BRPI0610334A2 - hidrolisados de proteìnas que diminuem a pressão sangüìnea - Google Patents

Abstract

A presente invenção descreve o tripeptldeo MAP e<sym> ou o tripeptídeo ITP e<sym>ou um sal destes.

Description

HIDROLISADOS DE PROTEÍNAS QUE DIMINUEM A PRESSÃO SANGÜÍNEA

Campo da invenção

A presente invenção relaciona-se à produção de novospeptídeos.

Fundamento da invenção

Hipertensão é um estado de doença relativamente comumem humanos e apresenta um fator de risco prevalente paradoenças cardiovasculares, falência renal e AVC. Adisponibilidade de um grande arranjo de produtosfarmacêuticos como bloqueadores de cálcio, betabloqueadores, diuréticos, alfa bloqueadores, alfaantagonistas centrais, antagonistas de angiotensina II einibidores da ECA, ilustra que os mecanismos fisiológicossubjacentes para hipertensão são têm vários aspectos.

Dos mecanismos fisiológicos para hipertensão,especialmente o mecanismo de renina-angiotensina temrecebido muita atenção científica. Nesse mecanismo,angiotensina é secretada pelo fígado e é clivada pelarenina peptidase para gerar o decapeptídeo biologicamenteinativo angiotensina I. Uma vez que a angiotensina I passaatravés dos capilares pulmonares, uma outra peptidasechamada enzima de conversão de angiotensina (aqui referidacomo ECA) age sobre a angiotensina I por remoção dos doisúltimos resíduos da angiotensina I (His-Leu) para formar ooctapeptídeo angiotensina II. O octapeptídeo daangiotensina II exibe forte atividade vasoconstrictora edessa forma eleva a pressão arterial. A inibição da ECA queleva a menores níveis da angiotensina II evita avasoconstricção e assim a pressão sangüínea alta.

Além de clivar a angiotensina I, ECA também podehidrolisar bradiquinina, um nonapeptídeo que tambémparticipa na regulação da pressão arterial. No últimomecanismo, a inibição da ECA leva a níveis aumentados debradiquinina que promovem a vasodilatação e menor pressãoarterial também. A inibição de ECA assim, leva a efeitos dediminuição da pressão arterial por meio de pelo menos doismecanismos separados.

Também se sabe que o octapeptídeo angiotensina IIestimula a liberação de aldosterona pelo córtex adrenal. Oórgão alvo para a aldosterona é o rim onde a aldosteronapromove a reabsorção aumentada de sódio dos túbulos renais.Também por meio desse terceiro mecanismo a inibição de ECAreduz a pressão arterial, mas nesse caso por diminuição dareabsorção de sódio.

Por causa de seus múltiplos efeitos fisiológicos, ainibição da atividade proteolítica de ECA é uma via eficazde depressão da pressão arterial. Essa observação temresultado em inúmeros produtos farmacêuticos eficazes paraa diminuição da pressão arterial como captopril e enalapril(Ondetti, M.A. e cols., 1977, Science, Washington DC, 196,441-444) .

Pelo fato da hipertensão ser um estado de doençarelativamente comum seria vantajoso neutralizar esseresultado indesejável do estilo de vida moderno comingredientes naturais levemente ativos. Especialmente,ingredientes naturais levemente ativos podem serincorporados nos produtos alimentares ou bebidas pelo fatode esses produtos serem consumidos em uma base regular.Alternativamente, tais ingredientes naturais levementeativos podem ser incorporados em suplementos dietéticos.Durante a última década constatou-se peptídeos específicospresentes no leite fermentado têm uma capacidade de inibirECA e podem induzir a diminuição da pressão arterial emindivíduos hipertensos. Hoje em dia, numerosos experimentosin vitro e alguns em animais têm demonstrado os efeitosinibidores da ECA de diferentes peptídeos obtidos a partirde várias fontes de proteína. Embora ensaios de inibição daECA in vitro tenham revelado várias diferentes seqüênciasde peptídeos, deve ser enfatizado que os peptídeosinibidores da ECA precisam circular no sangue para exercerseu efeito in vivo. A conseqüência é que peptídeosinibidores da ECA eficazes devem resistir à degradação pelosistema de digestão proteolítica gastrointestinal e devempermanecer intactos durante um transporte subseqüente sobrea parede intestinal.

Um estudo da estrutura-função dos vários peptídeosinibidores da ECA sugeriu que eles freqüentemente possuemPro-Pro, Ala-Pro ou Ala-Hyp em sua seqüência C-terminal(Maruyama, S. e Suzuki, H. , 1982; Agric Biol Chem., 46(5):1393-1394). Esse achado é parcialmente explicado pelo fatode que a ECA é uma peptidil dipeptidase (EC3.4.15.1)incapaz de clivar ligações de peptídeos que envolvemprolina. Portanto, dos tripeptídeos que têm a estruturaXaaPro-Pro o dipeptídeo Pro-Pro não pode ser removido porque a ligação Xaa-Pro não pode ser clivada. É, portanto,concebível que se presente em concentrações relativamentealtas, os tripeptídeos que têm a estrutura Xaa-Pro-Proinibirão a atividade de ECA. Uma vez que não apenas a ECAmas também todas as enzimas proteolíticas têm dificuldadesem clivar ligações Xaa-Pro ou Pro-Pro, a opção de que apresença de (múltiplos) resíduos de prolina na extremidadecarboxiterminal dos peptídeos resulte em moléculasrelativamente resistentes à protease é quase evidente. Demodo similar, os peptídeos que contêm hidroxiprolina (Hyp)em vez de prolina são relativamente resistentes à protease.A partir disso pode ser deduzido que peptídeos que carregamum ou mais resíduos de (hidroxi) prolina em sua extremidadecarboxiterminal provavelmente escapam da degradaçãoproteolítica no trato gastrointestinal. Essas conclusõesajudarão a entender o notável efeito de diminuição dapressão arterial in vivo dos peptídeos inibidores da ECAespecíficos: eles não apenas estão de acordo com osrequisitos estruturais para inibição da ECA, mas elestambém resistem â degradação pelo sistema e digestãoproteolítica gastrointestinal e permanecem intactos duranteum transporte subseqüente pela parede intestinal.

Atividades fortes de inibição da ECA foram relatadaspara os tripeptídeos Leu-ProPro (JP02036127), Val-Pro-Pro(EP 0 583 074) e Ile-Pro-Pro (J. Dairy Sei., 78:777-783,1995)). Inicialmente, todos os peptídeos inibidores da ECAforam caracterizados com base em seu efeito in vitro sobrea atividade da ECA e os tripeptídeos Ile-Pro-Pro (aquireferidos como IPP) Val-Pro-Pro (aqui referidos como VPP) eLeu-Pro-Pro (aqui referidos como LPP) resistiram por causade seu forte efeito inibidor da ECA que resulta em valoresde IC50 relativamente baixos. Posteriormente, os efeitosanti-hipertensivos estimados dos tripeptídeos VPP bem comode IPP podem ser confirmados em ratos espontaneamentehipertensos (Nakamura et al. , J. Dairy Sei., 78:12531257(1995)). Nesses experimentos os tripeptídeos inibidoresforam derivados do leite fermentado com bactérias de ácidolático. Durante a fermentação do leite os peptídeosdesejáveis são produzidos por proteinases produzidas pelasbactérias de ácido lático crescentes. Peptídeos inibidoresda ECA foram concentrados a partir de produtos de leitefermentado após eletrodiálise, diálise de membrana de fibraoca ou métodos cromatográficos para permitir suacomercialização na forma de suplementos dietéticosconcentrados como comprimidos ou drágeas.

Sumário da invenção

A presente invenção relaciona-se a novos tripeptídeosMAP e/ou ITP ou a um sal de MAP e/ou um sal de ITP.

A presente invenção também se relaciona a umhidrolisado de proteína que compreende MAP e/ou ITP ou umsal de MAP e/ou ITP. Pref erivelmente o hidrolisado deproteína tem um DH de 5 a 50%, mais pref erivelmente 10 a40% e ainda mais pref erivelmente um DH de 20 a 35%. Alémdisso, a presente invenção relaciona-se a uma mistura depeptídeos que compreende MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ouITP. Preferivelmente essa mistura de peptídeos compreendepelo menos 1 mg MAP/g proteína, mais preferivelmente pelomenos 2 mg/g e ainda mais pref erivelmente pelo menos 4 mg/gproteína. Preferivelmente a mistura de peptídeos tambémcompreende LPP e/ou IPP. Portanto, a mistura de peptídeospreferivelmente também compreende pelo menos 1 mg IPP/gproteína, mais pref erivelmente pelo menos 2 mg/g e aindamais pref erivelmente pelo menos 4 mg/g proteína e/ou amistura de peptídeos preferivelmente também compreende pelomenos 1 mg LPP/g proteína, mais pref erivelmente pelo menos2 mg/g e ainda mais pref erivelmente pelo menos 4 mg/gproteína.

Essa mistura de peptídeos preferivelmente compreendepelo menos 30 % em peso (matéria seca) peptídeos que tem umpeso molecular de menos que 500 Da, mais preferivelmente 35a 70% em peso (matéria seca) da mistura de peptídeos sãopeptídeos que tem um peso molecular de menos que 500 Da.

Além disso, a presente invenção relaciona-se a umprocesso enzimático para produzir MAP e/ou ITP,preferivelmente por hidrólise enzimãtica de uma fonte deproteína.

Descrição detalhada da invenção

Como apresentado no presente pedido, os tripeptídeosMAP e ITP são bastante eficazes na inibição de ECA. Essesefeitos de inibição correspondem a valoressurpreendentemente baixos de IC50, respectivamente 0,4 paraMAP e 10 para ITP (em NM) como determinado na parteexperimental nessa. Além disso, constatou-se que ambostripeptídeos MAP e ITP resistem à degradação proteolíticagastrointestinal e, assim, são estáveis no trato intestinalhumano. O tripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP e saisdesses são, portanto, muito adequados para uma inibiçãoeficaz da ECA e podem, por exemplo, ser usados em alimentofuncional, como um nutracêutico ou como um medicamento. Otermo nutracêutico como aqui usado denota a utilidade nocampo de aplicação nutricional e farmacêutico. Portanto,novas composições nutracêuticas que compreendem MAP e/ouITP podem ter uso como suplemento para alimentos e bebidase como formulações farmacêuticas ou medicamentos paraaplicação enteral ou parenteral que podem ser formulaçõessólidas como cápsulas ou comprimidos, ou formulaçõeslíquidas, como soluções, suspensões ou emulsões.

Os tripeptídeos MAP (Met-Ala-Pro) e ITP (Ile-Thr-Pro)podem ser feitos por vários métodos que incluem síntesequímica, hidrólise enzimática e fermentação de soluções quecontêm proteína.

A identificação de peptídeos biologicamente ativos emmisturas complexas como hidrolisados de proteínas oulíquidos que resultam da fermentação é uma tarefadesafiadora. Fugindo da questão básica: Nós estamos usandoo substrato de proteína correto? Nós estamos usando aenzima correta? Nós estamos usando a cultura microbianacorreta? Vários peptídeos biologicamente ativos podem estarpresentes em amostras complexas que contêm milhares depeptídeos. As abordagens tradicionais de identificação queempregam ciclos repetidos de fracionamento cromatográficolíquido de alta performance (HPLC) e avaliação bioquímicasão geralmente longos e propensos a perdas dos peptídeosbiologicamente ativos presentes tornando a detecção debioatividade relevante extremamente difícil. No presentetrabalho equipamento muito sofisticado foi usado e váriosdiferentes hidrolisados de proteínas e caldos defermentação foram rastreados finalmente nos levando àidentificação dos dois novos peptídeos MAP e ITP que têmpropriedades inibidoras de ECA. Em nossa abordagem umensaio bioquímico de fluxo contínuo foi ligado on-line a umsistema de fracionamento de HPLC. O efluente de coluna deHPLC foi dividido entre um bioensaio de ECA de fluxocontínuo e uma técnica de análise química (espectrometriade massa). Hidrolisados brutos e caldos de fermentaçãoforam separados por HPLC, depois do que a presença decompostos biologicamente ativos foi detectada por meio doensaio bioquímico on-line. Os espectros de massa foramregistrados continuamente de modo que informação estruturalera imediatamente disponível quando um peptídeo mostrava umsinal positivo no ensaio bioquímico.

