BRPI0610781A2 - métodos para imobilizar um polissacarìdeo sobre um carreador, para determinar a presença de um anticorpo direcionado para um antìgeno de uma bactéria gram-negativa em uma amostra, e para determinar a presença de uma bactéria gram-negativa em uma amostra, carreador, coleção de microesferas ou de glóbulos, biossensor, e, sistema de detecção por ressonáncia de plasmon de superfìcie - Google Patents

Abstract

METODOS PARA IMOBILIZAR UM POLISSACARIDEO SOBRE UM CARREADOR, PARA DETERMINAR A PRESENçA DE UM ANTICORPO DIRECIONADO PARA UM ANTìGENO DE UMA BACTéRIA GRAM-NEGATIVA EM UMA AMOSTRA, E PARA DETERMINAR A PRESENçA DE UMA BACTERIA GRAM-NEGATIVA EM UMA AMOSTRA, CARREADOR, COLEçãO DE MICROESFERAS OU DE GLóBULOS, BIOSSENSOR, E, SISTEMA DE DETECçãO POR RESSONáNCIA DE PLASMON DE SUPERFìCIE A invenção refere-se ao campo da química e da diagnose, mais em particular à diagnose de infecções correntes e/ou passadas e/ou assintomáticas ou de uma história de exposição a uma bactéria gram-negativa (tal como uma Enterobacteriaceae ou uma Legioneila). Ainda mais particularmente, a invenção refere-se à seleção de animais ou de produtos animais para a presença de microorganismos indesejados /não desejados. A invenção adicionalmente refere-se a um método para selecionar amostras para a presença de anticorpos direcionados contra microorganismos indesejados 1não desejados e preferivelmente um tal método é realizado com o auxílio de um biossensor. A invenção também se refere a um método para imobilizar polissacarideos em superficies sólidas. A invenção adicionalmente proporciona superficies sólidas com polissacarídeos imobilizados bem como aplicações de tais superfícies.

Description

"MÉTODOS PARA IMOBILIZAR UM POLISSACARÍDEO SOBRE UMCARREADOR, PARA DETERMINAR A PRESENÇA DE UMANTICORPO DIRECIONADO PARA UM ANTÍGENO DE UMABACTÉRIA GRAM-NEGATIVA EM UMA AMOSTRA, E PARADETERMINAR A PRESENÇA DE UMA BACTÉRIA GRAM-NEGATIVAEM UMA AMOSTRA, CARREADOR, COLEÇÃO DE MICROESFERASOU DE GLÓBULOS, BIOSSENSOR, E, SISTEMA DE DETECÇÃO PORRESSONÂNCIA DE PLASMON DE SUPERFÍCIE"

A invenção refere-se ao campo da química e da diagnose, maisparticularmente à diagnose de infecções correntes e/ou passadas e/ouassintomáticas ou de uma história de exposição a uma bactéria gram-negativa(tal como uma Enterobacteriaceae ou uma Legionella). Ainda maisparticularmente, a invenção refere-se à seleção de animais ou de produtosanimais para a presença de microorganismos indesejados / não-desejados. Ainvenção adicionalmente refere-se a um método para seleção de amostras paraa presença de anticorpos direcionados contra microorganismos indesejados /não-desejados e preferivelmente um tal método é realizado com o auxílio deum biossensor. A invenção também se refere a um método para imobilizaçãode polissacarídeos em superfícies sólidas. A invenção adicionalmenteproporciona superfícies sólidas com polissacarídeos imobilizados bem comoaplicações de tais superfícies.

O mundo está cheio de bactérias gram-negativas, muitas dasquais são membros da família Enterobacteriaceae. Membros desta família sãoencontrados no trato gastrointestinal de animais, mas muitos também estãovivendo livremente no solo e na água. Membros da famíliaEnterobaeteriaeeae possuem estruturas antigênicas muito complexas. Alémdisso, compreendem múltiplos antígenos que são identificados comoantígenos K, antígenos H, e antígenos O. O antígeno K é a cápsula depolissacarídeo ácido. A cápsula possui muitas funções incluindo evasão dosistema imune do hospedeiro infectado e adesão no epitélio do hospedeiro. Oantígeno H está localizado sobre os flagelos.

A porção externa da parede celular em bactérias gram-negativas é principalmente composta de lipopolissacarídeos (LPS). LPS écomposto de lipídeo A que está enterrado dentro da membrana externa, umnúcleo de carboidrato curto e opcionalmente uma cadeia de polissacarídeosque é composta de unidades repetidas. Os antígenos O estão localizados sobreo polissacarídeo. Lipídeo A é o constituinte tóxico do LPS. A medida que acélula lisa, LPS é liberado, acarretando febre e consumo de complemento.Também interfere na coagulação e em concentrações altas eventualmenteocasiona um estado de choque.

Como um exemplo não-limitante um membro dasEnterobacteriaceae, Salmonella, será discutido com mais detalhe. Um grandenúmero de subespécies dos gêneros Salmonella enterica são bactériaspatogênicas importantes para humanos e animais. Além do fato de que osanimais entram em um episódio patológico, os animais podem ser veículosassintomáticos das bactérias. Animais contaminados podem ser uma fontedestes patógenos ameaçadores da saúde pública por exemplo por intermédiodo alimento que estes animais produzem. Visto que muitos financiadoresconsideram inaceitável o número de infecções causadas por Salmonellaproveniente de alimento, medidas têm que ser tomadas para conter estepatógeno na cadeia alimentar.

Salmonella é a significância maior como um microorganismopatogênico em infecções provenientes de alimento em humanos, causandoefeitos clínicos brandos a severos. Nos Países-Baixos, 5% de todos os casosidentificados de gastroenterite é salmonelose (Edel et al., 1993; HoogenboomVerdegaal et al., 1994). A incidência média desta infecção é 450 casos por100.000 pessoas por ano sob risco, que é similar àquela em paísesindustrializados (Berends et al., 1998). Não obstante os 2.480 sorotiposidentificados no grupo de S. enterica até 2001 (Popoff, 2001), apenas umnúmero pequeno tem estado envolvido em infecções de humano (Grimont etai., 2000). Salmonella typhimurium mais Salmonella enteritidis representaram>75% de todos os isolados de Salmonella das fontes humanas enviadas aoDutch National Salmonella Centre at the RIVM em 2002 (Van Pelt et ai.,2003). Esta percentagem consistida de 51% é proveniente do contato comprodutos de galinha (ave doméstica 15%; ovos 36%) (Van Pelt et al., 2003).

Detecção de imunoglobulinas nos fluidos corporais deorganismos (sorologia) é um modo de estabelecer uma história de exposiçãode animais e humanos aos agentes infecciosos. Uma resposta humoral contraantígenos de Salmonella pode ser detectada em galinhas 1 semana após ainfecção e persiste por pelo menos 10 semanas até mesmo de a ave não formais cultura-positiva (Holt, 2000). Os determinantes antigênicos deSalmonella são, como descrito acima, compostos de antígenos somático (O),flagelar (H) e superficial (Vi) (Holt, 2000). Variações na composição deantígenos correlacionam-se com sorotipos diferentes de Salmonella.

Tipicamente, sorologia é mais rápida do que tipificação decultura do organismo causador de doença. Detecção rápida e específica derebanhos e manadas é de importância com o propósito de se tomarem medidasadequadas em processos de produção. A detecção de anticorpos em amostrasde soro e de sangue de animas produtores de alimento relatando a presença depatógenos zoonóticos é portanto de significância. Tal informação é entãousada como a entrada para a avaliação de risco com o objetivo de se ser capazde aumentar a segurança de alimento, mas também para melhorar os perigosocupacionais e para reduzir a disseminação de patógenos no ambiente.

Numerosos testes sorológicos têm sido desenvolvidos para adetecção de espécie Salmonella invasiva. Dentre muitos de tais métodos,aglutinação e ELISA têm sido mais comumente usados (Barrow, 2000).Testes de aglutinação têm sido usados bem sucedidamente para erradicarSalmonella pullorum de bandos de aves domésticas. Contudo, a abordagem éenfadonha, laboriosa e inadequada para programas de triagem de grandeescala de acordo com os padrões modernos. Vários procedimentos de ELISAque são considerados relativamente baratos e rápidos, têm sido portantodesenvolvidos para detecção de respostas anti-antígeno de S. enteritidis e deS. typhimurium em soros de aves domésticas (Barrow et al., 1996; Thorns etal., 1996; de Vries et al., 1998; Barrow, 2000; Yamane et al., 2000).

O uso de biossensores também promete ser bem sucedido,barato e rápido nesta área de análise. Em adição, a técnica é capaz de detectarmúltiplos analitos de qualquer tipo biomolecular em uma única corrida. Umbiossensor é definido como um dispositivo analítico consistindo de (i) umligante biológico imobilizado reutilizável que 'sente' o analito, e (ii) umtransdutor físico, que traduz este fenômeno em um sinal eletrônico.

O fenômeno de ressonância de plasmon de superfície (SPR)foi primeiro reconhecido no início dos anos 1960s (Kretschmann e Raether,1968) e os primeiros biossensores de SPR foram introduzidos nos anos 1980s(Liedberg et al., 1983). Demorou até o final dos anos 1980s e início dos anos1990s antes que o primeiro equipamento de biossensor baseado em SPRcomercialmente disponível fosse lançado no mercado. Inicialmente, este tipode biossensor atraiu o interesse de companhias farmacêuticas como umaferramenta secundária para a triagem in vitro tanto seletiva quanto sensitivade produtos farmacêuticos novos promissores de bibliotecas combinatórias.

Mostrou-se ser uma alternativa valiosa às abordagens clássicas tais como osprocedimentos de ELISA. Além disso, oferece uma medição em tempo-realdo evento de ligação em contraste com as determinações de ponto-final. Osbenefícios desta abordagem analítica também têm sido reconhecidos pormuitas outras disciplinas da ciência da vida, incluindo as ciências de alimento(Ivnitski et al., 1999; Medina, 1997). Até agora, apenas umas poucaspublicações sobre a biossensação por SPR têm se referido à detecção demicroorganismos patogênicos, por exemplo o uso de células de Escherichiacoli 0157:H7 imobilizadas para selecionar o desempenho de anticorpos anti-E. coli 0157:H7 (Medina et al., 1997), e o uso destes anticorpos para detectarcélulas de E. coli 0157:H7 (Fratamico et al., 1997).

Em Jongerius-Gortemaker et al. (2002) foi iniciado um estudopara a adequabilidade de um biossensor óptico por SPR para detectaranticorpos em soro e sangue indicando uma reação humoral à invasão comSalmonella sorotipos enteritidis e typhimurium. Neste estudo, foi feito uso deproteínas de fusão de antígeno flagelar imobilizadas. Após análise completa éconcluído que a sensibilidade e/ou a robustez deste sistema não foramsuficientes e em particular não para triagem de rendimento alto de porexemplo aves domésticas na linha de matança em um abatedouro,processando animais em uma velocidade de vários milhares por hora.

O objetivo da presente invenção é proporcionar um métodoque possui uma sensibilidade melhorada e/ou uma robustez melhorada. Esteobjetivo tem sido alcançado pelo desenvolvimento de um suporte comantígenos somáticos ou denominados O imobilizados. Como descrito, osantígenos O estão localizados sobre os lipopolissacarídeos e a composição dopolissacarídeo varia e corresponde ao sorovar da (sub)espécie de Salmonella.

Cada sorotipo pode, dentre outros, ser descrito por numerosos antígenos O esão tipicamente codificados com um número, tal como 04, 06 ou 012. Osantígenos O podem ser encontrados como unidades repetidas sobre a parte depolissacarídeo do LP S. O comprimento do polissacarídeo também varia epode estar entre zero (LPS rugoso) e mais do que 50 unidades repetidas(LPSD liso).

Dentro da família de Salmonella enterica, podem serdistinguidos sorogrupos diferentes; cada grupo compreende pelo menos umantígeno O específico. Os sorovares de Salmonella de importância emgalinhas e porcos são listados com seu perfil de antígeno O na Tabela 1. EmDinamarca, Alemanha, Grécia e Países-Baixos, 39,5% de todos os porcosSalmonella-positivos amostrados no abatedouro foram determinados como S.typhimurium. Dependendo do país, outros isolados importantes de porcosforam S. derby (17,1%), S. infantis (8,0%), S. panama (5,1%), S. ohío (4,9%),S. Iondon (4,4%), S. Iivingstone (3,1%), S. virchow (2,7%), S. bredeny (2,1%),S. mbandaka (1,1%), S. Brandenburg (1,0%), S. goldcoast (0,8%).

No caso de galinhas, 14% das galinhas foram Salmonella-positivas em nível de bando em 2002 nos Países-Baixos. O sorovarpredominante foi naquele caso de S. paratyphi B var. Java. Em nível de vendaa varejo uma percentagem comparável (13,4%) foi encontrada nos Países-Baixos. Os sorovares de Salmonella mais freqüentes isolados de frangos 14estados membros da Comunidade Européia foram S. paratyphi B var. Java(24,7%), S. enteritidis (13,6%), S. infantis (8,0%), S. virchow (6,7%), S.Iivingstone (5,7%), S. mbandaka (5,5%), S. typhimurium (5,3%), S.senftenberg (5,0%), S. hadar (3,7%). S. paratyphi B var. Java é dominante,mas isto é totalmente atribuível aos Países-Baixos.

Tabela 1. Alguns sorovares de Salmonella considerados como agenteszoonóticos importantes em frangos e porcos listados com seus perfis deantígeno O (Popoff, 2001)

<table>table see original document page 7</column></row><table>a Antígeno O determinado por conversão em fago é indicado por sublinhado.

b Antígenos O que podem estar presentes ou ausentes são indicados entrecolchetes.

c Lisogenisado por fago Si5 [15] e por fago ε34 [15, 34]

Em uma primeira modalidade, a invenção proporciona ummétodo para imobilização de um polissacarídeo sobre um suporte,compreendendo contatar o citado polissacarídeo com um agente oxidante eum polímero compreendendo pelo menos dois grupos amina e/ou amida paraobter um complexo de polissacarídeo-polímero e copular o citado complexode polissacarídeo-polímero em citado suporte. O polímero pode ser qualquerpolímero que contém pelo menos dois grupos amina e/ou amida. Os citadospelo menos dois grupos amina e/ou amida preferivelmente ligamcruzadamente o citado polímero no citado polissacarídeo e no citado suporte.

Para permitir copulação mais eficiente é preferido que o citado polímerocompreenda pelo menos 4 e mais preferivelmente pelo menos 7 grupos aminaou amida. 0 polímero compreende pelo menos 10 blocos de construção.Blocos de construção de um polímero compartilham grupos reativoscaracterísticos que permitem alongamento do polímero. Um bloco deconstrução preferido é um aminoácido ou uma parte funcional, um derivadoe/ou um análogo do mesmo. Em uma modalidade preferida o citado polímerocompreende uma proteína. Uma proteína compreende pelo menos uma cadeiade polipeptídeo compreendendo pelo menos 10 aminoácidos ou equivalentesfuncionais do mesmo. Uma proteína contém pelo menos constituintespossuindo grupos amina e/ou amida livres. No contexto da invenção aproteína também pode ser um multímero compreendendo pelo menos duascadeias de polipeptídeo que estão não-covalentemente ou covalentementeligadas umas nas outras. A proteína pode compreender modificações taiscomo aquelas comuns para sistemas biológicos tal como glicosilação apóstradução. A proteína também pode ser artificialmente modificada ouproporcionada com um outro grupo desde que ela possua disponíveis osmencionados grupos amina e/ou amida.

Em uma modalidade preferida o citado polissacarídeo éderivado de uma bactéria gram-negativa. A sensibilidade de um tal suportepreparado é muito melhorada quando o polissacarídeo (antígeno O) antes daimobilização sobre o suporte é oxidado na presença de um polímerocompreendendo pelo menos dois grupos amina e/ou amida, preferivelmenteuma proteína. Embora não desejemos nos basearmos em qualquer teoria, écorrentemente considerado que os grupos aldeído que resultam da oxidaçãodos polissacarídeos são capazes de reagir com os grupos amino da proteínapara formar uma imina substituída (ligação de base de Schiff). Após umainjeção sobre o suporte (um ativado) (por exemplo um chip sensor) os gruposaldeído disponíveis reagem com hidrazida para formarem hidrazona. Aredução seguinte estabiliza não apenas a ligação covalente entre o suporte(por exemplo um suporte compreendendo dextrano) e o polissacarídeo mastambém a ligação imina entre a proteína e o polissacarídeo. Como seráexplicado com mais detalhe na parte experimental, polissacarídeos (àntígenosO) de sorotipos diferentes de Salmonella têm sido imobilizados sobre umsuporte. Os suportes preferidos foram subseqüentemente submetidos a umaanálise-SPR com soros padrão. A resposta sorológica obtida foi usada comoum indicador para o sucesso do método. Quando reações de copulação foramrealizadas sem a etapa de oxidação nenhuma resposta ou uma resposta quasenão significativa de soros de referência pôde ser detectada.

Preferivelmente, a imobilização / copulação do complexo depolissacarídeo-proteína em um suporte é tal que robustez e/ou sensibilidadealtas são obtidas. Visto que àntígenos flagelares se desnaturam e perdem suaantigenicidade com respeito aos anticorpos de soro embora o chip sensortenha que ser regenerado para um ciclo de análise seguinte com solventesrelativamente agressivos, os àntígenos somáticos são encontrados bastanteestáveis com respeito a estes solventes de regeneração. De fato, é crido que aperda de atividade de antígeno O imobilizado está primariamente associadacom a degradação da superfície sólida, a saber perda gradual de camada dedextrano ligada em filme de ouro, na qual os antígenos estão ligados. Ométodo de acordo com a invenção resulta em um suporte que é mais robustocomparado com um suporte da arte anterior.

imobilização de um polissacarídeo sobre um suporte, compreendendo contataro citado polissacarídeo com um agente oxidante e uma proteína para obter umcomplexo de polissacarídeo-proteína e copular o citado complexo depolissacarídeo-proteína em citado suporte, no qual o citado polissacarídeo éderivado de uma bactéria gram-negativa e ainda mais preferivelmente no qualo citado polissacarídeo é derivado de uma Enterobacteriaceae. Ainda bemmais preferivelmente, o citado polissacarídeo é derivado de uma bactériagram-negativa que é um patógeno de planta, veterinário ou de humano.

Exemplos de tais polissacarídeos são polissacarídeos derivados de uma(sub)espécie de Salmonella. Outros exemplos são polissacarídeos derivadosde espécie de Eseherichia eoli (por exemplo E. eoli Ol57) e de espéciesbacterianas descritas na Tabela 2.

Tabela 2. Exemplos de bactérias contendo LPS patogênicas para humanoe/ou animais.

<table>table see original document page 10</column></row><table><table>table see original document page 11</column></row><table>

Como será explicado com mais detalhe adiante, um suportecompreendendo um polissacarídeo (antígeno O) imobilizado éparticularmente útil na diagnose de bactérias contendo LPS mencionadas.entidade compreendendo duas ou mais unidades de monossacarídeo ligadaspor glicosídeo e inclui, dentre outros, um oligossacarídeo (2-10 resíduos) bemcomo um polissacarídeo (mais do que 10 monossacarídeos). A ligação poderesultar em polissacarídeo linear ou ramificado. Em uma modalidadepreferida, a invenção proporciona um método para imobilização de umpolissacarídeo sobre um suporte, compreendendo contatar o citadopolissacarídeo com um agente oxidante e uma proteína para obter umcomplexo de polissacarídeo-proteína e copular o citado complexo decomplexo de polissacarídeo-proteína, no qual o citado polissacarídeo é umlipopolissacarídeo (LPS), i.e. um polissacarídeo compreendendo lipídeo A.

Está claro para uma pessoa experiente na arte que o (lipo)polissacarídeousado tem que compreender uma estrutura antigênica e um grupo disponível /adequado para proporcionar uma ligação entre a proteína e o polissacarídeo.Mais detalhes com respeito ao último item serão proporcionados adiante.

Como conseqüência, desde que o (lipo)polissacarídeo compreenda umaestrutura antigênica e um grupo adequado para proporcionar uma ligaçãoentre a proteína e o polissacarídeo um método de imobilização da invençãopode ser usado para obter um suporte sensível e/ou robusto. O LPS éexpressado no exterior celular e é parte da parede celular bacteriana. Aexpressão de LPS não está sob o controle genético direto, de modo que LPS éuma reunião de moléculas diferentes com composição de lipídeo A variadaem termos da cadeia alifática ligada. Além disso, a célula bacteriana pode

O termo "polissacarídeo" é intencionado para significar umasintetizar LPS rugoso com ou sem uma cadeia de carboidrato curta existindomaior do que 50 unidades repetidas expressando sua antigenicidade. Emadição a esta heterogenicidade, dentro de uma única molécula de LPS, váriasentidades de antígeno O, que são distintamente numeradas, podem serexpressadas. Um perfil de antígeno O é, contudo, por definição único para umsorogrupo de Salmonella. Uma sorotipificação de uma Salmonella tambéminclui antígenos H bem como antígenos Vi.

LPS pode ser obtido por uma variedade de métodos e a parteexperimental descreve com mais detalhe o uso de uma extração em ácidotriclórico (opcionalmente seguida por extração em etanol e diálise) de acordocom Staub (1965) para este propósito. Outros exemplos de métodos deextração adequados são descritos por Wilkons (1996) e incluem, mas não sãorestritos a, extrações com dietileno-glicol, dimetil-sulfóxido, NaCl-dietil-éter(1:2 (v/v)), NaCl-butan-l-ol (1:1 (v/v)), EDTA aquoso, NaCl-citrato de sódio,fenol aquoso ou fenol aquoso - clorofórmio petróleo.

A pureza da batelada de LPS usado / obtido não é consideradaextremamente crítica. E experimentado que o LPS não tem que estarcompletamente livre de contaminantes. A reação de copulação específicaproporciona um certo grau de seletividade. Além disso, como descrito naparte experimental, o LPS usado / obtido (preferivelmente uma batelada deLPS) é otimizado com respeito à quantidade de proteína necessária para umaresposta ótima. Está claro para uma pessoa experiente na arte que o LPSpreferivelmente compreende não muito LPS rugoso. A batelada de LPSpreferida essencialmente compreende LPS liso.

Embora não desejemos nos basear em qualquer teoria écorrentemente considerado que a presença de um ácido 2-ceto-3-desóxi-octônico (KDO) e/ou de uma glicerol-manoheptose (Hep) e/ou de umGlcNAc no núcleo da molécula de LPS é necessária para uma copulaçãocovalente.Embora muitas bactérias diferentes estejam incluídas no termobactérias gram-negativas é crido que os LPS de todas estas bactérias sãoadequados para uso na invenção presentemente reivindicada desde que o LPScompreenda pelo menos um constituinte com grupos hidroxila vicinais não-conjugados ou desconjugados, preferivelmente na região de núcleo damolécula de LPS. Em Salmonella, os constituintes mais provavelmentecandidatos são resíduos de KDO e Hep e GlcNAc. A presença ou ausência deum tal grupo KDO e/ou Hep e/ou GlcNAc é indiretamente geneticamentedeterminada. Embora a informação genética necessária para construir osorotipo de espécie ou até mesmo de monossacarídeos específicos de cepaesteja presente no organismo correspondente, ela depende das circunstânciasde crescimento se o citado LPS contém monossacarídeos aldeído-conversíveisna região de núcleo.

Claro que também há outras fontes de LPS disponíveis, talcomo sua compra comercial.

Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ummétodo para imobilização de um polissacarídeo sobre um suporte,compreendendo contatar o citado polissacarídeo com um agente oxidante euma proteína para obter um complexo de polissacarídeo-proteína e copular ocitado complexo de polissacarídeo-proteína no citado suporte, no qual a citadaproteína é uma proteína (por exemplo uma proteína de soro) com uma certaquantidade de aminas (primárias). Preferivelmente, pelo menos algumasdestas aminas não estão estericamente impedidas e/ou não participam deligações não-covalentes, tais como pontes de H-H ou interações de dipolo-dipolo e/ou não estão protonadas. Uma tal proteína preferivelmente nãopossui um quase não possui, quaisquer propriedades imunogênicas e comoconseqüência anticorpos de reação cruzada direcionados para a proteína usadasão evitados tanto quanto possível. Exemplos de tais proteínas sãohemoglobina (Hb), ovalbumina (Ob)5 mioglobina(Mb) e albumina de soro(SA). Foram determinadas as respostas de biossensor de soros padrãodiferentes sobre LPS imobilizado oxidado na presença de Hb ou Ob ou Mb ouSA. Albumina de soro, mioglobina e hemoglobina deram, os resultados maispromissores. Em uma modalidade preferida a proteína é hemoglobina oumioglobina.

A proteína necessária é obtida comercialmente ou por(sobreexpressão) em um sistema de expressão adequado ou por seuisolamento de uma fonte adequada. Hemoglobina tem sido por exemploobtida por seu isolamento do sangue. Preferivelmente as bateladas de proteínausadas são tão puras quanto possível, eliminando-se deste modo o máximo dereações cruzadas quanto possível. Contudo é experimentado que quantidadespequenas de contaminação são permitidas sem porem e perigo a sensibilidadee/ou a robustez dos suportes obtidos.

A razão de (lipo)polissacarídeo para proteína depende, dentreoutras coisas, da proteína usada. Experimentos com Hb têm mostrado queconcentrações entre 15% e 50% (m/m) têm resultado em resultadossatisfatórios. Quando albumina de soro bovino é usada razões muito menores,entre 0,7% e 7% (m/m), são usadas. Alguns exemplos: a concentração de Hbótima para LPS de S. Iivingstone é de cerca de 50% (m/m) e para LPS de S.enteritidis a concentração de Hb ótima é de 15% (m/m).

As preparações de LPS isoladas são preferivelmente oxidadasna presença de uma proteína facilitada por um agente oxidante. Em umamodalidade preferida a invenção proporciona um método para imobilizaçãode um polissacarídeo sobre um suporte, compreendendo contatar o citadopolissacarídeo com um agente oxidante e uma proteína para obter umcomplexo de polissacarídeo-proteína e copular o citado complexo depolissacarídeo-proteína no citado suporte, no qual o citado agente oxidante écapaz de oxidar dióis vicinais. Ainda mais preferivelmente, o agente oxidantepreferivelmente oxida dióis vicinais pelo menos sob condições controladas.Oxidação de dióis vicinais é preferida por que isto garante copulaçãoconfiável de um polissacarídeo contendo diol vicinal na matriz. Em umamodalidade preferida da invenção os polissacarídeos a serem copulados namatriz contêm um antígeno que é para ser reconhecido por um membro de umpar de ligação. Para ser reconhecível é preferido que o antígeno seja deixadonão modificado pelo menos na maioria dos polissacarídeos que estão sendocopulados no suporte. Isto requer um balanço entre o nível de oxidaçãorequerido para obter copulação eficiente na matriz e a disponibilidade deantígeno para associação com o membro do par de ligação. O último requerque o antígeno seja deixado essencialmente não afetado pela oxidação pelomenos em uma quantidade suficiente a ser usável em um ambientediagnóstico. Oxidação de dióis vicinais de acordo com a presente invençãogarante a disponibilidade de antígeno suficiente em forma reconhecívelenquanto que ao mesmo tempo permite copulação eficiente do polissacarídeono suporte. Em uma modalidade preferida o citado agente oxidantecompreende m-periodato (de sódio). Outros periodatos tal como periodato depotássio ou outros sais do mesmo também são adequados para permitiroxidação preferencial de dióis vicinais de acordo com a presente invenção.Oxidação de dióis predominantemente vicinais em um polissacarídeo dainvenção pode ser tipicamente realizada pela incubação de citadopolissacarídeo com o citado periodato em uma concentração entre 1 mM e 10mM de periodato. Outros parâmetros da reação influenciam tanto avelocidade quanto o tipo de reação predominantemente realizada. Umexemplo é tempo de incubação. Quando se aplicam tempos de incubaçãomuito curtos periodato acima de 10 mM pode ser usado. Periodatopreferivelmente oxida dióis vicinais, particularmente os dióis vicinais maissuscetíveis nas cadeias laterais do polissacarídeo. Assim desde que sejamescolhidas as denominadas condições de reação 'brandas', serão oxidadospreferivelmente dióis vicinais. Quando são escolhidas condições que tambémpermitem mais freqüentemente ocorrência de outras reações de oxidação (porexemplo por causa da depleção do substrato diol vicinal), o antígeno presenteno polissacarídeo será significativamente afetado. Assim para a presenteinvenção uma oxidação por periodato é citada como sendo branda quando asconcentrações preferidas mencionadas são usadas e quando pelo menos 20% epreferivelmente pelo menos 50%, com maior preferência pelo menos 70% emais preferivelmente cerca de 90% do antígeno permanece intacto após aoxidação. Disponibilidade ou integridade do antígeno é preferivelmentemedida por meio de um ensaio ELISA usando um anticorpo padronizado. Denovo nós não desejamos nos basear em qualquer teoria mas é correntementeconsiderado que periodato induzirá uma disrupção oxidativa de ligações entredióis vicinais sobre grupos especialmente carboidrato, como em e.g. manose,para dar funcionalidades aldeído. Esta reação é tipicamente realizada emtampões em uma faixa de pH entre 4,5 e 5,5 no escuro usando um meta-periodato de sódio 1-100 mM (preferivelmente) recém-preparado em acetatode sódio 0,1 M. Preferivelmente a reação é realizada em uma concentraçãoentre 1 mM e 10 mM de meta-periodato. A oxidação é realizada na presençade uma proteína dentro das faixas como discutido acima. Os compostos bis-aldeído, como os constituintes de monossacarídeo oxidados na cadeia depolissacarídeo de LPS, podem reagir com qualquer grupo amino em umaproteína e podem formar uma ligação de base de Schiff resultando em umaimina substituída. Quando um ou ambos os grupos hidroxila vicinais sãocondensados em uma ligação açúcar covalente, a função hidroxila é perdida enão ocorre oxidação. Este é o caso de muitos polissacarídeos ramificados e/oulinearmente ligados. No caso de LPS de Salmonella, a estrutura de núcleointerna transporta na maioria dos casos um Gal, GlcNAc, Hep e/ou KDOoxidável, mas constituintes Hep e KDO não-redutores são mais suscetíveis àoxidação, em particular em condições de oxidação muito brandas emconcentrações de meta-periodato menores do que 6 mM. Devido ao fato de aregião de núcleo ser uma parte bastante conservada de LPS deEnterobactericeae diferentes, (lipo)polissacarídeos de membros deEnterobaeterieeae podem ser aplicados em um método da invenção.

Periodato também oxidará, quando presente, certos derivadosde amino-etanol tais como os resíduos de hidróxi-lisina em colágeno, bemcomo metionina (para seu sulfóxido) e certos tióis (normalmente paradissulfetos). Em adição, resíduos de serina e de treonina N-terminais depeptídeos e de proteínas podem ser seletivamente oxidados por periodato emgrupos aldeído. Estas reações, contudo, normalmente ocorrem em umavelocidade menor do que a da oxidação de dióis vicinais e a presença de talgrupo não interfere substancialmente com um método de acordo com ainvenção. A invenção também proporciona um método para imobilização deum polissacarídeo sobre um suporte, compreendendo contatar o citadopolissacarídeo com um agente oxidante e uma proteína para obter umcomplexo de polissacarídeo-proteína e copular o citado complexo depolissacarídeo-proteína no citado suporte, adicionalmente compreendendouma etapa que resulta no término / na interrupção do processo de oxidação,por exemplo por dessalinização de citado complexo de polissacarídeo-proteína. Isto é por exemplo realizado com o auxílio de uma coluna de NAP-5. Contudo, a pessoa experiente na arte está ciente de que há muitos outrosmétodos que possuem o mesmo efeito, por exemplo adição de um redutor oude uma molécula facilmente oxidável tal como glicerol. Preferivelmente, omodo de interromper a oxidação é aquele no momento que é realizadamudança de tampão, por exemplo HPLC, FPLC, diálise, trocadores de íons,eletroforese em gel ou ultrafiltração. Para propósitos de armazenagem, aprodução de alíquotas evaporadas, após adição de proteína, também é descritadentro da parte experimental. Isto resulta na presença de um estoque grandede material reproduzível.

A invenção portanto adicionalmente compreende ointermediário obtido, i.e. a preparação de na presença de polissacarídeooxidado proteína, opcionalmente dessalinizada e opcionalmente evaporada.

Preferivelmente, o suporte usado é feito de um material não-hidrofóbico, inerte, e a ligação do complexo de LPS-proteína no citadosuporte é covalente. Ainda mais preferivelmente um tal suporte possui umaligação de proteína baixa ou ligação biomolecular baixa. Exemplos são umsuporte de vidro ou sílica ou de um plástico não-hidrofóbico. Em umamodalidade preferida o citado suporte está na forma de uma microesfera ouglóbulo. Vários tipos de microesferas ou glóbulos estão disponíveis para apessoa experiente na arte. Em uma modalidade preferida a citada microesferaou glóbulo compreende poliestireno. Microesferas ou glóbulos sãoparticularmente preferidos porque podem ser proporcionados com antígenosdiferentes usando um método da invenção. Microesferas ou glóbulos comantígenos diferentes podem ser conseqüentemente codificados com uma cordiferente. Teste de uma amostra para a presença de um anticorpo contra umantígeno pode ser feito usando uma coleção de microesfera ou glóbulosmencionados. Ligação do anticorpo em um tipo particular de antígeno podeser agora detectada facilmente pelo código de cor da microesfera ou glóbuloligado. Ligação do anticorpo pode ser detectada em várias maneiras. Porexemplo, microesfera ou glóbulos contendo anticorpo ligado pode serextraída(o) da amostra e medida(o) usando um outro anticorpo específico paraa região constante de anticorpo. Por outro lado, amostra pode ser diretamenteanalisada, i.e. na ausência de outras manipulações por marcação do anticorpoligado e simultaneamente detecção da cor do anticorpo e da cor damicroesfera ou glóbulo. Vários métodos para detecção simultânea de duas oumais cores estão disponíveis para a pessoa experiente na arte. Na presenteinvenção, uma cor é definida como qualquer tipo de radiação eletromagnéticaque pode ser detectada, ser uma cor típica revelada, por exemplo, por reflexãode luz, para luz emitida como um resultado de fluorescência oufosforescência.

A invenção assim adicionalmente proporciona uma coleção depelo menos duas microesferas ou glóbulos na qual pelo menos as duas citadaspelo menos duas microesferas ou glóbulos compreendem cada um antígenodiferente da presente invenção. Em uma modalidade preferida o citadoantígeno compreende antígeno O de Salmonella. Em uma modalidadeparticularmente preferida o citado antígeno é ligado em citado suporte demicroesfera ou glóbulos usando um método da invenção. Assimpreferivelmente pelo menos um de citados microesfera ou glóbuloscompreende um revestimento de polissacarídeo ligado em um polissacarídeocompreendendo um antígeno a ser detectado ligado um no outro via umpolímero compreendendo pelo menos dois grupos amina e/ou amida,preferivelmente uma proteína da invenção, no qual o citado polímero deligação (proteína) é ligado no citado polissacarídeo compreendendo o citadoantígeno, via um grupo amina e/ou amida sobre o citado polímero e um diolvicinal oxidado por periodato sobre o citado polissacarídeo compreendendocitado antígeno.

Em uma modalidade preferida a invenção proporciona ummétodo para imobilização de um polissacarídeo sobre um suporte,compreendendo contatar o citado polissacarídeo com um agente oxidante euma proteína para obter um complexo de polissacarídeo-proteína e copular ocitado complexo de polissacarídeo-proteína no citado suporte, adicionalmentecompreendendo ativar a superfície de citado suporte. Em uma modalidadeainda mais preferida, o citado suporte compreende uma superfície de vidrorevestida com ouro e ainda mais preferido o citado suporte é modificado comum doador de carboxila. Uma superfície pode ser ativada. Grupos ácidocarboxílico (COOH) (adicionalmente referidos como grupos carboxila) sãonecessários sobre esta superfície. Preferivelmente estes grupos COOH sãoproporcionados por uma camada homogênea estável de moléculas, que podemter sido modificadas para este propósito. Estas superfícies podem existir de,mas não limitadas a, polissacarídeos, alcanos ou alquenos modificados comácido carboxílico, tal como um polietileno, ligado em por exemplo,superfícies de ouro, poliestireno ou silício. Preferivelmente o suportecompreende um polissacarídeo que atua como um doador de carboxila. Maispreferivelmente uma camada de dextrano carboximetilado na qual o citadosuporte modificado por polissacarídeo, preferivelmente compreendendo umacamada de dextrano é ativado com cloridrato de l-etil-3-(3- dimetil-amino-propil)-carbodiimida e N-hidróxi-succinimida. A ativação é preferivelmenteseguida pela preparação com carbohidrazina. Na etapa seguinte o complexode polissacarídeo-proteína é adicionado na camada de dextrano ativada. Asfuncionalidades aldeído reativas reagem espontaneamente com a hidrazida ahidrazonas, que são então reduzidas para estabilizar as ligações covalentes.

