BRPI0610549A2 - tratamento de pneumonia severa adquirida na comunidade pela administração de inibidor da via de fator tecidual (tfpi) - Google Patents

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BRPI0610549A2
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Abstract

Métodos para tratar profilaticamente ou terapeuticamente pneumonia severa envolvem a administração de inibidor da via de fator tecidual (TFPI) ou um análogo de TFPI a pacientes que sofrem de ou estão em risco de desenvolver essa condição. Os métodos envolvem o uso de infusão intravenosa continua de TFPI ou um análogo de TFPI, preferivelmente em baixas doses para evitar efeitos colaterais adversos.

Description

TRATAMENTO DE PNEUMONIA SEVERA ADQUIRIDA NA COMUNIDADE PELAADMINISTRAÇÃO DE INIBIDOR DA VIA DE FATOR TECIDUAL (TFPI)
Campo da invenção
A presente invenção relaciona-se a um método para otratamento terapêutico de pneumonia severa adquirida nacomunidade. Mais especificamente, ela relaciona-se àadministração de uma proteína inibidora da via de fatortecidual para atenuar vias fisiológicas exuberantes ouamplificadas associadas a pneumonia severa.
Fundamento da invenção
Pneumonia resulta de uma infecção aguda de um ou maiselementos funcionais do pulmão, incluindo espaçosalveolares e tecido intersticial. Nos EUA, cerca de 2milhões de pessoas desenvolvem pneumonia a cada ano e de40.000 a 70.000 dessas pessoas morrem. A pneumonia está emsexto lugar entre todas as categorias de doença como umacausa de morte e é a infecção nosocomial (adquirida emhospital) letal mais comum. Pneumonia adquirida nacomunidade (CAP) tem um impacto significativo sobre oscustos com saúde pública nos Estados Unidos, respondendopor uma estimativa de 14 bilhões de dólares por ano emcustos diretos e $9 bilhões em investimentos perdidos.(Lynch J P, Martinez F J. Pneumonia adquirida nacomunidade. CurrentT Opin Pulm Med. 1998; 4:162-172). Empaíses em desenvolvimento, infecções do trato respiratórioinferior são tipicamente a causa principal de morte ouperde apenas para a diarréia infecciosa. (The Merck Manual,Sec. 6, Ch. 73, Pneumonia, 2000).
A condição conhecida como "pneumonia severa" écaracterizada de acordo com as diretrizes apresentadas porvárias organizações, incluindo a Sociedade TorácicaAmericana (ATS). (Am J Respir Crit Care Med 2001;163:1730-1754). Por exemplo, a ATS requer pelo menos umcritério principal, como a necessidade por ventilaçãomecânica ou choque séptico, além de outros critérios paraum diagnóstico de pneumonia severa. Geralmente, a pneumoniasevera pode resultar de uma doença pulmonar aguda, doençapulmonar inflamatória ou qualquer perturbação na funçãopulmonar devido a fatores como inflamação ou coagulaçao. Umdiagnóstico de CAP severa é baseado em um paciente sendoadmitido em um UTI especificamente para pneumonia.Epidemiologicamente, essa população de pacientes compreendeaproximadamente 10% de todas as admissões na UTI. Ospacientes na UTI com pneumonia têm a mais alta mortalidadedos pacientes com CAP (3 0% a 4 0%) comparado a menos de 15%para os pacientes hospitalizados em geral com CAP.
A cada ano nos Estados Unidos, pneumonia adquirida nacomunidade (CAP) é diagnosticada em aproximadamente 4milhões de adultos, com 600.000 que necessitamhospitalização. Fine e cols., N. Engl. J. Med. 336, 243-50,1997. No geral, a incidência de CAP aumenta com a idade,com a maior prevalência encontrada naqueles com 65 anos oumais. Marston e cols., Arch Intern Med. 1997;157:1709-1718.A incidência também aumenta em pacientes com comorbidades,como doença pulmonar obstrutiva crônica, asma, diabetesmellitus, alcoolismo, imunossupressão, insuficiência renal,doença hepática crônica e doença cardíaca. Marrie, CurrOpin Pulm Med. 1996;2:192-197 ; Niedermann e cols., Am RevRespir Dis. 1993;148:1418-1426.
Pneumonia é a causa principal de morte por infecçãonos Estados Unidos e a sexta causa principal de morte nogeral. A taxa de mortalidade relacionada à pneumoniaaumentou em 22% de 1979 a 1992, com pacientes idosos (de 65anos e mais) respondendo por 8 9% de todas as mortesrelacionadas à pneumonia em 1992. Veja, "Pneumonia andinfluenza death rates" --United States, 1979-1994 [correçãopublicada aparece em MMWR. 1995;44:782]. MMWR. 1995;44:535-53 7. Fine e colegas (1997) relataram que certas doençascoexistentes (doença neoplásica, insuficiência cardíacacongestiva (CHF), doença cerebrovascular, doença renal edoença hepática) e certos achados de exames físicos (estadomental alterado, batimentos cardíacos aumentados, taxarespiratória aumentada, pressão sangüínea sistólicadiminuída e temperaturas anormalmente baixas ou elevadas)são também associadas com mortalidade aumentada relacionadaa CAP. Além disso, CAP tem um impacto significativo sobre aos custos de saúde pública nos Estados Unidos, respondendopor uma estimativa de 14 bilhões de dólares por ano emcustos diretos e $9 bilhões em investimentos perdidos.Lynch & Martinez, Curr Opin Pulm Med. 1998;4:162-172.
Inibidor da via de fator tecidual (TFPI) é umaproteína e um inibidor de serina protease presente emplasma sangüíneo de mamífero. Thomas, Buli. Johns HopkinsHosp. 81, 26 (1947); Schneider, Am. J. Physiol. 149, 123(1947); Broze & Miletich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,1886 (1987). TFPI é também conhecido como inibidor de fatortecidual, inibidor de tromboplastina tecidual, inibidor deFator III, inibidor de da via extrínseca (EPI) e inibidorda coagulação associada à lipoproteína (LACI). O nome"inibidor da via de fator tecidual" (TFPI) foi aceito pela"International Society on Trombose and Hemostasis" em 3 0 dejunho de 1991.
A ativação da coagulaçao sangüínea é a conversão desangue fluido em um gel sólido ou coágulo. Além disso, oconsumo das proteases da coagulaçao leva a um sangramentoexcessivo. O evento principal é a conversão defibrinogênio solúvel a filamentos insolúveis de fibrina,embora a fibrina por si forme apenas 0,15% do coágulosangüíneo total. Essa conversão é a última etapa em umacascata de enzima complexa. Os componentes (fatores) estãopresentes como zimogênios, precursores inativos de enzimasproteolíticas, que são convertidas em enzimas ativas porclivagem proteolítica em locais específicos. A ativação deuma pequena quantidade de um fator catalisa a formação demaiores quantidades do próximo, e assim por diante,resultando em uma amplificação que resulta em uma formaçãoextremamente rápida de fibrina.
Acredita-se que a coagulaçao seja iniciada por dano aovaso que expõe o fator Vila ao fator tecidual (TF) , que éexpresso em células abaixo do endotélio. 0 complexo fatorVIIa-TF cliva a fator X ao fator Xa e cliva o fator IX aofator IXa. O TFPI liga-se ao fator Vila e fator Xa. Ocomplexo formado entre TFPI, fator Vila (com seu TF ligado)e fator Xa inibe formação adicional de fatores Xa e IXa,necessária para homeostasia sustentada. Broze, Jr., Ann.Rev. Med. 46:103 (1995).
A ativação da cascata de coagulaçao por produtosbacterianos, que incluem endotoxinas, introduzidasdiretamente na corrente sangüínea pode resultar em grandedepósito de fibrina nas superfícies arteriais, bem comodepleção de fibrinogênio, protrombina, fatores V e VIII eplaquetas. Além disso, o sistema fibrinolítico é stimulado,resultando em formação adicional de produtos da degradaçãoda fibrina.
Ao mesmo tempo em que a ativação da coagulação éaparentemente iniciada por produtos bacterianos (porexemplo, endotoxina), mecanismos contrários também parecemser ativados por coagulação, ou seja, a ativação do sistemafibrinolítico. Fator XIII ativado converte pró-ativador deplasminogênio, ao ativador de plasminogênio quesubseqüentemente converte plasminogênio a plasmina, dessaforma mediando a lise do coágulo. A ativação de sistemasfibrinolíticos plasmáticos pode, portanto, tambémcontribuir para tendências a sangramento.
Endotoxemia é associada a um aumento nos níveiscirculantes de inibidor de ativador de plasminogêniotecidual (PAT). Esse inibidor inativa rapidamente oativador de plasminogênio tecidual (TPA), dessa formaimpedindo sua capacidade de promover a fibrinólise atravésda ativação de plasminogênio a plasmina. Uma falha nafibrinólise pode causar o depósito de fibrina nos vasossangüíneos, assim contribuindo para a DIC (coagulação intravascular disseminada) associada com choque séptico.
Esforços progressivos têm sido feitos para identificarintervenções satisfatórias para a prevenção ou tratamentode pneumonia severa e coagulopatias associadas. Um agenteque interrompe a via da coagulação não é necessariamenteeficaz como um tratamento terapêutico ou profilático depneumonia severa. Por exemplo, heparina é um anticoagulantecomumente usado, no entanto, o controle do uso de heparinatem sido difícil porque a heparina pode induzir sangramentoexcessivo e atenua as anormalidades da coagulação mas nãooferece um benefício à sobrevivência. Veja, por exemplo,Aoki e cols., "A Comparative Double-BLIND randomized Trialof Activated Protein C and Unfractionated Heparin in theTreatment of Disseminated Intravascular Coagulation", Int.J. Hematol. 75, 540-47 (2002). Vários experimentosclínicos, principalmente em endotoxemia meningocócica emque a DIC fulminante é uma característica proeminente,falharam em demonstrar uma redução de mortalidade em sepsispor tratamento com heparina. Veja, por exemplo, Corrigan ecols., "Heparin Therapy in Septacemia with DisseminatedIntravascular Coagulation. Effect on Mortality and onCorrection of Hemostatic Defects," N. Engl. J. Med. ,283:778-782 (1970); Lasch e cols., Heparin Therapy ofDiffuse Intravascular Coagulation (DIC)", Thrombos.Diathes. Haemorrh., 33:105 (1974); Straub, "A Case AgainstHeparin Therapy of Intravascular Coagulation", Thrombos.Diathes. Haemorrh., 33:107 (1974).