Os tripeptídeos MAP e ITP como identificados pelaabordagem acima mencionada podem ser produzidos por váriosmétodos que incluem vias de produção economicamenteviáveis. A produção via síntese química é possível com ouso de técnicas convencionais, por exemplo, descritas em"Peptides: Chemistry and Biology" por N. Sewald e H.D.Jakubke, eds. Wiley-VCH Verlag GmbH, 2002, capítulo 4.Métodos particulares de custo compensador de síntesequímica de peptídeos adequados para produção em largaescala são baseados no uso de alquilcloroformatos oucloreto de pivaloila para a ativação do grupo carboxílicocombinado com o uso de ésteres metílicos para proteção C-terminal e benziloxicarbonil (Z) ou grupos terc-butiloxicarbonil para N-proteção. Por exemplo, no caso deMAP, éster metílico de L-prolina pode ser ligado com Z-alaativado com isobutilcloroformato; o dipeptídeo resultantepode ser Z-desprotegido através de hidrogenólise usandohidrogênio e Pd em C e ligado novamente com Z-met ativadopor isobutilcloroformato; do tripeptídeo resultante o éstermetílico é hidrolisado usando NaOH e depois Z-desproteçãopor hidrogenólise, o tripeptídeo Met-Ala-Pro é obtido. Deforma similar, Ile-Thr-Pro pode ser sintetizado mas duranteas reações de ligação a função hidroxi de Thr requerproteção de benzil; na etapa final esse grupo é entãosimultaneamente removido durante a Z-desproteção.MAP e/ou ITP também podem ser feitos por hidróliseenzimática ou por abordagens de fermentação com o uso dequalquer substrato de proteína que contenha a as seqüênciasde aminoácidos MAP e/ou ITP. Vantajosamente o substrato deproteína contém tanto fragmentos MAP quanto ITP. Substratosde proteínas preferidos para tais abordagens enzimaticas oude fermentação são leite bovino ou a fração de caseína doleite bovino. Através da otimização da fermentação ou dascondições de hidrólise, a produção das moléculasbiologicamente ativas MAP e/ou ITP pode ser maximizada. Apessoa habilitada que tenta maximizar a produção saberácomo ajustar os parâmetros do processo, como tempo dehidrólise/fermentação, temperatura dehidrólise/fermentação, tipo de enzima/microorganismo econcentração etc.

MAP e/ou ITP ou composições que compreendem MAP e/ouITP são vantajosamente hidrolisadas e preferivelmentefeitas de acordo com um processo que envolve as seguintesetapas:

(a) hidrólise enzimática de um substrato adequado deproteína que compreendem MAP ou ITP em sua seqüência deaminoácidos que resulta em um produto de proteínahidrolisada que compreende os tripeptídeos MAP e/ou ITP;

(b) separação do produto de proteína hidrolisada deuma fração rica em tripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP;e opcionalmente

(c) concentração e/ou secagem da fração da etapa b)para obter um líquido concentrado ou um sólido rico emtripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP.

A etapa de hidrólise enzimática (a) pode ser qualquertratamento enzimático do substrato de proteína adequado queleva a hidrólise da proteína resultando na liberação detripeptídeos MAP e/ou ITP. Embora várias combinações deenzima possam ser usadas para liberar os tripeptídeosdesejados do substrato de proteína, a enzima preferidausada no presente processo é uma endoprotease específicapara prolina ou uma oligopeptidase específica para prolina.

Um substrato de proteína adequado pode ser qualquersubstrato que englobe a seqüência de aminoácidos de MAPe/ou ITP. Substratos de proteínas conhecidos por englobarMAP são, por exemplo, caseína, glúten de trigo, isolado deproteína de girassol, proteína de arroz, proteína de ovo.Substratos de proteínas adequados preferivelmente englobamas seqüências de aminoácidos aMAP ou pMAP como ocorre embeta-caseína bovina, a fração alfa-gliadina de glúten dotrigo e na fração 2S do isolado de proteína de girassol.

O substrato de caseína pode ser qualquer material quecontenha uma quantidade substancial de beta-caseína e alfa-S2-caseína. Exemplos de substratos adequados são leite bemcomo caseína, pó de caseína, concentrados de pó de caseína,isolados de pó de caseína, ou beta-caseína, ou alfa-S2-caseína. Preferivelmente um substrato que tem um altoconteúdo de caseína, como isolado de proteína caseína(CPI) .

A enzima pode ser qualquer enzima ou combinação deenzimas que seja capaz de hidrolisar proteína como beta-caseína e/ou alfa-S2-caseína resultando na liberação de umou mais dos tripeptídeos de MAP e/ou ITP.

A etapa de separação (b) pode ser executada dequalquer forma conhecida pela pessoa habilitada, porexemplo, por precipitação, filtração, centrifugação,extração ou cromatografia e combinações desses.

Preferivelmente a etapa de separação (b) é executada usandotécnicas de micro ou ultrafiltração. O tamanho de poro dasmembranas usadas na etapa de filtração, bem como a carga damembrana podem ser usados para controlar a separação dotripeptídeo MAP e/ou do tripeptideo ITP. 0 fracionamentodos hidrolisados de proteínas caseína usando membranascarregadas UF/NF é descrito em Y. Poilot e cols, Journal ofMembrane Science 158 (1999) 105-114.

A etapa de concentração (c) pode envolvernanofiltração ou evaporação da fração gerada pela etapa (b)para gerar um líquido altamente concentrado. Seadequadamente formulado, por exemplo, com uma baixaatividade em água (aw) , um baixo pH e pref erivelmente umconservante como benzoato ou sorbato, tais composiçõeslíquidas concentradas formam uma via atrativa de estocagemdos tripeptídeos de acordo com a invenção. Opcionalmente aetapa de evaporação é seguida por uma etapa de secagem, porexemplo, por secagem por spray ou liofilização para gerarum sólido que contém uma alta concentração de MAP e/ou ITP.

O processo enzimático compreende preferivelmente umaúnica etapa de incubação de enzima. O processo enzimáticode acordo com a presente invenção também se relaciona aouso de uma protease específica para prolina que épreferivelmente livre de atividades enzimáticascontaminantes. A protease específica para prolina édefinida como uma protease que hidrolisa uma ligação depeptídeo no lado do terminal carboxi da prolina. A proteaseespecífica para prolina preferida é uma protease quehidrolisa a ligação do peptídeo em um lado do terminalcarboxi dos resíduos de prolina e alanina. A proteaseespecífica para prolina é preferivelmente capaz dehidrolisar grandes moléculas de proteína como polipeptídeosou a proteína em si. O processo de acordo com a invençãotem em geral um tempo de incubação de menos que 24 horas,preferivelmente o tempo de incubação é de menos que 10horas e mais preferivelmente menos que 4 horas. Atemperatura de incubação é em geral maior que 3 0°C,preferivelmente maior que 4 0°C e mais preferivelmente maiorque 50°C.

Um outro aspecto da presente invenção é a purificaçãoe/ou separação dos tripeptídeos MAP e ITP de uma proteínahidrolisada. A maior parte da proteína hidrolisada deacordo com a invenção é preferivelmente capaz de precipitarsob condições selecionadas de pH. Esse processo depurificação compreende a alteração do pH ao pH por onde amaioria da proteína hidrolisada e não hidrolisada precipitae separada das proteínas precipitadas dos tripeptídeos(bioativos) que permanecem em solução.

Para obter aos presentes tripeptídeos com um resíduode prolina em sua extremidade carboxiterminal, o uso daprotease que pode clivar no lado do carboxiterminal dosresíduos de prolina oferece uma opção preferida. Aschamadas prolil oligopeptidases (EC 3.4.21.26) têm apossibilidade única de clivar preferencialmente peptídeosno lado carboxil dos resíduos de prolina. Proliloligopeptidases também têm a possibilidade de clivarpeptídeos no lado carboxil dos resíduos de alanina, mas aúltima reação é menos eficiente que a clivagem de ligaçãode peptídeos que envolve resíduos de prolina. Em todas asproteases específicas para prolina adequadamentecaracterizadas isoladas de mamíferos bem como de fontesmicrobianas, foi identificado um domínio único de peptidaseque exclui grandes peptídeos do sítio ativo da enzima. Defato, essas enzimas são incapazes de degradar peptídeos quecontêm mais que cerca de 3 0 resíduos de aminoácidos de modoque essas enzimas são agora referidas como "proliloligopeptidases" (Fulop e cols.: Cell, vol. 94, 161-170, 24de julho de 1998) . Como uma conseqüência, essas proliloligopeptidases requerem uma pré-hidrólise com outrasendoproteases antes que elas possam exercer sua açãohidrolítica. No entanto, como descrito em WO 02/45523,mesmo a combinação de uma prolil oligopeptidase com taloutra endoprotease resulta em hidrolisados caracterizadospor uma proporção significativamente aumentada de peptídeoscom um resíduo de prolina carboxiterminal. Por causa disso,tais hidrolisados formam um excelente ponto de iniciaçãopara a isolação dos tripeptídeos com efeitos inibidores daECA in vitro bem como uma melhor resistência à degradaçãoproteolítica gastrointestinal.

Um "peptídeo" ou "oligopeptídeo" é aqui definido comouma cadeia de pelo menos dois aminoácidos que são ligadosatravés de ligações de peptídeos. Os termos "peptídeo" e"oligopeptídeo" são considerados sinônimos (como écomumente reconhecido) e cada termo pode ser usado de formaintercambiável a media que o contexto necessitar. Um"polipeptídeo" é aqui definido como uma cadeia que contémmais que 30 resíduos de aminoácidos. Todos as fórmulas de(oligo)peptídeo e polipeptídeo ou seqüências nessa sãoescritas da esquerda para direita na direção do terminalamino para o terminal carboxi, de acordo com prática comum.

O código de uma letra de aminoacidos aqui usado é comumenteconhecido na técnica e pode ser encontrado em Sambrook, ecols. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Uma mistura depeptideos é uma composição que compreendem pelo menos 3 0%em peso (matéria seca) de peptideos determinada com base emNitrogênio de Kjeldahl em combinação com determinação dopeptideo que tem um peso molecular de menos que 3.500 Da.

Uma endoprotease é aqui definida como uma enzima quehidrolisa ligações de peptideos em um polipeptideo em umamodalidade endo ("endo-fasion") e pertence ao grupo EC 3.4.

As endoproteases são divididas em sub-subclasses com baseno mecanismo catalitico. Há sub-subclasses de serinaendoproteases (EC 3.4.21), cisteína endoproteases (EC3.4.22), aspártico endoproteases (EC 3.4.23),metaloendoproteases (EC 3.4.24) e treonina endoproteases(EC 3.4.25). Exoproteases são aqui definidas como enzimasque hidrolisam ligações de peptideos adjacentes a um grupoterminal a-amino ("aminopeptidases"), ou a ligação dopeptideo entre o grupo terminal carboxil e o penúltimoaminoácido ("carboxipeptidases").

WO 02/45524 descreve uma protease específica paraprolina obtível a partir de Aspergillus niger. A enzimaderivada de A. niger cliva preferencialmente nocarboxiterminal da prolina, mas também pode clivar nocarboxi terminal da hidroxiprolina e, seja com uma menoreficiência, no carboxiterminal de alanina. WO 02/45524também ensina que não existe homologia clara entre essaenzima derivada de A. niger e as prolil oligopeptidasesconhecidas de outras fontes microbianas ou de mamífero. Emcontraste com prolil oligopeptidases conhecidas, a enzimade A. niger tem um pH ácido ótimo. Embora as proliloligopeptidases conhecidas bem como a enzima derivada de A.niger sejam chamadas serina proteases, nós mostramos aqui(exemplo 1) que a enzima de A. niger pertence a umasubfamília completamente diferente. A enzima secretada porA. niger parece ser um membro da família S28 de serinapeptidases em vez da família S9 na qual a maioria dasprolil oligopeptidases citosólicas foram agrupadas(Rawling,N.D. e Barrett, A.J.; Biochim. Biopys. Acta 1298(1996) 1-3) . No Exemplo 2 nós mostramos o pH e temperaturaótimos da protease específica para prolina derivada de A.niger. No Exemplo 3 nós ilustramos a alta preferência daendoprotease específica para prolina derivada de A. nigerpara clivagem carboxiterminal de resíduos de prolina ealanina. Além disso, nós demonstramos nesse Exemplo que apreparação da enzima derivada de A. niger como usada noprocesso da presente invenção é preferivelmenteessencialmente pura significando que nenhuma atividadeendoproteolítica significativa outra que não a atividadeendoproteolítica inerente da endoprotease específica paraprolina pura é presente. Nós também demonstramos que nossapreparação de enzima derivada de A. niger preferivelmenteusada de acordo com a presente invenção não contémquaisquer atividades colaterais exoproteolíticas, maisespecificamente aminopeptidolíticas. Preferivelmente aatividade exoproteolítica é ausente na preparação de enzimaderivada de A. niger usada no processo da invenção. Provaexperimental para a noção de que a atividadeendoproteolítica específica para prolina é essencialmenteausente nas cepas de Aspergillus não recombinantes pode serencontrada em WO 02/45524 e é também ilustrada no Exemplo 3do presente pedido. Por causa do processo da presenteinvenção ser possível por incubação do substrato de caseinacom apenas a endoprotease específica para prolina, ascondições ótimas de incubação como temperatura, pH etc.podem ser facilmente selecionadas e não precisam serfixadas em condições subótimas como seria o caso se duasou mais enzimas fossem aplicadas. Além disso, a formação desubprodutos indesejados como, por exemplo, peptídeos nãobioativos adicionais ou aminoácidos livres que levam asabores diferentes é evitada. Tendo maiores graus deliberdade na seleção das condições de reação torna aseleção mais fácil por outros critérios possíveis. Porexemplo é muito mais fácil selecionar agora condições quesão menos sensíveis a infecções microbianas e para otimizaras condições de pH em relação a subseqüentes etapas deprecipitação de proteína, no Exemplo 4 nós mostramos que aenzima de Aspergillus não é uma oligopeptidase mas umaendopeptidase verdadeira capaz de hidrolisar proteínasintactas, grandes peptídeos bem como moléculas de peptídeosmenores sem a necessidade de uma endoprotease auxiliar.Esse novo e surpreendente achado abre a possibilidade deuso da enzima de A.niger para a preparação de hidrolisadoscom altos conteúdos inéditos de peptídeos com um resíduo deprolina carboxiterminal porque nenhuma endoproteaseauxiliar é necessária. Tais novos hidrolisados podem serpreparados a partir de diferentes materiais de iniciaçãoproteináceos seja de origem vegetal ou animal. Exemplos detais materiais de iniciação são caseínas, gelatina,proteínas de peixe ou ovo, glúten de trigo, proteína desoja e ervilha bem como proteína de arroz e proteína degirassol. Uma vez que o sódio é conhecido por ter umimportante papel na hipertensão, substratos preferidos paraa produção de peptídeos inibidores da ECA são cálcio epotássio em vez de sais de sódio dessas proteínas.

