ES2421354T3 - Secuencias consenso codificantes de cánceres de mama y colorrectales humanos - Google Patents

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D. Williams Parsons
Laura D. Wood
Jimmy Lin
Thomas Barber
Diana Mandelker
Bert Vogelstein
Kenneth W. Kinzler
Victor E. Velculesu
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Abstract

Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano, que comprende las etapas de: determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática humana en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados; e identificar la muestra como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.

Description

Secuencias consenso codificantes de cánceres de mama y colorrectales humanos
La presente invención se realizó usando fondos de subvención del gobierno de los Estados Unidos. Bajo el término de las subvenciones, el gobierno de los Estados Unidos conserva determinados derechos en la invención. Las subvenciones utilizadas incluyen las subvenciones NIH CA 121113, CA 43460, CA 57345, CA 62924, GM 07309, RR 017698, P30-CA43703 y CA109274 y DAMD17-03-1-0241 del Departament of Defense grant
Campo técnico de la invención
La presente invención se refiere al área de caracterización del cáncer. En particular se refiere a cánceres de mama y colorrectales.
Antecedentes de la invención
Es un hecho ampliamente aceptado que el cáncer humano es una enfermedad genética ocasionada por la acumulación secuencial de mutaciones en oncogenes y genes supresores tumorales (1). Estas mutaciones específicas de tumores (es decir, somáticas) proporcionan pistas con respecto a los procesos celulares causantes de tumorigénesis y se ha demostrado que son útiles con fines de diagnóstico y terapéuticos. Sin embargo, hasta ahora, solo se ha analizado una pequeña fracción de los genes y se desconoce el número y el tipo de alteraciones sensibles al desarrollo de tipos tumorales (2). En el pasado, las selecciones de genes seleccionados para análisis mutacional en cáncer se han guiado por la información de estudios de ligamiento en familias propensas al cáncer, identificación de anomalías cromosómicas en tumores o atributos funcionales conocidos de genes individuales o familias de genes (2-4). Se ha encontrado que una gran cantidad de genes se sobreexpresan en cáncer [50]. Además, la sobreexpresión de transportadores ABC como ABCA3 se ha relacionado con la resistencia a fármacos en células tumorales humanas [51-53]. La determinación de la secuencia del genoma humano junto con mejoras en la secuenciación y estrategias bioinformáticas han hecho ahora que sea posible, en principio, examinar el genoma de células cancerosas de una manera exhaustiva y objetiva. Dicha estrategia no solo proporciona los medios para descubrir otros genes que contribuyen a la tumorigénesis sino que también conduce a conocimientos mecanicistas que solo son obvios a través de una perspectiva de sistemas biológicos. El análisis genético exhaustivo de cánceres humanos podría conducir al descubrimiento de un conjunto de genes, relacionados entre sí a través de un fenotipo compartido, orientado a la importancia de procesos celulares específicos o rutas específicas.
Existe una necesidad continua en la técnica de identificar genes y modelos de mutaciones génicas útiles para identificar y estratificar cánceres de pacientes individuales.
Sumario de la invención
De acuerdo con una realización de la invención se proporciona un procedimiento para el diagnóstico del cáncer de mama en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en el gen ABCA3 o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. La muestra se identifica como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.
También se describe un procedimiento para el diagnóstico del cáncer colorrectal en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los indicados en la Figura 14 (Tabla S6). La muestra se identifica como cáncer colorrectal si se determina la mutación somática.
Se proporciona un procedimiento para estratificar cánceres de mama para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos. Se determina una firma mutacional de genes CAN para un cáncer de mama determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal de un ser humano. La al menos una mutación somática está en el gen ABCA3. Se forma un primer grupo de cánceres de mama que tienen la firma mutacional de genes CAN. La eficacia de un agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido del primer grupo se compara con la eficacia de un segundo grupo de cánceres de mama que tiene una firma mutacional de genes CAN diferente. Se identifica una firma mutacional de genes CAN que se correlaciona con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.
Se describe un procedimiento para estratificar cánceres colorrectales para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos. Se determina una firma mutacional de genes CAN para un cáncer colorrectal determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano. La al menos una mutación somática está uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 14 (Tabla S6). Se forma un primer grupo de cánceres colorrectales que tienen la firma mutacional de genes CAN. La eficacia de agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido del primer grupo se compara con la eficacia de un segundo grupo de cánceres colorrectales que tienen una firma mutacional de genes CAN diferente. Se identifica una firma mutacional de genes CAN que se correlaciona con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.
En el presente documento se describe un procedimiento para caracterizar un cáncer de mama en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 13 (Tabla S5).
Se describe otro procedimiento para la caracterización de un cáncer colorrectal en un ser humano. En una muestra de ensayo se determina una mutación somática en un gen o su ADNc codificado o proteína codificada con respecto a una muestra normal del ser humano. El gen se selecciona del grupo que consiste en los genes indicados en la Figura 14 (Tabla S6).
Breve descripción de las figuras
Figura 1A y 1B. Esquema de Exploraciones de Descubrimiento y Validación de Mutaciones.
Figura 2. Frecuencia de mutación de los grupos de genes CAN. Los genes CAN se agruparon por función usando grupos de Ontología de Genes, dominios INTERPRO y bibliografía disponible. Las barras indican la fracción de tumores (35 de mama o 35 colorrectales) al menos con un gen mutado en el grupo funcional.
Figura 3. (Fig. S1) Frecuencias de mutación de codón. Barras blancas, codones CCDS (n=7.479.318 en 13.023 genes); barras rojas, codones afectados por mutaciones de sustituciones de bases en cánceres de mama (n=789); barras azules, codones afectados por mutaciones de sustituciones de bases en cánceres colorrectales (n=669).
Figura 4. (Fig. S2) genes CCDS excluidos del análisis. Ciento treinta y cuatro transcritos de 119 genes que se emparejaban estrechamente con más de un locus genómico (círculo grande) y/o que estaban localizados en el cromosoma Y (círculo pequeño) se excluyeron del análisis.
Figura 5. (Tabla 1.) Resumen de mutaciones somáticas
Figura 6. (Tabla 2) Espectro de sustituciones de una sola base
Figura 7. (Tabla 3.) Clasificación funcional de genes CAN*
Figura 8. (Tabla S1) Cebadores usados para amplificación y secuenciación por PCR (página 1 solo de 1333; se dispone públicamente de todas las secuencias de cebadores en un archivo transferible (1133427_som_Tablas.zip) en el sitio web del journal Science (www.sci-encemag.org) con Material de apoyo Online localizado en la página web /cgi/content/full/sci;1133427/DC1)
Fig. 9. (Tabla S2A.) Características de las muestras de cáncer colorrectal.
Fig. 10. (Tabla S2B.) Características de las muestras de cáncer de mama.
Fig. 11. (Tabla S3.) Distribución de mutaciones en cánceres individuales.
Fig. 12. (Tabla S4.) Mutaciones somáticas identificadas en cánceres de mama o colorrectales.
Figura 13. (Tabla S5.) Genes CAN de mama.
Figura 14. (Tabla S6.) Genes CAN colorrectales.
Descripción detallada de la invención
Los autores de la invención han desarrollado procedimientos para la caracterización de cánceres de mama basándose en firmas genéticas. Estas firmas comprenden el gen ABCA3 que está mutado en cáncer de mama. Las firmas pueden usarse como un medio diagnóstico, pronóstico, identificación de metástasis, estratificación para estudios farmacológicos y para asignar un tratamiento apropiado.
De acuerdo con la presente invención una mutación somática puede determinarse mediante ensayos con un gen, su ARNm (o ADNc derivado) o su proteína codificada. Para determinar una mutación somática puede usarse cualquier procedimiento conocido en la técnica. El procedimiento puede implicar la determinación de la secuencia de todo o parte de un gen, ADNc o proteína. El procedimiento puede implicar reactivos específicos de mutación tales como sondas, cebadores o anticuerpos. El procedimiento puede basarse en reacciones de amplificación, hibridación, anticuerpo-antígeno, extensión de cebadores, etc. Puede usarse cualquier técnica o procedimiento conocido en la técnica para determinar una característica basada en secuencias.