Pacientes propensos a pneumonia adquirida nacomunidade severa são aqueles pacientes com pneumoniaadquirida na comunidade que requerem a admissão a umaUnidade de Terapia Intensiva (UTI). Pacientes com pneumoniaadquirida na comunidade são clinicamente identificados comotendo uma infecção do parênquima pulmonar e/ou confirmadospor via radiográfica e sinais clínicos. Pneumonia severainclui pneumonia adquirida na comunidade severa,tipicamente tem patógenos bem definidos, incluindo S.pneumonae, legionella, H. influenae ou vários bacilos gram-negativos. A maioria dos pacientes com pneumonia adquiridana comunidade severa mora na comunidade entes do episódiode CAP, com apenas cerca de 2 0% admitidos como umatransferência de um hospital, casa de repouso ouhospitalização de longa duração. Pacientes nos EstadosUnidos com CAP severa são cerca de 50% homens e cerca de50% mulheres, mas tendem a ser mais velhos. Cerca de 17%dos pacientes com CAP severa nos Estados Unidos estãoabaixo dos 50; cerca de 24% estão entre 50 e 64 anos; cercade 21% estão entre 65 e 74 anos e cerca de 38% estão cimados 75 anos de idade. A maioria dos pacientes com CAPsevera tem uma ou mais comorbididades significativas.Tipicamente, os pacientes dos EUA com CAP que recebemtratamento na UTI em 2003, têm doença cardíacacorrespondente, COPD/fibrose cística, diabetes, doençarenal, câncer, alcoolismo e/ou são dependentes de drogas.
A administração de ala-TFPI recombinante humano (umanálogo de TFPI) mostrou melhorar as taxas de sobrevivênciaem modelos animais de sepsis. See, por exemplo, PatenteU.S. No. 6.063.764. Como uma proteína endogena, TFPI é bemtolerado. A administração de TFPI por infusão intravenosaou injeção subcutânea mostrou reduzir a capacidade decoagulação, que é manifestada como tempo de protrombinaaumentado (PT) . Em estudos de animais e humanos,prolongamentos do PT foram linearmente relacionados aoaumento do TFPI plasmático. A. A. Creasey, Sepsis 3:173(1999).
Permanece uma necessidade na técnica por abordagens detratamento que inibirão os efeitos letais de pneumoniasevera e que minimizem simultaneamente efeitos colateraispotencialmente sérios.Sumário da invenção
Uma modalidade da presente invenção é um método detratamento ou prevenção de pneumonia severa que compreendea administração de TFPI ou um análogo de TFPI a um pacienteque tem ou está em risco de desenvolver pneumonia severa.
Em algumas modalidades, o paciente tem uma infecçãodemonstravei.
Uma outra modalidade da presente invenção é um métodopara o tratamento de pneumonia severa, que compreende aadministração a um paciente de uma infusão intravenosacontínua de um agente selecionado do grupo que consiste emTFPI ou um análogo de TFPI. Em algumas modalidades, opaciente tem uma infecção demonstrável.
Uma outra modalidade da presente invenção é um métodopara o tratamento ou prevenção de pneumonia severa quecompreende a administração de TFPI ou um análogo de TFPI, aum paciente humano que tem ou está em risco de desenvolverpneumonia severa, em uma quantidade que não induza asangramento excessivo.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido TFPI ou análogo de TFPIé administrado por infusão intravenosa contínua em uma taxade dose equivalente à administração de referência de ala-TFPI em uma taxa de dose de menos que cerca de 2,0mg/kg/hr. Em uma modalidade preferida, a referida taxa dedose é equivalente ã administração de referência de ala-TFPI em uma taxa de dose de cerca de 0,00025 a cerca de2,0, ou alternativamente, de cerca de 0,001 a cerca de 1,75mg/kg/hr. Em uma outra modalidade preferida, a referidataxa de dose é equivalente à administração de referência deala- TFPI em uma taxa de dose de cerca de 0,005 a cerca de1,50 mg/kg/hr. Em uma modalidade mais preferida a referidataxa de dose é equivalente à administração de referência deala-TFPI em uma taxa de dose de cerca de 0,010 a cerca de0,75 mg/kg/hr. Ainda em uma modalidade mais preferida, oreferido TFPI ou o referido análogo de TFPI é administradoem uma taxa de dose equivalente à administração dereferência de ala-TFPI em uma taxa de dose de cerca de 0,2mg/kg/hr a cerca de 0,8 mg/kg/hr. Em uma outra modalidadepreferida, a referida taxa de dose é administrada parafornecer uma dose total equivalente à administração dereferência de ala-TFPI em uma dose total de cerca de 0,024a cerca de 4,8 mg/kg. Em uma outra modalidade preferida, areferida taxa de dose é administrado para fornecer uma dosediária equivalente à administração de referência de ala-TFPI em uma dose diária de pelo menos cerca de 0,006 mg/kge menos que cerca de 1,2 mg/kg.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima, em que o referido TFPI ou análogo deTFPI é administrado por pelo menos 72 horas. Em umamodalidade preferida, o referido TFPI ou análogo de TFPI éadministrado for pelo menos 96 horas.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido análogo de TFPI é ala-TFPI não glicosilado.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido análogo de TFPIcompreende um primeiro domínio de Kunitz que consiste emaminoácidos 19-89 de Id. de Seq. N° : 1. Em uma modalidadepreferida, o referido análogo de TFPI também compreende umsegundo domínio de Kunitz que consiste em aminoácidos 90-160 de Id. de Seq. N°: 1.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido análogo de TFPIcompreende aminoácidos 1-160 de Id. de Seq. N° : 1 ou em queo referido análogo de TFPI compreende um segundo domínio deKunitz que consiste em aminoácidos 90-160 de Id. de Seq.N° : 1.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido TFPI ou análogo de TFPIé preparado a partir de uma composição liofilizada quecompreende TFPI ou um análogo de TFPI.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido TFPI ou análogo de TFPIé administrado como uma formulação que compreende arginina.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido TFPI ou análogo de TFPIé administrado como uma formulação que compreende citrato.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima em que o referido TFPI ou análogo de TFPItem uma concentração de cerca de 0,15 mg/ml em umaformulação que compreende cerca de 3 00 mM de cloridrato dearginina e cerca de 2 0 mM de citrato de sódio e que tem umpH de cerca de 5,5.
Outras modalidades incluem qualquer uma dasmodalidades acima, que também compreende a administração aomesmo tempo que, ou em 24 horas da administração doreferido TFPI ou análogo de TFPI, de um agente adicionalselecionado do grupo que consiste em um antibiótico, umanticorpo, um antagonista de endotoxina, um análogo defator tecidual que tem atividade anticoagulante, umimunoestimulante, um bloqueador de adesão celular,heparina, proteína BPI, um antagonista de IL-1, pafase(inibidor da enzima PAF), um inibidor de TNF, um inibidorde IL-6, e um inibidor do complemento. Em uma modalidadepreferida, o referido agente adicional é um anticorpo quese liga especificamente a um antígeno selecionado do grupoque consiste em TNF, IL-6, e M-CSF.
Modalidades adicionais da presente invenção sãoaparentes em vista dos desenhos de referência abaixo juntocom a descrição detalhada.
Descrição detalhada da invenção
A administração de TFPI ou análogos de TFPI é eficazna profilaxia e tratamento de pneumonia severa.administração de baixa dosagem contínua de TFPI ou análogosde TFPI (aqui "administração de baixa dose de TFPI") tambémé eficaz na profilaxia e tratamento de pneumonia severa. Aadministração de TFPI ou análogo de TFPI, particularmente,administração de baixa dose, inibe ou atenua inflamaçãoaguda ou crônica, particularmente pneumonia severa. Quandoa administração de baixa dose de TFPI é continuada por pelomenos três dias, o risco de morte por pneumonia severa éreduzido, enquanto a taxa de complicações de efeitoscolaterais adversos, particularmente distúrbios desangramento, pode ser minimizada. Uma vantagem adicional daadministração de baixa dose de TFPI é evitar os efeitos detolerância que, em doses suficientemente altas, podereduzir a concentração plasmática de TFPI. Efeitos detolerância são estimulados até a metade do Máximo em umaconcentração plasmática de TFPI de cerca de 850 ng/ml,enquanto com administração de baixa dose de TFPI os níveisplasmáticos geralmente ficam abaixo de 500 ng/ml.
Administração de baixa dose de TFPI geralmente é realizadapor infusão intravenosa contínua of TFPI ou um análogo deTFPI.
TFPI e análogos de TFPI
"TFPI" como aqui usado refere-se a glicoproteínamadura sérica que tem a seqüência de 276 resíduos deaminoácidos mostrada no Id. de Seq. N° : 1 e um pesomolecular de cerca de 38.000 Daltons. Ele é um inibidornatural da atividade de fator tecidual e assim da ativaçãoda coagulaçao. A Patente U.S. No. 5.110.73 0 descreve fatortecidual (TF), e a Patente U.S. No. 5.106.833 descreveTFPI. A clonagem do cDNA de TFPI é descrita em Wun e cols.,Patente u:s. No. 4.966.852. TFPI é um inibidor de proteasee tem 3 domínios de Kunitz, dois dos quais são conhecidospor interagir com fatores VII e Xa respectivamente. Afunção do terceiro domínio permanece desconhecida.
Acredita-se que TFPI funcione in vivo para limitar ainiciação da coagulaçao por formação de um complexo inerte,fator X quaternário.sub.a:TFPI:fator VII.sub.a:fatortecidual. Veja, revisões por Rapaport, Blood 73:359-365(1989) e Broze e cols., Biochemistry 29:7539-7546 (1990).Várias das características estruturais de TFPI podem serdeduzidas de sua homologia com outros inibidores deprotease bem estudados. TFPI não é uma enzima, assim eleprovavelmente inibe seu alvo de protease em uma maneiraestoiquiométrica, ou seja, um dos domínios de Kunitz deTFPI inibe uma molécula de protease. Preferivelmente, osdomínios de Kunitz 1 e/ou 2 estarão presentes em moléculasde TFPI da atual invenção, a função do domínio 3 de Kunitzé desconhecida.
Um "análogo de TFPI" é um derivado de TFPI modificadocom uma ou mais adições ou substituições de aminoácido(geralmente conservadoras em natureza) , uma ou maisdeleções de aminoácidos (por exemplo, fragmentos de TFPI)ou a adição de uma ou mais porções químicas a um ou maisaminoácidos, desde que as modificações não destruam aatividade biológica de TFPI. Métodos para fazer análogos depolipeptídeos são conhecidos na técnica e são descritosadicionalmente abaixo. Um análogo preferido de TFPI é N-L-alanil-TFPI (ala-TFPI), cuja seqüência de aminoácidos émostrada no Id. de Seq. N° : 2. Os análogos de TFPI possuemalguma medida da atividade de TFPI como determinado por umensaio de bioatividade como abaixo descrito, um ensaio debioatividade preferido para TFPI e análogos é o ensaio detempo de protrombina (PT) (veja abaixo).
TFPI e análogos de TFPI podem ser glicosilados ou nãoglicosilados. Análogos de TFPI são descritos na PatenteU.S. N° : 5.106.833. Ala-TFPI é um análogo de TFPI quetambém é conhecido sob o nome internacional de medicamento"tifacogin." Ala-TFPI inclui a seqüência de aminoácidosinteira de TFPI humano maduro, de comprimento total mais umresíduo adicional de alanina no terminal amino. 0 resíduode alanina de terminal amino de ala-TFPI foi projetado naseqüência de TFPI para melhorar a expressão de E. coli epara efetuar a clivagem do que seria, de outra forma, umresíduo de metionina de terminal amino. Veja a Patente U.S.N°: 5.212.091.