Antes do uso rotineiro, o desempenho de LPS chip-conjugado para ligaranticorpos anti-Enterobacterium (por exemplo Salmonella ) é avaliado usandosoros de aglutinação policlonal de referência.

Dependendo da questão analítica / diagnostica indagada édecidido se um ou por exemplo pelo menos dois carboidratos representandosorogrupo diferentes, preferivelmente 4 carboidratos representando sorogrupodiferentes são usados. No caso de se ter interesse em saber qual sorogrupoparticular está presente, múltiplos carboidratos representando sorogrupodiferentes (cuja quantidade é diferente sobre a questão particular inquirida esobre a aparelhagem usada) são utilizados e se apenas se deseja saber se porexemplo um animal está ou tem sido infectado por um sorogrupo particular,um único carboidrato representando sorogrupo pode ser oxidado na presençade uma proteína e imobilizado sobre o um suporte. O uso de pelo menos doiscarboidratos representando sorogrupo diferentes resulta em um suporte quepode ser usado em uma análise de multi-sorogrupo. Mais preferivelmentepelo menos três e até mesmo mais preferido pelo menos mais do que três (porexemplo quatro) polissacarídeos diferentes são usados. Estes polissacarídeospodem ser oxidados na presença de um tipo de proteína ou na presença detipos diferentes de proteína. A pessoa experiente é capaz de fazer qualquercombinação sensível. Por exemplo, para se ser capaz de detectar mais do que90% de todas as infecções de Salmonella sorogrupos B, C e D em galinhasorogrupos B, C, D e E em porcos devem ser representados.

Uso de um tipo de carboidratos representando sorogrupo éextremamente útil se se está interessado na questão de se ou não um certo tipode bactéria está ou esteve presente. Uso de múltiplos carboidratosrepresentando sorogrupo diferentes é por exemplo útil se se deseja determinarse um animal está ou esteve infectado por qualquer bactéria gram-negativa(por exemplo Enterobacteriaceaé).

Em uma modalidade preferida a invenção proporciona ummétodo para imobilização de um polissacarídeo sobre um suporte,compreendendo contatar o citado polissacarídeo com um agente oxidante euma proteína para obter um complexo de polissacarídeo-proteína e copular ocitado complexo de polissacarídeo-proteína no citado suporte, no qual ocitado suporte é um chip biossensor. Um tal chip biossensor estácomercialmente disponível (por exemplo aquele produzido por Biacore) ecomo conseqüência não será proporcionada formação adicional.

Em outra modalidade a invenção proporciona um suporteobtido pelo método de acordo como descrito acima ou um suportecompreendendo um complexo de polissacarídeo-proteína imobilizado sobressua superfície. Em uma modalidade da invenção um suporte da invençãocompreende um revestimento de polissacarídeo que é ligado em um outrorevestimento de polissacarídeo via aminação redutiva, no qual o citado outrorevestimento de polissacarídeo compreende uma proteína copulada em citadooutro revestimento de polissacarídeo por meio de oxidação de dióis vicinaissobre o citado outro polissacarídeo - proteína. Em uma modalidade preferida acitada aminação redutiva é realizada. Em uma modalidade preferida ainvenção proporciona um suporte compreendendo um revestimento depolissacarídeo que é copulado no polissacarídeo.

Em ainda outra modalidade a invenção proporciona biossensorcompreendendo um suporte de acordo com a invenção. Se o suporte é obtidopor um método de acordo com a invenção pode ser por exemplo determinadopela extração dos polissacarídeos de citado suporte e determinação de seproteína covalentemente ligada está presente. Como já discutido acima osuporte também pode compreender polissacarídeos diferentes imobilizados(por exemplo antígenos O) possivelmente em combinações com tiposdiferentes de proteína. Contudo, também um tipo de proteína pode ser usadona oxidação de polissacarídeos diferentes.

Se um suporte e/ou chip da invenção é empregado pode ser porexemplo determinado com o auxílio de MALDI-MS possivelmente emcombinação com digestão proteolítica. Uma tal análise proporcionainformação com respeito à proteína e ao polissacarídeo usados. Com o auxíliode hidrólise ácida os complexos de polissacarídeo-proteína são liberados dosuporte. Uma tal mistura obtida é então submetida à análise LC-MS/MS antese após hidrólise proteolítica. O complexo obtido também pode ser submetidoa uma análise de monossacarídeo, por exemplo GC-MS após metanólise e/oudegradação de Smith, da qual é determinado qual tipo de LPS é usado. Estainformação é adicionalmente usada para determinar se KDO, Hep ou outrosaçúcares têm sido oxidados.

Um suporte da invenção pode ser usado em diferentes sistemasde detecção, por exemplo óptico, térmico, acústico, amperométrico,magnético ou químico e um suporte da invenção pode ser usado em qualquerensaio de interação biomolecular (BIA) ou qualquer ensaio de afinidade(AA). Como um exemplo não-limitante, o uso de detecção óptica viaRessonância de Plasmon de Superfície é descrito com mais detalhe.A invenção proporciona um sistema de detecção porRessonância de Plasmon de Superfície compreendendo um biossensor comodescrito acima. A camada de ouro no chip sensor cria as condições físicasrequeridas para Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR). O princípio deSPR será descrito no contexto dos instrumentos Biacore. Eles incorporam ofenômeno de SPR para monitorar interações biomoleculares em 'tempo real'.

Em uma interface entre dois meios transparentes de índice de refraçãodiferente tais como vidro e água, luz proveniente do lado de índice de refraçãomais alto é parcialmente refletida e parcialmente refratada. Acima de um certoângulo crítico de incidência nenhuma luz é refratada através da interface ereflexão interna total (TIR) ocorre na interface de filme metálico - líquido.

Esta é onde luz atravessa através de um meio opticamente denso tal comovidro, e é refletido de volta através daquele meio na interface com um meioopticamente menos denso tal como tampão.

Embora a luz incidente seja totalmente refletida, o componentede campo eletromagnético, chamado de onda evanescente, penetra umadistância da ordem de um comprimento de onda no meio menos opticamentedenso. A onda evanescente é gerada na interface entre um prisma de vidro(índice de refração alto) e uma camada de tampão (índice de refração maisbaixo). Se a interface entre os meios de índices de refração mais alto e maisbaixo estiver revestida com um filme metálico fino (uma fração decomprimento de onda de luz), então a propagação da onda evanescenteinteragirá com os elétrons sobre a camada de metal. Metais contêm nuvens deelétrons em sua superfície, que podem copular com a luz incidente em certosângulos. Estas nuvens de elétrons são também conhecidas como plasmons, e apassagem da onda evanescente através da camada de metal faz com que osplasmons ressonem, formando uma onda mecânica de um quantum conhecidacomo um plasmon de superfície. Portanto, quando ocorre ressonância deplasmon de superfície, energia da luz incidente é perdida para o filme demetal resultando em um decréscimo na intensidade de luz refletida. Ofenômeno de ressonância apenas ocorre em um ângulo agudamente definidoda luz incidente. Este ângulo é dependente do índice de refração do meiopróximo da superfície de filme metálico. Mudanças no índice de refração dasolução tampão (e.g. um aumento na concentração de superfície de solutos),para uma distância de cerca de 300 nm da superfície de filme metálicoportanto alteram o ângulo de ressonância. Monitoração contínua deste ângulode ressonância permite a quantificação de mudanças em índice de refração dasolução tampão próximo da superfície de filme metálico. Em Biacore de'tempo real', as propriedades do filme metálico, o comprimento de onda, e oíndice de refração do vidro (meio mais denso) são todos mantidos constantes,e como um resultado a SPR pode ser usada para monitorar o índice derefração da camada aquosa imediatamente adjacente à camadas de metal(ouro). No sistema Biacore o chip é composto de vidro, possui 4 canais e acamada de ouro associada está coberta com uma camada de dextranoquimicamente modificado para facilitar imobilização de ligantes tais comoanticorpos ou antígenos. Quaisquer mudanças em massa que ocorrem devidoà ligação do analito com o anticorpo imobilizado sobre o chip sensor causarãouma mudança no ângulo de SPR, que é monitorada em 'tempo real' equantificada como um sensorgrama. Uma mudança de massa deaproximadamente 1 kRU (1.000 RU) corresponde a uma mudança de massaem concentração de proteína de superfície de 1 ng/mm . Respostas típicaspara ligação de superfície de proteínas são da ordem de 0,1-20 kRU.

Não há necessidade de moléculas marcadoras com etiquetasfluorescentes ou radioativas de modo se evitar a possibilidade de que osmarcadores possam comprometer a atividade e ainda mais dificultar ouencarecer a química necessária para marcação.

Os suportes obtidos podem ser usados em tipos diferentes deanálises, tais como bacteriologia (ensaio direto) ou sorologia (ensaio indireto).Um exemplo de um ensaio sorológico é um método paradeterminar a presença de um anticorpo direcionado para um antígeno de umabactéria gram-negativa em uma amostra, compreendendo contatar a citadaamostra com um suporte ou um biossensor como descrito acima e determinarse o suporte tem ligado qualquer anticorpo (Figura 1).

Um tal método é por exemplo muito adequado para determinara presença de um anticorpo direcionado contra um antígeno O e assim éindiretamente estabelecido se uma infecção está presente ou se uma infecçãorecente tem ocorrido. Um tal método é por exemplo usado para selecionaranimais mortos para Salmonella ou para selecionar animais para Salmonellaantes de serem expostos no exterior. Ainda mais, o método também é aplicadoàs amostras obtidas de animais vivos (por exemplo, de fazenda ou zoológico).

Exemplos de amostras que podem ser usados em um talmétodo são amostra de tecido, fluido corporal, secreções ou excreções eexemplos mais detalhados são sangue, amostras derivadas de sangue, tecido,suco de carne, leite, ovo, fluidos de um olho, saliva ou fezes. Como jádescrito as amostras podem ser obtidas de animais tanto mortos quanto vivos.

Um método de acordo com a invenção não é limitado a umcerto (sub)tipo de imunoglobulina mas pode em princípio ser todo (sub)tipode imunoglobulina tal como (s)IgAi, (s)IgA2, IgD, IgGi, IgG2, IgG3, IgG4,IgM, IgY. Além disso, também pode ser qualquer outro material ligante deantígeno. Preferivelmente, um tal material ligante de antígeno é umbiomarcador de uma (história) de infecção.

Um tal ensaio sorológico é por exemplo direcionado para umcarboidrato representando sorogrupo particular ou para carboidratosrepresentando sorogrupo diferentes (i.e. multi-analito) e como conseqüênciaum tal método é por exemplo usado para determinar a presença ou ausênciade um certo (sub)tipo de Salmonella.

Um exemplo de um ensaio bacteriológico é um método paradeterminar a presença de uma bactéria gram-negativa em uma amostra,compreendendo contatar a citada amostra com uma quantidadepredeterminada de anticorpos direcionados contra um antígeno de citadabactéria e determinar a quantidade de anticorpos não ligados na citadabactéria com um suporte ou um biossensor como descrito acima.

Preferivelmente o antígeno é um carboidrato representandosorogrupo.

Este método opcionalmente adicionalmente compreende aremoção de anticorpos não ligados da amostra contatada e quantidadepredeterminada de anticorpos por exemplo por lavagem ou procedimentos deseparação imuno-magnética, centrifugação ou filtração.

Para este tipo de análise cada tipo de amostra pode ser usado,tal como ração animal, esterco, penas, solo, água para consumo ou água deesgoto, carne, suco de laranja, chocolate, pele, hortaliças, etc. Amostras deanimal podem ser obtidas de animais tanto vivos quanto mortos. Neste ensaiobacteriológico é usado um tipo único de anticorpo bem como uma mistura depelo menos dois tipos diferentes de anticorpo (direcionados contra antígenosdiferentes, por exemplo dois carboidratos representando sorogrupodiferentes).

Preferivelmente, tais ensaios sorológicos e bacteriológicos sãorealizados de tal modo que ligação em citado suporte ou citado biossensor édeterminada por Ressonância de Plasmon de Superfície ou contador deglóbulo ou microesfera fluorescente.

A fonte de amostras é como já descrito acima ilimitada e podeser por exemplo obtida de um humano ou animal. Exemplos de animaisadequados são cavalos (de raça), porcos, aves domésticas (por exemplogalinha, peru, codorniz, pato, e ganso), ruminantes (por exemplo bezerro ouvaca, cabra, ovelha). Os animais podem ser animais de fazenda, animais dezoológico bem como animais vivos livres. Além disso, as amostras destesanimais podem ser obtidas de animais tanto vivos quanto mortos.

Em ainda outra modalidade a invenção proporciona ummétodo para determinar a presença de uma bactéria gram-negativa em umaamostra compreendendo:

- contatar a citada amostra com bacteriófagos, específicos parabactéria alvo, e permitir que os bacteriófagos infectem a citada amostra,

- remover bacteriófagos não-ligados e/ou não-invasoresresultando em uma amostra infectada por bacteriófago,

- contatar a amostra infectada com bacteriófago com umorganismo indicador suscetível para os bacteriófagos usados,

- incubar durante pelo menos um ciclo de multiplicação debacteriófago,

- recuperar os bacteriófagos para obter uma amostra contendobacteriófago,

- analisar a citada amostra contendo bacteriófago com umsuporte ou biossensor de acordo como descrito acima.

Os métodos analíticos em sua maioria requerem antesenriquecimento e crescimento em meios específicos para detectar bactérias,incluindo Salmonella. Normalmente preparação de amostra é muitoconsumidora de tempo relativamente ao tempo de análise total. Geralmentedemora 3 a 5 dias antes de a presença de e.g. Salmonella poder serconfirmada. Em muitas situações, este tempo para análise é inaceitável eimpede comércio e indiretamente ameaça a saúde da comunidade.

O objetivo desta parte da invenção é o desenvolvimento de ummétodo diagnóstico rápido (preferivelmente dentro de 24 h) e/ou custo-efetivoe/ou específico e/ou sensível para a determinação da presença demicroorganismos. Por este motivo, é almejado o desenvolvimento de umensaio de interação biomolecular (BIA) que explora a capacidade debacteriófagos específicos para gênero e/ou sorovar para se multiplicarem emsuas bactérias 'vítimas'. Um incremento no número de fago(s) específico(s)para patógeno indica não apenas a presença do organismo alvo mas também éuma medição (semi-)quantitativa para o conteúdo de bactérias alvo naamostra testada.

Uma visão geral esquemática do método BIA proposto émostrada na Figura 2. Uma amostra particulada é homogeneizada porexemplo usando um homogeneizador Stomacher. Amostras líquidas sãomisturadas por agitação vigorosa. Células analito são então extraídas ouenriquecidas por qualquer método adequado e pode compreender (umacombinação de) crescimento seletivo, centrifugação, filtração e/ou separaçãoimuno-magnética (IMS). Células enriquecidas são fortificadas combacteriófagos específicos para bactérias e incubadas por uns poucos minutosmantendo agitação. Antes de o ciclo de multiplicação do bacteriófago sercompletado, as células são lavadas para remover o mais completamentepossível quaisquer bacteriófagos não-ligados e não-invadores. Após o ciclo demultiplicação do bacteriófago, a amostra é contatada com um organismoindicador suscetível, i.e. em uma fase viva que é sensível à penetração emultiplicação intracelular de bacteriófago, ao bacteriófago usado,preferivelmente na concentração mais alta possível (por exemplo culturanoturna concentrada). A suspensão de bacteriófago-bactéria é incubada porpelo menos um ciclo de multiplicação de bacteriófago. A suspensão infectadapor fago é então centrifugada ou filtrada para precipitar / remover o materialcelular e para recuperar bacteriófagos multiplicados. A amostra contendobacteriófago é injetada sobre um chip biossensor conjugado com LPS (deacordo com a invenção) para reter estas partículas no detector para a geraçãode resposta de biossensor analito-específico. Para ganhar o máximo de tempopossível o organismo indicador pode ser mantido como uma cultura contínuano laboratório e possuir uma densidade de células normalmente de IO9CFU/mL. Uma tal suspensão pode ser concentrada para IO10 CFU/mL, porquedensidades celulares mais altas aumentarão a sensibilidade do métodoproposto.

Este método pode ser usado para determinar um tipo único desorovar mas para detectar múltiplos sorovares em uma corrida, uma misturade bacteriófagos diferentes e uma mistura de bactérias indicadoraspossivelmente diferentes têm que ser aplicadas. Bacteriófagos específicospara bactérias alvo são descritos na arte anterior e exemplos sãoproporcionados na parte experimental, por exemplo, bacteriófagos anti-Salmonella enteritidis.

Tem sido descrito que fagos se ligam em LPS, incluindo ofago descrito na parte experimental para detecção de Salmonella. Chips /suportes adequados são chips / suportes com LPS ou com moléculas desuperfície de bactéria imobilizadas (portanto incluindo proteínas demembrana e outras biomoléculas ou uma combinação das mesmas). Uso deLPS de material de membrana celular evitará a geração de anticorposmonoclonais ou policlonais. Se ligação dos fagos nas biomoléculasbacterianas (LPS) não for satisfatória no ΒΙΑ, anticorpos anti-fagoimobilizados em chip biossensor poderão ter que ser usados em um BIA bemsucedido para capturar bacteriófagos da amostra sondada.

A invenção adicionalmente proporciona um kit comcomponentes adequados para uso em qualquer uma das aplicações descritas.

Dependendo da demanda do cliente, um tal kit compreende um chip / suportepronto para uso obtido por um método de acordo com a invenção. Quando ocliente deseja preparar o suporte por si mesmo, o kit pelo menoscompreenderá (lipo)polissacarídeo fortificado / enriquecido com proteína (porexemplo hemoglobina ou albumina de soro) em uma quantidadepredeterminada, um quantidade de agente oxidante (por exemplo periodato),tampões adequados. Opcionalmente, um tal kit compreende meio paradessalinização, por exemplo uma coluna de dessalinização. Quando o clientedeseja misturar (lipo)polissacarídeo e proteína por si mesmo estescomponentes serão liberados separadamente juntamente com um manual deinstruções. Opcionalmente, um tal kit pode adicionalmente compreender sorosde referência positivos e/ou negativos, um tampão de diluição de amostra ealgum manual de instruções necessário.

Os métodos como descritos acima são particularmenteadequados para seleção de amostras em uma base de escala grande. Em umdos ambientes iniciais (lento) 96 amostras eram checadas dentro de 33minutos. Em um ambiente de escala grande com equipamento de biossensorrelativamente lento 15.000 amostras eram selecionadas dentro de 3 meses.Este número poderia ter sido muito maior mas infelizmente um osabatedouros interrompeu sua participação.

A invenção será explicada com mais detalhe na descriçãoseguinte, que não é limitante da invenção.

Exemplos

Exemplo 1

Materiais e métodos

1.1 Materiais

1.1.1 Compostos químicos

Kits de copulação de amina, consistindo de N-hidróxi-succinimida (NHS), cloridrato de l-etil-3-(3- dimetil-amino-propil)carbodiimida (EDC) e cloridrato de etanol-amina - hidróxido de sódiopH 8,5 e o tampão de corrida (HBS-EP), contendo HEPES 10 mM, cloreto desódio 150 mM, EDTA 3 mM e 0,005% (v/v) de tensoativo P20 em pH 7,4,foram adquiridos da Biacore AB (Uppsala, Suécia), que também forneceuhidróxido de sódio 50 mM e glicina 10 mM prontos para uso. Etanol, etileno-glicol, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e ácido tricloco-acético (TCA)foram adquiridos da Merck (Darmstadt, Alemanha). Sal de sódio de dextranocarboximetilado, cianoboroidreto de sódio e carbohidrazida foram adquiridosda Fluka Ghemie GmbH (Buchs, Suíça). CHAPS (Plus one) foi fornecidopela Pharmacia Biotech (Uppsala, Suécia). Acetato de sódio tri-hidratado eácido acético foram fornecidos pela J.T. Baker (Deventer, Os Países-Baixos).Cloridrato de guanidina foi obtido de Calbiochem (San Diego, CA, U.S.A.).Mioglobina (Mb) e hemoglobina (Hb) porcina, albumina de galinha (Ob; 98%grau V), albumina de soro bovino (BSA; 96% Fração V), periodato de sódio,Tween-20, Tween-80 e Triton X-IOO foram adquiridos de Sigma ChemicalCompany (St. Louis, MO, U.S.A.). Agua foi obtida de um sistema depurificação de água Milli Q (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.).

1.1.2 Materiais

Colunas NAP-5 (0,5 mL; Sephadex G-25) foram adquiridas deAmersham Biosciences (Roosendaal, Os Países-Baixos) e foram usadas comodescrito pelo produtor. Chips biossensores foram adquiridos de Biacore AB.Saco de diálise (Spectra/Por) com um corte de 1 kDa foi obtido de SpectrumLaboratories Inc. (Rancho Dominguez, CA, U.S.A.)

1.1.3 Anti-sorús anti-Salmonella

Os seguintes anti-soros lapine somático Ό' monovalente deSalmonella foram usados: anti-04, anti-05, anti-06,7, anti-08, anti-09, anti-O10, anti-012, O Poly E (anti-03, anti-010, anti-015, anti-019, anti-034).Em adição, anti-soros lapine (Poly A-S) somático Ό' polivalente deSalmonella (anti-02, anti-03, anti-04, anti-05, anti-06,7, anti-08, anti-09,anti-ΟΙΟ, anti-Oll, anti-012, anti-013, anti-015, anti-016, anti-017, anti-018, anti-019, anti-020, anti-021, anti-022, anti-023, anti-028, anti-030,anti-034, anti-035, anti-038, anti-040, anti-041) também foram usados. Ossoros foram adquiridos de Pro-Lab diagnostics (Salmonella Reference Sectionof the Central Veterinary Laboratory, Weybridge, U.K.). Anticorposmonoclonais de murino específicos para sorogrupo anti-B (anti-04, 05 en027), anti-C (anti-07, 08), anti-D (anti 09, Vi) e anti-E (anti-03, 019) foramcomprados de SIFIN (Berlin, Alemanha).Soros foram diluídos 1:20 (v/v) em HBS-EP contendo cloretode sódio 1,0 M, 1% (m/v) de dextrano carboximetilado e 0,05% (v/v) deTween 80, exceto soro anti-05 que foi diluído 1:200 (v/v) e as preparaçõesespecíficas para anti-sorogrupo foram diluídas 1:100 (v/v) no mesmosolvente.

1.1.4 Soros de porcos e de aves de referência

Todos os soros de referência foram obtidos de Dutch AnimalHealth Service (Deventer, Os Paises-Baixos). Os soros de referência de aveforam reativos com Salmonella enteritidis (sorogrupo D1), S. typhimurium(sorogrupo B), S. pullorum / gallinarum (sorogrupo Di) e S. infantis(sorogrupo Cj), e foram adicionalmente referidos como C-Se, C-St, C-Spg eC-Si, respectivamente. Estes soros de galinha foram originalmente preparadospara análises ELISA como referências positivas. Em adição, soro de galinhalivre de patógeno específico (adicionalmente referido como C-SPF) foiadquirido como uma amostra de referência de controle negativo. Estes sorosforam reconstituídos de material seco por congelamento pela adição de águaem um volume indicado pelo fabricante. C-Se, C-Spg e C-Si foramdiluídos 1:200 (v/v) em HBS-EP contendo cloreto de sódio 1,0 M, 1,0% (m/v)de dextrano carboximetilado e 0,05% (v/v) de Tween-80, enquanto que C-SPF e C-St foram diluídos 1:50 (v/v) na mesma solução. Igualmente, sorosporcinos de animais desafiados com S. typhimurium e S. Iivingstone(sorogrupo Ci) foram referidos como P-St e P-Sl, respectivamente. Emadição, soro porcino reativo como sorotipo 2 de Actinobacilluspleuropneumoniae usado como controle em um teste de fixação de referência,foi explorado como controle negativo para soro porcino no ensaio debiossensor de Salmonella. Os soros porcinos foram diluídos 1:20 (v/v) emHBS-EP contendo cloreto de sódio 1,0 M, 1% (m/v) de dextranocarboximetilado e 0,05% (v/v) de Tween 80 como concentrações finais.

1.1.5 Estoque de SalmonellaAs bactérias Salmonella goldcoast (Sg; sorogrupo C2), S.Iivingstone (Sl) e S. melaegridis (Sm; sorogrupo Ei) foram obtidas de umacoleção em casa, enquanto que S. enteritidis #23 fago tipo Pt4 (Se), e S.typhimurium X- 193 fago tipo 507 (St) foram gentilmente cedidas por F. G.van Zijderveld (Animal Sciences Group, Lelystad, Os Países-Baixos). Asbactérias foram crescidas em culturas noturnas em Caldo Nutriente #2(Oxoid, Basingstroke, U.K.). Estoques de cepas de Salmonella forammorfológica e bioquimicamente confirmadas como Salmonella e tambémforam verificadas para a presença dos antígenos O corretos, esperados poruma reação de aglutinação das células com anti-soros anti-antígeno O padrãoespecíficos (Pro-Lab diagnostics) como indicado na Tabela 3 sobre uma placade vidro. Após diluição de uma metade do volume original com glicerol(Merck), estoques foram armazenados em porções a -80°C.Tabela 3.Verificação de antígeno O dos sorovares de Salmonella usados para produçãode LPS. A reação esperada de anti-soros usados para verificação poraglutinação, é dada.<table>table see original document page 34</column></row><table>1.2 Métodos

1.2.1 Extração de LPS

Culturas noturnas de Salmonella foram preparadas pelaaplicação de 100 \iL· de seus estoques correspondentes sobre cada uma das120 placas contendo ágar de infusão de coração e cérebro (BHIa, Oxoid). Apresença de sorovar de Salmonella esperado foi confirmada por meio decrescimento seletivo convencional, classificação bio- e imunoquímica, sempreque novas suspensões de estoque eram obtidas. As bactérias foram colhidasda superfície das placas para dentro de 1 mL de solução de NaCl 9 g/L(solução salina) por placa de ágar usando uma espátula trigalski. Cada placafoi lavada duas vezes com 2 mL de solução salina. Bactérias foram colhidasem seis tubos de centrifugação. Cada tubo foi complementado com 100 mLde solução salina misturado antes da centrifugação a 10.000 g e a 4°C por 15min e o sobrenadante foi descartado. Esta etapa de centrifugação foi repetidaduas vezes por suspensão das células em 75 mL de solução salina de lavagempor tubo cada corrida. Enquanto mantidas sobre gelo, as bactérias pelotizadasforam suspensas em água em uma razão volumar, que foi uma de 5 vezes emrelação ao peso das bactérias. Um equivolume de TCA 0,250 M (Se) ou 0,500M (Sg, Sl Sm e St) foi adicionado para dar concentrações finais de 0,12 M e0,25 M, respectivamente, seguido por agitação contínua a 4°C por 3 h. Umsobrenadante contendo lipopolissacarídeo (LPS) foi então adquirido a 20.000g e a 4°C por 30 min. O pH do sobrenadante foi ajustado para pH 6,5 comhidróxido de sódio 5 M e quando próximo do pH almejado com hidróxido desódio 0,10 Μ. O volume final da solução contendo LPS foi determinado antesda armazenagem a -18°C por 30 min. A solução foi diluída com um volumeduplo de etanol absoluto congelado de um local de armazenagem a -18°C, eincubação foi continuada durante a noite a -4°C sem agitação em umdispositivos fechado, construído em casa, com etileno-glicol / água (1:4, v/v)frio circulando. Uma pelota contendo LPS foi obtida após centrifugação a20.000 g e a -4°C por 30 min. O material particulado foi suspenso em umvolume de 0,5 mL de água por grama de massa bacteriana original pesada noinício do processo de extração. A suspensão foi dialisada em um saco dediálise de 1-kDa contra água a 4°C por dois dias com reposição de águaintermitente regular. O conteúdo do saco foi centrifugado a 20.000 g e a 4°Cpor 30 min, e o sobrenadante foi liofilizado. O liofilizado foi pesado paraestabelecer a recuperação de LPS. LPS foi reconstituído em água para comporuma concentração final de 5 mg/mL. Dependendo do tipo de LPS e dabatelada (veja seção 1.2.2), um volume de 1 mg/mL de hemoglobina (Hb)porcina foi adicionado em uma concentração como indicada no texto. Cadabatelada foi dividida em porções de frações de LPS de 0,5 mg, que foramsecas usando um evaporador a vácuo e então armazenadas a 5-8°C.

1.22 Conteúdo de hemoglobina ótimo

Proteína foi adicionada em uma preparação de LPS antes desua modificação química e imobilização em um chip sensor para adquirirníveis de revestimento altos e antígenos responsivos a soro altos. O conteúdoótimo de Hb em cada batelada de LPS foi estabelecido por comparação dasrespostas de LPS imobilizado que foi fortificado com Hb em níveis diferentes,usando um painel de soros de referência negativos e positivos.

1.2.3 Oxidação de LPS

Uma porção de 0,5 mg de LPS fortificado com hemoglobinafoi dissolvida em 500 μί de acetato de sódio 100 mM de pH 5,5. Após aadição de 20 μί de periodato de sódio 50 mM, a solução foi incubada por 40min sobre gelo protegida da luz. A oxidação de LPS foi interrompida e asolução foi dessalinizada pela passagem de 500 pL da mistura reacionalatravés de um cartucho NAP-5 com um fluxo controlado por gravidade. LPSmodificado foi eluído com 1 mL de acetato de sódio 10 mM, pH 4,0. Antes douso, o cartucho foi condicionado três vezes com 3 mL de acetato de sódio 10mM, pH 4,0.1.2.4 Imobilização de LPS

Para imobilizar os antígenos em um chip sensor, os seguintesmanuseios foram conduzidos em uma vazão de fluxo de 5 jiL/min em uminstrumento Biacore 3000 controlado por Biacore 3000 Control Software(version 3.1.1; Biacore). Imobilização de LPS oxidado foi realizada pelaexecução do procedimento de copulação de aldeído descrito em BIAApplications Handbook, version AB (1998). Resumidamente, a camada dedextrano no chip biossensor CM5 foi ativada com um pulso de 7-min de umamistura de EDC/NHS disponível do kit de copulação de amina. A ativaçãotambém foi imediatamente seguida pela injeção de carbohidrazida aquosa 5mM por 7 min.

Desativação do excesso de grupos reativos foi então realizadacom um pulso de etanol-amina 1 M por 7 min. Antes da imobilização, LPS foidiluído em acetato de sódio de pH 4,0 em uma razão dependente do sorovarde Salmonella (veja texto) e imobilizado por 32 min. A ligação entre a matrizde dextrano e o antígeno foi então estabelecida por injeção de cianoboroidretode sódio 100 mM dissolvido em acetato de sódio 10 mM em pH 4 em umavazão de fluxo de 2 μί/ηιΐη por 20 min. Uma resposta relativa indicativa deum procedimento de imobilização de LPS bem sucedido é 2 kRU para umasolução de LPS de 62,5 μg/mL contendo 15% (m/m) de proteína, e 9 kRUpara uma solução de LPS de 250 μg/mL contendo 50% (m/m) de proteína.

1.2.5 Ensaio de biossensor SPR

Ensaios de biossensor SPR óptico foram realizados em umaplataforma de biossensor SPR Biacore 3000 controlada pelo mesmo programade computador como descrito acima. Antes da injeção, soros foram diluídosem tampão HBS-EP contendo 1,0% (m/v) de sal de sódio de dextranocarboximetilado, cloreto de sódio 1,0 M e 0,05% (m/v) de Tween 80 em umarazão de 1:50 (v/v) ou diferentemente como indicado no texto. As misturasforam incubadas por pelo menos 2 min na temperatura ambiente. Soros deporco firam incubadas por pelo menos 2 min na temperatura ambiente,enquanto que soros de ave foram injetados por 2 min a 5 μΙ7ιηΐη ou 20μL/min como indicado.

Regeneração do chip para recuperar a atividade antigênica dasuperfície de sensor foi realizada com um pulso de 15 s de glicina 6 mM empH 2, contendo cloridrato de guanidina 6 M, 0,1% (m/v) CHAPS, e 0,1%(v/v) de cada Tween-20, Tween-80 e Triton X-100. Isto foi seguido por umasegunda etapa de regeneração com o tampão de corrida HBS-EP enriquecidocom 0,05% (m/v) de CHAPS (concentração final) por 12 s a 100 μΙ7ιηπι.

1.2.6 Análise de monossacarídeo

Metil-glicosídeos (metil-éster) trimetilsililados forampreparados das amostras de glicano por metanólise (HCl metanólico 1,0 M,24 h, 850C) seguido por re-N-acetilação e trimetilsililação, e então analisadospor cromatografia gasosa / espectrometria de massa como descrito por[Kamerling JP, Vliegenthart JFG (1989)]. A análise quantitativa foi realizadapor cromatografia gasosa em uma coluna capilar EC-I (30 m χ 0,32 mm,Alltech) usando um cromatógrafo a gás Chrompack CP 9002 operado comum programa de temperatura de 140°C para 240°C a 4°C/min, e detecção porionização de chama. A identificação dos derivados de monossacarídeo foiconfirmada por cromatografia gasosa / espectrometria de massa em umsistema Fisons Instruments GC 8060/MD 800 (Interscience) equipado comuma coluna AT-I (30 m χ 0,25 mm, Alltech).

Resultados

Isolamento de LPS

Para a produção de LPS, rendimentos de células bacterianas ede LPS foram comparados com cultura em placa de ágar e crescimento deSalmonella em caldo (Tabela 4). Devido a razões técnicas de laboratório, foidecidido coletar bactérias das placas de ágar, em vez do isolamento dascélulas dos frascos de cultura. Os resultados do isolamento de LPS de Se, Sg,Si, Sm e St estão sumariados nas Tabelas 5 a 9, respectivamente. Oisolamento padronizado de LPS bem definido é determinativo para um ensaiosorológico bem sucedido e robusto. Para garantir desempenho de ensaiodiferenças de batelada para batelada devem ser mantidas em um mínimo. Poreste motivo, foram produzidas várias bateladas de LPS extraídas de cada Se,Sg, SI, Sm e St. A recuperação de LPS depende largamente da concentraçãofinal de TCA na mistura durante a extração de LPS (cf. Tabela 6 e Tabela 8),embora esta relação não esteja completamente clara para a extração de LPS deSt (Tabela 9). De fato, nenhuma concentração de TCA ótima acurada pôde serdeterminada para cada tipo de LPS por meio do teste de uma faixa ampla deconcentrações de TCA. Aqui, TCA ótimo renderia quantidades de LPS maisaltas, e daria respostas de biossensor não específicas mais baixas e sorológicasespecíficas mais altas. Neste estudo, a concentração de TCA escolhida como'ótima' para extração de LPS de sorotipos diferentes de Salmonella foibaseada nos rendimentos de LPS finais após diálise, e foram 0,12 M, 0,25 M,0,25 M, 0,25 M e 0,25 M como concentrações finais para Se, Sg, SI, Sm e St,respectivamente.

Tabela 4. Recuperação de LPS de células de S. enteritidis crescidas quercomo uma suspensão em um biorreator contendo caldo nutriente #2 (caldo)quer sobre placas de ágar BHI (ágar). LPS foi isolado usando concentraçõesfinais de TCA indicadas. O rendimento de LPS relativo à quantidade decélulas isoladas é indicado na última coluna.

<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

* pH de mistura contendo TCA é remoto

** algum material foi perdido durante o processo de recuperação.Tabela 5. Recuperação de células de Salmonella enteritidis crescidas sobreplacas BHIa. LPS foi isolado usando concentração final de TCA de 0,12 M(cf. Tabela 4). Rec, recuperado.

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Tabela 6. Recuperação de células de Salmonella goldcoast crescidas sobreplacas BHIa. LPS foi extraído usando uma concentração final de TCA comoindicado. Rec, recuperado.