Las muestras para el ensayo pueden ser muestras tisulares de tejido mamario o fluidos corporales o productos con células descamadas o genes o ARNm o proteínas. Dichos fluidos o productos incluyen leche materna, secreciones mamarias. Preferentemente, para la muestra de ensayo y la muestra normal se usa el mismo tipo de tejido o fluido. Sin embargo, se sospecha que la muestra de ensayo tiene una posible anomalía neoplásica, mientras que la
muestra normal carece de sospecha.
Las mutaciones somáticas se determinan hallando una diferencia entre una muestra de ensayo y una muestra normal de un ser humano. Este criterio elimina la posibilidad diferencias de línea germinal que inducen a confusión en los análisis. Para el cáncer de mama, el gen (o ADNc o proteína) a ensayar es el gen ABCA3. Son genes particulares, adicionalmente descritos en el presente documento, que pueden ensayarse y que son útiles, los genes de gelsolina GSN, cadherina CDH10 y CDH20, actina y proteína filamina B FLNB de unión a SMAD, y receptores del factor autocrino de motilidad AMFR. Otros genes útiles incluyen el transportador dependiente de ATP ATP8B1, receptores de cobalamina-factor intrínseco CUBN, la proteína de unión a actina DBN1, y la alfa tectorina TECTA. Para el cáncer colorrectal, el gen (o ADNc o proteína) a ensayar es cualquiera de los mostrados en la Figura 14. (Tabla S6). Son genes particulares, que pueden ensayarse y que son útiles, el receptor de efrina EPHB6, el gen 3 de la leucemia de linaje mixto (MLL3) y el receptor de la proteína tirosina fosfatasa PTPRD. Otros genes que pueden ensayarse y que son útiles son el gen de la enfermedad poliquística hepática y renal 1 PKHD1, guanilato ciclasa 1 GUCY1A2, factor de la transcripción TBX22, componente del complejo exoquístico SEC8L1, y tubulina tirosina ligasa TTLL3. Cualquier mutación somática puede ser informativa. En la Figura 12 (Tabla S4) se muestran las mutaciones particulares que pueden usarse.
El número de genes o mutaciones que puede ser útil en la formación de una firma de un cáncer de mama o colorrectal puede variar de uno a veinticinco. Pueden usarse al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más genes. Las mutaciones son normalmente mutaciones somáticas y mutaciones no sinónimas. Las mutaciones descritas en el presente documento se encuentran dentro de las regiones codificantes. También pueden encontrarse otras mutaciones en regiones no codificantes y pueden ser informativas.
Para ensayar agentes terapéuticos candidatos o ya identificados para determinar que pacientes y tumores serán sensibles a los agentes, puede usarse estratificación basándose en las firmas. Se formarán uno o más grupos con una firma de mutación similar y el efecto del agente terapéutico en el grupo se comparará con el efecto de pacientes cuyos tumores no comparten la firma del grupo formado. El grupo de pacientes que no comparten la firma pueden compartir una firma diferente o puede tratarse de una población mixta de pacientes portadores de tumores cuyos tumores porten una diversidad de firmas.
La eficacia puede determinarse mediante cualquiera de los medios convencionales conocidos en la técnica. Puede usarse un índice de eficacia. El índice puede ser la esperanza de vida, el periodo de remisión libre de enfermedad, la reducción del tumor, la detención del crecimiento tumoral, la mejoría de la calidad de vida, la disminución de los efectos secundarios, la disminución del dolor, etc. Puede usarse cualquier medida útil de la salud y bienestar del paciente. Además, pueden realizarse ensayos in vitro en células tumorales que tengan firmas particulares. Las células tumorales con firmas particulares también pueden ensayarse en modelos animales.
Una vez que una firma se ha correlacionado con la sensibilidad o la resistencia frente a un régimen terapéutico particular, esa firma puede usarse para prescribir un tratamiento al paciente. Por tanto la determinación de una firma es útil para tomar decisiones terapéuticas. La firma también puede combinarse con otros hallazgos físicos o bioquímicos relativos al paciente para llegar a una decisión terapéutica. Para tomar una decisión terapéutica no es necesario basarse solo en una firma.
Un agente anticanceroso asociado con una firma puede ser, por ejemplo, docetaxel, paclitaxel, topotecán, adriamicina, etopósido, fluorouracilo (5-FU) o ciclofosfamida. El agente puede ser un agente alquilante (por ejemplo mostazas de nitrógeno), antimetabolitos (por ejemplo, análogos de pirimidina), isótopos radioactivos (por ejemplo fósforo y yodo), agentes diversos (por ejemplo, ureas sustituidas) y productos naturales (por ejemplo, vinca alcaloides y antibióticos). El agente terapéutico puede ser alopurinol sódico, mesilato de dolasetrón, pamidronato disódico, etidronato, fluconazol, alfa epoetina, levamisol HCL, amifostina, granisetrón HCL, leucovorina cálcica, sargramostim, dronabinol, mesna, filgrastim, pilocarpin HCL, acetato de octreotida, dexrazoxano, ondansetrón HCL, ondansetrón, busulfán, carboplatino, cisplatino, tiotepa, melfalán HCL, melfalán, ciclofosfamida, ifosfamida, clorambucilo, mecloretamina HCL, carmustina, lomustina, polifeprosán 20 con implante de carmustina, estreptozocina, doxorrubicina HCL, sulfato de bleomicina, daunorrubicina HCL, dactinomicina, citrato de daunorrubicina, idarrubicina HCL, plimicina, mitomicina, pentostatina, mitoxantrona, valrrubicina, citarabina, fosfato de fludarabina, floxuridina, cladribina, metotrexato, mercaptopurina, tioguanina, capecitabina, metiltestosterona, nilutamida, testolactona, bicalutamida, flutamida, anastrozol, citrato de toremifeno, fosfato sódico de estramustina, etinil estradiol, estradiol, estrógenos esterificados, estrógenos conjugados, acetato de leuprolida, acetato de goserelina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, levamisol HCL, aldesleucina, irinotecán HCL, dacarbacina, asparaginasa, fosfato de etopósido, gemcitabina HCL, altretamina, topotecán HCL, hidroxiurea, interferón alfa-2b, mitotano, procarbacina HCL, tartrato de vinorrelbina, L-asparaginasa de E. coli, L-asparaginasa de Erwinia, sulfato de vincristina, denileucina diftitox, aldesleucina, rituximab, interferón alfa-2a, paclitaxel, docetaxel, BCG vivo (intravesical), sulfato de vinblastina, etopósido, tretinoina, tenipósido, porfimer sódico, fluorouracilo, fosfato sódico de betametasona y acetato de betametasona, letrozol, factor de etopósido citrororum, ácido folínico, leucovorina cálcica, 5-fluorouracilo, adriamicina, citoxano o diaminodicloroplatino.
Las firmas de genes CAN descritas en el presente documento pueden usarse para determinar una terapia apropiada para un individuo. Por ejemplo, puede proporcionarse una muestra de un tumor (por ejemplo un tejido obtenido por
un procedimiento de biopsia, tal como biopsia con aguja) procedente del individuo, de tal manera que antes se administre una terapia primaria. El perfil de expresión génica del tumor puede determinarse, tal como mediante una tecnología de matriz de ácido nucleico (o matriz de proteína) y el perfil de expresión puede compararse con una base de datos que correlaciona firmas con resultados de tratamiento. En una recomendación de tratamiento, puede tenerse en cuenta otra información relacionada con el ser humano (por ejemplo, edad, sexo, historial familiar, etc.). Un proveedor de asistencia sanitaria puede tomar una decisión para administrar o prescribir un fármaco particular basándose en la comparación de la firma de genes CAN del tumor e información en la base de datos. Como ejemplos de proveedores de asistencia sanitaria se incluyen médicos, enfermeros(as) y auxiliares de enfermería. Los laboratorios de diagnóstico también pueden proporcionar una terapia recomendada basada en firmas y en otra información sobre el paciente.
Después del tratamiento con una terapia primaria contra el cáncer, el paciente puede monitorizarse con respecto a una mejoría o empeoramiento del cáncer. Puede extraerse una muestra de tejido tumoral (tal como una biopsia) en cualquier fase de tratamiento. En particular, puede extraerse una muestra de tejido después del avance tumoral, que puede determinarse mediante crecimiento o metástasis tumoral. Puede determinarse una firma de genes CAN y puede administrarse uno más agentes terapéuticos secundarios para aumentar, o reestablecer, la sensibilidad del tumor con respecto a la terapia primaria.