Análogos de TFPI particularmente preferidos incluemsubstituições que são conservadoras em natureza, ou seja,aquelas substituições que ocorrem em uma família deaminoácidos que estão relacionados em suas cadeiaslaterais. Especificamente, os aminoácidos são geralmentedivididos em quatro famílias: (1) ácidos - aspartato eglutamato; (2) básicos- lisina, arginina, histidina; (3)não polares - alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenilalanina, metionina, triptofano; e (4) polaresnão carregados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína,serina, treonina e tirosina. Fenilalanina, triptofano etirosina são algumas vezes classificados como aminoácidosaromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que umasubstituição isolada de leucina com isoleucina ou valina,um aspartato com glutamato, uma treonina com serina, ou umasubstituição conservadora similar de um aminoácido com umaminoácido estruturalmente relacionado, não terá um grandeefeito sobre a atividade biológica. Por exemplo, opolipeptídeo de interesse pode incluir até cerca de 1-70substituições conservadoras ou não conservadoras deaminoácido, como 1, 2, 3, 4, 5, 6-50, 15-25, 5-10, ouqualquer número inteiro de 1 a 70, desde que a funçãodesejada da molécula permaneça intacta. Uma pessoahabilitada na técnica pode determine facilmente regiões damolécula de interesse que podem ser modificadas com umaprobabilidade razoável de reter a atividade biológica comoaqui definido.
"Homologia" refere-se ao percentual de similaridadeentre dois polinucleotídeos ou duas porções depolipeptídeo. Duas seqüências de polipeptídeos são"substancialmente homólogos" uma ao outros quando asseqüências exibem pelo menos cerca de 50% , preferivelmentepelo menos cerca de 75%, mais pref erivelmente pelo menoscerca de 80%-85%, preferivelmente pelo menos cerca de 90% eainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%-98% dehomologia de seqüência ou qualquer percentual de homologiaentre as faixas especificadas, por um comprimento definidodas moléculas. Como aqui usado, "substancialmentehomólogos" também referem-se a seqüências que mostramidentidade completa à seqüência de polipeptideosespecificada.
Em geral, "identidade" refere-se a uma correspondênciaexata aminoácido-para-aminoácido de duas seqüências depolipeptideos, respectivamente. O percentual de identidadepode ser determinado por uma comparação direta dainformação de seqüência entre duas moléculas poralinhamento das seqüências, contagem do número exato decombinações entre as duas seqüências alinhadas, divisãopelo comprimento da seqüência mais curta e multiplicação doresultado por 100.
Preferivelmente, análogos de TFPI de ocorrêncianatural ou não natural têm seqüências de aminoácidos quesão pelo menos 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% ou mais homólogasa derivado de TFPI de Id. de Seq. N° : 1. Maispreferivelmente, as moléculas são 98% ou 99% homólogas. Opercentual de homologia é determinado com o uso doalgoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman queusa uma pesquisa de intervalo afim com uma penalidade deintervalo aberto de 12 e uma penalidade de extensão deintervalo de 2 e uma matriz BLOSUM de 62. O algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman é ensinado em Smithe Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482-489.
A atividade biológica de TFPI e análogos de TFPI podeser determinada pelo ensaio de protrombina. Ensaios deprotrombina adequados são descritos na Patente U.S. N° :5.888.968 e em WO 96/40784. De forma breve, o tempos deprotrombina pode ser determinado com o uso de umcoagulômetro (por exemplo, Coag-AMate MTX II de OrganonTeknika). Um tampão de ensaio adequado é 100 mM NaCl, 50 mMTris ajustado ao pH 7,5, contendo 1 mg/ml albumina bovinasérica. Reagentes adicionais necessários são plasma normalhumano (por exemplo, "Verify 1" por Organon Teknika),reagente de tromboplastina (por exemplo, "Simplastin Excel"por Organon Teknika), e solução padrão de TFPI (porexemplo, 20 mu.g de 100% ala-TFPI puro (ou equivalentedesse) por ml de tampão de ensaio) . Uma curva padrão éobtida por análise do tempo de coagulaçao de uma série dediluições da solução padrão de TFPI, por exemplo, atéconcentrações finais que variam de 1 a 5 mu.g/ml. Para adeterminação do tempo de coagulaçao, a amostra ou padrão deDTI é primeiramente diluída no tampão de ensaio. Entãoplasma normal humano é adicionado. A reação de coagulaçao éiniciada pela adição de reagente de tromboplastina. Oinstrumento então registra o tempo de coagulaçao. Uma curvapadrão de TFPI linear é obtida de um gráfico de log detempo de coagulaçao vs. log de concentração de TFPI. Acurva padrão é ajustada baseado na pureza do padrão TFPIpara corresponder à concentração de TFPI equivalente de umpadrão 100% puro. Por exemplo, se o padrão é uma preparaçãode ala-TFPI que é 97% bioquimicamente pura (ou seja, elacontém 3% em peso da espécie molecular sem atividadebiológica de DTI), então a concentração de cada diluição dopadrão é multiplicada por 0,97 para dar a concentração realde TFPI. Assim, um padrão de TFPI que é 1,0 .mu. g/mlbaseado no peso real por ml de uma preparação que é 97%pura será equivalente a, e tratado como, uma concentraçãode 1,0.vezes.0,97, ou 0,97 .mu.g/ml.Obtenção de TFPI e Análogos de TFPI
TFPI e análogos de TFPI usados nos métodos da invençãopodem ser isolados e purificados de células ou tecidos,quimicamente sintetizados ou produzidos de formarecombinante em células procarióticas ou eucarióticas.
TFPI pode ser isolado por vários métodos. Por exemplo,células que secretam TFPI incluem células endoteliaisidosas, células endoteliais jovens que foram tratadas com
TNF por cerca de 3 a 4 dias, hepatócitos, e células dehepatoma. TFPI pode ser por métodos convencionais, queincluem os métodos cromatográficos de Pedersen e cols.,1990, J. Biol. Chem. 265, 16786-93, Novotny e cols., 1989,J. Biol. Chem. 264, 18832-37, Novotny e cols., 1991, Blood78, 394-400, Wun e cols., 1990, J. Biol. Chem. 265, 16096-101, e Broze e cols., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84,1886-90. TFPI aparece na corrente sangüínea e pode serpurificado do sangue, veja Pedersen e cols., 1990.
Um TFPI ou variante de TFPI pode ser produzido usandométodos químicos para sintetizar sua seqüência deaminoácido, tal como por síntese direta de peptídeo usandotécnicas de fase sólida (Merrifield, J". Am. Chem. Soe. 85,2149-2154, 1963; Roberge e cols., Science 269, 202-204,1995) . A síntese de proteína pode ser realizada usandotécnicas manuais ou por automação. Síntese automatizadapode ser obtida, por exemplo, usando Sintetizador dePeptídeo "Applied Biosystems" 431A (Perkin Elmer).Opcionalmente, fragmentos de TFPI ou variantes de TFPIpodem ser sintetizados separadamente e combinados usandométodos químicos para produzir uma molécula de comprimentototal.
TFPI e análogos de TFPI podem ser produzidos de formarecombinante como mostrado na Pat. U.S. No. 4.966.852. Porexemplo, o cDNA para a proteína desejada pode serincorporado em um plasmídeo para expressão em procariotasou eucariotas. A Pat. U.S. No. 4.847.201 fornece detalhespara a transformação de microorganismos com seqüências deDNA específicas e para expressá-las. Há muitas outrasreferências conhecidas por aqueles de habilidade comum natécnica que fornecem detalhes na expressão de proteínasusando microorganismos. Muitas dessas estão citadas na Pat.U.S. No. 4.847.201, tal como Maniatas e cols., 1982,Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press.
Uma variedade de técnicas está disponível paratransformação de microorganismos e para usá-los paraexpressar TFPI e análogos de TFPI. As seguintes sãomeramente exemplos de abordagens possíveis. Seqüências deDNA de TFPI devem ser isoladas e conectadas às seqüênciasde controle apropriadas. Seqüências de DNA de TFPI sãomostradas na Pat. U.S. No. 4.966.852 e podem serincorporadas em um plasmídeo, tal como pUNC13 ou pBR3822,que estão comercialmente disponíveis por companhias talcomo Boehringer-Mannheim. Uma vez que o DNA de TFPI estejainserido em um vetor, ele pode ser clonado em um hospedeiroadequado. O DNA pode ser amplificado por técnicas tais comoaquelas mostradas na Pat. U.S. No. 4.683.202 para Mullis ePat. U.S. No. 4.683.195 para Mullis e cols. cDNA de TFPIpode ser obtido pela indução de células, tais como célulasde hepatoma (tais como HepG2 e SKHep) para fazer mRNA deTFPI, então identificação e isolamento do mRNA etranscrevendo-se de forma reversa para obter cDNA paraTFPI. Após o vetor de expressão ser transformado em umhospedeiro tal como E. coli, as bactérias podem serfermentadas e a proteína expressa. Bactérias sãomicroorganismos procarióticos preferidos e E. coli éespecialmente preferida. Um microorganismo preferido útilna presente invenção é E. coli K-12, cepa MM294 depositadacom a ATCC em 14 de fevereiro de 1984 (No. de Acesso39607), sob as disposições do Tratado de Budapeste.
Também é possível, evidentemente, expressar genes quecodificam polipeptídeos em culturas de células hospedeiraseucarióticas derivadas de organismos multicelulares. Veja,por exemplo, Tissue Culture, 1973, Cruz e Patterson, eds. ,Academic Press. Linhas de células de mamíferos úteisincluem mielomas murídeos N51, VERO, células HeLa, célulasde ovário de hamster chinês (CHO) , COS, C127, Hep G2, e SKHep. TFPI e análogos de TFPI também podem ser expressos emcélulas de inseto infectadas com baculovírus (veja tambémPat. U.S. Nos. 4.847.201, acima referida). Veja, tambémPedersen e cols., 1990, J". of Biological Chemistry, 265:16786-16793. Vetores de expressão para células eucarióticasincluem normalmente seqüências promotoras e de controlecompatíveis com células de mamíferos tais como, porexemplo, os promotores precoces e tardios comumente usadosdo Vírus Símio 40 (SV40) (Fiers, e cols., 1978, Nature,273: 113), ou outros promotores virais tais como aquelesderivados de polioma, Adenovírus 2, vírus do papilomabovino, ou vírus do sarcoma aviário, ou promotores deimunoglobulina e promotores de choque de calor. Aspectosgerais de transformações de sistema hospedeiro de célula demamífero foram descritos por Axel, Pat. U.S. No. 4.399.216.
Agora também parece que regiões "intensificadoras" sãoimportantes na otimização da expressão; essas são,geralmente, seqüências encontradas acima da regiãopromotora. Origens de replicação podem ser obtidas , senecessárias, de fontes virais. No entanto, integração nocromossomo é um mecanismo comum para replicação de DNA emeucariotas. Células de planta também estão disponíveis comohospedeiros, e seqüências de controle compatíveis comcélulas de plantas tais como seqüências promotoras e desinal de poliadenilação de nopalina sintase (Depicker, A.,e cols., 1982, J. Mol. Appl. Gen.,1: 561) estãodisponíveis. Métodos e vetores para transformação decélulas de plantas foram revelados em WO 85/04899.
