ES2301158T3 - Produccion de anticuerpos xenogenicos. - Google Patents

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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN HUESPEDES MAMIFEROS NO HUMANOS QUE SE CARACTERIZAN POR POSICIONES IG ENDOGENAS INACTIVAS Y POSICIONES IG HUMANAS FUNCIONALES PARA LA RESPUESTA A UN INMUNOGEN PARA LA PRODUCCION DE ANTICUERPOS HUMANOS O ANALOGOS DE LOS MISMOS. LOS HUESPEDES SE PUEDEN PRODUCIR MEDIANTE MULTIPLES MODIFICACIONES GENETICAS DE CELULAS EMBRIONICAS JUNTO CON UNA REPRODUCCION. SE UTILIZAN DIFERENTES ESTRATEGIAS PARA LA RECOMBINACION DE LAS POSICIONES HUMANAS DE FORMA ALEATORIA O EN POSICIONES DE HUESPEDES ANALOGAS. SE PRESENTAN MAMIFEROS QUIMERICOS Y TRANSGENICOS, EN PARTICULAR RATONES, QUE TIENE SEGMENTOS DE ADN XENOGENEICOS, LARGOS, INTEGRADOS DE FORMA ESTABLE. ESTOS SEGMENTOS SE INTRODUCEN MEDIANTE UNA FUSION CON ESFEROPLASTOS DE LEVADURA QUE CONTIENEN CROMOSOMAS ARTIFICIALES DE LA LEVADURA (YACS) QUE INCLUYEN LOS SEGMENTOS DE ADN XENOGENEICOS Y UN MARCADOR SELECTIVO TAL COMO HPRT, Y CELULAS CON TALLO EMBRIONICAS.

Description

Producción de anticuerpos xenogénicos.
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Campo técnico
El campo de esta invención es la producción de proteínas xenogénicas de unión específica en un anfitrión mamífero no humano viable.
Antecedentes
La capacidad para producir animales transgénicos ha sufrido una revolución con la llegada de la capacidad para cultivar células madre embriónicas murinas, y para introducir modificaciones genéticas en dichas células para la posterior transmisión a la línea germinal de ratones. Por tanto, se tiene la oportunidad de modificar genes endógenos para producir cepas de animales capaces de producir nuevos productos mediante la introducción de genes extraños en el anfitrión, particularmente genes humanos para producir proteínas xenogénicas de unión. La expresión de dichos genes in vivo en un modelo animal puede facilitar la investigación de la función del gen, de la regulación de la expresión génica, de su procesado, de la respuesta a diversos agentes, y otros similares. Adicionalmente, se pueden producir animales con nuevos fenotipos, que incluyen los que imitan una variedad de enfermedades. Por ejemplo, existe interés en introducir una mutación dominante o complementar una mutación recesiva. Dependiendo del gen concreto, la dificultad de lograr la mutación deseada variará enormemente. Aunque algunas dianas génicas han demostrado ser relativamente susceptibles de modificación, otras dianas han demostrado ser extremadamente resistentes a la modificación.
Debido a la oportunidad para generar animales transgénicos, existe un interés sustancial en proporcionar nuevos procedimientos que aumenten el éxito de la producción de animales transgénicos. Particularmente, cuando se desea introducir fragmentos grandes de ADN, que abarquen cientos de kilobases, existe un importante preocupación acerca de la capacidad para introducir los fragmentos grandes intactos en las células de mamífero, acerca de la eficacia de la integración, de la capacidad funcional del gen(es) presente(s) en el fragmento y de la transmisión en la línea germinal de la progenie. Adicionalmente, dichos procedimientos para la introducción de grandes fragmentos de ADN permiten la determinación de la función de grandes fragmentos de ADN identificados en el proyecto genoma humano en curso.
En particular, existe un interés en producir proteínas xenogénicas de unión específica, por ejemplo anticuerpos monoclonales humanos, en pequeños animales de laboratorio tales como ratones. Los anticuerpos monoclonales se utilizan tanto en diagnosis como en terapia. Debido a su capacidad para unirse a un epítopo específico, pueden usarse exclusivamente para identificar moléculas que portan el epítopo, o pueden dirigirse, por sí mismas o en conjunción con otras funcionalidades, a una posición específica para diagnosis o terapia.
Los anticuerpos monoclonales comprenden cadenas pesadas y ligeras que se unen para definir una región de unión para el epítopo. Cada una de las cadenas está compuesta por una región variable y una región constante. La secuencia de aminoácidos de la región constante es específica para un isótopo particular del anticuerpo, así como para el anfitrión que produce el anticuerpo.
Debido a la relación entre la secuencia de la región constante y las especies a partir de las cuales se produce el anticuerpo, la introducción de un anticuerpo xenogénico en el sistema vascular del anfitrión puede producir una respuesta inmune. Cuando el anticuerpo xenogénico se introduce repetidamente, en el caso de enfermedades crónicas, la administración del anticuerpo deja de ser práctica, ya que se destruye rápidamente y puede tener efectos adversos. Por tanto, se han realizado numerosos esfuerzos para proporcionar una fuente de anticuerpos singénicos y alogénicos. En una técnica se recurrió al uso de tecnología de ADN recombinante en la que se identificaron los genes de las cadenas pesadas y ligeras y se aislaron las regiones que codifican la región constante. Dichas regiones se agruparon junto a la porción codificadora de región variable de otros genes de inmunoglobulina procedentes de otras especies dirigidas a un epítopo específico.
Aunque el anticuerpo quimérico parcialmente xenogénico resultante es sustancialmente más útil que el uso de un anticuerpo completamente xenogénico, sigue presentando una serie de desventajas. La identificación, aislamiento y reunión de las regiones variable y constante requiere un trabajo sustancial. Además, la reunión de una región constante procedente de una especie con una región variable de otra especie puede cambiar la especificidad y la afinidad de las regiones variables, de tal modo que se pierden las propiedades deseadas de la región variable. Asimismo, existen secuencias de estructura e hipervariables específicas de una especie en la región variable. Estas secuencias de estructura e hipervariables pueden dar como resultado respuestas antigénicas no deseadas.
Por tanto, sería más deseable producir anticuerpos alogénicos para la administración a un anfitrión mediante la inmunización del anfitrión con un inmunógeno de interés. Para primates, particularmente para humanos, esta estrategia no es práctica. Los anticuerpos humanos que han sido producidos se han basado en la presencia adventicia de un bazo disponible, de un anfitrión que hubiera sido inmunizado previamente frente al epítopo de interés. Aunque se pueden emplear linfocitos sanguíneos periféricos humanos para la producción de anticuerpos monoclonales, no han sido particularmente exitosos en fusiones y normalmente sólo han conducido a IgM. Además, es particularmente difícil generar una respuesta de anticuerpos humanos frente a una proteína humana, diana deseable en muchas aplicaciones terapéuticas y de diagnosis. Por lo tanto, existe un interés sustancial en descubrir rutas alternativas a la producción de anticuerpos alogénicos para humanos.
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Bibliografía Relevante
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Resumen de la invención
Se producen proteínas xenogénicas de unión específica en un anfitrión viable no humano mediante inmunización del anfitrión con un inmunógeno apropiado.
Un anfitrión no humano preferido se caracteriza por: (1) ser incapaz de producir cadena pesada de inmunoglobulina endógena; (2) ser sustancialmente incapaz de producir cadenas ligeras de inmunoglobulina endógena; y (3) ser capaz de producir cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina xenogénica para producir una inmunoglobulina xenogénica o un análogo de inmunoglobulina xenogénica. Por tanto, el anfitrión puede presentar un locus de inmunoglobulina endógeno completo sustituido por una porción o por el total de un locus de inmunoglobulina xenogénica, o puede presentar un locus de inmunoglobulina xenogénica insertado en un cromosoma de la célula anfitriona y una región de inmunoglobulina endógena desactivada. Estas diversas alternativas se llevarán a cabo, al menos en parte, empleando recombinación homóloga para desactivar o para sustituir en los locus de inmunoglobulina para cadenas pesadas y ligeras.
Adicionalmente, se proporcionan nuevos métodos para introducir segmentos grandes de ADN xenogénico de al menos 100 kb, particularmente ADN humano, en anfitriones animales no humanos, particularmente ratones, introduciendo un cromosoma artificial de levadura (YAC, del inglés "yeast artificial chromosome") que contiene un segmento de ADN xenogénico de al menos 100 kb, en una célula madre embrionaria no humana para integración en el genoma de la célula madre, selección de células madre que comprenden YAC integrado por medio de un marcador presente en el YAC, introducción de las células ME (madre embrionarias) que contienen YAC en embriones no humanos y generación de ratones quiméricos a partir de los embriones. Los animales quiméricos pueden aparearse para proporcionar animales que sean heterocigotos para el YAC. Los animales heterocigotos pueden aparearse para generar una progenie homocigota para el YAC integrado.
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Descripción de las figuras
La Figura 1 es un diagrama del vector de desactivación correspondiente a la región J de cadena pesada de ratón, tal como se describe en el Ejemplo I, ver más adelante.
La Figura 2 es un diagrama del mapa de restricción de ADN correspondiente al plásmido pmH\deltaJ y a los genes diana J de cadena pesada de ratón, tal como se describe en el Ejemplo II, ver más adelante.
La Figura 3 es un esquema de citometría de flujo de tinción de anticuerpos correspondiente a alotipos de IgM en cepas de ratones, tal como se describe en el Ejemplo II, presentado más adelante.
La Figura 4 es un histograma de citometría de flujo de tinción de anticuerpos correspondiente a alotipos de IgM en cepas de ratones, tal como se describe en el Ejemplo II, presentado más adelante.
La Figura 5 es un diagrama del vector de desactivación correspondiente a los genes de región constante de inmunoglobulina kappa de ratón, tal como se describe en el Ejemplo III, presentado más adelante.
La Figura 6 es un diagrama de la derivación del plásmido pK.TK/Neo, tal como se describe en el Ejemplo III, presentado más adelante.
La Figura 7 es un diagrama del mapa de restricción del locus diana de cadena ligera, tal como se describe en el Ejemplo III, presentado más adelante.
La Figura 8 es un diagrama del vector dirigido para la desactivación de las regiones constante y J de cadena ligera kappa y para el diseño del experimento de diana tal como se describe en el Ejemplo IV, presentado más adelante.
La Figura 9 es un diagrama de la construcción de vectores para la desactivación de las regiones constante y J de cadena ligera kappa tal como se describe en el Ejemplo IV, presentado más adelante.
La Figura 10 es un diagrama de los vectores de eliminación final para la desactivación de las regiones constante y J de cadena ligera kappa tal como se describe en el Ejemplo IV, presentado más adelante.
La Figura 11 es una ilustración del análisis de transferencia Southern de células eliminadas de región constante y J de cadena ligera tal como se describe en el Ejemplo IV, presentado más adelante.
Las Figuras 12 A-E son fotografías de los resultados de los análisis de transferencia Southern para caracterizar yHRPT y ADN genómico de levadura en clones ME tal como se describe en el Ejemplo VI, presentado más adelante (A = secuencia Alu repetitiva humana; B,C = pBR322- secuencias específicas para los brazos de YAC derecho (B) e izquierdo (C); D = secuencia Ty repetitiva de levadura; E = gen LYS2 de copia sencilla de levadura). También se muestran tiempos más cortos de exposición (12 h para II en comparación con 48 h para I) de yHRPT probado con secuencias Alu y Ty. Las posiciones de marcadores de peso molecular están indicadas. Se muestran esquemas de los brazos derecho (a) e izquierdo (b) de vector y las localizaciones de fragmentos de vector YAC derivados de pBR322 ( = telómero; = secuencias derivadas de levadura; 0 = centrómero de levadura; = secuencias derivadas de pBR322; = injerto humano; = posición de clonación Ncori; H = posiciones HindIII).
Las Figuras 13 A-D son fotomicrografías de los resultados de hibridación in situ para detectar la integración de yHPRT y de secuencias genómicas de levadura en cromosomas de célula ME tal como se describe en el Ejemplo VI, presentado más adelante (A, B = extensiones de metafase de células ESY 8-7 hibridadas a secuencias genómicas humanas biotiniladas y C = extensiones de metafase o D = núcleos de interfase de células ESY 8-6 hibridadas a secuencias de ADN repetidas de levadura biotinilada).
Las Figuras 14 A, B, C demuestran la retención estable de yHPRT durante la diferenciación y transmisión de células ME in vitro a lo largo de la línea germinal de ratón, tal como se describe en el Ejemplo VI, presentado más adelante (A: a, b = cuerpos embriodes; y tipos celulares diferenciados; c = islas sanguíneas; d = músculo en contracción; e = células neuronales; f = túbulos neurales formados por clones ESY; B: análisis de transferencia Southern de ADN extraído de células diferenciadas ESY 5-2, 3-6, 8-5 y 8-6 (20 \mug) e yHPRT en AB1380 (40 ng) usando a = sonda Alu humana; b = secuencias Ty de levadura; C: análisis de transferencia Southern de ADN de cola (20 \mug) procedentes de crías de agouti (4-2 y 4-3) derivadas de macho quimérico ESY 394/95-2 usando a = Alu humana y b = secuencias Ty; se muestran exposiciones más cortas (12 h) de 8-6 y de yHPRT probadas con Ty (II).
Las Figuras 15 A y B son fotografías de un gel de electroforesis que muestra la expresión del gen HPRT humano en diversos tejidos de ratón, tal como se describe en el Ejemplo VI, presentado más adelante (15 A = detección de mARN de HPRT humano usando PCR de transcripción inversa (RT-PCR) en células ME, ESY 3-1 y Hut 78, bazo e hígado de ratones de control o crías de agouti ESY 4-3; 15 B = detección de mARN de receptor de \gamma-interferón de ratón mediante RT-PCR en muestras procedentes de 15 A; M = marcador de tamaño).
La Figura 16 es un diagrama del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, y un vector YAC de sustitución de cadena pesada humano, tal como se describe en el Ejemplo VII, presentado más adelante.
La Figura 17 es un diagrama de un esquema de cría de ratón, tal como se describe en el Ejemplo VIII, presentado más adelante.
La Figura 18 presenta los genotipos de algunos animales anfitriones producidos mediante los métodos de la invención.
Descripción de realizaciones específicas
Se proporcionan nuevos anfitriones transgénicos no humanos, particularmente anfitriones mamíferos, habitualmente murinos, en los que el anfitrión es capaz de armar una respuesta inmune frente a un inmunógeno, en donde la respuesta produce anticuerpos que tienen regiones humanas, variables y constantes. Por "transgénico" se entiende un animal no humano que contiene una modificación de ingeniería genética, particularmente, en lo que se refiere a esta invención, la introducción de un gen de inmunoglobulina humana, en todas sus células. Los anfitriones se caracterizan por ser capaces de producir inmunoglobulinas xenogénicas o análogos de las mismas como resultado de la desactivación de los locus de codificación de subunidad de inmunoglobulina endógena y la introducción de ADN humano, por ejemplo ADN que codifica inmunoglobulina humana. Las modificaciones pueden mantener al menos una porción de las regiones constantes humanas que permiten la organización de la posición de unión de la región variable unida al extremo C de un péptido funcional. Los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo, por ejemplo IgA, D, E, G ó M, o de subtipos dentro de cada isotipo.
En una primera estrategia, en etapas individuales, se introducen los genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada xenogénicos, es decir humanos, en la línea germinal del anfitrión no humano (por ejemplo, esperma u oocitos) y en etapas separadas los correspondientes genes del anfitrión se hacen no funcionales mediante desactivación usando recombinación homóloga. Se reconstruyen genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanos en un microorganismo eucariótico o procariótico apropiado, y los fragmentos de ADN resultantes pueden introducirse en el anfitrión no humano apropiado, por ejemplo en los pronúcleos de oocitos fertilizados o de células madre embrionarias de ratón. La desactivación de los locus de inmunoglobulina endógeno del anfitrión se logra alterando los locus apropiados mediante recombinación homóloga en las células de anfitrión no humano, particularmente en células madre embrionarias no humanas o en pronúcleos de oocitos fertilizados de ratón. La alteración dirigida puede implicar la introducción de una lesión o de una eliminación en el locus objetivo, o una eliminación dentro del locus objetivo acompañada de una inserción en el locus, por ejemplo, una inserción de un marcador seleccionable. En el caso de células madre embrionarias no humanas, se generan animales quiméricos no humanos que son derivados en parte de las células madre embrionarias no humanas modificadas y que son capaces de transmitir las modificaciones genéticas a través de la línea germinal. El apareamiento de anfitriones a los que se ha introducido locus de inmunoglobulina humana y cepas con locus endógenos desactivados dará lugar a animales cuya producción de anticuerpos es puramente xenogénica, es decir humana.
En una segunda estrategia alternativa, al menos porciones de los locus de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada son usadas para reemplazar directamente los correspondientes locus de inmunoglobulina endógenos mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias no humanas. Esto da como resultado una desactivación y un reemplazamiento simultáneos de la inmunoglobulina endógena. Esto se sigue de la generación de animales quiméricos no humanos en los que las células derivadas de células madre embrionarias no humanas pueden contribuir a la línea germinal.
Estas estrategias se basan en la organización conocida de los locus de la cadena de inmunoglobulina en una serie de animales, ya que la organización, la posición relativa de exones que codifican dominios individuales, y la localización de posiciones de empalme y de elementos transcripcionales, se comprenden en diferente grado. En el ser humano, el locus de cadena pesada de inmunoglobulina (IgH_{hu}) se localiza en el cromosoma 14. En la dirección 5'-3' de la transcripción, el locus comprende un racimo grande de genes de región variable (V_{H}), los genes de región de diversidad (D), seguidos de los genes de región de unión (J_{H}) y el racimo de genes constantes (C_{H}). Se estima que el tamaño del locus es de aproximadamente 1.500 a aproximadamente 2.500 kilobases (kb). Durante el desarrollo de células B, se yuxtaponen segmentos de gen discontinuos procedentes del locus de la línea germinal IgH por medio de un reordenamiento físico del ADN. A fin de producir un polipéptido Ig de cadena pesada funcional, deben unirse tres segmentos de ADN discontinuos, de las regiones V_{H}, D y J_{H}, de un modo secuencial específico; primero D con J_{H}, entonces V_{H} con DJ_{H}, generando la unidad funcional V_{H}DJ_{H}. Una vez que se ha formado la V_{H}DJ_{H}, se producen cadenas pesadas específicas siguiendo la transcripción del locus de Ig, utilizando como molde la unidad específica V_{H}DJ_{H}C_{H} que comprende exones e intrones.
Existen dos locus para las cadenas ligeras de inmunoglobulina (IgL), el locus kappa en el cromosoma humano 2 y el locus lambda en el cromosoma humano 22. La organización de los locus de IgL es similar a la del locus IgH, excepto que la región D no está presente. Después de la reorganización de IgH, se lleva a cabo de forma similar la reorganización de un locus de cadena ligera mediante unido de V_{L} y J_{L} a la cadena kappa o lambda. Los tamaños de los locus lambda y kappa son de aproximadamente entre 1000 y 2000 kb. La expresión de IgH reorganizada y de una cadena ligera de Ig\kappa o de Ig\lambda en una célula B concreta permite la generación de moléculas de anticuerpos.
