BRPI0610794A2 - métodos para diagnosticar uma susceptibilidade a um cáncer e para predizer um risco aumentado de cáncer, kit para ensaiar uma amostra de um indivìduo para detectar uma susceptibilidade a um cáncer, e, métodos para diagnosticar um risco aumentado de cáncer e para diagnosticar um cáncer associado com chr8q24.21 - Google Patents

Abstract

METODOS PARA DIAGNOSTICAR UMA SUSCEPTIBILIDADE A UM CáNCER E PARA PREDIZER UM RISCO AUMENTADO DE CáNCER, KIT PARA ENSAIAR UMA AMOSTRA DE UM INDIVìDUO PARA DETECTAR UMA SUSCEPTIBILIDADE A UM CáNCER, E, METODOS PARA DIAGNOSTICAR UM RISCO AUMENTADO DE CáNCER E PARA DIAGNOSTICAR UM CáNCER ASSOCIADO COM CHR8Q24.2 1. Um locus em cromossomo 8q24.2 1 foi demonstrado como desempenhando um papel principal em formas particulares de câncer. Foi descoberto que alguns marcadores e haplótipos são indicativos de uma susceptibilidade a cânceres particulares. As aplicações diagnósticas paraidentificar a susceptibilidade a câncer são descritas.

Description

"MÉTODOS PARA DIAGNOSTICAR UMA SUSCEPTIBILIDADE A UMCÂNCER E PARA PREDIZER UM RISCO AUMENTADO DE CÂNCER,KIT PARA ENSAIAR UMA AMOSTRA DE UM INDIVÍDUO PARADETECTAR UMA SUSCEPTIBILIDADE A UM CÂNCER, E, MÉTODOSPARA DIAGNOSTICAR UM RISCO AUMENTADO DE CÂNCER EPARA DIAGNOSTICAR UM CÂNCER ASSOCIADO COM CHR8Q24.21"

Pedidos relacionados

Este pedido refere-se ao Pedido Provisional dos E.U.A. n°60/682.147, depositado em 18 de maio de 2005, e Pedido Provisional dosE.U.A. n° 60/795.768, depositado em 28 de abril de 2006. Os ensinamentoscompletos dos pedidos acima são incorporados aqui por referência.

Anterioridades da invenção

Câncer, o crescimento incontrolado de células malignas, é umproblema de saúde importante da era médica moderna e é uma das causasprincipais de morte em países desenvolvidos. Nos Estados Unidos, uma emcada quatro mortes é causada por câncer (Jemal, A. et ai., CA Câncer J. Clin.52:23-47 (2002)).

A incidência de câncer da próstata aumentou drasticamente aolongo das últimas décadas e câncer da próstata é agora a causa predominantede morte nos Estados Unidos e na Europa Oriental (Peschel, R.E. e J. W.Colberg, Lancet 4:233-41 (2003); Nelson, W.G. et a 1, N. Engl J. Med.349(4):366-81 (2003)). Câncer da próstata é a malignidade maisfreqüentemente diagnosticada em homens de países industrializados, e nosEstados Unidos, 1 em cada 8 homens desenvolverá câncer da próstata durantesua vida (Simard, J. et ai, Endocrinology 143 (6), 2029-40 (2002)). Emborafatores ambientais, como fatores dietéticos e fatores relacionados com o estilode vida, contribuam para o risco de câncer da próstata, mostrou-se que fatoresgenéticos também desempenham um papel importante. Efetivamente, umahistória familiar positiva encontra-se entre os mais fortes fatores de riscoepidemiológico para câncer da próstata, e estudos em gêmeos comparando aocorrência concordante de câncer da próstata em gêmeos monozigóticosrevelaram consistentemente um componente hereditário mais forte no risco decâncer da próstata do que em qualquer outro tipo de câncer (Nelson, W.G. etal., N. Engl. J. Med. 349(4):366-81 (2003); Lichtenstein P. et al, N. Engl. J.Med. 343(2):78-85 (2000)). Adicionalmente, observa-se um riscoincrementado de câncer da próstata em parentes de I0 a 5o grau com casos decâncer da próstata em um estudo de âmbito nacional relativamente àfamiliaridade de todos os casos de câncer diagnosticados na Islândia de 1955-2003 (Amundadottir et al, PLoS Medicine l(3):e65 (2004)). A base genética7 para esta doença, enfatizada pelo risco incrementado entre parentes, écorroborada adicionalmente por estudos de câncer da próstata entrepopulações particulares: por exemplo, afro-americanos encontram-se entre osque apresentam maior incidência de câncer da próstata e taxa de mortalidadeatribuível a esta doença: eles apresentam 1,6 vezes mais probabilidade dedesenvolver câncer da próstata e 2,4 vezes mais probabilidade de morrer destadoença do que europeus-americanos (Ries, L.A.G. et al., NIH Pub. n° 99-4649 (1999)).

Elementos do sexo masculino com câncer da próstata sãoafetados, em média, por uma redução de 40% da expectativa de vida. Sedetectado precocemente, antes da metástase e disseminação local além dacápsula, o câncer da próstata pode ser curado (p. ex., usando cirurgia). Noentanto, se diagnosticado após espalhamento e metástase da próstata, câncerda próstata é tipicamente uma doença fatal com baixas taxas de cura. Emboraseleção à base de antígeno específico para próstata (antígeno específico parapróstata (PSA, prostate specific antigerí) tenha auxiliado no diagnósticoprecoce de câncer da próstata, ela não é altamente sensível nem específica(Punglia et al, N Engl J Med. 349(4):335-42 (2003)). Isto significa que umelevado percentual de diagnósticos falsos negativos e falsos positivos estáassociado com o teste. As conseqüências compreendem, em muitos casos,cânceres não detectados e biópsias de acompanhamento [follow-up] paraaqueles sem câncer. Até de 65 a 85% dos indivíduos (dependendo da idade)com câncer da próstata apresentam um valor de PSA inferior ou igual a 4,0ng/ml, que foi usado tradicionalmente como o limite superior para um nívelnormal de PSA (Punglia et al, N Engl J Med. 349(4):335-42 (2003);Cookston, M.S., Câncer Control 8(2): 133-40 (2001); Thompson, I.M. et al,N Engl J Med. 350:2239-46 (2004)). Uma fração significativa daquelescânceres com baixos níveis de PSA recebeu um escore de Gleason de grau 7ou maior, que é uma medida de um câncer da próstata agressivo. Id.

Adicionalmente ao problema de sensibilidade delineado acima,testes com PSA também apresentam dificuldade com relação a especificidadee predição de prognóstico, níveis de PSA podem ser anomais naqueles semcâncer da próstata. Por exemplo, hiperplasia prostática benigna (BPH, benignprostatic hyperplasia) é uma causa comum de um teste de PSA falso-positivo.

Adicionalmente, diversas condições não-câncer podem elevar níveis séricosde PSA, incluindo retenção urinária, prostatite, massagem vigorosa dapróstata e ejaculação. Id.

Confirmação subseqüente de câncer da próstata usando biópsiacom agulha em pacientes com níveis positivos de PSA é difícil se o tumor forpequeno demais para ser observado com ultrassom. Colhe-se tipicamenteamostras randômicas múltiplas, mas o diagnóstico de câncer da próstata podefalhar devido à amostragem de apenas pequenas quantidades de tecido.

Exame retal digital (DRE, Digital Rectal Examination) também não detectamuitos cânceres porque somente o lobo posterior da próstata é examinado.Como cânceres precoces não são palpáveis, cânceres detectados por meio deDRE já podem ter se espalhado para fora da próstata (Mistry KJ., Am. BoardFam. Pract. 16(2):95-101 (2003)).

Assim, há claramente uma grande necessidade deprocedimentos diagnósticos aperfeiçoados que poderiam facilitar detecção eprognóstico de câncer da próstata em estágio precoce, e também de auxílioem tratamentos preventivos e curativos da doença. Adicionalmente, hánecessidade de se desenvolver ferramentas para identificar melhor aquelespacientes com maior probabilidade de apresentarem formas agressivas decâncer da próstata daqueles pacientes com maior probabilidade deapresentarem formas mais benignas de câncer da próstata que permanecemlocalizadas no interior da próstata e que não contribuem significativamentepara a morbidez ou mortalidade. Isto poderia auxiliar a evitar procedimentosinvasivos e onerosos para pacientes que não se encontrem em riscosignificativo.

Câncer de mama é um problema de saúde significativo paramulheres nos Estados Unidos e em todo o mundo. Embora se haja realizadoavanços na detecção e tratamento da doença, câncer de mama permanecesendo a segunda causa principal de mortes relacionadas com câncer emmulheres, afetando mais de 180.000 de mulheres nos Estados Unidos a cadaano. Para mulheres na América do Norte, a probabilidade ao longo de toda avida de apresentarem câncer de mama é agora de uma em oito.

Presentemente, não há nenhum método universalmente bemsucedido para o tratamento ou prevenção de câncer de mama. Ogerenciamento do câncer de mama baseia-se correntemente numa combinaçãode diagnóstico precoce (p. ex., por meio de procedimentos rotineiros deexame da mama) e tratamento agressivo, que pode incluir um ou mais dentrevários tratamentos, como cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapiahormonal. O curso de tratamento para um câncer de mama particular éfreqüentemente selecionado com base numa variedade de parâmetrosprognósticos incluindo uma análise de marcadores de tumor específicos. Ver,p. ex., Porter-Jordan e Lippman, Breast Câncer 5:73-100 (1994).

Embora a descoberta de BRCAl e BRCA2 tenha representadoetapas importantes na identificação de fatores genéticos-chave envolvidos nocâncer de mama, ficou claro que mutações em BRCAl e BRCA2 contribuemapenas para uma fração da suscetibilidade herdada para o câncer de mama(Nathanson, K.L. et al., Human Mol. Gen. 10(7):715-720 (2001); AnglicanBreast Câncer Study Group. Br. J. Câncer 83(10:1301-08 (2000); eSyrjakoski K. et al, J. Natl. Câncer Inst. 92: 1529-31 (2000)). Apesar deconsiderável pesquisa em terapias para câncer de mama, o câncer de mamapermanece difícil de diagnosticar e tratar efetivamente, e a alta mortalidadeobservada em pacientes com câncer de mama indica a necessidade deaperfeiçoamentos no diagnóstico, tratamento e prevenção da doença.

deCODE demonstrou um risco incrementado de câncer demama em parentes de I0 a 5o grau de casos de câncer de mama em um estudode âmbito nacional sobre a familiaridade de todos os cânceres diagnosticadosna Islândia de 1955 a 2003 (Amundadottir et al, PLoS Med. I(3):e65 (2004);Lichtenstein P. et al, N. Engl J. Med. 343(2):78-85 (2000)), em que osautores mostram que câncer de mama apresenta uma das mais elevadashereditariedades de todos os cânceres testados numa coorte de quase 45.000gêmeos.

Câncer do pulmão causa mais mortes de câncer em todo omundo do que qualquer outra forma de câncer (Goodman, G.E., Thorax57:994-999 (2002)). Nos Estados Unidos, câncer do pulmão é a causaprimária de morte por câncer entre homens e mulheres. Em 2002, estimou-seque a taxa de morte por câncer do pulmão foi de 134.900 mortes, excedendo ototal combinado de câncer de mama, de próstata e de colo. Id. Câncer dopulmão também é a causa principal de morte por câncer em todos os paíseseuropeus e está crescendo rapidamente em países em desenvolvimento.

Embora fatores ambientais, como fatores de estilo de vida (p. ex., hábito defumar) e fatores dietéticos, desempenhem um papel importante no câncer dopulmão, fatores genéticos também contribuem para a doença. Por exemplo,uma família de enzimas responsável pela ativação de carcinógeno, degradaçãoe subseqüente reparo de DNA foi implicada na suscetibilidade a câncer dopulmão. Id. Adicionalmente, geneticistas da deCODE mostraram um riscoincrementado para membros familiares fora da família nuclear ao analisaremtodos os casos de câncer do pulmão diagnosticados na Islândia ao longo de 48anos. Este risco incrementado não pôde ser atribuído inteiramente ao fumo,indicando que variantes genéticas podem predispor determinados indivíduos acâncer do pulmão (Jonson et al, JAMA 292(24):2977-83 (2004);Amundadottir et al, PLoS Med. I(3):e65 (2004)).

A taxa de sobrevida de cinco anos entre todos os pacientescom câncer do pulmão, independentemente do estágio da doença sendodiagnosticada, é de apenas 13%. Isto contrasta com uma taxa de sobrevida decinco anos de 46% entre casos detectados enquanto a doença ainda élocalizada. No entanto, apenas 16% dos cânceres de pulmão são descobertosantes da doença espalhar-se. A detecção é difícil porque freqüentemente nãose observa sintomas clínicos até que a doença tenha atingido um estágioavançado. Correntemente, o diagnóstico é auxiliado pelo uso de raios-X dotórax, análise do tipo de células contidas no esputo, e exame por fibra ópticadas passagens bronquiais. Regimes de tratamento são determinados de acordocom o tipo e o estágio do câncer, e incluem cirurgia, terapia de radiação e/ouquimioterapia. Apesar de considerável pesquisa em terapias para este e outroscânceres, o câncer do pulmão permanece difícil de diagnosticar e de tratarefetivamente. Assim, há uma grande necessidade de métodos aperfeiçoadospara a detecção e o tratamento de referidos cânceres.

A incidência de melanoma maligno está crescendo maisrapidamente do que qualquer outro tipo de câncer humano na América doNorte (Armstrong et al., Câncer Surv. 19-20:219-240 (1994)). Embora omelanoma seja curável quando identificado em um estágio precoce, ele requerdetecção e remoção do tumor primário antes que se espalhe para locaisdistantes. Melanomas malignos apresentam maior propensão a metástase esão notoriamente resistentes a tratamentos de câncer convencionais, comoquimioterapia e irradiação. Uma vez ocorridas metástases, o prognóstico émuito ruim. Assim, a detecção precoce de melanoma é de importância vital notratamento e controle de melanoma.

Estudos demonstraram que fatores genéticos desempenhamum papel importante no melanoma. Estudos baseados na população da Suéciae da Islândia reportam uma relação de incidência padronizada deaproximadamente 2 em parentes de primeiro grau (Hemminki K., J. Invest.Dermatol. 120(2):217-23 (2003); Amundadottir et al., PLoS Med. I(3):e65(2004)). Casos familiares tendem a apresentar idades mais precoces de inícioe um maior risco de tumores primários múltiplos, sugerindo também umcomponente genético (ver, p. ex., Tucker M., Oncogene 22(20):3042-52(2003)). Uma interação de fatores de risco genéticos e ambientaisprovavelmente desempenhará um papel importante no melanoma. No entanto,os mecanismos moleculares e biológicos de como um melanócito normal setransforma em uma célula de melanoma permanecem obscuros.

Claramente, a identificação de marcadores e genes que sãoresponsáveis pela suscetibilidade a formas particulares de câncer (p. ex.,câncer da próstata, câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) é um dosprincipais desafios que a oncologia enfrenta hoje em dia. Há uma necessidadede identificar meios para a detecção precoce dos indivíduos que apresentamuma suscetibilidade genética ao câncer, de modo que é possível instituirregimes de intervenção e triagem mais agressivos para a detecção precoce etratamento de câncer. Genes de câncer também podem revelar vias'moleculares-chaves que podem ser manipuladas (p. ex., usando-se drogascom pesos moleculares pequenos ou grandes) e podem levar a tratamentosmais efetivos independentemente do estágio do câncer quando um câncerparticular é diagnosticado primeiro.Sumário da invenção

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no câncer (p. ex., câncer dapróstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma). Verificou-se que marcadores particulares e/oucombinações de marcadores genéticos ("haplótipos") em um segmento deDNA específico no interior do lócus são indicativos de suscetibilidade acânceres particulares.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar uma suscetibilidade a um câncer em um sujeito, compreendendodetectar um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que apresença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade aocâncer. Em concretizações particulares, a invenção é um método dediagnosticar uma suscetibilidade a um câncer selecionado do grupo queconsiste de câncer da próstata, câncer de mama, câncer do pulmão emelanoma.

Em determinadas concretizações, o marcador ou haplótipo queé indicativo de câncer ou de uma suscetibilidade a câncer, compreende pelomenos um marcador selecionado do grupo que consiste dos marcadoreslistados na Tabela 13. Em outras concretizações, o método compreendedetectar um haplótipo que consiste de pelo menos dois dos marcadores naTabela 13.

Em uma concretização, a presença de um marcador ouhaplótipo (p. ex., um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A) éindicativa de uma taxa de resposta diferente para uma modalidade detratamento particular (p. ex., um agente terapêutico particular, droga anti-hormonal, um agente quimioterápico, tratamento com radiação). Assim,determinando se um sujeito porta um marcador ou haplótipo, é possíveldeterminar se aquele sujeito responderá melhor ou pior a um terapêuticoespecífico, droga anti-hormonal e/ou terapia de radiação usada para tratarcâncer.

Em uma concretização, a presença de um marcador ouhaplótipo (p. ex., um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A) éindicativa de uma predisposição a um rearranjo somático de Chr8q24.21 (p.ex., um ou mais dentre uma amplificação, uma translocação, uma inserçãoe/ou deleção) em um tumor ou seu precursor.

Em uma concretização, o marcador ou haplótipo compreendeum ou mais marcadores associados com Chr8q24.21 em desequilíbrio deligação (definido como o quadrado do coeficiente de correlação, r2, maior doque 0,2) com um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dosmarcadores listados na Tabela 13.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar uma suscetibilidade a um câncer (p. ex., câncer da próstata (p.ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma) compreendendo detectar um marcador ou haplótipo associadocom Chr8q24.21, sendo que a presença do marcador ou haplótipo é indicativade uma suscetibilidade a câncer.

Em uma concretização, a invenção é um método de predizerum risco incrementado de câncer agressivo da próstata (p. ex., apresentandoum escore de Gleason de 7(4+3) a 10, um estágio incrementado, um resultadopior) em um sujeito compreendendo detectar um marcador ou haplótipoassociado com LD Bloco A, sendo que a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de um risco incrementado de câncer agressivo da próstata. Emconcretizações particulares, o sujeito foi diagnosticado com câncer da próstataou ainda não foi diagnosticado com câncer da próstata.

Em uma concretização, o marcador ou haplótipo apresenta umrisco relativo maior do que um, i.e. o marcador ou haplótipo confere riscoincrementado de câncer (o marcador ou haplótipo encontra-se em risco).Em outra concretização, o marcador ou haplótipo apresenta umrisco relativo inferior a um, i.e. o marcador ou haplótipo confere um riscodiminuído de câncer (o marcador ou haplótipo é protetor).

Em uma concretização, a invenção é um kit para analisar umaamostra (p. ex., tecido, sangue) de um sujeito para detectar umasuscetibilidade herdada a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma).

Referidos kits compreendem um ou mais reagentes para detectar um marcadorou haplótipo associado com LD Bloco A. Em uma concretização particular,referidos reagentes compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeoscontígua que é completamente complementar a uma região compreendendopelo menos um dos marcadores selecionados do grupo que consiste dosmarcadores listados na Tabela 13. Em uma concretização particular, referidosreagentes compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeos contíguaque é completamente complementar a uma região compreendendo o alelo Ade rs 1447295 ou o alelo 8 de DG8S737.

Em uma concretização, a invenção é um método paradiagnosticar um risco incrementado de câncer (p. ex., câncer da próstata (p.ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma) em um sujeito, compreendendo selecionar um marcador ouhaplótipo associado com LD Bloco A, sendo que o marcador ou haplótipoestá presente com maior freqüência em um sujeito apresentando o câncer doque em um sujeito não apresentando o câncer, e sendo que a presença domarcador ou haplótipo aumenta o risco do sujeito em apresentar o câncer. Emconcretizações particulares, o risco é incrementado em pelo menos cerca de5%, ou o aumento do risco é identificado como um risco relativo de pelomenos cerca de 1,2.

Em uma concretização, a invenção é um método paradiagnosticar uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma)em um sujeito, compreendendo obter uma amostra de ácido nucleico de umsujeito e analisar a amostra de ácido nucleico quanto à presença ou ausênciade pelo menos um marcador ou haplótipo, sendo que o marcador ou haplótipocompreende um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dosmarcadores listados na Tabela 13. Nesta concretização, a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade ao câncer.

Em uma concretização, a invenção é um método paradiagnosticar uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma)em um sujeito, compreendendo obter uma amostra de ácido nucleico dosujeito e analisar a amostra de ácido nucleico quanto à presença ou ausênciade pelo menos um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidadeao câncer. Em uma concretização particular, o marcador ou haplótipocompreende um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dosmarcadores listados na Tabela 13. Em outra concretização, o marcador ouhaplótipo apresenta um risco relativo maior do que um e compreende o alelo8 de DG8S737 ou o alelo A de rsl447295.

Em uma concretização, a invenção é um método paradiagnosticar uma suscetibilidade ao câncer em um sujeito, compreendendoanalisar uma amostra de ácido nucleico obtida do sujeito quanto à presença depelo menos um marcador ou haplótipo associada com LD Bloco A, sendo quea presença do marcador ou haplótipo é indicativa de suscetibilidade ao câncer.

Em uma concretização particular, o marcador ou haplótipo compreende umou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dos marcadores naTabela 13. Em outra concretização, o marcador ou haplótipo apresenta umrisco relativo maior do que um e compreende o alelo 8 de DG8S737 ou oalelo A de rs 1447295. Em outra concretização, o sujeito é de ancestralidadeafricana negra.

Em uma concretização da invenção, o câncer é selecionado dogrupo que consiste de câncer da próstata, câncer de mama, câncer do pulmãoe melanoma. Em uma concretização preferida, o câncer é câncer da próstata, eo marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo de pelo menos 1,5. Emoutra concretização, o câncer da próstata é um câncer agressivo da próstatacomo definido por uma classificação combinada de Gleason de 7(4+3)-10.

Em outra concretização, o câncer da próstata é um câncer menos agressivo dapróstata como definido por uma classificação combinada de Gleason de 2-7(3+4). Em outra concretização adicional, a presença do marcador ouhaplótipo é indicativa de um câncer mais agressivo da próstata e/ou umprognóstico pior. Em outra concretização, o câncer é câncer de mama, e omarcador ou haplótipo apresenta um risco relativo de pelo menos 1.3. Emoutra concretização, o câncer é câncer do pulmão, e o marcador ou haplótipoapresenta um risco relativo de pelo menos 1.3.

Em outra concretização adicional, o câncer é melanoma, e omarcador ou haplótipo apresenta um risco relativo de pelo menos 1,5. Emoutra concretização, o melanoma é melanoma cutâneo maligno.

Em outra concretização da invenção, a presença do marcadorou haplótipo é indicativa de uma taxa de resposta diferente do sujeito a umamodalidade de tratamento particular.

Em outra concretização, a presença do marcador ou haplótipoé indicativa de uma predisposição a uma redisposição somática deChr8q24.21 em um tumor ou seu precursor. Em uma concretização particular,a redisposição somática é selecionada do grupo que consiste de umaamplificação, uma translocação, uma inserção e uma deleção.

Em outra concretização da invenção o marcador ou haplótipousado para diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer compreende um oumais marcadores associados com Chr8q24.21 em forte desequilíbrio deligação, como definido por (|D'| >0.8) e/ou r > 0,2, com um ou maismarcadores selecionados do grupo que consiste dos marcadores na Tabela 13.Em uma concretização, o um ou mais marcadores é selecionado do grupo queconsiste dos marcadores na Tabela 13 compreende o alelo A de rs 1447295 ouo alelo 8 de DG8S737.

Em outra concretização, o pelo menos um marcador ouhaplótipo para diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer apresenta um riscorelativo inferior a um e compreende alelo T de rs 12542685 e alelo C ders 12542685. Em outra concretização, o pelo menos um marcador ou haplótipocompreende pelo menos um dos marcadores mostrados na Tabela 13apresentando um risco relativo inferior a um. Em uma concretizaçãopreferida, o câncer é câncer da próstata. Em outra concretização, o sujeito étem acestrais africanos negros.

Em uma concretização, a presente invenção refere-se a um kitpara analisar uma amostra de um sujeito para detectar uma suscetibilidade aum câncer, sendo que o kit compreende um ou mais reagentes para detectarum marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A. Em umaconcretização, o um ou mais reagentes compreendem pelo menos umaseqüência de nucleotídeos contígua que é completamente complementar auma região compreendendo pelo menos um dos marcadores selecionados dogrupo que consiste dos marcadores na Tabela 13. Em uma concretização, ocâncer é câncer da próstata.

Em uma concretização preferida, o um ou mais reagentescompreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeos contígua que écompletamente complementar a uma região compreendendo o alelo A ders 1447295 ou o alelo 8 de DG8S737. Em uma concretização particular, osujeito é tem acestrais africanos negros.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar câncer associado com Chr8q24.21 em um sujeito,compreendendo detectar a presença de um marcador ou haplótipo (p. ex., osmarcadores ou haplótipos aqui descritos) associado com Chr8q24.21, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa do câncer associadocom Chr8q24.21. Em concretizações particulares, o câncer associado comChr8q24.21 é câncer da próstata associado com Chr8q24.21, câncer de mamaassociado com Chr8q24.21, câncer do pulmão associado com Chr8q24.21 oumelanoma associado com Chr8q24.21.

Em outra concretização, a invenção é um método dediagnosticar suscetibilidade a câncer da próstata, ou um risco incrementado decâncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), por meio de detecçãodo marcador DG8S737 ou marcador rs 1447295, sendo que a presença doalelo-8 no marcador DG8S737 ou alelo A no marcador rsl447295, éindicativa de suscetibilidade a câncer da próstata ou risco incrementado decâncer da próstata. Em uma concretização adicional, a invenção é um métodode diagnosticar suscetibilidade a câncer da próstata em um humanoapresentando ancestralidade que inclui ancestralidade africana, por meio dedetecção do marcador DG8S737, sendo que a presença do alelo-8 nomarcador DG8S737 é indicativa de suscetibilidade a câncer da próstata.

Breve descrição dos desenhos

O precedente e outros objetos, particularidades e vantagens dainvenção se tornarão aparentes a partir da descrição mais particular deconcretizações preferidas da invenção, como ilustrado nos desenhos anexos.

FIG. 1 é uma varredura de ligação do cromossomo 8 ilustrandouma classificação LOD significativa ampla do genoma de 4,0 no cromossomo8q24.

FIG. 2 ilustra uma análise de associação de haplótipos noChr8q24.21 para câncer da próstata usando 352 marcadores demicrossatélites.

FIGS. 3 A e 3 B ilustram a estrutura LD (HAPMAP) na área dohaplótipo que se associa com câncer da próstata. Intervalos equivalentessignifica que cada marcador é mostrado numa ordem seqüencial comdistâncias iguais entre dois marcadores consecutivos (FIG. 3A). Posiçõesefetivas significa que o intervalo correto (construção [Build] 34 do NCBI)entre quaisquer dois marcadores é representado na figura (FIG. 3B).

FIG. 4 ilustra a estrutura LD islandesa. Intervalos equivalentessignifica que cada marcador é mostrado numa ordem seqüencial comdistâncias iguais entre dois marcadores consecutivos.

FIG. 5 ilustra esquematicamente a identificação de genesconhecidos mapeando para cromossomo 8q24.21.

FIG. 6A1-6A31 ilustra uma seqüência de DNA genômico decarcaça 128.414-128.506 da construção [Build] 34 do NCBI (SEQ ID NO: 1;construção [Build] 34, hgl6_chr8:1284140007-128506000. Filamento à frente[Forward] (+)). A numeração na FIG. 6, e também os bp [n.t.: sigla em inglêspara pares de bases] indicados nas tabelas ali contidas, referem-se àlocalização dentro do cromossomo 8 na construção [Build] 34 do NCBI.

FIGS. 7A-7D ilustram uma vista esquemática de resultados deassociação e ligação, densidade de marcador e estrutura de LD em uma regiãono cromossomo 8q24.21 para câncer da próstata. FIG. 7 A mostra resultadosde varredura de ligação para cromossomo 8q realizada com 871 Pacientesislandeses com câncer da próstata em 323 famílias estendidas. FIG. 7B ilustraresultados de associação de marcador simples para casos não relacionados decâncer da próstata (grupo de controle de caso 1, n=869), usando 358microssatélites e indels (diamantes azuis), distribuídos sobre uma região de 10Mb. FIG. 7C mostra resultados de associação de marcador simples para todosos casos de câncer da próstata (n=1291), caixas vermelhas indicam valores Ppara os 63 SNPs e 12 microssatélites adicionados nesta região, diamantesazuis indicam os valores para os outros marcadores já tipificados nesta regiãode 7B. FIG. 7D ilustra LD pareada da população HapMap de CEU (fase II)para a região de 600 kb da FIG. 7C, os triângulos cinzas no fundo indicam alocalização do gene c-MYC e o AWl 83883 EST discutido no texto principal.Uma escala para r2 é proporcionada à direita. Linhas verticais pretasrepresentam a densidade de microssatélites (FIG. 7B), e microssatélites eSNPs (FIG. 7C) usados na análise de associação.

FIG. 8 ilustra um rede filogenética de 46 SNPs e omicrossatélite DG8S737 para amostras de HapMap.

FIGS. 9A-9C ilustram desequilíbrio de ligação entre 17 SNPse o alelo -8 DG8S737 tipificado na CEU e populações afro-americanas. Odesequilíbrio de ligação (LD) dos 17 SNPs e o alelo -8 de DG8S737 émostrado para CEU- na FIG. 9A e coortes afro-americanas de Michigan em9B. Apresenta-se aqui o D' (lado esquerdo superior) e r2 (lado direitoinferior) entre pares de alelos. Marcadores são plotados com um distânciaigual entre os mesmos e localizações físicas dadas na FIG. 9C. Nomes demarcadores são mostrados no eixo vertical e posições de pares de bases noeixo horizontal.

FIG. 10 é uma representação esquemática das variantes derecomposição de AW identificadas. Exons são mostrados como caixas eíntrons como linhas. As transcrições estendem-se de 128,258-128,451 Mb noChr8q24. O comprimento dos éxons é como a seguir: éxon 1: 503 bp's; éxon2: 343 bp's; éxon 3: 103 bp's; éxon 4: 88 bp's; éxon 5: 371 bp's; éxon 6: 135bp's; éxon 6 long: 546 bp's; éxon 7: 140 bp's e éxon 8: 246 bp's. Observe-seque a figura não é desenhada em escala.

Descrição detalhada da invenção

Informação geológica estensiva para uma população contendopacientes de câncer foi combinada com poderosos métodos decompartilhamento de genes [gene sharing] para mapear um lócus nocromossomo 8q24.21, que, como se demonstrou, desempenha um papelimportante no câncer (p. ex., câncer de mama, câncer da próstata, câncer dopulmão, melanoma). Vários pacientes de câncer e seus parentes foramgenotipificados com um conjunto de marcadores por todo o genoma incluindo1100 marcadores de microsatélites, com uma densidade média de marcadorde 3-4 cM. Apresenta-se aqui resultados de uma pesquisa sobre toda aamplitude do genoma em busca de Ioci genéticos causativos para câncer (p.ex., câncer de mama, câncer da próstata, câncer do pulmão, melanoma).Loci associados com várias formas de câncer da próstata

A incidência de câncer da próstata aumentou drasticamente aolongo das últimas décadas. Câncer da próstata é uma doença multifuncionalcom componentes genéticos e ambientais envolvidos em sua etiologia. Ele écaracterizado por padrões de crescimento heterogêneos que compreendemdesde tumores de crescimento lento até lesões altamente metastáticas muitorápidas.

Embora fatores genéticos estejam entre os fatores de riscoepidemiológico mais fortes para câncer da próstata, a pesquisa paradeterminantes genéticos envolvidos na doença tem sido um desafio. Estudosrevelaram que a ligação de marcadores genéticos candidatos ao câncer dapróstata tem sido mais difícil do que identificar genes de suscetibilidade paraoutros cânceres, como câncer de mama, ovário e colo. Diversas razões forampropostas para esta dificuldade incrementada, incluindo: o fato de que ocâncer da próstata é freqüentemente diagnosticado numa idade tardiatornando, com isso, difícil obter amostras de DNA de indivíduos afetadosvivos há mais de uma geração; a presença em pedrigrees de alto risco defenocópias que estão associadas com uma falta de característicasdiferenciadoras entre formas hereditárias e esporádicas; e a heterogeneidadegenética de câncer da próstata e a dificuldade associada de desenvolvermodelos de transmissão estatísticos apropriados para esta doença complexa(Simard, J. et ai, Endocrinology 143 (6):2029-40 (2002)).

Realizou-se várias varreduras genômicas em busca de genes desuscetibilidade para câncer da próstata e reportou-se vários Ioci desuscetibilidade a câncer da próstata. Por exemplo, HPCl (Iq24-q25), PCAP(Iq42-q43), HCPX (Xq27-q28), CAPB (lp36), HPC20 (20ql3),HPC2/ELAC2 (17p 11) e 16q23 foram propostos como Ioci de suscetibilidadea câncer da próstata (Simard, J. et al., Endocrinology 143 (6)\2029-40 (2002);Nwosu, V. et al., Hum. Mol. Genet. 10(20):2313-18 (2001)). Em umavarredura genômica realizada por Smith et al., a evidência mais forte paraligação foi em HPC1, embora análise de dois pontos também tenha reveladouma classificação LOD > 1,5 em D4S430 e classificações LOD >1,0 emvários loci, incluindo marcadores em Xq27-28 (Ostrander E. A. e J.L.Stanford, Am. J. Hum. Genet. 67:1361-15 (2000)). Outra varredura de genomareportou classificações LOD de dois pontos de > 1,5 para cromossomos IOq,12q e 14q usando-se um modelo dominante autosômico de hereditariedade, ecromossomos lq, 8q, IOq e 16p usando-se um modelo recessivo dehereditariedade. Id. Outra varredura de genoma adicional identificou regiõescom evidência normal para ligação em 2q, 12p, 15q, 16q e 16p. Id. Umavarredura de genoma para loci de predisposição para câncer da próstatausando-se um pequeno conjunto de pedigrees de câncer da próstata de altorisco de Utah e um conjunto de 300 marcadores polimórficos proporcionaramevidência para ligação a um lócus no cromossomo 17p (Simard. J. et al.,Endocrinology 143 (6):2029-40 (2002)). Oito novas análises de ligação forampublicadas no final de 2003, que ilustraram notável heterogeneidade.Reportou-se onze picos com classificações LOD acima de 2,0, sendo quenenhuma das quais se superpôs (ver Actane consortium, Schleutker et al,Wiklund et al, Witte et al, Janer et al, Xu et al, Lange et al, Cunningham etal·, sendo que todos aparecem em Prostate, vol. 57 (2003)).

Como descrito acima, a identificação de genes particularesenvolvidos no câncer da próstata tem sido um desafio. Um gene que tem sidoimplicado é KNASEL, que codifica uma endoribonuclease latenteamplamente expressa que participa de uma via de degradação de RNAinduzível com interferon e que, acredita-se, degrada KNA viral e celular, etem sido ligada ao lócus HPC (Carpten, J. et al., Nat. Genet. 30:181-84(2002); Casey, G. et al., Nat. Genet. 32(4):581-83 (2002)). Mutações emRNASEL têm sido associadas com suscetibilidade incrementada a câncer dapróstata. Por exemplo, em uma família, quatro irmãos com câncer da próstataapresentaram uma mutação incapacitante em KNASEL, enquanto que, emoutra família, quatro de seis irmãos com câncer da próstata apresentaram umasubstituição de bases afetando o códon metionina iniciador de RNASEL. Id.

Outros estudos revelaram alelos de RNASEL mutantes associados com umrisco incrementado de câncer da próstata em homens finlandeses com câncerda próstata familiar e numa população judaica Ashkenazi (Rokman, A. et al.,Am J. Hum. Genet. 70:1299-1304 (2002); Rennert, H. et al., Am J. Hum.Genet. 77:981-84 (2002)). Adicionalmente, o genótipo Ser217Leu tem sidoproposto como contribuindo para aproximadamente 9% de todos os casosesporádicos em americanos caucasianos com idades inferiores a 65 anos(Stanford, J.L., Câncer Epidemiol. Biomarckers Prev. 12(P):876-81 (2003)).

Em contraste com estes relatos positivos, contudo, algunsestudos não conseguiram detectar qualquer associação entre alelos deRNASEL com mutações inativadoras e câncer da próstata (Wang, L. et al.,Am. J. Hum. Genet 71:116-23 (2002); Wiklund, F. et al., Clin. Câncer Res.10(21)-7150-56 (2004); Maier, C. et al., Br. J. Câncer 92(6): 1159-64(2005)).