Métodos que podem ser usados para purificação de TFPIe análogos de TFPI expressos em células de mamíferosincluem aplicação seqüencial de cromatografia HPLC de fasereversa, heparina-Sefarose, MonoQ, MonoS. Veja, Pedersen ecols., supra; Novotny e cols., 1989, J". Biol. Chem. 264:18832-18837; Novotny e cols., 1991, Blood, 78: 394-400; Wune cols., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16096-16101; Broze ecols., 1987, PNAS (USA), 84: 1886-1890; Pat. U.S. No.5.106.833; e Patente U.S. No. 5.466.783. Essas referênciasdescrevem vários métodos para a purificação de TFPIproduzido por mamíferos.TFPI também pode ser expresso como uma proteínaglicosilada recombinante usando hospedeiros de célula demamífero, incluindo células de camundongo C127 (Day ecols., Blood 76, 1538-45, 1990), células de rim de filhotede hamster ( Pedersen e cols., 1990), células de ovário dehamster chinês e células de hepatoma humano SK. TFPI deC127 foi usado em estudos animais e mostrou-se eficaz nainibição de coagulação intravascular induzida por fatortecidual em coelhos (Day e cols., supra), na prevenção dere-oclusão arterial após trombolise em cachorros (Haskel ecols., Circulation 84: 821-827 (1991)), e na redução demortalidade em um modelo de sépsis de E. coli em babuínos(Creasey e cols., J. Clin. Invest. 91: 2850 (1993)). Ala-TFPI pode ser expresso como uma proteína recombinante nãoglicosilada com o uso de células hospedeiras de E. coli.Foram descritos métodos que produzem um alaTFPI byaltamente ativo por reformatação in vitro da proteínarecombinante produzida em E. coli. See, por exemplo, WO96/40784.
TFPI e análogos de TFPI também podem ser produzidos embactérias ou levedura e subseqüentemente purificados.Geralmente, os procedimentos mostrados nas Pats. U.S. Nos.5.212.091; 6.063.764; e 6.103.500 ou WO 96/40784 podem serempregados. Ala-TFPI e outros análogos de TFPI podem serpurificados, solubilizados, e reformatados de acordo com WO96/40784 e Gustafson e cols., Prot. Express. Pur. 5: 233(1994), que são aqui incorporados por referência. Porexemplo, quando preparadas de acordo com o Exemplo 9 de WO96/40784, podem ser obtidas preparações de ala-TFPI quecontêm de cerca de 85% a 90% da proteína total por pesocomo ala-TFPI maduro, adequadamente formatado,biologicamente ativo, cerca de 10% a 15% do qual tem um oumais resíduos oxidados de metionina. Essas formas oxidadastêm atividade biológica que é equivalente à atividadebiológica de ala-TFPI não-derivada, como determinado porensaio de protrombina e espera-se que sejam ativas nainvenção aqui revelada. O material restante compreendevárias formas modificadas de ala-TFPI, incluindo formasdimerizadas, agregadas e acetiladas.
TFPI e análogos de TFPI podem ter um númerosignificativo de resíduos de cisteína e o procedimentomostrado na Pat. U.S. No. 4.929.700 é relevante parareformatação de TFPI. TFPI e análogos podem ser purificadosa partir da solução tampão por vários métodoscromatográficos, tais como aqueles acima mencionados. Sedesejado, podem ser empregados os métodos mostrados na Pat.U.S. No. 4.92 9.700. Qualquer método pode ser empregado parapurificar TFPI e análogos de TFPI que resultem em um graude pureza e um nível de atividade adequado paraadministração a humanos.
Métodos e Composições Terapêuticos
Geralmente, TFPI e análogos de TFPI são úteis paratratar ou prevenir aquelas doenças que ocorrem devido àsupra-regulação de fator tecidual e dessa forma atividadede TF causada por TNF, IL-1 ou outras citocinas. Aadministração de TFPI, e particularmente administração dedose baixa de TFPI, pode diminuir a concentração decitocinas, como IL-6 em um paciente. A administração dedose baixa de TFPI é útil para o tratamento de inflamação eanormalidades da coagulação, geralmente, incluindo tantocondições inflamatórias agudas quanto crônica como apneumonia severa.
"Pneumonia severa" é definida de acordo com asdiretrizes estipuladas pela "American Thoracic Society".
Especificamente, a pneumonia severa requer um diagnósticode pneumonia e a existência de a) um ou dois critériosprincipais, b) dois ou três critérios menores, ou c) doisdos quatro critérios da "British Thoracic Society" (Thorax2001; 56 [suppl IV] :l-64) . Os critérios principais são 1)necessidade por ventilação mecânica e 2) choque séptico ounecessidade por pressores por >4 horas. Os critériosmenores são 1) pressão sangüínea sistólica < 90 mmHg, 2)pneumonia multilobar, e 3) critérios de hipoxemia(Pa02/Fi02) < 250. Os critérios da "British ThoracicSociety" são 1) taxa respiratória 3 0 respirações/minuto, 2)pressão sangüínea diastólica.ltoreq.60 mmHg, 3) nitrogêniode uréia sangüínea (BUN) > 7,0 mM (> 19,6 mg/dL) e 4)confusão. Como é entendido na técnica, o critério dehipoxemia (Pa02/Fi02) refere-se à pressão parcial deoxigênio arterial para a fração de oxigênio inspirado eindica o nível de falha na troca de gás.
Preferivelmente, pacientes com pneumonia severa têmuma infecção demonstrável por qualquer meio conhecido natécnica. Esses métodos incluem, mas não são limitados a,detecção de um organismo patogênico em uma cultura desangue ou outro fluido ou tecido corporal normalmenteestéril, por exemplo, por coloração de GRAM, cultura,coloração histoquímica, ensaio imunoquímico, ou ensaios deácido nucleico. Uma infecção demonstrável também pode serevidenciada por uma radiografia de tórax consistente com umdiagnóstico de pneumonia que constitui a razão para terapiasistêmica antiinfecciosa, bem como qualquer sintoma clínicode infecção, incluindo, sem limitação, um aumento na taxarespiratória rate>=30/min ou PaCO2/FiO2<250, uma diminuiçãona pressão sangüínea e um aumento na temperatura corporal.Formulações de TFPI e análogos de TFPI
As formulações de TFPI e análogos de TFPI sãopreferivelmente administradas por infusões intravenosas.Essencialmente, a infusão intravenosa contínua é preferida.
Métodos para se obter essa administração são conhecidos poraqueles de habilidade comum na técnica. A infusão pode serrealizada por meio de uma linha central ou uma linhaperiférica. Embora grandes flutuações na taxa de dose devamser evitadas, desvios de curto prazo das taxas de dose dainvenção são aceitáveis, desde que o nível plasmáticoresultante de TFPI administrado esteja dentro de 20%daquele esperado a partir de uma infusão contínua em umataxa de dose constante de acordo com as modalidadespreferidas da invenção.
Antes da administração a pacientes, pode seradicionado formulador ao TFPI e análogos de TFPI. Umaformulação líquida é preferida. TFPI e análogos de TFPIpodem ser formulados em concentrações diferentes, usandodiferentes formuladores, e em qualquer pH fisiologicamenteadequado compatível com a via de administração,solubilidade, e estabilidade da proteína de TFPI. Umaformulação preferida para infusão intravenosa inclui ala-TFPI em até cerca de 0,6 mg/mL, cloridrato de arginina ematé 300 mM, e tampão de citrato de sódio em pH 5,0-6,0.
Certos solutos tais como arginina, NaCl, sacarose e manitolservem para solubilizar e/ou estabilizar ala-TFPI. Veja, WO96/40784. Uma formulação especialmente preferida parainfusão intravenosa contém cerca de 0,15 mg/mL de ala-TFPI,300 mM de hidrocloreto de arginina, e 20 mM de citrato desódio em pH 5,5. TFPI e análogos de TFPI também podem serformulados em concentrações de até cerca de 0,15 mg/mL em15 0 mM de NaCl e 20 mM de fosfato de sódio ou outro tampãoem pH 5,5-7,2, opcionalmente com 0,005% ou 0,01% (p/v)polissorbato 80 (Tween 80). Outras formulações contêm atécerca de 0,5 mg/mL de TFPI, ou análogo de TFPI em 10 mM deacetato de sódio em pH 5,5 contendo 150 mM de NaCl, 8%(p/v) de sacarose, ou 4,5% (p/v) de manitol. TFPI eanálogos de TFPI também podem ser formulados emconcentrações maiores de até vários mg/mL usando sal alto.
Por exemplo, uma formulação contém até cerca de 6,7 mg/mLde ala-TFPI em 500 mM de NaCl e 20 mM de fosfato de sódioem pH 7,0. Em adição, a formulação de TFPI pode contermetionina, preferivelmente em uma faixa de cerca de 1 acerca de 10 mM de metiona.
Uma modalidade preferida de uma formulação de TFPI éala-TFPI em cerca de 0,1 a cerca de 0,7 mg/ml, 200 a 500 mML-arginina, 1 a 7 mM metionina, 5 a 50 mM de tampão decitrato de sódio em pH 5,0-6,0. Uma modalidade preferida deuma formulação de TFPI é ala-TFPI em cerca de 0,1 a cercade 0,5 mg/ml, 250 a 400 mM L-arginina, 3 a 6,5 mMmetionina, 15 a 30 mM de tampão de citrato de sódio em pH5,0-6,0. Em uma modalidade preferida de uma formulação deTFPI contém ala-TFPI em cerca de 0,15 mg/ml, Cloridrato deL-arginina em cerca de 3 00 mM, 5 mM metionina, 2 0 mM detampão de citrato de sódio em pH 5,5. Uma outra modalidadepreferida de uma formulação de TFPI contém ala- TFPI emcerca de 0,4 5 mg/ml, Cloridrato de L-arginina em cerca de3 00 mM, 5 mM metionina, 20 mM de tampão de citrato de sódioem pH 5,5.
Exemplos adicionais de formulador para TFPI e análogosde TFPI incluem óleos, polímeros, vitaminas, carboidratos,aminoácidos, sais, tampões, albumina, tensoativos, ouagentes de volume. Preferivelmente carboidratos incluemaçúcar ou álcoois de açúcar tais como mono, di, oupolissacarídeos, ou glicanos hidrossolúveis. Os sacarídeosou glicanos podem incluir frutose, dextrose, lactose,glicose, manose, sorbose, xilose, maltose, sacarose,dextrana, pululana, dextrina, alfa e beta ciclodextrina,amido solúvel, amido de hidroxetil e carboximetilceluloseou misturas desses. Sacarose é o mais preferido. Álcool deaçúcar é definido como um hidrocarboneto de C4 a C8 que temum grupo -0H e inclui galactitol, inositol, manitol,xilitol, sorbitol, glicerol, e arabitol. Manitol é maispreferido. Esses açúcares ou álcoois de açúcar mencionadosacima podem ser usados individualmente ou em combinação.