Con el objetivo de aislar, clonar y transferir el locus IgH_{hu}, se puede emplear un cromosoma artificial de levadura o "YAC". Un YAC que porta el ADN humano puede introducirse en células ME no humanas o en oocitos no humanos a través de una variedad de métodos, que incluye la fusión de esferoplastos de levadura: célula ME, la microinyección y la lipofección. El YAC se integrará aleatoriamente (es decir, no homogéneamente) en el genoma del anfitrión no humano. Si se emplea la fusión esferoplasto de levadura: célula ME para introducir un YAC que porta ADN humano en células ME anfitrionas no humanas, entonces se pueden introducir dos o más YACs de una única célula anfitriona de levadura simultáneamente en la misma célula ME del anfitrión no humano. La ventaja de esta estrategia es que se pueden introducir múltiples YACs que contienen cada uno ADN humano, por ejemplo locus de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanos, en un único cromosoma en una célula de anfitrión no humano. Esto elimina la necesidad de criar animales que contengan genes Ig humanos individuales a fin de generar un anfitrión capaz de producir inmunoglobulinas completamente humanas. Por ejemplo, una cepa de levadura que contiene un único YAC es tratada con un vector tal como pLUTO (descrito más adelante) para introducir un marcador seleccionable de mamífero tal como HPRT, y un marcador seleccionable de levadura tal como LYS2 en un brazo del YAC. El ADN cromosomal de la cepa tratada se usa a continuación para transformar una segunda cepa de levadura mutante lys2, normalmente haploide, que contiene un segundo YAC diferente. A continuación se analizan Lys + colonias mediante electroforesis de gel de campo pulsado (PFGE) para identificar clones que alojen los dos YACs y para confirmar que su tamaño no se ha visto alterado. Mediante transformación se pueden añadir posteriormente YACs adicionales con diferentes marcadores seleccionables, por ejemplo ADE2 (si el anfitrión es un mutante ade2). Alternativamente, se trata una cepa de levadura que contiene YAC con un vector tal como pLUTO para introducir un marcador seleccionable de mamífero (por ejemplo HPRT), tal como se ha indicado antes, y a continuación se aparea con una segunda cepa que contiene YAC de tipo de apareo opuesto. La presencia de dos YACs se confirma entonces en las células de levadura diploides tal como se ha descrito antes. La cepa de levadura diploide se usa directamente para fusión o se somete a meiosis y ascosporogénesis (esporulación) usando procedimientos estándar. Los productos meióticos se escrutan a continuación para identificar un clon haploide que contiene los dos YACs. Con cualquiera de las aproximaciones descritas anteriormente, se puede tratar el segundo YAC con HPRT o con otro marcador seleccionable antes de la introducción del primer YAC. Asimismo, si cada YAC contiene un marcador seleccionable diferente, el mantenimiento de ambos YACs durante la propagación de cepa puede seleccionarse genéticamente. La fusión con células ME no humanas se lleva a cabo entonces del mismo modo que con las células de levadura que contienen un único YAC. Debido a que muchos cromosomas de levadura pueden integrarse junto con el YAC, es de esperar que una porción sustancial de los clones ME que expresan el marcador seleccionable de mamífero presente en un YAC (por ejemplo, clones HAT^{R} si el marcador de YAC es HPRT, y las células ME no humanas son HPRT-), tenga integrados ambos YACs. Se pueden usar métodos tales como el análisis de transferencia Southern y/o PCR para identificar dichos clones, y el análisis de transferencia Southern que emplea electroforesis de gel de campo pulsado usado para caracterizar la extensión de la integración de YAC.
El locus IgH_{hu} completo puede estar contenido en uno en unos pocos clones YAC junto con un marcador de mamífero tal como Neo, HPRT, GPT, \beta-gal, etc. Esto mismo es válido para los locus de cadena ligera de Ig. En levaduras puede lograrse la reconstitución de línea germinal intacta de locus de Ig mediante recombinación homóloga entre YACs con regiones solapantes de homología. De este modo se obtiene el aislamiento de fragmentos de ADN que codifican la cadena Ig humana. Alternativamente, se puede clonar directamente un locus de línea germinal intacta en un único YAC.
Con el objetivo de obtener un amplio espectro de anticuerpos de alta afinidad, no es necesario que incluir la región V completa. En los seres humanos el racimo de la región V incluye varias familias de genes de región V. Por tanto, obteniendo un subconjuto de los genes de región V conocidos de los locus de Ig de cadena ligera y pesada humanos (Berman y col., EMBO J. (1998) 7: 727-738) en lugar del complemento completo de regiones V, el anfitrión transgénico no humano puede inmunizarse y ser capaz de armar una fuerte respuesta inmune, y proporcionar anticuerpos de alta afinidad. De este modo, se pueden emplear fragmentos de ADN relativamente pequeños del cromosoma. Por ejemplo, un fragmento documentado de 670 kb del locus Ig_{Hu} está contenido en un fragmento de restricción NotI-NotI, que serviría para proporcionar una variedad de regiones V (Berman y col., ver anterior). También se proporciona un aumento de la diversidad mediante la recombinación con las diversas regiones D y J y mutación somática.
Para hacer que los locus de inmunoglobulina de anfitrión no humano sean no funcionales, se puede emplear recombinación homóloga, en donde se introduce ADN en los locus de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógenos del anfitrión que inhibe la producción de inmunoglobulina endógena. Debido a que existen dos alelos de cadena pesada y dos locus de cadena ligera, kappa y lambda, cada uno con dos alelos, aunque se puede elegir ignorar los locus lambda, tendrán que producirse múltiples transformaciones que den como resultado la desactivación de cada uno de los alelos. Se puede emplear recombinación homóloga para desactivar funcionalmente cada uno de los locus, mediante la introducción del ADN homólogo vía un constructo que puede alterar o borrar el locus diana dentro de las células madre embrionarias no humanas, seguido de la introducción de las células modificadas en blastocistos no humanos receptores. El cultivo posterior permite la transmisión de línea germinal del locus desactivado. Por lo tanto se puede elegir criar descendientes heterocigotos y seleccionar descendientes homocigotos de los padres heterocigotos.
En la segunda estrategia alternativa descrita antes, el número de etapas puede reducirse proporcionando al menos un fragmento del locus de inmunoglobulina humana dentro de la construcción usada para la recombinación homóloga con la inmunoglobulina endógena análoga, de tal modo que el locus humano es sustituido por al menos una parte del locus de inmunoglobulina del anfitrión, que resulta en la desactivación del locus de subunidad de inmunoglobulina del anfitrión. De especial interés es el uso de transformación para una única desactivación, seguida de reproducción de descendientes heterocigotos para producir un descendiente homocigoto. Cuando se emplea el locus humano para sustitución o inserción en el locus de anfitrión no humano para desactivación, el número de transformaciones puede limitarse a tres transformaciones y tal como se ha indicado previamente, se puede elegir ignorar el locus menos usado y limitar las transformaciones a dos transformaciones. Alternativamente, se puede elegir proporcionar la desactivación en una etapa separada para cada locus, empleando células madre embrionarias no humanas procedentes de descendientes a los que previamente se les han desactivado uno o más locus. En el caso de que sólo se use una transformación y que el locus humano se integre en el genoma de anfitrión no humano de un modo aleatorio, pueden requerirse un total de ocho o más transformaciones.
Para la desactivación, se puede emplear cualquier lesión del locus diana que dé como resultado la prevención de la expresión de una subunidad de inmunoglobulina de dicho locus. De este modo, la lesión puede encontrarse en una región que comprende potenciadores, por ejemplo, un potenciador 5' ó 3', o intrón, en las regiones V, J ó C, y con la cadena pesada, existe la oportunidad en la región D, o combinaciones de los mismos. El factor importante es que se inhibe la redisposición de la línea germinal de Ig, o no se puede producir un mensaje funcional que codifica la inmunoglobulina endógena, tanto debido al fallo de la transcripción, como al fallo del procesado del mensaje, como a otra razón similar. Dicha lesión puede adoptar la formar de una eliminación en el gen diana, una inserción de un gen extraño, una combinación de una inserción y una eliminación, o una sustitución usando secuencias xenogénicas con o sin introducción de una eliminación en el gen endógeno.
Preferiblemente, cuando interesa desactivar el locus de subunidad de inmunoglobulina, la lesión se introducirá en uno o más de los exones contenidos en el locus de subunidad de inmunoglobulina, por ejemplo en la región constante o J del locus. Por tanto, se produce una construcción dirigida que carece de exones funcionales en esta región y que puede comprender las secuencias adyacentes por encima o por debajo, a la región J y/o C, o que comprende toda o parte de la región con una inserción desactivante en los exones J ó C. La inserción puede ser de hasta 50 pb o más, en donde dicha inserción da como resultado la alteración de la formación de un mARN funcional. De forma deseable, habitualmente se elimina al menos aproximadamente el 75% de la secuencia de exón, preferiblemente al menos aproximadamente el 90% de la secuencia de exón.
De forma deseable, se usa un marcador génico en la construcción dirigida para reemplazar las secuencias eliminadas. Se pueden emplear varios marcadores, particularmente aquellos que permiten una selección positiva. De especial interés es el uso de resistencia G418 resultante de la expresión del gen correspondiente a neomicina fosfotransferasa ("neo").
En la construcción dirigida, por encima y/o por debajo del gen diana, puede haber un gen que proporcione la identificación de si se ha producido un cruce doble homólogo (selección negativa). Para este propósito, se puede emplear el gen de timidina quinasa del virus simple de Herpes (HSV-tk), ya que las células que expresan el gen de timidina quinasa pueden ser eliminadas mediante el uso de análogos de nucleósido tales como acyclovir o gancyclovir, por sus efectos citotóxicos sobre las células que contienen una HSV-tk funcional (Manssur y col., Nature 336: 348-352 (1988)). La ausencia de sensibilidad a dichos análogos de nucleósido indica la ausencia del gen de timidina quinasa de HSV y, por tanto, en donde se ha producido recombinación homóloga, que también se ha producido un doble cruce.
Aunque la presencia del gen marcador en el genoma indica que se ha producido la integración, todavía será necesario determinar si se ha producido una integración homóloga. Esto se puede lograr de diferentes modos. En la mayor parte se empleará análisis de ADN mediante hibridación de transferencia Southern para establecer la localización de la integración. Empleando sondas para el injerto y las secuencias en las regiones 5' y 3' que flanquean la región en la que se podría producir la integración homóloga, se puede demostrar que se ha producido una alteración homóloga.
También se puede usar PCR con la ventaja de detectar la presencia de recombinación homóloga. Se pueden usar cebadores de PCR que son complementarios a una secuencia dentro de la construcción dirigida, y complementarios a una secuencia fuera de la construcción y en el locus diana. De este modo, se puede obtener sólo moléculas de ADN que tienen ambos cebadores presentes en las cadenas complementarias si se ha producido recombinación homóloga. Demostrando el tamaño esperado de los fragmentos, por ejemplo, usando análisis de transferencia Southern, se confirma la aparición de recombinación homóloga.
La construcción dirigida puede incluir además un sistema de réplica que es funcional en la célula de anfitrión no humano. En su mayor parte, estos sistemas de réplica implicarán sistemas de replicación viral, tales como el virus símico 40, el virus de Epstein-Barr, el virus de polioma, el virus de papiloma, y otros similares. Se pueden emplear diversos sistemas de inicio transcripcional, tanto de virus como de genes de mamíferos, tal como el SV40, los genes de metalationeina I y II, el gen de \beta-actina, los genes temprano y tardío de adenovirus, el gen de fosfoglicerato quinasa, el gen de ARN polimerasa II, y otros similares. Además de los promotores, se pueden emplear potenciadores naturales para potenciar aún más la expresión del gen marcador.
Al preparar las construcciones dirigidas para la recombinación homóloga, se puede incluir un sistema de réplica para procariotas, particularmente E. coli, para preparar la construcción dirigida, subclonar después de cada manipulación, análisis tal como mapeo o secuenciamiento de restricción, expansión y aislamiento de la secuencia deseada. En el caso de la estrategia de sustitución, en la que el injerto de ADN xenogénico es grande, excediendo generalmente aproximadamente los 50 kpb, habitualmente excediendo los 100 kpb, y habitualmente no más de aproximadamente 1000 kpb, se puede usar un cromosoma artificial de levadura (YAC) para clonar la construcción dirigida.
Una vez que se ha preparado una construcción dirigida y se han eliminado cualesquier secuencias no deseadas, por ejemplo, secuencias procariotas, la construcción puede ser introducida en la célula diana, por ejemplo una célula ME no humana. Se puede emplear cualquier técnica conveniente para introducir el ADN en las células diana. Dichas técnicas incluyen la fusión de protoplasto, por ejemplo fusión esferoplasto de levadura:célula, la lipofección, la electroporación, la transferencia de ADN mediada por fosfato cálcico o la microinyección directa.
Después de la transformación o transfección de las células diana, las células diana pueden seleccionarse por medio de marcadores positivos y/o negativos, tal como se ha indicado previamente, resistencia a neomicina y resistencia a acyclovir o gancyclovir. Las células que muestren el fenotipo deseado pueden analizarse entonces mediante análisis de restricción, electroforesis, análisis de transferencia Southern, PCR, u otros similares. Identificando los fragmentos que muestran la presencia de la(s) lesión(es) en el locus diana, se pueden identificar las células en las que se ha producido la recombinación homóloga para desactivar una copia del locus diana.
El proceso descrito anteriormente puede llevarse a cabo primero para desactivar un locus de cadena pesada en una célula madre embrionaria no humana, mediante el cual las células son microinyectadas en blastocistos del anfitrión no humano que se desarrolla en un animal quimérico. Los animales quiméricos se crían para obtener anfitriones heterocigotos. A continuación, reproduciendo los anfitriones heterocigotos, se puede obtener un anfitrión homocigoto o se pueden aislar y transformar células madre embrionarias no humanas para desactivar el segundo locus de IgH, y el proceso se repite hasta que se han desactivado todos los locus deseados. Alternativamente, el locus de cadena ligera puede ser el primero en ser desactivado. Para la completa eliminación de la capacidad de producir inmunoglobulina de cadena ligera, es deseable desactivar los locus de inmunoglobulina de cadena ligera kappa y lambda. En cualquier etapa se pueden introducir los locus xenogénicos.
Tal como se ha indicado ya, el locus diana puede ser sustituido por el locus xenogénico, es decir humano, análogo. De esta forma, el locus xenogénico se colocará sustancialmente en la misma región que el locus análogo del anfitrión, de tal modo que cualquier regulación asociada a la posición del locus será sustancialmente la misma para el locus de inmunoglobulina xenogénica. Por ejemplo, aislando la región variable del locus de IgH humano (que incluye las secuencias V, D y J), o una porción del mismo, y flanqueando el locus humano con secuencias procedentes de locus murino, preferiblemente secuencias separadas por al menos aproximadamente 5 kpb, en el locus anfitrión, preferiblemente al menos aproximadamente 10 kpb en el locus anfitrión, se puede insertar el fragmento humano en dicha región en un(os) evento(s) recombinatorio(s), sustituyendo el locus de inmunoglobulina humano por la región variable endógena del locus de inmunoglobulina del anfitrión. De esto modo, se puede alterar la capacidad del anfitrión para producir una subunidad de inmunoglobulina endógena, a la vez que se permite que el promotor del locus de inmunoglobulina humano sea activado por el potenciador del anfitrión y regulado por el sistema regulador del anfitrión.
A fin de proporcionar la producción de proteínas de unión xenogénicas en un anfitrión no humano, es necesario que el anfitrión sea competente para proporcionar las enzimas necesarias y otros factores implicados en la producción de anticuerpos, a la vez que carece de genes endógenos competentes para la expresión de subunidades pesadas y ligeras de inmunoglobulinas. Por tanto, las enzimas y otros factores asociados a la redisposición de la línea germinal, empalme, mutación somática, y otros similares, serán funcionales en el anfitrión. Lo que faltará es una región natural funcional que comprenda los diversos exones asociados a la producción de inmunoglobulina endógena.
La integración de ADN xenogénico, es decir humano, introducido puede ser aleatoria u homóloga dependiendo de la estrategia concreta que se vaya a emplear. De este modo, el uso de transformación, usando etapas repetitivas o en combinación con cría y reproducción, se pueden obtener animales transgénicos no humanos que sean capaces de producir proteínas de unión xenogénicas en una ausencia sustancial de inmunoglobulina endógena ligera o pesada. Por transformación se entiende cualquier técnica introducir ADN en una célula viable, tal como conjugación, fusión celular mediada por PEG, transformación, transfección, transducción, electroporación, lipofección, biolística, y otros similares.
Una vez que se han introducido los locus xenogénicos en el genoma de anfitrión no humano, ya sea mediante recombinación homóloga o mediante integración aleatoria, y que se hayan producido animales anfitriones no humanos con los locus de inmunoglobulina endógenos desactivados mediante una reproducción apropiada de los diversos animales transgénicos no humanos o de animales derivados de animales quiméricos no humanos, se puede producir un anfitrión que carece de la capacidad nativa de producir inmunoglobulina endógena, pero que presenta la capacidad de producir inmunoglobulinas xenogénicas con al menos una porción significativa del repertorio de la fuente xenogénica.
La desactivación funcional de las dos copias de cada uno de los tres locus de Ig de anfitrión (pesado, kappa y lambda), en donde el anfitrión contiene entonces IgH humana y los locus de Ig humana kappa y/o lambda permitiría la producción de moléculas de anticuerpos puramente humanos sin la producción de anticuerpos quiméricos anfitrión/humano. Dicha cepa de anfitrión, mediante inmunización con antígenos específicos, respondería a la producción de células B murinas que producen anticuerpos humanos específicos, células B que podrían fusionarse con células de mieloma murino o que podrían inmortalizarse de cualquier otro modo para la producción estable continua de anticuerpos monoclonales humanos. En la técnica existen métodos bien conocidos para obtener una producción estable continua de anticuerpos monoclonales.
La metodología y las estrategias del sujeto no necesitan limitarse a la producción de inmunoglobulinas completas, pero proporciona la oportunidad de generar regiones unidas a una porción de la región constante, por ejemplo, C_{H1}, C_{H2}, C_{H3} ó C_{H4}, o combinaciones de las mismas. Alternativamente, se pueden sustituir o ligar uno o más exones de las regiones C_{H} y C_{\kappa} o C_{\lambda} a una secuencia que codifica una proteína diferente, tal como una enzima, por ejemplo, activador plasminógeno, superóxido dismutasa, etc.; toxina, por ejemplo, ricina, abrina, toxina de difteria, etc.; factor de crecimiento; agente citotóxico, por ejemplo, TNF; ligando receptor, o otros similares. Véase, por ejemplo, WO 89/07142; WO 89/09344 y WO 88/03559. Insertando la proteína de interés en un exón de región constante y proporcionando el empalme de la región variable con el exón de región constante modificado, la proteína de unión resultante puede tener una región C-terminal diferente a la de la inmunoglobulina. Proporcionando una secuencia de parada con el gen insertado, el producto de proteína tendrá la proteína insertada como región C-terminal. Si se desea, la región constante puede ser sustituida completamente por otra región, proporcionando una construcción con las posiciones de empalme apropiadas para la unión de la región variable de la otra proteína.
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Las células B del anfitrión transgénico no humano que producen inmunoglobulina o análogo de inmunoglobulina pueden usarse para fusionarse a una célula mieloide murina para producir hibridomas o pueden inmortalizarse mediante otros procesos convencionales, por ejemplo, transfección con oncogenes. Estas células inmortalizadas pueden cultivarse en un cultivo continuo o pueden introducirse en el peritoneo de un anfitrión compatible para la producción de ascites.
La presente invención proporciona la producción de anticuerpos, o análogos de anticuerpos, anti-suero policlonales humanos o monoclonales humanos. Cuando el anfitrión mamífero no humano ha sido inmunizado con un inmunógeno, los anticuerpos humanos resultantes pueden aislarse de otras proteínas usando una columna de afinidad, que tiene una función de unión Fc, tal como proteína A, u otra similar.
Los hospedantes no humanos pueden ser (véase también la Figura 18):
I.
Animales heterocigotos para un gen de inmunoglobulina de cadena ligera endógena inactiva (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
II.
Animales heterocigotos para un gen de inmunoglobulina de cadena pesada endógena inactiva (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
III.
Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemocigotos para (es decir, que contengan una copia de) genes de inmunoglobulina de cadena pesada extraña, preferiblemente humana (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
IV.
Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera extraña, preferiblemente humana (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
V.
Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera endógena inactiva obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de la categoría I y animales de la categoría II (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
VI.
Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes extraños, preferiblemente humanos, de inmunoglobulina de cadena pesada mediante reproducción cruzada de animales de la categoría III y animales de la categoría V (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
VII.
Animales heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de la categoría IV y animales de la categoría V (mediante cría cruzada se obtienen los animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
VIII.
Animales homocigotos o heterocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraña, preferiblemente humana, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías VI y VII (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para el gen extraño);
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Los animales homocigotos de la categoría VIII pueden usarse para producir anticuerpos humanos.
IX.
Animales homocigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada endógena funcional y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías III y IV (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos);
X.