O pH ótimo da prolil endoprotease derivada de A. nigeré por volta de 4,3, (veja a figura 1) . Por causa dessebaixo pH ótimo, a incubação de caseinato de leite bovinocom a prolil endoprotease derivada de A. niger não é auto-evidente. Caseinato de leite bovino precipitará se o pHcair abaixo de 6,0 mas em pH 6,0 a enzima de A. niger temuma atividade limitada apenas. Entretanto, nós mostramosno Exemplo 5 que, mesmo sob essa condição bastantedesfavorável, uma incubação com a prolil endoproteasederivada de A.niger pode produzir vários peptídeosinibidores da ECA conhecidos como IPP e LPP. De formasurpreendente, nenhum VPP é produzido sob essas condições.Caseína de leite bovino incorpora inúmeras diferentesproteínas que incluem beta-caseína e kapa-caseína. Deacordo com as seqüências de amino conhecidas, beta-caseínaengloba tripeptídeos inibidores de ECA IPP, VPP e LPP.Kapa-caseína engloba apenas IPP. O fato de que a enzimaderivada de A. niger não contém qualquer atividademensurável de aminopeptidase sugere fortemente que o IPPformado é liberado da seqüência -A107-Iio8-Pio9-Piio- presenteem kapa-caseínas. Presumivelmente, a ligação do peptídeocarboxiterminal de IPP é clivada pela atividade principalde uma prolil endoprotease derivada de A. niger enquanto aclivagem da ligação anterior Ala-Ile é realizada por suaatividade especifica para ala. De modo similar. De formasimilar, a ausência de VPP pode ser explicada com base naausência de atividade lateral de aminopeptidase. VPP écontido em beta-caseina na seqüência — P8i-V82-V83-V84-P85-P8e- .Assim, a endoprotease especifica para prolina retira aseqüência VWPP mas é incapaz de liberar VPP.

Esses resultados são obtidos com incubação docaseinato com a endoprotease derivada de A. niger em umprocesso de enzima simples de uma etapa. Soluções aquosascontendo proteína são altamente suscetíveis a infecçõesmicrobianas, especialmente se mantidas por várias horas emvalores de pH acima de 5,0 e em temperaturas de 50 graus Cou menos. Especialmente, toxinas microbianas que podem serproduzidas durante tais etapas de incubação prolongadas eprovavelmente sobrevivem a etapas subseqüentes deaquecimento e formam uma ameaça potencial a processos degrau alimentício. A presente invenção preferivelmente usauma temperatura de incubação acima de 50 graus C. Emcombinação com o processo de enzima de uma etapa em que aincubação da enzima é realizada por um período de menos que24 horas, preferivelmente menos que 8 horas, maispreferivelmente menos que 4 horas, o processo de acordo coma invenção oferece a vantagem de melhor estabilidademicrobiológica. O uso da presente proporção enzima-substrato em combinação com as condições de altatemperatura, a retirada de IPP e LPP é completada em umperíodo de incubação de 3 horas.Porque os peptídeos inibidores da ECA IPP e LPP podemser retirados da caseína com o uso de uma única,endoprotease essencialmente pura, a presente invençãoresulta em um menor número de peptídeos hidrossolúveis quenos processos de técnica prévia. Entre esses peptídeoshidrossolúveis IPP e LPP estão presentes em maioresquantidades. Isso é especialmente importante no caso de umaalta concentração de tripeptídeos inibidores de ECA sernecessária sem quaisquer outros compostos freqüentementemenos ativos.

De acordo com o presente processo, preferivelmentepelo menos 20%, mais pref erivelmente pelo menos 30%, maispreferivelmente pelo menos 40% de qualquer seqüência —I-P-P- ou -L-P-P- presente em uma proteína é convertida notripeptídeo IPP ou LPP, respectivamente.

No exemplo 6 nós ilustramos o efeito da purificação de5 vezes dos peptídeos bioativos por uma nova esurpreendente etapa de purificação. A base desse processode purificação é formada pelas propriedades únicas daendoprotease derivada de A. niger específica para prolina.A incubação com essa enzima libera as partes mais bioativasda molécula do substrato na forma de tripeptídeoshidrossolúveis. As partes menos bioativas ou não bioativasda molécula do substrato permanecem em uma grande extensãoem não clivada e dessa forma partes muito maiores depeptídeo ou polipeptídeo das moléculas do substrato. Devidoàs solubilidades em água limitadas dessas partes maiores depeptídeo ou polipeptídeo sob condições selecionadas de pH,essas partes menos bioativas ou não bioativas da moléculado substrato são facilmente separadas dos tripeptídeosbioativos muito mais solúveis. Nesse processo o hidrolisadoinicial é formado durante o breve período de incubação daenzima a 55 graus C, pH 6,0 e é então opcionalmenteaquecido a uma temperatura acima de 8 0 graus C para matartodos os microorganismos contaminantes e para inativar aprolil endopeptidase derivada de A. niger.Subseqüentemente, o hidrolisado é acidifiçado para fazeruma queda de pH para 4,5 ou pelo menos abaixo de 5,0. Nessevalor de pH, que não pode ser usado inativar a prolilendopeptidase derivada de A. niger porque ele representa acondição ótima para a enzima, todos os grandes peptídeos docaseinato precipitam de modo que apenas os menorespeptídeos permanecem em solução. Uma vez que os caseinatosprecipitados podem ser facilmente removidos por decantaçãoou uma etapa de filtração ou uma centrifugação develocidade baixa (ou seja, abaixo de 5.000 rpm), a faseaquosa contém uma alta proporção de peptídeos bioativosrelativos à quantidade de proteína presente. De acordo comdados de Kjeldahl 8 0 a 70% da proteína de caseinato éremovida pela etapa de centrifugação de baixa velocidadeque significa uma purificação de quatro a cinco vezes dospeptídeos inibidores da ECA. Nós constatamos que esseprincípio de purificação pode ser vantajosamente aplicadopara obter peptídeos biologicamente ativos obtidos dematerial proteináceo outro que não caseina também. Alémdisso, não apenas hidrolisados enzimaticamente produzidosmas também proteínas que são fermentadas pormicroorganismos adequados podem ser separadas e purificadasde acordo com o presente processo. A incubação da enzima esubstrato em um valor de pH próximo ao que o substratoprecipitará e em que a enzima ainda é ativa, permitirá essaetapa de purificação. Devido ao baixo pH ótimo da prolilendoprotease derivada de A. niger, as precipitações desubstrato na faixa de pH entre 1,5 e 6,5 podem serconsideradas. Em vista de seu comportamento de precipitaçãoespecífico, as precipitações de glúten acima do pH 3,5,precipitações da proteína de girassol acima do pH 4,0 eabaixo de pH 6,0, precipitações de clara de ovo acima depH 3,5 e abaixo de pH 5,0 formam exemplos de condiçõesnas quais a proteína hidrolisada precipita e as proteínasprecipitadas podem ser separadas a partir da proteínahidrolisada ou peptídeos.

Depois da decantação, filtração ou centrifugação debaixa velocidade, os sobrenadantes que contêm os peptídeosbiologicamente ativos podem ser recuperados em um estadopurificado. Uma etapa subseqüente de evaporação e secagempor spray produzirá uma via econômica para obtenção de umapasta de grau alimentício ou pó com uma alta bioatividade.Após a digestão dos caseinatos de acordo com o processocomo descrito, um pó branco e inodoro com uma altaconcentração de peptídeos inibidores da ECA, é obtido.Alternativamente, a evaporação ou nanofiltração pode serusada para também concentrar os peptídeos bioativos. Aformulação adequada de tal concentrado por aumento daatividade em água (Aw) em combinação com um ajuste de pH ea adição de um conservante de grau alimentício comobenzoato ou um sorbato produzirão um concentrado líquidomicrobiologicamente estabilizado, de grau alimentício, dospeptídeos que diminuem a pressão arterial. Se adequadamentediluído à concentração de tripeptídeo correta, um materialde iniciação versátil é obtido adequado para favorecertodos os tipos de alimentos e bebidas com propriedadesinibidoras da ECA. Se necessário, o sobrenadante obtidoapós a decantação, filtração ou centrifugação de baixavelocidade, pode ser também processado para melhorar apalatabilidade do produto final. Por exemplo, osobrenadante pode fazer contato com carvão ativado em póseguido por uma etapa de filtração para remover o carvão.Para minimizar o amargor do produto final, o sobrenadanteobtido após a decantação, filtração ou centrifugação debaixa velocidade também pode ser submetido a uma incubaçãocom uma outra protease, como subtilisina, tripsina, umaprotease neutra ou uma endoprotease especifica paraglutamato. Se necessário, a concentração dosbioingredientes ativos MAP e/ou ITP pode ser aumentadaainda mais por subseqüentes etapas de purificação nas quaisé feito uso do caráter específico hidrofílico/hidrofóbicodos tripeptídeos MAP e ITP. Métodos preferidos depurificação incluem nanofiltração (separação em tamanho),extração, por exemplo, com hexano ou butanol seguida porevaporação/precipitação ou contato do hidrolisadoacidificado como obtido com resinas cromatográficas dafaixa Amberlite XAD (Roehm). Também podem ser usadasresinas de butil-sefarose como suprido por Pharmacia.

No Exemplo 7 nós descrevemos a identificação dos novospeptídeos inibidores da ECA MAP e ITP em um hidrolisado decaseína preparado com o uso da endoprotease derivada de A.niger específica para prolina em combinação com o novoprocesso de purificação de peptídeo. Apenas o uso dessaúnica (essencialmente pura) endoprotease em combinação coma remoção de uma grande proporção dos peptídeos nãobioativos e equipamentos de separação e de identificaçãoaltamente sofisticados nos permitiu traçar e identificaresses novos tripeptídeos inibidores de ECA. Nos peptídeosbioativos derivados de caseina (CDBAP) preparados de acordocom os o Exemplo 7 (após precipitação), os tripeptídeos MAPe ITP foram identificados em quantidades que correspondem a2,9 mg MAP/grama CDBAP (4,8 mg MAP/grama de proteína emCDBAP) e 0,9 mg ITP/ grama CDBAP (1,4 mg ITP/ gramaproteína em CDBAP). Uma característica adicional para CDBAPé seu conteúdo extraordinariamente alto de prolina de 24%em base molar. Os testes descritos no exemplo 7 ilustram osvalores muito baixos de IC50 para os dois novostripeptídeos no teste modificado de Matsui, ou seja, 0,5micromol/1 para MAP e 10 micromol/1 para ITP. Esse achado éainda mais surpreendente se nós percebermos que IPP, um dospeptídeos inibidores da ECA naturais mais eficazesconhecidos, tem um valor de IC50 nesse teste modificado deMatsui de 2,0 micromol/1.

De acordo com o presente processo preferivelmente pelomenos 20%, mais pref erivelmente pelo menos 30%, maispreferivelmente pelo menos 4 0% de uma seqüência -M-A-P- ouuma -I-T-P- presente em uma proteína é convertido notripeptídeo MAP ou ITP, respectivamente.

A utilidade dos peptídeos inibidores da ECA recémidentificados MAP e ITP é também ilustrada no Exemplo 8. Noúltimo exemplo nós mostramos que ambos peptídeos sobrevivema condições de incubação que simulam as condiçõesdigestivas tipicamente encontradas no trato

gastrointestinal. Com base nesses dados, nós concluímos queos novos tripeptídeos provavelmente sobrevivem no tratogastrointestinal de mamífero (por exemplo, humano) queimplica em considerável potencial econômico se usados paratratar hipertensão.

No Exemplo 9 nós demonstramos que o superior peptídeoinibidor de ECA MAP não pode ser apenas produzido emexperimentos de hidrólise enzimática, mas é tambémdetectável em preparações de leite fermentado com ummicroorganismo de grau alimentício adequado. No entanto,nós fomos incapazes de demonstrar a presença de peptídeoITP em tal produto fermentado.