O gene de receptor de macrófago-aglutinador 1 (MSR1,macrophage-scavenger receptor 1), que se encontra localizado em 8p22,também foi identificado como um gene candidato para a suscetibilidade acâncer da próstata (Xu, J. et al., Nat. Genet. 32:321-25 (2002)). Um alelo deMSRl mutante foi detectado em aproximadamente 3% dos homens comcâncer da próstata não hereditário, mas em apenas 0,4% de homens não-afetados. Id. No entanto, nem todos os relatos subseqüentes confirmaramestas verificações iniciais (ver, p. ex., Lindmark, F. et al., Prostate 59(2): 132-40 (2004); Seppala, E.H. et al, Clin. Câncer Res. 9(14):5252-56 (2003);Wang, L. et al., Nat Genet. 35(2): 128-29 (2003); Miller, D.C. et al., CâncerRes. 63(13):3486-89 (2003)). MSRl codifica subunidades de um receptor demacrófag-aglutinador que é capaz de ligar-se a uma variedade de ligantes,incluindo lipopolissacarídeo bacteriano e ácido lipoteicólico, e lipoproteína dealta densidade oxidada e lipoproteína de baixa densidade no soro (Nelson,W.G. etal.,N. Engl. J. Med. 349(4):366-81 (2003)).

O gene ELAC2 no Chr 17 foi o primeiro gene desuscetibilidade a câncer da próstata a ser clonado em famílias com alto riscode câncer da próstata de Utah (Tavtigian, S. V., et al., Nat. Genet. 27(2): 172-80 (2001)). Verificou-se uma mutação de deslocamento de matriz [frameshift](1641InsG) em um pedigree. Verificou-se também três alterações de missenseadicionais: Ser217Leu; Ala541Thr; e Arg781His, se associam com um riscoincrementado de câncer da próstata. Verificou-se que o risco relativo decâncer da próstata em homens portando ambos, Ser217Leu e Ala541 Thr, é de2,37 em uma coorte não selecionada com base na história familiar de câncerda próstata (Rebbeck, T.R., et al., Am. J. Hum. Genet. 67(4):1014-19 (2000)).

Outro estudo descreveu uma nova mutação de terminação (Glu216X) em umafamília com alta incidência de câncer da próstata (Wang, L., et al., CâncerRes. 61(17):6494-99 (2001)). Outros relatos não demonstraram forteassociação com as três mutações missense, e uma recente meta-análise sugereque o risco familiar associado com estas mutações é mais moderado do quefoi indicado em relatos iniciais (Vesprini, D., et al., Am. J. Hum. Genet.68(4):912-17 (2001); Shea, P.R., et al., Hum. Genet. 111 (4-5):398-400(2002); Suarez, B.K., et al., Câncer Res. 61(13):4982-84 (2001); Severi, G.,et al., J. Natl. Câncer Inst. 95(11):818-24 (2003); Fujiwara, H., et al, J. Hum.Genet. 47(12):641-48 (2002); Camp, N.J., et al, Am. J. Hum. Genet. 71(6): 1475-78 (2002)).Variantes polimórficas de genes envolvidos na ação deandrogênio (p. ex., o gene de receptor de androgênio (AR, androgenreceptor), o gene do citocromo P-450cl7 (CYP17), e o gene de esteróide-5-D-redutase tipo II (SRD5A2)), também foram implicadas em risco incrementadode câncer da próstata (Nelson, W.G. et al., N. Engl. J. Med. 349(4):366-81(2003)). Com relação a AR, que codifica o receptor de androgênio, diversosestudos genéticos epidemiológicos mostraram uma correlação entre um riscoincrementado de câncer da próstata e a presença de repetições curtas depoliglutamina receptor de androgênio, embora outros estudos tenham falhadoem detectar uma correlação do tipo referido. Id. Dados de ligação tambémimplicaram uma forma alélica de CYP17, um enzima que catalisa reações-chave na biossíntese de esteróides sexuais, com câncer da próstata (Chang, B.et al., Int. J. Câncer 95:354-59 (2001)). Variantes alélicas de SRD5A2, quecodifica a isozima predominante de 5-D-redutase na próstata e funcionaconvertendo testosterona a diidrotestosterona mais potente, foram associadascom um risco incrementado de câncer da próstata e com um prognóstico ruimpara homens com câncer da próstata (Makridakis, N.M. et al., Lancet354:975-78 (1999); Nam, R.K. et al., Urology 57:199-204 (2001)).

Em resumo, apesar do esforço de muitos grupos por todo omundo, os genes que contribuem para uma fração substancial de risco decâncer da próstata que não foram identificados. Embora estudos em gêmeostenham implicado que fatores genéticos provavelmente sejam preeminentesno câncer da próstata, apenas alguns poucos gense foram identificados comosendo associados com um risco incrementado de câncer da próstata, e estesgenes contribuem apenas para um percentual baixo de casos. Assim, fica claroque a maior parte dos fatores de risco genéticos para câncer da próstata aindafica por ser encontrada. E provável que estes fatores de risco genéticosincluam um número relativamente alto de variantes genéticas com risco debaixo a médio. No entanto, estas variantes genéticas de risco de baixo a médiopodem ser responsáveis por uma fração substancial de câncer da próstata, esua identificação é, portanto, um grande benefício para saúde pública. Alémdisso, nenhum dos genes de câncer da próstata publicados foi relatado comopredizendo um risco maior de câncer agressivo da próstata do que para câncerda próstata menos agressivo.

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no câncer da próstata e verificou-se que marcadores particulares e/ou haplótipos em um segmento de DNAespecífico no lócus estão presente numa freqüência maior do que a esperadaem sujeitos com câncer da próstata. Assim, nas várias concretizações dainvenção, determinados marcadores e/ou SNPs, identificados usando-se osmétodos aqui descritos, podem ser usados para o diagnóstico de umasuscetibilidade a câncer da próstata, e também para um diagnóstico de umamenor suscetibilidade a câncer da próstata ou para identificação de variantesque são protetoras contra câncer da próstata. Os ensaios diagnósticosapresentados abaixo podem ser usados para identificar a presença ou ausênciadestas variantes particulares.

Assim, em uma concretização, a invenção consiste de ummétodo de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer da próstata (p. ex.,câncer de próstata agressivo ou com elevado escore de Gleason, câncer depróstata menos agressivo ou com baixo escore de Gleason), compreendendodetectar um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A (p. ex., ummarcador como apresentado na Tabela 13, apresentando um valor de RRmaior do que um, indicando que o marcador está associado comsuscetibilidade a doença/risco incrementado de doença e, portanto, é umavariante "de risco"; valores de RR inferiores a um indicam que o marcadorestá associado com menor suscetibilidade a doença/menor risco de doença e,portanto, é uma variante "protetora"), sendo que a presença do marcador ouhaplótipo é indicativa de uma suscetibilidade a câncer da próstata. Em outraconcretização, a invenção é um método de diagnosticar uma suscetibilidade a,ou um risco incrementado de, câncer da próstata (p. ex., câncer de próstataagressivo ou com alto escore de Gleason, câncer de próstata menos agressivoou com baixo escore de Gleason), compreendendo, detectar o marcadorDG8S737 ou marcador rsl447295, sendo que a presença do alelo -8 nomarcador DG8S737 ou a presença do A alelo no marcador rsl447295, éindicativa de uma suscetibilidade a câncer da próstata ou um riscoincrementado de câncer da próstata. Em uma concretização adicional, ainvenção é um método de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer dapróstata em um indivíduo cuja ancestralidade compreende ancestralidadeafricana, compreendendo detectar o marcador DG8S737, sendo que apresença do alelo -8 no marcador DG8S737 é indicativa de umasuscetibilidade a câncer da próstata ou um risco incrementado de câncer dapróstata. Em concretizações particulares, o marcador ou haplótipo que éassociado com uma suscetibilidade ao câncer da próstata apresenta um riscorelativo de pelo menos 1,5, ou pelo menos 2,0. Em outra concretização, ocâncer da próstata é um câncer agressivo da próstata, como definido por umaclassificação combinada de Gleason de 7(4+3) a 10 e/ou um estado avançadode câncer da próstata (p. ex., estágios de 2 a 4). Em outra concretizaçãoadicional, o câncer da próstata é um câncer menos agressivo da próstata,como definido por uma classificação combinada de Gleason de 2 a 7(3+4)e/ou um estágio precoce de câncer da próstata (p. ex., estágio 1). Em outraconcretização, a presença de um marcador ou haplótipo associado com LDBloco A, em conjunto com o sujeito apresentando um nível de PSA maior doque 4 ng/ml, é indicativa de um câncer mais agressivo da próstata e/ou umprognóstico pior. Em outra concretização adicional, em pacientes queapresentam um nível normal de PSA (p. ex., inferior a 4 ng/ml), a presença deum marcador ou haplótipo é indicativa de um câncer mais agressivo dapróstata e/ou um prognóstico pior.Em outras concretizações, a invenção é um método dediagnosticar uma menor suscetibilidade a câncer da próstata, compreendendodetectar um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que apresença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma menor suscetibilidadea câncer da próstata ou de um marcador protetor ou haplótipo contra câncerda próstata. Em determinadas concretizações, o marcador é um marcadorcomo apresentado na Tabela 13, ou o haplótipo compreende um ou maismarcadores como apresentado na Tabela 13 (p. ex., um marcador comoapresentado na Tabela 13, ou um haplótipo compreendendo um ou maismarcadores apresentados na Tabela 13, sendo que o(s) marcador(s)apresenta(m) um valor de RR menor do que um, indicando que o marcadorestá associado com menor suscetibilidade a doença/menor risco de doença e,portanto, é uma variante "protetora"; valores de RR acima de um indicam queo marcador está associado com maior suscetibilidade a doença/riscoincrementado de doença e, portanto, é uma variante "de risco"). Em outraconcretização, a invenção é um método de diagnosticar uma menorsuscetibilidade a, ou menor risco de, câncer da próstata, compreendendodetectar marcador DG8S737 ou marcador rs 1447295, sendo que a presença deum alelo diferente do alelo -8 no marcador DG8S737 ou a presença do alelo Cno marcador rs 1447295, é indicativa de uma menor suscetibilidade a câncerda próstata ou um menor risco de câncer da próstata (protetor contra câncer dapróstata). Em uma concretização adicional, a invenção é um método dediagnosticar uma menor suscetibilidade a câncer da próstata em um indivíduocuja ancestralidade compreende ancestralidade africana, compreendendodetectar marcador DG8S737, sendo que a presença de um alelo diferente doalelo -8 no marcador DG8S737 é indicativa de uma menor suscetibilidade acâncer da próstata ou um menor risco de câncer da próstata (protetor contracâncer da próstata).

Câncer de mamaComo descrito aqui, embora a descoberta de BRCAl eBRCA2 tenha representado importantes etapas na identificação de doisfatores-chave genéticos envolvidos no câncer de mama, ficou claro quemutações de BRCAl e BRCA2 contribuem apenas para uma fração desuscetibilidade herdada para câncer de mama. Estima-se que apenas de 5 a10% de todos os cânceres de mama em mulheres estão associados comsuscetibilidade hereditária devida a mutações em genes dominantesautosômicos, como BRCAl, BRCA2, p53, pTEN e STK11/LKB1 (Mincey,B. A. Oncologist 5:466-73 (2003)). Um lócus genético, no Cromossomo 8p,foi proposto como um lócus para um gene de suscetibilidade para câncer demama com base em estudos que documentam perda alélica nesta região emcâncer de mama esporádico (Seitz, S. et al., Br. J. Câncer 75:983-91 (1997);Kerangueven, F. et ai., Oncogene 10:1023 (1995)). Estudos tambémsugeriram que um gene de suscetibilidade para câncer de mama podeencontra-se localizado em 13q21 (Kainu, T. et ai., Proc. Natl. Acad.. Sei. USA97:9603-08 (2000)). No entanto, como no casos de câncer da próstata, foidifícil a identificação de genes adicionais de suscetibilidade para câncer demama.

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no câncer de mama e verificou-se que os marcadores particulares e/ou haplótipos em um segmento de DNAespecífico no lócus estão presentes numa freqüência maior do que a esperadaem sujeitos com câncer de mama. Assim, em uma concretização, a invenção éum método de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer de mamacompreendendo detectar um marcador ou haplótipo associado com LD BlocoA, sendo que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umasuscetibilidade a câncer de mama. Em uma concretização particular, omarcador ou haplótipo que está associado com uma suscetibilidade ao câncerde mama apresenta um risco relativo de pelo menos 1,3. Em outrasconcretizações, a invenção é relacionada com um método de diagnosticar umamenor suscetibilidade a câncer de mama compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma menor suscetibilidade a câncer demama ou de um haplótipo ou marcador protetor contra câncer de mama(protetor contra câncer de mama). Em uma concretização particular, omarcador ou haplótipo que está associado com uma menor suscetibilidade acâncer de mama (protetor contra câncer de mama) apresenta um risco relativoinferior a 0,75.

Câncer do pulmão

Embora fatores ambientais, de estilo-de-vida (p. ex., o fumo) edietéticos desempenhem um papel importante no câncer do pulmão, fatoresgenéticos também são importantes. Estudos revelaram que defeitos, tanto navia p53 como também na via RB/pl6, são essenciais para a transformaçãomaligna de células epiteliais do pulmão (Yokota, J. e T. Kohno, Câncer Sci95(3): 197-204 (2004)). Outros genes, como K-ras, PTEN e MYOl 8B, sãoalterados geneticamente com menos freqüência do que p53 e RB/pl6 emcélulas de câncer do pulmão, sugerindo que alterações nestes genes estãoassociadas com progressão maligna adicional ou fenótipos únicos em umsubconjunto de células de câncer do pulmão. Id. Estudos de impressão[footprint] molecular que foram realizados nos sítios de mutações de p53 edeleções de RB/pl6 demonstraram adicionalmente que atividades de reparode DNA e interrupção de filamento duplo de DNA com pontas conjugadasnão-homólogas são importantes no acúmulo de alterações genéticas emcélulas de câncer do pulmão. Id. Adicionalmente, estudos identificaram genescandidatos para suscetibilidade a adenocarcinoma do pulmão, por exemplo,genes do metabolismo carcinógeno de drogas, como NQOl(NAD(P)H:quinona oxidorredutase) e GSTTl (glutationa S-transferase Tl), egenes de reparo de DNA, como XRCCl (grupo complementar cruzado araios-X 1) (Yanagitani, Ν. et al, Câncer Epidemiol. Biomarkers Prev.12:366-71 (2003); Lin5 P. et al, J. Toxicol. Environ. Health A. 58:187-97(1999); Divine, K.K. et al, Mutat. Res. 461:273-78 (2001); Sunaga, N. et al,Câncer Epidemiol Biomarkers Prev. 77:730-38 (2002)). Uma região docromossomo 19ql3.3, que compreende lócus D19S246, também foi sugeridacomo contendo um gene(s) associado(s) com adenocarcinoma do pulmão(Yanagitani, N. et al, Câncer Epidemiol Biomarkers Prev. 12:366-7 1(2003)).

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no câncer do pulmão e verificou-se que marcadores particulares e/ou haplótipos em um segmento de DNAespecífico no lócus estão presentes numa freqüência maior do que esperadaem sujeitos com câncer do pulmão. Em uma concretização, a invenção é ummétodo de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer do pulmãocompreendendo detectar um marcador ou haplótipo associado com LD BlocoA, sendo que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umasuscetibilidade a câncer do pulmão. Em uma concretização particular, omarcador ou haplótipo que está associado com uma suscetibilidade ao câncerdo pulmão apresenta um risco relativo de pelo menos 1,3. Em outrasconcretizações, a invenção é refere-se a um método de diagnosticar umamenor suscetibilidade a câncer do pulmão compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma menor suscetibilidade a câncer dopulmão ou de um haplótipo ou marcador protetor contra câncer do pulmão(protetor contra câncer do pulmão). Em uma concretização particular, omarcador ou haplótipo que está associado com uma menor suscetibilidade acâncer do pulmão (protetor contra câncer do pulmão) apresenta um riscorelativo inferior a 0,75.

MelanomaEstudos demonstraram que fatores genéticos desempenhamum papel importante na progressão em etapas de células pigmentadas normaispara verrugas atípicas para melanoma primário para células com potencialmetastático agressivo (Kim, C. J., et al, Câncer Control 9(l):49-53 (2002)).

Por exemplo, aberrações genéticas, como rearranjos no cromossomo 1, queabriga um gene supressor de tumor, foram implicadas em melanomamalignos. Id. No entanto, os mecanismos moleculares e biológicos de comoum melanócitos normal de pele adulta se transforma numa célula demelanoma permanecem obscuros.

Vários estudos implicaram fatores genéticos no melanoma. Porexemplo, risco familiar elevado para melanoma de início precoce foiobservado por meio de exame de um banco de dados de população de Utah(Cannon-Albright, L.A., et al, Câncer Res., 54(9):2378-85 (1994)).

Adicionalmente, o Banco de Dados Sueco de Câncer Familiar reportou umarelação de incidência padronizada familiar (SIR, standardized incidenceratió) de 2,54 e 2,98 para melanoma maligno cutâneo (CMM, cutaneousmalign melanoma) em um indivíduo com um parente sangüíneo ou parenteafetado, respectivamente. Para uma descendência cujo parental apresentoumúltiplos melanomas primários, a SIR elevou-se para 61,78 (Hemminki, K.,et al, J. Invest. Dermatol. 120(2):217-23 (2003)). Embora os índices possamvariar, reportou-se que cerca de 10% de casos de CMM são familiares(Hansen, CB., et al., Lancet Oncol. 5(5):314-19 (2004)). Dados os fatores derisco ambientais conhecidos para melanoma, ambiente compartilhadoadicionalmente à genética é provavelmente um fator nestas estimativas. Noentanto, casos familiares tendem a apresentar idades mais precoces de início eum risco maior de tumores primários múltiplos, sugerindo um componentegenético.

Uma série de estudos baseados em ligação implicou CDKN2aem Chr9p21 como um geme principal para suscetibilidade a CMM (Bataille,V., Eur. J. Câncer 39(10): 1341-47 (2003)). CDK4 foi identificado como umcandidato de via pouco após, no entanto, mutações em CDK4 só foramobservadas em algumas poucas famílias por todo o mundo (Zuo, L., et al.,Nat. Genet. 12(l):91-99 (1996)). CDKN2a codifica o inibidor de quinasedependente de ciclina ρ 16, que inibe CDK4 e CDK6, impedindo com isto otrânsito de ciclo de Gl a célula S. Uma transcrição alternativa de CKDN2aproduz pl4ARF, que codifica um inibidor de ciclo celular que atua pela viaMDM2-p53. E provável que melanócitos mutantes de CDKN2a apresentemdeficiência no controle do ciclo celular e o estabelecimento de senescência,seja como um estado desenvolvimental ou em resposta a dano ao DNA(Ohtani, N., et al., J. Med. Invest. 51(3-4): 146-53 (2004)). A penetrânciaglobal de mutações de CDKN2a em casos de CMM familiar é de 67% porvolta da idade de 80. No entanto, a penetrância é incrementada em áreas dealta prevalência de melanoma (Bishop, D.T., et al., J. Natl Câncer Inst.94(12):894-903 (2002)).

O Consórcio de Genética do Melanoma completourecentemente uma ampla varredura do genoma para CMM, usando-se umconjunto de famílias de alto risco predominantemente australianas não ligadasa 9p21 ou CDK4 (Gillanders, E., et al., Am. J. Hum. Genet. 73(2):301-13(2003)). A varredura com resolução de 10 cM deu uma classificação de LODde multipontos não-paramétrica de 2,06 na região lp22. Outras localizaçõesnos cromossomos 4, 7, 14, e 18 deram LODs acima de 1,0. Com marcadoresadicionais para lp22 e a aplicação de uma restrição de idade de inícioobservou-se classificações de LOD não-paramétricas acima de 5,0. Evidênciasugere que existe uma mutação de alta penetrância de um gene supressor detumor neste local, mas o padrão de LOH é complexo (Walker, G. J., et al.,Genes Chromossomes Câncer, 41(l):56-64 (2004)).

Outro lócus genético que foi implicado no CMM é aquele quecodifica o receptor de melanocortina 1 (MCIR, Melanocortin 1 Receptor).MClR é um receptor acoplado a proteína G que está envolvido na promoçãoda troca de síntese de feomelanina para eumelanina. Numerosas variantesbem caracterizadas do gene de MClR foram implicadas em fenótipos decabelos rui vos, de pele clara e propensos a sardas. Mais da metade dosindivíduos ruivos portam pelo menos uma destas variantes (Valverde, P., etal., Nat. Genet. ll(3):328-30 (1995); Palmer, J.S., et al., Am. J. Hum. Genet.66(1): 176-86 (2000)). Subseqüentemente, mostrou-se que as mesmasvariantes conferiram risco de CMM com taxas de probabilidades de cerca de2,0 para uma única variante e cerca de 4,0 para heterozigotos compostos.Estudos recentes mostraram que as variantes mais fortes de MClR aumentama penetrância de mutações de CDKN2a e diminuem a idade do início (Box,N.F., et al., Am. J. Hum. Genet. 69(4):765-73 (2001); van der Velden, Ρ. A.,et al., Am. J. Hum. Genet, 69(4):774-79 (2001)).

Diversos outros genes candidatos foram implicados no CMM.Por exemplo, um estudo de referência na genômica do câncer identificoumutações somáticas em BRAF (o homólogo Bl humano do oncogene dovírus do sarcoma murina v-raf) em 60% dos melanomas (Davies, H., et al.,Nature 417(6892):949-54 (2002)). Mutações também são comuns em nevos,tanto típicos como atípicos, sugerindo que a mutação é um evento precoce. Id.Mutações de linha germinativa não foram reportadas, contudo uma varianteSNP de linha germinativa de BRAF foi implicada em risco de CMM (Meyer,P., et al., J. Carcinog. 2(1):7 (2003)). Outros genes candidatos, que foramidentificados por meio de estudos de associação e que foram implicados emrisco de CMM risk incluem, p. ex., XRCC3, XPD, EGF, VDR, NBS1,CYP2D6, e GSTMl (Hayward, N.K., Oncogene, 22(20):3053-62 (2003)). Noentanto, estudos de associação padecem freqüentemente de pequenostamanhos de amostras, confiança em SNPs simples, e estratificação depopulação potencial.

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no melanoma e verificou-se queos marcadores particulares e/ou haplótipos em um segmento de DNAespecífico no lócus estão presentes numa freqüência maior do que esperadaem sujeitos com melanoma. Em uma concretização, a invenção é um métodode diagnosticar uma suscetibilidade a melanoma compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade a melanoma. Emuma concretização particular, o marcador ou haplótipo que está associadocom uma suscetibilidade a melanoma apresenta um risco relativo de pelomenos 1,5. Em outra concretização, o melanoma é melanoma cutâneomaligno. Em uma concretização adicional, o marcador ou haplótipo que estáassociado com melanoma cutâneo maligno apresenta um risco relativo de pelomenos 1,7.

Em outras concretizações, a invenção refere-se a um métodode diagnosticar uma menor suscetibilidade a melanoma, compreendendodetectar um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, sendo que apresença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma menor suscetibilidadea melanoma ou de um haplótipo ou marcador protetor contra melanoma(protetor contra melanoma). Em uma concretização particular, o marcador ouhaplótipo que está associado com uma menor suscetibilidade melanoma(protetor contra melanoma) apresenta um risco relativo inferior a 0,7. Emoutra concretização, o melanoma é melanoma cutâneo maligno. Em umaconcretização adicional, o marcador ou haplótipo que está associado com amenor suscetibilidade a melanoma cutâneo maligno (protetor contramelanoma cutâneo maligno) apresenta um risco relativo inferior a 0,6.

ANÁLISE EM BUSCA DE MARCADORES E HAPLÓTIPOS

Populações dos indivíduos apresentando diversidade genéticanão apresentam genomas idênticos. Ao invés, o genoma apresentavariabilidade de seqüências entre indivíduos em muitos locais no genoma; emoutras palavras, há muitos sítios polimórficos em uma população. Em algunscasos, faz-se referência a diferentes alelos em um sítio polimórfico semselecionar um alelo de referência. Alternativamente, uma seqüência dereferência pode ser referida para um sítio polimórfico particular. O alelo dereferência é denominado por vezes como o alelo "de tipo selvagem" e éselecionado usualmente, ou como o primeiro alelo seqüenciado, ou como oalelo de um indivíduo "não-afetado" (p. ex., um indivíduo que não apresentauma doença ou fenótipo anormal). Alelos que diferem da referência sãoreferidos como alelos "variantes".

Um "marcador", como descrito aqui, refere-se a umaseqüência genômica característica de um alelo variante particular (i.e. sítiopolimórfico). O marcador pode compreender qualquer alelo de qualquer tipovariante encontrado no genoma, incluindo SNPs, microssatélites, inserções,deleções, duplicações e translocações.

Nomenclatura de SNP como relatado aqui refere-se aomarcador [tag] de identificação oficial de SNP (rs) de referência comoatribuído a cada único SNP pelo Centro Nacional de InformaçãoBiotecnológica (NCBI, National Center for Biotechnological Information).

Um "haplótipo", como descrito aqui, refere-se a um segmentode DNA genômico que é caracterizado por uma combinação específica demarcadores genéticos ("alelos") dispostos ao longo do segmento. Acombinação de alelos, como haplótipo 1 e haplótipo la, encontram-sedescritas nas Tabelas 2 e 4, respectivamente. Em uma determinadaconcretização, o haplótipo pode compreender um ou mais alelos, dois ou maisalelos, três ou mais alelos, quatro ou mais alelos, ou cinco ou mais alelos. Osmarcadores genéticos são "alelos" particulares em "sítios polimórficos"associados com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A. Como usado aqui,"Chr8q24.21" e "8q24.21" referem-se à banda cromossômica 8q24.21 ou127.200.001-131.400.000 bp na construção [Build] 34 do UCSC (daconstrução [Build] 34 do browser do USCS Genome 34 no endereçowww.genoma.ucsc.edu). Como usado aqui, "LD Bloco A" refere-se ao blocoLD no Chr8q24.21 em que se observa associação de variantes de câncer dapróstata, mama, câncer do pulmão e melanoma. A posição da construção[Build] 34 do NCBI deste bloco LD é de 128.414.000 - 128.506.000 bp. Otermo "ancestralidade africana", como descrito aqui, refere-se aancestralidade africana auto-reportada dos indivíduos.

O termo "suscetibilidade", como descrito aqui, compreendetanto suscetibilidade incrementada e suscetibilidade diminuída. Assim,marcadores particulares e/ou haplótipos da invenção podem ser característicosde suscetibilidade incrementada de câncer, como caracterizado por um riscorelativo acima de um. Alternativamente, os marcadores e/ou haplótipos dainvenção são característicos de suscetibilidade diminuída de câncer, comocaracterizado por um risco relativo inferior a um.

Uma posição de nucleotídeo em que mais de uma seqüência épossível em uma população (quer seja uma população natural ou umapopulação sintética, p. ex., uma biblioteca de moléculas sintéticas) é referidaaqui como um "sítio polimórfico".

Onde um sítio polimórfico tem um comprimento de um úniconucleotídeo, o sítio é referido como um polimorfismo de nucleotídeo simples("SNP", síngle nucleotide polymorphism). Por exemplo, se em um localcromossômico particular um membro de uma população apresenta umaadenina e outro membro da população apresenta uma timina na mesmaposição, então esta posição é um sítio polimórfico, e, mais especificamente, osítio polimórfico é um SNP. Alelos para marcadores de SNP são referidosaqui com relação às bases A, C, G ou T como elas ocorrem no sítiopolimórfico no ensaio de SNP empregado. A pessoa versada na arte perceberáque, analisando ou lendo o filamento oposto, o alelo complementar pode sermedido em cada caso. Assim, para um sítio polimórfico contendo umpolimorfismo A/G, o ensaio empregado pode medir o percentual ou a relaçãodas duas bases possíveis, i.e. AeG. Alternativamente, projetando-se umensaio que determina o filamento oposto no modelo de DNA, é possívelmedir o percentual ou relação das bases T/C complementares.

Quantitativamente (por exemplo, em termos de risco relativo), seria possívelobter resultados idênticos para medição de qualquer dos filamentos de DNA(filamento + ou filamento -). Sítios polimórficos podem permitir diferenças deseqüências baseadas em substituições, inserções ou deleções. Por exemplo,um microssatélite polimórfico apresenta múltiplas pequenas repetições debases (como repetições CA) em um sítio particular em que o número decomprimentos de repetições varia na população em geral. Cada versão daseqüência com relação ao sítio polimórfico é referida to aqui como um "alelo"do sítio polimórfico. Assim, no exemplo precedente, o SNP permite ambos,um alelo de adenina e um alelo timina. SNPs e microssatélite marcadoresassociados com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo dapróstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) encontram-sedescritos nas Tabelas 1 e 13.

Tipicamente, uma seqüência de referência é referida para umaseqüência particular. Alelos que diferem da referência são referidos comoalelos "variantes". Por exemplo, a seqüência de referência de DNA genômicode 128.414.000 - 128.506.000 bp da construção [Build] 34 do NCBI, que serefere à localização no Cromossomo 8, é descrita aqui como SEQ ID NO:l(FIG. 6A1-6A31). Uma seqüência variante, como usado aqui, refere-se a umaseqüência que difere da SEQ ID NO:l, mas que, de outra forma, ésubstancialmente similar. Os marcadores genéticos que compõem oshaplótipos aqui descritos são variantes. Variantes adicionais podem incluemalterações que afetam um polipeptídio, p. ex., um polipeptídio codificado pelaSEQ ID NO: 1. Estas diferenças de seqüências, quando comparadas com umaseqüência de referência de nucleotídeos, podem incluem a inserção oudeleção de um único nucleotídeo, ou de mais do que um nucleotídeo,resultando em um desvio de matriz; a alteração de pelo menos umnucleotídeo, resultando em uma alteração no aminoácido codificado; aalteração de pelo menos um nucleotídeo, resultando na geração de um códonde interrupção [,stop] prematuro; a deleção de vários nucleotídeos, resultandoem uma deleção de um ou mais aminoácidos codificados pelos nucleotídeos;a inserção de um ou vários nucleotídeos, como por meio de recombinaçãodesigual ou conversão de genes, resultando em uma interrupção da seqüênciacodificante de uma matriz de leitura; duplicação de toda ou de uma parte deuma seqüência; transposição; ou um rearranjo de uma seqüência denucleotídeos, como descrito detalhadamente aqui. Referidas alterações deseqüência alteram o polipeptídio codificado pelo ácido nucleico. Por exemplo,se a alteração na seqüência de ácido nucleico causa um desvio de matriz, odesvio de matriz pode resultar em uma alteração nos aminoácidoscodificados, e/ou pode resultar na geração de um códon de interrupção [stop]prematuro, causando geração de um polipeptídio truncado. Alternativamente,um polimorfismo associado com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma)ou uma suscetibilidade ao câncer pode ser uma alteração sinônima em um oumais nucleotídeos (i.e., uma alteração que não resulta numa alteração naseqüência de aminoácidos). Um polimorfismo do tipo referido pode, porexemplo, alterar sítios de recomposição, afetar a estabilidade ou o transportede mRNA, ou, de outra forma, afetar a transcrição ou tradução de umpolipeptídio codificado. Ele também pode alterar o DNA para incrementar apossibilidade de que alterações estruturais, como amplificações ou deleções,ocorram no nível somático em tumores. O polipeptídio codificado pelaseqüência de referência de nucleotídeos é o polipeptídio de "referência" comuma seqüência de aminoácidos de referência particular, e polipeptídioscodificados por alelos variantes são referidos como polipeptídios "variantes"com seqüências de aminoácidos variantes.

Os haplótipos aqui descritos são uma combinação de váriosmarcadores genéticos, p. ex., SNPs e microssatélites, apresentando alelosparticulares em sítios polimórficos. Os haplótipos podem compreender umacombinação de vários marcadores genéticos, de modo que a detecção dehaplótipos pode ser realizada por meio de métodos conhecidos na arte padetecção de seqüências em sítios polimórficos. Por exemplo, é possível usartécnicas convencionais para genotipificação quanto à presença de SNPs e/oumarcadores de microssatélites, como técnicas à base de fluorescência (Chen,X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999)), PCR, LCR, PCR embutida eoutras técnicas para amplificação de ácido nucleico. Estes marcadores e SNPspodem ser identificados em haplótipos de risco. Determinados métodos deidentificar marcadores relevantes e SNPs incluem o uso de classificação dedesequilíbrio de ligação (LD) e/ou LOD.

Desequilíbrio de ligação

Desequilíbrio de ligação (LD, linkage desequilíbrium) refere-se a uma combinação não randômica de dois elementos genéticos. Porexemplo, se um elemento genético particular (p. ex., "alelos" em um sítiopolimórfico) ocorre em uma população a uma freqüência de 0,25 e outroocorre a uma freqüência de 0,25, então a ocorrência predita para uma pessoaapresentando ambos os elementos é de 0,125, presumindo-se uma distribuiçãorandômica dos elementos. No entanto, verificando-se que os dois elementosocorrem a uma freqüência maior do que 0,125, diz-se então que os elementosencontram-se em desequilíbrio de ligação porque eles tendem a ser herdadosem conjunto a uma taxa maior do que suas freqüências de alelosindependentes poderiam auxiliar a predizer. De uma maneira genérica, LD égeralmente correlacionado com a freqüência de eventos de recombinaçãoentre os dois elementos. Freqüências de alelos podem ser determinadas emuma população por meio de genotipificação de indivíduos em uma populaçãoe determinando-se a ocorrência de cada alelo na população. Para populaçõesde diplóides, p. ex., populações humanas, indivíduos apresentarão tipicamentedois alelos para cada elemento genético (p. ex., um marcador ou gene).

Propôs-se muitas medidas diferentes para avaliar a intensidadedo desequilíbrio de ligação (LD). A maior parte captura a intensidade deassociação entre pares de sítios bialélicos. Duas medidas pareadas importantesde LD são r (por vezes indicado como Δ ) e |D'|. Ambas as medidascompreendem de 0 (nenhum desequilíbrio) a 1 (desequilíbrio 'completo'),mas sua interpretação é ligeiramente diferente. |D'| é definido de tal modo queseja igual a 1 se apenas dois ou três dos possíveis haplótipos estiverempresentes, e é <1 se todos os quatro possíveis haplótipos estão presentes.

Assim, um valor de |D'| que é <1 indica que pode ter ocorrido recombinaçãohistórica entre dois sítios (mutação recorrente também pode causar |D'| a ser<1, mas para polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs) isto é usualmenteconsiderado como sendo menos provável do que recombinação). A medida rrepresenta a correlação estatística entre dois sítios, e assume o valor de 1 seapenas dois haplótipos estiverem presentes. E discutivelmente a medida maisrelevante para mapeamento de associação, porque há uma relação invertidasimples entre r e o tamanho da amostra requerida para detectar associaçãoentre Ioci de suscetibilidade e SNPs. Estas medidas são definidas para paresde sítios, mas, para algumas aplicações, poderia ser desejável umadeterminação de quão forte o LD é em toda uma região que contém muitossítios polimórficos (p. ex., testando se a intensidade do LD diferesignificativamente entre Ioci ou entre populações, ou se há mais ou menos LDem uma região do que pode ser predito em um modelo particular). A mediçãodo LD em toda uma região não é direta, porém uma abordagem consiste emusar a medida r, que foi desenvolvida em genética populacional. Dito de umamaneira geral, r mede quanta recombinação poderia ser necessária para ummodelo de população em particular para gerar o LD que é observado nosdados. Este tipo de método também pode proporcionar uma abordagemrigorosamente estatística para o problema de se determinar se dados de LDfornecem evidência quanto à presença de "pontos quentes" [hotspots] derecombinação. Para os métodos aqui descritos, um valor r significativo podeser de pelo menos 0,2, como pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0.

Assim, LD representa uma correlação entre alelos demarcadores distintos. E medido por meio de coeficiente de correlação ou |D'|(r2 até 1,0 e |D'| até 1,0).

Como descrito aqui, demonstrou-se que um lócus nocromossomo 8q24.21 desempenha um papel no câncer (p. ex., câncer dapróstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma). Verificou-se que marcadores particulares e/ou haplótiposestão presentes numa freqüência maior do que esperada em sujeitos de câncerparticulares. Em uma concretização, o marcador ou haplótipo compreende umou mais marcadores associados com Chr8q24.21 em desequilíbrio de ligação(definido como o quadrado do coeficiente de correlação, r , maior do que 0,2)com um ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dosmarcadores na Tabela 13.

Definição de classificação de LOD e haplótipos de um lócus desuscetibilidade

Em determinadas concretizações, um lócus de suscetibilidadecandidato é definido usando-se classificações de LOD. As regiões definidassão então mapeadas de forma ultra-fina com SNP e microssatélitemarcadores, com um espaçamento médio entre marcadores inferior a 100 kb.

