BRPI0610248A2

BRPI0610248A2 - anticorpos contra miostatina, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, linhas celulares que os produzem , moléculas de ácido nucleico codificantes dos mesmos bem como seus usos

Info

Publication number: BRPI0610248A2
Application number: BRPI0610248-4A
Authority: BR
Inventors: Eva Rose Chin; Chikwendu Ibebunjo; Philip Albert Krasney; Junming Yie; Joseph Zachwieja; Larry L Green
Original assignee: Pfizer; Amgen Fremont Inc
Priority date: 2005-04-25
Filing date: 2006-04-24
Publication date: 2010-06-08
Also published as: EP2295466A3; IL186739A0; MX2007013217A; CN101272802A; ZA200709291B; EP1877075A2; WO2006116269A2; NO20076061L; DOP2006000093A; AP2007004243A0; TW200724548A; NL1033650C2; AR053067A1; EA015534B1; NL2002255C2; KR20080011403A; NL2002255A1; AU2006239860B2; EP1877075A4; EA201100642A1

Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpos que incluem anticorpos humanos e partes de ligação de antigeno dos mesmos que se ligam a miostatina, e que funcionam para inibir a miostatina. A invenção também refere-se a anticorpos anti-miostatina humanos e partes de ligação de antigeno dos mesmos. A invenção também refere-se a anticorpos que são anticorpos de cadeia única quiméricos, biespecíficos, derivatizados ou partes de proteínas de fusão. A invenção também refere-se a imunoglobulinas isoladas de cadeia pesada e leve derivadas de anticorpos anti-miostatina humanos e as moléculas de ácido nucléico que codificam tais imunoglobulinas. A presente invenção também refere-se a métodos para fabricar anticorpos antimiostatina humanos, composições que compreendem estes anticorpos e métodos para utilizar os anticorpos e composições para diagnóstico e tratamento. A invenção também se proporciona métodos de terapia genética que utilizam moléculas de ácido nucléico que codificam as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e/ou leve que compreendem os anticorpos antimiostatina humanos. A invenção também refere-se a animais transgênicos ou plantas que compreende as moléculas de ácido nucléico da presente invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR-POS CONTRA MIOSTATINA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Um corpo crescente de fato indica que a miostatina (mstn, Fatorde Crescimento e Diferenciação 8, ou GDF-8) regula negativamente o cres-cimento do músculo esquelético. Por exemplo, uma mutação nula de miosta-tina em uma criança foi associada à hipertrofia muscular substancial semqualquer anormalidade evidente (Schuelke et al. (2004) Miostatina MutationAssociated with Gross Muscle Hypertrophy in a Child. New Engl. J. Med.3E>0:2682-8). Uma correlação negativa entre os níveis de proteína miostatinamuscular e massa de músculo esquelético também foi demonstrada (Schul-te, J.N. and Yarasheski, K.E. (2001). Effects of resistance training on the rateof muscle protein synthesis in frail elderly people. Int. J. Sport Nutr. Exerc.Metab. 11 Suppl:S111-820; Walker KS et al. (2004) Resistance training al-ters plasma miostatina but not IGF-1 in healthy men. Med Sei Sports Exerc.36(5):787-93.). Por exemplo, há uma expressão aumentada de níveis demiostatina muscular com a idade e a expressão de miostatina aumentadatambém mostrou contribuir com a atrofia muscular em pacientes infectadoscom HIV (Gonzalez-cadavid et al. (1998) Organization of the human miostat-ina gene and expression in healthy men and HlV-infected men with musclewasting. PNAS 95:14938-4321). Ademais, níveis elevados de miostatina fo-ram encontrados em populações idosas. (Yarasheski KE et al., (2002) Se-rum miostatina-immunoreactive protein is increased in 60-92 year old womenand men with muscle wasting. J Nutr. Health Aging. 6(5):343-8). A miostatinatambém influencia a massa óssea visto que os camundongos com defi-cientes de miostatina tiveram a densidade mineral óssea aumentada(Hamrick et al., (2003) Bone Architecture and Disc Degeneration in the Lum-bar Spine of Mice Lacking GDF-8 (Miostatina). J. Orthopaedic Res. 21: 1025-1032 (e referências neste).

Os anticorpos para circular a miostatina mostraram causar mas-sa muscular aumentada e homeostase da glicose aperfeiçoada em modelosmurinos de diabetes melito tipo 2. A inibição de miostatina por injeção ip deum anticorpo de neutralização aumenta a massa de músculo esquelético,reduz a glicose no sangue em jejum e aperfeiçoa a sensibilidade à glicoseem camundongos diabéticos obesos (Li X. et al. (2002) Inhibition of my-ostatin increases muscle mass and improves glicose sensitivity in obese,diabetic mice. Pôster Ne 224, in Keystone Symposia: Diabetes Mellitus: Mo-lecular Mechanisms, Genetics and New Therapies). Ademais, os camundon-gos Ay/a são conhecidos por desenvolver resistência à insulina e são usadoscomo um modelo para diabetes tipo 2. Quando os camundongos Ay/a estive-rem desprovidos de miostatina por deleção do loco miostatina, estes possu-em níveis normais de insulina e glicose alimentados, e níveis de glicosedramaticamente inferiores após uma carga de glicose exógena relativa acamundongos Ay/a normais (McPherron et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:595-601).

Considerando-se o músculo danoso, defeitos ósseos emetabólicos associados à miostatina, há uma necessidade urgente deanticorpos como compostos terapêuticos que são específicos paramiostatina e que impedem ou tratam condições ao reduzir a atividade demiostatina, bem como anticorpos como diagnósticos para identificarindivíduos que estão necessitados de tratamento para reduzir a atividade demiostatina.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona anticorpos antimiostatina, ácidos nucléi-cos que os codificam, vetores e células hospedeiras para produzir osanticorpos, composições e kits que compreendem os anticorpos e métodospara fabricar e utilizar os anticorpos. Diversas modalidades da invençãodescritas nos seguintes parágrafos numerados incluem, porém sem caráterlimitativo.

1. Anticorpo monoclonal humano, quimérico ou humanizado ouuma parte de ligação de antígeno deste que se liga especificamente àmiostatina.

2. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno de a-cordo com o parágrafo 1, onde a miostatina é miostatina humana.3. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno de a-cordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo ou parte se ligaseletivamente à miostatina através de GDF11 por pelo menos 50 dobras.

4. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 3, onde o dito anticorpo ou parte inibe a ligação demiostatina a um receptor de activina tipo I ou tipo II.

5. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 1, onde o anticorpo ou parte deste possui pelo me-nos uma propriedade selecionada a partir do grupo que consiste em:

(a) concorre para a ligação à miostatina com um anticorpo sele-cionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1 H-L81M, L-F58I, I85V;

(b) se ligar ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-l 12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1 H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(c) se ligar à miostatina substancialmente com o mesmo Kd co-mo um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1;1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1;1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-.F58I; 2_112_1L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; e

(d) se ligar à miostatina substancialmente com a mesma dissoci-ação que um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1;2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1 L-Q45K; 1_257_1 L-L211;-1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I;-2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e-2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

6. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste que compreende:

(a) um conjunto de CDR, CDR1, CDR2, e CDR3, que de formaseqüencial juntamente são pelo menos 90% idênticos em seqüência deaminoacido a CDRs de cadeia pesada, CDR1, CDR2, e CDR3, de forma se-qüencial juntamente, que estão incluídos na seqüência de aminoacido esta-belecida em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 e 118;

(b) um conjunto de CDR, CDR1, CDR2, e CDR3, que de formaseqüencial juntamente são pelo menos 90% idênticos em seqüência deaminoacido a CDRs de cadeia leve, CDR1, CDR2, e CDR3, de formaseqüencial juntamente, que estão incluídos na seqüência de aminoacidoestabelecida em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 e 120; ou

(c) um primeiro conjunto de CDR de (a) e um segundo conjuntode CDR de (b).

7. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste de acordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo compreende CDRsde cadeia pesada CDR1, CDR2, e CDR3, que de forma seqüencial junta-mente são pelo menos 90% idênticos em seqüência de aminoacido a CDRsde cadeia pesada, CDR1, CDR2, e CDR3, de forma seqüencial juntamente,que estão incluídos na seqüência de aminoacido estabelecida em qualqueruma entre SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81, 85 e 118.

8. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste de acordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo compreende CDRsde cadeia leve CDR1, CDR2, e CDR3, que de forma seqüencial juntamentesão pelo menos 90% idênticos em seqüência de aminoacido a CDRs de ca-deia leve, CDR1, CDR2, and CDR3, de forma seqüencial juntamente, queestão incluídos na seqüência de aminoacido estabelecida em qualquer umaentre SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 e 120.

9. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste de acordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo ou parte de ligaçãode antígeno compreende seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesa-da encontradas em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65,69, 73, 77, 81, 85 ou 118.

10. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antí-geno compreende as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve en-contradas em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71,75, 79, 83, 87 ou 120.

11. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antí-geno compreende uma cadeia pesada que utilize um gene VH 1-02 humano,um gene VH 3-21 humano ou um gene VH 3-23 humano.

12. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 1, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antí-geno compreende uma cadeia leve que utiliza um gene VK L2 humano, umgene VK A3 humano ou um gene VK A30 humano.

13.Um anticorpo monoclonal de acordo com o parágrafo 1, ondeo dito anticorpo ou parte de ligação de antígeno compreende um domínio VHpelo menos 90% idêntico em seqüência de aminoácido ao domínio VH emqualquer uma entre SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42 ou115.

14. Um anticorpo monoclonal de acordo com o parágrafo 1, ondeo dito anticorpo ou parte de ligação de antígeno compreende um domínio VLpelo menos 90% idêntico em seqüência de aminoácido ao domínio \A_ emqualquer uma entre SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou117.

15. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno deacordo com o parágrafo 1 que se liga especificamente à miostatina, onde:

(a) a cadeia pesada compreende as seqüências de aminoácidoCDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a par-tir do grupo que consiste em: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1;2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1 H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(b) a cadeia leve compreende as seqüências de aminoácidoCDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partirdo grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1;1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K;1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M;2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I;2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1 H-L81M, L-F58I, I85V; ou

(c) o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a) e umacadeia leve de (b).

16. Um anticorpo monoclonal de acordo com o parágrafo 12 quecompreende adicionalmente um domínio VL pelo menos 90% idêntico emseqüência de aminoácido ao domínio variável em qualquer uma entre SEQID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44 ou 117.

17. Um anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo queconsiste em:

(a) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

(b) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8;

(c) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12;

(d) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16;

(e) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20;

(f) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;

(g) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28;

(h) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32;

(i) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;

(j) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40;

(k) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44; e (I) um anticorpoque compreende as seqüências de aminoácido estabelecidas em SEQ IDNO: 115eSEQIDNO: 117.

18. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação deste selecio-nado a partir do grupo que consiste em:

(a) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQ. ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.

(b) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8;

(c) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12;

(d) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16;

(e) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20;

(f) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;

(g) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 26 e SEQ ID NO: 28;

(h) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 30 e SEQ ID NO: 32;

(i) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;

(j) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 38 e SEQ ID NO: 40;

(k) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQID NO: 42 e SEQ ID NO: 44; e

(I) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas em SEQIDNO: 115eSEQIDNO: 117.

19. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste que compreende um primeiro conjunto de seqüência que compreendeum primeiro conjunto de seqüência CDR que compreende um primeiroCDR1, primeiro CDR2 e primeiro CDR3 e um segundo conjunto de seqüên-cia CDR que compreende um segundo CDR1, segundo CDR2 e segundoCDR3, onde o cada dito primeiro conjunto CDR e dito segundo conjuntoCDR de forma seqüencial possuem juntamente pelo menos 90% de identi-dade com as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, de forma seqüencial junta-mente, de:

(a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente;

(b) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, respectivamente;

(c) SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO:12, respectivamente;

(d) SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:16, respectivamente;(e) SEQ ID N0:18 e SEQ ID NO:20, respectivamente;

(f) SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, respectivamente;

(g) SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:28, respectivamente;

(h) SEQID NO:30 e SEQ ID NO:32, respectivamente;

(i) SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:36, respectivamente;

(j) SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:40, respectivamente;(k) SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44, respectivamente; e(I) SEQ ID N0:115 e SEQ ID N0:117, respectivamente.

20. Um anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígenodeste que compreende um primeiro conjunto de seqüência CDR que com-preende um primeiro CDR1, primeiro CDR2 e primeiro CDR3 e um segundoconjunto de seqüência CDR que compreende um segundo CDR1, segundoCDR2 e segundo CDR3, onde cada dito primeiro conjunto CDR e dito se-gundo conjunto são as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, de forma seqüen-ciaijuntamente, de

(a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente;

(b) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, respectivamente;

(c) SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, respectivamente;

(d) SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:16, respectivamente;

(e) SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:20, respectivamente;

(f) SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, respectivamente;

(g) SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:28, respectivamente;

(h) SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32, respectivamente;

(i) SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:36, respectivamente;

(j) SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:40, respectivamente;

(k) SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44, respectivamente; e(I) SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO: 117, respectivamente.

21. Um anticorpo monoclonal que se liga especificamente àmiostatina que compreende o conjunto de seqüência de aminoácido de ca-deia pesada estabelecida em SEQ ID NO:115 e o conjunto de seqüência deaminoácido de cadeia leve estabelecidos em SEQ ID NO:117.

22. Um anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antí-geno deste que compreende as regiões variáveis contidas em SEQ IDNO:115e SEQ ID NO:117.

23. Um anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antí-geno deste, que se liga especificamente à miostatina que compreende CDRsCDR1,CDR2eCDR3 contidos em SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:117.

24. Um anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antí-geno deste sendo que o dito anticorpo monoclonal ou parte de ligação deantígeno se liga a partes de peptídeo 1 e peptídeo 5 de miostatina, onde opeptídeo 1 compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 103 epeptídeo 5 compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 107.

25. Um anticorpo produzido por uma célula que possui um Nú-mero de Designação de Depósito ATCC selecionado a partir do grupo queconsiste em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

26. Composição farmacêutica que compreende um anticorpo ouuma parte de ligação de antígeno de acordo com qualquer um dosparágrafos 1 a 25 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

27. Uma composição farmacêutica de acordo com o parágrafo26, que compreende adicionalmente pelo menos um agente terapêutico.

28. Método que compreende a etapa de administrar no dito indi-víduo um anticorpo ou uma parte de ligação de antígeno de acordo comqualquer um dos parágrafos 1 a 25 ou a composição farmacêutica de acordocom o parágrafo 26, onde o dito anticorpo, parte de ligação de antígeno oucomposição farmacêutica inibe a atividade de miostatina, onde o dito indiví-duo está necessitado de aumento de massa muscular, promoção de desen-volvimento de músculo esquelético, tratamento de um distúrbio de atrofiamuscular ou aumento de crescimento de músculo esquelético.

29. Linha celular isolada que produz um anticorpo ou uma partede anticorpo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25 ou a cadeiapesada ou cadeia leve do dito anticorpo ou da dita parte de ligação de antí-geno.

30. Molécula de ácido nucléico isolada que compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou uma parte de li-gação de antígeno desta ou a cadeia leve ou uma parte de ligação de antí-geno desta de um anticorpo de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a25.

31. Vetor que compreende a molécula de ácido nucléico de a-cordo com o parágrafo 30, onde o vetor compreende opcionalmente umaseqüência de controle de expressão ligada de forma operávei à molécula deácido nucléico.

32. Célula hospedeira que compreende o vetor de acordo com oparágrafo 31 ou a molécula de ácido nucléico de acordo com o parágrafo 30.

33. Método para produzir um anticorpo antimiostatina ou umaparte de ligação de antígeno deste, que compreende cultivar a célula hospe-deira de acordo com o parágrafo 32 ou a linha celular de acordo com oparágrafo 29 sob condições adequadas e recuperar o dito anticorpo ou partede ligação de antígeno.

34. Organismo transgênico não-humano que transporta o ácidonucléico de acordo com o parágrafo 30 tanto cromossomicamente comoextracromassomicamente, onde o organismo transgênico não-humano ex-pressa o dito ácido nucléico.

35. Método para isolar um anticorpo ou uma parte de ligação deantígeno deste que se liga especificamente à miostatina, que compreende aetapa de isolar o anticorpo do organismo transgênico não-humano de acordocom o parágrafo 34.

36. Método para tratar um indivíduo necessitado deste com umanticorpo ou uma parte de ligação de antígeno deste que se ligaespecificamente à miostatina que compreende as etapas de:

(a) administrar no dito indivíduo uma quantidade eficaz de umamolécula de ácido nucléico isolada de acordo como parágrafo 30; e

(b) expressar a dita molécula de ácido nucléico.

37. Método para produzir um anticorpo monoclonal humano quese liga especificamente à miostatina, que compreende as etapas de:

(a) imunizar um animal transgênico não-humano que é capaz deproduzir anticorpos humanos com miostatina, uma parte imunogênica demiostatina, ou uma célula ou tecido que expressa miostatina;

(b) permitir que o animal transgênico não-humano estabeleçauma resposta imune à miostatina;

(c) isolar os linfócitos B do animal transgênico não-humano; e

(d) isolar um anticorpo monoclonal que se liga especificamente àmiostatina dos ditos linfócitos B isolados.

38. Anticorpo isolado produzido pelo método de acordo com oparágrafo 37.

39. Método para inibir a ligação de miostatina a células que ex-pressam um receptor de activina Tipo II ou MB que compreende colocar amiostatina em contato com um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deacordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ouparte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

40. Método para aumentar a proliferação de mioblasto que com-preende colocar uma composição que compreende mioblastos e miostatinaem contato com um anticorpo ou parte de ligação de antígeno de acordocom qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte deligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

41. Método que compreende administrar em um indivíduo umanticorpo ou uma parte de ligação de antígeno deste de acordo com qual-quer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte de ligação deantígeno inibe a atividade de miostatina, onde o dito indivíduo está necessi-tado de aperfeiçoamento de homeostase da glicose, redução de massa degordura, aumento da sensibilidade à insulina, aperfeiçoamento de função derim, redução de acúmulo de gordura, tratamento, prevenção ou inibição deuma doença ou condição caracterizada por perda óssea, sendo que a ditadoença ou condição inclui osteoporose, osteopenia, osteoartrite e fraturasósseas, tratamento de síndrome metabolica, ou neutralização de atrofiamuscular a partir de administração prolongada de um glucocorticóide ou umhormônio esteróide durante o tempo em que o indivíduo está submetido aotratamento com um glucocorticóide ou um hormônio esteróide.42. Método para reduzir a atividade de miostatina em um indiví-duo necessitado deste que compreende a etapa de administrar no dito indi-víduo um anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígeno destede acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpomonoclonal ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

43. Método para reverter o declínio relacionado à idade em mas-sa muscular em um indivíduo necessitado deste que compreende a etapa deadministrar no dito indivíduo um anticorpo ou uma parte de ligação de antí-geno de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o ditoanticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

44. Método para aumentar a proliferação de mioblasto e diferen-ciação em um indivíduo necessitado deste que compreende a etapa deadministrar no dito indivíduo um anticorpo ou parte de ligação de antígenode acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ouparte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

45. Método para reduzir a sinalização celular mediada por recep-tor de membrana de activina induzida por miostatina tipo MA ou IIB em umindivíduo necessitado deste que compreende a etapa de administrar no ditoindivíduo um anticorpo ou uma parte de ligação de antígeno de acordo comqualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte de ligaçãode antígeno inibe a atividade de miostatina.

46. Método para reduzir a ativação mediada por miostatina deum receptor de membrana de activina tipo I em um indivíduo necessitadodeste que compreende a etapa de administrar no dito indivíduo um anticorpoou uma parte de ligação de antígeno de acordo com qualquer um dosparágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antígenoinibe a atividade de miostatina.

47. Método para reduzir a fosforilação mediada por miostatina deuma ou mais proteínas R-smad selecionadas a partir do grupo que consisteem: Smad 2 e Smad 3 em um indivíduo necessitado deste que compreendea etapa de administrar no dito indivíduo um anticorpo ou parte de ligação deantígeno de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 18, onde o ditoanticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.anticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

48. Método para aumentar a expressão de um gene selecionadoa partir do grupo que consiste em: myoD, myf5 e miogenina, em um indiví-duo necessitado deste que compreende a etapa de administrar no dito indi-víduo um anticorpo ou parte de ligação de antígeno de acordo com qualquerum dos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antí-geno inibe a atividade de miostatina.

49. Método para promover o crescimento muscular, ganho depeso ou auxílio na prevenção de fraqueza no gado, suíno, carneiro, frangos,perus, cavalos, peixe, cães e gatos necessitados deste que compreende aetapa de administrar no dito indivíduo um anticorpo ou parte de ligação deantígeno de acordo com qualquer um dos parágrafos 1 a 25, onde o ditoanticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

50. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno desteselecionado a partir do grupo que consiste em:

(a) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variávelestabelecidas em SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO:47;

(b) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:49 e SEQ ID NO:51;

(c) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO:55;

(d) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:57 e SEQ ID NO:59;

(e) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:61 e SEQ ID NO:63;

(f) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste que com-preende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas emSEQ ID NO:65 and SEQ ID NO:67;

(g) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:69 and SEQ ID NO:71;

(h) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:73 e SEQ ID NO:75;

(i) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste que com-preende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas emSEQ ID NO:77 e SEQ ID NO:79;

(j) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste que com-preende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas emSEQ ID NO:81 e SEQ ID NO:83; e

(k) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste quecompreende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabeleci-das em SEQ ID NO:85 e SEQ ID NO:87; e

(I) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno deste que com-preende as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas emSEQ ID NO: 118 e SEQ ID NO:120.

51. Método para tratar síndrome metabólica em um indivíduonecessitado deste que compreende a etapa de administrar no dito indivíduoum anticorpo ou parte de ligação de antígeno de acordo com qualquer umdos parágrafos 1 a 25, onde o dito anticorpo ou parte de ligação de antígenoinibe a atividade de miostatina.

52. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpohumano, quimérico ou humanizado que concorre para a ligação à miostatinacom um anticorpo ou uma parte de ligação de antígeno deste, onde oanticorpo ou parte deste possui pelo menos uma propriedade selecionada apartir do grupo que consiste em:

(a) concorrer para a ligação à miostatina com um anticorpo sele-cionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1 H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-l 12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1 H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(b) se ligar ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1 _46_1; 2_112_1; 1 _314_1; 1 _66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1 _132_1; 1 _268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1 H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(c) se ligar à miostatina substancialmente com o mesmo Kd co-mo um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1;1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1;1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M; L-F58I, I85V, I85V; e

(d) se ligar à miostatina substancialmente com a mesma dissoci-ação que um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste em1 _116_1; 1 _136_3; 1 _257_1; 1 _46_1; 2_112_1; 1 _314_1; 1 _66_1; 2_43_1;2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K; 1 _116_1 L-Q45K; 1_257_1L-L21I;1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e2_112_1H-L81M; L-F58I, I85V.

53. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpomonoclonal ou parte de ligação de antígeno deste que concorre para a liga-ção à miostatina com um anticorpo que compreende:

(a) uma cadeia pesada que utiliza um gene VH 1-02 humano, umgene VH 3-21 humano ou um gene VH 3-23 humano; e

(b) uma cadeia leve que utiliza um gene VK L2 humano, um geneVK A3 humano ou um gene VK A30 humano.54. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpomonoclonal ou uma parte de ligação de antígeno do dito anticorpo monoclo-do por uma linha de célula de hibridoma que possui um Número de Designa-ção de Depósito ATCC selecionado a partir do grupo que consiste em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572,PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

55. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam um anticorpo que possui a mesma seqüênciade aminoácido que o anticorpo produzido por uma célula de hibridoma quepossui um Número de Designação de Depósito ATCC selecionado a partirdo grupo que consiste em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569,PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

56. Método que compreende expressar o dito anticorpomonoclonal humano na dita linha de célula hospedeira de mamífero de qual-quer um dos parágrafos 52 a 55 e recuperar o dito anticorpo monoclonalhumano.

57. Linha de célula de hibridoma selecionada a partir do grupoque consiste em Números de Designação de Depósito ATCC PTA-6566,PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

58. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpomonoclonal humano, quimérico ou humanizado, onde o anticorpo ou partedeste possui pelo menos uma propriedade selecionada a partir do grupo queconsiste em:

(a) concorrer para a ligação à miostatina com um anticorpo sele-cionado a partir do grupo que consiste em :1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(b) se ligar ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;

(c) é um anticorpo que possui a mesma seqüência deaminoácido que o anticorpo produzido por uma célula de hibridoma que pos-sui um Número de Designação de Depósito ATCC selecionado a partir dogrupo que consiste em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576;e

(d) é uma linha de célula de hibridoma selecionada a partir dogrupo que consiste em Números de Designação de Depósito ATCC PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572,PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

BREVE DESCRICÀO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra os resultados de uma análise de gene repórterresponsivo à miostatina. Como mostrado, os anticorpos antimiostatina deneutralização inibem a atividade da luciferase induzida por miostatina emcélulas A204. As variantes de anticorpo humano 1_116_1L-Q45K; 1_257-1L-L21I; 1_314_1H-T92A e 2_112_1 H-I12V, L-F 58I, I85V inibiram a atividadeda luciferase na mesma magnitude que os anticorpos de tipo selvagem.

A Figura 2 mostra os resultados de uma análise de beta-lactamase L6 Aurora. Como mostrado, os anticorpos antimiostatina de neu-tralização inibem a atividade da beta-lactamase induzida por miostatina emmioblastos de rato L6. As variantes de anticorpo humano 1_116_1L-Q45K;1_257-1L-L21I; 1_314_1H-T92A e 2_112_1H-I12V, L-F58I, I85V inibiram aatividade de beta-lactamase na mesma magnitude que os anticorpos de tiposelvagem.A Figura 3 mostra os resultados de uma análise de western blot.Como mostrado, os anticorpos antimiostatina de neutralização da invençãoinibem a fosforilação de smad2 induzida por miostatina em células HepG2por análise de western blot.

A Figura 4 mostra os resultados de análises de expressão demRNA myf5. (A) Os anticorpos antimiostatina de neutralização 1_268_1,2_177_1, e 2_112_1 recuperaram a expressão de gene myf5 inibida pormiostatina em mioblastos de camundongos C2C12, enquanto que um anti-corpo de não-neutralização 1_159_1 não poderia fazer o mesmo. O nível demRNA Myf5 foi detectado por PCR TaqMan. (B) 1_116_1 resgatou a ex-pressão de gene myf5 de maneira dose-dependente.

A Figura 5 mostra os resultados de análises de diferenciação decélula muscular C2C12. (A) Os anticorpos anti-miostatina de neutralização2_43_1, 1_314_1, e 1_257_1 resgataram a diferenciação de músculo blo-queada por miostatina em células musculares em camundongos C2C12. Onível de proteína de cadeia pesada de miosina embriônica (MHC) utilizou ummarcador para medir a diferenciação de C2C12. (B) Os anticorpos 2_112_1,1_46_1, e 1_116_1 resgataram a diferenciação de músculo de C2C12 blo-queada por miostatina.

A Figura 6 (A) ilustra os peptídeos gerados de GDF8 madura(SEQ ID NO: 89) para testar a ligação de anticorpo anti-miostatina. Os ami-noácidos em letras minúsculas são os aminoácidos que são diferentes deGDF11 (B). Sumário de ligação de peptídeo. Como mostrado na Figura, al-guns anticorpos não se ligam a nenhum dos peptídeos. Alguns anticorpos seligam a peptídeos não-contíguos. (C) A estrutura previamente diagnosticadaGDF8 com a ilustração de ligação de peptídeo dos anticorpos anti-miostatinahumanos. A estrutura GDF8 foi gerada utilizando SWISS-MODEL; um servi-dor de modelagem de homologia de estrutura de proteína completamenteautomatizado, accessível através do servidor da web ExPASy, ou a partir doprograma DeepView (Swiss Pdb-Viewer). Os primeiros sete aminoácidosestavam ausentes da estrutura previamente diagnosticada. GDF8 madura éuma proteína homodímera. Apenas uma subunidade é mostrada. Osanticorpos descritos aqui se ligam a GDF8 como um homodímero. Comomostrado na Figura, os anticorpos monoclonais humanos 2_43_1, 2_112_1e 2_177_1 se ligam tanto ao peptídeo 1 como 5. Os peptídeos 1 e 5 estãoespacialmente próximos, porém não em estrutura primário.

A Figura 7 mostra as seqüências de aminoácido de peptídeos 1a 11 e identificadores de seqüência correspondentes (SEQ ID NOs 103-113).

A Figura 8 mostra a ligação de epítopo. A ligação de epitopo dosanticorpos anti-miostatina humanos da invenção foi mapeada por experimen-tos de concorrência cruzada que utilizam um instrumento BlAcore® 3000. Osanticorpos são mostrados como caixas rotuladas. Os anticorpos em umcírculo competem com anticorpos em círculos sobrepostos. Por exemplo, oanticorpo 1_46_1 compete com o anticorpo 1_136_3, porém o anticorpo1_46_1 não compete com o anticorpo 1_268_1. Quando dois ou maisanticorpos estiverem no mesmo círculo, sua respectiva ligação não pode serdistinguida.

A Figura 9 mostra os resultados de um estudo deimunoprecipitação para testar a capacidade que os anticorpos anti-miostatina humanos da invenção têm para abaixar o complexo latente deGDF8 madura e GDF8/propeptídeo maduro. O meio condicionado que con-tém células 293T transfectadas com GDF8 foi usado. Como mostrado naFigura, os anticorpos 2_112_1, 2_43_1 e 2_177_1 abaixaram GDF8 madura,complexo de GDF8 madura/propeptídeo, e GDF8 não-processada; o anti-corpo 1_66_1 abaixou complexo de GDF8 madura e GDF8/propeptídeo ma-duro; nenhum outros anticorpo abaixou GDF8 madura, propeptídeo, ouGDF8 não-processada. Viela 4 é o controle de carregamento de meio 1/10, ea viela 7 é o controle de imunoprecipitação apenas com meio.

A Figura 10 mostra os resultados de um estudo de uma imuno-precipitação para testar a capacidade que os anticorpos anti-miostatina dainvenção têm para abaixar GDF8 madura de soro de camundongo. Comomostrado na Figura, os anticorpos 2_112_1, 2_43_1 e 2_177_1 abaixaramGDF8 madura do soro de camundongo, enquanto que os anticorpos1_116_1 e 1_66_1 não poderiam fazer isto.1_116_1 e 1_66_1 não poderiam fazer isto.

A Figura 11 é um alinhamento de seqüência de GDF8 e GDF11humana madura. GDF8 (SEQ ID NO: 89) e GDF11 maduras (SEQ ID NO:90) partilham aproximadamente 90% de seqüências de aminoácido idênti-cas. Tanto GDF8 como GDF11 maduras formam homodímeros. Tanto GDF8como GDF11 maduras possuem nove cisteínas, que formam quatro ligaçõesde bissulfeto internas e uma ligação de bissulfeto intermolecular. Como mos-trado na Figura, as cisteínas que formam uma ligação de bissulfeto umascom as outras são marcadas com os mesmos pontos ou sinais de adição.

Uma cisteína (cys73) que forma a ligação de bissulfeto intermolecular foimarcada com uma estrela. A estrutura de GDF8 foi prognosticada utilizandoSWISS-MODEL (vide Figura 6C).

A Figura 12 é uma tabela que resume os dados de análise invitro.

A Figura 13 é uma tabela que resume o uso de gene, ligação deepítopo e ligação peptídica.

As Figuras 14 e 15 mostram os efeitos sobre a massa muscularem camundongos apos o tratamento in vivo com anticorpos anti-miostatinacomo comparado com o veículo para o os músculos gastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibiais anteriores (TA) e quadríceps (Quads).

A Figura 16 mostra os efeitos sobre o peso e resistência muscu-lar em camundongos SCID após o tratamento in vivo com um anticorpo anti-miostatina (2_112_K).

A Figura 17 ilustra os efeitos sobre o peso muscular em camun-dongos SCID após o tratamento in vivo com doses variadas de um anticorpoanti-miostatina (2_112_K).

A Figura 18 é uma análise de resposta de dose (A) e concentra-ção (B) de doses variadas de um anticorpo anti-miostatina (2_112_K) e seusefeitos sobre o peso muscular.

A Figura 19 é um alinhamento das regiões variáveis de cadeiapesada e leve de anticorpos 2_112_1 (cadeia pesada: SEQ ID NO:77; ca-deia leve: SEQ ID NO:79) e 2_112_K (cadeia pesada: SEQ ID NO: 118; ca-deia leve: SEQ ID NO:120).