Animales heterocigotos para gen de inmunoglobulina de cadena pesada endógena inactiva y hemicigoto para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías II y IX (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para gen extraño);
XI.
Animales heterocigotos para gen de inmunoglobulina de cadena ligera endógena inactiva y hemicigotos para genes de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada extraños, preferiblemente humanos, obtenidos mediante reproducción cruzada de animales de las categorías I y IX (mediante cría cruzada se obtienen animales homocigotos para los locus endógenos inactivos y homo- o hemicigotos para gen extraño).
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Para introducir secuencias de ADN grandes continuas en un anfitrión mamífero no humano, habitualmente, las secuencias tendrán al menos 100 kb, más habitualmente al menos aproximadamente 200 kb, generalmente en el intervalo entre aproximadamente 200 y 1000 kb. Por tanto, puede desearse transferir un locus de interés, tal como el locus de inmunoglobulina; regiones del cromosoma xenogénico, es decir humano, que pueden incluir uno o más genes de interés, que pueden haber sido caracterizados o no, tal como el receptor de Lipoproteína de Baja Densidad (LDL), Apolipoproteína (Apo) B, Apo E, regulador conductor transmembrana de fibrosis quística, distrofina, o regiones de cromosomas xenogénicos que pueden estar implicados en trisomía parcial de cromosomas (por ejemplo, los cromosomas 21, 7 y 10); y virus.
La presente invención proporciona un método para producir una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el genoma de la célula ME de mamífero no humano, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a)
combinar en condiciones de fusión las células ME no humanas y esferoplastos de levadura que contienen uno o más cromosomas artificiales de levadura (YACs) que comprenden la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde los YACs incluyen un gen que codifica un marcador seleccionable, mediante lo cual las porciones de los locus de inmunoglobulina humana se integran de forma estable en el genoma de las células madre embrionarias; y
(b)
seleccionar las células ME que portan los locus de inmunoglobulina humana por medio del marcador o marcadores.
La presente invención también proporciona una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el genoma de la célula ME de mamífero no humano, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde la célula ME de mamífero no humano es producida mediante el método de la presente invención para producir una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano.
El ADN xenogénico, es decir humano, que se va a introducir usando un YAC es de origen humano. Por tanto se pueden impartir numerosas nuevas capacidades al anfitrión, crear respuestas genéticas relacionadas con la fuente xenogénica, es decir humana, de ADN, proporcionar la producción de anticuerpos, introducir mutaciones dominantes o mutaciones recesivas complementarias. El ADN xenogénico, es decir humano, puede ser modificado cuando está presente en un YAC. Debido a que la recombinación homologa es eficaz en levaduras, generando una elevada proporción de integración específica respecto a la posición de ADN homólogo, cuando el ADN homólogo flanquea otro ADN de interés, se puede modificar el ADN xenogénico, es decir humano, antes de la introducción en una célula ME no humana. De este modo, se pueden introducir genes defectivos en el anfitrión no humano que expresen proteínas defectivas para imitar estados de enfermedad del anfitrión xenogénico, para estudiar los diversos mecanismos de interacción de proteínas defectivas con otras proteínas xenogénicas o proteínas endógenas, o para estudiar genes o sistemas de genes.
En general, para transferir grandes segmentos de ADN, tal como se describe en detalle en el presente documento, se emplean YACs que comprenden un centrómero de levadura, un origen de replicación y telómeros que rodean al ADN de interés. Se pueden usar varios centrómeros o telómeros, particularmente los centrómeros procedentes de los cromosomas de levadura 4 y 5. El YAC tiene un marcador que permite la selección o el escrutinio de células en las que se integra el YAC. No todos los marcadores permiten una selección eficaz. Particularmente, el gen HPRT, más particularmente HPRT humano, permite una selección eficaz de células no humanas deficientes en HPRT que portan el YAC. Otros marcadores seleccionables o escrutables conocidos incluyen higromicina, neomicina, \beta-gal y GPT. La célula ME puede derivar de cualquier anfitrión no humano, del cual se puedan tener disponibles células ME, y pueda expandirse en cultivo, que permanezca viable y funcional, para el que exista un marcador de selección, y en donde la célula ME pueda introducirse en un embrión no humano y pueda repoblar el anfitrión no humano, incluyendo la línea germinal. En su mayor parte, dicha capacidad se ha establecido para roedores, por ejemplo ratones y ratas, y en menor medida para cobayas. Se han usado ratones para la producción de anticuerpos o de linfocitos B para la inmortalización para la producción de anticuerpos. Debido a que los ratones son fáciles de manejar, se pueden producir en grandes cantidades, y se sabe que poseen un extenso repertorio inmune, habitualmente son los animales elegidos. Si se dispone de células ME no humanas de otras especies, también pueden emplearse de acuerdo con la presente invención. De especial interés son los animales de laboratorio pequeños, o animales domésticos, especialmente roedores, que incluyen ratones, ratas, conejos, vacas, cerdos, hámsteres, caballos, perros, ovejas y cobayas, o aves tales como pollos, pavos, etc. Las células ME no humanas pueden tener una o más mutaciones, por ejemplo, carecer de una actividad particular. De especial interés en esta invención son las células ME que son deficientes en HPRT. Además, óvulos fertilizados no humanos de determinadas especies pueden ser de utilidad de acuerdo con la invención.
El YAC puede obtenerse mediante escrutinio de bibliotecas de YAC humano existentes tales como las disponibles en el Centre d'Etude du Polymorphisme Human (C.E.P.H.), París, Francia, y en la Universidad de Washington, St. Louis, MO, usando procedimientos estándar. Alternativamente, el YAC se prepara fácilmente tal como se detalla en la presente memoria, uniendo los segmentos flanqueantes de levadura que comprenden un brazo con un centrómero y telómero y otro con un telómero junto con el ADN de interés. Habitualmente, también habrá presente uno o más marcadores que permitan la selección en las células anfitrionas de levadura. Para la selección de levadura, son de especial interés los marcadores que complementan mutaciones del anfitrión de levadura, tal como los genes implicados en la producción de aminoácidos, purinas o pirimidinas, URA3, TRP1, LYS2, ADE2 en el YAC para complementar las mutaciones ura3, trp1, lys2 y ade2 en el anfitrión. Proporcionando la complementación, en su mayoría sólo las células de levadura que portan el YAC completo serán capaces de sobrevivir en un medio selectivo. Además de la verificación genética de que se mantienen ambos brazos de YAC, es deseable confirmar la integridad del YAC usando un método tal como la electroforesis de gel de campo pulsado.
Los anfitriones de levadura que portan el YAC pueden ser utilizados a continuación como fuente del YAC para su introducción en la célula ME no humana. La transferencia del YAC se lleva a cabo de forma eficaz preparando esferoplastos de levadura de acuerdo según métodos convencionales. Degradando la pared externa, en condiciones suaves, en un medio isotónico, se producen esferoplastos con un elevado rendimiento. Las células ME no humanas en crecimiento exponencial son tratadas con proteasa, por ejemplo son tripsinizadas, y se combinan con los esferoplastos. De forma conveniente, se puede preparar una partícula de esferoplastos de levadura y se hacen girar las células no humanas con la partícula y se exponen a un agente fusogénico tal como PEG durante 1-2 minutos. A continuación las células son resuspendidas e incubadas en un medio apropiado libre de suero. Entonces las células son llevadas a placa sobre células alimentadoras, seguido de la selección de acuerdo con el marcador selectivo. Para el gen HPRT, se puede emplear medio HAT para la selección. Las colonias de fusión supervivientes son seleccionadas, expandidas y analizadas. El análisis puede llevarse a cabo mediante análisis con enzimas de restricción, con análisis de transferencia Southern combinado o mediante electroforesis de gel de campo pulsado, o mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR), empleando los cebadores apropiados, de los cuales al menos uno es complementario al injerto de ADN, y probar con secuencias repetitivas presentes en el ADN xenogénico, tal como Alu, para la detección de secuencias de ADN humano. Se usan secuencias Ty, Y', rADN y delta como sondas para las secuencias de levadura. Se usan sondas para los extremos de YAC para confirmar la integridad del YAC. Las células que demuestran la presencia de ADN de YAC intacto o sustancialmente intacto integrado en el genoma del anfitrión se usan a continuación en las siguientes etapas. En algunos clones, sólo una porción o poco o nada del ADN de levadura pasa a integrarse en el genoma de ratón. El ADN de levadura integrado oscila entre más de aproximadamente el 90% del genoma original de levadura y menos de aproximadamente el 10%.
La producción eficaz de anfitriones transgénicos no humanos puede lograrse usando un proceso que integra grandes fragmentos de ADN xenogénico, de al menos 100 kb, de un modo sustancialmente intacto, en una célula madre embrionaria (ME) de anfitrión no humano o en un óvulo fertilizado no humano (zigoto). La introducción del ADN xenogénico se logra de forma eficaz mediante la fusión de la célula ME no humana con esferoplastos de levadura que contienen YACs que portan el ADN de 100 kb y un marcador seleccionable, en condiciones que permitan la integración del ADN de YAC que contiene el marcador en un genoma de célula ME no humana, o mediante la transfección de un YAC purificado en células ME no humanas. Las células ME no humanas que comprenden el YAC integrado en el genoma son seleccionadas a continuación por medio de un marcador, que es funcional en la célula ME no humana. Por ejemplo, se puede usar el gen de hipoxantina fosforibosilo transferasa (HPRT) como marcador en células ME deficientes en HPRT (HPRT-). Para producir animales a partir de células madre embrionarias no humanas, después de la transformación, las células pueden colocarse en una capa de alimentador en un medio apropiado, por ejemplo DMEM potenciado con suero bovino fetal. La células ME no humana puede tener un locus diana sencilla (heterocigoto), o puede ser manipulada mediante el proceso de homogeneización para tener ambos locus como dianas (homocigoto). El proceso de homogeneización (formación de homocigotos) usa presión selectiva para extraer del cultivo las células que tengan el suceso de selección de genes en ambos cromosomas. Las células que contienen los dos alelos diana pueden detectarse empleando un medio selectivo y después del tiempo suficiente para que las colonias se desarrollen, las colonias pueden seleccionarse y analizarse para detectar la presencia de integración o de recombinación homóloga. Tal como se ha descrito previamente, se puede usar PCR, con cebadores dentro o fuera de la secuencia de construcción, pero en el locus diana.
La presente invención también proporciona un método para producir un mamífero quimérico no humano que tenga al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana integradas de forma estable en el genoma de al menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a)
producir una célula ME de mamífero no humano de la presente invención; y
(b)
transferir la célula embrionaria seleccionada a un blastocisto de anfitrión no humano, implantar el blastocisto en un receptor mamífero no humano pseudos-embarazado, y permitir que el blastocisto se desarrolle hasta el final para producir el mamífero quimérico no humano.
La presente invención también proporciona un mamífero quimérico no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana integrados de forma estable en el genoma de al menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el mamífero quimérico no humano es producido mediante el método de la presente invención para producir un mamífero quimérico no humano.
Las colonias que muestran recombinación homóloga pueden usarse para la manipulación de embriones no humanos y para la inyección de blastocistos no humanos. A continuación las células ME no humanas son introducidas en embriones no humanos, mediante microinyección o por otros medios, en el anfitrión no humano apropiado. Por ejemplo, se pueden obtener blastocistos murinos a partir de animales femeninos lavando el útero 3,5 días después de la ovulación. Entonces las células ME modificadas no humanas son tripsinizadas y al menos entre 1 y hasta 15 células son inyectadas en el blastocoel del blastocisto no humano. Después de la inyección, al menos 1, y no más de aproximadamente 10 de los blastocistos se devuelven a cada cuello uterino de hembras pseudopreñadas. Las hembras llegan a término y los animales quiméricos no humanos pueden analizarse para detectar la presencia del YAC en sus células somáticas. Por "quimérico" se entiende un animal no humano que porta células derivadas de más de una fuente, por ejemplo del anfitrión y de otro animal. Por ejemplo, en la presente invención un animal murino quimérico contiene una modificación de ingeniería genética, particularmente un gen humano, en algunas de sus células, por ejemplo en células que se desarrollan a partir de células madre embrionarias modificadas. Entonces se analiza la presencia del YAC integrado en los anfitriones quiméricos generados. Se evalúa la transmisión por apareamiento de la línea germinal del genoma de célula ME en los anfitriones quiméricos, por ejemplo se aparean ratones quiméricos con ratones C57BL/6J. Los anfitriones quiméricos pueden reproducirse con anfitriones no quiméricos, tanto singénicos como alogénicos, para escrutar las quimeras que porten el YAC en sus líneas germinales. Los descendientes que son heterocigotos para la modificación genética son cruzados para producir una progenie que sea homocigoto para la modificación, transmitiendo de forma estable la construcción YAC activa a su progenie.
El método de la invención para producir un mamífero quimérico no humano, particularmente un roedor y habitualmente un animal murino, proporciona una integración estable del ADN. Los genes del ADN insertado son funcionales y los anfitriones quiméricos no humanos son capaces de proporcionar la transmisión de línea germinal del ADN integrado. Tras la reproducción del anfitrión quimérico, se producen anfitriones transgénicos no humanos heterocigotos y son apareados para producir un animal no humano homocigoto que puede usarse para una amplia variedad de propósitos, que incluye la producción de productos, tales como proteínas de unión, por ejemplo inmunoglobulinas, para escrutar diversos fármacos, para terapia génicas, por ejemplo para complementar trastornos genéticos recesivos, para estu-
diar diversas enfermedades, para estudiar la función y la regulación de grandes fragmentos de ADN poco conocidos.
La presente invención también proporciona un método para producir un mamífero transgénico no humano, y su progenie, que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integradas de forma estable en el genoma de sus células somáticas y germinales, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
(a)
producir un mamífero quimérico no humano de la presente invención; y
(b)
reproducir el mamífero quimérico no humano según sea necesario para producir el mamífero transgénico no humano y su progenie.
Además, la presente invención proporciona un mamífero transgénico no humano y su progenie que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integradas de forma estable en el genoma de sus células somáticas y germinales, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el mamífero no humano es producido por el método de la presente invención para producir mamíferos transgénicos no humanos y su progenie.
En una realización preferida del método de la presente invención, la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma humano 14 de los genes del segmento D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes del segmento J y los genes de región constante a través del C\mu de dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye una región constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al menos un gen de segmento V humano.
En otra realización preferida del método de la presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado.
En una realización más preferida del método de la presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus es desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
En una realización preferida de la presente invención, la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana de la célula ME no humana o de la célula ME de mamífero no humano es una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN de la línea germinal del cromosoma humano 14, desde los genes del segmento D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes del segmento J y de los genes de la región constante hasta C\mu de dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye una región constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al menos un gen de segmento V humano.
Además, en otra realización preferida de la presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada.
En una realización más preferida de la presente invención, el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización preferida de la presente invención, el genoma de las células del mamífero quimérico no humano que tiene una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada.
En una realización más preferida de la presente invención, el genoma de las células del mamífero quimérico no humano que tiene una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización preferida de la presente invención, el genoma de las células somáticas y germinales del mamífero transgénico no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado.
En una realización más preferida de la presente invención, el genoma de las células somáticas y germinales del mamífero transgénico no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno inactivo, en donde el locus está desactivado para evitar la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
En otra realización más preferida de los métodos de la presente invención, al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno es desactivado mediante la eliminación de todos los genes del segmento J.
Además, en una realización aún más preferida, al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno de célula ME no humana o de célula ME de mamífero no humano de la presente invención es desactivado mediante la eliminación de todos los genes del segmento J.
En otra realización más preferida del método de la presente invención al menos un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógeno es desactivado mediante eliminación del gen C_{\kappa}.
Finalmente, en una realización más preferida de la presente invención, al menos un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógeno de célula ME no humana o de célula ME de mamífero no humano es desactivado mediante la eliminación del gen C_{\kappa}.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración y no como limitación.
Parte experimental Ejemplo I I. Desactivación de los genes de cadena pesada J (J_{H}) de ratón A. Construcción del vector de desactivación dirigido
Se clona un fragmento Ncori de 6,4 kb que contiene los genes de cadena pesada J de ratón y las secuencias flanqueantes a partir de una biblioteca genómica de embriones de ratón Balb/c usando las sondas descritas en Sakano y col. (1981), Nature 290: 562-565. Dicho fragmento (mDJ) se inserta en un plásmido pUCI9 digerido con EcoRI (pmDJ). Se elimina un fragmento de 2,9 kb que contiene los 4 genes J mediante digestión con XhoI-ScaI (pmD\deltaJNeo, véase la Figura 1). Se aísla un fragmento de XhoI-BamHI de 1150 pb a partir de pMCINeo, que contiene un gen de resistencia a neomicina dirigido por el promotor de gen de timidina quinasa del virus de Herpes simple (HSV-tk) y un potenciador de polioma (Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51, 503-512). Se añade un adaptador sintético a dicho fragmento para convertir el extremo BamHI en un extremo ScaI y el fragmento resultante se une al XhoI-ScaI pmD\deltaJ para formar el vector de desactivación (pmD\deltaJ.Neo) en el que la orientación 5' a 3' de la neomicina y de los promotores de cadena pesada es idéntica. Este plásmido es linealizado mediante digestión NdeI antes de su transfección a células ME. Las secuencias que conducen el evento de recombinación homóloga son fragmentos de 3 kb y de 0,5 kb, localizados a 5' y 3' respecto del gen de neomicina, respectivamente.
B. Cultivo, Electroporación y Selección de Células ME
La línea de células ME E14TG2a (Hooper y col. (1987), Nature, 326: 292-295) se cultiva sobre capas de alimentador de fibroblasto embriónico primario tratadas con mitomicina esencialmente como se ha descrito (Doetschman y col. (1985), J. Embryol. Exp. Morphol. 87: 27-45). Los fibroblastos embriónicos se preparan a partir de embriones de hembras C57BL/6 que han sido apareadas entre 14 y 17 días antes con machos homocigotos para un transgén de neomicina (Gossler y col. (1986), PNAS 83: 9065-9069). Estas células son capaces de crecer en un medio que contiene G418. Las condiciones de electroporación se describen en Boggs y col. (1986), Ex. Hematol. (NY) 149: 988-994. Las células ME son tripsinizadas, resuspendidas en medio de cultivo a una concentración de 4x10^{7}/mL y electroporadas en presencia de la construcción de ADN dirigido a una concentración 12 nM en el primer experimento y 5 nM en el segundo. El voltaje óptimo es de 300 V con una capacitancia de 150-250 \muF con una célula de electroporación de 5 mm de longitud y 100 mm^{2} de sección transversal. Se llevan a placa 5x10^{6} células electroporadas sobre fibroblastos tratados con mitomicina en platos de 100 mm en presencia de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 15% de suero fetal bovino (FBS) y con 2-mercaptoetanol 0,1 mM. El medio se cambia 24 horas después de la electroporación por otro medio que contiene 200 \mug/mL de G418.
Se seleccionan las colonias de células ME que resultan 10-14 días después de la electroporación con pipetas capilares de extracción para realizar análisis de PCR. La mitad de las colonias seleccionadas se guarda en placas de 24 pocillos ya sembradas con células alimentadoras tratadas con mitomicina. La otra mitad, combinadas en grupos de 3-4, es transferida a tubos Eppendorf que contienen aproximadamente 0,5 mL de PBS y es analizada para determinar recombinación homóloga mediante PCR. Las condiciones de las reacciones PCR son esencialmente como se ha descrito previamente (Kim y Smithies (1988), Nucleic Acid Res. 16: 8887-8893). Después de formar una partícula, las células ME son resuspendidas en 5 \muL de PBS y son lisadas mediante la adición de 55 \muL de H_{2}O a cada tubo. Se desactivan las ADNasas calentado los tubos a 95ºC durante 10 minutos. Tras un tratamiento con proteinasa K a 55ºC durante 30 minutos, se transfieren 30 \muL de cada lisato a un tubo que contiene 20 \muL de una mezcla de reacción que incluye tampón de PCR: 1,5 \mug de cada cebador, 3 U de Taq polimerasa, un 10% de DMSO y dNTPs, a 0,2 mM. La expansión PCR emplea 55 ciclos usando un termociclador con 65 segundos fundido a 92ºC y un tiempo de recocido y extensión de 10 minutos a 65ºC. Los dos oligonucleótidos de cebado son TGGCGGACCGCTATCCCCCAGGAC y TAGCCTGGGTCCCTCCTTAC, que corresponden respectivamente a una región a 650 bases 3' del codón de inicio del gen de neomicina y de las secuencias localizadas en el gen de cadena pesada de ratón, a 1100 bases 3' de la posición de inserción. Se someten a electroforesis 20 \muL de la mezcla de reacción en geles de agarosa y se transfieren a membranas de nylon (Zeta Bind). Los filtros se sondan con un fragmento marcado con ^{32}P del fragmento XbaI de 991 pb de la región J-C.