Não há limite fixo para a quantidade usada, desde que oaçúcar ou álcool de açúcar seja solúvel na preparaçãoaquosa. Preferivelmente, a concentração de açúcar ou álcoolde açúcar está entre 1,0 p/v % e 7,0 p/v %, mais preferívelentre 2,0 e 6,0 p/v %.
Preferivelmente aminoácidos incluem formaslevorrotatórias (L) de carnitina, arginina, e betaína; noentanto, outros aminoácidos podem ser adicionados.
Polímeros preferidos incluem polivinilpirrolidona (PVP) comum peso molecular médio entre 2.000 e 3.000, ou polietilenoglicol (PEG) com um peso molecular médio entre 3.000 e5.000. Também é preferível usar um tampão na composiçãopara minimizar mudanças de pH na solução antes daliofilização ou após reconstituição. A maioria dos tampõesfisiológicos pode ser usada, mas tampões de citrato,fosfato, succinato e glutamato ou misturas desses sãopreferidos. Preferivelmente, a concentração do tampão é de0,01 a 0,3 molar. Tensoativos que podem ser adicionados àformulação são mostrados em EP Nos. 270.799 e 268.110.
Adicionalmente, TFPI e análogos de TFPI podem sermodificados quimicamente, por exemplo, por conjugaçãocovalente a um polímero para aumentar sua meia-vidacirculante. Polímeros e métodos preferidos para aderi-losaos peptídeos são ensinados nas Pats. U.S. Nos. 4.766.106,4.179.337, 4.495.285, e 4.609.546. polímeros preferidos sãopolióis oxietilados e polietileno glicol (PEG). PEG ésolúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmulageral: R (O--CH2--CH2) n-0--R onde R pode ser hidrogênio, ouum grupo de proteção tal como um grupo alquil ou alcanol.
Preferivelmente, o grupo de proteção tem entre 1 e 8carbonos, mais preferivelmente ele é metil. O símbolo n éum número inteiro positivo, preferivelmente entre 1 e1.000, mais pref erivelmente entre 2 e 500. O PEG tem umpeso molecular médio preferido entre 1.000 e 40.000, maispreferivelmente entre 2.000 e 20.000, mais preferivelmenteentre 3.000 e 12.000. Pref erivelmente, PEG tem pelo menosum grupo hidroxi, mais pref erivelmente ele é um grupohidroxi terminal. Ele é um grupo hidroxi que épreferivelmente ativado para reagir com um grupo aminolivre no inibidor. No entanto, será compreendido que o tipoe quantidade dos grupos reativos podem ser variados para seobter um PEG/TFPI conjugado de forma covalente da presenteinvenção.
Polióis polioxietilados hidrossolúveis também sãoúteis na presente invenção. Eles incluem sorbitolpolioxietilado, glicose polioxietilada, glicerol (POG)polioxietilado etc. POG é preferido. Uma razão é que aestrutura central de glicerol de glicerol polioxietilado éa mesma estrutura central de ocorrência natural em, porexemplo, animais e humanos em mono-, di-, triglicerideos.
Portanto, essa ramificação não seria observadanecessariamente como um agente estranho no corpo. O POG temum peso molecular preferido na mesma faixa que PEG. Aestrutura para POG é mostrada em Knauf e cols., 1988, J.Bio. Chem. 263: 15064-15070, e uma discussão de conjugadosPOG-proteína é encontrada na Pat. U.S. No. 4.766.106.
Após a composição farmacêutica líquida de TFPI ou umanálogo de TFPI ser preparada, ela pode ser liofilizadapara evitar degradação e para preservar esterilidade.
Métodos para a liofilização de composições líquidas sãoconhecidos por aqueles de habilidade comum na técnica.
Imediatamente antes do uso, a composição pode serreconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer,água destilada, ou solução salina estéril, por exemplo) quepode incluir ingredientes adicionais. Mediantereconstituição, a composição é preferivelmente administradaaos indivíduos por infusão intravenosa contínua.Dosagens de TFPI e análogos de TFPI
TFPI ou análogos de TFPI são administrado em umaconcentração que é terapeuticamente eficaz para tratar eprevenir a pneumonia severa. Tais doses são também eficazespara outras inflamações agudas ou crônicas, e geralmentedoenças nas quais as citocinas suprarregulam a expressão defator tecidual. Para realizar isso, TFPI ou análogos deTFPI são preferivelmente administrados por via intravenosa.Métodos para realizar essa administração são conhecidos poraqueles habilitados na técnica. Geralmente, TFPI ouanálogos de TFPI são dados em uma dose entre 1 )-ig/kg e 3 0mg/kg, mais pref erivelmente entre 20 |ag/kg e 25 mg/kg, maispreferivelmente entre 1 e 15 mg/kg.
As dosagens acima são geralmente administradas por umperíodo de pelo menos cerca de 150 horas, e preferivelmentepor um período de pelo menos cerca de 100 horas. Em umamodalidade, a administração de TFPI é continuada por cercade 99 a cerca de 90 horas, preferivelmente por cerca de 97a cerca de 94 horas e mais preferivelmente, por cerca de 96horas. A dose diária total administrada a um hospedeiro emdoses únicas ou divididas pode ser em quantidades, porexemplo, de cerca de 2 a cerca de 20 mg/kg de peso corporaldiariamente e pref erivelmente de cerca de 2 a cerca de 15mg/kg de peso corporal diariamente de cerca de 4 a cerca de10 mg/kg. Composições de dosagem unitária podem conter taisquantidades ou submúltiplos dessas para construir a dosediária. Quantidades menores de dosagem diária podem serúteis para objetivos profiláticos ou para outros objetivos,por exemplo, de 1 ^g/kg a 2 mg/kg. A quantidade deingrediente ativo que pode ser combinado com os materiaistransportadores para produzir uma forma de dosagem únicairá variar dependendo do paciente tratado e do modoparticular de administração.O regime de dosagem é selecionado de acordo com váriosfatores, incluindo o tipo, idade, peso, sexo, dieta econdição médica do paciente, a severidade da condição, avia de administração, considerações farmacológicas como aatividade, eficácia, perfis de farmacocinética e detoxicologia, se um sistema de liberação de medicamento éutilizado e se o composto é administrado como parte de umacombinação medicamentosa. Portanto, o regime de dosagemrealmente empregado pode variar amplamente e, dessa forma,pode desviar do regime de dosagem preferido acimaapresentado. Preferivelmente, a doses de TFPI ou análogosde TFPI não deve exceder uma taxa de dose equivalente àtaxa de dose de ala-TFPI de cerca de 0,66 mg/kg/hr.
Administração de baixa dose
Quando TFPI ou um análogo de TFPI é dado em uma taxade dose equivalente à administração de ala-TFPI em uma taxade dosagem de pelo menos cerca de 0,00025 mg/kg/hr (0,00417ug/kg/min) e menos que cerca de 2,00 mg/kg/hr (0.833ug/kg/min) a eficácia no tratamento de pneumonia severa éretida e os efeitos colaterais adversos, como sangramento,são minimizados. Em uma modalidade preferida, ala-TFPI éadministrado em uma taxa de dose de pelo menos entre cercade 0,02 mg/kg/hr a cerca de 1,0 mg/kg/hr, maispreferivelmente entre cerca de 0,24 mg/kg/hr a cerca de 0,8mg/kg/hr. Para melhor eficácia e segurança combinadas, ataxa de dosagem preferivelmente é equivalente a uma taxa dedose de ala-TFPI de referência de pelo menos cerca de 0,010mg/kg/hr (0,167 }Kj/kg/min) e menos que cerca de 0,045mg/kg/hr (0.833 |ag/kg/min) , ou equivalente a uma taxa dedosagem de ala-TFPI de pelo menos cerca de 0,020 mg/kg/hr emenos que cerca de 0,040 mg/kg/hr, e mais preferivelmenteequivalente a uma taxa de dosagem de ala-TFPI de pelo menoscerca de 0,025 mg/kg/hr (0,417 |ag/kg/min) . A via deadministração é geralmente por administração intravenosa,com infusão intravenosa contínua preferida. A infusão podeser administrada por pelo cerca de 72, 96, 120, ou 240horas. Preferivelmente, a infusão contínua é administradapor 3 a 8 dias, mais pref erivelmente 3 a 6 dias, e maispreferivelmente ainda por cerca de 4 dias.
Para administrar por "infusão contínua" significa quea infusão é mantida aproximadamente na taxa prescrita seminterrupção substancial para a maior parte da duraçãoprescrita. Alternativamente, infusão intravenosaintermitente pode ser usada. Se for usada infusãointermitente, então uma taxa ponderada pelo tempo dedosagem deve ser usada, a qual é equivalente às taxas dedosagem descritas acima para infusão contínua. Em adição, oprograma de infusão intermitente deve resultar em umaconcentração sérica máxima de não mais do que cerca de 2 0%acima da concentração máxima obtida usando infusãocontínua. Para se evitar reações adversas no paciente,particularmente efeitos colaterais que envolvemsangramento, a taxa de dosagem deve ser menor do que a taxade dosagem que é equivalente à infusão intravenosa contínuade ala-TFPI em cerca de 0,050 mg/kg/hr.
Todas as doses aqui descritas, incluindo taxas de dosee doses totais, estão sujeitas a uma variação de até 10% naprática devido a erros na determinação da concentração deproteína e da atividade biológica com o ensaio deprotrombina. Dessa forma, qualquer dose realmenteadministrada até 10% maior ou 10% mais baixa do que umadose aqui estabelecida é considerada como sendo equivalenteà dose estabelecida. Por essa razão, todas as doses foramestabelecidas como "cerca de" uma dose específica. Porexemplo, uma dose descrita como "cerca de 0,025 mg/kg/hr" éconsiderada equivalente a qualquer dose real variando de0,0225 a 0,0275 mg/kg/hr.
Uma injeção em bolo ou uma taxa de infusãoligeiramente maior de TFPI ou de um análogo de TFPI tambémpode ser empregada na prática da presente invenção seseguida por administração de dose baixa de TFPI. Porexemplo, uma injeção em bolo ou taxa de infusão maior podeser usada para reduzir o tempo de equilíbrio de TFPI ouanálogo de TFPI administrado na circulação de um paciente.
Fazendo-se isso, o nível plasmático estado estável eventualde TFPI pode ser alcançado mais rapidamente e receptorespara TFPI podem ser saturados mais rapidamente. Aadministração de ala-TFPI a humanos a cerca de 0,025mg/kg/hr por 2 horas aumenta os níveis plasmáticos de TFPI(mais ala-TFPI) de cerca de 80 ng/mL a cerca de 125 ng/mL,ou um aumento de aproximadamente 50%. O mesmo nível seráalcançado mais rápido se a taxa de infusão for aumentada,ou for usada uma injeção em bolo. Taxas de infusão maiselevadas irão resultar em níveis mais elevados se a infusãofor continuada até ser obtido o estado estável. Verificou-se que o nível de estado estável para administração de ala-TFPI a cerca de 0,050 mg/kg/hr era de cerca de 300 ng/mL, epara administração de ala-TFPI a cerca de 0,33 ou cerca de0,66 mg/kg/hr é de cerca de pelo menos 2 |a,g/mL em pacientesque sofrem de sépsis.A dose diária total administrada a um hospedeiro emuma infusão contínua única ou em doses divididas de infusãopode estar em quantidades, por exemplo, equivalente àadministração de pelo cerca de 0,006 mg/kg/dia a menos doque cerca de 1,2 mg/kg/dia de ala-TFPI, mais usualmenteequivalente à administração de cerca de 0,24 mg/kg/dia amenos do que cerca de 1,2 mg/kg/dia de ala-TFPI epreferivelmente equivalente à cerca de 0,6 mg/kg/dia deala-TFPI. Quantidades menores dentro dessa faixa podem serúteis para finalidades profiláticas ou outras finalidades.