Os peptídeos MAP e/ou ITP como obtidos antes ou depoisde etapas adicionais de purificação (por exemplo,cromatográficas) podem ser usados para a incorporação emprodutos alimentícios que são amplamente consumidos em umabase regular. Exemplos de tais produtos são margarinas,cremes, vários produtos laticínios como manteiga ouiogurtes ou leite ou bebidas que contêm soro. Embora taiscomposições sejam tipicamente administradas a sereshumanos, elas também podem ser administradas a animais,preferivelmente mamíferos, para aliviar a hipertensão. Alémdisso, a alta concentração de inibidores da ECA nosprodutos como obtido torna esses produtos muito úteis paraa incorporação em suplementos dietéticos na forma depílulas, comprimidos ou soluções altamente concentradas oupastas ou pós. Suplementos dietéticos de liberação lentaque asseguram uma liberação contínua dos peptídeosinibidores da ECA são de particular interesse. Os peptídeosMAP e/ou ITP de acordo com a invenção podem ser formuladoscomo u pó seco, por exemplo, em uma pílula, um comprimido,um grânulo, um sache ou uma cápsula. Alternativamente, asenzimas de acordo com a invenção podem ser formuladas comoum líquido, por exemplo, em um xarope ou uma cápsula. Ascomposições usadas nas várias formulações e que contêm asenzimas de acordo com a invenção também podem incorporarpelo menos um composto do grupo que consiste em um veículo,adjuvante, excipiente, estabilizante, tampão e diluentefisiologicamente aceitáveis cujos termos são usados nosentido comum para indicar substâncias que auxiliam naembalagem, liberação, absorção, estabilização, ou, no casode um adjuvante, melhoria do efeito fisiológico dasenzimas. O fundamento relevante nos vários compostos quepodem ser usados em combinação com as enzimas de acordo coma invenção em uma forma em pó pode ser encontrado em"Pharmaceutical dosage forms", segunda edição, volumes 1,2e 3, ISBN 0-8247-8044-2 Mareei Dekker, Inc. Embora ospeptídeos inibidores da ECA de acordo com a invençãoformulados como um pó seco possam ser estocados porperíodos bastante longos, o contato com umidade ou ar úmidodeve ser evitado por escolha de embalagem adequada como,por exemplo, um blister de alumínio. Uma forma de aplicaçãooral relativamente nova é o uso de vários tipos de cápsulasde gelatina ou comprimidos baseados em gelatina.

Em vista da relevância de peptídeos inibidores da ECAnaturais para combater a hipertensão as presentes viasnovas e de custo eficaz oferecem um ponto de inícioatrativo para produtos alimentares levemente hipotensores you mesmo produtos veterinários. Pelo fato da presente viatambém incluir uma etapa de purificação surpreendentementesimples, as possibilidades para suplementos dietéticosconcentrados que diminuem a pressão arterial são tambémaumentadas.

Pela endoprotease específica para prolina de acordocom a invenção ou usada de acordo com a invenção entende-seo polipeptídeo como mencionado nas reivindicações 1-5, 11 e13 de WO 02/45524. Portanto, essa endoprotease específicapara prolina é um polipeptídeo que tem atividadeendoproteolítica específica para prolina, selecionado dogrupo que consiste em:

(a) um polipeptídeo que tem uma seqüência deaminoácidos que tem pelo menos 4 0% de identidade deseqüência de aminoácidos com aminoácidos 1 a 52 6 de Id. deSeq. No:2 ou um fragmento desse;

(b) um polipeptídeo que é codificado por umpolinucleotídeo que hibridiza sob condições de baixo rigorcom (i) a seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°:lou um fragmento desse que é pelo menos 80% ou 90% idênticosobre 60, preferivelmente sobre 100 nucleotídeos, maispreferivelmente pelo menos 90% idêntico sobre 200nucleotídeos, ou (ii) a seqüência de ácidos nucleicoscomplementar à seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq.N°:l. O Id. de Seq. N° : 1 e Id. de Seq. N°:2 como mostradoem WO 02/45524. Preferivelmente o polipeptídeo sta em formaisolada.

O polipeptídeo preferido usado de acordo com apresente invenção tem uma seqüência de aminoácidos que tempelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 60%,preferivelmente pelo menos 65%, preferivelmente pelo menos70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda maispreferivelmente pelo menos 90%, e mais pref erivelmente pelomenos 95%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de97% de identidade com aminoácidos 1 a 526 de Id. de Seq.N° : 2 ou que compreendem a seqüência de aminoácidos de Id.de Seq. N°:2.

Preferivelmente, o polipeptídeo é codificado por umpolinucleotideo que hibridiza sob condições de baixo rigor,mais preferivelmente condições de médio rigor, e maispreferivelmente condições de alto rigor, com (i) aseqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq. N°:l ou umfragmento desse, ou (ii) a seqüência de ácidos nucleicoscomplementar à seqüência de ácidos nucleicos de Id. de Seq.N° : 1.

O termo "capaz de hibridizar" significa que opolinucleotideo alvo da invenção pode hibridizar ao ácidonucleico usado como um marcador (por exemplo, a seqüênciade nucleotídeos apresentada no Id. de Seq. N°: 1, ou umfragmento desse, ou o complemento de Id. de Seq. N°: 1) emum nível significativamente acima do de base. A invençãotambém inclui os polinucleotídeos que codificam aendoprotease específica para prolina da invenção, bem comoseqüências de nucleotídeos que são cotnplementares a ela. Aseqüência de nucleotídeos pode ser RNA ou DNA, incluindoDNA genômico, DNA sintético ou cDNA. Preferivelmente, aseqüência de nucleotídeos é DNA e mais preferivelmente, umaseqüência de DNA genômico. Tipicamente, um polinucleotideoda invenção compreende uma seqüência contígua denucleotídeos que é capaz de hibridizar sob condiçõesseletivas à seqüência codificadora ou o complemento daseqüência codificadora de Id. de Seq. N°: 1. Taisnucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com métodosbem conhecidos na técnica.

Um polinucleotídeo da invenção pode hibridizar àseqüência codificadora ou o complemento da seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N°:l em um nívelsignificativamente acima do de base. Hibridização de basepode ocorrer, por exemplo, por causa de outros cDNAspresentes em uma biblioteca de cDNA. O nível do sinalgerado pela interação entre um polinucleotídeo da invençãoe a seqüência codificadora ou complemento da seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N° : 1 é tipicamente pelo menos10 vezes, preferivelmente pelo menos 20 vezes, maispreferivelmente pelo menos 50 vezes, e ainda maispreferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto asinterações entres outros polinucleotídeos e a seqüênciacodificadora de Id. de Seq. N°: 1. A intensidade dainteração pode ser medida, por exemplo, por rotulagem domarcador, por exemplo, com 32P. A hibridização seletivapode tipicamente ser realizada pelo uso de condições debaixo rigor (0,3 M cloreto de sódio e 0,03 M citrato desódio em cerca de 40°C), de médio rigor (por exemplo, 0,3 Mcloreto de sódio e 0,03 M citrato de sódio em cerca de50°C) ou de alto rigor (por exemplo, 0,3 M cloreto de sódioe 0,03 M citrato de sódio em cerca de 60°C).

O Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode serusado para calcular a identidade (por exemplo, usado emseus ajustes padrão).

Os algoritmos PILEUP e BLAST N também podem ser usadospara calcular a identidade de seqüência ou para alinharseqüências (como identificação de seqüências equivalentesou correspondentes, por exemplo, nos ajustes padrão).O programa para realizar análises de BLAST épublicamente disponível através do "National center forbiotechnology information" (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Esse algoritmo envolve primeiramente a identificação de parde seqüência de alta pontuação (HSPs) por identificação depalavras curtas de comprimento W na seqüência em questãoque combina ou satisfaz alguma pontuação limiar T de valorpositivo quando alinhada como uma palavra do mesmocomprimento em uma seqüência de base de dados. T é referidocomo o limiar de pontuação de palavra vizinha. Essascombinações de palavra vizinha iniciais agem como sementespara iniciar pesquisas para encontrar HSPs que as contém.

As combinações de palavra são estendidas em ambas direçõesjunto a cada seqüência por tanto quanto a pontuação dealinhamento cumulativo puder ser aumentada. As extensõespara as combinações de palavra em cada direção são detidasquando: a pontuação de alinhamento cumulativo diminui pelaquantidade X de seu valor máximo atingido; a pontuaçãocumulativa vai de zero ou menos, devido ao acúmulo de um oumais alinhamentos de resíduos de pontuação negativa; ou aextremidade de cada seqüência é atingida. Os parâmetros doalgoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade evelocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como padrãoum comprimento de palavra (W) de 11, os alinhamentos dematriz de pontuação BLOSUM62 (B) de 50, expectativa (E) de10, M=5, N=4 e uma comparação de ambos filamentos.

O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística dasimilaridade entres duas seqüências. Uma medida dasimilaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menorprobabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação daprobabilidade pela qual uma combinação entre doisnucleotídeos ou seqüências de aminoácidos pode ocorrer.Por exemplo, a seqüência é considerada similar a uma outraseqüência se a menor probabilidade de soma em comparação daprimeira seqüência para a segunda seqüência é de menos quecerca de 1, preferivelmente menos que cerca de 0,1, maispreferivelmente menos que cerca de 0,01 e ainda maispreferivelmente de menos que cerca de 0,001.

As cepas do gênero Aspergillus têm um status de graualimentício e enzimas derivadas desses microorganismos sãoconhecidas por serem de uma fonte de grau alimentício nãosuspeita. De acordo com uma outra modalidade preferida, aenzima é secretada por sua célula produtora ao invés de umachamada enzima citosólica não secretada. Dessa forma asenzimas podem ser recuperadas do caldo de células em umestado essencialmente puro sem etapas dispendiosas depurificação. Preferivelmente, a enzima tem uma altaafinidade para seu substrato sob o pH e condições detemperatura prevalescentes.

Descrição das Figuras

Figura 1: uma representação gráfica do pH ótimo daprolil endoprotease derivada de A. niger

Figura 2: perfil de especificidade da prolilendoprotease derivada de A. niger

Figura 3: SDS-PAGE de ovalbumina intacta e um peptídeosintético 27-mer após incubação com endoprotease específicapara prolina derivada de A. niger cromatograficamentepurificada.

Materiais e Métodos

MateriaisSpray comestível de caseinato de potássio (88%) foiobtido de DMV International, Holanda. Peptídeoscromogênicos sintéticos foram obtidos de Pepscan SystemsB.V. Holanda ou de Bachem, Suíça.

Endoprotease específica para prolina de A. niger.

Superprodução da endoprotease específica para prolinade Aspergillus niger foi realizada como descrito em WO02/45524. A atividade da enzima foi testada no peptídeosintético Z-Gly-Pro-pNA a 37 graus C em um tampão decitrato/fosfato dissódico pH 4,6. O produto da reação foimonitorado por espectrofotometria a 4 05 nM. Uma unidade édefinida como a quantidade de enzima que libera 1 \xmol dep-nitroanilida por minuto sob essas condições de teste.

Purificação cromatográfica da endoprotease derivada deA. niger.

O caldo de cultura obtido de uma cepa superprodutorade A. niger foi usado para purificação cromatográf ica daprotease para remover quaisquer atividades contaminantesendo e exoproteolíticas. Para esse fim o caldo dafermentação foi primeiramente centrifugado para remover ovolume da massa fúngica e o sobrenadante foi então passadoatravés de inúmeros filtros com tamanhos de porosdecrescentes para remover todos os fragmentos de células.Finalmente, o ultrafiltrado obtido foi diluído dez vezes em20 milimol/litro de acetato de sódio pH 5,1 e aplicado emuma coluna Q-Sepharose FF. As proteínas foram eluídas em umgradiente de 0 a 0,4 moles/litro de NaCl em 20milimol/litro de acetato de sódio pH 5,1. As frações depico que apresentam atividade para a clivagem de Z-Gly-Pro-pNA foram coletadas e reunidas, de acordo com o protocolodescrito em "World Journal of Microbiology & Biotechnology"11, 209 - 212 (1995) , mas sob condições de ensaio levementemodificadas. Levando em consideração o pH ácido ótimo daendoprotease específica para prolina derivada de A. niger,o ensaio de enzima foi realizado em pH 4,6 em um tampão decitrato/difosfato a 37°C. A união das frações ativasseguida por concentração finalmente gerou uma preparaçãoque mostrou apenas uma única banda em SDS-PAGE e um pico emHP-SEC. Análise adicional por cromatografia de interaçãohidrofóbica confirmou a pureza da preparação de enzimaobtida.

Análise LC/MS/MS usada na detecção de IPP, LPP e VPP.HPLC que usa um espectrômetro de massa ion trap(Thermoquest®, Breda, Holanda) ligado a bomba P4 000(Thermoquest®, Breda, holanda) foi usado na quantificaçãodo peptídeos de interesse, entre esses, os tripeptídeosIPP, LPP e VPP, nos hidrolisados de proteínas enzimáticosproduzidos pela mistura de enzima da invenção. Os peptídeosformados foram separados usando uma coluna Inertsil 3 ODS3, 3 (J,m, 150*2.1 mm (Varian Belgium, Bélgica) em combinaçãocom um gradiente de 0,1% ácido fórmico em água Milli Q(Millipore, Bedford, MA, USA; Solução A) e 0,1% ácidofórmico em acetonitrila (Solução B) para eluição. Ogradiente iniciou a 100% de Solução A, mantido aqui por 5minutos, aumento linear para 5% B em 10 minutos, seguidopor aumento linear a 45% da solução B em 30 minutos eimediatamente indo para as condições do início, e mantidoaqui 15 minutos para estabilização. O volume de unjecaousado foi 50 microlitros, a taxa de fluxo foi 200microlitros por minuto e a temperatura da coluna foimantida a 55°C. A concentração da proteína da amostrainjetada foi de aprox. 50 microgramas/mililitro.