Las predicciones del tratamiento pueden basarse en firmas de genes de tratamiento previo. Los agentes terapéuticos secundarios o posteriores pueden seleccionarse basándose en evaluaciones posteriores del paciente y en las firmas posteriores del tumor. El paciente se monitorizará normalmente con respecto al efecto del avance del tumor.
Puede seleccionarse una intervención médica basándose en la identidad de la firma de genes CAN. Por ejemplo, los individuos pueden clasificarse en subpoblaciones de acuerdo con su genotipo. Después, pueden prescribirse terapias farmacológicas específicas de genotipo.
Las intervenciones médicas incluyen intervenciones ampliamente practicadas, así como intervenciones menos convencionales. Por tanto, las intervenciones médicas incluyen, pero sin limitación, procedimientos quirúrgicos, administración de fármacos particulares o dosificaciones de fármacos particulares (por ejemplo, moléculas pequeñas, proteínas modificadas biológicamente por ingeniería genética, y fármacos basados en genes, tales como oligonucleótidos antisentido, ribozimas, sustituciones de genes y/o vacunas basadas en ADN o ARN), incluyendo fármacos autorizados por la FDA, fármacos autorizados por la FDA usados para fines no autorizados y agentes experimentales. Otras intervenciones médicas incluyen terapia nutricional, regímenes holísticos, acupuntura, meditación, estimulación eléctrica o magnética, remedios osteopáticos, tratamientos quiroprácticos, tratamientos naturopáticos y ejercicio.
A partir de nuestro análisis mutacional exhaustivo del cáncer humano han aparecido cuatro puntos importantes. En primer lugar, existe un número relativamente grande de genes CAN no caracterizados anteriormente en cánceres de mama y colorrectales y estos genes pueden descubrirse mediante estrategias objetivas, tales como las utilizadas en nuestro estudio. Estos resultados apoyan la idea de que el análisis mutacional a gran escala de otros tipos de tumores demostrará ser útil para identificar genes no anteriormente conocidos que están relacionados con el cáncer humano.
En segundo lugar, nuestros resultados sugieren que el número de acontecimientos mutacionales que se producen durante la evolución de los tumores humanos desde un estado benigno a metastático es mucho mayor de lo que se creía anteriormente. Hemos encontrado que los cánceres de mama y colorrectales contienen un promedio de 52 y 67 mutaciones somáticas no sinónimas en genes CCDS, de los cuales un promedio de 9 y 12, respectivamente, eran en genes CAN. Fig. 11 (Tabla S3). Estos datos pueden usarse para estimar el número total de mutaciones no sinónimas en genes codificantes que se originan en un cáncer “típico” a través de rondas de mutación y selección secuenciales. Suponiendo que la frecuencia de mutación en genes que aún no se han secuenciado es similar a la de los genes hasta ahora analizados, se calcula que hay 81 y 105 genes mutantes (promedio, 93) en el cáncer colorrectal o de mama típico, respectivamente. De estos, se esperaría que un promedio de 14 y 20, respectivamente, fuesen genes CAN. Además de los genes CAN, hubo otros genes CCDS mutados que posiblemente se hubiesen seleccionado durante la tumorigénesis pero que no han sufrido ningún cambio a una alta frecuencia suficiente para garantizar confianza en su interpretación.
Un tercer punto que aparece a partir de nuestro estudio es que los cánceres de mama y colorrectales muestran diferencias sustanciales en sus espectros de mutación. En los cánceres colorrectales, previamente se ha observado un sesgo hacia transiciones de C:G a T:A en sitios 5’-CpG-3’ en TP53 (42). Nuestros resultados sugieren que este sesgo es en todo el genoma en lugar de representar una selección por determinados nucleótidos dentro de TP53. Este sesgo puede reflejar una metilación más extensiva de dinucleótidos 5’-CpG-3’ en cánceres colorrectales que en cánceres de mama o el efecto de carcinógenos dietéticos (43, 44). En cánceres de mama, la fracción de mutaciones en sitios 5’-TpC-3’ fue muy superior en los genes CCDS examinados en este estudio en comparación con lo anteriormente indicado para TP53 (37). Se ha observado que una pequeña fracción de tumores de mama pueden tener un sistema de reparación defectuoso, dando como resultado mutaciones 5’-TpC-3’ (15). Nuestros estudios confirman que algunos cánceres de mama tienen mayores fracciones de mutaciones 5’-TpC-3’ que otros, pero
también muestran que las mutaciones en este dinucleótido son generalmente más frecuentes que en los cánceres colorrectales (Figs. 6 y 11; Tablas 2 y S3).
Por último, nuestros resultados revelan que hay diferencias sustanciales en el panel de genes CAN mutados en los dos tipos de tumores (Fig. 7; Tabla 3). Por ejemplo, los genes de la metaloproteinasa mutaron en una gran fracción de cánceres colorrectales pero solamente en una pequeña fracción de cánceres de mama (Figs. 13 y 14; Tablas S5 y S6). Los genes reguladores transcripcionales mutaron en una alta fracción de tumores tanto de mama como colorrectales, pero los genes específicos afectados variaron de acuerdo con el tipo de tumor (Fig. 7; Tabla 3). También hubo heterogeneidad considerable entre los genes CAN mutados en diferentes muestras de ensayo tumorales derivadas del mismo tipo de tejido (Figs. 12-14; Tablas S4, S5 y S6). Se ha documentado que prácticamente todos los atributos bioquímicos, biológicos y clínicos son heterogéneos dentro de los cánceres humanos del mismo subtipo histológico (45). Nuestros datos sugieren que las diferencias en los genes CAN mutados en diversos tumores podrían explicar una gran parte de esta heterogeneidad. Esto explicaría por qué ha sido tan difícil correlacionar el comportamiento, pronóstico o respuesta frente a la terapia de tumores sólidos comunes con la presencia o ausencia de una sola alteración génica, dichas alteraciones reflejan solamente un pequeño componente de cada composición mutacional del tumor. Por otro lado, genes dispares que contribuyen al cáncer son a menudo funcionalmente equivalentes, afectando al crecimiento celular neto a través de la misma ruta molecular (1). Por tanto, las mutaciones en TP53 y MDM2 ejercen efectos comparables en las células, al igual que las mutaciones en RB1, CDKN2A (p16), CCND1 y CDK4. Será de interés determinar si un número limitado de rutas incluye la mayoría de los genes CAN, una posibilidad en consonancia con las agrupaciones de la Fig. 2 y Fig. 7 (Tabla 3).
Al igual que una versión borrador de cualquier proyecto genómico, nuestro estudio tiene limitaciones. En primer lugar, solo se analizaron genes presentes en la versión actual de CCDS. Existen ∼5000 genes para los cuales se demuestran excelentes evidencias probatorias aunque aún no están incluidos en la base de datos CCDS (46). En segundo lugar, no se pudo secuenciar con éxito ∼10 % de las bases dentro de las secuencias codificantes de los
13.023 genes CCDS (equivalente a 1.302 genes no secuenciados). En tercer lugar, aunque podría esperarse que nuestra exploración identificase la mayoría de los tipos de mutaciones comunes encontrados en cánceres, algunas alteraciones genéticas, incluyendo mutaciones en genes no codificantes, mutaciones en regiones no codificantes de genes codificantes, deleciones o inserciones relativamente grandes, amplificaciones y translocaciones, no serían detectables mediante los procedimientos que usamos. Estudios futuros emplean una combinación de diferentes tecnologías, tales como las contempladas por The Cancer Genome Atlas Project (TCGA) (47), podrían abordar estos problemas.
Los resultados de este estudio informan acerca de futuras iniciativas de la secuenciación del genoma del cáncer de diversos modos importantes.
(i)
Un desafío técnico principal de dichos estudios será diferenciar mutaciones somáticas a partir de la gran cantidad de alteraciones de secuencias identificadas. En nuestro estudio, se detectaron 557.029 alteraciones de secuencias no sinónimas en la Exploración de Descubrimiento pero después de análisis posteriores solo se identifico un 0,23 % de estas como mutaciones somáticas legítimas (Fig. 1). Menos del 10 % de las alteraciones no sinónimas fueron polimorfismos conocidos; muchas del resto fueron variantes de línea germinal inusuales o artefactos de secuencias que no fueron reproducibles. La inclusión de muestras normales emparejadas y la secuenciación de ambas cadenas de cada producto PCR reduciría positivos falsos en la Exploración de Descubrimiento pero aumentaría por cuatro el coste de secuenciación. Aunque los procedimientos de secuenciación recientemente desarrollados podrían reducir el coste de dichos estudios en el futuro (48), las tasas de error más elevadas de estas estrategias pueden dar como resultado una proporción incluso más baja de autenticas mutaciones somáticas con respecto a supuestas alteraciones.