Doses maiores acima dessa faixa podem ser úteis para otratamento de CAP severa. Os protocolos de dosagem dainvenção também podem ser expressos como a dose totaladministrada ao paciente. A dose total é o produtomatemático da taxa de infusão e do tempo total de infusão.
Por exemplo, na taxa de dose preferida de cerca de 0,025mg/kg/hr para ala-TFPI e o tempo de infusão preferido de 96horas, a dose total é de cerca de 2,4 mg de ala-TFPI por kgde peso corporal. Em uma modalidade, a taxa de dosagempreferida de cerca de 0,25 mg/kg/hr para ala-TFPI e o tempode infusão preferido de 96 horas, a total dose é cerca de24 mg de ala-TFPI por kg de peso corporal. Em umamodalidade, a taxa de dosagem preferida de cerca de 0,75mg/kg/hr para ala-TFPI e o tempo de infusão preferido de 96horas, a dose total é cerca de 72 mg de ala-TEPI por kg depeso corporal. Em uma outra modalidade, a dose total deTFPI administrada de acordo com a invenção é equivalente apelo menos cerca de 0,75 J^g/kg e menos que cerca de 4,8mg/kg de ala-TFPI. Preferivelmente a dose total éequivalente a pelo menos cerca de 1 mg/kg e menos que cercade 4,8 mg/kg de ala-TFPI. Mais preferivelmente a dose totalé equivalente a cerca de 2,4 mg/kg de ala-TFPI.
Um fator que pode ser usado para ajustar o regime dedosagem é a função da coagulação individual do paciente,que é tipicamente medida usando um ensaio de tempo deprotrombina (PT) , ou a Proporção Normalizada Internacional(INR) . INR é a padronização do ensaio de PT na qual oensaio é calibrado contra um reagente de referênciainternacional de tromboplastina. Veja, por exemplo, R. S.Riley e cols. , J. Clin. Lab. Anal. 14: 101-114 (2000). Aresposta de INR a ala-TFPI em voluntários humanos saudáveisé aproximadamente linear ao longo da faixa observada deconcentrações plasmáticas (Fig. 3). A mudança global em INRé 1,2 unidades por 1 \xg/mL de aumento de concentraçãoplasmática de ala-TFPI.
Em um modelo farmacodinâmico, a resposta de INR a ala-TFPI foi mais bem descrita por um modelo log-linear no quallog INR era linearmente relacionado à concentraçãoplasmática de ala-TFPI. A natureza log-linear da respostasignifica que indivíduos com INR elevada na linha de basetêm probabilidade de vivenciar respostas anticoagulantesmais elevadas do que indivíduos com valores de base baixosque têm níveis similares de ala-TFPI circulante.
Os regimes de dosagem descritos acima, incluindo taxade dosagem em termos de mg/kg/hr e dose diária total, sãoexpressos como "equivalente à administração de ala-TFPI dereferência." Isso significa que elas são determinadasquantitativamente por normalização para uma dose de "ala-TFPI de referência", que é definida como ala-TFPI maduro,100% puro (em termos de proteína), formatado adequadamente,biologicamente ativo, não-glicosilado. Ala-TFPI é umanálogo de TFPI cuja seqüência de aminoácido é revelada noId. De Seq. N° : 2. Outras formas de TFPI também podem serusadas na invenção, incluindo TFPI maduro, de comprimentototal e análogos desse. Para determinar a faixa de dosagemapropriada para a prática da invenção com outras formas deTFPI que não ala-TFPI e com preparações de ala-TFPI ououtro análogo de TFPI que são menos do que 100% puros, asfaixas de dosagem aqui descritas para ala-TFPI dereferência podem ser ajustadas com base na atividadebiológica intrínseca da forma particular de TFPI eadicionalmente ajustada com base na pureza bioquímica dapreparação.
Em uma modalidade preferida, o paciente não recebeu umanticoagulante 10 dias após receber a primeiraadministração de TFPI. Em uma modalidade preferida, opaciente não recebeu um anticoagulante 7 dias após recebera primeira administração de TFPI. Preferivelmente, opaciente tem não recebeu uma forma de heparina 24 horasapós receber a primeira administração de TFPI. Em umamodalidade, o paciente não recebeu heparina não fracionada10 horas, preferivelmente 12 horas após receber a primeiraadministração de TFPI. Em uma modalidade, o paciente nãorecebeu heparina de baixo peso molecular 2 0 horas,preferivelmente 24 horas após receber a primeiraadministração de TFPI. Em uma modalidade, o paciente nãorecebeu drotrecogin-alpha 10 horas, preferivelmente 12horas após receber a primeira administração de TFPI.
A atividade biológica intrínseca de TFPI ou de umanálogo de TFPI se refere à atividade específica, comodefinida pelo ensaio de protrombina, do TFPI ouanálogo de TFPI maduro, 100% puro, formatado adequadamente.Dessa forma, a dose equivalente é calculada como (dose deala-TFPI de referência)/((atividade intrínseca relativa)x(pureza bioquímica)), onde atividade intrínseca relativase refere a (atividade intrínseca de análogo)/(atividadeintrínseca de ala-TFPI de referência). Por exemplo, se umanálogo de TFPI particular tem uma atividade biológicaintrínseca que é 80% daquela da ala-TFPI de referência,então a dose equivalente para o análogo de TFPI particularé obtida dividindo-se os valores de dose para ala-TFPI dereferência por 0,8. Além disso, se a formulaçãoadministrada a um paciente é, por exemplo, somente 90%bioquimicamente pura,ou seja, que compreende 10% de espéciemolecular que são desprovidas de atividade biológica deTFPI, então uma correção adicional dos valores de dose dereferência para ala-TFPI é realizada dividindo-se osvalores de dose por 0,9. Dessa forma, para um análogo deTFPI hipotético que tem 80% da atividade intrínseca de ala-TFPI e é 90% bioquimicamente puro como administrado, a taxade dose equivalente à administração de ala-TFPI dereferência a 0,025 mg/kg/hr seria 0,0347 mg/kg/hr (ou seja,0,025/ (0,8 x 0,9)).
Doses equivalentes também podem ser determinadas sem oconhecimento da atividade intrínseca ou da purezabioquímica pela determinação da atividade biológicarelativa. Atividade biológica relativa pode ser determinadapela comparação de um análogo de TFPI particular com umaatividade biológica padrão de TFPI usando o ensaio de tempode protrombina. Por exemplo, ala-TFPI produzido de acordocom o método do Exemplo 9 de WO 96/40784, que contém cercade 85% de espécies moleculares biologicamente ativas deala-TFPI, pode ser usado como uma atividade biológicapadrão de TFPI. Ala-TFPI produzido de acordo com o métododo Exemplo 9 de WO 96/4 0784 tem cerca de 85% da atividadede ala-TFPI de referência no ensaio de protrombina.Tabulando-se uma curva-padrão de tempo de protrombina, olog do tempo de formação de coágulo é tabulado contra o logda concentração de TFPI. Se a atividade biológica padrão deTFPI possui 85-90% da atividade de ala-TFPI de referência,então pode ser preparada uma curva-padrão que é equivalenteàquela para ala-TFPI de referência se as concentrações daatividade biológica de padrão de TFPI são multiplicadas por0,85 antes da tabulação, de forma que a atividade tabuladaé equivalente à atividade de ala-TFPI 100% puro dereferência. Quando o tempo de formação de coágulo para umanálogo de TFPI particular é comparado à curva-padrão, aconcentração equivalente de ala-TFPI de referência pode serdeduzida a partir da curva. Alternativamente, se ainclinação da porção linear da curva-padrão é obtida poranálise de regressão linear, então a inclinação pode sercorrigida com base na atividade da atividade biológica dopadrão de TFPI em relação a ala-TFPI de referência. Aatividade biológica relativa de um análogo de TFPIparticular é dessa forma igual à proporção da atividade deala-TFPI de referência para a atividade do análogo. Porexemplo, se um análogo particular requer 1,43 ng paraproduzir a mesma atividade de tempo de protrombina que 1,00ug de ala-TFPI de referência, então a atividade biológicarelativa do análogo é 1,00/1,43, ou 0,7. Para aqueleanálogo, a dose equivalente a uma dose de ala-TFPI dereferência é obtida dividindo-se a dose de ala-TFPI dereferência pela atividade biológica relativa do análogo.
Por exemplo, uma dose de 0,025 mg/kg/hr para ala-TFPI dereferência seria equivalente a 0,0357 mg/kg/hr do análogo(ou seja, 0, 025/0,7) .
Embora TFPI ou um análogos de TFPI possam seradministrados como o único agente farmacêuticoanticoagulação ativo, essas moléculas também podem serusadas em combinação com um ou mais agentes terapêuticosadicionais para fornecer uma terapia de combinação para otratamento de pneumonia severa. Tais agentes terapêuticosadicionais incluem anticorpos úteis como, por exemplo,anti-endotoxina, anticorpos monoclonais (por exemplo, Mabsde ligação com endotoxina) e produtos anti-TNF tal como umMab murídeo anti-TNF. TFPI e análogos de TFPI também podemser combinados com antagonistas de receptor deinterleucina-1, proteína bactericida/que aumenta apermeabilidade (BPI), imunoestimulante, compostos que têmatividade antiinflamatória tais como antagonistas de PAF ebloqueadores de adesão celular (por exemplo, agentes anti-plaquetários tais como inibidores GPIIb/lIIa) . Quandoadministrados como uma combinação, os agentes terapêuticospodem ser formulados como composições separadas que sãodadas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes.
Preferivelmente, os agentes terapêuticos adicionais sãodados ao mesmo tempo (ou seja, durante o período deadministração de TFPI ou análogos de TFPI) ou em 24 horasdo período de administração de TFPI ou análogos de TFPI (ouseja, 24 horas antes do início, ou 24 horas depois do fimdo período de administração de TFPI ou análogos de TFPI).Os agentes terapêuticos adicionais também podem ser dadoscomo composição única junto com o TFPI ou análogos de TFPI.TFPI e um análogo de TFPI também podem ser dados emcombinação com outros agentes que seriam efetivos paratratar pneumonia severa. Por exemplo, o seguinte pode seradministrado em combinação com TFPI ou com um análogo deTFPI: antibióticos que podem tratar a infecção bacterianasubjacente, anticorpos monoclonais que são dirigidos contracomponentes da parede celular bacteriana, receptores quepodem formar complexos com citocinas que estão envolvidasna via da pneumonia severa e geralmente qualquer agente ouproteína que pode interagir com citocinas ou pitras viasfisiológicas amplificadas que incluem proteína docomplemento para atenuar a pneumonia severa e/ou seussintomas.