Informação detalhada sobre os peptídeos individuaisfoi obtida pelo uso de MS/MS para os peptídeos deinteresse, usando emergia de colisão ótima de cerca de 3 0%.

A quantificação dos peptídeos individuais foi realizada como uso calibragem externa, pelo uso dos íons de fragmentomais abundantes observados no modo MS/MS.

O tripeptídeo LPP (M=325,2) foi usado para direcionarpara sensibilidade ótima em modo MS e para fragmentaçãoótima em modo MS/MS, realizando infusão constante de 5(j,g/ml, resultando em uma molécula protonada em modo MS euma energia de colisão ótima de cerca de 3 0% em modo MS/MS,gerando uma série de B- e Y-íons.

Antes de LC/MS/MS os hidrolisados de proteínasenzimáticos foram centrifugados em temperatura ambiente e13.000 rpm por 10 minutos, filtrados através de um filtrode 0,22 (J.m e o sobrenadante foi diluído a 1:100 com águaMilliQ.

Nitrogênio de Kjeldahl

O Nitrogênio Total de Kjeldahl foi medido por Análisede Injeção de Fluxo. Com o uso de um sistema "TecatorFIASTAR 5000 Flow Injection" equipado com um "TKN MethodCassette 5000-040", um computador Pentium 4 com programaSOFIA e um "Tecator 5027 Autosampler" a amônia liberada dassoluções que contêm proteína foi quantificada a 590 nm. Umaquantidade de amostra que corresponde à faixa dinâmica dométodo (0,5-20 mg N/I) é colocada no tubo de digestão juntocom 95-97% de ácido sulfúrico e um Kjeltab submetidos a umprograma de digestão de 30 minutos a 200 graus C seguidopor 90 minutos a 360 °C. Após injeção no sistema FIASTAR5000 o pico de nitrogênio é medido do qual a quantidade deproteína medida pode ser deduzida.

Análise de Aminoácidos

Uma amostra precisamente pesada do materialproteináceo foi dissolvida em ácido diluído e osprecipitados foram removidos por centrifugação em umacentrífuga Eppendorf. A análise de aminoácidos foirealizada no sobrenadante incolor de acordo com o métodoPicoTag como especificado no manual dos operadores do"Amino Acid Analysis System of Waters" (Milford MA, USA) .Para esse fim uma amostra adequada foi obtida do líquido,então seca e submetida a hidrólise de ácido de fase devapor e derivatizada usando fenilisotiocianato. Os váriosaminoácidos derivatizados presentes foram quantificadosusando métodos de HPLC e adicionados para calcular o níveltotal de aminoácidos livrs na amostra pesada. Osaminoácidos Cys e Trp não são incluídos nos dados obtidosnessa análise.

O grau de hidrólise (DH) do hidrolisado de proteínafoi medido com o uso do teste OPA rápido e calculado comodescrito (Nielsen e cols., JFS, Vol 66, NO 5, 642-646, 2001).

Distribuição de peso molecular dos peptídeos e proteínaspresentes nos hidrolisados.

A análise da distribuição de tamanho do peptídeo dasamostradas de proteína tratadas com protease foi feita emum sistema automatizado de HPLC equipado com uma bomba dealta pressão, dispositivo de injeção capaz de injetar 10-100 ul de amostra e um detector de UV capaz de monitorar oefluente da coluna a 214 nm.

A coluna usada para essa análise foi uma "SuperdexPeptide HR 10/300 GL" (Amersham) equilibrada com 20 mMtampão de fosfato de sódio/ 250 mM cloreto de sódio pH 7,0.após injeção da amostra (tipicamente 50 ul) os várioscomponentes foram eluídos da coluna com tampão em 90minutos em uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min. O sistema foicalibrado usando uma mistura de citocromo C (P.M. 13.500Da), aprotinina (P.M. 6.510 Da) e tetra-glicina (P.M. 246Da) como marcadores de peso molecular.

Exemplo 1

A enzima como obtida de A. niger representa uma nova classede enzimas específicas para prolina.

A partir da seqüência codificadora inteira daendoprotease específica para prolina derivada de A. nigercomo fornecido em WO 02/45524, a seqüência de proteínas de526 aminoácidos pode ser determinada. A inovação da enzimafoi confirmada por pesquisas BLAST de banco de dados comoSwissProt, PIR e trEMBL. Para nossa surpresa, nenhumahomologia clara pode ser detectada entre a enzima de A.niger e as prolil oligopeptidases conhecidas. Uma inspeçãomais detalhada da seqüência de aminoácidos, no entanto,revelou pequena, mas significativa homologia a Pro-Xcarboxipeptidases (EC3.4.16.2), dipeptidil aminopeptidasesI (EC3.4.14.2) , e serina protease específica para o timo.Todas essas enzimas foram designadas para a família S28 deserina peptidases. Também a configuração GxSYxG ao redor daserina do sítio ativo é conservada entre essas enzimas e aendoprotease derivada de A. niger. Aditionalmente, membrosda família S28 têm um pH ácido ótimo, têm especificidadepara clivar no lado carboxi-terminal de resíduos de prolinae são sintetizados com uma seqüência sinalizadora epropeptídeo como a endoprotease específica para prolinaderivada de A. niger. Também o tamanho da enzima de A.niger é similar aquele dos membros da família S28.Portanto, a endoprotease específica para prolina de A.niger parece ser um membro da família S28 de serinaproteases em vez da família S9 em que a maioria das proliloligopeptidases citosólicas incluindo a enzima obtida deFlavobacterium meningosepticum foi agrupada. Com basenessas características estruturais e fisiológicas nósconcluímos que a enzima de A. niger pertence à família S28em vez de S9 de serina proteases. Uma característicaadicional que discrimina a enzima derivada de A. niger dasprolil oligopeptidases que pertencem à família S9 é o fatode que, diferentemente das prolil endoproteases citosólicasque pertencem à última família, as novas enzimas de A.niger identificadas são secretadas no meio de crescimento.Esse é o primeiro relato sobre a isolação e caracterizaçãode um membro da família S28 a partir de um eucariotainferior.

Exemplo 2

O pH e temperatura ótimos da endoprotease específica paraprolina como obtida a partir de A. niger.

Para estabelecer o pH ótimo da endoprotease específicapara prolina derivada de A. niger, tampões com diferentesvalores de pH foram preparados. Tampões de pH 4,0 — 4,5 —4,8 — 5,0 — 5,5 e 6,0 foram feitos usando 0,05 mol/1acetato de sódio e 0,02 M CaCl2; tampões de pH 7,0 e 8,0foram feitos usando 0,05 M de tampões Tris/HCl contendo0,02 M CaCl2. Os valores de pH foram ajustados usando ácidoacético e HC1 respectivamente. O peptídeo sintéticocromogênico Z-Gly-Pro-pNA foi usado como o substrato. Apré-diluição da solução tampão, a solução de substrato e aprolil endoprotease (em uma atividade de 0,1 U/mL), foiaquecida a exatamente 37,0°C em um banho de água. Apósmistura a reação foi seguida por espectrofotometria a 4 05nm a 3 7,0°C por 3,5 minutos, medindo a cada 0,5 minuto. Apartir dos resultados mostrados na Figura 1 é claro que aendoprotease específica para prolina derivada de A. nigertem um pH ótimo por volta de 4.

Também a temperatura ótima da prolil endoprotease foiestabelecida. Para esse fim a preparação de enzimapurificada foi incubada em 0,1 mol/1 Na-acetato contendo0,02 mol/1 CaCl2 em pH 5,0 por 2 horas em diferentestemperaturas usando "Caseine Resorufine" (Roche versão 3)como o substrato e a atividade da enzima foramquantificados por medição a 574 nm. De acordo com osresultados obtidos, a endoprotease específica para prolinade A. niger tem uma temperatura ótima por volta de 50 °C.

Exemplo 3

A especificidade e pureza da endoprotease específica paraprolina derivada de A. niger.

Amostras de enzima bruta bem como cromatograficamentepurificada foram obtidas de uma cepa de A. niger contendomúltiplas cópias do cassete de expressão (cf WO 02/45524)foram testadas Cintra um conjunto de substratos de peptídeocromogênico para estabelecer a especificidade daendoprotease codificada. Usando diferentes conjuntos depeptídeos cromogênicos, a presença de possíveis atividadesde enzima contaminante foi estabelecida. A especificidadeendoproteolítica da endoprotease codificada foi testada emdiferentes substratos de Ala-AlaXpNA (AAXpNA). Nessecontexto "X" refere-se aos diferentes resíduos deaminoácidos naturais e "pNA" a p-Nitroanilida. A clivagemde uma ligação do peptídeo entre o resíduo "X" e a porçãopNA da molécula, causa uma mudança de cor que pode sermonitorada por um aumento na absorvência de luz em lambda=405 ou 410 nm. O substrato de AAXpNA. Para esse fim,soluções de estoque de substratos AAX-pNA (150 mmol/1)foram diluídas 100X em 0,1M tampão de acetato pH 4,0contendo 20 CaCl2. As medições cinéticas de 10 minutos emum leitor "TECAN Gênios MTP" (Salzburg, Vienna) a 405 nmregistraram os aumentos na densidade ótica que, via dadosprocessados em Excel, geraram o retrato mostrado na Figura2. A partir do resultado, é claro que a endoproteasederivada de A. niger é altamente específica para ligaçõesde prolil peptídeos com uma atividade lateral para ligaçõesde alanil. Preparações brutas e cromatograficamentepurificadas mostraram perfis de atividade similares.

Uma possível contaminação da endoprotease derivada deA. niger com atividades enzimáticas estranhas leva ainúmeras reações colaterais indesejadas. Por exemplo, apresença de exoproteases como carboxipeptidases ouaminopeptidases, resulta em preparações de peptídeo que têmníveis aumentados de aminoácidos livres. Esses aminoácidoslivres extra diluem as concentrações relativas dospeptídeos bioativos presentes e, além disso, transmitemsabores como o resultado de reações de Maillard aumentadas.

Se níveis importantes de endoproteases contaminantespresentes na preparação da endoprotease específica paraprolina superexpressa, os sítios de clivagem em outrasposições que o carboxiterminal dos resíduos de prolina oualanina são introduzidos. Tais sítios extra de clivagemgeram peptídeos extra por meio disso também diluindo aconcentração dos peptídeos bioativos tendo resíduos deprolina carboxiterminais. Para minimizar todas essasreações colaterais indesejadas, o uso de uma proteaseespecífica para prolina essencialmente pura é preferido.

Essencialmente pura significa que a atividade deendoproteases contaminantes bem como exopeptidasescontaminantes sob as condições de incubação usadas sãomínimas ou preferivelmente ausentes. Os procedimentos deteste a seguir foram planejados para quantificar taisatividades contaminantes das endo- e exopeptidases.

A base para o procedimento de teste é formada por umacoleção de vários peptídeos cromogênicos seletivos. Porqueapenas oligo e endoproteases específicas para prolina podemliberar pNA do peptídeo Z-AAAP-pNA, esse peptídeoparticular foi usado para quantificar a atividadeendoproteolítica específica para prolina desejada. Porquevárias endoproteases podem liberar pNA dos peptídeos Z-AAAF-pNA e Z-AAAR-pNA, esses dois peptídeos foram usadospara quantificar a atividade endoproteolítica contaminantenão específica para prolina.

Pelo fato de que várias aminopeptidases podem liberarde modo eficiente Phe e Gln de substratos de peptídeo, ospeptídeos cromogênicos Q-pNA e V-pNA foram usados paraquantificar atividades contaminantes da aminopeptidase.

Porque várias carboxipeptidases podem liberar resíduosde Phe e Arg de substratos de peptídeo, peptídeos contendoesses resíduos foram selecionados para quantificaratividades contaminantes da carboxipeptidase. No entanto,nenhum grupo cromogênico adequado é capaz de medir aatividades da carboxipeptidase de forma que um métodoalternativo que use os peptídeos sintéticos Z-AF e Z-ARteve que ser desenvolvido. Esse método alternativo éfornecido abaixo. Em todos os peptídeos sintéticos usados"Z" representa benziloxicarbonil e "pNA" o cromóforo para-nitroanilida. Todos os peptídeos cromogênicos foram obtidosde Pepscan (Lelystad, Holanda) . Peptídeos Z-AF e Z-AR foramadquiridos de Bachem (Suíça). Todas as incubações foramrealizadas a 40°C. Preparações de enzima diluída foramrecalculadas à concentração do produto comercial.

Para ilustrar os níveis das várias atividades daenzima que são regularmente presentes em preparações deenzima industrialmente disponíveis, messe Exemplo nósdescrevemos o teste de três preparações de enzimacomerciais para suas várias atividades proteolíticas, ouseja, Flavourzyme 1000L Batch HPN00218 (Novozymes) ,Sumizyme FP (Shin Nihon, Japan) e Corolase LAP Ch. : 4123(AB Enzimas, UK) . Tanto Flavourzyme quanto Sumizyme FP sãoconhecidas por serem preparações de enzimas complexas quecontêm várias atividades aminopeptidolíticas de enzima alémde atividades não especificadas endoproteolíticas ecarboxipeptidolíticas. Corolase LAP representa umaatividade de leucina aminopeptidase relativamente pura,clonada e superexpressa de Aspergillus.