(ii)
Otro problema técnico es que el diseño meticuloso de cebadores es importante para eliminar artefactos de secuencia debido a la amplificación y secuenciación accidental de genes relacionados. Los pares de cebadores que dan como resultado una amplificación y secuenciación satisfactoria representan un recurso valioso en este sentido. Incluso con cebadores bien diseñados, es esencial examinar cualquier mutación observada para garantizar que esto no se encuentra como una variante normal en un gen relacionado.
(iii) Aunque es probable que estudios de otros tipos de tumores sólidos también identificarán una gran cantidad de mutaciones somáticas, será importante aplicar estrategias rigurosas para identificar las mutaciones que se han seleccionado durante la tumorigénesis. Técnicas estadísticas, tales como las usadas en este estudio o descritas por Greenman y col. (11), pueden proporcionar pruebas firmes para la selección de genes mutados. Estas estrategias tienen más posibilidades de mejorar cuanto más datos de secuenciación genómica del cáncer se acumulen a través del Cancer Genome Atlas Project (47) y otros proyectos actualmente en vías de ejecución.
(iv) Se ha discutido mucho sobre que genes deberían ser el centro de futuras iniciativas de secuenciaciones. Nuestros resultados sugieren que muchos genes no anteriormente implicados en cáncer están mutados a niveles significativos y pueden proporcionar nuevas pistas para la patogénesis. A partir de estos datos, parecería que exploraciones objetivas, a gran escala, de genes codificantes, pueden ser más informativas que las exploraciones basadas en criterios anteriormente definidos.
(v)
Los resultados también plantean cuestiones sobre el número óptimo de tumores de cualquier tipo determinado que debería evaluarse en un estudio genómico del cáncer. Nuestro estudio se diseñó para determinar la naturaleza y tipos de alteraciones presentes en un cáncer de mama o colorrectal "promedio" y para descubrir genes mutados a frecuencias razonablemente altas. La capacidad de detectar genes mutados en más del 20 % de tumores de un tipo determinado fue del 90 %, pero solo el 50 % de los genes mutados en el 6 % de los tumores podrían haberse descubierto. Para detectar genes mutados en el 6 % o 1 % de tumores con una probabilidad > 99 % en una exploración de descubrimiento requeriría la determinación de secuencias de al menos 75 o 459 tumores, respectivamente. Aunque será imposible detectar todas las mutaciones que puedan producirse en tumores, pueden contemplarse estrategias que identifiquen las más importantes con un coste razonable basándose en los datos y en los análisis descritos en el presente documento.
(vi)
Finalmente, se obtendrán las secuencias de todos los genomas del cáncer, incluyendo las regiones intergénicas. Nuestro estudio demuestra las dificultades intrínsecas en la determinación del significado de las mutaciones somáticas incluso aquellas que alteran la secuencia de aminoácidos de genes muy acotados y bien estudiados. El establecimiento del significado de mutaciones en regiones no codificantes del genoma será posiblemente mucho más difícil. Hasta las nuevas herramientas para resolver este problema estarían disponibles, probablemente porque los análisis del cáncer, centrados en genes, serán más útiles.
Nuestros resultados proporcionan una gran cantidad de futuras oportunidades de investigación en el cáncer humano. Para la genética, será interesante aclarar la temporalización y el grado de mutaciones de genes CAN en cánceres de mama y colorrectales, tanto si estos genes están mutados en otros tipos de tumores como si variantes de la línea germinal en genes CAN están asociadas con predisposición al cáncer. Para la inmunología, el hallazgo de que tumores que contienen un promedio de ∼90 sustituciones de aminoácidos diferentes no presentes en ninguna célula normal puede proporcionar nuevas estrategias para crear inmunidad antitumoral. Para la epidemiología, la notable diferencia en los espectros de mutaciones de cánceres de mama y colorrectales sugiere la existencia de carcinógenos específicos de órganos. Para la biología del cáncer, está claro que ningún animal actual
o modelo in vitro de cáncer recapitula el panorama genético de un tumor humano real. El entendimiento y captura de este panorama y su heterogeneidad puede proporcionar modelos que imiten más satisfactoriamente las enfermedades humanas. Para la epigenética, es posible que un subconjunto de genes CAN también pueda regularse mal en tumores a través de cambios en la cromatina o metilación del ADN en lugar de a través de mutaciones. Para el diagnóstico, los genes CAN definen un subconjunto relativamente pequeño de genes que podrían demostrar ser útiles como marcadores para neoplasia. Finalmente, algunos de estos genes, particularmente los de la superficie celular, o los que tienen actividad enzimática, pueden demostrar ser buenas dianas para el desarrollo terapéutico.
Ejemplos
Para comenzar el estudio sistemático del genoma del cáncer, se examinó una fracción principal de genes humanos en dos tipos tumorales comunes, los cánceres de mama y colorrectales. Estos cánceres se seleccionaron para el estudio debido a su significado clínico sustancial en todo el mundo: en su conjunto, representan ∼2,2 millones de diagnósticos de cáncer (20 % del total) y 940.000 muertes por cáncer cada año (14 % del total) (5). Para la evaluación genética de estos tumores, nos centramos en un conjunto de genes codificantes de proteínas, denominados las secuencias consenso codificantes (CCDS) que representan el conjunto de genes más altamente curado actualmente disponible (6). La base de datos CCDS contiene genes codificantes de proteínas de longitud completa que se han definido por curación manual extensiva y procesamiento computacional y tiene explicaciones genéticas que son idénticas entre las bases de datos de referencia.
Este estudio tenía tres objetivos: (i) desarrollar una estrategia metodológica para realizar análisis de todo el genoma de genes del cáncer en tumores humanos; (ii) determinar el espectro y grado de mutaciones somáticas en tumores humanos de tipos histológicos similares y diferentes y (iii) identificar nuevos genes del cáncer y rutas moleculares que pudiesen conducir a mejoras en el diagnóstico o terapia.
Ejemplo 1-Exploración de descubrimiento de mutaciones del cáncer
La etapa inicial para conseguir estos objetivos fue el desarrollo de procedimientos de identificación de alto rendimiento de mutaciones somáticas en cáncer. Estos procedimientos incluyen diseño de cebadores, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), secuenciación y análisis mutacional (Fig. 1). El primer componente implicó la extracción de todas las secuencias codificantes de proteínas de los genes CCDS. Se obtuvo un total de 120.839 exones no redundantes y secuencias intrónicas adyacentes de 14.661 transcriptos diferentes en las CCDS. Estas secuencias se usaron para diseñar cebadores para la amplificación PCR y secuenciación de exones y sitios de corte y empalme adyacentes. Los cebadores se diseñaron usando diversos criterios para garantizar una fuerte amplificación y secuenciación de regiones molde (7). Aunque puso amplificarse la mayoría de los exones en una sola reacción PCR, se encontró que exones más grandes de 350 pb se amplificaban más eficazmente como amplicones de solapamiento múltiple. Un miembro de cada par de cebadores PCR fue en cola con una secuencia cebadora universal para posteriores reacciones de secuenciación. De este modo se diseñó un total de 135.483 pares de cebadores que incluían ∼21 Mb de la secuencia genómica (Fig. 8; Tabla S1).
Once líneas celulares o xenoinjertos de cada tipo tumoral (carcinomas mamarios y colorrectales) se usaron en la exploración de descubrimiento (Figs. 9-10; Tablas S2A y S2B). Se usaron dos muestras normales coincidentes como controles para ayudar a identificar variaciones de secuencia normales y artefactos de secuenciación específicos de amplicones tales como los asociados con regiones ricas en GC. Se generó un total de ∼3 millones de productos PCR y se secuenciaron directamente, dando como resultado 465 Mb de secuencias tumorales.
