BRPI0610396A2 - vacina de hpv multivalente, métodos para proteger um paciente contra a infecção, para prevenir ou reduzir a freqüênca de anormalidades citológicas em um paciente, para prevenir a formação de lesões cin histologicamente confirmadas e para fabricar a vacina, e, usos de uma composição, de uma vacina e de uma composição de vacina - Google Patents

Abstract

VACINA DE HPV MULTIVALENTE, MéTODOS PARA PROTEGER UM PACIENTE CONTRA A INFECçãO, PARA PREVENIR OU REDUZIR A FREQUêNCIA DE ANORMALIDADES CITOLóGICAS EM PACIENTE, PARA PREVENIR A FORMAçãO DE LESõES CINHISTOLOGICAMENTE CONFIRMADAS E PARA FABRICAR A VACINA, E, USOS DE UMA COMPOSIçãO, DE UMA COMPOSIçãO, DE UMA VACINA E DE UMA COMPOSIçãO DE VACINA. Esta invenção diz respeito a métodos e vacinas para tratar infecções causadas pelos papilomavírus humanos. Foi determinado que a imunização com partículas equivalentes a vírus HPV16 e HPV18 fornece proteção cruzada contra outros tipos de HPV

Description

"VACINA DE HPV MULTIVALENTE, MÉTODOS PAJRA PROTEGER UM PACIENTE CONTRA A INFECÇÃO, PARA PREVENIR OU REDUZIR A FREQÜÊNCIA DE ANORMALIDADES CITOLÓGICAS EM UM PACIENTE, PARA PREVENIR A FORMAÇÃO DE LESÕES CIN HISTOLOGICAMENTE CONFIRMADAS E PARA FABRICAR A VACINA, E, USOS DE UMA COMPOSIÇÃO, DE UMA VACINA E DE UMA COMPOSIÇÃO DE VACINA"

Campo da Invenção

A presente invenção diz respeito a vacinas do papilomavírus humano (HPV).

Fundamentos da Invenção

Os papilomavírus são vírus de tumor de DNA pequenos, que são altamente específicos de espécie. Até agora, mais de 100 genótipos do papilomavírus humano (HPV) individual foram descritos. Os HPVs são no geral específicos para a pele (por exemplo HPV-I e -2) ou superfícies mucósicas (por exemplo HPV-6 e -11) e usualmente causam tumores benignos (verrugas) que persistem por vários meses ou anos. Tais tumores benignos podem ser agoniantes para os indivíduos envolvidos mas tendem a não serem ameaçadores da vida, com umas poucas exceções.

Alguns HPVs também estão associados com cânceres, conhecidos como tipos do HPV oncogênicos. A associação positiva mais forte entre um HPV e o câncer humano é o que existe entre o HPV-16 e HPV-18 e o carcinoma cervical. O câncer cervical é a malignidade mais comum em países em desenvolvimento, com cerca de 500.000 novos casos ocorrendo no mundo a cada ano.

Outros tipos do HPV que podem causar câncer são os tipos 31,33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68 (aludidos como "tipos oncogênicos do HPV"). Os tipos 16 e 18 são aqueles que têm a associação mais alta com o câncer cervical. Os tipos 31 e 45 são os tipos com a associação contígua mais alta com um risco de câncer (Munoz N, Bosch FXj de Sanjose S et ai International Agency for Research on Câncer Multicenter Cervical Câncer Study Group. N Engl J Med 2003; 348: 518-27).

As partículas equivalentes a vírus (VLPs) do HPV foram sugeridas como vacinas potenciais para o tratamento do HPV. Os estudos de animal têm mostrado que as VLPs não produzem nenhuma proteção cruzada contra a infecção por outros tipos do HPV - ver, por exemplo Suzich, J. A., et ai, Proc Natl Acad Sei, 92: 11553-11557, 1995 e Breitburd, Seminars in Câncer Biologys vol 9, 1999, pp 431 - 445.

A WO 2004/056389 divulga que uma vacina de VLP do HPV .16, 18 pode fornecer proteção cruzada contra a infecção pelos tipos do HPV outros que não 16 e 18. Proteção estatisticamente significante foi observada contra certos grupos de tipos do HPV. Entretanto, o nível de proteção cruzada contra tipos individuais dentro dos grupos não foi divulgado. Existe ainda uma necessidade quanto a uma vacina que protela contra tipos múltiplos do HPV.

Sumário da Invenção

A presente invenção diz respeito a uma vacina do HPV multivalente, a vacina compreendendo uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo HPV 16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV 45, HPV 52 ou qualquer combinação desta.

A presente invenção diz respeito ainda ao uso de uma composição que compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 16 e HPV 18 na fabricação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença por um ou mais do grupo que consiste do HPV 31, HPV 45 e HPV 52. A presente invenção diz respeito ainda ao uso de uma composição que compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 16 e HPV 18 na fabricação de um medicamento para a prevenção de anormalidades citológicas e/ou redução da freqüência de anormalidades citológicas e/ou prevenção de lesões CIN (ASCUS, CIN 1, CIN 2, CIN, câncer cervical) em um indivíduo, as anormalidades ou lesões causadas por pelo menos um tipo do HPV outro que não HPV 16 ou HPV 18, adequadamente sendo causado pelo tipo do HPV 31 ou 45 ou 52 ou uma combinação dos mesmos.

A invenção diz respeito ainda a um método de prevenção e/ou tratamento de infecção e/ou doença pelo HPV5 o método compreendendo liberar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de uma composição que compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo HPV 16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV 45, HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos.

A invenção diz respeito ainda ao uso de uma composição multivalente na fabricação de um medicamento para a prevenção e/ou tratamento de infecção e/ou doença pelo HPV, a composição multivalente compreendendo uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo HPV .16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV 45, HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos e em que o medicamento fornece proteção contra a infecção e/ou doença causada pelo tipo do HPV omitido.

A invenção também diz respeito a um método para a fabricação de uma vacina, o método compreendendo combinar uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo tipos HPV 16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV .45, HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos.

Descrição Detalhada

A existência geral de proteção cruzada produzida pelo HPV 16 e HPV 18 contra infecção tanto incidente quanto persistente, como avaliado em relação a certos grupos de tipos do HPV, foi divulgada na WO .2004/056389.

Nós surpreendentemente descobrimos que a proteção cruzada contra certos tipos do HPV (não HPVl6, HPV 18) (como avaliado pela eficácia de uma vacina do HPV 16 e HPV 18 contra estes tipos), é mais alta do que contra certos outros tipos do HPV (não HPV 16, HPV 18). A proteção cruzada pode ser considerada como a proteção produzida por uma vacina contendo um tipo do HPV contra a infecção (incidente ou persistente) e/ou doença causada por um tipo diferente do HPV. A proteção cruzada pode ser avaliada considerando-se a eficácia da vacina (V.E.), em que a V.E. é a % de melhora na proteção contra a infecção ou doença pela vacina comparada a um grupo de placebo para um dado tipo.

A infecção pode ser infecção incidente ou persistente. A doença pode ser citologia anormal, ASCUS, CINl, CIN2, CIN3 ou câncer cervical relacionado com a infecção pelo HPV. A infecção pode ser avaliada pela PCR, por exemplo. A doença pode ser avaliada, por exemplo, pela examinação histológica ou análise de biomarcadores tais como ρ 16.

Uma tal descoberta tem implicações potenciais para o planejamento de vacina. Por exemplo, o nível de proteção cruzada proporcionado pelas vacinas contendo LI do HPV 16 e HPV 18 contra certos outros tipos do HPV, tais como HPV 31, HPV 45 e HPV 52, possibilita que os componentes Ll destes tipos do HPV sejam omitidos de uma vacina que compreende HPV 16 e HPV 18 enquanto fornece ainda uma vacina que fornece alguma proteção contra a infecção incidente e/ou persistente e/ou doença relacionada com estes tipos omitidos.

Depois os tipos do HPV 16 (encontrado em 53,5 % dos cânceres cervicais) e 18 (encontrado em 17,2 % dos cânceres cervicais), tipos .45 (6,7 %) e 31 (2,9 %) são os seguintes mais significantes em termos de sua freqüência em cânceres cervicais (Munoz et ai. supra). HPV 33 (2,6 %) é o seguinte, seguido pelo HPV 52 (2,3 %). Assim, quando do planejamento de uma vacina do HPV multivalente contra câncer cervical contendo pelo menos .3 tipos do HPV então os tipos 31 e 45 no geral seriam incluídos pela pessoa habilitada depois dos tipos 16 e 18 de uma perspectiva estatística.

A capacidade para omitir antígenos de certos tipos do HPV potencialmente permite a inclusão da proteína Ll a partir de outros tipos do HPV ou de fato antígenos de outros vírus ou patógenos, em uma vacina em um cenário onde a quantidade total de antígeno em uma vacina pode ser limitada, por exemplo pelas restrições físicas, químicas, regulatórias ou outras.

Em particular outros tipos do HPV incluem tipos do HPV oncogênicos tais como HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

A presente invenção diz respeito a uma vacina do HPV multivalente, a vacina compreendendo uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo HPV 16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV 45, HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos.

Em um aspecto da invenção a vacina não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 31.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e/ou persistente pelo HPV 31.

Em um aspecto da invenção a vacina da invenção não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 45.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e /ou persistente pelo HPV 45.

Em um aspecto da invenção a vacina não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 52.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e /ou persistente pelo HPV 52.

Em um aspecto da invenção a vacina da invenção não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 31 e 45.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e/ou persistente tanto pelo HPV .31 quanto pelo 45.

Em um aspecto da invenção a vacina não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 31 e 52.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e/ou persistente tanto pelo HPV .31 quanto pelo 52.

Em um aspecto da invenção a vacina da invenção não contém uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 45 e 52.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e/ou persistente tanto pelo HPV .52 quanto pelo 45.

Em um aspecto da invenção a vacina é capaz de fornecer proteção contra a infecção do HPV incidente e/ou persistente pelo HPV 31 e HPV 45 e HPV52. Adequadamente a vacina é capaz de proteger contra a infecção persistente. Adequadamente a vacina é capaz de proteger contra a infecção incidente. As infecções cervicais incidente e persistente são definidas no Exemplo 1.

Nós também determinamos que uma vacina que compreende as proteínas Ll do HPV 16 e Ll do HPV 18 (por exemplo, como descrito no exemplo 1) fornece proteção contra anormalidades citológicas causadas por certos outros tipos do HPV oncogênicos tais como HPV 52 e é significantemente protetora com respeito a tais anormalidades causadas por um grupo de tipos do HPV de alto risco (definidos como 31, 33, 35, 39, 45, .51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68). As anormalidades citológicas são adequadamente detectadas pela bem conhecida técnica de esfregaço Pap.