Antibióticos úteis incluem aqueles na categoria geralde anéis beta-lactam (penicilina) , açúcares de amino emligação glicosídica (aminoglicosídeos) , anéis macrolíticosde lactona (macrolídeos), derivados policíclicos denaftacenocarboxanida (tetraciclinas), derivadosnitrobenzenos de ácido dicloroacético, peptídeos(bacitracina, gramicidina, e polimixina), anéis grandes comum sistema conjugado de ligação dupla (polienos), drogas desulfa derivadas de sulfanilamida (sulfonamidas), grupos 5-nitro-2-furanil (nitrofuranos), ácidos carboxílicos dequinolona (ácido nalidíxico) e muitos outros. Outrosantibióticos e mais versões dos antibióticos específicosacima podem ser encontrados em "Encyclopedia of ChemicalTechnology", 3a Edição, Kirk-Othymer (ed.), Vol. 2, páginas782-1036 (1978) e Vol. 3, páginas 1-78, Zinsser,MicroBiology, 17a Edição W. Joldik e cols. (Eds. ) páginas235-277 (1980), ou "Dorland's Illustrated MedicaiDictionary", 27a Edição, W. B. Saunders Company (1988).
Outros agentes que podem ser combinados com TFPI oucom um análogo de TFPI incluem antagonistas de endotoxinatais como E5531 (um análogo de Lipídeo A, veja Asai ecols., Biol. Pharm. Buli. 22: 432 (1999)), análogos de TFcom atividade anticoagulante (veja, por exemplo, Kelley ecols., Blood 89: 3219 (1997) e Lee & Kelley, J. Biol. Chem.273: 4149 (1998)), anticorpos monoclonais dirigidos paracitocinas, tais como aqueles anticorpos monoclonaisdirigidos para IL-6 ou M-CSF, veja U.S. No. De Ser.07/451.218, depositada em 15 de dezembro de 1989, eanticorpos monoclonais dirigidos para TNF, veja Cerami ecols., Pat. U.S. No. 4.603.106, inibidores de proteína quecliva o pró-hormônio TNF maduro da célula na qual ele foiproduzido, (veja U.S. No. de Ser. 07/395.253, depositada em16 de agosto de 1989), antagonistas de IL-1, (veja, U.S.No. de Ser. 07/517.276, depositada em Io de maio de 1990),inibidores de expressão de citocina IL-6 tais como inibina,(veja, Patente U.S. 5.942.220) e inibidores baseados emreceptores de várias citocinas tais como IL-1. Anticorpospara complemento ou inibidores de proteína de complemento,tais como CRi, DAF, e MCP também podem ser usados.
Todas as patentes, pedidos de patentes e referênciascitados nessa revelação são aqui incorporados porreferência em suas totalidades.
A presente invenção será agora ilustrada em referênciaaos seguintes exemplos que apresentam modalidadesparticularmente vantajosas. No entanto, deve-se perceberque essas modalidades são ilustrativas e não são devem serinterpretadas como limitantes da invenção de qualquerforma.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Tratamento com ala-TFPI de Pacientes com Pneumonia severa
Pacientes com pneumonia severa foram avaliados paraexplorar o efeito potencial de tratamento com ala-TFPI emum grupo relativamente homogêneo. Os pacientes compneumonia foram identificados se uma fonte de sepsisdocumentada pelo investigador fosse codificada comopneumonia. Outros locais de infecção também poderiam estarpresentes. Devido à dificuldade na diferenciação deseqüelas infecciosas de químicas, os pacientes compneumonia por aspiração não foram incluídos. Pacientesidentificados como tendo pneumonia foram entãoclassificados como sendo de cultura positiva (qualquerevidência de infecção como cultura ou coloração de Gram),ou de cultura negativa (cultura negativa ou cultura nãofeita). Os pacientes foram tratados por infusão intravenosacontínua com uma preparação de ala-TFPI não glicosiladoexpresso em E. coli em uma dose de 0,025 mg/kg/h formuladoem um tampão que contém 3 00 mM de L-arginina, 20 mM decitrato de sódio, pH 5,5, osmolaridade de 560+/-110 mOsm. Oplacebo consistiu no mesmo tampão sem ala-TFPI e foiinfundido na mesma taxa que o medicamento do estudo. Osresultados dessas análises demonstraram um efeito positivodo tratamento com ala-TFPI naqueles pacientes com pneumoniade cultura positiva (Tabela 1) . Aqueles pacientes semevidência de um fonte infecciosa demonstraram um efeitonegativo.
Tabela 1. Mortalidade pelo Status da Pneumonia
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Tabela 2. Mortalidade pelo Status da Pneumonia Baixo INR
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A mortalidade aumentada n o grupo de cultura negativade alto INR pareceu estar presente em populações depacientes com ou sem administração de heparina adicionada,embora deva-se observar que o número de indivíduos no grupode pneumonia de cultura negativa, não heparina érelativamente pequeno (Tabela 3). Um forte efeito detratamento positivo foi observado no grupo de culturapositiva/sem heparina.Tabela 3. Mortalidade por Status da Pneumonia e Heparina
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Exemplo 2
Investigação da severidade de base das variáveis da doença
Inúmeras severidades de base das variáveis da doençaforam avaliadas para determinar se havia desequilíbrio degrupo que pudesse explicar o resultado obtido. Esses dadosindicam que a diferença nos resultados associada com ostatus da cultura não são devido a desequilíbrios de base.
Portanto, os resultados parecem representar um efeitodiferencial do tratamento com TFPI devido a diferençasbiológicas entre os pacientes com e sem infecção. Adespeito do fato de que os indicadores de severidade (porexemplo, pontuação APACHE II ou pontuação de disfunção deórgão) foram iguais aos do placebo ou menores no grupo depneumonia de cultura negativa tratado com TFPI o grupo decultura negativa demonstrou a mortalidade geral mais alta(Tabela 4).Tabela 4. Severidade de base de doença por Status daPneumonia
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IL-6 é uma citocina inflamatória que é elevadaprecocemente na sepsis, reflete a intensidade da respostainflamatória e está associada ao resultado, em valor debase, os níveis de IL-6 são menores em pacientesclinicamente identificados como tendo pneumonia mas semevidência de infecção (Tabela 5) . Isso sugere que há umadiferença biológica entre pacientes com uma fonteinfecciosa documentada de pneumonia versus aqueles sem umafonte infecciosa aparente. Paradoxalmente, o grupo de TFPIde cultura negativa tem os menores níveis de IL-6 de basemas a mais alta taxa de mortalidade. Em uma população comsepsis os níveis de IL-6 caem com o tempo. A taxa de quedana IL-6 é reduzida em indivíduos de pneumonia de culturanegativa tratados com TFPI (Tabela 5) . Isso sugere que oefeito biológico de TFPI pode diferir naqueles pacientescom e sem infecção.
Tabela 5. IL-6 por Status da Pneumonia
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Exemplo 3
Análise de Pacientes com Pneumonia severa por Tipo deDocumentação de Infecção
Como acima discutido, um benefício geral do tratamentocom ala-TFPI foi observado naqueles pacientes com a maisalta certeza de infecção, ou seja, aqueles com uma culturasangüínea positiva. Em uma análise de pacientes compneumonia severa por tipo de documentação de infecção, foiobservado um benefício do tratamento com ala-TFPI nosindivíduos com uma cultura sangüínea positiva e aqueles comoutra evidência (Tabela 6) . O efeito foi mais forte nogrupo de bacteremia, ou seja, o grupo com a probabilidademais alta de infecção ou com fonte mais demonstrável deinfecção.
Tabela 6. Mortalidade por Status da Cultura e Status daPneumonia
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Como previamente mostrado, os pacientes comdocumentação de infecção (sangüínea + "outra") sebeneficiaram do tratamento com TFPI na ausência deheparina. Esse resultado é principalmente devido aobenefício derivado do grupo de pneumonia (Tabela 7) . Esseachado parece indicar que o benefício de anticoagulantesendógenos é o mais alto naqueles pacientes com infecçõespulmonares severas.
Tabela 7. Mortalidade por Status da Infecção, Status daPneumonia e Uso de Heparina
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Para também limitar a heterogeneidade, futurosexperimentos podem ser focados em pneumonia adquirida emcomunidade (CAP). Os pacientes que desenvolvem pneumoniaenquanto no hospital (pneumonia nosocomial) tem maisprobabilidade de serem colonizados com organismospatogênicos e têm outros distúrbios pulmonares tornando odiagnóstico de pneumonia infecciosa mais difícil. Alémdisso, os pacientes com CAP tem menos probabilidade deserem expostos a heparina que os pacientes com pneumonianosocomial. Quando os dados foram analisados por duração daestadia no hospital antes do tratamento, um benefíciosimilar foi notado para pacientes de cultura positivahospitalizados por <2 dias (adquirida na comunidade) versusaqueles hospitalizados por mais do que 2 dias (nosocomial).
O efeito negativo nos pacientes de cultura negativa foiprimariamente no grupo nosocomial (Tabela 8).Tabela 8. Mortalidade por status da pneumonia e tempo dehospitalização
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Exemplo 4
Depósito de fibrina alveolar e alteração na atividadefibrinolítica é uma característica distintiva da pneumoniae dano agudo ao pulmão. Fator tecidual foi considerado comoum importante iniciador de coagulação nesse ambiente einibidor da via de fator tecidual (TFPI) demonstrou evitarou reduzir o dano pulmonar em modelos animais.
Inibidor da via de fator tecidual (tifacogin)recombinante foi investigado em sepsis severa e umexperimento de fase III duplo-cego aleatório, controladopor placebo, foi completado (TFP007). O estudos falhou emdemonstrar uma redução significativa na mortalidade em 28dias por qualquer causa. Uma análise- post-hoc foi realizadapara avaliar se os pacientes que desenvolvem sepsis severadevido a CAP podem se beneficiar de tifacogin. Além disso,a possível interação de heparina e importância dadocumentação microbiologica foram investigadas.Material e Métodos
Pacientes (pts) alistados em TFP007 com CAP como acausa primária de sepsis severa foram mantidos para análisepost hoc. Mortalidade em 28 dias por qualquer causa esegurança foram determinados para a população geral de CAP.A influência de administração concomitante de heparina paraprofilaxia de DVT e a importância da documentaçãomicrobiológica também foram analisadas.
Resultados
TFP007 incluiu 1.955 pacientes dos quais 435 tiveramCAP (TFPI 217, placebo 218). As características de baseeram similares nos dois grupos (idade média 62,3 vs 62;APACHE II médio 24,9 vs 24; OD médio 3 vs 3) no TFPI eplacebo respectivamente (NS) . Dados de mortalidade em 28dias por qualquer causa são fornecidos abaixo na tabela 9.A mortalidade tendeu a ser reduzida em pacientes tratadoscom tifacogin comparados ao placebo em particular quandonenhuma heparina concomitante foi administrada e napresença de documentação microbiológica.