E possível usar todos os marcadores de SNP e microssatélites que sãoencontrados em bancos de dados públicos e mapeados naquela região.Adicionalmente, é possível usar marcadores de microssatélites identificadosno conjunto de seqüências genéticas deCODE do genoma humano. Asfreqüências de haplótipos no paciente e nos grupos de controle podem serestimadas usando-se um algoritmo de expectativa-maximização (Dempster A.et al., J. R. Stat. Soe. B, 39:1-38 (1977)). E possível usar uma implementaçãodeste algoritmo que pode manusear genótipos faltantes e incerteza com a fase.

Nas hipóteses nulas, presume-se que os pacientes e os controles apresentamfreqüências idênticas. Usando uma abordagem de probabilidades testa-se umahipótese alternativa, em que um haplótipo de risco candidato, que pode incluiros marcadores aqui descritos, é deixado apresentar uma freqüência maior empacientes do que controles, enquanto se presume que as relações dasfreqüências de outros haplótipos são iguais em ambos os grupos.

Probabilidades são maximizadas separadamente em ambas as hipóteses, eusa-se uma estatística de relação de probabilidade 1-df correspondente paraavaliar a significância estatística.

Para procurar haplótipos e marcadores de risco e protetores emuma região de ligação, por exemplo, estuda-se a associação de todas aspossíveis combinações de marcadores genotipificados, desde que essesmarcadores abrangem uma região prática. Os grupos de controle e pacientescombinados podem ser divididos randomicamente em dois conjuntos detamanho igual ao grupo original de pacientes e controles. Repete-se então aanálise de marcador e haplótipo, e determina-se o valor ρ registrado maissignificativo. Este esquema de randomização pode ser repetido, por exemplo,mais de 100 vezes para construir uma distribuição empírica de valores p. Emuma concretização preferida, um valor ρ <0,05 é indicativo de uma associaçãosignificativa de marcador e/ou haplótipo.

Segue uma discussão detalhada de análise de haplótipos.

Análise de haplótipos

Uma abordagem geral para a análise de haplótipos envolve ouso de inferência baseada em probabilidade aplicada a modelos embutidosNEsted MOdels (Gretarsdottir S., et alNat. Genet. 35:131-38 (2003)). Ométodo é implementado no programa NEMO, que permite muitos marcadorespolimórficos, SNPs e microssatélites. O método e programa [software] sãoprojetados especificamente para estudos de caso-controle em que a finalidadeé identificar grupos de haplótipos que conferem riscos diferentes. Também éuma ferramenta para estudar estruturas de LD. No NEMO, estimativas deprobabilidade máxima, relações de probabilidade e valores ρ são calculadosdiretamente, com o auxílio do algoritmo EM, para os dados observadostratando isto como um problema de dados faltantes.

Informação de medição

Embora testes de relação de probabilidade baseados emprobabilidades computadas diretamente para os dados observados, quecapturaram a perda de informação devido à incerteza de fase e genótiposfaltantes, possam merecer crédito proporcionando valores ρ válidos, aindaseria interessante saber quanta informação foi perdida devido à informaçãoser incompleta. A medição de informação para análise de haplótipos encontra-se descrita em Nicolae e Kong (Technical Report 537, Department ofStatistics, Universidade de Statistics, Universidade de Chicago; Biometrics,60(2):368-75 (2004)) como uma extensão natural de medições de informaçãodefinidas para análise de ligação, e é implementada no NEMO.

Análise estatística

Para associação de marcador simples com a doença, é possívelusar o teste exato de Fisher para calcular valores ρ de duplo lado para cadaalelo individual. Todos os valores ρ são apresentados de forma não-ajustadapara múltiplas comparações exceto se indicado especificamente. Asfreqüências apresentadas (para microssatélites, SNPs e haplótipos) sãofreqüências alélicas em oposição a freqüências de portadores. Para minimizarqualquer viés devido ao parentesco dos pacientes que foram recrutados comofamílias para a análise de ligação, parentes de primeiro e segundo grau podemser eliminados da lista de pacientes. Adicionalmente, o teste pode ser repetidopara correção de associação para qualquer parentesco remanescente entre ospacientes, por meio de extensão de um procedimento de ajuste de variânciadescrito em Risch, N. & Teng, J. (<Genome Res., 8: 1273-1288 (1998)),combinação de DNA (ibid) para parentescos sangüíneos para que possa seraplicado a relações familiares gerais, e apresenta valores p, tanto ajustadoscom não-ajustados, para comparação. As diferenças são em geral muitopequenas, como esperado. Para avaliar a significância de uma associação demarcador simples para testes múltiplos, nós podemos realizar um teste derandomização usando os mesmos dados de genótipo. Coortes de pacientes econtroles podem ser randomizadas e análise de associação refeita múltiplasvezes (p. ex., até 500.000 vezes) e o valor ρ é a fração de replicações queproduziram um valor ρ para algum alelo marcador que é menor ou igual aovalor ρ que nós observamos usando o paciente original e coortes de controle.

Para análises de haplótipo e de marcador simples, riscorelativo (RR) e o risco atribuível à população (PAR, population attributablerisk) pode ser calculado presumindo-se um modelo multiplicativo (modelo derisco relativo a haplótipo) (Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46(1992) e Falk, CT. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):221-33(1987)), i.e., que os riscos dos dois alelos/haplótipos que uma pessoa portamultiplicam-se. Por exemplo, se RR for o risco de A relativamente a, então orisco de um pessoa homozigoto AA será RR vezes aquele de um heterozigotoAa e RR2 vezes aquele de um homozigoto aa. O modelo multiplicativoapresenta uma propriedade vantajosa que simplifica análise e computações —haplótipos são independentes, i.e., em equilíbrio de Hardy-Weinberg, napopulação afetada e também na população de controle. Como umaconseqüência, contagens dos haplótipos dos afetados e de controlesapresentam, cada um, distribuições multinomiais, mas com diferentesfreqüências de haplótipos na hipótese alternativa. Especificamente, para doishaplótipos, hj e hj, risco(hj)/risco(hj) = (fi/pi)/(fj/pj), sendo que f e ρ indicam,respectivamente, freqüências na população afetada e na população decontrole. Embora ainda haja alguma perda de potência se o modelo verdadeironão for multiplicativo, a perda tende a ser branda exceto em alguns casosextremos. O mais importante é que valores ρ são sempre válidos porque elessão computados com relação à hipótese nula.

Desequilíbrio de ligação usando NEMO

O LD entre pares de marcadores pode ser calculado usando-sea definição padrão de D' e R2 (Lewontin, R., Genetics 49:49-67 (1964); Hill,W.G. & Robertson, A. Theor. Appl Genet. 22:226-231 (1968)). UsandoNEMO, freqüências das duas combinações de alelos marcadores sãoestimadas por meio de probabilidade máxima e o desvio do equilíbrio deligação é avaliado por meio de um teste de relação de probabilidades. Asdefinições de D' e R2 são estendidas para incluir microssatélites por meio decálculo das médias dos valores para todas as possíveis combinações de alelosdos dois marcadores considerando o peso de acordo com as probabilidades dealelos marginais.

Quando se plota todas as combinações de marcadores paraelucidar a estrutura do LD em uma região particular, nós plotamos D' nocanto superior esquerdo e o valor ρ no canto inferior direito. Nas plotagens deLD os marcadores podem ser plotados equidistantes, ao invés de segundo sualocalização física, se desejado.

Métodos estatísticos para análise de ligação

É possível usar métodos de compartilhamento de alelo apenas-afetados nas análises para avaliar a evidência de ligação. Resultados, tanto daclassificação de LOD e da classificação de ligação não-paramétrica (NPL,non-parametric linkage), podem ser obtidos usando-se o programa Allegro(Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000)). Nossa análise de ligação delinha-de-base usa a função de classificação Spairs (Whittemore, A.S., Halpern,J. Biometrics 50:118-27 (1994); Kruglyak L. et al, Am. J. Hum. Genet.55:1347-63 (1996)), o modelo de compartilhamento de alelo exponencial(Kong, A. e Cox3 N. J., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997)) e umesquema de ponderação da família que se encontra a meio-caminho, na escalalog, entre ponderação de cada par afetado igualmente e ponderação de cadafamília igualmente. A medida de informação que nós usamos é parte doproduto do programa Allegro e o valor da informação eqüivale a zero se osgenótipos dos marcadores forem completamente não-informativos, e eqüivalea um se os genótipos determinarem a quantidade exata de compartilhamentode alelos por meio de derivação hereditária entre os parentes afetados(Gretarsdottir et al., Am. J. Hum. Genet, 70:593-603 (2002)). Os valores ρforam computados de duas maneiras diferentes, e reporta-se aqui umresultado menos significativo. O primeiro valor ρ pode ser computado combase na teoria de amostra grande; a distribuição de Zir = □ (2[Ioge(IO)LOD])aproxima uma variável normal padrão na hipótese nula de nenhuma ligação(Kong, A. e Cox, NJ., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997)). O segundovalor ρ pode ser calculado comparando-se a classificação LOD observadacom sua distribuição de amostragem de dados completa na hipótese nula (p.ex., Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000)). Quando os dadosconsistem de mais do que algumas poucas famílias, estes dois valores ρtendem a ser muito similares.

Haplótipos e definição de "Bloco de Haplótipos" de um lócus desuscetibilidade

Em determinadas concretizações, a análise de marcador ehaplótipo envolve a definição de um lócus de suscetibilidade candidatobaseado em "blocos de haplótipos" (também denominados "blocos de LD").Reportou-se que porções do genoma humano podem ser quebradas em sériesde blocos de haplótipos distintos contendo alguns poucos haplótipos comuns;para estes blocos, dados de desequilíbrio de ligação proporcionaram poucaevidência indicando recombinação (ver, p. ex., Wall., J.D. e Pritchard, J.K.,Nature Reviews Genetics 4:587-597 (2003); Daly, Μ. et al, Nature Genet.29:229-232 (2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225-2229 (2002); Patil,N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387 (2003)).

Há dois métodos principais para definir estes blocos dehaplótipos: blocos podem ser definidos como regiões de DNA que apresentamlimitada diversidade de haplótipos (ver, p. ex., Daly, M. et al., Nature Genet.29:229-232 (2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson,E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. SciUSA pp:7335-7339 (2002)), ou como regiões entre zonas de transiçãoapresentando extensa recombinação histórica, identificadas usandodesequilíbrio de ligação (ver, p. ex., Gabriel, S.B. et al, Science 296:2225-2229 (2002); Phillips, M.S. et al, Nature Genet. 33:382-387 (2003); Wang,N. et al, Am. J. Hum. Genet. 77:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., eGoldstein, D.B., Curr. Biol. 73:1-8 (2003)). Como usado aqui, os termos"bloco de haplótipos" ou "bloco de LD" inclui blocos definidos por qualquercaracterística.

Métodos representativos para identificação de blocos dehaplótipos são apresentados, por exemplo, nos Pedidos de Patentes dosE.U.A. Publicados nums. 20030099964, 20030170665, 20040023237 e20040146870. Blocos de haplótipos podem ser facilmente usados para mapearassociações entre fenótipo e status do haplótipo. Os principais haplótipospodem ser identificados em cada bloco de haplótipos, e, então, é possívelidentificar um conjunto de marcadores ou SNPs "marcadores" (o menorconjunto de SNPs ou marcadores necessários para distinguir entre oshaplótipos). Estes marcadores ou SNPs de marcação podem então ser usadosna avaliação de amostras de grupos dos indivíduos, para identificar associaçãoentre fenótipo e haplótipo. Se desejado, blocos de haplótipos adjacentespodem ser avaliados concorrentemente, porque também pode existirdesequilíbrio de ligação entre os blocos de haplótipos.

Haplótipos e Diagnósticos

Como descrito aqui, verificou-se que determinados marcadorese haplótipos são úteis para a determinação da suscetibilidade a câncer - i.e.,verificou-se que são úteis para diagnosticar uma suscetibilidade a câncer.Marcadores e haplótipos particulares (p. ex., haplótipo 1, haplótipo la, eoutros haplótipos contendo um ou mais dos marcadores ilustrados emqualquer uma das Tabelas abaixo) são encontrados com maior freqüência emindivíduos com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo dapróstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) do que emindivíduos sem câncer. Portanto, estes marcadores e haplótipos apresentamvalor preditivo para detectar câncer, ou uma suscetibilidade a câncer, em umindivíduo. Blocos de haplótipos compreendendo determinados marcadores detagging, podem ser encontrados mais freqüentemente em indivíduos comcâncer do que em indivíduos sem câncer. Portanto, estes marcadores detagging "de risco" nos blocos de haplótipos também apresentam valorpreditivo para detectar câncer, ou uma suscetibilidade a câncer, em umindivíduo. Marcadores de tagging "de risco" nos blocos de LD ou haplótipostambém podem incluir outros marcadores que diferenciam entre oshaplótipos, porque estes apresentam, de maneira similar, valor preditivo paradetectar câncer ou uma suscetibilidade a câncer. Como uma conseqüência daestrutura do bloco de haplótipos do genoma humano, um grande número demarcadores ou outras variantes e/ou haplótipos compreendendo referidosmarcadores ou variantes em associação com o bloco de haplótipos (bloco deLD) pode ser encontrado associado com uma determinada característica e/oufenótipo. Assim, é possível que marcadores e/ou haplótipos que existem noLD Bloco A como definido aqui ou em LD forte (caracterizado por r2 maiordo que 0,2) com LD Bloco A estejam associados com câncer (p. ex., câncerda próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata, câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma). Isto inclui marcadores que são descritos aqui (Tabelas13, 20 e 21), mas também podem incluir outros marcadores que são LD forte(caracterizado por r maior do que 0,2) com um ou mais dos marcadoreslistados na Tabelas 13, 20 e 21. A identificação de referidas variantesadicionais pode ser obtida por meio de métodos bem conhecidos por aquelesversados na arte, por exemplo, por meio de seqüenciamento de DNA daregião genômica do LD Bloco A, e a presente invenção também compreendereferidas variantes adicionais.

Como descrito aqui (p. ex., Tabela 13), determinadosmarcadores no LD Bloco A são encontrados com menor freqüência emindivíduos com câncer, e verificou-se que haplótipos compreendendo dois oumais marcadores listados nas Tabelas 13, 20 e 21 também estão presentescom menor freqüência em indivíduos com câncer. Estes marcadores ehaplótipos são, portanto, protetores para câncer (p. ex., câncer da próstata (p.ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma), i.e. eles conferem um menor risco de indivíduos portando estesmarcadores e/ou haplótipos desenvolverem câncer. Um exemplo de referidoshaplótipos protetores compreende os marcadores alelo C de rs7814251 e aleloT de rs 12542685 alelo (Tabela 22).

Os haplótipos e marcadores aqui descritos são, em algunscasos, uma combinação de vários marcadores genéticos, p. ex., SNPs emicrossatélites. Portanto, a detecção de haplótipos pode ser realizada pormeio de métodos conhecidos na arte e/ou descritos aqui para a detecção deseqüências em sítios polimórficos. Adicionalmente, a correlação entredeterminados haplótipos ou conjuntos de marcadores e fenótipo de doençapode ser verificada usando-se técnicas convencionais. Um métodorepresentativo de um teste simples para correlação poderia ser um teste exatode Fisher em uma tabela dois a dois.

Em concretizações específicas, um marcador ou haplótipoassociado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21 é um em que o marcador ouhaplótipo está presente com maior freqüência em um indivíduo com risco decâncer (afetado), em comparação com a freqüência de sua presença em umindivíduo saudável (controle), sendo que a presença do marcador ou haplótipoé indicativa de câncer ou uma suscetibilidade a câncer. Em outrasconcretizações, marcadores de tagging de risco em um bloco de haplótiposem desequilíbrio de ligação com um ou mais marcadores associados com LDBloco A e/ou Chr8q24.21, são marcadores de tagging que estão presentescom maior freqüência em um indivíduo com risco de câncer (afetado), emcomparação com a freqüência de sua presença em um indivíduo saudável(controle), sendo que a presença dos marcadores de tagging é indicativa desuscetibilidade a câncer. Em uma concretização adicional, marcadores derisco em desequilíbrio de ligação com um ou mais marcadores associadoscom LD Bloco A e/ou Chr8q24.21, são marcadores que estão presentes commais freqüência em um indivíduo com risco de câncer, em comparação com afreqüência de sua presença em um indivíduo saudável (controle), sendo que apresença do marcadores é indicativa de suscetibilidade a câncer.

Em concretizações particulares da invenção, o(s) marcador(s)ou haplótipos estão associados com LD Bloco A. Como descrito eexemplificado aqui, análise de genótipo revelou uma associação demarcadores e haplótipos no cromossomo 8q24.21 com câncer. Em particular,os estudos aqui descritos demonstram uma associação de marcadores ehaplótipos associados com LD Bloco A (i.e., a seqüência de DNA genômicode 128.414.000 - 128.506.000 bp da construção [Build] 34 do NCBI (SEQ IDNO: 1; FIG. 6A1-6A31)) com câncer. Deveria-se observar que os marcadorese haplótipos no LD Bloco A, diferentes daqueles descritos aqui em particular,podem associar-se com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) e sãocompreendidos pela invenção. Com base nos ensinamentos descritos aqui e ono conhecimento da arte, seria possível identificar outros marcadores ehaplótipos sem experimentação desnecessária (p. ex., por meio de regiões deseqüenciamento de LD Bloco A em sujeitos com, e sem, câncer ou por meiode marcadores de genotipificação que estão em forte LD com marcadorese/ou haplótipos aqui descritos). Em uma concretização, o(s) marcador(s) ouhaplótipo compreende pelo menos um dos marcadores na Tabela 13. Em outraconcretização, o(s) marcador(s) ou haplótipo compreendendo alelo A ders 1447295 e/ou o alelo 8 de DG8S737.

Em determinados métodos aqui descritos, um indivíduo que seencontra em risco de câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) é umindivíduo em quem se identifica um haplótipo de risco, ou um indivíduo emque se identificou marcadores de risco. Em uma concretização, a intensidadeda associação de um marcador ou haplótipo é medido de acordo com o riscorelativo (RR). RR é a relação da incidência da condição entre sujeitos queportam uma cópia do marcador ou haplótipo para a incidência da condiçãoentre sujeitos que não portam o marcador ou haplótipo. Esta relação éequivalente à relação da incidência da condição entre sujeitos que portamduas cópias do marcador ou haplótipo para a incidência da condição entresujeitos que portam uma cópia do marcador ou haplótipo. Em umaconcretização, o marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo de pelomenos 1,2. Em outras concretizações, o marcador ou haplótipo apresenta umrisco relativo de pelo menos 1,3, pelo menos 1,4, pelo menos 1,5, pelo menos2,0, pelo menos 2,5, pelo menos 3,0, pelo menos 3.5, pelo menos 4,0, ou pelomenos 5,0.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar suscetibilidade a câncer da próstata compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade acâncer da próstata, e o marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo depelo menos 1,5. Em outra concretização, o marcador ou haplótipo apresentaum risco relativo de pelo menos 2,0.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar suscetibilidade a câncer de mama compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade acâncer de mama, e o marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo depelo menos 1,3.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar suscetibilidade a câncer do pulmão compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade acâncer do pulmão, e o marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo depelo menos 1,3.

Em uma concretização, a invenção é um método dediagnosticar suscetibilidade a melanoma compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Blõco~A~e7óu~Chr8q24:21, sendo-que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade amelanoma, e o marcador ou haplótipo apresenta um risco relativo de pelomenos 1,5. Em outra concretização, a invenção é um método de diagnosticarsuscetibilidade a melanoma cutâneo maligno compreendendo detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21, sendoque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma suscetibilidade amelanoma cutâneo maligno, e o marcador ou haplótipo apresenta um riscorelativo de pelo menos 1,7.

Em outra concretização, significância associada com ummarcador ou haplótipo é medida por meio de um risco relativo. Em umaconcretização, um risco incrementado significativo é medido como um riscorelativo de pelo menos cerca de 1,2, incluindo, mas sem limitação: 1,2, 1,3,1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 e 1,9. Em uma concretização adicional, um risco relativode pelo menos 1,2 é significativo. Em uma concretização adicional, um riscorelativo de pelo menos cerca de 1,5 é significante. Em uma concretizaçãoadicional, um aumento de risco significativo é de pelo menos cerca de 1,7.

Em outra concretização, um risco diminuído significativo é medido como umrisco relativo inferior a um, incluindo, embora sem limitação: menos de 0,8,0,7, 0,6, 0,5 e 0,4. Em uma concretização adicional, um risco relativo inferiora 0,8 é significante. Em uma concretização adicional, um risco relativoinferior a 0,6 é significante.

Em outra concretização adicional, significância associada comum marcador ou haplótipo é medida por meio de um percentual. Em umaconcretização, um aumento ou diminuição significante de risco é de pelomenos cerca de 20%, incluindo, embora sem limitação cerca de 25%, 30%,35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% e98%. Em uma concretização adicional, um aumento ou diminuiçãosignificante de risco é de pelo menos cerca de 50%. Assim, como usado aqui,o termo "suscetibilidade a" um câncer indica que fia úm risco~mãiõr ou"menor-do câncer, por um valor que é significante, quando um determinado marcador(alelo marcador) ou haplótipo está presente; a significância é medida comoindicado acima. Os termos "menor suscetibilidade a" um câncer e "proteçãocontra" um câncer, como usado aqui, indicam que o risco relativo é diminuídocorrespondentemente quando um determinado outro marcador ou haplótipoestá presente. No entanto, compreende-se que identificar se um risco éclinicamente significante também pode depender de uma variedade de fatores,incluindo a doença específica, o marcador ou haplótipo, e, freqüentemente,fatores ambientais.

Concretizações particulares da invenção compreendemmétodos de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer dapróstata (ρ. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma) em um indivíduo, compreendendo avaliar no indivíduo apresença ou freqüência de SNPs e/ou microssatélites em, compreendendoporções de, a região de ácido nucleico associada com LD Bloco A e/ouChr8q24.21, sendo que um excesso ou freqüência maior dos SNPs e/oumicrossatélites em comparação com um indivíduo de controle saudável éindicativa de que o indivíduo tem câncer, ou é suscetível a câncer (ver, p. ex.,Tabelas 1 e 13 (abaixo) para SNPs e marcadores de microssatélites quepodem ser usados como ferramentas de seleção e/ou são componentes dehaplótipos). Estes marcadores de microssatélites e SNPs podem seridentificados em haplótipos. Por exemplo, um haplótipo pode incluirmarcadores de microssatélites e/ou SNPs, como aqueles apresentados nasTabelas abaixo. A presença do marcador ou haplótipo é indicativa de câncer,ou de uma suscetibilidade a câncer, e, portanto, é indicativa de um indivíduoque é um bom candidato para métodos terapêuticos e/ou profiláticos. Estesmarcadores e haplótipos podem ser usados como ferramentas de seleção.Outras concretizações particulares da invenção compreendem métodos dediagnosticar uma suscetibilidade ao câncer em um indivíduo, compreendendodetectar um ou mais marcadores em um ou mais sítios polimórficos, sendoque o um ou mais sítios polimórficos encontram-se em desequilíbrio deligação com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21,

Utilidade do teste genético

O conhecimento acerca de uma variante genética que confereum risco de desenvolver câncer oferece a oportunidade de aplicar um testegenético para diferenciar entre indivíduos com risco incrementado dedesenvolver a doença (i.e. portadores da variante de risco) e aqueles commenor risco de desenvolver a doença (i.e. portadores da variante protetora).

Os valores de centrais de testes genéticos, para indivíduos pertencentes aambos os grupos mencionados acima, representam as possibilidades de oclínico diagnosticar a doença em um estágio precoce e proporcionam aoclínico informação acerca do prognóstico/agressividade da doença parapermitir tratamento mais apropriado.

1. Para auxiliar a detecção precoce

A aplicação de um teste genético para câncer da próstata podeproporcionar uma oportunidade para a detecção da doença em um estado maisprecoce que leva a taxas de cura mais elevadas, se encontrado localmente, eaumenta as taxas de sobrevida minimizando espalhamento regional e distantedo tumor.

No caso de câncer da próstata, um teste genético aumentarámui provavelmente a sensibilidade e especificidade do teste de antígenoespecífico para próstata (PSA, Prostate Specific Antigen) já aplicadogeralmente e o exame retal digital (DRE, Digital Rectal Examination). Istopode levar a taxas menores de falsos positivos (minimizando assimprocedimentos desnecessários, como biópsias com agulha) e falsos negativos(aumentando com isso a detecção de doença oculta e minimizando a morbideze a mortalidade devida ao PCA).

2. Para determinar a agressividade

Testes genéticos podem fornecer informação acerca deindicadores prognósticos pré-diagnósticos e permitir a identificação dosindivíduos com alto ou baixo risco de tipos agressivos de tumor que podemlevar à modificação da estratégias de seleção. Por exemplo, um indivíduodeterminado a ser um portador de um alelo de alto risco para odesenvolvimento de câncer agressivo da próstata provavelmente serásubmetido a testes de PSA e exames mais freqüentes, e apresentará um menorlimiar para biópsia com agulha biópsia com agulha na presença de um valoranormal de PSA. Adicionalmente, a identificação de indivíduos que sãoportadores de alelos de alto risco ou de baixo risco para tipos de tumoragressivos levará à modificação em estratégias de tratamento. Por exemplo, secâncer da próstata for diagnosticado em um indivíduo que é um portador deum alelo que confere risco incrementado de desenvolver uma forma agressivade câncer da próstata, então o clínico também poderá recomendar umaestratégia de tratamento mais agressiva, como uma prostatectomia em lugarde uma estratégia de tratamento menos agressiva.

Como é de conhecimento na arte, o antígeno específico parapróstata (PSA, Prostate Specific Antigen) é uma proteína que é secretadapelas células epiteliais da glândula da próstata, incluindo células de câncer.

Um nível elevado no sangue indica uma condição anormal da próstata, querbenigna ou maligna. PSA é usado para detectar problemas potenciais naglândula da próstata e para acompanhar o progresso de terapia de câncer dapróstata terapia. Níveis de PSA acima de 4 ng/ml são indicativos da presençade câncer da próstata (embora, como é de conhecimento na arte e descritoaqui, o teste nem é muito específico ou sensível).

Em uma concretização, o método da invenção é realizado emcombinação com (seja antes, concorrentemente, ou após) um ensaio de PSA.

Em uma concretização particular, a presença de um marcador ou haplótipo,em conjunto com o sujeito apresentando um nível de PSA maior que 4 ng/ml,é indicativa de um câncer mais agressivo da próstata e/ou um prognósticopior. Como descrito aqui, marcadores particulares e haplótipos estãoassociados com câncer da próstata com alta [classificação de] Gleason (i.e.,mais agressivo). Em outra concretização, a presença de um marcador ouhaplótipo, em um paciente que apresenta um nível normal de PSA (p. ex.,inferior a 4 ng/ml), é indicativa de um câncer da próstata com alto escore deGleason (i.e., mais agressivo) e/ou de um prognóstico pior. Um "prognósticopior" ou "prognóstico ruim" ocorre quando é mais provável que o câncer sedesenvolva além dos limites da glândula da próstata, atingindo metástase,escapando terapia e/ou matando o hospedeiro.

Em uma concretização, a presença de um marcador ouhaplótipo é indicativa de uma predisposição a um rearranjo somáticodeChr8q24.21 (p. ex., uma ou mais de uma amplificação, uma translocação,uma inserção e/ou deleção) em um tumor ou precursor do mesmo. O rearranjosomático por si só pode levar subseqüentemente a uma forma mais agressivade câncer da próstata (p. ex., um grau histológico mais elevado, comorefletido por um escore de Gleason mais elevado ou um estágio maisavançado no diagnóstico, uma progressão incrementada de câncer da próstata(p. ex., a um estágio mais avançado), um resultado pior (p. ex., em termos demorbidez, complicações ou morte)). Como é de conhecimento geral na arte,um escore de Gleason é um método amplamente usado para classificar tecidode câncer da próstata quanto ao grau de perda da arquitetura glandular normal(tamanho, forma e diferenciação das glândulas). Uma classificação de 1 a 5 éatribuída sucessivamente a cada um dos dois padrões de tecidos maispredominantes presentes na amostra de tecido examinada e são adicionadosem conjunto para produzir um escore de Gleason total ou combinada (escalade 2 a 10). Números elevados indicam pouca diferenciação e, portanto, câncermais agressivo.

Câncer agressivo da próstata é câncer que cresce além dapróstata, atinge metástase e eventualmente mata o paciente. Como descritoaqui, uma medida substituta de agressividade é um escore de Gleasoncombinado alto. Quanto maior a classificação numa escala de 2 a 10, tantomais provável é que o paciente apresente doença agressiva.

Como usado aqui e exceto se observado diferentemente, otermo "estágio" é usado para definir o tamanho e a extensão física de umcâncer (p. ex., câncer da próstata). Um método de determinar o estágio devários cânceres é o método TNM, sendo que no acrônimo TNM, T representao tamanho do tumor e a invasividade (p. ex., o tumor primário na próstata); Nrefere-se ao envolvimento nodal (p. ex., câncer da próstata que se espalhoupara nódulos linfáticos); e M indica a presença ou ausência de metástase(disseminação para um sítio distante).

MÉTODOS DA INVENÇÃO

Métodos para o diagnóstico de suscetibilidade a câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma) são descritos aqui e são compreendidos pelainvenção. Kits para analisar uma amostra de um sujeito visando detectar asuscetibilidade a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo dapróstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) também sãocompreendidos pela invenção. Em outras concretizações, a invenção é ummétodo para diagnosticar câncer associado com Chr8q24.21 (p. ex., câncer dapróstata associado com Chr8q24.21, câncer de mama associado comChr8q24.21, câncer do pulmão associado com Chr8q24.21, melanomaassociado com Chr8q24.21) em um sujeito.

DIAGNÓSTICO E ENSAIOS DE SELEÇÃO DA INVENÇÃO

Em determinadas concretizações, a presente invenção refere-sea métodos de diagnosticar, ou auxiliar no diagnóstico de câncer ou de umasuscetibilidade a câncer, por meio de detecção de marcadores genéticosparticulares que aparecem mais freqüentemente em sujeitos com câncer ou emsujeitos que são suscetíveis a câncer. Em uma concretização particular, ainvenção é um método de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer dapróstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão e/ou melanoma por meio de detecção de um ou mais marcadoresgenéticos particulares (p. ex., os marcadores ou haplótipos aqui descritos). Apresente invenção descreve métodos com que a detecção de marcadoresparticulares ou haplótipos é indicativa de uma suscetibilidade a câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma). Referidos ensaios prognósticos ou preditivostambém podem ser usados para determinar tratamento profilático de umsujeito antes do início de sintomas associados com referidos cânceres.Adicionalmente, in determinadas outras concretizações, apresente invenção refere-se a métodos de diagnosticar, ou auxiliar nodiagnóstico de, uma menor suscetibilidade a câncer, por meio de detecção demarcadores genéticos particulares ou haplótipos que ocorrem menosfreqüentemente no câncer. Em uma concretização particular, a invenção é ummétodo de diagnosticar uma menor suscetibilidade a câncer da próstata (p.ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão e/oumelanoma por meio de detecção de um ou mais marcadores genéticosparticulares (p. ex., os marcadores ou haplótipos aqui descritos). A presenteinvenção descreve métodos, com que a detecção de marcadores particularesou haplótipos é indicativa de uma menor suscetibilidade a câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma), ou de um haplótipo ou marcador protetorcontra o câncer.

Como descrito e exemplificado aqui, marcadores particularesou haplótipos associados com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21 (p. ex.,haplótipos) são ligados a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma). Emuma concretização, o marcador ou haplótipo é um que confere um riscosignificativo de suscetibilidade a câncer da próstata, câncer de mama, câncerdo pulmão e/ou melanoma. Em outra concretização, a invenção refere-se amétodos de diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer dapróstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma) em um sujeito, por meio de seleção para encontrar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A e/ou Chr8q24.21 que estápresente com maior freqüência em um sujeito apresentando, ou que ésuscetível a, câncer (afetado), em comparação com a freqüência de suapresença em um sujeito saudável (controle). Em determinadas concretizações,o marcador ou haplótipo apresenta um valor ρ < 0,05,Nestas concretizações, a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de uma suscetibilidade a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma). Estes métodos diagnósticos envolvem detectar a presença ouausência de um marcador ou haplótipo que está associado com LD Bloco Ae/ou Chr8q24.21. Os haplótipos aqui descritos incluem combinações de váriosmarcadores genéticos (p. ex., SNPs, microssatélites). A detecção dosmarcadores genéticos particulares que constituem os haplótipos particularespode ser realizada por meio de uma variedade de métodos aqui descritos e/ouconhecidos na arte. Por exemplo, marcadores genéticos podem ser detectadosno nível do ácido nucleico (p. ex., por meio de seqüenciamento direto denucleotídeos) ou no nível dos aminoácidos se o marcador genético afetar aseqüência codificante de uma proteína codificada por um ácido nucleicoassociado com Chr8q24.21 (p. ex., por meio de seqüenciamento de proteínaou por meio de ensaios imunológicos que reconhecem uma proteína do tiporeferido). Como usado aqui, um "ácido nucleico associado com Chr8q24.21"refere-se a um ácido nucleico que é ou que corresponde a um ácido nucleicoque é ou que corresponde a um fragmento de uma seqüência de DNAgenômico de Chr8q24.21. Um "ácido nucleico associado com LD Bloco A"refere-se a um ácido nucleico que é, ou que corresponde a, um fragmento deuma seqüência de DNA genômico de LD Bloco A.

Em uma concretização, o diagnóstico de uma suscetibilidade acâncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncerde mama, câncer do pulmão, melanoma) pode ser realizado usando-semétodos de hibridização, como análise Southern, análise Northern, e/ouhibridizações in situ (ver Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel,F. et ai., eds., John Wiley & Sons, incluindo todos os suplementos). Umaamostra biológica de um indivíduo ou sujeito de teste (uma "amostra deteste") de DNA genômico, RNA, ou cDNA é obtida de um sujeito suspeito deapresentar, de ser suscetível a, ou predisposto a câncer (o "sujeito de teste").O sujeito pode ser um adulto, criança, ou feto. A amostra de teste pode ser dequalquer fonte que contém DNA genômico, como uma amostra de sangue,amostra de fluido amniótico, amostra de fluido cerebroespinhal, ou amostrade tecido da pele, músculo, mucosa bucal ou conjuntiva, placenta, tratogastrintestinal ou outros órgãos. E possível obter uma amostra de teste deDNA de tecido ou células fetais por meio de métodos apropriados, como pormeio de amniocentese ou amostragem de vilosidade coriônica. A amostra deDNA, RNA, ou cDNA é então examinada. A presença de um alelo dohaplótipo pode ser indicada por meio de hibridização específica paraseqüência de uma sonda de ácido nucleico específica para o alelo particular.Uma sonda específica para seqüência pode ser direcionada para hibridizarcom o DNA genômico, RNA, ou cDNA. Uma "sonda de ácido nucleico",como usado aqui, pode ser uma sonda de DNA ou uma sonda de RNA quehibridiza com uma seqüência complementar. Alguém com prática na artehaverá de saber como projetar uma sonda do tipo referido para que ocorrahibridização específica-para-seqüência apenas se um alelo particular estiverpresente em uma seqüência genômica de uma amostra de teste.

Para diagnosticar uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncerda próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma), forma-se uma amostra de hibridização contactando-se aamostra de teste contendo um ácido nucleico associado com LD Bloco A e/ouassociado com Chr8q24.21, com pelo menos uma sonda de ácido nucleico.Um exemplo não limitante de uma sonda para detectar mRNA ou DNAgenômico é uma sonda de ácido nucleico marcada que é capaz de hibridizarcom seqüências de mRNA ou DNA genômico aqui descritas. A sonda deácido nucleico pode ser, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico decomprimento pleno, ou um porção da mesma, como um oligonucleotídeo comum comprimento de pelo menos 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos queé suficiente para hibridizar em condições estringentes com mRNA ou DNAgenômico apropriado. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ser todaou uma porção da SEQ ID N0:1, compreendendo opcionalmente pelo menosum alelo contido nos haplótipos aqui descritos, ou a sonda pode ser aseqüência complementar de uma seqüência do tipo referido. Em umaconcretização particular, a sonda de ácido nucleico é uma porção da SEQ IDNO: 1, compreendendo opcionalmente pelo menos um alelo contido noshaplótipos aqui descritos, ou a sonda pode ser a seqüência complementar deuma seqüência do tipo referido. Outras sondas vantajosas para uso nos ensaiosdiagnósticos da invenção são descritos aqui.