Assim a invenção diz respeito ainda ao uso de uma combinação de uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV 16 e HPV 18 na preparação de uma composição para a prevenção de anormalidades citológicas ou redução da freqüência de anormalidades citológicas em um indivíduo causadas por outros tipos do HPV (não HPV 16, HPV 18), adequadamente tipos do HPV oncogênicos e na prevenção de lesões CIN histologicamente confirmadas (CIN 1, CIN 2, CIN 3) e câncer cervical associado com a infecção pelos tipos do HPV que não são HPV 16 ou 18. O dito uso está além da prevenção ou redução de tais eventos causados pelos tipos do HPV na vacina, HPV 16 e 18.

Adequadamente a prevenção de anormalidades citológicas, a redução da freqüência de anormalidades citológicas ou a prevenção de lesões CIN histologicamente confirmadas é prevenção contra aquelas anormalidades ou lesões causadas pelos tipos não incluídos na combinação, adequadamente selecionados da lista do HPV 31, HPV 45 e HPV 52 ou é a prevenção contra aquelas anormalidades ou lesões causadas pelo grupo de 31, 33, 35, 39, 45, .51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68. O dito uso está além da prevenção ou redução de tais eventos causados pelos tipos do HPV na vacina, HPV 16 e 18.

Adequadamente a composição que compreende HPV 16 e HPV 18 para o uso como acima é a vacina do HPV multivalente da invenção, a vacina que compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de pelo menos 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos, estes tipos incluindo HPV 16 e HPV 18, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um tipo do HPV selecionado da lista que consiste do HPV 31, HPV 45, HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos.

A vacina da invenção compreende L1 ou fragmento imunogênico do HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo do HPV oncogênico. Os tipos do HPV oncogênicos são estes tipos associados com um risco de câncer cervical e aqueles tipos oncogênicos que poderiam ser incluídos na vacina da invenção além do HPV 16 e HPV 18 incluem, mas não são limitados a, HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68, com a condição de que a vacina não compreende todos os HPV 31, 45 e 52.

A vacina da invenção adequadamente compreende uma proteína Ll do HPV 33 ou fragmento imunogênico da mesma.

A vacina da invenção adequadamente compreende uma proteína Ll do HPV 58 ou fragmento imunogênico da mesma.

A vacina da invenção adequadamente compreende uma proteína Ll do HPV 59 ou fragmento imunogênico da mesma.

A vacina da invenção adequadamente compreende uma proteína Ll do HPV 16 ou fragmento imunogênico da mesma, proteína Ll do HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, proteína Ll do HPV 33 ou fragmento imunogênico da mesma e proteína Ll do HPV 58 ou fragmento imunogênico da mesma.

As proteínas Ll ou fragmentos de proteína de tipos adicionais do HPV podem ser incluídos na vacina da invenção, tal como tipos de pele (em particular HPV 5 e 8) e tipos associados com verrugas genitais, tal como HPV 6 e 11. Os tipos 6 e 11 não são considerados aqui tipos oncogênicos.

Em um aspecto da invenção a vacina pode incluir um antígeno inicial do HPV, por exemplo um antígeno selecionado da lista que consiste do HPV E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7 ou E8. em um aspecto alternativo a vacina pode carecer de um antígeno inicial do HPV, por exemplo um antígeno selecionado da lista que consiste do HPV El, E2, E3, E4, E5, E6, E7 ou E8.

Em um aspecto a vacina da invenção é trivalente (contém uma Ll do HPV ou fragmento desta de 3 tipos diferentes do HPV oncogênicos). Em um outro aspecto a vacina é tetravalente. Em um outro aspecto a vacina é pentavalente. Em um outro aspecto a vacina é heptavalente. Em um outro aspecto a vacina é septavalente. Em um outro aspecto a vacina é octavalente. Valências de ordem mais alta também são aqui consideradas. Em outros aspectos a vacina é pelo menos tetravalente, pentavalente, heptavalente, septavalente ou octavalente com respeito a tipos do HPV oncogênicos.

Preferivelmente a combinação de componentes do HPV dentro da vacina não influencia significantemente a imunogenicidade de qualquer componente do HPV. Em particular é preferido que não haja nenhuma interferência biologicamente relevante entre os antígenos do HPV na combinação da invenção, tal que a vacina combinada da invenção é capaz de oferecer proteção eficaz contra a infecção ou doença causada por cada genótipo do HPV representado na vacina. Adequadamente a resposta imune contra um dado tipo do HPV na combinação é de pelo menos 50 % da resposta imune daqueles mesmos tipos do HPV quando medidos individualmente, preferível 100 % ou substancialmente 100 %. Para as respostas para o HPV 16 e HPV 18, a vacina combinada da invenção preferivelmente estimula uma resposta imune que é pelo menos 50 % daquela fornecida por uma vacina do HPV 16/HPV 18 combinadas. Adequadamente a resposta imune gerada pela vacina da invenção está em um nível em que o efeito protetor de cada tipo do HPV é ainda observado. A resposta imune pode ser adequadamente medida, por exemplo, pelas respostas de anticorpo, em experimentos pré clínicos ou humanos. A medição de respostas de anticorpo é bem conhecida na técnica e divulgada (por exemplo) na WO 03/077942.

Nós determinamos que uma vacina que compreende as proteínas Ll do HPV 16 e Ll do HPV 18 (por exemplo ver o exemplo 1) fornece proteção cruzada contra a infecção ou doença causada por certos tipos do HPV. Assim como fornecemos novas composições, esta informação permite novos usos a serem desenvolvidos.

Em particular, a invenção diz respeito ao uso de uma composição que compreende a proteína Ll do HPV 16 e HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, na fabricação de um medicamento para a prevenção de infecção pelo HPV 31.

A invenção diz respeito ainda ao uso de uma composição que compreende a proteína Ll do HPV 16 e HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, na fabricação de um medicamento para a prevenção de infecção pelo HPV 45.

A invenção diz respeito ainda ao uso de uma composição que compreende a proteína Ll do HPV 16 e HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma na fabricação de um medicamento para a prevenção de infecção pelo HPV 52.

Em um aspecto a invenção diz respeito ao uso de uma vacina que compreende a proteína Ll do HPV 16 ou fragmento imunogênico da mesma, na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença causada pelo HPV 31 ou HPV 52 ou qualquer combinação dos mesmos.

Em um aspecto a invenção diz respeito ao uso de uma vacina que compreende a proteína Ll do HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença causada pelo HPV 45.

A composição para o dito uso pode carecer de um componente antigênico do tipo do HPV para o qual a proteção cruzada é fornecida.

Alternativamente a composição para o dito uso pode compreender um tal componente antigênico, por exemplo a proteína Ll ou fragmento desta do dito tipo protegido cruzado. No último caso o uso da composição que compreende a proteína Ll do HPV 16 e HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, fornece tanto proteção cruzada (por exemplo contra HPV 31, 45 e 52) quanto proteção homóloga (por exemplo contra HPV 16 e HPV 18).

A composição em um aspecto é uma composição multivalente que compreende as proteínas Ll ou fragmentos imunogênicos das mesmas do HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo do HPV oncogênico, em que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um ou mais tipos do HPV selecionados do grupo que consiste do HPV 31, HPV 45 e HPV 52 é omitida(o) da vacina e em que a vacina fornece proteção contra a infecção causada pelo tipo do HPV omitido.

Onde a vacina ou composição da invenção compreendem um fragmento imunogênico de LI, então fragmentos imunogênicos adequados de Ll do HPV incluem mutantes de truncagem, deleção, substituição ou inserção de LL Tais fragmentos imunogênicos são adequadamente capazes de incitar uma resposta imune (se necessário, quando com adjuvante), a dita resposta imune sendo capaz de reconhecer uma proteína Ll tal como uma partícula equivalente a vírus, do tipo do HPV do qual a proteína Ll foi derivada.

Um fragmento imunogênico adequada do HPV 16 é capaz de proteger cruzado contra pelo menos um do HPV 31 e HPV 52 e em um aspecto da invenção, capaz de proteger cruzado contra ambos.

Um fragmento imunogênico adequado do HPV 18 é capaz de proteger cruzado contra HPV 45. A proteção cruzada obtenível pelos fragmentos imunogênicos do HPV 16 e/ou HPV 18 pode ser avaliada pelos testes em seres humanos,

por exemplo como esboçado no Exemplo 1.

Similarmente, vacinas diferentes de acordo com a presente invenção podem ser testadas usando técnicas padrão, por exemplo como no Exemplo 1 ou em modelos pré clínicos padrão, para confirmar que a vacina é imunogênica.

Os fragmentos Ll imunogênicos adequados incluem proteínas Ll truncadas. Em um aspecto a truncagem remove um sinal de localização nuclear. Em um outro aspecto a truncagem é uma truncagem de terminal C. Em um outro aspecto a truncagem de terminal C remove menos do que 50 aminoácidos, tal como menos do que 40 aminoácidos. Onde o Ll é do HPV 16 então em um outro aspecto a truncagem de terminal C remove 34 aminoácidos da Ll do HPV 16. Onde o Ll é do HPV 18 então em um outro aspecto a truncagem de terminal C remove 35 aminoácidos da Ll do HPV 18. As proteínas Ll truncadas são descritas na US 6.060.324, US 6.361.778 e US 6.599.508 incorporadas aqui por referência.

Em um aspecto a seqüência de aminoácido do HPV 16 é a

seguinte seqüência: (SEQID NO: 1)

Em um outro aspecto a invenção diz respeito às partículas equivalentes a vírus que consistem apenas da Ll do HPV 16 tendo a seqüência de aminoácido acima e às composições contendo tais VLPs.

A seqüência HPV 16 também pode ser aquela divulgada na WO 9405792 ou US 6649167, por exemplo, adequadamente truncada. Os truncados adequados são truncados em uma posição equivalente àquela mostrada acima, como avaliado pela comparação de seqüência.

Em um aspecto a seqüência de aminoácido do HPV 18 é a seguinte seqüência: (SEQ ID NO: 2)

Em um outro aspecto a invenção diz respeito às partículas equivalentes a vírus que consistem apenas da Ll do HPV 18 tendo a seqüência de aminoácido acima e às composições contendo tais VLPs.