<table>table see original document page 40</column></row><table>

a concentração final de TCA na mistura de extração.aproximadamente um terço da produção foi perdido durante a recuperação.Tabela 7. Recuperação de células de Salmonella livingstone crescidas sobreplacas BHIa. LPS foi extraído usando concentração final de TCA de 0,250 MTCA. Rec, recuperado.

<table>table see original document page 40</column></row><table>

Tabela 8. Recuperação de células de Salmonella meleagridis crescidas sobreplacas BHIa. LPS foi isolado usando uma concentração final de TCA comoindicado. Rec, recuperado.<table>table see original document page 41</column></row><table>

a concentração final de TCA na mistura de extração.

b bateladas Sm2003.1 a 2003.2 foram combinadas em uma batelada únicachamada de Sm2003.1

Tabela 9. Recuperação de células de Salmonella typhimurium crescidas sobreplacas BHIa. LPS foi isolado usando uma concentração final de TCA de0,250 M. Rec, recuperado.

<table>table see original document page 41</column></row><table>

a concentração final de TCA na mistura de extração.

b bateladas St2003.2 a St2003.4b foram combinadas em uma batelada únicachamada de St2003.2

A composição de monossacarídeo de preparações de LPSisolado foram analisadas para revelar a consistência do procedimento deisolamento e purificação para LPS de diferentes crescimentos de Salmonella.Tem que ser observado que análises foram realizadas sobre preparações deLPS que estavam prontas para oxidação e por este motivo fortificadas com Hbem níveis que foram determinados mais ótimos para a batelada de LPS testada(veja abaixo). Para este propósito, análises C-FID e GC-MS foram realizadasapós metanólise das preparações de LPS fortificadas com Hb (Tabela 10 aTabela 14). Estes resultados mostram que Hb não contribui para umaquantidade significativa de carboidratos na preparação final de LPS. Análisede BHIa, mostrou a presença de exclusivamente galactose (Gal) e glicose(Glc). O conteúdo destes monossacarídeos foi 5,6 μg/mg de BHIa seco.Análises de preparações de LPS de Salmonella, demonstraram a ocorrência deGal, Glc, N-acetil-glicosamina (GlcNAc), glicero-mano-heptose (Hep), ácido2-ceto-3-desóxi-octônico (KDO), manose (Man) e ramnose (Rha; 6-desóxi-manose) de acordo com suas estruturas de carboidrato. Sua ocorrência relativafoi expressada como uma razão molar para 1,0 Man (como parte da regiãoPS) ou relativa a 3.0 Hep (como parte da região de núcleo). Contudo, deve serobservado que a região de núcleo contém 2 ou 3 resíduos Hep. Ainda mas,GlcNAc pode originar quer de GlcNAc como na unidade repetida de Sl LPS,quer de glicosamina (GlcN), que ocorre como dissacarídeo no grupo lipídeo Acomo estrutura principal para os lipídeos ligados. Gal ocorre na região denúcleo, que está conservada em todos os sorovares de Salmonella enterica, etambém na região PS de Se, Sg, St e Sm. Nestes casos, é esperado que a razãomolar de Gal seja maior do que 1,0 Man, exceto para Sg no qual cada unidaderepetida contem 2 resíduos Man. As análises de monossacarídeo nãoincluíram a detecção de constituintes O-acetilados, fosforil-etanol-aminadosou fosforilados, nem aquele de abequose (Abe; 3,6-didesóxi-xilo-hexose) outivelose (Tyv; 3,6-didesóxi-arabinose), que também correm no polissacarídeoe nas regiões de núcleo dos tipos isolados de LPS.

Análises de Se LPS, mostraram a ocorrência de Gal, Man eRha em uma razão molar de 1,4, 1,0 e 1,2, respectivamente, em bateladaSe2003.1, enquanto que esta razão foi 1,1, 1,0 e 0,9, respectivamente, embatelada Se2003.4 (Tabela 5). Esta razão está em boa conformidade com acomposição de uma unidade repetida como [Tyv-]Man-Rha-Gal, exceto que arazão de Rha foi significativamente excessivamente alta em bateladaSe2003.1. O conteúdo de carboidrato calculado baseando-se nosmonossacarídeos determinados, foi significativamente maior em bateladaSe2003.4, a saber 241 μg comparado com 123 μg da batelada Se2003.1.Considerando a ocorrência de 2 resíduos GlcN no lipídeo A e um únicoresíduo GlcNAc na região de núcleo e um único resíduo Man em cadaunidade repetida, o número de unidades repetidas estimado foi 19 e 20 embateladas Se2003.1 e Se2003.4, respectivamente.

Análise de monossacarídeo de Se2003.1 oxidado demonstraclaramente diferenças significativas com a batelada idêntica não-oxidada(Tabela 10). Em contraste aos dois resíduos GlcN, é esperado que o resíduoGlcAn terminal, não-redutor esteja oxidado na maior parte. Derivados dealditol não foram detectados pela análise de monossacarídeo aplicada e umaquantidade correspondente de GlcNAc-ol não foi determinada. Visto que Gale Man na unidade repetida não são suscetíveis à oxidação por periodato, arazão molar de Man na batelada oxidada é normalizada para aquela de Manna batelada não-oxidada. Deve ser notado que ambos os resíduos Gal naregião de núcleo são suscetíveis à oxidação e assim a razão total de Gal éafetada. Inspeção da estrutura molecular de Se LPS, sugere que em adição aoGlcNAc terminal e Gal de núcleo, dissacarídeo terminal KDOII-KDOIII, eHepI conjugado e HepIII terminal também são suscetíveis à oxidação porperiodato. De fato, as razões molares destes resíduos de monossacarídeosugerem a perda de um resíduo Hep e de aproximadamente 1,6 resíduosKDO. Deve ser observado que KDOII pode não ser completamente oxidadoquando este resíduo está conjugado com um grupo fosfotil-etanol-amina.

Tabela 10. Análise de monossacarídeo de LPS de S. enteritidis e de LPS de S.enteritidis oxidado. LPS foi fortificado com Hb a 15% (m/m). Razões molaresforam determinadas baseando-se em dois resíduos GlcN e um resíduoGlcNAc (detectados como três resíduos GlcNAc) presentes nas regiões denúcleo e de lipídeo A (referidas como NÚCLEO) e baseando-se em umresíduo Man na unidade repetida (referida como UNIDADE). ResíduosGlcNAe e Man normalizados são indicados sublinhados. Conteúdo decarboidrato foi determinado em preparações de LPS de 0,5 mg, exceto análisede monossacarídeo foi realizada em 125 mg de material oxidado.Razão molar

Monossacarídeo Batelada Se2003.1_Batelada Se2003.1 (oxidada) Batelada Se2003.4

<table>table see original document page 44</column></row><table>

a não inclui a contribuição de resíduos Tyv;

b Quantidade de material contendo LPS- analisado não foi acuradamentedeterminada.

Comparado com Se LPS, análise de monossacarídeo de SgLPS sugere que a estrutura de LPS foi menor à medida que o número deunidades repetidas foi significativamente menor (Tabela 11). A contribuiçãorelativa de Gal de núcleo para PS Gal é por este motivo maior e a razão molartotal verificada é 1,5. Em uma maneira similar, a razão molar para Glcverificada é 1,3 (batelada Sg2003.2) e 1,5 (batelada Sg2003.3), enquanto quea razão molar para Rha está de acordo com a estrutura esperada. Contudoparece que a batelada Sg2003.2 contém menos HepIII terminal e KDOIIIterminal e portanto poderia oferecer possibilidade menor para imobilização nochip sensor.

Tabela 11. Análise de monossacarídeo de LPS isolado de S. goldcoastfortificado com Hb a 50% (m/m). Razões molares foram determinadasbaseando-se em dois resíduos GlcN e um resíduo GlcNAc (detectados comotrês resíduos GlcNAc) presentes nas regiões de núcleo e de lipídeo A(referidas como NÚCLEO) e baseando-se em dois resíduos Man na unidaderepetida (referida como UNIDADE). Resíduos GlcNAc e Man normalizadossão indicados sublinhado. Conteúdo de carboidrato foi determinado empreparações de LPS de 0,5 mg.<table>table see original document page 45</column></row><table>

a não inclui a contribuição de resíduos Abe.

Normalização do número de resíduos de núcleo de resultadosde análise de carboidrato de Sl LPS (Tabela 12) foi impedida pela ocorrênciade GlcNAc nas unidades repetidas de PS. Quando o número de resíduos Hepfoi ajustado em 3,0, ocorreu uma sobreestimativa inaceitável do número deresíduos KDO. Por este motivo, o número de Hep foi ajustado em 2,0, maspode necessitar ser modificado, de modo que o número de KDO fiquepróximo de 3,0. Visto que o número de resíduos Man em cada unidaderepetida é quatro, razões molares foram corrigidas para 4,0 resíduos Man.Baseando-se em uma razão molar de 4:1 de Man/GlcNAc na região PS, onúmero de unidades repetidas foi calculado baseando-se nos resíduos LipídeoA GlcN e GlcNA de núcleo restantes. Este cálculo revelou que o número deunidades repetidas em Sl também foi relativamente pequeno, a saber 8 e 10unidades em batelada S 12003.1 e batelada 2003.2, respectivamente.Tabela 12. Análise de monossacarídeo de LPS isolado de S. Iivingstonefortificado com Hb a 50% (m/m). Razões molares foram determinadasbaseando-se em dois resíduos Hep presentes no núcleo (referidos comoNÚCLEO) e baseando-se em quatro resíduos Man na unidade repetida(referida como UNIDADE). Resíduos Man e GlcNAc normalizados sãoindicados sublinhados. Conteúdo de carboidrato foi determinado empreparações de LPS de 0,5 mg, n.d., não detectado.<table>table see original document page 46</column></row><table>

Tabela 13. Análise de monossacarídeo de LPS de S. meleagridis. BateladasSm2003.1 e Sm2003.3 foram fortificadas com 50% (m/m) de Hb. Razõesmolares foram determinadas baseando-se em dois resíduos GlcN e um resíduoGlcNAc (detectados como três resíduos GlcNAc) presentes nas regiões delipídeo A e de núcleo (referidas como NÚCLEO) e baseando-se em umresíduo man na unidade repetida (referida como UNIDADE). ResíduosGlcNAc e Man normalizados são indicados sublinhados. Conteúdo decarboidrato foi determinado em preparações de LPS de 0,5 mg.

<table>table see original document page 46</column></row><table>

a não inclui a contribuição de grupos O-acetila, que podem estar ligados nosresíduos Gal repetidos.

Análise de monossacarídeo de Sm LPS (Tabela 13) mostrouuma composição completamente diferente como aquela para Sl LPS deacordo com sua estrutura molecular contendo unidades repetidas Man-Rha-Gal. Como descrito acima, a razão molar para Gal é maior do que o esperado1,0 na unidade repetida parcialmente pela contribuição de resíduos Gal naregião de núcleo.

Igualmente, razões equimolares são esperadas para Glc, Man,Rha e Gal porque estes resíduos formam uma unidade repetida em St LPS(Tabela 14). Aqui deve ser observado que abequose também é parte daunidade repetida, mas não é aplicada na análise. Batelada St2003.2, contudo,contém KDO e Hep menos oxidável, que pode afetar a eficácia daimobilização de LPS desta preparação. Por outro lado, batelada St2003.2contém muito mais carboidrato do que a batelada St2003.1, a saber 249 μg emrelação a 154 μg em 0,5 mg de LPS, respectivamente.

Tabela 14. Análise de monossacarídeo de LPS de S. typhimurium. BateladasSt2003.1 e St2003.2 foram fortificadas com Hb a 15% (m/m) e 25% (m/m),respectivamente. Razões molares foram determinadas baseando-se em doisresíduos GlcN e um resíduo GlcNAc (detectados como três resíduos GlcNAc)presentes nas regiões de lipídeo A e de núcleo (referidas como NÚCLEO) ebaseando-se em um resíduo Man na unidade repetida (referida comoUNIDADE). Resíduos GlcNAc e Man normalizados são indicadossublinhados. Conteúdo de carboidrato foi determinado em preparações deLPS de 0,5 mg.

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a não inclui a contribuição de resíduos Abe (O-acetilados).Imobilização de LPS suportado em proteína

Surpreendentemente, LPS intacto insatisfatoriamente copuloupor meio de sua função ácido carboxílico-KDO em dextrano carboximetiladoativado por EDC/NHS, e respostas significativas de soros de referência nãoforam obtidas. Para melhorar a imobilização de LPS no chip sensor, LPS foioxidado usando periodato de sódio para criar grupos aldeído reativos em seusconstituintes carboidrato, que permitiriam o denominado procedimento decopulação de aldeído, i.e. condensação de aldeído com uma função hidrazidaem uma ligação hidrazona seguida por redução para um produto hidrazida.Sem oxidação, LPS tinha de fato pouco potencial para imobilizar em umasuperfície de um chip CM5 revestido com carbohidrazida (resultados nãomostrados).

Copulação de LPS oxidado, contudo, deu reatividadedesapontadora com soros de referência, provavelmente como um resultado deimobilização insuficiente dos antígenos. LPS extraído em fenolcomercialmente adquirido (i.e. clivagem de lipídeo A), de S. enteritidis deurespostas baixas quando imobilizado após oxidação, a saber 187 RU e 167RU, respectivamente. Tem que ser observado, contudo, que além dacopulação insatisfatória, oxidação pode ter destruído uma parte das estruturasantigênicas, que pode dar respostas sorológicas insatisfatórias. O grau deoxidação foi investigado pela análise de monossacarídeo de Se LPS (Tabela10). Esta análise revelou que quantidades relativas de KDO, Hep e GlcNAc,que são constituintes da região de núcleo e não das unidades antigênicasrepetidas na parte PS, foram significativamente reduzidas comparado com SeLPS não oxidado. O importante é que parte de resíduos de monossacarídeo dePS, e portanto estruturas antigênicas, aparentemente permaneceram intactossob as condições de oxidação suaves, que foram aplicadas.

Tabela 15. Respostas de biossensor após imobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfície de chip, que foram preparadoscom Se ou St LPS oxidado e não oxidado na presença de 15% (m/m) de Hbporcina.<table>table see original document page 49</column></row><table>

a anti-soro contra antígeno O indicado foi testado

Tabela 16. Respostas de biossensor após imobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfície de chip, que foram preparadoscom St LPS oxidado (batelada St2003.1) na presença de 7% (m/m) daproteína indicada.

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a nível de imobilização;

b BSA foi adicionado em LPS oxidado e dessalinizado;

c imobilização de LPS foi considerada muito baixa para outra análise de sorosde referência.

Para otimizar a ligação de LPS e conseqüentemente melhorar adetecção de anticorpos ligantes dos soros, oxidação de LPS foi entãoexecutada na presença de uma proteína para permitir a formação decomplexos de proteína-LPS por meio de reações de base de Schiff entreaminas proteináceas e funções aldeído de LPS. De fato, Se LPS extraído deTCA comercialmente disponível, contendo quantidades consideráveis deproteínas bacterianas, deu imobilização melhorada a 562 RU comparado comSe LPS extraído em fenol e purificado por cromatografia de troca iônica a 208 RU.

Oxidação de LPS foi necessária, porque misturas contendoLPS não oxidado e proteína mostraram níveis de imobilização relativamentealtos mas respostas específicas insignificantes (Tabela 15). Em adição, adiçãode proteína foi apenas benéfica antes da oxidação de LPS, porque a adição deBSA em St LPS oxidado e dessalinizado deu níveis de imobilizaçãoaceitáveis mas não respostas sorológicas esperadas (Tabela 16). Em umamaneira similar, Hb deu níveis de imobilização relativamente altos mas nãorespostas sorológicas, como esperado (resultados não mostrados).

Para propósitos de melhoria de método, proteínas com graurelativamente alto de homologia de suas estruturas primária e secundária entreespécies de vertebrado homeotérmicas e ocorrendo em matrizes adequadaspara sorologia foram selecionadas para investigações adicionais. Por estemotivo, foram comparados os desempenhos de St LPS fortificado (7% m/m)com ovalbumina de galinha, hemoglobina porcina, albumina de soro bovinoou mioglobina porcina (Tabela 16). Hemoglobina deu melhoria claramentemelhor de níveis de imobilização juntamente com melhor perfil de reatividadede anticorpo - antígeno esperado. Na presença de Hb, em particular, soros dereferência 012, poly O A-S e C-St deram respostas melhores.

Este experimento foi repetido com a adição de B SA, Hb e Mbem níveis indicados em Tabelas 17 a 20 usando bateladas Se2005.1,Sg2005.1, S 12005.1 e St2005.1. Nesta vez, 04 e 05 ligaram em St LPSimobilizado como esperado (Tabela 20). Avaliação destes resultadossumariados nas Tabelas 16 a 20 revelaram que quando se consideram todas asrespostas esperadas simultaneamente por tipo de LPS, a adição de Hb deurespostas específicas mais altas comparado com a adição de BSA e Mb. Alémdisso, na maioria dos casos desvios padrão que ocorreram com Hb comoproteína suportadora, foram mais favoráveis do que aqueles para a adição deBSA e Mb. Hemoglobina foi, portanto, selecionada para experimentaçãoadicional.

Foi observado que os anti-soros O poly A-S provavelmentecontêm títulos baixos de anti-sorogrupo C1 e C2, como no caso de teste de SgLPS imobilizado (Tabela 18) e de Sl LPS (Tabela 19) foram encontradasrespostas relativamente baixas.

Tabela 17. Respostas de biossensor em unidades de resposta (RU) apósimobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfíciesde chip, que foram preparados com Se LPS oxidado na presença de 15%(m/m) de proteína indicada. Valores foram corrigidos para as respostas de C-SPF, que também estão listadas. Desvios padrão estão indicados entreparênteses (JV = 5, exceto para soros de galinha e suíno JV= 4).

<table>table see original document page 51</column></row><table>

a nível de imobilização.

Tabela 18. Respostas de biossensor em unidades de resposta (RU) apósimobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfíciesde chip, que foram preparados com Sg LPS oxidado na presença de50%(m/m) de proteína indicada. Valores foram corrigidos para as respostas de C-SPF3 que também estão listadas. Desvios padrão estão indicados entreparênteses (JV = 5, exceto para soros de galinha e suíno N= 4).

<table>table see original document page 51</column></row><table>

a nível de imobilização.

Tabela 19. Respostas de biossensor em unidades de resposta (RU) apósimobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfíciesde chip, que foram preparados com Sl LPS oxidado na presença de50% (m/m)de proteína indicada. Valores foram corrigidos para as respostas de G-SPF,que também estão listadas. Desvios padrão estão indicados entre parênteses(N= 5, exceto para soros de galinha e suíno N = 4).<table>table see original document page 52</column></row><table>

a nível de imobilização

Tabela 20. Respostas de biossensor em unidades de resposta (RU) apósimobilização e respostas de anti-soros de referência fluídos sobre superfíciesde chip, que foram preparados com St LPS oxidado na presença dei5% (m/m)de proteína indicada. Valores foram corrigidos para as respostas de C-SPF,que também estão listadas. Desvios padrão estão indicados entre parênteses(N = 5, exceto para soros de galinha e suíno JV= 4).

<table>table see original document page 52</column></row><table>

a nível de imobilização.

Níveis de imobilização e reatividade esperada de soros deaglutinação com LPS de S. enteritidis (batelada Se2003.1), S. goldcoast(batelada Sg2003.2), S. Iivingstone (batelada S 12003.1), S. typhimurium(batelada St2003.1) e S. meleagridis (Batelada Sm2003.1) revelaram umacorrelação com quantidade relativa de Hb adicionada antes da oxidação (vejapor exemplo Figura 3). Também foi verificado que para um tipo de LPSespecífico de sorovar de Salmonella, a concentração ótima de Hb também foidependente da batelada de produção.

Orientando-se pela resposta máxima do perfil antigênicoesperado usando um painel de soros de controle de referência e padrão eorientando-se pelas respostas baixas de soros de referência de SPF de ave,concentração ótima de Hb foi determinada para cada tipo e para cada bateladade LPS (Tabela 21). No texto, preparações de LPS contendo hemoglobina,oxidadas, são adicionalmente referidas como preparações LPSox-Hb.

Deve ser observado que, em qualquer experimento, o nível deimobilização não se correlaciona com respostas sorológicas mas secorrelaciona com a quantidade de Hb que foi adicionada.Tabela 21. Efeito de concentração de LPS e de hemoglobina sobre o nível deimobilização final de LPS derivado de S. enteritidis (Se) e de S. typhimurium(St).

<table>table see original document page 53</column></row><table>

a concentração de Hb relativa a LPS

b preparado sobre canais de sensor separados.

O efeito da diluição de Se LPS e St LPS antes da oxidação napresença de 10% (m/m) ou 15% (m/m) de Hb em relação a LPS,respectivamente, foi investigado (Tabela 21). Estes resultados não revelaramclaramente uma correlação entre concentração de LPS e o nível de copulação.

Tabela 22. Relação entre o nível imobilizado de LPSox-Hb e as respostassorológica de anti-soro de antígeno O e soros de controle de ave. Campos paraos quais uma resposta sorológica era esperada estão sombreados em uma corverde e valores dentro do campo estão sublinhados. Soros de controle foramdiluídos em HBS-EP contendo cloreto de sódio 0,5 M e 0,5% (m/v) dedextrano carboximetilado.<table>table see original document page 54</column></row><table>

Estabilidade e robustez de imobilização de LPS

Reprodutibilidade e repetibilidade da imobilização de LPS e aresposta específica de soros de referência foram testados. As preparações deLPS de Se, Sg, Sl e St foram oxidadas na presença de sua correspondenteconcentração ótima de Hb, dessalinizadas, e então armazenadas em solução a4°C no escuro. Sob condições idênticas, mas considerando a variabilidadegeralmente observada para imobilização de moléculas em uma superfície debiossensor, os níveis de imobilização de LPS oxidado foram quercomparáveis nos casos de bateladas Sl (5% RSD) e St (8% RSD) quertenderam a aumentar nos casos das bateladas Se (13% RSD) e Sg (8% RSD)durante dois meses de armazenagem (Tabela 23 até Tabela 26). As respostasde soros de referência também foram provadas sobre os chips de biossensorseparados. Inspeção destes não revelou uma correlação entre o nível deimobilização e a resposta específica. Por exemplo, níveis de imobilização deSe LPS e Sg LPS podem tender a aumentar no decorrer do tempo; esteaumento não foi refletido na resposta de ligação de anticorpos de soro nosantígenos imobilizados. O desvio padrão relativo varia entre 12% e 38%.

Quando se consideram os primeiros 3 dias de medida (dia 0, dia 7 ou 10, e dia14 ou 17) a variância é grandemente reduzida de 3,5% para 23% (resultadosnão mostrados). Tabelas 27 a 30 sumariam a repetibilidade do método emvários momentos durante um período de 12 meses. Em cada instante de tempode análise, uma alíquota fresca de LPS fortificado com Hb foi oxidada,imobilizada e analisada e portanto reflete a soma de variabilidade de váriasetapas.

Tabela 23. Resposta de anti-soros de aglutinação e de referência com LPSox-Hb Se2003.1 preparados no dia 0 e armazenados a 5-8°C. A preparação deLPS foi imobilizada e testada após oxidação nos dias indicados.

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Tabela 24. Resposta de anti-soros de aglutinação e de referência com LPSox-Hb Sg2003.2 preparados no dia 0 e armazenados a 5-8°C. A preparação deLPS foi imobilizada e testada após oxidação nos dias indicados.

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Tabela 25. Resposta de anti-soros de aglutinação e de referência com LPSox-Hb S 12003.1 preparados no dia 0 e armazenados a 5-8°C. A preparação deLPS foi imobilizada e testada após oxidação nos dias indicados.

<table>table see original document page 55</column></row><table><table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 26. Resposta de anti-soros de aglutinação e de referência com LPSox-Hb St2003.1 preparados no dia 0 e armazenados a 5-8°C. A preparação deLPS foi imobilizada e testada após oxidação nos dias indicados.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Tabela 27. Respostas de Se LPS recém-oxidado (batelada Se2003.1) nosinstantes de tempo indicados (em meses). O LPS foi isolado de célulasbacterianas, fortificado com 15% (m/m) de Hb, seco e armazenado a 4-7°Caté o dia de oxidação, imobilização e análise.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

a soro foi diluído 1:50 (v/v)b soro foi diluído 1:100 (v/v)c LPS foi diluído em outra razão volumar

Tabela 28. Respostas de Sg LPS recém-oxidado (batelada Sg2003.2) nosinstantes de tempo indicados (em meses). O LPS foi isolado de célulasbacterianas, fortificado com 50% (m/m) de Hb, seco e armazenado a 4-7°Caté o dia de oxidação, imobilização e análise.<table>table see original document page 57</column></row><table>

Tabela 29. Respostas de Sl LPS recém-oxidado (batelada S12003.1) nosinstantes de tempo indicados (em meses). O LPS foi isolado de célulasbacterianas, fortificado com 50% (m/m) de Hb, seco e armazenado a 4-7°Caté o dia de oxidação, imobilização e análise.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Tabela 30. Respostas de St LPS recém-oxidado (batelada St2003.1) nosinstantes de tempo indicados (em meses). O LPS foi isolado de célulasbacterianas, fortificado com 15% (m/m) de Hb, seco e armazenado a 4-7°Caté o dia de oxidação, imobilização e análise.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

a soro foi diluído 1:100 (v/v);

b Após oxidação, solução contendo LPS foi diluída duas vezes em vez deuma.Exemplo 2

Introdução

Biossensor SPR para detecção de anticorpos de gema de ovo refletindoSalmonella enteritidis

Salmonella é uma das causas maiores de gastroenteritebacteriana de humanos (Fischer, 2004; van Duynhoven et al., 2005). NosPaíses-Baixos, entre 1994-1998, Salmonella enterica sorovar enteritidis (S.e.)foi o sorovar muito mais freqüentemente isolado (Pelt et al. 1999). Dentrodeste sorovar, ovos e produtos de ovo foram a fonte de infecção maisimportante. Apesar das várias medidas de controle, aproximadamente 9% dosrebanhos de galinhas poedeiras holandesas tornam-se anualmente infectados.

Visto que contaminação de ovo com Salmonella continua a ser uma ameaçapara a saúde pública, é importante detectar uma infecção de um rebanho tãocedo quanto possível por um programa de vigilância adequado.

O corrente sistema de monitoração holandês em galinhaspoedeiras é baseado em sorologia (Bokkers, 2002). O objetivo é reduzir aprevalência de S.e. e de S. typhimurium no setor de galinhas poedeiras.Amostragem, contudo, ocorre apenas duas vezes: antes e no final do períodode postura de ovos. O programa de vigilância corrente, portanto, não podedetectar todas as infecções de rebanhos durante o período de postura de ovos,e os fazendeiros não podem 'garantir' que seus produtos são de galinhaspoedeiras livres de Salmonella.

Conseqüentemente, o programa de vigilância deve sermelhorado. Como uma alternativa à corrente sorologia, teste de ovos paraanticorpos poderia der realizado. Amostragem de ovos possui a vantagem deque ela pode ser realizada em instalações de embalagem de ovos, em umafreqüência de amostragem alta com tamanhos de amostra grandes.

Testes para detecção de anticorpo em ovos têm sido antesdesenvolvidos e usados. Os testes existentes são freqüentemente baseados emensaios imunoabsorvente ligados à enzima (ELISA) usando (combinações de)componentes antigênicos diferentes de Salmonella spp. (veja por exemploRefs. Gast et al, 2002 e 1997; Skov et ai, 2002; Holt et al, 2000; Desmidt etal., 1996; Sachsenweger et al, 1994; Van Zijderveld et al, 1992).

Recentemente, a adequabilidade possível de biossensores para a detecção deresposta humoral tem sido reconhecida (Bergwerff e van Knapen, 2006,aceito para publicação; Bergwerff e van Knapen, 2003; Jongerius-Gortemaker, 2002; Pyrohova et al, 2002; Vetcha et al., 2002; Li et al, 2002;Liu et al, 2001; Uttenthaler et al. 1998). Um biossensor consiste de um ligantebiológico imobilizado reutilizável que 'sente' o analito, e um transdutorfísico, que traduz este fenômeno em um sinal eletrônico (Jongerius-Gortemaker et al, 2002). O uso de biossensores promete a possibilidade deanálises de rendimento alto, e assim a detecção de múltiplos sorovares ousorogrupos dentro de uma família de anticorpos ou agentes de doençasinfecciosas contra estes agentes em uma única corrida. Isto oferece aoportunidade para melhorar programas de vigilância, porque mais amostraspodem ser testadas em uma freqüência mais alta durante um período depostura de ovos.

Este exemplo avalia a sensibilidade, a especificidade e acapacidade discriminatória de um teste de detecção de anticorpo porbiossensor de ressonância de plasmon de superfície (SPR) (biacore 3000) emuma gema de ovo baseado no lipopolissacarídeo (LPS) de Salmonellaenterica de sorovar enterítidis e compara os resultados com aqueles obtidoscom um kit de teste de ELISA comercial baseado em g,m flagellin e um kit deteste de ELISA comercial baseado em LPS para detecção de anticorpos deovo pela criação e análise de curvas características de operador receptor(ROC).

2. Materiais e métodos

2.1 Método de biossensor de SPRAdaptamos o método de detecção por ressonância de plasmonde superfície (biacore 3000 por Biacore AB5 Uppsala, Suécia) de anticorposde soro contra Salmonella enteritidís usando antígeno LPS comodesenvolvido por Bergwerff et al. (em preparação) para gema de ovo. Oprimeiro ajuste para este método foi feito na preparação da amostra. Após aseparação da gema de ovo e da clara de ovo, a gema de ovo foi diluída 1:5(v/v) em tampão HEPES 10 mM em pH 7,4, contendo EDTA 3 mM, cloretode sódio 0,15 M, 0,005 % (v/v) de tensoativo P20 (Biacore AB, Suécia), ecloreto de sódio 0,85 M adicional (Merck, Darmstadt, Alemanha), 1% (m/v)de dextrano carboximetilado (Fluka Chemie, Buchs, Alemanha) e 0,05 %(v/v) de Tween 80 (Merck, Alemanha). Foi misturado com pérolas de vidro,centrifugado a 15.000 g na temperatura ambiente por 25 min; e tensoativo foifiltrado sobre um filtro de 0,45 μιη (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemanha).

Uma segunda adaptação foi a limpeza do chip sensor. Apósanálise de 15 amostras de gema de ovo, um solvente contendo 0,5 % (p/v) dedodecil-sulfato de sódio (Biacore AB, Suécia) foi injetado para removercomponentes de gema de ovo depositados.2.2 Gemas de ovo e soros de referência

Soros foram usados como referência nos vários testes devido àinvariabilidade do estoque de amostra de gemas de ovo de referência bemdefinidas. Soros de referência e SPF definidos, liofilizados originários degalinhas infectadas com a) S. enteritidís, b) S. typhimurium, c) S. infantis, oud) S. pullorum foram obtidos do Animal Health Service Ltd. (Deventer,Países-Baixos). Estes soros foram preparados dos soros reunidos. Antes douso, soros liofilizados foram reconstituídos em 1 mL de Milli-Q.

Adicionalmente, anti-grupo B, anti-grupo C, anti- grupo D e anti-grupo E deanticorpo monoclonal de camundongo anti-Salmonella foram usados (Sifin,Berlim, Alemanha).

Gemas de ovo de controle interno foram usadas paraestabelecer repetibilidade e sensibilidade analítica do ensaio de biossensor.Consistiram de uma amostra de gema de ovo livre de patógeno específico(SPF) (Animal Health Service Ltd., Países-Baixos) e uma amostra de folículopré-ovulatório elevadamente imuno-responsiva originária do experimento 2(cf. seção 2.4. abaixo).

2.3 ELISA

Amostras foram ensaiadas usando técnicas de imunoensaio deenzima de sanduíche. Dois kits de detecção de anticorpo de S.e.comercialmente disponível foram usados; Flockscreén S.e. Guildhay(Guildford, Inglaterra) e FlockChek S.e. IDEXX (Westbrook, Maine, USA).

As amostras foram analisadas de acordo com os procedimentos dacompanhia.

O Guildhay S.e. indirect ELISA é baseado em LPS comoantígeno. As cavidades de placas de microtítulo foram revestidas com LPS,diluições de 1:500 de amostras foram adicionadas em mono. Resultados deteste foram expressados como uma razão S / P de acordo com a seguintefórmula:

<formula>formula see original document page 61</formula>

A razão S / P foi interpretada usando os seguintes critérios:

Geme de ovo: S / P < 0,08 = imuno-negativo; 0,08 < S / P < 0,25 = imuno-suspeito; S / P > 0,25 = imuno-positivo.

O IDEXX S.e. competitive ELISA é baseado em antígeno g,mflagellar. As cavidades das placas de microtítulo foram revestidas comantígeno g,m flagellar, diluições 1:2 de amostras foram adicionadas em mono.

Os resultados foram expressados como razão S / N como segue:

<formula>formula see original document page 61</formula>A razão S / N foi interpretada usando os seguintes critérios:Geme de ovo: S / N > 0,75 = imuno-negativo; 0,75 < S / N < 0,59 = imuno-suspeito; S / N < 0,59 = imuno-positivo.

2.4 Experimentos

As amostras de ovo usadas neste estudo originaram-se de doisexperimentos de infecção.

Experimento 1. Quinze galinhas poedeiras de umasemana de idade (Isa Brown) foram alojadas em isoladores de filtro de arparticulado de eficiência alta de pressão negativa (HEPA) com um volume de1,3 m e equipado com um piso de tela de 1,1 m , e aplicando um ritmo defotoperíodo de 12 h de luz e 12 h de escuro. Os isoladores foram ventiladosem uma vazão de aproximadamente 30 m3/h. Durante o período decrescimento, nenhuma Salmonella pôde ser cultivada da forragem. Asgalinhas foram proporcionadas com alimentação não-medicada e água adlibitum. Foram alojadas, manuseadas e tratadas conforme aprovação docomitê de Dutch Animal Health Service Ltd. de acordo com as regulaçõesholandesas sobre animais experimentais. Todas as galinhas foram inoculadasoralmente uma vez com1 χ 10° CFU por ave em semana 20 do experimentousando S. enteritidis CL344 (Animal Health Service Ltd., Deventer, OsPaíses-Baixos). Antes e após a inoculação, os ovos foram colhidos em umabase diária, mas não rotulados individualmente e não datados. Os ovos foramarmazenados na temperatura ambiente por quatro semanas esubseqüentemente a 4°C. O experimento terminou na semana 22 e produziu147 amostras 'positivas' e 71 amostras 'negativas'.

Experimento 2. Este experimento é descrito em detalhepor Van Eerden et al. (2005, em preparação). Resumidamente, 128 galinhaspoedeiras de 15 semanas de idade (Lohmann Brown, 16 aves, 8 replicações)foram divididas em dois grupos (8 galinhas cada) e alojadas individualmenteem duas células de aclimatação, usadas como isoladores, na mesma sala, sobum ritmo de fotoperíodo de 9 h de luz e 12 h de escuro. Durante o período decrescimento até inoculação, nenhuma Salmonella foi cultivada das fezes.

Foram proporcionadas com alimento não-medicado e água ad libitum. Oexperimento animal foi conduzido de acordo com as Guidelines for AnimalExperimentation of Wageningen University e aprovado pelo EthicalCommittee sob o Número de Referência de 2003219. Cada uma de sessenta equatro galinhas (16 aves, 4 replicações) foi inoculada oralmente uma vez com1 χ IO8 CFU de S.e. resistente a ácido nalidíxico (ASG, Lelystad, Os Países-Baixos) uma semana após o início do experimento. As outras 64 aves foramconsideradas controles não infectados. Ovos foram colhidos no dia 21 e nodia 28 após inoculação. Doze vezes, os ovos de uma célula aclimatadoraforam colhidos e reunidos após fendilhamento da casca (cf. seção 2.5 abaixo).