Los datos de secuencias de cada amplicón se agruparon y se evaluaron con respecto a la calidad dentro de la región diana usando un programa informático especialmente diseñado para este propósito (7). La región diana de cada exón incluyó todas las bases codificantes así como las cuatro bases intrónicas en los dos extremos 5’ y 3’ que se utilizan como los sitios de reconocimiento de corte y empalme principales. Para considerar que un amplicón se analizaba con éxito, se necesitaron que ≥ 90 % de bases en la región diana tuviesen una puntuación de calidad Phred (definida como - 10[log10(error original por base)]) de al menos 20 en al menos tres cuartas partes de las muestras de tumor analizadas (8). Este límite de calidad se seleccionó para proporcionar una alta sensibilidad para la detección de mutaciones minimizando al mismo tiempo positivos falsos. Usando estos criterios, el 93 % de los
135.483 amplicones y el 91 % de las bases diana totales en CCDS se analizaron satisfactoriamente con respecto a posibles alteraciones.
El examen de trazas de secuencia de estos amplicones reveló un total de 816.986 supuestos cambios de nucleótidos. Dado que la inmensa mayoría de los cambios que no influyeron en la secuencia de aminoácidos (es decir sustituciones sinónimas o silenciosas), eran posiblemente no funcionales, estos cambios no se analizaron posteriormente. Los 557.029 cambios restantes podrían representar variantes de línea germinal, artefactos de PCR
o secuenciación, o mutaciones somáticas genuinas. Se emplearon diversas etapas bioinformáticas y experimentales para diferenciar entre estas posibilidades. En primer lugar, se eliminó cualquier alteración que también estuviese presente en cualquiera de las dos muestras normales incluidas en la exploración de descubrimiento, ya que posiblemente representaban polimorfismos de línea germinal comunes o artefactos de secuencias. En segundo lugar, dado que podría esperarse que estas dos muestras de control normales contuviesen solo un subconjunto de variantes conocidas, también se eliminó cualquier cambio correspondiente a un polimorfismo de línea germinal validado encontrado en las bases de datos de polimorfismos de un único nucleótido (SNP) (7). Finalmente las trazas de secuencia de cada posible alteración se inspeccionó visualmente para eliminar resultados positivos falsos en el análisis automatizado. La combinación de estas iniciativas de análisis de datos fue eficaz, eliminando ∼96 % de las posibles alteraciones y dejando 29.281 para un análisis minucioso posterior (Fig. 1).
Para garantizan que las mutaciones observadas no se producían como artefactos durante las etapas de PCR o secuenciación, las regiones que las contenían se re-amplificaron independientemente y se re-secuenciaron en los tumores correspondientes. Esta etapa eliminó 9.295 alteraciones. Después, las regiones que contenían las supuestas mutaciones se secuenciaron en muestras de ADN normales emparejadas para determinar si las mutaciones eran realmente somáticas: se observaron 18.414 cambios que estaban presentes en la línea germinal de estos pacientes, lo que representaba variantes no actualmente incluidas en las bases de datos SNP, y se excluyeron. Como una etapa final, las 1.572 supuestas mutaciones somáticas restantes se examinaron cuidadosamente in silico para garantizar que las alteraciones no se producían a partir de secuenciación diana errónea de regiones muy relacionadas que se producen en cualquier parte en el genoma (7). Las alteraciones en dichas regiones duplicadas pueden parecer ser somáticas cuando se pierden uno o ambos alelos de la región diana en el tumor o cuando los cebadores seleccionados están estrechamente emparejados y por lo tanto amplifican áreas similares del genoma. De esta manera se excluyó un total de 265 cambios en regiones estrechamente relacionadas, dando como resultado un total de 1.307 mutaciones somáticas confirmadas en 1.149 genes (Fig. 5; Tabla 1).
Ejemplo 2- Exploración de validación
Para evaluar la frecuencia y espectro de mutaciones somáticas en estos 1.149 genes, se determinó su secuencia en tumores adicionales del mismo tipo histológico (Figs. 1, 9, 10; Tablas S2A y S2B). Los genes mutados en al menos un tumor de mama o colorrectal en la Exploración de Descubrimiento se analizaron en 24 tumores adicionales de mama o colorrectales, respectivamente. Esta iniciativa implicó 453.024 reacciones de secuenciación y PCR adicionales, que incluían 77 Mb de ADN tumoral. En la exploración de validación se identificó un total de 133.693 supuestos cambios. Se usaron procedimientos similares a los empleados en la Exploración de Descubrimiento para excluir cambios silenciosos, variantes de línea germinal nuevas y conocidas, positivos falsos que surgen de la PCR
o artefactos de secuenciación y aparentes cambios que posiblemente se deben a la co-amplificación de genes muy relacionados. Adicionalmente, cualquiera de los cambios correspondientes a variantes de línea germinal no encontrados en las bases de datos SNP, pero identificados en la exploración de descubrimiento, se excluyeron. Las regiones que contenían los 4.948 cambios restantes se re-amplificaron y se re-secuenciaron en los tumores correspondientes (para garantizar la reproducibilidad) y en tejido normal emparejado para determinar si eran somáticos. De esta manera se identificaron 365 mutaciones somáticas adicionales en 236 genes. En total, se identificaron 921 y 751 mutaciones somáticas en cánceres de mama y colorrectales, respectivamente (Fig. 1, 5 y 12; Tablas 1 y S4).
Ejemplo 3- Espectro de mutación
La gran mayoría de estas 1.672 mutaciones observadas en las Exploraciones de Descubrimiento o de Validación fueron sustituciones de una única base: el 81 % de las mutaciones fueron de sentido erróneo, el 7 % fueron sin sentido y el 4 % sitios de corte y empalme alterados (Fig. 5; Tabla 1). El 8 % restante fueron inserciones, deleciones y duplicaciones que variaban de uno a 110 nucleótidos de longitud. Aunque la fracción de mutaciones que eran sustituciones de una única base era similar en cánceres de mama y colorrectales, el espectro y contexto de nucleótidos de las mutaciones por sustitución fueron muy diferentes entre los dos tipos de tumores. De estas diferencias, la más llamativa se produjo en los pares de bases C:G: el 59 % de las 696 mutaciones de cáncer colorrectal fueron transiciones de C:G a T:A mientras que solo el 7 % fueron transversiones de C:G a G:C (Figs. 6 y 11; Tablas 2 y S3). En cambio, en los cánceres de mama, solo el 35 % de las mutaciones fueron transiciones de C:G a T:A, mientras que el 29 % fueron transversiones de C:G a G:C. Además, una gran fracción (44 %) de las mutaciones en cánceres colorrectales se produjo en sitios dinucleotídicos 5’-CpG-3’ pero solo el 17 % de las mutaciones en cánceres de mama se produjo en dichos sitios. Esta preferencia en 5’-CpG-3’ conduce a un exceso de mutaciones no sinónimas, dando como resultado cambios de restos de arginina en cánceres colorrectales aunque no en cánceres de mama (fig. S1). En cambio, en cánceres de mama el 31 % de las mutaciones se produjo en los sitos 5’-TpC-3’ (o en sitios 5’-GpA-3’ complementarios), mientras que en los cánceres colorrectales solo el 11 % de las mutaciones se produjo en estos sitios dinucleotídicos. Todas las diferencias indicadas anteriormente fueron muy significativas (P<0,0001) (7) y tiene implicaciones sustánciales para los mecanismos causantes de mutagénesis en los dos tipos de tumores.
Ejemplo 4- Diferenciación entre mutaciones pasajeras y no pasajeras
Las mutaciones somáticas en tumores humanos pueden surgir a través de selección de alteraciones funcionalmente importantes mediante su efecto sobre el crecimiento celular neto o a través de la acumulación de alteraciones “pasajeras” no funcionales que surgen durante rondas repetidas de división celular en el tumor o en sus células madre progenitoras. En vista de las tasas de mutación relativamente bajas en las células cancerosas humanas (9, 10), la diferenciación entre mutaciones seleccionadas y pasajeras generalmente no se requiere cuando el número de genes y de tumores analizados es pequeño. Sin embargo, en estudios a gran escala, dichas diferenciaciones son de vital importancia (11, 12). Por ejemplo, se ha calculado que, en cánceres de mama o colon, se presentan mutaciones pasajeras no sinónimas a una frecuencia no mayor de ∼1,2 por Mb de ADN (13-15). Por tanto, como se evaluaron 542 Mb de ADN tumoral, podría esperarse observar -650 mutaciones pasajeras. Realmente se observaron 1.672 mutaciones (Fig. 5; Tabla 1), muchas más de las que posiblemente se había esperado que se produjeran por cambios (P < 1 x 10-10) (7). Además, la frecuencia de mutaciones en la Exploración de Validación fue significativamente mayor que la de la Exploración de Descubrimiento (5,8 frente a 3,1 mutaciones por Mb, P < 1 x 10-10, Fig. 5; Tabla 1). Las mutaciones en la Exploración de Validación también eran ricas en cambios sin sentido, inserción, deleción, duplicación y sitios de corte y empalme en comparación con las de la Exploración de Descubrimiento; podría esperarse que cada una de estas tuviese un efecto funcional en las proteínas codificadas.