Uma seqüência do HPV 18 alternativa é divulgada na WO 9629413, que pode ser adequadamente truncada. Os truncados adequados são truncados em uma posição equivalente àquela mostrada acima, como avaliada pela comparação de seqüência.

Outras seqüências do HPV 16 e HPV 18 são bem conhecidos na técnica e podem ser adequadas para o uso na presente invenção.

As truncagens adequadas do HPV 31, HPV 45 e HPV 52 também podem ser fabricadas, adequadamente removendo porções do terminal C da proteína Ll equivalentes àquelas descritas acima como avaliado pelo alinhamento de seqüência.

As proteínas Ll truncadas são divulgadas, por exemplo, na WO 9611272 e US6066324, aqui incorporada por referência.

A proteína Ll ou fragmento da invenção podem estar opcionalmente na forma de uma proteína de fusão, tal como a fusão da proteína Ll com L2 ou uma proteína inicial.

A proteína Ll do HPV está adequadamente na forma de um capsômero ou partícula equivalente a vírus (VLP). Em um aspecto as VLPs do HPV podem ser usadas na presente invenção. As VLPs do HPV e os métodos para a produção de VLPs são bem conhecidos na técnica. As VLPs são tipicamente construídas das proteínas estruturais Ll e opcionalmente L2 dos vírus, ver por exemplo a WO 9420137, US5985610, WO 9611272, US6599508B1, US6361778B1, EP 595935. Qualquer VLP do HPV adequada pode ser usada na presente invenção fornecendo proteção cruzada, tal como uma VLP Ll ou Ll + L2.

Adequadamente a VLP é uma VLP apenas de LL

Em um aspecto da invenção a vacina compreende VLPs apenas de Ll do HPV 16 e HPV 18, adequadamente em combinação com uma VLP Ll selecionada do HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68, com a condição de que a vacina não compreenda VLPs de todos os HPV 31, 45 e 52.

A formação de VLP pode ser avaliada pelas técnicas padrão tais como, por exemplo, microscopia eletrônica e dispersão de luz de laser dinâmica.

A VLP pode compreender a proteína Ll de tamanho natural. Em um aspecto a proteína Ll usada para formar a VLP é uma proteína Ll truncada, como descrita acima.

As VLPs podem ser fabricadas em qualquer substrato de célula adequado tal como células de levedura ou células de inseto por exemplo células de baculovírus e as técnicas para a preparação de VLPs são bem conhecidas no ramo, tais como WO 9913056, US 6416945B1, US 6261765B1 e US6245568 e referências nestas, os conteúdos inteiros das quais são por meio deste incorporados por referência.

As VLPs são adequadamente fabricadas pelas técnicas de desmontagem e remontagem, que podem fornecer VLPs de papilomavírus mais estáveis e/ou homogêneas. Por exemplo, McCarthy et al, 1998 "Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papilomavirus Type 11 Virus Lyke Particles In Vitro" J. Virology 72(1): 33-41, descrevem a desmontagem e remontagem de VLPs de Ll do HPV 11 recombinantes purificadas a partir de células de inseto de modo a obter uma preparação homogênea de VLPs. A WO 9913056 e US6245568 também descrevem processos de desmontagem/remontagem para fabricar VLPs do HPV.

Em um aspecto as VLPs de HPV são fabricadas como descrito na WO 9913056 ou US6245568.

A Ll do HPV da invenção pode ser combinada com um adjuvante ou imunoestimulante tal como, mas não limitado ao lipídeo A destoxificado de qualquer fonte e derivados não tóxicos de lipídeo Aj saponinas e outros reagentes capazes de estimular uma resposta tipo THl.

É a muito conhecido que o lipopolissacarídeo enterobacteriano (LPS) é um estimulador potente dos sistema imune, embora seu uso em adjuvantes tenha sido restringido pelos seus efeitos tóxicos. Um derivado não tóxico de LPSs o monofosforil lipídeo A (MPL)j produzido pela remoção do grupo de carboidrato do núcleo e o fosfato da glicosamina da extremidade redutora, foi descrito por Ribi et al (1986, Immunology and Immunopharmacology of bacterial endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419) e tem a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 16</formula> Uma outra versão destoxificada de MPL resulta da remoção da cadeia de acila da posição 3 da cadeia principal de dissacarídeo e é chamada de monofosforil lipídeo A 3 -O-Desacilado (3D-MPL). Este pode ser purificado e preparado pelos métodos divulgados na GB 2122204B, referência esta que também divulga a preparação de difosforil lipídeo A e variantes 3-0-desaciladas deste.

Uma forma adequada de 3D-MPL está na forma de uma emulsão tendo um tamanho de partícula pequeno menor do que 0,2 μπα no diâmetro e seu método de fabricação é divulgado na WO 94/21292. As formulações aquosas que compreendem o monofosforil lipídeo A e um tensoativo foram descritas na WO 9843670A2.

Os adjuvantes derivados de lipopolissacarídeo bacteriano a serem formulados nas composições da presente invenção podem ser purificados e processados a partir de fontes bacterianas ou alternativamente eles podem ser sintético. Por exemplo, monofosforil lipídeo A purificado está descrito em Ribi et al 1986 (supra) e monofosforil ou difosforil lipídeo A 3- O-Desacilados derivados de Salmonella sp. estão descritos na GB 2220211 e US 4912094. Outros lipopolissacarídeos purificados e sintéticos foram descritos (Hilgers et al, 1986, Int. Arch. Allergy. Immunol., 79(4): 392-6; Hilgers et al, 1987, Immunology, 60(1): 141-6; e EP 0 549 074 BI). Em um aspecto o adjuvante de lipopolissacarídeo bacteriano é o 3D-MPL.

Conseqüentemente, os derivados de LPS que podem ser usados na presente invenção são aqueles imunoestimulantes que são similares em estrutura àquele de LPS ou MPL ou 3D-MPL. Em um outro aspecto da presente invenção os derivados de LPS podem ser um monossacarídeo acilado, que é uma sub-porção da estrutura acima de MPL.

As saponinas são divulgadas em: Lacaille-Dubois, M e Wagner H. (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363386). As saponinas são glicosídeos esteróides ou triterpênicos amplamente distribuídos nos reinos vegetal e animal marinho. As saponinas são mencionadas por formar soluções coloidais em água que espumam na agitação e para precipitar colesterol. Quando as saponinas estão próximas das membranas celulares elas criam estruturas semelhantes a poro na membrana o que faz com que a membrana se rompa. A hemólise de eritrócitos é um exemplo deste fenômeno, que é uma propriedade de certas, mas nem todas as saponinas.

As saponinas são conhecidas como adjuvantes em vacinas para a administração sistêmica. A atividade adjuvante e hemolítica das saponinas individuais foi extensivamente estudada na técnica (Lacaille-Dubois e Wagner, supra). Por exemplo, Quil A (derivado da casca da árvore sul americana Quillaja Saponaria Molina) e frações desta, são descritas na US 5.057.540 e "Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2): 1-55; e EP 0 362 279 BL As estruturas particuladas, chamadas de Complexos Imuno Estimulantes (ISCOMS), que compreendem frações de Quil A são hemolíticos e foram usados na fabricação de vacinas (Morein, B., EP 0 109 942 BI; WO 96/11711; WO 96/33739). As saponinas hemolíticas QS21 e QS17 (frações purificadas pela HPLC de Quil A) foram descritas como adjuvantes sistêmicos potentes e o método de sua produção é divulgado na Patente US N- 5.057.540 e EP 0 362 279 BL Outras saponinas que foram usadas em estudos de vacinação sistêmica incluem aqueles derivados de outras espécies vegetais tais como Gypsophila e Saponaria (Bomford et ai., Vaccine, 10(9): 572-577, 1992).

Um sistema realçado envolve a combinação de um derivado de lipídeo A não tóxico e um derivado de saponina particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada na WO 94/00153 ou uma composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol como divulgado na WO 96/33739.

Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo QS21 e 3D-MPL em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO 95/17210 e o uso destas formas de adjuvante é um aspecto da invenção.

Conseqüentemente em uma forma de realização da presente invenção é fornecida uma vacina com adjuvante com lipídeo A destoxifícado ou um derivado não tóxico de lipídeo A, mais adequadamente com adjuvante com um monofosforil lipídeo A ou derivado deste.

Em um aspecto a vacina adicionalmente compreende uma saponina, por exemplo QS21.

Em um aspecto a formulação de vacina compreende uma emulsão de óleo em água. A presente invenção também fornece um método para produzir uma formulação de vacina que compreende misturar um peptídeo Ll da presente invenção junto com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.

Os componentes adicionais que podem ser incluídos presentes em uma formulação de vacina de acordo com a invenção incluem detergentes não iônicos tais como os octoxinóis e ésteres de polioxietileno como aqui descrito, particularmente t-octilfenóxi polietoxietanol (Triton X-100) e monooleato de polioxietileno sorbitano (Tween 80); e sais biliares ou derivados de ácido cólico como aqui descrito, em particular desoxicolato ou taurodesoxicolato de sódio. Assim, em um aspecto da invenção uma formulação compreende 3D-MPL, Triton X-100, Tween 80 e desoxicolato de sódio, que podem ser combinados com uma preparação de antígeno L2 para fornecer uma vacina adequada.

Em uma forma de realização da presente invenção, a vacina compreende uma formulação adjuvante vesicular que compreende colesterol, uma saponina e um derivado de LPS. A este respeito a formulação de adjuvante adequadamente compreende uma vesícula unilamelar que compreende colesterol, tendo uma bicamada lipídica adequadamente compreendendo dioleoil fosfatidil colina, em que a saponina e o derivado de LPS estão associados com ou embutidos dentro, da bicamada lipídica. Em um aspecto estas formulações de adjuvante compreendem QS21 como a saponina e 3D-MPL como o derivado de LPSs em que a razão de QS2 lxolesterol é de 1:1 a 1:100 peso/peso e em um aspecto, uma razão de 1:5 peso/peso. Tais formulações adjuvantes são descritas na EP 0 822 831 B, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência.

Adequadamente as vacinas da invenção são usadas em combinação com alumínio e são adequadamente adsorvidas ou parcialmente adsorvidas sobre adjuvantes de alumínio. Adequadamente o adjuvante é um sal de alumínio, que pode estar em combinação com MPL 3D, tal como fosfato de alumínio e MPL 3D. Hidróxido de alumínio, opcionalmente em combinação com MPL 3D também é adequado.

Em um outro aspecto da presente invenção a vacina compreende a combinação de VLPs do HPV com um sal de alumínio ou com um sal de alumínio + MPL 3D. O hidróxido de alumínio é adequado como o sal de alumínio.