Quatro das amostras de ovos reunidas foram retiradas das células deaclimatação 'não-infectadas'. A gema de ovo e clara de ovo foram misturadase armazenadas a -20°C. O experimento terminou quatro semanas após ainoculação. Folículos pré-ovulatórios foram então colhidos de oito avesindividuais não infectadas e de cinco aves individuais infectadas.2.5 Preparação de amostras de ovo

Ovos do experimento 1 foram preparados na seguinte maneira.Para facilitar a preparação asséptica, as cascas de ovo foram desinfetadas comum etanol aquoso 70 % (v/v). Subseqüentemente, os ovos foram quebrados, eos conteúdos foram coletados em placas de Petri estéreis. Um volume de 1mL de gema de ovo foi coletado usando uma seringa estéril descartável edividido em frações de 200 |iL. Cada fração foi diluída com um tampãoapropriado quer para biossensor SPR quer para análise de ELISA, e entãoarmazenada a -20°C.

Igualmente, gema de ovo e clara de ovo e folículos ovulatóriosreunidos obtidos do experimento 2 foram fracionados, diluídos e armazenadosa -20°C.2.6 Avaliação de método de biossensor SPR

2.6.1 Sensibilidade e especificidade analíticas

Para estabelecer o limite de detecção do ensaio, oito diluiçõesseriais de 1:2 (v/v) de uma amostra de gema de ovo elevadamente imuno-responsiva e uma amostra de controle negativo de SPF foram analisadas emtriplicata pelo biossensor SPR. Análise de variância (ANOVA) foi realizadausando SPSS (SPSS for Windows, Standard Version51999) para avaliardiferenças em respostas de biossensor SPR obtidas após injeção das amostrasde controle serialmente diluídas. Soros de referência foram usados para injetaruma gema SPF para testar a especificidade do ensaio de biossensor SPR. Paraeste propósito, gema de ovo foi injetada com anti-soros reativos a 1) S.enteritidis (sorogrupos D), 2) S. infantis (sorogrupos C), 3) S. pullorum(sorogrupos D), e 4) S. typhimurium (sorogrupos B). Estas amostras foramdiluídas em seus volumes quer em uma proporção de l:100(l,2e3) quer em1:50 (4). Teste de especificidade adicional foi realizado por injeção de gemade ovo SPF com anticorpo monoclonal de camundongo diluído 1:100 (v/v)reativo contra sorogrupos B, G, D e E de Salmonella.

2.6.2 Repetibilidade

A repetibilidade do ensaio de biossensor SPR foi avaliada pelacorrida de amostra de gema de ovo elevadamente imuno-responsiva e deamostra de gema de ovo de controle negativo SPF duas vezes em um únicodia e em três dias consecutivos (em triplo). Valores de médias, de desviospadrão (SD) e de coeficiente percentual de variação (%CV) foram calculadosem Excel 2000 (pacote de programas de computador da Microsoft).

2.6.3 Curvas R OC

Curvas características de operador receptor (ROC) foramgeradas usando os resultados das análises de biossensor SPR e de ELISA paraavaliar os desempenhos de teste de cada ensaio (Zweig e Campbell, 1993).Usando SPSS, a acurácia total de cada ensaio foi calculada da área integradasob a curva (AUC), correspondendo ao erro padrão (SE) e à probabilidade dahipótese nula da AUC verdadeira sendo 0,5. Pelo uso de análise de ROC não-paramétrica (Metz et al., 1998), a acurácia de detecção por biossensor SPR deanticorpos contra S.e. foi comparada com a acurácia de dois ELISA1S. Opadrão ouro foi o estado de infecção do grupo experimental.

2.6.4 Especificidade e sensibilidade diagnosticas

Em uma curva ROC a taxa positiva verdadeira (sensibilidade)é plotada em função da taxa positiva falsa (especificidade-100) para pontos decorte diferentes de um parâmetro. Cada ponto sobre a curva ROC representaum par de sensibilidade / especificidade correspondendo a um limite dedecisão particular. Assim, as sensibilidades diagnosticas máximas naespecificidade diagnostica mais alta para o ensaio de biossensor SPR e os doisELISA's foram calculadas, usando SPSS. Para o teste de biossensor SPRusando as amostras do experimento 1, a especificidade diagnostica máxima nasensibilidade diagnostica mais alta e as especificidade e sensibilidadediagnosticas ótimas também foram calculadas.

3. Resultados

3.1 Especificidade e sensibilidade analíticas

Uma diluição de 1:640 (v/v) da amostra de gema de ovoelevadamente imuno-responsiva foi, em 50 RU, a diluição mais alta testadaque diferiu significativamente (P < 0,001) do controle negativo.

Os sinais de teste das gemas de ovo SPF injetadas com sorospositivos a S. enteritidis (1:100, 145 RU), S. pullorum (1:100, 1012 RU) ou S.typhimurium (1:50, 58 RU) positive estiveram acima do valor de corte de 52RU (cf. seção 3.4.1 abaixo) e foram considerados positivos, como o foi agema de ovo SPF injetada com anti-soro de camundongo anti-grupo D deSalmonella (1:100, 130 RU). Gema de ovo SPF não injetada foi verificadanegativa, i.e. resposta média foi 30 RU. As gemas injetadas com soro positivopara S. infantis (1:100, 24 RU) e anti-soro de camundongo contra subgruposB (1:100, 27 RU), C (1:100, 16 RU), e E (1:100, 15 RU) de Salmonellatambém estiveram abaixo do valor de corte.

3.2 Repetibilidade

O coeficiente de variação dentro de um único dia foi 1% para aamostra de gema de ovo elevadamente imuno-responsiva e 13% para aamostra negativa. O coeficiente de variação de dia - para - dia durante trêsdias foi 2 % para a amostra positiva e 17% para a amostra negativa.

3.3 Determinação de limite

3.3.1 Análise de ROC

Análise de ROC foi realizada sobre os resultados de ensaio de71 e 135 amostras de gema de ovo das galinhas não infectadas e infectadas,respectivamente, do experimento 1 (nem todos os testes foram realizadossobre 12 amostras das galinhas infectadas). Areas integradas sob as curvasROC foram 0,892 (SE 0,024, P< 0,001) para o ensaio de biossensor SPR;0,432 (SE 0,039, P = 0,103) para o IDEXX ELISA e 0,430 (SE 0,039, P =0,096) para o Guildhay ELISA (Tabela 31). As curvas ROC são mostradas naFig. 4. A área integrada (AUC), e portanto a acurácia total, para o ensaio debiossensor SPR foi significativamente maior do que aquelas de IDEXX (Z =11,5, P < 0,001) e Guildhay ELISA (Z =10,5, P< 0,001).

Análise de ROC também foi realizada para quatro amostras degema e clara de ovo combinadas e 15 amostras de gema de ovo de oitoamostras de gema e clara de ovo combinadas, de galinhas não infectadas, e deoito amostras de gema de ovo de galinhas infectadas do experimento 2. Asáreas integradas sob as curvas ROC foram 0,811 (SE 0,082, P = 0,002) para oensaio de biossensor SPR, 0,615 (SE 0,098, P = 0,098) para o IDEXX ELISAe 0,870 (SE 0,064, P < 0,001) para o Guildhay ELISA (Tabela 32 e Fig. 5). AAUC do ensaio de biossensor SPR foi significativamente (Z= 1,9, P = 0,055)maior do que aquela de IDEXX ELISA, mas não diferente do que aquela deGuildhay ELISA (Z= -1,0, P= 0,322).3.4 Estimativas de desempenho

3.4.1 Estimativas de especificidade e de sensibilidade diagnosticas

Com respeito aos resultados das amostras adquiridas doExperimento 1, as amostras da população não infectada deram respostas debiossensor variando de 6 a 50 RU. As respostas das amostras da populaçãoinfectada variaram de 11 a 3584 RU. Em um valor de corte de 52 RU, 24 de135 amostras tiveram que ser consideradas imuno-negativas.

Um valor de corte de 52 RU deu a estimativa de especificidadediagnostica mais alta possível de 100 % (com um intervalo de confiança (CI)exato a 95% de 95-100 %) e uma estimativa de sensibilidade diagnostica de82 % (Cl a 95%: 76-98 %) para o teste de ensaio de biossensor SPR. Umvalor de corte de 10 RU deu a estimativa de especificidade diagnostica maisalta possível de 100 % (Cl exato a 95 %: 97-100 %) e uma estimativa deespecificidade de 1 % (Cl a 95%: 0-4 %). Um valor de corte de 42 RU deu asespecificidade e sensibilidade diagnosticas combinadas ótimas: 84 % (Cl a95%: 77- 90 %) e 99 % (Cl a 95%: 96-100 %), respectivamente.

Em um valor de corte de OD550nm de 0,11, o IDEXX ELISAteve uma especificidade diagnostica de 100 % e uma sensibilidade de 1 % (Cla 95%: 0-3 %). A OD55Onm das amostras da população não infectada variou de0,174 a 1,377, i.e. acima do valor de corte a 0,11. Da população positiva, 145de 147 amostras tiveram que ser consideradas imuno-negativas no valor decorte escolhido, a saber a OD550nm correspondente variou de 0,042 a 1,572. OGuildhay ELISA teve uma especificidade diagnostica de 100 % e umasensibilidade de 16 % (Cl a 95%: 10-22 %) em um valor de corte de OD650nmde 0,12. Nenhuma das amostras da população não infectada mostrou valoresde OD650nm acima de 0,12 (0,051 a 0,093). No caso da população positiva, 124de 147 amostras tiveram que ser consideradas imuno-negativas. A OD650nmdestas amostras variou de 0,048 a 1,471. No caso do Experimento 2, um valorde corte de 542 RU deu a estimativa de especificidade diagnostica mais altapossível de 100 % (Cl exato a 95%: 82-100 %) e uma estimativa desensibilidade diagnostica de 63 % (Cl a 95%: 39-86 %) para o teste de ensaiode biossensor SPR. As amostras da população não infectada tiveram valoresde RU variando de 101-448. Os valores de população infectada variaram de117-3012e6del6 amostras tiveram resultados de teste negativos. Em umvalor de corte de OD550nm de 0,49, o IDEXX ELISA teve uma especificidadediagnostica de 100 % e uma sensibilidade de 19 % (Cl a 95%: 0-38 %).

Nenhuma das amostras da população não infectada teve valores de OD650nmmenores do que 0,49. Os valores variaram de 0,537- 1,621. Da populaçãopositiva, 13 de 16 amostras tiveram resultados negativos no valor de corteescolhido. Os valores variaram de 0,134-1,630. O Guildhay ELISA teve umaespecificidade diagnostica de 100 % e uma sensibilidade de 67 % (Cl a 95%:43-91 %) em um valor de corte de OD650nm de 0,14. Nenhuma das amostras dapopulação não infectada teve valores de OD650nm maiores do que 0,14. Osvalores variaram de 0,072-0,140. Da população positiva, 5 de 15 amostrastiveram resultados de teste negativos (uma amostra não pôde ser testada). Osvalores variaram de 0,086-2,144.

4. Discussão

O objetivo deste estudo foi quantificar as características deteste do biossensor SPR para a detecção de anticorpos de S.e. em ovos. Osresultados mostraram que o ensaio de biossensor SPR apresentou desempenhosignificativamente melhor do que aquele dos dois ELISA's comercialmentedisponíveis para as amostras do Experimento 1. As especificidade esensibilidade diagnosticas ótimas combinadas do biossensor SPR foram 84 %(77-90 %) e 99 % (96-100 %), respectivamente. Tanto o IDEXX ELISAbaseado em g,m flagellin, quanto o Guildhay ELISA baseado em LPS nãoforam capazes de detectar a infecção de S.e. com uma especificidade esensibilidade diagnostica combinada mais alta usando este painel de teste.

Este estudo indica que um ensaio de biossensor SPR poderia ser umaferramenta nova e poderosa para a monitoração de infecções causadas porSalmonella enterica sorovar enteritidis em rebanhos de galinhas poedeiras pormeio de detecção de anticorpo em ovos.

O ensaio de biossensor SPR oferece a possibilidade de detectarinfecções em uma maneira rápida e confiável. A qualidade alta do teste e asvantagens de bem-estar de animal e técnicas da coleção de ovos são boasrazões para explorar seu uso em seleção de populações. Em adição, asconfigurações do biossensor SPR aplicado da Biacore permitem a detecçãosimultânea de anticorpos em múltiplos sorovares de Salmonella em uma únicacorrida em um único canal de sensor ou em canais de sensor separados sobreo mesmo chip sensor (resultados não mostrados). Isto poderia ser designificância porque é bem sabido que sorovares diferem em países nodecorrer do tempo (veja por exemplo Refs. Guerin et al., 2005; vanDuijnkeren et al, 2002).

A avaliação de teste foi realizada usando ovos de doisexperimentos que não foram realizados especificamente para esta avaliaçãode teste, possivelmente influenciando o desempenho do teste. Os ovos'positivos' foram coletados provavelmente no instante de tempo que aresposta humoral estava se desenvolvendo nas galinhas expostas. Estes ovos'prematuros' foram analisados e seus resultados falso-negativos interferemcom a avaliação dos ensaios. Se pudesse ter sido possível excluir ovos até 2semanas após a infecção, a sensibilidade diagnostica de cada teste, ELISA oubiossensor SPR, teria sido melhorada.

Detecção de anticorpo em soro é mais sensível do que emovos, porque o surgimento de anticorpos em ovos é precedido pelosurgimento em soro em uma semana (Gast e Beard, 1991; Sunwoo et al.,1996; Skov et al., 2002). Contudo, sensibilidade de rebanho aos testes paraanticorpos em ovos pode ser melhorada pela aquisição de mais amostras, queé mais fácil do que quando se usam ovos. O desempenho do biossensor (AUC0,892) foi comparado com aquele dos dois ELISA's comerciais, (IDEXXAUC 0,432, Guildhay AUC 0,430). Em nosso conhecimento IDEXX ELISAnão foi validado para ovos, mas existem dados quantitativos sobre odesempenho de teste em comparação com outros testes: Van Zijderveld et al.

(1992) avaliaram quatro ELISAs diferentes para diagnose de infecções porS.e. em galinhas experimentalmente infectadas. Relataram uma especificidadede 100% e uma sensibilidade de 95% para 127 gemas de ovos dos ovos postosentre 13 e 40 dias após a infecção com S.e. Em nossa avaliação, o teste deIDEXX não teve desempenho tão bom quanto na avaliação de 1992. Umaexplicação poderia ser a seleção de amostra diferente, porque nossas amostrasoriginaram-se dos experimentos de infecção que pararam 2 e 4 semanas apósinoculação, tendo tido tempo para desenvolver uma resposta humoral.

E sabido que antígenos O compartilhados dentre os membrosde sorogrupos B e D de Salmonella limitam a especificidade de detecção deS.e. usando antígenos de lipopolissacarídeo (de Vries et al., 1998; Baay eHuis in't Veld, 1993; Hassan et al., 1990). Isto é confirmado por nossosresultados: o ensaio não pôde diferenciar entre infecções com soro varesenteritidis, gallinarum e typhimurium, compartilhando O 9 e O 12. Visto quesorovares zoonóticos dos três (S. typhimurium mais S. enteritidis) representam80% de isolados identificados pelos laboratórios de referência nacionaisparticipando na rede de vigilância Enter-net entre 1998-2003 (Fischer et al.,2004), esta descoberta tem limitado a relevância clínica para a populaçãohumana. O ensaio diferenciou entre gema de ovo SPF injetada com anti-sorode camundongo anti-grupo B (1:100, 27 RU) e anti-grupo D (1:100, 130 RU)de Salmonella. Isto não é surpreendente, porque o LPS de Salmonellaenteritidis possui 01,09e012 como antígenos somáticos, enquanto que osreagentes de teste específicos para grupo contêm os seguintes anticorposmonoclonais; anti-grupo B de Salmonella: Anti-04, O 5, 027; anti- grupo Dde Salmonella: Anti-09.O valor de corte de Experimento 2 foi muito maior do que ocorte do Experimento 1, possivelmente porque parte de nossas amostrasconsistiu de geme e clara de ovo em vez de apenas gema de ovo. Paraaplicações diferentes, valores de corte diferentes podem ser opcionais. Paraaplicações diferentes, valores de corte diferentes podem ser ótimos. Custosrelativos ou indesejabilidade de erros (classificações de positivo falso /negativo falso) e as proporções relativas esperadas de galinhas infectadas enão infectadas são parâmetros, importantes na determinação do valor de corte,que afeta o valor diagnóstico do ensaio. Sugeriríamos um valor de corte queminimize o número de resultados positivos falsos, raciocinando queamostragem e teste freqüentes seriam necessários se o ensaio fosse para serusado em um programa de vigilância na população de galinhas poedeiras,dada a prevalência relativamente baixa de S.e.

A técnica de biossensor SPR tem detectada com sucessoanticorpos de ovo para determinar infecções experimentais em galinhas. Emprogramas de seleção futuros, o biossensor SPR poderia possivelmentedetectar, ao mesmo tempo, analitos diferentes.

Tabela 31. Análise de ROC dos resultados das amostras derivadas doExperimento 1 analisadas por biossensor SPR, IDEXX e Guildhay ELISA's.

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a teste exato de Fisher

Tabela 32. Análise de ROC dos resultados das amostras derivadas doExperimento 2 analisadas por biossensor SPR, IDEXX e Guildhay ELISA's.<table>table see original document page 72</column></row><table>

a teste exato de Fisher

Exemplo 3

Introdução

Detecção direta de Campylobacter spp. por meio de monitoração deinfecções por bacteriófago usando glóbulos revestidos com LPS

Campylobacter é o patógeno mais comum proveniente dealimento em países desenvolvidos, causador de gastroenterite caracterizadapor diarréia sanguinolenta e/ou aquosa. Campylobacter está associado comsíndromes de Guillain- Barre (GBS), de Reiter e urêmica hemolítica (HUS) eartrite reativa (FSAI, 2002; Lake et al., 2003; Tauxe, 2000). Nos últimos 20anos, a taxa de infecção de Campylobacter ainda está crescendo em muitospaíses desenvolvidos, talvez devido às melhorias em detecção e relatório. NosEstados Unidos da América, 2.400.000 casos de campilobacteriose sãorelatados anualmente correspondendo a aproximadamente 1% da populaçãodos E.U.A. (Tauxe, 2000).

Pássaros selvagens e animais domésticos são reservatórios deCampylobacter e disseminam bactérias no ambiente. Ave doméstica é umveículo importante para infecção por Campylobacter em humanos. De fato,cepas, que foram isoladas de galinhas, também puderam ser isoladas depacientes (Coker, 2000). Estudos epidemiológicos têm mostrado que oconsumo e o manuseio de carne de ave doméstica devem ser consideradoscomo um risco maior para infecção de humano com C. jejuni ou C. eoli(FSAI, 2002). O fator de risco mais consistente nos Estados Unidos, NovaZelândia e Europa tem sido o consumo ou o contado com carne de avedoméstica crua ou não cozida, totalizando 10% a 50% de todos os casos decampilobacteriose (Tauxe, 2000). C. jejuni, C. coli e C. Iari representam cercade 90% de campilobacteriose de humano (Stern e Line, 2000). A dose efetivade Campylobacter é considerada baixa, variando de 500 - 10.000 células(FSAI, 2002).

Campylobaeter são bacilos Gram-negativos, curvos, deformato de S, ou de formato espiral possuindo um ou mais flagelos em umdos pólos e são elevadamente móveis (Ghristensen et al., 2001).Campylobaeter cresce entre 30,5°C e 45°C em uma temperatura ótima de42°C. Crescimento ótimo é estabelecido em 10% de dióxido de carbono, 5-6% de oxigênio, e 85% de nitrogênio (FSAI, 2002).

Métodos de fenotipificação tradicionais para determinação deCampylobaeter demoram de 4 a 5 dias e envolvem pré-enriquecimentoseguido por isolamento de ágar seletivo e confirmação por teste bioquímico.Devido à natureza perecível de itens de alimento e a velocidade requeridapara análise de produtos de alimento, são necessários métodos mais rápidos,sensíveis e específicos para detecção custo-efetiva de Campylobaeter.

Procedimentos de separação imunomagnética (IMS) foram usados porWaller e Ogata (2000), Che et al. (2001), Yu et al. (2001) para concentrar C.jejuni de carne de ave doméstica sem a etapa de cultura celular de pré-enriquecimento. Esta abordagem pôde recuperar IO4 unidades formadoras decolônia (cfu)/g em carnes de ave doméstica conforme detectadas commicroscopia de fluorescência e força atômica (Yu et al., 2001). IMS podepotencialmente reduzir o tempo de pré-enriquecimento de Campylobaeter epode suplantar os problemas de inibidores de fontes de alimento tais comoinibidores de PCR (Benoit e Donahue, 2003). O uso de IMS pode portantoacelerar o enriquecimento do analito.Este exemplo descreve um método de detecção a jusanteusando bacteriófagos específicos para Campylobacter, i.e. organismos viraispequenos que se fixam em ou infectam bactérias vivas Campylobaeter. Suafixação ou infecção é dependente da fase do ciclo devida da bactéria. Ligaçãoem ou infecção de Campylobaeter pode ocorrer a saber em fase estacionária,log ou Iag da bactéria e também depende da espécie de fago. Infecção dabactéria resulta normalmente em um número alto de cópias de bacteriófago.Registro deste aumento de fagos é portanto usado como um instrumentoanalítico para traçar a presença de Campylobaeter na amostra original.

O objetivo deste estudo é demonstrar que a aplicação debacteriófagos como ferramentas analíticas específicas e sensíveis para adetecção de Campylobaeter em produtos animais, tais como fezes e carnes (deaves domésticas).

Materiais e métodos

Configuração experimental

Após homogeneização, e.g. facilitada por digestão, IMS seráusada para purificar e concentrar Campylobaeter de amostras contaminadas,tais como carne e fezes. Na segunda etapa, bactérias isoladas por IMS serãoincubadas com, uma cepa apropriada de bacteriófago. Bacteriófagos não-fixados serão removidos por lavagem do isolado celular usando o mesmoprocedimento de IMS. Campylobaeter imobilizado por IMS trazendobacteriófago e/ou infectado são então introduzidos em uma cultura fresca epura de Campylobaeter de referência que está em uma fase estacionária. Estacultura de células é usada como um hospedeiro estranho para reforçar amultiplicação dos bacteriófagos. Após uma cultura curta para permitir que asbactérias alcancem sua fase log, os bacteriófagos serão colhidos porcentrifugação. O sobrenadante contendo bacteriófago será incubado comglóbulos fluorescentes revestidos com LPS. Aqui, o glóbulo está revestidocomo descrito no exemplo com o LPS isolado de Campylobaeter usado comoo organismo hospedeiro. A presença de bacteriófagos ligados nos glóbulosfluorescentes será testadas em duas maneiras. Após a adição de e incubaçãocom anticorpos anti-bacteriófago marcados com um marcador fluorescente, aquantidade de fluorescência corresponderá à concentração de bacteriófagos eindiretamente à concentração de Campylobacter na amostra original. Em umaabordagem alternativa, anticorpos anti-LPS contendo um marcadorfluorescente competirão com bacteriófagos pelos lugares de ligação. Umadiminuição da fluorescência registrada em comparação com uma amostralivre de Campylobaeter indicará, portanto, uma amostra positiva paraCampylobaeter. O teste será validado em termos de seletividade e desensibilidade por C. jejuni, C. eoli e C. Iarii em matrizes diferentes, incluindofezes, pele, e carne de porcos e galinhas. Organismos proximamenterelacionados, tais como espécies Areobaeter, serão usados para testar aespecificidade do método.

Cepas virais e baeterianas e condição de cultura

C. jejuni (ATCC 33291) e C. eoli (ATCC 33559) serãoadquiridas de Microbiologies (St. Cloud, USA). As bactérias crescerão emcaldo de soja-triptona (TSB) (Oxoid, CM 129, Hampshire, Inglaterra) por 24h a 42oC, sob atmosfera microaerofílica, que será gerada usando uma cilindrode gás (BBL, Becton Dickinson, Sparks, USA). Campylobacter são entãoposicionadas sobre Agar de Carvão-Cefoperazona-Desoxicolato (mCGDA)(base de ágar seletiva livre de sangue com Campylobacter [Oxoid, CM 739]com suplemento seletivo CCDA [Oxoid, SRl55], cefoperazona 32 μg/mL eanfotericina BlO μg/mL) e incubados sob atmosfera microaerofílica por 24 ha 48 h a 42°C. Uma colônia pura de Campylobacter é então transferida para oágar de soja tríptica (TSA) (Oxoid, CM131) e será incubada sob umaatmosfera microaerofílica por 24 h a 48 h a 42°C e então deixada em umrefrigerador a 4°C até o uso. Bacteriófagos infectantes de CampylobacterNTCC12669, NTCC12670, NTCC12671, NTCC12672, NTCC12673,NTCC12674, NTCC12675, NTCC12676, NTCC12677, NTGC12678,NTCC12679, NTCC12680, NTCC12681, NTCC12682, NTCC12683,NTCC12684 são adquiridos da National Type Culture Collection (Londres,Reino Unido).

Preparação de amostra

A cultura de Campylobacter pura armazenada a 4°C serásubcultivada em TSB e incubada sob atmosfera microaerofílica por 24 h a42°C. Este é o hospedeiro para crescimento exponencial do bacteriófago.

Uma quantidade de 25 g de filé de galinha moído serásuspensa em 225 mL de caldo de Preston (Caldo Nutriente de No.2 [Oxoid,CM 67], 5% (v/v) de sangue lisado de cavalo [Oxoid, SR48], suplemento paracrescimento de Campylobacter [Oxoid, SR232] e suplemento sepetivo paraCampylobaeter de Preston modificado [Oxoid, SR204]) contido em um sacodigestor. O meio de caldo de Preston será preparado de acordo com ainstrução do fabricante. O saco digestor contendo amostra seráhomogeneizado por 90 s em um digestor (Inter science, St.Nom, França). Asuspensão inteira será então incubada sob atmosfera microaerofílica a 42°Cpor um tempo de incubação apropriado para permitir o crescimento deCampylobaeter.

Separação imuno-magnética

Após enriquecimento com caldo de Preston, o saco digestorcontendo a amostra será adicionado em um pote de incubação da máquina deIMS (Pathatrix™, Microscience, Cambridgeshire, UK). A aparelhagem éentão operada de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 50μΙ> de glóbulos magnéticos anti-Campylobacter (Microscience) serãoadicionados na amostra, que é então recirculada 30 min a 37°C. Os glóbulosmagneticamente imobilizados são liberados, lavados com 100 mL de água depeptona tamponada preaquecida (peptona [Becton Dickinson] 10 mg/mL,cloreto de sódio [Merck, Darmstadt, Alemanha] 5 mg/mL, hidrogeno-fosfatode dissódio di-hidratado [Merck] 4,5 mg/mL, diidrogeno-fosfato de potássio[Merck] 1,5 mg/mL ajustado para pH 7,2) e então atraídos de novo pelomagneto. Solução de lavagem foi removida deixando uma suspensão de 200uL para crescimento seletivo e análises de bacteriófago.

Detecção de bacteriófagos

Glóbulos-IMS trazendo Campylobacter são contatados comum volume pequeno de bacteriófagos específicos para bactéria. Após umaincubação curta para permitir fixação específica dos fagos na superfície dabactéria alvo, os glóbulos de IMS são lavados e amostrados para ajustar umponto de referência no procedimento de análise final. O restante da suspensãoé misturado com uma suspensão de espécie Campylobacter Jfresca parahospedar o bacteriófago em crescimento. Após incubação a 42°C, a suspensãoé centrifugada e o sobrenadante será suplementado com um volume deglóbulos fluorescentes revestidos com LPS de Campylobacter. Multiplicaçãode fagos é então avaliada após a adição quer de anticorpos fluorescentementemarcados anti-bacteriófago quer anticorpos fluorescentemente marcados anti-Campylobacter. Após uma incubação de 15 min, os glóbulos são analisadosusando e.g. um dispositivo BioPlex (Bio-Rad) para selecionar fluorescênciaimobilizada sobre os glóbulos como um resultado de reações de ligaçãoespecíficas.

Exemplo 4

Introdução

Detecção de anticorpos anti- Salmonella em soro porcino e suco de carne degalinhas usando glóbulos fluorescentes

Microorganismos incluem uma ampla variedade de bactérias,bolores (fungos), parasitas e vírus. Microorganismos patogênicos têm atraídomuito mais atenção do público como consumidores de água e alimentocontaminados, que resultaram em ataques de família ou de comunidade.Como uma conseqüência, a mídia e os políticos têm desempenhado sua parteno aumento da conscientização do consumidor e legislação nova está empreparação ou já em uso.

Com respeito aos microorganismos patogênicos, atençãoespecial é dada a numerosas doenças zoonóticas, i.e. micróbios transmissíveisde animais para humano, pelas seguintes razões: 1) a maioria das doençasprovenientes da água e de alimento são de natureza zoonótica; 2) muitosagentes zoonóticos possuem sua rota de transmissão através do ambiente, e 3)contaminações tanto de alimento / água quanto do ambiente também sãousadas por (bio)terroristas para adquirirem o impacto máximo na sociedade.

Perigos microbiológicos podem entrar nas cadeias alimentaresem qualquer ponto durante pré-colheita, produção, processamento, transporte,venda a varejo, armazenagem doméstica ou preparação de refeição.A partir desua introdução em ração ou alimento, podem ocorrer ambientes elevadamentecomplexos nos quais o microorganismo pode esquivar-se da detecção einativação. Sistemas de distribuição internacional eficiente e mudançasrápidas nas preferências dos consumidores podem facilitar a penetraçãorápida de patógenos através de populações grandes, encurtando sobremaneirao tempo de reação disponível para agências de saúde pública.

Autoridades e produtores de alimentos estão convencidos deque ensaios mais rápidos, versáteis e seletivos (diagnósticos) são necessáriospara monitoração ambiental, de ração e de alimento para reagiradequadamente às ligações contaminadas na cadeia alimentar.

Uma grande porção das técnicas de monitoração exploradasenvolviam o uso de tecnologias de ensaio de afinidade, incluindo plataformade biossensor.

Em [AAB5] princípio, detecção da presença demicroorganismos pode ser realizada em duas maneiras: direta ouindiretamente. No ensaio direto, o próprio organismo é detectadonormalmente com a aplicação de anticorpos reagindo com estruturasantigênicas específicas para cepa e/ou (sub)espécie. Esta análiseimunoquímica segue a preparação de amostra consumidora de tempo pormeio de cultura em meios de crescimento seletivos. No caso de infecção deparasita, isto não é possível e detecção direta envolve inspeção microscópicade amostras. No ensaio indireto, a presença do microorganismo é sugeridapela detecção de produtos humorais (imunoglobulinas) ou celulares (e.g.,citocinas) de uma resposta imunológica do hospedeiro infectado. Na maioriados estudos, antígenos bem definidos são usados para capturarimunoglobulinas de hospedeiro em qualquer fluido corporal (sorologia). Aligação observada então revela a natureza de uma infestação invasiva de umpatógeno.

As vantagens e desvantagens de detecções de patógenoindireta e direta são claras: i) indivíduos não são sempre imunologicamenteresponsivos a uma infecção, i.e., diferenças entre respondedores imunesbaixos ou altos, ii) respostas humorais são retardadas vários dias ou atémesmo semanas possivelmente deixando uma infecção recente não notada,iii) anticorpos de soro podem ser encontrados onde o organismo causador nãoé detectado, porque ele mesmo tem sido rejeitado ou retraído em certostecidos (não amostrados), iv) investigações sorológicas são muito rápidas emuitas vezes oferecem possibilidades melhores para rendimento alto do que adetecção direta, e v) análise sorológica de soro ou plasma prediz o estado deinfecção de Salmonella de um rebanho ou bando melhor do que análise diretade antígeno, i.e. cultura bacteriana seletiva clássica.

De fato, sorologia realizada melhor detecção direta, e namaioria dos casos insensível de parasitas de tecido, que pode ser apenasrealizada por histoquímica ou técnicas de digestão e microscopia. Diferençassignificativas também são evidentes em coleta e preparação de amostra:enquanto que bactérias, fungos e vírus têm que ser cultivados de matrizes parafacilitar sua detecção em soluções enriquecidas, sangue é relativamentefacilmente coletado e preparado para análise. Aqui, deve ser observado,contudo, que anticorpos não podem ser apenas recuperados de sangue, plasmaou soro, mas também de músculo (suco de carne), leite, colostros, fluidocerebroespinhal e ovos. Em particular, amostragem de ovos, de suco de carnee/ou de leite é mais fácil e mais custo-efetiva do que a amostragem de sangue,plasma, soro ou fluido cerebroespinhal.

Métodos diagnósticos baseados em análise sorológica demateriais biológicos contendo anticorpo são portanto aprobativos emdenominada matança de animais. Nesta abordagem de processamentoinovadora, decisões baseadas em evidência e confiáveis são feitas baseando-se em monitoração contínua e intensiva em nível de fazenda de se aminais sãopermitidos entrarem em uma infra-estrutura de processamento contaminadacom Salmonella ou livre de Salmonella.

Dentre os componentes da estrutura antigênica do gêneroSalmonella, os antígenos somáticos são importantes como um instrumentopara traçar resposta imune em animais sob uma infecção invasiva desteorganismo. Antígenos somáticos estão localizados sobre a parte depolissacarídeo de lipopolissacarídeo (LPS), que é um constituinte da paredecelular bacteriana. Detecção de uma resposta humoral com escolha cuidadosade LPS, pode ser deduzida a identidade do sorogrupo de Salmonellainfectante.

Em Dinamarca, Alemanha, Grécia e Os Países-Baixos, 39.5%de todos os porcos positivos para Salmonella amostrados no abatedouro foramdeterminados como S. typhimurium. Dependente do país, outros isoladosimportantes de porcos foram S. derby (17,1%), S. infantis (8,0%), S. panama(5,1%), S. ohio (4,9%), S. Iondon (4,4%), S. Iivingstone (3,1%), S. virchow(2,7%), S. bredeny (2,1%), S. mbandaka (1,1%), S. Brandenburg (1,0%), S.goldcoast (0,8%).

No caso de galinhas, 14% das galinhas foram positivas paraSalmonella em nível de rebanho em 2002 em Os Países-Baixos. O sorovarpredominante foi naquele caso S. paratyphi B var. Java.

O nível de venda varejo uma percentagem comparável (13,4%)foi encontrada em Os Países-Baixos. Os sorovares mais freqüentes deSalmonella isolados dos frangos em 14 estados membros de EU foram S.paratyphi B var. Java (24,7%), S. enteritidis (13,6%), S. infantis (8,0%), S.virchow (6,7%), S. Iivingstone (5,7%), S. mbandaka (5,5%), S. typhimurium(5,3%),S. senftenberg (5,0%), S. fiadar (3,7%). S. paratyphi B var. Java édominante, mas é totalmente atribuível ao Os Países-Baixos.

Em suíno e galinhas produtores de alimento, os sorogrupos deSalmonella prevalecentemente ocorrentes são portanto pertencentes aosgrupos B, C e D, e no caso de suíno também E.

Neste estudo, é explorada uma nova plataforma de ensaio deafinidade analítica para a detecção indireta de infecção de Salmonella emporcos e galinhas. Esta plataforma de tecnologia de Luminex analisa glóbulosinternamente codificados que podem estar revestidos com antígenosdiferentes em um teste único. Apenas quando fluorescências de ambos doglóbulo e do analito ligado passam no detector será registrada uma resposta.Esta abordagem é aplicada para detectar anticorpos anti-Salmonella em soro elíquido extraído (drip) de carne.

Materiais e métodos

Compostos químicos

Kit de copulação de amina, consistindo de N-hidróxi-succinimida (NHS), cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDC) e cloridrato de etanol-amina - hidróxido de sódio de pH8,5 foram adquiridos de Biacore AB (Uppsala, Suécia). Etanol e ácidotricloco-acético (TCA) foram adquiridos de Merck (Darmstadt, Alemanha).Cianoboroidreto de sódio e carbohidrazida foram obtidos de Fluka ChemieGmbH (Buchs, Suíã). Hemoglobin (Hb) porcina foi adquirida de SigmaChemical Company (St. Louis, MO, U.S.A.). Água foi obtida de um sistemade purificação de água Milli Q (Millipore, Bedford, MA, U.S.A.).

Materiais

Colunas NAP-5 (0,5 mL; Sephadex G-25) foram adquiridas deAmersham Biosciences e foram usadas como descrito pelo produtor. Chipsbiossensores CM5 foram adquiridos de Biacore AB. Saco de diálise(Spectra/Por) com um corte de 1 kDa foi obtido de Spectrum LaboratoriesInc. (Rancho Dominguez, CA, U.S.A.). Alexa532 foi de Molecular Probes(Leiden, Os Países-Baixos). IgG (H+L) de cabra anti-suíno foi pedida deJackson Immunoresearch (West Grove, PA5 USA). Este anticorpo foiconjugado com Alexa532 usando procedimentos de marcação padrão.

