BRPI0610368A2 - modulação de enzima e de receptor - Google Patents

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BRPI0610368A2
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amino acid
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ester
enzyme
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Alan Hornsby Davidson
Alan Hastings Drummond
Lindsey Ann Needham
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Chroma Therapeutics Ltd
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Abstract

Conjugação covalente de um éster de alfa-aminoácido a um modulador da atividade de uma enzima ou um receptor intracelular-alvo, em que o grupo áster do conjugado é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxilesterases intracelulares no ácido correspondente, leva ao acúmulo do produto de hidrólise de ácido carboxílico na célula e permite uma modulação aumentada ou mais prolongada da enzima ou do receptor em relação ao modulador não conjugado.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA-ÇÃO DE ENZIMA E DE RECEPTOR".
A presente invenção refere-se a um método geral de aumentoou prolongamento da atividade de um composto que modula a atividade deuma enzima ou um receptor intracelular pela conjugação covalente de ummotivo éster de alfa-aminoácido ao modulador. A invenção também refere-seaos moduladores aos quais um motivo éster de alfa-aminoácido foi conjuga-do covalentemente, e a um método para a identificação desses conjugadosque possuem propriedades superiores em relação ao modulador não conju-gado parente. A invenção ainda refere-se ao uso de moduladores que con-têm motivos éster de aminoácido que permitem o acúmulo seletivo de conju-gados de aminoácido dentro das células da linhagem monócito-macrófago.
Antecedentes da invenção
Muitas enzimas e receptores intracelulares são alvos para fár-maços farmaceuticamente úteis que modulam suas atividades ligando-seaos seus sítios ativos. São apresentados exemplos na Tabela 1 abaixo. Paraalcançar as enzimas e receptores-alvo, os compostos moduladores devem,evidentemente, atravessar a membrana celular do líquido plasmáti-co/extracelular. Em geral, moduladores de carga neutra atravessam a mem-brana celular mais facilmente do que as espécies com carga. É atingido en-tão um equilíbrio dinâmico pelo qual o modulador se equilibra entre o plasmae o interior da célula. Em conseqüência desse equilíbrio, os tempos de per-manência e as concentrações intracelulares de muitos moduladores de en-zimas e receptores intracelulares são freqüentemente muito baixos, especi-almente nos casos em que o modulador é rapidamente depurado do plasma.
As potências dos moduladores são, portanto, baixas, apesar de suas afini-dades de ligação elevadas pela enzima ou receptor-alvo.
Seria desejável, portanto, que houvesse a disponibilidade de ummétodo para o aumento da concentração intracelular de certo modulador deuma enzima ou um receptor intracelular. Isso produziria uma potência au-mentada e, por prolongar a permanência do modulador dentro da célula, re-sultaria na melhora das propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas.Seriam obtidas uma exposição mais consistente e freqüências de dosagemreduzidas. Um benefício adicional poderia ser obtido se o fármaco pudesseser direcionado às células-alvo específicas responsáveis por sua ação tera-pêutica, reduzindo a exposição sistêmica e, desse modo, os efeitos colaterais.
Breve descrição da invenção
Esta invenção fornece um método como esse, e descreve modu-ladores aprimorados que incorporam os princípios estruturais sobre os quaiso método se baseia. Ela se beneficia do fato de que moléculas lipofílicas(baixa polaridade ou carga neutra) passam através da membrana celular epenetram nas células de forma relativamente fácila, o que não ocorre commoléculas hidrofílicas (polaridade maior, com carga). Portanto, se um motivolipofílico for anexado a certo modulador, permitindo que o modulador penetrena célula, e se aquele motivo for convertido na célula em um com polaridademaior, deve-se esperar que o modulador com o motivo com polaridade maioranexado se acumule dentro da célula. Desde que um motivo como esse sejaanexado ao modulador de tal forma que não altere seu modo de ligação coma enzima ou receptor-alvo, espera-se que o acúmulo de modulador com omotivo de polaridade maior anexado resulte em atividade prolongada e/ouaumentada.
A presente invenção se utiliza do fato de que há enzimas carbo-xilesterase dentro das células, as quais podem ser utilizadas para hidrolisarum motivo éster de alfa-aminoácido anexado a certo modulador no ácidoparente. Portanto, um modulador pode ser administrado como um conjugadocovalente com um éster de alfa-aminoácido, e nessa forma ele penetra fa-cilmente na célula onde é hidrolisado eficientemente por uma ou mais carbo-xilesterases intracelulares, e o conjugado alfa-aminoácido-modulador resul-tante se acumula dentro da célula, aumentando a potência global e/ou otempo de permanência ativa. Constatou-se também que, por modificação domotivo alfa-aminoácido ou a forma na qual ele é conjugado, moduladorespodem ser direcionados a monócitos e macrófagos. Nesta especificação, amenos que "monócito" ou "monócitos" seja especificado, o termo "macrófa-go" ou "macrófagos" será usado para indicar macrófagos (incluindo macró-fagos associados a tumores) e/ou monócitos.Descrição detalhada da invenção
Portanto, em um aspecto amplo, a presente invenção forneceum conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e um modulador daatividade de uma enzima ou um receptor intracelular-alvo, em que: o grupoéster do conjugado é hidrolisável por uma ou mais enzimas intracelularescarboxilesterase no ácido correspondente; e o éster de alfa-aminoácido éanexado covalentemente ao modulador em uma posição distante da interfa-ce de ligação entre o modulador e a enzima ou o receptor-alvo, e/ou é con-jugado ao modulador de tal forma que o modo de ligação do modulador con-jugado e o referido ácido que corresponde à enzima ou receptor-alvo seja omesmo que aquele do modulador não conjugado.
Olhada de outra forma, a invenção fornece um método de au-mento ou prolongamento da potência e/ou do tempo de permanência intra-celular de um modulador da atividade de uma enzima ou um receptor intra-celular-alvo que compreende a modificação estrutural do modulador por a-desão covalente a ele de um éster de alfa-aminoácido, em uma posição dis-tante da interface de ligação entre o modulador e a enzima ou o receptor-alvo, e/ou de tal forma que o modo de ligação do modulador conjugado e oreferido ácido que corresponde à enzima ou receptor-alvo seja o mesmo queaquele do modulador não conjugado, o grupo éster do conjugado sendo hi-drolisável por uma ou mais enzimas intracelulares carboxilesterase no ácidocorrespondente.
Como definido, a invenção refere-se à modificação de modula-dores de enzimas ou receptores intracelulares. Embora o princípio da inven-ção seja de aplicação geral, não restrito pela identidade química do modula-dor ou pela identidade da enzima ou do receptor-alvo, prefere-se fortementeque o modulador seja um que exerça seus efeitos por ligação reversível àenzima ou ao receptor-alvo, em oposição àqueles cujo efeito é causado porligação covalente à enzima ou ao receptor-alvo.
Como por questões práticas, é necessário que o conjugadocarboxilesterase-hidrolisado retenha a atividade de ligação intracelular domodulador parente com sua enzima ou receptor-alvo, e a adesão do motivoéster deve levar em conta esse requisito, que será preenchido caso o motivoéster de alfa-aminoácido carboxilesterase seja anexado ao modulador de talforma que o modo de ligação do produto da hidrólise de carboxilesterasecorrespondente (ou seja, o ácido correspondente) ao alvo seja essencial-mente o mesmo que o do modulador não conjugado. Em geral, isso é obtidopor adesão covalente do motivo éster de carboxilesterase ao modulador emuma posição distante da interface de ligação entre o modulador e a enzimaou o receptor-alvo. Dessa forma, o motivo é disposto para se estender emsolvente, em vez de interferir potencialmente com o modo de ligação.
Além disso, o motivo aminoácido carboxilesterase obviamentedeve ser um substrato para a carboxilesterase caso ele deva ser hidrolisadopor ela dentro da célula. Carboxilesterases intracelulares são promíscuas emgeral, pelo fato de que sua habilidade para hidrolisar não depende de requi-sitos estruturais muito restritos do substrato de éster de aminoácido. Portan-to, a maioria dos modos de conjugação covalente do motivo aminoácido car-boxilesterase a um modulador permite a hidrólise. Geralmente, isso é obtidoatravés de adesão por uma cadeia vinculadora flexível.
Será observado que qualquer modificação química de um fár-maco pode subitamente alterar sua geometria de ligação, e a estratégiaquímica para a ligação do motivo éster de carboxilesterase pode introduzirinterações de ligação adicionais com o alvo, ou pode substituir uma ou maisdessas interações. Portanto, o requisito de que o modo de ligação do conju-gado hidrolisado ao alvo seja o mesmo que o do modulador não conjugadodeve ser interpretado como sendo necessário que não haja perturbação sig-nificativa do modo de ligação; em outras palavras, que o modo de ligaçãoseja essencialmente o mesmo que o do modulador não conjugado. Quandoo requisito é cumprido, as principais características de ligação do moduladorparente são retidas, e os moduladores modificados e não modificados têmum conjunto global comum de características de ligação. Os pontos de vistade "mesmo modo de ligação" e "adesão remota" são similares, pois, comodefinido anteriormente, a forma normal de se obter o requisito de "mesmomodo de ligação" é a anexação do motivo carboxilesterase em um ponto namolécula de modulador que seja distante da interface de ligação entre o ini-bidor e a enzima ou o receptor-alvo. No entanto, deve-se observar que es-ses requisitos não implicam em que o conjugado e/ou seu ácido correspon-dente devam ter a mesma potência moduladora in vitro ou in vivo que o mo-dulador parente. Em geral, no entanto, prefere-se que a esterase-ácido car-boxílico hidrolisado tenha uma potência em um ensaio de ligação de enzimaou de receptor in vitro de, no mínimo, um décimo da potência do moduladorparente naquele ensaio, e que o éster tenha uma potência em um ensaio deatividade celular pelo menos tão alta quanto àquela do modulador parenteno mesmo ensaio.
Embora os métodos tradicionais de química medicinal de ma-peamento dos relacionamentos estrutura-atividade sejam perfeitamente ca-pazes de identificar uma estratégia de adesão para atingir os requisitos cita-dos anteriormente de "mesmo modo de ligação" e "adesão remota", técnicasmodernas como RMN e cristalografia de raios-X avançaram ao ponto emque é muito comum que o modo de ligação de um modulador conhecido deuma enzima ou um receptor seja conhecido ou determinável. Tais informa-ções são, na grande maioria dos casos, de domínio público, ou podem sermodeladas com o uso de métodos computacionais de modelagem, tais comoancoragem de ligante e modelagem de homologia, com base nos modos deligação conhecidos de moduladores estruturalmente similares, ou a estruturaconhecida do sítio ativo da enzima ou do receptor-alvo. Conhecendo-se omodo de ligação do modulador obtido por essas técnicas, pode ser identifi-cada uma localização adequada para adesão do motivo éster de carboxiles-terase, normalmente (como definido anteriormente) em um ponto no modu-lador que seja distante da interface de ligação entre o inibidor e a enzima ouo receptor-alvo.
Enzimas carboxilesterases intracelulares capazes de hidrolisaro grupo éster do conjugado de alfa-aminoácido ao ácido correspondente in-cluem os três isótipos conhecidos da enzima carboxilesterase humana("hCE") hCE-1 (também conhecida como CES-1), hCE-2 (também conhecidacomo CES-2) e hCE-3 (Drug Disc. Today 2005, 10, 313-325). Embora essassejam consideradas as enzimas principais, outras enzimas carboxiléster co-mo, por exemplo, bifenilhidrolase (BPH) também podem participar na hidróli-se dos conjugados.
O ensaio de células rompidas descrito é um método simples deconfirmação de que certo conjugado de modulador e éster de alfa-aminoácido, ou que certo éster de alfa-aminoácido seja avaliado quanto aum possível motivo éster de carboxilesterase, é hidrolisado, como necessá-rio. Essas enzimas também podem ser prontamente expressas com a utili-zação de técnicas recombinantes, e as enzimas recombinantes podem serusadas para determinar ou confirmar a ocorrência da hidrólise.
É uma característica da invenção que o conjugado desejado re-tenha o motivo alfa-aminoácido ligado covalentemente, quando hidrolisadopela(s) carboxilesterase(s) dentro da célula, uma vez que é o grupo carboxilapolar daquele motivo que evita ou reduz a depuração do conjugado hidroli-sado pela célula e, portanto, contribui para o seu acúmulo dentro da célula.
Na verdade, a potência celular do modulador modificado é predominante-mente causada pelo acúmulo do ácido e sua modulação da atividade do alvo(embora o éster não hidrolisado também exerça sua atividade no alvo pelotempo em que permanece não hidrolisado). Como as células em geral con-têm vários tipos de enzimas peptidase, é preferível que o conjugado, oumais especialmente o conjugado hidrolisado (o ácido correspondente), nãoseja um substrato para tais peptidases. Em particular, prefere-se fortementeque o grupo éster de alfa-aminoácido não possa ser o elemento C-terminalde um motivo dipeptídico no conjugado. No entanto, além da limitação sobreo modo de adesão covalente, o grupo éster de alfa-aminoácido pode ser li-gado covalentemente ao modulador por meio de seu grupo amina ou pormeio de seu carbono alfa. Em alguns casos, o modulador terá um ponto deadesão conveniente para o motivo éster de carboxilesterase e, em outroscasos, uma estratégia sintética terá que ser prevista para sua adesão.
Verificou-se que células que só expressam as carboxilesteraseshCE-2 e/ou hCE-3 e formas recombinantes dessas enzimas só hidrolisamconjugados de éster de aminoácido nos seus ácidos resultantes se o nitro-gênio do grupo alfa-aminoácido for não substituído ou for ligado diretamentea um grupo carbonila, enquanto células que contêm hCE-1, ou hCE-1 re-combinante, podem hidrolisar conjugados de aminoácido com uma grandevariedade de grupos no nitrogênio. Esses requisitos de seletividade de hCE-2 e hCE-3 podem se transformar em uma vantagem quando for necessárioque o modulador se dirija a enzimas ou receptores apenas em certos tiposde células. Verificou-se que as quantidades relativas dessas três enzimascarboxilesterase variam entre os tipos de células (vide Figura 1 e base dedados em http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas (observe que, nessa base de da-dos, hCE3/CES3 é citado pelo símbolo FLJ21736)). Se o modulador for des-tinado a atuar somente em tipos de células nos quais se encontra hCE-1, aadesão de um motivo éster de carboxilesterase na qual o grupo amina é li-gado diretamente a um grupo diferente de carbonila resultará no acúmulo deconjugado de modulador hidrolisado preferentemente em células com con-centrações expressivas de hCE-1. Em outras palavras, o acúmulo específicodo ácido derivado do conjugado de modulador em células que expressamem hCE-1 pode ser obtido ligando-se o motivo éster de aminoácido ao mo-dulador de tal forma que o átomo de nitrogênio do éster de aminoácido nãoseja ligado diretamente a um carbonila, ou que seja mantido não substituído.
Os macrófagos são conhecidos por sua participação em distúr-bios inflamatórios através da liberação de citocinas, em particular TNFcc e IL-1 (van Roon e outros. Arthrítis and Rheumatism, 2003, 1.229-1.238). Na ar-trite reumatóide, eles são os principais contribuintes para a inflamação edestruição articulares (Conell em N. Eng J. Med. 2004, 350, 2.591 -2.602).Os macrófagos também estão envolvidos no crescimento e desenvolvimentode tumores (Naldini e Carraro em Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy, 2005,3-8). Portanto, agentes que se dirigem seletivamente a células de macrófa-gos teriam aplicação no tratamento de câncer, inflamação e doença autoi-mune. Espera-se que esse direcionamento a tipos celulares específicos levea uma redução dos efeitos colaterais. A presente invenção fornece um mé-todo de direcionamento de moduladores aos macrófagos, com base na ob-servação acima de que a forma pela qual o motivo éster de carboxilesteraseé ligado ao modulador determina se ele é hidrolisado por carboxilesterasesespecíficas e, dessa forma, se o ácido resultante se acumula ou não em di-ferentes tipos celulares. Especificamente, verificou-se que macrófagos con-têm a carboxilesterase humana hCE-1, o que não ocorre em outros tiposcelulares. Nos conjugados da invenção, quando o nitrogênio do motivo ésterfor substituído, mas não ligado diretamente a uma porção de grupo carboni-la, o éster só será hidrolisado por hCE-1 e, desse modo, os conjugados deesterase-modulador hidrolisado só irão se acumular em macrófagos.
Há, evidentemente, muitos grupos éster possíveis que podem,em princípio, estar presentes no motivo éster de carboxilesterase para ade-são ao modulador. Da mesma forma, há muitos alfa-aminoácidos, tanto na-turais quanto não naturais, que diferem na cadeia lateral no carbono alfa,que podem ser usados como ésteres no motivo éster de carboxilesterase.Alguns ésteres de alfa-aminoácido são rapidamente hidrolisados por um oumais dos isótipos hCE-1, -2 e -3 ou células que contêm essas enzimas, en-quanto outros são hidrolisados mais lentamente, ou só são hidrolisados emuma extensão muito pequena. Em geral, se carboxilesterase hidrolisa o ésterde aminoacido livre no ácido parente, submetida à dependência N-carbonilade hCE-2 e hCE-3 discutida anteriormente, ela também irá hidrolisar o moti-vo éster quando conjugada covalentemente ao modulador. Portanto, o en-saio de células rompidas e/ou o ensaio de carboxilesterase isolada aqui des-critos fornecem um primeiro rastreamento direto, rápido e simples para éste-res que possuem o perfila de hidrólise necessário. Motivos éster seleciona-dos dessa forma podem, então, ser testados novamente no mesmo ensaiode carboxilesterase quando conjugados ao modulador por meio da químicade conjugação escolhida, para confirmar que ainda é um substrato carboxi-lesterase naquele quadro. Tipos de éster adequados serão discutidos poste-riormente, mas nesse ponto pode-se mencionar que foi verificado que t-butila ésteres de alfa-aminoácidos são substratos relativamente ruins parahCE-1, -2 e -3, enquanto ciclopentila ésteres são hidrolisados eficazmente.Alfa aminoácidos adequados também serão discutidos com mais detalheposteriormente, mas nesse ponto pode ser mencionado que fenilalanina,homofenilalanina, fenilglicina e leucina são geralmente adequadas, e ésteresde alcoóis secundários são preferidos.
Como definido anteriormente, o éster de alfa-aminoácido podeser conjugado ao modulador por meio do grupo amina do éster de aminoaci-do, ou por meio do carbono alfa (por exemplo, através de sua cadeia lateral)do éster de aminoacido. Um radical vinculador pode estar presente entre omotivo éster de carboxilesterase e o modulador. Por exemplo, o éster dealfa-aminoácido pode ser conjugado ao modulador como um radical de fór-mula (IA), (IB) ou (IC):
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que
R1 é um grupo éster que é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxiles-terases intracelulares em um grupo ácido carboxílico;
R2 é a cadeia lateral de um alfa-aminoácido natural ou não natural;
R4 é hidrogênio; ou CrC6 alquila opcionalmente substituída, C3-C7 cicloalqui-la, arila ou heteroarila ou -(C=0)R3, -(C=0)OR3, ou -(C=0)NR3, em que R3 éhidrogênio ou (Ci-C6)alquila opcionalmente substituída;
B é um anel heterocíclico monocíclico de 5 ou 6 átomos no anel em que Riestá ligado a um carbono do anel adjacente ao nitrogênio do anel mostrado,e o anel B é opcionalmente fundido a um segundo anel carbocíclico ou hete-rocíclico de 5 ou 6 átomos no anel, quando então a ligação com L pode serpor um átomo do anel no referido anel.Y é uma ligação, -C(=0)-, -S(=0)2-, -C(=0)0-, -C(=0)NR3-, -C(=S)-NR3-, -C(=NH)NR3- ou - S(=0)2NR3-, em que R3 é hidrogênio ou d-C6 alquila op-cionalmente substituída;
Y1 é uma ligação, -(C=0)-, -S(02)-, -C(=0)0-, -OC(=0)-, -(C=0)NR3-, -NR3(C=0)-, -S(02)NR3-, -NR3S(02)- ou -NR3(C=0)NR5-, em que R3 e R5 sãoindependentemente hidrogênio ou (Ci-Ce)alquila opcionalmente substituída,L é um radical divalente de fórmula -(Alk1)m(Q)n(Alk2)p, em que m, nep sãoindependentemente 0 ou 1,
Q é (i) um radical divalente carbocíclico ou heterocíclico mono- ou bicíclicoopcionalmente substituído que possui 5-13 membros no anel, ou (ii), no casoem que tanto m quanto p são 0, um radical divalente de fórmula -X2-Q1- ou -Q1-X2-, em que X2 é -O-, -S- ou NRA-, em que RA é hidrogênio ou C,-C3 al-quila opcionalmente substituída, e Q1 é um radical divalente carbocíclico ouheterocíclico mono- ou bicíclico opcionalmente substituído que possui 5-13membros no anel,
Alk1 e Alk2 representam independentemente radicais divalentes C3-C7 ciclo-alquila opcionalmente substituídas, ou radicais Ci-Cô alquileno linear ou ra-mificado opcionalmente substituído, C2-C6 alquenileno ou C2-C6 alquinileno,que podem opcionalmente conter ou terminar em uma ligação éter (-0-), tio-éter (-S-) ou amina (-NRA-), em que RA é hidrogênio ou CrC3 alquila opcio-nalmente substituída;
X representa uma ligação, -C(=0)-; -S(=0)2-; -NR3C(=0)-, -C(=0)NR3-, -NR3C(=0)NR5-, -NR3S(=0)2- ou -S(=0)2NR3- em que R3 e R5 são indepen-dentemente hidrogênio ou CrC6 alquila opcionalmente substituída;
Z é O ouV,
S é 0 ou 1; e
Alk3 representa um radical divalente q3-C7 cicloalquila opcionalmente substi-tuída, ou um radical CrC6 alquileno linear ou ramificado opcionalmentesubstituído, C2-C6 alquenileno ou C2-C6 alquinileno que pode opcionalmenteconter ou terminar em uma ligação éter (-0-), tioéter (-S-) ou amina (-NRA-),em que RA é hidrogênio ou Ci-C3 alquila opcionalmente substituída;O termo "éster" ou "grupo carboxila esterificado" significa um grupoRgO(C=0)- no qual Rg é o grupo que caracteriza o éster, conceitualmentederivado do álcool RgOH.