A vacina também pode compreender alumínio ou um composto de alumínio como um estabilizador.

Em um outro aspecto o adjuvante pode ser uma combinação de um adjuvante de emulsão de óleo em água e MPL 3D. Em um aspecto a emulsão de óleo em água compreende um óleo metabolizável, um esterol e um agente emulsificante.

As vacinas da invenção podem ser fornecidas por qualquer uma de uma variedade de vias tais como a liberação oral (por exemplo ver a WO 9961052 A2), tópica, subcutânea, mucósica (tipicamente intravaginal), intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intradérmica e por intermédio de supositório.

Opcionalmente a vacina também pode ser formulada ou co- administrada com outros antígenos do HPV ou antígenos que não do HPV. Adequadamente estes antígenos que não do HPV podem fornecer proteção contra outras doenças, tais como as doenças sexualmente transmitidas tais como o vírus do herpes simples, EBV, clamídia e HIV. Nós particularmente preferimos que a vacina compreenda gD ou um truncado desta do HSV. Deste modo a vacina fornece proteção tanto contra HPV quanto HSV.

A dosagem dos componentes da vacina variará com a condição, sexo, idade e peso do indivíduo, a via de administração e HPV da vacina. A quantidade também pode ser variada com o número de tipos da VLP. Adequadamente a liberação é de uma quantidade de vacina adequada para gerar uma resposta imunologicamente protetora. Adequadamente cada dose de vacina compreende de 1 a 100 μg de cada VLP, em um aspecto de 5 a 80 μg, em um outro aspecto de 5 a 30 μg de cada VLP, em um outro aspecto de 5 a 20 μg de cada VLP, em ainda em um outro aspecto 5 μ^ 6 μg, 10 μg, 15 μgou 20 μg.

Em um aspecto a vacina pode compreender os componentes da proteína Ll do HPV, preferivelmente como partículas equivalentes a vírus, em quantidades diferentes. Em um aspecto, as VLPs de HPV 16 e HPV 18 podem ser fornecidas em uma dose mais alta do que as dos outros tipos oncogênicos, tais como HPV 33 ou 58. Em um aspecto apenas VLPs de Ll do HPV 16 e HPV 18 são fornecidas a 20 μg por dose para o uso humano. Outras VLPs do HPV podem ser usadas a uma dose mais baixa, tal como 15 ou 10 μg por dose para o uso humano.

Para todas as vacinas da invenção, em um aspecto a vacina é usada para a vacinação de meninas adolescentes de idade de 10 a 15, tal como de 10 a 13 anos. Entretanto, meninas mais velhas acima de 15 anos de idade e mulheres adultas também pode ser vacinadas. A vacina também pode ser administrada às mulheres a seguir de esfregaço de pap anormal ou depois de cirurgia a seguir da remoção de uma lesão causada pelo HPV ou que sejam soronegativa e DNA negativo para tipos de câncer do HPV. A vacina da invenção pode ser usada em homens.

Em um aspecto a vacina é liberada em um regime de 2 ou 3 doses, por exemplo em um regime de 0, 1 mês ou regime de 0,1 e 6 meses respectivamente. Adequadamente o regime de vacinação incorpora uma injeção de reforço depois de 5 a 10 anos, tal como 10 anos.

Em um aspecto a vacina é uma formulação de vacina líquida, embora a vacina possa ser liofilizada e reconstituída antes da administração.

A divulgação de todas as referências no presente pedido, incluindo pedidos de patente e patentes concedidas, são aqui totalmente incorporadas por referência.

As vacinas da invenção compreendem certos componentes do HPV como exposto acima. Em um outro aspecto da invenção a vacina consiste essencialmente de ou consiste dos ditos componentes.

O termo 'vacina', como usado na presente invenção, refere-se a uma composição que compreende um componente imunogênico capaz de provocar uma resposta imune em um indivíduo, tal como um ser humano, opcionalmente quando adequadamente formulada ou com adjuvante. Uma vacina adequadamente evoca uma resposta imune protetora contra a infecção incidente ou infecção persistente ou anormalidade citológica tal como ASCUS, CIN1, CIN2 , CIN3 ou câncer cervical causados por um ou mais tipos do HPV.

A presente invenção é agora descrita com respeito aos seguintes exemplos que servem para ilustrar a invenção.

Exemplo 1

Os detalhes exatos do experimento realizado são fornecidos em Harper et al, the Lancet. 13 de Nov de 2004; 364(9447): 1757-65, incorporada aqui por referência.

Em resumo, mulheres saudáveis entre as idades de 15 e 25 anos foram imunizadas com uma mistura de VLPs de Ll do HPV 16 e HPV

18. As mulheres no alistamento foram: 1) soronegativas quanto ao HPV-16 e HPV-18; 2) negativas quanto à infecção pelo HPV de alto risco do colo do útero (detectado pela PCR do HPV); 3) tiveram 6 ou menos parceiros na sua vida sexual e 4) tiveram esfregaço PAP normal.

A mistura compreendeu, por 0,5 ml de dose, 20 μg de VLP de Ll do HPV-16, 20 μg de VLP de Ll do HPV-18 e foi com adjuvante com 500 μg de hidróxido de alumínio e 50 μg de MPL 3D. O grupo do placebo foi injetado com 500 ug de hidróxido de alumínio sozinho.

A eficácia da vacina (V.E.) contra certos tipos de câncer do HPV foi avaliada, em que a V.E. é a % de melhora na proteção contra a infecção ou doença pela vacina comparada a um grupo de placebo.

A proteção cruzada foi avaliada detectando-se a presença de ácido nucléico específico para vários tipos oncogênicos nas vacinas e grupo de controle. A detecção foi realizada usando técnicas como descrito na WO 03014402 e referências nesta, particularmente para a amplificação não específica de DNA do HPV e detecção subseqüente de tipos de DNA usando um sistema LiPA como descrito na WO 99/14377 e em Kleter et ai, [Journal of Clinicai Microbiology (1999), 37 (8): 2508-2517], os conteúdos inteiros dos quais são aqui especificamente incorporados por referência.

Qualquer método adequado, entretanto, pode ser usado para a detecção de DNA do HPV em uma amostra, tal como a PCR específica de tipo usando iniciadores específicos para cada tipo do HPV de interesse. Os iniciadores adequados são conhecidos pela pessoa habilitada ou podem ser facilmente construídos dado que as seqüências dos tipos do HPV oncogênicos são conhecidas.

Em detalhes, a seção de métodos do documento Lancet é reproduzida aqui abaixo, para abrangência completa (continua até a seção intitulada "análise inicial e resultados")

O objetivo primário deste estudo foi avaliar a eficácia da vacina na prevenção de infecção com HPV-16, HPV-18 ou ambos (HPV- 16/18), entre os meses 6 e 18 em participantes que foram inicialmente mostrados serem soronegativos quanto ao HPV-16/18 pelo ELISA e negativos quanto ao DNA do HPV-16/18 pela PCR. Objetivos secundários incluídos: avaliação da eficácia de vacina na prevenção da infecção persistente com HPV-16/18 e a avaliação da eficácia de vacina na prevenção de lesões intraepiteliais escamosas de grau baixo citologicamente confirmada (LSIL), lesões intraepiteliais escamosas de grau alto (HSIL) e LSIL histologicamente confirmada (CIN 1), HSIL (CIN 2 ou 3) de câncer de célula escamosa ou adenocarcinoma associado com a infecção pelo HPV-16/18 entre os meses 6 e 18 e meses 6 e 27. A prevenção de células escamosas atípicas de citologia de significância indeterminada (ASCUS) associada com a infecção pelo HPV-16/18 foi adicionada post-hoc às análises de resultado.

Nós também realizamos uma análise exploratória dos pontos finais histopatológicos de CIN 1 e 2 associados com o DNA DO HPV-16/18 detectado pela PCR em tecido lesional. Outros objetivos incluíram a avaliação da imunogenicidade, segurança e tolerabilidade da vacina. O investigadores na América do Norte (Canada e nos USA) e Brasil recrutaram mulheres para este estudo de eficácia através de anúncios ou participação anterior em um estudo de epidemiologia de HPV de uma amostra representativa que ocorreu entre Julho e Dezembro de 2000. Para cada um dos 32 sítios de estudo, uma junta revisora institucional aprovou o protocolo, formas de consentimento e emendas. As mulheres assinaram consentimento por escrito separado para a participação no estudo e colposcopia. Para aquelas abaixo de 18 anos, o consentimento e aprovação dos pais da participante foram obrigatórios.

Houve duas fases do estudo: uma fase inicial para a vacinação e acompanhamento que foi concluído em 18 meses; e uma fase de extensão de acompanhamento cego que foi concluído em 27 meses.

As mulheres elegíveis para a fase inicial (meses 0 a 18) incluíram mulheres saudáveis de idade de 15 a 25 anos, que não tiveram mais do que seis parceiros sexuais, nenhuma história de um teste de Pap anormal ou tratamento ablativo ou excisional do colo do útero e nenhum tratamento em andamento quanto a condilomas externos; e que foram citologicamente negativas, soronegativas quanto aos anticorpos do HOPV-16 e HPV-18 pelo ELISA e negativos em DNA do HOPV pela PCR para os 14 tipos de alto risco do HPV (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) nenhum mais do que 90 dias antes da entrada no estudo.

As mulheres que completaram a fase inicial do estudo mais cedo e que não tiveram terapia ablativa ou excisional do colo do útero ou histerectomia depois do alistamento, foram elegíveis para participarem na fase de extensão do estudo (18 a 27 meses).