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Ejemplo II II. Eliminación de los genes de cadena pesada J (J_{H}) de Ig de ratón en células ME A. Construcción del vector de sustitución dirigido
Se digirió un fragmento EcoRI de 6,1 Kb, que contiene los genes de región J de cadena pesada de inmunoglobulina de ratón y las secuencias flanqueantes, clonado a partir de una biblioteca genómica de embriones de ratón BALB/c y insertado en pUC18 (pJ_{H}), con XhoI y NaeI para eliminar un fragmento de aproximadamente 2,3 kb que contiene los cuatro genes J (véase la Figura 2A). Un fragmento XhoI-BamHI de aproximadamente 1,1 kb, tratado en la posición BamHI, que contiene un gen de resistencia a neomicina conducido por un promotor de gen de timidina quinasa de virus de Herpes simple (HSV-tk) y un potenciador de polioma, fue aislado a partir de pMC1Neo (Thomas y Capecchi (1987), Cell, 51, 503-512). Este fragmento se insertó en el pJH borrado con XhoI-NaeI para formar el vector de eliminación (pmH\deltaJ, véase la Figura 2B), en donde la orientación transcripcional de los genes de neomicina y de cadena pesada es la misma. Este plásmido fue linealizado mediante digestión NdeI antes de su transfección a células EM. Las secuencias que conducen el evento de recombinación homóloga son fragmentos de aproximadamente 2,8 kb y aproximadamente 1,1 kb, localizados 5' y 3' respecto al gen de neomicina, respectivamente.
B. Cultivo, Electroporación y Selección de células ME
La línea de células ME E14TG2a (Koller y Smithies (1989), PNAS USA, 86: 8932-8935) se cultivó en capas de alimentador de fibroblasto embriónico tratado con mitomicina C, tal como se ha descrito antes (Koller y Smithies (1989), PNAS USA, 86: 8932-8935). Las células ME fueron tripsinizadas, resuspendidas en tampón HBS (pH 7,05; NaCl 137 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 2 mM, Na_{2}HPO_{4} 0,7 mM, HEPES 21 mM, pH 7,1) a una concentración de 2x10^{7}/mL, y se electroporaron en presencia de 50 \mug/mL del vector de desactivación linealizado. La electroporación se llevó a cabo con BioRad Gene Pulser usando 240 voltios y 500 \muF de capacitancia. 5x10^{6} células electroporadas se llevaron a placa sobre fibroblastos tratados con mitomicina C en platos de 100 mm en presencia de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 15% de suero bovino fetal y 2-mercaptoetanol 0,1 mM. El medio fue reemplazado 24 h después de la electroporación con medio que contenía 200 \mug/mL de G418. Las colonias ME resistentes a G418 resultantes del cultivo durante 12-14 días tras la electroporación fueron seleccionadas con pipetas capilares de extracción para su análisis usando la reacción en cadena de polimerasa (PCR). La mitad de cada colonia seleccionada fue transferida a un pocillo individual de una placa de 24 pocillos, previamente sembrada con células alimentadoras tratadas con mitomicina C. Las otras mitades, combinadas en grupos de cuatro, fueron transferidas a tubos Eppendorf que contenían 0,3 mL de PBS, y se prepararon lisatos celulares para el análisis PCR tal como se describe en Joyner y col. (1989) Nature, 338: 153-155. La reacción PCR incluyó 5-20 \muL del lisato celular, 1 \muM de cada cebador, 1,5 U de polimerasa Taq y 200 \muM de dNTPs. La amplificación PCR empleó 45 ciclos usando un ciclador térmico (Perkin-Elmer Cetus), con 1 minuto de fusión a 94ºC, 2 minutos de recocido a 55ºC y 3 minutos de extensión a 72ºC. Los dos nucleótidos de cebado son ACGGTATCGCCGCTCCCGAT y AGTCACTGTAAAGACTTCGGGTA, que corresponden respectivamente a aproximadamente 120 bases 5' respecto a la posición BamHI del gen de neomicina, y a las secuencias localizadas en el gen de cadena pesada de ratón, aproximadamente a 160 bases 3' de la posición de inserción. La recombinación homóloga exitosa da lugar a un fragmento de aproximadamente 1,4 kb. Se someten a electroforesis 20 \muL de la mezcla de reacción sobre geles de agarosa al 1%, se tiñen con bromuro de etidio y se transfieren a membranas de nylon (Gene Screen). Los filtros fueron sondados con un fragmento EcoRI-PstI marcado con ^{32}P de aproximadamente 1,4 kb localizado en la cadena pesada de ratón, 3' respecto a la posición de inserción (véase la Figura 2). Para análisis posteriores, se preparó ADN genómico a partir de células ME, se digirió con enzimas de restricción tal como recomiendan los fabricantes, y se separó el fragmento con geles de agarosa al 1%. El ADN fue transferido a membranas de nylon (Gene Screen) y se sondó con el fragmento marcado con ^{32}P descrito antes.
C. Análisis de colonias ME resistentes a G418
En el primer experimento, el análisis PCR de las colonias reunidas detectó una señal PCR positiva del tamaño esperado (aproximadamente 1,4 kb) entre los 34 grupos que representaban 136 colonias resistentes a G418. Las cuatro colonias individuales que habían contribuido a este grupo positivo fueron analizadas individualmente mediante PCR, y se identificó un clon positivo, ES33D5. Un análisis similar de las 540 colonias resistentes a G418 obtenidas en el segundo experimento dio lugar a 4 clones positivos adicionales (ES41-1, ES61-1, ES65-1, ES110-1).
A fin e verificar la alteración dirigida de una copia de los genes J (el gen es autosomal y por tanto está presente en dos copias), los clones positivos en PCR fueron expandidos y se preparó ADN genómico, se digirió con HindIII o con SacI y se analizó mediante análisis de transferencia Southern tal como se ha descrito para el uso de sonda EcoRI-PstI.
La sustitución de los genes J mediante inserción del gen de neomicina mediante un evento de recombinación homóloga da como resultado un fragmento HindIII, detectable con la sonda EcoRI-PstI, que es aproximadamente 1,9 kb más larga que el fragmento equivalente en el locus nativo, debido a la pérdida de dos posiciones HindIII localizadas en la región de gen J eliminada (véase la Figura 2C). El análisis de transferencia Southern de los 5 clones positivos mediante digestión HindIII proporcionó una tendencia que indicó que una de las dos copias de los genes de cadena pesada J había sido alterada. Se detectaron tres fragmentos marcados: un fragmento (de aproximadamente 760 pb), idéntico en tamaño al presente en las células no tratadas con la misma intensidad, un fragmento (de aproximadamente 2,3 kb) idéntico en tamaño al presente en las células no tratadas, pero con menor intensidad en el clone positivo en PCR, y un fragmento adicional de aproximadamente 4,2 kb, el tamaño predicho para un evento de recombinación homóloga, presente solo en los clones positivos en PCR. De forma similar, la sustitución de los genes J por el gen de neomicina mediante un evento de recombinación homóloga da como resultado la pérdida de una posición SacI y la aparición de un fragmento, detectable con la sonda EcoRI-PstI, que es aproximadamente 570 pb más pequeño que el fragmento equivalente del locus nativo (véase la Figura 2C). El análisis de transferencia Southern de los clones mediante digestión con SacI proporcionó el resultado esperado de un alelo nativo y un alelo diana: fragmento de aproximadamente 4,0 kb, idéntico en tamaño al detectado en las células no tratadas, pero de menor intensidad en los 5 clones positivos, y un fragmento adicional de aproximadamente 3,4 kb, el tamaño predicho para un evento de recombinación homóloga dirigida, presente sólo en los clones identificados. La rehibridación de las manchas Southern con una sonda para el gen de neomicina demostró que sólo los fragmentos de 4,2 kb y de 3,4 kb, resultantes de las digestiones con HindIII y SacI, respectivamente, se hibridaron a la sonda tal como había predicho el evento dirigido.
D. Generación de ratones quiméricos con eliminaciones J_{H}
Se obtuvieron blastocistos de C57BL/6J (Jackson Laboratorios, Bar Harbor, ME) de tres días y medio de edad a partir de hembras superovuladas de 4-5 semanas de edad tal como se describe en Koller y col. 1989 (ver anterior). Las células ME fueron tripsinizadas, lavadas una vez con medio DMEM fresco, y diluidas hasta 1 X 10^{6}/mL en medio DMEM que contiene un 10% de suero bovino fetal y HEPES 20 mM, pH 7,5. Se inyectaron de 10 a 15 células en el blastocoel para cada blastocisto. A continuación, los blastocistos que contienen células ME fueron transferidos quirúrgicamente a un cuello uterino de hembras C57BL/6J X DBA/2 ó C57BL/6J X CBA F1 pseudopreñadas.
La contribución de las células ME a la descendencia se evaluó visualmente mediante examen del color de la piel de las crías. Los ratones C57BL/6J son de color negro sólido. La línea celular parental ME E14TG2a se aisló a partir de embriones 129/Ola, que portan tres genes de color de piel, el alelo dominante A^{W} en el locus de agouti, el alelo recesivo diluido de ojos rosa en el locus p, y el C^{ch} recesivo en el locus c. Los descendientes quiméricos en los que participaron las células ME en la formación del animal presentan pieles que contienen pelo agouti y crema.
La capacidad de transmisión de la línea germinal de los ratones quiméricos se evaluó apareando con ratones C57BL/6J y puntuando para descendiente F1 con color agouti. Sería de esperar que el 50% de estos ratones agouti heredaran el alelo mutado de cadena pesada, que puede identificarse mediante análisis de transferencia Southern de ADN aislado de las colas.
La línea celular ME ES65-1 tratada con J_{H}, que porta un alelo de cadena pesada diana, fue inyectada en blastocistos de ratón C57BL/6J. Aproximadamente el 45% de las crías supervivientes eran quimeras. Dos hembras quiméricas, 238-2 y 244-3, tras apareamiento con machos C57BL/6J, dieron lugar a transmisión de la línea germinal con una frecuencia del 100% y del 15%, determinado por el porcentaje de descendientes agouti. El análisis de transferencia Southern del ADN procedente de descendientes heterocigotos indicó la presencia de la cadena pesada diana además de un alelo nativo en 2 de cada 5 descendientes agouti evaluados.
Los ratones homocigotos para la mutación fueron obtenidos mediante reproducción cruzada de ratones machos y hembras que fueron identificados como heterocigotos con J_{H} eliminado (\deltaJ_{H}). Los descendientes de dichos apareamientos fueron analizados para determinar la presencia de dos alelos diana de cadena pesada mediante análisis de transferencia Southern.
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E. Análisis de células B procedentes de ratones quiméricos
Si la eliminación de la región J_{H} es suficiente para desactivar el locus de cadena pesada, entonces daría como resultado un completo bloqueo del desarrollo de células B que expresan IgM y de la producción de anticuerpos. Los ratones que son heterocigotos en el locus J_{H} portan un alelo de cadena pesada funcional e intacto, derivado de los ascendientes C57BL/6J, y un alelo de cadena pesada con J_{H} eliminado que deriva de las células ME (cepa 129/Ola). Las cepas 129 y B6 difieren en los alotipos de cadena pesada de Ig. Las células B derivadas de ME (alotipo IgM^{a}) pueden distinguirse de las células B derivadas de B6 (alotipo IgM^{b}) con anticuerpos monoclonales específicos de alotipo, usando análisis de citometría de flujo de B que expresan anticuerpos.
La especificidad de dichos anticuerpos se muestra en la Figura 3 (A-C). Se tiñeron linfocitos sanguíneos periféricos con anticuerpos para el marcador específico de células B, B220, y con anticuerpos para el alotipo IgM. Células B procedentes de ratones C57BL/6J teñidas con anticuerpos dirigidos contra el alotipo IgM^{b} pero no contra el alotipo IgM^{a} (Figura 3B). Células B procedentes de ratones 129/Ola teñidas con anticuerpos dirigidos contra el alotipo IgM^{a} pero no contra el alotipo IgM^{b} (Figura 3A). En ratones heterocigotos (a/b F1) que portan un alelo de cadena pesada derivado de ME intacto y un alelo de cadena pesada derivado de C57BL/6J intacto, ambos alotipos estaban presentes en cantidades iguales (Figura 3C).
Cuando se analizaron células B de ratones que eran heterocigotos para la eliminación de J_{H}, en las que el alelo de cadena pesada de J_{H} eliminado procedía del ascendente 129/Ola, no había células positivas para el alotipo IgM^{a}. Todas las células B fueron positivas para IgM^{b}, del alelo de cadena pesada de C57BL/6J intacto (Figura 3D). Estos resultados indicaron que el locus de cadena pesada con J_{H} eliminado está desactivado y no puede codificar un anticuerpo IgM funcional.
Los ratones que eran homocigotos para la eliminación J_{H} también fueron analizados para determinar su capacidad para producir anticuerpos funcionales. Se analizaron linfocitos sanguíneos periféricos procedentes de ratones mutantes homocigotos mediante citometría de flujo, usando anticuerpos para el marcador B220 específico de células B, y con los marcadores específicos de alotipo (véase la Figura 4). Al contrario que con los ratones de control (Figura 4D-F), no pudieron detectarse células B220+ ó células productoras de IgM en los ratones mutantes (Figura 4A-C). Además, los ratones mutantes no presentaron IgM detectable en el suero. Estos resultados indican que la eliminación de la región J_{H} de ambos alelos de cadena pesada conduce a la completa inhibición del desarrollo de células B hasta células B maduras y la producción de anticuerpos.
F. Generación de células ME mutantes homocigotas
El efecto de la eliminación de JH en células B también puede analizarse generando células ME con ambos alelos diana de cadena pesada, que son usados entonces para producir ratones quiméricos que contienen una población de células linfoides homocigotos para la mutación.
Se generaron células ME mutantes \deltaJ_{H} homocigotos sometiendo uno de los clones ME mutante heterocigoto, el ES110-1, a niveles elevados de G418 (1,4 mg/mL) seleccionado de este modo para la homogeneización del alelo diana. Se escrutaron siete de las colonias supervivientes mediante análisis de transferencia Southern usando digestión con SacI para determinar la pérdida de alelo de cadena pesada natural y la adquisición de un segundo alelo diana. Uno de estos clones, el ESDK207, presentó una perdida del alelo de cadena pesada nativo, tal como se evidenció por la incapacidad de las sondas para detectar el fragmento natural de 4,0 kb y por el aumento de la intensidad del fragmento diana de 3,4 kb. El análisis cariotípico de ESDK207 indicó que, como la línea parental ES110-1, aproximadamente el 80% de las células tenía 40 cromosomas, lo que sugiere la presencia de dos alelos diana. Las células ME mutantes homocigotos fueron microinyectadas en blastocistos de C57BL/6J y se generaron ratones quiméricos.
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G. Análisis de células B procedentes de quimeras homocigotas
Se analizaron las células B de ratones quiméricos para determinar el efecto de la eliminación de J_{H} sobre el desarrollo de células B y la producción de anticuerpos. Los linfocitos procedentes de la línea de células ME (129/Ola) pueden distinguirse de los linfocitos derivados de blastocistos (C57BL/6J) mediante un anticuerpo monoclonal para el marcador Ly-9.1, que se encuentra en los linfocitos de origen 129, pero no en los de origen B6. Adicionalmente, las dos cepas difieren en su alotipo IgM, tal como se ha descrito previamente.
Las quimeras analizadas habían derivado de células ME naturales E14TG2a (WT), o de células ME que eran heterocigotos (ES110-1, ES65-1) u homocigotos (ESDK207) en la región J_{H} diana. Las células mononucleares sanguíneas periféricas fueron teñidas con anticuerpos para el marcador B220 específico de células B, y con anticuerpos para cualquier de los alotipos Ly-9.1 o IgM, y a continuación fueron analizadas mediante citometría de flujo bicolor. Para evaluar el quimerismo del linaje de células T, las células fueron teñidas con anticuerpos para el marcador de células T Thy 1.2, y con anticuerpo anti-Ly-9.1. La tinción de las células procedentes de cepas parentales de ratones proporcionó controles para la especificidad y la sensibilidad del ensayo.
Se compararon ratones con grados similares de quimerismo, según el color de la piel. Se detectaron células B y T derivadas de ME en la sangre periférica de ratones quiméricos generados a partir de células ME E14TG2a naturales, lo que confirma la capacidad de esta línea celular para proporcionar un aumento de las células linfoides in vivo. El análisis de quimeras generadas a partir de células sencillas ES65-1 y ES110-1 con J_{H} tratado demostró la presencia de células B B220^{+}/IgM^{a+}/Ly-9.1 que contenían un único locus intacto de cadena pesada de Ig derivado de célula ME.
Al contrario que las quimeras WT y de eliminación sencilla, los ratones generados a partir de la línea mutante ESDK207 homocigota carecían de células B Ly-9.1^{+}/B220^{+} ó IgM^{a+}/B220^{+}1 en la sangre periférica. La carencia observada de células B derivadas de ESDK207 no se debió a una falta de linfopoiesis, ya que las células Ly-9.1^{+}/B220 derivadas de ME representaron el 12% del conjunto total de células mononucleares sanguíneas periféricas. De estas, aproximadamente la mitad eran células T Thy-1.2^{+}. Por tanto, la eliminación de la región J_{H} de ambos alelos bloquea el desarrollo de células B maduras que producen IgM^{a}. Se obtuvieron observaciones similares con las células de bazo quimérico.
También se evaluó la presencia de IgM en suero derivado de células ME en las quimeras. Los niveles de IgM^{a} fueron elevados en las quimeras procedentes de células ME naturales y en células con una mutación diana sencilla, pero fueron indetectables en ratones derivados de la línea celular ESDK207.
Un análisis más profundo demostró que la médula ósea de ratones ESDK207 contenía células B IgM^{b+} normales derivadas de los blastocistos del anfitrión, pero carecía de células B IgM^{a+} derivadas de ME. Sin embargo, la médula ósea derivada de DK207 no contenía una población de células que fuera B220^{dull}/Ly-9.1^{+} derivada de células ME. Por tanto, la médula ósea probablemente contiene una subpoblación de precursores de células B derivadas de ME, cuya maduración está bloqueada por la eliminación homocigota de la región J_{H}.
Las células de médula ósea también fueron analizadas con citometría de flujo tricolor, usando anticuerpos para Ly-9.1, B220 y tanto CD43 como Thy-1.2. Los resultados muestran que la mayoría de las células derivadas de ME eran CD43 positivas, lo cual es consistente con un bloqueo temprano de la maduración. Muchas de las células también eran positivas para Thy-1.2, como cabría esperar de precursores de células B muy tempranos. Estos datos muestran que la eliminación de la región J_{H} da como resultado la incapacidad del locus de cadena pesada para reorganizar y producir IgM funcional. La carencia de una reorganización de IgH da como resultado el bloqueo de la maduración de células B, restringiendo a los progenitores de células B a una etapa temprana de desarrollo.
Ejemplo III Eliminación de la región de cadena constante (C_{K}) de cadena ligera de Ig kappa A. Construcción del vector de sustitución dirigido
La región kappa se desactivó con un vector de tipo de sustitución, que fue diseñado para eliminar la región constante del locus kappa, y para reemplazarlo con el marcador de resistencia a fármaco G418 mediante recombinación homóloga. La recombinación homóloga fue conducida por regiones de homología que flanquean la región constante (véase la Figura 5).
