCTTCTCCCACTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGG TGTCCGGCATCTACTCCTCCGGCGGCATCACCGTGTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCTGGCGGAGAATCGGCGTGCCCAGACGGGACTCCTTCGACATGTGGGGACAGGGCACCATGGTGA CAGTGTCCTCC
55 9 A -X 0115 -BO 7 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCATGGTCGGCCAGGGAATCCGGGGCAGATCCCGGACCTCCTACTTCGCCCAGTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
55 9 A -X 0115 -DO 1 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCATCTACTCCATGCACTGGGTGCGACAGGCTCCAGGCAAGGGCCTGGAATGGG TGTCCTCCATCTACCCCTCCCGGGGCATGACTTGGTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCTACCGGCGGACCGGCATCCCTAGACGGGACGCCTTCGACATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGA CAGTGTCCTCC
55 9 A -X 0115 -DO 5 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGTGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCGACTACATGATGGCCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGG TGTCCTCCATCGTGCCCTCTGGCGGCCACACCCACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCAGAGTGGCCAGAGGAATCGCCGCCAGATCCCGGACCTCCTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACAGTGTCCTCC
559 A -X 0115 -E 09 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCCGGGTGGCCCAGGGAATCGCCGCCAGATCCCGGACCTCCTCTGTGGATCAGTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
5 59 A -X 0115 - F 02 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACATCATGATGTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAGGGGCTGGAATGGG TGTCCGGCATCTACTCCTCCGGCGGCATCACCGTGTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCT CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCTACCGGCGGATCGGCGTGCCCAGACGGGACGAGTTCGACATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGA CAGTGTCCTCC
55 9 A -X 0115 -G 04 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCTCACTACATTATGATGTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG TGTCCGGCATCTACTCCTCCGGCGGCATCACCGTGTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGCGCCTACAGACGGACCGGCGTGCCCAGACGGGACGAGTTCGATATCTGGGGGCAGGGCACCATGGTGA CAGTGTCCTCC
55 9 A -X 0115 -H 0 6 HV
GAGGTGCAATTGCTGGAATCCGGCGGAGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCTCCCTGAGACTGTCTTGCGCCGC CTCCGGCTTCACCTTCTCCCACTACCTGATGACCTGGGTGCGACAGGCTCCTGGCAAAGGCCTGGAATGGG TGTCCTACATCTCCCCCTCTGGCGGCCACACCATCTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTTACCATCTCC CGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTA CTGTGCCCGGGTGGCCCAGGGAATCTCCGCCAGATCCCGGACCTCCTACTTCGATTACTGGGGCCAGGGCA CCCTGGTGACAGTGTCCTCT
5 59A -M 0006 -D O 9 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC TTCCGGATTCACTTTCTCTTTTTACTATATGGTTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG TTTCTGTTATCTATCCTTCTGGTGGCATTACTGTTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT AGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAACAGCTTAAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTA CTGTGCGAGAGATAAATGGGCGGTGATGCCCCCCTACTACTACTACGCTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGA CCACGGTCACCGTCTCAAGC
5 59 A -M 0035 -G 04 HV
GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCTGGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGC TTCCGGATTCACTTTCTCTTATTACCATATGTCTTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTAAAGGTTTGGAGTGGG TTTCTGTTATCTCTCCTTCTGGTGGCTCTACTAAGTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCTCT AGAGACAAC T C TAAGAATACTCTC TAC T T GCAGAT GAACAGCT TAAGGGCT GAGGACAC TGCAGT CTAC TA TTGTGCGAGAGGCGGTTCGAGCGATTACGCTTGGGGGAGTTATCGTCGACCCTACTACTTTGACTACTGGG GCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCAAGC

Claims (13)

r e i v i n d i c a c i o n e s
1. Un ácido o ácidos nucleicos que codifican un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: (i) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVS
S
y una secuencia Vl de DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(ii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWGQGTMVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de QDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPNLLIYKASTLESGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(iii) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS
y una secuencia VL de
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(iv) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de QDIQMTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQTPGQAPRLLIYGASSRATGIP DRFSGTGYGTDFTLTISRLEPEDYGTYYCQQSSRTPWTFGQGTRVEIK;
(v) un anticuerpo que comprende una secuencia VH de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSS
y una secuencia Vl de
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(vi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia Vl de
QDIQMTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK;
(vii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPSGGRTTY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLLLWFRELKSNYFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia Vl de
Figure imgf000167_0001
(viii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPSGGRTTY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLLLWNRELKSNYFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia Vl de
QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPS RLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR;