Como aqui usado, o termo "(Ca-Cb)alquila", em que a e b sãonúmeros inteiros, refere-se a um radical alquila linear ou ramificado que pos-sui a a b átomos de carbono. Dessa forma, quando a for 1 e b for 6, por e-xemplo, o termo incluirá metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila,sec-butila, t-butila, n-pentila e n-hexila.
Como aqui usado, o termo "radical divalente (Ca-Cb)alquileno",em que a e b são números inteiros, refere-se a uma cadeia de hidrocarbone-to saturado que possui de a a b átomos de carbono, e duas valências nãosatisfeitas.
Como aqui usado, o termo "(Ca-Cb) alquenila", em que a e b sãonúmeros inteiros, refere-se a uma porção de alquenila de cadeia linear ouramificada que possui de a a b átomos de carbono tendo pelo menos umaligação dupla de E ou Z estereoquimicamente, quando aplicável. O termoinclui, por exemplo, vinila, alila, 1- e 2-butenila e 2-metila-2-propenila.
Como aqui usado, o termo "radical divalente (Ca-Cb) alquenile-no" significa uma cadeia de hidrocarboneto que possui de a a b átomos decarbono, pelo menos uma ligação dupla e duas valências não satisfeitas.
Como aqui usado, o termo "Ca-Cb alquinila", em que a e b sãonúmeros inteiros, refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou decadeia ramificada que possuem de dois a seis átomos de carbono e que,além disso, têm uma ligação tripla. Esse termo incluiria, por exemplo, etinila,1-propinila, 1- e 2-butinila, 2-metila-2-propinila, 2-pentinila, 3-pentinila, 4-pentinila, 2-hexinila, 3-hexinila, 4-hexinila e 5-hexinila.
Como aqui usado, o termo "radical divalente (Ca-Cb) alquinile-no", em que a e b são números inteiros, refere-se a uma cadeia de hidrocar-boneto divalente que possui de 2 a 6 átomos de carbono, e pelo menos umaligação tripla.
Como aqui usado, o termo "carbocíclico" refere-se a um radicalmono-, bi- ou tricíclico que possui até 16 átomos no anel, todos eles sendocarbono, e inclui arila e cicloalquila.Como aqui usado, o termo "cicloalquila" refere-se a um radicalcarbocíclico monocíclico saturado que possui de 3-8 átomos de carbono einclui, por exemplo, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclohexila, ciclohep-tila e ciclooctila.
Como aqui usado, o termo não qualificado "arila" refere-se a umradical aromatico carbocíclico mono-, bi- ou tricíclico, e inclui radicais quepossuem anéis carbocíclicos aromáticos monocíclicos que são ligados dire-tamente por uma ligação covalente. Exemplos ilustrativos desses radicaissão fenila, bifenila e naftila.
Como aqui usado, o termo não qualificado "heteroarila" refere-se a um radical aromatico mono-, bi- ou tricíclico que contém um ou maisheteroatomos selecionados de S, N e O, e inclui radicais que possuem doisdesses anéis monocíclicos, ou um anel monocíclico e um anel monocíclicoarila, que são ligados diretamente por uma ligação covalente. Exemplos ilus-trativos desses radicais são tienila, benzotienila, furila, benzofurila, pirrolila,imidazolila, benzimidazolila, tiazolila, benzotiazolila, isotiazolila, benzisotiazo-lila, pirazolila, oxazolila, benzoxazolila, isoxazolila, benzisoxazolila, isotiazoli-la, triazolila, benzotriazolila, tiadiazolila, oxadiazolila, piridinila, piridazinila,pirimidinila, pirazinila, triazinila, indolila e indazolila.
Como aqui usado, o termo não qualificado "heterociclila" ou "he-terocíclico" inclui "heteroarila", como definido acima e, em suas formas nãoaromáticas, relaciona-se a um radical não aromatico mono-, bi- ou tricíclicocontendo um ou mais heteroatomos selecionados de S, N e O, e aos gruposque consistem em um radical não aromatico monocíclico contendo um oumais desses heteroatomos, o qual é ligado covalentemente a outro dessesradicais ou a um radical carbocíclico monocíclico. Exemplos ilustrativos des-ses radicais são os grupos pirrolila, furanila, tienila, piperidinila, imidazolila,oxazolila, isoxazolila, tiazolila, tiadiazolila, pirazolila, piridinila, pirrolidinila,pirimidinila, morfolinila, piperazinila, indolila, morfolinila, benzofuranila, pirani-Ia, isoxazolila, benzimidazolila, metilenodioxifenila, etilenodioxifenila, malei-mido e succinimido.
A menos que especificado de forma diferente no contexto noqual ele ocorre, o termo "substituído", da forma aplicada a qualquer porçãodesta especificação, significa substituído com até quatro substituintes com-patíveis, cada um deles independentemente podendo ser, por exemplo, (d-C6)alquila, (CrC6)alcóxi, hidróxi, hidróxi(CrC6)alquila, mercapto, mercap-to(CrC6)alquila, (Ci-C6)alquiltio, fenila, halo (incluindo flúor, bromo e cloro),trifluormetila, trifluormetóxi, nitro, nitrila (-CN), oxo, -COOH, -COORA, -CORA,-S02RA, -CONH2, -SO2NH2, -CONHRA, -S02NHRA, -CONRARB, -S02NRARB,-NH2, -NHRA, -NRARB, -OCONH2, -OCONHRA, -OCONRARB, -NHCORA, -NHCOORA, -NRBCOORA, -NHS02ORA, -NRBS02OH, -NRBS02ORA,-NHCONH2, -NRACONH2, -NHCONHR8, -NRACONHRB, -NHCONRARB ou -NRACONRARB, em que RA e RB são independentemente um (CrC6)alquila,(C3-C6)cicloalquila, fenila ou heteroarila monocíclica que possuem 5 ou 6átomos no anel. Um "substituinte opcional" pode ser um dos grupos substitu-intes citados anteriormente.
O termo "cadeia lateral de um alfa-aminoácido natural ou nãonatural" refere-se ao grupo R1 em um aminoácido natural ou não natural defórmula NH2-CH(R1)-COOH.
Exemplos de cadeias laterais de alfa-aminoácidos naturais in-cluem aquelas de alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína,cistina, ácido glutâmico, histidina, 5-hidroxilisina, 4- hidroxiprolina, isoleucina,leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano,tirosina, valina, ácido a-aminoadípico, ácido ct-amina-n-butírico, 3,4-diidroxifenilalanina, homosserina, a-metilserina, ornitina, ácido pipecolico etiroxina.
Alfa-aminoácidos naturais que contêm substituintes funcionais,por exemplo, grupos amina, carboxila, hidróxi, mercapto, guanidila, imidazoli-la ou indolila em suas cadeias laterais características, incluem arginina, lisi-na, ácido glutâmico, ácido aspártico, triptofano, histidina, serina, treonina,tirosina e cisteína. Quando R2 nos compostos da invenção for um com umadessas cadeias laterais, o substituinte funcional poderá opcionalmente serprotegido.
O termo "protegido", quando usado em relação a um substituin-te funcional em uma cadeia lateral de um alfa-aminoácido natural, significaum derivado de um desses substituintes que é substancialmente não funcio-nal. Por exemplo, grupos carboxila podem ser esterificados (por exemplo,como um CrC5 alquila éster), grupos amina podem ser convertidos em ami-das (por exemplo, como uma NHCO CrC6 alquila amida) ou carbamatos(por exemplo, como um NHC(=0)0 d-C6 alquila ou NHC(=0)OCH2Ph car-bamato), grupos hidroxila podem ser convertido em éteres (por exemplo,uma O CrC6 alquila ou um 0(CrC6 alquila)fenila éter) ou ésteres (por e-xemplo, um OC(=0)CrC6 alquila éster) e grupos tiol podem ser convertidosem tioéteres (por exemplo, um terc-butila ou benzila tioéter) ou tioésteres(por exemplo, um SC(=0)CrC6 alquila tioéster).
Exemplos de cadeias laterais de alfa-aminoácidos não naturaisincluem aquelas citadas abaixo na discussão de grupos R2 adequados parauso nos compostos da presente invenção.
O grupo éster R1
Além do requisito de que o grupo éster deve ser hidrolisável poruma ou mais enzimas intracelulares, pode ser preferível para algumas apli-cações (por exemplo, para administração sistêmica do conjugado) que eleseja resistente à hidrólise por enzimas que hidrolisam carboxilester no plas-ma, uma vez que isso assegura que o modulador conjugado sobreviveráapós administração sistêmica por tempo suficiente para penetrar nas célulascomo o éster. É um processo simples o teste de certo conjugado para medirsua meia-vida plasmática como o éster, por incubação no plasma. No entan-to, verificou-se que ésteres conceitualmente derivados de alcoóis secunda-rios são mais estáveis às enzimas plasmáticas que hidrolisam carboxilesterdo que aqueles derivados de alcoóis primários. Além disso, verificou-se tam-bém que, embora ésteres conceitualmente derivados de alcoóis terciáriossejam geralmente estáveis às enzimas plasmáticas que hidrolisam carboxi-lester, eles também são freqüentemente relativamente estáveis às carboxi-lesterases intracelulares. Levando-se em conta esses achados, prefere-seatualmente que Ri nas fórmulas (IA), (IB) e (IC) acima seja um grupo ésterde fórmula -(C=0)OR9, em que R9 é (i) RyRsCH-, em que um R7 é (Ci-C3)alquila-(Z1)(Ci-C3)alquila- ou (C2-C3)alquenila-(Z1)a-(Ci-C3)alquila- opcio-nalmente substituído, em que a é 0 ou 1 e Z1 é -O-, -S- ou -NH-, e Rs é hi-drogênio ou (CrC3)alquila- ou R7 e R8, considerados em conjunto com ocarbono ao qual estão anexados, formam um anel C3-C7 cicloalquila opcio-nalmente substituída ou um anel heterocíclico opcionalmente substituído de5 ou 6 átomos no anel; ou (ii) anel fenila heterocíclico ou monocíclico opcio-nalmente substituído com 5 ou 6 átomos no anel. Dentro dessas classes, R9pode ser, por exemplo, metila, etila, n- ou isopropila, n- ou sec-butila, ciclo-hexila, alila, fenila, benzila, 2-, 3- ou 4-piridilmetila, N-metilpiperidin-4-ila, te-trahidrofuran-3-ila ou metoxietila. Atualmente, prefere-se que R9 seja ciclo-pentila.
A cadeia lateral de aminoácido R2
Atendendo ao pré-requisito de que o grupo éster R-i seja hidroli-sável por enzimas carboxilesterases intracelulares, a seleção do grupo R2 decadeia lateral pode determinar a taxa de hidrólise. Por exemplo, quando ocarbono em R2 adjacente ao carbono do alfa-aminoácido não contiver umaramificação, por exemplo, quando R2 for etila, isobutila ou benzila, o ésterserá mais facilmente hidrolisado do que quando R2 for ramificado, por exem-plo, isopropila ou t-butila.
Exemplos de cadeias laterais de aminoácidos incluem:
- grupos C-i-C6 alquila, fenila, 2,- 3- ou 4-hidroxifenila, 2,- 3- ou 4-metoxifenila, 2, 3- ou 4-piridilmetila, benzila, feniletila, 2-, 3- ou 4-hidroxibenzila, 2,- 3- ou 4-benziloxibenzila, 2,- 3- ou 4-Ci-C6 alcoxibenzila ebenzilóxiíd-Ce alquila);
- o grupo de caracterização de um ct-aminoácido natural, no qual qualquergrupo funcional pode ser protegido;
- grupos -[Alk]nR6, em que Alk é um grupo (CrC6)alquila ou (C2-C6)alquenilaopcionalmente interrompido por um ou mais átomos -O- ou -S- ou grupos -N(R7)- [nos quais R7 é um átomo de hidrogênio ou um grupo (CiC6)alquila], né 0 ou 1 e R6 é um grupo cicloalquila ou cicloalquenila opcionalmente substi-tuído;
- um grupo benzila substituído no anel fenila por um grupo de fórmula -OCH2COR8, em que R6 é hidroxila, amina, (Ci-C6)alcóxi, fenila(CrC6)alcóxi,(Ci-C6)alquilamino, di((Ci-C6)alquila)amina, fenila(CrC6)alquilamino, o resí-duo de um haleto de aminoácido ou ácido, derivado éster ou amida destes, oreferido resíduo sendo ligado por meio de uma ligação amida, o referido a-minoácido sendo selecionado de glicina, a ou p alanina, valina, leucina, iso-leucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, serina, treonina, cisteína, metionina,asparagina, glutamina, lisina, histidina, arginina, ácido glutâmico e ácido as-pártico;
- um grupo (CrC6)alquila heterocíclico, não substituído ou mono- ou dis-substituído no anel heterocíclico com halo, nitro, carbóxi, (CrC6)alcóxi, cia-no, (CrC6)alcanoila, trifluormetila (CrC6)alquila, hidróxi, formila, amina, (d-C6)alquilamino, di-(CiC6)alquilamino, mercapto, (CrC6)alquiltio, hidróxi(Ci-C6)alquila, mercapto(CrC6)alquila ou (CiC6)alquilfenilmetila; e
- um grupo -CRaRbRc no qual:
- cada um de Ra, Rb e Rc é independentemente hidrogênio, (Ci-C6)alquila,(C2-C6)alquenila, (C2-C6)alquinila, fenila(Ci-C6)alquila, (C3-C8)cicloalquila; ou
- Rc é hidrogênio e Ra e Rb são independentemente fenila ou heteroarila co-mo, por exemplo, piridila; ou
- Rc é hidrogênio, (CrC6)alquila, (C2-C6)alquenila, (C2-C6)alquinila, fenila(Ci-C6)alquila, ou (C3-C8)cicloalquila, e Ra e Rb, juntos com o átomo de carbonoao qual estão anexados, formam um cicloalquila de 3 a 8 membros ou umanel heterocíclico de 5 a 6 membros; ou
- Ra, Rb e Rc, juntos com o átomo de carbono ao qual estão anexados, for-mam um anel tricíclico (por exemplo, adamantila); ou
- Ra e Rb são, cada um independentemente, (Ci-C6)alquila, (C2-C6)alquenila,(C2-C6)alquinila, fenila(CrC6)alquila ou um grupo como definido para Rc a-baixo, diferente de hidrogênio, ou Ra e Rb, juntos com o átomo de carbonoao qual estão anexados, formam um anel cicloalquila ou heterocíclico e Rc éhidrogênio, -OH, -SH, halogênio, -CN, -C02H, (Ci.C4)perfluoralquila, -CH2OH, -C02(Ci-C6)alquila, -0(CrC6)alquila, -0(C2-C6)alquenila, - S(d-C6)alquila, -SO(CrC6)alquila, -S02(CrC6)alquila, -S(C2-C6)alquenila, -SO(C2C6)alquenila, -S02(C2-C6)alquenila ou um grupo -Q-W em que Q re-presenta uma ligação ou -O, -S-, -SO- ou -S02- e W representa um grupofenila, fenilalquila, (C3-C8)cicloalquila, (C3-C8)cicloalquilalquila, (C4-C8)cicloalquenila, (C4-C8)cicloalquenilalquila, heteroarila ou heteroarilalquila,cujo grupo W pode opcionalmente ser substituído por um ou mais substituin-tes selecionados independentemente de hidroxila, halogênio, -CN, -CO2H, -C02(Ci-C6)alquila, -CONH2, -CONH(CrC6)alquila, -CONH(CrC6 alquila)2) -CHO, -CH2OH, (Ci-C4)perfluoralquila, -0(CrC6)alquila, -S(CrC6)alquila, -SO(CrC6)alquila, -SO^d-CeJalquila, - N02, -NH2, -NH(Ci-C6)alquila, -N((CrC6)alquila)2, -NHCO(Ci-C6)alquila, (CrC6)alquila, (C2C6)alquenila, (C2-C6)alquinila, (C3-C8)cicloalquila, (C4-C8)cicloalquenila, fenila ou benzila.
Exemplos de grupos R2 em particular incluem benzila, fenila,ciclohexilmetila, piridin-3-ila-metila, terc-butoximetila, iso-butila, sec-butila,terc-butila, 1 -benziItio-1 -metiletila, 1 -metiltio-1 -metiletila e 1-mercapto-1-metiletila, feniletila. Grupos R2 preferidos atualmente incluem fenila, benzila,terc-butoximetila, feniletila e iso-butila.
O grupo R4
Como mencionado anteriormente, caso o modulador se destinea atuar somente em tipos celulares nos quais hCE-1 esteja presente, porexemplo, macrófagos, o grupo amina do motivo éster de carboxilesterasedeverá ser substituído de tal forma que ele seja ligado diretamente a umgrupo diferente de carbonila. Nesses casos, R4 pode ser CrCô alquila opcio-nalmente substituída, C3-C7 cicloalquila, arila ou heteroarila, por exemplo,metila, etila, n- ou isopropila, ciclopropila, ciclopentila, ciclohexila, fenila oupiridila. Nos casos nos quais a especificidade para macrófago não é neces-sária, R4 pode ser H, -(C=0)R3, -(C=0)OR3 ou -(C=0)NR3, em que R3 é hi-drogênio ou (C-i-C6)alquila opcionalmente substituída, por exemplo, metila,etila, ou n- ou isopropila, e CH2CH2OH.
O anel ou sistema de anel B
O anel ou o sistema de anel B pode ser um escolhido dentre, porexemplo, os seguintes:<formula>formula see original document page 19</formula>
O radical-Y-L-X-[CH2]z-
Quando o éster de alfa-aminoácido for conjugado ao inibidorcomo um radical de fórmula (IA), esse radical (ou ligação) surgirá da estraté-gia química específica escolhida para ligar o motivo éster de aminoácidoR1CH(R2)NH- ao modulador. Nitidamente, a estratégia química para esseacoplamento pode variar amplamente e, dessa forma, são possíveis muitascombinações das variáveis Y, L, X e z.
Deve-se observar que os benefícios do motivo éster de aminoá-cido carboxilesterase descritos acima (fácila entrada na célula, hidrolise decarboxilesterase dentro da célula e acúmulo dentro da célula de produto ati-vo da hidrolise de ácido carboxílico) são obtidos mais facilmente quando aligação entre o motivo éster de aminoácido e o modulador não é um substra-to para atividade de peptidase dentro da célula, o que poderia resultar emclivagem do aminoácido da molécula. Evidentemente, a estabilidade às pep-tidases intracelulares é facilmente testada incubando-se o composto com oconteúdo de uma célula rompida, e analisando-se quanto à possibilidadedessa clivagem.
Considerando-se as observações apresentadas anteriormente,em relação às variáveis que constituem o radical -Y-L-X-[CH2]z, por sua vez:
z pode ser 0 ou 1, de tal forma que um radical metileno ligado aomodulador é opcional.
Exemplos específicos preferidos de Y incluem uma ligação, -(C=0)-, -(C=0)NH- e -(C=0)0-. No entanto, para a especificidade de hCE-1,quando o éster de alfa-aminoácido estiver conjugado ao inibidor como umradical de fórmula (IA), Y deverá ser uma ligação.
No radical L, exemplos de radicais Alk' e Alk2, quando presentes,incluem -CH2-, -CH2CH2- -CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH=CH-,CH=CHCH2-, -CH2CH=CH-, CH2CH=CHCH2-, -OC-, -OCCH2-, CH2C=C- eCH2C=CCH2. Exemplos adicionais de Alk' e Alk2 incluem -CH2W-, -CH2CH2W-, -CH2CH2WCH2-, -CH2CH2WCH(CH3)-( -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2- e -WCH2CH2-, em que W é -O-, -S-, -NH-, N(CH3)- ou -CH2CH2N(CH2CH2OH)CH2-. Exemplos adicionais de Alk" e Alk2 incluem ra-dicais divalentes ciclopropila, ciclopentila e ciclohexila.
Em L, quando n for 0, o radical será uma cadeia de hidrocarbone-to (opcionalmente substituído e, talvez, com uma ligação éter, tioéter ou a-mina). Atualmente, prefere-se que não haja substituintes opcionais em L.
Quando tanto m quanto p forem 0, L será um radical divalente carbocíclicoou heterocíclico mono- ou bicíclico com 5-13 átomos no anel (opcionalmentesubstituído). Quando n for 1 e pelo menos um de m e p for 1, L será um radi-cal divalente que incluirá uma cadeia ou cadeias de hidrocarboneto e umradical carbocíclico ou heterocíclico mono- ou bicíclico com 5-13 átomos noanel (opcionalmente substituído). Quando presente, Q pode ser, por exem-pio, um radical divalente fenila, naftila, ciclopropila, ciclopentila ou ciclohexi-la, ou um radical heterocíclico mono- ou bicíclico com 5 a 13 membros noanel, por exemplo, um radical piperidinila, piperazinila, indolila, piridila, tienilaou pirrolila, mas 1,4-fenileno é atualmente preferido.
Especificamente, em algumas modalidades da invenção, m e ppodem ser 0, com n sendo 1. Em outras modalidades, n e p podem ser 0,com m sendo 1. Em modalidades adicionais, m, n e p podem todos ser 0.
Ainda em modalidades adicionais, m pode ser 0, n pode ser 1, com Q sendoum radical heterocíclico monocíclico, e p pode ser 0 ou 1. Alk' e Alk2, quandopresentes, podem ser selecionados de -CH2-, CH2CH2- e -CH2CH2CH2-, e Qpode ser 1,4-fenileno.