Se escrutó una biblioteca genómica de ADN de hígado fetal de ratón 129/Ola (Stratagene) clonado en fago lambda para determinar la presencia del gen C_{\kappa} de ratón con fragmento HpaI/BamHI de aproximadamente 1,6 kb (Steinmetz y Zachau (1980) Nucleic Acids Research 8: 1693-1706) que extiende la región constante kappa de ratón. Se identificó un clon de fago lambda que se hibridó a esta sonda, a continuación se purificó y se usó como fuente de ADN de C_{\kappa}. El análisis del ADN de fago mostró que la sonda de región constante kappa se hibridó a un fragmento SphI/BamHI de 5,6 kb. Dicho fragmento contenía los genes de región J kappa, un elemento potenciador intrónico y la región constante kappa. Entonces se aisló y subclonó en las posiciones SphI y BamHI del plásmido pUC218 para dar lugar al plásmido pUC218/5.6kappa.
A fin de construir el vector de eliminación, los fragmentos que contienen la región 5' de la región constante kappa, un gen de timidina quinasa para selección negativa, un gen de resistencia a neomicina y una región 3' de homología con la región constante kappa, fueron ligados juntos (véase la Figura 6).
Se subclonó un fragmento SphI/Bsu361 de 4,0 kb procedente del plásmido pUC218/5.6kappa en las posiciones SphI y Bsu361 del vector pSK.A para dar lugar al plásmido pSK.A/5'K. El vector pSK.A es una modificación de pBluescript SK- que tiene un poliligando sintético:
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insertado entre las posiciones pBluescript KpnI y SacI.
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Un fragmento EcoRI/HindIII de 2,7 kb que contiene el gen de timidina quinasa (TK) de herpes conducido por el promotor de gen de fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK) procedente del plásmido pKJtk (Tybulewicz y col. (1991) Cell 65: 1153-1163) se insertó en las posiciones EcoRI y NotI de pSK.A/5'K usando un adaptador HindIII/NotI con la secuencia:
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En el plásmido resultante, pSK.A/5'/TK, el extremo 5' del gen TK y el gen de región constante kappa están adyacentes uno al otro, con orientaciones transcripcionales opuestas.
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Un fragmento XhoI/BamHI de 1,1 kb procedente de pMC1Neo, que contiene el marcador seleccionable de fármaco de mamífero para resistencia a neomicina, fue clonado en las posiciones XhoI y BamHI del plásmido pSK.B para dar lugar al plásmido pSK.B/Neo. El vector pSK.B es una modificación de pBluescript SK- que tiene un poliligando sintético:
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insertado entre las posiciones pBluescript KpnI y SacI.
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Un fragmento BgIII/BamHI de 1,1 kb procedente de pUC218/5.6kappa, que contiene homología con respecto al extremo 3' de la región kappa, fue clonado en vector pSK.C tratado con fosfatasa alcalina y digerido con BamHI. El vector pSK.C es una modificación de pBluescript SK- que tiene un poliligando sintético:
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insertado entre las posiciones pBluescript KpnI y SacI. El plásmido resultante, pSK.C/3'K está orientado de tal modo que la transcripción procede desde la posición SacI del plásmido poliligando en la dirección de la posición KpnI.
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El plásmido dirigido final fue construido con una ligación de tres partes, usando (A) un fragmento NotI/NdeI de 6,1 kb procedente de pSK.A/5'K/TK, (B) un fragmento NdeI/SacI de 1,2 kb procedente de pSK.B/Neo y (C) un fragmento SacI/NotI de 4,0 kb procedente de pSK.C/3'K ligados para formar el plásmido pK.TK/neo.
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B. Electroporación de vector de eliminación kappa en células ME
ADN de plásmido purificado procedente de pK.TK/Neo fue cortado con PvuI, extraído con fenol/cloroformo y precipitado en etanol. El ADN fue resuspendido después de la precipitación con una concentración de 1 mg/mL en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM.
Se cultivó la línea de células madre embrionarias E14-1, un subclon de E14 (Hooper y col. (1987) Nature 326: 292-295) en DMEM con 4,5 g/L de glucosa (J.R.H. Biosciences) suplementado con un 15% de suero fetal de ternero desactivado térmicamente, factor inhibidor de leucemia murina recombinante (ESGRO de Gibco BRL, 1000 U/mL), \beta-mercaptoetanol 0,1 mM, glutamina 2 mM y 100 U/mL de penicilina a 37ºC en un 5% de CO_{2}.
Las células fueron cultivadas en capas de alimentador de fibroblasto embriónico primario tratado con mitomicina esencialmente como se ha descrito (Koller y Smithies (1989), ver anterior). Se prepararon fibroblastos embriónicos a partir de embriones de 14 días que portan la mutación homocigota dirigida de \beta_{2}-microglobulina (Koller y Smithies (1990) Science 248: 1227-1230). Estas células alimentadoras son capaces de crecer en un medio que contiene G418.
Con una confluencia del 80%, se prepararon células ME para electroporación mediante tripsinización, concentración mediante una breve centrifugación y resuspensión en disolución salina tamponada con HEPES a 2 x 10^{7} células/mL. Las células son equilibradas a temperatura ambiente, y se añade ADN de vector dirigido linealizado (20 \mug). La mezcla fue sometida a electroporación a 960 \muF y a 250 V con un Pulsador BioRad Gene. Se dejó que las células se asentaran a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de llevarlas a platos de 4 x 10 cm de alimentadores de fibroblasto tratado con mitomicina (3 x 10^{6} células alimentadoras/plato). Después de incubar a 37ºC durante 48 horas, las células fueron alimentadas con medio que contiene 150 \mug/mL de G418 para seleccionar en función de la resistencia a neomicina. Después de otras 48 horas se alimentó a las células con un medio que contiene 150 \mug/mL de G418 y gancyclovir 2 \muM (Syntex) para seleccionar en función de la pérdida del gen de timidina quinasa.
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C. Análisis de células ME diana
Después de diez días de selección con fármacos con G418 y gancyclovir, se seleccionaron las colonias individuales supervivientes y se disociaron con una gota de tripsina en una placa de 96 pocillos, a continuación fueron incubadas a 37ºC durante 2 minutos. Las células de cada colonia fueron transferidas a un pocillo de una placa de 24 pocillos que contiene células alimentadoras tratadas con mitomicina C y medio selectivo con G418 pero no con gancyclovir. Después de otros 5-8 días, se congeló el 20% de las células de cada pocillo, y el resto se usó para preparar ADN genómico. Las células fueron lisadas con 0,4 mL de Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, SDS al 1% y proteinasa K (1 mg/mL) mediante incubación de una noche a 50ºC. El ADN fue purificado mediante extracción con fenol y precipitación en etanol, a continuación se lavó con etanol al 70% y se resuspendió en 20 \muL de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM.
Se llevó a cabo el análisis de transferencia Southern de cada muestra usando ADN genómico digerido con BgIII. Como sonda se usó un fragmento de aproximadamente 1,2 kb que contiene la región contigua al fragmento de homología 3' del vector dirigido. El locus de célula ME nativo proporcionó un fragmento de aproximadamente 2,3 kb, mientras que el locus de célula ME dirigida proporcionó un fragmento de aproximadamente 5,7 kb. El aumento de tamaño es debido a la pérdida de una posición BgIII durante la construcción del vector de eliminación.
Un análisis de transferencia Southern de 166 clones mostró dos líneas celulares que tenían la mutación pretendida. Dichos clones fueron analizados mediante un resondeo de los filtros con un fragmento de aproximadamente 1,1 kb que expande el gen neo. Como era de esperar, la sonda sólo se hibridó con el alelo diana.
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Un análisis adicional del ADN genómico procedente de los dos clones positivos, 1L2-850 y 1L2-972, después de ser congelado y expandido, reconfirmó las observaciones iniciales. Una tercera sonda, se usó un fragmento HindIII/BgIII de aproximadamente 1,7 kb que expande el locus de región J kappa para comprobar el correcto modelo de integración desde el extremo 5' del vector dirigido. Usando esta sonda con ADN genómico digerido con EcoRI, se detecta un fragmento de aproximadamente 1,5 kb en el alelo nativo, y un fragmento de aproximadamente 5 kb a partir del locus diana. La posición EcoRI adicional se introduce mediante el gen neo durante el tratamiento de recombinación homóloga (véase la Figura 7).
D. Generación de quimeras de línea germinal
Se ha descubierto que las células E14-1 no modificadas contribuyen a la línea germinal con una frecuencia elevada después de la inyección en blastocistos C57BL/6J. Para generar quimeras de líneas germinales que contienen la región kappa diana, las líneas celulares diana 1L2-850 y 1L2-972 fueron cultivadas en células alimentadoras primarias, a continuación fueron tripsinizadas y resuspendidas en medio de inyección, que consistía en DMEM suplementado con un 15% de suero fetal de ternera, HEPES 20 mM (pH 7,3), antibióticos y \beta-mercaptoetanol. Las células ME fueron inyectadas en cada blastocisto, y los blastocistos fueron transferidos a continuación a un cuello uterino de un ratón hembra pseudopreñado. Las crías quiméricas fueron identificadas a través del color quimérico de la piel. Los machos quiméricos fueron cruzados con hembras C57BL/6J, y se detectó la transmisión de la línea germinal de células ME derivadas de 129/Ola a través del color agouti de la piel de los descendientes.
Un macho quimérico de la línea celular 1L2-972 (derivado aproximadamente en un 40% de células ME según el color de su piel), tras apareamiento con hembras C57B1/6J dio lugar a la transmisión de la línea germinal con una frecuencia del 25%, determinada por el porcentaje de descendientes agouti. Los machos quiméricos, quiméricos en aproximadamente un 40%, un 70% y un 90%, de la línea celular 1L2-850 dieron lugar a transmisión de la línea germinal con frecuencias del 90%, 63% y 33%, respectivamente. Entre los descendientes agouti generados a partir de machos quiméricos al 70% de 1L2-850, se descubrió que ocho de cada 12 animales F1 evaluados eran heterocigotos en el locus kappa para la mutación dirigida C_{\kappa} mediante análisis de transferencia Southern (una digestión BgI II usando el fragmento Bam HI/BgI de 1,2 kb descrito antes como una sonda) usando ADN genómico derivado de muestras de cola. La reproducción posterior de un macho y una hembra de este grupo de 8 animales F1, ambos heterocigotos para la mutación C_{\kappa}, dio lugar a un descendiente hembra que era homocigoto para dicha mutación según se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.
E. Análisis de células B obtenidas de ratones tratados en el locus kappa
Si el locus de cadena ligera kappa (\kappa) está desactivado debido a la eliminación de la región constante de cadena ligera (C_{\kappa}), de la región de unión (J_{\kappa}), o de ambos C_{\kappa} y J_{\kappa}, entonces se produciría un completo bloqueo del desarrollo de las células B que expresan \kappa. Se introdujeron células madre embrionarias de ratón que contenían una única copia de la eliminación C_{\kappa} completa (\DeltaC_{\kappa}) en blastocistos de ratón tal como se ha descrito antes para producir ratones quiméricos. Entonces, dichos ratones quiméricos fueron apareados con ratones C57BL/6 (B6) naturales, y la progenie F1 fue evaluada para determinar la presencia de la mutación \DeltaC_{\kappa} mediante análisis de transferencia Southern de ADN de cola. Los ratones F1 que portaban la mutación \DeltaC_{\kappa} fueron apareados y los descendientes F2 fueron evaluados de forma similar para determinar \DeltaC_{\kappa}. Uno de 5 descendientes F2 portaba una eliminación C_{\kappa} homocigota, y otro era heterocigoto, portando ambos \DeltaC_{\kappa} y un alelo C_{\kappa} natural. Los otros 3 descendientes eran de tipo natural. La presencia o la ausencia de células B positivas en \kappa se evaluó mediante análisis de citometría de flujo de células B sanguíneas periféricas teñidas con anticuerpos fluorescentes que reaccionan con un marcador de células pan-B (B220) o con la cadena ligera \kappa. Para el ratón F2 homocigoto en \DeltaC_{\kappa} no se detectaron células B positivas en \kappa, y en el heterocigoto, se produjo una reducción en la frecuencia de células B positivas en \kappa, consistente con la presencia de un alelo natural y un alelo \DeltaC_{\kappa} no funcional. Estos resultados demuestran que la eliminación de C_{\kappa} del cromosoma previene la expresión de \kappa debida a células B de ratón.
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Ejemplo IV Desactivación de la región J y constante de cadena ligera kappa de inmunoglobulina de ratón A. Diseño del experimento dirigido
El vector dirigido se diseñó como un vector de tipo sustituto inicialmente para eliminar la región constante así como la región J del locus kappa, y para sustituirlo con tres elementos mediante recombinación homóloga usando regiones de homología que flanquean la región constante (Figura 8). En algunos casos se incluyó un gen de la toxina de difteria (cadena A) flanqueando una o las dos regiones de homología como marcador seleccionable negativo. Los tres elementos consistieron en el marcador de fármaco de resistencia a G418, una secuencia de homología de ADN (ADH) adicional de ADN de ratón homóloga a una región del locus kappa localizado por encima de la región J, y un gen de timidina quinasa. Como resultado de la inclusión de la secuencia ADH en el vector, este ataque inicial colocó una segunda copia del ADH en el locus. Esta duplicación fue usada a continuación para efectuar una eliminación definida de las secuencias entre los segmentos aplicando una presión selectiva. En este caso la célula elimina el gen de timidina quinasa que subyace entre los dos segmentos a fin de sobrevivir a la selección de gancyclovir.
B. Construcción del vector dirigido
Las regiones de homología fueron derivadas de una biblioteca genómica de hígado fetal de ratón 129 (Stratagene) que fue escrutada usando dos sondas, tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III. Este subclon contenía la región J, un elemento potenciador intrónico y la región constante del locus de cadena ligera kappa. La segunda sonda era un fragmento EcoRI de 0,8 kb (Van Ness y col. (1981), Cell 27: 593-602) que subyace a 2,8 kb por encima de la región J. El ADN de fago procedente de un clon lambda positivo para esta sonda mostró que la sonda se hibridaba con un fragmento SacI de 5,5 kb que fue subclonado en la posición SacI de pBluescript SK- (Stratagene) para dar lugar al plásmido pSK.5'kappa (Figura 8).
Los vectores de desactivación que contenían una región 5' de homología, un gen de timidina quinasa, una ADH, un gene de resistencia a neomicina y una región 3' de homología (Figura 9) flanqueados en algunos casos por genes de toxina de difteria fueron construidos a partir de tres plásmidos (Figura 8) que contenían: (a) el fragmento 5' de homología con o sin el gen de toxina de difteria (DT) conducido por el promotor de gen de fosfoglicerato quinasa (PGK) de ratón como marcador seleccionable negativo, (b) el gen de timidina quinasa (tk) de herpes conducido por el promotor de gen de fosfoglicerato quinasa (PGK) de ratón como marcador seleccionable negativo junto con el DSH y el gen seleccionable de neomicina (neo) de G418 de pMC1Neo (Thomas y Capecchi (1987), Cell 51: 503-12), y (c) el fragmento 3' de homología con o sin el gen DT conducido por PGK. Estos tres plásmidos (Figura 8) fueron construidos a partir de pSK.A, pSK.B y pSK.C, respectivamente, derivaron todos del plásmido pBluescript SK- mediante modificación del poliligando.
El poliligando del plásmido pBluescript SK fue modificado mediante clonación entre las posiciones KpnI y SacI un poliligando sintético definido por los oligonucleótidos 5'-GCATATGCCTGAGGGTAAGCATGCGGTACCGAATTC
TATAAGCTTGCGGCCGCAGCT-3' y 5'-GCGGCCGCAAGCTTATAGAATTCGGTACCGCATGCTTACCTCAGG
CATATGCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.A, 5'- GAGCTCGGATCCTATCTCGAGGAATTCTATAAGCTT
CATATGTAGCT-3' y 5'-ACATATGAAGCTTATAGAATTCCTCGAGATAGGATCCHA GCTCGTAC-3' para crear el plásmido pSK.8, 5'-AAGCTTATAGAATTCGGTACC TGGATCCTGAGCTCATAGCGGCCGCAGCT-3' para
crear el plásmido pSK. B y 5'- GCGGCCGCTATGAGCTCAGGATCCAGGTACCGAATTCTATAAGCTTGTAC-3' para crear el plásmido pSK. C.
Se creó una casete de gen de toxina de difteria en la que el gen estaba flanqueado por el promotor PGK y la señal de poliadenilación de hormona del crecimiento bovino (Woychik y col. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 81: 3944-3948; Pfarr y col. (1986) DNA 5: 115-122). Se clonó un fragmento XbaI/EcoRI de 2,3 kb de pTH-1 (Maxwell y col. (1986), Cancer Res. 46: 4660-4664) que contenía la cadena A de toxina de difteria conducida por el promotor de metalotioneína humana (hMTII) en pBluescript SK- cortado con XbaI y EcoRI para proporcionar el plásmido pSK.DT. El promotor hMTII de pSK.DT fue sustituido por el promotor PGK de pKJ1 (Tybulewicz y col. (1991), Cell 65: 1153-1163). Se unió un fragmento XbaI/PstI de 0,5 kb procedente de pKJ1 a un fragmento XbaI/NcoI de 3,1 kb procedente de pSK.DT usando un adaptador PstI/NcoI formado a partir de los nucleótidos 5'-GGGAAGCCGCCGC-3' y 5' CATGGCGGCGGCTTCCCTGCA-3' para proporcionar el plásmido pSK.pqkDT. Un fragmento de 248 pb que contiene la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino, obtenida mediante amplificación PCR de ADN genómico bovino usando los oligonucleótidos cebadores 5'-CAGGATCCAGCTGTGCCTTCTAGTTG-3' y 5'-CT
GAGCTCTAGACCCATAGAGCCCACCGCA-3', se clonó en PCR1000 (Invitron Corp., San Diego, CA). La secuencia de poliadenilación fue clonada entonces detrás del gen DT como un fragmento HindIII/PvuII en pSK.pgkDT cortado con HindIII y HpaI para dar lugar al plásmido pSK.pgkDTbovGH. La casete de gen DT de pSK.pgkDTbovGH fue trasladada como un fragmento EcoRI/HindIII de 2,1 kb a pSK.A cortado con EcoRI y NotI usando un adaptador HindIII/NotI formado a partir de los oligonucleótidos 5'-AGCTGGAACCCCTTGC-3' y 5'-GGCCGCAAGGGGTTCC-3' para generar el plásmido pSK.A/DT. Entre las posiciones SphI y Bsu36I del pSK.A y del pSK.A/DT se clonó la región 5' de homología para el locus kappa. Para este propósito se ligó un fragmento SphI/Bsu36I de 4,0 kb, resultante de una digestión parcial con Bsu36I seguida de una digestión completa con SphI de subclon de plásmido pUC218/5.6kappa, con pSK.A o con pSK.A/DT para generar los plásmidos pSK.A/5'K y pSK.A/DT/5'K, respectivamente. En el plásmido, pSK.A/DT/5'K, el extremo 5' del gen DT y el fragmento kappa estaban adyacentes uno al otro dispuestos en orientaciones transcripcionales opuestas.
El gen PGKtk del plásmido pKJtk (Tybulewicz y col. (1991), Cell 65: 1153-1163) fue clonado como un fragmento EcoRI/HindIII de 2,7 kb entre las posiciones únicas EcoRI e HindIII del pSK.B para generar pSK.B/(TK/0.8K) de tal modo que el extremo 5' del gen tk y el fragmento kappa estuvieran adyacentes el uno al otro y dispuestos en orientaciones transcripcionales opuestas. El gen neo de 1,1 kb de pMC1Neo fue clonado como un fragmento XhoI/BamHI entre las mismas posiciones de pSK.B(TK/0.8K) para generar pSK.B/(TK/0.8K/Neo). El plásmido pSK.C/3'K que contiene el fragmento 3' de homología fue construido ligando pSK.C digerido con BamHI y tratado con fosfatasa alcalina al fragmento BgIII/BamHI de 1,1 kb aislado a partir de pUC218/5.6kappa. En el pSK.C/3'K, el fragmento kappa fue orientado de tal modo que la transcripción se produjo desde el SacI del plásmido poliligando en la dirección de la posición KpnI. La casete DT de 2,1 kb de pSK.pgkDTbovGH fue clonada como un fragmento EcoRI/HindIII en las mismas posiciones de pSK.C para generar pSK.C/3'K/DT.