(ix) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYSMIWVRQAPGKGLEWVSYIRPSGGRTTY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGLLLWARELKSNYFDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia Vl de QDIQMTQSPSSLSAFVGDRVTITCRASQPIDNYLNWYHQKPGKAPKLLIYAASRLQSGVPS RLSGSGFGTDFTLTISSLQPEDFGNYYCQQSYTVPYTFGGGTKVEIR;
(x) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMVGQGIRGRSRTSYFAQWGQGTL VTVSS
y una secuencia Vl de
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(xi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYMMAWVRQAPGKGLEWVSSIVPSGGHTH YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVARGIAARSRTSYFDYWGQGTL VTVSS
y una secuencia Vl de
Figure imgf000168_0001
(xii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGIAARSRTSSVDQWGQGTL VTVSS
y una secuencia Vl de EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(xiii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYLMTWVRQAPGKGLEWVSYISPSGGHTIY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVAQGISARSRTSYFDYWGQGTL VTVSS
y una secuencia Vl de
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRTSQFVNSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDR FSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSSRTPWTFGQGTKVEIK;
(xiv) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAWRRIGVPRRDSFDMWGQGTMVT VSS
y una secuencia Vl de
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xv) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYSMHWVRQAPGKGLEWVSSIYPSRGMTW YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGIPRRDAFDIWGQGTMVTV SS
y una secuencia Vl de
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xvi) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRTGVPRRDEFDIWGQGTMVTV SS
y una secuencia Vl DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLESGVPSRF SGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNTYWTFGQGTKVEIK;
(xvii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSWYTMVWVRQAPGKGLEWVSYIYPSGGATF YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMGSYDYIWGFYSDHWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia Vl de
QSALTQPPTVSVSPGQTARITCSGNKLGDKYVAWYQQKPGQSPMLVIYQDTKRPSRVSER FSGSNSANTATLSISGTQALDEADYYCQAWDSSIVIFGGGTRLTVL;
(xviii) un anticuerpo que comprende una secuencia Vh de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYRMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPSGGRTV YADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDKFEWRLLFRGIGNDAFDIWGQ GTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS
y una secuencia VL de
QSVLTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGDKYTSWYQQRPGQSPVLVIYQDIKRPSGIPERF SGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQAWDSPNARVFGSGTKVTVL.
2. El ácido o ácidos nucleicos de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena pesada (Vh) de
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSHYIMMWVRQAPGKGLEWVSGIYSSGGITVY ADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAYRRIGVPRRDEFDIWGQGTMVTVS
S
y una secuencia del dominio variable de inmunoglobulina de cadena ligera (Vl) de
D IQ M T Q S P S T L S A S V G D R V T IT C R A S Q S IS S W L A W Y Q Q K P G K A P K L L IY K A S T L E S G V P S R F S G S G S G T E F T L T IS S L Q P D D F A T Y Y C Q Q Y N T Y W T F G Q G T K V E IK ,
3. El ác id o o ác ido s nu c le ico s de la re iv in d ica c ió n 1 o la re iv in d ica c ió n 2, do n d e el a n ticu e rp o es un an ticu e rp o de lo ng itud com p le ta .
4. El ác ido o ác ido s nuc le icos de la re iv in d ica c ió n 1 o la re iv in d ica c ió n 2, do n d e el an ticu e rp o es un Fab so lub le (sFab).
5. El ác ido o ác ido s nu c le icos de la re iv in d ica c ió n 4, do n d e el an ticu e rp o es u n a IgG .
6. Un v e c to r o ve c to re s que c o m p re n d e n el ác ido o ác ido s nu c le icos de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1 -5.
7. El v e c to r o ve c to re s de la re iv in d ica c ió n 6, do n d e el v e c to r o v e c to re s son un v e c to r o ve c to re s de exp res ión .
8. U na c é lu la h o sp e d a d o ra q u e co m p re n d e el ác id o o ác ido s nu c le icos de u n a cu a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 1-5 o el v e c to r o ve c to re s de la re iv in d ica c ió n 6 o la re iv in d ica c ió n 7.
9. La c é lu la h o sp e d a d o ra de la re iv in d ica c ió n 8, do n d e la cé lu la es u n a c é lu la de m am ífe ro .
10. La c é lu la h o sp e d a d o ra de la re iv in d ica c ió n 9, do n d e la c é lu la de m am ífe ro es una c é lu la de ova rio de h á m ste r ch in o (C H O ).
11. Un m étod o de p ro d u cc ió n de un an ticu e rp o q u e se une a la fo rm a ac tiva de c a lic re ín a p la sm á tica h u m a n a y no se une a p re c a lic re ín a hum ana , q u e co m p re n d e cu ltiva r la c é lu la h o sp e d a d o ra de u n a c u a lq u ie ra de las re iv in d ica c io n e s 8 -10 en un m ed io de cu ltivo , p a ra p ro d u c ir de es ta m a n e ra el an ticue rpo .
12. El m é tod o de la re iv in d ica c ió n 11, q u e co m p re n d e ad em á s re cu p e ra r el a n ticu e rp o de l m ed io de cu ltivo .
13. El m é tod o de la re iv in d ica c ió n 11 o la re iv ind ica c ión 12, que co m p re n d e ad em á s p u rif ica r e l a n ticue rpo .
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