Procedimentos

Cada dose da vacina de partícula equivalente a vírus do HPV- 16/18 bivalente (GlaxoSmithKline Biologicals, Rixensart, Bélgica) conteve 20 μg de partícula equivalente a vírus de Ll do HPV-16 e 20 μg de partícula equivalente a vírus de Ll do HPV-18. Cada tipo de partícula equivalente a vírus foi produzida em substrato de célula de Spodoptera frupperda Sf-9 e Trichoplusia ni Hi-5 com adjuvante AS04 contendo 500 μg de hidróxido de alumínio e 50 μg de monofosforil lipídeo A 3-desacilado (MPL, Corixa, Montana, USA) fornecidos em um frasco de monodose. O placebo conteve 500 μg de hidróxido de alumínio por dose e foi idêntico em aparência à vacina do HPV-16/18. Cada participante do estudo recebeu uma dose de 0,5 ml de vacina ou placebo em 0 mês, 1 mês e 6 meses. Os provedores de serviços médicos obtiveram espécimes cervicais com uma escova e espátula cervicais (lavadas em PreservCyt, Cytyc Corporation, Boxborough, MA, USA) para a citologia e teste de DNA do HPV na triagem e meses 6, 12 e 18. Nos meses 0 e 6 e subseqüentemente a cada 3 meses, as mulheres auto- obtiveram amostras cervicovaginais com dois cotonetes seqüenciais (colocados em PreservCyt) para o teste de DNA do HPV. [DM Harper, WW Nolls DR Belloni e BF. Cole, Randomized clinicai trial of PCR-determined human papilomavirus detection methods: self-sampling versus clinician- directed-biologic concordance and women's preferences. Am J Obstet Gynecol 186 (2002), pp. 365-373] Um laboratório central (Quest Diagnosticsi Teterboro, NJ, USA) relataram os resultados de citologia (ThinPrep, Cytyc Corporation) pelo uso do sistema de classificação de Bethesda 1991. As diretrizes do protocolo recomendaram colposcopia depois de dois relatos de ASCUS ou um relato de células glandulares atípicas de significância indeterminado, LSIL ou HSIL, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma in situ ou adenocarcinoma. Estas diretrizes também recomendaram biópsia para qualquer lesão suspeita.

O laboratório de histologia central fez um diagnóstico inicial dos espécimes de tecido fixados em formalina para o controle clínico. Um painel de três patologistas fizeram um diagnóstico de consenso subseqüente para lesões associadas com HPV-16 e HPV-18 com o sistema CIN. Este diagnóstico de consenso também incluiu a revisão das seções coletadas no momento da microdissecação para a detecção pela PCR de DNA do HPV lesional.

O DNA do HPV isolado do espécime de citologia (MagNaPure Total Nucleic Acid system, Roche Diagnostics, Almere, Países Baixos) e do espécime de biópsia cervical (extração com proteinase K) foi amplificada de uma alíquota de DNA total purificado com os iniciadores de espectro amplo SPFlO que amplificam uma região de 65 pares de base do gene LL [B Kleter, LJ van Doom, J ter Schegget et aí., Novel short- fragmento PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 153 (1998), pp. 1731-1739: LJ van Doom, W Quint, B Kleter et ai, Genotyping of human papillomavirus in liquid cytology cervical specimens by the PGMY Iine blot assay and the SPF(IO) Iine probe assay. J Clin Microbiol 40 (2002), pp. 979-983 e WG Quint, G Scholte, LJ van Dooms B Kleter, PH Smits e J. Lindemano, Comparative analysis of human papillomavirus infections in cervical scrapes and biopsy specimens by general SPF(IO) PCR and HPV genotyping. J Pathol 194 (2001), pp. 51-58] Os produtos de amplificação foram detectados por um imunoensaio de enzima de DNA. Um ensaio de sonda em linha (LiPA Kit HPV INNO LiPA HPV genotyping assay, sistema SPF-10 versão 1, Innogenetics5 Gent, Bélgica, fabricado pela Labo Biomedical Products, Rijswijk, Países Baixos) detectou 25 genótipos do HPV (6, 11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 40, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70 e 74). [B Kleter, LJ van Doom, L Schrauwen et al., Development and clinicai evaluation of a highly sensitive PCR-reverse hibridization Iine probe assay for detection and identification of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 37 (1999), pp. 2508-2517] Qualquer espécime que foi positivo pelo imunoensaio de enzima de DNA foi testado pela PCR específica de tipo do HPV-16 e HPV-18. Os iniciadores de PCR específicos de tipo do HPV-16 amplificaram um segmento de 92 pares de base do gene E6/E7 e os iniciadores de OCR específicos de tipo do HPV-18 amplificaram um segmento de 126 pares de base do gene LL [MF Baay, WG Quint, J Koudstaal et al., Comprehensive study of several general and type-speciflc primer pairs for detection of human papillomavirus DNA pela PCR em carcinomas cervicais embutidos em parafina. J Clin Microbiol 34 (1996), pp. 745-747]

Nós definimos a infecção cervical incidente com HPV-16/18 como pelo menos um resultado de PCR positivo quanto ao HPV-16 ou HPV- 18 durante o teste e a infecção persistente com HPV-16/18 como pelo menos dois ensaios positivos de PCR do DNA do HPV para o mesmo genótipo viral separados por pelo menos 6 meses. [H Richardson, G Kelsall, P Tellier et a/., The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students. Câncer Epidemiol Biomarkers Prev 12 (2003), pp. 485-490 e AB Moscickij JH Ellenberg, S Farhat e J. Xui Persistence of human papillomavirus infection in HlV-infected and -uninfected adolescent girls: risk factors and differences, by philogenetie type. J Infect Dis 190 (2004), pp. 37-45] os resultados do teste de DNA do HPV foram ocultados dos investigadores durante o estudo e os diagnósticos citológicos e histológicos foram apenas revelados com os propósitos de controle clínico. As análises incluíram os resultados de DNA do HPV-16/18 para os espécimes cervicais e combinaram os espécimes cervicais e cervicovaginais auto-obtidos.

Nós coletamos soro de participantes do estudo nos meses 0, 1, 6, 7, 12 e 18 para avaliação da imunogenicidade. O teste sorológico para anticorpos para as partículas equivalentes a vírus HPV-16 e HPV18 foi pelo ELISA. As partículas equivalentes a vírus do HPV-16 ou HPV-18 recombinantes foram usadas como antígenos de revestimento para a detecção de anticorpo (ver o anexo da http://image.thelancet.com/extras/ 04art 10103webappendix.pdf). A soropositividade foi definida como um título maior do que ou igual ao título do ensaio de corte estabelecido em 8 unidades ELISA/mL para o HPV-16 e 7 unidades ELISA/mL para o HPV-18. Os títulos naturais típicos foram determinados pelo uso de amostras de sangue obtidas de mulheres no estudo de epidemiologia precedente que foram verificadas serem soropositivas para HPV-16 ou HPV-18 pelo ELISA.

As mulheres registraram os sintomas experimentados durante os primeiros 7 dias depois da vacinação nos cartões diários com uma escala de três graus de intensidade de sintoma. Adicionalmente, elas relataram ao pessoal do estudo por entrevista todos os efeitos adversos dentro dos primeiros 30 dias depois da vacinação. A informação sobre eventos adversos sérios e gravidez foi coletada por todo o estudo.

Métodos estatísticos

Assumindo uma taxa de incidência acumulativa de 6 % tanto da infecção do tipo HPV-16 quanto do HPV-18 em 12 meses, nós estimamos que 500 mulheres por grupo de tratamento forneceria 80 % de domínio para avaliar um limite inferior dos 95 % de CI da eficácia de vacina acima de zero. Nós assumimos uma taxa de retenção de 80 % em 18 meses. As análises intermediárias quanto a eficácia, segurança e imunogenicidade foram feitas apenas com propósitos de planejamento de estudo futuro; o método de 0'Brien e Fleming foi usado para ajustar o valor para a análise final depois que as análises intermediárias ocorreram (total α = 0,05; ensaio bilateral). [PC 0'Brien e TR. Fleming, A multiple testing procedure for clinicai trials. Biometrics 35 (1979), pp. 549556]

A randomização estratificada, de bloco de acordo com algoritmos validados foi centralizada com um sistema de randomização da internet. A estratificação foi de acordo com a idade (15 a 17, 18a21e22a25 anos) e região (América do Norte e Brasil). A cada dose de vacina foi atribuída um número aleatoriamente escolhido com base na informação de participante específico entrada no sistema de randomização computadorizada pelo pessoal de estudo. A distribuição do tratamento permanece escondida dos investigadores e das mulheres que participam em um estudo de acompanhamento de longa duração.

Os grupo de intenção para tratar e de acordo com o protocolo são mostrados na figura, na qual as razões para a exclusão das análises são listadas na classificação; as mulheres que atingiram mais do que um critério de exclusão foram contadas apenas uma vez de acordo com o critério de classificação mais alto. Nós nos referimos aos conjuntos de participantes introduzidos nas análises de intenção para tratar e de acordo com o protocolo como grupos, embora a informação usada para restringir a inclusão do paciente no de acordo com o protocolo foi apenas conhecido depois do acompanhamento. Nós fizemos as análises tanto de acordo com o protocolo e intenção para tratar quanto a eficácia. O cálculo da eficácia da vacina na análise de 18 meses de acordo com o protocolo foi fundamentado na proporção de participantes com infecção pelo HPV-16/18 nos grupos de vacinados versus de placebo. A eficácia da vacina foi definida como 1 menos a razão entre estas duas proporções; 95 % de CIs mediram a precisão das estimativas de eficácia. Os valores ρ foram calculados com o teste exato de Fisher bilateral. As razões correspondentes foram expressadas como os números de casos com o resultado dividido pelos números de participantes em risco. O grupo de 18 meses de acordo com o protocolo incluíram mulheres alistadas que receberam três doses programadas de vacina e cumpriram com o protocolo como descrito na figura.

O cálculo da eficácia da vacina nas análises de 27 meses de intenção para tratar e de acordo com o protocolo foi fundamentado no modelo de risco proporcional de Cox usando o tempo para ocorrência de casos com infecção pelo HPV-16/18 nos grupos vacinados versus placebo. Isto permitiu controlar quanto aos dados de Tempo-persona acumulado em cada grupo. A eficácia da vacina foi calculada usando 1 menos a razão de risco e valores ρ calculados usando o teste de classificação de log. As taxas correspondentes foram expressadas como o número de casos dividido pelo Tempo-persona total. Todas as mulheres alistadas que receberam pelo menos uma dose de vacina ou placebo, foram negativas quanto ao DNA do HPV de alto risco no mês 0 e não tiveram nenhum dado disponível para a medição de resultado foram incluídas no grupo de intenção para tratar.

O grupo de acordo com o protocolo de 27 meses incluíram resultados do grupo de acordo com o protocolo 18 meses e os resultados que ocorreram durante a fase de extensão (de 18 meses a 27 meses).