Exemplos específicos do radical -Y-L-X-[CH2] incluem -C(=0)- e -C(=Q)NH-, além de -(CH2)V, -(CH2)vO-, -C(=Q)-(CH2)V, -C(=Q)-(CH2)vO-, -C(=0)-NH-(CH2)w, -C(=0)-NH-(CH2)wO-
<formula>formula see original document page 21</formula>
em que v é 1, 2, 3 ou 4, e w é 1, 2 ou 3, por exemplo, -CH2-, -CH20-, -C(=0)-CH2-, - C(=0)CH20-, -C(=0)-NH-CH2- e -C(=0)-NH-CH20-.O radical -L-Y1-
Quando o éster de alfa-aminoácido for conjugado ao inibidorcomo um radical de fórmula (IB), esse radical (ou ligação) surgirá da estraté-gia química particular escolhida para ligar o carbono alfa do motivo éster deaminoácido na fórmula (IB) ou (IC) ao modulador (nesse último caso, o radi-cal -L-Y1- é ligado indiretamente ao carbono alfa através dos átomos de in-terferência no anel do sistema de anel B). Claramente, a estratégia químicapara aquele acoplamento pode variar amplamente e, dessa forma, são pos-síveis muitas combinações das variáveis L e Y1.
Por exemplo, L pode ser como discutido acima no contexto doradical -Y-L-X-[CH2]p. Por exemplo, em algumas modalidades, m e n são 1 ep é 0; Q é -O-; e Alk' é um radical opcionalmente substituído, linear ou rami-ficado, d-C6 alquileno, C2-C6 alquenileno ou C2-C6 alquinileno, que podeopcionalmente conter ou terminar em uma ligação éter (-0-), tioéter (-S-) ouamina (-NRA-), em que RA é hidrogênio ou C1-C4 alquila opcionalmente subs-tituída. Em outras modalidades, m, n e p podem, cada um, ser 1, e nessecaso Q pode ser, por exemplo, um radical 1,4-fenileno, ou um radical ciclo-pentila, ciclohexila, piperidinila ou piperazinila. Em todas as modalidades, Y1pode ser, por exemplo, uma ligação, ou -(C=0)-, -(C=0)NH- e - (C=0)0-.
Para os compostos da invenção que devam ser administradossistemicamente, preferem-se ésteres com uma taxa baixa de clivagem decarboxilesterase, uma vez que são menos suscetíveis ao metabolismo pré-sistêmico. Sua habilidade para alcançar o tecido-alvo intacto é, portanto,aumentada, e o éster pode ser convertido dentro das células do tecido-alvono produto ácido. No entanto, para administração local, na qual o éster éaplicado diretamente ao tecido-alvo ou direcionado para ele, por exemplo,por inalação, freqüentemente será desejável que o éster tenha uma taxa rá-pida de clivagem de esterase, para minimizar a exposição sistêmica e osefeitos colaterais indesejados conseqüentes. Quando o motivo esterase esti-ver ligado ao modulador através de seu grupo amina, como na fórmula (IA)acima, se o carbono adjacente ao carbono alfa do éster de alfa-aminoácidofor monossubstituído, ou seja, R2 for CH2RZ (R2 sendo o monossubstituinte),então os ésteres tenderão a ser clivados mais rapidamente do que se o car-bono for di- ou trissubstituído, como no caso em que R2 é, por exemplo, feni-la ou ciclohexila. Da mesma forma, quando o motivo esterase estiver ligadoao modulador através de um átomo de carbono como nas fórmulas (IB) e(IC) acima, se um átomo de carbono ao qual os motivos esteraseR4NHCH(Ri)- ou Rr(anel B)- estão anexados for não substituído, ou seja,R4NHCH(R1)- ou Rr(anel B)- estiver anexado a um radical metileno (-CH2)-,então os ésteres tenderão a ser clivados mais rapidamente do que se aquelecarbono for substituído, ou for parte de um sistema de anel como, por exem-pio, um anel fenila ou ciclohexila.
Moduladores de enzimas e receptores intracelulares
Os princípios desta invenção podem ser aplicados aos modula-dores de uma grande variedade de alvos intracelulares que estão implicadosem diversas doenças. Como discutido anteriormente, os modos de ligaçãode moduladores conhecidos aos seus alvos são geralmente conhecidos logodepois de os próprios moduladores serem descobertos. Além disso, técnicasmodernas, tais como cristalografia de raios-X e RMN, são capazes de reve-lar essas topologias e geometrias de ligação, o que também ocorre com mé-todos químicos medicinais tradicionais de caracterização dos relacionamen-tos estrutura-atividade. Com esse conhecimento, fica fácila identificar onde,na estrutura de certo modulador, um motivo éster de carboxilesterase pode-ria ser anexado, sem romper a ligação do modulador à enzima ou receptoratravés do uso de dados estruturais. Por exemplo, a Tabela 1 lista algunsalvos de enzimas ou receptores intracelulares sobre os quais existem dadospublicados da estrutural cristal.Tabela 1
<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table><table>table see original document page 25</column></row><table><table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table><formula>formula see original document page 29</formula>
Uma abordagem similar também pode ser usada para os outrosexemplos identificados na Tabela 1. O método da invenção para aumento dapotência celular e/ou do tempo de permanência intracelular de um modula-dor da atividade de uma enzima ou um receptor intracelular-alvo pode envol-ver várias etapas:
Etapa 1: Identificação de uma posição ou de posições em uma ou emdiversas moléculas moduladoras que compartilham o mesmo modo de liga-ção à enzima ou receptor-alvo, distante da interface de ligação entre os mo-duladores e a enzima ou receptor-alvo.Normalmente, tais posições são identificadas a partir da estrutu-ra co-cristal por raios-X (ou estrutura derivada por RMN) da enzima ou doreceptor-alvo com um modulador conhecido (ou um análogo estrutural pró-ximo deste) ligado à enzima ou ao receptor, por inspeção da estrutura. Alter-nativamente, a estrutura cristal por raios-X da enzima ou do receptor-alvocom o modulador ancorado no sítio ativo da enzima ou do receptor é mode-lada por métodos gráficos computacionais, e o modelo é inspecionado. Pre-sume-se que seja improvável que a modificação estrutural do modulador emposições distantes da interface de ligação interfira significativamente com aligação do modulador ao sítio ativo da enzima ou do receptor. Normalmente,surgem posições adequadas a partir da estrutura co-cristal ou do modeloancorado a ser orientado em direção ao solvente.
Etapa 2: Modificação covalente do(s) modulador(es) por adesão de umradical éster de alfa-aminoácido ou uma gama de diferentes radicais éster dealfa-aminoácidos em uma ou mais das posições identificadas na Etapa 1.
A adesão dos radicais éster de alfa-aminoácido (isto é, os po-tenciais motivos carboxilesterase) pode ocorrer por meio de uma funcionali-dade de acoplamento covalente existente no(s) modulador(es), ou por meiode uma funcionalidade adequada introduzida especificamente para essa fi-nalidade. Os motivos carboxilesterase podem ser espaçados do volume mo-lecular principal por um elemento espaçador ou vinculador, para posicionar omotivo mais profundamente no solvente e, portanto, reduzir ainda mais opequeno efeito do motivo sobre o modo de ligação do modulador, e/ou paraassegurar que o motivo seja acessível à carboxilesterase por redução dainterferência estérica que pode ser causada pelo volume molecular principaldo modulador.
O desempenho da Etapa 2 resulta na preparação de um candi-dato a modulador ou, mais freqüentemente, uma pequena biblioteca de can-didatos a moduladores, cada um deles modificado covalentemente em rela-ção ao seu inibidor parente pela introdução de vários radicais éster de ami-noácido, em um ou mais pontos de adesão identificados na Etapa 1.
Etapa 3: Teste do(s) conjugado(s) de alfa-aminoácido-modulador prepa-rado na Etapa 2 para determinar sua atividade contra a enzima ou receptor-alvo.
Como é normal em química medicinal, as versões do motivocarboxilesterase do(s) modulador(es) parente(s), preparadas como resultadoda realização das Etapas 1 e 2, são testadas, de preferência, em ensaiosadequados para determinar se a retenção esperada da atividade do modu-lador foi, de fato, obtida, e em que grau e com que perfila de potência. Deacordo com a finalidade subjacente da invenção, que é causar o acúmulo daatividade do modulador nas células, ensaios adequados incluem normalmen-te ensaios em linhagens celulares para avaliar o grau de atividade celular e operfila de potência dos moduladores modificados. Outros ensaios que po-dem ser empregados na Etapa 3 incluem ensaios de modulação enzimáticaou de receptor in vitro para determinar a atividade intrínseca do moduladormodificado e seu suposto produto de hidrólise de carboxilesterase; ensaiospara determinar a taxa de conversão dos moduladores modificados no ácidocarboxílico correspondente por carboxilesterases; e ensaios para determinara taxa e/ou nível de acúmulo do produto de hidrólise de carboxilesterase (oácido carboxílico) nas células. Nesses ensaios, podem ser usadas célulasmonocíticas e não monocíticas e/ou um painel de carboxilesterases isoladasa fim de identificar compostos que exibam seletividade celular.
Se necessário ou desejável, a etapa 3 pode ser repetida com umconjunto diferente de versões de candidatos a éster de alfa-aminoácido-conjugado do modulador parente.
Etapa 4: A partir dos dados obtidos na Etapa 3, seleção de uma ou maisdas versões testadas de éster de alfa-aminoácido-conjugado do(s) modula-dores) parente(s) que causa(m) a modulação da atividade da enzima ou doreceptor dentro das células, que são convertidas e se acumulam como o á-cido carboxílico correspondente dentro das células, e que exibem potênciacelular aumentada ou prolongada.
As Etapas 1-4 descritas anteriormente representam um algorit-mo geral para a implementação dos princípios da presente invenção. A apli-cação do algoritmo é ilustrada no Exemplo A abaixo, aplicado a um inibidorconhecido da enzima intracelular diidrofolato redutase (DHFR).
Exemplo A
O ácido fólico (pteroilglutâmico) é uma vitamina que é um com-ponente crucial na biossíntese de nucleotídeos purina e pirimidina. Após ab-sorção, o folato da dieta é reduzido em diidrofolato e depois reduzido aindamais a tetrahidrofolato pela enzima diidrofolato redutase (DHFR). A inibiçãode DHFR leva a uma redução na biossíntese de nucleotídeo que resulta nainibição da biossíntese de DNA e redução da divisão celular. Inibidores deDHFR são amplamente usados no tratamento de câncer (Bertino J, J. Cin.Oncol. 11, 5-14, 1993), doenças proliferativas celulares, tais como artritereumatóide (Cronstein N., Pharmacol. Rev. 57, 163-1.723), psoríase e rejei-ção a transplantes. Os inibidores de DHFR também são utilizados como a-gentes antiinfecciosos (Salter A., Rev. Infect. Dis. 4,196-236, 1982) e antipa-rasitários (Plowe C. BMJ 328, 545-548, 2004).
Foram sugeridos muitos tipos de compostos inibidores de DHFR,e vários desses compostos são usados como agentes anticâncer, antiinfla-matórios, antiinfecciosos e antiparasitários. Um modelo geral para inibidoresde DHFR conhecidos é apresentado abaixo:
<formula>formula see original document page 32</formula>
Metotrexato ácido (S)-2-(4-(((2,4-diaminopteridin-6-ila)metila)metilamino)benzamido)pentanedióico é o inibidor de DHFR usado mais am-plamente e contém uma funcionalidade glutamato que o permite ser trans-portado ativamente para dentro das células e ser retido em seu interior. Noentanto, células cancerosas podem se tornar resistentes ao metotrexato pormodificação desse mecanismo de transporte ativo. Além disso, células nãomamíferas são desprovidas do sistema de transporte ativo e metotrexatotem utilidade limitada como agente antiinfeccioso. Portanto, foram desenvol-vidos inibidores de DHFR lipofílicos, tais como trimetrexato (2,4-diamino-5-metila-6-[(3,4,5-trimetoxianilino)metila] quinazolina) (2 G = CH) (patente daGB 1345502) e análogos como (2 G = N) (Gangjee e outros. J. Med. Chem.1993, 36, 3.437-3.443) que podem ser captados por difusão passiva, tantopara contornar a resistência da célula cancerosa quanto para uso como a-gentes antiinfecciosos.
<formula>formula see original document page 33</formula>
No entanto, agentes que se difundem passivamente para dentrodas células também saem da célula facilmente e não são retidos facilmentedentro da célula. Dessa forma, um inibidor de DHFR modificado de acordocom a presente invenção, que seja lipofílico, mas cuja atividade se acumuledentro da célula, poderia ter vantagens significativas. Além disso, ambas asclasses de inibidores de DHFR têm efeitos colaterais que limitam as dosesque podem ser usadas na clínica. Um inibidor de DHFR cuja atividade seacumule seletivamente em macrófagos poderia ser útila, uma vez que osmacrófagos, através da produção de citocinas, são conhecidos por terem umpapel fundamental em distúrbios inflamatórios, e há evidências crescentesde que têm uma participação negativa no câncer.
Etapa 1 do algoritmo geral descrito acima
A estrutura por RMN de DHFR com trimetrexato (2 G = CH) an-corado no ativo está publicada (Polshakov, V.l. e outros., Protein Sei. 1999,8, 467-481) e é evidente que a posição mais adequada para afixar um moti-vo carboxilesterase de acordo com a invenção era no anel fenila, como mos-trado abaixo. Deduziu-se que a adesão naquele ponto em análogos estrutu-rais próximos conhecidos de trimetrexato, por exemplo, (2 G = N), tambémseria adequada. A Figura 2 mostra (2 G = N) ancorado em DHFR, mostran-do que um ponto adequado para adesão é a posição 4 do anel aromático,uma vez que essa se afasta do sítio ativo da enzima.
Etapa 2 do algoritmo geral descrito acima
Foram preparados compostos nos quais o motivo carboxileste-rase é ligado por meio de seu nitrogênio do alfa-aminoácido, como mostradonos esquemas I e II. Dentro dessa série, foram feitos compostos com e semum carbonila para identificar potenciais compostos seletivos para macrófago.
Esquema I
<formula>formula see original document page 34</formula><formula>formula see original document page 35</formula>Também foram feitos compostos nos quais o motivo esterase foiligado ao modulador por meio da cadeia lateral do alfa-aminoácido (esque-mas III e IV). Dentro dessa série, também foram preparados compostos comsubstituição de alquila no nitrogênio para identificar compostos seletivos pa-ra macrófago (esquema IV).<formula>formula see original document page 37</formula>Esquema IV
<formula>formula see original document page 38</formula>
Etapa 3 do algoritmo geral descrito acima
Os compostos que incluem o análogo de trimetrexato (2 G = N)foram testados no ensaio da enzima DHFR, no ensaio da proliferação celu-lar, usando linhagens celulares tanto monocíticas quanto não monocíticas, eno ensaio de células rompidas, a fim de avaliar a possibilidade de clivagemdos ésteres por linhagens celulares monocíticas e não monocíticas. Detalhesde todos esses ensaios são apresentados abaixo.
Etapa 4 do algoritmo geral descrito acima
Como mostrado na Tabela 2, foram identificados compostos cu-jos ácidos possuem atividade contra a enzima comparável com o análogo detrimetrexato (2 G = N). Também se pode observar que a alteração da formapela qual o motivo esterase é ligado pode levar à formação de um composto(6) que é 100 vezes mais potente em células U937 e 15 vezes mais potentenas HCT116 do que o análogo não modificado (2 G=N).
Além disso, modificações do vinculador ou do substituinte no nitrogênio domotivo esterase permitiram a identificação de compostos 4 e 5 que mostra-ram clivagem seletiva em linhagens celulares monocíticas, mas não em li-nhagens celulares não monocíticas, e que foram significativamente mais an-tiproliferativos em linhagens celulares monocíticas do que em linhagens ce-lulares não monocíticas (vide tabela 2).<table>table see original document page 40</column></row><table>continuação
<table>table see original document page 41</column></row><table>Com o uso de estratégias similares, o conceito foi aplicado comsucesso a uma faixa de vários alvos intracelulares, como demonstrado nosexemplos abaixo.
Como forma ilustrativa adicional dos princípios desta invenção,serão apresentados os Exemplos seguintes. Nas sínteses de compostosdescritas abaixo:
Foram usados reagentes e solventes disponíveis comercial-mente (grau de HPLC), sem purificação adicional.
A irradiação por microondas foi efetuada com o uso de um rea-tor concentrado de microondas CEM Discover. Os solventes foram removi-dos com o uso de GeneVac Serie I, sem aquecimento, ou um Genevac SérieII com VacRamp a 30°C.
A purificação de compostos por coluna de cromatografia instan-tânea foi realizada usando sílica-gel, tamanho de partícula de 40-63 |im(230-400 mesh) obtida de Silicycle. A purificação de compostos por HPLCpreparatória foi realizada em sistemas Gilson com o uso de colunas C18 defase reversa ThermoHypersila-Keystone Hyperprep HS (12 um, 100 X 21,2mm), gradiente de 20-100% B (A = água/TFA 0,1%, B= acetonitrila/TFA0,1%) ao longo de 9,5 min, fluxo = 30 ml/min, injeção de solvente 2:1 DM-SO:acetonitrila (1,6 ml), detecção U.V. a 215 nm.
Os espectros de 1H RMN foram registrados em um espectrôme-tro AV Bruker 400 MHz em solventes deuterados. As mudanças químicas (ô)estão em partes por milhão. A análise de cromatografia de camada delgada(TLC) foi realizada com placas Kieselgel 60 F254 (Merck), e visualizada coma utilização de luz U.V. HPLCMS analíticas em sistemas LC Agilent HP1100,Waters 600 ou Waters 1525, usando colunas C18 de fase reversa HypersilaBDS (5 um, 2,1 X 50 mm), gradiente 0-95% B (A= água/TFA 0,1%, B= ace-tonitrila/TFA 0,1%) ao longo de 2,10 minutos, fluxo = 1,0 ml/min. Os espec-tros U.V. foram registrados a 215 nm, com a utilização de um detector comarranjo de diodos Gilson G1315A, detector U.V. de comprimento de ondaúnico G1214A, detector U.V. de comprimento de onda duplo Waters 2487,detector U.V. de comprimento de onda duplo Waters 2488, ou detector U.V.com arranjo de diodos Waters 2996. Os espectros de massa foram obtidossobre a faixa m/z 150 a 850, em uma taxa de amostragem de 2 varreduraspor segundo ou 1 varredura por 1,2 segundo, usando Micromass LCT cominterface Z-spray ou Micromass LCT com interface Z-spray ou MUX. Os da-dos foram integrados e registrados usando o programa de computador O-penLynx e OpenLynx Browser.
Foram utilizadas as seguintes abreviações:
MeOH = MeOH
EtOH = EtOH
EtOAc = EtOAc
Boc = terc-butoxicarbonila
DCM = DCM
DMF = dimetilformamida
DMSO = dimetila sulfóxido
TFA = ácido trifluoracético
THF = tetrahidrofurano
Na2C03 = carbonato de sódio
HCI = ácido clorídrico
DIPEA = diisopropiletilamina
NaH = hidreto de sódio
NaOH = hidróxido de sódio
NaHC03 = carbonato de sódio hidrogênio
Pd/C = paládio sobre carbono
TBME = terc-butila metila éter
N2 = nitrogênio
PyBop = hexafluorfosfato de benzotriazol-1-ila-óxi-tris-pirrolidino-fosfônio
Na2S04 = sulfato de sódio
Et3N = trietilamina
NH3 = amônia
TMSCI = trimetilclorosilano
NH4CI = cloreto de amônio
LÍAIH4 = hidreto de lítio alumínioPyBrOP = hexafluorfosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfônio
MgS04 = MgS04
"BuLi = n-butillítio
CO2 = dióxido de carbono
EDCI = cloridrato de /V-(3-Dimetilaminopropila)-N'-etilcarbodiimida
Et20 = éter dietílico
LiOH = hidróxido de lítio
HOBt= 1-hidroxibenzotriazol
ELS = dispersão luminosa evaporativa
TLC = cromatografia de camada delgada
ml = mililitro
g = grama(s)
mg = miligrama(s)
mol = mol(s)
mmol = milimol(s)
LCMS = cromatografia líquida de alto rendimento/ espectrometria de massa
RMN = ressonância magnética nuclear
r.t. = temperatura ambiente
min = minuto(s)
h = hora(s)
INTERMEDIÁRIOS
Ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidróxi-butírico
Os seguintes elementos fundamentais foram usados para a sín-tese dos moduladores modificados:Ciclopentila éster de ácido (S)-4-bromo-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico
<formula>formula see original document page 45</formula>
Ciclopentila éster de ácido (S)-2-amina-4-metila-pentanóico
<formula>formula see original document page 45</formula>
Ciclopentila éster de ácido (S)-amina-fenila-acético
<formula>formula see original document page 45</formula>
1 -Ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
<formula>formula see original document page 45</formula>
Terc-butila éster de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromo-butírico
<formula>formula see original document page 45</formula>
Terc-butila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidróxi-butírico e 1-terc-butila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonila-mino-4-hidróxi-butírico<formula>formula see original document page 46</formula>
Estágio 1 - Síntese de ácido (S)-2-amina-4-(terc-butila-dimetila-silanilóxi)-butírico
<formula>formula see original document page 46</formula>
A uma suspensão de L-homosserina (1 g, 8,4 mmols) em aceto-nitrila (10 mi) a 0°C, foi adicionado 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno (1,32ml, 8,8 mmols, 1,05 eq). Terc-butila-dimetila-silila cloreto (1,33 g, 8,8 mmols,1,05 eq.) foi então adicionado em porções ao longo de 5 minutos, e permitiu-se que a mistura de reação aquecesse até a temperatura ambiente, e depoisfoi agitada por 16 horas. Formou-se um precipitado branco que foi retiradopor filtração e lavado com acetonitrila, antes da secagem sob vácuo. O com-posto do título foi isolado como um sólido branco (1,8 g, 92%). 1H RMN (500MHz, DMSO), ô: 7,5 (1H, bs), 3,7 (1H, m), 3,35 (4H, bm), 1,95 (1H, m), 1,70(1H, m), 0,9 (9H, s), 0,1 (6H, s).