A amostra de hibridização é conservada em condições que sãosuficientes para permitir hibridização específica da sonda de ácido nucleicocom o ácido nucleico associado com Bloco de LDA A e/ou ácido nucleicoassociado com Chr8q24.21. "Hibridização específica", como usado aqui,indica hibridização exata (p. ex., sem mal-pareamentos). Hibridizaçãoespecífica pode ser realizada em condições de alta estringência ou condiçõesde estringência moderada como descrito aqui. Em uma concretização, ascondições de hibridização para hibridização específica são alta estringência(p. ex., como descrito aqui).

Hibridização específica, se presente, é então detectada usando-se métodos convencionais. Se ocorrer hibridização específica entre a sonda deácido nucleico e o ácido nucleico associado com Bloco de LDA A e/ouassociado com Chr8q24.21 na amostra de teste, então a amostra contém oalelo que é complementar ao nucleotídeo que está presente na sonda de ácidonucleico. O processo pode ser repetido para os outros marcadores queconstituem o haplótipo, ou é possível usar múltiplas sondas concorrentementepara detectar mais de um marcador em um dado momento. Também épossível projetar uma sonda simples contendo mais de um marcador de umhaplótipo particular (p. ex., uma sonda contendo alelos complementares a 2,3, 4, 5 ou todos os marcadores que constituem um haplótipo particular). Adetecção dos marcadores particulares do haplótipo na amostra é indicativa deque a fonte da amostra apresenta o haplótipo particular (p. ex., um haplótipo)e, portanto, é suscetível a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma).

Em outro método de hibridização, análise Northern (verCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley& Sons, supra) é usado para identificar a presença de um polimorfismoassociado com câncer ou uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer dapróstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma). Para análise Northern, obtém-se uma amostra de teste deRNA do sujeito através de meios apropriados. Como descrito aqui,hibridização específica de uma sonda de ácido nucleico a RNA do sujeito éindicativa de um alelo particular complementar à sonda. Para exemplosrepresentativos de uso de sondas de ácido nucleico, ver, por exemplo,Patentes dos Estados Unidos nums. 5.288.611 e 4.851.330.

Adicionalmente, ou alternativamente, é possível usar umasonda de ácido nucleico peptídico (PNA, peptide nucleic acid) adicionalmentea, ou em lugar de, uma sonda de ácido nucleico nos métodos de hibridizaçãoaqui descritos. Um PNA é uma emulação de DNA apresentando uma espinhadorsal inorgânica semelhante a peptídio, como unidades de N-(2-aminoetil)glicina, com uma base orgânica (A, G, C, T ou U) ligada aonitrogênio de glicina via um ligante de metileno carbonila (ver, por exemplo,Nielsen, P., et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 (1994)). A sonda de PNA pode serprojetada para hibridizar especificamente a uma molécula em uma amostrasuspeita de conter um ou mais dos marcadores genéticos de um haplótipo queestá associado com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivoda próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma). Hibridização dasonda de PNA é diagnostica para câncer ou uma suscetibilidade a câncer.Em uma concretização da invenção, diagnóstico de câncer oude uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) érealizado por meio de amplificação enzimática de um ácido nucleico dosujeito. Por exemplo, uma amostra de teste contendo DNA genômico pode serobtida do sujeito e é possível usar a reação em cadeia de polimerase (PCR)para amplificar um ácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácidonucleico associado com Chr8q24.21 na amostra de teste. Como descrito aqui,a identificação de um marcador particular ou haplótipo (p. ex., um haplótipo)associado com a região de Chr8q24.21 amplificada e/ou região de LD BlocoA, pode ser realizada usando-se uma variedade de métodos (p. ex., análise deseqüências, análise por meio de digestão de restrição, hibridização específica,ensaios de polimorfismo de conformação de filamento simples (SSCP, singlestranded conformation polymorphism), análise eletroforética, etc.). Em outraconcretização, o diagnóstico é realizado por meio de análise de expressãousando-se PCR quantitativa (ciclização térmica cinética). Esta técnica podeusar, por exemplo, tecnologias comercialmente obteníveis, como TaqMan®(Applied Biosystems, Foster City, CA), para permitir a identificação depolimorfismos e haplótipos (p. ex., haplótipos). A técnica pode avaliar apresença de uma alteração na expressão ou composição de um polipeptídio ouvariante(s) de recomposição que é codificada por Chr8q24.21 e/ou LD BlocoA. Adicionalmente, a expressão da(s) variante(s) pode ser quantificada comofisicamente ou funcionalmente diferente.

Em outro método da invenção, é possível usar análise por meiode digestão de restrição para detectar um alelo particular se o alelo resultar nacriação ou na eliminação de um sítio de restrição relativamente a umaseqüência de referência. A amostra de teste contendo DNA genômico é obtidado sujeito. E possível usar PCR para amplificar regiões particulares de -Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A na amostra de teste do sujeito de teste. Análisede polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP,Restriction fragment length polymorphism) pode ser realizada, p. ex., comodescrito em Current Protocols in Molecular Biology, supra. O padrão dedigestão do fragmento de DNA relevante indica a presença ou ausência doalelo particular na amostra.

Também é possível usar análise de seqüências para detectaralelos específicos em sítios polimórficos associados com Chr8q24.21 e/ou LDBloco A. Portanto, em uma concretização, a determinação da presença ouausência de um marcador particular ou haplótipo (p. ex., um haplótipo)compreende análise de seqüências. Por exemplo, uma amostra de teste deDNA ou RNA pode ser obtida do sujeito de teste. E possível usar PCR ououtros métodos apropriados para amplificar uma porção de Chr8q24.21 e/ouLD Bloco A, e a presença de um alelo específico pode então ser detectadadiretamente por meio de seqüenciamento do sítio polimórfico do DNAgenômico na amostra.

Oligonucleotídeos específicos para alelos também podem serusados para detectar a presença de um alelo particular em um sítiopolimórfico associada com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A, por meio do uso dehibridização de manchamento pontual [dot-blot\ de oligonucleotídeosamplificados com sondas de oligonucleotídeos específicos para alelo (ASO,alelle-specifie oligonueleotide) (ver, por exemplo, Saiki, R. et ai., Nature,324:163-166 (1986)). Um "oligonucleotídeo específico para alelo" (tambémreferida aqui como uma "sonda de oligonucleotídeo específico para alelo") éum oligonucleotídeo com aproximadamente de 10 a 50 pares de bases ou comaproximadamente de 15 a 30 pares de bases, que hibridiza especificamente auma região do Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A, e que contém um aleloespecífico em um sítio polimórfico (p. ex., um polimorfismo descrito aqui).Uma sonda de oligonucleotídeo específico para alelo que é específica para umou mais polimorfismos particulares associados com Chr8q24.21 e/ou LDBloco A pode ser preparada usando-se métodos convencionais (ver, p. ex.,Current Protocols in Molecular Biology, supra). É possível usar PCR paraamplificar a região desejada de Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A. O DNAcontendo a região amplificada do Chr8q24.21 e/ou região de LD Bloco Apode ser submetido a manchamento pontual [dot blotting] usando-se métodosconvencionais (ver, p. ex., Current Protocols in Molecular Biology, supra), eo manchamento pode ser contactado com a sonda de oligonucleotídeo. Apresença de hibridização específica da sonda com a região amplificada comChr8q24.21 e/ou região de LD Bloco A pode, então, ser detectada.Hibridização específica de uma sonda de oligonucleotídeo específico paraalelo ao DNA do sujeito é indicativa de um alelo específica em um sítiopolimórfico associado com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A (ver, p. ex., Gibbs,R. et ai, Nucleic Acids Res., 17:2437-2448 (1989) e WO 93/22456).

Com a adição de referidos análogos como ácidos nucleicosbloqueados (LNAs, locked nucleic acids), o tamanho de iniciadores e sondaspode ser reduzido até meras 8 bases. LNAs são uma classe inédita deanálogos de DNA bicíclicos em que as posições 2' e 4' posições no anelfuranose são ligadas via uma porção O-metileno (óxi-LNA), S-metileno (tio-LNA), ou amino metileno (amino-LNA). O que é comum a todas estasvariantes de LNA é uma afinidade por ácidos nucleicos complementares, queé de longe a mais alta reportada para um análogo de DNA. Por exemplo,mostrou-se que nonâmeros totalmente óxi-LNA particulares apresentamtemperaturas de fusão (Tm) de 64°C e 74°C quando em complexo com DNAcomplementar ou RNA, respectivamente, em oposição a 28°C para ambos,DNA e RNA, para o nonâmero de DNA correspondente. Aumentossubstanciais da Tm também são obtidos quando se usa monômeros de LNAem combinação com monômeros de RNA ou DNA convencionais. No caso deiniciadores e sondas, dependendo de onde os monômeros de LNA sãoincluídos (p. ex., na ponta 3', na ponta 5', ou no meio), a Tm poderia serincrementada consideravelmente.

Em outra concretização, conjuntos de sondas deoligonucleotídeos que são complementares para a seqüência-alvo desegmentos de ácido nucleico de um sujeito podem ser usados para identificarpolimorfismos em um ácido nucleico associado com Chr8q24.21 e/ou ácidonucleico associado com LD Bloco A. Por exemplo, é possível usar umconjunto de oligonucleotídeos. Conjuntos de oligonucleotídeos compreendemtipicamente uma pluralidade de diferentes sondas de oligonucleotídeos quesão acopladas a uma superfície de um substrato em diferentes locais. Estesconjuntos de oligonucleotídeos, também descritos como "Genechips™", têmsido descritos geralmente na arte (ver, p. ex., Patente dos Estados Unidos n°5.143.854, Publicações de Patentes PCT nums. WO 90/15070 e 92/10092).Estes conjuntos podem ser produzidos de uma maneira geral usando-semétodos de síntese mecânica ou métodos de síntese dirigida com luz queincorporam uma combinação de métodos fotolitográficos e métodos desíntese de oligonucleotídeos de fase sólida (Fodor, S. et ai., Science, 251:767-773 (1991); Pirrung et ai., Patente dos Estados Unidos n° 5.143.854 (vertambém Pedido PCT publicado n0 WO 90/15070); e Fodor. S. et ai., PedidoPCT publicado n° WO 92/10092 e Patente dos Estados Unidos n° 5.424.186,sendo que os ensinamentos completos de cada uma são incorporados aqui porreferência). Técnicas para a síntese destes conjuntos usando métodos desíntese mecânica encontram-se descritos, por exemplo, na Patente dos EstadosUnidos n° 5.384.261; cujos ensinamentos completos uma são incorporadosaqui por referência. Em outro exemplo usa-se conjuntos lineares.

Uma vez que um conjunto de oligonucleotídeos é preparado,deixa-se um ácido nucleico de interesse hibridizar com o conjunto. Adetecção de hibridização é uma detecção de um alelo particular no ácidonucleico de interesse. Hibridização e varredura são realizadas geralmente pormeio de métodos aqui descritos e também, p. ex., nos Pedidos PCTpublicados nums. WO 92/10092 e WO 95/11995, e Patente dos EstadosUnidos n° 5.424.186, sendo que os ensinamentos completos de cada uma sãoincorporados aqui por referência. De maneira resumida, uma seqüência deácido nucleico - alvo, que inclui um ou mais marcadores polimórficospreviamente definidos, é amplificada por meio de técnicas de amplificaçãobem conhecidas (p. ex., PCR). Tipicamente, isto envolve o uso de seqüênciasde iniciadores que são complementares aos dois filamentos da seqüência-alvo,tanto a montante como a jusante, do sítio polimórfico. Também é possívelusar técnicas assimétricas. Alvo amplificado, geralmente incorporando ummarcador, é então deixado hibridizar com o conjunto em condiçõesapropriadas que permitem hibridização específica para seqüência. Apóscompletamento da hibridização e lavagem do conjunto, o conjunto éescaneado para determinar a posição no conjunto com que a seqüência-alvohibridiza. Os dados de hibridização obtidos da varredura são tipicamente emforma de intensidades de fluorescência como uma função da localização noconjunto.

Embora descritos primariamente em termos de um único blocode detecção, p. ex., para detecção de um único sítio polimórfico, conjuntospodem incluir múltiplos blocos de detecção, e, portanto, são capazes deanalisar múltiplos polimorfismos específicos (p. ex., polimorfismos múltiplosde um haplótipo particular (p. ex., um haplótipo)). Em arranjos alternativos,se compreenderá geralmente que blocos de detecção podem ser agrupados emum único conjunto ou em conjuntos múltiplos separados de forma que épossível usar condições ótimas variáveis durante a hibridização do alvo com oconjunto. Por exemplo, freqüentemente será desejável proporcionar adetecção daqueles polimorfismos que se enquadram em extensões ricas em G-C de uma seqüência genômica, separadamente daqueles que se enquadram emsegmentos ricos em A-T. Isto permite a otimização separada de condições dehibridização para cada situação.Descrições de uso adicionais de conjuntos deoligonucleotídeos para detecção de polimorfismos podem ser encontradas, porexemplo, nas Patentes dos Estados Unidos nums. 5.858.659 e 5.837.832,sendo que os ensinamentos integrais de ambas são incorporados aqui porreferência.

É possível usar outros métodos de análise de ácido nucleicopara detectar um alelo particular em um sítio polimórfico associado comChr8q24.21 e/ou LD Bloco A. Métodos representativos incluem, porexemplo, seqüenciamento manual direto (Church e Gilbert, Proc. Natl. Acad.Sci USA, 81: 1991-1995 (1988); Sanger, F., et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA,74:5463-5467 (1977); Beavis, et al., Patente dos Estados Unidos n°5.288.644); seqüenciamento fluorescente automatizado; ensaios depolimorfismo de conformação de filamento simples (SSCP, single strandeonformation polymorphism); eletroforese pinçada em gel desnaturador(CDGE, elamped denaturing gel eleetrophoresis); eletroforese em gel degradiente desnaturador (DGGE, denaturing gradient gel eleetrophoresis)dgge (Sheffield, V, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 55:232-236 (1989)),análise de desvio de mobilidade (Orita, M., et al., Proc. Natl Acad. Sei USA,86:2766-2770 (1989)), análise de enzima de restrição (Flavell, R., et al., Cell,15:25-41 (1978); Geever, R, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 78:5081-5085(1981)); análise de heterodúplice; clivagem química de malpareamento(CMC, chemical mismatch cleavagé) (Cotton, R., et al., Proc. Natl Acad. SciUSA, 85:4397-4401 (1985)); ensaios de proteção de RNase (Myers, R., et al,Science, 230:1242-1246 (1985); uso de polipeptídios que reconhecemmalpareamentos de nucleotídeos, como proteína mutS de E. coli; e PCRespecífica para alelo.

Em outra concretização da invenção, diagnóstico de câncer oude uma suscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) podeser realizado examinando-se a expressão e/ou composição de um polipeptídiocodificado por um ácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácidonucleico associado com Chr8q24.21 naqueles casos em que o(s) marcador(es)genético(s) ou haplótipo aqui descrito resulta em uma alteração nacomposição ou expressão do polipeptídio. Como descrito aqui, genesparticulares e genes preditos que mapeiam o Chr8q24.21 incluem, p. ex.,POU5FLC20 (n° de acesso Genbank AF268618; gene conhecido), n° deacesso Genbank BE676854 (EST), n° de acesso Genbank AL709378 (EST),n° de acesso Genbank BXl08223 (EST), n° de acesso Genbank AA375336(EST), n° de acesso Genbank CB104826 (EST), n° de acesso GenbankBG203635 (EST), n° de acesso Genbank AWl83883 (EST), n° de acessoGenbank BM804611 (EST), C-MYC (n° de acesso Genbank NM_002467;gene conhecido) e PVTl (n° de acesso Genbank XM_372058; geneconhecido). Assim, o diagnóstico de uma suscetibilidade a câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma) pode ser preparado examinando-se a expressãoe/ou composição de um destes polipeptídios, ou outro polipeptídio codificadopor um ácido nucleico associado com Chr8q24.21 e/ou ácido nucleicoassociado com LD Bloco A, naqueles casos em que o marcador genético ouhaplótipo aqui descrito resulta numa alteração da composição ou expressão dopolipeptídio. Os haplótipos e marcadores aqui descritos que podem mostrarassociação com câncer também podem desempenhar um papel por meio deseu efeito sobre um ou mais destes genes próximos. Possíveis mecanismosque afetam estes genes incluem, p. ex., efeitos sobre a transcrição, efeitossobre a recomposição de RNA, alterações nas quantidades relativas de formasde recomposição alternativas de mRNA, efeitos sobre a estabilidade do RNA,efeitos sobre o transporte do núcleo para o citoplasma, e efeitos sobre aeficiência e precisão de tradução.

O gene c-myc no Chr8q24.21 codifica a proteína c-MYC quefoi identificado ao longo dos últimos 20 anos como a contraparte celular dooncogene viral v-myc do retrovírus da mielocitomatose aviária (Vennstrom etal., J. Virology 42:773-19 (1982)). A proteína c-MYC é um fator detranscrição que é rapidamente induzido por meio de tratamento de célulascom estímulos mitogênicos. c-MYC regula a expressão de muitos genes pormeio de ligação de caixas [boxes] E (CACGTG) em um complexoheterodimérico com uma proteína denominada MAX. Muitos dos genesregulados com c-MYC estão envolvidos no controle do ciclo celular. c-MYCpromove progressão de ciclo celular, inibe diferenciação celular e induzapoptose. c-MYC também apresenta um efeito negativo sobre o reparo deDNA de filamento duplo (Karlsson, A, et al., Proc. Natl Aead. Sci USA100(17): 9974-79 (2003)). c-MYC também promove angiogênese (Ngo, C.V.,et al., Cell Growth Differ. 11(4):201-10 (2000); Baudino T.A., et al., GenesDev. 16(19):2530-43 (2002)).

O gene c-myc é altamente carcinogênico in vitro e in vivo. c-MYC sinergiza com proteínas que inibem apoptose, como BCL, BCL-Xl oucom a perda de p53 ou ARF na linfomagênese em camundongos transgênicos(Strasser et al., Nature 348:331-333 (1990); Blyth, K., et al., Oncogene10:1717-23 (1990); Elson, A., et al., Oncogene 11:181-90 (1995); Eischen,CM., et al., Genes Dev. 13:2658-69 (1999)).

A amplificação e superexpressão do gene c-myc é observadano câncer da próstata e é freqüentemente associada com tumores agressivos,independência de hormônios e um prognóstico ruim (Jenkins, R.B., et al.,Câncer Res. 57(3):524-31 (1997); El Gedaily, A., et al., Prostate 46(3): 184-90 (2001); Saramaki, O., et al., Am. J. Pathol. 159(6):2089-94 (2001);Bubendorf, L., et al., Câncer Res. 59(4):803-06 (1999)). c-myc e a região doChr8q24.21 é obtida adicionalmente em tumores da próstata, mama e pulmãoe em melanoma (Blancato J., et al., Br. J. Câncer 90(8): 1612-9 (2004);Kubokura, H., et al., Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 7(4): 197-203 (2001);Treszl5 Α., et al, Cytometry 60B(l):37-46 (2004); Kraehn, G.M., et al, Br. J.Câncer 84(l):72-79 (2001)). Adicionalmente, muitos outros tipos de tumormostram um ganho desta região, incluindo câncer do colo, fígado, ovário,estômago, intestino e bexiga. A combinação todos os tipos de tumores mostraque Chr8q24.21 é a região cromossômica mais freqüentemente obtida comum ganho de aproximadamente 17% de todos os tipos de tumores(www.progenetix.com).

O oncogene está envolvido no linfoma de Burkitt como umresultado de translocações que justapõem c-myc a acentuadores deimunoglobulina, ativando com isso a expressão do gene (Dalla-Favera, R., etal, Proc. Natl. Acad. Sci USA 79(24):7824-27 (1982); Taub, R., et al, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 79(24):7837-41 (1982). Ele também está envolvido nocâncer cervical por meio de integração do papilomavírus humano (HPV,human papillomavirus) próxima do gene. Na maior parte dos casos,integrações com HPV ocorrem numa região que compreende 500 kbcentromérica e 200 kb telomérica do gene c-myc (Ferber, J.M., et al, CâncerGenetics Cytogenetics 154:1-9 (2004); Ferber, M.J., et al, Oncogene22:7233-7242 (2003)).

Dois sítios frágeis, FRA8C e FRA8D, situam-se centroméricose teloméricos com relação ao c-myc, respectivamente, no Chr8q24.21. Sítiosfrágeis são propensos a fragmentação na presença de agentes queinterrompem a síntese de DNA. Considera-se que a replicação de sítiosfrágeis ocorre tardiamente em fase S e mediante indução até mais tarde. Oenvolvimento de sítios frágeis na amplificação cromossômica, translocaçãoe/ou inserção viral pode relacionar-se com a replicação tardia destes sítios, epode iniciar-se uma quebra nas bifurcações de replicação interrompida oupróximo aos mesmos (Hellman, A., et al, Câncer Cell 1:89-97 (2002)).

É possível que os marcadores ou haplótipos descritos aqui noLD Bloco A ou em forte LD com LD Bloco A (como medido sendo r maiordo que 0,2) poderiam afetar a estabilidade da região que leva a amplificaçõesgênicas do gene c-myc ou outras genes próximos. Ou seja, uma pessoapoderia herdar o LD Bloco A ou uma região com forte LD com LD Bloco A(conforme medido sendo r maior do que 0,2) de um ou ambos os pais e,portanto, poderia ter mais probabilidade de apresentar um evento mutacionalsomático mais tarde em uma ou mais células levando à progressão de câncerpara uma forma mais agressiva. Assim, em uma concretização, a identificaçãode um marcador ou haplótipo da invenção (p. ex., um marcador ou haplótipoassociado com LD Bloco A) pode ser usada a diagnosticar umasuscetibilidade a um evento mutacional somático, que pode levar à progressãodo câncer a uma forma mais agressiva.

Em uma concretização, o marcador ou haplótipo nãocompreende um marcador que se encontra localizado na matriz de leituraaberta do c-myc (i.e., chr8:128.705.092-128.710.260 bp na construção 34 doNCBI). Em outra concretização, o marcador ou haplótipo não compreende ummarcador que se encontra localizado na matriz de leitura aberta ou nopromotor do c-myc. Em outra concretização adicional, o marcador ouhaplótipo não compreende um marcador que se encontra localizado nopromotor de c-myc, acentuador ou matriz de leitura aberta. Em outrasconcretizações adicionais, o marcador ou haplótipo não compreende ummarcador que se encontra localizado dentro de 1 kb, 2 kb, 5 kb, 10 kb, 15 kb,20 kb ou 25 kb da matriz de leitura aberta do c-myc.

É possível usar uma variedade de métodos para realizar umadetecção do tipo referido, incluindo ensaios imunossorventes ligados a enzima(ELISA, enzyme linked immunosorbent assays), Western blotting,imunoprecipitações e imunofluorescência. Uma amostra de teste de umsujeito é avaliada quanto à presença de uma alteração na expressão e/ou deuma alteração na composição do polipeptídio codificado por um ácidonucleico associado com Chr8q24.21 e/ou ácido nucleico associado com LDBloco A. Uma alteração na expressão de um polipeptídio codificado por umácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácido nucleico associado comChr8q24.21 pode ser, por exemplo, uma alteração na expressão quantitativado polipeptídio (i.e., a quantidade de polipeptídio produzido). Uma alteraçãona composição de um polipeptídio codificado por um ácido nucleicoassociado com LD Bloco A e/ou ácido nucleico associado com Chr8q24.21 éuma alteração na expressão qualitativa do polipeptídio (p. ex., expressão deum polipeptídio mutante ou de uma variante de recomposição diferente). Emuma concretização, diagnóstico de uma suscetibilidade a câncer (p. ex., câncerda próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer dopulmão, melanoma) é feito por meio de detecção de uma variante derecomposição particular codificada por um ácido nucleico associado comChr8q24.21 e/ou ácido nucleico associado com LD Bloco A, ou um padrãoparticular de variantes de recomposição.

Ambas alterações do tipo referido (quantitativa e qualitativa)também podem estar presentes. Uma "alteração" na expressão ou composiçãodo polipeptídio, como usado aqui, refere-se a uma alteração na expressão oucomposição em uma amostra de teste, em comparação com a expressão oucomposição de polipeptídio codificado por um ácido nucleico associado comLD Bloco A e/ou ácido nucleico associado com Chr8q24.21 em uma amostrade controle.

Uma amostra de controle é uma amostra que corresponde àamostra de teste (p. ex., é do mesmo tipo de células), e é de um sujeito quenão é afetado por, ou que não tem uma suscetibilidade a, câncer (p. ex., umsujeito que não possui um marcador ou haplótipo como descrito aqui). Demaneira similar, a presença de uma ou mais variantes de recomposiçãodiferentes na amostra de teste, ou a presença de quantidadessignificativamente diferentes de variantes de recomposição diferentes naamostra de teste, em comparação com a amostra de controle, pode serindicativa de uma suscetibilidade a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma). Uma alteração na expressão ou composição do polipeptídio naamostra de teste, em comparação com a amostra de controle, pode serindicativa de um alelo específico no caso em que o alelo altera um sítio derecomposição relativo à referência na amostra de controle. E possível usardiversos meios para examinar a expressão ou composição de um polipeptídiocodificado por um ácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácidonucleico associado com Chr8q24.21, incluindo espectroscopia, colorimetria,eletroforese, focalização isoelétrica, e ensaios imunológicos (p. ex., David et al., Patente dos Estados Unidos n° 4.376.110), como imuno-manchamento(ver, p. ex., Current Protocols in Molecular Biology, particularmente capítulo10, acima).

Por exemplo, em uma concretização, é possível usar umanticorpo (p. ex., um anticorpo com um marcador detectável) que é capaz deligação a um polipeptídio codificado por um ácido nucleico associado comLD Bloco A e/ou ácido nucleico associado com Chr8q24.21. Anticorpospodem ser policlonais ou monoclonais. E possível usar um anticorpo intacto,ou um fragmento do mesmo (p. ex., Fv, Fab, Fab', F(ab')2). O termo"marcado", com relação à sonda ou anticorpo, destina-se a compreendermarcação direta da sonda ou anticorpo por meio de acoplamento (i.e., ligaçãofísica) de uma substância detectável a uma sonda ou anticorpo, e tambémmarcação indireta da sonda ou anticorpo por meio de reatividade com outroreagente que é marcado diretamente. Exemplos de marcação indireta incluemdetecção de um anticorpo primário usando-se um anticorpo secundáriomarcado (p. ex., um anticorpo secundário marcado fluorescentemente) emarcação terminal de uma sonda de DNA com biotina de tal forma que possaser detectada com estreptavidina marcada fluorescentemente.

Em uma concretização deste método, o nível ou a quantidadede polipeptídio codificado por um ácido nucleico associado com LD Bloco Ae/ou ácido nucleico associado com Chr8q24.21 em uma amostra de teste écomparado com o nível ou a quantidade do polipeptídio codificado por umácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácido nucleico associado comChr8q24.21 em uma amostra de controle. Um nível ou quantidade dopolipeptídio na amostra de teste que é maior ou inferior do que o nível ouquantidade do polipeptídio na amostra de controle, de tal forma que adiferença é estatisticamente significante, é indicativa de uma alteração naexpressão do polipeptídio codificado pelo ácido nucleico associado comChr8q24.21 e/ou ácido nucleico associado com LD Bloco A, e é diagnósticopara um alelo particular responsável para causar a diferença na expressão.Alternativamente, a composição do polipeptídio codificado por um ácidonucleico associado com LD Bloco A e/ou ácido nucleico associado comChr8q24.21 em uma amostra de teste é comparada com a composição dopolipeptídio codificado por um ácido nucleico associado com LD Bloco Ae/ou ácido nucleico associado com Chr8q24.21 em uma amostra de controle.Em outra concretização, tanto o nível ou quantidade e a composição dopolipeptídio podem ser avaliados na amostra de teste e na amostra decontrole.

Como descrito e exemplificado aqui, marcadores particulares ehaplótipos (p. ex., haplótipo 1, haplótipo la, haplótipos contendo dois ou maismarcadores listados nas Tabelas abaixo) associados com Chr8q24.21 e/ou LDBloco A são ligados a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma). Emuma concretização, a invenção refere-se a um método de diagnosticar umasuscetibilidade ao câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivoda próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) em um sujeito,compreendendo selecionar um marcador ou haplótipo associado com umácido nucleico associado com LD Bloco A e/ou ácido nucleico associado comChr8q24.21 que está presente com maior freqüência em um sujeitoapresentando, ou que é suscetível a, câncer (afetado) em comparação com afreqüência de sua presença em um sujeito saudável (controle). Nestaconcretização, a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umasuscetibilidade a câncer. E possível usar técnicas convencionais paragenotipificação quanto à presença de SNPs e/ou marcadores demicrossatélites associados com câncer, como técnicas à base de fluorescência(Chen, X., et ai., Genome Res., 9:492-498 (1999)), PCR, LCR, PCR embutidae outras técnicas para amplificação de ácido nucleico. Em uma concretização,o método compreende avaliar em um sujeito a presença ou freqüência de umou mais alelos de SNP específicos e/ou alelos de microssatélites que estãoassociados com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A e que estão ligados a câncere/ou suscetibilidade a câncer. Nesta concretização, um excesso ou maiorfreqüência do(s) alelo(s), em comparação com um sujeito de controlesaudável, é indicativa de que o sujeito é suscetível a câncer.

Em outra concretização, o diagnóstico de uma suscetibilidadea câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata),câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) é feito por meio de detecçãode pelo menos um alelo associado como Chr8q24.21 e/ou alelo associado comLD Bloco A em combinação com um ensaio adicional à base de DNA ou àbase de RNA, à base de proteína (p. ex., outros ensaios diagnósticos de câncerincluem, embora sem limitação: ensaios de PSA, ensaios de antígenocarcinoembrionário (CEA, carcinoembryonic antigen), ensaios de BRCAl eensaios de BRCA2). Referidos ensaios diagnósticos para câncer sãoconhecidos na arte. Os métodos da invenção também podem ser usados emcombinação com uma análise da história familiar do sujeito e fatores de risco(p. ex., fatores de risco ambientais, fatores de risco devido a estilo de vida).

Como é de conhecimento geral na arte, e como descrito aqui,testes de PSA auxiliaram no diagnóstico precoce de câncer da próstata, porémnem é altamente sensível nem específico (Punglia et al., N. Engl. J. Med..349(4):335-42 (2003)). Assim, teste de PSA apenas leva a um elevadopercentual de diagnósticos falsos negativos e falsos positivos, o que resultatanto em muitos casos de cânceres não detectados e em biópsias deacompanhamento desnecessárias para aqueles sem câncer. Em umaconcretização, o diagnóstico de câncer da próstata ou uma suscetibilidade aocâncer da próstata é feito por meio de detecção de pelo menos um aleloassociado com Chr8q24.21 e/ou alelo associado com LD Bloco A emcombinação com um ensaio de PSA.

KITS

Kits úteis nos métodos de diagnóstico compreendemcomponentes úteis em quaisquer dos métodos aqui descritos, incluindo porexemplo, sondas de hibridização, enzimas de restrição (p. ex., para análise deRPLP), oligonucleotídeos específicos para alelo, anticorpos que se ligam a umpolipeptídio codificado alterado por meio de um ácido nucleico deChr8q24.21 e/ou ácido nucleico associado com LD Bloco A (p. ex.,anticorpos que se ligam a um polipeptídio compreendendo pelo menos ummarcador genético incluído nos haplótipos aqui descritos), ou a umpolipeptídio não-alterado (nativo) codificado por um ácido nucleico deChr8q24.21 nucleico e/ou ácido nucleico associado com LD Bloco A, meiospara amplificação de um ácido nucleico de Chr8q24.21 e/ou ácido nucleicoassociado com LD Bloco A, meios para analisar a seqüência de ácidonucleico de um ácido nucleico de Chr8q24.21 e/ou ácido nucleico associadocom LD Bloco A, meios para analisar a seqüência de aminoácidos de umpolipeptídio codificado por um ácido nucleico de Chr8q24.21 e/ou ácidonucleico associado com LD Bloco A, etc. Adicionalmente, kits podemproporcionar reagentes para ensaios a serem usados em combinação com osmétodos da presente invenção, p. ex., reagentes para uso com outros ensaiosdiagnósticos para câncer (p. ex., reagentes para detectar PSA, CEA, BRCA1,BRCA2, etc.).Em uma concretização, a invenção é um kit para analisar umaamostra de um sujeito para detectar câncer ou uma suscetibilidade ao câncer(p. ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer demama, câncer do pulmão, melanoma) em um sujeito, sendo que o kitcompreende um ou mais reagentes para detectar um marcador ou haplótipoassociado com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A. Em uma concretizaçãoparticular, o kit compreende pelo menos uma seqüência de nucleotídeoscontígua que é completamente complementar a uma região compreendendopelo menos um dos marcadores associados com Chr8q24.21 e/ou LD BlocoA. Em outra concretização, o kit compreende um ou mais ácidos nucleicosque são capazes de detectar um ou mais marcadores ou haplótipos específicos.Em outra concretização adicional, o kit compreende um ou mais reagentesque compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeos contígua que écompletamente complementar a uma região compreendendo pelo menos umdos marcadores da Tabela 1 ou Tabela 13 (p. ex., uma região da SEQ EDNO:l contendo pelo menos um dos marcadores da Tabela 1 ou Tabela 13), ououtra Tabela abaixo. Referidos ácidos nucleicos ou seqüências denucleotídeos contíguas ou (p. ex., iniciadores de oligonucleotídeos) podem serprojetados usando-se porções dos ácidos nucleicos que flanqueiam SNPs oumicrossatélites que são indicativos de câncer ou de uma suscetibilidade acâncer. Referidos ácidos nucleicos (p. ex., iniciadores de oligonucleotídeos)são projetados para amplificar regiões do Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A queestão associados com um marcador ou haplótipo para câncer. Em outraconcretização, o kit compreende um ou mais ácidos nucleicos marcadoscapazes de detectar um ou mais marcadores ou haplótipos específicosassociados com Chr8q24.21 e/ou LD Bloco A e reagentes para detecção domarcador. Marcadores vantajosos incluem, p. ex., um radioisótopo, ummarcador fluorescente, um marcador de enzima, um marcador de co-fator deenzima, um marcador magnético, um marcador de rotação [spin] ummarcador de epítopo.

Em concretizações particulares, o marcador ou haplótipo a serdetectado pelos reagentes do kit compreende um ou mais marcadores, dois oumais marcadores, três ou mais marcadores, quatro ou mais marcadores oucinco ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dos marcadoresna Tabela 13. Em outra concretização, o marcador ou haplótipo a serdetectado compreendendo alelo A de rsl447295 e/ou o alelo 8 de DG8S737.Em referidas concretizações, a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de uma suscetibilidade a câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma).

DIAGNÓSTICO DE CÂNCER DA PRÓSTATA ASSOCIADO COM Chr8q24.21

Embora os métodos de diagnóstico tenham sido descritos deuma maneira geral no contexto do diagnóstico da suscetibilidade a câncer (p.ex., câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma), os métodos também podem ser usados paradiagnosticar câncer associado com Chr8q24.21 (p. ex., câncer da próstataassociado com Chr8q24.21, câncer de mama associado com Chr8q24.21,câncer do pulmão associado com Chr8q24.21, melanoma associado comChr8q24.21). Por exemplo, um indivíduo apresentando câncer pode seravaliado para se determinar se a presença no indivíduo de um polimorfismoem um ácido nucleico associado com ácido nucleico associado comChr8q24.21 e/ou ácido nucleico associado com LD Bloco A, e/ou a presençade um haplótipo no indivíduo, poderia ter sido um fator contribuinte para ocâncer do indivíduo. Como usado aqui, os termos, "câncer associado comChr8q24.21", "câncer da próstata associado com Chr8q24.21", "câncer demama associado com Chr8q24.21", "câncer do pulmão associado comChr8q24.21" e "melanoma associado com Chr8q24.21" referem-se àocorrência de câncer, ou uma forma particular de câncer, em um sujeito queapresenta um polimorfismo em uma seqüência de ácido nucleico associadacom Chr8q24.21 ou um haplótipo associado com Chr8q24.21. A identificaçãode câncer associado com Chr8q24.21 (p. ex., câncer da próstata associadocom Chr8q24.21, câncer de mama associado com Chr8q24.21, câncer dopulmão associado com Chr8q24.21, melanoma associado com Chr8q24.21)facilita o planejamento do tratamento, porque o tratamento pode ser projetadoe terapêuticos selecionados para objetivar a proteína ou gene associados comChr8q24.21 apropriados.