A Figura 20 mostra os efeitos sobre a massa muscular (A) emassa adiposa (B) em camundongos após o tratamento in vivo comcortisona com um anticorpo anti-miostatina (2_112_K) como comparado como veículo para os músculos gastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibiaisanteriores (TA) e quadríceps (Quads) (em 20A) e as massas inguinais, epi-didimais e de placa de gordura abdominal (em 20B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições e Técnicas Gerais

Salvo definição em contrário aqui, os termos científicos e técni-cos usados em conjunto com a presente invenção devem possuir os signifi-cados que são comumente compreendidos pelos versados na técnica. Ade-mais, salvo requerido em contrário pelo contexto, os termos no singular de-vem incluir pluralidades e os termos no plural devem incluir o singular.

Geralmente, a nomenclatura usada em conjunto com, e técnicas de, culturacelular e de tecido, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética equímica de proteína e ácido nucléico e hibridização descritas aqui são aque-las bem-conhecidas e comumente usadas na técnica.

Os métodos e técnicas da presente invenção são geralmenterealizados de acordo com métodos convencionais bem-conhecidos na técni-ca e conforme descrito em diversas referências gerais e mais específicasque são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo, salvoindicação em contrário. Veja, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Clon-ing: A Laboratorv Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) e Ausubel et al., Current Protocols in Mo-lecular BíoIoqv, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow and LaneAntibodies: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, N.Y. (1990), incorporados aqui à guisa de referência. As rea-ções enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com asespecificações do fabricante, conforme comumente realizadas na técnica oucomo descrito aqui. A nomenclatura usada em conjunto com, e os procedi-mentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânicasintética, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelastica, e química medicinal e farmacêutica descritas aqui são aquelas bem-conhecidas e comumente usadas na técnica. As técnicas padrão são usadaspara síntese química, análise química, preparação, formulação, e entregafarmacêutica, e tratamento de pacientes.

Os seguintes termos, salvo indicação em contrário, devem serentendidos com os seguintes significados:

O termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativas ou artificiais,fragmentos de proteína e análogos de polipeptídeo de uma seqüência deproteína. Um polipeptídeo pode ser monomérico ou polimérico.

O termo "proteína isolada", "polipeptídeo isolado" ou "anticorpoisolado" é uma proteína, polipeptídeo ou anticorpo que devido a sua origemou fonte de derivação (1) não está associado a componentes naturalmenteassociados que o acompanham em seu estado nativo, (2) está isento de ou-tras proteínas da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de uma es-pécie diferente , ou (4) não ocorre na natureza. Desta maneira, um polipeptí-deo que é quimicamente sintetizado ou sintetizado em um sistema celulardiferente da célula a partir da qual este naturalmente se origina, ficará"isolado" de seus componentes naturalmente associados. Uma proteínatambém pode ser proporcionada substancialmente isenta de componentesnaturalmente associados por isolamento, utilizando técnicas de purificaçãode proteína bem-conhecidas na técnica.

Em diversas modalidades, um anticorpo anti-miostatina isoladoé aquele que foi purificado por proteína A (vide, por exemplo, Exemplo XVI),um que foi sintetizado por um hibridoma ou outra linha celular in vitro, e/ouum anticorpo anti-miostatina humano derivado de um camundongotransgênico.

Uma proteína ou polipeptídeo é "substancialmente puro", "subs-tancialmente homogêneo", ou "substancialmente purificado" quando pelomenos 60 a 75% de uma amostra exibir uma única espécie de polipeptídeo.

O polipeptídeo ou proteína pode ser monomérico ou multimérico. Um poli-peptídeo ou proteína substancialmente puro irá compreender tipicamentecerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% peso/peso de uma amostra deproteína, mais geralmente cerca de 95%, e de preferência será mais de 99%puro. A pureza ou homogeneidade de proteína pode ser indicada por inúme-ros meio bem-conhecidos na técnica, tal como eletroforese em gel depoliacrilamida de uma amostra de proteína, seguida por visualização de umaúnica faixa de polipeptídeo através de coloração do gel com uma coloraçãobem-conhecida na técnica. Para certos propósitos, uma resolução superiorpode ser proporcionada utilizando HPLC ou outros meio bem-conhecidos natécnica para purificação.

O termo "organismo transgênico não-humano" como usado aquise refere a qualquer criatura viva individual transgênica não-humana, inclusi-ve um animal transgênico não-humano, planta, bactéria, protista, ou fungo.

O termo "fragmento de polipeptídeo" como usado aqui se referea um polipeptídeo que possui uma deleção amino-terminal e/ou carbóxi-terminal, porém onde a seqüência de aminoácido restante é idêntica às po-sições correspondentes na seqüência naturalmente ocorrente. Em algumasmodalidades, os fragmentos possuem pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoácidosde comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos possuem pelo me-nos 14, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150ou 200 aminoácidos de comprimento.

O termo "análogo de polipeptídeo" como usado aqui se refere aum polipeptídeo que compreende um segmento que possui identidadesubstancial a uma parte de uma seqüência de aminoácido e que possui pelomenos uma das seguintes propriedades: (1) ligação específica à miostatinasob condições de ligação adequadas, (2) capacidade de inibir ou ativarmiostatina. Tipicamente, os análogos de polipeptídeo compreendem umasubstituição de aminoácido conservativa (ou inserção ou deleção) com rela-ção à seqüência nativa. Os análogos possuem tipicamente pelo menos 20ou 25 aminoácidos de comprimento, de preferência pelo menos 50, 60, 70,80, 90, 100, 150 ou 200 aminoácidos de comprimento ou mais, e podem sergeralmente tão longos quanto um polipeptídeo de comprimento total. Algu-mas modalidades da invenção incluem anticorpos de fragmentos depolipeptídeo ou análogos de polipeptídeo com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16 ou 17 substituições da seqüência de aminoácido de linha-gem germinativa.

Em certas modalidades, as substituições de aminoácido por umanticorpo anti-miostatina ou parte de ligação de antígeno deste são aquelasque: (1) reduzem a susceptibilidade a proteólise, (2) reduzem a susceptibili-dade a oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para formar complexosde proteína, e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos, porém ainda mantêm a ligação es-pecífica à miostatina. Os análogos podem incluir diversas muteínas de umaseqüência, que não a seqüência normalmente ocorrente. Por exemplo, asúnicas ou múltiplas substituições de aminoácido, de preferência, substitui-ções de aminoácido conservativas, podem ser feitas na seqüêncianormalmente ocorrente, de preferência na parte do polipeptídeo fora do(s)domínio(s) que forma(m) contatos intermoleculares. Uma substituição deaminoácido conservativa não deve alterar substancialmente as característi-cas estruturais da seqüência de origem; por exemplo, uma substituição deaminoácido não deve alterar a estrutura folha-p antiparalela que constitui odomínio de ligação de imunoglobulina que ocorre na seqüência de origem,ou divide outros tipos de estrutura secundária que caracterizam a seqüênciade origem. Em geral, a glicina e prolina não deveriam ser usadas em umafolha-p antiparalela. Exemplos de estruturas secundárias e terciárias depolipeptídeo reconhecidas na técnica estão descritos em Proteins, Structuresand Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company,New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Too-ze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); e Thornton et al., Natu-re 354:105 (1991), incorporados aqui à guisa de referência.

Os análogos não-peptídicos são comumente usados na indústriafarmacêutica como fármacos com propriedades análogas àquelas do peptí-deo padrão. Estes tipos de composto não-peptídica são chamados de"peptídeo miméticos" ou "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res.15:29 (1986); Veber and Freidinger, TINS p.392 (1985); and Evans et al., J.Med. Chem. 30:1229 (1987), incorporados aqui à guisa de referência. Taiscompostos são geralmente desenvolvidos com o auxílio de modelagemmolecular computadorizada. Os peptídeo miméticos que são estruturalmentesimilares a peptídeos terapeuticamente úteis podem ser usados para produ-zir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Geralmente, os peptido-miméticos são estruturalmente similares a um polipeptídeo modelo (isto é,um polipeptídeo que possui uma propriedade bioquímica ou atividade farma-cológica desejada), tal como um anticorpo humano, porém possui uma oumais ligações peptídicas substituídas por uma ligação selecionada a partirdo grupo que consiste em : -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH=CH-(cis etrans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, e -CH2SO-, através de métodos bem-conhecidos na técnica. A substituição sistemática de um ou maisaminoácidos de uma seqüência consenso por um D-aminoácido do mesmotipo (por exemplo, D-lisina em vez de L-lisina) também pode ser usada paragerar peptídeos mais estáveis. Ademais, peptídeos restritos que compreen-dem uma variação de seqüência consenso ou de seqüência consenso subs-tancialmente idêntica podem ser gerados através de métodos conhecidos natécnica (Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992), incorporadoaqui à guisa de referência); por exemplo, ao adicionar resíduos internos decisteína capazes de formar pontes de bissulfeto intramolecular que ciclizamo peptídeo.

Quando um "anticorpo" for referido aqui com relação à invenção,entende-se normalmente que uma parte de ligação de antígeno deste tam-bém pode ser usada. Uma parte de ligação de antígeno compete com oanticorpo intacto para ligação específica. Veja de forma geral, FundamentalImmunoloqy. Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (incor-porado à guisa de referência em sua totalidade para todos os propósitos). Aparte de ligação de antígenos pode ser produzida por técnicas de DNA re-combinante ou clivagem química de anticorpos intactos. Em algumas moda-lidades, a parte de ligação de antígenos inclui Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb,e fragmentos de região determinante de complementaridade (CDR), anticor-pos de cadeia única (scFv), anticorpos quiméricos, anticorpos bivalentes epolipeptídeos que contêm pelo menos uma parte de um anticorpo que ésuficiente para conferir ligação de antígeno específica ao polipeptídeo.

A partir de N-terminal até C-terminal, os domínios variáveis tantode cadeia leve como pesada maduros compreendem, seqüencialmente, asregiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A atribuição deaminoácidos a cada domínio no presente documento está de acordo com asdefinições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (Nati-onal Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), Chothta & Lesk, J.Mol. Biol. 196:901-917 (1987) ou Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Como usado aqui, um anticorpo que é referido por número é i-gual a um anticorpo monoclonal que é obtido a partir do hibridoma do mes-mo número. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 2_112 é igual àqueleanticorpo obtido a partir do hibridoma 2_112, ou um subclone deste, tal co-mo 2_112_1, 2_112_2, e similares. A única exceção é 1_136_3 que é umhibridoma diferente de subclones 1_136_1 e 1_136_2.

Como usado aqui, um fragmento Fd se refere a um fragmento deanticorpo que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv consistenos domínios VL e Vh de um único braço de um anticorpo; e um fragmentodAb (Ward et al., Nature 341:544 a 546 (1989)) consiste em um domínio VH.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de ca-deia única (scFv) onde os domínios VL e Vh são pareados para formar umamolécula monovalente através de um ligante sintético que permite que estessejam formados como uma cadeia de proteína única. (Bird et al., Science242:423 a 426 (1988) e Huston et al., Proc. A/aí/. Acad. Sei. USA 85:5879 a5883 (1988)). Em algumas modalidades , os anticorpos são anticorpos biva-lentes, ou seja, anticorpos com duas valências onde os domínios Vh e Vlsão expressos sobre uma cadeia de polipeptídeo única, porém utilizando umligante que é curto o bastante para permitir o pareamento entre os dois do-mínios sobre a mesma cadeia, desta forma fazendo com que os domíniossejam pareados com domínios complementares de outra cadeia e criandodois sítios de ligação de antígeno. (Vide por exemplo, Holliger P. et al., Proc.A/aí/. Acad. Sei. USA 90:6444 a 6448 (1993), e Poljak R. J. et al., Structure2:1121 a 1123 (1994)). Em algumas modalidades, uma ou mais CDRs de umanticorpo da invenção podem ser incorporadas dentro de uma molécula tan-to de forma covalente como não-covalente para tornar esta umaimunoadesina que se liga especificamente à miostatina. Em tais modalida-des, a(s) CDR(s) pode(m) ser incorporada(s) como parte de uma cadeia depolipeptídeo maior, pode(m) ser covalentemente ligada(s) a outra cadeia depolipeptídeo, ou pode(m) estar não-covalentemente incorporada(s). Ade-mais, as regiões de moldura (FRs) podem ser derivadas de um dos anticor-pos anti-miostatina a partir dos quais uma ou mais CDRs são obtidas ou apartir de um ou mais anticorpos humanos diferentes.

Em modalidades que possuem um ou mais sítios de ligação, ossítios de ligação podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferentes.

Como usado aqui, o termo "anticorpo humano" significa qualqueranticorpo onde as seqüências de domínio variável e constante são seqüên-cias humanas. O termo abrange anticorpos com seqüências derivadas de(isto é, que utilizam) genes humanos, porém que foram alteradas, por exem-plo, para reduzir a possível imunogenicidade, aumentar a afinidade, eliminaras cisteínas que podem causar dobra indesejada, etc. O termo abrange taisanticorpos produzidos de forma recombinante em células não-humanas, quedevem conferir glicosilação não típica de células humanas. Estes anticorpospodem ser preparados de uma variedade de maneiras, como descrito abaixo.

O termo "anticorpo quimérico" como usado aqui se refere a umanticorpo que compreende regiões de dois ou mais anticorpos diferentes.Em uma modalidade, uma ou mais CDRs do anticorpo quimérico são deriva-das de um anticorpo anti-miostatina humano. Em outra modalidade, todas asCDRs são derivadas de anticorpos anti-miostatina humanos. Em outra mo-dalidade, as CDRs com mais de um anticorpo anti-miostatina humano sãocombinadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticorpo quimé-rico pode compreender uma CDR1 da cadeia leve de um primeiro anticorpoanti-miostatina humano, uma CDR2 da cadeia leve de um segundo anticorpoantimiostatina humano e uma CDR3 da cadeia leve de um terceiro anticorpoantimiostatina humano, e CDRs da cadeia pesada podem ser derivadas deum ou mais outros anticorpos antimiostatina humanos. Ademais, as regiõesde moldura podem ser derivadas de um dos anticorpos antimiostatina huma-nos a partir dos quais uma ou mais CDRs são obtidas ou a partir de um oumais anticorpos humanos diferentes.

Em algumas modalidades, um anticorpo quimérico da invençãoé um anticorpo antimiostatina humanizado. Um anticorpo antimiostatina hu-manizado da invenção compreende a seqüência de aminoácido de uma oumais regiões de moldura e/ou a seqüência de aminoácido de pelo menosuma parte da região constante de um ou mais anticorpos anti-miostatinahumanos da invenção compreende seqüências derivadas de um anticorpoantimiostatina não-humano, por exemplo, seqüências de CDR.

Os fragmentos ou análogos de anticorpos ou moléculas deimunoglobulina podem ser facilmente preparados por um versado na técnicaapós as instruções deste relatório descritivo. Os amino e carbóxi-terminaispreferidos de fragmentos ou análogos ocorrem próximos de limites de domí-nios funcionais. Os domínios etruturais e funcionais podem ser identificadospor comparação dos dados de nucleotídeo e/ou seqüência de aminoácidocom bancos de dados de seqüência públicos ou privados. De preferência, osmétodos de comparação computadorizados são usados para identificar mo-tivos de seqüência ou domínios de conformação de proteína previamentediagnosticados que ocorrem em outras proteínas de estrutura e/ou funçãoconhecida. Os métodos para identificar as seqüências de proteína que sedobram formando uma estrutura tridimensional são conhecidos. Vide, Bowieet al., Science 253:164 (1991).

O termo "ressonância de plásmon de superfície", como usadoaqui, se refere a um fenômeno óptico que permite a análise de interaçõesbioespecíficas em tempo real por detecção de alterações em concentraçõesde proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, utilizando osistema BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Pisca-taway, N.J.). Para descrições adicionais, vide Johnsson U. et al., Ann. Biol.Clin. 51:19 a 26 (1993); Jonsson U. et al., Biotechniques 11:620 a 627(1991); Jonsson B. et al., J. Mol. Recognit. 8:125 a 131 (1995); e JohnssonB. et al., Anal. Biochem. 198:268 a 277 (1991).

O termo "KD" se refere à constante de dissociação em equilíbriode uma interação anticorpo-antígeno particular.

O termo "dissociação" significa a constante de taxa dedissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

O termo "epítopo" inclui qualquer determinante de proteína ca-paz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de célula-T ouque interage de outra maneira com uma molécula. Os determinantes epitópi-cos consistem geralmente em agrupamentos de superfície quimicamenteativa de moléculas tais como aminoácidos ou carboidrato ou cadeias lateraisde açúcar e possuem geralmente características estruturais tridimensionaisespecíficas, bem como características de carga específicas. Um epítopo po-de ser "linear" ou "conformacional". Em um epitopo linear, todos os pontosde interação entre a proteína e a molécula de interação (tal como umanticorpo) ocorrem de forma linear ao longo da seqüência de aminoácidoprimária da proteína. Em um epitopo conformacional, os pontos de interaçãoocorrem através de resíduos de aminoácido sobre a proteína que são sepa-rados um do outro. Um anticorpo é considerado para ligar especificamenteum antígeno quando a constante de dissociação for < 1 mM, de preferência< 100 nM e mais preferivelmente < 10 nM. Em certas modalidades, KD é 1pM a 500 pM. Em outras modalidades, KD está entre 500 pM a 1 uM. Emoutras modalidades, KD está entre 1 uJvl a 100 nM. Em outras modalidades,Kd está entre 100 mM a 10 nM. Uma vez que determina-se um epitopo dese-jado sobre um antígeno, é possível gerar anticorpos naquele epitopo, porexemplo, utilizando as técnicas descritas na presente invenção. Alternativa-mente, durante o processo de descoberta, a geração e caracterização deanticorpos pode elucidar informações sobre epitopos desejados. A partirdestas informações, é então possível selecionar de forma competitiva osanticorpos para ligação ao mesmo epitopo. Uma abordagem para obter istoé realizar estudos de concorrência cruzada para encontrar anticorpos que seliga de forma competitiva um ao outro, por exemplo, os anticorpos competempara ligação ao antígeno. Um processo de alto rendimento para "recipiente"de anticorpos baseados em sua concorrência cruzada está descrito no Pedi-do de Patente Internacional N- WO 03/48731.

Como usado aqui, os vinte aminoácidos convencionais e suasabreviações seguem o uso convencional. Veja, Immunoloqy - A Svnthesis(2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunder-land, Mass. (1991)), incorporado aqui à guisa de referência.

O termo "polinucleotídeo" como referido aqui significa uma for-ma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10 bases de comprimento, ouribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos ou uma forma modificada de ambostipos de nucleotídeo. O termo inclui formas de cadeia simples e dupla.

O termo "polinucleotídeo isolado" como usado aqui significa umpolinucleotídeo de origem genômica, cDNA, ou sintética ou algumas combi-nação destes, que devido à sua origem o " polinucleotídeo isolado" (1) nãoestá associado a todos ou parte de um polinucleotídeo com o qual o"polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é ligado de formaoperável a um polinucleotídeo ao qual não está ligado em natureza, ou (3)não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.

O termo "nucleotídeos naturalmente ocorrentes" como usadoaqui inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeosmodificados" como usado aqui inclui nucleotídeos com grupos de açúcarmodificados ou substituídos e similares. O termo "ligações de oligonucleotí-deo" referido aqui inclui ligações de oligonucleotídeos tais como fosforotioa-to, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato,fosforaniladato, fosforoamidato, e similares. Vide por exemplo, LaPlanche etal., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soe.106:6077 (1984); Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al.,Anti-Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oliqonucleotides and Ana-loques: A Practical Approach. pp.87 a 108 (F. Eckstein, Ed., Oxford Univer-sity Press, Oxford England (1991)); Patente Ne U.S. 5.151.510; Uhlmann andPeyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas descrições estão incorpo-radas por meio deste à guisa de referência. Um oligonucleotídeo pode incluiruma marcação para detecção, se desejado.As seqüências "ligadas de forma operável" incluem tanto se-qüências de controle de expressão que são contíguas com o gene de inte-resse como seqüências de controle de expressão que atuam em trans ou emuma distância para controlar o gene de interesse. O termo "seqüência decontrole de expressão" como usado aqui se refere a seqüências de polinu-cleotídeo que são necessárias para efetuar a expressão e processamento deseqüências codificantes às quais estas estão ligadas. As seqüências de con-trole de expressão incluem seqüências de iniciação, término, promotoras eintensificadoras de transcrição apropriadas; sinais de processamento deRNA eficientes tais como sinais de junção e poliadenilação; seqüências queestabilizam o mRNA citoplásmico; seqüências que aumentam a eficiência detradução (isto é, seqüência consenso Kozak); seqüências que aumentam aestabilidade de proteína; e quando desejado, seqüências que aumentam asecreção de proteína. A natureza de tais seqüências de controle se diferedependendo do organismo hospedeiro; em procariotos, tais seqüências decontrole incluem geralmente promotor, sítio de ligação ribossomal e seqüên-cia de término de transcrição; em eucariotos, geralmente, tais seqüências decontrole incluem promoteres e seqüência de término de transcrição. O termo"seqüências de controle" pretende incluir, no mínimo, todos os componentescuja presença é essencial para a expressão e processamento, e tambémpodem incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exem-plo, seqüências líder e seqüências associadas de fusão.

O termo "vetor", como usado aqui, significa uma molécula deácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual este foi li-gado. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmídeo, isto é, uma partepadrão dupla circular de DNA dentro da qual os segmentos de DNA adicio-nais podem ser ligados. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral,onde os segmentos de DNA adicionais podem ser ligados dentro do genomaviral. Em algumas modalidades, os vetores são capazes de replicação autô-noma em uma célula hospedeira dentro da qual estes são introduzidos (porexemplo, vetores bacterianos que possuem uma origem bacteriana de repli-cação e vetores de mamífero epissomal). Em outras modalidades, os veto-res (por exemplo, vetores de mamífero não-epissomal) podem ser integra-dos dentro do genoma de uma célula hospedeira mediante introdução dentroda célula hospedeira, e desse modo, são replicados juntamente com o ge-noma hospedeiro. Ademais, certos vetores são capazes de dirigir a expres-são de gene à qual estes estão ligados de forma operável. Tais vetores sãoreferidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente,"vetores de expressão").

O termo "células hospedeira recombinante" (ou simplesmente"célula hospedeira"), como usado aqui, significa uma célula dentro da qualum vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser entendido quea "célula hospedeira recombinante" e "célula hospedeira" significam não só acélula em questão particular como também a progênie de tal célula. Devido àpossibilidade de ocorrer certas modificações em gerações seguintes tantodevido à mutação como a influências ambientais, tal progênie pode não ser,na verdade, idêntica à célula de origem, porém ainda está incluída dentro doescopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui.

O termo "se hibridizar seletivamente" referido aqui significa seligar de forma detectável e específica. Os polinucleotídeos, oligonucleotídeose fragmentos destes de acordo com a invenção se hibridizam seletivamenteem cadeias de ácido nucléico sob condições de hibridização e lavagem queminimizam as quantidades notáveis de ligação detectável a ácidos nucléicosnão-específicos. Condições de "alta estringência" ou "altamente estringente"podem ser usadas para obter condições de hibridização seletivas como co-nhecido na técnica e discutido aqui. Um exemplo de condições de "alta es-tringência" ou "altamente estringente" é a incubação de um polinucleotídeocom outro polinucleotídeo, onde um polinucleotídeo pode ser adicionado auma superfície sólida tal como uma membrana, em um tampão de hibridiza-ção de 6X SSPE ou SSC, 50% de formamida, 5X de reagente de Denhardt,0,5% de SDS, 100 |^g/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado, frag-mentado em uma temperatura de hibridização de 429C durante 12 a 16 ho-ras, após lavar duas vezes a 55QC utilizando um tampão de lavagem de 1XSSC, 0,5% de SDS. Vide tambeém Sambrook et al., supra, pp. 9.50-9.55.O termo "porcentagem de identidade de seqüência" no contextode seqüências de ácido nucleico significa os resíduos em duas seqüênciasque são iguais quando alinhadas para correspondência máxima. O compri-mento de comparação de identidade de seqüência pode estar acima de umaextensão de pelo menos cerca de nove nucleotídeos, geralmente pelo me-nos cerca de 18 nucleotídeos, mais geralmente pelo menos cerca de 24 nu-cleotídeos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipica-mente pelo menos cerca de 32 nucleotídeos, e de preferência pelo menoscerca de 36, 48 ou mais nucleotídeos. Há inúmeros algoritmos diferentesconhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade deseqüência de nucleotídeo. Por exemplo, as seqüências de polinucleotídeopodem ser comparadas utilizando FASTA, Gap ou Bestfit, que são progra-mas no Pacote Wisconsin Versão 10.0, Genetics Computer Group (GCG),Madison, Wisconsin. FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA2e FASTA3, proporciona alinhamentos e porcentagem de identidade de se-qüência das regiões de melhor superposição entre as seqüências de consul-ta e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol. 183:63 a 98 (1990); Pearson,Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol.266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998); incorporadosaqui à guisa de referência). Salvo especificação em contrário, os parâmetrospadrão de um programa ou algoritmo particular são usados. Por exemplo, aporcentagem de identidade de seqüência entre seqüências de ácido nucleicopode ser determinada utilizando FASTA com seus parâmetros padrão (umtamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de contagem) ouutilizando Gap com seus parâmetros padrão como proporcionado em GCGVersão 6.1, incorporado aqui à guisa de referência.

Uma referência a uma seqüência de nucleotídeo abrange seucomplemento, salvo especificação em contrário. Desta maneira, uma refe-rência a um ácido nucleico que possui uma seqüência particular deve serentendida incluindo sua cadeia complementar, com sua seqüência comple-mentar.

Como usado aqui, os termos "porcentagem de identidade deseqüência" e "porcentagem de homologia de seqüência" são usados de for-ma intercambiável.

O termo "similaridade substancial" ou "similaridade de seqüênciasubstancial," quando referido a um ácido nucléico ou fragmento deste, signi-fica que quando otimamente alinhado com inserções ou deleções de nucleo-tídeo apropriadas com outro ácido nucléico (ou sua cadeia complementar),há identidade de seqüência de nucleotídeo de pelo menos cerca de 85%, depreferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente, pelo menoscerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases de nucleotídeo, comomedido por qualquer algoritmo bem-conhecido de identidade de seqüência,tal como FASTA, BLAST ou Gap, como discutido acima.

Como aplicado a polipeptídeos, o termo "identidade substancial"significa que duas seqüências de peptídeo, quando otimamente alinhadas,tal como através dos programas GAP ou BESTFIT que utilizam pesos dife-renciais como fornecidos com os programas, compartilham.pelo menos 70%,75% ou 80% de identidade de seqüência, de preferência, pelo menos 90%ou 95% de identidade de seqüência, e mais preferivelmente, pelo menos97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência. Em certas modalidades, asposições de resíduo que não são idênticas se diferem por substituições deaminoácido conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" éaquela onde um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo deaminoácido que possui um grupo de cadeia lateral R com propriedades quí-micas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, umasubstituição de aminoácido conservativa não irá alterar substancialmente aspropriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou maisseqüências de aminoácidos se diferem uma da outra por substituições con-servativas, a porcentagem de identidade de seqüência pode ser ajustadapara cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Os meiospara fazer este ajuste são bem-conhecidos pelo versado na técnica. Vide,por exemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243:307-31 (1994). Exemplos degrupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedadesquímicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, va-lina, leucina, e isoleucina; 2) cadeias laterais de hidroxila alifáticas: serina etreonina; 3) cadeias laterais dotadas de amida: asparagina e glutamina; 4)cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias late-rais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais acídicas: ácidoaspártico e ácido glutâmico; e 7) cadeias laterais dotadas de enxofre: cisteí-na e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativa são:valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina,glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer alte-ração que possui um valor positivo na matriz PAM250 de log da verossimi-lhança descrita em Gonnet et al., Science 256:1443-45 (1992), incorporadoaqui à guisa de referência. Uma substituição "moderadamente conservativa"é qualquer alteração que possui um valor não-negativo na matriz PAM250de log da verossimilhança.

A identidade de seqüência de polipeptídeos é tipicamente medi-da utilizando software de análise de seqüência. O software de análise deproteína adapta seqüências utilizando medidas de similaridade atribuídas adiversas substituições, deleções e outras modificações, inclusive substitui-ções de aminoácido conservativas. Por exemplo, GCG contém programastais como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usados com parâmetros padrãocomo especificado pelos programas para determinar a homologia de se-qüência ou identidade de seqüência entre polipeptídeos intimamente rela-cionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de or-ganismos ou entre uma proteína tipo selvagem e uma muteína da mesma.

Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1 (University of Wisconsin, Wl). As se-qüências de polipeptídeo também podem ser comparadas utilizando FASTAque utiliza parâmetros padrão ou recomendados, vide, GCG Versão 6.1.FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e por-centagem de identidade de seqüência das regiões da melhor superposiçãoentre as seqüências de consulta e pesquisa (Pearson, Methods Enzymol.183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000)). Outroalgoritmo preferido quando se compara uma seqüência da invenção com umbanco de dados que contém um grande número de seqüências de organis-mos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente blastpou tblastn, que utiliza parâmetros padrão como fornecidos com os progra-mas. Vide, por exemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990);Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997).

O comprimento de seqüências de polipeptídeo comparado parahomologia será geralmente pelo menos cerca de 16 resíduos de aminoácido,geralmente pelo menos cerca de 20 resíduos, mais geralmente pelo menoscerca de 24 resíduos, tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos, e depreferência, mais de cerca de 35 resíduos. Quando se examina um banco dedados que contém seqüências de um grande número de organismos diferen-tes, é preferível comparar a seqüência de aminoácidos.

Como usado aqui, os termos "marcador" ou "marcado" se refe-rem à incorporação de outra molécula no anticorpo. Em uma modalidade, omarcador é um marcador detectável, por exemplo, a incorporação de umaminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de porções de bioti-nila que podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo, estrepta-vidina que contém um marcador fluorescente ou atividade enzimática quepode ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos). Em outra moda-lidade, o rótulo ou marcador pode ser terapêutico, por exemplo, um conjuga-do de fármaco ou toxina. Diversos métodos para marcar polipeptídeos e gli-coproteínas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplos demarcadores para polipeptídeos incluem, porém sem caráter limitativo, os se-guintes: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y,"Tc, 111ln, 125l, 131l), marcadores fluorescentes (por exemplo, FITC, rodami-na, fósforos de lantanídeo), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxi-dase de rábano silvestre, (3-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina),marcadores quimiluminescentes, grupos biotinila, epitopos de polipeptídeopredeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo,seqüências de par de zíper de leucina, sítios de ligação de anticorpos se-cundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epitopo), agentesmagnéticos, tais como quelatos de gadolínio, toxinas tais como toxina dacoqueluche, taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina,mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colquicina, do-xorrubicina, daunorrubicina, diona antracina diidróxi, mitoxantrona, mitrami-cina, actinomicina D, 1-deidrotestosterona, glucocorticóide, procaína, tetra-caína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.Em algumas modalidades, os marcadores são ligados por braços espaçado-res de diversos comprimentos para reduzir o congestionamento estérico po-tencial.

Ao longo deste relatório descritivo e reivindicações, a palavra"compreender," ou variações tais como "compreende" ou "compreendendo",será entendida por implicar a inclusão de um número inteiro estabelecido ougrupo de números inteiros, porém não a exclusão de nenhum outro númerointeiro ou grupo de números inteiros.

Anticorpos Anti-Miostatina Humanos e Caracterização Destes

A invenção no presente documento proporciona anticorpos anti-miostatina. Em algumas modalidades, os anticorpos são humanos. Em ou-tras modalidades, os anticorpos são humanizados. Em algumas modalida-des, os anticorpos anti-miostatina humanos são produzidos ao imunizar umanimal transgênico não-humano, por exemplo, um roedor, cujo genomacompreende genes de imunoglobulina humanos de modo que o animaltransgênico produza anticorpos humanos.

Um anticorpo anti-miostatina da invenção pode compreenderuma cadeia leve humana kappa ou humana lambda ou uma seqüência deaminoácido derivada deste. Em algumas modalidades que compreendemuma cadeia leve kappa, o domínio variável de cadeia leve (VL) utiliza um ge-ne VK A30, A3 ou L2 humano.

Em algumas modalidades, V|_ do anticorpo anti-miostatina com-preende uma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácido(adições) relativas à seqüência de aminoácido V« de linhagem germinativa.