Estágio 2 - Síntese de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butila-dimetila-silanilóxi)butírico<formula>formula see original document page 47</formula>
Uma suspensão de produto do Estágio 1 (1,8 g, 7,7 mmols) emDCM (100 ml) a 0°C foi tratada com trietilamina (2,15 ml, 15,4 mmols, 2 eq)e dicarbonato de di-terc-butila (1,77 g, 8,1 mmols, 1,05 eq). A mistura de re-ação foi agitada em temperatura ambiente por 16 horas para completar areação. O DCM foi removido sob pressão reduzida e a mistura foi tratadacom EtOAc/salmoura. A camada de EtOAc foi seca sobre MgS04 e evapo-rada sob pressão reduzida. O produto bruto foi usado posteriormente sempurificação adicional (2,53 g, 99%). 1H RMN (500 MHz, CDCI3), ô: 7,5 (1H,bs), 5,85 (1H, d, J = 6,5 Hz), 4,3 (1H, m), 3,75 (2H, m), 1,95 (2H, m), 1,40(9H, s), 0,85 (9H, s), 0,1 (6H, s).
Estágio 3 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butila-dimetila-silanilóxi)butírico
<formula>formula see original document page 47</formula>
DCM (50 ml) a 0°C, foram adicionados ciclopentanol (1,39 ml, 15,3 ml, 2 eq),EDCI (1,61 g, 8,4 mmols, 1,1 eq) e DMAP (0,093 g, 0,76 mmol, 0,1 eq). Amistura de reação foi agitada por 16 horas em temperatura ambiente, antesde evaporação sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi dissolvido em E-tOAc (100 ml) e lavado com 1 M de HCI, 1 M de Na2C03 e salmoura. A ca-mada orgânica foi então seca sobre MgS04 e evaporada sob pressão redu-zida. O produto foi purificado por coluna de cromatografia usando EtO-Ac/heptano (1:4) para gerar o composto do título (2,24 g, 73%). Pureza porLCMS de 100%, m/z 402,5 [M++H], 1H RMN (250 MHz, CDCI3), ô: 5,2 (1H, d,
A uma solução de produto do Estágio 2 (2,53 g, 7,6 mmols) emJ = 6,3 Hz), 5,15 (1 H,m), 4,2 (1H, m), 3,6 (2H, m), 2,0 (1H, m), 1,95-1,55(9H, bm), 1,4 (9H, s), 0,85 (9H, s), 0,1 (6H, s).
Estágio 4 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidróxi-butírico
<formula>formula see original document page 48</formula>
O produto do Estágio 3 (1,57 g, 3,9 mmolss) foi dissolvido emácido acético:THF:água (3:1:1, 100 ml). A mistura de reação foi agitada a30°C por 16 horas para completar a reação. EtOAc (200 ml) foi adicionado elavado com 1 M de Na2C03, 1 M de HCI e salmoura. Os extratos de EtOAcforam secos sobre MgS04 e evaporados sob pressão reduzida para gerar oproduto como um óleo transparente que se cristalizou quando em repouso(1,0 g, 95%). Pureza por LCMS de 100%, m/z 310,3 [M++Na], 1H RMN (250MHz, CDCI3), ô: 5,4 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,2 (1H, m), 4,4 (1H, m), 3,65 (2H,m), 2,15 (1H, m), 1,9-1,55 (9H, bm), 1,45 (9H, s).
Estágio 5 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-4-Bromo-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico
<formula>formula see original document page 48</formula>
A uma pasta fluida de N-bromo succinimida (1,86 g, 10,4 mmols)em DCM (16,2 ml), foi adicionada uma solução de trifenila fosfina (2,56 g,9,74 mmols) em DCM (7,2 ml). A solução foi agitada por mais 5 minutos a-pós a adição. Piridina (338 ul, 4,18 mmols) foi adicionada, seguida por umasolução de produto do Estágio 4 (1,00 g, 3,48 mmols) em DCM (8,8 ml). Asolução foi agitada por 18 horas, concentrada sob pressão reduzida e o sol-vente residual submetido à azeotropia com tolueno (3x16 ml). O resíduo foitriturado com éter dietílico (10 ml) e acetato de etila: heptano (1:9, 2 x 10 ml).A solução combinada de éter e heptano foi concentrada sobre sílica e purifi-cada por cromatografia em coluna eluindo com EtOAc/heptano (1:9 a 2:8)para fornecer o composto do título (1,02 g, 84%). 1H RMN (300 MHz, CD-Cl3), 5: 5,30-5,05 (2H, m), 4,45-4,30 (1H, m), 3,45 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,50-2,30 (1H, m), 2,25- 2,10 (1H, m), 1,95-1,60 (8H, br m), 1,47 (9H, s).
Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-Amina-4-metila-pentanóico
<formula>formula see original document page 49</formula>
Estágio 1
Estágio 1 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-Amina-4-metila-pentanóico e ácido tolueno-4-sulfônico
<formula>formula see original document page 49</formula>
A uma suspensão de (S)-leucina (15 g, 0,11 mol) em ciclohexa-no (400 ml), foram adicionados ciclopentanol (103,78 ml, 1,14 mmol) e ácidop-tolueno sulfonico (23,93 g, 0,13 mol). A suspensão foi aquecida no refluxopara efetuar sulfato. Após refluxo da solução por 16 horas, ela foi resfriadapara gerar uma suspensão branca. Heptano (500 ml) foi adicionado à mistu-ra, e a suspensão foi filtrada para gerar o produto como um sólido branco(35 g, 85%). 1H RMN (300 MHz, MeOD), Ô: 1,01 (6H, t, J = 5,8 Hz), 1,54-2,03(11H, m), 2,39 (3H, s), 3,96 (1H, t, J = 6,5 Hz), 5,26-5,36 (1H, m), 7,25 (2H,d, J = 7,9 Hz), 7,72 (2H, d, J = 8,3 Hz).
Estágio 2 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-Amina-4-metila-pentanóico
<formula>formula see original document page 50</formula>
Uma solução de produto do Estágio 1 (2,57 g, 0,013mol) emDCM (5 ml) foi lavada com solução aquosa saturada de NaHC03 (2x3 ml).As camadas aquosas combinadas foram extraídas de volta com DCM (3x4ml). As camadas orgânicas combinadas foram secas (MgS04), e o solventeremovido in vácuo para gerar o composto do título como um óleo incolor(1,10 g, 80%). 1H RMN (300 MHz, CDCI3), 8: 0.90 (6H, t, J = 6,4 Hz), 1,23-1,94(11 H,m), 3,38 (1H,dd,J = 8,4, 5,9 Hz), 5,11-5,22 (1H,m).
Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-amina-fenila-acético
<formula>formula see original document page 50</formula>
Ciclopentila éster de ácido (S)-Amina-fenila-acético foi preparadoa partir de ácido (S)-amina-fenila-acético seguindo o mesmo procedimentousado para a síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-amina-4-metila-pentanóico.
Síntese de 1-ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico<formula>formula see original document page 51</formula>
Estágio 1 - Síntese de 5-benzila éster 1-ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
<formula>formula see original document page 51</formula>
A uma solução agitada de 5-benzila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico (5 g, 14,8 mmols) em uma mistura deDCM (50 ml) e DMF (30 ml) a 0°C, foram adicionados ciclopentanol (2,7 ml,29,6 mmols), EDCl (4,25 g, 22,2 mmols) e DMAP (0,18 g, 1,48 mmol). A agi-tação continuou em temperatura ambiente de um dia para o outro, quandoentão LCMS mostrou o término da reação. DCM foi removido sob pressãoreduzida. A mistura de reação foi diluída com EtOAc (200 ml), lavada comágua (100 ml), 1 M de HCI aquoso (50 ml), seguido por NaHC03 aquoso sa-turado (50 ml). A camada de EtOAc foi seca (Na2S04), filtrada e concentra-da in vácuo para gerar um óleo viscoso que se solidificou em repouso de umdia para o outro. A trituração com Et20 (2x10 ml) gerou o composto do títu-lo como um sólido branco (43,78 g, 80%). Pureza por LCMS de 94%.
Estágio 2 - Síntese de 1-ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
<formula>formula see original document page 51</formula>Uma mistura de produto do Estágio 1 (1,3 g, 3,20 mmols) e Pd/C
10% (0,5 g) em EtOH (150 ml) foi agitada sob H2 (balão) em temperaturaambiente por 4 horas, quando então LCMS mostrou o término da reação. Amistura de reação foi filtrada através de um bloco de celite, lavada com E-tOH (20 ml) e concentrada in vácuo para gerar um sólido branco. Para re-mover EtOH residual, o sólido foi dissolvido em mistura tolueno/THF (5/1)(20 ml) e concentrado in vácuo para gerar o composto do título (0,8 g, 79%).1H RMN (400 MHz, MeOD), ô: 1,35 (9H, s), 1,60-2,10 (10H, m), 4,05 (1 H,m), 5,20 (1 H, m).
Síntese de 1-terc-butila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
<formula>formula see original document page 52</formula>
1-Terc-butila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico foipreparado a partir de 5-benzila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico seguindo o mesmo procedimento usadopara a síntese de 1-ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico
Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-benzifoxicarbonilamino-4-bromo-butírico
<formula>formula see original document page 52</formula>Estágio 1 - Síntese de 1-terc-butila éster de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-succínico
<formula>formula see original document page 53</formula>
1-Terc-butila éster de ácido (S)-2-amina-succínico (0,9 g, 4,75mmols) e hidróxido de sódio (0,28 g, 7,13 mmols, 1,5 eq) foram dissolvidosem 25% de água em dioxano (50 ml). A solução foi agitada a 5°C e dibenzil-dicarbonato (2 g, 4,13 mmols, 1,5 eq) em dioxano (10 ml) foi adicionado len-tamente. A mistura foi agitada a 0°C por 1 hora, e a seguir em temperaturaambiente de um dia para o outro. Foi adicionada água (10 ml) e a mistura foiextraída com EtOAc (2 x 20 ml). A fase orgânica foi extraída de volta comuma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (2x10 ml). As ca-madas aquosas combinadas foram acidificadas até o pH 1 com 1 M de HCI,e extraídas com EtOAc (3x10 ml). As frações orgânicas combinadas foramsecas sobre MgS04 e concentradas sob pressão reduzida. O produto foi pu-rifiçado por cromatografia em coluna (35% EtOAc em heptano) para gerar ocomposto do título como um óleo incolor (0,76 g, 50%). m/z 346 [M+23]+, 1HRMN (300 MHz, CDCI3), S: 7,39-7,32 (5H, m), 5,72 (1H, d, J = 8,1 Hz), 5,13(2H, s), 4,58-4,50 (1H, m), 3,10-2,99 (1H, m), 2,94-2,83, 91H, m), 1,45 (9H,s).
Estágio 2 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-hidróxi-butírico
<formula>formula see original document page 53</formula>
A uma solução de produto do Estágio 1 (0,6 g, 1,87 mmol) emTHF anidro (20 ml) a -20°C, foram adicionados lentamente trietilamina (0,032ml, 2,24 mmols, 1,2 eq) e cloroformato de etila (0,021 ml, 2,24 mmols, 1,2eq). A mistura foi agitada a -20°C por 2 horas. O sólido formado foi retiradopor filtraçao e lavado com THF (2x10 ml). O filtrado foi adicionado gota agota a uma solução de borohidreto de sódio (0,2 g, 5,61 mmols, 3 eq) a 0°C,e agitado em temperatura ambiente por 4 horas. O solvente foi removido sobpressão reduzida, o resíduo foi diluído com água (10 ml), acidificado até opH 5 com 1 M de HCI e extraído com EtOAc. As frações orgânicas foramcombinadas e lavadas com hidróxido de sódio aquoso 10%, água e salmou-ra, secas sobre MgS04 e concentradas sob pressão reduzida para gerar ocomposto do título como um óleo transparente (0,3 g, 51%). m/z 332[M+23]+.
Estágio 3 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromo-butírico
<formula>formula see original document page 54</formula>
A uma solução de N-bromosuccinimida (0,52 g, 2,91 mmols, 3eq) em DCM (10 ml), foi adicionada lentamente uma solução de trifenilfosfina(0,71 g, 2,72 mmols, 2,8 eq) em DCM (10 ml). A mistura foi agitada em tem-peratura ambiente por 5 minutos. Piridina (0,094 ml, 1,16 mmol, 1,2 eq) euma solução de produto do Estágio 2 (0,3 g, 0,97 mmoi, 1 eq) em DCM (20ml) foram adicionadas gota a gota, e a mistura agitada em temperatura am-biente de um dia para o outro.
O solvente foi removido sob pressão reduzida, e o resíduo foisubmetido à azeotropia com tolueno (2 x 15 ml) e triturado com éter dietílico(2 x 25 ml) e EtOAc 10% em heptanos. As soluções da trituração foramcombinadas e evaporadas até secas. O produto bruto foi purificado por cro-matografia em coluna (EtOAc 15% em heptanos) para gerar o composto dotítulo como um óleo transparente (0,16 g, 44%). m/z 395 [M+23]+, 1H RMN(300 MHz, CDCI3), 6: 7,39-7,30 (5H, m), 5,40 (1H, d, J = 6,8 Hz), 5,12 (2H,s), 4,38 (1H, q, J = 7,7 Hz), 3,47-3,38 (2H, m), 5,49-2,33 (1H, m), 2,28-2,13(1H, m), 1,48 (9H, s).
EXEMPLO 1
Este exemplo descreve a modificação do inibidor de HDAC (his-toria desacetilase) conhecido ácido suberoilanilida hidroxâmico (composto 7)aqui denominado "SAHA", pela adesão de motivos éster de aminoácido empontos distantes da interface de ligação com o alvo onde não ocorra rupturado seu modo de ligação.
Composto 7: Ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA)
<formula>formula see original document page 55</formula>
SAHA foi adquirido de BioCat GmbH, Heidelberg, Alemanha.
Procedimento de lavagem padronizado para química de resina
A resina foi lavada na seguinte seqüência: DMF, MeOH, DMF,MeOH, DCM, MeOH, DCM, MeOH x 2, TBME x 2.
Teste da clivaaem da resina
Uma pequena quantidade de resina hidroxilamina 2-clorotritilafuncionalizada (ca 0,3 ml de mistura de reação, ca 10 mg de resina) foi tra-tada com TFA 2%/DCM (0,5 ml) por 10 minutos em temperatura ambiente. Aresina foi filtrada e o filtrado foi concentrado soprando-se um jato de gás N2.
A LCMS do resíduo foi obtida.
Preparação de resina hidroxilamina 2-clorotritila derivatizada com ácido subérico
Estágio 1 - Imobilização à resina 2-clorotritila-0-NH2
<formula>formula see original document page 55</formula>
A um frasco de fundo redondo carregado com resina 2-clorotritila-0-NH2 (6 g, carga de 1,14 mmol/g, 6,84 mmols) e DCM (60 ml), foiadicionado DIPEA (5,30 g, 41,0 mmols, 6 eq). 8-cloro-8-oxooctanoato demetila (4,2 g, 20,5 mmols, 3 eq) foi adicionado lentamente à mistura de rea-ção com agitação orbital, e a mistura de reação foi agitada por 48 horas. Aresina foi filtrada e lavada usando o procedimento de lavagem padronizado.A resina foi seca sob vácuo. A pureza por LCMS foi determinada por detec-ção ELS, 100%, m/z 204 [M++H]+.
Estágio 2 - SaponificaçãoA um frasco de fundo redondo carregado com resina do Estágio1 (4 g, carga de 1,14 mmol/g, 4,56 mmols), foram adicionados THF (16 ml) eMeOH (16 ml). À reação, foi adicionada uma solução de NaOH (0,91 g, 22,8mmols, 5 eq) em água (16 ml). A mistura de reação foi agitada por 48 horas.
A resina foi filtrada e lavada com água x 2, MeOH x 2, seguido pelo proce-dimento de lavagem padronizado. A resina foi seca sob vácuo. A pureza porLCMS foi determinada por detecção ELS, 100% m/z 190 [M++H]+
Preparação de derivados de SAHA
Compostos baseados no SAHA foram preparados pelos méto-dos apresentados abaixo.
Os compostos (8), (9) e (10) foram preparados pela metodologiadescrita nos seguintes esquemas:<formula>formula see original document page 57</formula>
R = Ciclopentil Composto (8)
R = t-Butil Composto (10)
Composto (9)
Os estágios 1 a 5 são exemplificados para R = ciclopentilaEstágio 1 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-(3-nitro-benzilamino)-fenila-acético
Brometo de 3-nitrobenzila (46 mmols) foi dissolvido em DMF(180 ml) e foi adicionado carbonato de potássio (92 mmols), seguido peloéster de (S)-fenilglicina (10,6 g, 46 mmols). A reação foi agitada por 17 horasem temperatura ambiente, antes de ser evaporada até secura. O resíduo foiredissolvido em EtOAc (150 ml) e lavado com água (3 x 80 ml), seco(Na2S04), filtrado e concentrado até seco. Após purificação por cromatogra-fia instantânea em coluna (30% EtOAc/hexano), o éster foi obtido e usadodiretamente no Estágio 2.
Estágio 2 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-[terc-Butoxicarbonila-(3-nitro-benzila)-amina]-fenila-acético
<formula>formula see original document page 58</formula>
O produto do Estágio 1 (40,9 mmols) foi dissolvido em THF (250ml), antes da adição de carbonato de potássio (61,4 mmols) e água (150 ml).
Di-terc-butila-dicarbonato (163 mmols) foi adicionado, e a mistura de reaçãofoi aquecida até 50°C por 18 horas. DCM foi adicionado, e a mistura resul-tante foi lavada consecutivamente com 0,1 M de HCI (150 ml), NaHC03 a-quoso saturado e água (150 ml). A camada de DCM foi seca (Na2S04), fil-trada e concentrada até seca. Após purificação por cromatografia instantâ-nea em coluna (5% EtOAc/hexano), o sulfato do título foi isolado e usadodiretamente no Estágio 3.
Estágio 3 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-[(3-amina-benzila)-terc-butoxicarbonila-amina]-fenila-acético
<formula>formula see original document page 58</formula>
O produto do Estágio 2 (11,5 mmols) foi dissolvido em EtOAc(150 ml), antes da adição de catalisador Pd/C (10% de umidade) (0,8 g), ehidrogenado sob pressão de balão em temperatura ambiente por 18 horas. Amistura de reação foi filtrada através de um bloco de celite e evaporada atéseca para gerar um sólido.Estágio 4 - Acoplamento da resina
<formula>formula see original document page 59</formula>
Resina hidroxilamina 2-clorotritila derivatizada com ácido subéri-co (1,0 g, carga de 0,83 mmol/g) foi expandida em DMF (15 ml), e foi adicio-nado PyBOP (1,36 g, 2,61 mmols), seguido por DIPEA (1,5 ml, 8,7 mmols).O produto do Estágio 3 (2,61 mmols) foi dissolvido em DCM (15 ml) e adi-cionado à mistura de reação. A reação foi agitada por 24 horas em tempera-tura ambiente. A resina foi filtrada e lavada usando o procedimento de lava-gem padronizado. A resina foi seca sob vácuo.
Estágio 5 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-[3-(7-hidroxicarbamoila-heptanoilamino)-benzilamino]-fenilacético - Compos-to (8)
<formula>formula see original document page 59</formula>
O produto do Estágio 4 (carga de 0,83 mmol) foi agitado gentil-mente em TFA 2%/DCM (10 ml) por 20 minutos. A resina foi filtrada. O filtra-do foi evaporado sob pressão reduzida em temperatura ambiente. A resinafoi retratada com TFA 2%/DCM (10 ml) e filtrada após 20 minutos. Os filtra-dos combinados foram evaporados até secos sob pressão reduzida em tem-peratura ambiente para gerar um resíduo oleoso. Permitiu-se que o resíduorepousasse em TFA 20%/DCM por 40 minutos. Após evaporação até seco,também sob pressão reduzida em temperatura ambiente, o produto bruto foipurificado por HPLC preparatória.
Dados analíticos para o Composto 8:
Pureza por LCMS de 100%, m/z 496 [M++H]+1H RMN (400 MHz,MeOD), 8: 1,30-1,70 (16H, m), 2,00 (2H, t), 2,30 (2H, t), 4,05 (2H, dd), 5,00(1H, m), 5,15 (1H, m), 7,05 (1H, m), 7,30 (2H, m), 7,40 (5H, m), 7,75 (1H, m).
Dados analíticos para o Composto (10):
Pureza por LCMS de 97%, m/z 484 [M++H]+, 1H RMN (400 MHz,MeOD), ô: 1,30 (13H, m), 1,45-1,65 (4H, m), 1,93-2,05 (2H, m), 2,20-2,40(2H, m), 3,99 (2H, q), 4,65-4,95 (1H, m) 7,05 (1H, d), 7,25-7,33 (2 H, m),7,35-7,50 (5H, m), 7,75 (1H, s).
Estágio 6 - Saponificação
<formula>formula see original document page 60</formula>
O produto do Estágio 5, em que R = Et (1,4 g, carga de 0,83mmol), foi suspenso em THF (8,6 ml) e MeOH (8,6 ml), e foi adicionada umasolução de 1,4 M de hidróxido de sódio (5,98 mmols). A mistura foi agitadapor 24 horas, e a resina foi filtrada e lavada com água x 2, MeOH x 2, segui-do pelo procedimento de lavagem padronizado. A resina foi seca sob vácuo.