Em uma concretização da invenção, diagnóstico de câncerassociado com Chr8q24.21 (p. ex., câncer da próstata associado comChr8q24.21, câncer de mama associado com Chr8q24.21, câncer do pulmãoassociado com Chr8q24.21, melanoma associado com Chr8q24.21) é feito pormeio de detecção de um polimorfismo em um ácido nucleico associado comChr8q24.21 (p. ex., usando-se os métodos aqui descritos e/ou outros métodosconhecidos na arte). Polimorfismos particulares em seqüências de ácidonucleico associado com Chr8q24.21 encontram-se descritos aqui (ver, p. ex.,Tabela 1 e Tabela 13). Uma amostra de teste de DNA genômico, RNA, oucDNA, é obtida de um sujeito apresentando câncer para se determinar se ocâncer é associado com Chr8q24.21. A amostra de DNA, RNA ou cDNA éentão examinada para se determinar a presença de um polimorfismo em umaseqüência de ácido nucleico associada com Chr8q24.21. Se a seqüência deácido nucleico associada com Chr8q24.21 apresenta o polimorfismo, então apresença do polimorfismo é indicativa do câncer associado com Chr8q24.21.

Por exemplo, em uma concretização, métodos de hibridização,como análise Southern, análise Northern ou hibridização in situ, podem serusados para detectar o polimorfismo. Em outras concretizações, é possívelusar análise de mutação por meio de digestão de restrição ou análise deseqüências, como oligonucleotídeos específicos para alelo, ou PCRquantitativa (ciclização térmica cinética). Diagnóstico de câncer associadocom Chr8q24.21 também pode ser realizado examinando-se a expressão e/oucomposição de um polipeptídio codificado por um ácido nucleico associadocom Chr8q24.21, usando-se uma variedade de métodos, incluindo ensaiosimunossorventes ligados a enzima (ELISA, enzyme linked immunosorbentassays), Western blotting, imunoprecipitações e imunofluorescência. Umaamostra de teste de um sujeito é avaliado quanto à presença de uma alteraçãona expressão e/ou uma alteração na composição do polipeptídio codificadopor meio de um ácido nucleico associado com Chr8q24.21, ou quanto àpresença de uma variante particular codificada por um ácido nucleicoassociado com Chr8q24.21. Uma alteração na expressão de um polipeptídiocodificado por um ácido nucleico associado com Chr8q24.21 pode ser, porexemplo, uma alteração na expressão quantitativa do polipeptídio (i.e., aquantidade de polipeptídio produzido); uma alteração na composição de umpolipeptídio codificado por um ácido nucleico associado com Chr8q24.21 éuma alteração na expressão qualitativa do polipeptídio (p. ex., expressão deum polipeptídio associado com Chr8q24.21 alterado ou de uma variante derecomposição diferente).

Em outras concretizações, a invenção refere-se a um métodopara o diagnóstico e identificação de câncer associado com Chr8q24.21 (p.ex., câncer da próstata associado com Chr8q24.21, câncer de mama associadocom Chr8q24.21, câncer do pulmão associado com Chr8q24.21, melanomaassociado com Chr8q24.21) em um sujeito, por meio da identificação dapresença de um marcador ou haplótipo associado com Chr8q24.21, comodescrito detalhadamente aqui. Por exemplo, os marcadores e/ou haplótiposaqui descritos nas Tabelas 1, 2, 4, 5 e 13 são encontrados com maiorfreqüência em sujeitos com câncer (p. ex., câncer da próstata (p. ex., cânceragressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma) do queem sujeitos não afetados por câncer. Portanto, estes marcadores e/ouhaplótipos apresentam valor preditivo para detectar câncer associado comChr8q24.21. Em uma concretização, o marcador ou haplótipo apresentandovalor preditivo para detectar câncer associado com Chr8q24.21 compreendeum ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste dos marcadoresna Tabela 13. Em outra concretização, o marcador ou haplótipo apresentandovalor preditivo para detectar câncer associado com Chr8q24.21 compreendeum ou mais marcadores selecionados do grupo que consiste do alelo -8 deDG8S737 e o alelo A de rs 1447295. Em outras concretizações adicionais, ohaplótipo apresentando valor preditivo para detectar câncer associado comChr8q24.21 compreende haplótipo 1 ou haplótipo la. Os métodos aquidescritos podem ser usados para se avaliar uma amostra de um sujeito quantoà presença ou ausência de um marcador ou haplótipo; a presença de ummarcador ou haplótipo é indicativa de câncer associado com Chr8q24.21.

Como é de conhecimento geral na arte, indivíduos podemapresentar respostas diferenciais a uma terapia particular (p. ex., um agenteterapêutico). A base da resposta diferencial pode ser determinadageneticamente em parte. Assim, em uma concretização, a presença de ummarcador ou haplótipo é indicativa de uma taxa de resposta diferente a umamodalidade de tratamento particular. Isto significa que um paciente comcâncer portando um marcador ou haplótipo no Chr8q24.21 poderia respondermelhor, ou pior, a um terapêutico específico, droga anti-hormonal e/ou terapiade radiação usada para tratar câncer. Portanto, a presença ou ausência domarcador ou haplótipo poderia auxiliar a decidir que tratamento poderia serusado para um paciente com câncer. Por exemplo, para um paciente comcâncer da próstata recentemente diagnosticado, é possível avaliar a presençade um marcador ou haplótipo no Chr8q24.21 (p. ex., por meio de teste deDNA derivado de uma amostra de sangue, como descrito aqui). Se o pacientefor positivo para um marcador ou haplótipo at Chr8q24.21 (ou seja, omarcador ou haplótipo está presente), então o médico recomenda uma terapiaparticular, enquanto que se o paciente for negativo para um marcador ouhaplótipo, então é possível recomendar um diferente curso de terapia (quepode incluir recomendar a realização de nenhuma terapia a não ser omonitoramento serial da progressão do câncer da próstata). Assim, a condiçãode portador do paciente poderia ser usada para determinar se uma modalidadede tratamento particular (p. ex., um agente quimioterápico, um agente anti-hormonal, tratamento com radiação) deveria ser administrada.

ÁCIDOS NUCLEICOS E POLIPEPTÍDIOS DA INVENÇÃO

Os ácidos nucleicos e polipeptídios aqui descritos podem serusados em métodos de diagnóstico de uma suscetibilidade a câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma), e também em kits úteis para um diagnósticodo tipo referido.

Uma molécula de ácido nucleico "isolada", como usado aqui, éuma que é separada de ácidos nucleicos que normalmente flanqueiam o geneou seqüência de nucleotídeos (como em seqüências genômicas) e/ou que foicompletamente ou parcialmente purificada de outras seqüências transcritas (p.ex., como em uma biblioteca de RNA). Por exemplo, um ácido nucleicoisolado da invenção pode ser substancialmente isolado com relação ao meiocelular complexo em que ocorre naturalmente, ou meio de cultura quandoproduzido por meio de técnicas recombinantes, ou precursores químicos ououtros químicos quando sintetizados quimicamente. Em alguns casos, omaterial isolado formará parte de uma composição (por exemplo, um extratobruto contendo outras substâncias), sistema tamponador ou mistura dereagentes. Em outras circunstâncias, o material pode ser purificado atéhomogeneidade essencial, por exemplo como determinado por meio deeletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE, polyacrylamide gelelectrophoresis) ou cromatografia de coluna (p. ex., HPLC). Uma moléculade ácido nucleico isolada da invenção pode compreender pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% (numa basemolar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Com relação aoDNA genômico, o termo "isolado" também pode referir-se a moléculas deácido nucleico que são separadas do cromossomo com que o DNA genômicose encontra associado naturalmente. Por exemplo, a molécula de ácidonucleico isolada pode conter menos do que cerca de 250 kb, 200 kb, 150 kb,100 kb, 75 kb, 50 kb, 25 kb, 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1kb dos nucleotídeos que flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNAgenômico da célula de que a molécula de ácido nucleico é derivada.

A molécula de ácido nucleico pode ser fundida com outrasseqüências codificantes ou reguladoras, e ainda ser considerada isolada.Assim, DNA recombinante contido em um vetor é incluído na definição de"isolado" como usado aqui. Da mesma forma, moléculas de ácido nucleicoisoladas incluem moléculas de DNA recombinante em células hospedeirasheterólogas ou organismos heterólogos, e também moléculas de DNAparcialmente ou substancialmente purificadas em solução. Moléculas de ácidonucleico "isoladas" também compreendem transcrições de RNA in vivo e invitro das moléculas de DNA da presente invenção. Uma molécula de ácidonucleico isolada ou seqüência de nucleotídeos pode incluir uma molécula deácido nucleico ou seqüência de nucleotídeos que é sintetizada quimicamenteou com meios recombinantes. Referidas seqüências de nucleotídeos isoladassão úteis, por exemplo, na fabricação do polipeptídio codificado, como sondaspara isolar seqüências homólogas (p. ex., de outras espécies mamíferas), paramapeamento genético (p. ex., por meio de hibridização in situ comcromossomos), ou para detectar expressão do gene no tecido (p. ex., tecidohumano), como por meio de análise de manchamento Northern análise ououtras técnicas de hibridização.

A invenção refere-se também a moléculas de ácido nucleicoque hibridizam em condições de hibridização de alta estringência, como parahibridização seletiva, a uma seqüência de nucleotídeos aqui descritos (p. ex.,moléculas de ácido nucleico que hibridizam especificamente a uma seqüênciade nucleotídeos contendo um sítio polimórfico associado com um haplótipoaqui descrito). Em uma concretização, a invenção inclui variantes quehibridizam em condições de lavagem e de hibridização de alta estringência (p.ex., para hibridização seletiva) a uma seqüência de nucleotídeos quecompreende SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma (ou uma seqüência denucleotídeos compreendendo o complemento da SEQ ID NO:l ou umfragmento da mesma), sendo que a seqüência de nucleotídeos compreendepelo menos um alelo polimórfico contido nos haplótipos (p. ex., haplótipos)aqui descritos.

Referidas moléculas de ácido nucleico podem ser detectadase/ou isoladas por meio de hibridização específica para seqüência ou alelo (p.ex., em condições de alta estringência). Condições de estringência e métodospara hibridizações de ácido nucleico são explicadas nas páginas 2.10.1-2.10.16 e páginas 6.3.1-6.3.6 em Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel, F. et ai., iiCurrent Protocols in Molecular Biology", John Wiley &Sons, (1998)), e Kraus, M. e Aaronson, S., Methods Enzymol, 200:546-556(1991), cujos ensinamentos completos uma são incorporados aqui porreferência.

O percentual de identidade de duas seqüências de nucleotídeosou aminoácidos pode ser determinado alinhando-se as seqüências visandocomparação ótima (p. ex., é possível introduzir intervalos na seqüência deuma primeira seqüência). Os nucleotídeos ou aminoácidos em posiçõescorrespondentes são então comparados, e o percentual de identidade entre asduas seqüências é uma função do número de posições idênticascompartilhadas pelas seqüências (i.e.,% de identidade = n° de posiçõesidênticas/n0 total de posições χ 100). Em determinadas concretizações, ocomprimento de uma seqüência alinhada para fins de comparação é pelomenos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 95%, docomprimento da seqüência de referência. A comparação efetiva das duasseqüências pode ser realizada por meio de métodos bem conhecidos, porexemplo, usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não-limitante deum algoritmo matemático do tipo referido encontra-se descrito em Karlin, S. eAltschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90:5873-5877 (1993). Um algoritmodo tipo referido é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão2.0), como descrito em Altschul, S. et al., Nucleic Aeids Res., 25:3389-3402(1997). Quando se usa programas BLAST e BLAST Gapped, é possível usaros parâmetros padrão dos respectivos programas (p. ex., NBLAST). Ver owebsite na rede mundial de computadores em ncbi.nlm.nih.gov. Em umaconcretização, parâmetros para comparação de seqüências podem receberuma classificação = 100, ou podem ser variados (p. ex., W=5 ou W=20).

Outro exemplo não-limitante de um algoritmo matemáticousado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers e Miller,CABIOS (1989). Um algoritmo do tipo referido é incorporado no programaALIGN (versão 2.0), que é parte do pacote de programas de alinhamento deseqüências GCG. Quando se usa o programa ALIGN para compararseqüências de aminoácidos, é possível usar uma tabela de radicais PAM depeso 120, uma penalidade de comprimento de espaço de 12, e uma penalidadede intervalo de 4. Algoritmos adicionais para análise de seqüências sãoconhecidos na arte e incluem ADVANCE e ADAM como descrito emTorellis, A. e Robotti, C, Comput. Appl. Biosei 10:3-5 (1994); e FASTAdescrito em Pearson, W. e Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 85:2444-48 (1988).

Em outra concretização, o percentual de identidade entre duasseqüências de aminoácidos pode ser determinado usando o programa GAP nopacote de programas GCG (Accelrys, Cambridge, UK) usando uma matrizBlossom 63 ou uma matriz PAM250, e um escore de espaço de 12, 10, 8, 6,ou 4 e um peso de comprimento de 2, 3, ou 4. Em outra concretizaçãoadicional, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidospode ser determinado usando o programa GAP no pacote de programas GCG,usando um escore de espaço de 50 e um peso de comprimento de 3.

A presente invenção também proporciona moléculas de ácidonucleico isoladas que contêm um fragmento ou porção que hibridiza emcondições altamente estringentes a um ácido nucleico que compreende, ouconsiste de, SEQ ID NO:l ou um fragmento da mesma (ou uma seqüência denucleotídeos compreendendo, ou consistindo de, o complemento da SEQ IDNO:1 ou um fragmento da mesma), sendo que a seqüência de nucleotídeoscompreende pelo menos um alelo polimórfico contido nos haplótipos (p. ex.,haplótipos) aqui descritos. Os fragmentos de ácido nucleico da invenção sãode pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 18, 20, 23 ou 25nucleotídeos, e pode ter comprimento de 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000,10,000 ou mais nucleotídeos.

Os fragmentos de ácido nucleico da invenção são usados comosondas ou iniciadores em ensaios, como aqueles descritos aqui. "Sondas" ou"iniciadores" são oligonucleotídeos que hibridizam de uma maneira específicapara base com um filamento complementar de uma molécula de ácidonucleico. Adicionalmente a DNA e RNA, referidas sondas e iniciadoresincluem ácidos nucleicos de polipeptídio (PNA), como descrito em Nielsen,P. et ai., Science 254:1497-1500 (1991).

Uma sonda ou iniciador compreende uma região de seqüênciade nucleotídeos que hibridiza com pelo menos cerca de 15, tipicamente cercade 20 a 25, e em determinadas concretizações cerca de 40, 50 ou 75,nucleotídeos consecutivos de uma molécula de ácido nucleicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos contígua da SEQ DD NO: 1 ecompreendendo pelo menos um alelo contido em um ou mais haplótipos aquidescritos, e o seu complemento. Em concretizações particulares, uma sondaou iniciador pode compreender 100 ou menos nucleotídeos; por exemplo, emdeterminadas concretizações, de 6 a 50 nucleotídeos, ou, por exemplo, de 12 a30 nucleotídeos. Em outras concretizações, a sonda ou iniciador é pelo menos70% idêntico, pelo menos 80% idêntico, pelo menos 85% idêntico, pelomenos 90% idêntico, ou pelo menos 95% idêntico, à seqüência denucleotídeos contígua ou ao complemento da seqüência de nucleotídeoscontígua.

Em outra concretização, a sonda ou iniciador é capaz de hibridizarseletivamente com a seqüência de nucleotídeos contígua ou ao complementoda seqüência de nucleotídeos contígua. Freqüentemente, a sonda ou iniciadorcompreende adicionalmente um marcador, p. ex., um radioisótopo, ummarcador fluorescente, um marcador de enzima, um marcador de co-fator deenzima, um marcador magnético, um marcador de rotação, um marcador deepítopo.

As moléculas de ácido nucleico da invenção, como aquelasdescritas acima, podem ser identificadas e isoladas usando-se técnicasconvencionais da biologia molecular e a informação de seqüênciaproporcionada na SEQ ID NO:l. Ver, de uma maneira geral, PCRTechnology: Principies and Applications for DNA Amplification (ed. H. A.Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methodsand Applications (Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990);Mattila, P. et al., Nucleie Acids Res., 19:4967-4973 (1991); Eckert, K. eKunkel, T., PCR Methods and Applications, 1:17-24 (1991); PCR (eds.McPherson et al., IRL Press, Oxford); e Patente dos Estados Unidos n°4.683.202, cujos teores integrais de cada obra referida são incorporados aquipor referência.

Outros métodos de amplificação vantajosos incluem a reaçãoem cadeia de ligase (LCR [ligase chain reaction]; ver Wu, D. e Wallace, R.,Genomics, 4:560-469 (1989); Landegren, U. et al., Science, 241:1077-1080(1988)), amplificação de transcrição (Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. SciUSA, 86:1173-1177 (1989)), replicação de seqüência auto-sustentada(Guatelli, J. et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 87: 1874-1878 (1990)) eamplificação de seqüência à base de ácido nucleico (NASBA, nucleic acidbased sequence amplification). Os dois métodos de amplificação indicadospor último envolvem reações isotérmicas baseadas em transcrição itsotérmica,que produzem tanto RNA de filamento simples ((ssRNA, single-strandedRNA) e DNA de filamento duplo (dsDNA, double-stranded DNA) como osprodutos de amplificação numa relação de cerca de 30 e 100 a 1,respectivamente.

O DNA amplificado pode ser marcado (p. ex., rádio-marcado)e usado como uma sonda para triagem uma biblioteca de cDNA derivada decélulas humanas. O cDNA pode ser derivado de mRNA e contido em zapexpress (Stratagene, La Jolla, CA), ZIPLOX (Gibco BRL, Gaithesburg, MD)ou outro vetor vantajoso. Clones correspondentes podem ser isolados, DNApode ser obtido após excisão in vivo, e o inserto clonado pode ser seqüenciadoem uma ou ambas as orientações por meio de métodos reconhecidos na artepara identificar a matriz de leitura correta codificando um polipeptídio dopeso molecular apropriado. Por exemplo, a análise direta da seqüência denucleotídeos de moléculas de ácido nucleico da presente invenção pode serrealizada usando-se métodos bem conhecidos que são comercialmenteobteníveis. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, ALaboratory Manual (2a ed., CSHP, New York 1989); Zyskind et al.,Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)).

Adicionalmente, métodos de fluorescência também podem ser obteníveis paraanalisar ácidos nucleicos (Chen, X. et al., Genome Res., 9:492-498 (1999)) epolipeptídios. Usando-se estes métodos ou métodos similares, o polipeptídio eo DNA que codifica o polipeptídio pode ser isolado, seqüenciado ecaracterizado adicionalmente.Em geral, as seqüências de ácido nucleico isoladas dainvenção podem ser usadas como marcadores de peso molecular em géisSouthern, e como marcadores de cromossomos que são marcados para mapearposições de genes relacionados. As seqüências de ácido nucleico tambémpodem ser usadas para comparação com seqüências de DNA endógenas empacientes para identificar câncer ou uma suscetibilidade ao câncer (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma), e como sondas, para hibridizar e descobrirseqüências de DNA relacionadas ou subtrair seqüências conhecidas de umaamostra (p. ex., hibridização subtrativa). As seqüências de ácido nucleicopodem ser usadas adicionalmente para derivar iniciadores para identificação[fingerprinting] genética, para desenvolver anticorpos anti-polipeptídiousando-se técnicas de imunização, e/ou como um antígeno para desenvolveranticorpos anti-DNA ou elicitar respostas imunológicas.

Como usado aqui, dois polipeptídios (ou uma região dospolipeptídios) são substancialmente homólogos ou idênticos quando asseqüências de aminoácidos são pelo menos cerca de 45-55% [idênticas]. Emoutras concretizações, dois polipeptídios (ou uma região dos polipeptídios)são substancialmente homóloga ou idênticos quando eles são pelo menoscerca de 70-75%, pelo menos cerca de 80-85%, pelo menos cerca de 90%,pelo menos cerca de 95% homólogos ou idênticos, ou são idênticos. Umaseqüência de aminoácidos substancialmente homóloga, de acordo com apresente invenção, será codificada por uma molécula de ácido nucleicocompreendendo SEQ ID NO.l ou uma porção do mesmo, e compreendendoadicionalmente pelo menos um polimorfismo como mostrado na Tabela 1,sendo que o ácido nucleico codificante hibridizará com a SEQ ID NO: 1 emcondições estringentes como descrito mais particularmente aqui.

A presente invenção será ilustrada agora com os Exemplos aseguir, que não se destinam a ser limitantes de qualquer maneira. Osensinamentos relevantes de todas as publicações aqui indicadas e nãoincorporadas previamente por referência, são incorporadas aqui integralmentepor referência.

EXEMPLO 1 - IDENTIFICAÇÃO DE REGIÃO ASSOCIADA COM CÂNCER

Estudo

Identificou-se uma região no cromossomo 8q24.21 queconfere um risco incrementado de cânceres particulares (p. ex., câncer dapróstata). Esta região foi detectada inicialmente por meio de análise deligação com câncer da próstata (PrCa) de famílias de pacientes com câncer dapróstata que são estreitamente relacionadas com casos de câncer de mama.Pacientes envolvidos no estudo genético

A população de pacientes que foram diagnosticados comcâncer da próstata desde 1955 incluiu 3123 pacientes, sendo que cerca de umterço dos mesmos ainda estavam vivos no período do estudo. A população depacientes que foram diagnosticados com câncer de mama incluiu 4045pacientes. Cerca de 950 pacientes com câncer da próstata foram recrutados noperíodo do estudo. Nós estivemos interessados inicialmente na descoberta degenes que contribuíssem para ambos, câncer de próstata e câncer de mama.Portanto, nós processamos a lista de nossos pacientes recrutados contra obanco de dados de genealogia para cobrir toda a Islândia. Nós apenasincluímos famílias que tiveram pelo menos dois pacientes com câncer dapróstata relacionados até 6 meioses (primos em segundo grau separados por 6meioses) e que também incluíram pelo menos um paciente de câncer de mamaque era estreitamente relacionado (até 3 meioses) com um paciente comcâncer da próstata (nós não usamos o DNA ou genótipos para o paciente decâncer de mama - nós só buscamos fracionar nossa coorte de câncer dapróstata de acordo com o status [a condição] de câncer de mama em parentes).Estes critérios resultaram em 75 grandes famílias que incluíram 167 pacientescom câncer da próstata. A distância máxima entre dois pacientes com câncerda próstata foi de 6 meioses, contudo, a distância média foi de 3,5 meioses.Varredura ampla do genoma

Usou-se o banco de dados de genealogia para criar famíliasque incluíram dois ou mais pacientes com câncer da próstata e pelo menos umpaciente de câncer de mama relacionado com ambos os pacientes com câncerda próstata em 3 eventos meióticos (gerações). Realizou-se uma varreduraampla do genoma em 167 pacientes com câncer da próstata em 75 famíliasestendidas. O procedimento foi similar àquele descrito em Gretarsdóttir, et ai.,Am J Hum Genet., 70(3):593-603 (2002). De maneira resumida, o DNA foigenotipificado com um conjunto de marcadores de matriz constituído de 1200marcadores de microssatélites com uma resolução média de 3 cM. Sujeitos noestudo tiveram 45 ml de sangue coletado após terem assinado um formuláriode consentimento informado aprovado pela Autoridade de Proteção de Dados[Data Protection Authorities] e o Comitê Nacional de Bioética [.NationalBioethics Committee] na Islândia. DNA foi isolada de sangue integral usando-se o método de extração da Qiagen, que foi ajustado para alta vazão. Oconjunto de seleção de microssatélites usou iniciadores marcados comfluorescência e todos os marcadores foram testados extensivamente quanto areações de PCR multiplex para otimizar o rendimento. A taxa de erros degenotipificação foi inferior a 0,2%, com base em comparação de genótipos de5.000 indivíduos genotipifcados duas vezes para este conjunto de marcadoresde matriz. As amplificações de PCR foram ajustadas e combinadas usando-serobôs Cyberlab usando-se um volume de reação de 5 μΐ contendo 20 ng deDNA genômico. Os alelos foram denominados automaticamente com oprograma DAC ou manualmente, e usou-se o programa deCODE-GT parafracionar de acordo com a qualidade e editar os genótipos denominados(Palsson, B., et al., Genome Res. , 9(10): 1002-1012 (1999)). As freqüências dealelos na população para os marcadores foram construídas a partir de umcoorte de mais de 30.000 Islandeses que participaram de estudos amplos dogenoma em vários projetos de doenças na genética de deCODE.

Os marcadores de microssatélites que foram genotipificadosno lócus eram obteníveis publicamente ou foram projetados na deCODEgenetics; aqueles marcadores são indicados com uma denominação DG.Identificou-se repetições na seqüência de DNA que nos permitiram selecionarou projetar iniciadores que foram espaçados homogeneamente em todo olócus. A identificação das repetições e a localização com relação a outrosmarcadores basearam-se no trabalho da equipe de mapeamento físico nadeCODE genetics.

No caso dos marcadores usados na varredura ampla degenoma, as posições genéticas foram obtidas do mapa genético de altaresolução (HRGM, high-resolution genetic map) recentemente publicado,construído na deCODE genetics (Kong A., et al., Nat Genet, 31: 241-247(2002)). A posição genética dos marcadores adicionais são obtidas do HRGM,quando disponível, ou por meio de aplicação dos mesmos métodos demapeamento genético que foram usados na construção do mapa HRGM parao material familiar genotipificado para este estudo de ligação em particular.

Métodos estatísticos para análise de ligação

A análise de ligação foi realizada usando-se o programa[software] Allegro (Gudbjartsson et al, Nat. Genet. 25:12-3, (2000)), quedetermina a significância estatística do excesso de compartilhamento entrepacientes aparentados por meio da aplicação de métodos de compartilhamentoalelos, somente afetados, não-paramétricos (sem que se especifiquequalquer modelo de hereditariedade de doença particular). Allegro, umprograma de ligação desenvolvido na deCODE gebnetics, calculaclassificações LOD com base em cálculos de multi-pontos. Nossa análise deligação de linha-de-base usou a função de classificação Spairs (Whittemore,A.S. e Halpern, J., Biometrics 50:118-27 (1994); Eruglyak L, et al., Am JHum Genet 58:1347-63, (1996)), o modelo de compartilhamento de aleloexponencial (Kong, A. e Cox, NJ., Am. J. Hum. Genet, 61:1179 (1997)), e umesquema de ponderação de famílias, que se encontrava a meio-caminho numaescala Iog entre a ponderação de cada par afetado igualmente e a ponderaçãode cada família igualmente. Na análise, todos os indivíduos genotipificadosque não estavam afetados foram tratados como "desconhecidos". Em virtudede preocupação com o comportamento de pequenas amostras, nóscomputámos valores ρ correspondentes de duas maneiras diferentes paracomparação. O primeiro valor ρ foi computado com base na teoria deamostras grandes; Zir =V(2 Ioge (10) LOD) e foi distribuído aproximadamentecomo uma distribuição normal convencional na hipótese nula de nenhumaligação. Um segundo valor ρ foi computado por meio de comparação daclassificação LOD observada com sua distribuição de amostragem de dadoscompleta na hipótese nula. Quando um conjunto de dados consiste de mais doque um punhado de famílias, estes dois valores ρ tendem a ser muitosimilares.

Todos os Ioci sugestivos com classificações LOD maiores que2 foram acompanhados com alguns marcadores extras para incrementar ainformação sobre o compartilhamento dentro de famílias e para diminuir apossibilidade de que uma classificação LOD represente uma ligação falsa-positiva. A medida de informação que se usou foi definida por Nicolae (D. L.Nicolae, Tese, Universidade de Chicago (1999)) e foi uma parte da saída[output] do programa Allegro. Esta medida encontra-se relacionadaestritamente com uma medida clássica de informação como descritopreviamente por Dempster et al. (Dempster, A.P., et al., J. R. Stat. Soe. B,39:1-38 (1977)); a informação eqüivale a zero se os genótipos marcadoresforam completamente não-informativos, e eqüivale a um se os genótiposdeterminarem a quantidade exata de compartilhamento de alelos por meio dederivação hereditária entre os parentes afetados. Usando-se o conjunto demarcadores de matriz com espaçamento médio de marcadores de 4 cM,obtém-se tipicamente um teor de informação de cerca de 0,7 nas famíliasusadas em nossa análise de ligação. Aumentando-se a densidade de marcadorpara um marcador a cada centimorgan aumenta-se usualmente o teor deinformação acima de 0,85.

Métodos estatísticos para análise de haplótipos e associação

Para associação de marcador simples à doença usou-se o testeexato de Fisher para calcular um valor ρ de duplo lado para cada aleloindividual. Quando apresentamos os resultados, nós usamos freqüênciasalélicas ao invés de freqüências de portador para microssatélites, SNPs ehaplótipos. Realizou-se análises de haplótipo usando um programa decomputador que nós desenvolvemos na deCODE denominado NEMO(NEsted MOdels) (Gretarsdóttir, et al, Nat Genet. 2003 Oct;35(2):131-8).NEMO foi usado tanto para estudar a associação marcador-marcador e paracalcular o desequilíbrio de ligação (LD) entre marcadores, e como paraanálise de haplótipos de caso-controle. Com NEMO, freqüências dehaplótipos são estimadas por meio de probabilidade máxima e as diferençasentre pacientes e controles são testadas usando-se um teste de relação deprobabilidade generalizada. As estimativas de probabilidade máxima, relaçõesde probabilidade e valores ρ são computadas com o auxílio do algoritmo EMdiretamente para os dados observados, e, portanto, a perda de informação emvirtude da incerteza com genótipos faltantes e fase é capturadaautomaticamente pelas relações de probabilidade, e, na maior parte dassituações, é possível usar teoria de amostras grandes para determinar demaneira confiável a significância estatística. O risco relativo (RR) de um aleloou de um haplótipo, i.e., o risco de um alelo comparado com todos os outrosalelos do mesmo marcador, é calculado assumindo-se o modelo multiplicativo(Terwilliger, J.D. & Ott, J. A haplotype-based 'haplotype relative risk'approach to detecting allelic associations. [Uma abordagem de "risco relativode haplótipo" baseada em haplótipos para detectar associações alélicas] Hum.Hered. 42, 337-46 (1992) e Falk, CT. & Rubinstein, P. Haplotype relativerisks: an easy reliable way to construct a proper control sample for riskcalculations. [Riscos relativos de haplótipos: uma maneira fácil e confiável deconstruir uma amostra de controle apropriada para cálculos de risco], Ann.Hum. Genet. 51 ( Pt 3), 227-33 (1987)), juntamente com o risco atribuível àpopulação (PAR, population attributable risk).

Na análise de haplótipos pode ser útil agrupar haplótipos etestar o grupo como um todo quanto à associação com a doença. Isto épossível de ser realizado com NEMO. Um modelo é definido por umapartição do conjunto de todos os haplótipos possíveis, em que se presume quehaplótipos no mesmo grupo conferem o mesmo risco, enquanto haplótipos emdiferentes grupos podem conferir riscos diferentes. Afirma-se que umahipótese nula e uma hipótese alternativa soa embutidas quando esta últimacorresponde a uma partição mais fina do que a primeira. NEMO proporcionaflexibilidade completa na partição do espaço do haplótipo. Desta forma, épossível testar múltiplos haplótipos conjuntamente para associação e testar sediferentes haplótipos conferem risco diferente. Como uma medição do LD,nós usamos duas definições convencionais de LD, D' e R (Lewontin, R.,Genetics, 49:49-67 (1964) e Hill, W.G. e A. Robertson, Theor. Appl. Genet,22:226-231 (1968)) porque proporcionam informação complementar sobre onível de LD. Para os fins de estimar D' e R , as freqüências de todas ascombinações de dois alelos marcadores são estimadas usando-se métodos deprobabilidade máxima e o desvio do desequilíbrio de ligação é avaliadousando-se um teste de relação de probabilidades. As definições convencionaisde D' e R são estendidas de forma a incluírem microssatélites calculando-sea média dos valores para todas as possíveis combinações de alelos dos doismarcadores ponderados pelas probabilidades de alelos marginais.

O número de possíveis haplótipos que podem ser construídos apartir do conjunto denso de marcadores genotipificados no 1-LOD-drop émuito grande e, embora o número de haplótipos que são efetivamenteobservados na coorte de pacientes e controles seja muito menor, o teste detodos os haplótipos para associação com a doença é um risco formidável.

Deve-se observar que nós não restringimos nossa análise a haplótiposconstruídos a partir de um conjunto de marcadores consecutivos, porquealguns marcadores podem ser muito mutáveis e poderiam dividir umhaplótipo de outra forma bem conservado construído a partir de marcadorescircundantes.

Neste estudo, considerou-se apenas haplótipos que abrangemmenos de 300 kb.

Resultados

Como descrito aqui, identificou-se uma região no cromossomo8q24.21 que confere um risco incrementado de cânceres particulares (p. ex.,câncer da próstata (p. ex., câncer agressivo da próstata), câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma). Haplótipos e marcadores particularesassociados com um risco incrementado de câncer são ilustrados na Tabela 1.

Como indicado na Tabela 1, os haplótipos envolvem os seguintes marcadores(p. ex., SNP, microssatélite) e alelos: alelo 2 de SG08S686, alelo 2 deSG08S710, alelo -8 de DG8S737, alelo 4 de SG08S687, alelo 1 deSG08S717, alelo 2 de SG08S664, alelo 2 de SG08S722, alelo 2 deSG08S689, alelo 4 de SG08S690, alelo 4 de SG08S720, alelo 1 deDG8S1769, alelo 2 de SG08S691 e alelo -1 de DG8S1407. Os haplótiposencontram-se localizados no que nós denominamos LD Bloco A entre128.417.467 e 128.511.854 bp (construção [Build\ 34 do NCBI) e posiçõesdos marcadores individuais são indicados na Tabela 1.<table>table see original document page 97</column></row><table>Para encontrar este haplótipo associado com câncer, pode-serealizar primeiro uma varredura ampla do genoma usando-se famílias em queambos, câncer da próstata e câncer de mama segregam. Usando essescritérios, um total de 167 pacientes com câncer da próstata ligados entre si em75 famílias. FIG. 1 ilustra os resultados da varredura de ligação e detalha opico observado no Chr8q24. Especificamente, a varredura de ligação mostrauma classificação LOD significativa ampla do genoma de 4,0 no Chr8q24.

O marcador de pico no Chr8 é D8S1793 e a classificação LODcai por uma unidade na região que se estende do marcador DG8S507 aomarcador D8S1746, ou de 125.594.794 - 135.199.182 bp [pares de bases](construção [Build] 34 do NCBI). A região foi genotipificada com 352marcadores de microssatélites e 73 marcadores de SNP para uma densidademédia de um marcador a cada 22,8 kb. Análise de associação com osgenótipos resultantes de ambos, casos de câncer da próstata e de controles,proporcionaram marcadores e haplótipos que se associam significantementecom câncer da próstata (FIG. 2, Tabelas 2 - 5). Os resultados para câncer dapróstata, câncer de mama, câncer do pulmão, melanoma e hiperplasiaprostática benigna são detalhados nas Tabelas de 2 a 5.

A estrutura de LD na área do haplótipo que se associa comcâncer da próstata é mostrada nas FIGS. 3A e 3B. A estrutura foi derivada docomunicado de dados 14 do HAPMAP. Em particular, o bloco de LD quecompreende haplótipo 1 é mostrado com as setas horizontais na parteesquerda da FIG. 3 A. Este bloco de LD (LD Bloco A) localizou-se noChr8q24.21 entre os marcadores rs7841228, localizados em 128.417.467 bp, ers7845403, localizado em 128.511.854 bp, e tem um comprimento de quase95 kb. LD Bloco A foi refinado agora como estando localizado entre128.414.000 bp e 128.516.000 bp no Chr8q24.21. A estrutura de LD éobservada como um bloco de DNA que apresenta uma elevada r e |D'| entremarcadores como indicado pelas cores vermelha e azul nas figuras.Marcadores são representados com a mesma distância entre quaisquer doismarcadores na FIG. 3 A mas com coordenadas de construção [Build] 34 doNCBI (distancias efetivas entre marcadores) na FIG. 3B. FIG. 4 mostra obloco de LD na coorte islandesa de pacientes com câncer da próstata e5 controles na área dos haplótipos que se associam com câncer da próstata,câncer de mama, câncer do pulmão e melanoma. Isto apresenta uma elevada|D'| para a maior parte dos pares de marcadores (|D'| >0,8) e r atingindo até 1para pares de marcadores no interior desta estrutura de blocos. Esta área incluieventos de recombinação que revelam a si mesmos por meio de um padrão detabuleiro de xadrez que é melhor observado na FIG. 3. Marcadores nestaestrutura de blocos também estão em correlação moderada (r abaixo de 0,2),com marcadores mais distantes a 200 kb de distância (incluindo marcadores a128515000 bps (rs7845403, rs6470531 e rs7829243) e marcadores em tornode 128720000 bps (rsl0956383 e rs6470572) na área do gene PVT1).