Anti-soros anti- Salmonella

Anti-soros monoclonais somáticos Ό' monovalentes deSalmonella contra 04, 05, O61, 07, 08, 09, OlO foram adquiridos de Sifin(Berlin, Alemanha). Soluções de anticorpo foram diluídas em PBS 50 mMpara suas concentrações de trabalho.

Soros porcinos e de aves de referência

Todos os soros de referência foram obtidos do Dutch AnimalHealth Service (Deventer, Os Países-Baixos). O soros de referência de avesobtidos foram reativos com Salmonella enteritidis (sorogrupo D1), S.typhimurium (sorogrupo B), S. pullorum / gallinarum (Spg; sorogrupo D1) eS. infantis (sorogrupo Q), e foram adicionalmente referidos como CH-Se,CH-St, CH-Spg e CH-Si, respectivamente. Estes soros de galinha foramoriginalmente preparados para análises ELISA como referências positivas.

Em adição, soro de galinha livre de patógeno (adicionalmente referido comoCH-SPF) foi obtido desta organização como amostra de referência de controlenegativo. Estes soros foram reconstituição de material seco por congelamentopela adição de água em um volume indicado pelo produtor. Igualmente, sorosporcinos de animais desafiados com S. typhimurium e S. Iivingstone(sorogrupo Ci) foram adquiridos de GD e foram referidos como P-St e P-Sl,respectivamente. Em adição, soro porcino reativo a sorotipo-2 deActinobacillus pleuropneumoniae (GD) usado como controle em um Teste deFixação de Complemento, foi explorado como controle negativo para soroporcino no ensaio de biossensor de Salmonella.

Métodos

Extração de LPS[aabó]

Culturas noturnas de Salmonella foram preparadas pelaaplicação de 100 μΐ. de seus estoques correspondentes sobre cada uma das120 placas contendo ágar de infusão de coração (BHIa, Oxoid). As bactériasforam colhidas da superfície das placas para dentro de 1 mL de solução(salina) de NaCl 9 g/L por placa de ágar usando uma espátula trigalski. Cadaplaca foi lavada duas vezes com 2 mL de solução salina. Bactériascombinadas foram centrifugadas em seis tubos a 10.000 g e a 4°C por 15 mine o sobrenadante foi descartado. Esta etapa de centrifugação foi repetida duasvezes com 75 mL de solução salina de lavagem por tubo em cada corrida.

Enquanto mantidas sobre gelo, as bactérias pelotizadas foram suspensas emágua em uma razão volumar, que foi uma de 5 vezes em relação ao peso dasbactérias. Um equivolume de TCA 0,250 M (Se) ou 0,500 M (Sg, SI, Sm e St)foi adicionado para dar concentrações finais de 0,12 M e 0,25 M,respectivamente, seguido por agitação contínua a 4°C por 3 h. Umsobrenadante contendo lipopolissacarídeo (LPS) foi então adquirido a 20.000g e 4°C por 30 min. O pH do sobrenadante foi ajustado para pH 6,5 comhidróxido de sódio 5 M e quando se aproximava de pH desejado comhidróxido de sódio 0,10 Μ. O volume final da solução contendo LPS foideterminado antes da armazenagem a -18°C por 30 min. A solução foi diluídacom um volume duplo de etanol absoluto congelado de um lugar dearmazenagem a -18°C, e incubação foi continuada durante a noite a -4°C semagitação em um dispositivo fechado, construído em casa, com etileno-glicol /água (1:4, v/v) frio circulando. Uma pelota contendo LPS foi obtida apóscentrifugação a 20.000 g e a -4°C por 30 min. O material particulado foisuspenso em um volume de 0,5 mL de água por grama de massa bacterianaoriginal pesada no início do processo de extração. A suspensão foi dialisadaem um saco de diálise de 1-kDa contra água a 4°C por dois dias comreposição de água intermitente regular. O conteúdo do saco foi centrifugado a20.000 g e a 4°C por 30 min, e o sobrenadante foi liofilizado. O liofilizado foipesado para estabelecer a recuperação de LPS. LPS foi reconstituído em águapara compor uma concentração final de 5 mg/mL. Dependendo do tipo deLPS e do número da batelada, um volume de hemoglobina (Hb) porcina a 1mg/mL foi adicionado em uma concentração como indicada no texto. Cadabatelada foi dividida em porções em frações de 0,5 de LPS, que foram secasusando um evaporado a vácuo e então armazenadas, a 5-8°C.

Oxidação de LPS[aab7]

Uma porção de 0,5 mg de LPS fortificado com hemoglobinafoi dissolvida em 500 μί de acetato de sódio 100 mM de pH 5,5. Após aadição de 20 μί de periodato de sódio 50 mM (Sigma), a solução foiincubada por 40 min sobre gelo protegida da luz. A oxidação de LPS foiinterrompida e a solução foi dessalinizada pela passagem de 500 μί damistura reacional através de um cartucho NAP-5 com um fluxo controladopor gravidade. LPS modificado foi eluído com 1 mL de acetato de sódio 10mM, pH 4,0. Antes do uso, o cartucho foi condicionado três vezes com 3 mLde acetato de sódio 10 mM, pH 4,0.

Imobilização de LPS[aabs]

Para imobilizar os antígenos de LPS oxidado nos glóbulos, osgrupos ácido carboxílico na superfície do glóbulo foram ativados com umamistura de EDC/NHS disponível do kit de copulação de amina por 20 minsobre um gyro rocker. Após centrifugação e remoção de sobrenadante,ativação foi seguida por uma reação com carbohidrazida aquosa 5 mM por 20min. Glóbulos com superfície modificada foram pelotizados de novo e olíquido superior foi descartado antes da adição de etanol-amina IMeincubação por 20 min. Após outra etapa de centrifugação a 14.000 g por 5min, LPS oxidado dissolvido em acetato de sódio de pH 4,0 foi adicionadopara permitir imobilização por 90 min. Após remoção do sobrenadanteadquirido por centrifugação, a ligação entre a superfície do glóbulo e oantígeno foi estabilizada usando cianoboroidreto de sódio 100 mM dissolvidoem acetato de sódio 10 mM em pH 4.

Ensaio BioPlex

Após aquecimento do dispositivo de contagem de glóbulos,este BioPlex (BioRad, Veenendaal, Os Países-Baixos) foi calibrado de acordocom as instruções do produtor usando um kit de calibração de BioPlex(BioRad). Amostras foram diluídas em PBS 50 mM em cavidades de umaplaca de microtítulo que foram então suplementadas com 50 μΐ, de 5.000glóbulos/mL de glóbulos revestidos de LPS. A ligação de antígeno-anticorpofoi permitida por 30 min sobre um agitador de placa de microtítulo operado a200 rpm. Então 10 μί de IgG (H+L) de cabra anti-suíno marcada commarcadores fluorescentes Alexa532 diluídos 8 vezes em PBS 50 mM foramadicionados e incubação foi continuada por 15 min sobre o agitador. Osglóbulos foram então analisados para seus perfis de fluorescência por 30 s namáquina BioPlex.

Resultados e discussão

Glóbulos fluorescentes foram preparados para revestimentocom LPS de fontes diferentes de sorovares de Salmonella específicosrepresentado os sorogrupos B, C e D relevantes como zoonoses em alimentosde galinha e suíno. Deve ser observado que o sorogrupo E, que é relevantepara produtos de carne de porco, não é aqui estudado. Após a imobilização decada tipo de LPS em glóbulos individuais, que estão internamentecodificados, o sucesso do revestimento foi avaliado usando anti-sorosmonoclonais comercialmente disponíveis contra antígenos somáticos 04, 05,07, 08 e 09. Contudo, embora anti-05 desse uma resposta de 6398 unidades,anti-09 deu 145 unidades, enquanto que o sinal de fundo de anticorpos-antígenos não combináveis foi menor do que 91 unidades em todos os casos(Fig. 6). Em uma maneira similar, anti-04 e anti-07 deram respostas de 305unidades e 174 unidades, respectivamente (Fig. 7). Estas diferenças emrespostas entre preparações de anti-soros comercialmente disponíveisestiveram em correspondência muito boa com aquelas observadas usando umbiossensor de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) e refletemdiferenças em títulos de anticorpo.

Em um modo similar, as atividades de bateladas de LPSidênticas oxidadas em dias diferentes foram testadas usando um painel similarde anti-soros comerciais (Fig. 8). Comparado com outra batelada de oxidação,as respostas variaram entre 57% e 148%, que é suscetível de melhorias.

Preparações diferentes de líquido extraído (drip) de carne, i.e.suco que é adquirido de tecido muscular após um ciclo de congelamento edescongelamento, e soros de galinhas foram analisadas (Fig. 9). Atividadesregistradas foram como esperado. Soro, líquido extraído idrip) de carne, euma mistura de soro e líquido extraído {drip) de carne de galinhas livres deSalmonella deram glóbulos conjugados fluorescentes abundantes baixos. Emcontraste, anti-iS. pullorum e anti-S. gallinarum devem dar uma resposta sobresorogrupos BeD, porque contêm antígenos Ol e 012, que ocorre paralíquido extraído (drip) e soro. S. infantis contém antígeno 06, que écompartilhado por Ci e C2. De fato, esta atividade é observada em líquidoextraído (drip) e soro [aab9]·

Além de soro de galinha, soros suínos preparados tambémforam testados (Fig. 10). Soro de porcos livres de Salmonella deram respostasMFI dentro da faixa de 110 unidades (sorogrupo C2) a 137 unidades(sorogrupo B) e estiveram próximas das respostas de glóbulos apenasincubados com tampão, a saber 94 unidades (sorogrupo D) a 129 unidades(sorogrupo C2). Como esperado, sinais significativos foram registradosquando soros foram injetados com anti-soros anti-S. typhimurium e S.livingstone, a saber 969 unidades sobre sorogrupo B e 207 unidades sobresorogrupo Ci, respectivamente. Os soros injetados não reagiram comantígenos não-correspondentes entre 104 unidades MFI 131 unidades MFI.

Exemplo 5

Determinação de anticorpos anti-Salmonella em espécies exóticas de avesusando um biossensor SPR[aabio]

Objetivo do estudo

O objetivo deste estudo foi explorar se a tecnologia debiossensor SPR desenvolvida baseada no uso de LPS de Salmonellaselecionado imobilizado para detectar indiretamente infecções de Salmonellaem animais produtores de alimento, também é capaz de detectar tais infecçõesem espécies animais exóticas.

Materiais

Plasmas de tucanos (Rhamphastos toco) e de um galo silvestre(Tympanuchus phasianellus), que estavam infectados com S. typhimurium dediferentes tipos de fago, foram gentilmente proporcionados pelo dr. W.Schaffcenaar e pelo eng. M. de Boer (Veterinary Department, Rotterdam Zoo,Os Países-Baixos). A história de doença destes animais é a seguinte.

Das fezes de um tucano amostradas em 24 de março de 1994,fagotipo 292 de S. typhimurium foi isolado. De outra amostra de fezes demesmo pássaro, fagotipo 352 de S. typhimurium 352 foi isolado em 28 dejunho de 194. Plasma de 24 de agosto de 1994 foi coletado deste animalusado para análise SPR neste estudo.

Sangue foi coletado de um galo silvestre doente em 28 deoutubro de 1997. O plasma preparado deste sangue foi usado para análiseneste estudo. Este animal morreu no dia seguinte. Fagotipo 507 de S.typhimurium foi isolado da ave morta.

Métodos

Um biossensor SPR (Biacore 3000) contendo um chip sensorcujos canais de fluxo estavam revestidos com LPS de S. enteritidis, S.livingstone, S. goldcoast e S. typhimurium, foi operado como descrito noinício. Amostras de plasma foram diluídas como descrito para os soros emExemplos 1 e 2 e analisadas.

Resultados e discussão

A invenção foi em primeiro lugar desenvolvida para aplicaçãoem cadeia alimentar para garantir a segurança de alimento de origem animalcom respeito às contaminações de Salmonella. Contudo, o campo deaplicabilidade foi testado com plasma coletado de duas espécies exóticas, asaber um tucano (R. toco) e um galo silvestre (T. phasianellus), que foraminfectadas com S. typhimurium como descrito pelos diagnósticosmicrobiológicos clássicos (comunização pessoal com M. de Bôer, BlijdorpZoo, Rotterdam). As fezes do tucano foram verificadas positivas cinco e doismeses antes da amostragem de sangue e uma resposta humoral pôdedesenvolver no decorrer de um período de tempo relativamente longo. Defato, a resposta de biossensor foi alta (Tabela 33). Comparada com o sorobranco de galinhas SPF e com anti-soro padrão (anti-sorogrupos A a S), areatividade com LPS de S. typhimurium foi dramaticamente alta (4185unidades de resposta (RU)). Uma resposta também foi observada no canal deS. enteritidis (1220 RU), que também foi observada para o soro de galinhaselevadamente infectadas exclusivamente com S. typhimurium e está de acordocom a presença de antígeno somático )12 em ambos os sorovares e portantonos sorogrupos BeD (cf. Tabelas 1 e 3). Surpreendentemente, uma respostarelativamente alta também foi observada no canal de S. goldgoast. Não podeser aqui excluído que esta ave foi infectada com múltiplos sorovares deSalmonella simultânea ou seqüencialmente com S. typhimurium como aúltima infecção, incluindo uma infecção C2.

O plasma do galo silvestre não foi muito reativo com os tiposde LPS diferentes, mas a reatividade foi em todos os casos maior do queaquela do soro branco e sobre LPS de Sl e de St maior do que aquela do anti-soro de referência (Tabela 33). Visto que as aves morreram rapidamentedesde a infecção, uma resposta humoral significativa contra os antígenosselecionados provavelmente não foi totalmente desenvolvida e não detectadapelo biossensor. Deve ser observado portanto que sorologia é não muitoadequada para diagnose em um nível individual. Como evidenciado emSwanenburg (Utrecht Thesis, Utrecht University, 2000), sorologia é, emparticular, adequada para avaliar o estado de Salmonella em um nível depopulação.

Tabela 33. Resultados da análise de plasma coletado de um tucano e de umgalo silvestre que estavam infectados com S. typhimurium. Os resultados sãoexpressados em unidades de resposta relativa. Amostras foram analisadas trêsvezes.

<table>table see original document page 89</column></row><table>

a soro de galinhas livres de patógeno específico, i.e. soro brancob anticorpo monoclonal comercialmente disponível reativo ao sorogrupo B deSalmonella.

Exemplo 6

Detecção de bacteriófago Felix Ol (FOI) por meio de sua ligação em LPS deSalmonella LPS imobilizado sobre superfície de chip biossensor SPRObjetivo

Para determinar a ligação do bacteriófago FOl em LPSimobilizado na superfície de biossensor

Abordagem

Para provar a ligação de bacteriófago Felix Ol (FOI, Felixd'Herelle Reference Centre for Bacterial Viruses, Lavai, Canadá) em LPS deSalmonella, o bacteriófago foi diluído em HBSEP para obter uma série deconcentrações. Estas amostras foram injetadas por 2 min no biossensor parapermitir ligação em LPS de S. typhimurium, S. enteritidis, S. goldcoast e S.livingstone, que foram cada um imobilizados separadamente em um canal defluxo individual do chip sensor.

Resultados

Os resultados são sumariados na Fig. 11.

Embora uma concentração relativamente alta de bacteriófagofosse necessária para obter uma resposta significativa, é evidente desteexperimento que IO9 PFU de bacteriófagos FOl/mL e maior ligaram em LPScopulado nesta superfície de chip.

Exemplo 7

Detecção de bacteriófago FOl por meio de sua ligação emLPS de S. typhimurium imobilizado sobre um biossensor SPR após suaincubação com S. typhimurium, S. enteritidis, S. goldcoast e S. livingstone

Objetivo

Para determinar a ligação de bacteriófago FOl em uma culturaviva de Salmonella spp. em HBSEP.

Abordagem

Concentrações diferentes de culturas de S. typhimurium, S.enteritidis, S. goldcoast, S. livingstone e meio branco foram misturadas por 5min com 1,2x1 OO9 PFU de bacteriófago FOI. Após incubação, as bactériasforam centrifugadas e o sobrenadante foi analisado em Biacore com um chipbiossensor contendo LPS imobilizado de S. typhimurium.Resultados

Com o objetivo de determinar respostas significativas, umvalor de corte foi estabelecido pelas leituras tomadas na média de meiobranco não contendo Salmonella mas contendo 1,2x109 PFU de bacteriófagos,menos 3 vezes desvio padrão. Aplicação deste valor foi descrito queSalmonella deve estar presente em uma concentração de pelo menos 6x10CFU/mL, 3xl06 CFU/mL, 4xl07 CFU/mL e 3xl04 CFU/mL para £typhimurium, S. enteritidis, S. goldcoast, S. livingstone, respectivamente, paradar uma resposta significativa (Figure 12).

Discussão

A velocidade de absorção de bacteriófago FOl paraSalmonella spp. provavelmente é dependente da acessabilidade de N-acetil-glicosamina na região de núcleo, o sítio de ligação de FOl (Lindberg, 1977;Lindberg e Holme, 1969[aabii])· Cadeias laterais-O longas e numerosasocorrendo na região de polissacarídeo do LPS de Salmonella selecionadapuderam, portanto, prejudicar a ligação de FOl no analito. Portanto, éesperado que bacteriófagos livres possuirão uma capacidade de ligaçãovariável em cepas de Salmonella e que a propagação do vírus dependerálargamente do perfil molecular do LPS exposto.

Quando se imobilizam complexos de LPS-proteína nasuperfície de um suporte sólido para um método diagnóstico, como descritona invenção, pode ser formada uma rede densa de ligantes. Na análise Biacoreapresentada, a densidade do complexo e o impedimento pelas proteínaspodem desempenhar um papel na diferença observada na ligação debacteriófago em quatro tipos de LPS.

Deve ser observado que, como também discutido na invenção,é esperada a oxidação de constituintes monossacarídeo na região de núcleo,incluindo aquele de N-acetil-glicosamina. O ligante para o bacteriófago é,portanto, afetado e isto pode influenciar a sensibilidade do teste.Exemplo [AAB12]_8

Propagação de bacteriófago FOl em cepas de Salmonella e de não-Salmonella

Objetivo

A propagação de FOl não é exclusiva em Salmonella spp.,mas possivelmente também em cepas de não-Salmonella (3). Este estudo foiiniciado para investigar a seletividade da proliferação do bacteriófago FOI.Para este propósito, numerosos patógenos de não-Salmonella de alimentoforam expostos ao bacteriófago FOI.

Métodos

Sete cepas de não-Salmonella (.Listeria monocytogenes,Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus, Citrobacter,Enterococcus feacalis, e Staphylococcus aureus) e sete cepas de Salmonella(S. cholerasuis, S. berta, S. meleagridis, S. Agona, S. pullorum, S. Virehow eS. enteritidis) foram crescidas em Caldod e Soja Triptona (Oxoid CM129).

Em t 0 horas, 1,2x10 PFU de FOl (concentração final de1xIO6 PFU/mL) foram adicionados em todas as culturas. Cada hora umaamostra foi retirada, e foram determinadas absorbância em λ 600 nm (Figs. 13e 14), unidades de formação de placa bacteriana/mL (Figs. 15 e 16) e, apósconcentração e troca de tampão, ligação em St-LPS imobilizado sobre umasuperfície de chip sensor em um biossensor Biacore biossensor (Fig. 17).

Algumas bactérias de não-Salmonella, incluindo L.monocytogenes, P. aeruginosa, E. faecalis e Staph. aureus, não mostraramcrescimento em cinco horas de cultura (Fig. 13). Estas bactérias obviamentenão foram carregadas nem infectadas pelo bacteriófago FOI, porque aconcentração de bacteriófagos não aumentou no decorrer do tempo e ficouestacionaria em IxlO6 PFU/mL (Fig. 15). Em contraste, todos os sorovaresSalmonella, exceto S. virchow, cresceram em cinco horas de incubação (Fig.14). Esta cepa de S. virchow provavelmente foi lisada completamente pelosbacteriófagos em proliferação, porque um aumento claro na concentração debacteriófagos pode ser mostrado delxlO6 PFU/mL para IxlO10 PFU/mL (Fig.16). Em um modo similar, bactérias S. berta e S. meleagridis mostraram, umaumento de concentração de bacteriófagos. Contudo, estas bactérias, emparticular, S. berta mostraram crescimento bom (Fig. 14).

No contexto da invenção, a ligação de bacteriófagospropagados na superfície do sensor é de maior interesse. Para este propósito,bacteriófagos propagados em Salmonella foram concentrados, dialisados eserialmente diluídos antes da análise por biossensor SPR (Fig. 17).

Surpreendentemente, concentrações de bacteriófago comparáveis deramrespostas de biossensor diferentes dramáticas. Mais provavelmente fagosforam perdidos, em particular durante etapa de concentração e diálise, durantea preparação de amostra. Contudo, as preparações de bacteriófagos, que têmmostrado propagação (cf. Fig. 16) deram respostas claramente mais altas doque a da amostra branca, que continha apenas a concentração inicial debacteriófagos.

Conclusão

Estes experimentos mostraram que bacteriófagos podem serusados como uma ferramenta analítica para detectar a presença de Salmonellaem amostras e que LPS de Salmonella imobilizado em uma superfície sólidapode ser usado para sondar o incremento dos bacteriófagos como umresultado de propagação do vírus nas bactérias hospedeiras após um períodode incubação curto.

Exemplo 9

Imobilização de LPS derivado de Salmonella sobre glóbulos fluorescentes(Iuminex) e detecção de anticorpos relatando uma infecção passada oucorrente de Salmonella em várias amostras biológicaS[AAB\3]0. ADVERTÊNCIA E PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

Lipopolissacarídeos são imunógenos potentes, que podemlevar pessoas sensíveis a um choque séptico após ingestão ou inalação.Precauções devem ser feitas para prevenir o contato com este agentesbioquímico.

Periodato de sódio é um agente oxidante e pode causarexplosões quando contatado com agentes redutores.

O procedimento utiliza cianoboroidreto de sódio. Oprocedimento deve ser portanto realizado com precauções tais como porexemplo o uso de luvas de mão e uma máscara. Usar esta substância químicaapenas em uma capela. O material é muito tóxico para organismos aquáticos epode causar efeito adverso de longa duração em ambiente aquático. O resíduode solução e de material deve ser disposto como um resíduo perigoso.

1. INTRODUÇÃO

Dentre os componentes da estrutura antigênica do gêneroSalmonella, os antígenos somáticos são importantes como um instrumentopara traçar resposta imune em animais sob uma infecção invasiva destemicroorganismo. Antígenos somáticos estão localizados sobre a parte depolissacarídeo do lipopolissacarídeo (LPS), que é um constituinte da paredecelular bacteriana. Após extração e isolamento do LPS de sorotipos deSalmonella cuidadosamente escolhidos (cf. SOP CHEMIE/A21 [aabi4])> LPScontendo antígeno é copulado covalentemente em glóbulos, que sãointernamente codificados por uma mistura específica de material fluorescente.

A plataforma de tecnologia explorada de Luminex pode identificar até 100glóbulos diferentemente internamente codificados em um único teste. Umaespécie única de glóbulos pode ser imobilizada com uma mistura de LPSrefletindo sorogrupos diferentes, ou espécies de glóbulos diferentes podemser, cada uma, imobilizadas com LPS refletindo um sorogrupo ou sorovarespecífico único do microorganismo patogênico. Os glóbulos contendo LPSsão incubados com materiais derivados de corpo, tais como sangue, plasma,soro, suco/líquido extraído (drip) de carne, gema de ovo, leite etc., parapermitir ligação de antígeno - anticorpo anti-Salmonella. A ligação específicaé detectada após uma segunda incubação com anticorpos de imunoglobulinafluorescentemente marcados em um dispositivo analisando simultaneamenteos comprimentos de onda de emissão de glóbulos excitados e anticorposmarcados. Apenas quando ambas as fluorescências do glóbulo e do anticorposão detectadas simultaneamente será registrada uma resposta para umaespécie de glóbulo específica.

Este SOP descreve o método para oxidação, imobilização deLPS sobre glóbulos (Luminex) e um ensaio para avaliar a qualidade doproduzido.

2. ESCOPO E CAMPO DE APLICAÇÃO

Para analisar fluidos biológicos, tais como amostras de soro degalinha e porcos, para a presença de anticorpos anti-Salmonella reagindo comantígenos somáticos 03, 04, 05, 06, 07, 08, 09, OlO e Ol2 refletindo umahistória de infecção passada ou corrente de Salmonella de sorogrupos B, C, D e E.

3. REFERÊNCIAS

Extração e isolamento de lipopolissacarídeos de Salmonella SPP· 5

Imobilização de LPS derivado de Salmonella sobre um chipbiossensor (biacore) e detecção de anticorpos de soro relatando uma infecçãopassada ou corrente de Salmonella;

Otimização da adição de proteína em LPS para imobilização edetecção de anticorpos de soro; veja Exemplo 1.

4. DEFINIÇÕES

c - concentração em % (m/v), % (v/v), mol/L ou mmol/L comoindicado.

5. LISTA DE ABREVIAÇÕES

5.1 EDC, cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida5.2 LPS, Lipopolissacarídeos

5.3 NaCl5 Cloreto de sódio

5.4 NaOH3 Hidróxido de sódio

5.5 NHS5 N-hidróxi-succinimida

5.6 PBS, Solução salina tamponada com fosfato

5.7 Se, Salmonella enteritidis

5.8 Sg, Salmonella goldcoast

5.9 SI, Salmonella livingstone

5.10 Sm7 Salmonella meleagridis

5.11 SOP, Procedimento operacional padrão

5.12 St, Salmonella typhimurium

5.13 TCA, Acido tricloroacético

6. PRINCÍPIO

LPS é oxidado na presença de uma proteína facilitado porperiodato de sódio. A solução de LPS-proteína é dessalinizada usando umacoluna NAP-5. Após ativação dos grupos ácido carboxílico na superfície dosglóbulos com o auxílio de cloridrato de l-etil-3- (3-dimetil-amino-propiI)-carbodiimida - (EDC), N-hidróxi-succinimida (NHS) seguido por uma reaçãocom carbohidrazida, o complexo de LPS-proteína oxidado dessalinizado éimobilizado na fase sólida dos glóbulos. LPS ligado é então estabilizado comcianoboroidreto de sódio. Antes do uso rotineiro, o desempenho do LPSconjugado em glóbulo para ligar anticorpos anti-Salmonella é avaliadousando um painel de soros de aglutinação monoclonais de referência.

7. REAÇÕES

7.1 OXIDAÇÃO DE GRUPO CABOIDRATO

Periodato induzirá uma disrupção oxidativa de ligações entrecis-dióis vicinais, em particular, grupos carboidrato, como em e.g. manose,para dar funcionalidades aldeído, veja Figure 18. Esta reação é tipicamenterealizada em tampões em uma faixa de pH entre 4,5 e 5,5 no escuro usandoum meta-periodato de sódio 10-100 mM recém-preparado em acetato de sódio0,1 M.

NOTA 1: As posições de conjugações indicadas na Figura 18,para ligar o monossacarídeo mostrado com os outros resíduos demonossacarídeo em um polissacarídeo, como em e.g. LPS, são aqui apenasdadas como um Exemplo. R' e R indicam as posições distai e proximal,respectivamente, na cadeia de carboidrato. A oxidação de grupos hidroxila emaldeídos pode se repetir dentro da cadeia de polissacarídeo em cadaconstituinte monossacarídeo contendo dióis vicinais suscetíveis.

NOTA 2: Periodato também oxidará, quando presentes, certos6-amino-etanol-derivados tais como resíduos de hidróxi-lisina em colágeno,bem como metionina (para seu sulfóxido) e certos tióis (normalmente paradissulfetos). Em adição, resíduos de serina e de treonina N-terminais depeptídeos e proteínas podem ser seletivamente oxidados por periodato agrupos aldeído. Estas reações, contudo, normalmente ocorrem em umavelocidade menor do que a oxidação de dióis vicinais.

7.2 CONJUNGAÇÃO EM PROTEÍNA

Oxidação é realizada na presença de uma proteína. Oscompostos de bis-aldeído, tais como os constituintes de monossacarídeooxidados na cadeia de polissacarídeo de LPS aqui, podem reagir comqualquer grupo amino em uma proteína e podem formar uma ligação de basede Schiff resultando em uma imina substituída. Veja Figura 19.

NOTA: A imina substituída está estabilizada enquanto ocomplexo estiver ligado na superfície do glóbulo, por uma redução facilitadapelo cianoboroidreto. Este tipo de esquema de reação é conhecido comoaminação redutiva.

7.3 IMOBILIZAÇÃO EM GLÓBULOS FLUORESCENTES

Os glóbulos marcados com ácido carboxílico são ativadosusando cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetil amino-propil)-carbodiimida (EDC)e N-hidróxi-succinimida (NHS). A ativação é seguida por uma reação comcarbohidrazida. As funcionalidades aldeído reativas reagem espontaneamentecom a hidrazida para dar hidrazonas, que são então reduzidas para estabeleceras ligações covalentes. veja Figura 20.

NOTA: A proteína (R") transporta múltiplos grupos -NH2 epode portanto ser conjugada com múltiplas entidades LPS oxidadas. Por outrolado, a parte de polissacarídeo em LPS pode transportar múltiplos gruposaldeído livres em uma única molécula. Estes grupos aldeído podem seremcapturados parcial ou completamente pela camada de hidrazida sobre osglóbulos. O resultado líquido pode ser uma rede complexa estável deproteína-LPS covalentemente ligada na superfície do glóbulo.

8. REAGENTES E MATERIAIS

No procedimento completo apenas reagentes de grau analíticoreconhecido e apenas água destilada ou água de pureza equivalente sãousados, a não ser que seja indicado de outro modo. Referência a umacompanhia é apenas para informação e identificação e não implica umarecomendação a não ser que assim declarado.

8.1 COMPOSTOS QUÍMICOS

8.1.1 Acido acético (J.T. Baker, Deventer, Os Países-Baixos)

8.1.2 Kit de copulação de amina (Biacore AB, Uppsala, Suécia) consistindode:

8.1.2.1. Frasco contendo 115 mg de N-hidróxi-succinimida (NHS)

8.1.2.2. Frasco contendo 750 mg de cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDC)

8.1.2.3. Frasco contendo 10,5 mL, c = 1 mol/L, cloridrato de etanol-amina -hidróxido de sódio pH 8,5

8.1.3. Kit de calibração Bio-Plex (Bio-Rad, Veenendaal, Os Países-Baixos)

8.1.4. Carbohidrazida, CN4H6CO (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Suíça)

8.1.5. Sal de sódio de carbóxi-metil-dextrano (Fluka)8.1.6. Diidrogeno-fosfato de potássio (KH2PO4) (Merck, Darmstadt,Alemanha)

8.1.7. Proclin 150 (Supleco, Bellefonte, PA, USA)

8.1.8. Anticorpos Monoclonais anti-antígenos O de Salmonella:

8.1.8.1. anti-04 (SIFIN, Berlim, Alemanha)

8.1.8.2. anti-05 (SIFIN)

8.1.8.3. anti-06i (SIFIN)

8.1.8.4. anti-07 (SIFIN)

8.1.8.5. anti-08 (SIFIN)

8.1.8.6. anti-09 (SIFIN)

8.1.8.7. anti-010 (SIFIN)

8.1.9. LPS de Salmonella, LPS isolado em casa por extração em TCA (SOPCHEMIE/A21) preparado de soro vares de bactérias Salmonella enteriditis(Se), goldcoast (Sg), livingstone (SI), meleagridis (Sm) e typhimurium (St)com proteína (SOP CHEMIE/A23)

8.1.10. Ig-PE de ovelha anti-camundongo (Chemicon, Boronia, Victoria,Austrália)

8.1.11. Acetato de sódio tri-hidratado (J.T. Baker, Phillipsburgh, NJ, USA)

8.1.12. Cloreto de sódio (Merck)

8.1.13. Cianoboroidreto de sódio (NaCNBH3) (Fluka)

8.1.14. Hidrogeno-fosfato de dissódio (Na2HPO4) (Merck)

8.1.15. Hidróxido de sódio, c = 50 mmol/L (Biacore)

8.1.16. m-periodato de sódio (NaIO4) (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, OsPaíses-Baixos)

8.1.17. Água é obtida de um sistema de purificação de água Milli Q

8.2. SOLUÇÕES

8.2.1. Solução de ácido acético, c = 0,1 g/mL: Diluir 1 mL de ácido acético(8.1.1) com 9 mL de água.

8.2.2. Solução tampão acetato, c = 10 mmol/L, pH 4,0: dissolver 0,272 g deacetato de sódio tri-hidratado (8.1.11) em 180 mL de água e ajustar para pH4,0 com ácido acético (8.1.1) e completar para 200 mL com água. Estetampão é estável por aproximadamente seis meses.

8.2.3. Solução de tampão acetato, c = 1,0 mol/1, pH 5,5: dissolver 13,6 gacetato de sódio tri-hidratado (8.1.11) em 90 mL de água e ajustar para pH 5,5com ácido acético (8.1.1) e completar para 100 mL com água. Este tampão éestável por aproximadamente seis meses. 8.2.4. Solução de tampão acetato, c= 100 mmol/L, pH 5,5: diluir 1,0 mL de solução de tampão acetato, c ~ 1,0mol/Ll (8.2.3) com 9,0 mL de água.

8.2.5. Solução de carbohidrazida, c = 100 mmol/L: dissolver 9,0 mg decarbohidrazida (8.1.4) em 1.000 μΕ de água.

8.2.6. Solução de carbohidrazida, c = 5 mmol/L: diluir 10 μί de solução decarbohidrazida (8.2.5) com 190 μΙ, de água. Preparar imediatamente antes douso.

8.2.7. Solução de EDC: reconstituir EDC (8.1.2.2.) em 10,0 mL de água.

8.2.7.1. Fracionar alíquotas delOO μί desta solução (8.2.7) em tubo depolietileno (9.15). Armazenar a -18°C ou em temperatura menor. As alíquotassão estáveis por dois meses. Antes do uso: descongelar alíquotas congeladas eagitá-las cuidadosamente para garantir soluções homogêneas.

8.2.8. Solução de etanol-amina: pipetar 200 μί de solução de etanol-amina dec=l mol/L (8.1.2.3) em um tubo de polipropileno (9.15)

8.2.9. Solução de NHS: reconstituir NHS (8.1.2.1) em 10,0 mL de água.

8.2.9.1. Fracionar alíquotas de 100 μΕ desta solução (8.2.9) em tubo depolietileno(9.15). Armazenar a -18°C ou em temperatura menor. As alíquotassão estáveis por dois meses. Antes do uso: descongelar alíquotas congeladas eagitá-las cuidadosamente para garantir soluções homogêneas.

8.2.10. PBS (5.6), c = 100 mmol/L, pH 7,2: dissolver 67,9 g de cloreto desódio (8.1.12), 14,7 g de hidrogeno-fosfato de dissódio (8.1.14) e 4,3 g dediidrogeno-fosfato de potássio (8.1.6) em 1 L de água (8.1.17).8.2.11. PBS5 c = 10 mmol/L, pH 7,2: diluir 100 mL de PBS 10 vezesconcentrado (8.2.10) em 1 L de água (8.1.17).

8.2.12. Ig-PE anti-camundongo, pré-diluída: diluir conjugado fluorescente 5vezes por misturação de 40 μί de Ig-PE anti-camundongo (0) com 160 μΙ, dePBS (8.2.11).

8.2.13. Cianoboroidreto de sódio, c = 1.00 mol/L: dissolver 62,8 mg decianoboroidreto de sódio (8.1.13) em 1.000 μΙ. de solução de acetato 10 mMde pH 4,0 (8.2.2).

8.2.14. Cianoboroidreto de sódio, c = 100 mmol/L: diluir 180 μι de soluçãode cianoboroidreto de sódio (8.2.13) com 1.620 μΙ. de solução de acetato, c =10 mmol/L, pH 4,0 (8.2.2). Preparar imediatamente antes do uso.

8.2.15. Hidróxido de sódio, c = 5 mmol/L: Diluir 400 \)L de hidróxido desódio c = 50 mmol/L (8.1.15) com 3,6 mL de água em frasco de vidro (9.10).