Para diferenciar genes que posiblemente contribuían a tumorigénesis de aquellos en los que se producían mutaciones pasajeras por cambios, primero se excluyeron genes que no estaban mutados en la Exploración de Validación. Después se desarrollaron procedimientos estadísticos para calcular la probabilidad de que el número de mutaciones en un gen determinado era mayor que el esperado a partir de la tasa de mutación de fondo. Para cada gen, este análisis incorporó el número de alteraciones somáticas observadas en la Exploración de Descubrimiento o de Validación, el número de tumores estudiados y el número de nucleótidos que se analizaron con éxito (como indica el número de bases con puntuaciones de calidad Phred ≥ 20). Debido a que las frecuencias de mutación variaban con el tipo de nucleótido y el contexto y que fueron diferentes en cánceres de mama frente a colorrectales (Fig. 6; Tabla 2), estos factores se incluyeron en los cálculos. El resultado de este análisis fue una puntuación de predominio de mutaciones de cáncer (CaMP) por cada gen analizado. La puntuación CaMP refleja la probabilidad de que el número de mutaciones realmente observado en un gen es mayor que el esperado observado por cambios dada la tasa de mutación de fondo; su obtención está basada en los principios descritos en el Material de apoyo Online. El uso de la puntuación CaMP para el análisis de mutaciones somáticas es análogo al uso de la puntuación LOD para el análisis de ligamiento en entornos de genética hereditaria. Por ejemplo, se prevé que el 90 % de los genes con puntuaciones CaMP >1,0 tenga frecuencias de mutación mayores que la frecuencia de mutación de fondo.
Ejemplo 5- Genes candidatos de cáncer
En la Fig. 12; Tabla S4, se proporciona una lista completa de las mutaciones somáticas identificadas en este estudio. Se considero que, los genes validados con puntuaciones CaMP mayores de 1,0 eran genes candidatos de cáncer (genes CAN). Por tanto, la combinación del cálculo de validación experimental y estadístico produjo cuatro conjuntos de genes anidados: de los 13.023 genes evaluados, 1.149 mutaron, 242 se validaron y 191 eran genes CAN. Entre estos, los genes CAN eran más probablemente los que se habían sometido a selección mutacional durante la tumorigénesis. Hubo 122 y 69 genes CAN identificados en cánceres de mama y colorrectales, respectivamente (Figs. 13 y 14; Tablas S5 y S6). Los cánceres de mama individuales examinados en la exploración de descubrimiento incluían un promedio de 12 (intervalo de 4 a 23) genes CAN mutantes mientras que el número promedio de genes CAN en cánceres colorrectales fue de 9 (intervalo 3 a 18) (Fig. 11; Tabla S3). De manera
interesante, cada muestra de ensayo de cáncer de un tipo tumoral llevaba su propia firma mutacional definida de gen CAN, ya que ningún cáncer tuvo más de seis genes CAN mutantes en común con cualquier otro cáncer (Figs. 12-14; Tablas S4, S5 y S6).
Los genes CAN podrían dividirse en tres clases: (a) genes previamente observados alterados por mutación en cánceres humanos; (b) genes en los que no se habían descubierto mutaciones previas en cánceres humanos pero que se habían relacionado con cáncer a través de estudios funcionales; y (c) cánceres sin fuertes conexiones previas con neoplasia.
(a)
La reidentificación de genes que previamente se había observado que estaban somáticamente mutados en cánceres representó una validación crítica de la estrategia usada en este estudio. En este estudio, se encontró que todos los genes CCDS que previamente mostraron estar mutados en >10 % de cánceres de mama o colorrectales eran genes CAN. Estos incluyeron TP53 (2), APC (2), KRAS (2), SMAD4 (2) y FBXW7 (CDC4) (16) (Figs. 12-14; Tablas S4, S5 y S6). Además, se identificaron mutaciones en genes cuya frecuencia de mutación en cánceres esporádicos era bastante baja. Estos cánceres incluyeron EPHA3 (17), MRE11A (18), NF1 (2), SMAD2 (19, 20), SMAD3 (21), TCF7L2 (TCF4) (22), BRCA1 (2) y TGFBRII (23). También se detectaron mutaciones en genes que previamente se había encontrado que estaban alterados en tumores humanos pero no en el mismo tipo de tumor identificado en este estudio. Estos incluyeron la proteína de unión al nucleótido guanina, GNAS alfa estimulante (24), proteína KEAP1asociada a ECH similar a kelch (25), proto-oncogén RET (2) y factor de transcripción TCF1 (26). Finalmente, se encontraron mutaciones en diversos genes que previamente se habían identificado como dianas de translocación o amplificación en cánceres humanos. Estos incluyeron la nucleoporina NUP214 (2), receptor de quinesina K7N1 (27), polipéptido 10 de la caja DEAD DDX10 (28), oncogén homólogo 1 asociado a glioma GLI1
(29)
y el gen diana de translocación del enanismo relacionado con el factor de transcripción RUNX1T1 (MTG8) (2). Se llegó a la conclusión de que si no se hubiese demostrado que estos genes desempeñaban una función causativa en tumores humanos, podrían haberse descubierto a través de la estrategia adoptada en este estudio. Por analogía, los otros 176 genes CAN de las Figuras 13 y 14 (Tablas S5 y S6) probablemente desempeñan importantes funciones en cánceres de mama, colorrectales y quizás otros tipos de cánceres.
(b)
Aunque actualmente las alteraciones genéticas proporcionan el indicador más fiable de una importancia génica en neoplasia humana (1, 30), hay muchos otros genes que se piensa que desempeñan funciones clave basándose en estudios funcionales o de expresión. Nuestro estudio proporciona pruebas genéticas que refuerzan la importancia de diversos de estos genes en neoplasia. Por ejemplo, se descubrieron mutaciones intragénicas en el receptor de efrina EPHB6 (31), gen 3 de la leucemia de linaje mixto (MLL3) (32), GSN de gelsolina (33), genes de cadherina CDH10 y CDH20, proteína filamina B de unión a actina y SMAD, FLNB (34), receptor de la proteína tirosina fosfatasa PTPRD (35) y receptor del factor autocrino de motilidad AMFR (36).
(c)
Además de los genes indicados anteriormente, el estudio reveló una gran cantidad de genes que no se había sospechado que estuviesen fuertemente implicados en cáncer. Estos incluyeron gen de la enfermedad poliquística hepática y renal 1 PKHD1, guanilato ciclasa 1 GUCY1A2, factor de transcripción TBX22, componente del complejo exocístico SEC8L1, tubulina tirosina ligasa TTLL3, transportador dependiente de ATP, ATP8B1, receptor de cobalamina-factor intrínseco CUBN, proteína de unión a actina DBN1 y alfa tectorina TECTA. Además, siete genes CAN correspondieron a genes para los cuales aún no se había establecido ninguna función biológica.
Se examinó la distribución de mutaciones en los productos de los genes CAN para ver si se producía agrupamiento en regiones específicas o en dominios funcionales. Además de los puntos calientes bien documentados en TP53
(37)
y KRAS (38), se identificaron tres mutaciones en GNAS en cánceres colorrectales que afectaron a un solo resto de aminoácido (R201). Previamente se ha observado que las alteraciones de este resto conducen a la activación constitutiva de la proteína G codificada αs a través de la inhibición de actividad GTPasa (24). Dos mutaciones en el gen EGFL6 similar a EGF en tumores de mama afectó a la misma posición nucleotídica y dio como resultado un cambio L508F en el dominio de adhesión MAM. Un total de nueve genes tuvieron alteraciones localizadas en cinco restos de aminoácidos entre sí y 12 genes más tuvieron grupos de mutaciones múltiples en un dominio de proteína específico (de 13 a 78 aminoácidos de separación). Treinta y uno de 40 de estos cambios afectó a restos que eran evolutivamente conservados. Aunque los efectos de estas alteraciones se desconocen, su agrupamiento sugiere funciones específicas para las regiones mutadas en los procesos neoplásicos.