Em algumas modalidades, VL do anticorpo anti-miostatina compreende 1, 2,3, 4 ou 5 substituições de aminoácido com relação à seqüência de aminoá-cido V«. Em algumas modalidades, uma ou mais substituições de linhagemgerminativa está nas regiões de CDR da cadeia leve. Em algumas modali-dades, as substituições de aminoácido VK relativas à linhagem germinativaestão em uma ou mais das mesmas posições que as substituições relativasà linhagem germinativa encontrada em qualquer um dos VL dos anticorposproporcionados aqui. Por exemplo, VL de um anticorpo anti-miostatina dainvenção pode conter uma ou mais substituições de aminoácido comparadascom linhagem germinativa encontrada em VL de anticorpo 1_257_1. Podehaver também uma ou mais substituições de aminoácido comparadas com alinhagem germinativa encontrada em VL de anticorpo 1_116_1, que utiliza omesmo gene V« que o anticorpo 1_257_1. Em algumas modalidades, oaminoácido se altera em uma ou mais das mesmas posições, porém envolveuma substituição diferente daquela no anticorpo de referência. Em todos oscasos, a recitação de um clone de anticorpo com traços é equivalente aomesmo clone de anticorpo com pontos (por exemplo, 1_257_1 = 1.257.1).

Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido relati-vas à linhagem germinativa ocorrem em uma ou mais das mesmas posiçõesque as substituições de linhagem germinativa em qualquer um dos Vl deanticorpos 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1,1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1 L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V, porém as substituições podem representarsubstituições de aminoácido conservativas em tal(is) posição(ões) relativa(s)ao aminoácido no anticorpo de referência. Por exemplo, se uma posição par-ticular em um destes anticorpos for alterada com relação à linhagem germi-nativa e para glutamato, alguém pode substituir aspartato naquela posição.

De forma similar, se uma substituição de aminoácido comparada com linha-gem germinativa em um anticorpo exemplificado for serina, alguém podesubstituir de forma conservativa treonina por serina naquela posição. Assubstituições de aminoácido conservativas são discutidas supra, ao longodeste pedido.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-miostatina compre-ende uma seqüência de aminoácido de cadeia leve selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40 e44. Em outras modalidades, a cadeia leve compreende a seqüência de ami-noácido de cadeia leve de anticorpo 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211;2_112_1L-F58I; 2_112_1 L-I85V ou 2_112_1L-F58I, I85V. Em algumas mo-dalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-miostatina humano compreende aseqüência de aminoácido VL de anticorpo 1_116_1 (SEQ ID NO: 4);1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO:24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20); 1_66_1 (SEQ IDNO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1(SEQ ID NO: 8); ou 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) ou dita seqüência de aminoá-cido que possui até 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoácido conservativase/ou um total de até 3 substituições de aminoácido não-conservativas. Emoutras modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-miostatina humanocompreende a seqüência de aminoácido VL de anticorpo 1_116_1L-Q45K;1_257_1 L-L21I; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V ou 2_112_1 L-F58I, I85V.Em algumas modalidades, a cadeia leve compreende a seqüência de ami-noácido a partir do início da CDR1 até o final da CDR3 de qualquer um dosanticorpos anteriores.

Em algumas modalidades, a cadeia leve pode compreender aseqüência de aminoácidos de regiões CDR1, CDR2 e CDR3 independente-mente selecionadas das regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, res-pectivamente, de dois ou mais anticorpos monoclonais selecionados a partirde 1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ IDNO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1(SEQ ID NO: 20); 1_66_1 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44);2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); ou 1_268_1 (SEQ IDNO: 32), ou cada dita região CDR que possui menos que 3 ou menos que 2substituições de aminoácido conservativas e/ou um total de três ou menossubstituições de aminoácido não-conservativas.

Em certas modalidades, a cadeia leve do anticorpo anti-miostatina compreende a seqüência de aminoácidos das regiões CDR1,CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partir de1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQ ID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO:16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1 (SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ IDNO: 20); 1_66_1 (SEQ ID NO: 36); 2_43_1 (SEQ ID NO: 44); 2_177_1 (SEQID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO: 8); ou 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) ou cadadita região CDR que possui menos que 3 ou menos que 2 substituições deaminoacido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições deaminoacido não-conservativas.

Com relação à cadeia pesada, em algumas modalidades, o do-mínio variável (VH) utiliza um gene VH 1-02, VH 3-21 ou VH 3-23 humano. Emalgumas modalidades, a seqüência Vh de anticorpo anti-miostatina contémuma ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoacido (adições),coletivamente "mutações", relativas às seqüência de aminoacido Vh de li-nhagem germinativa. Em algumas modalidades, o domínio variável da ca-deia pesada compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 mutações da se-qüência de aminoacido Vh de linhagem germinativa. Em algumas modalida-des, a(s) mutação(ões) são substituições não-conservativas comparadascom a seqüência de aminoacido de linhagem germinativa. Em algumas mo-dalidades, as mutações estão nas regiões CDR da cadeia pesada.

Em algumas modalidades, as substituições de aminoacido estãoem uma ou mais das mesmas posições que as substituições de linhagemgerminativa em qualquer um dos Vh de anticorpos 1_116_1, 1_136_3,1 _257_1, 1 _46_1, 2_112_1, 1 _314_1, 1 _66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1 _132_1,1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1 H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. Em outrasmodalidades, o aminoacido se altera em uma ou mais das mesmas posi-ções, porém envolve uma substituição diferente daquela no anticorpo de re-ferência.

Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende umaseqüência de aminoacido selecionada a partir do grupo que consiste em- SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 e 42. Em outra modalida-des, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácido de cadeiapesada de anticorpo 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; ou 2_112_1H-I12V.Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende a seqüência deaminoácido VH de anticorpo 1_116_1 (SEQ ID NO: 2), 1_136_3 (SEQ ID NO:10), 1_257_1 (SEQ ID NO: 14), 1_46_1 (SEQ ID NO: 22), 2_112_1 (SEQ IDNO: 26), 1_314_1 (SEQ ID NO: 18), 1_66_1 (SEQ ID NO: 34), 2_43_1 (SEQID NO: 42), 2_177_1 (SEQ ID NO: 38), 1_132_1 (SEQ ID NO: 6) e 1_268_1(SEQ ID NO: 30); ou dita seqüência de aminoácido VH que possui até 1, 2, 3,4, 6, 8, 9, 10 ou 11 substituições de aminoácido conservativas e/ou um totalde até 3 substituições de aminoácido não-conservativas. Em outras modali-dades, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácido Vh de anti-corpo 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; ou 2_112_1H-I12V. Em algumasmodalidades, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácido apartir do início da CDR1 até o fim da CDR3 de qualquer um dos anticorposanteriores.

Em algumas modalidades, a cadeia pesada compreende as re-giões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de anticorpo 1_116_1,1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1,1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A;1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V ou cada dita região de CDR que possui menos que 8, menos que6, menos que 4, ou menos que 3 substituições de aminoácido conservativase/ou um total de três ou menos substituições de aminoácido não-conservativas.

Em algumas modalidades, as regiões de CDR de cadeia pesadasão independentemente selecionadas a partir das regiões de CDR de doisou mais anticorpos selecionados a partir de anticorpos 1_116_1, 1_136_3,1 _257_1, 1 _46_1, 2_112_1, 1 _314_1, 1 _66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1 _132_1,1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. Em outramodalidade, o anticorpo compreende uma cadeia leve como descrito acimae uma cadeia pesada como descrito acima. Em uma modalidade adicional,as CDRs de cadeia leve e CDRs de cadeia pesada pertencem ao mesmoanticorpo.

Em diversas modalidades, os anticorpos anti-miostatina possu-em a(s) seqüência(s) de aminoácido de cadeia pesada de comprimento totale de cadeia leve de comprimento total, as seqüências de aminoácidos Vh eVL, seqüência de aminoácidos de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada eCDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve ou a seqüência de aminoácido de ca-deia pesada a partir do início da CDR1 até o fim da CDR3 e a seqüência deaminoácido de cadeia leve a partir do início da CDR1 até o fim da CDR3 deum anticorpo anti-miostatina proporcionado aqui.

Um tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita é alte-rar uma ou mais cisteínas no anticorpo, que pode ser quimicamente reativo,a outro resíduo, tal como, sem caráter limitativo, alanina ou serina. Em outramodalidade, há uma a substituição de uma cisteína não-canônica. A substi-tuição pode ser feita em uma CDR ou região de moldura de um domínio va-riável ou no domínio constante de um anticorpo. Em algumas modalidades, acisteína é canônica.

Outro tipo de substituição de aminoácido que pode ser feita éremover sítios proteolíticos potenciais no anticorpo. Tais sítios podem ocor-rer em uma CDR ou região de moldura de um domínio variável ou no domí-nio constante de um anticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e re-moção de sítios proteolíticos pode reduzir o risco de heterogeneidade noproduto de anticorpo e, desta maneira, aumentar sua homogeneidade. Outrotipo de substituição de aminoácido é eliminar os pares asparagina-glicina,que formam sítios de desamidação potenciais, ao alterar um ou ambos osresíduos.

Em algumas modalidades, a lisina C-terminal da cadeia pesadado anticorpo anti-miostatina da invenção é clivada. Em diversas modalidadesda invenção, as cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-miostatina podemincluir opcionalmente uma seqüência de sinal.Em um aspecto, a invenção proporciona onze anticorpos mono-clonais anti-miostatina humanos inibidores e as linhas celulares de hibridomaque os produz. A Tabela 1 lista os identificadores de seqüência (SEQ IDNOs) dos ácidos nucléicos que codificam as cadeias pesada e leve de com-primento total e partes dotadas de domínio variável daquelas cadeias, e aseqüência de aminoácido deduzida de comprimento total.

Tabela 1

<table>table see original document page 45</column></row><table>

A invenção proporciona adicionalmente variantes de cadeia pe-sada e/ou leve de certos anticorpos anti-miostatina humanos listados acima,que compreendem uma ou mais modificações de aminoácido. Para designaras variantes, a primeira letra é uma letra que simboliza o aminoácido da ca-deia de anticorpo naturalmente ocorrente, o número se refere à posição doaminoácido (onde a posição um é o aminoácido N-terminal de FRI), e a se-gunda letra é letra que simboliza o aminoácido variante.

A invenção proporciona uma variante de cadeia leve de anticor-po monoclonal 1_116_1 chamada 1_116_1L-Q45K, que possui uma lisina naposição 45 de SEQ ID NO: 4.Outra variante de cadeia leve é 1_257_1 L-L211, que possui umresíduo de isoleucina na posição 21 de SEQ ID NO: 16.

Uma variante de cadeia pesada de anticorpo monoclonal de1_314_1 chamada 1_314_1H-T92A, que possui um resíduo de alanina naposição 92 de SEQ ID NO: 18.

A invenção proporciona adicionalmente uma variante de cadeiapesada de anticorpo monoclonal 1_46_1 chamada 1_46_1H-L81M, que pos-sui uma metionina na posição 81 de SEQ ID NO: 22.

A invenção proporciona uma variante de cadeia pesada (I12V) eduas variantes de cadeia leve (F58I e I85V) de anticorpo monoclonal2_112_1. As variantes de cadeia pesada chamada 2_112_1 H-I12V possuiuma valina na posição 12 de SEQ ID NO: 26. Uma variante de cadeia leve,2_112_1 L-F85I, possui uma isoleucina na posição 85 de SEQ ID NO: 28. Aoutra variante de cadeia leve, chamada 2_112_1L-I85V, possui uma valinana posição 85 de SEQ ID NO: 28. A invenção também proporciona uma va-riante de cadeia leve que compreende ambas mutações, isto é, 2_112_1L-F85I, I85V. A invenção também inclui anticorpos que compreendem a varian-te de cadeia pesada tanto com uma como ambas mutações de cadeia leve,ou seja, 2_112_1H-I12V, L-F58I; 2_112_1H-I12V, L-I85V; e 2_112_1H-I12V,L-F58I, I85V.

Ainda em modalidades adicionais, a invenção inclui anticorposque compreendem seqüência de aminoácido de domínio variável com maisde 80%, mais de 85%, mais de 90%, mais de 95%, mais de 96%, mais de97%, mais de 98% ou mais de 99% de identidade de seqüência com umaseqüência de aminoácido de domínio variável de qualquer anticorpo anti-miostatina humano listado acima.

Classe e Subclasse de Anticorpos Anti-miostatina

A classe e subclasse de anticorpos anti-miostatina podem serdeterminadas por qualquer método conhecido na técnica. Em geral, a classee subclasse de um anticorpo podem ser determinadas utilizando anticorposque são específicos para uma classe e subclasse particular de anticorpo.Tais anticorpos estão comercialmente disponíveis. A classe e subclasse po-dem ser determinadas por ELISA, ou Western Blot bem como outras técni-cas. Alternativamente, a classe e subclasse podem ser determinadas ao se-qüenciar todo ou parte dos domínios constantes das cadeias pesada e/ouleve dos anticorpos, comparar sua seqüência de aminoácido com aseqüência de aminoácido conhecida de diversas classes e subclasses deimunoglobulinas, e determinar a classe e subclasse dos anticorpos.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-miostatina é um anti-corpo monoclonal. O anticorpo anti-miostatina pode ser uma molécula IgG,IgM, IgE, IgA, ou IgD. Em uma modalidade preferida, o anticorpo anti-miostatina é uma IgG e é uma subclasse de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4. Em ou-tra modalidade preferida, o anticorpo é subclasse de lgG2.Identificação de Epitopos de Miostatina Reconhecidos por Anticorpos Anti-miostatina

A invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-miostatinahumano que se liga à miostatina e concorre ou concorre reciprocamentecom e/ou se liga ao mesmo epitopo que: (a) um anticorpo selecionado a par-tir de 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1,2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1 L-Q45K; 1_257_1L-L21I;1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; (b) um anticorpo que compreende um domí-nio variável de cadeia pesada que possui a seqüência de aminoácido dodomínio VH em qualquer uma entre SEQ ID NOS: 2, 6, 10,14, 18, 22, 26, 30,34, 38, 42, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 ou 85, (c) um anticorpo quecompreende um domínio variável de cadeia leve que possui a seqüência deaminoácido do domínio VL em qualquer uma entre SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16,20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 ou 87 (d) umanticorpo que compreende tanto um domínio variável de cadeia pesada co-mo definido em (b) como um domínio variável de cadeia leve como definidoem (c).

Alguém pode determinar se um anticorpo se liga ao mesmo epi-topo ou concorre reciprocamente para a ligação com um anticorpo anti-miostatina utilizando métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade,alguém permite que o anticorpo anti-miostatina da invenção se ligue à mios-tatina sob condições de saturação e então mede a capacidade do anticorpode teste se ligar à miostatina. Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar àmiostatina ao mesmo tempo que o anticorpo anti-miostatina de referência,então o anticorpo de teste se liga a um epitopo diferente do anticorpo anti-miostatina de referência. Entretanto, se o anticorpo de teste não for capaz dese ligar à miostatina ao mesmo tempo, então o anticorpo de teste se liga aomesmo epitopo, um epitopo de superposição, ou um epitopo que está emestrita proximidade ao epitopo ligado pelo anticorpo anti-miostatina da inven-ção. Este experimento pode ser realizado utilizando ELISA, RIA, BIACORE®,ou citometria de fluxo. Para testar se um anticorpo anti-miostatina concorrereciprocamente com outro anticorpo anti-miostatina, alguém pode usar o mé-todo de concorrência descrito acima em duas direções, ou seja, determinarse o anticorpo conhecido bloqueia o anticorpo de teste e vice versa. Em umamodalidade preferida, o experimento é realizado utilizando ELISA.

Inibição de Atividade de Miostatina por Anticorpo Anti-miostatina

Alguém pode identificar os anticorpos monoclonais anti-miostatina que inibem a ligação de miostatina utilizando inúmeras análises.

Por exemplo, os anticorpos anti-miostatina de neutralização podem ser iden-tificados por sua capacidade de bloquear atividade de luciferase induzida pormiostatina em células A204 transfectadas com um constructo de elemen-tos/luciferase de resposta Smad como descrito no Exemplo III. Os anticorposanti-miostatina preferidos possuem um IC50 de não mais que 500nM, 250nM,100nM, 75nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 1nM, 0,5nM ou 0,1 nM.

Alguém também pode determinar a capacidade de um anticorpoanti-miostatina de bloquear a ativação de proteína Smad induzida por mios-tatina ao contactar células de mioblasto de ratos L6 transfectadas com umconstructo de beta lactamase/elemento de ligação-2/3 Smad com um anti-corpo anti-miostatina como descrito no Exemplo IV. Em diversas modalida-des, o anticorpo anti-miostatina possui um IC50 nesta análise de não maisque 500nM, 250nM, 100nM, 75nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 1nM,0,5nM ou 0,1nM.

Alternativamente, os anticorpos anti-miostatina de neutralizaçãopodem ser identificados por sua capacidade de inibir a fosforilação de Smad2 ou 3 em uma análise de Western Blot como descrito no Exemplo V.

Em outras modalidades, um anticorpo anti-miostatina da inven-ção modula a expressão de genes associados com a proliferação e diferen-ciação de célula muscular. Tal modulação inclui, porém sem caráter limitati-vo, reduzir a expressão da proteína P21 de inibidor de ciclo celular e proteí-na Bax pró-apoptótica, aumentar a fosforilação de Rb, e aumentar a expres-são de Cdk2. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-miostatina anta-gonista da invenção aumentam a expressão de MyoD, miogenina e Myf5. Oefeito de um anticorpo anti-miostatina sobre a expressão genética pode serdeterminado utilizando inúmeras técnicas de rotina. (Vide, por exemplo, E-xemplo VI).

Em algumas modalidades, um anticorpo anti-miostatina de neu-tralização da invenção aumenta a diferenciação de mioblasto. A capacidadede um anticorpo aumentar tal proliferação e diferenciação pode ser determi-nada por análises que utilizam, por exemplo, células C2C12 como descritono Exemplo VII.

Anticorpos Anti-miostatina Humanos Competitivos vs Não-competitivos

Os anticorpos anti-miostatina humanos da invenção podem sercategorizados como competitivos e não-competitivos com outras proteínasde ligação de miostatina inibidoras que utilizam experimentos de imunopre-cipitação. Por exemplo, o pró-peptídeo, que forma um complexo com GDF8maduro, é uma proteína inibidora. O meio condicionado de células 293T queexpressam GDF8 contém GDF8 maduro, GDF8 maduro/complexo de pró-peptídeo e GDF8 não-processado. Os estudos de imunoprecipitação foramrealizados para testar a ligação dos anticorpos anti-miostatina humanos nainvenção a GDF8 maduro/complexo de pró-peptídeo utilizando este meiocondicionado. Como descrito no Exemplo X, os anticorpos 2_112_1, 2_43_1e 2_177_1 ligaram e imunoprecipitaram GDF8 maduro, GDF8 madu-ro/complexo de pró-peptídeo, e GDF8 não-processado. O anticorpo 1_66_1ligou e imunoprecipitou GDF8 maduro e GDF8 maduro/complexo de pró-peptídeo. Nenhum destes anticorpos imunoprecipitou GDF8 maduro, pró-peptídeo, ou GDF8 não-processado. Os anticorpos 2_112_1, 2_43_1 e2_177_1, desta maneira, são anticorpos não-competitivos, e anticorpo1_66_1 também é um anticorpo não-competitivo, porém um que se liga a umepitopo diferente de miostatina. Um anticorpo de neutralização não-competitivo, isto é, um que se liga à miostatina na presença de outras prote-ínas inibidoras, terá melhor eficácia in vivo do que um anticorpo competitivo.

Em outras modalidades, um anticorpo anti-miostatina da inven-ção imunoprecipita GDF8 maduro a partir de soro de camundongo. Comodescrito no Exemplo XI, os anticorpos monoclonais 2_112, 2_43_1 e 2_ ob-têm mais GDF8 madura do que 1_116_1 e 1_66_1.

Especificidade de Espécie e Seletividade Molecular

Em outro aspecto da invenção, os anticorpos anti-miostatinademonstram tanto especificidade de espécie como seletividade molecular.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-miostatina se liga a miostatina emseres humanos, camundongo, Rattus norvegicus (rato Norway), cynomolgusmacaque (macaco), Macaca fascicularis (macaco caranguejeiro), Meleagrisgallopavo (peru), Sus scrofa (porco), Gallus gallus (galo), Gallus gallus (ga-Io), Canis familiaris (cão), Equus caballus (cavalo), Coturnix chinensis (co-dorna), Coturnix coturnix (codorna comum), e Columba livia (pombo co-mum). Após as instruções do relatório descritivo, alguém pode determinar aespecificidade de espécie do anticorpo anti-miostatina utilizando métodosbem-conhecidos na técnica. Por exemplo, alguém pode determinar a especi-ficidade de espécie utilizando análise de Western blot, ressonância deplásmon de superfície, por exemplo, BlAcore, ELISA, imunoprecipitação ouRIA.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-miostatina possui umaseletividade de miostatina sobre GDF11 de pelo menos 50 dobras ou pelomenos 100 dobras. GDF11 é um elemento de família próxima de miostatinaque compartilha noventa porcento de identidade em sua proteína madura.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-miostatina não exibe nenhumaligação específica notável a nenhuma outra proteína que não miostatina.Alguém pode determinar a seletividade do anticorpo anti-miostatina de mios-tatina utilizando métodos bem-conhecidos na técnica seguindo as instruçõesdo relatório descritivo. Por exemplo, alguém pode determinar a seletividadeutilizando análise de Western blot, citometria de fluxo, ELISA, imunoprecipi-tação ou RIA.

Em outras modalidades da invenção, o anticorpo anti-miostatinanão possui este alto grau de seletividade para GDF8 sobre GDF11.

Métodos para Produzir Anticorpos e Linhas Celulares Produtoras de Anticorpo

Imunização

Em algumas modalidades, os anticorpos humanos são produzi-dos ao imunizar um animal não-humano, transgênico que compreende den-tro de seu genoma algum ou todos os locos de cadeia leve e cadeia pesadade imunoglobulina humana com um antígeno de miostatina. Em uma moda-lidade preferida, o animal não-humano é um animal XENOMOUSE® (Abge-nix, Inc., Fremont, CA).

Os camundongos XENOMOUSE® são cepas de camundongosengenheirados que compreendem grandes fragmentos de locos de cadeialeve e cadeia pesada de imunoglobulina humana e são deficientes em pro-dução de anticorpo de camundongo. Vide, por exemplo, Green et al., NatureGenetics 7:13-21 (1994) e Patentes U.S. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615,5.998.209, 6.075.181, 6.091.001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963 e6.150.584. Vide também, WO 91/10741, WO 94/02602, WO 96/34096, WO96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO99/53049, WO 00/09560, e WO 00/037504.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para fa-bricar anticorpos anti-miostatina de animais não-humanos, não-camundongos ao imunizar animais transgênicos não-humanos que compre-endem locos de imunoglobulina humana com um antígeno de miostatina.

Alguém pode produzir tais animais utilizando os métodos descritos nos do-cumentos citados acima. Os métodos descritos nestes documentos podemser modificados como descrito na Patente U.S. 5.994.619, que está incorpo-rada por meio deste à guisa de referência. A Patente U.S. 5.994.619 descre-ve métodos para produzir novas linhas celulares e células de massa de célu-la interna (CICM) cultivadas, derivadas de porcos e vacas, e células deCICM transgênicas dentro das quais o DNA heterólogo foi inserido. As célu-las de CICM transgênicas podem ser usadas para produzir embriões, fetos eprodutos transgênicos clonados. A patente '619 também descreve métodospara produzir animais transgênicos que são capazes de transmitir o DNAheterólogo para sua progênie. Em modalidades preferidas da presente in-venção, os animais não-humanos são mamíferos, particularmente, ratos,carneiro, porcos, cabras, gados, cavalos ou galinhas.

Os camundongos XENOMOUSE® produzem um repertório hu-mano tipo adulto de anticorpos completamente humanos e geram anticorposhumanos específicos de antígeno. Em algumas modalidades, os camundon-gos XENOMOUSE® contêm aproximadamente 80% do repertório de gene Vde anticorpo humano através da introdução de fragmentos de configuraçãode linhagem germinativa dimensionada em megabase dos locos de cadeiapesada humana e locos de cadeia leve kappa em cromossomo artificial delevedura (YAC). Em outras modalidades, os camundongos XENOMOUSE®contêm de forma adicional aproximadamente todo o loco de cadeia levelambda. Vide, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green andJakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), e WO 98/24893, cujas descri-ções estão incorporadas por meio deste a guisa de referência.

Em algumas modalidades, o animal não-humano que compre-ende genes de imunoglobulina humana são animais que possuem um "mini-loco". Na abordagem de minilocos, um loco Ig exógeno é imitado através dainclusão de genes individuais do loco Ig. Desta maneira, um ou mais genesVH, um ou mais genes Dh, um ou mais genes Jh, um domínio constante e umsegundo domínio constante (de preferência, um domínio constante gamma)são formados dentro de um constructo para a inserção dentro de um animal.

Esta abordagem é descrita, inter alia, nas Patentes Nos. U.S. 5.545.807,5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429,5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215, e5.643.763, incorporadas aqui a guisa de referência.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para fa-bricar anticorpos anti-miostatina humanizados. Em algumas modalidades, osanimais não-humanos são imunizados com um antígeno de miostatina comodescrito abaixo sob condições que permitem a produção de anticorpo. Ascélulas produtoras de anticorpo são isoladas dos animais, e os ácidos nu-Ncléicos que codificam as cadeias pesada e leve de um anticorpo anti-miostatina de interesse são isolados das células produtoras de anticorpoisoladas ou de uma linha celular imortalizada produzida a partir de tais célu-las. Estes ácidos nucléicos são subseqüentemente engenheirados utilizandotécnicas conhecidas pelo versado na técnica e como descrito adicionalmenteabaixo para reduzir a quantidade de seqüência não-humana, ou seja, parahumanizar o anticorpo para reduzir a resposta imune em seres humanos.

Em algumas modalidades, o antígeno miostatina é miostatinaisolada e/ou purificada. Em algumas modalidades, o antígeno de miostatinaé miostatina humana. Entretanto, devido ao fato de a miostatina madura deC-terminal de seres humanos, camundongos, rato, cão, codorna, galinha,peru, porco, cavalo e macacos ser idêntica e não ser glicosilada em células,a miostatina destas espécies e outras espécies que possuem a mesma se-qüência de proteína madura também pode ser usada como imunógeno. Emoutras modalidades, o antígeno de miostatina é uma célula que expressa ousuperexpressa miostatina. Em outras modalidades, o antígeno de miostatinaé uma proteína recombinante expressa a partir de levedura, células de inse-tos, bactérias como E.Coli, ou outros recursos por tecnologia recombinante.

A imunização de animais pode ser feita através de qualquer mé-todo conhecido na técnica. Vide, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies:A Laboratorv Manual. New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Os méto-dos para imunizar animais não-humanos tais como camundongos, ratos,carneiro, cabras, porcos, gado e cavalos são bem-conhecidos na técnica.Vide, por exemplo, Harlow and Lane, supra, e Patente U.S. 5.994.619. Emuma modalidade preferida, o antígeno de miostatina é administrado com umadjuvante para estimular a resposta imune. Os adjuvantes exemplificativosincluem adjuvante de Freund completo ou incompleto, RIBI (dipeptídeos demuramil) ou ISCOM (complexos imunoestimulantes). Tais adjuvantes podemproteger o polipeptídeo de dispersão rápida por seqüestro do mesmo em umdepósito local, ou estes podem conter substâncias que estimulam o hospe-deiro a secretar fatores que são quimiotáticos de macrófagos e outros com-ponentes do sistema imune. De preferência, se um polipeptídeo estiver sen-do administrado, o programa de imunização irá envolver duas ou mais admi-nistrações do polipeptídeo, distribuídas durante diversas semanas. O Exem-pio I exemplifica um método para produzir anticorpos monoclonais anti-miostatina em camundongos XenoMouse®.

Produção de Anticorpos e Linhas Celulares Produtoras de Anticorpo

Após a imunização de um animal com um antígeno de miostati-na, os anticorpos e/ou células produtoras de anticorpo podem ser obtidos apartir do animal. Em algumas modalidades, o soro dotado de anticorpo anti-miostatina é obtido do aninal por sangramento ou sacrificando o animal. Osoro pode ser usado, visto que este é obtido do animal, uma fração de imu-noglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos anti-miostatina podemser purificados a partir do soro.

Em algumas modalidades, as linhas celulares produtoras de an-ticorpo são preparadas a partir de células isoladas do animal imunizado. A-pós a imunização, o animal é sacrificado e o linfonodo e/ou células B esplê-nicas são imortalizadas através de qualquer meio conhecido na técnica. Osmétodos para imortalizar células incluem, porém sem caráter limitativo,transfectá-las com oncogenes, infectá-las com um vírus oncogênico e culti-vá-las sob condições que selecionam células imortalizadas, submetê-las acompostos carcinogênicos ou mutantes, fundi-las com uma célula imortali-zada, por exemplo, uma célula do mieloma, e ao inativar um gene supressorde tumor. Vide, por exemplo, Harlow and Lane, supra. Se a fusão com célu-Ias do mieloma for usada, as células do mieloma, de preferência, não secre-tam polipeptídeos de imunoglobulina (uma linha celular não-secretora). Ascélulas imortalizadas são examinadas utilizando miostatina, ou uma parte damesma. Em uma modalidade preferida, a triagem inicial é realizada utilizan-do um imunoensaio ligado à enzima (ELISA) ou um radioimunoensaio. Umexemplo de triagem ELISA é proporcionado em WO 00/37504, incorporadoaqui a guisa de referência.

As células produtoras de anticorpo anti-miostatina, por exemplo,hibridomas, são selecionadas, clonadas e adicionalmente examinadas porcaracterísticas desejadas, inclusive, crescimento robusto, alta produção deanticorpo e características de anticorpo desejadas, como discutido adicio-nalmente abaixo. Os hibridomas podem ser expandidos in vivo em animaissingênicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo,camundongos nus, ou em cultura celular in vitro. Os métodos de seleção,clonagem e expansão de hibridomas são bem-conhecidos pelos versados natécnica.

Em uma modalidade preferida, o animal imunizado é um animalnão-humano que expressa genes de imunoglobulina humana e as células Besplênicas são fundidas com uma linha celular de mieloma da mesma espé-cie que o animal não-humano. Em uma modalidade mais preferida, o animalimunizado é um camundongo XENOMOUSE® e a linha celular do mieloma éum mieloma de camundongo não-secretor. Em uma modalidade ainda maispreferida, a linha celular de mieloma é P3-X63-Ag8.653 (American Type Cul-ture Collection). Vide, por exemplo, Exemplo I.

Desta maneira, em uma modalidade, a invenção proporcionamétodos para produzir uma linha celular que produz um anticorpo monoclo-nal humano ou um fragmento deste direcionado a miostatina que compreen-de (a) imunizar um animal transgênico não-humano descrito aqui com mios-tatina, uma parte de miostatina ou uma célula ou tecido que expressa mios-tatina; (b) permitir que o animal transgênico estabeleça uma resposta imuneà miostatina; (c) isolar as células produtoras de anticorpo do animal transgê-nico; (d) imortalizar as células produtoras de anticorpo; (e) criar populaçõesmonoclonais individuais das células produtoras de anticorpo imortalizadas; e(f) examinar as células produtoras de anticorpo imortalizadas para identificarum anticorpo direcionado a miostatina.Em outro aspecto, a invenção proporciona uma linha celular queproduz um anticorpo anti-miostatina humano. Em algumas modalidades, alinha celular é uma linha celular de hibridoma. Em algumas modalidades, oshibridomas são hibridomas de camundongo, como descrito acima. Em outrasmodalidades, os hibridomas são produzidos em uma espécie não-humana,não-camundongo tal como ratos, carneiro, porcos, cabras, gado ou cavalos.

Em outra modalidade, os hibridomas são hibridomas humanos.

Em outra modalidade, um animal transgênico é imunizado comum antígeno de miostatina, as células primárias, por exemplo, células B dobaço ou sangue periférico, são isoladas de um animal transgênico imunizadoe as células individuais, que produzem anticorpos específicos para o antíge-no desejado, são identificadas. O mRNA poliadenilado de cada célula indivi-dual é isolado a reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa(RT-PCR) é realizada utilizando iniciadores senso que se anelam em se-qüências de domínio variável, por exemplo, degeneram iniciadores que re-conhecem a maioria ou todas as regiões FR1 de genes humanos de domíniovariável de cadeia leve e pesada e iniciadores anti-senso que se anelam emseqüências de região constante ou de união. Os cDNAs dos domínios variá-veis de cadeia leve e pesada são então clonados e expressos em qualquercélula hospedeira adequada, por exemplo, uma célula do mieloma, comoanticorpos quiméricos com respectivas regiões constantes de imunoglobuli-na, tais como a cadeia pesada e domínios constantes k ou X. Vide, Babcook,J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-48, 1996, incorporado aqui àguisa de referência. Os anticorpos anti miostatina podem ser então identifi-cados e isolados como descrito aqui.