Estágio 7 - Síntese de ácido (S)-[3-(7-hidroxicarbamoila-heptanoilamino)-benzilamino]-fenilacético (9)
<formula>formula see original document page 60</formula>
O produto do Estágio 6 (1,44 g, carga de 0,83 mmol) foi então gentilmenteagitado em TFA 2%/DCM (10 ml) por 20 minutos. A resina foi filtrada e o fil-trado foi evaporado sob pressão reduzida em temperatura ambiente. A resi-na foi retratada com TFA 2%/DCM (10 ml) e filtrada após 20 minutos. Osfiltrados combinados foram evaporados até secos sob pressão reduzida emtemperatura ambiente para gerar um resíduo oleoso. Permitiu-se que o resí-duo repousasse em TFA 20%/DCM por 40 minutos. Após evaporação atéseco, sob pressão reduzida em temperatura ambiente, o produto bruto foipurificado por HPLC preparatória para gerar composto (9). Pureza por LCMSde 100%, m/z 428 [M++H]+, 1H RMN (400 MHz, MeOD), S: 1,20-1,35 (4H, m),1,50-1,65 (4H, m), 2,00 (2H, m), 2,30 (2H, m), 4,00 (2H, dd), 4,90 (1H, m),7,05 (1H, m), 7,25-7,50 (7H, m), 7,70 (1H, m).
O Composto (24) foi preparado seguindo a mesma metodologia descrita pa-ra a síntese de composto (8).
Ciclopentila éster de ácido ({(R)-[(4-7-hidroxicarbamoila-heptanoilamino)-fenila]-fenila-metila}-amina)acético (24)
<formula>formula see original document page 61</formula>
Pureza por LCMS de 95%, m/z 496 [M++H]+, 1H RMN (400 MHz,DMSO), ô: 1,30-1,50 (6H, m), 1,50-1,70 (8H, m), 1,80 (2H, m), 2,10 (2H, t),2,45 (2H, t), 4,1 (2H, dd), 5,25 (1H, m), 5,35 (1H, m), 7,45 (2H, d), 7,60 (5H,m), 7,80 (2H,d), 10,00-10,10 (2H, br s), 10,50 (1H,s).
EXEMPLO 2
Este exemplo descreve a modificação do inibidor de aurora qui-nase A ("Aurora A") conhecido N-{4-(7-metóxi-6-metóxi-quinolina-4-ilóxi)-fenilaj-benzamida (composto (11)) pela adesão de um motivo éster de ami-noácido em um ponto onde não ocorra ruptura do seu modo de ligação.Composto (11): N-{4-(7-metóxi-6-metóxi-quinolina-4-ilóxi)-fenila}-benzamida
<formula>formula see original document page 61</formula>O Composto (11) foi preparado como descrito na Patente U.S.Ne 6.143.764.
Compostos baseados no composto (11) foram preparados pelosmétodos apresentados abaixo.
Os Compostos (12) e (13) foram preparados pelo método descri-to no seguinte esquema:<formula>formula see original document page 63</formula>
Estágio 1 - Síntese de N-(4-hidróxi-fenila)-benzamida<formula>formula see original document page 64</formula>
A uma solução de 4-aminofenol (4,27 g, 39,1 mmols) em DMF(50 ml) a 0°C sob uma atmosfera de argônio, foi adicionada trietilamina (7,44ml, 53,4 mmols, 1,5 eq). A reação foi agitada por 10 minutos antes da adiçãolenta de cloreto de benzoila (5 g, 35,6 mmols, 1 eq) ao longo de um períodode 5 minutos. Permitiu-se que a mistura aquecesse até a temperatura ambi-ente, e foi agitada ao longo de 18 horas. O DMF foi removido sob pressãoreduzida, e a mistura foi tratada com EtOAc/água. Como resultado, houve aprecipitação de um sólido branco, que foi retirado por filtração e seco sobpressão reduzida para gerar o composto do título (8,0 g, 96%). 1H RMN (270MHz, DMSO), ô: 10,0 (1H, s), 9,35 (1H, s), 7,9 (2H, d, J = 7,2Hz),. 7,5 (5H,m), 6,75 (2H, d, J = 7,4 Hz).
Estágio 2 - Síntese de N-[4-(7-benziIóxi-6-metóxi-quinolin-4-i!óxi)-fenila]-benzamida
<formula>formula see original document page 64</formula>
A um frasco de fundo redondo carregado com 4-cloro-6-metóxi-7-benziloxiquinolina [vide Org. Synth. Col. Vol. 3, 272 (1955) eUS006143764A (Kirin Beer Kabushiki Kaisha) para os métodos de síntese](1,09 g, 3,6 mmols), foi adicionado o produto do Estágio 1 (2,33 g, 10,9mmols, 3 eq). A reação foi aquecida até 140°C por 3 horas. Após resfriar atéa temperatura ambiente, foi adicionada água à mistura de reação, e a mistu-ra foi extraída 3 vezes com EtOAc. A camada combinada de EtOAc foi lava-da com NaOH aquoso 5% e salmoura, e seca sobre MgSCv O solvente foiremovido sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em colunaeluindo com EtOAc/heptano (2:1) para se obter o composto do título (0,56 g,32%). m/z 477 [M++H].
Estágio 3 - Síntese de N-[4-(7-hidróxi-6-metóxi-quinolin-4-ilóxi)-fenila]-benzamida
<formula>formula see original document page 65</formula>
Uma mistura de produto do Estágio 2 (0,56 g, 1,17 mmol) e Pd/C10% (0,08 g) em ciclohexeno 10%/ EtOH (80 ml) foi aquecida sob refluxo por3 h. O catalisador Pd/C foi filtrado através de um bloco de celite, lavandoduas vezes com MeOH. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida paragerar o composto do título como um sólido amarelo (0,34 g, 75%). m/z 387[M++H].
Estágio 4 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-2-terc-butoxicarbonilamino-butírico
<formula>formula see original document page 65</formula>
A uma solução de produto do Estágio 3 (0,2 g, 0,52 mmol) emDCM anidro (30 ml) a 0°C, foi adicionado ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidróxi-butírico (0,223 g, 0,78 mmol, 1,5 eq) em 5ml de DCM. Ph3P (0,557 g, 2,1 mmols, 4,1 eq) e DIAD (0,412 ml, 2,1 mmols,4,1 eq) foram então adicionados e permitiu-se que a mistura de reação a-quecesse até a temperatura ambiente, e ela foi agitada por 16 horas. A mis-tura de reação bruta foi evaporada sob pressão reduzida e purificada porcromatografia em coluna para gerar o composto do título (0,135 g, 46%). m/z656,3 [M++H].
Estágio 5 - Síntese de ciclopentila éster de ácido ((S)-2-amina-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-butírico) (12)
<formula>formula see original document page 66</formula>
A uma solução de produto do Estágio 4 (5,8 mg, 0,009 mmol)em DCM (1 ml), foi adicionado TFA (1 ml). Permitiu-se que a mistura de rea-ção fosse agitada por 16 horas, antes de evaporação sob pressão reduzida,sendo submetida a azeotropia com tolueno para remover os traços de TFA.
O Composto (12) foi isolado como um sólido esbranquiçado (4,7 mg). Pure-za por LCMS de 95%, m/z 556,2 [M++H], 1H RMN (270 MHz, DMSO), ô: 10,4(1H, s), 8,8 (1H, d, J = 6,5 Hz), 8,55 (2H, bs), 8,01 (4H, m), 7,65 (4H, m),7,35 (1H, d, J = 7,6 Hz), 6,75 (1H, d, J = 6,5 Hz), 5,25 (1H, m), 4,35 (3H, m),4,0 (3H, s), 2,4 (2H, m), 1,85-1,4 (8H, bm).
Estágio 6 - Síntese de ácido (S)-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-2-terc-butoxicarbonilamino-butíricoA uma solução de produto do Estágio 4 (17 mg, 0,02 mmol) em
<formula>formula see original document page 67</formula>
THF (1 ml), foram adicionados 2 M de NaOH (0,026 ml, 0,046 mmol, 2 eq).Após 16 horas, a reação estava incompleta e, portanto, foi acrescentado umadicional de 2 equivalentes de NaOH. A agitação completou-se após 6 ho-ras, e o THF foi removido sob pressão reduzida. A camada aquosa foi diluí-da com 3 ml de água e acidificada até o pH 6 com 1 M de HCI. O compostodo título foi extraído em EtOAc, seco sobre MgSGv e isolado como um sólidobranco. Esse foi usado diretamente no Estágio 7, sem purificação adicional.Estágio 7 - Síntese de ácido (S)-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-2-terc-butilcarbonilamino-butírico (13)
em DCM (1 ml), foi adicionado TFA (1 ml). Permitiu-se que a reação fosseagitada por 6 horas, e a seguir ela foi evaporada sob pressão reduzida paragerar o composto do título (13) como um sólido esbranquiçado (90%). Pure-za por LCMS de 100%, m/z 488,2 [fvf+H], 1H RMN (300 MHz, MeOD), 5:8,75 (1H, d, J = 7,8 Hz), 8,00 (4H, m), 7,65 (4H, m), 7,4 (1H, d, J = 7,6 Hz),6,95 (1H, d, J = 8,0 Hz), 4,6 (2H, m), 4,3 (1H, m), 4,2 (3H, s), 2,6 (2H, m).
O Composto (14) foi preparado pelo método descrito no esque-
A uma solução de produto do Estágio 6 (6,5 mg, 0,011 mmol)ma seguinte:
<formula>formula see original document page 68</formula>
Os Estágio 1, 2 e 3 são os mesmos descritos acima para a sín-tese do composto (12).
Estágio 4 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-2- benziloxicarbonilami-no-butírico<formula>formula see original document page 69</formula>
O produto do Estágio 3 (0,15 g, 0,39 mmol), terc-butila éster deácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromo-butírico (0,16 g, 0,43 mmol, 1,1eq) e K2C03 (0,11 g, 0,78 mmol, 2 eq) foram dissolvidos em DMF anidro (10ml) sob uma atmosfera de nitrogênio. A reação foi agitada a 35°C de um diapara o outro, antes de o DMF ter sido removido sob pressão reduzida. O re-síduo foi dissolvido em DCM e lavado com água seguida por salmoura. Acamada orgânica foi seca sobre MgSCM e evaporada sob pressão reduzida.A cromatografia em coluna (eluindo com MeOH 1%/DCM) gerou o compostodo título (0,16 g, 60%). m/z 678 [M+H]+, 1H RMN (300 MHz, CDCI3), ô: 8,49(1H, d, J = 5,3 Hz), 7,98 (1H, s), 7,92 (2H, dd, J = 8,2, 1,4 Hz), 7,80-7,72(2H, m), 7,63-7,48 (4H, m), 7,43-7,29 (4H, m), 7,24-7,17 (2H, m), 6,64 (1H,d, J = 8,9 Hz), 6,49 (1H, d, J = 5,3 Hz), 5,15 (2H, s), 4,66-4,57 (1H, m), 4,43-4,34 (1H, m), 3,85 (3H, s), 2,55-2,33 (2H, m), 1,41 (9H, m).
Estágio 5 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-Amina-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-butírico (14)<formula>formula see original document page 70</formula>
O produto do Estágio 4 (0,045 g, 0,066 mmol) foi dissolvido emEtOAc anidro (5 ml) e Pd(OH)2/C foi adicionado sob uma atmosfera de nitro-gênio. A reação foi desgaseificada e agitada sob uma atmosfera de hidrogê-nio em temperatura ambiente de um dia para o outro. O catalisador foi reti-rado por filtraçao através de um bloco de celite, e o solvente foi removidosob pressão reduzida. O Composto (14) foi purificado por HPLC preparató-ria, m/z 544 [M+H]+, 1H RMN (300 MHz, CD3OD), 8: 8,67 (1H, d, J = 6,8 Hz),7,98 (4H,d, J = 8,7 Hz), 7,90 (1 H, s), 7,68-7,51 (4H, m), 7,42-7,36 (2H, m),6,97 (1H, d, J = 6,6 Hz), 4,52 (2H, t, J = 5,7 Hz), 4,28 (1H, t, J = 6,5 Hz), 4,13(3H, s), 2,69-2,45 (2H,m), 1,53 (9H,s).
Estágio 1 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-4-[4-(4-benzoilamino-fenóxi)-6-metóxi-quinolin-7-ilóxi]-2-ciclohexilamino-butírico(25)
O Composto (25) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 70</formula><formula>formula see original document page 71</formula>
Ao composto (12) (37 mg, 0,066 mmol) em MeOH anidro (1 ml)foram adicionados 100 ul de uma solução 1 M de ciclohexanona em MeOH e1 gota de ácido acético. A mistura de reação foi agitada em temperatura am-biente por 3 horas. Foi então adicionado cianoborohidreto de sódio (10,3 mg,0,165 mmol), e a reação foi deixada em agitação por 4 horas em temperatu-ra ambiente, antes da concentração sob vácuo. A purificação por HPLC pre-paratória gerou o composto do título (25) como um sal de di-TFA. m/z 638[M+H]+. 1H RMN (300 MHz, CD3OD) Ô; 8,72 (1H, d, J = 6,8 Hz), 8,02-7,98(4H, m), 7,93 (1H, s), 7,67 (1H, s), 7,66-7,53 (3H, m), 7,42 (2H, m), 6,99 (1H,d, J = 6,8 Hz), 5,38 (1H, m), 4,49 (3H, m), 4,14 (3H, s), 3,27 (11H, m), 2,66(2H, m), 2,20 (2H, m), 12,05-1,46 (16H, m).
EXEMPLO 3
Este exemplo descreve a modificação do inibidor de P38 quina-se conhecido 6-Amina-5-(2,4-diflúor-benzoila)-1-(2,6-diflúor-fenila)-1 H-piridin-2-ona (composto 3258) pela adesão de um motivo éster de aminoáci-do em um ponto onde não ocorra ruptura do seu modo de ligação.
Composto (15): 6-Amina-5-(2,4-diflúor-benzoila)-1 -(2,6-diflúor-fenila)-1 H-piridin-2-ona
<formula>formula see original document page 71</formula>
O Composto (15) foi preparado como descrito em WO 03/076405.
Os Compostos baseados no composto (15) foram preparadospelos métodos apresentados abaixo.
Os Compostos (16) e (17) foram preparados pelo método descri-to no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 72</formula>
Estágio 1 - Síntese de ciclopentila (S)-4-{4-[6-Amina-5-(2,4-difluorbenzoila)-2-oxo-2H-piridin-1-ila]-3,5-difluorofenóxi}-2-terc-butoxi-carbonilaminobutirato
<formula>formula see original document page 72</formula>
A uma mistura agitada de 6-amina-5-(2,4-difluorbenzoila)-1-(2,6-diflúor-4-hidróxi-fenila)-1 H-piridin-2-ona [preparada por métodos descritosem WO 03/076405] (100 mg, 0,265 mmol) e K2C03 em DMF (1,5 ml), foi a-dicionado ciclopentila éster de ácido (L)-5-bromo-2-terc-butoxicarbonilami-nopentanóico (96 mg, 0,265 mmol). A mistura de reação foi agitada a 60°Cpor 2 horas. A mistura de reação foi diluída com EtOAc (15 ml) e lavada comNaHC03 aquoso saturado (3 ml) e água (10 ml). A camada de EtOAc foi se-ca (Na2S04), filtrada e concentrada até secura. A purificação por cromato-grafia instantânea (EtOAc 20%/heptano) gerou o composto do título comoum sólido branco (50 mg, 29%). Pureza por LCMS de 100%, m/z 648[M++H], 1H RMN (400 MHz, MeOD), 8: 1,30 (9H, s), 1,40-1,65 (6H, m), 1,70-1,85 (2H, m), 1,95-2,30 (2H, m), 4,00-4,10 (2H, m), 4,15-4,20 (1H, m), 5,05-5,10 (1H, m), 5,65 (1H, d), 6,70-6,80 (2H, m), 6,95-7,05 (2H, m), 7,25-7,45(2H, m).
Estágio 2 - Síntese de trifluoracetato de ciclopentila (S)-2-Amina-4-{4-[6-amina-5-(2,4-dif luorbenzoíla)-2oxo-2H-piridin-1 -ila]-3,5-difluorofenóxi}butanoato (16)
<formula>formula see original document page 73</formula>
Permitiu-se que uma mistura de produto do Estágio 1 (10 mg) eTFA 20%/ DCM (0,5 ml) ficasse em repouso em temperatura ambiente por 3horas. A mistura de reação foi concentrada até ser secura por jato de N2. Oresíduo foi triturado com Et20 (0,3 ml x 2) para gerar o composto (16) comoum sólido branco (9,3 mg, 91%). Pureza por LCMS de 100%, m/z 548[M++H], 1H RMN (400 MHz, MeOD), Ô: 1,55-1,80 (6H, m), 1,85-2,00 (2H, m),2,30-2,50 (2H, m), 4,15-4,30 (3H, m), 5,25-5,35 (1H, m), 5,75 (1H, d), 6,85-6,95 (2H, m), 7,05-7,15 (2H, m), 7,40-7,55 (2H, m).
Estágio 3 - Síntese de ácido (S)-2-Amina-4-{4-[6-amina-5-(2,4-dif luorbenzoila)-2-oxo-2H-piridin-1 -ila]-3,5-dif luorofenóxijbutanóico (17)
<formula>formula see original document page 73</formula>
A uma solução de composto (16) (20 mg, 0,0317 mmol) em umamistura de MeOH (0,3 ml) e THF (0,3 ml), foram adicionados 2 M de NaOHaquoso (0,3 ml). Permitiu-se que a mistura de reação repousasse em tempe-ratura ambiente por 3 horas. Com o término, a mistura de reação foi evapo-rada até seca com um jato de N2) acidifiçada até o pH 1-2 por adição gota agota de 2 M de HCI aquoso. O sólido branco resultante formado foi coletadopor filtração. Rendimento = 9 mg, 48%, pureza por LCMS de 97%, m/z 480[M++H], 1H RMN (400 MHz, MeOD), 8: 2,35-2,55 (2H, m, CH2), 4,15-4,20(1H, m, CH), 4,25-4,35 (2H, m, CH2), 5,75 (1H, d, CH), 6,85-7,00 (2H, m, Ar),7,05-7,20 (2H, m, Ar), 7,40-7,55 (2H, m, Ar).
O Composto (18) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 74</formula>
Estágio 1 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-4-{4-[6-Âmina-5-(2,4-diflúor-benzoila)-2-oxo-2H-piridin-1-ila]-3,5-diflúor-fenóxi}-2-benziloxicarbo-nilamino-butírico
A uma solução de 6-Amina-5-(2,4-difluorbenzoila)-1-(2,6-diflúor-4-hidroxifenila)-1H-piridin-2-ona (100 mg, 0,26 mmol) e t-butila éster de ácido(S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromo-butírico (108 mg, 0,29 mmol) em ace-tona (2 ml), foram adicionados iodeto de sódio (79 mg, 0,53 mmol) e carbo-nato de potássio (146 mg, 1,06 mmol). A reação foi aquecida no refluxo por12 horas, resfriada e dividida entre água (20 ml) e acetato de etila (20 ml). Acamada aquosa foi re-extraída com acetato de etila (2 x 10 ml) e os extratosorgânicos combinados lavados com salmoura (20 ml), secos (MgS04) e con-centrados sob pressão reduzida para gerar um óleo amarelo. Esse resíduofoi submetido à cromatografia em coluna [sílica-gel, acetato de etila 40%-heptano] para gerar o produto desejado (186 mg, 79%) como um sólido inco-lor, m/z 670 [M+H].
Estágio 2 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-Amina-4-{4-[6-amina-5-(2,4-diflúor-benzoila)-2-oxo-2H-piridin-1-ila]-3,5-diflúor-fenóxi}-butírico
<formula>formula see original document page 75</formula>
Terc-butila éster de ácido (S)-4-{4-[6-Amina-5-(2,4-diflúor-benzoila)-2-oxo-2H-piridin-1-ila]-3,5-diflúor-fenóxi}-2-benziloxicarbonilamino-butírico (140 mg, 0,2 mmol) foi dissolvido em acetato de etila (15 ml) conten-do paládio hidróxido sobre carbono 10% (20 mg) e agitado sob uma atmos-fera de hidrogênio (1 atmosfera) por 1 hora. A mistura de reação foi depura-da com N2, e filtrada através de lavagem com Celite® com mais acetato deetila. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para gerar um sólidoque foi submetido à cromatografia em coluna [sílica-gel: MeOH 5% em diclo-rometano]. Esse gerou o produto desejado (60 mg, 54%) como um solidocinza: pureza por LCMS de 98%, m/z 536 [M+H]+, 1H RMN (300 MHz, CD-Cl3) 7,65-7,44 (1H, m), 7,39-7,29 (2H, m), 6,96-6,82 (2H, m), 6,66 (2H, br d,J = 8,1 Hz), 5,82 (1H, d, J = 9,9 Hz), 4,20-4,07 (3H, m), 3,48 (1H, dd, J = 4,8,8,7 Hz), 2,22-2,15 (1H,m), 1,91-1,84 (1H, m), 1,62 (2H, br s), 1,43(9H, s).
EXEMPLO 4
Este exemplo descreve a modificação do inibidor de DHFR co-nhecido 5-Metila-6-((3,4,5trimetoxifenilamino)metila)pirido[2,3-d]pirimidina-2,4-diamina (composto (2 G=N)) pela adesão de um motivo éster de amino-ácido em um ponto onde não ocorra ruptura do seu modo de ligação.
Composto (2 G=N): 5-Metila-6-((3,4,5-trimetoxifenilamino)metila) pirido[2,3-o]pirimidina-2,4-diamina<formula>formula see original document page 76</formula>
O Composto (2 G=N) foi preparado por uma modificação do mé-todo descrito em J. Med. Chem. 1993, 36, 3.437-3.443.
2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-c/]pirimidina-6-carbonitrila (0,10 g,0,5 mmol), 3,4,5-trimetoxianilina (0,10 g, 0,55 mmol) e níquel de Raney (0,7g, úmido) em ácido acético (20 ml) foram agitados em temperatura ambientesob uma atmosfera de hidrogênio. Após 2 horas, a mistura de reação foi fil-trada através de celite, e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. Oresíduo bruto foi purificado por HPLC de fase reversa para gerar o composto(2 G=N) como um sólido (22 mg, 16%). Pureza por LCMS de 94%, m/z371,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), ô: 8,5 (1 H, s), 7,0 (2H, bs), 6,2(2H, bs), 6,0 (2H, s), 5,7 (1 H, m), 4,2 (2H, d), 3,7 (6H, s), 3,5 (3H, s), 2,7(3H,s).