Se llevaron a cabo ligaciones de tres partes para construir los plásmidos dirigidos finales (Figura 9). El fragmento NotI/NdeI de 4,0 kb procedente de pSK.A/5'K, el fragmento NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de pSK.B/(TK/0.8K/Neo) (obtenido mediante una digestión parcial con SacI seguida de una digestión con NdeI del plásmido), y el fragmento SacI/NotI de 4,0 kb procedente de pSK.C/3'K, fueron aislados y ligados juntos para crear pK. (TK/0.8K/Neo). El fragmento NotI/NdeI de 6,1 kb procedente de pSk.A/DT/5'K, el fragmento NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de pSK.B/(TK/0.8K/Neo), y el fragmento NotI/NdeI de 4,0 kb procedente de pSK.C/3'K fueron aislados y ligados juntos para crear pK.DT/(TK/0.8K/Neo). El fragmento NotI/NdeI de 6,1 kb procedente de pSK.A/DT/5'K, el fragmento NdeI/SacI de 4,8 kb procedente de pSK.B/(TK/0.8K/Neo), y el fragmento SacI/NotI de 6,1 kb procedente de pSK.C/3'K/DT (obtenido mediante una digestión SacI parcial seguida de una digestión NotI del plásmido) fueron aislados y ligados juntos para crear pK.DT/(TK/0.8K/Neo)/DT. Para la electroporación, los ADNs de plásmido purificados fueron cortados en primer lugar con PvuI o con ApaLI, a continuación fueron extraídos con fenol/cloroformo y precipitados mediante adición de etanol antes de centrifugación. Las partículas de ADN resultantes fueron resuspendidas con una concentración de 1 mg/mL en Tris-HCl 10 mM, EDTA (TE) 1 mM.
C. Introducción de ADN en las células
La línea de células madre embrionarias E14-1 fue cultivada tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III. Las células fueron equilibradas a temperatura ambiente, y se añadió ADN (20 \mug) linealizado con PvuI (tal como se ha descrito antes). La mezcla fue sometida a electroporesis tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III.
D. Análisis de células ME con región constante diana
Tras 7-10 días bajo selección de fármaco con G418, las colonias individuales supervivientes fueron seleccionadas y disociadas en una gota de tripsina tal como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo III.
Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern usando ADN genómico digerido de cada muestra. Se detectó un fragmento de 2,3 kb del locus de células ME nativas, mientras que se detectó un fragmento mayor de 4,9 kb de un locus de células ME diana (Figura 11), usando como sonda el fragmento BamHI/BgIII de 1,2 kb aislado del ADN fago original contiguo con el fragmento usado para la homología 3' del vector dirigido. El fragmento aumentó de tamaño debido a que la posición BgIII del fragmento BgIII/BamHI se perdió en el plásmido dirigido debido a la unión de una posición BgIII a una posición BamHI en la ligación, y a que se introdujo una nueva posición BgIII localizada en el gen de timidina quinasa en el locus diana.
De un bazo, mediante el análisis de transferencia Southern descrito anteriormente, de un total de 103 clones derivados de experimentos que usan tres plásmidos dirigidos diferentes, se identificaron 5 líneas celulares que portaban la mutación pretendida (Tabla 1).
TABLA 1
1
Un análisis más profundo del ADN genómico producido a partir de 4 de los clones positivos (clones 625, 604, 611 y 653) después de ser descongelados y expandidos, reconfirmó las observaciones iniciales. Usando una segunda sonda, un fragmento HindIII/BgIII de 1,7 kb que extendía la región J del locus kappa, se comprobó el correcto modelo de integración para el ataque homólogo en el extremo 5' del vector dirigido. De este modo, usando dicha sonda con una digestión EcoRI del ADN genómico, se detectó un fragmento de 15 kb a partir del alelo no modificado. Por el contrario, se observó un fragmento de 7,8 kb del alelo diana como resultado de la introducción de una nueva posición EcoRI en el gen de timidina quinasa durante la integración homóloga (Figura 11).
E. Escisión in vitro de ADN de región J procedente de clones diana
A fin de efectuar la eliminación deseada del locus kappa diana de forma homóloga, se llevaron a placa células del clon 653 sobre células alimentadoras con una densidad de 0,5-1 x 10^{6} células/plato de 10 cm en presencia de gancyclovir (2 \muM) y G418 (150 \mug/mL). Después de un cultivo de 5 días en presencia de ambos fármacos, se seleccionaron los clones tal como se ha descrito antes en placas de 24 pocillos y se cultivaron únicamente bajo selección con G418. Después de otros 5-8 días, se congeló el 20% de las células de cada pocillo y el resto se usó para preparar ADN genómico tal como se ha descrito previamente.
F. Análisis de células ME con región constante/J eliminada
Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern usando ADN genómico digerido con BamHI para cada muestra. Usando como sonda el fragmento EcoRI de 0,8 kb usado como ADH en los vectores dirigidos, se detectó un fragmento de 12,7 kb procedente del locus de células ME nativas, a la vez que se detectó un fragmento mayor, de 15,8 kb, procedente del locus de células ME con región constante diana (Figura 11) usando ADN del clon 653. El fragmento aumentó de tamaño debido a la inserción del gen tk, el ADH y el gen neo en el fragmento BamHI de 12,7 kb. También había una nueva posición BamHI introducida en el extremo 3' del gen neo. Usando ADN de las células con región J/constante eliminada, se detectó un fragmento de 5,5 kb procedente del locus modificado, además del fragmento de 12,7 kb procedente del alelo no atacado tal como predecía el análisis del mapa de restricción. A partir de este escrutinio con análisis de transferencia Southern de 2 clones producidos a partir de 1,5 x 10^{6} células ME en placa (clon 653), se identificó una línea celular (clon 653B) que portaba la eliminación pretendida de las regiones J y constante.
Un análisis más profundo del ADN genómico producido a partir del clon 653B después de ser descongelado y expandido reconfirmó las observaciones iniciales. Usando el fragmento EcoRI de 0,8 kb, se comprobó la eliminación con otras dos digestiones de restricción que deberían cortar por fuera de la región escindida en los extremos 5' y 3' del vector dirigido. De este modo, usando dicha sonda con una digestión BgIII del ADN genómico procedente del clon 653 no escindido, se detectó un fragmento de 2,6 kb procedente de ambos alelos, el modificado y el no modificado, a la vez que se observó un fragmento adicional de 4,9 kb procedente únicamente del alelo diana (Figura 11). Este fragmento de 4,9 kb era el mismo que el detectado con el fragmento BamHI/BgIII de 1,2 kb usado previamente. Usando ADN del clon 653B, una digestión BgIII reveló un fragmento de 5,8 kb además del fragmento de 2,6 kb de ambos alelos, modificado y no modificado, y un fragmento de 3,1 kb procedente únicamente del alelo diana (Figura 11). El fragmento de 5,5 kb también fue detectado en ADN del clon 653B y un fragmento adicional de 2,0 kb. El fragmento BgIII de 5,8 kb y el fragmento ScaI de 2,0 kb fueron consistentes con un análisis del mapa de restricción predicho para una etapa de escisión precisa en la que 10,3 kb de ADN fueron eliminadas, incluyendo la región J, el gen tk y una copia del ADH.
G. Generación de Quimeras de Línea Germinal
Las células E14-1 no modificadas contribuyeron a la línea germinal con una elevada frecuencia después de la inyección en blastocistos C57BL/6J. Las células procedentes de la línea de células ME 691, en la que sólo se ha eliminado la región constante kappa mediante recombinación homóloga sin ninguna selección negativa, fueron microinyectadas y se produjeron animales quiméricos tal como se ha descrito en el anterior Ejemplo III. Las células procedentes de la línea de células ME 653B en la que se han eliminado ambas regiones, constante y J, también fueron microinyectadas y se produjeron animales quiméricos tal como se ha descrito anteriormente. Las crías quiméricas fueron identificadas mediante el color de la piel. La transmisión de la línea germinal de las células Me es detectada mediante el color agouti de la piel de los descendientes F1.
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Ejemplo V Clonación de Locus de Cadena Pesada Humano usando Cromosomas Artificiales de Levadura A. Producción de cadena pesada humana que contiene Cromosoma Artificial de Levadura (YAC)
Se aísla un fragmento SpeI, que expande la región VH6-D-J-C\mu-C\delta de cadena pesada humana (Berman y col. (1988), EMBO J. 7: 727-738; véase la Figura 15) de una biblioteca de YAC humano (Burke y col., Science, 236: 806-812) usando sondas de ADN descritas por Berman y col. (1988) EMBO J. 7: 727-738. Se obtiene un clon que se estima que es de aproximadamente 100 kb. El clon de YAC aislado es caracterizado mediante electroforesis de gel de campo pulsado (Burke y col., ver anterior; Brownstein y col., Science, 244: 1348-1351), usando sondas radiomarcadas para la cadena pesada humana (Berman y col., ver anterior).
B. Introducción de clones YAC en embriones o en células ME
Se prepara ADN de elevado peso molecular en pistones de agarosa a partir de células de levadura que contienen el YAC de interés (es decir, un YAC que contiene el anteriormente mencionado fragmento SpeI procedente del locus IgH). El ADN se fracciona en tamaño en un aparato de gel CHEF, y se corta la banda de YAC del gel de agarosa de bajo punto de fusión. El fragmento de gel es equilibrado con poliaminas y a continuación se funde y se trata con agarasa para digerir la agarosa. El ADN recubierto de poliaminas se inyecta a continuación en pronúcleos masculinos de embriones de ratón fertilizados que son introducidos quirúrgicamente en el útero de una hembra pseudopreñada tal como se ha descrito anteriormente. La naturaleza transgénica de los recién nacidos es analizada mediante slot-blot y se aísla ADN de las colas, y la producción de cadena pesada humana se analiza obteniendo una pequeña cantidad de suero y evaluándola para determinar la presencia de cadenas de Ig con anticuerpos anti-humanos de conejo.
Como alternativa a la microinyección, se transfiere ADN de YAC a células ME murinas mediante fusión célula ME:protoplasto de levadura (Traver y col. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 86: 5898-2902; Pachnis y col., (1990), Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 87: 5109-5113). En primer lugar, se inserta el gen de resistencia a neomicina procedente de pMC1Neo, o HPRT u otro marcador seleccionable de mamífero, y un marcador seleccionable de levadura en secuencias de vector de YAC no esenciales en un plásmido. Esta construcción se usa para transformar una cepa de levadura que contiene el YAC de IgH, y se integra pMC1Neo (u otro marcador seleccionable) en secuencias de vector del YAC de IgH mediante recombinación homóloga. A continuación el YAC modificado es transferido a una célula ME mediante fusión de protoplastos (Traver y col. (1989); Pachnis y col., 1990), y las células ME resistentes a G418 resultantes (o que exhiben otro fenotipo seleccionable), que contienen las secuencias de IgH humana intacta, son usadas para generar ratones quiméricos. Alternativamente, se transfecta un YAC purificado, por ejemplo mediante lipofección o transferencia de ADN mediada por fosfato cálcico, en células ME.
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Ejemplo VI Introducción de Genes de Ig Humana en Ratones A. Clonación de Genes de Ig Humana en Levadura 1. Identificación y caracterización de un clon de YAC de IgH humana que contiene secuencias VH, D, JH, mu y delta
Se usaron cebadores de PCR para el gen VH6 humano (V6A = 5' GCA GAG CCT GCT GAA TTC TGG CTG 3' y V6B = 5' GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTG G 3') para escrutar conjuntos de ADN procedentes de la biblioteca de YAC humano de la Universidad de Washington (Washington University, St. Louis, MO). Los conjuntos positivos fueron escrutados posteriormente mediante hibridación de colonia y se identificó un pocillo de placa de microtitulación positivo, A287-C10. Se aislaron dos YACs que contienen VH6 de dos tamaños diferentes (205 kb y 215 kb) a partir del pocillo de microtitulación. Además del VH6, el más pequeño de los dos YACs de IgH, A287-C10 (205 kb), se hibridó a sondas para las siguientes secuencias: delta, mu, JH, D, VH1, VH2 y VH4. El mayor de los dos YACs de IgH, A287-C10 (215 kb), se hibridó a las siguientes sondas: delta, JH, D, VH1, VH2 y VH4, pero no a mu. Los YACs contenían secuencias de al menos 5 genes VH incluyendo dos genes VH1, uno VH2, uno VH4 y uno VH6. El análisis de la digestión de restricción indicó que el YAC de 205 kb contiene una eliminación (de aproximadamente 20 kb de tamaño) que elimina parte, aunque no todo el racimo de gen D, apareciendo el resto del YAC intacto y en una configuración de línea germinal. El análisis de PCR y de digestión de restricción detallada del YAC de 205 kb demostró la presencia de varios miembros diferentes de la familia de genes D. El YAC de 215 kb parecía contener el principal racimo de gen D completo pero tenía una eliminación (de aproximadamente 10 kb) que eliminaba el gen mu. Esta eliminación no parece afectar al racimo JH o al potenciador localizado entre los genes JH y mu.
El progenitor putativo de los dos anteriores YACs de IgH relacionados, un YAC de aproximadamente 225-230 kb que contiene la región genómica completa entre el gen VH2 y el gen delta (Shin y col., 1991, ver anterior) (véase la Figura 15), no había sido identificado en el pocillo de microtitulación A287-C10. Por tanto, se examinó una alícuota anterior de la placa de microtitulación de A287-C10 con el fin de buscar el YAC progenitor asumiendo que se había perdido durante el pasaje de la biblioteca. El pocillo de microtitulación A287-C10 fue pasado rápidamente (Washington University, St. Louis, MO), y 2 de 10 clones analizados contenían un YAC de IgH de 230 kb con otro YAC aparentemente no relacionado. El clon 1 contenía además el YAC de IgH, un YAC de aproximadamente 220 kb, y el clon 3 contenía además un YAC de aproximadamente 400 kb. El YAC de IgH contenía mu, el perfil D completo (basado en una digestión BamHI, véase más adelante) y JH. El YAC de IgH del clon 1 fue separado físicamente del YAC no relacionado mediante segregación meiótica en un cruce entre A287-C10/AB1380 y YPH857 (genotipo = MATa ade2 lys2 ura3 trp1 HIS5 CAN1 his3 leu2 cyh2, para generar A287-C10 (230 kb)/MP 313 (genotipo anfitrión = MAT\alpha ade2 leu2 lys2 his3 ura3 trp1 can1 cyh2).
2. Ataque del YAC A287-C10 kb con un marcador seleccionable de mamífero, HPRT
Se generó un vector dirigido a brazo derecho de YAC denominado pLUTO (15,6 kb) mediante subclonación de un minigen de HPRT humano contenido en un fragmento BamHI de 6,1 kb (Reid y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 4299-4303 (1990)) en la posición BamHI del poliligando de pLUS (Hermanson y col., Nucleic Acids Research 19: 4943-4938 (1991)). Un cultivo de A287-C10/AB1380 que contiene el YAC de IgH de 230 kb y un YAC no relacionado fue transformado con pLUTO linealizado y se seleccionaron transformantes Lys+. Los clones Lys+ fueron escrutados mediante hibridación de colonia para determinar la presencia de mu. Se identificó un clon que contenía un único YAC de aproximadamente 245 kb que se hibridó a sondas para mu, HPRT y LYS2.
El análisis de transferencia Southern del YAC A287-C10 de 230 kb atacado con pLUTO se llevó a cabo usando una variedad de sondas para demostrar la naturaleza intacta y no redispuesta de las secuencias de IgH humana clonadas. En la mayoría de los casos, los resultados de las digestiones BamHI, HindIII y EcoRI fueron comparados con los datos de restricción para WI38 (una línea de células derivada de pulmón fetal embriónico humano), con los derivados de eliminación de 205 kb y 215 kb de A287-C10, y con valores aún no publicados. El perfil génico de diversidad (D) determinado mediante hibridación con una sonda de región D (fragmento 0.45 NcoI/PstI; Berman y col., 1988) demostró los cuatro segmentos de gen D esperados (D1-D4 (Siebenlist y col., 1981; Nature 294: 631-635). Por ejemplo, con BamHI, se observaron cuatro fragmentos de restricción, de 3,8 kb, 4,5 kb, 6,9 kb y 7,8 kb, en A287-C10 y WI38. WI38 tenía una banda adicional más grande, que supuestamente procede de la región D5 del cromosoma 16 (Matsuda y col., 1988, EMBO J. 7: 1047-1051). Los análisis de PCR y de transferencia Southern con cebadores y sondas específicos de familia D demostraron en el YAC derivado de eliminación de 215 kb (que parecía tener una región D intacta con la misma estructura de restricción que el YAC de 230 kb) la presencia de 2 a 4 miembros de cada una de las siguientes familias de genes D: DM, DN, DK, DA, DXP y DLR. El potenciador intrónico J-mu, que se secuenció de los productos PCR clonados procedentes del YAC de 230 kb A287-C10 (cebadores EnA = 5' TTC CGG CCC CGA TGC GGG ACT GC 3' y EnB1 = 5' CCT CTC CCT AAG ACT 3') y se determinó que estaban intactos, también generó fragmentos de restricción sencillos con aproximadamente los tamaños predichos con BamHI, EcoRI y HindIII cuando se sondaron con el producto PCR de 480 pb. La región JH se evaluó con una sonda fragmento BamHI/HindIII de aproximadamente 6 kb que extiende el DHQ52 y la región JH completa (Ravetch y col., 1981, Cell 27: 583-591). El A287-C10 generó fragmentos de restricción de aproximadamente los tamaños esperados. Además, se detectaron fragmentos de restricción del mismo tamaño con el potenciador y las sondas JH (Ravetch y col., ver anterior; Shin y col., 1991, ver anterior). El fragmento JH BamHI de aproximadamente 18 kb detectado en A287-C10 y WI38 también se hibridó con una secuencia sonda de mu de 0,9 kb (Ravetch y col., ver anterior). La hibridación con la sonda de mu de fragmento EcoRI de 0,9 kb (Ravetch y col., ver anterior) mostró fragmentos de restricción de aproximadamente los tamaños esperados (Ravetch y col., ver anterior; Shin y col., ver anterior): BamHI de > 12 kb (esperado aproximadamente 17 kb); EcoRI de 0,9 kb (esperado aproximadamente 0,9 kb) y HindIII de aproximadamente 12 kb (esperado aproximadamente 11 kb). El WI38 generó el mismo tamaño de fragmento BamHI que el A287-C10. Las regiones JH y DHQ52 fueron secuenciadas a partir de los YACs derivados de eliminación, y ambas estaban en configuración de línea germinal. Se analizó el delta con un producto PCR de exón 1 (que contenía la región de aproximadamente 160 pb entre los cebadores D1B = 5' CAA AGG ATA ACA GCC CTG 3' y D1D = 5' AGC TGG CTG CTT GTC ATG 3'); los fragmentos de restricción correspondientes a A287-C10 estaban próximos a los esperados por bibliografía (Shin y col., ver anterior) y a los determinados para el WI38. La posición 3' de clonación del YAC puede ser la primera posición EcoRI 3' de delta (Shin y col., ver anterior) u otra posición EcoRI más allá de 3'. Las sondas de gen VH para VH1, VH4 y VH6 (Berman y col., ver anterior), y para VH2 (Takahashi y col., 1984, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 5194-5198) se usaron para evaluar el contenido variable de gen del YAC. El A287-C10 contiene dos genes VH1 que se aproximan a los tamaños esperados (Shin y col., ver anterior; Matsuda y col., 1993, ver anterior); el análisis de restricción con las tres enzimas estuvo cerca de los tamaños de fragmento esperados; por ejemplo, para las bandas observadas de EcoRI son 3,4 y 7,8 kb (esperado 3,4 y 7,2 kb). En A287-C10 estaban presentes los fragmentos EcoRI de tamaño predicho para VH4 (5,3 kb observado, 5,1 kb esperado) y para VH6 (0,8 kb esperado, 0,9 kb esperado) (Shin y col., ver anterior; Matsuda y col., ver anterior). El fragmento EcoRI de tamaño esperado fue observado para VH2 (5,5 kb observado, 5,4 kb esperado), pero los fragmentos BamHI y HindIII eran diferentes a los predichos. La hibridación coincidente de los fragmentos BamHI y HindIII con una sonda pBR322 sugirió que la posición EcoRI que se encuentra en el extremo 5' del gen VH2 (Shin y col., ver anterior) es la posición de clonación 5', eliminando de este modo la posición HindIII 5' y las posiciones BamHI naturales. El tamaño global del injerto de YAC (estimado en aproximadamente 220 kb) se ajusta bien con el tamaño predicho para un segmento no redispuesto intacto que comienza en el extremo 5' del gen VH2 de mayoría 3' y que se extiende hasta una posición 3' EcoRI del locus delta (Shin y col., ver anterior).