O cálculo de valores ρ para a análise de segurança foi realizada usando as comparações de teste exato de Fisher. O grupo para a análise de segurança incluiu todas as mulheres alistadas que receberam pelo menos uma dose de vacina ou placebo e cumpriram com as exigências do protocolo especificadas, mínimas (ver protocolo abaixo:) <figure> figure see orginal document page </figure>

A imunogenicidade foi avaliada em um subconjunto do grupo de segurança de acordo com o protocolo, que incluiu mulheres com resultados da sorologia nos meses 0, 7 e 18, que receberam todas as três doses da vacina do estudo ou placebo de acordo com o programa, cumpriram com o programa de amostragem de sangue e não se tornaram positivas para HPV-16/18-DNA " durante o teste. As taxas de soropositividade entre os grupos de vacina e placebo foram comparados com os testes exatos de Fisher (p < 0,001 julgado signiflcante). Os títulos médios geométricos foram comparados com os testes de ANOVA e Kruskal-Wallis.

A randomização de bloco e as análises estatísticas foram feitas com SAS versão 8.2 (SAS Institute5 Cary, Carolina do Norte).

Análise inicial e resultados

Os resultados da análise inicial sobre a proteção cruzada são apresentados no pedido de patente WO 2004/056389, os conteúdos inteiros dos quais são aqui incorporados por referência.

Uma análise inicial foi realizada em um "ITT" (grupo de Intenção para Tratars que representa todos os indivíduos que receberam pelo menos uma dose de vacina). Estes dados são mostrados na Tabela A.

Os resultados apresentados nas Tabelas BeC dizem respeito ao grupo "ATP" (De acordo com Protocolo) para aqueles pacientes que cumpriram com todos os critérios do teste. A Tabela B é uma análise de ponto intermediário com os dados tomados de todos os pacientes no ponto de tempo em que pelo menos 50 % do grupo estava com 18 meses depois da sua primeira vacinação. A Tabela C dá os resultados finais, todos os dados sendo de pacientes com 18 meses após a primeira vacinação (mês 0). No grupo ATP todos os pacientes receberam 3 doses de vacina em 0, 1 e 6 meses e foram soronegativos com 6 meses.

Como demonstrado pelos dados apresentados na Tabela A, a imunização com uma mistura de VLPs do HPV 16 e HPV18 forneceu proteção cruzada aparente contra outros tipos do HPV. Neste ponto os tamanhos de amostra são muito pequenos para fornecer uma análise estatística rigorosa, entretanto os dados demonstram uma tendência positiva e sugere que a imunização com VLPs do HDPV 16 e HPV 18 serão eficazes contra a infecção com outros tipos do HPV.

Isto foi confirmado conforme o estudo progrediu.

A Tabela B demonstra que o HPV 16 e HPV 18 fornecem proteção cruzada estatisticamente significante contra o grupo de tipos de alto risco de câncer 31, 33, 35, 39,45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.

A Tabela C demonstra que, exceto para os tipos relacionados com o HPV-18 (que mostram uma tendência muito forte), existe proteção cruzada estatisticamente significante contra os grupos de: tipos HPV 31, 35, 58; HPV 31, 33, 35, 52, 58; e os 12 de alto risco (não HPV-16/18) avaliados.

Outra análise foi realizada sobre a proteção cruzada específica contra tipos específicos.

A eficácia de vacina foi avaliada contra infecções e doenças relacionadas com o 12 tipos de alto risco de câncer 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68, tipos relacionados com a filogenética HPV-16 (os grupos de; 31, 35 e 58; 31, 33, 35, 52 e 58) e tipos relacionados com a filogenética HPV-18 (45 e 59).

Uma análise foi realizada em um grupo "ATP" (De acordo com o Protocolo) para aqueles pacientes que cumpriram com todos os critérios do teste. No grupo ATP todos os pacientes receberam 3 doses de vacina em 0, 1 e 6 meses e foram soronegativos em 6 meses.

Como demonstrado pelos dados apresentados na Tabela D, a imunização com uma mistura de VLPs do HPV16 e HPV18 forneceram proteção cruzada estatisticamente significante contra a infecção incidente pelos tipos do HPV 31, 52 e 45 comparados com o controle.

A proteção cruzada estatisticamente significante contra a infecção incidente também foi observada contra o grupo de todos os tipos relacionados com o HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (HPV 31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66 e 68). A proteção cruzada estatisticamente signiflcante contra a infecção persistente também foi observada contra os tipos 31 e 52 e foi também observada contra o grupo de todos os tipos relacionados com o HPV .16 (ver a Tabela E).

A proteção cruzada estatisticamente signiflcante foi observada contra as anormalidades citológicas associadas com HPV 52 e também foi observada contra as anormalidades citológicas associadas com o grupo de todos os tipos relacionados com HPV 16 (HPV-31, 33, 35, 52 e 58) e o grupo de todos os tipos de alto risco, excluindo 16 e 18 (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68) (Tabela F).

Tabela A

<table>table see original document page 34</column></row><table>

As amostras foram coletadas em 9, 12, 15 e 18 meses dos pacientes e testadas quanto a infecção pelo HPV pelos tipos especificados acima.

Tabela B - Eficácia de vacina depois de três doses na prevenção de infecções heterólogas incidentes.

A eficácia de vacina contra a infecção com tipos filogeneticamente relacionados do HPV-16, tipos filogeneticamente relacionados do HPV-18, tipos filogeneticamente relacionados do HPV-16 e/ou HPV-18 e todos tipos de alto risco exclusivos de HPV-16 e HPV-18 - grupo ATP (6 a 18 meses)

<table>table see original document page 35</column></row><table>

N = número de pacientes no grupo específico η = número de pacientes com infecção por HPV incidente AR = Razão de ataque = n/N

95 % CI = 95 % de intervalo de confidência limite inferior = 1 - exp (Iog (arv/arp) + 1,96 * raiz q. (1/nv - 1/Nv + 1/np - l/Np)) limite superior = 1 - exp (Iog (arv/arp) - 1,96 * raiz q. (1/nv-1/Nv+1/np-l/Np)) quando o número de cases na vacina = O:. limite inferior* = 1 - exp ( Iog (arv*/arp*) + 1,96 * raiz q (l/(nv + 0,5) - l/(Nv + 0,5) + l/(np + 0,5) - l/(Np + 0,5))) limite superior* = 1 - exp (Iog (arv*/arp*) - 1,96 * raiz q. (l/(nv + 0,5) - l/(Nv + 0,5) + l/(np + 0,5) - l/(Np + 0,5))) com: arv = razão de ataque em receptores da vacina arp = razão de ataque em receptores de placebo nv = número de casos em receptores da vacina Nv = número de casos e não casos em receptores da vacina np = número de casos em receptores de placebo Np = número de casos e não casos em receptores de placebo

HPV-16 relacionado: tipos filogeneticamente relacionados com HPV-16 35, 31, 58 sem considerar outros tipos do HPV HPV-16 relacionado*: tipos filogeneticamente relacionados com HPV-16 35, 31, 58, 33, 52 sem considerar outros tipos do HPV

HPV-18 relacionado: tipos filogeneticamente relacionados

do HPV-18 45, 59 sem considerar outro tipos do HPV

HPV-16 e/ou HPV-18 relacionado: tipos filogeneticamente

relacionados com o HPV-16 e/ou HPV-18 35, 31, 58, 45, 59

sem considerar outro tipos do HPV

HPV-16 e/ou HPV-18 relacionado*: tipos filogeneticamente

relacionados com o HPV-16 e/ou HPV-18 35, 31, 58, 33,

52, 45, 59 sem considerar outro tipos do HPV

* * = Tipos de alto risco exclusivos de HPV-16 e HPV-18 Tabela C

<table>table see original document page 36</column></row><table>

As amostras foram coletadas em 18 meses de pacientes e testados quanto a infecção pelo HPV pelos tipos especificados acima.

Tabela D

Eficácia contra infecções incidentes com tipos relacionados com 16/18*

<table>table see original document page 36</column></row><table> * Amostras cervicais: grupo ATP Tabela E

Eficácia contra infecções persistentes com tipos relacionados com 16/18*

<table>table see original document page 37</column></row><table>

*Todas as Amostras: grupo ATP

Tabela F

Eficácia contra anormalidades citológicas ass. com tipos relacionados com 16/18*

<table>table see original document page 37</column></row><table>

* Grupo ATP Nas tabelas D5 E e F,

N = número de pacientes no grupo específico AR= Razão de ataque = η (número de pacientes com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica do HPV, como apropriado para a tabela)/N

% de eficácia da vacina é 1 - (A/B) χ 100, ajustada para o tamanho relativo do grupo da vacina e do placebo, em que

A = % de mulheres no grupo da vacina com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica, como apropriado para a tabela

B = % de mulheres no grupo do placebo com infecção incidente, infecção persistente ou anormalidade citológica, como apropriado para a tabela. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Glaxosmithfclins biologicals <120> VACINA

<130> b45331-l

<150> 11/114301 <151> 2005-04-26

<150> 11/367601 <151> 2005-12-16

<150:> PCT/EP2005/006461 <151> 2005-06-14

<160> 6

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 471 <212> PRT

<213> SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO hpv 16

<400> 1

Met Ser Leu Trp Leu Pro Ser Glu Ala Thr Val Tyr Leu Pro Pto Val

1 5 10 15

Pro Val Ser Lys Val Val Ser Thr Asp Glu Tyr Val Ala Arg Thr Asn

20 25 30

Ile Tyr Tyr His Ala Gly Thr Ser Arg Leu Leu Ala Val Gly His Pro

35 40 45

Tyr Phe Pro Ile Lys Lys Pro Asn Asn Asn Lys Xle Leu Val Pro Lys

50 55 60

Val Ser Gly Leu Gln Tyr Arg Val Phe Arg Ile His Leu Pro Asp Pro 65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Phe Pro Asp Thr Ser Phe Tyr Asn Pro Asp Thr Gln

B5 90 95

Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Val Gly Arg Gly Gln Pro 100 105 no Leu Gly Val Gly Ile Ser Gly His Pro Leu Leu Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Asn Ala Ser Ala Tyr Ala Ala Asn Ala Gly Val Asp Asn. Arg

130 135 140

Qlu Cys Xle Ser Met Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Leu Ile Gly 145 150 155 160

Cys Lys Pro Pro lie Gly Glu His Trp Gly Lys Gly Ser Pro Cys Thr

155 170 175

Asn Val Ala Val Asn Pro Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Ile Asn

180 185 190

Thr Val Ile Gln Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Phe Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Thr Thr Leu Gln Ala Asn Lys Ser Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Thr Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Ile Lye Met Val Ser Glu 225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Leu Phe Phe Tyr Leu Arg Arg Glu Gln Met Phe

245 250 255

Val Arg His Leu Phe Asn Arg Ala Gly Ala Val Gly Glu Asn Val Pro

260 265 270

Asp Asp Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gly Ser Thr Ala Asn Leu Ala Ser