Compostos baseados no composto (2 G=N) foram preparadospelos métodos apresentados abaixo.
Os Compostos (6) e (19) foram preparados pelo método descritono esquema seguinte:<formula>formula see original document page 77</formula>
Estágio 1 - Síntese de (S)-ciclopentila 4-metila-2-(4-nitrobenzamido)pentanoato
Cloreto de 4-nitrobenzoila (0,60 g, 3,9 mmols) em DCM (2 ml) foiadicionado gota a gota ao longo de 10 minutos a uma solução de (S)-ciclopentila 2-amina-4-metilpentanoato (0,70 g, 3,5 mmols) e diisopropileti-lamina (0,94 ml, 5,3 mmols) em DCM (10 ml) a -5°C sob uma atmosfera denitrogênio. Ao término da adição, permitiu-se que a mistura de reação aque-cesse até a temperatura ambiente, e ela foi agitada por mais 30 minutos. Amistura de reação foi derramada em NaHC03 aquoso saturado e a camadaaquosa foi extraída com DCM. Os extratos orgânicos foram combinados,lavados com salmoura, secos sobre MgS04 e evaporados sob pressão re-duzida para gerar o composto do título como um sólido oleoso em rendimen-to quantitativo. Pureza por LCMS de 92%, m/z 347,1 [M+H]+.
Estágio 2 - Síntese de (S)-ciclopentila 2-(4-aminobenzamido)-4-metilpentanoato
<formula>formula see original document page 78</formula>
Trietilamina (1,09 g, 10,8 mmols) e ácido fórmico (0,50 g, 10,8mmols) foram dissolvidos em EtOH (10 ml) e adicionados a uma solução doproduto do Estágio 1 (1,2 g, 3,4 mmols) em EtOH (10 ml). Foi adicionadoPd/C 10% (aproximadamente 10% mol), e a mistura foi aquecida até o reflu-xo. Após 1 hora, a mistura de reação quente foi filtrada através de celite e oresíduo lavado com MeOH. O filtrado e as lavagens foram combinados eevaporados, e o resíduo dividido entre DCM e NaHC03 aquoso saturado. Acamada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre MgS04 e evaporadasob pressão reduzida para dar origem ao o composto do título como um só-lido branco (0,80 g, 73%). Pureza por LCMS de 97%, m/z 319,2 [M+H]+, 1HRMN (400 MHz, CDCI3), ô: 7,6 (2H, dd), 6,6 (2H, dd), 5,2 (1H, m), 6,4 (1H, d)4,7 (1H, m), 4,0 (2H, s), 1,9 (2H, m), 1,7 (5H, m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd).
Estágio 3 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metila-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetila)amino]-benzoilamino}-4-metila-pentanóico (6)<formula>formula see original document page 79</formula>
2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-cf]pirimidina-6-carbonitrila (0,47 g,2,4 mmols), o produto do Estágio 2 (300 mg, 0,94 mmol) e níquel de Raney(1 g, úmido) em ácido acético (40 ml) foram agitados em temperatura ambi-ente sob uma atmosfera de hidrogênio. Após 48 horas, a mistura de reaçãofoi filtrada através de celite, e o solvente foi evaporado sob pressão reduzi-da. O material foi carregado em MeOH sobre uma coluna SCX e retirado poreluição com uma solução de amônia 1% em MeOH. O produto bruto foi en-tão adsorvido sobre sílica e purificado por cromatografia em coluna (MeOH10%/DCM) para gerar composto (6) (60 mg,13%). Pureza por LCMS de95%, m/z 506,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), 8: 8,5 (1H, s), 8,2 (1H,d), 7,7 (2H, d), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, m), 6,2 (2H, bs), 5,1 (1H,m), 4,4 (1H, m), 4,3 (2H, d), 2,7 (3H, s), 1,7 (11H, m), 0,9 (6H, dd).
Estágio 4 - Síntese de ácido (S)-2-(4-((2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-£/]pirimidin-6-ila)metilamino)benzamido)-4-metilpentanóico (19)
<formula>formula see original document page 79</formula>
O produto do Estágio 3 (3901) foi suspenso em EtOH (1,0 ml).
Uma solução de 1 M de hidróxido de lítio (156 ul) foi adicionada à soluçãoacima e a suspensão foi agitada por 48 horas. O EtOH foi subseqüentemen-te removido sob pressão reduzida, o residual foi diluído com água e reduzidoao pH 4 com ácido acético diluído. A solução foi lavada com DCM, evapora-da e submetida à purificação com SCX para gerar o composto (19). Purezapor LCMS de 92%, m/z 438 [M+H]+; 1H RMN (400 MHz, DMSO) Ô: 8,5 (1H,s), 8,1 (1H, d), 7,7 (2H, d), 7,2 (2H, br s), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, t), 6,4 (2H, brs), 4,4 (1H, m), 4,3 (2H, d), 2,7 (3H, s), 1,8-1,6 (2H, m), 1,6 - 1,5 (1H, m),0,9 (6H, dd).
Os Compostos (5) e o ácido correspondente foram preparadospelo método descrito no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 80</formula>
Estágio 1 - Síntese de (S)-ciclopentila 4-metila-2-(4-nitrobenzilamino)pentanoato
<formula>formula see original document page 81</formula>
A uma solução de (S)-ciclopentila 2-amina-4-metilpentanoato(2,00 g, 10,0 mmols) e 4-nitrobenzaldeído (3,04 g, 20,0 mmols) em DCM (40ml), foi adicionado ácido acético glacial (2 gotas). A solução foi agitada emtemperatura ambiente por 1 hora, quando então foi adicionado triacetoxibo-rohidreto de sódio (6,40 g, 30,2 mmols) em uma porção única. Após agitaçãopor 3 horas, a solução foi derramada em 1 M de HCI aquoso, agitada por 30minutos, neutralizada com 1 M de NaOH aquoso e extraída com DCM. Osorgânicos combinados foram lavados com água e salmoura, secos sobreMgS04, e evaporados sob pressão reduzida. O material bruto foi purificadopor cromatografia (EtOAc 5%/isohexano) para gerar o composto do títulocomo um óleo (1,51 g). Esse foi usado sem purificação adicional na etapaseguinte. Pureza por LCMS de 71%, m/z 335,1 [M-H].
Estágio 2 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-(4-amina-benzilamino)-4-metila-pentanóico
<formula>formula see original document page 81</formula>
O produto do Estágio 1 (0,90 g, 2,7 mmols) foi dissolvido em E-tOH (5 ml) e adicionado a uma suspensão de níquel de Raney (~ 0,5 g) emonohidrato de hidrazina (0,38 ml, 8,1 mmols) em EtOH (5 ml). Após aque-cimento sob refluxo por 1 hora, a mistura de reação quente foi filtrada atra-vés de celite, e o resíduo foi lavado com MeOH. O filtrado e as lavagens fo-ram combinados e evaporados, e o resíduo foi dividido entre DCM e carbo-nato de sódio hidrogênio aquoso saturado. A camada orgânica foi lavadacom salmoura, seca sobre MgS04 e evaporada sob pressão reduzida. Omaterial bruto foi purificado por cromatografia (20% EtOAc/isohexano) paragerar o composto do título como um óleo (0,50 g, 61%). Pureza por LCMSde 99%, m/z 305,2 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, CDCI3), ô: 7,1 (2H, d), 6,6(2H, d), 5,2 (1H, m), 3,7 (1H, d), 3,5 (1H, d), 3,2 (1H, t), 1,9 (2H, m), 1,7 (5H,m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd).
Estágio 3 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metila-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetila)amino]-benzilamino}-4-metila-pentanóico (5)
<formula>formula see original document page 82</formula>
2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidina-6-carbonitrila (0,16 g,0,83 mmol), produto do Estágio 2 (100 mg, 0,33 mmol) e níquel de Raney (1g, úmido) em ácido acético (10 ml) foram agitados em temperatura ambientesob uma atmosfera de hidrogênio. Após 5 horas, a mistura de reação foi fil-trada através de celite, e o solvente evaporado sob pressão reduzida. O ma-terial foi carregado em MeOH sobre uma coluna SCX e eluído com uma so-lução de amônia 1% em MeOH. O produto bruto foi então adsorvido sobresílica e purificado por cromatografia em coluna (MeOH 10%/DCM) para ge-rar o composto do título (5) (30 mg, 19%). Pureza por LCMS de 95%, m/z492,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), Ô: 8,5 (1H, s), 7,2 (2H, bs), 7,0(2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,8 (1H, m), 5,1 (1H, m), 4,2 (2H, s), 3,6(1H, m), 3,4 (1H, m), 3,1 (1H, m), 2,7 (3H, s), 1,5 (11H, m), 0,8 (6H, dd).Estágio 4 - Síntese de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metila-pirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetila)amino]-benzilamino}-4-metila-pentanóico<formula>formula see original document page 83</formula>
O produto do Estágio 3 (39 um) foi suspenso em EtOH (1,0 ml).Foi adicionada uma solução de 1 M de hidróxido de lítio (156 ul) à soluçãoacima e permitiu-se que a suspensão fosse agitada por 48 horas. O EtOH foisubseqüentemente removido sob pressão reduzida, o residual diluído comágua e o pH reduzido a pH 4 com ácido acético diluído. A solução foi lavadacom DCM, evaporada e submetida à purificação em SCX para gerar o com-posto do título LCMS: 95% pureza em Rt 0,52 e 1,91 min, m/z (ES+) 424[M+H]+; 1H RMN (400 MHz, DMSO) 0:8,5 (1H, s), 7,1 (2H, d), 7,0 (2H, br s),6,6 (2H, d), 6,2 (2H, br s), 5,7 (1H, t), 4,3 (2H, d), 3,6 (1H, m), 3,3 (2H, obs-curecido por água), 2,7 (3H, s), 1,8 (1H, m), 1,3 (1H, m), 1,2 (1H, m).
O Composto (3) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte:<formula>formula see original document page 84</formula>
Composto (3)
Estágio 1 - Síntese de (S)-ciclopentila-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-4-(4-nitrofenóxi)butanoato
<formula>formula see original document page 84</formula>
A uma solução de 4-nitrofenol (2,18 g, 15,7 mmols) em tetrahi-drofurano (100 ml) a 0°C sob nitrogênio, foi adicionado hidreto de sódio(0,63 g, 15,7 mmols). Após aquecimento até a temperatura ambiente e agi-tação por 10 minutos, uma solução de (S)-ciclopentila-4-bromo-2-(terc-butoxicarbonilamino)butanoato (5,0 g, 14,3 mmols) em DMF (20 ml) foi adi-cionada. A reação foi aquecida até 60°C por 10 horas, quando então a rea-ção foi resfriada até a temperatura ambiente e derramada sobre é-ter/carbonato de sódio. A camada orgânica foi coletada e lavada com 2 M desolução aquosa de carbonato de sódio, 1 M de HCI e salmoura, antes de serseca sabre MgS04 e concentrada sob pressão reduzida para gerar um óleoque foi solidificado mediante repouso para gerar o composto do título (4,0 g,69%). Pureza por LCMS de 97%, m/z 407,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz,CDCI3), S: 8,2 (2H, d), 7,4 (1H, d), 7,1 (2H, d), 5,1 (1H, m), 4,1 (3H, m), 2,1(2H, m), 1,8 (2H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s).
Estágio 2 - Síntese de (S)-ciclopentila-4-(4-aminofenóxi)-2(tertbutoxicar-bonilamino)butanoato
<formula>formula see original document page 85</formula>
Trietilamina (0,77 ml, 5,2 mmols) e ácido fórmico (0,19 ml, 5,2mmols) foram dissolvidos em EtOH (4 ml) e adicionados a uma solução doproduto do Estágio 1 (0,7 g, 1,7 mmol) em EtOH (4 ml). Foi acrescentadoPd/C 10% (aproximadamente 10 mol%), e a mistura foi aquecida até o reflu-xo. Após 2 horas, a mistura de reação quente foi filtrada através de celite e oresíduo foi lavado com MeOH. O filtrado e as lavagens foram combinados eevaporados, e o resíduo dividido entre DCM e carbonato de sódio hidrogênioaquoso saturado. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobreMgSCv e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado porcromatografia em coluna (gradiente de eluição, EtOAc 10-40% em hexano)para gerar o composto do título (0,3 g, 46%). Pureza por LCMS de 93%, m/z379,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, CDCI3), ô: 6,9 (2H, d), 6,8 (2H, d), 5,3 (2H,m), 4,4 (1H, m) 4,0 (2H, m), 2,3 (1H, m), 2,2 (1H, m), 1,9 (2H, m), 1,7 (4H,m), 1,6 (2H, m), 1,4(9H,s).
Estágio 3 - Síntese de (S)-ciclopentila-2-(ferc-butoxicarbonilamino)-4-(4-((2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-c/]pirimidin-6-ila)metilamino)fenóxi) bu-tanoato<formula>formula see original document page 86</formula>
2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-c(lpirimidina-6-carbonitrila (0,50 g,2,5 mmols), o produto do Estágio 2 (0,38 g, 1,0 mmol) e níquel de Raney (3g, úmido) em ácido acético (40 ml) foram agitados em temperatura ambientesob uma atmosfera de hidrogênio. Após 16 horas, a mistura de reação foifiltrada através de celite, e o solvente evaporado sob pressão reduzida. Omaterial foi carregado em MeOH sobre uma coluna SCX e eluído com umasolução de amônia 1% em MeOH. O produto bruto foi então adsorvido sobresílica e purificado por cromatografia em coluna (MeOH 5%/DCM) para geraro composto do título (145 mg, 26%). Pureza por LCMS de 95%, m/z 566,2[M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), Ô: 8,5 (1H, s), 7,3 (2H, m), 7,0 (2H, m),6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, bs), 5,1 (1H, m), 4,1 (3H, m),3,9 (2H, m), 2,6 (3H, s), 2,0 (1H, m), 1,8 (3H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s).
Estágio 4 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-Amina-4-{4-[(2,4-diamino-5-metila-pirido[2,3-cdpirimidin-6-illmetila)-amina]-fenóxi}-butírico(3)
<formula>formula see original document page 86</formula>
A uma solução de produto do Estágio 3 (145 mg, 0,26 mmol) em DCM (3ml), foi adicionado ácido trifluoracético (3 ml), e a reação foi agitada por 30minutos em temperatura ambiente. O solvente foi evaporado sob pressãoreduzida e o resíduo bruto purificado por carga em MeOH sobre uma colunaSCX e eluindo com uma solução de amônia 1% em MeOH para gerar ocomposto (3) (39 mg, 33%). Pureza por LCMS de 94%, m/z 466,1 [M+H]+,1H RMN (400 MHz, DMSO), ô: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H,d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, bs), 5,1 (1H, m), 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m), 3,4 (1H,m), 2,7 (3H, s), 2,0 (2H, m), 1,8 (3H, m), 1,6 (6H, m).
O Composto (4) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 87</formula>
O Estágio 1 é o mesmo descrito para o composto (3).
Estágio 2 - Síntese de (S)-ciclopentila 2-amina-4-(4-nitrofenóxi) butano-ato<formula>formula see original document page 88</formula>
A uma solução de produto do Estágio 1 (4,0 g, 9,8 mmols) emDCM (12 ml), foi adicionado ácido trifluoracético (12 ml). Após agitação emtemperatura ambiente por 1 hora, a reação foi diluída com DCM, resfriadaem gelo e neutralizada pela adição de amônia aquosa. A camada orgânicafoi coletada e lavada com água, carbonato de sódio hidrogênio aquoso esalmoura, e depois seca sobre MgSCM e concentrada sob pressão reduzidapara gerar o composto do título como um óleo amarelo (3,0 g, 100%). Pure-za por LCMS de 97%, m/z 309,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, CDCI3), ô: 8,2(2H, d), 7,0 (2H, d), 5,2 (1H, m), 4,2 (2H, m), 3,6 (1H, dd), 1,7-1,5 (10H, m).
Estágio 3 - Síntese de (S)-ciclopentila 2-(ciclohexilamino)-4-(4-nitrofenóxi)butanoato
<formula>formula see original document page 88</formula>
A um frasco contendo o produto do Estágio 2 (1,0 g, 3,3 mmols)e ciclohexanona (0,34 ml, 3,3 mmols) sob nitrogênio, foi adicionado MeOHanidro (10 ml). Após agitação por 12 horas em temperatura ambiente, foiadicionado triacetoxiborohidreto de sódio (2,07 g, 9,75 mmols). Após 4 ho-ras, a reação foi derramada lentamente sobre uma mistura de DCM/HCI a-quoso (1 M). Após agitação por 10 minutos, a camada orgânica foi coletadae lavada com carbonato de sódio hidrogênio e salmoura, e depois seca so-bre MgSCv e concentrada sob pressão reduzida para gerar o composto dotítulo como um sólido oleoso amarelo (1,21 g, 95%). Pureza por LCMS de92%, m/z 391,1 [M+H]+.
Estágio 4 - Síntese de (S)-ciclopentila 4-(4-aminofenóxi)-2-(ciclohexilamino)butanoato<formula>formula see original document page 89</formula>
Trietilamina (1,29 ml, 9,3 mmols) e ácido fórmico (348 ul, 9,3mmols) foram dissolvidos em EtOH (10 ml) e adicionados a uma solução doproduto do Estágio 3 (1,2 g, 3,1 mmols) em EtOH (10 ml). Foi adicionadoPd/C 10% (aproximadamente 10 mol%) e a mistura foi aquecida até o reflu-xo. Após 30 minutos, a mistura de reação quente foi filtrada através de celitee o resíduo foi lavado com MeOH. O filtrado e as lavagens foram combina-dos e evaporados, e o resíduo dividido entre DCM e NaHC03 aquoso satu-rado. A camada orgânica foi lavada com salmoura, seca sobre MgS04 econcentrada sob pressão reduzida para gerar o composto do título (1,01 g,92%). Pureza por LCMS de 94%, m/z 361,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz,CDCI3), Ô: 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 5,2 (1H, m), 4,0 (1H, m), 3,9 (1H, m), 3,5(1 H, dd), 2,3 (1H, m), 2,1 (1H, m), 1,9 (4H, m), 1,7 (7H, m), 1,6 (3H, m), 1,3-0,9 (5H, m).
Estágio 5 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-ciclohexilamino-4-{4-[(2,4-diamino-5-metila-pirido[2,3-c/]pirimidin-6-ilmetila)-amina]-fenóxi}-butírico (4)
<formula>formula see original document page 89</formula>
2,4-Diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidina-6-carbonitrila (0,50 g,2,5 mmols), o produto do Estágio 4 (0,36 g, 1,0 mmol) e níquel de Raney (3g, úmido) em ácido acético (40 ml) foram agitados em temperatura ambientesob uma atmosfera de hidrogênio. Após 48 horas, a mistura de reação foifiltrada através de celite, e o solvente evaporado sob pressão reduzida. Omaterial foi carregado em MeOH sobre uma coluna SCX e eluído com umasolução de amônia 1% em MeOH. O produto bruto foi então adsorvido sobresílica e purificado por cromatografia em coluna (MeOH 10%/DCM) para ge-rar o composto do título (76 mg, 14%). Pureza por LCMS de 90%, m/z 548,2[M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), ô: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, bs), 6,7 (2H, d),6,6 (2H, d), 6,2 (2H, bs), 5,5 (1H, m), 5,1 (1H, m), 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m),3,4 (1H, m), 2,7 (3H, s), 2,3 (1H, m), 1,9 (1H, m), 1,8 (4H, m), 1,6 (11 H, m),1,1 (5H, m).
EXEMPLO 5
Este exemplo descreve a modificação do inibidor de PI3 quinaseconhecido N-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metila-tiazol-2-ila]-ace-tamida (composto (20)) pela adesão de um motivo éster de aminoácido emum ponto onde não ocorra ruptura do seu modo de ligação.
Composto (20): N-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metila-tiazol-2-ila]-acetamida
<formula>formula see original document page 90</formula>
O Composto (20) foi preparado como descrito em WO 03072552.
Compostos baseados no composto (20) foram preparados pelosmétodos apresentados abaixo.
Os Compostos (21) e (22) foram preparados pelo método descri-to no esquema seguinte:<formula>formula see original document page 91</formula>
Estágio 1 - Síntese de cloreto de 2-cloro-5-(2-oxo-propila)-benzenossulfonila
<formula>formula see original document page 91</formula>
4-Clorofenila acetona (4 g, 0,023 mol) foi adicionada gota a gotaao ácido clorossulfônico (30 ml, 0,45 mol) a -10°C sob N2 com agitação sua-ve. Permitiu-se que a mistura aquecesse até temperatura ambiente e a agi-tação continuou por 18 horas. A mistura de reação foi cuidadosamente extin-ta por adição gota a gota de gelo moído (500 ml). A solução aquosa foi ex-traída com EtOAc (3 x 250 ml). As camadas de EtOAc foram combinadas,secas (Na2S04), filtradas e concentradas até secas in vácuo para gerar ocomposto do título bruto (6,3 g, 65%) que foi usado na etapa seguinte, sempurificação adicional. Pureza por LCMS de 92%. 1H RMN (400 MHz, CDCI3),ô: 2,30 (3H, s), 3,85 (2H, s), 7,50 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,95 (1H, s).
Estágio 2 - Síntese de 1-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-propan-2-ona
<formula>formula see original document page 92</formula>
Uma mistura de Na2S03 (3,79 g, 0,030 mol) e NaHC03 (2,53 g,0,030 mol) em água (90 ml) foi agitada a 70°C. A essa solução, foi adiciona-da uma solução de produto do Estágio 1 (4,65 g, 0,015 mol) em dioxano(190 ml). A agitação continuou a 70°C por 1 hora. Com o resfriamento até atemperatura ambiente, a mistura de reação foi concentrada até seca in vá-cuo, gerando um sólido marrom. DMF (190 ml) foi adicionado, seguido porMel (1,88 ml, 0,030 mol). A mistura de reação foi agitada a 40°C por 1 hora.