8.2.16. Solução de m-periodato de sódio, c = 100 mmol/L: Adicionar 214 mgde m-periodato de sódio (8.1.16) em 10,0 mL de água (8.1.17).

8.2.17. m-Periodato de sódio 'pronto para uso': pipetar 100 μί de m-periodato de sódio, c = 100 mmol/L 1 (8.2.16) em um tubo de polipropileno de1,4 mL (9.14) e secar com um evaporador centrífugo (9.4).

8.2.18. Solução de periodato de sódio, c = 50 mmol/L: Dissolver periodato desódio 'pronto para uso' (8.2.17) em 200 μΕ de solução de acetato, c = 100mmol/L de pH 5,5 (8.2.4). Preparar imediatamente antes do uso.

8.3. SOLUÇÃO DE REFERÊNCIA MONOCLONAL PADRÃO

8.3.1. Anticorpo monoclonal concentrado anti-05 de Salmonella (8.1.8.2):diluir 5 μΕ de anti-05 10 vezes pela adição de 45 μΕ de PBS c ~ 10 mmol/L,pH 7,2 (8.2.11).

8.3.2. Anticorpo monoclonal anti-05 de Salmonella: 7,5 μΕ de anti-05 (8.3.1)10 vezes diluído pela adição de 67,5 μΕ de PBS c ~ 10 mmol/L, pH 7,2(8.2.11).

8.3.3. Anticorpo monoclonal anti-antígenos O de Salmonella (8.1.8): diluir7,5 \)L de cada anticorpo monoclonal (8.1.8.1, 8.1.8.3, 8.1.8.4, 8.1.8.5,8.1.8.6, 8.1.8.7) com 67,5 μΐ. de PBS (8.2.11) em uma placa de microtítulo(9.20),

8.3.4. Anticorpos monoclonais três vezes diluídos: adicionar 25 μΐ, de soluçãode anticorpo monoclonal (8.3.2 e 8.3.3) em 50 pL de PBS c ^ 10 mmol/L, pH

7,2 (8.2.11) em cavidades de mesma placa de microtítulo (8.3.3)

8.3.5. Repetir etapa 8.3.4 duas vezes para obter anticorpos 9 e 27 vezesdiluídos em cavidades frescas da placa de microtítulo no caso de anti-04,anti-06, anti-07, anti-08, anti-09 e anti-010. No caso de anti-05, estesfatores de diluição foram de 90 e 270 vezes, respectivamente.

8.3.6 Remover 25 \\L da solução mais alta (8.3.5).

8.3.7 As soluções de anticorpo estão agora prontas para uso.

NOTA: Os fatores de diluição final são 100, 300, 900 e 2700 vezes no caso deanti-05, enquanto que nos outros casos os anticorpos foram finalmentediluídos 10, 30, 90 e 270 vezes comparados com a preparação original (8.1.8).

8.4. MATERIAIS AUXILIARES

8.4.1 Coluna NAP-5 (0,5 mL, Sephadex G-25, Amersham Biosciences).

8.4.2. Glóbulos-COOH (microesferas-COOH de 5,6 μηι) números 24, 25, 26,27 e 28 misturados em mertiolate aquoso 0,01% em1,25x10' glóbulos/mL

(BioRad).

9. EQUIPAMENTO E APARELHAGEM

Referência a uma companhia é apenas para informação e nãoimplica uma recomendação a não ser que enunciada. Aparelhagens eequipamento equivalentes também podem ser apropriados.

9.1. Balança analítica (tipo AE 240, Mettler, Zurique, Suíça)

9.2. BioPlex 200 (Bio-Rad)

9.3. Câmara de contagem Bürker-Türk (Mainit B.V., Wormer, Os Países-Baixos)

9.4. Evaporador centrífugo (Jouan, Saint-Herblain, França)9.5. Pipeta Finn, 5-40 \\L (Labsystems Oy, Helsinki, Finlândia)

9.6. Pipeta Finn, 40-200 μΐ, (Labsystems Oy)

9.7. Pipeta Finn, 200-1000 μΐ. (Labsystems Oy)

9.8. PipetaFinn, 1- 5 mL (Labsystems Oy)

9.9. Tubo coletor de vidro, 5 mL, tampado (Renes, Zeist, Os Países-Baixos)

9.10. Frasco de vidro de diâmetro de 16 mm (Sarstedt B.V., Etten-Leur, OsPaíses-Baixos)

9.11. Gyro rocker SSL3 (Stuart, Barloworld Scientific Ltd. Stone,Staffordshire, Reino Unido)

9.12. Lamínulas de cobertura de vidro de microscópio (Chance Propper Ltd,Smethwick, Warley, Inglaterra)

9.14. Miniagitador com cabeça de copo de mitrotitulador (MS 1, Janke &Kunkel, Staufen, Alemanha)

9.15. Tubo de polipropileno, diâmetro de 7 mm, com tampas de pressão(Biacore)

9.16. Tubo de polipropileno, 1,4 mL (Micronic, Lelystad, Os Países-Baixos)

9.17. Medidor de pH (tipo pH 537, WTW, Weilheim, Alemanha).

9.18. Banho de sonicação, Branson 2200 (Branson Ultrasonics B.V., Soest,Os Países-Baixos)

9.19. Distribuidor de vácuo, para operar várias colunas NAP-5simultaneamente (tipo SPE-12G, com tampa(s) de PTFE, J.T.Baker).

9.20. Placa de poliestireno de microtítulo de fundo em V, de formato de 96cavidade (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha)

9.21. Misturador-Vórtice (KS-I, Janke & Kunkel)

10. PROGRAMA DE COMPUTADOR

A aparelhagem BioPlex é operada com Bio-Plex Managersoftware 4.1.

11. PROCEDIMENTO

11.1. OXIDAÇÃO E DESSALINIZAÇAO DE SOLUÇÃO DE LPSPRECAUÇÃO DE SEGURANÇA:

Lipopolissacarídeos são imunógenos potentes, que podemtrazer pessoas sensíveis para um estado de choque séptico após ingestão ouinalação. Precauções devem ser feitas para se prevenir o contato com esteagente bioquímico. Periodato de sódio é um agente oxidante e pode causarexplosões quando contatado com agentes redutores fortes.

O procedimento utiliza cianoboroidreto de sódio. Oprocedimento deve ser portanto realizado com precauções tais como porexemplo o uso de luvas de mão e uma máscara. Usar esta substância químicaapenas em uma capela. O material é muito tóxico para organismos aquáticos epode causar efeito adverso de longa duração em ambiente aquático. O resíduode solução e de material deve ser disposto como um resíduo perigoso.

11.1.1. OXIDAÇÃO

11.1.1.1. Adicionar 500 μΐ, de tampão acetato, c ~ 100 mmol/L, pH 5,5(8.2.4) em LPS seco (8.1.9); veja precaução de segurança)

11.1.1.2. Agitar com Vórtice (9.21) a solução (11.1.1.1) e sonicar (9.18) pormin e observar o processo de reconstituição de modo que todo o LPS sejadissolvido.

11.1.1.3. Adicionar 20 μί de solução de periodato c ^ 50 mmol/L (8.2.18) nasolução de LPS (11.1.1.2)

11.1.1.4. Agitar com Vórtice (9.21) a solução (11.1.1.3)

11.1.1.5. Incubar sobre gelo por 40 min protegido da luz.

11.1.1.6 Interromper a oxidação por dessalinização da solução (11.1.1.4)como descrito em 11.1.2

11.1.2. DESSALINIZAÇÃO

11.1.2.1. Posicionar a(s) coluna(s) NAP-5 (8.4.1) no distribuidor (9.19).

11.1.2.2. Condicionar a(s) coluna(s) (11.1.2.1) por passagem de três porçõesde 3 mL de tampão acetato c ~ 10 mmol/L, pH 4,0 (8.2.2) sobre o leito decoluna em um fluxo gerado apenas por gravidade. Permitir que o tampãoentre completamente no leito de gel.

11.1.2.3. Pipetar 0,5 mL de solução de LPS oxidado (11.1.1.5) para a coluna.Permitir que a amostra entre completamente no leito de gel. O fluxo atravésda coluna não é coletado.

11.1.2.4. Eluir LPS oxidado com 1 mL de tampão acetato c = 10 mmol/L, pH4,0 (8.2.2). Coletar eluato em um tubo de vidro de 5 mL (9.9).

11.1.2.5. Agitar com vórtice (9.21) a solução (11.1.2.4) por IOse adicionar 2μl de Proclin 150(8.1.7).

11.1.2.6.Quando não usadas imediatamente (11.1.2.5) armazenar as amostrasa de 4°C a 7°C.

11.1.2.7. Antes da imobilização, a solução contendo LPS (11.1.2.5) que podeser usada para diferentes aplicações de espécies e matriz de gel é diluídacomo indicado nas seguintes Tabelas 34 e 35.

Tabela 34. Quantidade de solução de LPS usada para imobilizar glóbulospara detecção de anticorpos em antígenos O de Salmonella em soros de suíno

<table>table see original document page 105</column></row><table>

Tabela 35. Quantidade de solução de LPS usada para a imobilização emglóbulos fluorescentes para a detecção de anticorpos em soros de galinhareagindo com antígenos O de Salmonella.

<table>table see original document page 105</column></row><table>

11.2. IMOBILIZAÇÃO DE LPS EM GLÓBULOS

11.2.1. Glóbulos (8.4.2) são misturados com Vórtice minimamente por 1minuto.

11.2.2. Transferir uma porção de 300 μΐ, de glóbulos (11.2.1) em umrecipiente novo (9.16).

11.2.3. Centrifugar a 14.000 g por 5 min.

11.2.4. Remover o sobrenadante cuidadosamente dos glóbulos usando umapipeta de 200 μΐ. (9.6).

11.2.5. Deixar uma quantidade pequena de solução (10 μΙ.) no frasco emisturar os glóbulos na solução restante sobre um misturador de vórtice(9.21).

11.2.6. Descongelar duas porções de 100 μί de EDC (8.2.7.1)

11.2.7. Descongelar duas porções de 100 μίν de solução de NHS (8.2.9.1).

11.2.8 Misturar 180 μι de EDC (11.2.6) e 180 μΐ, de NHS (11.2.7).

11.2.9. Transferir 300 μΐ, de mistura de EDC/NHS (11.2.8) nos glóbulos(11.2.4) e suspender vigorosamente usando uma pipeta.

11.2.10.Facilitar a reação em um gyro rocker (9.11) por 20 min.

11.2.11. Centrifugar a 14.000 g por 5 min.

11.2.12. Cuidadosamente remover o sobrenadante dos glóbulos, deixar umvolume pequeno (ca. 10 μι) sobre o topo de pelota e glóbulos suspensosusando o misturador de vórtice (9.21).

11.2.13. Adicionar 300 μΐ, de solução de carbohidrazida 5 mM (8.2.6) nosglóbulos (11.2.12) e suspender vigorosamente usando uma pipeta.

11.2.14. Facilitar a reação em um gyro rocker (9.11) por 20 min.

11.2.15. Centrifugar a 14.000 g por 5 min, remover sobrenadante dosglóbulos, deixar um volume pequeno (ca. 10 pL) sobre o topo de pelota eglóbulos suspensos usando misturador de vórtice (9.21).

11.2.16. Adicionar 300 μι de solução de etanol-amina 1 M (8.2.8) nosglóbulos (11.2.15) e suspender rigorosamente usando uma pipeta.

11.2.17. Facilitar a reação em um gyro rocker (9.11) por 20 min.

11.2.18. Centrifugar a 14.000 g por 5 min, remover sobrenadante dosglóbulos, deixar um volume pequeno (ca. 10 μΐ.) sobre o topo de pelota eglóbulos suspensos usando um misturador de vórtice (9.21).11.2.19. Adicionar 300 μL de LPS oxidado diluído em acetato de sódio c ~ 10mmol/L de pH 4,0 (11.1.2.7) e suspender rigorosamente usando uma pipeta.

11.2.20. Permitir a reação em um gyro rocker (9.11) por 90 min.

11.2.21. Centrifugar a 14.000 g por 5 min, remover o sobrenadante dosglóbulos, deixar um volume pequeno (ca. 10 μΐ,) sobre o topo de pelota eglóbulos suspensos usando misturador de vórtice (9.21).

11.2.22. Adicionar 300 μΕ de solução de cianoboroidreto de sódio c = 100mmol/L (8.2.14) e suspender rigorosamente usando uma pipeta.

11.2.23 Facilitar a reação em um gyro rocker (9.11) por 60 min.

11.2.24. Centrifugar a 14.000 g por 5 min e cuidadosamente remover osobrenadante dos glóbulos, deixar um volume pequeno (ca. 10 μL) sobre otopo de pelota e glóbulos suspensos usando misturador de vórtice (9.19).

11.2.25. Adicionar 300 μΐ, de PBS (8.2.11).

11.2.26. Adicionar 1 μL de Proclin 150 (8.1.7) e misturar a suspensão.

11.2.27 Os glóbulos estão prontos para testar anticorpos contra Salmonella emmateriais biológicos.

11.2.28. Contagem de glóbulos copulados com LPS

11.2.28.1.Misturar com vórtice suspensões de glóbulos copulados com LPS(11.2.25) e transferir 1 μί em um tubo de 1 mL novo (9.15)

11.2.28.2. Diluir pela adição de 24 μL de PBS c ~ 10 mmoM, pH 7,2 (8.2.11)e misturar.

11.2.28.3 Os suportes externos de uma câmara de contagem Bürker-Türk(9.3) são para serem umedecidos com água milliQ (8.1.17) e a lamínula decobertura de vidro (9.13) é cuidadosamente empurrada para cima da câmarade contagem a partir da frente.

11.2.28.4 Encher uma pipeta com 20 μί de solução de glóbulo (11.2.28.2),cuidadosamente formando uma gota na ponta da pipeta.11.2.28.5 Esta gota (11.2.28.4) é para ser posicionada entre a lamínula decobertura de vidro e a câmara de contagem.

11.2.28.6 Como um resultado do efeito capilar o vazio entre a lamínula decobertura de vidro e a base da câmara é preenchido. Antes de a solução de osglóbulos poderem transbordar nas bordas da seção da câmara, a ponta dapipeta tem que ser removida. Se algumas bolhas de ar forem visíveis ou se olíquido tiver transbordado sobre as bordas para dentro dos sulcos, a câmaratem que ser limpa e a alimentação tem que ser repetida.

11.2.28.7 Posicionar a câmara de contagem cheia sob um microscópio (9.12)para magnificar a imagem com uma objetiva de IOx.

11.2.28.8 A contagem deve ser iniciada no canto esquerdo superior e seguir adireção mostrada pela seta (Figura 23, painel inferior). Contagem pode serintensificada com iluminação do microscópio reduzida.

11.2.28.9 Contar o número de glóbulos em 16 quadrados (Figura 23, painelsuperior) dentro de cada área de linha espessa (veja Figura 24).

11.2.28.10 Notas sobre a contagem:

11.2.28.10.1 Usar iluminação de microscópio reduzida para todas as câmaras.

11.2.28.10.2 A diferença das células de contagem nos quadrados grandes enos quadrados de grupo não pode ultrapassar 10 células.

11.2.28.10.3 Checagens duplas têm que ser realizadas em todas as contagensde células. Após contagem das duas malhas de contagem a malha decontagem inferior é para ser contada na mesma maneira como uma checagem.

Quando isto é feito deve ser garantido que a câmara não seque. Isto pode serevitado pelo enchimento da câmara inferior apenas imediatamente antes dacontagem e contando após o tempo de sedimentação.

11.2.28.10.4 A diferença entre os totais das contagens para as duas malhas decontagem não deve ultrapassar 10 células. O valor médio das contagens éentão usado na fórmula de cálculo ou multiplicado pelo fator correspondente.

11.2.28.11 Multiplicar o número contado (11.2.28.9) pelo fator de diluição(25 χ) dividido pela área contada (1 mm2) multiplicada pela profundidade dacâmara para calcular a concentração de glóbulos por mL.

11.3. DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-SALMONELLA

Nota: Garantir que todos os reservatórios de solvente e dereagente contenham volume suficiente para operação completa do métodoante de iniciar o ensaio.

11.3.1. Tornar a aparelhagem BioPlex (9.2) operacional por uma etapa deaquecimento a laser de 30 minutos, seguida por um procedimento de início ecalibração com solventes de calibração apropriados (8.1.3) de acordo com oguia rápido.

11.3.2. Misturar e diluir os glóbulos revestidos com LPS (11.2.26) com PBS c= 10 mmol/L, pH 7,2 (8.2.11) de modo que a concentração de cada glóbuloiguale 5.000 por mL.

11.3.3. Transferir 50 μί de mistura de glóbulos (11.3.2) em uma placa demicrotítulo já cheia com anticorpo monoclonal anti-antígenos O diluídos(8.3.7).

11.3.4. Incubar por 30 min em um agitador de placa de microtítulo (9.14).

11.3.5. Adicionar 10 μί de Ig-PE anti-camundongo 5 vezes diluída (8.2.12).

11.3.6. Incubar por 15 min em um agitador de placa de microtítulo (9.14).

11.3.7. Nota em registro de cavidades de amostra e seus conteúdos.

11.3.8. Posicionar a placa em BioPlex (9.2), ajustar tempo de contagemmáximo em 120 s e contar pelo menos 50 glóbulos por grupo de LPS.

11.3.9. Ativar o programa software para contar a fluorescência de glóbulos,que haviam capturado anticorpos (fluorescentes).

Para uma representação esquemática do procedimento veja a Figura 21.

Respostas típicas de anticorpos monoclonais contraSalmonella são apresentadas na Tabela 36.

Tabela 36. Respostas típicas de soros de referência incubadas com glóbulosrevestidos com LPS e um anticorpo fluorescente secundário proporcionando osinal.

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Exemplo 10

OXIDAÇÃO BRANDA POR PERIODATO

O sucesso da ligação final de anticorpos anti-Salmonella, eportanto a seleção de infecções invasivas no animal, é muito dependente daoxidação dos constituintes monossacarídeo da parte de polissacarídeo de LPS,e da parte de oligossacarídeo da região de núcleo de LPS. Pode ser deduzidodas estruturas descritas para sorotipos diferentes de e.g. Salmonella queoxidação pode acarretar uma quebra das estruturas antigênicas, que são, emparticular, parte da parte de polissacarídeo de LPS.

Enquanto que a oxidação de hexitóis ocorre rapidamente,piranosídeos, que são predominantemente ocorrentes em LPS de Salmonella,necessitam de uma concentração mais alta de periodato para facilitar aoxidação ao mesmo tempo. Piranosídeos, que possuem grupos a-eritro-hidroxila, tais como configurações arabino, galacto ou mano como em LPS deSalmonella spp., são mais facilmente oxidados do que os grupos a-treo-hidroxila, tais como variantes xilo ou glico. Deve ser realizado que quando oanel é aberto e funções aldeído para ligação de e.g. moléculas de proteína sãocriadas, também podem ser criados compostos α-hidróxi-carbonilados, quepodem oxidar de novo se periodato ainda estiver presente. Por isso, sãoaqueles monossacarídeos não-conjugados, que deste modo não são parte deum oligo ou polissacarídeo, que são completamente destruídos por umaoxidação por periodato a ácido fórmico e formaldeído em concentraçõessuficientemente altas do oxidante.

Em concentrações relativamente altas deperiodato, 1,3-dicetonas e também dióis di-axiais podem ser oxidados. Umareação de oxidação ou decomposição mais do que apenas a criação de gruposaldeído acarretaria, por conseguinte, uma falha na detecção de uma infecçãoem uma amostra de material biológico a despeito de uma reação de copulaçãoboa em uma fase sólida suportada pela presença de uma molécula contendopoliamina, tal como uma proteína. Em outras palavras, uma reação branda deperiodato é necessária para deixar a estrutura antigênica intacta, mas apenassuficiente para permitir uma copulação entre proteína e a fase sólida.

RESULTADOS

LPS de Se, Sg, Sl e St foi oxidado por 40 min em pH 5,5usando uma faixa de concentrações de m-periodato de sódio. Após oxidação,LPS fõi copulado em uma superfície de biossensor e eficiência deimobiiização e atividades antigênicas foram monitoradas.

Da Fig. 25 é óbvio que um grau de oxidação maior de LPS deS. enteritidis ocasionou um nível de revestimento maior correspondente nochip biossensor. Contudo, a despeito dos níveis de imobiiização mais altos, aresposta da sondagem de anticorpo diminui como demonstrado nas Figs. 26 e27. Para este tipo de LPS foi determinada uma concentração de periodatoótima de 1,8 mM.

Em uma maneira similar, os efeitos de oxidação sobre aimobiiização e a atividade antigênica de LPS de S. goldcoast foram testados(Figs. 28 e 29). Um ótimo idêntico para a concentração de periodato de sódioverificado foi de 1,8 mM. Resultados similares foram obtidos para S.livingstone (Figs. 30 e 31). Aqui também foi verificado um ótimo de m-periodato dei,8 mM.

Exemplo 11

Extração de lipopolissacarídeos de Salmonella spp.

ADVERTÊNCIA E PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

Salmonella spp., que são usadas neste método de extração paraobter lipopolissacarídeos (LPS), pertencem aos microorganismos de classe derisco 2. Microorganismos de classe de risco 2 são descritos como segue:podem induzir doenças como diarréia e febre, mas disseminação da doença éimprovável e há profilaxias efetivas e tratamento possível. O procedimentoquando se trabalha com bactérias vivas deve ser portanto realizado comprecauções como desinfecção de mãos e de equipamento, com etanol 70%. Oresíduo de Salmonella spp. viva deve ser destruído ou disposto em autoclaveou como resíduo bi-operigoso, respectivamente.

Compostos de LPS são elevadamente pirogênicos e podemcausar febre. Para evitar ingestão, tratar soluções aquosas de LPS comcuidado e usar uma máscara quando se trabalha com material sólido. Sequalquer um destes compostos entrar na corrente sangüínea, procurarimediatamente atendimento médico.

0. INTRODUÇÃO

Salmonella é uma bactéria gram-negativa, e sua membranaexterna consiste de várias estruturas antigênicas, incluindo flagelos, proteínasde membrana externa e lipopolissacarídeos (LPS). A molécula de LPSconsiste de uma parte denominada de lipídeo A, que está embebida no folíoloda membrana externa, uma região de núcleo e polissacarídeo. A região denúcleo é composta de duas ou três hexoses e dois ou três resíduos demonossacarídeos negativamente carregados, de oito carbonos KDO. A regiãode núcleo liga o lipídeo A nos polissacarídeos, que também é conhecia comoa cadeia lateral O. Esta cadeia lateral O é elevadamente variável com respeitoao seu comprimento e à sua composição entre as cepas, mas também dentrode uma cepa influenciada pelas condições de crescimento da Salmonella.

Apesar da variação, estruturas antigênicas codificadas no PS são únicas paraum certo sorovar de Salmonella. De fato, estruturas antigênicas 03, 04, 06/7,08, 09, OlO e 012 representam aproximadamente 90% dos sorovares deSalmonella conhecidos em produtos porcinos, em particular, de abatedourosholandeses.

Para detectar uma resposta humoral antígenos O como umaindicação de uma exposição de animais de fazenda a Salomonella, LPS podeser usado para sondar a ligação de anticorpos produzidos nestas biomolécula.Para este propósito, pode ser extraído LPS de S. typhimurium (04, 05, 012),S. enteritidis (09, 012), S. Iivingstone (06/07), S. goldcoast (06, 08) e S.meleagridis (03,010).

Uma extração feita em casa é muito importante porque LPS deapenas um número limitado de sorovares de Salmonella está comercialmentedisponível. Em adição, a produção em casa pode garantir uma disponibilidadecontínua de tipos de LPS para um ensaio de detecção de anticorpo bemsucedido. O método de extração em casa aqui descrito para este propósito, ébaseado em um protocolo descrito por Staub (0). Extratos em ácido tricloco-acético (TCA) de LPS contendo 1-10% de contaminação de proteína. Esteproduto é adequado para imobilização covalente de LPS em uma camada dedextrano carboximetilado revestida sobre uma superfície metálica de ouro deum chip biossensor (veja SOP CHEMIE/A22 (Exemplo 12)). Este chipimobilizado com LPS, em combinação com um sistema de SPR de biossensoróptico Biacore, pode ser usado para rastrear anticorpos contra LPS deSalmonella em soros também conhecido como sorologia.

1. ESCOPO E CAMPO DE APLICAÇÃO

Este método descreve a extração de LPS de vários sorovaresde Salmonella com o uso de ácido tricloro-acético. LPS extraído é adequadopara modificações para facilitar sua imobilização sobre uma superfície dedextrano carboximetilado.

2. REFERÊNCIAS

Staub, A.M., Methods in Carbohydrate Chemistry, 5, 92 (1965)SOP Chemie/A22: Imobilização de LPS derivado de Salmonella sobre umchip biossensor (Biacore) e detecção de anticorpos de soro relatando umainfecção presente ou passada de Salmonella (Exemplo 12).SOP Chemie/A23: Optimização de adição de proteína em LPS paraimobilização e detecção de anticorpos de soro (Exemplo 13).

3. DEFINIÇÕES

c = concentração em % (m/v), % (v/v), mol/L ou mmol/Lcomo indicado.

4. LISTA DE ABREVIAÇÕES

4.1 BGA: Ágar verde brilhante

4.2 BHI: Infusão de cérebro e coração

4.3 BHIa: Agar de infusão de cérebro e coração

4.4 LPS: Lipopolissacarídeos

4.5 NB: Caldonutriente

4.6 NaCl: Cloreto de sódio

4.7 NaOH: Hidróxido de sódio

4.8 TCA: Ácido tricloro-acético

5. PRINCÍPIO

Lipopolissacarídeos (LPS) são produzidos por extração deSalmonella com o auxílio de ácido tricloro-acético (TCA). Salmonella écultivada sobre e coletada de placas de ágar de infusão de cérebro e coração.

Após várias etapas de lavagem com uma solução salina e várias etapas decentrifugação, TCA é adicionado. A suspensão acidulada é incubada emtemperatura baixa por três horas para solubilizar LPS das células bacterianas.

A suspensão é centrifugada para remover material celular e o pH éneutralizado. LPS é então parcialmente purificado e concentrado porprecipitação em etanol em temperatura baixa. Finalmente, sais e etanol sãoremovidos por diálise, e partículas restantes na solução contendo LPS retidosão decantados por centrifugação. O sobrenadante é liofilizado e pesado paradeterminar a recuperação de LPS produzido.

6. REAGENTES E MATERIAIS

Durante o procedimento, a não ser que seja enunciado de outromodo, são usados apenas reagentes de grau analítico reconhecido e apenaságua destilada ou água de pureza equivalente. Referência a uma companhia éapenas para informação e identificação e não implica uma recomendação anão ser que seja enunciado de outra maneira.

6.1 Compostos químicos

6.1.1 Ágar verde brilhante (Oxoid, Basingstroke, Inglaterra, CM329)

6.1.2 Infusão de cérebro e coração (Oxoid, CM225)

6.1.3 Ágar de infusão de cérebro e coração (Oxoid, CM375)

6.1.4 Etanol, absoluto (Merck, Darmstadt, Alemanha, 1.00983.2500)

6.1.5 Glicerol 87% (Merck, 1.04091.1000)

6.1.6 Caído nutriente No. 2 (Oxoid, 67)

6.1.7 Cloreto de sódio (Merck, 1.06404.1000)

6.1.8 Hidróxido de sódio (Merck, 1.06498.1000)

6.1.9 Etileno-glicol (Merck, 9621.2500))

6.1.10 Ácido tricloco-acético (Merck, 1.00807.0250)

6.1.11 Água foi obtida de sistema de purificação Milli Q (8.24)

6.2 Soros de aglutinação de Salmonella

6.2.1 anti-04 (Pro-Lab diagnostics, Salmonella Reference Section of theCentral Veterinary Laboratory, Weybridge, Grã-Bretanha)

6.2.2 anti-05 (Pro-Lab diagnostics)

6.2.3 anti-06,7 (Pro-Lab diagnostics)

6.2.4 anti-08 (Pro-Lab diagnostics)

6.2.5 anti-09 (Pro-Lab diagnostics)

6.2.6 anti-012 (Pro-Lab diagnostics)

6.2.7 anti-0 Poly A-S (anti-soros para grupos A até S) (Pro-Lab diagnostics)

6.2.8 anti-O Poly E (anti-soros para fatores 03, OlO, 015, 019, O 34) (Pro-Lab diagnostics)

6.3 Cepas bacterianas

6.3.1 Salmonella enteritidis (#23, fago tipo 1 cepa RIVM, Os Países-Baixos;90-16-706)6.3.2 Salmonella goldcoast (Division's working bank, Utrecht University, OsPaíses-Baixos)

6.3.3 Salmonella livingstone (Division's working bank)

6.3.4 Salmonella melaegridis (Division's working bank)

6.3.5 Salmonella typhimurium X-193 (ASG, Lelystad)

6.4 Reagentes

A não ser que seja enunciado de outro modo, todos os meiospreparados podem ser armazenados por 3 meses a 2- 8°C.

Após dispensação de meio de ágar em placas de Petri, asplacas são esfriadas na temperatura ambiente. Após endurecimento do ágar, asplacas são invertidas e secas na temperatura ambiente por dois a três diassobre o topo da bancada.

6.4.1 Placas de ágar verde brilhante (BGA): suspender 52 g de BGA (6.1.1)em 1,0 L de água (6.1.11). Ferver para dissolver o meio completamente.

Misturar bem e dispensar porções de 15 mL em placas de Petri (7.29).

6.4.2 Caldo de infusão de cérebro e coração (BHI): dissolver 37 g de caldoBHI (6.1.2) em 1,0 L de água (6.1.11). Misturar bem, distribuir pararecipientes finais e esterilizar em autoclave a 1210C por 15 min.

6.4.3 Ágar de infusão de cérebro e coração (BHIa): suspender 47 g de ágarBHI (6.1.3) em 1,0 L de água (6.1.11). Ferver para dissolver o meiocompletamente. Misturar bem e dispensar porções de 15 mL em placas dePetri (7.29).

6.4.4 Solução de esfriamento: misturar 1,0 L de etileno-glicol (6.1.9) com 3 Lde água (7.1.11)

6.4.5 Etanol frio em congelador: armazenar 1 L de etanol (6.1.4) em umcongelador (-18°C) (7.17)

6.4.6 Glicerol 87% estéril: esterilizar em autoclave 50 mL de glicerol (6.1.5) a121°C por 15 min.

6.4.7 Caldo nutriente (NB): dissolver 25 g NB (6.1.6) em 1,0 L de água(6.1.11). Misturar bem, distribuir em frascos de 100 mL e esterilizar emautoclave a 1210C por 15 min.

6.4.8 Solução salina (c = 0,9% (m/v)): dissolver 9 g de cloreto de sódio(NaCl) (6.1.7) em 1,0 L de água (6.1.11). Antes do uso, esfriar a soluçãosalina durante a noite em um refrigerador.

6.4.9 Solução de ácido tricloco-acético (TCA), c = 0,25 mol/L: dissolver 40,8g de TCA (6.1.10) em 1,0 L de água (6.1.11).

6.4.10 Solução de ácido tricloco-acético (TCA), c = 0,50 mol/L: dissolver81,7 g de TCA (6.1.10) em 1,0 L de água (6.1.11).

6.4.11 Solução de hidróxido de sódio (NaOH), c = 5,0 mol/L: dissolver 40 gde NaOH (6.1.8) em 200 mL de água (6.1.11).

6.4.12 Solução de hidróxido de sódio (NaOH), c = 0,10 mol/L: diluir 1,0 mLc = 5 mol/L de NaOH (6.4.11) em 49,0 mL de água (6.1.11).

7. EQUIPAMENTO E APARELHAGEM

Referência a uma companhia é apenas para informação eidentificação e não implica uma recomendação a não ser que assimenunciado. Aparelhagem e equipamento equivalentes também podem serapropriados.

7.1 Balança analítica (tipo AE240, Mettler, Zurique, Suíça), faixa de pesagem

0 - 40 g (SOP CHEMIE/011)

7.2 Balança (tipo MCl LC2000P, Sartorius Instrumenten BV, Nieuwegein, OsPaíses-Baixos)

7.3 Centrífuga de velocidade alta (T-124 Centrikon, Kontron, Zurique, Suíça)

7.4 Centrífuga de supervelocidade (RC-5B, Sorvall, Newton, Connecticut, USA)

7.5 Tubos de polipropileno de centrífuga, para Centrikon 290 mL (253483,Beun de Ronde, Abcoude, Os Países-Baixos)

7.6 Tubos de centrífuga para rotor SM-24, Sorvall (Sorvall)

7.7 Tubos cônicos (50 mL) (Cellstar 210261, Greiner bio-one, Alphen a/dRijn5 Os Países-Baixos)

7.8 Tubos cônicos (15 mL) (Cellstar 188271, Greiner bio-one)

7.9 Tubos criogênicos (1.8 mL) (Cryo's 122261, Greiner bio-one)

7.10 Grampos para membrana de diálise (Part#CB-1050, Cellu Sep,Membrane Filtration Products Inc., Seguin, Texas, USA) Grã-Bretanha

7.11 Tubulação de diálise Spectra/Por MWCO 1000 (Spectrum LaboratoriesInc., Rancho Dominguez, Califórnia, USA)

7.12 Pipeta Finn, 200-1000 μί (Labsystems Oy, Helsinque, Finlândia)

7.13 Pipeta Finn, 40-200 μί (Labsystems Oy, Helsinque, Finlândia)

7.14 Pipeta Finn, 5-40 \iL (Labsystems Oy, Helsinque, Finlândia)

7.15 Aparelhagem de secagem a seco (7570001, Labconco Corporation,Kansas City, Missouri, USA)

7.16 Congelador -18°C, faixa de congelamento entre -16°C e -25°C (Elbanton,Kerkdriel, Os Países-Baixos)

7.17 Congelador -80°C (U57085 Classic, New Brunschwick Scientific BV,Nijmegen, Os Países-Baixos)

7.18 Bécher de vidro, 15 L (Schott-Duran, Omnilabo International BV, Breda,Os Países-Baixos)

7.19 Lâminas de vidro (AAOOOOO 102E, Menzel-Glaser, Braunschweig,Alemanha)

7.20 Banho de sal e gelo: misturar aproximadamente 150 g de NaCl (7.1.7)com 3 L de gelo triturado após adição de 150 mL de água de torneira

7.21 Incubadora a -4°C feita em casa (temperatura medida de líquido decontato em extrato de LPS precipitado em etanol (9.3.37), aproximadamenteI0C)

7.21.1 Refrigerador de circulação; temperatura de ajuste de -4°C (WK230,Lauda, Lauda- Konigshofen, Alemanha)

7.21.2 Núcleo de esfriamento central PROTEAN II (165-1806, BioRadlaboratories BV, Veenendaal, Os Países-Baixos)7.21.3 Caixa de poliestireno & tigela interna plástica de encaixe

7.21.3.1 Sistema inteiro (8.22.1, 8.22.2) foi cheio com solução de esfriamento

(7.4.4)

7.22 Agitador magnético (EM3300T, LaboTech B.V., Ochten, Os Países-Baixos)

7.23 Sistema de purificação de água Milli Q (Millipore, Bedford, Ma, USA)

7.24 Medidor de pH (tipo pH 537, WTW, Weilheim, Alemanha)

7.25 Refrigerador (Elbanton)

7.26 Rotor Centrikon (A6.14, Kontron)

7.27 Rotor Sorvall (SM-24, Sorvall)

7.28 Espátula, vidro Drigalski (408014, Omnilabo International BV)

7.29 Placas de Petri (633102, Greiner bio-one)

7.30 Powerpette plus (Jencons, Bedfordshire, England)

7.31 Misturador vórtice (KS-I, Janke & Kunkel, Staufen, Alemanha)

8. PROCEDIMENTO

8.1 Preparação de cultura de estoque

8.1.1 Preparar um isolado de Salmonella (6.3) por espalhamento de umacolônia, ou o conteúdo de uma alça de inoculação sobre uma placa BGA(6.4.1).