Em outra modalidade, as técnicas de expositores de fago podemser usadas para proporcionar bibliotecas que contêm um repertório de anti-corpos com afinidades variadas com miostatina. Para produção de tal reper-tório, não é necessário imortalizar as células B do animal imunizado. De pre-ferência, as células B primárias podem ser usadas diretamente como umafonte de mRNA. A mistura de cDNAs obtida das células B, por exemplo, de-rivadas de baços, é usada para preparar uma biblioteca de expressão, porexemplo, uma biblioteca de expositores de fago transfectada em E.coli. Ascélulas resultantes são testadas para imunorreatividade a miostatina. Astécnicas para a identificação de anticorpos humanos de alta afinidade de taisbibliotecas são descritas por Griffiths et al., EMBO J., 13:3245-3260 (1994);

Nissim et al., ibid, pp. 692 a 698 e por Griffiths et al., ibid, 12:725 a 734, queestão incorporados aqui à guisa de referência. Finalmente, os clones da bi-blioteca que são identificados produzem afinidades de ligação de uma mag-nitude desejada ao antígeno e o DNA que codifica o produto responsável portal ligação é recuperado e manipulado para expressão recombinante padrão.

As bibliotecas de expositores de fago também podem ser construídas utili-zando seqüências de nucleotídeo anteriormente manipuladas e examinadasde maneira similar. Em geral, os cDNAs que codificam cadeias pesadas eleves são independentemente fornecidos ou ligados para formar análogos deFv para a produção na biblioteca de fago.

A biblioteca de fago é então examinada para os anticorpos comas afinidades mais altas com miostatina e o material genético recuperado doclone apropriado. Séries adicionais de triagem podem aumentar a afinidadedo anticorpo original isolado.

Ácidos Nucléicos, Vetores, Células Hospedeiras e Métodos Recombinantespara Fabricar Anticorpos

Ácidos Nucléicos

A presente invenção também inclui moléculas de ácido nucléicoque codificam anticorpos anti-miostatina ou fragmentos dê ligação de antí-geno destes. Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucléico diferen-tes codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulinaanti-miostatina. Em outras modalidades, a mesma molécula de ácido nucléi-co codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulinaanti-miostatina.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico que co-difica o domínio variável da cadeia leve (VL) utiliza um gene humano Vk A3,A30 ou L2, e um gene humano Jk1 , Jk3 ou Jk4. Em algumas modalidades, amolécula de ácido nucléico utiliza um gene humano Vk A30, A3 ou L2 e umgene humano Jk4. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucléicoutiliza um gene humano A30, A3 ou L2 e um gene humano Jk1 . Em algumasmodalidades, a molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia leve codifi-ca uma seqüência de aminoacido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou10 substituições da(s) seqüência(s) de aminoacido de linhagem germinativa.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica uma seqüência de aminoacido Vi. quecompreende 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições de aminoacido conservativas e/ou1, 2, ou 3 substituições não-conservativas comparadas com seqüências Vk eJk de linhagem germinativa. As substituições podem estar nas regiões CDR,nas regiões de moldura ou no domínio constante.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificauma seqüência de aminoacido VL que compreende uma ou mais mutaçõescomparadas com a seqüência de linhagem germinativa que são idênticas àsmutações de linhagem germinativa encontradas na Vl de qualquer um entreos anticorpos 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1,1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1 L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificapelo menos três substituições de aminoacido comparadas com a seqüênciade linhagem germinativa encontrada na Vl de qualquer um entre os anticor-pos 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1,2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211;1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1 H-L81M, L-I85V; ou2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de amino-acido VL de anticorpo monoclonal 1_116_1 (SEQ ID NO: 4); 1_136_3 (SEQID NO: 12); 1_257_1 (SEQ ID NO: 16); 1_46_1 (SEQ ID NO: 24); 2_112_1(SEQ ID NO: 28); 1_314_1 (SEQ ID NO: 20--_); 1_66_1 (SEQ ID NO: 36);2_43_1 (SEQ ID NO: 28); 2_177_1 (SEQ ID NO: 40); 1_132_1 (SEQ ID NO:8); ou 1_268_1 (SEQ ID NO: 32) ou uma variante ou parte desta. Em algu-mas modalidades, o ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoacidoque compreende CDRs de cadeia leve de um dos ditos anticorpos listadosacima. Em algumas modalidades, a dita parte é uma parte contígua quecompreende CDR1 a CDR3.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de amino-ácido de uma entre SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47,51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 ou 87. Em algumas modalidades, a molécu-la de ácido nucléico compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ IDNOs: 3, 7, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64,76, 84 ou 88 ou uma parte desta. Em algumas modalidades, o ácido nucléicocodifica a seqüência de aminoacido da cadeia leve de uma, duas ou todastrês CDRs de dito anticorpo. Em algumas modalidades, a dita parte codificauma região contígua de CDR1 a CDR3 da cadeia leve de um anticorpo anti-miostatina.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificauma seqüência de aminoacido VL que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoacido VL dequalquer um entre os anticorpos 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1,2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1,1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M;2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V, ou àseqüência de aminoacido da região VL de qualquer uma entre SEQ ID NOs:4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83ou 87. As moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicosque se hibridizam sob condições altamente estringentes, tais como aquelesdescritos acima, ou que são pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,97%, 98% ou 99% idêntico a um ácido nucléico que codifica a seqüência deaminoácido de região VL de SEQ ID NOs: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40,44, 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 79, 83 ou 87 ou a um ácido nucléico quecompreende a seqüência de nucleotídeo de região VL de SEQ ID NOs: 3, 7,11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 48, 52, 56, 60, 68, 72, 80, 64, 76, 84 ou 88.

Em outras modalidades preferidas, a molécula de ácido nucléicocodifica o domínio variável de uma cadeia pesada (Vh) que utiliza uma se-qüência de gene humano VH 1-02, 3-21 ou 3-23 ou uma seqüência derivadadesta. Em diversas modalidades, a molécula de ácido nucléico utilize umgene humano VH 1-02, um gene D4-23 e um gene humano Jh6d; um genehumano VH3-21, um gene humano D3-16 ou D5-12 e um gene humanoJh6d; um gene humano VH3-21, um gene humano D1-26 ou D5-5 e um genehumano Jh4d; um gene humano VH 3-23, um gene humano D1-7 e um genehumano Jh3d.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificauma seqüência de aminoácido que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou11 mutações comparadas com a seqüência de aminoácido de linhagemgerminativa dos genes humanos V, D ou J. Em algumas modalidades, asditas mutações estão na região VH. Em algumas modalidades, as ditas mu-tações estão nas regiões de CDR.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificauma seqüência VH que compreende uma ou mais mutações de aminoácidocomparadas com a seqüência Vh de linhagem germinativa que são idênticasàs mutações de aminoácido encontradas na VH de anticorpo monoclonal1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1,2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica pelo menostrês mutações de aminoácido comparadas com as seqüências de linhagemgerminativa que são idênticas a pelo menos três mutações de aminoácidoencontradas em um dos anticorpos listados acima.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma parteda seqüência de aminoácido VH de um anticorpo monoclonal selecionadoentre 1_116_1 (SEQ ID NO: 2); 1_136_3 (SEQ ID NO: 10); 1_257_1 (SEQID NO: 14); 1_46_1 (SEQ ID NO: 22); 2_112_1 (SEQ ID NO: 26); 1_314_1(SEQ ID NO: 18); 1_66_1 (SEQ ID NO: 34); 2_43_1 (SEQ ID NO: 42);2_177_1 (SEQ ID NO: 38); 1_132_1 (SEQ ID NO: 6); ou 1_268_1 (SEQ IDNO: 30), uma variante deste, ou dita seqüência que possui mutações deaminoácido conservativas e/ou um total de três ou menos substituições deaminoácido não-conservativas. Em diversas modalidades, a seqüência codi-fica uma ou mais regiões de CDR, de preferência, uma região CDR3, todastrês regiões de CDR, uma parte contígua que inclui CDR1 a CDR3, ou todaa região VH, de um anticorpo anti-miostatina listado acima.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo que codifica a seqüência de amino-ácido de uma entre SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45,49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 ou 85. Em diversas modalidades preferidas,a molécula de ácido nucléico compreende pelo menos uma parte da se-qüência de nucleotídeo de SEQ ID NOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37,41, 46, 50, 54, 58, 62, 66, 70, 74, 78, 82 ou 86. Em algumas modalidades, adita parte codifica a região VH, uma região CDR3, todas três regiões de CDRou uma região contígua que inclui CDR1 a CDR3.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codificauma seqüência de aminoácido Vh que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácido VH emqualquer uma entre SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 45,49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77, 81 ou 85. As moléculas de ácido nucléico dainvenção incluem ácidos nucléicos que se hibridizam sob condições alta-mente estringentes, tais como aqueles descritos acima, ou que são pelo me-nos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou 99% idênticos a um á-cido nucléico que codifica a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, 6,10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42 ou a uma região VH desta, ou a um ácidonucléico que compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 1, 5,9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 ou 41 ou a seqüência de nucleotídeo que codifi-ca uma região VH desta.

Em outra modalidade, o ácido nucléico codifica uma cadeia pe-sada de comprimento total de um anticorpo selecionado a partir de 1_116_1,1 _136_3, 1 _257_1, 1 _46_1, 2_112_1, 1 _314_1, 1 _66_1, 2_43_1, 2_177_1,1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A;1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V, ou uma cadeia pesada que compreende a seqüência de aminoá-cido de SEQ ID NOs: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38 ou 42. Ademais, oácido nucléico pode compreender a seqüência de nucleotídeo de SEQ IDNOs: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37 ou 41.

Uma molécula de ácido nucléico que codifica a cadeia pesadaou leve de um anticorpo anti-miostatina ou partes deste pode ser isolada dequalquer fonte que produz tal anticorpo. Em diversas modalidades, as molé-culas de ácido nucléico são isoladas de uma célula B que expressa um anti-corpo anti-miostatina isolado de um animal imunizado com miostatina ou deuma célula imortalizada derivada de tal célula B. Os métodos para isolar áci-dos nucléicos que codificam um anticorpo são bem-conhecidos na técnica.

Vide, por exemplo, Sambrook et al. O mRNA pode ser isolado e usado paraproduzir cDNA para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou clo-nagem de cDNA de genes de anticorpo. Em uma modalidade preferida, amolécula de ácido nucléico é isolada de um hibridoma que possui como umde seus associados de fusão, uma célula de um animal transgênico não-humano, sendo que a dita célula produz uma imunoglobulina humana. Emuma modalidade ainda mais preferida, a célula que produz imunoglobulinahumana é isolada de um animal XENOMOUSE®. Em outra modalidade, acélula que produz a imunoglobulina humana é isolada de um animal trans-gênico não-humano, não-camundongo, como descrito acima. Em outra mo-dalidade, o ácido nucléico é isolado de um animal não-transgênico não-humano. As moléculas de ácido nucléico isoladas de um animal não-transgênico não-humano, podem ser usadas, por exemplo, por anticorposhumanizados que compreendem uma ou mais seqüências de aminoacido deum anticorpo anti-miostatina humano da presente invenção.

Em algumas modalidades, um ácido nucléico que codifica umacadeia pesada de um anticorpo anti-miostatina da invenção pode compreen-der uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínio Vh da invençãounido em moldura a uma seqüência de nucleotídeo que codifica um domínioconstante de cadeia pesada de qualquer fonte. De forma similar, uma molé-cula de ácido nucléico que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-miostatina da invenção pode compreender uma seqüência de nucleotídeoque codifica um domínio VL da invenção unido em moldura a uma seqüênciade nucleotídeo que codifica um domínio constante de cadeia leve de qual-quer fonte.

Em um aspecto adicional da invenção, as moléculas de ácidonucléico que codificam o domínio variável das cadeias pesadas (VH) e/ouleves (VL) são "convertidas" em genes de anticorpo de comprimento total.Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucléico que codificam os do-mínios VH ou VL são convertidas em genes de anticorpo de comprimentototal mediante inserção dentro de um vetor de expressão que já está codifi-cando os domínios constantes de cadeia pesada (Ch) ou constantes de ca-deia leve (Cl), respectivamente, de modo que o segmento VH seja ligado deforma operável ao(s) segmento(s) Ch dentro do vetor, e/ou de modo que osegmento VL seja ligado de operável ao segmento Cl dentro do vetor. Emoutra modalidade, as moléculas de ácido nucléico que codificam os domíniosVh e/ou Vl são convertidas em genes de anticorpo de comprimento total me-diante ligação, por exemplo, ligar uma molécula de ácido nucléico que codifi-ca os domínios Vh e/ou Vl a uma molécula de ácido nucléico que codificaum domínio Ch e/ou Cl que utiliza técnicas biológicas moleculares padrão.As seqüências de ácido nucléico de genes humanos de domínio constantede imunoglobulina de cadeia pesada e leve são conhecidas na técnica. Vide,por exemplo, Kabat et al., Seauences of Proteins of Immunoloaical Interest.5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. As moléculas de ácido nucléico quecodificam as cadeias pesadas e/ou leves de comprimento total podem serentão expressas a partir de uma célula dentro da qual estas foram introduzi-das e o anticorpo anti-miostatina isolado.

As moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para expres-sar de forma recombinante grandes quantidades de anticorpos anti-miostatina. As moléculas de ácido nucléico também podem ser usadas paraproduzir anticorpos quiméricos, anticorpos biespecíficos, anticorpos de ca-deia única, imunoadesinas, anticorpos bivalentes, anticorpos modificados ederivados de anticorpo, como descrito adicionalmente abaixo. Se as molécu-las de ácido nucléico forem derivadas de um animal não-transgênico não-humano, as moléculas de ácido nucléico podem ser usadas para humaniza-ção de anticorpo, também como descrito abaixo.

Em outra modalidade, uma molécula de ácido da invenção é u-sada como uma sonda ou iniciador de PCR para uma seqüência de anticor-po específica. Por exemplo, o ácido nucléico pode ser usado como umasonda em métodos diagnósticos ou como um iniciador de PCR para amplifi-car as regiões de DNA que poderiam ser usadas, inter alia, para isolar molé-culas de ácido nucléico adicionais que codificam domínios variáveis de anti-corpos anti-miostatina. Em algumas modalidades, as moléculas de ácidonucléico são oligonucleotídeos. Em algumas modalidades, os oligonucleotí-deos são de domínios altamente variáveis das cadeias pesadas e leves doanticorpo de interesse. Em algumas modalidades, os oligonucleotídeos codi-ficam todas ou parte de uma ou mais CDRs de anticorpos 1_116_1,1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1,1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L21I; 1_314_1H-T92A;1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V;2_112_1H-L81M, L-F58I; ou 2_112_1 H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M,L-F58I, I85V ou variantes destes como descrito aqui.

Vetores

A invenção proporciona vetores que compreendem moléculas deácido nucléico que codificam a cadeia pesada de um anticorpo anti-miostatina da invenção ou uma parte de ligação de antígeno deste. A inven-ção também proporciona vetores que compreendem moléculas de ácido nu-cléico que codificam a cadeia leve de tais anticorpos ou parte de ligação deantígeno deste. A invenção proporciona adicionalmente vetores que com-preende moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas de fusão, anti-corpos modificados, fragmentos de anticorpo, e sondas destes.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-miostatina da in-venção ou parte de ligação de antígeno são expressos ao inserir DNAs quecodificam cadeias leves e pesadas de comprimento parcial ou total, obtidoscomo descrito acima, dentro de vetores de expressão de modo que os genessejam ligados de forma operável a seqüências de controle de expressão ne-cessárias tais como seqüências de controle transcricional e translacional. Osvetores de expressão incluem plasmídeos, retrovírus, adenovírus, vírus ade-no-associado (AAV), vírus de planta tais como vírus do mosaico de couve-flor, vírus do mosaico do tabaco, cosmidios, YACs, epissomas derivados deEBV, e similares. O gene de anticorpo está ligado dentro de um vetor demodo que as seqüências de controle transcricional e translacional dentro dovetor cumpram sua função programada de regular a transcrição e traduçãodo gene de anticorpo. O vetor de expressão e seqüências de controle deexpressão são selecionados para serem compatíveis com a célula hospedei-ra de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de ca-deia pesada de anticorpo podem ser inseridos dentro de vetores separados.Em uma modalidade preferida, ambos os genes são inseridos dentro domesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos dentro dovetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios derestrição complementares sobre o fragmento de gene de anticorpo e vetor,ou ligação de extremidade cega, se nenhum sítio de restrição estiver presente).

Um vetor conveniente é um que codifica uma seqüência de imu-noglobulina Ch ou Cl humana funcionalmente completa, com sítios de restri-ção apropriados engenheirados de modo que qualquer seqüência Vh ou Vlpossa ser facilmente inserida e expressão, como descrito acima. Em taisvetores, geralmente ocorre junção entre o sítio doador de junção na região Jinserida e o sítio aceptor de junção que antecede o domínio humano C, etambém em regiões de junção que ocorrem dentro dos exons humanos Ch-A poliadenilaçao e o término da transcrição ocorrem em sítios cromossomaisnativos a jusante das regiões de codificação. O vetor de expressão recombi-nante também pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção dacadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticor-po pode ser clonado dentro do vetor de modo que o peptídeo de sinal sejaligado em moldura à terminação amino da cadeia de imunoglobulina. O pep-tídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptí-deo de sinal heterólogo (isto é, um peptídeo de sinal de uma proteína denão-imunoglobulina).

Além dos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expres-são recombinantes da invenção conduzem seqüências reguladoras que con-trolam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospe-deira. Será avaliado pelo versado na técnica que o desenho do vetor de ex-pressão, inclusive a seleção de seqüências reguladoras pode depender detais fatores como a seleção da célula hospedeira que será transformada, onível de expressão de proteína desejado, etc. As seqüências reguladoraspreferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem ele-mentos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em célu-las de mamíferos, tais como promotores e/ou intensificadores derivados deLTRs retrovirais, citomegalovírus (CMV) (tal como o promotor/intensificadorde CMV), Vírus Simian 40 (SV40) (tal como o promotor/intensificador deSV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor principal tardio de adenovírus(AdMLP)), polioma e fortes promotores de mamífero tais como promotoresde imunoglobulina e actina nativos. Para descrição adicional de elementosreguladores virais, e seqüências destes, vide, por exemplo, Patente No. U.S.5.168.062, Patente No. U.S. 4.510.245 e Patente No. U.S. 4.968.615. Osmétodos para expressar anticorpos em plantas, inclusive uma descrição depromotores e vetores, bem como, transformação de plantas são conhecidosna técnica. Vide, por exemplo, Patente norte-americana 6.517.529, incorpo-rada aqui à guisa de referência. Os métodos para expressar polipeptídeosem células bacterianas ou células fungosas, por exemplo, células de levedu-ra, também são bem-conhecidos na técnica.

Além dos genes de cadeia de anticorpo e seqüências regulado-ras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem conduzirseqüências adicionais, tais como seqüências que regulam a replicação dovetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genesmarcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleçãode células hospedeiras dentro das quais o vetor foi introduzido (vide, por e-xemplo, Patente Nos. U.S. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, incorporadasaqui à guisa de referência). Por exemplo, tipicamente o gene marcador sele-cionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou me-totrexato, sobre uma célula hospedeira dentro da qual o vetor foi introduzido.Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem gene de diidrofolatoredutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com sele-ção/amplificação de metotrexato), o gene neo (para seleção de G418), e ogene glutamato sintetase.

Células Hospedeiras de Não-Hibridoma e Métodos para Produzir Proteínade forma Recombinante

As moléculas de ácido nucléico que codificam anticorpos anti-miostatina e vetores que compreendem estas moléculas de ácido nucléicopodem ser usadas para transfecção de uma célula hospedeira de mamífero,planta, bactéria ou levedura adequada. A transformação pode ser realizadaatravés de qualquer método para introduzir polinucleotídeos dentro de umacélula hospedeira. Os métodos para introdução de polinucleotídeos heteró-logos dentro de células de mamíferos são bem-conhecidos na técnica e in-cluem transfecção mediada por dextrano, precipitação de fosfato de cálcio,transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplasto, eletroporação, en-capsulação do(s) polinucleotídeo(s) em lipossomas, e microinjeção direta doDNA dentro dos núcleos. Ademais, as moléculas de ácido nucléico podemser introduzidas dentro de células de mamífero por vetores virais. Os méto-dos para transformar células são bem-conhecidos na técnica. Vide, por e-xemplo, Patente Nos. U.S. 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461, e 4.959.455,incorporadas aqui à guisa de referência). Os métodos para transformar célu-Ias de plantas são bem-conhecidos na técnica, inclusive, por exemplo, trans-formação mediada por agrobacteria, transformação biolística, injeção direta,eletroporação e transformação viral. Os métodos para transformar células debactérias e de levedura também são bem-conhecidos na técnica.

As linhas celulares de mamífero disponíveis como hospedeiraspara expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem muitas linhas ce-lulares imortalizadas disponíveis a partir de American Type Culture Collecti-on (ATCC). Estas incluem, inter alia, células de ovário de hamster chinês(CHO), células NSO, células SP2, células HEK-293T, células NIH-3T3, célu-las HeLa, células de rim de hamster recém-nascido (BHK), células de rim demacaco verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humanas(por exemplo, Hep G2), células A549, e inúmeras outras linhas celulares. Aslinhas celulares de preferência particular são selecionadas através da de-terminação de quais linhas celulares possuem altos níveis de expressão.

As linhas celulares que não aquelas de origem mamífera tam-bém podem ser usadas. Estas incluem linhas celulares de insetos (tais comocélulas Sf9 ou Sf21), células de plantas (inclusive aquelas de Nicotiana, Ara-bidopsis, nadabau, milho, trigo, batata, etc), células de bactérias (inclusiveE. coli e Streptomyces) e células de levedura (inclusive Schizosaccharomy-ces pombe, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris).

Quando os vetores de expressão recombinante que codificamgenes de anticorpo forem introduzidas dentro de células hospedeiras, osanticorpos são produzidos ao cultivar as células hospedeiras durante umperíodo de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas célu-las hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo dentro domeio de cultura onde as células hospedeiras estão se desenvolvendo. Osanticorpos podem ser recuperados do meio de cultura utilizando métodos depurificação de proteína padrão.

A expressão de anticorpos da invenção de linhas celulares deprodução pode ser aumentada utilizando inúmeras técnicas conhecidas. Porexemplo, o sistema de expressão de gene glutamina sintetase (o sistemaGS) é uma abordagem comum para aumentar a expressão sob certas con-dições. O sistema GS é discutido em sua totalidade ou parte em conjuntocom a Patente européia Nos. 0 216 846, 0 256 055, 0 323 997 e 0 338 841.

É provável que os anticorpos expressos por linhas celulares dife-rentes ou em animais transgênicos irão possuir glicosilação diferente um dooutro. Entretanto, todos os anticorpos codificados pelas moléculas de ácidonucléico proporcionadas aqui, ou que compreendem a seqüência de amino-ácido proporcionada aqui são parte da presente invenção, independente daglicosilação dos anticorpos.

Animais e Plantas Transqênicas

Os anticorpos anti-miostatina da invenção também podem serproduzidos de forma transgênica através da geração de um mamífero ouplanta que é transgênico para as seqüências de cadeia pesada e leve deimunoglobulina de interesse e produção do anticorpo em uma forma recupe-rável destas. Em conjunto com a produção transgênica em mamíferos, osanticorpos anti-miostatina podem ser produzidos em, e recuperados de, leitede cabras, vacas, ou outros mamíferos. Vide, por exemplo, Patente Nos.U.S. 5.827.690, 5.756.687, 5.750.172, e 5.741.957, incorporadas aqui à gui-sa de referência. Em algumas modalidades, os animais transgênicos não-humanos que compreendem locos de imunoglobulina humana são imuniza-dos com miostatina ou uma parte imunogênica desta, como descrito acima.Os métodos para fabricar anticorpos em plantas são descritos, por exemplo,nas patentes U.S. 6.046.037 e 5.959.177, incorporadas aqui à guisa de refe-rência.

Em algumas modalidades, os animais transgênicos não-humanos ou plantas são produzidos ao introduzir uma ou mais moléculas deácido nucléico que codificam um anticorpo anti-miostatina da invenção den-tro do animal ou planta através de técnicas transgênicas padrão. Vide, Ho-gan e Patente norte-americana 6.417.429, supra. As células transgênicasusadas para formar o animal transgênico podem ser células-tronco embriô-nicas ou células somáticas ou um ovo fertilizado. Os organismos não-humanos transgênicos podem ser quiméricos, heterozigotos não-quiméricos,e homozigotos não-quiméricos. Vide, por exemplo, Hogan et al., Manipulat-ina the Mouse Embrvo: A Laboratorv Manual 2 ed., Cold Spring HarborPress (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A PracticalApproach, Oxford University Press (2000); e Pinkert, Animal transaênico Te-chnoloav: A Laboratorv Handbook. Academic Press (1999), todas incorpo-radas aqui à guisa de referência. Em algumas modalidades, os animaistransgênicos não-humanos possuem uma interrupção e substituição marca-dos por um constructo de marcação que codifica uma cadeia pesada e/ouuma cadeia leve de interesse. Em uma modalidade preferida, os animaistransgênicos compreendem e expressam moléculas de ácido nucléico quecodificam cadeias pesadas e leves que se ligam especificamente à miostati-na, de preferência, miostatina humana. Em algumas modalidades, os ani-mais transgênicos compreendem moléculas de ácido nucléico que codificamum anticorpo modificado tal como um anticorpo de cadeia única, um anticor-po quimérico ou um anticorpo humanizado. Os anticorpos anti-miostatinapodem ser feitos em qualquer animal transgênico. Em uma modalidade pre-ferida, os animais não-humanos são camundongos, ratos, carneiro, porcos,cabras, gado ou cavalos. O animal transgênico não-humano expressa osditos polipeptídeos codificados em sangue, leite, urina, saliva, lágrimas, mu-cos e outros fluidos corpóreos.

Bibliotecas Expositores de faqo

A invenção proporciona um método para produzir um anticorpoanti-miostatina ou parte de ligação de antígeno deste que compreende asetapas de sintetizar uma biblioteca de anticorpos humanos sobre fago, exa-minar a biblioteca com miostatina ou uma parte de ligação de anticorpo des-ta, isolar o fago que se liga a miostatina, e obter o anticorpo do fago. À guisade exemplo, um método para preparar a biblioteca de anticorpos para usoem técnicas de expositores de fago compreende as etapas de imunizar umanimal não-humano que compreende locos de imunoglobulina humana commiostatina ou uma parte antigênica destes para criar uma resposta imune,extrair as células produtoras de anticorpo do animal imunizado; isolar o RNAque codifica cadeias pesadas e leves de anticorpos da invenção das célulasextraídas, transcrever de forma reversa o RNA para produzir cDNA, amplifi-car o cDNA que utiliza iniciadores, e inserir o cDNA dentro de um vetor ex-positores de fago de modo que os anticorpos sejam expressos sobre o fago.

Os anticorpos anti-miostatina recombinantes da invenção podem ser obtidosdesta maneira.

Os anticorpos anti-miostatina recombinantes humanos da inven-ção podem ser isolados ao examinar uma biblioteca de anticorpo combinató-ria recombinante. De preferência, a biblioteca é uma biblioteca scFv exposi-tores de fago, gerada utilizando cDNAs VL e VH humanos preparados demRNA isolado de células B. Os métodos para preparar e examinar tais bibli-otecas são conhecidos na técnica. Os kits para gerar bibliotecas expositoresde fago estão comercialmente disponíveis (por exemplo, the Pharmacia Re-combinant Phage Antibody System, número de catálogo. 27-9400-01; e o kitexpositores de fago Stratagene SurfZAP®, catalog no. 240612). Também háoutros métodos e reagentes que podem ser usados para gerar e examinarbibliotecas de apresentação de anticorpo (vide, por exemplo, Patente No.U.S. 5.223.409; Publicação de PCT Nos. WO 92/18619, WO 91/17271, WO92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fu-chs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hy-bridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); Mc-Cafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson et al.,Nature 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogen-boom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); e Barbas et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 88:7978-7982 (1991), todas incorporadas aqui à guisa dereferência.

Em uma modalidade, para isolar e produzir anticorpos anti-miostatina humanos com as características desejadas, um anticorpo anti-miostatina humano como descrito aqui é primeiramente usado para selecio-nar seqüências de cadeia pesada e leve humanas que possuem atividade deligação similar a miostatina, que utiliza os métodos de impressão de epitopodescritos em Publicação de PCT No. WO 93/06213, incorporada aqui à gui-sa de referência. As bibliotecas de anticorpo usadas neste método são, depreferência, bibliotecas scFv preparadas e examinadas como descrito emPublicação de PCT No. WO 92/01047, McCafferty et al., Nature 348:552-554(1990); e Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993), todas incorporadasaqui à guisa de referência. As bibliotecas de anticorpo scFv são, de prefe-rência, examinadas utilizando miostatina humana como o antígeno.

Uma vez que os domínios Vl e VH humanos iniciais foram sele-cionados, experimentos de "mistura e comparação" são realizados, ondepares diferentes dos segmentos VL/VH inicialmente selecionados são exami-nados para ligação de miostatina para selecionar combinações de par VL/VHpreferidas. Adicionalmente, para aperfeiçoar adicionalmente a qualidade doanticorpo, os segmentos VL e VH do(s) par(es) preferido(s) pode(m) ser alea-toriamente modificado(s), de preferência, dentro da região CDR3 de VH e/ouVL, em um processo análogo ao processo de mutação somática in vivo res-ponsável pela maturação de afinidade de anticorpos durante uma respostaimune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser realizada aoamplificar os domínios Vh e Vl utilizando iniciadores de PCR complementa-res a CDR3 VH ou CDR3 VL, respectivamente, onde iniciadores foram "refor-çados" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em cer-tas posições de modo que os produtos de PCR resultantes codifiquem seg-mentos Vh e VL onde as mutações aleatórias foram introduzidas dentro dasregiões CDR3 Vh e/ou Vl. Estes segmentos Vh e VL aleatoriamente modifi-cados podem ser reexaminados para ligação a miostatina.

Após a triagem e isolamento de um anticorpo anti-miostatina dainvenção a partir de uma biblioteca de apresentação de imunoglobulina re-combinante, os ácidos nucléicos que codificam o anticorpo selecionado po-dem ser recuperados do pacote de apresentação (por exemplo, a partir dogenoma de fago) e subclonados dentro de outros vetores de expressão pormeio de técnicas de DNA recombinante padrão. Se desejado, o ácido nu-cléico pode ser adicionalmente manipulado para criar outras formas de anti-corpo da invenção, como descrito abaixo. Para expressar um anticorpo hu-mano recombinante isolado por triagem de uma biblioteca combinatória, oDNA que codifica o anticorpo é clonado dentro de um vetor de expressãorecombinante e introduzido dentro de células hospedeiras de mamífero, co-mo descrito acima.

Troca de classe

Outro aspecto da invenção proporciona um método para conver-ter a classe ou subclasse de um anticorpo anti-miostatina em outra classe ousubclasse. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico quecodifica Vl ou VH que não inclui seqüências codificantes de Cl ou Ch é isola-da utilizando métodos bem-conhecidos na técnica. A molécula de ácido nu-cléico é então operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucléico quecodifica Cl ou Ch de uma classe ou subclasse de imunoglobulina desejada.Isto pode ser realizado utilizando um vetor ou molécula de ácido nucléicoque compreende uma cadeia Cl ou Ch, como descrito acima. Por exemplo,um anticorpo anti-miostatina que era originalmente IgM pode se ter a classetrocada por um IgG. Adicionalmente, a troca de classe pode ser usada paraconverter uma subclasse IgG em outra, por exemplo, de IgGI para lgG2.Outro método para produzir um anticorpo da invenção que compreende umisótipo desejado compreende as etapas de isolar um ácido nucléico que co-difica uma cadeia pesada de um anticorpo anti-miostatina e um ácido nucléi-co que codifica uma cadeia leve de um anticorpo anti-miostatina, isolar aseqüência que codifica a região Vh, ligar a seqüência VH a uma seqüênciaque codifica um domínio constante de cadeia pesada do isótipo desejado,expressar o constructo de gene de cadeia leve e de cadeia pesada em umacélula, e coletar o anticorpo anti-miostatina com o isótipo desejado.

Anticorpos Desimunizados

Em outro aspecto da invenção, o anticorpo pode ser desimuni-zado para reduzir sua imunogenicidade utilizando as técnicas descritas em,por exemplo, Publicação de PCT Nos. W098/52976 e WO00/34317 (incor-poradas aqui à guisa de referência).