Após o término da reação, a mistura de reação foi derramada em água (90ml) e extraída com EtOAc (500 ml). O EtOAc foi seco (Na2S04), filtrado econcentrado in vácuo para gerar o composto do título como um sólido mar-rom (2,49 g, 67%), que foi usado na etapa seguinte, sem purificação adicio-nal. Pureza por LCMS de 81%, m/z 247 [M++H]; 1H RMN (400 MHz, CDCI3),ô: 2,15 (3H, s), 3,20 (3H, s), 3,75 (2H, s), 7,35 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,85 (1H,
Estágio 3 - Síntese de 1-bromo-1-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)propan-2-ona
<formula>formula see original document page 92</formula><formula>formula see original document page 93</formula>
A uma solução agitada de produto do Estágio 2 (1,88 g, 7,60mmols) em 1,4-dioxano (120 ml), foi adicionado bromo (0,292 ml, 5,72mmols) gota a gota em temperatura ambiente, gerando uma solução laranjaescura. A agitação continuou por 18 horas. A mistura de reação foi evapora-da até seca in vácuo, evitando aquecimento acima de 30°C durante a evapo-ração. O resíduo foi re-dissolvido em EtOAc (100 ml) e lavado com NaHCCbaquoso saturado (20 ml), seguido por água (20 ml). A camada de EtOAc foiseca (Na2S04), filtrada e concentrada in vácuo. A purificação por cromato-grafia instantânea (EtOAc 50%/heptano) gerou o composto do título comoum óleo amarelo (2,0 g, 80%). Pureza por LCMS de 74%, m/z 325/327[M++H]; 1H RMN (400 MHz, CDCI3), ô: 2,35 (3H, s), 3,25 (3H, s), 5,35 (1H, s),7,50 (1H, d), 7,65 (1H, dd), 8,05 (1H, s).
Estágio 4 - Síntese de 5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metila-tiazol-2-ilamina
<formula>formula see original document page 93</formula>
Uma mistura de produto do Estágio 3 (2 g, 6,15 mmols) e tioure-ía (468 mg, 6,15mmols) em EtOH (65 ml) foi agitada a 70°C por 1,5 hora. Areação foi então resfriada até a temperatura ambiente, e ocorreu precipita-ção. O sólido cremoso foi coletado por filtração para gerar o composto dotítulo (1,2 g, 64%). Pureza por LCMS de 91%, m/z 303 [M++H], 1H RMN (400MHz, MeOD), 8: 2.35 (3H, s), 3,35 (3H, s), 7,75-7,85 (2H, m), 8,15 (1H, s).
Estágio 5 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenila)-4-metila-tiazol-2-ilcarbamoila]-butírico
<formula>formula see original document page 94</formula>
A uma mistura agitada de 1-ciclopentila éster de ácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico (208 mg, 0,66 mmol), EDCI (190 mg,0,99 mmol) e HOBt (107 mg, 0,79 mmol) em DMF (1,5 ml), foi adicionadagota a gota uma solução de produto do Estágio 4 (200 mg, 0,66 mmol) emDMF (1,5 ml) em temperatura ambiente. Foi acrescentada trietilamina (0,138ml, 0,99 mmol), e a agitação continuou por 18 horas. A mistura de reação foidiluída com água (10 ml) e extraída com EtOAc (15 ml). A camada de EtOAcfoi lavada com água (10 ml), seca (Na2S04), filtrada e concentrada in vácuo.
A purificação por TLC preparatória (EtOAc 70%/ heptano, Rf 0,5) gerou ocomposto do título (160 mg, 40%). Pureza por LCMS de 91%, m/z 600/602[M++H], 1H RMN (400 MHz, DMSO), ô: 1,45-1,55 (9H, s), 1,65-2,15 (10H, m),2,45 (3H, s), 2,70 (2H, m), 3,45 (3H, s), 4,10-4,25 (1H, m), 5,25 (1H, m),7,75-7,90 (2H, m), 8,25(1 H, s).
Estágio 6 - Síntese de ciclopentila éster de ácido (S)-2-amina-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoila]-butírico
<formula>formula see original document page 94</formula>
Permitiu-se que uma solução de produto do Estágio 5 (140 mg,0,233 mmol) em TFA 20%/DCM (2 ml) ficasse em repouso e em temperaturaambiente por 3 horas. Após término da reação, a mistura de reação foi con-centrada in vácuo para gerar o composto (21) (143 mg, 100%). Pureza porLCMS de 97%, m/z 500/502 [M++H], 1H RMN (400 MHz, MeOD), 8: 1,35-1,85 (8H, m), 2,00-2,20 (2H, m), 2,25 (3H, s), 2,60 (2H, m), 3,20 (3H, s),3,85-4,00 (1H, m), 5,10 (1H, m), 7,50-7,65 (2H, m), 7,95 (1H, s).
Estágio 7 - Síntese de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenila)-4-metila-tiazol-2-ilcarbamoila]-butírico
<formula>formula see original document page 95</formula>
A uma solução de produto do Estágio 5 (20 mg, 0,033 mmol) emuma mistura de THF (0,5 ml) e MeOH (0,5 ml), foram adicionados 2 M deNaOH aquoso (0,5 ml). Permitiu-se que a mistura ficasse em repouso e emtemperatura ambiente por 3 horas. Com o término da reação, a mistura dereação foi concentrada até quase seca, e 1 M de HCI foi adicionado gota agota até que o pH alcançasse 1-2. O precipitado resultante foi coletado porfiltração sob ligeira pressão. O sólido foi lavado com água (0,5 ml) e cuida-dosamente seco in vácuo para gerar o composto do título (12 mg, 68%). Pu-reza por LCMS de 94%, m/z 532/534 [M++H], 1H RMN (400 MHz, CDCI3), 6:1,55-1,70 (9H, s), 2,15-2,55 (2H, m), 2,60 (3H, s), 2,75-2,90 (2H, m), 3,55(3H, s), 4,25-4,45 (1H, m), 7,85-8,00 (2H, m), 8,35 (1H, s).
Estágio 8 - Síntese de ácido (S)-2-Amina-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoila]-butírico (22)
<formula>formula see original document page 95</formula>
Permitiu-se que uma solução de produto do Estágio 7 (12 mg,0,0225 mmol) em TFA 20%/DCM (0,3 ml) ficasse em repouso e em tempera-tura ambiente por 3 horas. Após o término da reação, a mistura de reação foiconcentrada in vácuo para gerar o composto do título (22) (12 mg, 100%).Pureza por LCMS de 94%, m/z 432/434 [M++H], 1H RMN (400 MHz, MeOD),ô: 2,10-2,25 (2H, m), 2,30 (3H, s), 2,65-2,75 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,95-4,05(1H, m), 7,60-7,80 (2H, m), 8,05 (1H, s).
O Composto (23) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte:
<formula>formula see original document page 96</formula>
Os estágios 1, 2, 3 e 4 são os mesmos descritos para a prepara-ção de compostos (21) e (22).
Estágio 5 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-amina-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoila]-butírico
<formula>formula see original document page 96</formula>Esse composto foi preparado a partir de 1-terc-butila éster deácido 2-terc-butoxicarbonilamino-pentanodióico e 5-(4-cloro-3-metanossul-fonila-fenila)-4-metila-tiazol-2-ilamina (produto do Estágio 4) seguindo o pro-cedimento descrito para a síntese do composto (21).
Estágio 6 - Síntese de terc-butila éster de ácido (S)-2-amina-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonila-fenila)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoila]-butírico (23)
<formula>formula see original document page 97</formula>
A uma solução de produto do Estágio 5 (50 mg, 0,085 mmol) emEtOAc (0,25 ml), foram adicionados 2 M de HCI/solução de éter (0,25 ml) emtemperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada vigorosamente por 4horas. A reação foi retratada com uma mistura de EtOAc (0,25 ml) e 2 M deHCI/éter (0,25 ml). A agitação continuou por 1 hora. O precipitado formadofoi coletado por filtração sob gravidade, dividido entre EtOAc (3 ml) e NaH-C03 aquoso saturado (0,5 ml). A camada de EtOAc foi lavada com água (1ml), seca (Na2S04), filtrada e concentrada in vácuo para gerar o composto(23) (6,5 mg, 16%). Pureza por LCMS de 95%, m/z 488/490 [M++H], 1H RMN(400 MHz, MeOD), 8: 1,35-1,40 (9H, s), 1,80-2,05 (2H, m), 2,30 (3H, s), 2,45-2,55 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,30-3,35 (1H, m), 7,60-7,70 (2H, m), 8,05 (1H, s).
Ensaios biológicos
Ensaio de atividade inibidora sobre historia desacetilase
A habilidade de compostos para inibir atividades de histona de-sacetilase foi medida com o uso do ensaio de atividade fluorescente HDACdisponível comercialmente por Biomol. Resumidamente, o substrato Fluor deLys™, uma lisina com uma acetilação epsilon-amina, é incubado com a fontede atividade de histona desacetilase (extrato nuclear de célula HeLa) na pre-sença ou ausência de inibidor. A desacetilação do substrato sensibiliza osubstrato ao desenvolvedor de Fluor de Lys™, o que gera um fluoróforo.Dessa forma, a incubação do substrato com uma fonte de atividade deHDAC resulta em um aumento do sinal que é diminuído na presença um ini-bidor de HDAC.
Os dados são expressos como uma percentagem do controle,medidos na ausência de inibidor, com o sinal de base sendo subtraído detodas as amostras, da seguinte forma:
% de atividade = ((S1 - B) / (S° - B)) x 100
em que S'éo sinal na presença de substrato, enzima e inibidor, S° é o sinalna presença de substrato, enzima e do veículo no qual o inibidor é dissolvi-do, e B é o sinal de base medido na ausência de enzima.
Os valores de IC50 foram determinados por análise por regres-são não linear, após ajuste dos resultados de oito pontos de dados à equa-ção para sigmóide resposta-dose com inclinação variável (% de atividadecontra concentração log de composto), usando o programa de computador"Graphpad Prism".
A atividade contra histona desacetilase do extrato nuclear brutoderivado de células HeLa foi usada para rastreamento. A preparação, adqui-rida de 4C (Seneffe, Bélgica), foi preparada a partir de células HeLa colhidasquando em fase de crescimento exponencial. O extrato nuclear foi preparadode acordo com Dignam J.D. 1983 Nucl. Acid. Res. 11, 1.475-1.489, congela-do em nitrogênio líquido e estocado a -80°C. A composição de tampão finalfoi 20 mM de Hepes, 100 mM de KCI, 0,2 mM de EDTA, 0,5 mM de DTT, 0,2mM de PMSF e 20% (v/v) de glicerol.
Ensaio de atividade inibidora contra aurora quinase A
A habilidade de compostos para inibir a atividade de aurora qui-nase A foi medida usando um ensaio de microplaca. Resumidamente, Fla-shplates® de 96 cavidades (PerkinElmer Life Sciences) foram pré-cobertascom proteína básica de mielina (MBP). MBP (100 ul de 100 mg/ml em PBS)foi incubada a 37°C por 1 hora, seguida por incubação de um dia para o ou-tro a 4°C. As placas foram então lavadas com PBS e permitiu-se que secas-sem ao ar.
Para determinar a atividade de aurora quinase A, 40 ng de en-zima (ProQuinase: aurora quinase A humana de comprimento total recombi-nante, fundida no terminal N à GST e expressa por baculovírus em célulasde inseto Sf21) foram incubados em tampão de ensaio (50 mM de Tris (pH7,5), 10 mM de NaCI, 2,5 mM de MgCI2) 1 mM de DTT, DMSO 0,4%), 10 uMde ATP (Km da enzima) e 0,5 uCi de [y-33P]-ATP e com concentrações vari-áveis de inibidor. Cavidades sem inibidor foram usados como controles deveículo e as cavidades que não continham enzima foram usados para mediro sinal "de base". As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
Após incubação, os conteúdos das cavidades foram removidos e as placaslavadas três vezes com PBS contendo 10 mM de pirofosfato tetrassódico,antes de se efetuar a contagem de cintilação com a utilização de um "WallacMicroBeta TriLux".
Foram geradas curvas de dose-resposta a partir de 10 concen-trações (concentração superior final de 10 uM, com diluições de 3 vezes),usando cavidades em triplicata.
Os valores de IC50 foram determinados por análise por regres-são não linear, após ajuste dos resultados dos pontos de dados à equaçãopara sigmoide resposta-dose com inclinação variável (% de atividade contraconcentração log de composto), usando o programa de computador "Xlfit".
Ensaio de atividade inibidora contra diidrofolato redutase (DHFR)
A habilidade de compostos para inibir a atividade de DHFR foimedida em um ensaio baseado na habilidade de DHFR para catalisar a re-dução reversível dependente de NADPH de ácido diidrofólico em ácido te-trahidrofólico usando um kit Sigma (número de Catálogo CS0340). Esse usatampão proprietário de ensaio e DHFR humana recombinante a 7,5 x 10"4unidades por reação, NADPH a 60 uM e ácido diidrofólico a 50 uM. A reaçãofoi acompanhada por monitoramento da diminuição da absorbância a 340nm, por um período de 2 minutos, em temperatura ambiente, e a atividadeenzimática foi calculada como a taxa de diminuição na absorbância. A ativi-dade enzimática, na presença de inibidor, era expressa como uma percenta-gem de atividade livre de inibidor e a 1C50 do inibidor foi determinada a partirde uma curva sigmoide de resposta-dose usando o programa de computador"Xlfit" (% de atividade contra concentração log de composto). Cada amostrafoi processada em triplicata, e cada curva de dose-resposta era compostapor 10 diluições do inibidor.
Ensaio de atividade inibidora contra P38 MAP Quinase a
A habilidade de compostos para inibir a atividade de p38 MAPquinase a (enzima humana de comprimento total expressa em E. coli comouma proteína rotulada com GST no terminal N) foi medida em um ensaiorealizado por Upstate (Dundee UK). Em um volume de reação final de 25 ul,p38 MAP quinase a (5-10 mU) foi incubada com 25 mM de Tris pH 7,5, 0,02mM de EGTA, 0,33 mg/ml de proteína básica de mielina, 10 mM de acetatode magnésio, ATP 90 uM (Km 97 uM) e [y-33P]-ATP (atividade específica deaproximadamente 500 cpm/pmol). A reação foi iniciada pela adição da mistu-ra MgATP. Após incubação por 40 minutos em temperatura ambiente, a rea-ção foi interrompida pela adição de 5 ul de uma solução 3% de ácido fosfóri-co. Dez ul da reação foram então espalhados sobre um papel de filtro "P30filtermat" e lavados três vezes por 5 minutos em 75 mM de ácido fosforico euma vez em metanol, antes da secagem e contagem de cintilação.
Foram geradas curvas de dose-resposta a partir de uma série dediluições de Vz log de uma solução de estoque de inibidor em DMSO. Foramfeitas nove etapas de diluições a partir de uma concentração superior finalde 10 uM, e foi incluído um controle "sem composto". As amostras foramprocessadas em duplicata. Os dados das contagens de cintilação foram co-letados e submetidos à análise free-fit pelo programa de computador "Gra-phpad Prism". A partir da curva gerada, foi determinada a concentração quegera 50% de inibição.
Ensaio de inibição de P1 3-Quinase
A medida da atividade de PI 3-quinase y depende da ligação es-pecífica e de alta afinidade do domínio de homologia à pleckstrina (PH)GRP1 à PIP3, o produto da atividade de PI 3-quinase. È formado um com-plexo entre anticorpo monoclonal anti-GST marcado com európio, um domí-nio PH GRP1 marcado com GST, PIP3 biotinilada e estreptavidina-aloficocianina (APC). Esse complexo gera um sinal de fluorescência resolvi-da no tempo de transferência de energia ressonante (FRET), que é diminuí-do por competição de PIP3, gerado pelo ensaio de PI 3-quinase, com a PIP3biotinilada.
O ensaio foi realizado em Upstate (Dundee, UK) da seguinteforma: em um volume de reação final de 20 pl, PI 3-quinase y (enzima hu-mana de comprimento total recombinante marcada com His6 no terminal N,expressa por baculovírus em células de inseto Sf21) foi incubada em tampãode ensaio contendo 10 pM de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato e 100 uM deMgATP (Km da enzima 117 pM). A reação foi iniciada pela adição da misturaMgATP. Após incubação por 30 minutos em temperatura ambiente, a reaçãofoi interrompida pela adição de 5 pl de solução de interrupção contendo ED-TA e fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato biotinilado. Finalmente, 5 pl de tampãode detecção foram adicionados, os quais continham anticorpo monoclonalanti-GST marcado com európio, domínio PH GRP1 marcado com GST eestreptavidina-APC. A placa foi então lida no modo de fluorescência resolvi-da por tempo e o sinal homogêneo de fluorescência resolvida por tempo (H-TRF) foi determinado de acordo a fórmula HTRF = 10.000 x (Em 665 nm/Em620 nm).
Foram gerados pontos de dados em duplicata a partir de umasérie de diluições de 1/2 log de uma solução de estoque de composto emDMSO. Foram feitas nove etapas de diluições a partir de uma concentraçãosuperior final de 10 pM, e foi incluído um controle "sem composto". Os dadosda proporção de HTRF foram transformados em % de atividade de controlese analisados com uma aplicação de dose-resposta sigmóide de quatro pa-râmetros (inclinação variável). Foi determinada a concentração que gera50% de inibição (IC50).
Ensaio de inibição da proliferação celular
Linhagens celulares de câncer (U937 e HCT 116) crescendo emfase log foram colhidas e semeadas a 1.000-2.000 células/cavidade (volumefinal de 100 pl) em placas de cultura de tecido de 96 cavidades. Após 24 ho-ras de crescimento, as células foram tratadas com composto. As placas fo-ram então reincubadas por mais 72-96 horas, antes de ser realizado um en-saio de viabilidade celular WST-1 de acordo com as instruções dos fornece-dores (Roche Applied Science).
Os dados foram expressos como uma percentagem de inibiçãodo controle, medida na ausência de inibidor, da seguinte forma:
% de inibição = 100 -((S'/S°)x 100)
em que:
S'éo sinal na presença de inibidor e S° é o sinal na presença deDMSO.
Foram geradas curvas de dose-resposta a partir de 8 concentra-ções (concentração superior final de 10 uM, com diluições de 3 vezes), u-sando 6 réplicas.
Os valores de IC50 foram determinados por análise por regres-são não linear, após ajuste dos resultados à equação para sigmóide respos-ta-dose com inclinação variável (% da atividade contra concentração log decomposto), usando o programa de computador "Graphpad Prism".
Estimulação de LPS de sangue total humano
Sangue total foi colhido por punção venosa usando vacutainersheparinizados (Becton Dickinson), e diluído em um volume igual de meio decultura de tecido RPMI1640. Cem ul foram colocados em placas de culturade tecido de 96 cavidades com fundo em "V". Foi adicionado inibidor em 100ul de meio RPMI1640, e 2 horas mais tarde o sangue foi estimulado comLPS (E. coli cepa 005:B5, Sigma) em uma concentração final de 100 ng/ml,e incubado a 37°C em em C02 5% por 6 horas. Os níveis de TNF-a forammedidos dos sobrenadantes livres de células por ELISA intercalado (R&DSystems #QTA00B).
Ensaio de células rompidas de carboxilesterase
Preparação de extrato de células
Células tumorais U937 ou HCT 116 (~ 109) foram lavadas em 4volumes de Dulbeccos PBS (1 litro) e peletizadas a 525 g por 10 minutos a4°C. Esse processo foi repetido duas vezes, e o pélete celular final foi res-suspenso em 35 ml de tampão de homogeneização gelado (10 mM de Triz-ma, 130 mM de NaCI, 0,5 mM de CaCI2, pH 7,0 a 25°C). Os homogeneiza-dos foram preparados por cavitação com nitrogênio (4.826,33 kPa por 50minutos a 4°C). O homogeneizado foi mantido no gelo e suplementado comum coquetel de inibidores em concentrações finais de:
Leupeptina 1 uM
Aprotinina 0,1 uM
E64 8 uM
Pepstatina 1,5 uM
Bestatina 162 uM
Quimostatina 33 uM
Após purificação do homogeneizado celular por centrifugação a525 g por 10 minutos, o sobrenadante resultante foi usado como uma fontede atividade de esterase e foi estocado a -80°C, até ser utilizado.
Medidas de clivagem de éster
A hidrólise de ésteres nos ácidos carboxílicos correspondentespode ser medida usando o extrato de células, preparado como acima. Paraisso, o extrato de células (~ 30 ug/volume total do ensaio de 0,5 ml) foi incu-bado a 37°C em um tampão Tris-25 mM de HCI, 125 mM de NaCI, pH 7,5, a25°C. No tempo zero, o éster (substrato) foi então adicionado em uma con-centração final de 2,5 uM, e as amostras foram incubadas a 37°C pelo perí-odo apropriado (normalmente 0 ou 80 minutos). As reações foram interrom-pidas pela adição de 3 x volumes de acetonitrila. Para as amostras do tempozero, a acetonitrila foi adicionada antes do composto de éster. Após centrifu-gação a 12.000 g por 5 minutos, as amostras foram analisadas quanto aoéster e seu ácido carboxílico correspondente em temperatura ambiente porLCMS (Sciex API 3000, bomba binaria HP1100, CTC PAL). A cromatografiafoi baseada em uma coluna AceCN (75*2,1 mm) e uma fase móvel de ace-tonitrila 5-95% em água/ácido fórmico 0,1 %.