275 280 285

Ser Asn Tyr Phe Pro Thr Pro Ser Gly Ser Met Val Thr Ser Asp Ala

290 295 300

Gln Ile Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Leu Gln Arg Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320

Asn Gly Ile Cys Trp Gly Aen Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Asn Met Ser Leu Cys Ala Ala Ile Ser Thr Ser Glu

340 345 350

Thr Thr Tyr Lys Asn Thr Asn Phe Lys Glu Tyr Leu Aig His Gly Glu

355 360 365

Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Lys Ile Thr Leu Thr

370 375 380

Ala Asp Val Met Thr Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Thr Ile Leu Glu 385 390 395 400

Asp Trp Asn Phe Gly Leu Gln Pro Pro Pro Gly Gly Thr Leu Glu Asp

405 410 415

Thr Tyr Arg Phe Val Thr Ser Gln Ala Ile Ala Cys Gln Lys His Thr

420 425 _ 430

Pro Pro Ala Pro Lys Glu Asp Pro Leu Lys Lys Tyr Thr Phe Trp Glu

435 440 445

Val Asn Leu Lys Glu Lys Phe Ser Ala Asp Leu Asp Gln Phe Pro Leu 450 455 460 Gly Arg Lys Phe Lbu Leu Gln 455 470

<210> 2 <2I1> 472 <212> PRT

*213> SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO hpv 18

<400> 2

Met Ala Leu Trp Arg Pro Ser Asp Asn Thr Val Tyr Leu Pro Pro Pro

15 ID

Ser vai Ala Arg Val vai Asn Thr Asp Asp Tyr Val Thr Arg Thr Ser

20 25 30

IlG Phe Tyr His Ala Gly Ser Ser Arg Leu Leu Thr Val Gly Asn Pro

35 40 45

Tyr Phe Arg Val Pro Ala Gly Gly Gly Asn Lys Gln Asp Ile Pro Lys

50 .55 SO

Val Ser Ala Tyr Gln Tyr Arg VaX Phe Arg Val Gln Lea Pro Asp Pro 65 70 75 80

Asn Lys Phe Gly Leu Pro Asp Asn Ser Ile Tyr Asn Pxo Glu Thr Gln

85 90 95'

Arg Leu Val Trp Ala Cys Val Gly Val Glu Ile Gly Arg Gly GIti Pro

100 105 HO

Leu Gly Val Gly Leu Ser Gly His Pro Phe Tyr Asn Lys Leu Asp Asp

115 120 125

Thr Glu Ser Ser His Ala Ala Thr Ser Asn Val Ser Glu Asp Val Arg

130 135 140

Asp Asn Val Ser Val Asp Tyr Lys Gln Thr Gln Leu Cys Ile Leu Gly 145 150 155 160

Cys Ala Pro Ala Ile Gly Glu His Trp Ala Lys Gly Thr Ala Cys I.ys

165 Í70 175

Ser Arg Pro Leu Ser Gln Gly Asp Cys Pro Pro Leu Glu Leu Lys Asn

180 185 190

Thr Val Leu Glu Asp Gly Asp Met Val Asp Thr Gly Tyr Gly Ala Met

195 200 205

Asp Phe Ser Thr Leu Gln Aep Thr Lys Cys Glu Val Pro Leu Asp Ile

210 215 220

Cys Gln Ser Ile Cys Lys Tyr Pro Asp Tyr Leu Gln Met Ser Ala Asp 225 230 235 240

Pro Tyr Gly Asp Ser Met Phe Phe Cys Leu Arg Arg Glu Gln Leu Phe

245 250 255

Ala Arg His Phe Trp Asn Arg Ala Gly Thr Met Gly Asp Thr Val Pro 260 265 270 Pro Ser Leu Tyr Ile Lys Qly Thr Gly Met Arg Ala Ser Pro Gly Ser

275 2β0 285

Cys Val Tyr Ser Pro Ser Pro Ser Gly Ser Ile Val Thr Ser Asp Ser

290 295 300

Gln Leu Phe Asn Lys Pro Tyr Trp Iieu His Lys Ala Gln Gly His Asn 305 310 315 320

Asn Gly Val Cye Trp Ris Asn Gln Leu Phe Val Thr Val Val Asp Thr

325 330 335

Thr Arg Ser Thr Aen Leu Thr Ile Cys Ala Ser Thr Gln Ser Pro Val

340 345 350

Pro Gly Gln Tyr Asp Ala Thr Lys Phe Lys Gln Tyr Ser Arg His vai

355 360 365

Glu Glu Tyr Asp Leu Gln Phe Ile Phe Gln Leu Cys Thr Ile Thr Leu

370 375 3BO

Thr Ala Asp Val Met Ser Tyr Ile His Ser Met Asn Ser Ser Ile Leu 385 390 395 400

Glu Asp Trp Asn Phe Gly Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Ser Leu Val

405 410 415

Asp Thr Tyr Arg Phe Val Gln Ser Val Ala Ile Thr Cys Gln Lys Aap

420 425 430

Ala Ala Pro Ala Glu Asn Lys Asp Pro Tyr Asp Lys Leu Lye Phe Trp

435 440 445

Asn Val Asp Leu Lys Glu Lys Phe Ser Leu Asp Leu Asp Gln Tyr Pro

450 455 460

Leu Gly Arg Lys Phe Leu Val Gln 465 470

<210> 3 <211> 1416 <212> DNA

<213> SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO hpv 16

<400> 3 atgCctcttt ggctgcctag tgaggccact gtctacttgc ctcctgtccc agtatctaag €0 gttgeaagca cggatgaata tgttgcacgc acaaacatat attatcatgc aggaacatcc 120 agactacttg cagttggaca tccctatttt cctattaaaa aacctaacaa taacaaaata 180 ttagttccta aagtatcagg attacaatac agggtattta gaatacattt acctgacccc 240 aataagtttg gttttcctga cacctcattt tataatccag atacacagcg gctggtttgg 300 gcctgtgtag gtgttgaggt aggtcgtggt cagccattag gtgtgggcat taStggccat 360 cctttattaa ataaattgga tgacacagaa aatgctagtg cttatgcagc aaatgcaggt 420 gtggataata gagaatgtat atctatggat tacaaacaaa cacaattgtg cttaattggt 4&0 tgcaaaccac ctatagggga acactggggc aaaggatccc catgtaccaa tgttgcagta 540 aatccaggtg attgtccacc attagagtta ataaacacag ttattcagga tggtgatacg 600 gttgatactg gctttggtgc tatggacttt actacattac aggctaacaa aagtgaagtt 660 ccactggata tttgtacatc tatttgcaaa tatccagatt atattaaaat ggtgccagaa 720 ccatatggcg acagcttatt tttttattta cgaagggaac aaatgtttgt tagacattta 780 tttaataggg ctggtgctgt tggtgaaaat gtaccagacg atttatacat taaaggctct 840 gggtctactg caaatttagc cagttcaaat tattttccta caectagtgg ttctatggtt SOO acctctgatg cccaaatatt caataaacct tattggttac aacgagcaca gggccacaat 960 aatggcattt gttggggtaa ccaactattt gttactgttg ttgatactac acgcagtaca 1020 aatatgtcat tatgtgctgc catatctact tcagaaacta catataaaaa tactaactet 1080 aaggagtacc tacgacatgg ggaggaatat gatttacagt ttatttttca actgtgcaaa 1140 ataaccttaa ctgcagacgt tatgacatac atacattcta tgaattccac tattttggag 1200 gactggaatt ttggtctaca acctccccca ggaggcacac tagaagatac ttataggttt 1260 gtaacatccc aggcaattgc ttgtcaaaaa catacacctc cagcacctaa agaagatccc 1320 cttaaaaaat acactttttg ggaagfcaaat ttaaaggaaa agttttctgc agacctagat 1380 cagtttcctt taggacgcaa atttttacta caataa 1416

<210> 4 <211> 1419 <212> DNA

<213 > SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAP1L0MA HUMANO hpv 18

<400> 4

atggctttgt ggcggcctag tgacaatacc gtatatcttc cacctccttc tgtggcaaga 60 gttgtaaata ccgatgatta tgtgactcgc acaagcatat tttatcatgc tggcagctct 120 agattattaa ctgttggtaa tccatatttt agggttcctg caggtggtgg caataagcag 180 gafcattccta aggtttctgc ataccaatat agagtattta gggtgcagtc acctgaccca 240 aataaacttg gtttacctga taatagtatt tataatcctg aaacacaacg tttagtgtgg 300 gcctgtgttg gagtggaaat tggccgtggt cagcctttag gtgttggcct tagtgggcat 360 ccattttata ataaattaga tgacactgaa agttcceatg ccgccacgtc taatgtttct 420 gaggacgtta gggacaatgt gtctgtagat tataagcaga cacagttatg tatttfegggc 480 tgtgcccctg ctattgggga acactgggct aaaggcactg cttgtaaatc gcgtccttta 540 tcacagggcg attgcccccc tttagaactt aaaaacacag ttttggaaga tggtgatatg 600 gtagatactg gatatggtgc catggacttt agtacattgc aagatactaa atgtgaggta 660 ccattggata tttgtcagtc tatttgtaaa tatcctgatfc atttacaaat gtctgcagat 720 ccttatgggg attccatgtt tttttgctta cggcgtgagc agctttttgc taggcatttt 780 tggaataggg caggtactat gggtgacact gtgcctccat ccttatatat taaaggcaca 640 ggtatgcgtg cttcacctgg cagctgtgtg tattctccct ctccaagtgg ctctattgtt 900 acctctgact cccagttgtt taataaacca tattggttac ataaggcaca gggtcataac 960 aatggtgttt gctggcataa tcaattattt gttactgtgg tagataccac tcgcagtacc 1020 aatttaacaa tatgtgcttc tacacagtct cctgtacctg ggcaatatga tgctaccaaa 1080 tttaagcagt atagcagaca tgttgaggaa tatgatttgc agtttatttt tcagttgtgt 1140 actattactt taactgcaga tgttatgtcc tatattcata gtatgaatag cagtatttta 1200 gaggattgga actttggtgt tccccccccg ccaactacta gtttggtgga fcacatatcgt 1250 tttgtacaat ctgttgctat tacctgtcaa aaggatgctg caccggctga aaataaggat 1320 ccctatgata agttaaagtt ttggaatgtg gatttaaagg aaaagttttc tttagactta 1380 gatcaatatc cccttggacg taaatttttg gttcagtaa