8.1.2 Inocular a placa (8.1.1) durante a noite a 37°C.

8.1.3 Uma única colônia é retirada da placa (8.1.2) com uma alça deinoculação e suspensa em 100 mL de NB (6.4.7)

8.1.4 Incubar durante a noite a 37°C

8.1.5 Adicionar 50 mL de glicerol (6.4.5) em 100 mL de meio NB cultivado(8.1.4)

8.1.6 Adicionar alíquotas de mistura de cultura/glicerol (8.1.5) em onde tubosestéreis de 14 mL (7.9) (volume de 12,5 mL) e doze tubos estéreis de 1,5 mL(7.10) (volume de 1 mL).

8.1.7 Um dos tubos de 1,5 mL é marcado como banco padrão. O conteúdodeste tubo apenas será usado para preparar mais alíquotas de 1 mL e 12,5 mLvia o método aqui descrito (8.1).

8.1.8 Congelar rapidamente as alíquotas a -80°C (8.1.6) e armazenar até ouso.

8.2 Determinação de pureza de isolado de Salmonella por aglutinação

8.2.1 Pipetar 25 μΐ, (7.15) de solução salina estéril (6.4.8) para cima dalâmina de vidro (7.20).

8.2.2 Suspender uma colônia de Salmonella cultivada em placa (8.1.2) nasolução salina (6.4.8).

8.2.3 Adicionar uma gota única de soro de aglutinação (6.2) usando o sistemade gotejamento de recipiente facilitado

8.2.4 Misturar soros e suspensão por inclinação suave da lâmina para frente epara trás por dois minutos.

8.2.5 Determinar aglutinação por procura de formação de agregação em frentede um fundo preto.

8.2.6 Descrever a identidade de cepa de Salmonella por comparação dosresultados de agregação com Tabela 37.

8.2.7 Quando a identidade da cepa cultivada difere da agregação precipitadaem Tabela 37, pode ser concluído que a cultura testada não era(exclusivamente) composta do sorotipo esperado de Salmonella. Em tal caso,uma nova cultura de estoque tem que ser preparada.

8.3 Método de extração

8.3.1 Preparar 120 placas de ágar BHI (6.4.3).

8.3.2 Descongelar um tubo de 12,5 mL com cultura de estoque de Salmonella(8.1.8).

8.3.3 Espalhar 100 |iL (7.14) de cultura de estoque (8.1.8) sobre cada placa(8.3.1) com uma espátula (7.29).

8.3.4 Incubar durante a noite a 37°C.

8.3.5 Encher um recipiente de 15 L (7.19) com 10 L de água (6.1.11), e esfriarpara em um refrigerador (7.26) até uso posterior.

8.3.6 Pesar (7.3) seis tubos de centrifugação vazios (7.6) e anotar o peso delesna folha de qualidade (veja Figura 32.).

8.3.7 Posicionar os recipientes milliQ (6.1.11) e de TCA (6.4.9, 6.4.10) dentrodo banho de sal e gelo preparado (7.21).

8.3.8 Separar vinte placas (8.3.4) das placas incubadas durante a noite eadicionar 1 mL de solução salina em cada placa.

8.3.9 Colher as bactérias por raspagem suave (fazendo movimentoscirculares) usando uma espátula Drigalski (7.29) sobre o ágar, preparandouma suspensão das bactérias em solução salina.

8.3.10 Coletar a suspensão em um dos seis tubos de centrifugação pré-pesados (8.3.6).

8.3.11 Lavar cada placa (8.3.9) duas vezes com 2 mL de solução salina(6.4.8).

8.3.12 Combinar as suspensões (8.3.11) com o conteúdo do tubo decentrifugação (8.3.10).

8.3.13 Repetir 5 vezes as etapas 8.3.8 a 8.3.12 nas placas restantes (8.3.4).

8.3.14 Adicionar 100 mL de solução salina (6.4.8) em cada tubo decentrifugação.

8.3.15 Tarar os tubos (8.3.14)

8.3.16 Centrifugar por 15 min a lO.OOOxg e 4°C (7.4, 7.27).

8.3.17 Decantar o sobrenadante em um recipiente de resíduos.

8.3.18 Suspender cada pelota bacteriana em 10 mL de solução salina (6.4.8)até ser formada uma suspensão uniforme.

8.3.19 Adicionar 75 mL de solução salina (6.4.8) em cada tubo de centrífuga.

8.3.20 Repetir uma vez as etapas 8.3.14 a 8.3.19.

8.3.21 Repetir uma vez as etapas 8.3.15 a 8.3.17.

8.3.22 Pesar (7.3) os tubos com pelota bacteriana (8.3.21) e anotar osresultados de peso na folha de qualidade (veja Figura 32)8.3.23 Determinar a massa (=m) de bactérias depositadas por subtração dopeso do tubo vazio dos tubos contendo células (8.3.22).

8.3.24 Suspender as pelotas bacterianas (8.3.22) com χ mL (paradeterminação de x, veja Tabela 38) de água (6.1.11) por sucção e lavagemrepetidas com uma pipeta de 10 mL (7.31).

8.3.25 Combinar as suspensões dos dois tubos de ensaio em um tubo.

8.3.26 Repetir 8.3.25 para os tubos de centrifugação restantes.

8.3.27 Adicionar χ mL de TCA y M (6.4.10) (veja Tabela 38 para valores dexey).

8.3.28 Inserir bastões de agitação em cada uma das suspensões (8.3.27).

8.3.29 Agitar as suspensões (8.3.28) por 3 h a 4°C sobre um agitadormagnético (7.23).

8.3.30 Remover os bastões de agitação.

8.3.31 Centrifugar as suspensões por 30 min a 20.000xg e 4°C (7.5, 7.28).

8.3.32 Coletar os sobrenadantes dos tubos de centrifugação em um bécher de500-mL.

8.3.33 Ajustar o pH do sobrenadante com NaOH 5 M (6.4.11) e NaOH 0,10M (6.4.12) para pH 6,5.

8.3.34 Determinar o volume (v) do sobrenadante de pH ajustado (8.3.33)

8.3.35 Esfriar o sobrenadante para o ponto de congelamento deixando osfrascos cheios (8.3.34) em um congelador a -18°C (7.17) por 30 min

8.3.36 Adicionar 2*e mL (para valores de e veja Tabela 38) de etanol frio emcongelador (6.4.5).

8.3.37 Esfriar a solução da a -4°C (7.21).

8.3.38 Dispensar a solução em seis tubos de centrífuga (7.6).

8.3.39 Centrifugar a solução por 30 min a 20.000xg e -4°C (7.4, 7.27).

8.3.40 Cortar três partes (cada uma de 10 cm de comprimento) do tubo dediálise (7.12)

8.3.41 Lavar os tubos de diálise (8.3.40) brevemente com água (6.1.11) emantê-los úmidos em água (6.1.11) até uso posterior.

8.3.42 Prender um grampo de membrana (7.11) em uma extremidade do tubode diálise (8.3.41), deixando 1 cm de tubo livre.

8.3.43 Decantar o sobrenadante (8.3.39) em uma garrafa de resíduo.

8.3.44 Remover o sobrenadante restante dos tubos de centrífuga com o auxíliode uma pipeta (7.13).

8.3.45 Adicionar um mL de água (6.1.11) em cada tubo de centrífuga(8.3.44).

8.3.46 Suspender as pelotas por sucção e lavagem com uma pipeta de um mL(7.13).

8.3.47 Encher um dos sacos de diálise preparados (8.3.42) com as pelotasressuspensas (8.3.46) de dois tubos de centrífuga.

8.3.48 Lavar cada um dos tubos com (z-l)/6 mL (para o valor de z, vejaTabela 38) de água (6.1.11) e combinar a lavagem com o conteúdo do saco dediálise (8.3.47).

8.3.49 Prender outro grampo (6.10) no topo do tubo de diálise cheio (8.3.48)deixando uma bolha de ar pequena entre a solução e o grampo.

8.3.50 Repetir as etapas 8.3.42 a 8.3.49 nos tubos de centrífuga restantes.

8.3.51 Deixar os três tubos de diálise cheios em água pré-esfriada (8.3.5) a 4°C.

8.3.52 Incubar o conteúdo de diálise dos tubos (8.3.51) por dois dias sobcondições de agitação suave a 4°C sobre um agitador magnético (7.23).

8.3.53 Repor o dialisado pelo menos duas vezes, por troca da água por 7 L deágua fresca, pré-esfriada (6.1.11).

8.3.54 Coletar o conteúdo dos tubos em um recipiente de 50 mL (7.8).

8.3.55 Dividir o volume coletado (8.3.54) em tubos de centrífuga (7.7).

8.3.56 Centrifugar os tubos a 20.000xg por 30 min a 4°C (7.5)

8.3.57 Pesar um recipiente vazio de 50 mL (7.8) em uma balança analítica(7.2) (sem tampa) e anotar seu peso na folha de qualidade (veja Figura 32)8.3.58 Coletar o sobrenadante (8.3.56) em recipiente pré-pesado (8.3.57).

8.3.59 Congelar os sobrenadantes em um congelador a -80°C (6.15).

8.3.60 Liofilizar (6.15) os sobrenadantes congelados (8.3.59) até serobservada uma estrutura cristalina branca seca.

NOTA: Manusear cuidadosamente o produto de LPSliofilizado, porque suas características eletrostáticas podem fazê-lo suspenderem ar.

NOTA: LPS é uma toxina bem conhecida, que quando inaladaou engolida pode induzir efeitos clínicos em humanos. Medidas de segurança,tais como máscaras, devem ser rigorosamente seguidas para se evitar qualquerintoxicação.

Pesar o recipiente contendo LPS liofilizado (8.3.60) em umabalança analítica (7.2) e anotar a massa resultante na folha de qualidade (vejaFigura 32)

8.3.62 Calcular o rendimento de LPS: (peso de LPS (8.3.61) - peso derecipiente (8.3.57))/massa total de células úmidas (8.3.23) * 100%8.3.63 Armazenar o pó de LPS liofilizado em um recipiente fechado a 4°C atéuso posterior.

Uma visão geral do procedimento é mostrada na Figura 33.

Tabela 37. Folha de checagem das leituras de aglutinação para descrever aidentidade das bactérias presentes em termos de espécie de Salmonella esorovar de Salmonella

<table>table see original document page 124</column></row><table>Legenda: + = Formação de agregação, aglutinação positiva- = Sem formação de agregação, aglutinação negativa

Tabela 38. Tabela de conversão para determinar volumes de água (x),TCA(x), etanol (e) e concentração de TCA (y) para extração e precipitação, evolume de água (z) para procedimentos de diálise para isolar e purificar LPSde Salmonella. Letras anotadas: m refere-se à massa (9.3.23), enquanto que νrefere-se ao volume de sobrenadante de pH ajustado (9.3.34).

<table>table see original document page 125</column></row><table>

n.e.y..- ainda não estabelecido.

Exemplo 12

Imobilização de LPS derivado de Salmonella sobre um chip biossensor(Biacore) e detecção de anticorpos de soro relatando uma infecção deSalmonella passada ou presente

O. ADVERTÊNCIA E PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

Lipopolissacarídeos são imunógenos potentes, que podemlevar pessoas sensíveis a um choque séptico após ingestão ou inalação.Precauções devem ser feitas para prevenir o contato com este agentesbioquímico.

Periodato de sódio é um agente oxidante e pode causarexplosões quando contatado com agentes redutores.

O procedimento utiliza cianoboroidreto de sódio. Oprocedimento deve ser portanto realizado com precauções tais como porexemplo o uso de luvas de mão e uma máscara. Usar esta substância químicaapenas em uma capela. O material é muito tóxico para organismos aquáticos epode causar efeito adverso de longa duração em ambiente aquático. O resíduode solução e de material deve ser disposto como um resíduo perigoso.

1. INTRODUÇÃO

Dentre os componentes da estrutura antigênica do gêneroSalmonella, os antígenos somáticos são importantes como um instrumentopara traçar resposta imune em animais sob uma infecção invasiva destemicroorganismo. Antígenos somáticos estão localizados sobre a parte depolissacarídeo do lipopolissacarídeo (LPS), que é um constituinte da paredecelular bacteriana. Após extração e isolamento do LPS de sorotipos deSalmonella cuidadosamente escolhidos (cf. SOP CHEMIE/A21 (Exemplo11)), LPS contendo antígeno é copulado covalentemente em uma superfíciede chip biossensor por meio de sua ligação no LPS contendo antígenoimobilizado sobre a superfície do chip (veja SOP CHEMIE/A23 (Exemplo13)). Este SOP descreve o método para oxidação, imobilização de LPS sobreo chip biossensor (BIACORE) e a análise de anticorpos em soros.

2. ESCOPO E CAMPO DE APLICAÇÃO

Para analisar amostras de soro de galinha para a presença deanticorpos anú-Salmonella reagindo com antígenos somáticos 04, 5, 6, 7, 8, 9e 12.

3. REFERÊNCIAS

Concentration Analysis Handbook, Version AA, December 2001, BiacoreAB, Uppsala, Suécia

BIA applications Handbook, version AB (reimpresso 1998), Biacorehttp://www.jp.

amershambiosciences.eom/tech_support/manual/pdf/dnapuri/52207400af.pdfSOP Chemie/A21: Extração de lipopolissacarídeos de Salmonellaspp.(Exemplo 11)

SOP Chemie/A23: Otimização de adição de proteína em LPS paraimobilização e detecção de anticorpos de soro (Exemplo 13).

4. DEFINIÇÕESc - concentração em % (m/v), % (v/v), mol/L ou mmol/L como indicado.

5. LISTA DE ABREVIAÇÕES

5.1 EDC, cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida

5.1.2. NHS: N-hidróxi-succinimida

5.1.3. LPS Se: de bactéria Salmonella sorovares enteriditis

5.1.4. LPS Sg: de bactérias Salmonella sorovares goldcoast

5.1.5. LPS SI: de bactérias Salmonella sorovares livingstone

5.1.6. LPS Sm: de bactérias Salmonella sorovares meleagridis

5.1.7. LPS St: de bactérias Salmonella sorovares typhimurium

6. PRINCÍPIO

LPS é oxidado na presença de uma proteína facilitado porperiodato de sódio. A solução de LPS-proteína é dessalinizada usando umacoluna NAP-5. O complexo de LPS-proteína é imobilizado sobre um chipCM5 após ativação da camada de dextrano carboximetilado sobre um chipbiossensor com o auxílio de cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDC) e N-hidróxi-succinimida (NHS) e carbohidrazida. LPSligado é então estabilizado com cianoboroidreto de sódio. Antes de usorotineiro, o desempenho do LPS conjugado em chip biossensor para ligaranticorpos anti-Salmonella é avaliado usando um painel de soros deaglutinação policlonais.

7. REAÇÕES

7.1 OXIDAÇÃO DE GRUPO CABOIDRATO

Periodato induzirá uma disrupção oxidativa de ligações entredióis vicinais, em particular, grupos carboidrato, como em e.g. manose, paradar funcionalidades aldeído. Esta reação é tipicamente realizada em tampõesem uma faixa de pH entre 4,5 e 5,5 no escuro usando um meta-periodato desódio 10-100 mM recém-preparado em acetato de sódio 0,1 M (Figura 18).

NOTA 1: As posições de conjugações indicadas nesteesquema, para ligar este monossacarídeo em um polissacarídeo, como e.g.LPS, são apenas exemplos. R1 e R indicam as posições distai e proximal,respectivamente, na cadeia de carboidrato. A oxidação em aldeídos pode serepetir dentro da cadeia de polissacarídeo em cada constituintemonossacarídeo contendo dióis vicinais.

NOTA 2: Periodato também oxidará, quando presentes, certosβ-amino-etanol-derivados tais como resíduos de hidróxi-lisina em colágeno,bem como metionina (para seu sulfóxido) e certos tióis (normalmente paradissulfetos). Em adição, resíduos de serina e de treonina N-terminais depeptídeos e proteínas podem ser seletivamente oxidados por periodato agrupos aldeído. Estas reações, contudo, normalmente ocorrem em umavelocidade menor do que a oxidação de dióis vicinais.

7.2 CONJUNGAÇÃO EM PROTEÍNA

Oxidação é realizada na presença de uma proteína. Oscompostos de bis-aldeído, tais como os constituintes de monossacarídeooxidados na cadeia de polissacarídeo de LPS aqui acima, podem reagir comqualquer grupo amino em uma proteína e podem formar uma ligação de basede Schiff resultando em uma imina substituída (Figura 19).

NOTA: A imina substituída está estabilizada enquanto ocomplexo estiver ligado na superfície de dextrano, por uma redução facilitadapelo cianoboroidreto (aminação redutiva).

7.3.IMOBILIZAÇÃO EM SUPERFÍCIE DE SENSOR

A camada de dextrano carboximetilado localizada em chipsensor é ativada por cloridrato de N-etil-N'-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDC) e N-hidróxi-succinimida (NHS). A ativação é seguidapela preparação com carboidrazida. As funcionalidades aldeído reagemespontaneamente com a hidrazida para dar hidrazonas, que são entãoreduzidas para estabilizar as ligações covalentes (Figura 34).

NOTA. A proteína R" transporta múltiplos grupos -NH2 epode ser portanto conjugada com múltiplas entidades de LPS oxidado. Poroutro lado, a parte de polissacarídeo em LPS pode transportar múltiplosgrupos aldeído livres em uma única molécula. Estes grupos aldeído podem serparcial ou completamente capturados pela camada de hidrazida-dextrano. Oresultado final pode ser uma rede complexa muito estável de proteína-LPS-dextrano sobre a superfície.

8. REAGENTES E MATERIAIS

No procedimento completo apenas reagentes de grau analíticoreconhecido e apenas água destilada ou água de pureza equivalente sãousados, a não ser que seja indicado de outro modo. Referência a umacompanhia é apenas para informação e identificação e não implica umarecomendação a não ser que assim declarado.

8.1 COMPOSTOS QUÍMICOS

8.1.1 Ácido acético (J.T. Baker, Deventer, Os Países-Baixos)

8.1.2 Kit de copulação de amina (Biacore AB, Uppsala, Suécia) consistindo de:

8.1.2.1. Frasco contendo 115 mg de N-hidróxi-succinimida (NHS)

8.1.2.2. Frasco contendo 750 mg de cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDC)

8.1.2.3. Frasco contendo 10,5 mL, c = 1 mol/L, cloridrato de etanol-amina -hidróxido de sódio pH 8,5

8.1.3. Kit de calibração Bio-Plex (Bio-Rad, Veenendaal, Os Países-Baixos)

8.1.4. Carbohidrazida, CN4H6eO (Fluka Chemie GmbH, Buchs, Suíça)

8.1.5. Sal de sódio de carbóxi-metil-dextrano (Fluka)

8.1.6. Glicina, c = 10 mmol/L pH 1,5 (Biacore)

8.1.7. Cloridrato de guanidina (Calbiochem, San Diego, CA, USA)

8.1.8. Tampão HEPES contendo tampão HBS-EP (Biacore), c = 10 mmol/L,pH 7,4, cloreto de sódio, c = 150 mmol/L, EDTA, c = 3 mmol/L e tensoativoP20, c = 0,005% (v/v).8.1.9. Reagentes de teste monoclonais, específicos anti-grupo de Salmonella:

8.1.9.1. anti- Salmonella gr. B (SIFIN, Berlim, Alemanha), contém mAbAnti-04, 05, 027

8.1.9.2. anti- Salmonella gr. C (SIFIN), contém mAb Anti-07, 08

8.1.9.3. anti- Salmonella gr. D (SIFIN), contém mAb Anti-09, Vi

8.1.9.4. anti- Salmonella gr. E (SIFIN), contém mAb Anti-03, Ol9

8.1.10. anti-soros somáticos Ό' monovalentes de Salmonella:

8.1.10.1. anti-04 (Pro-Lab diagnostics, Salmonella Reference Section of theCentral Veterinary Laboratory, Weybridge, Grã-Bretanha)

8.1.10.2. anti-05 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.3. anti-06.7 CPro-Lab diagnostics)

8.1.10.4. anti-08 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.5. anti-09 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.6. anti-010 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.7. anti-012 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.8. anti-019 (Pro-Lab diagnostics)

8.1.10.9. anti-O Poly E (03,010,015,019,034; Pro-Lab diagnostics)

8.1.11. anti-soros somáticos Ό' polivalentes de Salmonella:

8.1.11.1. anti-O Poly A-S(02,03,04,05,06,7,08,09,010,011,012,013,015,

016,017,018,019,020,021,022,023,028,030,034,035,038,040,041;Pro-Lab diagnostics)

8.1.12. LPS de Salmonella, LPS isolado em casa por extração em TCA (SOPCHEMIE/A21 (Exemplo H)) preparado de bactérias Salmonella sorovaresenteriditis (Se), goldcoast (Sg), livingstone (SI), meleagridis (Sm) etyphimurium (St) com proteína (SOP CHEMIE/A23, Exemplo 13)

8.1.12.1.1. Alíquotas de 0,5 mg de LPS são armazenadas a + 4°C ou emtemperatura menor.

8.1.13. Soros de referência de ave8.1.13.1. SPF-CH, soro SPF referido como soro de controle negativo (AnimalHealth Service Ltd. (GD), Deventer, Os Países-Baixos)

8.1.13.2. EIA-SE, soro de controle positivo para Salmonella enteritidis degalinha para uso em ELISA (GD)

8.1.13.3. EIA-ST, soro de controle positivo para Salmonella typhimurium degalinha para uso em ELISA (GD)

8.1.13.4. SPA-PG, soro de controle positivo para Salmonella pullorum degalinha para uso em ELISA (GD)

8.1.13.5. CH-SI, soro de controle positivo para Salmonella infantis de galinhapara uso em ELISA (GD)

8.1.14. Acetato de sódio tri-hidratado (J.T. Baker, Phillip sburgh, NJ, USA)

8.1.15. Cloreto de sódio (Merck, Darmstadt, Alemanha)

8.1.16. Cianoboroidreto de sódio (NaCNBH3) (Fluka)

8.1.17. Hidróxido de sódio,, c = 50 mmol/L (Biacore)

8.1.18. Periodato de sódio. (Sigma Chemical Comp., St. Louis, MO, USA)

NOTA: Este composto químico é sensível à luz. Armazenareste material protegido da luz.

8.1.19. Triton X-1OO (Sigma)

8.1.20. Tween 20 (Sigma)

8.1.21. Tween 80 (Sigma)

8.1.22. Água é obtida de um sistema de purificação de água Milli Q(MilliQplus)

8.2. SOLUÇÕES

8.2.1. Solução de ácido acético, c = 0,1 g/mL: diluir 1 mL de ácido acético

(8.2) com 9 mL de água.

8.2.2. Solução de tampão acetato, c = 10 mmol/L, pH 4,0: dissolver 0,272 gde acetato de sódio tri-hidratado (8.2.14) em 180 mL de água e ajustar parapH 4,0 com ácido acético (8.3.1) e completar para 200 mL com água. Estetampão é estável por aproximadamente seis meses.8.2.3. Solução de tampão acetato, c = 1.0 mol/1, pH 5,5: dissolver 13,6 g deacetato de sódio tri-hidratado (8.2.14) em 90 mL de água e ajustar para pH 5,5com ácido acético (8.3.1) e completar para 100 mL com água. Este tampão éestável por aproximadamente seis meses.

8.2.4. Solução de tampão acetato, c = 100 mmol/L, pH 5,5: diluir 1,0 mL desolução de tampão acetato, c = 1,0 mol/1 (8.3.3) com 9,0 mL de água.

8.2.5. Solução de carbohidrazida, c = 100 mmol/L: dissolver 9,0 mg decarbohidrazida (8.2.4) em 1.000 μί de água.

8.2.6. Solução de carbohidrazida, c = 5 mmol/L: diluir 10 μΐ, de solução decarbohidrazida (8.3.5) com 190 μί de água. Preparar imediatamente antes douso.

8.2.7. Solução de CHAPS, c = 0,05% (m/v): dissolver 0,02 g (8.2.3) em 40mL de HBS-EP (8.2.8).

8.2.8. Solução de detergentes, c = 0,3% (m/v): dissolver 0,3 g de CHAPS(8.2.3), 0,3 g de Tween 20 (8.2.21), 0,3 g de Tween 80 (8.2.22) e 0,3 g deTriton X-100 (8.2.20) em 100 mL de água.

8.2.9. Solução de EDC: reconstituir EDC (8.1.2.2) em 10,0 mL de água.

8.2.9.1. Frações de 100 μί desta solução (8.3.9) são armazenadas em tubo depolipropileno (9.12) a -18°C ou em temperatura menor. As alíquotas sãoestáveis por dois meses.

8.2.9.2. Antes do uso: Descongelar as alíquotas e agitá-las cuidadosamentepara garantir soluções homogêneas.

8.2.10. Solução de etanol-amina: pipetar 200 μΕ de solução de etanol-aminade c = 1 mol/L (8.1.2.3) para um tubo de polipropileno (9.12)

8.2.11. Solução de guanidina, c = 6 mol/L: dissolver 17,18 g de cloridrato deguanidina (8.2.7) em 10 mL de solução de detergentes (8.3.8) e ajustar ovolume para 30 mL com solução tampão de glicina (8.2.6).Esta solução éestável por aproximadamente três meses.

8.2.12. Solução de NHS: reconstituir NHS (8.1.2.1) em 10,0 mL de água.8.2.12.1. Fracionar alíquotas de 100 μΐ. desta solução (8.3.12) em tubo depolipropileno (9.12). Armazenar a -18°C ou em temperatura menor. Asalíquotas são estáveis por dois meses.

8.2.12.2. Antes do uso: Descongelar as alíquotas e agitá-las cuidadosamentepara garantir soluções homogêneas.

8.2.13. Tampão de diluição de amostra: dissolver 2 g de sal de sódio decarbóxi-metil-dextrano (8.2.5), 9,97 g de cloreto de sódio (8.2.15) e 0,1 g deTween 80 (8.2.22) em 200 mL de HBS-EP (8.2.8).

8.2.14. Cianoboroidreto de sódio, c = 1.00 mol/L: dissolver 62,8 mg decianoboroidreto de sódio (8.2.16) em 1.000 μΐ, de solução de acetato de pH4,0 (8.3.2).

8.2.15. Cianoboroidreto de sódio, c = 100 mmol/L: diluir 20 μΐ, de solução decianoboroidreto de sódio (8.3.14) com 180 μι de solução de acetato, c = 10mmol/L, pH 4,0 (8.3.2). Preparar imediatamente antes do uso.

8.2.16. Hidróxido de sódio, c = 5 mmol/L: diluir 400 μί de hidróxido desódio c = 50 mmol/L (8.2.17) com 3,6 mL de água em frasco de vidro (9.10).

8.2.17. Solução de periodato de sódio, c = 100 mmol/L: adicionar em 214 mgperiodato de sódio (8.2.18) 10,0 mL de água.

8.2.18. Periodato de sódio 'pronto para uso': pipetar 100 μΕ de solução deperiodato de sódio, c = 100 mmol/L (8.3.17) em um tubo de polipropileno de1,4 mL (9.13) e secar com um evaporador centrífugo (8.4).

8.2.19. Solução de periodato de sódio, c = 50 mmol/L: dissolver periodato desódio 'pronto para uso (8.3.18) em 200 μL de solução de acetato, c = 100mmol/L pH 5.5 (8.3.4). Preparar imediatamente antes do uso.

8.3. SOLUÇÃO DE REFERÊNCIA PADRÃO

8.3.1. Soros anti-O de Salmonella: diluir 20 μί de cada soro (8.2.10 e 8.2.11)em 380 μΐ, de tampão de diluição de amostra (8.3.13) em uma placa demicrotítulo (9.18) com a exceção de soro anti-05: 2 μL deste soro (8.2.10.2)são diluídos em 400 μι de tampão de diluição de amostra (8.3.13).8.3.2. Reagentes de teste específicos para anti-grupo de Salmonella: diluir 4μΐ, de cada soro (8.2.9.1, 8.2.9.2, 8.2.9.3 e 8.2.9.4) em 395 μι de tampão dediluição de amostra (8.3.13)

8.3.3. Soros de referência de ave: diluir 6 μΐ, de soros (8.2.13.1 e 8.2.13.3) em295 μΐ, de tampão de diluição de amostra (8.3.13) em uma placa demicrotítulo (9.18) e diluir 3 μί de soros (8.2.13.2 e 8.2.13.4) em 295 μΐ. detampão de diluição de amostra (8.3.13)

8.3.4. Agitar (9.11). Preparar imediatamente antes do uso.

8.4. MATERIAIS AUXILI ARES

8.4.1. Coluna NAP-5 (0,5 mL, Sephadex G-25, Amersham Biosciences).

8.4.2. Chips CM5 (Biacore).

9. EQUIPAMENTO E APARELHAGEM

9.1. Referência a uma companhia é apenas para informação e identificação enão implica uma recomendação a não ser que enunciada. Equipamento eaparelhagens equivalentes também podem ser apropriados.

9.2. Balança analítica (tipo AE 240, Mettler, Zurique, Suíça)

9.3. Biacore 3000 (Biacore)

9.4. Evaporador centrifugo (Jouan, Saint-Herblain, France)

9.5. Pipeta Finn, 5-40 μι (Labsystems Oy, Helsinque, Finlândia)

9.6. Pipeta Finn, 40-200 μι (Labsystems Oy)

9.7. Pipeta Finn, 200-1000 μΐ, (Labsystems Oy)

9.8. Pipeta Finn, 1-5 mL (Labsystems Oy)

9.9. Tubo coletor de vidro, 5 mL, tampado (Renes, Zeist, Os Países-Baixos)

9.10. Frasco de vidro de diâmetro de 16 mm (Biacore)

9.11. Miniagitador com cabeça de copo de microtítulo (MS 1, Janke &Kunkel, Staufen, Alemanha)

9.12. Tubo de polipropileno, diâmetro de 7 mm, com tampas de pressão(Biacore)

9.13. Tubo de polipropileno, 1,4 mL (Micronic, Lelystad, Os Países-Baixos)9.14. Medidor de pH (tipo pH 537, WTW, Weilheim, Alemanha).

9.15. Banho de sonicação, Branson 2200 (Branson Ultrasonics B.V., Soest5Os Países-Baixos)

9.16. Filtro de seringa de 0,45 μηι de diâmetro de 25 mm (GeIman Sciences,Ann Arbor,MI, USA)

9.17. Distribuidor de vácuo, para operar várias colunas NAP-5simultaneamente (tipo SPE-12G, com tampa(s) de PTFE, J.T.Baker).

9.18. Placa de poliestireno de microtítulo de fundo em V, formato de 96cavidades (Greiner Bio-one GmbH, Frickenhausen, Alemanha)

9.19. Misturador de vórtice (KS-I, Janke & Kunkel)

10. PROGRAMA DE COMPUTADOR

A aparelhagem de biossensor é operada com Biacore 3000control software 4.1 (1999-2003).

11. PROCEDIMENTO

11.1. OXIDAÇÃO E DESSALINIZAÇÃO DE SOLUÇÃO DE LPS PRECAUÇÃO DE SEGURANÇA:

Lipopolissacarídeos são imunógenos potentes, que podemlevar pessoas sensíveis a um choque séptico após ingestão ou inalação.Precauções devem ser feitas para prevenir o contato com este agentesbioquímico.

Periodato de sódio é um agente oxidante e pode causarexplosões quando contatado com agentes redutores.

O procedimento utiliza cianoboroidreto de sódio. Oprocedimento deve ser portanto realizado com precauções tais como porexemplo o uso de luvas de mão e uma máscara. Usar esta substância químicaapenas em uma capela. O material é muito tóxico para organismos aquáticos epode causar efeito adverso de longa duração em ambiente aquático. O resíduode solução e de material deve ser disposto como um resíduo perigoso.

11.1.1. OXIDAÇÃO11.1.1.1. Adicionar 500 μί de tampão acetato de pH 5,5 (8.3.4) no LPS(8.2.12) (veja precaução de segurança)

11.1.1.2. Agitar com vórtice (9.19) totalmente até a pelota ficar dissolvida.

11.1.1.3. Sonicar (9.15) a solução por 10 minutos e julgar a solução para suatransparência.

11.1.1.4. Quando transparência não estiver satisfatória continuar a sonicaçãoaté ser obtida uma solução transparente (convalescente).

11.1.1.5. Adicionar 20 μί de solução de periodato (8.3.19) na solução de LPS(11.1.2.4)

11.1.1.6. Agitar com vórtice (9.19) a solução (11.1.2.5)

11.1.1.7. Incubar sobre gelo por 40 min protegido da luz.

11.1.1.8. Extinguir a oxidação por dessalinização da solução (11.1.2.6) comodescrito em 11.1.3

11.1.2. DESSALINIZAÇÃO

11.1.2.1. Posicionar a(s) coluna(s) NAP-5 (8.5.1) no distribuidor (9.17).

11.1.2.2. Condicionar a(s) coluna(s) (11.1.3.1) pela passagem de três porçõesde 3 mL de tampão acetato (8.3.2) sobre o leito de coluna em um fluxo geradoapenas por gravidade. Permitir que o tampão entre completamente no leito de gel.

11.1.2.3. Pipetar 0,5 mL de solução de LPS oxidado (11.1.2.8) sobre a coluna.Permitir que a amostra entre completamente no leito de gel.

11.1.2.4. Eluir o LPS oxidado com 1 mL de tampão acetato (8.3.2). Coletar oeluato em um tubo de vidro de 5 mL (9.9).

11.1.2.5. Misturar com vórtice (9.19) a solução (11.1.3.4) por 10 s.

11.1.2.6. Quando não usadas imediatamente (11.1.3.5) armazenar as amostrasa de 4°C a TC.

11.1.2.7. Antes da imobilização, a solução contendo LPS é diluída comoindicado na seguinte Tabela 39.Tabela 39.

<table>table see original document page 137</column></row><table>

11.2. !MOBILIZAÇÃO

NOTA: Garantir que todos os reservatórios de solvente e dereagente contenham volume suficiente para realizar o método completamenteantes de iniciar o conjunto de ensaios.

NOTE: Palavras escritas em itálico referem-se aos comandosdo programa de computador e aos menu's etc. de operação de Biacore 3000.

11.2.1. Preparação

11.2.1.1. Descongelaruma porção de EDC (8.3.9.1)

11.2.1.2. Descongelar uma porção de solução NHS (8.3.12.1).

11.2.1.3. Posicionar a prateleira Thermo A na posição direita de prateleira(R2) e a prateleira Reagent no meio (RR)

11.2.1.4. Command [comando]: conectar um chip CM5 (8.5.2) e revestir comtampão HBS-EP (8.2.8).

11.2.1.5. Posicionar a solução de EDC (11.2.1.1) em posição R2A1

11.2.1.6. Posicionar a solução de NHS (11.2.1.2) em posição R2A2.

11.2.1.7. Posicionar um tubo vazio (9.12) em posição R2A3.

11.2.1.8. Posicionar a solução de carbohidrazida (8.2.6) em posição R2A4.

11.2.1.9. Posicionar a solução de etanol-amina (8.2.10) em posição R2A5.

11.2.1.10. Posicionar a solução com LPS oxidado (11.1.2.7) em posiçãoR2A6.

11.2.1.11. Posicionar a solução de cianoboroidreto de sódio (8.2.15) emposição R2A7.

11.2.1.12. Posicionar a solução de guanidina 6 M (8.2.11) em frasco de vidro(9.10) em posição RR211.2.1.13. Posicionar a solução de CHAPS (8.2.7) em frasco de vidro (9.10)em posição RR4

PRECAUÇÃO: Posicionar um tubo descartável sob a saída deresíduo do instrumento para coletar solução usada de cianoboroidreto desódio. O resíduo de solução deve ser disposto como resíduo perigoso.

11.2.2. Imobilização do chip CM5

11.2. S. File [arquivo] (veja Figura 35.) —» New application wizard

11.2.3.1. Open Template [abrir modelo] —> Procurar pelo arquivo: Wizardimmobilisation, (veja Figura 36) 11.2.3.2. Preencher: Notebook (veja Figura 38)

11.2.3.3. Run [executar], next [a seguir] en start [iniciar]

11.2.3.4. Nota: para ver qual instrução está no wizard faça Edit [editar] nolugar de Run [executar]

11.2.4. Save [gravar] o sensorgrama. Os arquivos de resultado são gravadoscom a extensão pré-estabelecida '.ó/r'

11.2.5. O chip está pronto para testar anticorpos contra Salmonella em soros.Nota: Os níveis de imobilização obtidos devem se aproximar dos níveis comoindicados na Tabela 40. Caso contrário considerar a imobilização devido àfalha de oxidação.