Anticorpos Modificados

Em outra modalidade, as moléculas de ácido nucléico, vetores ecélulas hospedeiras podem ser usadas para fabricar anticorpos anti-miostatina modificados. Os anticorpos podem ser modificados nos domíniosvariáveis das cadeias pesadas e/ou leves, por exemplo, para alterar umapropriedade de ligação do anticorpo. Por exemplo, uma mutação pode estarem uma ou mais regiões de CDR para aumentar ou diminuir Kd do anticorpocontra miostatina, para aumentar ou diminuir k|ivre, ou para alterar a especifi-cidade de ligação do anticorpo. As técnicas em mutagênese sítio-dirigida sãobem-conhecidas. Vide, por exemplo, Sambrook et al. e Ausubel et al., supra.Em outra modalidade, uma ou mais mutações são feitas em um resíduo deaminoácido que é conhecido como alterado comparado com a linhagemgerminativa em anticorpo monoclonal 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1,2_112_1, 1_314_1, 1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1,1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M;2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I;2_112_1H-L81M, L-I85V; ou 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V. As mutaçõespodem ser feitas em uma região de CDR ou região de moldura de um domí-nio variável, ou em um domínio constante. Em uma modalidade preferida, asmutações são feitas em um domínio variável. Em algumas modalidades,uma ou mais mutações são feitas em um resíduo de aminoácido que é co-nhecido como alterado comparado com uma região de CDR ou região demoldura de um domínio variável de uma seqüência de aminoácido selecio-nada a partir de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67,69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85 ou 87 ou cuja seqüência de ácido nucléicoé apresentada em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86 ou 88.

Em outra modalidade, a região de moldura é modificada de mo-do que a(s) região(ões) modificada(s) possua(m) a seqüência de aminoácidodo gene de linhagem germinativa correspondente. Uma mutação pode serfeita em uma região de moldura ou domínio constante para aumentar ameia-vida do anticorpo anti-miostatina. Vide, por exemplo, Publicação dePCT No. WO 00/09560, incorporada aqui à guisa de referência. Uma muta-ção em uma região de moldura ou domínio constante também pode ser feitapara alterar a imunogenicidade do anticorpo, para proporcionar um sítio deligação covalente ou não-covalente a outra molécula, ou para alterar taispropriedades como fixação de complemento, ligação de FcR e citotoxicidademediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). De acordo com a in-venção, um único anticorpo pode possuir mutações em qualquer uma dasCDRs ou regiões de moldura do domínio variável ou no domínio constante.

Em algumas modalidades, há a partir de 1 a 8, inclusive qual-quer número entre estes, mutações de aminoacido tanto nos domínios Vhcomo VL do anticorpo anti-miostatina modificado comparado com o anticorpoanti-miostatina antes da mutação. Em qualquer uma destas acima, as muta-ções podem ocorrer em uma ou mais regiões de CDR. Ademais, qualqueruma das mutações pode ser substituições de aminoacido conservativas. Emalgumas modalidades, não há mais que 5, 4, 3, 2, ou 1 alterações deaminoacido nos domínios constantes.

Anticorpos Modificados

Em outra modalidade, um anticorpo de fusão ou imunoadesinapode ser feito compreendendo todo ou uma parte de um anticorpo anti-miostatina da invenção ligado a outro polipeptídeo. Em uma modalidade pre-ferida, apenas os domínios variáveis do anticorpo anti-miostatina são ligadosao polipeptídeo. Em outra modalidade preferida, o domínio VH de um anti-corpo anti-miostatina é ligado a um primeiro polipeptídeo, enquanto o domí-nio VL de um anticorpo anti-miostatina é ligado a um segundo polipeptídeoque se associa com o primeiro polipeptídeo de tal maneira que os domíniosVh e V|_ possam interagir um com o outro para formar um sítio de ligação deantígeno. Em outra modalidade preferida, o domínio VH é separado do do-mínio VL por um ligante de modo que os domínios VH e VL possam interagirum com o outro (vide abaixo sob Anticorpos de Cadeia Única). O anticorpo-VH-ligante-V|_ é então ligado ao polipeptídeo de interesse. Ademais, os anti-corpos de fusão podem ser criados onde dois (ou mais) anticorpos de cadeiaúnica são ligados uns aos outros. Isto é útil se alguém desejar criar um anti-corpo divalente ou polivalente sobre uma cadeia de polipeptídeo única, ou sealguém desejar criar um anticorpo biespecífico.

Para criar um anticorpo de cadeia única, (scFv) os fragmentosde DNA que codificam Vh e VL são operativamente ligados a outro fragmentoque codifica um ligante flexível, por exemplo, que codifica a seqüência deaminoácido (Glv4-Ser)3, (SEQ ID NO: 122) de modo que as seqüências VH eVL possam ser expressas como uma proteína de cadeia única contígua, comos domínios VL e VH unidos pelo ligante flexível. Vide, por exemplo, Bird etal., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990). O anti-corpo de cadeia única pode ser monovalente, se apenas uma VH e uma VLforem usadas, bivalente, se duas VH e VL forem usadas, ou polivalente, semais de duas Vh e VL forem usadas. Os anticorpos biespecíficos ou poliva-lentes que podem ser gerados se ligam especificamente à miostatina e aoutra molécula.

Em outras modalidades, outros anticorpos modificados podemser preparados utilizando anticorpo anti-miostatina que codifica moléculas deácido nucléico. Por exemplo, "Kappa bodies" (III et al., Protein Eng. 10: 949-57 (1997)), "Minibodies" (Martin et al., EMBO J. 13: 5303-9 (1994)), "Diabo-dies" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 6444-6448 (1993)), ou"Janusins" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991) e Traunecker etal., Int. J. Câncer (Suppl.) 7:51-52 (1992)) podem ser preparados utilizandotécnicas biológicas moleculares padrão que seguem as instruções do relató-rio descritivo.

Os anticorpos biespecíficos ou fragmentos de ligação de antíge-no podem ser preparados através de uma variedade de métodos que inclu-em fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab'. Vide, por exemplo,Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990), Kostelny etal., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992). Ademais, os anticorpos biespecíficospodem ser formados como "anticorpos bivalentes" ou "Janusins". Em algu-mas modalidades, o anticorpo biespecífico se liga a dois epitopos diferentesde miostatina. Em algumas modalidades, o anticorpo biespecífico possuiuma primeira cadeia pesada e uma primeira cadeia leve de anticorpo mono-clonal 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1, 1_66_1,2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, 1_268_1, 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211;1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I;2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; ou2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V e um anticorpo com cadeia pesada e cadeialeve adicionais. Em algumas modalidades, a cadeia leve e cadeia pesadaadicionais também pertencem a um dos anticorpos monoclonais adiciona-dos, porém são diferentes das primeiras cadeia pesada e leve.

Em algumas modalidades, os anticorpos modificados descritosacima são preparados utilizando um ou mais dos domínios variáveis ou regi-ões de CDR de um anticorpo monoclonal anti-miostatina humano proporcio-nado aqui.

Anticorpos Derivatizados e Marcados

Um anticorpo anti-miostatina ou parte de ligação de antígeno dainvenção podem ser derivatizados ou ligados a outra molécula (por exemplo,outro peptídeo ou proteína). Em geral, os anticorpos ou parte destes sãoderivatizados de modo que a ligação de miostatina não seja afetada de for-ma contrária pela derivatização ou marcação. Conseqüentemente, os anti-corpos e partes de anticorpo da invenção pretendem incluir tanto formas in-tactas como modificadas dos anticorpos anti-miostatina humanos descritosaqui. Por exemplo, um anticorpo ou parte de anticorpo da invenção pode serfuncionalmente ligado (por acoplamento químico, fusão genética, associaçãonão-covalente ou de outra maneira) a uma ou mais entidades moleculares,tal como outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou um anti-corpo bivalente), um agente de detecção, um agente farmacêutico e/ou umaproteína ou peptídeo que pode mediar a associação do anticorpo ou parte deanticorpo com outra molécula (tal como uma região de núcleo de estreptavi-dina ou uma cauda de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivatizado é produzido ao reticular doisou mais anticorpos (do mesmo tipo ou de tipos diferentes, por exemplo, paracriar anticorpos biespecíficos). Os reticuladores adequados incluem aquelesque são heterobifuncionais, que possuem dois grupos distintamente reativosseparados por um espaçador apropriado (por exemplo, éster m-maleimidobenzoil-N-hidroxissuccinimida) ou homobifuncionais (por exemplo,suberato de dissuccinimidila). Tais ligantes estão disponíveis a partir de Pi-erce Chemical Company, Rockford, II.

Outro tipo de anticorpo derivatizado é um anticorpo marcado. Osagentes de detecção úteis com os quais um anticorpo ou parte de ligação deantígeno da invenção pode ser derivatizado incluem compostos fluorescen-tes, inclusive fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloretode 5-dimetilamina-1-naftaleno-sulfonila, ficoeritrina, fósforos de lantanídeo esimilares. Um anticorpo também pode ser marcado com enzimas que sãoúteis para detecção, tal como peroxidase de raiz forte, (i-galactosidase, luci-ferase, fosfatase alcalina, glicose oxidase e similares. Quando um anticorpofor marcado com uma enzima detectável, o mesmo é detectado ao adicionarreagentes adicionais que a enzima utiliza para produzir um produto de rea-ção que pode ser discernidos. Por exemplo, quando o agente peroxidase daraiz forte estiver presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminoben-zidina resulta em um produto de reação colorido, que é detectável. Um anti-corpo também pode ser marcado com biotina, e detectado através de medi-da indireta de ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo tambémpode ser marcado com um epitopo de polipeptídeo predeterminado reconhe-cido por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par zíper deleucina, sítios de ligação de anticorpos secundários, domínios de ligação demetal, etiquetas de epitopo). Em algumas modalidades, os marcadores sãoligados por braços espaçadores de diversos comprimentos para reduzir ocongestionamento estérico potencial.

Um anticorpo anti-miostatina também pode ser derivatizado comum grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), um grupo metila ou etila,ou um grupo de carboidrato. Estes grupos são úteis para aperfeiçoar as ca-racterísticas biológicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vida no soro.

Composições Farmacêuticas e Kits

A invenção também se refere a composições que compreendemum anticorpo anti-miostatina humano com propriedades inibidoras.

Os anticorpos anti-miostatina antagonista da invenção são úteispara prevenir ou tratar uma grande faixa de condições e distúrbios em que édesejado aumentar a massa de músculo esquelético e/ou óssea. Em algunscasos, tais condições e distúrbios podem ser relacionados à idade ou rela-cionados à doença. Um anticorpo anti-miostatina antagonista da invençãopode ser usado para tratar, prevenir ou inibir a perda de massa e resistênciamuscular relacionadas à idade inclusive atrofia muscular que resulta, porexemplo, em imobilização.

Ademais, um anticorpo anti-miostatina antagonista da invençãoé útil para tratar ou prevenir perda muscular em doenças consuntivas ou ou-tras doenças ou condições, associadas com perda de massa muscular inclu-sive, porém sem caráter limitativo, trauma (inclusive trauma de músculo,nervo e osso), queimaduras, AIDS, câncer, fraturas no quadril (especialmen-te nos idosos), prótese de articulação, lesões agudas no joelho, artrite, insu-ficiência renal crônica (CRF), insuficiência cardíaca congestiva (CHF), doen-ça pulmonar obstrutiva crônica (COPD), esclerose múltipla (MS), doença deParkinson, doença crônica crítica, lesão no sistema nervoso central (CNS),acidente vascular cerebral, caquexia, síndrome de distrofias musculares,lesão em cirurgia e articulação.

Os anticorpos anti-miostatina antagonistas da invenção tambémsão úteis para tratar condições metabólicas. Tais condições incluem diabe-tes melito tipo 2, síndromes metabólicas tais como síndrome X, resistência àinsulina, tolerância à glicose comprometida e obesidade.

Ademais, um anticorpo anti-miostatina antagonista da invençãoé útil para tratar ou prevenir distúrbios associados com perda óssea, inclusi-ve, porém sem caráter limitativo, osteopenia e osteoporose relacionadas àidade ou hormônio, osteoartrite e fraturas relacionadas à osteoporose.

O tratamento pode envolver a administração de um ou mais an-ticorpos monoclonais anti-miostatina inibidores da invenção, ou fragmentosde ligação de antígeno destes, sozinhos ou com um veículo farmaceutica-mente aceitável. Os anticorpos antimiostatina inibidores da invenção e ascomposições que compreendem os mesmos, podem ser administrados emcombinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, diagnósticos ouprofiláticos. Os agentes terapêuticos adicionais incluem agentes de antidis-trofia muscular (inclusive esteróides como prednisona, deflazacorte), e este-róides anabólicos, albuterol, suplementos nutritivos tais como creatina, e an-tibióticos tal como gentamicina. Os agentes terapêuticos adicionais tambémincluem agentes antidiabetes que incluem, porém sem caráter limitativo,metformina, sulfoniluréias, insulina, pramlintida (SYMLIN®), TZDs tais comorosiglitazona (Avandia®) e pioglitazona (Actos®), análogos de GLP-1, taiscomo exenitida, e inibidores de DPP-IV, tal como LAF237. Ademais, os a-gentes terapêuticos adicionais incluem agentes antiosteoporose que inclu-em, porém sem caráter limitativo, bisfosfonatos tais como alendronato (Fo-samax®) e risedronato (Actonel®), calcitonina (Miacalcin®), Raloxifeno (E-vista®), agentes hormonais tais como estrogênio e paratireóide. Tais agen-tes adicionais podem ser incluídos na mesma composição ou administradosseparadamente. Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável"significa qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos,agentes antibacterianos e antifungosos, agentes de atraso isotônicos e deabsorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis. Alguns exem-pios de veículos farmaceuticamente aceitáveis são água, salina, salina tam-ponada com fosfato, dextrose, glicerol, etanol e similares, bem como combi-nações destes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos,por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbitol, ou cloreto desódio na composição. Exemplos adicionais de substâncias farmaceutica-mente aceitáveis são agentes umectantes ou quantidades menores de subs-tâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, conser-vantes ou tampões, que aumentam a vida útil ou efetividade do anticorpo.

As composições desta invenção podem estar em uma variedadede formas, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semi-sólidas e sólidas,tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis),dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e suposi-tórios. A forma preferida depende do modo programado de administração eaplicação terapêutica. As composições preferidas típicas estão na forma desoluções injetáveis ou infusíveis, tais como composições similares àquelasusadas para imunização passiva de humanos. O modo preferido de adminis-tração é parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal,intramuscular). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é administradopor infusão ou injeção intravenosa. Em outra modalidade preferida, o anti-corpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas podem ser tipicamente estéreis eestáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composiçãopode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, liposso-ma, ou outra estrutura ordenada adequada a alta de concentração de fárma-co. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas ao incorporar oanticorpo antimiostatina na quantidade requerida em um solvente apropriadocom um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, como re-querido, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões sãopreparadas ao incorporar o composto ativo dentro de um veículo estéril quecontém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridosdentre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a prepara-ção de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparaçãosão secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pódo ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de umasolução estéril anteriormente filtrada deste. A fluidez apropriada de uma so-lução pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento talcomo lecitina, através da conservação do tamanho de partícula requerido nocaso de dispersão e através do uso de tensoativos. A absorção prolongadade composições injetáveis pode ser induzida ao incluir na composição umagente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gela-tina.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado em uma formu-lação como uma solução aquosa estéril que possui um pH que varia a partirde cerca de 5,0 a cerca de 6,5 e que compreende de cerca de 1 mg/ml acerca de 200 mg/ml de anticorpo, de cerca de 1 milimolar a cerca de 100milimolar de tampão de histidina, de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 10mg/ml de polisorbato 80, de cerca de 100 milimolar a cerca de 400 milimolarde trealose, e de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de diidratodissódico EDTA.

Os anticorpos da presente invenção podem ser administradospor uma variedade de métodos conhecidos na técnica, embora para muitasaplicações terapêuticas, a rota/modo preferido de administração é infusãosubcutânea, intramuscular, ou intravenosa. Como será avaliado pelo versa-do na técnica, a rota e/ou modo de administração irá variar dependendo dosresultados desejados.

Em certas modalidades, o composto ativo para composições deanticorpo pode ser preparado com um veículo que irá proteger o anticorpocontra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada,inclusive implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de entrega microen-capsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usa-dos, tais como, acetato de etileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico,colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a prepara-ção de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos peloversado na técnica. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled ReleaseDrug Deliverv Systems (J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York,1978).

Em certas modalidades, um anticorpo antimiostatina da invençãopode ser oralmente administrado, por exemplo, com um diluente inerte ouum veículo edível assimilável. O composto (e outros ingredientes, se deseja-dos) pode ser envolvido em uma cápsula de gelatina com revestimento duroou macio, comprimido formando comprimidos, ou diretamente incorporadosna dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os anticorpos an-ti-miostatina podem ser incorporados com excipientes e usados na forma decomprimidos ingestíveis, comprimidos orais, pastilhas, cápsulas, elixires,suspensões, xaropes, hóstias e similares. Para administrar um composto dainvenção por administração que não parenteral, pode ser necessário revestiro composto com, ou co-administrar o composto com um material para pre-venir sua inativação.

Os compostos ativos adicionais também podem ser incorpora-dos dentro das composições. Em certas modalidades, um anticorpo anti-miostatina inibidor da invenção é co-formulado com e/ou co-administradocom um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Estes agentes incluem,sem caráter limitativo, anticorpos que se ligam a outros alvos, agentes anti-neoplásicos, agentes antitumor, agentes quimioterapêuticos, análogos depeptídeo que inibem miostatina, ou anticorpos ou outras moléculas que seliga a receptores de membrana Tipo II e previnem sua ligação a ou ativaçãopor miostatina. Tais terapias de combinação podem requerer dosagens infe-riores do anticorpo anti-miostatina inibidor bem como os agentes co-administrados, desta maneira, evitando possíveis toxicidades ou complica-ções associadas com as diversas monoterapias.

Os anticorpos anti-miostatina inibidores da invenção e composi-ções que compreendem os mesmos também podem ser administrados emcombinação com outros regimes terapêuticos, em particular, em combinaçãocom exercício e/ou suplementos alimentares (inclusive nutritivos).

Em certas modalidades, um anticorpo anti-miostatina inibidor dainvenção é co-formulado com e/ou co-administrado com um ou mais agentesterapêuticos adicionais discutidos, supra. Estes agentes incluem aquelesque inibem miostatina. Ademais, tais terapias de combinação também po-dem ser usadas para tratar, prevenir ou inibir qualquer doença e condiçãomencionadas antes. Tais terapias de combinação podem requerer dosagensinferiores do anticorpo anti-miostatina inibidor bem como os agentes co-administrados, desta maneira, evitando as possíveis toxicidades ou compli-cações associadas com as diversas monoterapias.

As composições da invenção podem incluir uma "quantidadeterapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade profilaticamente eficaz" de umanticorpo ou parte de ligação de antígeno da invenção. Uma "quantidadeterapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens edurante períodos de tempo necessários, para obter o resultado terapêuticodesejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou parte deanticorpo pode variar de acordo com fatores, tais como, o estado da doença,idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo ou parte deanticorpo produzir uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidadeterapeuticamente eficaz também é uma em que qualquer efeito tóxico ouprejudicial do anticorpo ou parte de anticorpo é excedido em peso pelos efei-tos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" serefere a uma quantidade eficaz, em dosagens e durante períodos de temponecessários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, umavez que uma dose profilatica é usada em indivíduos antes ou em uma etapaanterior da doença, a quantidade profilaticamente eficaz pode ser menor doque a quantidade terapeuticamente eficaz.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para proporcionara resposta ótima desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profi-latica). Por exemplo, um único bolo pode ser administrado, diversas dosesdivididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser propor-cionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelas exigências da si-tuação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições paren-terais em forma de dosagem única para facilidade de administração e uni-formidade de dosagem. A forma de dosagem única como usada aqui se re-fere a unidades fisicamente descontínuas adaptadas como dosagens únicaspara os animais mamíferos que serão tratados; cada unidade contém umaquantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o e-feito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico reque-rido. A especificação das formas de dosagem única da invenção é prescritae diretamente dependente (a) das características exclusivas do anticorpoanti-miostatina ou parte deste e do efeito terapêutico pu profilático particularque será obtido, e (b) as limitações inerentes na técnica para compor tal an-ticorpo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Uma faixa exemplificativa, não-limitativa de uma quantidade te-rapêutica ou profilaticamente eficaz de um anticorpo ou parte de anticorpoda invenção é 0,025 a 50 mg/kg, mais preferivelmente, 0,1 a 50 mg/kg, maispreferivelmente, 0,1 a 25, 0,1 a 10 ou 0,1 a 3 mg/kg. Em algumas modalida-des, uma formulação contém 5 mg/ml de anticorpo em um tampão de 20mMde citrato de sódio, pH 5,5, 140mM de NaCI e 0,2 mg/ml de polisorbato 80.Deve ser observado que os valores de dosagem podem variar com o tipo egravidade da condição que será suavizada. Deve ser adicionalmente enten-dido que em qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específi-cos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade do in-divíduo e da opinião profissional da pessoa que está administrando ou su-pervisionando a administração das composições, e que as faixas de dosa-gem estabelecidas aqui são apenas exemplificativas e não pretendem limitaro escopo ou prática da composição reivindicada.

Outro aspecto da presente invenção proporciona kits que com-preendem um anticorpo anti-miostatina ou parte de ligação de antígeno dainvenção ou uma composição que compreende tal anticorpo ou parte. Um kitpode incluir, além do anticorpo ou composição, agentes diagnósticos ou te-rapêuticos. Um kit também pode incluir instruções para uso em um métododiagnóstico ou terapêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anti-corpo ou uma composição que compreende o mesmo e um agente diagnós-tico que pode ser usado em um método descrito abaixo. Em outra modalida-de preferida, o kit inclui o anticorpo ou uma composição que compreende omesmo e um ou mais agentes terapêuticos que podem ser usados em ummétodo descrito abaixo.

Métodos Diagnósticos de Uso

Em outro aspecto, a invenção proporciona métodos diagnósti-cos. Os anticorpos anti-miostatina podem ser usados para detectar miostati-na em uma amostra biológica in vitro ou in vivo.

Os anticorpos anti-miostatina podem ser usados em um imuno-ensaio convencional, que inclui, sem caráter limitativo, ELISA, RIA, citome-tria de fluxo, imunoistoquímica em tecido, Western blot ou imunoprecipita-ção. Os anticorpos anti-miostatina da invenção podem ser usados para de-tectar miostatina de humanos. Em outra modalidade, os anticorpos anti-miostatina podem ser usados para detectar miostatina de, por exemplo, ca-mundongos, macacos cinomólgos, rato, cão, codorna, galinha, peru, porco ecavalo.

A invenção proporciona um método para detectar miostatina emuma amostra biológica que compreende colocar a amostra biológica em con-tato com um anticorpo anti-miostatina da invenção e detectar o anticorpoligado. Em uma modalidade, o anticorpo anti-miostatina está diretamentemarcado com um marcador detectável. Em outra modalidade, o anticorpoanti-miostatina (o primeiro anticorpo) não está marcado e um segundo anti-corpo ou outra molécula que pode ligar o anticorpo anti-miostatina está mar-cado. Como é bem-conhecido pelo versado na técnica, um segundo anticor-po que é selecionado é capaz de se ligar especificamente a espécies parti-culares e classe do primeiro anticorpo. Por exemplo, se o anticorpo anti-miostatina for um IgG humano, então o anticorpo secundário poderia ser umIgG anti-humano. Outras moléculas que podem se ligar a anticorpos inclu-em, sem caráter limitativo, Proteína A e Proteína G, sendo que ambas estãocomercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de Pierce Chemical Co.

Os marcadores adequados para o anticorpo ou anticorpo secun-dário foram mostrados supra, e incluem diversas enzima, grupos prostéticos,materiais fluorescentes, materiais luminescentes materiais radioativos. E-xemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase da raiz forte, fosfatasealcalina, p-galactosidase, ou acetilcolinasterase; exemplos de complexos degrupo prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina;exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluo-resceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotri-azinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um materialluminescente inclui luminol; e exemplos de material radioativo adequado in-cluem 125l, 131l, 35S ou 3H.

Em outras modalidades, a miostatina pode ser analisada emuma amostra biológica por meio de um imunoensaio de concorrência queutiliza modelos de miostatina marcados com uma substância detectável eum anticorpo anti-miostatina não-marcado. Nesta análise, a amostra biológi-ca, os modelos de miostatina marcados e o anticorpo anti-miostatina sãocombinados e a quantidade de modelo de miostatina marcado ligado ao an-ticorpo não-marcado é determinada. A quantidade de miostatina na amostrabiológica é inversamente proporcional à quantidade de modelo de miostatinamarcado ligado ao anticorpo anti-miostatina.

Alguém pode utilizar os imunoensaios descritos acima para inú-meros propósitos. Por exemplo, os anticorpos anti-miostatina podem ser u-sados para detectar miostatina em células cultivadas. Em uma modalidadepreferida, os anticorpos anti-miostatina são usados para determinar a quan-tidade de miostatina produzida por células que foram tratadas com diversoscompostos. Este método pode ser usado para identificar compostos quemodulam níveis de proteína miostatina. De acordo com este método, umaamostra de células é tratada com um composto de teste durante um períodode tempo, enquanto outra amostra é deixada não-tratada. Se o nível total demiostatina for medido, as células são usadas e o nível total de miostatina émedido utilizando um dos imunoensaios descritos acima. O nível total demiostatina nas células tratadas versus não-tratadas é comparado para de-terminar o efeito do composto de teste.

Um imunoensaio preferido para medir os níveis totais de miosta-tina é a citometria de fluxo ou imunoistoquímica. Métodos, tais como ELISA,RIA, citometria de fluxo, Western blot, imunoistoquímica, marcação de su-perfície celular de proteína de membrana integral e imunoprecipitação sãobem-conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Harlow and Lane, supra.Ademais, os imunoensaios podem ser aumentados em escala para seleçãode alto rendimento para testar um grande número de compostos tanto paraativação como inibição de expressão de miostatina.

Os anticorpos anti-miostatina da invenção também podem serusados para determinar os níveis de miostatina em um tecido ou soro. Emalgumas modalidades, o tecido é um tecido doente. Em algumas modalida-des do método, um tecido ou uma biópsia do mesmo é excisada de um pa-ciente. O método compreende as etapas de administrar um anticorpo anti-miostatina marcado de forma detectável ou uma composição que o compre-ende em um paciente necessitado de tal teste diagnóstico e submeter o pa-ciente a análise de imagens para determinar o local dos tecidos que expres-sam miostatina. A análise de imagens é bem-conhecida na técnica médica, einclui, sem caráter limitativo, análise de raio-x, imagens por ressonânciamagnética (MRI) ou tomografia computadorizada (CT). O anticorpo pode sermarcado com qualquer agente adequada para imagem in vivo, por exemplo,um agente de contraste, tal como, bário, que pode ser usado para análise deraio-x ou um agente de contraste magnético, tal como, um quelato de gado-línio, que pode ser usado para MRI ou CT. Outros agentes de marcação in-cluem, sem caráter limitativo, radioisótopos, tal como, 99Tc. Em outra moda-lidade, o anticorpo anti-miostatina será não-marcado e será representado aoadministrar um segundo anticorpo ou outra molécula que é detectável e quepode se ligar ao anticorpo anti-miostatina. Em uma modalidade, uma biópsiaé obtida do paciente para determinar se o tecido de interesse expressa mios-tatina.

Métodos Terapêuticos de Uso

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método parainibir a atividade de miostatina ao administrar um anticorpo anti-miostatinaem um paciente necessitado do mesmo. Qualquer um dos tipos de anticor-pos descritos aqui pode ser usado de forma terapêutica. Em diversas moda-lidades, o anticorpo anti-miostatina é um anticorpo humano, quimérico ouhumanizado. Em uma modalidade preferida, a miostatina é humana e o pa-ciente é um paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser ummamífero que expressa uma miostatina com a qual o anticorpo anti-miostatina reage cruzadamente. O anticorpo pode ser administrado em ummamífero não-humano que expressa miostatina com a qual o anticorpo rea-ge cruzadamente (ou seja, um rato, um camundongo ou um macaco cino-mólgo) para propósitos veterinários ou como um modelo de animal de doen-ça humana. Tais modelos de animal podem ser úteis para avaliar a eficáciaterapêutica de anticorpos desta invenção.

Estes anticorpos podem ser usados para promover crescimentomuscular, ganho de peso e auxílio na prevenção de fraqueza em animais(gado, suíno, carneiro, cavalos, frangos, perus e peixes) e animais de com-panhia (cães, gatos e cavalos).Em outra modalidade, a invenção proporciona um método parapromover o crescimento muscular, ganho de peso e auxílio na prevenção defraqueza em gado, suíno, carneiro, frangos, perus, cavalos, peixes, cães egatos necessitados deste que compreende a etapa de administrar no ditoindivíduo um anticorpo ou parte de ligação de antígeno como descrito aqui.

Como usado aqui, o termo "uma condição que pode ser preveni-da ou tratada ao reduzir a atividade miostatina" pretende incluir doenças eoutros distúrbios onde a presença de altos níveis de miostatina em um indi-víduo que sofre do distúrbio foi mostrada como ou suspeita de ser tanto res-ponsável pela patofisiologia do distúrbio como um fator que contribui paraum agravamento do distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, porexemplo, através de um aumento nos níveis de miostatina em tecidos e flui-dos ou Smad 2 ou 3 fosforilado em tecido muscular nas células afetadas outecidos de um indivíduo que sofre do distúrbio. O aumento nos níveis de mi-ostatina podem ser detectados, por exemplo, utilizando um anticorpo anti-miostatina, como descrito acima.

Em outra modalidade preferida, um anticorpo anti-miostatina po-de ser administrado em um paciente que expressa níveis inapropriadamentealtos de miostatina. É conhecido na técnica que a expressão de alto nível demiostatina pode resultar em uma variedade de condições debilitantes, perdaóssea e em acúmulo de massa de gordura. Em uma modalidade, o dito mé-todo se refere ao tratamento de doenças e condições onde deseja-se reduzira perda de ou aumentar a massa de músculo esquelético, para reduzir aperda óssea ou para aumentar a massa óssea e/ou reduzir massa de gordu-ra neutralizando os efeitos de miostatina. Tais condições e doenças sãomencionadas supra.

Em outra modalidade preferida, um anticorpo anti-miostatina po-de ser administrado em um paciente que não expressa níveis inapropriadosde miostatina (altos ou baixos), porém cuja condição ainda será tratada ouprevenida com êxito utilizando o tratamento antimiostatina. Em uma modali-dade, o dito método se refere ao tratamento de doenças e condições em quedeseja-se inibir a atividade de miostatina para tratar a perda de ou para a-perfeiçoar a massa de músculo esquelético, para tratar a perda óssea oupara aumentar a massa óssea e/ou para tratar a massa de gordura neutrali-zando os efeitos de miostatina. Tais doenças e condições são conhecidas natécnica e poderiam incluir doenças e condições que se associam com umavariedade de condições debilitantes que podem incluir perda óssea e acú-mulo de massa de gordura, por exemplo, doenças degenerativas relaciona-das à idade e condições normais relacionadas à idade.

O anticorpo pode ser administrado uma vez, porém de formamais preferida, é administrado múltiplas vezes. O anticorpo pode ser admi-nistrado de três vezes ao dia a uma vez a cada seis meses ou por mais tem-po. A administração pode ocorrer através de um programa tal como três ve-zes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia, uma vez a cada dois dias,uma vez a cada três dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas se-manas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada trêsmeses e uma vez a cada seis meses. O anticorpo também pode ser adminis-trado de forma contínua através de uma mini bomba. O anticorpo pode seradministrado através de uma rota oral, mucosa, bucal, intranasal, inalável,intravenosa, subcutânea, intramuscular ou parenteral. O anticorpo pode seradministrado uma vez, pelo menos duas vezes ou pelo menos durante o pe-ríodo de tempo até a condição ser tratada, paliada ou curada. O anticorposerá geralmente administrado durante o tempo em que a condição estiverpresente. O anticorpo será geralmente administrado como parte de umacomposição farmacêutica como descrito supra. A dosagem de anticorpo es-tará geralmente na faixa de 0,1 a 100 mg/kg, mais preferivelmente, 0,5 a 50mg/kg, mais preferivelmente, 1 a 20 mg/kg, e ainda mais preferivelmente, 1 a10 mg/kg. A concentração de soro do anticorpo pode ser medida por meiode qualquer método conhecido na técnica.