Medição das atividades de AminoPeptidase

Soluções estoque de 150 mmol/1 de F-pNA e Q-pNA em100% DMSO foram diluídas 80 vezes em 0,1 M tampão BisTrispH 6 para fazer uma solução de 3,75 mmol/1 F-pNA+ de Q-pNA-substrato contendo F-pNA e Q-pNA em uma proporção de 1:1.uma alíquota de 200 |il dessa solução de substrato deaminopeptidase foram pipetados em cavidades separadas deuma placa microtítulo (MTP). A MTP é pre-incubada a 40°C emuma "MTP Tecan Gênios" (Salzburg, Vienna) correndo sobprograma Magellan4. a reação foi iniciada pela adição de 50ul da solução de enzima adequada de forma que as incubaçõesocorressem em uma concentração de substrato de 3mM.Tipicamente, uma diluição de 1:50 das amostras de enzimalíquida Flavourzyme, Corolase LAP e endoprotease específicapara prolina foi usada. Do produto seco Sumizyme FP foiusada uma solução a 1%.

A cor amarela como medido a 405 nm pela "MTP TecanGênios" que se desenvolve como o resultado da clivagem daligação aminoácido-pNA foi seguido por pelo menos 2 0 cicloscinéticos (cerca de 10 minutos). O programa gerou os dadosobtidos como OD405/min.

Medição da atividade de endoprotease especifica paraprolina

Essa medição foi realizada essencialmente da mesmaforma que o ensaio de aminopeptidase mas nesse caso Z-AAAP-pNA foi usado como o único substrato em uma concentraçãofinal de 3 mmol/1. Esse substrato foi solubilizado poraquecimento da suspensão em tampão de pH 6 a 50-55°Cresultando em uma solução transparente em temperaturaambiente. As medições foram realizadas a 4 0°C.

Tipicamente uma diluição de 1:50 das amostras deenzima líquida Flavourzyme e Corolase LAP foram usadas.Sumizyme FP foi usada em uma solução a 1%. A endoproteaseespecífica para prolina foi tipicamente usada em umadiluição de 1:5000.

O programa gerou os dados como OD40s/min.

Medição das atividades contaminantes da endoprotease nãoespecífica para prolina

Essa medição também foi realizada essencialmente domesmo modo descrito para o ensaio de aminopeptidase masnesse teste Z-AAAF-pNA e Z-AAAR-pNA em uma proporção de 1:1e em uma concentração final de 3 mmol/1 foram usados como osubstrato. O substrato Z-AAAF-pNA era pouco solúvel sob ascondições de teste de pH 6,0 usadas, mas uma incubação deteste com subtilisina resultou em uma rápida solubilizaçãodo substrato concomitantemente com a liberação de pNA. Asmedições foram realizadas a 40°C. No entanto, paracompensar essa pouca solubilidade, o leitor de MTP foiprogramado para agitar entre os ciclos cinéticos.

Novamente o programa gerou os dados como OD405/min.

Medição das atividades contaminantes de carboxipeptidase

Porque nenhum peptídeo cromogênico sensível édisponível para medir as atividades de carboxipeptidase,foi usado um método baseado no protocolo de Boehringer paraquantificar a carboxipeptidase C.

Duas soluções de estoque de 150 mmol/1 em etanol de Z-A-F e Z-A-R foram diluídas 80 vezes em 0,1 mol/1 tampãoBisTris pH 6 para fazer uma solução de substrato a 3,75mmol/1 de Z-A-F + Z-A-R contendo Z-A-F e Z-A-R em umaproporção de 1:1. Então 200 pl da solução de substratoforam pipetados em um frasco de Eppendorf e pré-incubados a40° C. A reação foi iniciada pela adição de 50 |il de umasolução de enzima adequada. Tipicamente, uma diluição de1:50 é usada de Flavourzyme e Corolase LAP e aendoprotease específica para prolina. Uma solução a 1% foiusada para Sumizyme FP. Depois de 5 minutos a reação foiinterrompida pela adição de 250 ul de reagente deninhidrina. 0 reagente de ninhidrina foi feito de 4 00 mg deninhidrina (Merck) e 60 mg hidrindantina dissolvida 15 mlDMSO, à qual 5 ml de 4,0 mol/1 de tampão de acetato delítio em pH 5,2 foram adicionados. Os 4,0 mol/1 de tampãode acetato de lítio foram feitos por dissolução de LiOH(Sigma) após o que o pH da solução foi ajustado ao pH 5,2usando ácido acético glacial (Merck).

Após interromper a reação, cada amostra foi aquecidapor 15 minutos a 95°C para facilitar a formação de cor esubseqüentemente diluída 10 vezes com etanol puro. A corformada foi medida a 578 nm em um espectrofotômetro Uvikon.Os Brancos foram feitos da mesma forma que as amostras deatividade, mas a adição do reagente de ninhidrina e enzimafoi revertida. Para quantificar a quantidade de aminoácidoslivres gerados pela atividade de carboxipeptidase, oaminoácido L-fenilalanina foi usado para criar uma curva decalibragem. Soluções em tampão em pH 6 contendo 0,1875,0,375, 0,75, 1,5 e 3,0 mmol/1 de L-fenilalanina (Sigma)foram tratadas da mesma forma que as amostras, ou seja,25 0 jj.1 em um frasco. Dos valores de OD578 obtidos, foiconstruída uma curva em Excel. As concentrações dosaminoácidos livres presentes nas amostras contendo ossubstratos Z-A-F e Z-A-R foram calculados com o uso dessacurva. A partir dos valores obtidos a atividade decarboxipeptidase foi calculada em micromoles por minuto poruma quantidade de enzima testada.Cálculo das proporções da atividade

Para estabelecer a adequação das várias preparações deenzima para o processo de acordo com a invenção, quocientesdas atividades de enzima relevante foram calculados. Nosensaios baseados em leito de MTP, as atividades da enzimasão caracterizadas por liberação de pNA pelo tempo, ouseja, como ÀOD405/min. Os quocientes de atividades de enzimaobtidos pelo leitor de MTP foram calculados por divisãosimples dos valores de AOD/min obtidos pelas quantidadesidênticas de enzima.

No entanto, no caso do ensaio de carboxipeptidase, égerado um OD que não pode ser comparado diretamente aoAOD/min gerado pelos ensaios baseados em MTP-pNA. Aqui, oOD medido foi primeiramente convertido a jamol de aminoácidoliberado por minuto (|j,mol/min) . Então o ÀOD/min de pNAliberado foi convertido em |imol/min. Para esse fim, umacurva de calibragem foi gerada no leitor de MTP no qual asdiluições de pNA puro (Sigma) 0,25, 0,125, 0,0625, 0,0312 e0,015 mmol/1 e 250 j^l por cavidade foram medidas. A partirdos dados obtidos foi construída uma curva de calibragem emExcel. A partir dessa curva de calibragem o AOD/min foiconvertido em |j,mol/min de modo que as medições baseadas empNA podem ser comparadas com as medições baseadas emninhidrina.

Com base nos dados gerados nos testes acimamencionados, as varias preparações de enzima usadas foramcaracterizadas em termos de atividades específicas paraprolina desejadas (e alanina) e endoprotease contaminante,atividades de aminopeptidase e carboxipeptidase. Os dadossobre as atividades oligo ou endoproteolíticas específicaspara prolina presentes em cada preparação de enzima sãomostrados na Tabela 1 na coluna "Atividade Prol SpEC". Osdados sobre as atividades de aminopeptidase contaminante(AP/Prol SpEC Act), a carboxipeptidase contaminante(CPD/Prol SpEC Act) e as atividades endoproteolíticascontaminantes (Endo/Prol SpEC Act) são mostrados em relaçãoà atividades específica para prolina presente. O nível daatividade de aminopeptidase contaminante em relação àatividade de carboxipeptidase contaminante presente em cadapreparação é mostrada como (AP/CPD).

É evidente que nenhuma das preparações comerciais deenzima testadas contém qualquer atividade oligo ouendoproteolítica significativa específica para prolina.

Além disso todas as preparações comerciais de enzimatestadas contêm significativas atividades endo ouexoproteolítica contaminantes.

Tabela 1: Níveis de atividades desejadas deendoprotease (específicas para prolina e alanina) emrelação aos níveis de atividades endo e exoproteolíticacontaminantes.

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* Sumizima foi medida em uma solução a 1%, Flavorzima eCorolase como uma diluição a 1:50. Atividade específicapara Prolina como obtida de A. niger foi medida comodiluição de 1:5000. Os dados foram então calculados para aatividade presente no produto como apresentado.

Exemplo 4

A endoprotease específica para prolina derivada de A. nigerpode hidrolisar grandes proteínas bem como pequenospeptídeos e é, portanto, uma endoprotease verdadeira.

Devido a uma característica estrutural específica, asprolil oligopeptidases que pertencem à família S9 não podem-digerir peptídeos maiores que 3 0 aminoácidos. Essalimitação é uma desvantagem óbvia para uma enzima, que éfeita para hidrolisar, tão rápido e tão eficientementequanto possível, diferentes proteínas. Para verificar se aendoprotease específica para prolina derivada de A. nigerexibe as mesmas limitações com relação ao tamanho damolécula do substrato, nós incubamos a prolil endopeptidasecromatograficamente purificada de A. niger com um pequenopeptídeo sintético e com a molécula grande de ovalbumina eanalisamos os produtos da hidrólise formados por SDS-PAGE.

O peptídeo sintético usado foi um 27-mer da seqüênciaNH2FRASDNDRVIDPGKVETLTIRRLHIPR-C00H e foi um presente dacompanhia Pepscan (Lelystad, Holanda). Como mostrado porsua seqüência de aminoácidos, esse peptídeo contém 2resíduos de prolina, um no meio e um bem na extremidade dopeptídeo.

A molécula intacta de ovalbumina (Pierce Imject,frascos contendo 20 mg de material liofilizado) consiste em385 aminoácidos com um peso molecular de 42.750 Da. Essamolécula contêm 14 resíduos de prolina, um deles localizadona última extremidade C-terminal da molécula e não pode serclivado por a endoprotease específica para prolina.

Ovalbumina e o oligopeptídeo foram separadamenteincubados a 50°C com a endoprotease específica para prolinaderivada de A. niger purificada. As amostras foramretiradas em vários intervalos de tempo que foramanalisadas usando SDS-PAGE.

Uma endoprotease específica para prolinacromatograficamente purificada derivada de A. niger com umaatividade de 4,5 unidades/ml foi diluída 100 vezes com 0,1M tampão de acetato em pH 4 contendo 20 mM CaCl2. Aovalbumina foi dissolvida em tampão de acetato em pH 4 auma concentração de 1 mg/ml (22 uM). O 27-mer foidissolvido no mesmo tampão para atingir uma concentração de0,48 mg/ml (152 uM) . A molaridade da ovalbumina e dasolução de 27-mer foi escolhida em tal forma que ambas assoluções continham a mesma molaridade em resíduos deprolina cliváveis. Ovalbumina contém 13 sítios potenciaisde clivagem de prolina, enquanto o peptídeo 27-mer temapenas dois. De ambas soluções de substrato 0,5 ml foiincubado com 10 ul (0,45 miliU) da solução de enzima em um"Eppendorf thermomixer" a 50°C. Em vários intervalos detempo amostras de 10 \xl foram retiradas da mistura deincubação e mantidas a 20°C até SDS-PAGE. Todos osmateriais usados para SDS-PAGE e coloração foram adquiridosde Invitrogen. As amostras foram preparadas com o uso detampão LDS de acordo com as instruções do fabricante eseparadas em géis a 12% Bis-Tris usando sistema de tampãoMES-SDS de acordo com as instruções do fabricante. Acoloração foi realizada usando "Simply Blue Safe Stain"(Collodial Coomassie G250).

Como pode ser observado na Figura 3 ovalbumina éclivada pela enzima derivada de Aspergillus em uma bandadistinta de cerca de 35 a 36 kD nas primeiras 4,75 horas deincubação (linha 3). Períodos prolongados de incubaçãoresultam em quebra adicional a produtos menores de váriospesos moleculares (linha 7).

O peptídeo 27-mer é também quebrado, como julgadopelas bandas mais fracas nas linhas 4, 6 e 8 quandocomparadas à linha 2. A troca de peso molecular muitopequena do produto (comparar linhas 9 e 8) é maisprovavelmente devido à clivagem do resíduo de arginina naextremidade carboxílica do peptídeo. A diferença é de cercade 200 D (medida usando programa AlpHalmager 3.3d em umsistema AlpHalmager 2000) e arginina tem um peso molecularde 174. Essa troca de peso molecular pequena éprovavelmente a primeira etapa na quebra do peptídeo.

A deterioração adicional do produto pode ser observadaapenas pela diminuição na intensidade da banda no gel deSDS. Os produtos da deterioração adicional não sãovisíveis, uma vez que a coloração a gel de componentes comum peso molecular de cerca de 1.000 não é possível com Azulde Coomassie Brilhante.A partir desse experimento pode ser concluído que,diferentemente das prolil oligopeptidases conhecidas quepertencem à família S9, a endoprotease específica paraprolina derivada de A. niger não tem preferência específicapara clivagem de peptídeos de pequeno tamanho sobreproteínas muito maiores. Como tal, a enzima derivada de A.niger representa uma verdadeira endoprotease e uma enzimapreferida para hidrolisar diferentes tipos de proteínas.Esse achado leva ao surpreendente uso da enzima comoilustrado no Exemplo seguinte.