Tabela 40. Níveis de imobilização típicos de Ips

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11.3. DETECÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-SALMONELLA

Nota: Garantir que todos os reservatórios de solvente ereagente contenham volume suficiente para corrida de método completo desoros de referência antes de iniciar o conjunto de ensaios.

11.3.1. Tornar o Biacore operacional com um chip CM5 apropriado.

11.3.2. File [arquivo] (veja Figura 36) —> New application wizard11.3.2.1. Open Template [abrir modelo] —> Procurar por arquivo: Wizardcontrol chip immobilization (veja Figura 37)

11.3.2.2. Preencher: Notebook (veja Figura 38)

11.3.2.3. Run [executar], next [a seguir] en start [iniciar]

11.3.2.4. Nota: para ver qual instrução está no wizard faça Edit [editar] nolugar de Run [executar]

11.3.3. Save [gravar] o sensorgrama. Os arquivos de resultado são gravadoscom a extensão pré-estabelecida \blr'

Sensorgrama típico para imobilização de LPS é mostrado emFigura 39, enquanto que um sensorgrama para a análise de um anti-soro émostrado em Figura 40. Respostas típicas são listadas em Tabela 41.

Tabela 41. Respostas típicas de soros de anticorpos contra Salmonella

<table>table see original document page 139</column></row><table>

Exemplo 13

Otimização de adição de proteína em Ips para imobilização e detecção deanticorpos de soro

ADVERTÊNCIA E PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

Lipopolissacarídeos (LPS) são elevadamente pirogênicos epodem causar febre. Para evitar ingestão, tratar soluções aquosas de LPS comcuidado e usar uma máscara quando se trabalha com material sólido. Sequalquer um destes compostos entrar na corrente sangüínea, procurarimediatamente atendimento médico.

0. INTRODUÇÃO

Estudos recentes indicam que quando proteína é adicionadaem LPS antes da oxidação, a imobilização em uma camada de ouro e dextranocarboximetilado é tornada possível e em alguns casos é melhorada. A seguir,respostas sorológicas também são tornadas possíveis e são melhoradas. Oótimo das respostas sorológicas depende da percentagem de proteínaadicionada em LPS. Este efeito de proteína pode ser obtido pela adição dehemoglobina. Hemoglobina é uma proteína naturalmente ocorrente, que podeser encontrada em todos os vertebrados de sangue quente. Portanto anticorposanti-hemoglobina de reação cruzada em soros não são esperados em soros.

1. ESCOPO E CAMPO DE APLICAÇÃO

Este método descreve a adição de uma quantidade dehemoglobina para lipopolissacarídeos (LPS) produzidos por meio de extraçãoem ácido tricloro-acético t (veja SOP Chemie/A21: Extração e isolamento delipopolissacarídeos (Exemplo H)). A percentagem ótima de hemoglobina édefinida como uma mistura reacional dando níveis de imobilização altos emcombinação com reação sorológica máxima de soros de controle positivo. Emadição, são descritas a produção e a armazenagem de misturas reacionais deLPS, prontas para serem usadas, para imobilização sobre um chip sensor.

2. REFERÊNCIAS

SOP Chemie/A21: Extração e isolamento delipopolissacarídeos (versão 3; Exemplo 11)

SOP CHEMIE/A22: Imobilização de LPS derivado deSalmonella sobre um chip biossensor (BIACORE) e detecção de anticorposde soro relatando uma infecção de Salmonella corrente ou passada (versão 3;Exemplo 12)

3. LISTA DE ABREVIAÇÕES

3.1 LPS: Lipopolissacarídeos

3.2 SOP: Procedimento de operação padrão

3.3 NaAc: tampão acetato de sódio

3.4 Hb: Hemoglobina

3.5 mQ: água milliQ

4. PRINCÍPIOEm SOP Chemie/A21 (Exemplo 11), é descrita a produção delipopolissacarídeos (LPS) de Salmonella spp. LPS extraído é usado como umligante em uma análise analítica realizada em um sistema Biacore 3000 paradetectar anticorpos anti- Salmonella em soros derivados de porcos e galinha(veja SOP CHEMIE/A22 (Exemplo 12)). Para melhorar a imobilização deLPS, hemoglobina é adicionada antes da oxidação. Para produzir um estoquegrande de material para dar níveis de imobilização, dados sorológicos edesempenho de método reproduzíveis, LPS é fortificado com hemoglobina,dividido em alíquotas e seco antes da armazenagem a 4°C. Para imobilizar umchip, uma das alíquotas é imobilizada e oxidada no modo de batelada.

5. REAGENTES E MATERIAIS

Durante o procedimento, a não ser que seja enunciado de outromodo, usar apenas reagentes de grau analítico reconhecido e apenas águadestilada ou água de pureza equivalente. Referência a uma companhia éapenas para informação e identificação e não implica uma recomendação anão ser que assim enunciado.

5.1 Compostos químicos

5.1.1 Ácido acético (J.T. Baker, Deventer, Os Países-Baixos)

5.1.2 Hemoglobina, porcina (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Os Países-Baixos)

5.1.3 água MilliQ(O)

5.1.4 Acetato de sódio tri-hidratado (J.T. Baker, Phillipsburgh, NJ, USA)

5.2 Soros de aglutinação de Salmonella

5.2.1 Anti-04 (Pro-Lab diagnostics, Salmonella reference section of theCentral Veterinary Laboratory, Weybridge, Reino Unido)

5.2.2 anti-05 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.3 anti-06,7 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.4 anti-08 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.5 anti-09 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.6 anti-010 (Pro-Lab diagnostics)5.2.7 anti-012 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.8 anti-019 (Pro-Lab diagnostics)

5.2.9 anti-0 Poly A-S (anti-soros para grupos A a S) (Pro-Lab diagnostics)

5.2.10 anti-O Poly E (anti-soros para fatores 03, OlO, 015, 019, 034) (Pro-Lab diagnostics)

5.3 Anti-soros de Salmonella específicos para grupo

5.3.1 Enteroclon anti-grupo B de Salmonella (Sifin, Berlin, Alemanha)

5.3.2 Enteroclon anti-grupo C de Salmonella (Sifin)

5.3.3 Enteroclon anti-grupo D de Salmonella (Sifin)

5.3.4 Enteroclon anti-grupo E de Salmonella (Sifin)

5.4 Soros de referência de ave

5.4.1 SPF-CH, soro de controle negativo livre de patógeno específico (SPF)(Animal Health Service Ltd. (GD), Deventer, Os Países-Baixos)

5.4.2 EIA-SE5 controle positivo para Salmonella enteritidis de galinha parauso em ELISA (GD)

5.4.3 EIA-ST, controle positivo para Salmonella typhimurium de galinha parauso em ELISA (GD)

5.4.4 SPA-PG, controle positivo para Salmonella pullorum de galinha parauso em ELISA (GD)

5.4.5 CH-SI, controle positivo para Salmonella infantis de galinha para usoem ELISA (GD)

5.5 Soros de referência de suíno

5.5.1 Sw-Liv5 soro de controle positivo para Salmonella livingstone de suínoem ELISA (GD)

5.5.2 Sw-Typ5 soro de controle positivo para Salmonella typhimurium desuíno em ELISA (GD)

5.5.3 Sw-APP5 soro de controle positivo para Actinobacciluspleuropneumoniae de suíno em ELISA (GD)

5.6 LipopolissacarídeosLipopolissacarideos (LPS) são extraídos, liofüizados earmazenados como descrito SOP Chemie/A21 (Exemplo 11).

5.6.1 LPS de Salmonella enteritidis

5.6.2 LPS de Salmonella goldcoast

5.6.3 LPS de Salmonella livingstone

5.6.4 LPS de Salmonella meleagridis

5.6.5 LPS de Salmonella typhimurium

5.7 Reagentes

5.7.1 Solução de tampão acetato, c = 10 mmol/L, pH 4.0: dissolver 0,272 g deacetato de sódio tri-hidratado (5.1.4) em 180 mL de MQ (5.1.3) e ajustar parapH 4,0 com ácido acético (5.1.1) e completar para 200 mL com mQ (5.1.3).Este tampão é estável por aproximadamente seis meses a 4°C.

5.7.2 Solução de tampão acetato, c = 1,0 mol/L, pH 5,5: dissolver 13,6 g deacetato de sódio tri-hidratado (5.1.4) em 90 mL MQ (5.1.3) e ajustar para pH

5,5 com ácido acético (5.1.1) e completar para 100 mL com mQ (5.1.3). Estetampão é estável por aproximadamente seis meses a 4°C.

5.7.3 Solução de estoque de hemoglobina, 5 mg/mL: dissolver 5 mg dehemoglobina (5.1.2) em 1 mL de mQ (5.1.3).

5.8 Materiais auxiliares

5.8.1 Chips CM5 (Biacore AB, Uppsala, Suécia).

6. EQUIPAMENTO E APARELHAGEM

Referência a uma companhia é apenas para informação eidentificação e não implica uma recomendação a não ser assim enunciado.Aparelhagens e equipamento equivalentes também podem ser apropriados.

6.1 Evaporador centrífugo (Jouan, Saint-Herblain, França)

6.2 Biacore 3000 (Biacore)

6.3 Pipeta Finn, 40-200 μί (Labsystems Oy, Helsinque, Finlândia)

6.4 Tubo coletor de vidro, 5 mL, 12mm x75 mm com tampa (Renes, Zeist, OsPaíses-Baixos)6.5 Instalação MilliQ (Millipore, Bedford, MA, USA)

6.6 Banho de sonicação, Branson 2200 (Branson Ultrasonics, Soest, OsPaíses-Baixos)

6.7 Misturador vórtice (KS-I, Janke & Kunkel, Staufen, Alemanha)

7. PROCEDIMENTO

7.1 Produção de solução de estoque de lipopolissacarídeos

7.1.1 Coletar o LPS produzido (veja SOP Chemie/A21 (Exemplo H)) dorefrigerador e deixá-lo aclimatar na temperatura ambiente.

7.1.2 Recuperar o peso do LPS produzido (7.1.1) no tubo da folha de dados dequalidade (veja SOP Chemie/A21 (Exemplo H)).

7.1.3 Calcular o volume de mQ a ser adicionado em LPS usando Fórmula 1(9.1).

7.1.4 Adicionar o volume calculado de mQ (7.1.3) no tubo de LPS (7.1.2)(concentração final de LPS: 5 mg/mL).

7.1.5 Agitar com vórtice totalmente até que todo o pó esteja dissolvido.

7.1.6 Sonicar (6.6) a solução por 10 min e julgar a solução para a suatransparência.

7.1.7 Quando a transparência (7.1.6) não for satisfatória continuar a sonicação(6.6) até ser obtida uma solução transparente (convalescente).

7.2 Adição de hemoglobina

7.2.1 Preparar quatro diluições de solução de LPS (7.17) (uma para cada canalde fluxo) em tampão de acetato de sódio com conteúdos variáveis dehemoglobina como descrito em Tabela 42 (8) em um tubo de vidro (6.4).

7.2.2 A escolha das quantidades iniciais de hemoglobina relativas adicionadasem cads batelada de LPS recém-preparada é dada na Tabela 43 (8).

7.2.3 Completar para um volume total de 500 μι com mQ (5.1.3) comodescrito em Tabela 42 (8).

7.3 Oxidação e dessalinização (veja SOP Chemie/A22; capítulo 10.1(Exemplo 12)7.3.1 Iniciar oxidação a partir do ponto 10.1.1.2.

7.4 Imobilização (veja SOP Chemie/A22, capítulol0.2 (Exemplo 12)

NOTA: Imobilizar LPS oxidado fortificado com quatroquantidades diferentes de hemoglobina (7.3) sobre um chip CM5 (5.8.1) demodo que cada canal de fluxo represente uma quantidade relativa diferente.

7.5 Detecção de anticorpos anti-Salmonella (veja SOP Chemie/A22,capítulo 10.3 (Exemplo 12))

7.6 Determinação de percentagem ótima de hemoglobina

7.6.1 Calcular a média e o desvio padrão das 5 respostas relativas de cada umdos soros de aglutinação em (5.2) e dos anti-soros de Salmonella específicospara grupo listados em (5.3) por canal de fluxo.

7.6.2 Criar um gráfico de coluna agrupada com sobre o eixo χ os nomes dosanti-soros de Salmonella específicos para grupo e de aglutinação, e sobre oeixo y a média das unidades de resposta relativa para todas as quantidadesrelativas diferentes de hemoglobina (7.6.1) (veja para um exemplo: Figura 41).

7.6.3 Calcular a média e o desvio padrão de 4 respostas relativas de cada umdos soros de controle de referência de ave listados em (5.4) e dos soros dereferência de suíno listados em (5.5) por canal de fluxo.

7.6.4 Criar um gráfico de coluna agrupada com sobre o eixo χ os nomes dossoros de controle de ave e dos soros de controle de suíno, e sobre o eixo y amédia das unidades de resposta relativa para todas as percentagens diferentesde hemoglobina (7.6.3) (veja para um exemplo: Figura 42).

7.6.5 Adicionar narras de erro Y em ambos os gráficos agrupados (7.6.2,7.6.4) pelo uso dos valores de desvio padrão para cada coluna de eixo χ (vejapara um exemplo: Figuras 41 ou 42).

7.6.6 Copiar as médias calculadas de soros esperados positivos selecionados(veja Tabelas 44 a 46 (8)) e os soros de galinha SPF negativos de todas asquantidades de hemoglobina relativas medidas em uma tabela nova (veja paraum exemplo: Tabela 47 (8).

7.6.7 Subtrair as respostas de soros de galinha SPF (7.6.6) das respostas desoros positivos esperados (7.6.6) (veja para um exemplo: Tabela 48 (8)).

7.6.8 Determinar a resposta mais alta por soro positivo por quantidade dehemoglobina relativa e dar a esta um valor de 10 (veja para um exemplo

Tabela 49 (8)).

7.6.9 Calcular para o restante dos canais de fluxo os valores relativos pelo usode fórmula 2a (9.2) (veja para um exemplo Tabela 49 (8)).

7.6.10 Calcular a soma de todos os valores relativos por percentagem dehemoglobina (veja para um exemplo Tabela 49 (8)).

7.6.11 A percentagem ótima de hemoglobina (para as quatro percentagenscomparadas) é determinado pelo resultado de soma mais alto nas quatropercentagens de hemoglobina / canal de fluxo.

7.6.12 Quando as quantidades relativas ótimas de hemoglobina (7.6.11) foremas quantidades de hemoglobina mais altas ou mais baixas comparadas, etapas

7.2 a 7.6.11 têm que ser repetidas com as seguintes condições.

7.6.12.1 No caso de as quantidades de hemoglobina mais baixas para Sg, Sme Sg (20%) serem as ótimas máximas, as quantidades de 20% e 30% serãorepetidas em adição a 0% e 10% de hemoglobina.

7.6.12.2 No caso de as quantidades de hemoglobina relativas mais altas paraSe e St serem ótimas máximas, as quantidades de 20% e 30% serão repetidasem adição a 40% e 50% de hemoglobina.

7.6.12.3 No caso de as quantidades de hemoglobina relativas mais altas paraSg, Sm e Sl serem ótimas máximas, as percentagens de 40% e 50% serãorepetidas em adição a 60% e 70% de hemoglobina.

7.6.13 Um ótimo de percentagem de hemoglobina é alcançado:

7.6.13.1 Quando a soma de valores relativos (7.6.8), por quatro quantidadesde hemoglobina relativas comparadas, possui o valor mais alto.

7.6.13.2 Dentro da faixa de hemoglobina comparada onde o valor mais alto édetectado, um nível maior ou menor de adição de hemoglobina também édeterminado.

7.7 Preparação de estoque de LPS seco a vácuo com hemoglobinaadicionada

7.7.1 O volume da solução de LPS restante a 5 mg/mL após determinação dequantidade de hemoglobina ótima é calculado pela subtração do peso de tubovazio inicial lido da folha de dados de qualidade do peso de tubo mais soluçãode LPS (7.1.7) (veja SOP Chemie/A21 (Exemplo 11).

7.7.2 A quantidade de LPS restante é calculada usando a Fórmula 3 (9.3).

7.7.3 Calcular a quantidade de hemoglobina a ser adicionada em LPS usandoa Fórmula 4 (9.4).

7.7.4 Adicionar a quantidade calculada de hemoglobina (7.7.1) na solução deLPS restante para alcançar uma concentração final, que foi determinada em7.6.13

7.7.5 Inverter, agitar com vórtice e/ou sonicar a solução (7.7.4) até que ahemoglobina esteja totalmente dissolvida.

7.7.6 Dispensar 100 μί em tubos de vidro (6.4).

7.7.7 Secar a solução dispensada (7.7.6) em um secador rotativo a vácuo (6.1)(ponto de aquecimento 1,15 min., tempo de corrida total: 60 min.)

7.7.8 Tampar os tubos e armazenar a 4 - 7°C até uso posterior.

Respostas de linha base típicas de complexos de hemoglobina - LPS de S.goldcoast imobilizados em chip CM5 são dadas em Figura 43.

8. Tabelas

Tabela 42. Adição de hemoglobina (5.7.3), tampão acetato de sódio (5.7.2) emQ (5.1.3) em LPS (7.2.1) antes da oxidação.<table>table see original document page 148</column></row><table>

Tabela 43. Quantidades iniciais relativas de hemoglobina adicionadas em LPS.

<table>table see original document page 148</column></row><table>

Tabela 44. Resultados esperados de ligação de soro de aglutinação (diluído)em LPS de Salmonella imobilizado<table>table see original document page 149</column></row><table>

Legenda:

+ = ligação positiva de soro em LPS imobilizado- = nenhuma ligação em LPS imobilizado

+ = soros selecionados a serem usados em determinação de adição ótima dehemoglobina.

Tabela 45. Resultados esperados de ligação de soro de referência de ave(diluído) em LPS de Salmonella imobilizado<table>table see original document page 150</column></row><table>

Legenda: + = ligação positiva de soro em LPS imobilizado- = nenhuma ligação em LPS imobilizado+/- = soros selecionados a serem usados em determinação deadição ótima de hemoglobina.

Tabela 46. Resultados esperados de ligação de soro de referência de suíno(diluído) em LPS de Salmonella imobilizado

Cepa de Salmonella proporcionadora de LPS, Soros de referência de ave [sic]<table>table see original document page 151</column></row><table>

Legenda:

+ = ligação positiva de soro em LPS imobilizado

- = nenhuma ligação em LPS imobilizado

+/- = soros selecionados a serem usados em determinação de adição ótima dehemoglobina

Tabela 47. Respostas sorológicas típicas sobre LPS de Salmonella goldcoastimobilizado com adições variáveis de hemoglobina (dados de dois chips CM5preparados)<table>table see original document page 152</column></row><table>

Tabela 48. Tabela típica de subtração de CH-SPF de respostas sorológicaspositivas selecionadas (dados de Tabela 47) sobre LPS de Salmonellagoldcoast imobilizado com adições variáveis de hemoglobina (dados de doischips CM5 preparados).

<table>table see original document page 152</column></row><table>

Tabela 49. Tabela típica de resultados de valores relativos de Tabela 48(dados de dois chips CM5 preparados)<table>table see original document page 153</column></row><table>

9. Fórmulas

9.1 Fórmula 1

Cálculo de volume de mQ

ν = w/5

ν = volume de mQ (5.1.3) (em mL)

w = peso de LPS (7.1.2) (mg) (veja SOP ChemieA21

(Exemplo H))

9.2 Fórmula 2

Cálculo de valor relativo de soros positivos

Rv = MvZMhv* 10

Rv = valor relativo

Mv = valor médio (7.6.1)

Mhv = valor mais alto médio (7.6.8)

9.3 Fórmula 3

Cálculo de quantidade de LPS restante

z = w* 0,005

z = quantidade de LPS restante (em mg)

w = peso de solução de LPS restante (7.7.1) (em mg)

9.4 Fórmula 4

Cálculo de quantidade de hemoglobina

h = y * z * 0,05h = massa de hemoglobina (em mg)y = percentagem (%) ótima de hemoglobina (%) (7.6.13)ζ = quantidade de LPS restante (9.3) (mg)

Descrição das figuras

Figura 1. Representação esquemática de uma modalidade dométodo de acordo com a invenção.

Figura 2. Esboço esquemático de BIA para detecção debactérias usando bacteriófagos como organismos indicadores. Organismosindicadores podem ser cultivados durante a noite ou brevemente.

Figura 3. Reatividade de LPS oxidado, fortificado com Hb,isolado de S. typhimurium (batelada St2003.2) com soros de aglutinação emrespostas de biossensor arbitrárias relativas (RU). O nível de fortificação deHb de LPS durante oxidação é mostrado na figura. A ligação esperada dossoros de aglutinação é mostrada em Tabela 3.

Figura 4. Curvas ROC de Exemplo 2, Experimento 1. TPF:fração positiva-verdadeira; FPF: fração positiva falsa.

Figura 5. Curvas ROG de Exemplo 2, Experimento 2. TPF:fração positiva-verdadeira; FPF: fração positiva falsa.

Figura 6. Análise de glóbulos preparados revestidos com LPSde S. enteritidis (refletindo sorogrupo D), S. goldcoast (refletindo sorogrupoC2), S. Iivingstone (refletindo sorogrupo Ci), S. meleagridis (refletindosorogrupo E) e S. typhimurium (refletindo sorogrupo B). Os sucessos dorevestimento e da especificidade do LPS foram testados com anti-soros(sorogrupo B), Ol (sorogrupo Cj),O8 (sorogrupo C2) e 09 (sorogrupo D).

Respostas são expressadas em unidades arbitrárias como índice defluorescência média no eixo Y, enquanto que o eixo X indica o tipo deconjugação de LPS dos glóbulos individuais.

Figura 7. Análise de glóbulos preparados revestidos com LPSrefletindo sorogrupos Β, Ci, C2 e D. A atividade do revestimento foi testadacom anti-soros monoclonais contra 04 (sorogrupo B), 05 (sorogrupo B), 07(sorogrupo Ci), 08 (sorogrupo C2) e 09 (sorogrupo D). Similar à Figura 6,exceto aumentado nas respostas menores. Notar que a resposta de anti-05 estáabaixo do ponto de corte. Veja para detalhes legenda de Fig. 6.

Figura 8. Comparação de glóbulos revestidos com doisbateladas de oxidação diferentes de LPS oxidado de S. enterítidis (refletindosorogrupo D.) e S. goldcoast (refletindo sorogrupo C2), S. Iivingstone(refletindo sorogrupo Ci) e S. typhimurium (refletindo sorogrupo Β). Orevestimento foi testado com anti-soros monoclonais comercialmentedisponíveis contra 05 (sorogrupo B), 07 (sorogrupo Ci), 08 (sorogrupo C2) e09 (sorogrupo D).

Figura 9. Análise de líquido extraído (drip) de carne e soro degalinhas. Anti-soros comercialmente disponíveis usados para injetar líquidoextraído de carne e soro. Drip, líquido extraído coletado de tecido muscularde uma galinha, que foi testado como livre de Salmonella usando métodosISO padrão; Drip+CH-SPF, líquido extraído (drip) que foi injetado com sorocoletado de galinhas livres de patógeno específico (SPF); CH-SPF, soroobtido de galinhas livres de patógeno (SPF); DripSPA- PG, líquido extraídoque foi injetado com anti-soro reativo com S. pullorum e S. gallinarum; SPA-PG, anti-soro anti-S. pullorum e anti-S. gallinarum·, DripCHSi, líquidoextraído que foi injetado com soro de galinha que era sorologicamentepositivo para uma infecção de S. infantis·, CH-Si, soro de galinhasorologicamente positivo para S. infantis. O eixo X indica o tipo deconjugação de LPS dos glóbulos individuais. Veja Figuras 6, 7 e 8 para maisdetalhes.

Figura 10. Análise de soros de suíno injetados com e anti-S.typhimurium (barras coloridas de amarelo) e anti-S. Iivingstone (barrascoloridas de ciano) comercialmente disponíveis. Em adição, glóbulos emsolução tampão (barras coloridas de azul) c soro de suíno negativo (barreiscoloridas de púrpura) foram analisados sobre glóbulos que estavam revestidoscom LPS representando sorogrupos B, Ci, C2 e D.

Figura 11. Ligação de bacteriófago FOl em LPS imobilizadode S. typhimurium, S. enteritidis, S. goldcoast e S. Iivingstone em umbiossensor SPR Biacore. PFU, unidades de formação de placa bacteriana.

Figura 12. Ligação de bacteriófago FOl em chip biossensorSPR revestido com LPS de S. typhimurium após incubação de S. typhimurium,S. enteritidis, S. goldcoast, S. Livingstone com 1,2x109 PFU de bacteriófagosFO1. Linha tracejada indica o valor de corte.

Figura 13. Incubação de bactérias degradadoras e patógenosde alimento diferentes na presença de bacteriófago FOl específico paraSalmonella spp. Durante crescimento a densidade óptica em λ 600 nm comouma medida de crescimento bacteriano foi monitorada. bl+FOl, meio brancodestituído de bactérias suplementado exclusivamente com bacteriófagos.

Figura 14. Incubação de sorovares de Salmonella diferentesna presença de bacteriófago FOl específico para Salmonella spp. Veja paramais detalhes a legenda de Fig. 13.

Figura 15. Incubação de bactérias degradadoras e patógenosde alimento diferentes na presença de bacteriófago FOl específico paraSalmonella spp. O número de unidade de formação de placa bacteriana (PFU)foi determinado após uma incubação de 5 h. bl+FOl, meio branco destituídode bactérias suplementado exclusivamente com bacteriófagos.

Figura 16. Incubação de sorovares de Salmonella diferentesna presença de bacteriófago FOl específico para Salmonella spp. Veja paramais detalhes a legenda de Fig. 13. Estoque de FOl não foi incubado.

Figura 17. Análise por biossensor SPR de bacteriófago FOlpropagado em sorovares de Salmonella diferentes após concentração e diálisedos vírus. As suspensões foram serialmente diluídas e analisadas; asconcentrações finais de bacteriófagos concentrados / diluídos são indicadas noeixo X.

Figura 18. Oxidação de grupo carboidrato. R' e R indicam asposições distai e proximal, respectivamente, na cadeia de carboidrato.

Figura 19. Conjugação em uma molécula contendo poliamina(R"), tal como uma proteína

Figura 20. Imobilização em glóbulos fluorescentes eestabilização de ligações químicas.

Figura 21. Representação esquemática do procedimento decopulação de LPS em glóbulos e análise de soro.

Figura 22a. Exemplos de bacteriófagos infectadores deCampylobacter.

Figura 22b. Exemplos de bacteriófagos infectadores deListeria.

Figura 22c. Exemplos de bacteriófagos infectadores deSalmonella.

Figura 23. Câmara de contagem e técnica.

Figura 24. Área total de uma câmara de contagem de Bürker-Türk (A) de 1 mm2, na qual B representa a área de 1/16 da área total.

Figura 25. Efeito de concentração de periodato sobre aimobilização de LPS de S. enteritidis sobre um chip biossensor SPR.

Figura 26. Efeito de concentração de periodato sobre aatividade antigênica de LPS imobilizado de S. enteritidis (batelada Se2002.1).LPS foi imobilizado em um chip biossensor e analis ado em um biossensorSPR (Fig. 25). Faixa testada foi 0,2 mM a 1,8 mM de periodato de sódio. 09,012, O poly A-S, S. typh, SE, resposta de biossensor de anti-soros anti-09;anti-soros anti-012, anticorpo policlonal contra sorogrupos A a S,soro degalinha positivo para S. typhimurium e soro de galinha positivo para S.enteridis, respectivamente.Figura 27. Efeito de concentração de periodato sobre aatividade antigênica de LPS imobilizado de S. enteritidis (batelada Se2002.1).Faixa testada foi 1,8 mM a 48,6 mM de periodato de sódio. Veja para maisdetalhes Fig. 26.

Figura 28. Efeito de concentração de periodato sobre aimobilização de LPS de S. goldcoast sobre um chip biossensor, SPE.

Figura 29. Efeito de concentração de periodato sobre aatividade antigênica de LPS imobilizado de S. goldcoast (batelada Sg2002.1).LPS foi imobilizado em um chip biossensor e analisado em um biossensorSPR (Fig. 28). Faixa testada foi 0,2 mM a 5,4 mM de periodato de sódio.06,7, 08, O poly A-S, S. livingstone, S. infantis, resposta de biossensor deanti-soros anti-06/7; anti-soros anti-08, anticorpo policlonal contrasorogrupos A a S, soro porcino positivo para S. livingstone e soro de galinhapositivo para S. infantis, respectivamente.

Figura 30. Efeito de concentração de periodato sobre aimobilização de LPS de S. livingstone sobre um chip biossensor SPR.

Figura 31. Efeito de concentração de periodato sobre aatividade antigênica de LPS imobilizado de S. goldcoast (batelada Sg2002.1).LPS foi imobilizado em um chip biossensor e analisado em um biossensorSPR (Fig. 30). Faixa testada foi 0,2 mM a 5,4 mM de periodato de sódio.06,7, 08, O poly A-S, S. livingstone, S. infantis, resposta de biossensor deanti-soros anti-06/7; anti-soros anti-08, anticorpo policlonal contrasorogrupos A a S, soro porcino positivo para S. livingstone e soro de galinhapositivo para S. infantis, respectivamente.

Figura 32. Apresentação esquemática do procedimento.

Figura 33. Folha de qualidade para processo de extração deLPS.

Figura 34. Imobilização de LPS em superfície de biossensor eestabilização de ligações químicas.Figura 35. Biacore 3000 control software em COM 1.

Figura 36. Immobilization wizard.

Figura 37. Immobilization test wizard.

Figura 38. Logging [conexão].

Figura 39. Sensorgrama típico de imobilização de LPS.

Pontos de relatório: 1. linha base; 2. ativação EDC/NHS; 3 carbohidrazida; 4etanol-amina; 5 Imobilização de LPS Se.

Figura 40. Sensorgrama de anti-O Poly A-S de Salmonellaanalisado em um chip CM5 contendo LPS.

Figura 41. Respostas sorológicas típicas de soros deaglutinação e anti-soros de Salmonella específicos para grupo em um chipbiossensor CM5 contendo imobilizado hemoglobina - LPS de S. goldcoast.

Figura 42. Respostas sorológicas típicas de soros de referênciade ave (soros SPF-CH, EIA St, EIA Se, SPA -PG e CH-Si) e soros dereferência de suíno (soros SW) em um chip biossensor CM5 contendoimobilizado hemoglobina - LPS de S. goldcoast.

Figura 43. Respostas de linha base típicas de um chipbiossensor CM5 contendo imobilizado hemoglobina - LPS de S. goldcoast.

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Claims (36)

1. Método para imobilizar um polissacarídeo sobre umcarreador, caracterizado pelo fato de compreender contatar o citadopolissacarídeo com um agente oxidante e um polímero compreendendo pelomenos dois grupos amina e/ou amida para obter um complexo depolissacarídeo-polímero e copular o citado complexo de polissacarídeo-polímero com o citado carreador.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o citado polímero é proteína.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o citado polissacarídeo é derivado de umabactéria gram-negativa.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--3, caracterizado pelo fato de que o citado polissacarídeo é derivado de umaEnterobacteriaceae.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo fato de que o citado polissacarídeo é derivado de uma(sub)espécie de Salmonella.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de que o citado polissacarídeo é umlipolissacarídeo.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-6, caracterizado pelo fato de que a citada proteína é hemoglobina oumioglobina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-7, caracterizado pelo fato de que o citado agente oxidante é m-periodato (desódio).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender ativar a superfíciede citado Carreador.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 9, caracterizado pelo fato de que o citado carreador compreende umasuperfície de vidro revestida com ouro.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 10, caracterizado pelo fato de que o citado carreador é modificado com umrevestimento compreendendo um doador de grupo carboxila, preferivelmenteuma camada de dextrano carboximetilado.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o citado doador de grupo carboxila e/ou a camada dedextrano é ativado(a) com cloridrato de l-etil-3-(3-dimetil-amino-propil)-carbodiimida, N-hidróxi-succinimida e carboidrazida.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos dois polissacarídeosdiferentes.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 13, caracterizado pelo fato de que o citado carreador é um chip debiossensor.

15. Carreador, caracterizado pelo fato de ser obtido pelométodo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.

16. Carreador, caracterizado pelo fato de compreender umcomplexo de polissacarídeo-polímero imobilizado sobre sua superfície.

17. Carreador de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de compreender um revestimento compreendendo um doador degrupo carboxila, preferivelmente um dextrano carboximetilado, ligado em umpolissacarídeo compreendendo um antígeno, no qual o citado doador de grupocarboxila e o citado polissacarídeo estão ligados um no outro via um polímerocompreendendo pelo menos dois grupos amina e/ou amida, no qual pelomenos o citado polissacarídeo é ligado no citado polímero via um diol vicinaloxidado por periodato sobre o citado políssacarídeo e um grupo amina e/ouamida sobre o citado polímero.

18. Carreador de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de ser uma microesfera ou um glóbulo.

19. Carreador de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a citada microesfera ou o citado glóbulo é uma microesferaou um glóbulo de poliestireno.

20. Carreador de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-19, caracterizado pelo fato de ser codificado.

21. Carreador de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de ser codificado pela presença de certo marcador.

22. Carreador de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o citado marcador compreende uma cor.

23. Carreador de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a citada cor é uma cor fluorescente ou fosforescente.

24. Coleção de microesferas ou de glóbulos, caracterizada pelofato de compreender pelo menos duas microesferas ou dois glóbulosdiferentemente codificadas(os) de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20-23.

25. Coleção de microesferas ou de glóbulos de acordo com areivindicação 24, caracterizada pelo fato de que cada uma das(os) citadas(os)microesferas ou glóbulos diferentemente codificadas(os) compreende umpolíssacarídeo que compreende um antígeno diferente.

26. Biossensor, caracterizado pelo fato de compreender umcarreador como definido na reivindicação 15 ou 23.

27. Sistema de detecção por Ressonância de Plasmon deSuperfície, caracterizado pelo fato de compreender um biossensor de acordocom a reivindicação 26.

28. Método para determinar a presença de um anticorpodirecionado para um antígeno de uma bactéria gram-negativa em umaamostra, caracterizado pelo fato de compreender contatar a citada amostracom um carreador como definido em qualquer uma das reivindicações 15 ou-23 ou com um biossensor como definido na reivindicação 26 e determinar seo carreador tem ligado algum anticorpo.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que a citada amostra é sangue, material líquido derivado desangue, fluidos derivados de tecido, tais como líquido gotejado de carne, leite,ovos, fluidos de um olho, saliva ou fezes.

30. Método para determinar a presença de uma bactéria gram-negativa em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender contatar acitada amostra com uma quantidade predeterminada de anticorposdirecionados contra um antígeno de citada bactéria e determinar a quantidadede anticorpos não ligados na citada bactéria com um carreador como definidona reivindicação 15 ou 23 ou com um biossensor como definido nareivindicação 26.

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-28 a 30, caracterizado pelo fato de que a ligação em citado carreador oucitado biossensor é determinada por Ressonância de Plasmon de Superfície.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-28 a 31, caracterizado pelo fato de que a citada amostra é obtida de umhumano ou de um animal.

33. Método para determinar a presença de uma bactéria gram-negativa em uma amostra, caracterizado pelo fato de compreender:- contatar a citada amostra com bacteriófagos específicospara bactérias alvo e permitir que os bacteriófagos infectem a citada amostra,remover os bateriófagos não-ligados e/ou não-invasoresresultando em uma amostra infectada por bacteriófago,contatar a citada amostra infectada por bacteriófago comum organismo indicador suscetível aos bacteriófagos usados,incubar durante pelo menos um ciclo de multiplicação debacteriófago,recuperar os bacteriófagos para obter uma amostracontendo bacteriófago,analisar a citada amostra contendo bacteriófago com umcarreador como definido na reivindicação 15 ou 23 ou com um biossensorcomo defindio na reivindicação 26.

34. Método de acordo com a reivindicações 33, caracterizadopelo fato de que a citada amostra é obtida de um humano, uma planta ou umanimal.

35. Método de acordo com a reivindicação 33 e 34,caracterizado pelo fato de que o citado bacteriófago compreende umbacteriófago da figura 22a, 22b e/ou 22c.

36. Carreador de acordo com qualquer uma das reivindicações 15-23, caracterizado pelo fato de compreender um bacteriófago da figura 22a, 22b e/ou 22c.