3. Identificación y caracterización de YACs de IgK que contienen secuencias CK y VK
Se identificaron dos YACs en un escrutinio de conjuntos de gel de campo pulsado (PFG) procedente de la biblioteca de YAC humano de la Universidad de Washington (St. Louis, MO) con una sonda del gen de región constante kappa (CK) humana (fragmento EcoRI de 2,5 kb con Nº ATCC 59173, Parklawn Dr, Rockville, MD). Los YACs, designados A80-C7 (170 kb) y A276-F2 (320 kb), contienen el elemento kde de eliminación kappa, CK, JK y el potenciador intrónico C-J y se extienden 3' más allá de kde. Extendiéndose 5' desde JK, los YACs también contienen los genes B1, B2 y B3 VK determinados mediante hibridación y/o PCR, y posiblemente otras secuencias VK. La cepa A80-C7/AB1380 incluía, además del YAC de IgK, un YAC no relacionado de tamaño similar. Por tanto, se usó segregación meiótica para separar dichos YACs; se cruzó A80-C7 con YPH857 y se obtuvo un producto meiótico que contenía únicamente el YAC de IgK (MP8-2; genotipo de anfitrión = \alpha ade2 leu2 his3 his5 lys2 ura3 trp1 can1 cyh2). Los YACs A80-C7 y A276-F2 han sido tratados con pLUTO para incorporar el minigen HPRT humano en el brazo vector derecho del YAC.
El análisis de restricción de los YACs de IgK A80-C7 y A276-F2 usando una serie de enzimas apoya la conclusión de que ambos YACs no han sido reorganizados (es decir, están en configuración de línea germinal). Por ejemplo, la digestión BamHI seguida de hibridación con la sonda CK demuestra el fragmento de restricción de 13 kb esperado (Klobeck y col., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 370: 1007-1012 (1989)). La banda del mismo tamaño se hibrida con una sonda JK (un producto de 1,2 kb de PCR usando un conjunto de cebadores para ampliar la región JK1-5), tal como predice el mapa genómico (Klobeck y col., ver anterior). El gen IV de clase B3 (la sonda es un producto de PCR de 123 pb procedente del gen B3) proporciona un fragmento BamHI de 4,9 kb y un fragmento BgIII de 2,2 kb, cercanos a los valores publicados de 4,6 kb y 2,3 kb, respectivamente (Lorenz y col., Molec. Immunol. 25: 479-484 (1988)). El análisis PCR de ambos YACs de IgK, así como de ADN genómico, para las siguientes secuencias de locus kappa reveló los tamaños de banda predichos: Kde (120 pb), CK (304 pb), potenciador intrónico C-J (455 pb), JK1-5 (1204 pb), B3 VK (123 pb) y pseudogen B1 VK (214 pb). Las secuencias usadas para diseñar cebadores PCR para las regiones de potenciador CK, JK y C-J proceden de Whitehurst y col., Nucl. Acids. Res. 20: 4929-4930 (1992); Kde procede de Klobeck y Zachau, Nucl. Acids. Res. 14: 4591-4603 (1986); B3 procede de Klobeck y col., Nucl. Acids. Res. 13: 6515-6529 (1985); y B1 de Lorenz y col., ver anterior.
B. Introducción de YAC yHPRT de 680 kb en Células ME 1. Cultivo de cepa de levadura yHPRT y preparación de esferoplastos de levadura
El yHPRT de 680 kb es un YAC que contiene una copia funcional del gen de hipoxantina fosforibosiltransferasa humana (HPRT) clonado de una biblioteca de YAC, tal como se describe en Huxley y col. (1991), Genomics 9: 742-750. La cepa de levadura que contiene el yHPRT se cultivó en medio líquido deficiente en uracilo y triptófano, tal como se describe en Huxley y col. (1991), ver anterior.
Para preparar los esferoplastos de levadura, se giró un cultivo de 400 mL de levadura que contenía yHPRT y la partícula de levadura se lavó una vez en agua y una vez con sorbitol 1 M. La partícula de levadura se resuspendió en SPEM (sorbitol 1 M, fosfato sódico 10 mM, pH 7,5, EDTA 10 mM, pH 8,0, \beta-mercaptoetanol 30 mM) en una concentración de 5 x 10^{8} células de levadura/mL. Se añadió Zymolase 20T en una concentración de 150 \mug/mL de células de levadura, y se incubó el cultivo a 300ºC hasta que el 90% de las células eran esferoplastos (habitualmente durante 15-20 minutos). Las células fueron lavadas dos veces en STC (sorbitol 1 M, Tris 10 mM, pH 7,5, CaCl_{2} 10 mM) y resuspendidas en STC a una concentración de 2,5 x 10^{8}/mL.
2. Cultivo de Células ME E14TG2a
La línea de células ME negativas en HPRT, E14TG2a, fue cultivada tal como se ha descrito previamente.
3. Fusión de Células ME y de Esferoplastos de Levadura
Células ME E14TG2a en crecimiento exponencial cultivadas en platos recubiertos de gelatina fueron tripsinizadas y lavadas tres veces con DMEM libre de suero. Se recubrió con cuidado una partícula de 2,5 x 10^{8} esferoplastos de levadura con 5 x 10^{6} células ME que fueron giradas sobre la partícula de levadura. La partícula combinada fue resuspendida en 0,5 mL de polietilenglicol (PEG) 1500 al 50% o en PEG 4000 al 50% (Boeringer Mannheim) que contiene CaCl_{2} 10 mM. Después de 1,5 minutos de incubación a temperatura ambiente o a 37ºC, se añadieron lentamente 5 mL de DMEM libre de suero, y se dejó las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, las células fueron paletizadas y resuspendidas en 10 mL de medio completo de células ME (tal como se ha descrito previamente) y se llevaron a una placa de 100 mm recubierta con células alimentadoras. Después de 24 horas el medio fue sustituido con medio fresco. Cuarenta y ocho horas después de la fusión, se impuso selección HAT (medio ME que contiene hipoxantina 1 x 10^{-4} M, aminopterina 4 x 10^{-7} M, timidina 1,6 x 10^{-5} M). Se observaron colonias ME resistentes a HAT a los 7-10 días después de la fusión en las placas procedentes de las diferentes condiciones de fusión usadas. Se seleccionaron las colonias yHPRT-ME ("ESY") y se llevaron a pocillos recubiertos con alimentador, y se expandieron para un análisis más profundo.
4. Análisis de ADN de YAC Integrado en Clones de Fusión yHPRT-ME
El ADN extraído de 23 colonias de fusión yHPRT-ME se digirió con HindIII y fue sometido a análisis de transferencia Southern (Figura 12) usando las siguientes sondas: una secuencia Alu repetitiva humana (A); secuencias específicas de pBR322 para los brazos vectores de YAC derecho (B) e izquierdo (C); secuencia repetitiva Ty de levadura (D); gen de copia sencilla de levadura LYS2 (E). La sonda HPRT humana, un cADN de 1,6 kb de longitud completa (Jolly y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 477-481 (1983)) se usó para confirmar la presencia del gen HPRT humano en los clones ESY. La sonda Alu fue un fragmento BamHI de 300 pb procedente del elemento BLUR8 Alu en pBP63A (Pavan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1300-1304 (1990)). Las sondas de brazo vector derecho e izquierdo fueron fragmentos BamHI-PuvII de 1,7 y de 2,7 kb, respectivamente, derivados de pBR322, que corresponden a las secuencias de vector de pYAC4 (esquema a, b (Burke y col., en: Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Guthrie y Fink, eds., Academic Press, 194: 251-270 (1991)). El fragmento de 4,5 kb, detectado mediante la sonda de brazo derecho, expande la región entre la posición HindIII en el telómero del extremo 5' y la primera posición HindIII del injerto humano (esquema a). Los fragmentos de 3 kb y de 4,1 kb detectados mediante la sonda del extremo izquierdo corresponden a la región entre la posición HindIII en el extremo del telómero y la posición HindIII 5' de las secuencias de levadura, y la región que extiende desde la posición HindIII 3' del centrómero del injerto humano, respectivamente (esquema b). La diferencia en la intensidad de hibridación de estas dos bandas está relacionada con la diferencia en la cantidad de homología entre dichos fragmentos y la sonda. La sonda repetitiva Ty de levadura (Philippsen y col., en Gene Expression in Yeast, Proceedings of the Alko Yeast Symposium, Helsinki, Korhola y Vaisanen, eds., Foundation for Biotechnical and Industrial Fermentation Research, 1: 189-200 (1983)) era un fragmento XhoI de 5,6 kb aislado de pJEF742 que contiene Tyl, que también podría detectar el fragmento HindIII 3' de Ty2, debido a la homología entre los dos elementos. La sonda génica LYS2 era un fragmento BamHI de 1,7 kb procedente de pLUS (Hermanson y col., Nuc. Acids. Res. 19: 4943-4948 (1991)).
La hibridación con una sonda HPRT humana (sonda de cADN de 1,6 kb de longitud completa) demostró que todos los clones analizados contenían los mismos fragmentos de 15,7 y 5 kb que contienen exón del gen HPRT humano que el YAC yHPRT. El resondado de las mismas manchas con una sonda de secuencia Alu repetitiva humana de 300 pb indicó que todos los clones analizados contenían casi todos, si no todos, los fragmentos que contienen Alu presentes en yHPRT (Figura 12A). Estos datos indican que en la mayoría de los clones analizados el injerto humano de 680 kb no había sido redispuesto o eliminado de forma detectable después de la integración en el genoma de la célula ME. La integración de secuencias vector de YAC se examinó usando sondas específicas para los brazos del vector. La rehibridación de las mismas manchas con una sonda para el brazo vector derecho de YAC, que detecta un fragmento HindIII de 4,5 kb, indicó que en 10 de cada 23 clones analizados, todavía estaba intacto y no redispuesto desde el brazo derecho de YAC hasta el telómero, y ligado al injerto humano (Figura 12B), proporcionando de este modo una evidencia adicional de la integridad del YAC en estos clones. La sonda de brazo izquierdo detectó los fragmentos HindIII de yHPRT de 3 kb y de 4,1 kb en 18 de cada 20 clones analizados (Figura 12C), lo que indica una elevada frecuencia de retención de brazo izquierdo.
La integridad estructural de yHPRT en clones ESY se evaluó con más detalle con dos clones (ESY 5-2 y 8-7) usando un análisis de restricción de gel de campo pulsado. En levadura que porta yHPRT, se definieron cinco fragmentos Sfi con los siguientes tamaños aproximados empleando diferentes sondas: 315 kb (Alu, brazo izquierdo), 145 kb (Alu, brazo derecho), 70 y 50 kb (únicamente Alu). En ambos clones ME, los fragmentos específicos de HPRT y de Alu eran de tamaño similar a los fragmentos yHPRT. Los fragmentos de extremo detectados para ambos clones fueron de mayor tamaño que los de yHPRT, como era de esperar para YACs integrados en un cromosoma de ratón: 185 y 200 kb para el fragmento de extremo derecho, respectivamente, y más de 800 kb para el fragmento de extremo izquierdo para ambos clones. Estos datos, junto con el perfil Alu, proporcionan una evidencia adicional de la retención de la integridad estructural del YAC en estos clones. Estos estudios fueron complementados mediante hibridación de fluorescencia in situ llevada a cabo con extensiones cromosomales de metafase de ESY 8-7 (Figura 13 A, B) y ESY 8-6, en los que se detectó una única posición de integración para las secuencias humanas. Fotomicrografías de extensiones de metafase representativas (Figura 13 A, B, C) o de núcleos de interfase (Figura 13 D) de células ESY 8-7 (Figura 13 A, B) hibridadas con secuencias genómicas humanas biotiniladas y con células ESY 8-6 (Figura 13 C, D) hibridadas con secuencias de ADN repetidas de levadura biotinilada. La sonda human se generó a partir de ADN placental genómico humano (Clontech, Palo Alto, CA). La sonda de levadura consistió en una mezcla de fragmentos de ADN que codifican los elementos repetidos de levadura; delta (un fragmento Sau3A de 1,08 kb de pdelta6 (Gafner y col., EMBO J. 2: 583-591 (1983)) y Ty (un fragmento EcoRI-SaII de 1,35 kb de p29 (Hermanson y col., Nuc. Acids. Res. 19: 4943-4948 (1991)), los radas (un fragmento EcoRI-SaII de 1,35 kb y otro BgIII-B L92 de 4,4 kb (Keil y Roeder, Cell 39: 377-386 (1984)), y los elementos de telómero Y' (fragmentos BgIII-HindIII de 2,0 y 1,5 kb de p198 (Chan y Tye, Cell 33: 563-573 (1983)). La hibridación de secuencias en extensiones de metafase de cromosoma con sondas biotiniladas y la detección mediante Avidin-FITC seguida de amplificación de biotin-anti-Avidin y Avidin-FITC se llevó a cabo tal como se ha descrito en Trask y Pinkel, Methods Cell Biol. 30: 383-400 (1990), usando un microscopio Zeiss Axiophot. Los cromosomas fueron contrateñidos con yoduro de propicio. Las fotomicrografías mostradas son representativas de un 95% de las extensiones de metafase o de núcleos de interfase escaneados en tres experimentos independientes llevados a cabo con las sondas humanas o de levadura. Se detectó una única posición de integración para las secuencias humanas.
También se probaron las mismas manchas con la secuencia de elemento repetitivo Ty de levadura para detectar la presencia de secuencias de ADN genómicas de levadura en los clones ESY (Figura 12 D). Aunque se observó que algunos de los clones contenían la mayoría de los fragmentos que contienen Ty presentes en la cepa de levadura parental, se descubrió que algunos de los clones tenían una fracción muy pequeña, o nada, de los fragmentos que contienen Ty. Estos resultados indican que en algunos clones ME, aunque el ADN de YAC se ha integrado intacto, poco o ningún ADN genómico de levadura se ha integrado. Para determinar si el ADN cromosomal de levadura estaba integrado en una única posición o en múltiples posiciones dentro del genoma de la célula ME, se llevó a cabo una hibridación fluorescente in situ con el clon ESY 8-6 que tenía un perfil de Ty completo. Se detectó un único sitio de integración usando una sonda repetitiva de levadura combinada (Figura 13 C, D), lo que indica que dentro de los límites de resolución, todos los fragmentos de ADN se integraron en un bloque.
Usando la capacidad de las células ME para verse sometidas a una diferenciación in vitro ordenada, se investigó la estabilidad del YAC y el efecto del ADN integrado sobre la pluripotencia de las células ME. Cuatro clones ME, que contenían diferentes cantidades de ADN de levadura (ESY 5-2, 3-6, 8-6 y 8-7) exhibieron un modelo de diferenciación indistinguible del de las células ME no fusionadas: formación de cuerpos embriodes que dan lugar a una variedad de tipos celulares diferenciados (Figura 14 A). Se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern sobre el ADN extraído de los clones ESY no diferenciados 5-2, 3-6, 8-5 y 8-6 (20 \mug) e yHRPT en AB1380 (40 ng) usando (a) una sonda Alu humana; (b) secuencias Ty de levadura. Los clones ME fueron inducidos a formar cuerpos embriodes cultivándolos como agregados en suspensión durante 10-14 días tal como se describe en Martin y Evans, Cell 6: 467-474 (1975). Después de su reacoplamiento al sustrato de cultivo de tejido, los cuerpos embriodes derivados de ESY dieron lugar a tipos celulares diferenciados. Las secuencias de YAC y de ADN de levadura fueron retenidas de forma estable mediante los clones ME diferenciados durante 40 días de cultivo en medio no selectivo, lo que demuestra que el ADN extraño integrado establemente no afectó negativamente a la pluripotencia de células ME (Figura 14 B). Los cultivos diferenciados mantuvieron un gen HRPT humano funcional, tal como evidencia su crecimiento y diferenciación normales cuando son transferidos a medio selectivo de HAT.
5. Generación de ratones quiméricos a partir de líneas yHPRT-célula ME
La capacidad de las células ESY para repoblar ratones, incluyendo la línea germinal, quedó demostrada mediante la microinyección de células ME en blastocistos de ratones y la generación de ratones quiméricos. Las células ESY fueron microinyectadas en blastocistos de ratón C57BL/6J, y se generaron ratones quiméricos tal como se ha descrito previamente. Los machos quiméricos fueron apareados con hembras C57BL/6J y se determinó la transmisión de la línea germinal a través de la presencia de retoños agouti. El ADN genómico preparado a partir de las colas de los ratones quiméricos fue analizado para determinar la presencia del ADN de yHPRT en el genoma de ratón mediante análisis PCR. Se analizó la presencia del brazo izquierdo de YAC usando los dos oligonucleótidos de cebado, 5' TTCTCGGAGCACTGTCCGACC y 5' CTTGCGCCTTAAACCAACTTGGTACCG, que fueron derivados, respectivamente, de las secuencias de pBR322 y del gen SUP4 del brazo vector izquierdo de YAC. Se obtuvo un producto de PCR de 259 pb del análisis de la levadura que contiene las líneas celular yHPRT y ESY. El análisis de PCR de ADN de cola preparado a partir de 18 ratones quiméricos generados a partir de las líneas celulares ESY ESY-3, ESY-6 y ESY-2, dio lugar al producto de PCR esperado, indicando de este modo la presencia del brazo vector izquierdo de YAC en el genoma de los ratones quiméricos.
6. Transmisión de la línea germinal de yHPRT
Se prepararon machos quiméricos, con un 30-60% de quimerismo en el color de la piel, derivados de las líneas celulares ESY ESY3-1 y ESY5-2, para apareamiento a fin de evaluar la transmisión de la línea germinal, es decir, determinar si la modificación genética era transferida a través de las células germinales (esperma u oocitos) a la progenie de los animales. Tres de los machos quiméricos derivados de ESY3-1, 394/95-1, 394/95-2 y 411-1 transmitieron el genoma de célula ME a sus descendientes con una frecuencia de 20%, 30% y 30%, respectivamente. El análisis de transferencia Southern de ADN de cola de las crías agouti indicó la presencia del yHPRT en el genoma de tres ratones, 4-2, 4-3 y 5-1, derivados de la quimera 394/395-2. El perfil Alu obtenido de dicho análisis era indistinguible del de la línea de células ES3-1 parental (Figura 14 C), lo que demuestra que el injerto humano de 680 kb se había transmitido fielmente a través de la línea germinal del ratón.
Usando un ensayo PCR específico para HPRT humano sobre cADNs derivados de mARN procedente de un descendiente que contiene yHPRT, se detectó la expresión del gen HPRT humano en todos los tejidos evaluados (Figura 15 A y B), demostrando de este modo que el YAC transmitido retiene su función con fidelidad. En este experimento, se detectó mARN de HPRT humano mediante transcripción inversa (RT)-PCR en células ME, ESY 3-1 y Hut 78 (humana), en bazo e hígado de un ratón de control (C) o en el descendiente agouti 4-3 (derivado de la quimera 394/95-2), y en una muestra que no contenía ningún ADN de molde (indicado como "-" en la Figura 15 A). Se llevó a cabo la transcripción inversa de poli (A+) ARN y la amplificación PCR de secuencias de cADN específicas usando el cDNA Cycle Kit (Invitrogen). La amplificación específica de un fragmento de 626 pb procedente de cADN de HPRT humano en presencia de cADN de HPRT murino se llevó a cabo como se ha descrito en Huxley y col., ver anterior. La integridad de todas las muestras de ARN se demostró mediante amplificación PCR de cADNs correspondientes al receptor \gamma-interferón de ratón. Los cebadores usados para amplificar un fragmento de 359 pb fueron: GTATGTGGAG
CATAACCGGAG y CAGGTTTTGTCTCTAACGTGG. Los cebadores de HPRT humano y de receptor \gamma-interferón se diseñaron para eliminar la posibilidad de obtener productos PCR procedentes de contaminación de ADN genómico. Los productos PCR fueron analizados mediante electroforesis y visualizados con bromuro de etidio. Los marcadores de tamaño son escaleras de 1 kb (BRL). Los resultados de la detección de mARN de receptor \gamma-interferón de ratón mediante RT-PCR en las muestras descritas anteriormente se muestran en la Figura 15B. También se detectó el mARN de HPRT humano específico en los otros tejidos evaluados (cerebro, riñón y corazón) derivados del ratón 4-3. Se detectaron niveles comparables de estado estacionario de mARN de HPRT humano y de ratón en el hígado de progenie que contiene yHPRT. Estos resultados indican que la captación de hasta 13 megabases de ADN genómico de levadura no fue perjudicial para un correcto desarrollo, para la transmisión de la línea germinal o para la expresión génica.