A co-administração do anticorpo com um agente terapêutico adi-cional (terapia de combinação) inclui administrar uma composição farmacêu-tica que compreende o anticorpo anti-miostatina e o agente terapêutico adi-cional bem como administrar duas ou mais composições farmacêuticas se-paradas, sendo que uma compreende o anticorpo anti-miostatina e a(s) ou-tra(s) compreende(m) o(s) agente(s) terapêutico(s) adicional(is). Ademais,embora a co-administração ou terapia de combinação signifique geralmenteque o anticorpo e agentes terapêuticos adicionais são administrados simul-taneamente, a mesma também inclui casos onde o anticorpo e agentes tera-pêuticos adicionais são administrados em momentos diferentes. Por exem-plo, o anticorpo pode ser administrado uma vez a cada três dias, enquanto oagente terapêutico adicional é administrado uma vez ao dia. Alternativamen-te, o anticorpo pode ser administrado antes ou subseqüente ao tratamentodo distúrbio com o agente terapêutico adicional, por exemplo, após a terapiado paciente falhar com o agente adicional. De forma similar, a administraçãodo anticorpo anti-miostatina pode ser administrada antes ou subseqüente aoutra terapia, tal como exercício e/ou suplementos alimentares (inclusivenutritivos). O anticorpo e um ou mais agentes terapêuticos adicionais (a te-rapia de combinação) pode ser administrado uma vez, duas vezes ou pelomenos durante o período de tempo até a condição ser tratada, paliada oucurada. De preferência, a terapia de combinação é administrada múltiplasvezes. A terapia de combinação pode ser administrada de três vezes ao diaa uma vez a cada seis meses. A administração pode ocorrer através de umprograma tal como de três vezes ao dia, duas vezes ao dia, uma vez ao dia,e uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez por semana,uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois me-ses, uma vez a cada três meses e uma vez a cada seis meses, ou pode seradministrada de forma contínua através de uma mini bomba. A terapia decombinação pode ser administrada através de uma rota oral, mucosa, bucal,intranasal, inalável, intravenosa, subcutânea, intramuscular ou parenteral.

Terapia Genética

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem seradministradas em um paciente necessitado destas através de terapia genéti-ca. A terapia pode ser tanto in vivo como ex vivo. Em uma modalidade prefe-rida, as moléculas de ácido nucléico que codificam tanto uma cadeia pesadacomo uma cadeia leve são administrada em um paciente. Em uma modali-dade preferida, as moléculas de ácido nucléico são administradas de modoque estas sejam estavelmente integradas dentro de cromossomos de célulasB devido ao fato de estas células serem especializadas para produzir anti-corpos. Em uma modalidade preferida, as células precursoras B são trans-fectadas ou infectadas ex vivo e retransplantadas dentro de um paciente ne-cessitado destas. Em outra modalidade, as células precursoras B ou outrascélulas são infectadas in vivo utilizando um vírus conhecido por infectar otipo de célula de interesse. Os vetores típicos usados para terapia genéticaincluem lipossomas, plasmídeos e vetores virais. Os vetores virais exemplifi-cativos são retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associado. Após a infecçãotanto in vivo como ex vivo, os níveis de expressão de anticorpo podem sermonitorados ao retirar uma amostra do paciente tratado e ao utilizar qual-quer imunoensaio conhecido na técnica ou discutido aqui.

Em uma modalidade preferida, o método de terapia genéticacompreende as etapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isola-da que codifica a cadeia pesada ou uma parte de ligação de antígeno destade um anticorpo anti-miostatina e que expressa a molécula de ácido nucléi-co. Em outra modalidade, o método de terapia genética compreende as eta-pas de administrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica acadeia leve ou uma parte de ligação de antígeno desta de um anticorpo anti-miostatina e que expressa a molécula de ácido nucléico. Em um métodomais preferido, o método de terapia genética compreende as etapas de ad-ministrar uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica a cadeia pe-sada ou uma parte de ligação de antígeno desta e uma molécula de ácidonucléico isolada que codifica a cadeia leve ou a parte de ligação de antígenodesta de um anticorpo anti-miostatina da invenção e que expressa as molé-culas de ácido nucléico. O método de terapia genética também pode com-preender a etapa de administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais,tais como aqueles mencionados, supra.

Para que esta invenção possa ser melhor compreendida, os se-guintes exemplos são estabelecidos. Estes exemplos servem apenas parapropósitos de ilustração e não devem ser interpretados de forma algumacomo uma limitação do escopo da invenção.EXEMPLO I

Geração de Hibridomas que Produzem Anticorpo Anti-miostatina

Os anticorpos da invenção foram preparados, selecionados eanalisados como se segue:

Camundongos XenoMouse™ com oito a dez semanas de idadeforam imunizados de forma intraperitoneal ou em suas patas traseiras tantocom uma miostatina madura c-terminal (10ug/dose/camundongo) (R&D Sys-tems, Catalog N9 788-G8) como com uma miostatina madura cinomóloga decomprimento total. Esta dose foi repetida sete vezes durante um período detrês a quatro semanas. Quatro dias antes da fusão, os camundongos foramadministrados com uma injeção final da miostatina em PBS. Os linfócitos dobaço e linfonodo de camundongos imunizados foram fundidos com a linhacelular de mieloma não-secretor P3-X63-Ag8.653, e três células fundidasforam submetidas à seleção de HAT como anteriormente descrito (Galfreand Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46, 1981). Um grupo de hibridomas foirecuperada sendo que todos secretam anticorpos humanos específicos demiostatina lgG2 ou lgG4.

Protocolo de análise ELISA GDF8 e GDF11:

A análise ELISA foi usada para detectar a ligação de anticorpo amiostatina ou GDF11. A miostatina ou GDF11 foi revestida sobre uma placamicrotiter de 96 cavidades Immulon (superfície NUNC-lmmuno® plate Maxi-Sorp®, Nalge Nunc International, Cat. No.439454) em 4jxg/ml em 50mM detampão de bicarbonato de sódio durante a noite a 4°C. As placas foram la-vadas, e então bloqueadas com salina tamponada com fosfato (PBS) quecontém 0,1% de Tween-20 e 0,5% de albumina de soro bovino. Os anticor-pos foram adicionados às placas ELISA bloqueadas, incubados durante 1hora, e lavados com PBS com Tween-20. A ligação foi detectada por peroxi-dase de raiz forte de IgG anti-humano (Pierce Cat. No. 31420) seguida pelaadição de ABTS (Pierce Cat. No. 37615). As medidas colorimétricas foramrealizadas em 405nm em uma leitora de micro-placa (Utilizou-se SpectraMaxPlus 384, Molecular Devices).

Onze hibridomas foram selecionados para estudo adicional eforam designados 1_116_1, 1_136_3, 1_257_1, 1_46_1, 2_112_1, 1_314_1,1_66_1, 2_43_1, 2_177_1, 1_132_1, e 1_268_1. Os onze hibridomas foramdepositados sob termos de acordo com o Tratado de Budapeste com Ameri-can Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA20110-2209 em 10 de fevereiro de 2005. Os hibridomas foram designadoscom as seguintes referências numéricas:

Anticorpo_Identificador de Hibridoma_No. de Referência ATCC.

1_116_1 PF8-1-116-1 (LN 15902) PTA-6566

1_132_1 PF8-1 -132-1 (LN 15903) PTA-6567

1_136_3 PF8-1-136-3 (LN 15904) PTA-6568

1_257_1 PF8-1-257-1 (LN 15905) PTA-6569

1_268_1 PF8-1-268-1 (LN 15906) PTA-6570

1_314_1 PF8-1-314-1 (LN 15907) PTA-6571

1_46_1 PF8-1-46-1 (LN 15908) PTA-6572

1_66_1 PF8-1-66-1 (LN 15909) PTA-6573

2_112_1 PF8-2-112-1 (LN 15910) PTA-6574

2_43_1 PF8-2-43-1 (LN 15911) PTA-6575

2_177_1 PF8-2-177-1 (LN 15912) PTA-6576

EXEMPLO II

Seqüências de Anticorpos Anti-miostatina Preparados de Acordo com a In-venção

Para analisar a estrutura de anticorpos produzidos de acordocom a invenção, os ácidos nucléicos que foram clonados codificam fragmen-tos de cadeia pesada e cadeia leve de hibridomas que produzem anticorposmonoclonais anti-miostatina.

A clonagem e seqüenciamento das regiões variáveis de anticor-po, foram realizados como se segue: Poly(A)+ mRNA foi isolado utilizandoum kit Fast-Track (Invitrogen) de aproximadamente 2 X 105 células de hibri-doma derivadas de camundongos XenoMouse® imunizados com miostatina.

O cDNA foi sintetizado a partir do mRNA utilizando iniciadores aleatórios. OcDNA aleatoriamente iniciado foi amplificado utilizando iniciadores de domí-nio variável específicos de família VK ou Vh humanos (Marks et al., "Oligonu-cleotide iniciadores for polymerase chain reaction amplification of humanimmunoglobulin variable genes and design of family-specific oligonucleotideprobes". Eur. J. Immunol. 21:985-991 (1991)) ou um iniciador VH universalhumano [MG-30, 5'-CAGGTGCAGCTGGAGGAGTCIGG-3'] (SEQ ID NO:91), em conjunto com iniciadores específicos para a região constante Cy2humana, MG-40d [5'-GCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAGGA-3'] (SEQ ID NO:92) ou uma região constante Ck [hicP2; como anteriormente descrito emGreen et al., 1994]. As moléculas de ácido nucléico que foram obtidas codifi-cam transcrições de cadeia pesada e cadeia leve humanas kappa de hibri-dornas que produzem anti-miostatina por amplificação PCR de poly(A+) RNAque utiliza os iniciadores descritos acima. Os produtos de PCR foram clona-dos [pCRIl (Invitrogen)] utilizando um kit de clonagem TA (Invitrogen) e am-bas foram seqüenciadas utilizando kits de seqüenciamento terminador decorante Prism (Applied Biosystems Inc) e uma máquina de seqüenciamentoABI 377 (Applied Biosystems Inc). Todas as seqüências foram analisadaspor alinhamentos com o "diretório de seqüência BASE V" (Tomlinson et al.,MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK) utilizando programasde software MacVector® (Accelrys, San Diego, CA) e Geneworks® (Hindmar-sh, S.A. Austrália).

Para obter a seqüência de ácido nucléico expressa de compri-mento total de anticorpos produzida de acordo com a invenção, os ácidosnucléicos que foram clonados codificam regiões de codificação de cadeiapesada e cadeia leve de comprimento total de hibridomas que produzemanticorpos anti-miostatina. A clonagem e seqüenciamento foram realizadoscomo se segue: Poly(A)+ mRNA foi isolado utilizando um Mini Kit RNeasy(Qiagen) e o cDNA sintetizado do mRNA com o kit RT-para-PCR Advantage(BD Biosciences) que utiliza iniciação por oligo(dT). O cDNA iniciado por oli-go(dT) foi amplificado em duas reações independentes que utilizam iniciado-res degenerados designados para se hibridizar na região não-traduzida 5'(5'UTR) de segmentos de gene VH ou VK humano (TABELA 2A e 2B) emconjunto com iniciadores não-degenerados específicos para regiões em3'UTR de IGHG2 ou IGHG4 [G_3UTR_R, 5TACGTGCCAAGCATCCTCGC](SEQ ID NO: 93) ou IGK [K_3UTR_R,5'AGGCTGGAACTGAGGAGCAGGTG] (SEQ ID NO: 94). A amplificação foirealizada utilizando o kit Expand High Fidelity PCR (Roche) e um DNA Engi-ne PTC-200 (MJ Research) com ciclização como se segue: 2 minutos a94°C; 23x (30 segundos a 94°C, 50 segundos a 52°C, 2 minutos a 72°C); 8minutos a 72°C. Tanto para reação em cadeia pesada como em cadeia leve,os produtos de PCR de duas PCRs independentes foram clonados em p-CR2.1 utilizando um kit de clonagem TOPO-TA (Invitrogen) e ambas as ca-deias de dois clones foram seqüenciadas utilizando química de Grills 16thBDTv3.1/dGTP (Applied Biosystems Inc) e um Analisador de DNA 3730x1(Applied Biosystems Inc).

TABELA 2A

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TABELA 2B

Iniciadores 5' usados para amplificação de cadeias pesada e leve de anti-corpo anti-miostatina:

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Análise de Utilização de Gene

A partir da seqüência de ácido nucléico e seqüência de aminoá-cido prognostica dos anticorpos, o uso de gene foi identificado para cadacadeia de anticorpo. A Tabela 3 estabelece a utilização de gene de clonesde hibridoma selecionados de anticorpos de acordo com a invenção:

TABELA 3

Utilização de Segmento de Gene de Cadeia Pesada e Leve:

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As mutações desenvolvidas durante a maturação de anticorpodas regiões de moldura foram modificadas novamente nas seqüências delinhagem germinativa como ilustrado no alinhamento de seqüência da Figura19. Especificamente, o resíduo 12 na cadeia pesada de anticorpo monoclo-nal 2_112_1 (SEQ ID NOs: 26 e 77) foi modificado de lie para Vai. Na cadeialeve (SEQ ID NOs:28 e 79), o resíduo 58 foi modificado de Phe para He e oresíduo 85 foi modificado de lie para Vai. A mutagênese de resíduos especí-ficos das cadeias pesadas e leves de anticorpo 2_112_1 foi realizada ao de-signar iniciadores que utilizam o Kit de Mutagênese Sítio-Dirigida Quick-Change de Stratagene, de acordo com as instruções do fabricante. As muta-ções foram confirmadas por seqüenciamento automático, e os insertos mu-tagenizados foram subclonados em vetores de expressão. Estes vetores deexpressão foram transfectados em células NSO (ECACC Ne 85110503) eHEK-293T (American Type Culture Collection) para expressar anticorposrecombinantes da invenção. O anticorpo resultante que possui regiões demoldura novamente modificadas é designado anticorpo 2_112_K.

EXEMPLO III

Inibição de Miostatina por Anticorpos Anti-Miostatina Humanos (análise luci-ferase A204)

Uma análise de gene repórter responsivo de miostatina (vide,Thies, et al., Growth Factors, (2001) 18:251-259.) foi usada para avaliar aatividade biológica de miostatina ativa in vitro. Esta análise utiliza um vetorrepórter pGL3(CAGA)-i5 acoplado a luciferase. A seqüência de caixa CAGA(AGCCAGACA) (SEQ ID NO: 101) foi considerada como um elemento TGF-P-responsivo na região de promotor de um gene TGF-p-induzido, PAI-1. (Za-wel, et al. Mol. Cell, (1998) 1:611-617). Este vetor repórter foi gerado ao in-serir 15 cópias de caixas CAGA dentro dos sítios Smal e Xhol de vetor pro-motor pGL3 (Promega, Cat. No. E1761). A linha celular de rabdomiosarcomahumano, A204 (Célula ATCC No. HTB-82), foi transfectada de forma transi-ente com pGL3(CAGA)15 e CMV (3-GAL utilizando o reagente de transfec-ção Fugene 6 (Roche Diagnostics, Cat. No. 1814443). As células transfecta-das fora cultivadas em meio 5A de McCoy (Invitrogen, Cat. No. 16600) su-plementadas com 10% de soro fetal bovino, 100 U/ml de estreptomicina, e100ng/ml de penicilina durante 16 horas. As células foram alteradas parameio de inanição (meio 5A de McCoy com estreptomicina, penicilina, e1 mg/ml de albumina de soro bovino), e então tratadas com miostatina,GDF11, ou activina durante 6 horas a 37°C. A atividade de luciferase foi me-dida utilizando o sistema de análise de luciferase Dual-light® (Applied Biosy-tems, Cat. No. T1004). A miostatina ativa o repórter a cerca de 10 dobrascom EC50 em torno de 8ng/ml. GDF11 ativa o repórter na resposta muitosimilar. A atividade de neutralização de um anticorpo foi determinada ao pré-incubar o anticorpo com miostatina durante 30 minutos antes da adição àscélulas A204. Como mostrado na Figura 1, os anticorpos anti-miostatina hu-manos da invenção inibiram a atividade de luciferase estimulada por miosta-tina nas células A204. Um experimento similar que utiliza GDF11 também foirealizado para estudar as especificidades dos anticorpos da invenção. Osdados são resumidos na Figura 1. A maioria dos anticorpos possui atividadede neutralização muito mais potente contra GDF8 do que GDF11. Os anti-corpos monoclonais 1_46_1 e 1_132_1 neutralizam tanto GDF8 comoGDF11 com a mesma potência.

EXEMPLO IV

Inibicão de Miostatina por Anticorpos Anti-miostatina Humanos (análise beta-lactamase L6)

Em análises in vitro para medir a ligação de miostatina a recep-tores de membrana Tipo II na presença de anticorpos anti-miostatina foramrealizadas para determinar se os anticorpos anti-miostatina eram capazes deinibir tal ligação e seu grau de inibição.

Uma análise de repórter L6 Aurora foi realizada para avaliar aatividade biológica de miostatina ativa in vitro. A LD10 miostatina L6 é umalinha celular que expressa de forma estável um gene repórter de beta-lactamase. A região de promotor no repórter inserido consiste em 16 cópiasde elemento de ligação Smad (SBE, GTCTAGAC (SEQ ID NO: 102), Zawelet al., Mol. Cell 1: 611-17 (1998)). As células foram cultivadas em DMEM dealta glicose (Invitrogen, Cat. No. 11995) suplementadas com 10% de sorofetal bovino inativado por calor (FBS), 200-400|Lig/ml de Zeocina, 100 U/mlde estreptomicina e 100|ig/ml de penicilina. As células foram semeadas emplaca de 96 cavidades no primeiro dia e alteradas para meio de inanição(DMEM com Zeocina, estreptomicina, penicilina e 0,1% de FBS) na tarde dosegundo dia. Na manhã do terceiro dia, as células foram tratadas com mios-tatina, GDF11, ou activina durante 4 horas a 37°C. O kit de carregamentoAurora CCF2 foi usado para analisar a atividade de beta-lactamase de acor-do com a sugestão do fabricante (Invitrogen, Cat. No. K1032).

A expressão mediada por smad ativada por miostatina do repór-ter a cerca de 2 a 3 dobras com EC50 em torno de 5ng/ml. GDF11 e activinaativaram o repórter na resposta muito similar.

A atividade de neutralização de um anticorpo foi determinada aopré-incubar o anticorpo com miostatina durante 30 minutos antes da adiçãoàs células LD10 de miostatina L6. Como mostrado nas Figuras 2 e 11, todosos anticorpos anti-miostatina humanos testados inibiram a ativação de prote-ína smad em uma faixa de cerca de 1 a cerca de 225 nM.

EXEMPLO V

Inibição de Fosforilação Smad 2 induzida por Miostatina (Western Blot)

As células do carcinoma hepatocelular HepG2 humanas (ATTCCell No. HB-8065) foram cultivadas em DMEM de alta glicose (Invitrogen,Cat. No. 11995) suplementadas com 10% de soro bovino fetal (FBS), 100U/ml de estreptomicina, e 100|i.g/ml de penicilina. 60 a 70% de células con-fluentes foram alteradas para o meio de inanição (DMEM com estreptomici-na, penicilina, e 0,5% de FBS) durante a noite. As células foram tratadascom miostatina durante 30 minutos. A atividade de neutralização de um anti-corpo foi determinada ao pré-incubar o anticorpo com miostatina durante 30minutos antes da adição às células HepG2. As células foram lisadas porwestern blot. Smad2 fosforilado foi detectado utilizando um anticorpo anti-fosfo-Smad2 de coelho (Cell Signalling, Cat. No. 3101), que foi então detec-tado por Alex 680 Anti-coelho (Molecular Probes, Cat. No. A21076). A quan-tidade de Smad fosforilado Smad2 foi quantificada utilizando Odyssey Infra-red Imager (Li-Cor). A desidrogenase de gliseraldeído-3-fosfato (GAPDH) foiusada para normalização. Como mostrado na Figura 3, todos os anticorposanti-miostatina humanos de neutralização testados inibiram a fosforilação desmad 2.

EXEMPLO VI

Expressão Aumentada de mvf5 por Anticorpos Anti-Miostatina Humanos

Os mioblastos C2C12 (ATCC Cell No. CRL-1772) foram cultiva-dos em DMEM de alta glicose (Invitrogen, Cat. No. 11995) suplementadosco 10% de soro bovino fetal (FBS), 100 U/ml de estreptomicina e 100|ig/mlde penicilina. As células foram tratadas com 300ng/ml de miostatina durante2 horas. A atividade de neutralização de um anticorpo foi determinada aopré-incubar o anticorpo com miostatina durante 30 minutos antes da adiçãoàs células C2C12. As células foram colhidas e o RNA purificado utilizando kitminiprep RNeasy (Qiagen Cat. No. 74104). O RNA purificado foi quantificadocom Kit de Quantificação de RNA RiboGreen® (Molecular Probes, Cat. No.R11490). Uma quantidade igual de RNA total foi usada para análise de PCRem tempo real para detectar a expressão de RNA myf5. Os conjuntos deiniciador/sonda para detecção de RNA myf5 de camundongo foram adquiri-dos a partir de produtos de expressão genética Assays-On-Demand® (Appli-ed Biosystems, Cat. No. Hs00271574_m1). As condições de análise usadasestavam de acordo com as recomendações do fabricante. RT-PCR de umaetapa foi conduzida sobre o sistema de detecção de seqüência ABI7900(Applied Biosystems). Como mostrado na Figura 4, os anticorpos anti-miostatina humanos de neutralização da invenção aumentaram a expressãode myf5. Um anticorpo anti-miostatina humano de não-neutralização,1_159_1, não aumenta a expressão de myf5.

EXEMPLO VII

Aumento de Diferenciação Celular por Anticorpos Anti-Miostatina Humanos

A capacidade de anticorpos inibir a inibição mediada por miosta-tina de diferenciação de mioblasto foi avaliada em mioblastos C2C12. Ascélulas C2C12 foram semeadas em placas de 96 cavidades em 25.000 célu-las/cavidade em 200 ul de DMEM/20% de FBS/Penn-Strep. Vinte e quatrohoras depois, o meio foi aspirado, as células enxaguadas 1X com meio HIT(DMEM/2% de soro de cavalo/Penn-Strep), e 200 ul de meio HIT sozinho ousuplementado com 300 ng/ml de GDF-8 (R&D Systems) sozinho ou com di-versas concentrações de anticorpo adicionadas. Quarenta e oito horas de-pois, o meio foi aspirado e as células lisadas em 100 ul de tampão liso (25mM de Tris pH 7,5, 3 mM de EDTA, 1% de NP-40, 1% de Desoxicolato,0,1% de SDS e 1 comprimido de inibidor de protease Roche Complete/25 mlde tampão liso). Os níveis embriônicos de cadeia pesada de miosina (MHC)nos lisatos foram determinados por localização 5 ul de lisato em cavidadesindividuais de placas High Bind MA6000 (MSD Ne P11XB-1, Meso ScaleDiscovery, MSD), secagem a ar durante 1 hora, adição de 100 ul de BlockerA (MSD N9 R93BA-2), incubação durante 1 hora a 25°C com agitação, lava-gem 4X com PBS/0,05% de Tween-20, adição de 50 ul de anticorpo MHCembriônico (meio condicionado de hibridoma ATCC Ne CRL-2039), incuba-ção durante 1,5 hora a 25°C com agitação, lavagem 4X como antes, adiçãode 50 ul de IgG Anti-Camundongo Sulfo-TAG (MSD Ne R32AC) que foi diluí-do 1:1000 no diluente de anticorpo (MSD N9 R50AA-2), incubação durante1,5 hora a 25°C com agitação, lavagem 4X como antes, adição de 150 pi 1Xde Tampão Pronto (MSD Ne R92TC-2) e análise de quimiluminescência emum Sector Imager 6000 (MSD). Como mostrado na Figura 5, os anticorposanti-miostatina humanos de neutralização reverteram diferenciação muscularbloqueada por miostatina na análise MHC.

EXEMPLO VIII

Ligação Peptídica de Miostatina

Onze peptídeos foram gerados de GDF8 maduro para testar elocalizar a ligação de anticorpo (Vide Figura 6). ELISA de peptídeo foi feitasobre placas ELISA revestidas por glutaraldeído e sobre placas ELISA não-revestidas (superfície NUNC-lmmuno® plate MaxiSorp®, Nalge Nunc Interna-tional, Cat. No. 439454). As placas revestidas por glutaraldeído foram prepa-radas ao misturar 250 ul de glutaraldeído (50% peso/v) com 50 ml de águadeionizada e adicionar 200ul da solução em cada cavidade. As placas foramincubadas durante pelo menos 1 hora em temperatura ambiente. O glutaral-deído foi agitado fora da placa e despedaçado na parte superior de toalhasde papel para remover todo o líquido antes do uso.

As placas ELISA foram revestidas com peptídeo a1,0ug/cavidade/50ul (em tampão de bicarbonato de sódio, pH 9,6) durantepelo menos 4 horas, e então bloqueadas com 200ul de bloqueador (1% deBSA, 1% de Etanolamina pH 7,4) durante um mínimo de 4 horas. As placasforam lavadas com PBST três vezes com 200 ul/cavidade. 50ul de amostrade anticorpo (1ug/ml em PBST, Salina tamponada com fosfato (PBS) com0,05% de Tween-20) foram adicionados aos cavidades durante 1 hora. Asplacas foram então lavadas com PBST três vezes. 50 ul de peroxidase deraiz-forte de IgG anti-humano (HRP) (Pierce, Cat N9 31420) diluídos emPBST são adicionados durante mais uma hora. As cavidades foram lavadasnovamente com TBST três vezes, e então com água deionizada duas vezes.50 uJ de ABTS (MOSS) foram adicionados durante 5 a 20 minutos, e o sinalfoi detectado a 405 nm em uma leitora de placa colorimetrica. Os resultadosdo experimento de ligação são mostrados na Figura 6. Os onze peptídeossão mostrados na Figura 7.

EXEMPLO IX

Estudos de Mapeamento de Epitopo

Os experimentos de concorrência cruzada foram realizados utili-zando o instrumento BIACORE® 3000 (Biacore International AB, Uppsala,Sweden and Piscataway, N.J), seguindo os protocolos do fabricante.

Os experimentos foram realizados em um instrumento BIACO-RE® 3000 a 25°C em 0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCI, 3 mM deEDTA, 0,005% de Tween-20. A miostatina foi imobilizada sobre um chipCM5 (Biacore®) utilizando procedimentos de acoplamento de amina padrãoque produzem aproximadamente 1300 RU (unidades de ressonância). Asamostras de anticorpo foram preparadas a 50 nM e injetadas em pares, porexemplo, um mAb de referência foi injetado durante 10 minutos imediata-mente seguido por uma injeção de 10 minutos de um mAb de teste. A super-fície foi regenerada e as injeções foram repetidas em ordem inversa. O pro-cedimento foi repetido para todos os pares possíveis de anticorpos. Uma

comparação cruzada da resposta total obtida de um par de anticorpos comaquela obtida por injeções em duplicata de cada anticorpo individual foi usa-da para encontrar anticorpos que se ligam uma ao outro de ligação competi-tiva, por exemplo, os anticorpos concorrem para a ligação ao antígeno. Umaresposta maior do que aquela observada em ambas injeções em duplicatafoi indicativa de ligação a epitopos diferentes se uma resposta intermediáriaàquela observada nas injeções duplicatas for indicativa de ligação aos mes-mos epitopos, de superposição ou adjacentes. Os resultados deste experi-mento são mostrados na Figura 8 e resumidos na Figura 13.

EXEMPLOE X

lmunoprecipitação de miostatina de meio de cultura celular

Um estudo de imunoprecipitação foi realizado para testar a liga-ção de anticorpos de miostatina a GDF8 madura/complexo de pró-peptídeo.As células 293T foram transfectadas com construção de expressão GDF-8.O meio condicionado foi colhido 7 dias após a transfecção, este continhaGDF8 madura e complexo latente. 100 fil de meio condicionado foram incu-bados com 10 jxg de anticorpos de miostatina durante 16 horas a 4°C. Dyna-beads de Proteína A (Dynal, Norway) foram adicionados e incubados duran-te 90 minutos a 4°C. O imunoprecipitado foi coletado utilizando concentradormagnético MPC-E (Dynal, Norway), e lavado quatro vezes com PBS. O imu-noprecipitado foi ressuspenso no tampão de amostra de redução e carrega-do sobre 4 a 12% de gel Bis-Tris NuPage (Invitrogen). A análise de Westernblotting foi realizada utilizando sistema de imagem infravermelha Odyssey(Li-Cor). GDF8 madura e GDF8 não-processada foram detectadas utilizandoanticorpo anti-miostatina de cabra (R&D systems, Cat N9 AF788). O anticor-po policlonal anti-propeptídeo de coelho (feito em casa) foi usado para de-tectar tanto pró-peptídeo como GDF8 não-processada. Como mostrado naFigura 9, os anticorpos 2_112_1, 2_43_1, e 2_177_1 imunoprecipitaramGDF8 madura, GDF8 madura/complexo de pró-peptídeo e GDF8 não-processada; o anticorpo 1_66_1 imunoprecipitou GDF8 madura e GDF8 ma-dura/complexo de pró-peptídeo. Nenhum outro anticorpo imunoprecipitouGDF8 madura, pró-peptídeo, ou GDF8 não-processada. Viela 4 é o controlede carregamento de meio 1/10, e viela 7 é o controle de imunoprecipitaçãoapenas com meio.

EXEMPLO XI

Imunoprecipitação de miostatina de soro de camundongo

Um estudo de imunoprecipitação foi realizado para testar a ligaçãode anticorpos de miostatina a GDF8 madura de soro de camundongo. 200 uJde soro de camundongo (Rockland, Cat NQ D208-00) foram incubados com 20ug de anticorpos de miostatina durante 16 horas a 4°C. Dynalbeads de Proteí-na A foram adicionados e incubados durante 90 minutos a 4°C. O imunopreci-pitado foi coletado utilizando concentrador magnético MPC-E (Dynal, Norway),e lavado quatro vezes com PBS. O imunoprecipitado foi ressuspenso no tam-pão de amostra de redução e carregado sobre 4 a 12% de gel Bis-Tris NuPage(Invitrogen). A análise de Western blotting foi realizada utilizando sistema deimagem infravermelha Odyssey (Li-Cor). GDF8 madura foi detectada utilizandoanticorpo anti-miostatina de cabra biotinilatado (R&D systems, Cat NeBAF788). Como mostrado na Figura 10, os anticorpos 2_112_1, 2_43_1, e2_177_1 imunoprecipitaram GDF8 madura do soro de camundongo, se 1_116_1 e 1_66_1 não puderem. Sabe-se que GDF8 madura no soro se liga amuitas proteínas inibidoras tais como pró-peptídeo, FLRG, e GASAP1 (Hill etal. (2002) "The miostatina propeptide and the follistatin-related gene are inhibi-tory binding proteins of miostatina in normal serum". J. Biol. Chem. 277: 40735-40741. Hill et al. (2003) "Regulation of miostatina in vivo by growth and differ- entiation factor-associated serum protein-1: a novel protein with protease inhibi-tor and follistatin domains". Mol. Endocrin. 17(6): 1144-1154). Este experimentoindica que os anticorpos 2_112_1, 2_43_1, e 2_177_1 são de fato anticorposde neutralização não-competitivos, ou seja, os anticorpos neutralizam miostati-na, porém não bloqueiam a ligação de proteínas de ligação inibidoras presen-tes no soro. Tais anticorpos de neutralização não-competitivos poderiam servantajosos in vivo.

EXEMPLO XII

Comparação de anticorpos anti-miostatina in vivo

Camundongos KKAy/a com cinco semanas (The Jackson Labo-ratory (Bar Harbor, Maine)) foram tratados com 10 mg/kg de anticorpos mo-noclonais 2_43_1, 2_177_1, e 2_112_K ou veículo (PBS) administrados deforma subcutânea uma vez por semana durante cinco semanas. No final doestudo os animais foram submetidos à eutanásia e os grupos de músculosgastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibiais anteriores (TA) e quadríceps(Quads) foram dissecados e pesados. O tratamento com o anticorpo2_112_k aumentou significativamente (p<0,05) a massa muscular absolutado GPS (+15,5%) e Quads (+30,6%). O anticorpo 2_177 aumentou significa-tivamente apenas Quads (+11,5%). Embora TA tenham aumentado após otratamento com anticorpo 2_112_K (+16,8%), o aumento não foi estatistica-mente significativo (p=0,330). O peso de corpo aumentou durante 5 sema-nas, porém não foi significativamente diferente entre grupos de tratamentoem qualquer ponto de tempo durante o estudo. Quando a massa muscularfor corrigida para peso de corpo (o índice de massa muscular), ocorreramdiferenças significativas apenas com tratamento de 2_112_K (+11,4% emGPS e +20,6% em Quads). Os resultados deste experimento são mostradosnas Figuras 14 e 15.