1419

<2lO> 5 <211> 1419 <212> DNA

<213> SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO hpv 31

<400> 5 atgtctctgt ggcggcctag cgaggctact gtctacttac cacctgtccc agtgtctaaa 60 gttgtaagca cggatgaata tgtaacacga accaacatat attatcacgc aggcagtgct 120 aggctgctta cagtaggcca tccatattat tccatadcta aatctgacaa tcctaaaaaa 180 atagttgtac caaaggtgtc aggattacaa tatagggtat ttagggttcg tttaccagat 240 ccaaacaaat ttggattccc tgatacatct ttttataatc ctgaaactca acgcttagtt 300 tgggcctgtg ttggtttaga ggtaggtcgc gggcagccat taggtgtagg tattagtggt 360 catccattat taaataaatt tgatgacact gaaaactcta atagatatgc cggtggtcct 420 ggcactgata atagggaatg tatatcaatg gattataaac aaacacaact gtgtttactt 430 ggttgcaaac cacctattgg agagcattgg ggtaaaggta gtccttgtag taacaatgct 540 attacccctg gtgattgtcc tccattagaa ttaaaaaatt cagttataca agatggggat 600 atggttgata caggctttgg agctatggat ttfcacfcgctt tacaagacac taaaagtaat 660 gttcctttgg acatttgtaa ttctatttgt aaatatccag attatcttaa aatggttgct 720 gagccatatg gcgatacatt atttttttat ttacgtaggg aacaaatgtt tgtaaggcat 780 ttttttaata gatcaggcac ggttggtgaa toggfccccta ctgacttata tatfcaaaggc 840 tccggttcaa cagctactct agctaacagt acatactttc ctacacctag cggctccatg 900 gttacttcag atgeacaaat ttttaataaa ccatattgga tgcaacgtgc tcagggacac 960 aataatggta tfctgttgggg caatcagtta tttgttactg bggtagatac cacacgtagt 1020 accaatatgt ctgtttgtgc tgcaattgca aacagtgata ctacatttaa aagtagtaat 1080 tttaaagagt atttaagaca tggtgaggaa tttgatttac aatttatatt tcagttatgc 1140 aaaataacat tatctgcaga cataatgaca tatattcaca gtatgaatcc tgctatcttg 1200 gaagattgga attttggatt gaccacacct ccctcaggfcfc ctttggagga tacctatagg 1260 tttgtcacct cacaggccat tacatgtcaa aaaactgccc cccaaaagcc caaggaagat 1320 ccatttaaag attatgtatt Ctgggaggtt aatttaaaag aaaagttttc tgcagattta 1380 gateagtttc cactgggtcg caaattttta ttacagtaa 1419

<2I0> s <211> 1428 <212> DNA

<213> SEQÜÊNCIA PARCIAL L1 DO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO hpv 45

<400> 6

atggctttgt ggcggcctag fcgacagtacg gtatatcttc caccaccttc tgtggccaga 60 gttgtcaaca ctgatgatta tgtgtctcgc acaagcatat tttaccatgc aggcagttcc 120 cgattattaa ctgtaggcaa tccatatfctt agggttgtac ctagtggtgc aggtaataaa 180 caggctgttc ctaaggtatc cgcatatcag tatagggtgt ttagagtagc tttacccgat 240

cctaataaat ttggattacc tgaccctact atatataatc ctgaaacaca acgtttggtt 300 tgggcatgtg taggtatgga aattggtcgt catccatttt ataataaatt ggatgataca acgcaggatg ttagggataa tgtgtcagtt ggttgtgtac ctgctattgg tgagcactgg ttgcagcctg gtgactgtcc fccctttggaa atggtggata caggttatgg ggcaatggat gttccattag acatttgtca atccatctgt gatccctatg gggattctat gtbtttttgc ttttggaata gggcaggtgt tatgggtgac actagcgcta atatgcgtga aacccctggc cctattatta cttctgattc tcaattattt ggccataaca atggtatttg ttggcataat cgcagtacta atttaacatt atgtgcctct cctactaagt fcfcaagcaota tagtagacat cagttgtgca ctattacttt aactgcagag agtatattgg aaaattggaa ttttggtgta acatatcgtt ttgtgcaatc agttgctgtt aagcaggatc catatgataa attaaagttt tccgatttgg atcaatatcc ccttggtcga

gggcagcctt taggtattgg cctaagtggc 360 gaaagtgctc atgcggctac ggctgttgtt 420 gattataagc aaacacagct gtgtatttta 480 gccaagggca cactttgtaa acetgcacaa 540 cttaaaaaca ccattattga ggatgstgafc 600 tttagtacat tgcaggatac aaagtgcgag 660 aaacatccag attatttgca aatgtctgct 720 ctacgccgtg aacaactgtt tgcaagacat 780 acagtaccta cagacctata tattaaaggc 840 agttgtgtgt attccccttc tcccagtggc 900 aataagccat attggttaca taaggcccag 960 cagttgtttg ttactgtagt ggacactacc 1020 acacaaaatc ctgtgccagg tacatatgat 1080 gtggaggaat atgafcttaca gtttatfcttt 1X40 gttatgtcat atatccatag Catgaatagt 1200 cctccaccac ctactacaag tttagtggat 1260 acctgtcaaa aggatactac acctccagaa 1320 tggactgttg acctaaagga aaaattttcc 1380 aagtttttag ttcagtaa 1428

Claims (45)

REIVINDICAÇÕES

1. Vacina de HPV multivalente, caracterizada pelo fato de que compreende proteínas Ll ou fragmentos imunogênicos das mesmas do HPV .16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV oncogênico, em que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um ou mais tipos de HPV selecionado do grupo que consiste do HPV 31, HPV 45 e HPV 52 é omitida(o) da vacina e em que a vacina fornece proteção contra a infecção causada pelo tipo de HPV omitido.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .31 é omitida(o) da vacina.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .45 é omitida(o) da vacina.

4. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .52 é omitida(o) da vacina.

5. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .31 e do HPV 45 é omitida(o) da vacina.

6. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .31 e do HPV 52 é omitida(o) da vacina.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .45 e do HPV 52 é omitida(o) da vacina.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma do HPV .31 e do HPV 45 e do HPV 52 é omitida(o) da vacina.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a vacina protege contra a infecção incidente.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a vacina protege contra a infecção persistente.

11. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o outro tipo de HPV oncogênico é o HPV 33.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o outro tipo de HPV oncogênico é o HPV 58.

13. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o outro tipo de HPV oncogênico é o HPV 59.

14. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína Ll do HPV 16 ou fragmento imunogênico da mesma, a proteína Ll do HPV 18 ou fragmento imunogênico da mesma, proteína Ll do HPV 33 ou fragmento imunogênico da mesma e proteína Ll do HPV 58 ou fragmento imunogênico da mesma.

15. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das proteínas Ll ou fragmentos desta está na forma de uma partícula equivalente a vírus.

16. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma das proteínas Ll é uma proteína Ll truncada.

17. Vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a pelo menos uma proteína Ll é uma proteína Ll truncada no terminal C.

18. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um adjuvante.

19. Vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é um sal de alumínio.

20. Vacina de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é hidróxido de alumínio.

21. Vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é MPL 3D.

22. Vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é MPL 3D e hidróxido de alumínio.

23. Vacina de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é uma emulsão de óleo em água.

24. Vacina de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o adjuvante adicionalmente compreende um sal de alumínio.

25. Método para proteger um paciente contra a infecção causada pelo HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV selecionado do grupo que consiste de HPV 31, HPV 45 e HPV 52, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina como definida na reivindicação 1 em que a vacina fornece proteção contra a infecção causada pelo tipo de HPV omitido.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 31.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 45.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 52.

29. Método para prevenir ou reduzir a freqüência de anormalidades citológicas em um paciente causada pelo HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV selecionado do grupo que consiste de HPV -31, HPV 45 e HPV 52, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina como definida na reivindicação 1 em que a vacina previne ou reduz a freqüência de anormalidades citológicas causadas pelo tipo de HPV omitido.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 52.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 45.

32. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 31.

33. Método para prevenir a formação de lesões CIN histologicamente confirmadas causadas pelo HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV selecionado do grupo que consiste de HPV 315 HPV 45 e HPV 52, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina como definida na reivindicação 1 em que a vacina previne a formação de lesões CIN histologicamente confirmadas causadas pelo tipo de HPV omitido.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 52.

35. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 45.

36. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o tipo de HPV omitido é o HPV 31.

37. Método para prevenir ou reduzir a freqüência de anormalidades citológicas em um paciente causada pelos tipos de HPV oncogênicos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina como definida na reivindicação 1.

38. Método para prevenir a formação de lesões CIN histologicamente confirmadas em um paciente causada pelos tipos de HPV oncogênicos, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a vacina como definida na reivindicação 1.

39. Método para fabricar a vacina como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende combinar proteínas Ll ou fragmentos imunogênicos das mesmas de HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV oncogênico, em que a vacina não compreende uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um ou mais tipos de HPV selecionados do grupo que consiste de HPV 31, HPV 45 e HPV 52.

40. Uso de uma composição que compreende proteínas Ll do HPV 16 e Ll do HPV 18, ou fragmento imunogênico da mesmas, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença causada por um ou mais de: HPV 31, HPV 45 ou HPV 52.

41. Uso de uma vacina que compreende uma proteína Ll do HPV 16, ou fragmento imunogênico da mesma, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença causadas pelo HPV 31, ou HPV 52, ou uma combinação dos mesmos.

42. Uso de uma composição de vacina que compreende uma proteína Ll do HPV 18, ou um fragmento imunogênico da mesma, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para a prevenção de infecção e/ou doença causadas pelo HPV 45.

43. Uso de uma vacina de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a prevenção de anormalidades citológicas ou redução da freqüência de anormalidades citológicas em um indivíduo causadas por um tipo outro que não HPV 16 e HPV 18.

44. Uso de uma vacina ou combinação de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para a prevenção de lesões CIN histologicamente confirmadas (CIN 1, CIN 2, CIN 3) causada por um tipo outro que não HPV 16 e HPV 18.

45. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 40 a 44, caracterizado pelo fato de que a composição que compreende proteínas Ll ou fragmentos imunogênicos das mesmas de HPV 16, HPV 18 e pelo menos um outro tipo de HPV oncogênico, em que uma proteína Ll ou fragmento imunogênico da mesma de um ou mais tipos de HPV selecionados do grupo que consiste de HPV 31, HPV 45 e HPV 52 é omitida(o) da vacina e em que a vacina fornece proteção contra a infecção e/ou doença causadas pelo tipo de HPV omitido.