Ejemplo 6-grupos de genes CAN
Una exploración objetiva de un gran conjunto de genes puede proporcionar conocimientos en la patogénesis que podrían no ser obvios a través de análisis mutacional de genes simple. Esto se ha ilustrado mediante exploraciones de mutagénesis a gran escala en organismos experimentales (39-41). Por lo tanto se intentó asignar cada gen CAN a un grupo funcional basándose en la Función Molecular de Ontología de Genes (OG) o en grupos de procesos Bioquímicos, la presencia de dominios de secuencia INTERPRO específicos o bibliografía previamente publicada (Fig. 7; Tabla 3) y (Fig. 2). Diversos de los grupos identificados de esta manera fueron de interés especial. Por ejemplo, 22 de los 122 genes CAN de mama (18 %) y 13 de los 69 genes CAN colorrectales (19 %) fueron reguladores transcripcionales. Al menos uno de estos genes se mutó en más del 80 % de los tumores de cada tipo. Los factores de transcripción de dedo de cinc estuvieron particularmente muy representados (8 genes mutados colectivamente en el 43 % de las muestras de cáncer de mama). De manera similar, genes implicados en la
adhesión celular representaron ∼22 % de los genes CAN y afectaron a más de dos tercios de tumores de cada tipo. Los genes implicados son en transducción de señales representaron ∼23 % de genes CAN y al menos uno de dichos genes mutó en el 77 % y 94 % de las muestras de cáncer de mama y colorrectal, respectivamente. Los subconjuntos de estos grupos también fueron de interés e incluyeron metaloproteinasas (parte del grupo de adhesión y motilidad celular y mutaron en el 37 % de los cánceres colorrectales), y proteínas G y sus reguladores (parte del grupo de transducción de señales y alterado el 43 % de los cánceres de mama). Estos datos sugieren la mala regulación de procesos celulares específicos se selecciona genéticamente durante la neoplasia y que distintos miembros de cada grupo pueden realizar funciones similares en diferentes tumores.
Ejemplo 7 - Materiales y procedimientos
Selección de genes. La base de datos de Secuencias de ADN Consenso Codificantes (CCOS) representa una colección altamente curada de 14.795 transcritos de 13.142 genes (www.ncbi.nlm.nih.gov/CCOSI). Para la inclusión en la CCOS, las coordenadas genómicas que definen la secuencia codificante transcrita deben ser idénticas en las bases de datos Ensembl y RefSeq. Los transcritos deben tener codones de inicio y de terminación canónicos y sitios de corte y empalme consenso, no tener codones de terminación en fase y ser traducibles a partir de la secuencia del genoma de referencia sin desplazamiento de fase. Finalmente, los transcritos CCOS deben soportarse por homología de transcritos y proteínas y conservación entre-especies. Se examinaron todos los transcritos CCOS y se excluyeron aquellos que estaban localizados en sitios múltiples en el genoma a través de duplicación génica (113 transcritos) o que estaban presentes en el cromosoma Y (21 transcritos adicionales) (fig. S1). Los 14.661 transcritos CCOS restantes de 13.023 genes se seleccionaron para análisis mutacional.
Recursos bioinformáticos. Los genes CCOS y coordinadas de transcritos (publicación 1, 3/02/05) secuencias del genoma humano y polimorfismo de un único nucleótido se obtuvieron del Sitio USCS Santa Cruz Genome Bioinformatics (http://genome.ucsc.edu). Se realizaron búsquedas de homología en los genomas humano y de ratón usando la herramienta de alineamiento BLAT similar a BLAST (S1) y PCR In Silico (http://genome.ucsc.edu/cqi-bin/hqPcr). Todas las posiciones genómicas correspondían a la secuencia genómica humana de Santa Cruz UCSC hg17 build 35.1. Los SNP de -3.4 M de la dbSNP (publicación 125) que se habían validado a través del proyecto HapMap (S2) se usaron para retirar automáticamente los polimorfismos conocidos.
Diseño de cebadores. Para cada trascrito, se extrajeron las secuencias genómicas que comprendían toda la región codificante de cada exón así como las secuencias intrónicas flanqueantes y las secuencias 5’UTR y 3’ UTR. Se crearon pares de cebadores para la amplificación PCR y secuenciación de cada exón codificante, usando Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cqi-bin/primer3/primer3 www.cqi)(S3). Se necesitaron cebadores PCR directo e inverso localizados no más de 50 pb con respecto a los límites del exón diana y se evitaron posiciones genómicas con polimorfismos conocidos en las cinco bases más 3’ de los cebadores. Se analizaron exones con un tamaño mayor de 350 pb como amplicones de solapamiento múltiple. Los productos de la PCR se diseñaron con respecto a un intervalo de tamaño de 300 a 600 pb, considerado óptimo para la amplificación, purificación y secuenciación. Para minimizar la amplificación de secuencias genómicas homólogas, se filtraron pares de cebadores usando PCR in silico UCSC y solamente se usaron los pares que produjeron un producto sencillo. 0,33 Mb (-1,5 %) de la secuencia genómica diana se excluyó del análisis posterior debido a la ausencia de cebadores de amplificación y secuenciación adecuados. Un total de 135.482 pares de cebadores que incluían -21 Mb de la secuencia diana se diseñaron con éxito. Un cebador de secuenciación universal (M13 directo, 5’-GTAAAACGACG-GCCAGT-3’; SEC ID Nº: 1) se agregó al extremo 5’ del cebador en el par con el número más pequeño de repeticiones mono- y dinucleotídicas entre él mismo y el exón diana. Las secuencias de cebadores se indican en la Figura 8; Tabla S1.
Muestras de tumor. Las muestras de ADN de líneas celulares de carcinoma de mama ductal y tejido mamario normal emparejado o líneas de sangre periférica se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Manassas, VA) o de A. Gazdar (S4, S5). Las muestras de ensayo de tejido quirúrgico de tumor de mama primario y normal circundante aisladas de pacientes con nodos positivos de los hospitales Palmetto Health Richland o Baptist se obtuvieron a través del Banco de Tejidos del Centro del Cáncer de Carolina del Sur. Cada muestra de tejido se ultra congeló a los 30 minutos de la escisión y se conservó a -80 ºC. Los tumores colorrectales extraídos quirúrgicamente se separaron y se implantaron en ratones desnudos o en condiciones de cultivo in vitro como se ha descrito anteriormente (S6, 57). Se preparó ADN en 3 pases después del establecimiento del xenoinjerto. Las características de las muestras tumorales usadas en este estudio se indican en las Figuras 9-10; Tablas S2A y S2B. En este estudio no se usaron tumores con deficiencia de reparación coincidente como se valora con marcadores microsatélite convencionales (S8); dichos tumores se excluyeron debido a sus tasa de mutación de fondo mucho más elevadas. Todas las muestras se obtuvieron de acuerdo con el Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA).
Microdisección por captura con láser. Secciones de 20 μm de tejidos de tumor de mama primario congeladas instantáneamente embebidas en OCT se depositaron en portaobjetos Sigma silane-prep™ y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las células tumorales se separaron del tejido circundante y se recuperaron sobre un film de transferencia por microdisección por captura con láser (PixCell® lie, Arcturus). El ADN genómico se purificó a partir de aproximadamente 20 portaobjetos para cada muestra usando el kit ADN Micro QIAamp® de Qiagen™ de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Amplificación de todo el genoma. La amplificación de todo el genoma se usó para proporcionar cantidades suficientes de ADN para la Exploración de Validación. Brevemente, se desnaturalizaron 5-20 ng de ADN molde con KOH 5 M, se neutralizaron y se incubaron a 30 ºC durante 16-24 horas con tampón 4x REPLI-g y ADN polimerasa REPLI-g de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). Las muestras se incubaron a 65 ºC durante 3 minutos para inactivar la enzima antes de conservar a 20 ºC. Para cada muestra, se agrupó un mínimo de 5 reacciones WGA independientes para reducir los efectos de cualquier sesgo alélico o de locus que pudiese producirse durante la amplificación.