EXEMPLO XIII

Farmacologia in vivo e eficácia de anticorpo

A farmacologia in vivo e eficácia de anticorpo 2_112_K foramavaliados em camundongos. Para evitar a imunomodulação potencial devidoa uma resposta de anticorpo anti-humano de camundongo (MAHA), estudosin vivo foram realizados em camundongos beges imunodeficientes combina-dos com imunodeficientes graves (Imunodeficiência Combinada Severa)(SCID). A administração subcutânea de anticorpo 2_112_K naqueles ca-mundongos em 10 mg/kg/semana s.c. durante 5 semanas aumentou a mas-sa de músculo esquelético em 19 a 25% e a resistência muscular em cercade 15%. O prolongamento da duração deste tratamento para 10 semanasresultou em um aumento adicional em resistência muscular para 21%, po-rém nenhum aumento adicional em massa muscular (em 18 a 27%). Tam-bém, a Dose de 50 mg/kg/semana s.c. durante 10 semanas não produziuaumentos superiores em massa ou resistência muscular comparados com10 mg/kg/semana. Os resultados deste experimento são mostrados na Figu-ra 16.

EXEMPLO XIV

Efeitos de dose e resposta de concentração

Quando administradas de forma subcutânea em camundongosSCID em doses que variam de sem efeito a dose máxima possível (0,01,0,1, 1 e 10 mg/kg/semana), anticorpo 2_112_K aumentou a massa muscularesquelética de forma dependente de dose em cerca de 0%, 3%, 7% e 28%,respectivamente, após 5 semanas (Figura 17). O prolongamento da duraçãode tratamento para 10 semanas não resultou em nenhum aumento adicionalem massa muscular, porém tem a tendência a aumentar a resistência demúsculo tibial de forma marginal por um adicional de 5%. Também, o anti-corpo dependente de dose alterou a composição de gordura de corpo destescamundongos em +10%, +1%, -10%, -22% com relação a controle de PBSem 0,01, 0,1, 1,0 e 10 mg/kg/semana durante 5 semanas.

A análise não-linear, de quatro parâmetros dos dados de respos-ta de dose e concentração produziu valores ED50 e EC50 estimados de 3,6mg/kg/semana e 20,4 mg/mL (-136 nM), respectivamente, adotando o au-mento em massa muscular obtido com a dose de 10 mg/kg/semana que seráde máxima eficácia. A relação entre a concentração de dose ou soro de anti-corpo 2_112_K versus alterações na massa muscular são mostradas na Fi-gura 18.

EXEMPLO XV

Eficácia de anticorpo para atenuação de atrofia muscular

Camundongos KK com dez semanas (JAX laboratories, BarHarbor, Maine) foram randomizados em três grupos: placebo/veículo, corti-sona/veículo, e cortisona/anticorpo 2_112_K. Os camundongos foram dosa-dos de forma subcutânea tanto com veículo (PBS) como 10 mg/kg de anti-corpo 2_112_K durante cinco semanas seguido por implante de um péletede placebo ou cortisona. Cinco dias depois, os camundongos foram subme-tidos à eutanásia, sacrificados e a massa muscular e massa de placa degordura foram avaliadas. Para avaliar a massa muscular, os grupos de mús-culos gastrocnemius-plantaris-soleus (GPS), tibiais anteriores (TA) e quadrí-ceps (quads) foram dissecados e pesados. O implante de cortisona resultouem uma redução significativa (p<0,05) em massa muscular para 85,1 ± 2,2%(GPS), 85,5 ± 3,9% (TA) e 84,1 ± 3,7% (quads) do nível de placebo/veículo.O tratamento com anticorpo 2_112_K melhorou completamente o disperdícioinduzido por cortisona de nível de placebo/veículo de GPS ((102,0 ± 2,2%) ,TA (99,5 ± 3,6) e quads (104,6 ± 2,8%). Os valores eram similares quandonormalizados por grama de peso do corpo. Para testar se este efeito era es-pecífico para massa muscular, a massa de placa de gordura foi determinada.Para massa de placa de gordura, as placas de gordura inguinais, epididimaise abdominais foram dissecadas e pesadas. O tratamento com anticorpo2_112-K não evitou significativamente (p<0,05) a perda na massa de placade gordura devido ao implante de cortisona em placas de gordura inguinais,(cortisona/veículo (75,1 ± 4,7%) e cortisona/2_112_K, (82,3 ± 5,3%)), epidi-dimais (cortisona/veículo (79,3 ± 5,0%) e cortisona/2_112_K (87,1 ± 3,9%)),ou abdominais, (cortisona/veículo (79,5 ± 5,5%) e cortisona/2_112_K (82,2 ±4,2%)). Os valores foram expressos com relação à placa de gordura de pla-cebo/veículo. Os resultados deste experimento são mostrados nas Figuras20A e 20B.

EXEMPLO XVI

Purificação de Proteína A de Anticorpo de Miostatina

1 a 2 litros de meio concentrado (10 dobras) HEK293 foi filtrado(2 microns) e carregado sobre uma coluna de proteína A equilibrada (Amer-sham Biosciences, Piscataway, NJ) (53 mLs, equilibrados com 5 volumes decoluna de D-PBS, pH 7,0) em 2 mL/min. A coluna foi lavada com 5 volumesde coluna de tampão acetato (20 mM de acetato de sódio, pH 5,5) e a prote-ína eluída com 4 volumes de coluna de pH 3,2 a 3,5 de acetato de sódio (20mM). O pH do eluato foi ajustado para pH 5,5 com hidróxido de sódio e fil-trado, se necessário. Por fim, o material foi concentrado a 10 mg/mL, diali-sado em 140mM de cloreto de sódio, 20 mM de acetato de sódio, pH 5,5,filtrado e armazenado a 4 graus C.

Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relató-rio descritivo estão incorporados aqui à guisa de referência como se cadapublicação individual ou pedido de patente estivesse indicado de forma es-pecífica e individual para ser incorporado à guisa de referência. Embora ainvenção anterior seja descrita em alguns detalhes à guisa de ilustração eexemplo para propósitos de clareza de compreensão, será facilmente avali-ado pelo versado na técnica, em consideração com as instruções desta in-venção, que certas alterações e modificações podem ser feitas neste semque se abandone o espírito ou escopo das reivindicações em anexo.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> PFIZER, INC.

AMGEN FRBMQNT INC.

<120> ANTIBODSRS TO MYOSTATIN

<130> ABX-PF7 PCT

<140><141>

<150> 60/674,933<151> 2005-04-25

<160> 122

<I7D> Pafcentln. Ver. 3.3

<21G> 1

<211> 133 6

<212> DNA

<213> Homo eapiens

<400> 1

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggctçotgtgcag ectctggatc caccttcagtceagggaagg ggctggsgtg ggtetcatccgeag&ctcag tgaagggccg ettcaccatcctgoaaatga acageetgag agccgaggacgggtacagct atggtcttga ctactggggctccaccaagg gcccatcggt cttccccctgacagcggccc tgggetgect ggtcaaggacaactcaggcg ctctgaccag çggegtgcacctctactccc tcagcagogt ggtgaccgtgaectgcaacg tagatcacaa gcccagcasctgttgtgtcg agtgcccacc gtgcccagcattcceeccaa aaeccaagga caccctcatggcggtggacg tgagccacga agaccccgaggaggtgcata atgccaagac aaagccacgggtcagcgtec tcaccgfctgt gcaccaggacgcctccaaca aaggcctccc agcccccatcccccgagaac cacaggfcgta caccctgcccgtcagcctga cctgectggt caaaggcttcagcaatgggc agccggagaa caactaeaagtccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtgttetcatgct ccgtgatgca tgaggctctgctgtctccgg gtaaatga

etggteaagc ctggggggfcc cctgagactc 60agctatagca. tgaattgggt ecgccaggct 120attagtagta gtagtagtfca eafcatactae 180tccagagaea acgccaagaa ctcactgtat 240acggctgtgt attacfcgtgc gagagatcgg 300cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc 360gegccctgct ccaggagcac ctccgagagc 420tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480accttcccag ctgtcctaça gtcctcagga 540ccctccagca acttcggcac ccagacctac 600accaaggtgg acaagacagt, tgagcgcaaa 660ceacctgtgg caggaccgtc agtcttcetc 720atctcccgga ccçetgaggt cacgtgcgtg 780gtccagttca actggtadgt ggaeggegtg B40gaggageagt tcaacagcac gttccgtgtg 900tggctgaacg gcaaggagta caagtgcaag SS0gagaaaacca tctccaaaac caaagggçag 1020ccatcccggg agg&gatgac caagaaccag 1080taccccag<?g acatcgccgt ggagtgggag 1140accacacctc ccatgctgga cfcccgacggc 1200gae&agagca ggtggcagca ggggaacgtc 1260caeaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1320

1338

<210> 2

<211> 445

<2l2> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Vai Gln Ley Vai Glu Ser Gly Gly Gly I*eu Vai J*ye Prç> Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ser Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lye Gly Leu Glti Trp vai35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 SÓ

liys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Axg Aep Asa Ala Lys Asn Ser Leu Tyx65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cye85 90 95

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Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lye Gly Pro Ser Vai Phe115 120 12S

Pro Leu Ala pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu130 135 140

Gly Cys Leu Vai Lye Aep Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser Trp145 150 XSS 160

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Ser Agi". Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Asp Bis Lys Pro1S5 200 205

Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lye Thr Vai Glu Arg Lya Cys Cys Vai Glu210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser Vai Phe Leu225 23 0 235 240

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Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu290 295 300

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Thr Lys Gly Gln Pro Arg Gltt Pro Gln Vai Tyx Thr Leu Pro Pro Ser340 345 3S0

Arg Glu Glu Met Thr Lye Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys3SS 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln370 375 380

Pro Glu Aen Asn Tyr Lys Thr The Pro Pro Met Leu Âep Ser Aep Gly38S 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr Vai Asp liys Ser Arg Trp Gln405 410 415

Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Aen420 425 430

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<210> 3<211> 64S<2X2> DNA

<213> iíómo eaplens<400> 3

gacatecaga tgacccagtc tccatectccatcacttgcc gggcaagtca gggcattagagggaaagccc ctcagcgcet gatctafcgcfcaggttcagcg gcagtggate tgggacagaagaagattttg caacttatta çtgfcctacaggggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtgtctgafegagc agttgaaatc tggaactgcccecagagagg ccaaagtaca gtggaaggtggagagbgtca eagagcagga cagcaaggacctgagcaaag cagactacga gaaacacaaactgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac

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<2X0> 4<211> 214<212» PRT

<213> Hottio sapiens<400> 4

Asp Xle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Xle Arg Asn Ala20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pró Glit Arg Leu Xle35 40 4STyr Ala Ala Ser Ser I«eu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thx Glu Phe Thr I»eu Thr lie Ser Ser teu Gln Pro65 70 75 B0

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Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser S>ys Asp Ser Thr Tyr Ser L>eu Ser1<55 170 175

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Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly heu Sex Ser Pro Vai Thr hys Ser155 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 5<211> 1350<212> DÜÉA

<213> Homo sapiens<400> 5

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1350

<210> 6<211> 449<212> PRT

e2X3> Homo sapiece<400> 6

Glo Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Giu Vai Lys Lys Pro Gly Ala1 S 10 15

Ser Vai I»ys Vai Ser Cye Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ths: Gly Tyr20 25 30

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Ala Arg Asn Thr Vai Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr vai Thr Vai Ser Ser ala Ser Thr Lys Gly115 120 125

Pro Ser Vai Phe Pr o Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thx Ser Glu Ser13Q 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr She Pro Glu Pro Vai14S 1S0 155 160

Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe16S 170 175

Pro Ala Vai Leu Gira Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai vai180 185 190

Thr vai Pro Ser Ser Aan Piie Gly Tnr Glu Thr Tyr Thr Cys Asn Vai195 200 205

Asp Eie Lye Pro Ser Ase Thr Lys vai Asp Lyg Thr Vai Glu Arg Lys210 215 220

Cys Cye Vai Glu Cys Pro Pro Cye Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro225 230 235 240Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met II© Ser245 250 255

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Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lye Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys325 330 335

Thr lie Ser Lye Thr Lys Gly Gln PrOAxg Glu Pro Gln Vai Tyx Thr340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn, Gln Vai Ser Leu Thr355 360 365

Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu370 375 " 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asa Tyr Lye Thr Thr Pro Pro Met Leu385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lye Leu Thr Vai Asp Lys405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Aen Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lye Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly435 440 445

Lye

<210> 7

<211> 660

<2X2s. DKA

«213> Horoo sapienfi

<4P0> 7

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<210> 6<211> 219<212> PRT

<213> Koroo sapiens<400> 6

Asp lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser leu Pro Vai Thr Pro Gly1 S 10 15

Glu Pro Ala. Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Hia Ser20 25 30

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Ser Arg Vai Glu Ala Glu. ÁBp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cye Met Gln Vai85 90 95

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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Aep Ser165 Í7D 175

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Lye Híb Lys Vai Tyr Ala Cye Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser135 200 205

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<210> 5

<2XX> 1336

<212> DNA

<213> Homo sspiens<400> 9

gagotgcagc tggtggagtc tgggggaggetcctgtgcag cctçtggatt cacctteagtccagggaagg ggetggagtg ggtetcatcegeagactcag tg&agggccg attcaccatcctgeaaatga acagcctgag agccgaggaeggafcacagct afcggtattga ctacfcggggctccaecaagg gcccatcggt cttccccetgacagcggccc tgggotgccfc ggtcaaggacaaetcaggcg ctctgaocag cggcgtgcaectctactccc teagcagcgt ggtgaccgtgacctgcaacg tagatcacaa geeçageaactgttgtgtcg agtgcceacc gtgcccagcáttocccccaa aacccaagga oacccteafcggtggtggacg tgagccacga agaccccgaggaggtgcata atgecaagac aaagccacgggtcagcgtcc tcacegttgt gcaceaggacgtctccaaca aaggcctccc agcccccafceccccgagaac caeaggtgta caccctgcccgtcagcctga cctgcccggt caaaggcctcagcsatgggc agocggagaa caactaeaagtccttcttcc tcfcacagcaa gctcaccgtgfcfcctcatgct cegtgatgca tgaggctctgctgtctccgg gtaaatga

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1338

<210> 10<21l> 445<212> PRT

<213> Homo eapiéias<400> 10

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Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Abií Ser Thr Phe Arg Vai Vai Ser Vai Leu290 295 300

Thr Vai Vai His Gln Aap Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys30S 310 315 320

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Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai Lys355 360 365

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<211> 645

<212> t>m

<213> Homo sapiens

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<210> 12

<223> 21<

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

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Asp Arg Vai Thr lie Thr Cye Arg Ala Ser Gln Giy He Ãrg Asn Ala20 25 30

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asa, Ser Tyr Pro Arg85 S0 95

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Thr Ala Ser Vai Vai Cye Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

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<21Q> 13

<211> 1336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

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1338

<210> 14

<:211> «45

<212> PRT

<213> Homo eaplens

<400> 14

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly1 S 10 15

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Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Gln260 265 270

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Vai Ser Leu Thr Cye Leu vai Lys365

Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln360

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<210> 15<211> 64.5<212> DNA

<213> Momo sapieas<400> 15

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<210> Ifi

e211> 214

«212> PRT

<213> Hosno sapiene

<400> 15

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Asp Arg Vai Thr Leu Thr Cye Arg Ala S&r Gln Gly IIe Arg Asn Ala20 25 30

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Hie Asa Ser Tyr Pro Phe85 90 B5

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Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 17

<211> 1338

<212> DMA

<213> fiomo sapiens

<400> 17

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<210> 18

<211> 44S

*212> PRT

<213> Homo sapiene

<400> 18

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly1 S '10 15

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Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met IIe ser Arg Thr Pro Glu245 250 255Vai Thr Cys Vai vai vai Asp Vai Ser Bis Glu Asp Pro Glu vai Gln260 265 2?0

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<210> 19<211> 645<212> DNA

<213> Homo sapiene

<:4O0> 19

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<211> 214

<212> PRT

<213s- Homo sapiens

<4QQ> 20

Asp lie Gln Met Thr Glu Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 S 10 1S

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala lie Arg Aso Asp20 2S 30

Leu Gly Trp Tyr Glu Gín Lys Pro Gly Lys Ala £ro Lye Arg Leu lie35 40 45

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<210» 21

<211> 1350

<212> DNA

<213> Hoffio sapiens

<400> 21

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accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240acggccgtgt attactgtgc gagaaatacg 300gacgtctggg gccaagggac cacggtcace 360gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc 420ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480agcggcgfcgc acaccttccc agctgtccta 540gtggtgacog tgccctccag eaacfctcggc 600aagcccagca acaccaaggt ggacaagaca 660ccgtgcccac caccacctgt ggcaggaccg 720gacaccotca tgatctcccg gaccccfcgag 780gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840aeaaagecac gggaggagca gfctcaacage 900gtgcaccagg actggctgaa eggcaaggag 960ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020taeaccetgc ccccatcccg ggaggagatg X060gtcaaaggct tctaeetcag cgaoatcgcc 1140aacaactaca agaccaoacc tcccatgctg 1200aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320

13S0

<210> 22<2U> 449<212> PRT

<2i3> Homo sapíens<400> 22

Qln Vai Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala15 10 15

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Vai Ser Vai Leu thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asa Gly Lys Glu305 310 315 320

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Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu370 375 380

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Lys<210> 23<2ll> 660

<2i2> m&

<213> Hotno sapierts<400> 23

gatattgtga tgactcagtc tccactctcc

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<210> 24

<211> 219<212> PRX<213> Hotno eapiens

<400> 24

Asp He Vai Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Pro Giy

i 5 .10 :s

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Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gln Ala85 90 95

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<210> 25<211> 33S0

<2i2> m.k

<213> Horao sapien.5<400> 25

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135 0

<210> 26<211> 449<212> PRT

<2i3> Horoo sapiens<400> 26

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130 135 14.0

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Vai Sex Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro165 3,70 175

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<210> 27

<211> 645

<212> DNA

<213> Komo sapiens

<400> 27

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«2103. 26

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapienB

<400> 28

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<2XG> 25

•<213> 1338

<212> DNA

c213> Momo sapiens

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1338<210> 30

<211> 445

<2X2> FRT

<213> Homo eapiens

<400> 30

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<210> 31

<211> 645

<212> DNA

<213> Momo eapiene

<400> 31

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<210> 32<211> 214<212> PRT

<21Z> Homo sapiens<400> 32

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<210> 33

<211> 1338

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

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133 B

<210> 34

<211> 445

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 34

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<2ID> 35

<211:> 645

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<213> Homo sapiens<4O0> 35

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<210> 36<211> 214<212> PRT

«213» Momo sapiena<4D0> 3 6

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<210> 37<211? 13SO<212> DttA

<213> Horao eapiens<400> 37

gaggtgcagc tattggagtc tgggggaggc ttgatacagc ctggggggtc cctgagactc 60tcctgtgcag ectctggaet caccttfcagc agctttgcca tgagctgggt ccgccaggct 130ccagggaagg ggctggaafcg ggtcfcc&act attagtggta gtggtggtag caeatactac 180gcagacttcg tgaagggccg gttcaccatc tcçagagaca attccaagaa oacgctgtat 240ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgfcát attactgtgc gaaagatgga 300aggtataact ggaactaçgg ggetfcttgat atctggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 360tetteagett ccaccaaggg cccatccgtc ttccccctgg cgccctgctc caggagcaec 420tccgagagea c&gcesgeect gggctgcctg gtcaaggact acttccccga accggtgacg 80gfcgtcgtgga actcaggcgc cctgaec&gc ggcgtgeaca ccfctcccggc tgtcctacag 540tcctcaggac tctactccct cagoagcgtg gtgaccgtgc cetccagcag cttgggcaeg 600aagacctaca cctgçaaçgt agatcacaag cccagcaaca ecaaggtgga caagagagtt 660gagtecaaat atggtccccc atgcccatca tgcceagcac ctgagttcct ogggggacea 720tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaeg gacactctea tgatctcccg gacccctgag 780gtcacgtgeg tggcggtgga egtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 840gbggâtggcg tggaggtgca taatgccaag aeaaagcegc gggaggagca gttcaacagc 900acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaeeagg actggctgaa cggeaaggag 960tacaagtgca aggtctooaa caaaggcctc ccgtcctcca fccgagaaaao catctocaaa 1020gccaaagggc agecccgaga gccaçaggtg tacaccctgc ccceatccca ggaggagatg 1060accaagaacc aggtcagcct gaccfcgcctg gtcaâaggct tctaccceag cgacatcgcc 1140gtggagtggg agagcaatgg gcagecggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200gactccgacg gctcotfcctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 1260gaggggaacg tcttctcatg etcegtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 1320aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 1350

<21C> 36<211> 449

<2i2> mr

<213> Hotao sapienB<400> 38

Glu Vai Gln Iteu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie. Gln Pro Gly Gly1 5 10 1S

Ser Leu Arg i»eu Ser Cys Ala- Ala s<sr Gly Phe Thr Phe ser ser Fhe20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ser Thr lia Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Phe Vai50 55 $0

Lye Gly Arg Pha Thr He Ser Arg Asp Aen Ser Lys abi Thr leu Tyr55 70 75 60Leu Gln »et Asn ser Leu Arg Ala65

Ala Lys Asp Gly Arg Tyr Asn Trp100

Gly Gln Gly Thr Met Vai Thr Vai

115 X20

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cye130 135

Ala Ala Leu Gly Cye Leu V&l Lys145 150

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu165

Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Gys90 95

Asn Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp10S lio

Ser Ser Ala Ser Thr Lye Gly Pro12 S

Ser Arg Ser Thr Sex Glu Ser Thr140

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr

1SS 160

Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro170 175

Ala Vai Leu Gln Seríao

Vai Pro Ser Ser Ser195

His Lys Pro Ser Asa

210

Gly Pro Pro Cys Pro225

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu185

Leu Gly Thr Lys Thr Tyr200

Thr Lys Vai Asp Lys Arg215

Ser Cye Pro Ala Pro Glu230 235

Ser Ser Vai Vai Thr190

Thr Cye Asn Vai Aep20S

Vai Glu Ser Lys Tyr220

Phe Leu Gly Gly Pro240

Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lye Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser245 2S0 255

Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cye Vai Vai Vai Asp Vai Ser Gln Glu Asp260 265 270

Pro Glu Vai Gln Phe Aen Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai Ms Asn275 2S0 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai290 295 300

Vai Ser vai Leu Thr Vai Leu Bis Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu305 310 315 320

Tyr Lys Cye Lys Vai Ser Asn Lye Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys32S 330 335

Thr Ile Ser Lye Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Aen Gln Vai Ser Leu Thr355 360 3C5

Cye Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp Glu370 375 380Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Aen385 390

Asp ser Asp Gly Ser Fhe Pfee Leu405

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Vai420

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln435 440

L>ys

Tyr Lye Thr Thr Pro Pro Vai Leu395 400

Tyr Ser Arg Leu Thr vai Aep Lys410 415

Phe Ser Cye Ser Vai Met His Glu425 430

Lye Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly445.

<:210> 39<211> 645<212> DNA

<213> Horao sapiens<40&> 39

gaaatagtga tgacgcagte tccagccace ctgtetgtgt ctccagggga aagagcca.cc 60ctctcctgca gggccagtca gagtgCtaga agcaatttag cctggttcce gcagaaacct 120ggccaggctc ccaggctcct catctafcggt gcatccacca. gggccaetgg tatcccsgcc 180aggbbcagtg gcagtgggtc tgggaeagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 24 0gaagatttt^ eacfbbtafcta ctgtcagcag tabaataact ggccgctcac tttcggcgga 3 00gggaccaagg tggagatcaa acgaaetgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agfctgaaatc tggaaetgcc tctgttgtgt gcctgctgaa fcaacttcbat 4 20cccagagagg ccaaagtaca etggaaggtg gataacgccc fcccaatcggg taactçecag 480gagagtgtca cagagcagga cagc&aggac agcacctaca gcctçagcag caccctgacg 54 0ctgagcáaag eagacfeaega gaaaçaçaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600etgagctcgc ccgtcacaaa gagcfctcaac aggggagagt gtbag 645

<210> 40<211> 214<212> PRT

<2l3> Honvo sapienB<400> 40

Glu lie V&l Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Vai Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cye Arg Ala Ser Gln Ser Vai Arg Ser Asn20 25 30

Lau Ala Trp Phe Gln Gln Lye Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie35 40 4S

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He ser ser Leu Gln Ser65 70 75 80

Glu Asp Hbe Ala Vai Tyr Tyr Cye Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 S0 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai GLu ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala100 10S 110

Pro Ser Vai Phe lie Phe ?ro Pr« Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Aen Asü Pite Tyr Pro Arg Glu Ala130 13S 140

Lys Vai Gla Trp Lys Vai Asp Asa Ala Leu Gln ser Gly Aen Ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Vai Thr Gln Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu S«r Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His lye Vai Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr Híe Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys? Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 41

<211> 1350

<212> DMA

<213> Momo Bspienfs

<4D0> 41

gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggctcctgtgcag cctctggatt cacctttagçccaggcaagg ggctggagtg ggtctcagctgcagactccg tgaegggccg gttcaccatcCtgcaattge acagcctgag agccgaggacaggtttaact ggaactacgg ggcttctgafctcttcagctt ccaocaaggg cccatccgtctccgagagca cagcegccct gggctgcctggtgtcgtgga actcaggcgc cctgaccagctcetcaggac tctaeteeet oageagcgtgaagacctaca cctgcaacgt agatcacaaggagtccaaat atggtccccc atgcccatcatcagccttcc tgttcccccc aaaacccaaggtcacgtgcg tggtggtggâ egtgagccaggtggatggcg tggaggtgca taatgccaagaegtaccgtg tggtcagegt ccteaccgtctacaagtgcá aggtctccaa caaaggcctcgccaaagggc agccccgaga gccacaggtgaccaagaaec aggtcagcct gacctgcctggtggagtggg agageaatgg gcagccggaggactçogaeg gctccttctt cetetacagcgaggggaatg tcttcfccatg ctcegtgatgaagagcctct ccctgtctct gggtaaatga

ttggtacagc ctggggggtc cctgagacte 60agctatgcca cgagctgggt cegocaggct 120attagtggta gtggtggtag oacattctac 180tccagagace attceaagaa cacgctgttt 240acgeccgtat atcaotgtgc gaaagatgga 300atctggggcc ãagggaccat ggtoaccgtc 360tteeccctgg cgecctgctc caggagcacc 420gtcaaggact acttccccge accggtgacg 4S0ggcgtgcaca cctteccggc tgtcctacag 54 0gtgaccgtgc cctccagcag ettgggcacg 600cccagcaaca ecaaggtgga caagagagtt 660tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 720gacactctca tgatctcccg gaccectgag 780gaagaceccg aggtecagtt caactggtac 840aeaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 900ctgcaccagg actggctgaa cggcaãggag 960çegtccfccca tcgagaaaac catctccaaa 1020tacaccccgc ccccatccca ggaggagatg 1080gtcaaaggct tctaccccsg cgacatcgcc 1140aacaaotaca agaccacgcc tcccgtgetg 1200aggctaaccg tggaeaagag caggtggcag 1260catgaggctc tgcacaacca ctacaeacag 1320

1350<210> 42

<2Í1> 443

<212> F&T

<213> Hoífto sapíens

<400> 42Glu vai Gln Leul

Ser Leu Arg Leu20

Alá Met Ser Trp

Ser Ala lie SerS0

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Leu Gln Leu Açu

Ala Lys Asp Gly100

Leu Glu Ser Gly5

Ser Cys Ala Ala

vai Arg Gln Ala

40

Gly ser Gly Gly55

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Ser Leu Arg Ala85

Arg Phe Asn Trp

Gly Gly Leu Vai10

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2S '

Pxo Gly Lys Gly

Ser Thr Phe Tyr60

Asp Asn Ser Lye7S

Glu Asp Thr Al»90

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Leu Glu Trp Vai45

Ala Asp Ser Vai

Asn Thr Leu Phe80

Vai Tyr His CyBS5

Ser Asp lie Trp110

Gly Gln. Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala ser Thr Lys Gly Pro

11.5 120 125

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr1.4 S 1S0 ÍSS 160

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly vai His Thr Phe Pro165 170 175

Ala vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr180 185 190

Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Vai Aap195 200 205

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Ala Lye Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gla Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Vai290 295 300

Vai Bar Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp Trp í»eu Asn Gly hys Glu305 310 315 320

Tyr Lya Çye Lys Vai Ser Asn Lye Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lya325 330 33S

Thr lie Ser Lye Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyx Thr340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu Thr355 360 365

Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp IIe Ala Vai Glu Trp Glu3 70 375 3 80

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu385 390 3SS 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe L-eu Tyr Ser Arg Leu Thr Vai Asp Lys4 05 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Vai. Phe Ser Cye Ser Vai Met His Glu

420 425 43 0

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ber Leu Ser Leu Gly435 440 445

<210> 43<211> 645<212> DNA

<213> Hotno Bapiace<4O0> 43

gaaatagtgá tgacgcagtc tccagccactctetecfcgca ggaccagtca gagtgfctagcggcca-ggctc ccaggctcct catctatggtaggttcagtg gcagtgggtc tgggacagaggaagattttg cagtttatta ctgtcagcaggggaccaagg tggagatcaa acgaactgtgtctgatgagc agttgaaatc tggaactgcccccagagagg ecaaagtaca gtggaaggtggagagtgtca cagageagga cageaagga.cctgagcaaag cagactacga gaaacaeaaactgagetege ccgtcacaaa gagcttcsac

ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60ageaacttag cctggtacca gcagaaacet 120gcatccacca gggceaetgg tatcccagcc 180ttcactctea ccatcagcag cctgcagtct 240tataataact ggccgctcac tttcggcgga 300gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgttgtgt gcetgetgaa caacttctat 420gataacgccc tccaatcggg taaetcccag 480agcacctaca gcctcagcag caecctgacg 54 0gtctacgcct gcgaagtcac ecatcagggc 600aggggagagt gttag €45c210> 44

<211> 214

<212> PRT

<213> Horoo sapiens

<400> 44

Glií lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Vai Ser Pro Gly1 S 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cye Arg Thr Ser Gln Ser Vai Ser Ser Asn20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lye Pro Gly Gln Ala Pro Arg L*u Leu Sle35 40 43

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 SS 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Xle Ser Ser Leu Gln SeréS 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala AlaIDO 105 110

Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro í>re Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu. Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala13 0 135 140

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Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 17S

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser S«r Pro Vai Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 45

<211> 119

<2l2> PRT

<213> fioroo sapiens

<400> 4S

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 2S 30

Ser Met Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Gltt Trp Vai35 40 45

Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn. Alá Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 ?5 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Aap Thr Ala Vil Tyr Tyr Cys65 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Ser Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser

11.5

<21ü> 46<21J> 358<212> DHA

<?..3> Homo sapiene<400> 46

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc cfcggtcaage cfcggggggtc ecfcgagaetc 60tectgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatagca tga&ttgggt ccgccaggct 120eca-gggaagg ggetggagtg ggtctcatcc attagtagta gtágtagtta eatatactac 180gcagactcag fcgaagggccg attca.ccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240ctgcaaatga acagcctgag ageeg&ggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 3 00gggtacagct atggtcttga ctaetggggc cagggaaccç tggtcaecgt ctcctcag 358

<210> 47<211> 10?<212> PKT

<213> Homo eapiesis<400> 47

Asp Ele Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly15 10 15

Aep Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gln, Gly lie Arg Asn Ala20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln. Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gla Arg Leu lie35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu J?he Thr Leu Thr lie Ser Ser Lew Gln ProS5 70 75 8DGlu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu lia Lys100 105

<210> 48

<211> 322

<212> PISA

<213> Komo sapiene

gacatccaga tgacccagtcatcacttgcc gggcaagtcaggga&agccc ctcagcgcctsggttcagcg gcagtggatcgaagattttg caacttattagggaccaagg tggaaatcáã

tccatcctcc ctgtctgcatgggeattaga aatgctttaggatctatgct gcatccagtttgggacagaa Htcaefcctcactgtctacag cataatagttac

ctgtaggaga câgagtcacc 60gctggtatca gcagaaacca 120tgcaaagtgg agtcceatca 180caatcagcag cotgcagcct 24 0accctcggac gttcggccaa 3 00

322

<210> 49

<2ll> 123

<212> PRT

<213> ítonto a&piens

<4CG> 45

Glm Vãl Gln Leu Vai Gln Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala.1 5 10 15

Ser Vai Lya Vai Ser Cye Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr Met Hie Trp Vai Arg Gln Ala »ro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45

Gly Trp lie Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60

Gln Gly Arg Vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser IIe Ser Thr Ala Tyx65 70 75 80

Mat Glu Leu Ser Arg Leu Arg Sex Aep Asp Thr Ala Vai Tyr Hie Cye65 S0 95

Aia Arg Asn Thr Vai Gly Ser Gly Tyr Tyr Tyr Tyx Gly Met Asp Vai100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 50<21l> 370<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 50

eaggtgcagc tggtgcagtctcctgcaagg cttctggatacctggacaag ggcttgagtggcacagaagt tteagggcagatggagctga gcaggctgaggtgggaagtg ggtacfcactagtctoctcag

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ctggggecte agcgaaggtc 60tgcactgggt gcgacaggcc 120acaatggtgg cacaaactat 180cgtccatcag cacagcctac 240atcactgtgc gagaaatacg 300gceaagggae cacggfccacc 360

370

<2i0> SI

<2Xl> 112

<212> PRT

<213> Horoo sapiena

<400> 51.