Como descrito aqui, genes e genes preditos que mapeiam ocromossomo 8q24.21 do genoma humano incluem os genes conhecidosPOU5FLC20 (n° de acesso Genbank AF268618), C-MYC (n° de acessoGenbank NM_002467) e PVTl (n° de acesso Genbank XM_372058), etambém genes preditos (p. ex., números de acesso Genbank BE676854,AL709378, BX108223, AA375336, CB104826, BG203635, AWl 83883 eBM804611. Como ilustrado na FIG. 5, os marcadores e haplótipos dainvenção estão situados entre dois genes conhecidos, nominalmentePOU5FLC20/AF28618 e C-MYC (da versão 34 do browser do USCSmarcadores ou haplótipos associados com esta região e com câncer podeafetar a expressão de genes próximos, como POU5FLC20, c-MYC, PVT1,e/ou outros genes conhecidos, desconhecidos ou preditos na área.Adicionalmente, referida variação pode afetar a estabilidade da proetina ouRNA ou pode apresentar conseqüências estruturais, de tal forma que a regiãoé mais propensa a rearranjo somático nos portadores de haplótipo. Isto é deacordo com Chr8q24.21 sendo amplificado em um grande percentual decânceres, incluindo, mas sem limitação, câncer da próstata, câncer de mama,câncer do pulmão e melanoma (www.progenetix.com). Efetivamente,Chr8q21 -24 é a região cromossômica mais freqüentemente obtida em todosos cânceres combinados (cerca de 17%) e em câncer da próstata (cerca de20%) (www.progenetix.com). Assim, a variação subjacente poderia afetargenes não caracterizados ligados diretamente aos haplótipos aqui descritos, oupoderia influenciar genes adjacentes não ligados diretamente aos haplótiposaqui descritos. Tabela 2 descreve um haplótipo, haplótipo 1 (Alelo 2 deSG08S686, alelo -8 de DG8S737, alelo 4 de SG08S687, alelo 1 deSG08S717, alelo 2 de SG08S664, alelo 0 de DG8S1761, alelo 2 deSG08S722, alelo 2 de SG08S689, alelo 4 de SG08S690, alelo 4 deSG08S720, alelo 1 de DG8S1769, alelo 2 de SG08S691, alelo -1 deDG8S1407), e mostra que este haplótipo aumenta o risco de câncer dapróstata, com um risco maior de câncer agressivo da próstata (como definidopor uma classificação combinada de Gleason de 7(4+3 apenas)-10). Estehaplótipo foi replicado em um segundo conjunto de casos de câncer dapróstata islandês e um novo conjunto de controles. Como ilustrado na Tabela2, haplótipo 1 é portado por 21,4% de pacientes com câncer da próstata e11,8% dos controles. O risco relativo de apresentar câncer da próstata no casode portadores do haplótipo 1 é 1,92 (valor ρ = 1,71x10" ). Deveria-se observarque freqüências alélicas são mostradas em todas as Tabelas, que representamaproximadamente metade das freqüências de portadores.

O escore de Gleason é o sistema de classificação maisfreqüentemente usado para câncer da próstata (DeMarzo, A.M. et al., Lancet361:955-64 (2003)). O sistema é baseado na descoberta de que o prognósticode câncer da próstata é intermediário entre aquele do padrão de câncer maispredominante e aquele do segundo padrão mais predominante. Id. Estes doispadrões, predominante e segundo mais prevalente, são identificados emamostras histológicas de tumores da próstata, e cada um é classificado de 1 (amais diferenciado) a 5 (menos diferenciado) e as duas classificações sãoadicionadas, um escore de Gleason combinado, também conhecido comoclassificação ou soma de Gleason, compreende portanto de 2 (para tumoresuniformemente de padrão 1) a 10 (para tumores não diferenciados). A maiorparte dos casos com padrões divergentes, particularmente quando de biópsiacom agulha, não difere em mais do que um padrão. Id.

O escore de Gleason é um indicador prognóstico, sendo que omaior desvio prognóstico é entre 6 e 7, porque tumores com escore deGleason 7 comportam-se muito pior, levando a mais morbidez e maiormortalidade do que tumores com classificação 5 ou 6. Tumores comclassificação 7 podem ser ainda mais subclassificados em 3+4 ou 4+3 (oprimeiro número é o subtipo histológico predominante na amostra de tumorbiopsiada, e o segundo número é o subtipo histológico predominanteseguinte), sendo que a classificação 4+3 é associada com prognóstico pior.

Um escore de Gleason de um paciente também pode influenciar opções detratamento. Por exemplo, homens mais jovens com quantidades limitadas deum escore de Gleason de 5 a 6 em biópsia com agulha e baixas concentraçõesde PSA podem ser simplesmente monitorados, enquanto que homens comescores de Gleason de 7 ou maiores usualmente recebem tratamento ativo. NaTabela 2, indica-se a freqüência de haplótipo e o risco associado de cânceragressivo da próstata (i.e., como indicado por uma classificação combinada deGleason de 7(4+3 apenas) a 10) e câncer menos agressivo da próstata (i.e.,como indicada por uma classificação combinada de Gleason de 2 a 7 (3+4apenas)). No entanto, um escore de Gleason não é um preditor perfeito deprognóstico. Assim, pacientes apresentando tumores com baixos escores deGleason ainda podem apresentar câncer mais agressivo da próstata (definidocomo tumores que se estendem além da próstata localmente ou por metástasedistante).

<table>table see original document page 102</column></row><table>

O risco e a significância associados com alguns dosmarcadores individuais do Haplótipo 1 (listados no cabeçalho da Tabela 2)aproximam-se daqueles do Haplótipo 1. Tabela 3 lista estes marcadores e orisco associado com os mesmos.<table>table see original document page 103</column></row><table>Um haplótipo altamente correlacionado com o haplótipo 1, queé detectado usando-se menos marcadores de microssatélites, está associadocom um risco incrementado de outras formas de câncer (p. ex., câncer demama, câncer do pulmão, melanoma). Tabela 4 mostra que este haplótipo(haplótipo la, que contém o alelo -8 de DG8S737, o alelo 1 de DG8S1769 e oalelo -1 de DG8S1407) aumenta significativamente (valor ρ de um lado só<0,05) o risco de apresentar câncer da próstata, câncer da próstata com altaclassif. de Gleason (agressivo), câncer de mama, câncer do pulmão,melanoma e melanoma cutâneo maligno, mas não aumenta o risco deapresentar melanoma in situ. Haplótipo Ia é portado por 22,2%, 16,0%,15,4% e 18,0% de pacientes de câncer da próstata, da mama, do pulmão emelanoma, respectivamente. Novamente, deveria-se observar que freqüênciasalélicas são mostradas em todas as Tabelas, que representamaproximadamente metade das freqüências de portadores.

<table>table see original document page 104</column></row><table>

Como ilustrado na Tabela 5, estudos revelaram que ohaplótipo Ia não aumenta o riso de um sujeito de apresentar hiperplasiaprostática benigna (BPH, benign prostatic hyperplasia), que não éconsiderada câncer da próstata. Como mostrado na Tabela 5, haplótipo Ia éportado por 13,8% de pacientes com BPH, em comparação com 11,4% doscontroles, com um risco relativo não significativo de 1,22.

<table>table see original document page 105</column></row><table>

Tabela 6 ilustra os amplímeros usados para amplificarseqüências para detectar marcadores de microssatélites. Tabela 7 ilustra osamplímeros usados para amplificar seqüências para detectar SNP marcadores.

Tabela 6: Listagem de iniciadores de amplímeros de microssatélites.

<table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 107</column></row><table>

Tabela 7: Listagem de iniciadores e amplímeros de SNP.

<table>table see original document page 107</column></row><table><table>table see original document page 108</column></row><table><table>table see original document page 109</column></row><table><table>table see original document page 110</column></row><table><table>table see original document page 111</column></row><table><table>table see original document page 112</column></row><table>que um percentual significativo de câncer da próstata é uma forma nãoagressiva que não se espalhará além da próstata causando morbidez oumortalidade, e sendo que todos os tratamentos de câncer da próstata,incluindo prostatectomia, radiação, e quimioterapia, apresentam efeitoscolaterais e custo significativo, seria valioso contar com marcadoresdiagnósticos marcadores diagnósticos, como aqueles descritos aqui, quemostram maior risco de câncer agressivo da próstata em comparação com a(s)forma(s) menos agressiva(s).

O risco relativo significativamente incrementado de câncer demama, câncer do pulmão e melanoma maligno em indivíduos com osmarcadores e haplótipos aqui descritos corrobora adicionalmente seu uso paraidentificar risco incrementado destas formas de câncer. Dado que oshaplótipos resultam em um risco incrementado de câncer da próstata (p. ex.,câncer agressivo da próstata), câncer de mama, câncer do pulmão e melanomamaligno, é possível que estes marcadores e haplótipos também estejamassociados com um risco incrementado de outras formas de câncer.

EXEMPLO 2: VERIFICAÇÃO DE ASSOCIAÇÃO COM CÂNCER DAPRÓSTATA EM VÁRIAS COORTES

Análise adicional corroborou a presença da variante associadacom câncer da próstata no cromossomo 8q24, alelo -8 do microssatéliteDG8S737 foi associado com câncer da próstata em três coortes deancestralidade européia da Islândia, Suécia e os Estados Unidos. O riscorelativo estimado do alelo é 1,62 (P = 2,7 χ IO"11). Cerca de 19% dos pacientese 13% da população em geral portam pelo menos uma cópia (PAR = 7,4%). Aassociação também foi replicada em uma coorte afro-americana com riscorelativo similar. Uma maior freqüência do alelo, 41% dos pacientes e 30% dapopulação são portadores, leva a uma maior PAR (16,8%) e contribuiprovavelmente para a maior incidência de câncer da próstata em afro-americanos. O alelo associa-se mais com formas agressivas de câncer dapróstata.

Materiais e métodos

População de estudo islandesa. Esta coorte foi baseada numalista de abrangência nacial do Registro de Câncer da Islândia (ICR, IslandicCâncer Registry) que contém todos os 3815 pacientes islandeses com câncerda próstata (código 10 da Revisão da Classificação Internacional de Doençascódigo (ICD10, International Classification of Disease Revision code 10)C61) diagnosticados durante o período de I0 de janeiro de 1955 a 31 dedezembro de 2004, dos quais 1291 consentiram com o estudo.

Adicionalmente, uma média de três esposas e parentes de primeiro grautambém participaram (88% de taxa de participação para pacientes e parentes).Informação clínica para pacientes do ICR incluiu idade no diagnóstico,morfologia SNOMED e códigos e estágio. Obteve-se escores de Gleason dabiópsia a partir de registros médicos que foram revistos por patologistas KRBe BAA. A idade média do diagnóstico de pacientes genotipificados foi de 71anos, e a idade média de todos os pacientes com câncer da próstata no ICR foide 73 anos.

A população com BPH compreendia 510 indivíduosdiagnosticados na Islândia com diagnósticos de BPH confirmadoshistopatologicamente entre os anos de 1982 a 2000 que não foramdiagnosticados com câncer da próstata.

Um grupo de controle de 997 indivíduos foi recrutado dapopulação em geral. Este grupo é não-relacionado nas três meioses, apresentauma relação de sexo de um, e uma faixa de idade entre 25 e 85 anos (idademédia de 50 anos). Não se observou diferenças de sexo para o alelo -8 deDG8S737 e alelo A de rs 1447295 em indivíduos de controle. O estudo foiaprovado pela Comissão de Proteção de Dados [Data Protection Commission]da Islândia e pelo Comitê Nacional de Bioética [.National BioethicsCommittee] da Islândia. Obteve-se consentimento informado por escrito detodos os pacientes, parentes e controles. Identificadores pessoais associadoscom informação médica e amostras de sanue foram criptografados com umsistema de criptografia de uma terceira parte como descrito previamente(Gulcher, J.R. etal.,Eur. J. Hum. Genet. S-.739-42 (2000)).

Populações de estudo da Suécia e dos Estados Unidos. CAPS1(CAncer Prostate in Sweden 1) [câncer da próstata na Suécia] é umapopulação baseada em estudo de caso-controle em que pacientes com câncerda próstata (ICD10 C61) foram recrutados de quatro dos seis registros decâncer regionais na Suécia de Io de janeiro ou I0 de julho de 2001 atésetembro de 2002. A população de estudo constitui de 1435 casos e 779controles equiparados por idade, sexo, e local de residência. Informaçãoclínica incluindo estágio e escores de Gleason, -80% por meio de biópsia, e-20% de cirurgia, foi obtida de registros de câncer ou do Registro Nacial deCâncer da Próstata. A idade média no diagnóstico foi de 66,6 anos parapacientes, e a idade média na inclusão foi de 67,9 anos para os controles. Oestudo foi aprovado pelos Comitês de Etica no Instituto Karolinska eUniversidade Umea. Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos(Zheng, S.L. et ai., Câncer Res. 64:2918-22 (2004); Lindmark, F. et ai., J.Natl Câncer Inst. 96: 1248-54 (2004)).

A população de estudo caucasiana constitui de 458 pacientescom câncer da próstata (ICD10 C61), que foram submetidos a cirurgia noDepartamento de Urologia do Northwestern Memorial Hospital, Chicago, e260 controles baseados na população foram incluídos no Departamento deGenética Humana, Universidade de Chicago. Registros médicos foramexaminados para recuperar informação clínica incluindo estágio e escore deGleason da biópsia. A idade média no diagnóstico foi de 59 anos parapacientes. Tanto pacientes como também controles foram de etnia americanaeuropéia auto-reportada. Isto foi confirmado pela estimativa de ancestralidadegenética usando-se 30 marcadores de microssatélites distribuídosrandomicamente por todo o genoma (ver abaixo). As porções média e devalor médio de ancestralidade Européia nesta coorte foram, ambas, maioresdo que 0,99 (ver métodos descritos abaixo para detalhes). Os protocolos deestudo foram aprovados pelo Institutional Review Boards of NorthwesternUniversity e Universidade de Chicago. Todos os sujeitos forneceramconsentimento informado.

A população de estudo afro-americana constitui de 246pacientes com câncer da próstata (ICD10 C61) e 352 controles recrutadosatravés do Flint Men 's Health Study e o Prostate Câncer Genetics Project. OFlint Men's Health Study (FMHS) é um estudo de caso-controle baseado nacomunidade, de câncer da próstata em homens afro-americanos entre asidades de 40 a 79, que foi conduzido em Genesee County, Michigan entre1996 e 2002 (Cooney, K.A. et ai, Urology 57:91-6 (2001); Beebe-Dimmer,J.L. et ai. Prostate Câncer Prostatic Dis. 9, 50-5 (2006)) e, daquele estudo,analisou-se 113 casos e 352 controles. O Prostate Câncer Genetics Project(PCGP) conduzido na Universidade de Michigan é um estudo amplo baseadoem famílias com recrutamento incluindo homens com dois ou mais membrosda família vivos com câncer da próstata ou homens diagnosticados comcâncer da próstata antes da idade de 56 anos sem uma história familiardocumentada da doença (Douglas, J.A. et al., Câncer Epidemiol BiomarkersPrev. 14:2035-9 (2005)). Daquela coorte analisou-se 153 pacientesprovenientes de 109 famílias, dos quais 78 pacientes não eram aparentados e75 agrupados em 31 famílias (maior parte de parentes de primeiro grau).Quinze pacientes com câncer da próstata estavam presentes em ambas ascoortes, FMHS e PCGP. Registros médicos foram revistos para extrairinformação relacionada com diagnóstico de câncer da próstata, incluindoestágio e escore de Gleason de biópsia. Pacientes e controles foram de etniaafro-americana auto-reportada. A proporção de ancestralidade africana eeuropéia nesta coorte foi avaliada usando-se o programa Structure (Pritchard,J.K. et al., Am. J. Hum. Genet 67: 170-81 (Epub [publicado eletronicamente],em 26 de maio de 2000)) para analisar genótipos de 30 microssatélitesdistribuídos randomicamente por todo o genoma (Helgadottir, A. et al., Am. J.Hum. Genet. 76:505-9 (Epub [publicado eletronicamente] em 7 de janeiro de2005)). Cada um destes microssatélites tem alelos que apresentam grandesdiferenças na freqüência (>0,4) entre pares de amostras de população usadasno projeto HapMap (i.e. CEU, YRI ou East Asian). Genótipos da coorte deMichigan foram processados com [o programa] Structure com genótipos deYRI (como uma amostra de referência africana), amostras CEU HapMap, euma amostra de 96 islandeses (como uma amostra de referência européiacombinada). A opção USEPOPINFO no programa Structure foi empregadacom K=3, de tal modo que a informação acerca de indivíduos comancestralidade conhecida (as amostras de referência africana e européia) pôdeser usada para determinar a ancestralidade dos indivíduos com ancestralidadedesconhecida (os afro-americanos de Michigan). As proporções médiasresultantes de ancestralidade européia na coorte de Michigan foram estimadascomo sendo de 0,224 (valor médio = 0,21) em pacientes e de 0,215 (valormédio = 0,207) nos controles. A diferença em valores médios não foiestatisticamente significante (P=0.11) de acordo com um teste derandomização realizado com 10.000 iterações. Cálculos de associação para acoorte de Michigan foram ajustados para estas estimativas genéticas deancestralidade (ver abaixo para detalhes). Consentimento informado foiobtido de todos os participantes do estudo, e protocolos foram aprovados pelaComissão de Revisão Institucional na Escola de Medicina da Universidade deMichigan.

Análise estatística. Realizou-se uma varredura ampla dogenoma com uma varredura de matriz de 1068 microssatélites, como descritopreviamente (Gretarsdottir, S. et al., Am. J. Hum. Genet. 70:593-603 (2002);Styrkarsdottir, U. et al., PLoS boil. 1:E69 (2003)). Analisou-se genótipos deum total de 871 pacientes islandeses com câncer da próstata e uma média detrês dos seus parentes de primeiro grau. Identificou-se pedigrees usando nossobanco de dados genealógico de islandeses (Gulcher, J. e Stefansson, K., Clin.Chem. LabMed 36:523-7 (1998); Gulcher, J. et al., Câncer J. 7:61-8 (2001);

Gulcher, J. et al., Eur. J. Hum. Genet. 5:739-42 (2000)). Realizou-se análisede ligação definindo-se pacientes com câncer da próstata como afetados etodos os outros como desconhecidos. Para análise de ligação de multipontosusou-se um método de compartilhamento de alelo apenas afetado (Kong, A. eCox, NJ., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997)), como implementado noprograma Allegro (Gudbjartsson, D.F. et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000)), e omapa genético deCODE (Kong, A. et al., Nat. Genet. 31:241-7 (2002)) (verabaixo). 25 marcadores adicionais foram tipificados na região de ligaçãosugestiva para incrementar o teor de informação.

Para associação de marcador simples a câncer da próstata,usou-se um teste de probabilidade para calcular um valor ρ de dois lados paracada alelo. No caso de toda a coorte islandesa (1291 casos e 997 controles),formada por meio de combinação das coortes I e II, alguns dos indivíduoscom câncer da próstata eram aparentados entre si. Considerando isto, obteve-se uma distribuição nula da estatística de teste mediante simulação degenótipos através da genealogia islandesa (ver abaixo). Usou-se umprocedimento similar para ajustar a relação de alguns indivíduos com câncerda próstata na coorte afro-amaricana de Michigan. Freqüências alélicas, aoinvés de freqüências de portadores, são apresentadas aos marcadores.Calculou-se o RR específico para alelo considerando-se um modelomultiplicativo (Falk, CT. e Rubinstein, P., Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):227-33(1987)). Para comparação dos riscos de diferentes grupos de haplótipos, usou-se o programa NEMO que emprega um procedimento de probabilidade(Gretarsdottir, S. etal.,Nat. Genet. 35:131-8 (2003)). Resultados de múltiplascoortes foram combinados usando-se um modelo de Mantel-Haenszel(Mantel, Ν. e Haenszel, W., J. Natl Câncer Inst. 22:719-48 (1959)) em que ascoortes foram deixadas apresentar diferentes freqüências de população paraalelos ou genótipos, mas presumiu-se que apresentam riscos relativos comuns.

Análise de ligação. A função de classificação de Spairs(Whittemore, A. S. e Halpern, J., Biometrics 50: 118-27 (1994); Kruglyak, L.et al, Am. J. Hum. Genet. 58: 1347-63 (1996)) e o modelo decompartilhamento de alelo exponencial (Kong, A. e Cox, NJ., Am. J. Hum.Genet. 61:1179-88 (1997)) foram usados para gerar as estatísticas de 1 df(idegree of freedom [grau de liberdade]). Quando se combinou asclassificações familiares para obter uma classificação global, em lugar de seponderar as famílias igualmente ou de se ponderar os pares afetadosigualmente, empregou-se um esquema de ponderação que fica a meio-caminho entre os dois na escala log; os pesos familiares são as médiasgeométricas dos pesos dos dois esquemas.

Correção do parentesco. A associação de um alelo para câncerda próstata foi testada usando-se a raiz quadrada indicada (+ para excesso nospacientes, - para déficit) de uma estatística padrão de relação de probabilidadeaplicada às contagens de alelos nos pacientes e controles, que, se os sujeitosforem não-aparentados, poderia apresentar assintomaticamente umadistribuição normal convencional na hipótese nula. Como alguns pacientesislandeses eram aparentados e seus genótipos não independentes, a estatísticacomo descrita apresenta um padrão de desvio maior do que 1 e ignorar issopoderia levar a valores ρ que são anti-conservativos. Realizou-se um ajusteempregando um procedimento descrito previamente (Grant, S. F. et al., Nat.Genet. 35:320-3 (Epub [publicado eletronicamente] em 15 de janeiro de2006); Stefansson, H. et al., Nat. Genet. 57:129-37 (Epub [publicadoeletronicamente] em 16 de janeiro de 2005)). 10.000 conjuntos de genótiposforam simulados para o marcador DG8S737 por meio da genealogia de708.683 Islandeses. Com cada conjunto simulado, a estatística foi recalculadatratando-se os genótipos simulados como genótipos reais dos pacientes econtroles no estudo. A partir das simulações, usou-se o desvio padrãoverdadeiro da estatística que sob a hipótese nula é de 1,018 para alelo -8, eeste valor foi usado para calcular os valores ρ para a coorte islandesa total1291 pacientes com câncer da próstata e 997 controles. Com base emsimulações semelhantes, verificou-se que o fator de ajuste para o alelo A ders 1447295 é um tanto mais baixo, conforme esperado em virtude da maiorfreqüência de alelo A comparado com o alelo -8. Decidiu-se usar o fator deajuste mais elevado de 1,018 durante o processo visando a simplicidade.

Assim, os resultados reportados para o alelo A são ligeiramenteconservativos. Aplicando-se o mesmo método à coorte afro-americana deMichigan com as relações dadas de alguns dos pacientes, verificou-se que ofator de ajuste é de 1,032.

Avaliação da ancestralidade genética. Usou-se o programaStructure (Pritchard, J.K. et ai., Genetics 115:945-59 (2000)) para estimar aancestralidade genética dos indivíduos. Structure infere as freqüências dealelos de populações ancestrais K com base em genótipos multi-lócus a partirde um conjunto dos indivíduos e um valor de K específico para o usuário, edetermina para cada indivíduo uma proporção de ancestralidade a partir decada uma das populações K inferidas. A análise do conjunto de dados foirealizada com K=3, com o objetivo de identificar a proporção deancestralidade africana e européia em cada indivíduo. A significânciaestatística da diferença na ancestralidade européia média entre pacientes econtroles afro-americanos foi avaliada com referência a uma distribuição nuladerivada de 10000 conjuntos de dados randomizados.

Para avaliar geneticamente a ancestralidade das coortes deestudo dos Estados Unidos, selecionou-se 30 marcadores de microssatélitesnão-ligados dentre cerca de 2000 microssatélites genotipificados em umacoorte multi-étnica previamente descrita (Pritchard, J.K. et al., Genetics115:945-59 (2000)) de 35 americanos europeus, 88 afro-americanos, 34chineses, e 29 americanos mexicanos. Dos 2000 marcadores demicrossatélites, o conjunto selecionado mostrou as diferenças maissignificativas entre americanos europeus, afro-americanos, e asiáticos, etambém apresentou uma boa qualidade e rendimento: D1S2630, D1S2847,D1S466, D1S493, D2S166, D3S1583, D3S4011, D3S4559, D4S2460,D4S3014, D5S1967, DG5S802, D6S1037, D8S1719, D8S1746, D9S1777,D9S1839, D9S2168, D10S1698, D11S1321, D11S4206, D12S1723,D13S152, D14S588, D17S1799, D17S745, D18S464, D19S113, D20S878 eD22S1172. Usou-se o seguinte par de iniciadores para DG5S802: DG5S802-F: CAAGTTTAGCTGTGATGTACAGGTTT (SEQ ID NO: 23) e DG5S802-R: TTCCAGAACCAAAGCCAAAT (SEQ ID NO: 24).

Seleção de bibliotecas de cDNA com PCR. Bibliotecas decDNA comercialmente obteníveis foram selecionadas para transcrições AW.As bibliotecas selecionadas foram Prostate Marathon-Ready cDNA library(Clontech Cat. 7418-1), Testis Marathon-Ready cDNA library (Clontech Cat.7414-1), Bone marrow-Ready cDNA library (Clontech Cat.7431-1),Adicionalmente, construiu-se bibliotecas de cDNA para sangue integral ecélulas linfoblastóides humanas transformadas com EBV. RNA total foiisolado das linhas de células linfoblastóides e de sangue integral, usando-se okit de isolamento de RNA RNeasy da Qiagen (Cat. 75144) e o isolamento deRNA RNeasy do kit de sangue integral (Cat. 52304), respectivamente. RNAfoi analisado subseqüentemente e quantificado usando-se o bioanalisadorAgilent 2001 Bioanalyser. Preparou-se bibliotecas de cDNA empregando umprotocolo de hexâmero randômico do kit de síntese de cDNA de primeirofilamento menos H da RevertAid™ (Fermentas Cat. Kl631). As reações PCRforam realizadas em volume de 10 ul a uma concentração final de 3,5 μΜ deiniciadores à frente [forward] e invertidos, 2 mM de dNTP, Ix tamponador dePCR Advantage 2 PCR e 0,5 ul de biblioteca de cDNA. Realizou-se seleçãode PCR empregando o sistema Advantage® 2 PCR Enzyme RT PCRSystem (Clontech) de acordo com instruções dos fabricantes. Pares deiniciadores de PCR (Operon Biotechnologies) usados são mostrados naTabela 8.<table>table see original document page 123</column></row><table>RACE. 5'- e 3'-RACE da transcrição de AW foram realizadosempregando as bibliotecas de cDNA Marathon-Ready (Clontech), de acordocom as instruções do fabricante. Usou-se os iniciadores (OperonBiotechnologies) mostrados na Tabela 9.

Tabela 9. Iniciadores usados para RACE

<table>table see original document page 124</column></row><table>

Novas variantes de recomposição da transcrição de AWidentificadas por meio de RACE foram verificadas usando-se RT-PCR nasbibliotecas de cDNA correspondentes. Todos os produtos de PCR foramclonados e suas seqüências verificadas para confirmar os resultados de RACEoriginais.

Linhas de células. As linhas de células de câncer da próstata aseguir foram obtidas do ATCC. DU 145, uma linha de células de câncer dapróstata gerada de metástase do cérebro; LNCaP, uma linha de células decâncer da próstata gerada de metástase de nódulos linfáticos; CA-HPV-10,uma linha de células de câncer da próstata gerada de adenocarcinoma apóstransfecção com HPV 18; PZ-HPV-7 e RWPE-1, ambos gerados de tecido depróstata normal após transfecção com HPVl 8. Adicionalmente, gerou-selinhas de células de linfoblastóides por meio de transformação de EBV apartir do sangue periférico de determinados pacientes islandeses com câncerda próstata. Estas linhas de células foram usadas para análise demanchamento Southern blot.

Análise de manchamento Northern. Manchamentos Northernde tecido, múltiplos, comerciais foram obtidos da Clontech (Human MTN®Blot II Cat. 7759-1). Adicionalmente realizou-se manchamentos das linhas decélulas de câncer da próstata descritas acima. Em resumo, RNA total foiisolado de linhas de células usando-se um protocolo de purificaçãocombinado de Trizol (GIBCO BRL n° de catálogo 15596-018) e RNAeasy(Qiagen n° de catálogo 74106) de acordo com as instruções do fabricante.

Purificou-se mais Poli (A) RNA usando o kit Poly(A)Purist™ MAG daAmbion (Cat. 1922) 1,5 μg de poli (A) RNA foi submetido da electoforeseem um gel de agarose-formaldeído, manchado sobre membranas de nylonHybond N (Amersham), e fixado usando reticulação com UV.

Incluiu-se o uso de sondas: i) O clone de cDNA AWl838833(IMAGp998M21665OQ) obtido da RZPD Deutsches Ressourcenzentrum furGenomforschung GmbH, Alemanha(http://www.rzpd.de/products/genomecube.shtml); e ii) clone de cDNA quecorrespondeu aos éxons de 6 a 8 das transcrições AW obtidas dosexperimentos RT-PCR. O clone teve a seqüência verificada como a seguir:ttgctcctcaggaaccctattttggactgacgtttaatacaacatggaagccaccaággcttacagaatgtgctttccagagctgtgacctgaactgtacctggggccttttgagtgaggctggaactggagtggcctggatgcagagagcagtgtcctaaggctgtgcaggttgc^aagaaagctcaagtagcctatggagaggatgcaaggcttccagctgatgccctcagccaggctcagtagcagccagaactagcctaccaacgaacctgctgatcatgtgcataagccaccttgaacgtcgatcctcctgcctggtggagccatcccagctgatgccacatgaagcagacacaagctgtccctactaagctctgctcaagttggatattcatgagtgaAATAAATGACTGTTACTAAGTAATTAATTTTTGGGTGGCTGTrATGTAGCAgtagataatragaacaaagcttattgacataatacatctatatcmctccaatccatttttttaagtaataaagttgatgtttgttttgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagacctgcccgggcggccgctcgagccctatagtgagtaagggcgaatccagcacactggcgccgtactagtgatccgagctcgtagca (seqid no: 77).

Fragmentos de cDNA foram rádio-marcados com [a"32P]dCTP(atividade específica de 6000Ci/mmol), usando o kit de marcação Megaprime(Amersham Cat. RPN 1607) e nucleotídeos não incorporados removidos dareação usando microcolunas ProbeQuant G-50 (Amersham Cat. 27-5335-01).Membranas foram pré-hibridizadas em tamponador Rapid-hyb (AmershamCat. RPN 1635) durante pelo menos 30 minutos e subseqüentementehibridizadas com de 100 a 300 ng da sonda de cDNA marcada. Hibridizaçõesforam realizadas em tamponador Rapid-hyb a 68°C de um dia para o outro e0,1-0,15 μg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado cisalhado quandose usa sondas de cDNA. As sondas marcadas foram aquecidas durante 5minutos a 95°C antes da adição nos filtros na solução de pré-hibridização.Após a hibridização, as membranas foram lavadas com baixa estringência em2x SSC, 0,05% de SDS à temperatura ambiente durante de 30 a 40 minutosseguido de duas lavagens com alta estringência em 0,lx SSC, 0,1% de SDS a50oC durante 40 minutos. Os manchamentos foram imediatamente fechadoshermeticamente e expostos a película de raios-X Kodak BioMax MR (Cat.8715187).

Análise de manchamento Southern de campo pulsanteL

Preparou-se DNA com alto peso molecular em blocos de agarose por meio deembutimento de linhas de células de linfoblastos, geradas de sangue periféricode pacientes com câncer da próstata, em agarose com baixo ponto de fusão(Incert, FMC bioproducts) com um plexi-molde de plugue Biorad 10(catálogo Biorad n° 170-3591). A concentração final de células na agarose foisempre ajustada a 2x107 células por ml. DNA também foi isolado de tecido depróstata maligno e normal recentemente congelado. Para cada paciente, DNAfoi isolado de 20 fatias de quatro a cinco mícrons de amostras de tecidorecentemente congeladas embutidas em OCT (percentual >70% de tumor)usando-se o kit de preparação de DNA MasterPure™ da Epicentre Inc., n° deCat, MC85200). DNA foi amplificado subseqüentemente usando-se o kit deamplificação de DNA GenomiPhi (GE Healthcare, Cat. 25-6600-02) deacordo com o protocolo do fabricante e diluído com uma quantidade igual detamponador TE. Blocos de agarose e amostras de DNA de tecido de próstataWGA correspondendo a 10 ug de DNA foram digeridos com a endonucleasede restrição HindIII de acordo com protocolos convencionais (New EnglandBiolabs). Após digestão, os blocos de agarose ou amostras de DNA WGAforam carregados em um gel de agarose a 0,8%. Após eletroforese o gel foidepurado em 0,25M de HCl durante 30 min e desnaturado em 0,5M deNaOH, 1,5M de NaCl. DNA foi então transferido para um filtro de nylon(Hybond N+). As membranas foram então sondadas com um inserto de BACpurificado rádio-marcado RPll 367L7 (Amersham megaprime) de acordocom protocolos convencionais como descrito acima para manchamentoNorthern. Após lavagem a membrana foi exposta a película (Kodak MR)durante de 1 a 4 dias a -80°C.

Confirmação em coortes islandesas

Numa tentativa de identificar variantes genéticas subjacentesao risco de câncer da próstata, empreendeu-se uma varredura de ligaçãoampla no genoma empregando 1068 marcadores de microssatélites tipificadosem uma coorte de 871 pacientes islandeses com câncer da próstata agrupadosem 323 famílias estendidas. Esta varredura produziu um sinal de ligaçãosugestivo no cromossomo 8q24 que, após adição de marcadores paraincrementar o teor de informação, forneceu uma classificação máxima deLOD de 2,11 (D8S529 a 148,25 cM) e 3,15 (D8S557 a 145,65 cM) (FIG. 7A).

Para refinar a fonte do sinal de ligação, 358 microssatélite e marcadores indelcompreendendo IOMb (18,6cM) no cromossomo 8 de 125-135 Mb (Build 34do NCBI) em 869 foram genotipificados em pacientes com câncer da próstatanão-aparentados e 596 controles da população (coorte I) (FIG. 7A e 7B). Aassociação de marcador simples ao câncer da próstata foi calculada com baseem um modelo multiplicativo de risco (Falk, CT. e Rubinstein, P., Ann. Hum.Genet. 51(pt 3), 227-33 (1987)). A associação mais forte foi observada noalelo -8 do microssatélite DG8S737, com um risco relativo (RR) estimado de1,79 por cópia portada (P = 3,OxlO"6) (FIG. 7B e Tabela 10). Esta associaçãofoi replicada em uma segunda coorte islandesa de 422 pacientes com câncerda próstata e 401 controles baseados na população (coorte II), em que alelo -8portou um RR estimado de 1,72 (P = 0,0018, todos os valores ρ são de doislados, incluindo aqueles obtidos de estudos de replicação). Na coorteislandesa global de 1291 pacientes com câncer da próstata e 997 controles(combinando-se as coortes I e II), o alelo -8 de DG8S737 apresentou umafreqüência de 13,1% em pacientes e 7,8% em controles. Isto resulta em umRR estimado de 1,77 (P =2,3 xlO"8), um RR estimado de 1,77 (P = 2,3 χ 10-8)e um risco atribuível à população (PAR) de 11% (Tabela 10), após ajuste doparentesco das coortes I e II. O marcador DG8S737 (128,433096 Mb)encontra-se localizado em um bloco de desequilíbrio de ligação (LD) quecompreende 92 kb no cromossomo 8q24.21 (de 128.414 a 128.506 Mb deconstrução [Build] 34 do NCBI) em amostras de HapMap CEU. O bloco deLD é referido como LD Bloco A.