Exemplo 5

Incubação de caseinato de potássio com a endoproteaseespecífica para prolina de A. niger rapidamente produz IPPe LPP mas não VPP.

Nesse experimento a endoprotease específica paraprolina superproduzida e essencialmente pura de A. nigerfoi incubada com caseinato de potássio para testar aliberação dos peptídeos inibidores da ECA IPP, VPP bem comoLPP. A endoprotease usada foi essencialmente purasignificando que nenhuma atividade endoproteolíticasignificativa outra que não a atividade endoproteolíticainerente à endoprotease específica para prolina pura (ouseja, clivagem carboxiterminal de prolina e alaninaresíduos) é presente. Além disso, a preparação da enzima édesprovida de atividades exoproteolítica significativa comodescrito no Exemplo 3.

Para limitar o consumo de sódio como o resultado daingestão de peptídeos inibidores da ECA tanto quantopossível, caseinato de potássio foi usado como o substratonessa incubação.O caseinato foi suspenso em água a 65 graus C em umaconcentração de 10% (p/p) de proteína depois do que o pHfoi ajustado a 6,0 using ácido fosfórico. Então, asuspensão foi resfriada a 55 graus C e a endoproteasederivada de A. niger específica para prolina foi adicionadaem uma concentração de 4 unidades/grama de proteína (veja,a seção materiais e métodos para definição de unidade). Sobagitação contínua essa mistura foi incubada por 24 horas.

Nenhum ajuste de pH adicional foi realizado durante esseperíodo. As amostras foram feitas depois de 1, 2, 3, 4, 8 e24 horas de incubação. De cada amostra, a atividade daenzima foi terminada por aquecimento imediato da amostra a90 graus C por 5 minutos. Após resfriamento, o pH de cadaamostra foi rapidamente diminuído a 4,5 usando ácidofosfórico depois do que a suspensão foi centrifugada por 5minutos a 3.000 rpm em uma centrífuga de topo de mesaHereaus. O sobrenadante completamente transparente foiusado para análise LC/MS/MS para quantificar os peptídeosVPP, IPP, LPP, VWPP e VWPPF no sobrenadante (seja a seçãomateriais & métodos).

Caseína de leite bovino incorpora inúmeras diferentesproteínas que incluem beta-caseína e kapa-caseína. Deacordo com as seqüências amino conhecidas, beta-caseínaengloba os tripeptídeos inibidores de ECA IPP, VPP e LPP.

Em beta-caseína IPP é contido na seqüência -P71-Q72-N73-I74-P75-P76-/ VPP é contido na seqüência -P8i-V82-V83-V84-P85-P86- eLPP e contido na seqüência caseína, que é presente em preparações de caseinatoprecipitadas em ácido em uma concentração molar de quase50% da concentração de beta-caseína, engloba apenas IPP. Emkapa-caseína, IPP está contido na seqüência -A107-I108-P109-P110-. Os outros constituintes da proteína de caseína nãocontêm IPP, VPP ou LPP.

As tabelas 2 e 3 mostram as concentrações dospeptídeos presentes nos sobrenadantes acidificados ecentrifugados como calculado por grama de caseinato depotássio adicionado à mistura de incubação. Como mostradona tabela 2, IPP atinge sua concentração máxima após 1 horade incubação. Além disso, a concentração de IPP não aumentamais. A formação do pentapeptídeo WVPP mostra a mesmacinética que a geração de IPP. Como teoricamente esperado,o rendimento molar de WVPP é similar ao rendimento molardo peptídeo LPP. O rendimento de LPP e de WVPP atingemquase 60% daquilo que seria teoricamente possível. O fatode que a concentração máxima de LPP é atingida apenasdepois de 3 horas de incubação sugere que a clivagemdaquela e particular da molécula de beta-caseína é talvezmais difícil. Em contraste com WVPP, o hexapeptídeo WVPPFnão é formado completamente. Essa observação sugere que aendoprotease específica para prolina cliva de forma eficaza ligação -P-F- dessa forma gerando WVPP. 0 tripeptídeoIPP é formado imediatamente mas seu rendimento molar não émais que cerca de um terço do rendimento molar máximo deWVPP ou LPP. Uma vez que o tripeptídeo IPP está contido embeta-caseínas como em kapa-caseínas, esse resultado éinesperado. Uma explicação provável para essa observação éque a protease específica para prolina pode gerar IPP masda porção kapa-caseínae dos caseinatos apenas. Em vista daseqüência de aminoácidos relevante de kapa-caseínas issosugere que a ligação do peptídeo -A107-I108- é clivada pelaatividade específica para alanina da enzima. Se verdadeiro,a quantidade de IPP liberada atinge aproximadamente 4 0% daquantidade que está presente em kapa-caseína, mas não maisque cerca de 10% do IPP que é teoricamente presente em betamais kapa caseína. Esse mecanismo de clivagem para aliberação de IPP também explica porque VPP não pode serformado a partir de sua molécula precursora WVPP: aatividade endoproteolítica necessária simplesmente não estápresente na preparação de enzima derivada de A. nigerusada.

Tabela 2

Conteúdo de peptídeo molar de sobrenadantes acidificadoscalculado por grama de proteína adicionada.

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Tabela 3

Concentrações de peptídeos em sobrenadantes acidificadoscalculadas em mg/g de proteína adicionada.

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Exemplo 6

Incorporação de uma etapa de precipitação de caseínaácida resulta em uma concentração de 5-vezes dos peptídeosinibidores da ECA

Como descrito no exemplo 5, caseinato de potássio emuma concentração de 10% (p/p) de proteína foi submetido auma incubação com a endoprotease derivada de A. nigerespecífica para prolina em pH 6,0. Depois de váriosperíodos de incubação as amostras foram aquecidas parainterromper atividade adicional da enzima depois do que opH foi diminuído para 4,5 para minimizar a solubilidade dacaseína. Moléculas não solúveis de caseína foram removidaspor uma centrifugação de baixa velocidade. Nas tabelas 2 e3 nós fornecemos concentrações de peptídeos inibidores daECA calculadas com base na concentração inicial de 10% deproteína. No entanto, como o resultado da acidificação e asubseqüente etapa de centrifugação, uma grande proporção daproteína adicionada foi removida. Para levar emconsideração esses conteúdos reduzidos da proteína dossobrenadantes acidifiçados, análises de nitrogênio(Kjeldahl) foram realizadas. De acordo com os últimos dadosos vários sobrenadantes continham os níveis de proteínamostrados na Tabela 4.

Tabela 4

Conteúdo de Proteína de sobrenadantes acidificados

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Levando esses dados em consideração, nós recalculamos aconcentração dos peptídeos inibidores da ECA presentes emcada sobrenadante mas dessa vez usando seu conteúdo real deproteína. Esses dados recalculados são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5

Concentrações de peptídeos em sobrenadantes acidificadoscalculadas por grama de proteína presente.

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A comparação dos dados apresentados nas Tabelas 3 e 5mostra claramente que a etapa simples de acidificaçãoseguida por uma etapa de decantação, filtração oucentrifugação de baixa velocidade industrialmente viáveisresulta em um aumento de 5 vezes na concentração dospeptídeos inibidores da ECA específicos.Exemplo 7

Identificação dos novos e potentes tripeptídeos inibidoresde ECA MAP e ITP em hidrolisados concentrados de caseína

Para facilitar uma análise mais completa dos peptídeosbioativos presentes, o hidrolisado de caseína obtido peladigestão com endoprotease derivada de A. niger específicapara prolina pura e purificado por precipitação de ácidofoi preparado em uma escala preparatória. Para esse fim3.000 gramas de caseinato de potássio foram suspensos em 25litros de água a 75°C. Depois de uma homogeneizaçãocompleta o pH foi lentamente ajustado para 6,0 usandoácido fosfórico diluído. Após resfriamento a 55 graus C, aendoprotease derivada de A. niger específica para prolinasfoi adicionada em uma concentração de 4 unidades deenzima/grama de caseinato (veja a seção materiais & métodospara definição de unidade) . Após uma incubação (comagitação) por 3 horas a 55 graus C, o pH foi diminuídopara 4,5 por lenta adição de ácido fosfórico concentrado.Nessa preparação de maior escala etapa de tratamento porcalor para inativar a endoprotease específica para prolinanessa parte do processo foi omitida. Então a suspensão foirapidamente resfriada a 4 graus C e mantida de um dia parao outro (sem agitação) nessa temperatura. Na próxima manhãa camada superior transparente foi decantada e evaporadapara atingir um nível fr 40% de matéria seca. O últimolíquido concentrado foi submetido a um tratamento UHT de 4segundos a 14 0 graus C e então ultrafiltrado a 50 graus C.Após filtração de germe, o líquido foi seco por spray. Essematerial é aqui referido como peptídeos bioativos derivadosde caseína (CDBAP). Com o uso de procedimentos LC/MSapontados na seção materiais & métodos, o conteúdo de IPP,LPP e VPP do produto em pó foi determinado. De acordo comseu conteúdo de nitrogênio, o produto em pó tem um conteúdode proteína de cerca de 60% (usando um fator de conversãode 6,38). Os conteúdos de IPP, LPP e VPP do pó sãofornecidos na Tabela 6. A composição de aminoácidos doproduto CDBAP é fornecida na Tabela 7. É bastante notável oaumento do conteúdo molar de prolina do material seco porspray obtido após precipitação de ácido: de 12% inicialpara aproximadamente 24%.

Tabela 6: conteúdo de IPP, LPP e VPP de CDBAP.

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Tabela 7: Composição de aminoácidos do material deiniciação de caseinato de potássio e CDBAP (conteúdo deaminoácido após hidrólise ácida e mostrado comopercentagens do conteúdo de aminoácido molar).

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A presença de novos peptídeos inibidores da ECA emCDBAP foi investigada pelo uso de separação cromatográficabidimensional combinada com um ensaio de inibição de ECA emlinha e espectrometria de massa para identificação. Naprimeira análise a mistura de peptídeos foi separada em umacoluna de cromatográfia líquida (LC) 0DS3 e perfis deinibição de ECA foram gerados das várias frações obtidas.

Em uma segunda análise as frações da primeira coluna quemostram uma alta inibição de ECA foram também separadas emuma coluna Biosuite LC usando um diferente perfil degradiente. As frações coletadas dessa segunda coluna foramdivididas em duas partes: uma parte foi usada para amedição da inibição de ECA em linha enquanto a outra partefoi submetida a análise MS e MS-MS para identificar ospeptídeos presentes.

Todas as análises foram realizadas em sistema Alliance2795 HPLC (Waters, Etten-Leur, Holanda) equipado com umdetector de UV de traço duplo. Para a identificação dospeptídeos o sistema de HPLC foi ligado a um espectrômetrode massa Q-TOF do mesmo fornecedor. Nos testes 20 pl de umasolução a 10% (p/v) de CDBAP em água Milli-Q foraminjetados em uma coluna 150 x 2,1 Inertsil 5 0DS3 com umtamanho de partícula de 5 um (Varian, Middelburg, Holanda).

A fase A móvel consistia em uma solução a 0,1% de ácidotrifluoracético (TFA) em água Milli-Q. A fase móvel Bconsistia em uma solução a 0,1% de TFA em acetonitrila. Acomposição eluente inicial foi 100% A. O eluente foimantido em 100% de A por 5 minutos. Então um gradientelinear foi iniciado em 10 minutos a 5% de B, seguido por umgradiente linear em 10 minutos para 3 0% de B. A coluna foiestimulada elevando a concentração de B para 70% em 5minutos, e foi mantida a 70% de B por mais 5 minutos.

Depois disso o eluente foi trocado para 100% de A em 1minuto e equilibrado por 9 minutos. O tempo de passagemtotal foi de 50 minutos. O fluxo de efluente foi 0,2 mlmin"1 e a temperatura da coluna foi ajustada em 60°C. Umcromatograma de UV foi registrado a 215 nm. As frações doeluente foram coletadas em uma placa de 96 cavidades usandoum tempo de intervalo de 1 minuto que resulta em volumes defração de 200 pl. O efluente nas cavidades foi neutralizadopor adição de 80 ul de uma solução a 0,05% de hidróxido deamônio aquoso (25%). O solvente foi evaporado até secar sobnitrogênio a 50°C. Depois disso, o resíduo foireconstituído em 4 0 pl de água Milli-Q e misturado por 1minuto.

Para o ensaio de inibição de ECA em linha 27 pl de33,4 mU ml"1 ECA (enzima obtida de Sigma Chemicals) emsolução salina tamponada por fosfato (PBS) pH 7,4 com umaconcentração de cloreto de 260 mm foi adicionada e amistura foi deixada em incubação por 5 minutos em ummisturador de placa de 96 cavidades a 700 rpm. Após operíodo de incubação, 13 ul de uma solução 0,35 mm ácidohipúrico-histidina-leucine (hhl) em tampão de PBS foiadicionada e misturada por 1 minuto a 700 rpm. A misturafoi deixada em reação por 60 minutos a 50°C em um forno GC.Depois da reação, a placa foi resfriada em gelo emderretimento.