Eventos sérios de sangramento ocorreram em 12pacientes tratados (5,5%) vs 5 pacientes (2,2%) em placebo(NS). Sangramento do SNC foi observado em 6 pacientestratados com tifacogin (2,7%) vs 2 em placebo ((1%) (NS)para o primeiro período de 28 dias.
Tabela 9 : Mortalidade em 2 8 dias por qualquer causa em CAPcom relação a heparina concomitante e evidência microbiológica
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Hep : Heparina ME : evidência microbiológica
Conclusão
A partir dessa análise posfc hoc, tifacogin parecereduzir a mortalidade em 28 dias por qualquer causa empacientes com CAP severa. Um maior benefício parece serobtido em pacientes que têm uma CAP documentada e/ou naausência de administração concomitante de heparina. Operfil de segurança é aceitável. O benefício potencial detifacogin é atualmente avaliado em um estudo clínico defase III que inclui pacientes com CAP severa.
Ocorrências de sangramento e sangramento sério paratodos os pacientes alistados em TFP007, bem como paravárias subpopulações, são fornecidas nas tabelas 9A-9F.
Tabelas 9A-9F
Tabela 9A: sangramento de TFP007 para população de TFP007 (todos indivíduos)
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* teste Chisq; + Hospital- pneumonia adquirida # N = número de indivíduos; n (%)=número de sangramentos (taxa)Tabela 9B: sangramento sério de TFP007 para população deTFP007 (todos indivíduos)
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Tabela 9C. sangramento de TFP007 para subpopulaçoes deCAP/HAP (todos indivíduos)
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* teste Chisq; + Hospital- pneumonia adquirida
# N = número de indivíduos; n (%)=número de sangramentos(taxa)
Tabela 9D: sangramento de TFP007 para subpopulaçoes deCAP/HAP (todos indivíduos)
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* teste Chisq; + Hospital- pneumonia adquirida# N = número de indivíduos; n (%)=número de sangramentos
sérios (taxa)
Tabela 9E. sangramento deTFP007 para subpopulações de
<table>table see original document page 53</column></row><table>Tabela 9F. sangramento sério de TFP007 para subpopulações (todos indivíduos)
<table>table see original document page 54</column></row><table>
* Teste Exato de Fisher; + Hospital- pneumonia adquirida # N = número de indivíduos; n (%)=número de sangramentos sérios (taxa)Tabela 10
Listagem de eventos adversos isquemicos do SNC TFP007 <table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table><table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table><table>table see original document page 59</column></row><table><table>table see original document page 60</column></row><table><table>table see original document page 61</column></row><table><table>table see original document page 62</column></row><table><table>table see original document page 63</column></row><table><table>table see original document page 64</column></row><table><table>table see original document page 65</column></row><table><table>table see original document page 66</column></row><table><table>table see original document page 67</column></row><table><table>table see original document page 68</column></row><table><table>table see original document page 69</column></row><table><table>table see original document page 70</column></row><table><table>table see original document page 71</column></row><table><table>table see original document page 72</column></row><table><table>table see original document page 73</column></row><table><table>table see original document page 74</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table><table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 79</column></row><table><table>table see original document page 78</column></row><table><table>table see original document page 81</column></row><table>Tabela 12
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A presente invenção foi descrita com referência amodalidades específicas. No entanto, esse pedido visacobrir aquelas mudanças e substituições que podem serfeitas por aqueles habilitados na técnica sem se afastar doespírito e do escopo das reivindicações em anexo.Seqüência CWU 1
2 1 276 PRT Homo sapiens 1 Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr De He Thr Asp Thr Glu Leu1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30 Gly ProCys Lys Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn De Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu PheDe Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys LysMet Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Asn Arg He Ilc Lys Thr Thr Leu Gln Gln Glu LysPro Asp Phe 85 90 95 Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly He Cys Arg Gly Tyr De Thr Arg 100105 110 Tyr Phe Tyr Asn Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125 GlyCys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140 Asn De Cys GluAsp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Vai Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160 Thr Gln Leu Asn Ala VaiAsn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr Lys 165 170 175 Vai Pro Ser Leu Phe Glu Phe His GlyPro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190 Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn ArgPhe Tyr Tyr Asn 195 200 205 Ser Vai He Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys GlyGly 210 215 220 Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230235 240 Lys Gly Phe He Gln Arg De Ser Lys Gly Gly Leu He Lys Thr Lys 245 250 255 Arg LysArg Lys Lys Gln Arg Vai Lys De Ala Tyr Glu Glu De Phe 260 265 270 Vai Lys Asn Met 275 2277 PRT Homo sapiens 2 Alá Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr De De Thr Asp Thr Glu 1 510 15 Leu Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp 20 25 30 Asp GlyPro Cys Lys Ala He Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn De Phe 35 40 45 Thr Arg Gln Cys Glu GluPhe De Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln 50 55 60 Asn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys LysLys Met Cys Thr Arg Asp 65 70 75 80 Asn Ala Asn Arg lie De Lys Thr Thr Leu Gln Gln GluLys Pro Asp 85 90 95 Phe Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Be Cys Arg Gly Tyr De Thr 100105 110 Arg Tyr Phe Tyr Asii Asn Gln Thr Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr 115 120 125 GlyGly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys 130 135 140 Lys Asn He CysGlu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gln Vai Asp Asn Tyr 145 150 155 160 Gly Thr Gln Leu Asn AlaVai Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gln Ser Thr 165 170 175 Lys Vai Pro Ser Leu Phe Glu Phe HisGly Pro Ser Trp Cys Leu Thr 1S0 185 190 Pro Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn
Arg Phe Tyr Tyr 195 200 205 Asn Ser Vai De Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly CysGly 210 215 220 Gly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys 225 230235 240 Lys Lys Gly Phe De Gln Arg He Ser Lys Gly Gly Leu De Lys Thr 245 250 255 Lys ArgLys Arg Lys Lys Gln Arg Vai Lys De Ala Tyr Glu Glu De 260 265 270 Phe Vai Lys Asn Met275

Claims (43)

1. Método de tratamento ou prevenção de pneumoniasevera caracterizado por compreender: a administração deTFPI ou um análogo de TFPI a um paciente que tem risco ouestá em risco de ter pneumonia severa por infusãointravenosa contínua em uma taxa de dose equivalente àadministração de referência de ala-TFPI em uma taxa de dosede menos que cerca de 1.0 mg/kg/hr e o paciente não recebeuum anticoagulante em até 24 horas após administração deTFPI ou análogo de TFPI.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido paciente tem umainfecção demonstrável.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado por infusão intravenosa contínua emuma taxa de dose equivalente à administração de referênciade ala-TFPI em uma taxa de dose de menos que cerca de 0,80mg/kg/hr.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência ala-TFPI em umataxa de dose de cerca de 0.025 a cerca de 0.10 mg/kg/hr eem que o referido TFPI ou análogo de TFPI é administradopor pelo menos cerca de 72 horas.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência ala-TFPI em umataxa de dose de cerca de 0,010 a cerca de 0,10 mg/kg/hr.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência ala-TFPI em umataxa de dose de cerca de 0,020 mg/kg/hr a cerca de 0,08mg/kg/hr.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou oreferido análogo de TFPI é administrado por cerca de 96horas.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado por infusão intravenosa contínuapara fornecer uma dose total equivalente à administração dereferência de ala-TFPI em uma dose total de cerca de 0,025a cerca de 2,5 mg/kg.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
14. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado por infusão intravenosa contínua emuma taxa de dose equivalente à administração de referênciade ala-TFPI em uma taxa de dose de cerca de 0,02 mg/kg/hr acerca de 0,09 mg/kg/hr.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
16. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado por infusão intravenosa contínuapara fornecer uma dose diária equivalente à administraçãode referência de ala-TFPI em uma dose diária de cerca de 0,06 mg/kg a cerca de 4 mg/kg.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPIcompreende um primeiro domínio de Kunitz que consiste emaminoácidos 19-89 de Id. de Seq. N° : 1.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPItambém compreende um segundo domínio de Kunitz que consisteem aminoácidos 90-160 de Id. de Seq. N°: 1.
20. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPIcompreende aminoácidos 1-160 de Id. de Seq. N°: 1.
21. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPIcompreende um segundo domínio de Kunitz que consiste emaminoácidos 90-16 0 de Id. de Seq. N°: 1.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
23. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é preparado a partir de uma composição liofilizadaque compreende TFPI ou um análogo de TFPI.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
25. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado como uma formulação que compreendearginina.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
27. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado como uma formulação que compreendecitrato.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
29. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI tem uma concentração de cerca de 0,15 mg/ml em umaformulação que compreende cerca de 300 mM cloridrato dearginina e cerca de 20 mM citrato de sódio e que tem um pHde cerca de 5,5.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
31. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por também compreender a administração de, aomesmo tempo que, ou até 24 horas após a administração doreferido TFPI ou análogo de TFPI, de um agente adicionalselecionado do grupo que consiste em um antibiótico, umanticorpo, um antagonista de endotoxina, um análogo defator tecidual que tem atividade anticoagulante, umimunoestimulante, um bloqueador de adesão celular,heparina, proteína BPI, um antagonista de IL-1, pafase(inibidor de enzima PAF) , um inibidor de TNF, um inibidorde IL-6 e um inibidor de complemento.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o referido agente adicionalé um anticorpo, em que o referido anticorpo liga-seespecificamente a um antígeno selecionado do grupo queconsiste em TNF, IL-6 e M-CSF.
34. Método, de acordo com a reivindicação 33,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
35. Método para o tratamento de pneumonia severa,caracterizado por compreender: a administração a umpaciente de (i) TFPI ou um análogo de TFPI e (ii) um agenteadicional selecionado do grupo que consiste em umantibiótico, um anticorpo monoclonal, um inibidor decitocina e um inibidor do complemento.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido análogo de TFPI éala-TFPI não glicosilado.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido paciente tem umainfecção demonstrável.
38. Método, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido TFPI ou análogode TFPI é administrado por infusão intravenosa contínua emuma taxa de dose equivalente à administração de referênciade ala-TFPI em uma taxa de dose de menos que cerca de 1,0mg/kg/hr.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência de ala-TFPI emuma taxa de dose de cerca de 0,001 a cerca de 0,090mg/kg/hr.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência de ala-TFPI emuma taxa de dose de cerca de 0,002 a cerca de 0,050mg/kg/hr.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência de ala-TFPI emuma taxa de dose de cerca de 0,002 a cerca de 0,010mg/kg/hr.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que a referida taxa de dose éequivalente à administração de referência de ala-TFPI emuma taxa de dose de cerca de 0,0025 a cerca de 0,075mg/kg/hr.
43. Método de tratamento ou prevenção de pneumoniasevera caracterizado por compreender a administração a umpaciente humano que tem ou está em risco de ter pneumoniasevera, de TFPI ou um análogo de TFPI em uma quantidade quenão induza a sangramento excessivo.
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