Tabela 10. Associação de alelos no cromossomo 8q24 com câncer da próstata na Islândia <table>table see original document page 128</column></row><table>

Mostra-se os alelos para os marcadores DG8S737 e rsl447295 em 8q24.21 eos números correspondentes de casos e controles (N), freqüências alélicas devariantes em indivíduos afetados e indivíduos de controle, a relação deprobabilidade (RR) e valores P de dois lados.

a Indivíduos não são aparentados a 3 meioses.

b A análise de associação foi ajustada quanto ao parentesco de alguns dosindivíduos.Para investigar a extensão do sinal de associação, 12microssatélites adicionais e 63 SNPs em uma região de 600 kb circundando oDG8S737 foram genotipificados (FIG. 7C, Tabelas lie 12). Após tipificaçãode microssatélites e marcadores de SNP adicionais em uma região de 600 kbcircundando o DG8S737, verificou-se que o alelo A do SNP SG08S717(rs 1447295) apresento a associação mais forte (FIG. 7C). Outrosalelos/marcadores que se encontram localizados no mesmo bloco de LD queDG8S737 e SG08S717 (rsl447295) associaram-se significativamente comcâncer da próstata como mostrado na Tabela 13 e podem ser usados paradetectar as variantes de risco que se associam com câncer da próstata. Estesmarcadores e alelos são, portanto, substitutos para os alelos -8 de DG8S737 eA de SG08S717 (rsl447295), como o são muitos dos possíveis haplótiposcompreendendo pelo menos dois dos marcadores listados na Tabela 13.<table>table see original document page 130</column></row><table><table>table see original document page 131</column></row><table>Tabela 12. Marcadores de SNP genotipificados na região de 600 kb noChr8q24

<table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table><table>table see original document page 134</column></row><table><table>table see original document page 135</column></row><table><table>table see original document page 136</column></row><table><table>table see original document page 137</column></row><table>De uma maneira global empregou-se 53 SNPs e 6microssatélites do bloco de LD que também contém DG8S737. Estes Iocicapturaram a maior parte da diversidade do haplótipo no bloco de LD deacordo com os dados de HapMap de Utah CEPH (CEU) (fase II, comunicado19). Um total de 37 dos 53 SNPs foram associados significativamente comcâncer da próstata (P < 0.001), com alelo A de SNP rs 1447295 apresentando aassociação mais forte (RR = 1,72, P= 1,7x10"9) (Tabela 10). Dezesseis dosSNPs pertencem à mesma classe de equivalência (r = 1) como rs 1447295 naamostra de HapMap de CEU, e, portanto, apresentaram resultados deassociação comparáveis.

Nas amostras islandesas, alelo -8 de DG8S737 e alelo A ders 1447295 foram substancialmente correlacionadas (r « 0,5). Após tipificar omarcador DG8S737 na amostra de HapMap de CEU, verificou-se que acorrelação foi inferior ali (r « 0,3), mas nenhum SNP no HapMap (fase II)apresentou uma correlação maior (Tabela 13). Em outras palavras, os SNPsque foram mais associados com alelo -8 de DG8S737 também são aquelesmais associados com câncer da próstata.Replicação em duas coortes de ancestralida.de européia

A replicação desta associação usando os marcadores DG8S737e rs 1447295 foi realizada em uma coorte sueca de 1435 pacientes não-relacionados com câncer da próstata e 779 controles baseados na população, euma coorte de 458 pacientes europeus-americanos e 247 controles deChicago. Em ambas as coortes a freqüência do alelo -8 de DG8S737 foisignificativamente maior em pacientes do que em controles, com um RR de1,32 (P = 0,013) e 2,10 (P = 0,0029) para as coortes suecas e européia-americana, respectivamente. Obteve-se um resultado similar para o alelo A ders 1447295 (Tabela 14), indicando que as variantes identificadas na coorteislandesa provavelmente são associadas com risco incrementado de câncer dapróstata na maior parte das populações de ancestralidade européia.Para investigar os riscos do alelo -8 de DG8S737 e do alelo Ade rsl447295 conjuntamente (Gretarsdottir, S. et ai., Nat. Genet. 35:131-8(2003)), cromossomos foram repartidos em três grupos: i) Cromossomos queportam o alelo -8 de DG8S737 e, ou o alelo de rsl447295 (a ampla maioriaporta o alelo A) (-8 & A/G); ii) Cromossomos com o alelo A de rs 1447295 equalquer alelo de DG8S737 diferente do alelo -8 (referida como Χ) (X & A);e iii) Cromossomos que não portam o alelo -8 nem o alelo A (X & G).Combinando-se os dados das três coortes usando um modelo de Mantel-Haenszel (Mantel, N. e Haenszel, W., J. Natl. Câncer Inst. 22:719-48 (1959)),o risco de (-8 & A/G) relativamente a (X & G) foi estimado como sendo de1,61 (P= 5,9 χ IO"11). O risco estimado de (X & A) relativamente a (X & G)foi substancialmente inferior em 1,27 mas significante (P = 0,0088). Comonem o alelo -8 de DG8S737 nem os alelos A de rsl447295 por si só podemexplicar totalmente o perfil de risco, pode haver variantes funcionaismúltiplas na região, ou estes alelos são LD forte, porém imperfeito.

Replicação da variante de risco e maior risco atribuível à população em umacoorte afro-americana

Um terceiro estudo de replicação, em uma coorte afro-americana com 246 pacientes com câncer da próstata e 352 controles, foirealizado para determinar se as variantes identificadas acima também sãoassociadas com câncer da próstata em um grupo com alta incidência dadoença. Adicionalmente, se este fosse o caso, postulou-se que a maiordiversidade genética em afro-americanos, resultando de uma grandeproporção de ancestralidade africana, poderia proporcionar mais resoluçãopara apontar a localização da variante de risco desconhecida. Esta suposiçãofoi corroborada por uma análise da região que compreende o bloco de LD de92kb na amostra de HapMap de iorubanos da Nigéria (YRI), que reveloumaior diversidade genética e também menor LD neste grupo entre os SNPsque se mostraram altamente correlacionados nas populações de ancestralidadeeuropéia. Especificamente, enquanto 19 SNPs, incluindo rs 1447295,encontram-se na mesma classe de equivalência (r = 1) nos dados de HapMapde CEU (fase II), estes SNPs pertencem a 13 diferentes classes deequivalência na amostra YRI de HapMap (Tabela 14). Conseqüentemente,adicionalmente a DG8S737, a coorte afro-americana foi genotipificada com17 dos 19 SNPs equivalentes (incluindo rs 1447295). Dentre os dois omitidos,um correlacionou-se perfeitamente com dois outros SNPs que foramgenotipificados, e o outro foi não-polimórfico nas amostras de YRL

As diferenças nas freqüências de alelos entre a amostra deHapMap YRI e os controles das coortes com ancestralidade européiasuscitaram a possibilidade de que resultados de associação falsos positivos ounegativos poderiam ser causados por diferenças na distribuição daancestralidade européia entre os pacientes afro-americanos e os controles.

Portanto, para controlar a ancestralidade realizou-se genotipificação de umconjunto de 30 microssatélites que são distribuídos randomicamente nogenoma e informativo para distinguir entre ancestralidade africana eancestralidade européia. Uma análise destes dados com Structure (Pritchard,J.K. et al., Am. J. Hum. Genet. (67:170-81 (Epub [publicado eletronicamente]em 26 de maio de 2000)) não revelou diferenças significativas naancestralidade européia entre pacientes e controles. Adicionalmente, análisesde associação realizadas com e sem ajuste de ancestralidade deram resultadospraticamente idênticos (Helgadottir, A. et al., Am. J. Hum. Genet. 76:505-9(Epub [publicado eletronicamente] em 7 de janeiro de 2005); Pritchard, J.K.et al., Am. J. Hum. Genet. 67:170-81 (Epub [publicado eletronicamente] em26 de maio de 2000)).

A freqüência do alelo -8 de DG8S737 foi de 23,4% nospacientes afro-americanos com câncer da próstata e 16,1% nos controles, comRR=I,60 (P = 0,0022, com ajuste de parentesco entre alguns dos pacientes).

O SNP que deu o menor valor ρ foi rs 1447295, sendo que a freqüência do Aalelo foi de 34,4% em pacientes e de 31,3% em controles (RR=I515), mas aassociação não foi significativa (P = 0,29). Estes resultados indicam que -8 deDG8S737 é, ou por si só uma variante funcional, ou é muito estreitamenteassociado com uma variante de risco presentemente desconhecida tanto empopulações de ancestralidade européia como de ancestralidade africana. Emcontraste, nem rs 1447295 nem qualquer um dos outros 16 SNPs foramsignificativamente associados com câncer da próstata na coorte afro-americana (Tabela 14). Comparando com os dados de HapMap YRI (fase II)verificou-se que os três SNPs que apresentam a correlação mais forte com oalelo -8 de DG8S737 ali (r2=0,32 a 0,34) foram incluídos nos 17 SNPsgenotipificados nas amostras afro-americanas (Tabela 14). Embora o RR sejasimilar em populações de ancestralidade africana e ancestralidade européia, oPAR nos afro-americanos é consideravelmente maior (16,8% versus 5,8-11%)devido à maior freqüência de -8 de DG8S737 no primeiro grupo. Estafreqüência mais elevada pode ser explicada pela freqüência deste alelo empopulações africanas, p. ex. na amostra de YRI HapMap a freqüência é de22,5%. Isto abre a possibilidade de que PAR do -8 de DG8S737 pode serainda maior em populações africanas.

O marcador DG8S737 é uma repetição de dinucleotídeo AC eo alelo -8 deriva-se do fato de que este alelo é 8 bp menor do que o menoralelo da amostra de CEPH 1347-02, que foi usada como uma referência paragenótipos de microssatélite. Embora DG8S737 apresente uma considerávelfaixa de tamanhos de alelos, uma análise filogenética indica que apresentauma taxa de mutação moderada e que tamanhos de repetições estãofortemente correlacionados com o fundo de SNP nas amostras de HapMap(FIG. 8). Uma rede de conjugação média (Bandelt, HJ., Forster, P. & Rohl,Mol Biol Evol 16, 37-48 (1999)) descrevendo as relações genealógicas entre136 haplótipos distintos inferiu que os genótipos de 46 SNPs obtidos dobanco de dados do projeto HapMap ÇNature 437, 1299- 320 (2005))(comunicado 19) e um microssatélite, DG8S737. Todos estes Ioci estãocontidos em uma região de ~30 kb (128.426.310-128.456.027, construção[Build] 34 do NCBI) no cromossomo 8. Mostra-se haplótipos dos 60 parentesde CEPH de Utah (CEU) com ancestralidade européia do norte ou do oeste,60 parentes iorubanos da Nigéria (YRI), 45 indivíduos chineses de Beijing e44 indivíduos japoneses de Tokyo (HCB & JPT), usados no projeto HapMap.Haplótipos em fase foram gerados usando-se o algoritmo EM, emcombinação com a informação trio de famílias para as amostras de Utah eloruba (sendo que os genótipos das 30 crianças em cada uma das amostras depopulação foram usadas para auxiliar a inferir a fase alélica dos haplótipos).Cada haplótipo mutacionalmente diferente é representado por um circo cheiocuja área reflete o número combinado de cópias observadas nos quatro grupospopulacionais. Em casos em que se inferiu a presença de haplótipos em maisde uma população, pie slices indicam o número de cópias de haplótipos decada população. As linhas entre os círculos indicam diferenças entre osestados alélicos dos haplótipos, com um comprimento proporcional aonúmero de diferenças e os Ioci em que alelos diferem indicados pormarcadores. As linhas representam as vias mutacionais mais prováveis entreos haplótipos de acordo com o princípio da parsimônia evolucionáriasubjacente ao algoritmo de conjugação média. Diferenças mutacionais entrehaplótipos são mostradas como linhas perpendiculares curtas que cruzam avias evolucionárias conectando haplótipos. Neste caso, eventos mutacionaissão considerados como sendo, ambos, mutações pontuais em SNPsindividuais, mutações escalonadas do microssatélite DG8S737 e eventos derecombinação. Mostra-se paralelogramas na rede quando a ordem temporal dedois ou mais eventos de mutação não puderam ser resolvidos.

A estabilidade evolucionária (taxa de mutação) de ummicrossatélite é refletida na medida em que tamanhos de repetição sãocorrelacionados com haplótipos de SNP. Assim, poderia-se esperar que ummicrossatélite relativamente estável apresente tamanhos similares de alelos nofundo de haplótipos de SNP idênticos ou estreitamente relacionados, comdiferenças maiores entre haplótipos de SNP relacionados mais distantemente.Em contraste, uma correlação do tipo referido não seria esperada para ummicrossatélite rapidamente mutante, onde diferenças substanciais no tamanhoda repetição podem ser encontradas em haplótipos de SNP estreitamenterelacionados e pode-se encontrar tamanhos idênticos de repetições emhaplótipos de SNP distantemente relacionados devido a eventos de mutaçãorecorrentes no microssatélite. FIG. 8 mostra claramente que haplótipos deSNP estreitamente relacionados tendem a apresentar tamanhos similares derepetições para o microssatélite DG8S737, e haplótipos de SNP distantementerelacionados tendem a apresentar tamanhos de repetições mais divergentes.Estimou-se que a correlação entre o número de alelos de SNP que diferiramentre todos os pares haplótipos e o número de repetições de DG8S737 quediferiram entre todos os pares de haplótipos. Coeficiente de correlação não-paramétrico de Spearman ρ = 0,334 com um valor P empírico <0,00001, combase na avaliação da correlação em 10.000 conjuntos de dados em que osalelos de microssatélites foram atribuídos randomicamente aos haplótipos deSNP. Isto indicou uma taxa de mutação moderada para o microssatéliteDG8S737, suficiente para gerar um grande número de diferentes tamanhos dealelos, porém insuficiente para degradar a correlação entre tamanho darepetição com fundo do haplótipo de SNP.<table>table see original document page 144</column></row><table>Análise de múltiplas coortes

Tabela 15 mostra as características de LD do alelo -8 deDG8S737 e 19 outros SNPs que pertencem à mesma classe equivalente queSG08S717/rs 1447295 em HapMap CEU5 Islândia, Iorubans HapMap (YRI) eafro-americanos dos estudos FMHS e PCGP na Universidade de Michigan.Marcadores nesta estrutura de blocos também estão em correlação moderada(r abaixo de 0,2) com marcadores mais distantes a até 200 kb (incluindomarcadores a 128515000 bps (rs7845403, rs6470531 e rs7829243) emarcadores em torno de 128720000 bps (rsl0956383 e rs6470572) na área dogene PVT1).<table>table see original document page 146</column></row><table><table>table see original document page 147</column></row><table>Verificou-se que o modelo de risco multiplicativo usado paratestar a adequação dos dados apropriadamente para ambas as populações deancestralidade européia e de ancestralidade africana. Assim, nós replicamos aassociação observada em pacientes islandeses com câncer da próstata econtroles usando os marcadores DG8S737 e SG08S717 (rsl447295) em umaamostra de controle de caso sueco.

Tabela 16: Comparação do risco relativo de -8 de DG8S737 e A dersl447295 no modelo multiplicativo com aquele de estimativas livres demodelo dos riscos relativos do genótipo dos portadores heterozigóticos(0X), homozigóticos (XX) e não-portadores (00).

<table>table see original document page 148</column></row><table>

a Teste do modelo pleno Versus o modelo multiplicativo e em umaamostra de controle de caso incluindo 458 pacientes europeus-americanos e247 controles de Chicago, E.U.A. Indivíduos que são portadoreshomozigóticos do alelo -8 de DG8S737 ou do alelo A de rsl447295apresentam um RR ainda maior do que portadores heterozigóticos para todasas quatro populações estudadas como mostrado na Tabela 16 (genótipo XX).

Assim, indivíduos que portam dois alelos de risco encontram-se em um riscoainda maior de desenvolver câncer da próstata do que aqueles portando umalelo de risco.

Variante de risco associa-se mais fortemente com câncer agressivo dapróstata.

Em seguida, determinou-se se as variantes de risco seassociam mais fortemente com formas agressivas de câncer da próstata comorefletido por classificações Gleason elevadas. Em todas as quatro coortespacientes-controles, a freqüência do -8 de f DG8S737 foi significantementemaior em pacientes com câncer da próstata com escores de Gleasoncombinados de 7 a 10 do que nos controles (Tabela 17). O mesmo éverdadeiro para pacientes com câncer da próstata com escores de Gleason de2 a 6 em comparação com controles, mas o RR é maior no grupo comGleason de 7 a 10 em comparação com o grupo Gleason de 2 a 6. Além disso,a freqüência do alelo -8 foi maior em pacientes com altas classificaçõesGleason (7-10) em comparação com baixas classificações Gleason (2-6) emtodos os quatro grupos de casos-controles combinados (RR = 1,21, P = 0,02)e os três grupos de casos-controles de ancestralidade européia combinados,(RR= 1,18, P = 0,07).

Tabela 17. Associação de alelos no cromossomo 8q24 com altos e baixosescores de Gleason na Islândia, Suécia e nos E.U.A.

<table>table see original document page 149</column></row><table><table>table see original document page 150</column></row><table>

Mostra-se alelos para os marcadores DG8S737 e rsl447295 em 8q24.21 e osnúmeros correspondentes de casos e controles (N)5 freqüências de variantesem indivíduos afetados e de controle, o risco relativo (RR), valores P de doislados e risco atribuível à população (PAR). Cerca de 80% dos escores deGleason da Suécia são de material de biópsia e o resto é de cirurgia.

Além disso, a freqüência de alelo -8 foi maior em pacientescom alto escore de Gleason (7-10) do que em pacientes com baixo escore deGleason (2-6) em todas as quatro coortes (combinadas, relação deprobabilidade = 1,22, P = 0,020). Uma análise de 510 homens islandesesdiagnosticados com hiperplasia prostática benigna (BPH), mas não câncer dapróstata, não apresentaram excesso significativo de qualquer dos alelos -8 deDG8S737 ou alelo A de rs 1447295 (Tabela 18) indicando que estas variantessó aumentarão o risco de tumores de próstata malignos, particularmente asformas mais agressivas.Tabela 18. Associação de alelos no cromossomo 8q24 com hiperplasiaprostática benigna (BPH) na Islândia.

<table>table see original document page 151</column></row><table>

Mostra-se alelos em 8q24.21 e os números correspondentes decasos e controles (N), freqüências alélicas de variantes em indivíduos afetadose de controle, o risco relativo (RR), P valores e risco atribuível à população(PAR). Hiperplasia prostática benigna pacientes (BPH) foram diagnosticadoscom base na excisão transuretral da próstata (TURP, transurethral excision ofthe prostate), biópsias com agulha fina ou excisão da glândula da próstata.Indivíduos são não-aparentados a 3 meioses. Controles usados nesta análiseforam os mesmos indivíduos usados na análise de associação para as coortesislandesas de câncer da próstata. BPH+PrCa- indica indivíduosdiagnosticados com BPH mas não com câncer da próstata.Caracterização funcional do bloco de LD incluindo a variante de risco.

Como apenas o alelo de microssatélite apresentou significativaassociação na coorte afro-americana e como o bloco de LD contendo estelócus é menor e é fragmentado em unidades menores em afro-americanos(FIG. 9A-9C), é possível que a região mais provável de conter a variantefuncional pode ser estreitada às posições 128.414-128.474 Mb (construção[Build] 34 do NCBI). Esta região contém um EST recomposto (AWl 83883) etrês ESTs de éxon simples (BE144297, CV364590 e AFl 19310)adicionalmente a alguns genes preditos, mas nenhum gene conhecido (Kent,WJ. et al., Genome Res. 12:996-1006 (2002)). Não se detectou microRNAsdentro do bloco (Griffiths- Jones, S., Nucleic Acids Res. 32:D109-11 (2004)).

Análise de expressão em várias bibliotecas de cDNA25 confirmou a expressão do EST de AWl83883 mas nenhuma dos outros ESTs(ver Materiais e Métodos acima). Identificou-se quatro variantes derecomposição diferentes do EST de AWl83883 por meio de identificaçãorápida de pontas de cDNA (RACE) a 5'and 3' que foram verificadas por meiode RT-PCR e análise de manchamento Northern (FIG. 10). Duas destastranscrições (1,5 kb), ambas abrigando o EST de AWl83883, foram expressasem testículos, mas não no baço, timo, próstata, ovário, intestino delgado, colo,leucócitos do sangue periférico ou linhas de células da próstata (dados nãomostrados). Em contraste, a expressão das duas outras transcrições, abrigandoéxons de 6 a 8 só foram detectados em linhas de células de próstata normais(transcrição de 0,6 kb) e malignas (transcrições de 0,6 e 0,9 kb) (dados nãomostrados). As ORFs preditas para estas transcripções não apresentaramhomologia significativa com proteínas conhecidas. O microssatélite DG8S737e o SNP rs 1447295 encontram-se localizados no íntron entre éxons 4 e 5 (ou6) nas transcrições de testículo e a 5' com relação às transcrições específicaspara próstata (FIG. 10). E concebível que estes marcadores ou outrosmarcadores em LD com estes marcadores afetem o padrão de recomposiçãode uma ou mais transcrições nesta região. Verificou-se que 8q24 é a regiãocromossômica mais freqüentemente obtida em tumores da próstata (Baudis,M. e Cleary, ML., Bioinformatics 17:1228-9 (2001)). Ganho nesta região foiassociado com tumores agressivos, independência hormonal e prognósticoruim (El Gedaily, A. et al., Prostate 46:184-90 (2001)). Para avaliar secromossomos portando o alelo -9 de DG8S737 foram associados cominstabilidade genômica incrementada, realizou-se uma análise demanchamento Southern, cobrindo a região de LD de 92 kb usando-se linhagerminativa e DNA de tumor de pacientes com câncer da próstata que foramportadores e não-portadores do alelo -8. Apenas uma amostra de tumor (não-portador) de 14 apresentou um padrão de restrição polimórfico, mas não seobservou nenhum no DNA de linha germinativa, seja de portadores ou não-portadores (dados não mostrados). Assim, parece improvável que a variantede linha germinativa do -9 de DG8S737 esteja associada com rearranjo daregião A do bloco de LD.

Também é interessante a proximidade do DG8S737 com obem conhecido oncogene c-MYC, a uma distância de apenas -270 kb(telomérico). No entanto, não se observou qualquer correlação significativaentre SNPs localizados no gene c-MYC e risco de câncer da próstata ou asvariantes de risco identificadas neste estudo (dados não mostrados). Noentanto, é possível que a variante de risco atue modificando a regulação do c-MYC mediante predisposição à instabilidade genômica ou mediante alteraçãoda regulação de expressão de longo alcance.

DISCUSSÃO

Em resumo, significativa associação do câncer da próstatarisco com o alelo -9 do DG8S737 e o alelo A de rs 1447295 foi demonstradaem três coortes de ancestralidade européia (em que o alelo de rs 1447295 éperfeitamente correlacionado com alelos de pelo menos 18 outros SNPspróximos). Combinando-se resultados destas coortes obteve-se um RRestimado de 1,59 (P = 1,40 χ IO"10) para -9 de DG8S737 e um risco relativoestimado de 1,50 (P = 1,62 χ IO"11) para o alelo A de rs 1447295. Presumindo-se freqüências de população de 6,6% e 10,7% (médias das três coortes), osPAR correspondentes são de 7,4% e 9,9%, respectivamente, para estes doismarcadores. A associação foi replicada entre câncer da próstata e o alelo -8em uma coorte afro-americana com risco relativo quase idêntico (RR = 1,60,P = 0,0022). Neste momento, não se demonstrou associação com qualquer umdos SNPs de HapMap nesta região nos afro-americanos.

As variantes aqui descritas foram identificadas por meio deuma abordagem de clonagem posicionai, partindo de análises de ligação.Também seria possível usar associação ampla no genoma, empregando SNPscomuns, seja através de rs 1447295 ou um de seus equivalentes de LD. Oresultado poderia permanecer altamente significativo, mesmo se fossenecessário ajustar os testes de centenas de milhares de SNPs comuns. Emcontraste, se baseado apenas em SNPs contidos no comunicado 19 do projetoHapMap, as análises sugerem que um estudo de associação ampla no genomapoderia ter capturado seu sinal de associação em coortes afro-americanas ouafricanas. Isto se deve ao fato de que nenhum dos SNPs de HapMapexistentes é suficientemente correlacionado com o alelo -8 de DG8S737 empopulações de ancestralidade africana. Conseqüentemente, postula-se que, ouo alelo -8 confere por si só o risco ou alguma variante que é maisestreitamente correlacionada com o alelo -8 do que qualquer um dos SNPs deHapMap correntes. Se esta última hipótese for verdadeira, então o reduzidoLD em afro-americanos indica que a variante desconhecida localiza-se dentrode uma região de 60 kb contendo DG8S737. De igual importância é afreqüência de população relativamente alta do alelo -8 em afro-americanos,que confere um PAR estimado de 16,8%. Assim, as freqüências do alelo -8poderiam produzir uma incidência 14% maior de câncer da próstata em afro-americanos do que em europeus-americanos, e, com isto, contribuemparcialmente para a incidência incomumente alta de câncer da próstata emafro-americanos.

Deveria-se observar também que estas variantes de riscodescritas com relação a câncer da próstata também foram observadas emfreqüências maiores em outras formas de câncer (p. ex., câncer de mama,câncer do pulmão, melanoma). A Tabela 19 mostra que o alelo -8 deDG8S737 e alelo A de SG08S717 (rsl447295) aumenta o risco de câncer demama, câncer do pulmão e melanoma cutâneo maligno invasivos.Novamente, deveria-se observar que freqüências alélicas são mostradas emtodas as Tabelas, que são aproximadamente metade das freqüências deportadores.Tabela 19. Associação de alelos e haplótipos no cromossomo 8q24 commelanoma, câncer de mama e câncer do pulmão na Islândia.

<table>table see original document page 155</column></row><table>

Mostra-se os alelos para os marcadores DG8S737 e rsl447295 em 8q24.21 eos números correspondentes de casos e controles (N)5 freqüências alélicas devariantes em indivíduos afetados e de controle, o risco relativo (RR) e valoresP de um lado.

A Tabela 20 contém todos os marcadores de SNP conhecidos edescritos, de acordo com o banco de dados do NCBI (db SNP 125), nointervalo de blocos de LD (128.414 - 128.506).Tabela 20. Todos os SNPs no intervalor de blocos de LD com 92 Mb(128.414-128.506 Mb) de dbSNP 125 (um mapa da construção [Build] 125do dbSNP do NCBI)

<table>table see original document page 156</column></row><table>rs7830306 8 128427674 dbSNP-125rs7830412 8 128427630 cfcSNP-125rs7830530 8 128428007 dbSNP-125!«7830770 8 128428079 dbSNP~125rs?387447 8 128428265 dbSNP-125rs10112657 8 128428269 dbSNP-125rs10094871 8 128428550 dbSNÍM25fS1447293 8 128428909 dbSNP-125rs1447292 β 128429231 dbSNP-125rs4871796 8 128430114 dbSNP-125ís6651169 8 128431273 dbSNP-125rs921146 8 128431774 dbSNP-125ns3999772 8 128432143 dbSNP-125Π53999773 3 128432171 dbSNP-125rs3S99774 S 128432275 dbSNP-125rs7825118 8 128432406 dbSNP-125r$13250904 8 128433768 dbSNP-125re13251194 8 128433845 dbSNF-125rs2121630 8 128434749 dbSNP-125rs21666S9 3 128434804 dbSNP-125re4871797 8 128435349 dbSNP-125rs 10095293 8 128436099 dbSNP-125fs3956790 8 128436116 dbSNP-125rs399Ô775 8 128436126 dbSNP-125rs487179S 8 128436552 dbSNP-125rs12545929 8 128436814 dbSNP-125rsl0089310 8 128437573 dbSNP-125rs7819102 8 128437938 dbSNP-125rs4871?99 8 128439231 dbSNP-125rs487l8G0 8 128439304 dbSNP-125rs6981424 8 128439685 dbSNP-125rs7001513 8 128439754 dbSNP-125rs4871801 S 128440503 dbSNP-125rs8986285 8 128440524 dbSNP->125rs6986469 8 128440699 dbSNP-125rs6470518 8 128440770 dbSNP-125rS6470S19 8 128440812 dbSNP-125rs6470520 8 128440922 dbSNP-125$7816556 8 128440988 dbSNP-125rs1447295 8 128441627 dbSNP-125rs487l802 8 128442229 dbSNP-125rsS993Q74 8 128442270 dbSNP-125FS10109700 8 128442553 dbSNP-125rs9297758 6 128443177 dbSNP-125rs69S4861 8 128443731 dbSNP-125r$1061Q521 8 128443970 dbSNP-125fs13363309 8 128444111 dbSNP-12§rsS692964 8 128444780 dbSNP-125rs7387935 8 128444971 dbSNP-125rs7357547 8 128445291 dbSMP.126rs13259398 8 128445300 dbSNP-125rs13260378 8 12844533S dbSNP-125rs1597019 8 128445342 dbSNP-125rs7826042 8 128445690 dbSNP-125<table>table see original document page 158</column></row><table>rs7013S17 8 128459443 dbSNP-125IS6993832 8 128459872 dbSNP-125rs6S94142 8 128460075 dbSNF-125rs16902173 8 128460588 dbSNP-125re177662Í7 8 128461086 dbSNP-125rs16902175 8 128461247 dbSNP.125rs4871806 8 128461725 dbSNP-125rs781881? 8 128462254 dbSNP-125rs7010066 8 128462851 <Jfc>SNP-125rs16902176 a 128482924 dbSNP-125rs1562435 8 128463046 dbSNP-i25rs12155672 8 128463613 dbSNP-125rs12155128 8 128463780 dbSNP-125rs1562434 β 128463908 dbSNP-125rs1562433 8 128464039 dbSNP-125rs1562432 8 128464191 dbSNP-125is1562431 8 128464240 dbSNP-125rs12©56473 8 128464511 dí>SNP-125rs1374626 8 128464584 dbSMP-125rs1374625 8 128484650 dbSNP-125PSl2056788 8 128464661 dbSNP-125rst1365782 8 128464669 dbSNP-125rs4599773 8 128467013 d&SNP»125rs4078241 8 120467729 dbSNP-125rs1254§487 β 128467881 dbSNM2Srs446l869 8 128467959 dbSNP-125ÍS4078240 e 128468152 d.bSNP-125rs13269895 8 128468547 db$NP-125rs7Q13S5Q 8 128468613 dbSNP-125rs28609?91 8 128469167 dbSNP-125rs7813015 8 128469646 tibSNP-125rs6931321 8 128469894 dbSNP-125rs4871807 8 128469920 dbSNP-125rs58S4S86 8 128470115 dbSNP-125rs4871808 8 128470134 dbSNP-125rs 7817835 8 128470790 dbSNP-125rs4412338 8 128471606 dbSNP«125rs11408392 8 128472364 dbSNP-125rs11383128 8 128472372 dbSNP-125ÍS28475136 8 128472373 dbSNP-125rs7827428 8 128472636 dbSNP-125rs7632031 g 128473541 dbSNP-1251*10113577 8 128473620 dbSNP-125rs4242382 8 128474162 dbSNP-125rs4242383 8 128474349 dbSNP-125fs4314621 8 128474604 dbSNP-125rs4242384 8 128475143 dbSNP-125rs9297759 8 128475760 dbSNP-125rs7018386 8 128476546 dbSNP-125rs7812429 8 128476762 dbSNP-125rs7812894 8 128477068 dbSNP-125rs4871026 8 128477366 dbSNP-125re4871027 8 128478096 dbSNP-125rs10099413 8 128478652 dbSNP-125<table>table see original document page 159</column></row><table>rs12542685 8 128494172 dbSNP-125rs11987811 8 128494732 dbSNP-125re7814251 8 128494806 dbSNP-125rs11268643 8 128494062 dbSNP-125csfil8trao5 8 128495413 dbSNP-125rs9694G93 8 128495737 dbSNP-125rs7837688 8 128495949 dbSNP-125rs13256658 8 128496050 dbSNP-125rs7824118 8 128498937 dbSNP-125re10551941 8 128496952 dbSNP-125r$132Ê5998 8 128496973 dbSNP-125rs13266000 8 128496975 dbSNP-1251510107283 8 128496987 dbSNP-125rs 13268425 8 128498989 dbSNP-125rs13268712 8 128497079 dbSNP-125rs13288351 8 128497100 dbSNP-125r$12549761 8 128497365 dbSNP-125rs4871811 8 128497463 tíbSHP'125rs4242386 8 128497682 dbSNP-125rs7825823 8 128498506 dbSNP-125rs28489376 8 128499033 dbSNP-125rs7465074 8 128499382 dbSNP-125rs11308670 8 128499734 dbSNP-125rs11988556 8 128500924 dbSNP-125r$70Q7198 8 128601145 dbSNP-125rs6470529 8 128501401 dbSNP-125rs11323753 8 128501468 dbSNP-125(«11300434 8 128501591 dbSNP-125rs10106375 8 128501959 dbSNP-125(S690198O 8 128501972 dbSNP-12513454351O 8 128502208 dbSNP-125rs7846l78 8 128503193 dbSNP-125rs11786789 8 128503317 dbSNP-125re5894888 8 128503510 dbSNP-125rei 1368434 8 128503511 dbSNP-125rs 11988207 8 128503749 dbSNP-125:rs7003189 8 128504149 dbSNP-125S4871812 8 128504310 dbSNP-125rs78370Õ9 8 128504410 dtóNP-125rê4871813 8 128504531 dbSNP-125rei2386846 8 128505038 dbSNP-125HS13268742 8 128505267 dbSNP-125

Localização embp e de acordo com a constru-ído (BuiId) 34 do NCBI do browser UCSCA Tabela 21 contém todos os marcadores de microssatélitesidentificados e testados pela deCODE genetics no intervalo de blocos de LDno cromossomo 8 (128.414 - 128.506).