Quantificação da expressão de hCE-1, hCE-2 e hCE-3 em linhagens ce-lulares monocíticas e não monocíticas
Iniciadores gene-específicos foram utilizados para amplificar porPCR hCE-1, -2 e -3 do cDNA humano. Os produtos de PCR foram clonadosem um vetor de plasmídeo e tiveram a seqüência verificada. Eles foram en-tão diluídos serialmente para uso como curvas-padrão em reações de PCRem tempo real. O RNA total foi extraído de várias linhagens celulares huma-nas e o cDNA preparado. Para quantificar os níveis absolutos de hCE's naslinhagens celulares, os níveis de expressão gênica foram comparados comos padrões de produto de PCR clonado em um ensaio "SYBR Green PCR"de tempo real. A Figura 1 mostra que hCE-1 só é expressa em uma quanti-dade significativa em uma linhagem celular monocítica.
Resultados biológicos
Os compostos citados nos Exemplos 1 -5 acima foram investiga-dos nos ensaios de inibição enzimática, proliferação celular e clivagem deéster descritos acima e os resultados são mostrados nas Tabelas 3 e 4.
Potência
Tabela 3
<table>table see original document page 104</column></row><table>
Os resultados acima mostram que:
(i) os compostos modificados de éster de aminoacido (Compostos 8 e 10) eo ácido (Composto 9) que resultaria da clivagem do motivo éster têm IC50sno ensaio enzimático comparáveis ao valor para o inibidor de HDAC nãomodificado (SAHA - Composto 7), indicando que o motivo éster de alfa-aminoácido estava anexado ao SAHA em um ponto que não rompeu seumodo de ligação.
(ii) muito embora os ésteres (Compostos 8 e 10) e o ácido (Composto 9) te-nham atividades comparáveis ao inibidor não modificado (SAHA - Composto7), há um aumento significativo na potência celular do ciclopentila éster pas-sível de clivagem por esterase (Composto 8) em relação ao inibidor não mo-dificado (Composto 7), mas uma diminuição substancial na potência celularno caso do t-butila éster estável à esterase (Composto 10), indicando queesse último não acumulou o ácido em células para gerar potência celularaumentada.
(iii) a maior atividade no ensaio de proliferação celular para o Composto 8em relação à contraparte não modificada, Composto 7 (ou o derivado ésternão hidrolisável, Composto 10), indica que o éster é hidrolisado no ácidoparente, Composto 9, na célula onde ele se acumula e exerce um efeito ini-bidor maior.
Tabela 3 (continuação <table>table see original document page 105</column></row><table>
Os resultados acima mostram que:
(i) o inibidor modificado de alfa-aminoácido, Composto 13, que resultaria daclivagem do motivo éster no Composto 12 tem um valor de IC50 no ensaioenzimático comparável àquele do inibidor não modificado de aurora quinase(Composto 11), indicando que é possível anexar o motivo éster de alfa-aminoácido em um ponto que não rompa a ligação à aurora quinase A.(ii) muito embora o ácido (Composto 13) tenha uma atividade enzimáticacomparável ao inibidor não modificado (Composto 11) e o éster (Composto12) seja um inibidor mais fraco, há um aumento significativo na potência ce-lular do Composto 12 em relação ao inibidor não modificado (Composto 11).
O t-butila éster clivado menos facilmente (Composto 14) tem uma atividadeenzimática comparável ao ciclopentila éster passível de clivagem (Composto12), mas é aproximadamente 20 vezes menos ativo no ensaio celular.
(iii) a maior atividade no ensaio de proliferação celular do Composto 12 emrelação tanto à contraparte não modificada (Composto 11) quanto ao t-butilaéster clivado menos facilmente (composto 14) indica que o ciclopentila ésteré hidrolisado no ácido parente na célula, onde ele se acumula e exerce umefeito inibidor maior.
Tabela 3 (continuação)
<table>table see original document page 106</column></row><table>
Os resultados acima mostram que:
(i) o inibidor modificado de alfa-aminoácido, Composto 16, e o ácido, Com-posto 17, que resultaria da clivagem do motivo éster em Composto 16, têmvalores de IC50 no ensaio enzimático comparáveis ao valor para o inibidornão modificado de P38 MAP quinase (Composto 15), indicando que é possí-vel anexar o motivo éster de alfa-aminoácido em um ponto que não rompa aligação à P38 MAP quinase.
(ii) o ácido, Composto 17, tem atividade comparável contra a enzima em re-lação ao inibidor não modificado (Composto 15) e ao t-butila éster (Compos-to 18). No entanto, há um aumento significativo na habilidade do ciclopentilaéster (Composto 16) para inibir a produção de TNF dentro de células mono-cíticas presentes no sangue total, comparado ao inibidor não modificado(Composto 15) e ao t-butila éster clivado menos facilmente (Composto 18).
(iii) a maior atividade no ensaio de sangue total para o Composto 16 em re-lação à contraparte não modificada, Composto 15, e ao t-butila éster clivadomenos facilmente, Composto 18, indica que o ciclopentila éster é hidrolisadono ácido parente na célula, onde ele se acumula e exerce um efeito inibidormaior.
Tabela 3 (continuação)
<table>table see original document page 107</column></row><table>
Os resultados acima mostram que:
(i) o inibidor modificado de alfa-aminoácido, Composto 19, que resultaria daclivagem do motivo éster no Composto 6, tem um valor de IC50 no ensaioenzimático comparável àquele do inibidor não modificado de DHFR (Com-posto 2 (G=N)), indicando que é possível anexar o motivo éster de alfa-aminoácido em um ponto que não rompa a ligação à DHFR.
(ii) muito embora o ácido (Composto 19) tenha uma atividade enzimáticainibidora comparável ao inibidor não modificado (Composto 2 (G=N)), o éster(Composto 6) é significativamente mais potente na inibição da proliferaçãocelular do que o inibidor não modificado (Composto 2 (G=N)).(iii) a maior atividade no ensaio de proliferação celular do Composto 6 emrelação à contraparte não modificada (Composto 2 (G=N)) indica que o ci-clopentila éster é hidrolisado no ácido parente na célula, onde ele se acumu-Ia e exerce um efeito inibidor maior.
Tabela 3 (continuação)
<table>table see original document page 108</column></row><table>
Os resultados acima mostram que:
(i) o inibidor modificado de éster de alfa-aminoácido, Composto 21, e o áci-do, Composto 22, que resultaria da clivagem do motivo éster no Composto21, têm valores de IC50 no ensaio enzimático dentro de um fator de 10 dovalor para o inibidor não modificado de PI3-quinase (Composto 20), indican-do que é possível anexar o motivo éster de alfa-aminoácido em um pontoque ainda retenha ligação razoável à PI3-quinase.
(ii) embora o ácido, Composto 22, tenha atividade comparável ao inibidornão modificado (Composto 20) e ao éster (Composto 21), há um aumentosignificativo na potência do éster para inibir a produção de TNF em célulasmonocíticas presentes no sangue total, comparado com o inibidor não modi-ficado (Composto 20) e o t-butila éster clivado menos facilmente (Composto23).(iii) a maior atividade no ensaio de sangue total para o Composto 21 em re-lação à contraparte não modificada, Composto 20, e ao t-butila éster clivadomenos facilmente, Composto 23, indica que o ciclopentila éster é hidrolisadono ácido parente na célula, onde ele se acumula, e exerce um efeito inibidormaior.
SeletividadeTabela 4: Comparação de proliferação celular e clivagem de éster para uma linhagem celular monocítica e não monocí-tica.
<table>table see original document page 110</column></row><table>
1 Quantidade de ácido produzida após incubação do composto não modificado (Composto 24) por 80 minutos no ensaio de célu-las rompidas de carboxilesterase descrito acima.
Os resultados acima mostram:(i) que o composto não modificado (composto 7) não exibe seletividade entreuma linhagem celular monocítica e não monocítica, o que pode ser obtidoanexando-se um motivo éster apropriado, como no Composto 24.
(ii) essa seletividade está correlacionada à maior clivagem do éster no ácidopela linhagem celular monocítica.
(iii) o aumento da atividade celular só é observado na linhagem celular emque o ácido é produzido, indicando que esse aprimoramento da potênciacelular é causado pelo acúmulo do ácido.Tabela 4 (continuação)
<table>table see original document page 112</column></row><table>
1 A quantidade de ácido produzida após incubação do Composto (25) por 80 minutos no ensaio de células rompidas de carboxi-lesterase descrito acima.Os resultados acima mostram:
(i) que o composto não modificado (composto (10)) não exibe seletividadeentre uma linhagem celular monocítica e uma não monocítica, o que ocorreanexando-se um motivo éster apropriado, como no Composto 25.
(ii) essa seletividade está correlacionada ao aumento da clivagem do ésterno ácido pela linhagem celular monocítica.
(iii) o aumento da atividade celular só é observado na linhagem celular emque o ácido é produzido, indicando que esse aprimoramento da potênciacelular é causado pelo acúmulo do ácido.Tabela 4 (continuação)
<table>table see original document page 114</column></row><table>
1 A quantidade de ácido produzida após incubação do composto (5) por 80 minutos no ensaio de células rompidas de carboxi-lesterase descrito acima.Os resultados acima mostram que:
(i) o composto não modificado (composto 2 G = N) não exibe seletividadeentre as linhagens celulares monocíticas e não monocíticas, o que ocorrequando se anexa um motivo éster apropriado, como no composto 5.
(ii) essa seletividade esta correlacionada ao aumento da clivagem do ésterno ácido pela linhagem celular monocítica.
(iii) o aumento da atividade celular só é observado na linhagem celular emque o ácido é produzido, indicando que esse aprimoramento da potênciacelular é causado pelo acúmulo do ácido.

Claims (16)

1. Conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e ummodulador da atividade de uma enzima ou um receptor intracelular-alvo, emque:- o grupo éster do conjugado é hidrolisavel por uma ou mais enzimas carbo-xilesterases intracelulares no ácido correspondente; e- o éster de alfa-aminoácido é conjugado ao modulador em uma posição dis-tante da interface de ligação entre o inibidor e a enzima ou receptor-alvo.
2. Conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e ummodulador da atividade de uma enzima ou um receptor intracelular-alvo, emque:- o grupo éster do conjugado é hidrolisavel por uma ou mais enzimas carbo-xilesterases intracelulares no ácido correspondente; e- o éster de alfa-aminoácido é conjugado ao modulador de tal forma que omodo de ligação do modulador conjugado e do referido ácido corresponden-te à enzima ou receptor-alvo é o mesmo que o do modulador não conjugado.
3. Método de aumento ou prolongamento da potência intracelu-lar e/ou do tempo de permanência do modulador da atividade de uma enzi-ma ou um receptor intracelular-alvo que compreende a modificação estrutu-ral do modulador por adesão covalente a ele de um éster de alfa-aminoácidoem uma posição distante da interface de ligação entre o inibidor e a enzimaou receptor-alvo, o grupo éster do conjugado sendo hidrolisavel por uma oumais enzimas carboxilesterases intracelulares no ácido correspondente.
4. Método de aumento ou prolongamento da potência intracelu-lar e/ou do tempo de permanência do modulador da atividade de uma enzi-ma ou um receptor intracelular-alvo que compreende a modificação estrutu-ral do modulador por adesão covalente a ele de um éster de alfa-aminoácidode tal forma que o modo de ligação do modulador conjugado e do referidoácido correspondente à enzima ou receptor-alvo é o mesmo que o do modu-lador não conjugado, o grupo éster do conjugado sendo hidrolisavel por umaou mais enzimas carboxilesterases intracelulares no ácido correspondente.
5. Conjugado de acordo com a reivindicação 1 ou na reivindica-ção 2, ou um método de acordo com a reivindicação 3 ou na reivindicação 4,em que o éster de alfa-aminoácido conjugado covalentemente não é o ele-mento C-terminal de um motivo dipeptídico do modulador conjugado.
6. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o modulador é um que se liga de formanão covalente à enzima ou receptor intracelular-alvo.
7. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações precedentes em que o éster de alfa-aminoácido é conjugadocovalentemente ao modulador através de um radical vinculador.
8. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o éster de alfa-aminoácido é conjugadoao modulador por meio do grupo amina do éster de aminoacido.
9. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, em que o éster de alfa-aminoácido é conjugado ao mo-dulador através do carbono alfa do éster de aminoacido.
10. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações precedentes, em que o éster é hidrolisável por células quecontêm uma ou mais das enzimas carboxilesterases intracelulares hCE-1,hCE-2 e hCE-3 no alfa-aminoácido correspondente.
11. Conjugado ou método como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, em que o éster é hidrolisável por células que contêm aenzima carboxilesterase intracelular hCE-1 no alfa-aminoácido correspon-dente e não por células que contêm hCE-2 ou hCE-3.
12. Conjugado ou método como definido na reivindicação 11, emque o nitrogênio do grupo amina do éster de aminoacido é substituído, masnão ligado diretamente a uma porção carbonila.
13. Composição farmacêutica que compreende um conjugadocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 e 5 a 12, e um veí-culo farmaceuticamente aceitável.
14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13,que é adaptada para administração tópica e em que, no conjugado, (a)quando o éster de alfa-aminoácido estiver ligado ao modulador por meio deseu grupo amina, o carbono adjacente ao carbono alfa do éster de alfa-aminoácido será monossubstituído, ou (b) quando o éster de alfa-aminoácido estiver ligado ao modulador por meio de um átomo de carbonodo aminoácido, o átomo de carbono adjacente àquele átomo de carbono doaminoácido será não substituído.
15. Método de aumentar ou prolongar seletivamente a potênciaintracelular e/ou o tempo de permanência de um modulador da atividade deuma enzima ou de um receptor intracelular-alvo em macrófagos e/ou monó-citos em relação a outros tipos celulares, que compreende o tratamento deuma população mista de células in vitro ou in vivo com um conjugado domodulador como definido na reivindicação 12.
16. Método de identificação de um conjugado covalente de uméster de alfa-aminoácido de certo modulador da atividade de uma enzima oude um receptor intracelular-alvo, o referido conjugado tendo potência celularaumentada ou prolongada em relação ao certo modulador, cujo métodocompreende:(i) identificação de uma posição ou posições em certo modulador da ativida-de de uma enzima ou de um receptor intracelular-alvo, ou em diversos mo-duladores da atividade de uma enzima ou de um receptor intracelular-alvoque compartilham o mesmo modo de ligação para a enzima ou receptor-alvo, a referida posição ou posições sendo distantes da interface de ligaçãoentre os moduladores e a enzima ou o receptor-alvo;(ii) modificação de forma covalente do modulador(s) por adesão de um radi-cal éster de alfa-aminoácido, ou vários radicais éster de alfa-aminoácido di-ferentes em uma ou mais das posições identificadas em (i);(iii) teste do conjugado(s) de alfa-aminoácido-modulador preparado em (ii)para determinar sua atividade contra uma enzima ou um receptor-alvo; e(iv) a partir dos dados adquiridos em (iii), seleção de uma ou mais das ver-sões testadas de éster de alfa-aminoácido-conjugado de certo modulador(s)que produzam a modulação da atividade da enzima ou do receptor dentrodas células, e sejam convertidos e se acumulem como o ácido carboxílicocorrespondente dentro das células, e que exibam potência celular aumenta-da ou prolongada.
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0509223D0 (en) 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
PT2013175T (pt) * 2006-05-04 2017-02-14 Chroma Therapeutics Ltd Inibidores de map-quinase p38
GB0608821D0 (en) * 2006-05-04 2006-06-14 Chroma Therapeutics Ltd DHFR enzyme inhibitors
GB0608854D0 (en) * 2006-05-04 2006-06-14 Chroma Therapeutics Ltd P13 kinase inhibitors
GB0608837D0 (en) 2006-05-04 2006-06-14 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of MAP kinase
GB0608822D0 (en) * 2006-05-04 2006-06-14 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of DHFR
GB0608823D0 (en) * 2006-05-04 2006-06-14 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of P13 kinase
GB0619753D0 (en) 2006-10-06 2006-11-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
ES2509342T3 (es) * 2006-10-30 2014-10-17 Chroma Therapeutics Limited Hidroxamatos como inhibidores de histona desacetilasa
GB0622084D0 (en) 2006-11-06 2006-12-13 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of HSP90
JP2011503042A (ja) * 2007-11-07 2011-01-27 クロマ セラピューティクス リミテッド ｐ３８ＭＡＰキナーゼ阻害剤
GB0803747D0 (en) * 2008-02-29 2008-04-09 Martin Enzyme and receptor modulation
EP2245012B1 (en) * 2008-02-29 2013-07-03 Chroma Therapeutics Limited Inhibitors of p38 map kinase
GB0903480D0 (en) 2009-02-27 2009-04-08 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme Inhibitors
US20110002897A1 (en) 2009-06-11 2011-01-06 Burnham Institute For Medical Research Directed differentiation of stem cells
CA2773985A1 (en) 2009-09-16 2011-03-24 Avila Therapeutics, Inc. Protein kinase conjugates and inhibitors
BR112012015721A2 (pt) 2009-12-30 2017-09-26 Avila Therapeutics Inc modificação covalente de proteínas dirigida por ligante
GB201009853D0 (en) 2010-06-11 2010-07-21 Chroma Therapeutics Ltd HSP90 inhibitors
GB201211310D0 (en) 2012-06-26 2012-08-08 Chroma Therapeutics Ltd CSF-1R kinase inhibitors
DK3222616T3 (da) 2012-10-17 2019-08-19 Macrophage Pharma Ltd N-[2-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorbenzoyl)-2-oxopyridin-1(2H)-yl]-3,5-difluorphenyl}ethyl]-L-alanin og terbutylester deraf
GB201504694D0 (en) * 2015-03-19 2015-05-06 Glaxosmithkline Ip Dev Ltd Covalent conjugates
WO2017216297A1 (en) 2016-06-16 2017-12-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Dosage regimen
US10256877B2 (en) * 2017-08-02 2019-04-09 Qualcomm Incorporated Apparatus and methods for beam refinement
GB201713975D0 (en) 2017-08-31 2017-10-18 Macrophage Pharma Ltd Medical use
CN111303024B (zh) * 2018-12-12 2023-03-28 安徽中科拓苒药物科学研究有限公司 一种喹啉结构的pan-KIT激酶抑制剂及其用途
WO2024208705A1 (en) 2023-04-02 2024-10-10 The Francis Crick Institute Limited Inhibitors of ets2-activating molecules for the treatment of inflammatory diseases

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1345502A (en) 1972-07-06 1974-01-30 Parke Davis & Co Quinazoline compounds and processes for their production
US4725687A (en) * 1986-04-28 1988-02-16 Southern Research Institute 5-methyl-5-deaza analogues of methotrexate and N10 -ethylaminopterin
US5175153A (en) * 1987-11-30 1992-12-29 Warner-Lambert Company Substituted alpha-amino acids having pharmaceutical activity
US5331006A (en) * 1990-08-31 1994-07-19 Warner-Lambert Company Amino acid analogs as CCK antagonists
AU666416B2 (en) * 1993-01-29 1996-02-08 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Ellipticine derivative and process for preparing the same
US5480906A (en) * 1994-07-01 1996-01-02 Eli Lilly And Company Stereochemical Wortmannin derivatives
EP0860433B1 (en) 1995-11-07 2002-07-03 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Quinoline derivatives and quinazoline derivatives inhibiting autophosphorylation of growth factor receptor originating in platelet and pharmaceutical compositions containing the same
IL145772A0 (en) * 1999-04-09 2002-07-25 Basf Ag Prodrugs of thrombin inhibitors
US6448256B1 (en) * 1999-05-24 2002-09-10 University Of Massachusetts Antibiotic prodrugs
KR20020059393A (ko) * 1999-09-08 2002-07-12 제임스 에스. 쿼크 새로운 부류의 세포분화제 및 히스톤 데아세틸라아제, 및이의 사용 방법
AU2002239454A1 (en) * 2000-11-01 2002-05-27 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Ace-2 modulating compounds and use thereof
US6936720B2 (en) 2002-02-22 2005-08-30 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Method for preparing benzisoxazole methane sulfonyl chloride and its amidation to form zonisamide
AR038703A1 (es) * 2002-02-28 2005-01-26 Novartis Ag Derivados de 5-feniltiazol y uso como inhibidor de quinasa p i 3
EP1487426B1 (en) * 2002-03-04 2012-08-22 Sloan-kettering Institute For Cancer Research Methods of inducing terminal differentiation
WO2003076405A1 (en) 2002-03-14 2003-09-18 Bayer Healthcare Ag Monocyclic aroylpyridinones as antiinflammatory agents
AU2003287349B2 (en) 2002-11-12 2009-04-23 Alcon, Inc. Histone deacetylase inhibitors for the treatment of ocular neovascular or edematous disorders and diseases
NZ601772A (en) * 2003-07-29 2012-10-26 Signature R & D Holdings Llc Amino Acid Prodrugs
JP2007509082A (ja) * 2003-10-22 2007-04-12 アルピダ エー／エス ペプチドデホルミラーゼ阻害剤としてのベンゾイミダゾール誘導体類およびそれらの使用
EP3075247B1 (en) * 2004-02-02 2022-10-12 BioSight Ltd. Conjugates for cancer therapy and diagnosis
TW200536528A (en) * 2004-02-27 2005-11-16 Schering Corp Novel inhibitors of hepatitis C virus NS3 protease
AU2005230682B2 (en) * 2004-04-05 2010-10-21 Merck Hdac Research, Llc Histone deacetylase inhibitor prodrugs
EP2261226B1 (en) * 2004-05-14 2015-04-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for preparing aurora kinase inhibitors
GB0509225D0 (en) * 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of enzymatic activity
GB0509224D0 (en) * 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of intracellular enzymatic activity
GB0509223D0 (en) * 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
GB0509227D0 (en) * 2005-05-05 2005-06-15 Chroma Therapeutics Ltd Intracellular enzyme inhibitors
GB0619753D0 (en) * 2006-10-06 2006-11-15 Chroma Therapeutics Ltd Enzyme inhibitors
GB0621830D0 (en) * 2006-11-02 2006-12-13 Chroma Therapeutics Ltd Inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase

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