A placa de 96 cavidades foi então analisada em umacoluna flash-HPLC. Da mistura de reação de cada cavidade,30 ul foram injetados em uma coluna de HPLC Chromlith FlashRP18e 25 x 4,6 mm (Merck, Darmstadt, Alemanha) equipada comuma coluna 10 x 4,6 mm RP18e guard do mesmo fornecedor. Afase móvel isocrática consistia em uma solução a 0,1% deTFA em água/acetonitrila 79/21. O fluxo de eluente foi 2 mlmin"1 e a temperatura da coluna foi de 25°C. As injeçõesforam realizadas com um tempo de intervalo de 1 minuto.Ácido hipúrico (H) e HHL foram monitorados a 28 0 nm. Asalturas do pico de H e HHL foram medidas e a inibição deECA (ACEI) de cada fração foi calculada de acordo com aequação:

<formula>formula see original document page 60</formula>

ACEIa percentagem de inibição do analito

DCw grau de clivagem por ECA de HHL para H e HL em água

DCa grau de clivagem de HHL para H e HL para oanalitoO grau de clivagem foi calculado por expressão daaltura do pico de H como uma fração da soma das alturas dospicos de H e HHL.

A maior inibição de ECA foi medida nas frações queeluem entre 18 e 26 minutos. Essa região foi coletada ereinjetada em uma coluna 150 x 2,1 mm Biosuite com umtamanho de partícula de 3 um (Waters, Etten-Leur, Holanda).A fase móvel A consistiu em uma solução a 0,1% de ácidofórmico (FA) em água Milli-Q. A fase móvel B consistiu emuma solução a 0,1% em metanol. A composição eluente inicialfoi 100% A. O eluente foi mantido em 100% de A por 5minutos. Depois disso, um gradiente linear foi iniciado em15 minutos a 5% de B, seguido por um gradiente linear em 3 0minutos para 60% de B. Finalmente o eluente foi reduzidopara 100% de fase móvel A em 1 minuto e equilibrado por 10minutos. 0 tempo de passagem total foi de 65 minutos. Ofluxo de efluente foi 0,2 ml min"1 e a temperatura dacoluna foi ajustada em 60°C. O traço de UV foi registrado a215 nm. As frações do eluente foram coletadas da colunaBiosuite em 10 segundos de tempo de intervalo. As fraçõesforam novamente divididas em duas partes, uma parte foiusada para medir a atividade usando o método de inibição deECA em linha anteriormente descrito, enquanto a outra partefoi usada para identificar os peptídeos ativos que usam MSe MS-MS.

Dois picos cromatográficos com íons moleculares de326,2080 Da e dois outros picos com íons moleculares de330,2029 Da e 318,1488 Da corresponderam com a inibição deECA aumentada medida na área entre 18 e 26 minutos. UsandoMS-MS, esses peptídeos foram identificados como os isômerosestruturais IPP e LPP (- 0,6 ppm) , ITP (-4,8 ppm) e MAP(+2,8 ppm) respectivamente. As fontes de proteína dospeptídeos são kapa-caseína f108-110 (IPP) , p-caseína f151-153 (LPP), a-s2-caseína fll9-121 (ITP) e p-caseína fl02-104(MAP). IPP e LPP foram relatados anteriormente comopeptídeos inibidores da ECA com valores de IC50 de 5 e 9,6um respectivamente (Y. Nakamura, M. Yamamoto., K. Sakai.,A. Okubo., S. Yamazaki, T. Takano, J. Dairy Sei. 78 (1995)777-783; Y. Aryoshi, Trends in Food Science and Technol. 4(1993) 139-144). No entanto, os tripeptídeos ITP e MAPnunca foram antes relatados como potentes peptídeosinibidores da ECA.

MAP, ITP e IPP foram quimicamente sintetizados e aatividade de cada peptídeo foi medida usando um ensaiomodificado de Matsui aqui descrito.

A quantificação de MAP e ITP nas várias amostras foirealizada em um instrumento Micromass Quattro II MS operadono eletrospray positivo, modo de monitoramento de reaçãomúltiplo. O método de HPLC usado foi similar àqueledescrito acima. Os ajustes de MS (ESI+) foram como sesegue: voltagem de cone 37 v, voltagem capilar 4 kv,secagem de gás nitrogênio a 3 00 l/h. Temperatura da fonte enebulizador: 100°C e 250°C, respectivamente. Os peptídeossintetizados foram usados para preparar uma linha decalibragem usando o íon precursor 318,1 e os íons doproduto somado 227,2 e 347,2 para MAP e usando o íonprecursor 320,2 e os íons do produto somado 282,2 e 501,2para ITP. De acordo com essas análises os novostripeptídeos inibidores de ECA MAP e. ITP estão presentes noproduto CDBAP em quantidades que correspondem com 2,9 mgMAP/grama de CDBAP ou 4,8 mg MAP/grama de proteína em CDBAPe 0,9 mg ITP/grama de CDBAP e 1,4 mg ITP/grama de proteínaem CDBAP.

Para determinar a atividade de inibição de ECA de MAPe ITP, os tripeptídeos quimicamente sintetizados foramanalisados de acordo com o método de Matsui e cols.(Matsui, T. e cols. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56:517-518) com algumas pequenas modificações. As váriasincubações são mostradas na Tabela 8.

Tabela 8: Procedimento para ensaio de inibição de ECA deMatsui. Os componentes foram adicionados em um tubo de 1,5ml com um volume final de 120 \il.

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Cada uma das quatro amostras continha 75 ml 3 mmhipuril histidina leucina (Hip-His-Leu, sigma) dissolvidosem uma solução de 250 mm borato contendo 200 mm Nacl, pH8,3. ECA foi obtido de Sigma Chemicals. As misturas foramincubadas a 3 7°C e interrompidas depois de 3 0 minutos pelaadição de 125 ul 0,5 M HC1. Subseqüentemente, 225 ul desolução bicine/NaOH (1 M NaOH:0,25 m bicine (4:6)) foramadicionados, seguido por 25 ul 0,1 M TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, Fluka, Suíça; em 0,1 M Na2HP04).

Depois de incubação por 20 minutos a37°C, 4ml4mM Na2S03em 0,2 M NaH2P04 foi adicionado e a absorvência de luz a416 nm foi medida com espectrofotômetro UV/Vis (ShimadzuUV-1601 com um controlado CPS, Holanda).

A quantidade da atividade de inibição de ECA (ACEI)foi calculada como uma percentagem de inibição comparadacom a taxa de conversão de ECA na ausência de um inibidorde acordo com a seguinte fórmula:

ACEI (%) = ((controle 1 - controle 2)-(amostra 1-amostra 2))/(controle 1- controle 2)) * 100 em quecontrole 1 = absorvência sem componente inibidor de ECA(=atividade max. de ECA) [AU].

controle 2 = absorvência sem componente inibidor de ECA esem ECA (valor de base) [AU].

Amostra 1 = absorvência na presença de ECA e do componenteinibidor de ECA [AU].

Amostra 2 = absorvência na presença do componente inibidorde ECA, mas sem ECA [AU].

As IC50 dos tripeptídeos MAP e ITP quimicamentesintetizados como obtido são mostradas na Tabela 9 juntocom valores de IC50 obtidos nas medições em linha usadas nafase de rastreamento do experimento. A medição de IPPquimicamente sintetizado foi incluída como uma referênciainterna para as várias medições.

Tabela 9: Inibição de ECA (valores de IC50) de MAP, ITP evalores de IPP determinados pelo ensaio de ECA em linha e oensaio modificado de Matsui.

<table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table>

Exemplo 8

Novos peptídeos inibidores da ECA MAP e ITP provavelmentesobrevivem no trato gastrointestinal humano

Após o consumo, as proteínas e peptídeos da dietahumana são expostos a vários processos enzimáticosdigestivos no trato gastrointestinal. Para avaliar aestabilidade dos peptídeos bioativos recém identificados notrato gastrointestinal humano, a preparação de CDBAP(preparada como descrito no exemplo 7) foi submetida a umtratamento gastrointestinal (GIT) que simula as condiçõesdigestivas tipicamente encontradas no corpo humano.

Amostras obtidas após vários tempos de incubação no modelode sistema GIT foram analisadas usando o sistema em linhaHPLC-bioensaio-MS ou HRS-MS para quantificar quaisquerpeptídeos residuais MAP e ITP. O procedimento GIT foirealizado em um dispositivo padrão de mistura que incorporaum frasco de 100 ml (suprido por Vankel, US). A temperaturado banho de água foi ajustada em 37,5°C e a velocidade foiescolhida de modo que a amostra fosse mantida em suspensão(100 rpm).

Cerca de 3,4 gramas de CDBAP (nível de proteína deaprox 60%) foi dissolvida/suspensa em 100 ml de águaMilliQ. Durante a simulação gástrica 5 M HC1 foram usadospara diminuir o pH. Ao final da simulação gástrica edurante a fase duodenal 5 M NaOH foram usados para elevar opH.

A suspensão de CDBAP foi pré-aquecida a 37,5°C e 5 mlda suspensão foram removidos para dissolver 0,31 g depepsina (Fluka order no. 77161) . Em t= 0 minutos os 5 mlcom a pepsina agora dissolvida foram adicionados de volta àsuspensão. Então o pH da suspensão de CDBAP foi ajustadolentamente por uso manual de um medidor de pH separado deacordo com o seguinte esquema:

t = 20 min pH diminuiu a 3,5

t = 40 min pH a 3,0

t = 50 min pH a 2,3

t = 60 min pH a 1,8

t = 65 min pH elevado a 2,7

t = 75 min pH a 3,7

t = 80 min pH a 5,3

em t = 90 min 0,139 g de 8 vezes USP pancreatina (Sigmaorder no. p7545) foi cuidadosamente misturado em outros 5ml da suspensão de CDBAP e imediatamente adicionado devolta. A incubação continuou de acordo com o seguinteesquema:

t = 93 min pH a 5,5

t = 95 min pH a 6,3

t = 100 min pH a 7,1

o experimento foi interrompido em t = 125 minutos e o pHfoi checado (foi ainda pH 7).

Então as amostras foram transferidas para um Beaker eforam colocadas em um microondas até ferver.Subseqüentemente, as amostras foram transferidas para tubosde vidro e incubadas a 95°C por 60 minutos para inativartoda a atividade da protease. Após resfriamento as amostrasforam colocadas em tubos Falcon e centrifugadas por 10minutos a 3.000 x g. O sobrenadante foi liofilizado. Aconcentração total N do pó como obtido foi determinada econvertida ao nível de proteína usando o fator de Kjeldahlde caseína (6,38) . De acordo com esses dados o nível deproteína da preparação de CDBAP após o procedimento GIT foide 48,4%. Os níveis de MAP e ITP que sobrevivem aotratamento proteolítico de acordo com o procedimento GITforam determinados como descrito no exemplo 7 e os dadosobtidos são mostrados na Tabela 10.

De acordo com os resultados do experimento MAP e ITPexibem uma alta resistência contra digestão GIT. Emcombinação com os baixos valores de IC50 para essestripeptídeos (também como determinado no exemplo 7) , osdados sugerem considerável potencial para os dois novospeptídeos inibidores da ECA como peptídeos de diminuição dapressão arterial.

Tabela 10: Concentrações de MAP e ITP antes e depois dapassagem através de um trato gastrointestinal humanosimulado (procedimento GIT)

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Claims (10)

1. Tripeptídeo MAP e/ou o tripeptídeo ITP e/ou um salde MAP e/ou um sal de ITP.

2. Hidrolisado de proteínas caracterizado porcompreender MAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal deITP.

3. Hidrolisado de proteínas, de acordo com areivindicação 2, caracterizado por possuir um DH de 5 a-50%, preferivelmente 10 a 40%, mais preferivelmente um DHde 2 0 a 3 5%.

4. Mistura de peptídeos caracterizada por compreenderMAP e/ou ITP ou um sal de MAP e/ou um sal de ITP.

5. Mistura de peptídeos, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por compreenderpelo menos 1 mg de proteína MAP/grama, preferivelmentepelo menos 2 mg de proteína MAP/grama,mais preferivelmente pelo menos 4 mg de proteínaMAP/grama.

6. Mistura de peptídeos, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que a quantidade depeptídeos que tem um peso molecular de menos que 500 Da épelo menos 3 0 % em peso (matéria seca) da mistura depeptídeos, preferivelmente entre 35 e 70% em peso (matériaseca) da mistura de peptídeos.

7. Mistura de peptídeos, de acordo com qualquer umadas reivindicações 4, 5 ou 6 ou um hidrolisado de proteínasde acordo com as reivindicações 2 ou 3 caracterizada porcompreender ainda IPP ou LPP.

8. Mistura de peptídeos, de acordo com qualquer umadas reivindicações 4, 5 ou 6 ou um hidrolisado de proteínasde acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada porcompreender 1 a 90% de água, pref erivelmente 1 a 3 0% deágua, mais preferivelmente 1 a 15% de água.

9. Método para produção do tripeptídeo MAP e/ou ITPe/ou um sal destes, caracterizado por compreender ahidrólise enzimática de uma proteína e conversão opcionalde MAP e/ou ITP em seu sal.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado por compreender o uso de uma protease,preferivelmente uma protease específica para prolina, parahidrolisar uma proteína adequada.