Aep lie Vai Met. Thr Gln Ser Pro Leu S«r Leu Pro Vai Thr Kco <32yI B 10 1S

Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Hia Ser20 25 30

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Pro Gln Leu Leu XI e Hie Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Vai »ro50 5 5 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr. Asp Phe TJar Leu Lys lie65 70 75 fiO

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Met Gln Vai85 90 95

Leu Gln Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Vai Glu lie Lys100 105 110

<210> 52<211> 337<212> DHA

<213> Horoo sapiens<400> 52

gat&ttgtga tgacfccagtc tccactctccatctcctgca ggtctagtca gagccfccctgtacctgcaga agtcagggca gectccacagtceggggtcc ctgacaggtt çagtggcagtagcagagtgg aggetgagga tgttggggttctcactttcg gcggagggae caaggtggag

ctgccegtca cccctggaga gceggcctcc 60catagtaatg gatacaacte tttggattgg 120ctcctgatcc atttgggttc taatcgggcc 180ggatcaggca cagattttac aetga&aatc 24 0tattactgca tgcaagttct acaaactccg 300atcaaac 337

<210> 53<211> Ü9<212> PRT

c213> Homo sapielis<400> 53

Glu vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Jüys S>ro Gly Gly1 5 20 15

Ser leu Arg fceu Ser cys Ala Ala Ser Gly phe Thr Phe ser Ser Tyr20 25 30

Ser Met Asn Trp Vai Arg Gln Ala. Pr© Gly I>ys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ser Ser lie Sex Ser Ser Ser Ser Tyr lie Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 €0

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Aen Ala Lye Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln, Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys65 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Ser Tyr Gly lie Asp Tyx Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser115

<210> 54

<2ll> 358

<212> DNA

<213> Homo Bapiens

«400> 54

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ctggtcaagc ctggggggfcc cctgagactc 60

tectgtgcag cctctggatt caeettcagt agctatagca tgaaccgggt ccgecaggct 120

ceagggaagg ggctggagtg ggtctcatcc attagtagta gtagfcagfcta cafcatactac 1B0

goagactcag tgaagggceg attcaccato tccagagaca acgccaagaa cfccactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgt 300

ggatacagct atggtattga ctaotgggge cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcag 358

<210> 55

<211> 107

<212> PRT

<213> Koüso sapians

<400> 55

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Arg Ala ser Gln Gly He Arg Asn Ala20 25 30

Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ilé35 40 45

Tyr Ala Ala Sex Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala "Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Aeri Ser Tyr Pro Arg65 90 35

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lye Vai Glu IIe Lye100 105

<210> S6<211> 322<212> mh

<2X3> lio?no sapiens<400> 56

gacatccaga tgacccagtc tccatcctccatcacttgcc gggcaagtca gggcattagagggaaagccc ctaaçcgcct gatctatgctaggttcagcg gcagtggate tggcacagaagaagattttg caacttatta etgtctacaggggaccaagg tggaaatcaa ac

ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcace 60aatgctttag gctggtatca gcagaaacca 120gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca ifiGttcaçtctca caatcagcag cctgcagcct 240cat«atagtt accctcggac gttcggccaa 3 00

322

<210> 57<211> XX9<212> PRT

<213> BtmQ sapiens<400> 57

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lye Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

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Ser Ser lie Ser Ser Ser Ser Ser Tyr He Tyr Tyr Ala Aep Ser Vai50 55 60

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Leu Gln «et Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly fíet Asp Vai Trp Gly Gln Gly100 105 110

Thr Thr vai Thr Vai Ser Ser115<21Q> 58

<211> 358

<212> DNA

<213> Hãtoo sapiens

<4O0> 58

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<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 'dama sapiens

<40Q> 59

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Eis Aen Ser Tyr Pro Phe85 90 95

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<210> 60<211> 322<212> DNA

<213> Homo sapiene<400> 60

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322<210> «1

<211> 119

<212> PRT

<213» Homo sapienç

<400> 61

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Ala Arg Asp Arg Gly Ser Tyr Phe Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly100 105 110

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<400> 62

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<210> 63

<2ll> 107

<212> PRT

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<210> 65c211> 119<212> PRT

<213> Horno sapiena<400> 65

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<210> 67<2ll> 107<212> PRT

<213> Homo èapicne<400> €7

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1 5 10 1.5

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<21Q> 68

<211> 322

<212> DÜA

<213> Homo eapiens

<400> 68

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ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60aatgatttag gctggtatca gcagaaacca 120gcatccagtt tgcaaagtgg ggteceatca 1BÒtteactotea caafecagcag cctgcagcct 240cataatagtt aeccteggae gttcggccaa 300

322<210> 69<211> 123<212> PRT

<213> Komo sapiene<400> 69

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<213> Horao sapiens<400> 70

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370

<210> 71c211> 112<212> PRT

<213> Homo eapiens

<400> 71

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<210> 72

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<2J2> DWA

<2i3> Homo sapiens

<400> 72

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<210> 73

<211> 119

<212> PRT

<213> Horoo sapiéne

<400> 73

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys Pro Gly Gly1 5 10 15

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<210> 74

<211> 358

<212> DNA

<213> tíomo eapiens

<400> 74

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«213> Momo Eâpíens<400> 75

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<210> 75

<211> 322

<212> DHA

<213> KoraD sapiens

<4O0> 76

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<210> 77<211> X22<212> PRT

<213> Horao sapiens<400> 77

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<210> 78<2il> 367<212> bna

<213> Homo sapíens

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3 67

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<211> 107<212s PRT

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<211> 122<2i2> PRT

<213> Homo sapiens-c400> 81

Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly15 10 15

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«213 > Homo sapiéíis<400> 62

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367

<210> 83<211> 107«212> PRT

<213> Momo eapiens<400> 83

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<213> Homo eapiens<400> 84

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322

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<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiene

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Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

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Ser Ala He Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Phe Tyr Ala Aep Ser Vai50 SS 60

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<210> 86

<211> 367

<212> DNA

<213> Horoo sapiens

<400> 86

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ttggtacagc ctggggggtc cetgagactc 60agctatgeca tgagctgggt ccgccaggct 120atfcagtggta gtggtggtag cacattctac 180tccagâgaca attccaagaa cacgctgttt 240acggccgtat atcaccgtgc gaaagatgga 300atctggggcc aagggaccat ggtcaccgtc 360

367<210> 87

<2lí> 107

<212> PRT

<213> Momo sapdene

<400> 67

Glu lie Vai Met Thr Qln Ser Pro Ala Thr Leu Bar Vai Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Thr Ser Gln Ser Vai ser Ser Asn20 25 30

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«211? 322

<212> DHA

<213> Horao sapiens

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ctgtctgtgt ctccagggga aagagceacc 60agcaaettag cctggtacca gcagaaacct 120gcatccacca gggccactgg fcatcccagcc 180ttcactctca ccatcageag cctgeagtct 240tataataact ggccgctcac ttccggcgga 3O0

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<210> 89

<2il> 109

<212> PRT

<213> Roíiio sapiens

■í400s. 89

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<210> 91<211> 23<212> DNA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Descriptiom of Artificial Sequence: Syntheticprimer

<220>

<221> reodified_base<222> (21)<223> laosine

<400> 91

caggtgcagc tggagcagte ngg<210> S2<2Xl> 24<212> DNA

<2i3> Artificial Sequence<220>

<223> Description of Artificial Sequence; Syntheticprimer

<400> 92

getgagggag tagagtcctg agga

<210> 93<2ll> 20<232> DNA

<213> Artificial Sequeaee<220>

<223> Descríption of Artificial Sequence: Syntheticprimer

<400> 93

tacgtgccaa gcatcctcgc

<210> 94«£211> 23<212> DNA

<213> Artificial Sequencec22 0>

<223> Descriptiôü o£ Artificial fiequençe: Syntheticpriwer

<4C0> 94

aggctggaac tgaggagcag gtg

-í210> 95<211> 24<212> DMA

<213> Artificial Sequeaee<22 0>

<223> DeBCription of Artificial Sequence: Syntheticprimer

<4Ô0> 95

ccçtgagagc afccaymyarm aacc

<210? 96<2ll> 2S<212> DNA

<213> Artificial Seçiuence<220>

<223> Description of Artificial Sequence; Syntheticprimer

<400> 96

hvthfceeact yggtgatcrg cactg

<2ÍÔ> 97<211> 25<212> DNÃ

<213> Artificial Sequence-c220>

<223> Description of artificial Sequences Syntheticprimar

<400> 97

attyrgtgat eagBactgaa caeag

<210> 98<211> 26<:212> DMA

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Description of Artificial Sequence; Syntheticprimer

<400> 98

gsartcagwc ycwvycâgga cacagc

<210> 99<211> 2S<212> tSHh

<212> Artificial Sequence<22Q>

<223> Description of Artificial Sequence: Syntheticprimer

<400> 99

caecaggkga tttgcatatt xtccc

<2io> 100c211> 24<212> DNA

<213> Artificial sequence<220>

<223> Deecxipticm of Artificial Sequence: Syntheticpriiücr

<400> 100

ateaatgcct gkgtcagagc yytg<210> 101<211> 9

<2i2> cm

<213> Artificial Sequence<220>

<223> üescription of Artificial Seguenee: Syntheticoligonuc1eoti de

<400> 101

agccagaca S

<210> 102<211> 8<212> DB3A

<2I3> Artificial Sequence<22 0>

<223> Deseription of Artificial Sequence; Syntheticoligonucleotide

<400> 102

gtetagac 6

<210> 103<211> 18<212> PRT

c213> Artificial Seguence<220>

<223> peeçriptioe of Artificial Sequence; Syntheticpeptide

<400> 103

Asp Phe Gly Leu Asp Cye Aep Glu His Ser Thr <31u Ser Arg Cye Cys15 10 15

Arg Tyr

<210> 104<2íl> 18<212> PRT

<223> Dêecription of Artificial Seguence: Syntheticpeptide

c400> 104

<210> 10S<211> 18<2Í2> PRT

<2I3> Artificial Segueace<220>

<223> Description of Artificial Sequence: Syntheticpeptide

<AOQ> 105

Arg Tyr Lys Ala Asn Tyx Cye Ser Gly Glu Cys Glu Phe Vai Phe Leu1 5 10 15

Gln Lys

<210> 106<211> 18•í212> FRT

<213> Artificial Sequence<220>

«223? Description of Artificial Sequence; Syntheticpeptiee

c400> 106

Tyr Pro His Thr His «eu Vai Kis Gln Ala Asn Pro Arg Gly Ser Alal 5 « 15

Gly Fro

<2Í0> 107<211> 18<212> PHT

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Deecripticn of Artificiei Sequence; Syntheticpeptide

<400> 107

Cya Cys Thr Pro Thr Lys Met Ser Pro lie Asn Met Leu Tyr Phe Asní 5 10 15<210> 108<211> 19<212> PRT

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Desçription of Artificial Sequence* Syntheticpeptide

<400> 108

Gly Cys Ser

<210> 109<211> 18c212> PRT

<213> Artificial Sequence<220>

<223> De-scription of Artificial Sequence: Syntheticpeptide

<400> 109

His Ser Tbi Glu Ser Arg Cys Cys Arg Tyr Pro Leu Thr Vai Asp Phe1 5 10 15

Glu Ala

«210> 110<21X> 18

<2i2> mr

<2i3> Artificial Sequence<220>

<223> Descripfcion of Artificial Sequence: Syntheticpeptide

<400> 110

Phe Gly Trp Asp Trp Ile Ile Ala Pro Lys Arg Tyr Lys Ala Aen Tyr1 5 10 15

Cys Ser

<210s 111<211> 18<212> PRT<213> Artificial

Sequence<220>

<223> Description of Artificial Seguence: Syntheticpeptide

<400> 111

Gly Glu Cye Ôlu Phe Vai Phe beu Glu. Lye Tyr Pro His Thr Kia Leu1 S 10 15

Vai Hie

<210> 212<21i> 10<212> PRT

<213> Artificial Secjüence

<223> DéBcxiption of Artificial Seqtiences Syntheticpeptide

<400> 112

Glft Ala Abh Pro Arg Gly Ser Ala Gly Pro Cys Cys Thr Pro Thr Lys1 5 10 IS

Met Ber

<210> 113<211> 18<212> PRT

<213> Artificial Sequeace<220>

<223> Deecriptíon o£ Artificial Sequence? Syntheticpeptide

<400> 113

Pro Xle Asn Mae I»eu Tyr Phe Asn Gly Lys Glu Gln lie He Tyr Gly1 5 10 15

Lys lie

<210> 114<2XX> 1347<212> DMA

<213:> Horao sapienB<i00> 114

gaggfcgcagc tgttggagtc tgggggaggctcctgtgcag cctctggatt cacctt-tagcccagggaagg ggctggaatg ggtctcaactgcagactecg tgaagggccg gttcaccatcctgcaaatga acagcctgag agccgaggacaggtataact ggaaetacgg ggcttttgat

ttggtacagc çtggggggtc cctgagactc 60agctttgcca tgagctgggt ccgccaggct 120attagtggta gtggtggtta cacattctac 180tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240acggcegtat attactgtge gaaagatgga 300aectggggcc aagggacaat ggtcaccgtc 3GOtccteagcct ccaccaaggg cccatcggtctccgagagca cagcggccct gggctgcctggtgtcgtgga acfccaggcgc tctgaceagctcctcaggac fcotactooct cagcagcgtacagacctaca cetgeaacgt agatcacaaggagcgcaaat gttgtgtcg» gfcgeccaccggtcttcctct tecceccaaa accçaaggacacgfcgcgtgg tggtggacgt gagccacgaagaoggogtgg aggtgcataa tgecaagacattccgtgtgg tcagcgtoct caccgtcgtgaagtgcaagg tctccaacaa aggcctcccaaaagggcage cccgageacc acaggtgtacaagaaccagg teagccfcgac ctgcctggtcgagtgggaga gcaatgggça gccggagaactccgacggct cettcttcct etaeagcaaggggaacgtct tctcatgctc cgtgatgeatagcctctccc tgtctçcggg taaatga

ttccccctgg egccctgcfcc caggageacc 420gtcaaggact acttccccga sccggtgácg 480ggcgtgcaca ccttcccggc tgtcctacag 540gtgaccgtgc cctccagcaa cttcggcacc 600cccagcaaca ccaaggtgga caagacagtt 660tgeccagcac cacctgtggc aggaccgtca 720accctcatga tcteecggac ccctgaggtç 780gaccccgagg tccagfctcaa ctggtacgtg 8*0aagccacggg aggagcagtt caacagcacg $00caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960gçcçccatcg agaaaacçat ctccaaaacc 1020accctgcccc cateccggga ggagatgacc 1080aaaggctfect aeeec&gcga catcgccgtg 1140aaetacaaga ccacaccfccc catgctggac 1200ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260gaggctctgc acaaccacta cacacagaag 1320

1347

<;210> 11S<21X> 448<212> PRT

<2l3> Horao sapiens<400> lis

Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln. Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cye Ala Ua Ser Qly Pfte Thr Phe .Ser Ser Phe20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp vai

35 40 45

Ser Thr He Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60

Lya Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg kmp Asn Ser Lys Asa Thr Leu Tyr65 70 75 B0

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr CysSS 90 95

Ala Lys Aap Gly Arg Tyr Asn Trp Aen Tyr Gly Ala Phe Asp lie Trp100 105 110

Gly Gln Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro115 120 125

Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thx130 13S 140

Ala Ala. Leu Gly Cys Leu Vai Lya Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr145 150 155 160

Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro3.65 170 175Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser lieu Ser Ser Vai vai Thr180 185 190

vai Pro Ser Ser Aen Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr cys Asn Vai Asp195 200 205

His Lys Pro Ser Aen Thr Lys Vai Asp Lye Thr vai Slu Arg Lys Cys210 215 220

Cys vsl Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala Gly Pro Ser225 230 235 240

Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pró I«ys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg245 2S0 2SS

Thr Pro Glu Vai Thr Cye Vai Vai Vai Asp Vai Ser Kis Glu Asp Pro260 265 270

Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala273 280 265

Lys Thr Lye Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Vai Vai230 2S5 300

Ser Vai Leu Thr Vai Vai Kis Gln Asp Trp Leu Aso. Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lye Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lye Thr

325 330 335

lie Ser hys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr Thr Leu340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr hys Asn Gln Vai Ser Leu Thr Cys355 360 365

Leu Vsl Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser370 375 380

Apn Gly Gln Pro Glu Aen Asn Tyr Lye Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp385 390 355 400

Ser Aep Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lye Ser405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cye Ser Vai Met Híb Glu Ala420 425 430

Leu Bis Asn ais Tyr Thr Gln Lys Ser I»e\s Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445

<210> 116<211> 645<212> PNA<213> Homo sapiens<400> 116

gaaatagtga tgacgcagtc tccagccaccctotcctgea gggcc&gtea gagtgttagtggccaggctc ccaggctcct catctatggtaggtteagtg gcagtgggtc tgggaeagaggaagattttg cagtttatta ctgtoagcaggggaccaagg tggagafccaa acgaactgtgtctgatgagc agttgaaatc tggaactgoccccagagagg ccaa&gtaca gtggaaggtggagagtgfcea cagagcagga cagcaaggacctgageaaag cagactacga gaaacaeaaaetgagctcgc ccgtcacaaa gagetfccaac

ctgtctgtgt cfcccagggga aagagccacc 60agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120gcatccacca gggccactgg tatcccagce 180ttcactctca ccatcagcag cctgcagtot 240tataataact ggccgctcac tfctcggcgga 30Qgctgcaccat otgtcttcat cttcccgeca 360tctgttgtgt gcctgctgaâ taacttctat 420gataacgccc fcccaatcggg taactcccag 480agcacctaca gcctcageag caccctgacg 540gtctacgcct gcgaagteac ccatcagggc 600aggggagagt gfetag 645

<210> 117<211> 214<212> PRT

<213> ítomo sapiena<400> 11?

Glu lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr lieu Ser Vai Ser Pro Gly15 10 15

Glu Arg Ala Thr leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Vai Ser Ser Asn20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 . 60

Ser Gly Ser Gly Thr- Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Ser65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Leu85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala100 105 110

Pro Ser Vai Phe lie Phe Pro Pro Ser Aep Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Vai Vai Cye Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala13 0 13 5 140

Lye Vai Gln Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Aen ser Gln145 150 155 160

Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Aep Ser Thr Tyr Ser Leu Ser16S 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys Hie Lys Vai Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu cys210

<210> 11B<211> 122<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 118

Glu Vai Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe20 25 3 0

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai3S 40 45

Ser T-hr lie Ser Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Vai50 £5 60

í«ys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Aen Ser Lys Asa Thr I»eu Tyr6S 70 75 SO

Leu Gln Met Asn Ser Leu. Arg Ala Glu Aep Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 S0 95

Ala Lys Asp Gly Arg Tyr Aerv Trp Asn Tyr Gly Ala Phe Asp lie Trp100 10S 110

Gly Gln Gly Thr Met vai Thr Vai Ser Ser115 120

<210> 119<211> 367<212> DNA<213> Homo sapiens

<400> 119

gaggtgcagc tgttggagtç tgggggaggctcctgfcgcag cetctggatt cacctctagcccagggaagg ggctggaatg ggtceeaactgeagactocg tgaagggceg gttcaccatcctgcaaatga acagcctgag agecgaggacaggtataact ggaactacgg ggcttttgattçetcag

<210> 120<211> 107<212> PRT

<213> Homo sapiens

ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60agctttgoca tgagctgggt ccgccaggct X20attagtggca gtggtggtta e&cattctac 1B0tecagagaca attccaagaa cacgctgtat 240acggcogtat attactgtgc geaagatgga 300atctggggcc aagggecaat ggtcaccgtc 360

367<400> 120

Glu lie Vai Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Vai Ser- Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Vai Ser Ser fusa20 25 30

Leu Ala Típ Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu IIe35 4 0 4S

Tyr Gly Ala. Ser Thr Arg Ala 'Ihr Gly lie Pro Ala Axg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln SerS5 70 75 80

Glu Asp Phe Ma Vai Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asfi Asn Trp Pro Leu65 50 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Vai Glu lie Lys100 105

<2I0> 121.

<211> 322

<212> DKA

<213> Horoo sapler.s

<400> 121

gaaatagtga tgacgcagtcctctcctgca gggccagtcaggccaggctç ccaggctcctaggttcagtg gcagtgggtcgaBgattttg cagtttattagggacoaagg tggaga.tcaa

tccagccacc ctgtctgtgtgagtgttagt agcaacttagcatctatggt gcatccaccafcgggacag&g ttcactctcactgtcagcag tataataaetac

ctecagggga aagagccace 60cctggtacca gcagaaacct 120gggccactgg tatccc&gcc 180ccatcagcag cctgcagtct 240ggcegctcaç fcttcggegga 300

322

■e210> 122<211> 15<212> PRT

<213> Artificial Sequence<220>

<223> Descriptioi» of Artificial Sequence; Syatheticpeptide

<400> 122

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser15 10 15

Claims

1. Anticorpo monoclonal humano, quimérico ou humanizado ouuma parte de ligação de antígeno deste que se liga especificamente àmiostatina, em que o dito anticorpo ou parte se liga seletivamente a miostati-na sobre GDF11 por pelo menos 50 dobras, e em que o dito anticorpo ouparte inibe a ligação de miostatina a um receptor de activina tipo I ou tipo II.

2. Anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígenodeste que possui pelo menos uma propriedade selecionada a partir do grupoque consiste em:(a) competir pela ligação a miostatina com um anticorpo selecio-nado a partir do grupo que consiste em:1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;-1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;-2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V; e(b) se ligar ao mesmo epitopo de miostatina como um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;-1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;-2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1 H-L81M, L-F58I, I85V.

3. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno desteque compreende:(a) um conjunto CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, que de forma se-qüencial juntamente são pelo menos 90% idênticos em seqüência de amino-ácido a CDRs, CDR1, CDR2, e CDR3 de cadeia pesada, de forma seqüen-cial juntamente, que estão incluídas na seqüência de aminoácido estabeleci-da em qualquer uma entre SEQ ID NOs: 45, 49, 53, 57, 61, 65, 69, 73, 77,-81,85e118;(b) um conjunto de CDR, CDR1, CDR2 e CDR3, que de formaseqüencial juntamente são pelo menos 90% idênticos em seqüência de ami-noácido a CDRs, CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de forma seqüencialjuntamente, que estão incluídas na seqüência de aminoácido estabelecidaem qualquer uma entre SEQ ID NOs: 47, 51, 55, 59, 63, 67, 71, 75, 83, 87 e 120; ou(c) um primeiro conjunto de CDR de (a) e um segundo conjunto de CDR de (b).

4. Anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígenodeste que se liga especificamente a miostatina, em que:(a) a cadeia pesada compreende as seqüências de aminoácidosCDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticorpo selecionado a par-tir do grupo que consiste em: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1;-2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;-2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1 H-L81M, L-F58I, I85V;(b) a cadeia leve compreende as seqüências de aminoácidoCDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo selecionado a partirdo grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1; 1_46_1; 2_112_1;-1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1; 2_112_K;-1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M;-2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1L-I85V; 2_112_1 H-L81M, L-F58I;-2_112_1 H-L81M, L-I85V; e 2_112_1 H-L81M, L-F58I, I85V; ou(c) o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a) e umacadeia leve de (b).

5. Anticorpo monoclonal selecionado a partir do grupo que con-sistem:(a) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas na SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.(b) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas na SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8;(c) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas na SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12;(d) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas na SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16;(e) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20;(f) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;(g) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28;(h) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32;(i) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;(j) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40;(k) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44; e(I) um anticorpo que compreende as seqüências de aminoacidoestabelecidas na SEQ ID NO: 115 e SEQ ID NO: 117.

6. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno desteselecionado a partir do grupo que consiste em:(a) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 2 e SEQ ID NO: 4.(b) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 6 e SEQ ID NO: 8;(c) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas na SEQIDNO: 10eSEQIDNO: 12;(d) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoacido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 14 e SEQ ID NO: 16;(e) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 18 and SEQ ID NO: 20;(f) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 22 e SEQ ID NO: 24;(g) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 26 e SEQ ID NO: 28;(h) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 30 e SEQ ID NO: 32;(i) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 34 e SEQ ID NO: 36;(j) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 38 e SEQ ID NO: 40;(k) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQID NO: 42 e SEQ ID NO: 44; e(I) um anticorpo ou parte de ligação de antígeno que compreen-de as seqüências de aminoácido de domínio variável estabelecidas na SEQIDNO: 115eSEQIDNO: 117.

7. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno domesmo que compreende um primeiro conjunto de seqüência CDR que com-preende um primeiro conjunto CDR1, primeiro CDR2 e primeiro e primeiroCDR3 e um segundo conjunto de seqüência CDR que compreende um se-gundo CDR1, segundo CDR2 e segundo, em que cada dito primeiro conjun-to CDR e o dito segundo conjunto CDR de forma seqüencial juntamente pos-suem pelo menos 90% de identidade com as seqüências CDR1, CDR2 eCDR3, de forma seqüencial juntamente, de:(a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente;(b) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, respectivamente;(c) SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:12, respectivamente;(d) SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:16, respectivamente;(e) SEQ ÍD NO:18 e SEQ ID NO:20, respectivamente;(f) SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, respectivamente;(g) SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:28, respectivamente;(h) SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32, respectivamente;(i) SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:36, respectivamente;(k) SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:40, respectivamente;(I) SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44, respectivamente; e(m) SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:117, respectivamente.

8. Anticorpo monoclonal ou parte de ligação de antígeno domesmo que compreende um primeiro conjunto de seqüência CDR que com-preende um primeiro CDR1, primeiro CDR2 e primeiro CDR3 e um segundoconjunto de seqüência CDR que compreende um segundo CDR1, segundoCDR2 e segundo CDR3, em que onde cada dito primeiro conjunto CDR edito segundo conjunto são as seqüências CDR1, CDR2 e CDR3, de formaseqüencial juntamente, de:(a) SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, respectivamente;(b) SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, respectivamente;

9. Anticorpo monoclonal que se liga especificamente a miostati-na que compreende a seqüência de aminoácido de cadeia pesada estabele-(c) SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:12, respectivamente;(d) SEQ ID NO:14 e SEQ ID NO:16, respectivamente;(e) SEQ ID NO:18 e SEQ ID NO:20, respectivamente;(f) SEQ ID NO:22 e SEQ ID NO:24, respectivamente;(g) SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:28, respectivamente;(h) SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:32, respectivamente;(i) SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:36, respectivamente;(k) SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:40, respectivamente;(I) SEQ ID NO:42 e SEQ ID NO:44, respectivamente; e(m) SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:117, respectivamente.cida em SEQ ID N0:115 e a seqüência de aminoácido de cadeia leve esta-belecida em SEQ ID NO:117.

10. Anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígenodo mesmo que compreende as regiões variáveis contidas em SEQ IDNO:115e SEQ ID NO:117.

11. Anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígenodo mesmo, que se liga especificamente a miostatina que compreende CDRsCDR1, CDR2, e CDR3 contidas em SEQ ID NO:115 e SEQ ID NO:117.

12. Anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígenodo mesmo, sendo que o dito anticorpo monoclonal ou parte de ligação deantígeno se liga às partes de peptídeo 1 e peptídeo 5 de miostatina, em queo peptídeo 1 compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 103 epeptídeo 5 compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 107.

13. Anticorpo produzido por uma célula que possui um Númerode Designação de Depósito ATCC selecionado a partir do grupo que consis-te em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571,PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

14. Composição farmacêutica que compreende um anticorpo ouuma parte de ligação de antígeno como definido em quaisquer reivindica-ções 1 a 13 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Método que compreende a etapa de administrar em um indi-víduo um anticorpo ou uma parte de ligação de antígeno como definido emquaisquer reivindicações 1 a 13 ou a composição farmacêutica como defini-da na reivindicação 14, em que o dito anticorpo, parte de ligação de antígenoou composição farmacêutica inibe a atividade de miostatina, em que o ditoindivíduo está necessitado de aumento de massa muscular, promoção dedesenvolvimento de músculo esquelético, tratamento de um distúrbio de a-trofia muscular ou aumento de crescimento de músculo esquelético.

16. Linha celular isolada que produz um anticorpo ou uma parteanticorpo como definido em quaisquer reivindicações 1 a 13 ou a cadeia pe-sada ou cadeia leve do dito anticorpo ou ou dita parte de ligação de antíge-no.

17. Molécula de ácido nucléico isolada que compreende umaseqüência de nucleotídeo que codifica a cadeia pesada ou uma parte de li-gação de antígeno da mesma ou a cadeia leve ou uma parte de ligação deantígeno da mesma de um anticorpo como definido em quaisquer reivindica-ções 1 a 13.

18. Método que compreende administrar em um indivíduo umanticorpo ou uma parte de ligação de antígeno do mesmo como definido emquaisquer reivindicações 1 a 13, em que o dito anticorpo ou parte de ligaçãode antígeno inibe a atividade de miostatina, em que o dito indivíduo está ne-cessitado de aperfeiçoamento de homeostase da glicose, redução de massade gordura, aumento da sensibilidade à insulina, aperfeiçoamento de funçãode rim, redução de acúmulo de gordura, tratamento, prevenção ou inibiçãode uma doença ou condição é caracterizada por perda óssea, sendo que adita doença ou condição inclui osteoporose, osteopenia, osteoartrite e fratu-ras ósseas, tratamento de síndrome metabólica, ou neutralização de atrofiamuscular a partir de administração prolongada de um glicocorticóide ou umhormônio esteróide durante o tempo em que o indivíduo está submetido aotratamento com um glicocorticóide ou um hormônio esteróide.

19. Método para reduzir a atividade de miostatina em um indiví-duo necessitado do mesmo que compreende administrar no dito indivíduoum anticorpo monoclonal ou uma parte de ligação de antígeno do mesmocomo definido em quaisquer reivindicações 1 a 13, em que o dito anticorpomonoclonal ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

20. Método para reverter o declínio relacionado à idade em mas-sa muscular em um indivíduo necessitado do mesmo que compreendeadministrar no dito indivíduo um anticorpo ou uma parte de ligação de antí-geno como definido em quaisquer reivindicações 1 a 13, em que o ditoanticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade de miostatina.

21. Linha de célula hospedeira de mamífero que compreendepolinucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves de um anticorpohumano, quimérico ou humanizado que concorre para a ligação à miostatinacom um anticorpo ou uma parte de ligação de antígeno do mesmo, em que oanticorpo ou parte do mesmo possui pelo menos uma propriedade selecio-nada a partir do grupo que consiste em:(a) concorrer para a ligação à miostatina com um anticorpo se-lecionado a partir do grupo que consiste em: 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;-1 _46_1; 2_112_1; 1 _314_1; 1 _66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1 _132_1; 1 _268_1;-2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1 L-L211; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1H-I12V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;(b) se ligar ao mesmo epítopo de miostatina como um anticorposelecionado a partir do grupo que consiste em 1_116_1; 1_136_3; 1_257_1;-1_46_1; 2_112_1; 1_314_1; 1_66_1; 2_43_1; 2_177_1; 1_132_1; 1_268_1;-2_112_K; 1_116_1L-Q45K; 1_257_1L-L21I; 1_314_1H-T92A; 1_46_1H-L81M; 2_112_1 H-112V; 2_112_1 L-F58I; 2_112_1 L-I85V; 2_112_1 H-L81M, L-F58I; 2_112_1H-L81M, L-I85V; e 2_112_1H-L81M, L-F58I, I85V;(c) é um anticorpo que possui a mesma seqüência de aminoáci-do que o anticorpo produzido por uma célula de hibridoma que possui umNúmero de Designação de Depósito ATCC selecionado a partir do grupoque consiste em PTA-6566, PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570,PTA-6571, PTA-6572, PTA-6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576; e(d) é uma linha celular de hibridoma selecionada partir do grupoque consiste em Números de Designação de Depósito ATCC PTA-6566,PTA-6567, PTA-6568, PTA-6569, PTA-6570, PTA-6571, PTA-6572, PTA--6573, PTA-6574, PTA-6575, e PTA-6576.

22. Método para promover o crescimento muscular, ganho depeso ou auxílio na prevenção de fraqueza em gado, suíno, carneiro, frangos,perus, cavalos, peixe, cães e gatos necessitados do mesmo que compreen-de a etapa de administrar no dito indivíduo um anticorpo ou parte de ligaçãode antígeno como definido em quaisquer reivindicações 1 a 13, em que odito anticorpo ou parte de ligação de antígeno inibe a atividade demiostatina.