Tabela 21. Todos os marcadores de microssatélite no intervalo de blocosde LD (128.414 - 128.506) da trilha de marcadores de microssatélite daprópria Decode no browser da UCSC

<table>table see original document page 162</column></row><table><table>table see original document page 163</column></row><table>

Tabela 22. Um haplótipo protetor que consiste de marcadores/alelos:alelo T de rsl2542685 e alelo C de rsl2542685

<table>table see original document page 163</column></row><table>

Os ensinamentos de todas as publicações relevantes aquiindicadas são incorporados aqui integralmente por referência. Embora estainvenção tenha sido mostrada e descrita com referências a concretizaçõespreferidas da mesma, aqueles versados na arte compreenderão que é possívelrealizar várias alterações na mesma, em forma e detalhes, sem afastar-se doescopo da invenção compreendida pelas reivindicações anexas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> DEOODE GEMETICS EHF.

ftEÍCFNDRDOTTIft, LaufeyGÜDMUNDSSOK, JuliusSOLEM, Patxick

<120> VARIANTES NO CHR8Q2421 CONFEREM RISCO DE CÂNCER

<130> 2066-PC

<150> OS €0/682,147<151> 2005-05-18

<150> OS 60/795,768<lbl> 2006-04-28

<160> 3-8 D

<170> PatentIn versão 3.3

<3l0> X

<211> 92001

<212> Dm

<213> Hcmo sapiens

<400> 1 ictttgacaa ataaattagc ataectagas ggaegccaga tgctattcca ttaagacaafe 60çgaagaâtgis Cgccaaagtc atttcaaaga tcttggaagc cgcoactctc staacaggct 120cagagtgcca gggccctgaa ggcagaacaa tttcafcaggt ggtâccttga ggettcatea 180cccaggactg cctcaggctt ctgctccact cattctggec caacactctt tgtctottgc 230agcfcgtagat cctcaagtge aeecaçgtgt ggttcaaagt gctagtccgg agagcatgag 30 Dgtaaaccetg gcsgoatcca tgtggtgcta actgagcaaa tgctcagagt gogtgaccta 360agoaggcatg gctacçtccfc cetcgattta asaggatget tatgagagcc ttggggcgia 420ggcagagaac tgtcacagfcg gcagggctac cacagatagc çccfeactagg gcaatgctta 480Stgggggcag ggccactcct gagacececc agectgtgca gccaccagea tigoaatgcce 540gcctgcaaga ataaeaggta tgtgsctcca acetgtgaaa gçtgeagcafc aagccgcgec 600tagçaaagcc acggggafcga ggcfegcccsg agtcttgtgg ggaceaaccc atataoeagt 660gfcgfccaagta gtcaggaafcg gagtcaaata aasttatttt cagtceteca tatttgagtg 720tfcafcttgccfc tgttgggttt cgastgggag tgagacctat t&çtcctttc fctefcfctccfea 780tttttttccc ctttggaatg ggaatatcea tcctatgect gtcceaceaé tgcatttgaa 840gcacataata aaatgtattc attctatcec aafcaattcca aaaatcttaa ttsatecaac $00atcaacttta acttataaat ctagagtatc atctaagtet c?atctaaatc agatatgggg $60gaattcttçt cçagesgtcí gcaeaatctg aeaagatata gatatctate tgtccasata 1020cgtaacfcata actâtctgtt gaattc&ttc fcctaaccact tcfcafccaegt cactgtgcta 1080

aaacttctta cttaatgctc attagtgtta cacacacaca cacaaagaca cacacscaca 1140

aagacacaca caettçfctgc tagattttác tctctfcggtg gafcfcttacfcc tcttgctgcfc 1200

agataagggg tacctaatgc aagatgtacc tatettagag tttgcacatc atctgcatta 1260

ttgaacgtaa agtaaaagcc aaatgaggga aaagagaegt tgactgtttc atgatcatfcg 1320

tcttacctgs aacaattagg aagtcaccgt tcagctttgç aggctafcgfca attgtcatat 1380

Atcatgaatg getgataagg ggttgsatct gtgaggtttt cceatagagg aaagggaaat 1440

aetgatfcctc acbttagcca acagcagfctg tctctaacfcc acceaaaefcg ctgagaagaá 1500

nttaagaact attttactgt gctctttttc ttatttafctfc attiagagac agagfccawt ISSO

tctgtcaccc aggctggagt gcagtggcga tctcgeetca ctgcaaccte fcgcctcc"tgg 1620

gttcaggfcga ttctccfcgtc tcagcctcce taatagctgg gattacaagc atgeaceacc 1680

atgcccagct aatttttgta tttttagaag atatgaggtt ttgtcatgtc ggccsggctg 1740

ctctcaaact cetggtotcg fcgâtcçacefc tcctcagcct cccaaagtgc fcgg&atcaca 1800

ggcãtgagee accgeaecca geetstaaga gctattttat ttccaatgca geatggaecc 1860

tcaacaccst catggatgag ttccagattc ataagacttfc aggcctacag cggacatcag 1920

acacaatcta actçagctcc fctcactgtag açatgtggga ssggsggççe aagataggaa 1S80

agagacttge ccaaggccac acafcctggtt aatggagaãe aagagaeaat acteatttct Z04Q

eccaaceaec atgccagtgg gagttccagg tccaccctge ctgagagctt catgaccacc 2100

tccaagatgg cccaacgetg cccttcaaaa ggggtcagta ccfcgggcaat ctgatggtga 2160

attcattágá ggtgeaataa atgcttataa aagggaaaat ggagacttgt aattctacct 2220

>■ cttgattcta agaaatcctt tcattgggtc iagagtgttc ataaatcfcct ataattfcgaa 2280

aattgaacag eaeagttttc tafcga^caag tgcaaaaaeg gggtcagaag tcaggaaaat 2340

tgtaaagatg ggatgtgaca ttgçtgcttc cccaatcttt acctaeaaaa cctctecfctg 2400

ctctcttcca ttctatcaaa tectagtetc agactattcã tttacactaa gatgtaaatg 2460

actgacagca aagtggccac tttcaggggc atttggagac aaagggatga cattgcgatt 2520

attgacctat cacactgggg atatcagagc cagagagaag acgtggagtc tgaaaagaaa 2580

agctgttccc aeasca&aga attatccagc cctaaatatc catagtçcag aggttgagat 2SlQ

atcctgctcfc gggtt&eaga aagttgcata aattccfcagc atgaatcatc açgtgggcac 2700

cttgagagca atctgceste tccacaactt tgtacctfccg cctttttttc caaaaagaaa 2760

gggtctaacc aaaccatgct tatgaccage cfccagcctee catcaactgg caccattggc 2820

atcctggccc ttgtgtgtct gcacagtgco tgctacaeae fettcattaag taaetctcaa 2880ccttachata attcagggaa aggagacagt attgttattc ataccccaca tacaaaga2a 2940caaagaagga ggcaatttac caggttttca cagggaggaa gaggaagggt caga«:ttcca $000atciagactg atcctagctc cagaaectáá actatcacac tatcacactt cagacaggag 3060tgcagattat caaacactaa ctattttaag aaatgttaeg gggeggagca agagcacagg 3120tgccatccãg tgctgtttgt ggagaggagg tattcggagg ccacaacgta gggcaaggcá 3180tttcttcctô ggctgggtat gátaggtaga ataatggctc ccccaaagat gtcoacatct 3240taacccctgt aacctgtgac tattacctta caccatgaaa gtgactttgc agatgtgatt 3300çaafctaagtg cectgagttg çggagatttt cctggaagaa tcaggagggc tgcatggaat 3360cacaagggcc cttataagagf ggaggcagga gagteagagt cagaggaggt gtgaggatgg 3420áagcagaafcfc tgt&ggggba tgggcgagaa gccaaggaat gcagatgacc tctagaagcc 3490ggagaagcaa aatggattct ctcccagagt ctcacaagga gtgcagtcct gtgaacacct 354Gtgatctfeagc ceagtgaagc tgatttccag cttcagacct ccaggacttt aatgafcaata 3600aatttgtgtt gttttcagcO accaagtçjtg caataatttg ttatggaaat cacaggaagc. 3S60taatatatga ggattgctac ataaagtata gaatiacacag tccâaettga acttCagata 3720s&catcaaat aatttfcctag tatgagcafeg otccatgcaa tattcatgtg tcctgtattt 37BOtcatttgcta aaactggtag ccctaaccgg cttccecctc ocactcagcc cctgcatccc 380caaagccctt teceaggtct gctctgtteac agtggtatca ttatacctgc tattctgggg 3900ttagtctatg actcaaccga gtgaaactgt taaggcctca gataaafcagc tcfcgagggaa 3360agttattatfc ctatatcatt gcctatcaat tatttatagt ttataatgca atgccatttg 4020t&atgggtaa tSitgtttttC tattgtgttg taãtatcatc caacte&tca gaacaaccat 4080tggggagatg gattggcttg atgtaaatag cagtgcctag taacaagctg tgtgeatttt 4140taaacctgga aatcactgct ctttcagata agaggaaact cttctttgaa ttcaaacaga 4200agggtccaag ccáccttttc tgacaagttg atttcctgag aageagggca ggaactaggg 4260caaggcaaat gtgttcaggg tacaaaatgt aaggaggcfce tccatttcag gtgccgaccc 4320fcçjcacttgca gaacgtgaaa atgagtgctg etttaaatct tgcacectgg gagactcaet 43BOtgcttcactc tagfcatcgac tctgçtaaga aaactcacat gaagccatCá acaaacgcca 4440aagctaacct agcctcttta catggcttat gggaaactga ggoccaaaaa aatgtggacc 4S0Qagccaagatt c^atttgctt agtgactagt ggacctaatg gttgctactg cagcatcagc 4SSOtgcttectgcc aacacctacc tactgagttt cagccagagg cttgaggtte gcactgcect 4S20cccagcectg ggacaaggec ctgtctcaac tggaítaage eaatcagtat aacttegtat 4fi60ccotgatccc agtgattgaa cacttsactc agfccefcaage cagtaaaiag gttgtatgtc 4740

cctggccaca gttgtfcagcb ccaggatata catgtgggge agggtgaagc teatgaettt 4800

gattcaegga gagagaaaat gattcctcfct tedfctfeggag ggtçtggaat acaaatagaa 3 B 60

agtctggaac fcgcfcgcaacc atttattacc atgagaaaag ccagaatggg aafcgaaagca 4SEO

atcafcafcata gaagggaaaa çgtgagagaa teafcaaaggg aaaccegatfc ettcaccgac 4980

fcçcçatçtsa aggacccact acctctggac tattctgfcta featgcaccãã taaattcaga 5040

tt&stattta atccagtttg agttaaaata ttctgttact fcgtacaaaag aggttectaa 5100

ctggacaatg accttagaaa agccaagtfcc tacagctaCâ fctgccccata gaactttefcg 5160

cattgatgcá actgttctat atctgtgctg ttcgatacag taagccacta cctgcgtgtg 5220

gçtattgaac atttgaaatg tggctaatgt gaçtgagaaa tggactfctta aaÊtttgtfca, 5280

atactaatte ctttcaattt êaaeagecac acagaccsgt ggttaec&ta ttggtccatg 5340

eagcccfcaca agcttctttt ccttcatttc atttgttgcc tcctcçagaa accagctcca 5400

gatcctttct ttCçtçç^gs gfetggfctagg ctgatctitt ctgfegatcct atagcaactg 5460

agcattccte taaaattgtg attgcctctc ttagaat&at atcttttacc gtgtgtatct 5520

cccaectfctg gtcgaggttt taaaaçgcaa ggcecattco tgtgtecaag cactgagcag 5580

aageattgcc afcggtgactt ttgaattgga tgagataatc tgtggcccaa atgtgtacca 56«0

gatgttgaaa ggctttgtag cttttaagaa tgfcaagacaa "tataaaaafcg ttfegctatca 5700

ttattagtca ctgttactat ttctgattgfc taacctfegat ccacttctca atifcfcctaea 5760

ggagtctcag tcactgccct cgaatgacta gaaatttgoc cagccttgtg acafcctgtga 5820

ccatcagtgt caggctcact ggcttcttac cccfcctgctg ccttgacttt ctfctfctefctt 5800

tcfcttctt-tt tttttttttt ccttgagacg gaatctegct ctgtcaecag gctggagtgc 5940

ãgtggçgtga tcfctggctca ctgcaa.ct.tc cgactcccct gttccctgct ttaagcaatt 6000

ctcctgactc agcctcctça gtagctggga ctaeaggcac acaccaceac goçcagetaa 6060

tttttgtatt tttaataggc acagagtttc accatgatgg ccaggatggt cttgatctce 6120

tgaccfccgtg atccgcccac cgcggccttc caaaactgcc tügactttet agetcaaatg 61Ô0

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tagagaaaga gacaaagcag gaaagagaaa agagaaagge atatatatat ttttttcttc 60attctggggg cccaccctga aactactgaa tcacagtctc tagaggttct eaggcaacía 120gcççagctgt ttttgccôac tggaatttat gagccaccgc aagagaccac atgcagçttc 180atgtaaaaca aattattttt aagcacgcag actgagcagt gatafcgagga gtgcacagga 240gtgcctacgc ctactcetgg tctccatgag tcteetttgc aaagteaagt attacaagat 3ÓÕtctagaacac atattgcctg CCactgataa tttagttgtt cagcaaacat tcatttgttg 360 agttgcacgc cagaeactat actagatgat gggacaacta aagggteatg aacagttctg 420tctCtatgta aaaataataa tgatgatgat gatgagatgg gacttcaatt gaggaagtgc 460cattggggag gtatgfcaaaa acgtgctatg gaaaaaaagc aacaggaacc ccttgataga 540aaaaaaaatg Ctggtggggg tagggatttc tgcctgtgtt cttcagaatg gggtatggga 600aaatctggga ggaaaagaaa tttaàgtaag agcagagact ttgcaaaatt tgttgtgttg 660actttteGtc atgctgcttc ccctggcatg ggaagtcatt agctggataa gagagacttc 720acaagaactg caatgaatca agatgtgctg gttttgtttt gacacatgga attcttaggg 780afcttgatgtt tttfcttccca gtcttctcca tcaaagttgt tttcaaccag tcctgattgg 840accgattgac tcateetcag atatcatagt tttoccacta caaaagcatg gaactgatgc 300caataaacco acfcccttatt cccagagggc fcagggfegagfe ccttgcagag gggaattgct 9SOagggatggca cctggcagaa atagaccstc tgtctttcct cç 1002<21 o> 21 <211> 1002 <212> DHft <213> Hemo saplens <400> 21 tggttttctt tcttcttatg ttttgcttgt tteattttgc attttccaaa atgatgatat 60tggagabaae aaactgttag gtccttgtta ttctgtgcat atatgatttt gtcctaagac 120aagatgaaat i: aafccátâtct cattttacta tceagttatt tggggtefcca tcttaactag 180cagttaggat tageatgtts etcaagctca caaagacata gctgggatga caacatgttc 240tttgttcaga gtatttgeca eattgaggac tcctggcaaa aatâaataac ttataaçaaa 300ggtaacttat Êttgacttta aaataatcga tgactaaaac fccatttttcc tcagaccatg 360agagcaattt accaagcttt attaatgggc afcctteatat ccttagcaag cttaattgct 420aattaattaa aagatgattg gataaacaat ggattgtact acaaaatgaa gatagcaaaa 480tttactgtca tggtgtctáa çtgagcafctc tttacctatt gccctaccaa tctttcagct 540ccataatttc tgaagtaaag atccccaaga gocatttçct gaaaattaga gttaaatcag 600atcaacgtta aaggaettct gggtcaaact atgttgaggg ceagccae&g gcaatcafcaa 660tttaattaaa gcaagagaga gaaaaaaaat catgccaagt gaaacagcct ggaagagtga 720caaaagectt tgtcttaaaa tcagaetacc tatgctctaa aeatttacta Ctgfeggaaac 780tagcgaaaga teatctaatt tttctgagct fccattttfcct catctataaa atggatatga 840

tcagttcagc tgcaagtaaa agaagcecaa aagteacaga ggactaagcâ agacaggagt SOO

ttatttttcfc aacttgcaaá agatecaaag gtagacagtc aâgaactcec agcagctctg 960

ctceacggaa atttcagagc ctaggfctect tctetgttgt tt 1002

<210> 22

<211> 1002

<2X2> DHA

<213> Homo sapiens

<400> 22

taaaggacag gcattggggt tgctttgttg aacaaatcta gcagatattt gaatgagaag 60

egfcaatatag tcagtagaaa aaaagtgcaa gaaataagta gagaaagaag ggatattttc 120

tgctgaagca tgtattctct ggcacããgce cacaataaat tgaaattgac accaacagtt 180

ggcteaaaaa taatoaacta caaatatgcfc eaacaeataa gcattctctt gg&eagaacc 240

aoaaagcatg grtctgcattg fctccfcaacaa ctertttagaa gtcaccagafc gcagtttaag 300

Otacaataac atagtgaggt acaagttaat taeatagtta ccagaaagtc aeagactttt 360

ttttcagtaa taatgtsçta aataaataca fegctcactce atgggaaatg gtggcaatta 420

ttaagagcac acattcacac catcatattg çttactgata actgtgcagt taaccaatgg 480

cagtgtgcta aaatggatat çttgfcgtttc ectgagtttfc gcatgctaca tgcg^tgcat S40

gtgaaaacca agcataggga atfefccaagta fcgaacttcag cgtgtgágtg ttgtttotgg 600

tccaatctcc gtccccsâac etccccagaa taaggcttct gctttttaac aatgtafcatc 660

tatttfca&cc aattgtctag cgtataatta atgctctata aaetetttgt taaatgeatt 720

cacagaaggt aacaaaagat ttttgtgaca cgagtaaaec aaaaggaaca aataaacttg 780

aattacttta tgtfctgtgtt ggtgtttcag aaaagagctfc tggctttgaa ttcagaagtt 840

cctaatctga ataccaggtc taccaattat taatfcaagga atatcaaatg aattacttge 900

agtatttgaa tttcagatfct cfcc&attata acaaggatgt aasgaggttt attatgtggc 960

tcaaataaga aaatgcatgt aaaaacactt gtaaaccaaa ca 1002

<210> 23<21i> 26<212> DKA<213> Ho»© sapiens

<400? 23

çaagtttagc tgtgatgtac aggttt 26

<Z10> 24<211> 20<212> DMA

<213> Hojiio sapieas

<i00> 2

ttccagaacc aaagccaaat

<210> 25

<221> 23

<212> DNA

<2i3> Hcaro sapiens

<400> 25

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<2105» 26

<211> 23

<212> DHA

<213> Homo sapleus

<40Q> 26

ttaagatgct tgaagteccç agt

<210> 27

<2ll> 23

<212> DHA

<213> Hoao Sapiens

<400> 21

aactgcctefc çacaaotctt gtg

<210> 28

<211> 23

<212> Dm

<213> Hcxao sapiens

<400> 28

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<210>

<211> 23

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<213> Homo sapiens

<40Q> 29

ggagagccta fcttgtggtca aga

<210> 30

<2ll> 23

<212> DNA

<213> Ηοϊϊιο sapiens

<400> 30

aagtggattg cagaagtctç tgg<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

ctaattgaga aggctggcta tgg 23

<210> 32

<211> 22

<212> DHA

<213> Homo sapiens

<400> 32

gtaggatcag accatccaat gc 22

<210> 33

<211> 23

<212> DHA

<213> Homo sapiens

<400> 33

cagggatttt gtctgttttg ttg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

tttattcgga tgctcagaag ctg 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> · 35

gcaggaagcc actgctgctc ctta 24

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

gcagtgccag cacctgttag cattaaa 27

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

tgcacaagcc tgatttaaaa gtg

23<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

ccagtttttg gttttggttg ttt

<210> 39

<211> 24

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

ccagacatgt tactgatgtt ttgg

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

ccagagtggt agcaatgttc tgt

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

ggaatgcttc cttgtatgtg gag

<210> .42

<211> *23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

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<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 43

gcacaagcct gatttaaaag tgc

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 44

cagggetttt gtctgttttg ttg

<210> 45

<211> 23

<212> OKfl

<213> Bojso sapíens

<400> 45

gcacaagcct gattfcaaaag tgc

<2Í0> 46

<211> 25

<212> DNA

<213> Hoaiso sapiens

<400> 46

ctfcctgtcct cagcggaaaç agctt

<210> 47

<2ll> 23

<2I2> DifA

<213> Bomo sapiens

<400> 47

tctgtttctt tgacctgggt tgt

<210> 49<211> 23

<2Í2> om

<È13> Homo sapiens<40q> 4S

eaçggatttt gtctgttttg ttg

<210> 49

<ZÍ1> 23

<212> Dm

<2l3> Homo sapiens

<400> 49

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<2 U> 25

<212 > DNA

<213> Hemo sapiens

<400> SO

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<210> 52

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<213> HtHiio sapiens

<400> 52

cagggatttt gtctgttttg ttg

<21ΰ> 53

<2Χ1> 23

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<213> Homo sapiens

<400> 53

ggagggaaac tgactggaaa gat

<210> 54

<211> 25

<212> DNA

<2Ι3> ΒΟΪΒΦ Sipiena

<400> 54

cttctgtcct cagcggaaac agctt

<210> 55

<2Χ1> 23

<212> DWA

<213> Botuo sapiens

<4 00> 55

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<210> 56

<211> 23

<212> DHA

<213> Korno sapiens

<4 OO 56

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<210> 57

<211> 23

<212> DNA

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<400> 57

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<210> SS<211> 23

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<400> 58

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<213> Homo sapiens<400> 60

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<21Q> 61

<211> 24

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<213> Somo sapiens

<«00> 61

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<210> 62

<211> 27

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<«00> 62

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<2lC> 63

<211> 25

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<213> Hcano sapiens

<4D0> 63

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<21ô> 64

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 64

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<211> 23

<212> DNA

<213> Ηοπιο sapiens

<400> 65

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<210> 66

<211> 25

<212 > Dm

<213> Hoiqq eapiens

<210 > 67

<211> 24

<212> DfcA

<213> Homo sapiens

<400? 67

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<2l0> S8

<211> 25

<212> DSA

<213> Hamo sapiens

<21G> 69

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<212> DSA

<213> Honto sapiens

<400> 69

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<210> 70<211>

<212> DNA

<213> Uoroo sapiens

<400> 66

gatagggccg ctaccatttg gaaag

25

<4Q0> 68

ctggagtgcc tetetteatt tttgc

25

<400> 70

tgattgcfcgfc agccctggca tett

24

<2Í0> 71<211> 25<212> DNA

<213> Kcafto sapieas

<400> 71ttgcttttaa gcatgaagcc actca 25

<210> 72

<?Λ1> 24

<21Ζ> DNA

<213> Homo sapiens

<4OO> 72

ggcatggacc aggagcacta gtta 24

<210> 73

<213> 24

<212> DNa

<2Χ3> Homo sapiens

<4 00> 73

aacacaacca gtgtfcgcggfc tgac 24

<210> 74

<211> 26

<212> DHA

<213> Hosno Bapiéns

<4Q0> 74

tgaaacaaca gtaagcaetg gctctc 26

<210> 75<211> 21<2i2> mh

<213> Hoxno sapiens<40Q> 75

gatgcggggc attetggtgt a 21

<21Ü> 76

<2U> 25

<212> DUA

<2l3> Horap sapiens

<4Ü0> 76

actcaattgt tgccatgggc ttgat 25

<21G> 77<211> 657

<212> om

<213> Homo sapiens<400> 77

ttgctcctca ggaaccctst tttggactga cgtfcfcaafcae aacatggaag ccaccaaggc 60

ttacagaatg tgctttccag agctgtgacc tgaactgtac ctggggcctt ttgagtgagg 120

ctggaaçtgg agtggcctgg atgcágâgag cagtgtccta aggctgtgca ggttgcaaga 180

aagctcaagt agcctatgga gaggatgcaâ ggettccagc tgatgccetc agccaggctc 240agtagcagcc agaactagcc taccaacgaa cctgctgatc atgtgcataa gccaccttga 300

acgtcgatCc tcctgcctgg tggagccatc ccagctgatg ccacatgaag cagacacaag 360

ctgtccctac taagctctgc tcaagttgga tattcatgag tgeaataaat gactgttact 420

aagtaafctaa ttttfcgggtg gctgtfcatgt agcagtagat aattggaaca aagcttattg 430

acataataca tctatateme afccctCCaat coattttttt aagtaataaa gtigatgttt 540

gttttçaaaa. aaaasaaaaa aaaaa&aaag acctgcccgg ^cggccgctc gageectata €00

gtgagtaagg gcgaatccag cacactggcg ccgtaetagt gatccgâgct cgtagca 657

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4Õ0> 78

ceacttgggt ggtatcaggt 20

a

<210> 79

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<213> Homo sapiens

<400> 79

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<21Õ> 80

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<400> 80

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<213> Homo sapiens

<4O0> 81

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<400> 83

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tgcagaetgfc gcagcagata 20

<210> 85

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<2Í3> Eoroo sapiens

<400> 85

çfcgcfeagaga tgtgtgccct a, · 21

<21Q> 66

<2ll> 20

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<213> Homo sapíeTis

<400> 86

atgggtcttg aiggacatgc 20

<210> 87

<2U> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 87

gtggatggat ccagagagga 20

<210> 68

<211> 20

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<213> Homo sapiens

<4 0Ü> 83

caçagcatca cctcaaacga 20

<210> 89

<211> 20

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<213> Homo sapiens

<400> 89

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20<210> 90

<211> 20

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<213> Hqiho sápiens

<400> 90

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<2iÓ> 91

<211> 20

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<213> Hamo eapiens

<400> 91

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<2U> 20

<212> DSA

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<400> 92

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<210> 93

<211> 20

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<213> Hcffivo sapiens

<400> 93

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<210> 94

<211> 20

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<213> Βολο sapiena

<400> 94

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<211> 20

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<213> Horno sapiens

<40ϋ> 35

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<21 Q> 36

<211> 20

<212> Im

<213> Homo sapiens<40Ο> 96

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<210> 97

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<400> 97

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<210> 98

<211> 20

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<400> 98

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<210> 99

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 99-

getccacaca cagaggtcaa

<210> 100

<211> 21

<212> DKA

<2l3> Horno sapiens

<400> 100

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<210> 101

<211> 23

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 101

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<210> 102

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<213> Homo sapiens

<400> 102

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<4D0> 103

tgagçaagag ccacaacaga 20

<21Q> 104

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<213> Hobsô sapiens

<400> 104

cagagagaca gsastggtct ca 22

<210> 105

<211> 20

<212> DNA

<213> Boíbó sapiêiis

<400?· 105

ttettaacac gcagcâcafct 20

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<2il> 21

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<400> 106

gccetatttc ctaacacatg c 21

<210> 107

<211> 22

<212> DMA

<213> Korno sapiens

<400> 10?

gctaacatgc fcaafcgtgctfc cc 22

<210> 108

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<212> DKA

<213> Bomo sapiens

<4ôo> ίοe

aaacaatcaa aggcccagg 19

<210> 105

<211> 20

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<213> Bomo sapiens

<S00> 109

cccattggaa acagagttga 20

<210> 110<211> 20<212> DNA

<213> Horoo sapiens<400> 110

caaggagggfc ggatcacttg

<210> 111

C211> 20

<212> DWA

<213> Honso sapiens

<400> 111

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<210> 112

<211> 22

<212> Bm

<213> Horoo saplens

<40D> 112

ccctaaatgc agatgçttat ga

<21õ> 113

<211> 21

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<400> 113

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<210> 114

<211> 21

<2X2> DNa

<213> HomQ sapiens

<400> 114

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<210> 115

<211> 20

<212> DNA

<213> Hcano sapiens

<40Q> US

acfcgcttcca gccagacatt

<210> 116

<211> 20

<212> DNA

<213> Hohk> sapiens

<400> 116

ctgcactecc aagacagaca<210> 117

<211> 20

<212> PNA

<213> Homo sapiens

<400> 117

gtfcgaagcag gctttctgga

<210> 1X8

<211> 20

<212> DtIA

<213> Homo sapiens

<400> 118

cagcaaccgt ttcctttcat

<21Q> 11?

<211> 20

<212> DHft

<213> Homo sapiens

<40Q> 119

tttgsggfctg gtgtcacfcgg

<210> 120

<213> 20

<212> DKA

<213> Hcmo sapiens

<400> 120

acatttcccg tatcgfccçaa

<210> 121

<211> 18

<212> DNA

<213> Jlamo sapiens

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<212> DNA

<213> Bomo sapiens

<400> IBO

ggcagaagaa tcgcttgaac

Claims (84)

1. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a um câncerem um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender detectar ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, em que a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma susceptibilidade a câncer.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o marcador ou haplótipo é um marcador selecionado dentre ogrupo consistindo de marcadores na Tabela 13.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o marcador é o alelo A de rsl447295 ou o alelo-8 de DG8S737.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o marcador ou haplótipo em risco é um haplótipo em riscocompreendendo um haplótipo selecionado dentre o grupo consistindo de:haplótipo 1 e haplótipo la.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o marcador ou haplótipo é um haplótipo que compreende um oumais marcadores selecionados dentre o grupo consistindo de marcadores naTabela 13.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que o haplótipo compreende o alelo A de rs 1447295 ou o alelo-8 deDG8S737.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncer depróstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que o câncer é câncer de próstata, e o marcador ou haplótipo tem umrisco relativo de pelo menos 1,5.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata agressivo, comodefinido por um escore de Gleason combinado de 7 (4+3)-10.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata menosagressivo, como definido por um escore de Gleason combinado de 2-7(3+4).

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umcâncer de próstata mais agressivo e/ou de um prognóstico pior.

12. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer de mama, e o marcador ou haplótipo temum risco relativo de pelo menos 1,3.

13. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer de pulmão e o marcador ou haplótipo temum risco relativo de pelo menos 1,3.

14. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o câncer é melanoma, e o marcador ou haplótipo tem umrisco relativo de pelo menos 1,5.

15. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o melanoma é um melanoma cutâneo maligno.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de uma taxade resposta diferente do indivíduo a uma modalidade de tratamento particular.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umapredisposição a um rearranjo somático de Chr8q24.21 em um tumor ou seuprecursor.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o rearranjo somático é selecionado dentre o grupoconsistindo de uma amplificação, uma translocação, uma inserção e umadeleção.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende um ou mais marcadoresassociados com Chr8q24.21 em um desequilíbrio de ligação forte, comodefinido por (ID' I >0,8) e/ou r2 > 0,2, com um ou mais marcadoresselecionados dentre o grupo consistindo dos marcadores na Tabela 13.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que um ou mais marcadores compreendem o alelo A ders 1447295 ou alelo-8 de DG8S737.

21. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer, caracterizado pelo fato de compreender detectar um marcador ouhaplótipo associado com Chr8q24.21, em que a presença do marcador ouhaplótipo é indicativa de uma susceptibilidade a câncer.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncerde próstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

23. Método para predizer um risco aumentado de câncer depróstata agressivo em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar um marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, em que apresença do marcador ou haplótipo é indicativa de um risco aumentado decâncer de próstata agressivo.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende o alelo A de rs 1447295ou o alelo-8 de DG8S737.

25. Kit para ensaiar uma amostra de um indivíduo paradetectar uma susceptibilidade a um câncer, caracterizado pelo fato de que okit compreende um ou mais reagentes para detectar um marcador ou haplótipoassociado com LD Bloco A.

26. Kit de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncer depróstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

27. Kit de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que um ou mais reagentes compreende pelo menos uma seqüência denucleotídeos contígua que é completamente complementar a uma regiãocompreendendo pelo menos um dos marcadores selecionados dentre o grupoconsistindo de marcadores na Tabela 13.

28. Kit de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que um ou mais reagentes compreende pelo menos uma seqüência denucleotídeos contígua que é completamente complementar a uma regiãocompreendendo o alelo A de rsl447295 ou o alelo-8 de DG8S737.

29. Método para diagnosticar um risco aumentado de câncerem um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender triar para ummarcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, em que o marcador ouhaplótipo está mais freqüentemente presente em um indivíduo tendo o câncerdo que em um indivíduo não tendo o câncer, e em que a presença do marcadorou haplótipo aumenta o risco do indivíduo de ter câncer.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncerde próstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

31. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender:i) obter uma amostra de ácido nucleico do indivíduo, eii) analisar a amostra de ácido nucleico pela presença ouausência de pelo menos um marcador ou haplótipo associado com LD BlocoA, em que a presença do marcador ou haplótipo é indicativa de umasusceptibilidade ao câncer.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende um ou mais alelosselecionados dentre o grupo consistindo dos marcadores na Tabela 13.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende o alelo-8 de DG8S737ou o alelo A de rs 1447295.

34. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncerde próstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

35. Método para diagnosticar um câncer associado comChr8q24.21 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar a presença de um marcador ou haplótipo associado Chr8q24.21, emque a presença do marcador ou haplótipo é indicativa do câncer associadocom Chr8q24.21.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende um ou mais marcadoresselecionados dentre o grupo consistindo de marcadores na Tabela 13.

37. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende o alelo-8 de DG8S737ou o alelo A de rs 1447295.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o câncer associado com Chr8q24.21 é selecionado dentre ogrupo consistindo de: câncer de próstata associado com Chr8q24.21, câncerde mama associado com Chr8q24.21, câncer de pulmão associado comChr8q24.21, e melanoma associado com Chr8q24.21.

39. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar o marcador DG8S737, em que a presença de um alelo-8 emDG8S737 é indicativa de uma susceptibilidade a câncer de próstata.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata agressivo, comodefinido por um escore de Gleason combinado de 7 (4+3)-10.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata menosagressivo, como definido por um escore de Gleason combinado de 2-7 (3+4).

42. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a presença do alelo-8 em DG8S737 é indicativa de um câncerde próstata mais agressivo e/ou um prognóstico pior.

43. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que a presença do alelo-8 em DG8S737 é indicativa de uma taxade resposta diferente do indivíduo a uma modalidade de tratamento particular.

44. Método para diagnosticar um risco aumentado de câncerde próstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender detectarmarcador DG8S737, em que a presença de um alelo-8 em DG8S737 éindicativa de um risco aumentado de câncer de próstata.

45. Método para predizer um risco aumentado de câncer depróstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender detectarmarcador DG8S737, em que a presença de um alelo-8 em DG8S737 éindicativa de um risco aumentado de câncer de próstata agressivo.

46. Método para predizer um risco aumentado de câncer depróstata agressivo em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar marcador DG8S737, em que a presença de um alelo-8 em DG8S737é indicativa de um risco aumentado de câncer de próstata agressivo.

47. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata em um humano tendo ascendência que inclui ascendênciasafricanas, caracterizado pelo fato de compreender detectar marcadorDG8S737, em que a presença de um alelo-8 em DG8S737 é indicativa de umasusceptibilidade a câncer de próstata.

48. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar marcador rsl447295, em que a presença de um alelo A em rs 1447295é indicativa de uma susceptibilidade a câncer de próstata.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata agressivo, comodefinido por um escore de Gleason combinado de 7 (4+3) -10.

50. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstata menosagressivo, como definido por um escore de Gleason combinado de 2-7(3+4).

51. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a presença do alelo A em rs 1447295 é indicativa de umcâncer de próstata mais agressivo e/ou um prognóstico pior.

52. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a presença do alelo A em rs 1447295 é indicativa de uma taxade resposta diferente do indivíduo a uma modalidade de tratamento particular.

53. Método para diagnosticar um risco aumentado de câncerde próstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de detectar marcadorrsl447295, em que a presença de um alelo A em rsl447295 é indicativa deum risco aumentado de câncer de próstata.

54. Método para predizer um risco aumentado de câncer depróstata em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender detectarmarcador rs 1447295, em que a presença de um alelo A em rs 1447295 éindicativa de um risco aumentado de câncer de próstata agressivo.

55. Método para predizer um risco aumentado de câncer depróstata agressivo em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreenderdetectar marcador rs 1447295, em que a presença de um alelo A em rs 1447295é indicativa de um risco aumentado de câncer de próstata agressivo.

56. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata diminuída em um indivíduo, caracterizado pelo fato decompreender detectar o haplótipo mostrado na Tabela 22, em que a presençado haplótipo é indicativa de uma susceptibilidade diminuída a câncer depróstata.

57. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata diminuída em um indivíduo, caracterizado pelo fato decompreender detectar um marcador mostrado na Tabela 13 tendo um riscorelativo de menos que um, em que a presença do marcador é indicativa deuma susceptibilidade diminuída a câncer de próstata.

58. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer de próstata aumentada em um indivíduo, caracterizado pelo fato decompreender detectar um marcador mostrado na Tabela 13 tendo um riscorelativo de mais do que um, em que a presença do marcador é indicativa deuma susceptibilidade a um câncer de próstata aumentada.

59. Método para diagnosticar uma susceptibilidade a umcâncer em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreender analisar umaamostra de ácido nucleico obtida do indivíduo para a presença de pelo menosum marcador ou haplótipo associado com LD Bloco A, em que a presença domarcador ou haplótipo é indicativa de uma susceptibilidade aumentada aocâncer.

60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende um ou mais marcadoresselecionados dentre o grupo consistindo de marcadores na Tabela 13 tendoum risco relativo de mais do que um.

61. Método de acordo com a reivindicação 60, caracterizadopelo fato de que o marcador ou haplótipo compreende o alelo-8 de DG8S737ou o alelo A de rs 1447295.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 59-61, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado dentre o grupoconsistindo de câncer de próstata, câncer de mama, câncer de pulmão emelanoma.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer de próstata, e o marcador ou haplótipo temum risco relativo de pelo menos 1,5.

64. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63,caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstataagressivo, como definido por um escore de Gleason combinado de 7 (4+3)-10.

65. Método de acordo com a reivindicação 62 ou 63,caracterizado pelo fato de que o câncer de próstata é um câncer de próstatamenos agressivo, como definido por um escore de Gleason combinado de 2-7(3+4).

66. Método de acordo com a reivindicação 63 ou 64,caracterizado pelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de um câncer de próstata mais agressivo e/ou um prognóstico pior.

67. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer de mama, e o marcador ou haplótipo temum risco relativo de pelo menos 1,3.

68. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer de pulmão, e o marcador ou haplótipo temum risco relativo de pelo menos 1,3.

69. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o câncer é melanoma, e o marcador ou haplótipo tem umrisco relativo de pelo menos 1,5.

70. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o melanoma é melanoma cutâneo maligno.

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 59 a 70, caracterizado pelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de uma taxa de resposta diferente do indivíduo a uma modalidadede tratamento particular.

72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-59 a 70, caracterizado pelo fato de que a presença do marcador ou haplótipo éindicativa de uma predisposição a um rearranjo somático de Chr8q24.21 emum tumor ou seu precursor.

73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizadopelo fato de que o rearranjo somático é selecionado dentre o grupoconsistindo de uma amplificação, uma translocação, uma inserção e umadeleção.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-59 a 73, caracterizado pelo fato de que o marcador ou haplótipo compreendeum ou mais marcadores associados com Chr8q24.21 em um desequilíbrio deligação forte, como definido por ( I D' I >0,8) e/ou r2 > 0,2, com um ou maismarcadores selecionados dentre o grupo consistindo dos marcadores naTabela 13.

75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizadopelo fato de que um ou mais marcadores selecionados dentre o grupoconsistindo dos marcadores na tabela 13 compreende o alelo A de rs 1447295ou o alelo-8 de DG8S737.

76. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizadopelo fato de que pelo menos um marcador ou haplótipo tem um risco relativode menos do que um e compreende alelo T de rs 12542685 e alelo C ders7814251.

77. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizadopelo fato de que pelo menos um marcador ou haplótipo compreende pelomenos um dos marcadores mostrados na Tabela 13, tendo um risco relativomenor do que um.

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-76 a 77, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de próstata.

79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações-59 a 79, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é de ascendência africananegra.

80. Kit para ensaiar uma amostra de um indivíduo paradetectar uma susceptibilidade a um câncer, caracterizado pelo fato de que okit compreende um ou mais reagentes para detectar um marcador ou haplótipoassociado com LD Bloco A.

81. Kit de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelofato de que o câncer é selecionado dentre o grupo consistindo de câncer depróstata, câncer de mama, câncer de pulmão e melanoma.

82. Kit de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelofato de que o câncer é câncer de próstata.

83. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a-82, caracterizado pelo fato de que um ou mais reagentes compreendem pelomenos uma seqüência de nucleotídeos contígua que é completamentecomplementar a uma região compreendendo pelo menos um dos marcadoresselecionados dentre o grupo consistindo dos marcadores na Tabela 13.

84. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 80 a-83, caracterizado pelo fato de que um ou mais reagentes compreendem pelomenos uma seqüência de nucleotídeos contígua que é completamentecomplementar a uma região compreendendo o alelo A de rs 1447295 ou oalelo-8 de DG8S737.