Los anteriores resultados demuestran que los esferoplastos de levadura son un vehículo eficaz para la entrega de una copia sencilla de fragmento de ADN de elevado peso molecular en células ME, y que dichas moléculas son transmitidas de forma estable y funcional a través de la línea germinal. Los perfiles Alu, complementados con análisis PFGE e hibridación in situ para algunos de los clones ME, indican firmemente que la mayoría de los clones contenía virtualmente todo el injerto humano de un modo redispuesto (es decir, en "configuración de línea germinal"), con una elevada frecuencia de clones (40%) que retienen ambos brazos YAC. La captación significativa de ADN genómico de levadura no fue perjudicial para la diferenciación apropiada de células ME in vitro e in vivo, y no previno la transmisión de línea germinal o la expresión génica mediante dichos métodos, se pueden transmitir grandes fragmentos de ADN genómico como injertos en genomas de animales no humanos, en donde los injertos pueden transmitirse intactos mediante transmisión de la línea germinal. Por tanto, se puede introducir una amplia variedad de ADN xenogénico en anfitriones no humanos tales como mamíferos, particularmente animales pequeños de laboratorio, que puede conferir nuevos fenotipos o nuevos genotipos. Por ejemplo, se puede proporcionar a animales pequeños de laboratorio genes de un mamífero, tal como un humano, para estudiar la etiología de una enfermedad, la respuesta a genes humanos de una amplia variedad de agentes. Alternativamente, se pueden introducir grandes locus en un anfitrión mamífero para producir productos de otras especies, por ejemplo humanos, para proporcionar secuencias proteicas humanas de proteínas tales como inmunoglobulinas, receptores de células T, antígenos de complejo principal de histocompatibilidad, etc.
Introducción de YAC de cadena pesada de A287-C10 y YAC de cadena kappa de A80-C en células ME y en Embriones
Levadura que contenía la cadena pesada humana de YAC A287-C10 tratada con pLUTO (yA287-C10) fue esferoplastada y fusionada con la línea de células ME deficiente en HPRT E14.1TG3B1, tal como se ha descrito antes. Se seleccionaron diez clones ME (ESY) resistentes a HAT (2B, 2C, 2D, 3A, 3B, 5C, 1125A, 1125E, 100/1500 y 100/4000) y se expandieron para análisis de ADN. La evaluación del YAC integrado se llevó a cabo mediante análisis de transferencia Southern de ADN digerido con HindIII procedente de dichos clones, usando sondas de cadena pesada humana para las regiones D, J_{H}, \mu y VH2, descritas anteriormente. Se descubrió que todos los clones contienen los fragmentos esperados > 10 kb J_{H} y \mu. Se determinó que todos los clones ESY, excepto los clones 2D y 5C, contenían el fragmento VH2 kb de 4,8 kb. Se descubrió que todos los clones ESY, excepto el 2D y el 3B, contenían los fragmentos de gen D esperados de 10 y 7,6 kb. Se detectaron secuencias genómicas de levadura mediante hibridación con el elemento Ty repetitivo de levadura en todos los clones ESY, excepto en 2B, 2D, 100/1500 y 5C. Los clones ESY 2B, 3A y 5C fueron microinyectados en blastocistos C57B/6 tal como se ha descrito anteriormente, y se generaron ratones quiméricos (10 del clon 2B, 1 del clon 3A y 1 del clon 5C). El análisis de transferencia Southern de ADN de cola de 10 de dichos animales quiméricos indicó la presencia de la mayoría, si no todos, de los 10 fragmentos Alu aparentes, detectados en yA287-C10 en levadura, así como la presencia de fragmentos de gen D y VH_{2}. Los ratones quiméricos generados fueron cruzados con ratones C57BL/6J para evaluar la transmisión de la línea germinal. Un macho quimérico 78K-3 derivado del clon 2B transmitió el genoma de célula ME a su descendencia con una frecuencia del 100%. El análisis de transferencia Southern de ADN de cola de 4 de 6 crías de ratón agouti indicó la presencia de secuencias de cadena pesada humanas.
Los experimentos de fusión con levadura que contiene la cadena kappa humana de YAC A80-C7 tratada con pLUTO (yA80-C7) con células ME E14.1TG3B1 generó 2 clones ESY resistentes a HAT: M4.4.1 y M5.2.1. El análisis de transferencia Southern de ADNs digeridos con HindIII procedentes de dichos clones reveló la presencia de todos los 10 fragmentos Alu aparentes detectados en yA80-C7 en levadura. En ambos clones, las secuencias genómicas de levadura estaban integradas. Los clones ESY fueron microinyectados en blastocistos de C57B1/6J y se generaron ratones quiméricos.
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Ejemplo VII Producción de Ig humana mediante ratones quiméricos a través de la Introducción de Ig Humana usando Recombinación Homóloga
Como estrategia alternativa a la establecida en los Ejemplos I-VI, se introducen genes de Ig humana en el locus de Ig de ratón mediante la sustitución de locus de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera directamente con fragmentos de locus de cadena pesada y ligera humanos usando recombinación homóloga. Posteriormente se realiza la generación de animales transgénicos quiméricos en los que las células derivadas de células madre embrionarias contribuyen a la línea germinal.
A. Construcción de vector de sustitución de cadena pesada humana
La sustitución de las secuencias humanas incluye el fragmento SpeI de 100 kb de ADN genómico que abarca la región humana de cadena pesada VH6-D-J-C\mu-C\delta aislada de una biblioteca de YAC humana, tal como se ha descrito anteriormente. Las secuencias flanqueantes de cadena pesada de ratón, que conducen el evento de sustitución de la recombinación homóloga, contienen un fragmento BamHI de 10 kb de la cadena pesada C\varepsilon-C\alpha de ratón y un fragmento 5' J558 que comprende la mitad 5' del fragmento J558 de la región variable de cadena pesada de ratón, en los extremos 3' y 5' de las secuencias humanas, respectivamente (Figura 16). Estas secuencias de ratón se aíslan de una biblioteca genómica de embriones de ratón usando las sondas descritas en Tucker y col. (1981), PNAS USA, 78: 7684-7688 y Blankenstein y Krawinkel (1987, ver anterior), respectivamente. El fragmento de 1150 pb de XhoI a BamJI, que contiene un gen de resistencia a neomicina conducido por el promotor de gen de timidina quinasa de virus de herpes simple (HSV-tk) y un potenciador de polioma se aísla a partir de pMC1Neo (Koller y Smithies, 1989, ver anterior). Se añade un adaptador sintético sobre este fragmento para convertir el extremo XhoI en un extremo BamHI y el fragmento resultante se une al BamHI C\varepsilon-C\alpha de ratón en un plásmido.
Del clon de YAC que contiene el locus de cadena pesada humana, se recuperan las secuencias de ADN de cada extremo del injerto mediante PCR inversa (Silverman y col. (1989), PNAS, 86: 7485-7489), o mediante rescate de plásmido en E. coli, (Burke y col., (1987); Garza y col. (1989) Science, 246: 641-646; Traver y col., 1989) (véase la Figura 8). La secuencia humana aislada procedente del extremo 5'V6 del YAC se liga a la secuencia J558 de ratón en un plásmido, y asimismo, la secuencia humana derivada del extremo 3'Cd del YAC se liga al gen Neo del plásmido que contiene Neo y C\varepsilon-C\alpha de ratón descritos anteriormente. El segmento J558 de ratón V6 se subclona en un vector de clonación medio YAC que incluye un marcador seleccionable de levadura (HIS3) no presente en el YAC de IgH original, un centrómero (CEN) y un telómero (TEL) sencillo. Asimismo, el C\varepsilon-C\alpha de ratón C\delta-Neo humano se subclona en un vector de medio YAC separado con un marcador seleccionable de levadura diferente (LEU2) y un TEL sencillo. El vector de medio YAC que contiene el ADN V6 humano se linealiza y se usa para transformar una cepa de levadura que es eliminada para los locus cromosomales HIS3 y LEU2, y que porta el YAC de IgH. La selección de prototrofia de histidina da lugar a colonias de levadura que han sido sometidas a recombinación homóloga entre las secuencias de ADN V6 humanas y que contienen un YAC recombinante. El vector medio YAC que contiene el ADN C\delta humano se linealiza a continuación y se usa para transformar la cepa de levadura generada en la etapa previa. La selección para prototrofia de leucina da como resultado una cepa de levadura que contiene el YAC completo de sustitución de IgH (véase la Figura 16). Preferiblemente, ambos eventos de alteración se llevan a cabo en una única etapa de transformación, seleccionando simultáneamente para prototrofia de leucina y de histidina. Esto es particularmente útil cuando los brazos originales de YAC céntricos y acéntricos tienen una orientación opuesta a la mostrada en la Figura 16. Este YAC se aísla y se introduce en células ME mediante microinyección, tal como se ha descrito previamente para los embriones.
Ejemplo VIII Reproducción cruzada de ratones transgénicos A. Generación de ratones que producen anticuerpos monoclonales humanos
Los ratones que contienen el locus de inmunoglobulina humana son apareados con ratones con genes de inmunoglobulina murina inactivos para generar ratones que produzcan únicamente los anticuerpos humanos. Comenzando con cuatro cepas heterocigotas, se requieren tres generaciones para crear un ratón que es homocigoto para las inmunoglobulinas de cadena pesada y kappa de murina inactivas, y heterocigoto para los locus de inmunoglobulina de cadena kappa y pesada humana. El esquema de reproducción se muestra en la Figura 17.
Ejemplo IX Producción de Anticuerpos Monoclonales Humanos A. Inmunización de ratones
Los ratones quiméricos de línea germinal que contienen ADN humano integrado procedente de locus de inmunoglobulina son inmunizados mediante inyección de un antígeno en adyuvante. Los ratones son tratados con antígeno 14 días después de la inmunización primaria, y se repite a los 35 y a los 56 días. Se extrae sangre de los animales inmunizados para evaluar el título de anticuerpos en suero contra el antígeno inmunizante. El ratón con el mayor título es sacrificado y se extrae el bazo.
B. Fusión de esplenocitos
Las células de mieloma usadas como compañero de fusión para las células de bazo son descongeladas 6 días antes de la fusión, y cultivadas en cultivo de tejido. Un día antes de la fusión, las células se dividen en medio fresco que contiene un 10% de suero fetal de ternero en una concentración de 5 x 10^{5} células/mL. La misma mañana de la fusión, las células son diluidas con un volumen igual de medio suplementado con un 20% de suero fetal de ternero y 2X disolución OPI (3 mg/mL de oxaloacetato, 0,1 mg/mL de piruvato sódico y 0,4 UI/mL de insulina).
Después de sacrificar el ratón, se extrae asépticamente el bazo y se coloca en un plato con medio de cultivo. Se separan las células hasta que el bazo queda en piezas pequeñas y la mayoría de las células han sido extraídas. Las células se lavan en medio esterilizado fresco, y se deja que los grumos se sedimenten.
Los esplenocitos se lavan dos veces mediante centrifugación en medio sin suero. Durante el segundo lavado, también se lavan las células de mieloma en un tubo separado. Después del lavado final, las dos partículas son combinadas y se centrifuga todo junto.
Se añade lentamente una disolución de polietilénglicol al 50% (PEG) a la partícula de células a la vez que las células son resuspendidas, durante un total de dos minutos. Se añaden 10 mL de medio precalentado a la disolución celular, agitando lentamente durante 3 minutos. Las células son centrifugadas y se retira el sobrenadante. Las células son resuspendidas en 10 mL de medio suplementado con un 20% de suero fetal de ternero, 1 X disolución OPI y 1 X disolución AH (azaserina 58 \muM, hipoxantina 0,1 mM). Las células fusionadas son divididas en alícuotas en placas de 96 pocillos, y se cultivan a 37ºC durante una semana.
Se toma asépticamente el sobrenadante de cada pocillo y se reúne en grupos. Estos grupos son evaluados para determinar la reactividad frente al antígeno inmunizante. Los grupos positivos se evalúan con más detalle para determinar pocillos individuales. Cuando se ha identificado un pocillo positivo, las células se transfieren de la placa de 96 pocillos a 0,5 mL de medio suplementado con un 20% de suero fetal de ternero, 1 X OPI y 1 X AH en una placa de 24 pocillos. Cuando dicho cultivo se densifica, las células son expandidas en 5 mL, y a continuación en 10 mL. En este punto las células son sub-clonadas de tal modo que en el cultivo sólo hay una célula productora de anticuerpos.
De acuerdo con los anteriores procedimientos, se puede producir un anfitrión quimérico no humano, particularmente un anfitrión murino, que puede ser inmunizado para producir anticuerpos humanos o análogos específicos para un inmunógeno. De este modo, se evitan los problemas asociados a la obtención de anticuerpos monoclonales humanos, ya que el anfitrión transgénico puede ser inmunizado con inmunógenos que no podrían ser usados con un anfitrión humano. Además, se pueden utilizar inyecciones y adyuvantes que no estarían permitidos con un anfitrión humano. Entonces las células B resultantes pueden ser usadas para inmortalización para la producción continua del anticuerpo deseado. Las células inmortalizadas pueden usarse para el aislamiento de genes que codifican la inmunoglobulina, o análogos, y pueden someterse a modificaciones moleculares adicionales mediante métodos tales como la mutagénesis in vitro u otras técnicas para modificar las propiedades de los anticuerpos. Estos genes modificados pueden entonces ser devueltos a las células inmortalizadas mediante transfección para proporcionar una fuente celular continua de mamífero de los anticuerpos deseados. La presente invención proporciona una fuente conveniente de anticuerpos humanos, en la que los anticuerpos son producidos de un modo análogo a la producción de anticuerpos en un anfitrión humano. Las células de anfitrión animal proporcionan de forma conveniente la activación y la redisposición de ADN humano en las células de anfitrión para la producción de anticuerpos humanos.
De acuerdo con la presente invención, se pueden producir anticuerpos humanos para inmunógenos humanos, por ejemplo proteínas, mediante inmunización del mamífero anfitrión con inmunógenos humanos. Los antisueros resultantes serán específicos para el inmunógeno humano y pueden ser recolectados del suero del anfitrión. Las células B de anfitrión inmunizado pueden usarse para inmortalización, por ejemplo fusión de célula de mieloma, transfección, etc., para proporcionar células inmortales, por ejemplo hibridomas, para producir anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos, el antisuero y los anticuerpos monoclonales serán glicosilados de acuerdo con la especie de la célula que produce los anticuerpos. Se pueden reclutar regiones variables poco comunes del locus de Ig en la producción de anticuerpos, de tal modo que puedan obtenerse anticuerpos que tengan regiones variables poco comunes.
Aunque la invención precedente ha sido descrita con un determinado detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, es fácilmente evidente para los especialistas en la técnica a la luz de lo mostrado en esta invención que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones en la misma, sin alejarse del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (20)

1. Un método para producir una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de la célula ME de mamífero no humano, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina human, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a)
combinar en condiciones de fusión las células ME de mamífero no humano y esferoplastos de levadura que contienen uno o más cromosomas artificiales de levadura (YACs) que comprenden la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, en donde los YACs incluyen un gen que codifica un marcador seleccionable, mediante el cual las porciones de los locus de inmunoglobulina humana se integran establemente en el genoma de las células madre embrionarias; y
(b)
seleccionar las células ME que portan los locus de inmunoglobulina humana por medio del marcador o marcadores.
2. Una célula madre embrionaria (ME) de mamífero no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de la célula ME no humana, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde la célula ME de mamífero no humano es producida de acuerdo con el método de la reivindicación 1.
3. Un método de producción de un mamífero quimérico no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de al menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho las etapas de:
(a)
producir una célula ME de mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 2; y
(b)
transferir la célula embrionaria seleccionada a un blastocisto del anfitrión no humano, implantar el blastocisto en un receptor de mamífero no humano pseudopreñado, y permitir que el blastocisto se desarrolle hasta término para producir el mamífero quimérico no humano.
4. Un mamífero quimérico no humano que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de al menos algunas de sus células, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana, y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, y en donde el mamífero quimérico no humano es producido mediante el método de acuerdo con la reivindicación 3.
5. Un método para producir un mamífero transgénico no humano y su progenie que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de sus células somáticas y germinales, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmunoglobulina humana, comprendiendo dicho método las etapas de:
(a)
producir un mamífero quimérico no humano de acuerdo con la reivindicación 4; y
(b)
reproducir el mamífero quimérico no humano como sea necesario para producir el mamífero transgénico no humano y su progenie.
6. Un mamífero transgénico no humano y su progenie que tiene al menos una porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina human y al menos una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana, integrados establemente en el genoma de sus células somáticas y germinales, en donde la porción de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena pesada de inmunoglobulina humana y la porción de una cadena ligera de inmunoglobulina humana es suficiente para codificar una cadena ligera de inmuno-
globulina humana, y en donde el mamífero no humano es producido mediante el método de la reivindicación 5.
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7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 ó 5, en el que la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma 14 humano procedente de los genes del segmento D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes del segmento J y de los genes de la región constante a través de C\mu de dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye una región constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al menos un gen del segmento V humano.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 5 ó 7, en el que el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
10. La célula ME de acuerdo con la reivindicación 2 o el mamífero no humano de acuerdo con la reivindicación 4 ó 6, en donde la porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana es una secuencia de ADN idéntica a la secuencia de ADN de línea germinal del cromosoma 14 humano procedente de los genes del segmento D del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana, que continúa a través de los genes del segmento J y de los genes de región constante a través de C\mu de dicho locus, en donde dicha secuencia de ADN no incluye una región constante gamma, y en donde dicho fragmento de ADN está ligado operativamente a al menos un gen de segmento V humano.
11. La célula ME de acuerdo con la reivindicación 2 ó 7, en donde el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada.
12. La célula ME de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el genoma de la célula ME de mamífero no humano comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
13. El mamífero quimérico no humano de acuerdo con la reivindicación 4 ó 10, en el que el genoma de las células que tienen una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizada.
14. El mamífero quimérico no humano de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el genoma de las células que tienen una porción del locus de cadena pesada de inmunoglobulina humana y una porción de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina humana además comprende al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizado.
15. El mamífero transgénico no humano de acuerdo con la reivindicación 6 ó 10, en el que el genoma de las células somáticas y germinales comprende al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena pesada de inmunoglobulina reorganizado.
16. El mamífero transgénico no humano de la reivindicación 15, en el que el genoma de las células somáticas y germinales comprende además al menos un locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno desactivado, en donde el locus está desactivado para prevenir la redisposición del locus y para prevenir la formación de un tránscrito de un locus de cadena ligera de inmunoglobulina reorganizada.
17. El método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno está desactivado por la eliminación de todos los genes del segmento J.
18. La célula ME o el mamífero no humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde al menos un locus de cadena pesada de inmunoglobulina endógeno está desactivado por la eliminación de todos los genes del segmento J.
19. El método de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, en el que al menos un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógeno está desactivado por la eliminación del gen C_{\kappa}.
20. La célula ME o el mamífero no humano de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde al menos un locus de cadena ligera kappa de inmunoglobulina endógeno está desactivado por la eliminación del gen C_{\kappa}.
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