Confirmación de la identidad de la muestra. Las identidades de la muestra de ADN se controlaron a través de las Exploraciones de Descubrimiento y Validación por amplificación PCR y secuenciación del exón 3 del gen del complejo de histocompatibilidad mayor HLA-A (cebador directo 5’CGCCTTTACCCGGTTTCATT-3’, SEC ID Nº: 2; cebador inverso 5’-CCAATTGTCTCCCCTCCTTG-3’, SEC ID Nº: 3). Además, el emparejamiento de todos los pares normales-tumorales se confirmó tipificando nueve locus STR (TPOX, chr 2p23-ter; D3S1358, chr3p; FGA, chr4q28; D8S1179, chr8; TH01, chr1 1p15.5; vWA, chr12p12-ter; Penta E, chr15q; D18S51, chr18q21.3; 021 S11, chr21 q1121) usando el Sistema PowerPlex 2.1 (Promega, Madison, WI).
Amplificación PCR y secuenciación. Todos los cebadores los sintetizó Invitrogen (San Diego, CA). La PCR se realizó en 5 reacciones III que contenían 1 x Tampón PCR (TrisHCl 67 mM, pH 8,8, MgCb 6,7 mM, NH4SO4 16,6 mM, 2-mercaptoetanol 10 mM), los dNTP 1 mM (Invitrogen, San Diego, CA), cebadores directo 1 11 M e inverso 1 11 M, DMSO al 6 %, ATP 2 mM, 0,25 U de Platinum Taq (Invitrogen, San Diego, CA) y 3 ng de ADN. Las reacciones se realizaron en termocicladores ABI9700 de 384 pocillos (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando un protocolo PCR touchdown (1 ciclo de 96 ºC durante 2 min; 3 ciclos de 96 ºC durante 10 s, 64 ºC durante 10 s, 70 ºC durante 30 s; 3 ciclos de 96 ºC durante 10 s, 61 ºC durante 10 s, 70 ºC durante 30 s; 3 ciclos de 96 ºC durante 10 s, 58 ºC durante 10 s, 70 ºC durante 30 s; 41 ciclo de 96 ºC durante 10 s, 57 ºC durante 10 s, 70 ºC durante 30 s; 1 ciclo de 70 ºC durante 5 min). Los moldes se purificaron usando AMPure (Agencourt Biosciences, Beverly, MA) y la secuenciación se realizó con el cebador directo M 13 (5’GTAAAACGACGGCCAGT-3’; SEC ID Nº: 1) y el Kit Big Dye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se incluyó DMSO al 1 % en las reacciones de secuenciación cuando el contenido de GC del molde superaba el 65 %. Los Dye Terminators se eliminaron usando el kit CleanSEQ (Agencourt Biosciences, Beverly, MA) y las reacciones de secuencia se delinearon sobre el aparato de secuenciación ABI PRISM 3730x1 (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Ensamblaje de secuencias y análisis de mutaciones. Se alinearon trazas de secuencias de muestras de ADN tumorales y normales con las secuencias de referencia genómicas. Para considerar que un amplicón estaba secuenciado con éxito, se necesitó que al menos tres cuartas partes de los tumores tuviesen 2´90 % de las bases en la región diana con una puntuación de calidad Phred de 20 o mejor. Los amplicones que no cumplían estos criterios no se analizaron posteriormente. Se realizó análisis mutacional en todas las secuencia exónicas codificantes y en las 4 pb flanqueantes de las secuencias intrónicas o UTR usando Surveyor Mutation (Softgenetics, State College, PA) acoplado a una base de datos relacional (Servidor Microsoft SQL). Para las exploraciones de Descubrimiento y Validación, se emplearon las siguientes etapas básicas para identificar mutaciones de interés. En primer lugar, se identificaron los cambios sinónimos y se excluyeron de análisis posterior. En segundo lugar, los cambios no sinónimos y las muestras tumorales se descartaron si se presentaba un cambio idéntico en una muestra de ADN normal. En tercer lugar, se eliminaron los polimorfismos de un único nucleótido conocidos por comparación con una base de datos de entradas dbSNP previamente validada por el proyecto Hap Map. Finalmente, los artefactos positivos falsos se eliminaron por inspección visual de cromatogramas de cada muestra con una supuesta mutación. Las etapas adicionales se describen más adelante.
Exploración de Descubrimiento de Mutaciones. Los cebadores diseñados anteriormente se usaron para amplificar todos los exones CCDS conocidos de 11 muestras de cáncer colorrectal, 11 muestras de cáncer de mama y dos muestras de ADN normales emparejadas. Esto dio como resultado un total de -3,25 millones de reacciones PCR, que comprenderían 465 Mb de secuencias derivadas de tumores así como un total de 42 Mb de secuencias normales de las dos muestras de ADN normales emparejadas. Después del ensamblaje de secuencias y análisis mutacional, cada supuesto cambio no sinónimo observado se confirmó en una reacción PCR independiente usando el mismo par de cebadores. Después de la confirmación, el ADN procedente de un tejido normal del mismo paciente se usó para determinar si la mutación observada era un acontecimiento somático verdadero en lugar de una variante de línea germinal. Cuando se observó la misma supuesta mutación en muestras tumorales múltiples, solo se usó una muestra de tumor sencilla y una muestra normal emparejada inicialmente para confirmar la mutación y su mutación somática. Si se confirmaba, el ADN procedente de otros tumores que contenía la misma mutación somática se evaluaba de manera similar. Para excluir la posibilidad de que pudiesen producirse supuestas mutaciones somáticas por amplificación de secuencias homólogas pero no idénticas, se usó BLAT (58) para buscar estas secuencias contra el genoma humano. Este examen garantizaba que el cambio nucleotídico no estuviese presente en una región altamente relacionada en el genoma humano. Para supuestas mutaciones somáticas encontradas en tumores xenoinjertados, se usó BLAT para buscar de manera similar el genoma de ratón para excluir la contribución de secuencias de ratón homólogas.
Exploración de Validación de Mutaciones. Cada encontrado mutado en la Exploración de Descubrimiento se analizó adicionalmente por amplificación y secuenciación de 24 muestras tumorales adicionales del mismo tipo tisular. Debido a las cantidades limitantes de ADN de muestra, el conjunto de 24 tumores evaluados cambió con el
tiempo. Se investigaron todas las variantes transcritas CCDS del gen de interés usando pares de cebadores que produjeron secuencias informativas en la Exploración de Descubrimiento. La detección de la mutación, confirmación de alteraciones y determinación del estado somático se realizó como se ha indicado anteriormente con la excepción de que todas las variantes de línea germinal previamente observadas en las muestras de ADN normal de la Exploración de Descubrimiento se consideraron que eran variantes conocidas (Figura 1).
Análisis estadístico
Puntuaciones CaMP. Para ayudar a identificar genes que mutaban más frecuentemente de lo que podría esperarse en ausencia de selección, primero se calculó la probabilidad de que un gen determinado mutase el número de veces observado dada la frecuencia de mutación de fondo. La frecuencia de mutación de fondo en cánceres de mama y colorrectales se ha determinado previamente que es menor de 1,2 mutaciones por Mb (59-511). La comparación de la frecuencia de mutaciones sinónimas frente a no sinónimas puede ser un indicador útil de genes que han experimentado selección, ya puede suponerse que las mutaciones sinónimas son generalmente no funcionales (511-515). Sin embargo, se detectaron relativamente pocas mutaciones en la mayoría de genes en muchos de los tumores estudiados, lo que condujo a un amplio límite de confianza en este parámetro. Por tanto se usó una combinación de validación experimental y un cálculo de la tasa de mutación de fondo para identificar aquellos genes que más probablemente habían experimentado selección.
Para corregir la influencia de la composición de nucleótidos sobre la posibilidad de mutación, se supuso que el espectro de mutación observado en este estudio no era diferente al de las mutaciones de fondo no seleccionadas y que ambos eran un resultado del mismo proceso subyacente y de exposiciones a agentes exógenos. La siguiente tabla muestra la frecuencia de mutación de fondo por Mb en cada uno de los seis contextos de nucleótidos y posiciones analizadas. Por ejemplo, en las Exploraciones de Descubrimiento y Validación en cánceres colorrectales, se observó que las mutaciones en 5’-CpG-3’ eran 6,44 más frecuentes que la frecuencia de mutaciones en todas las posiciones combinadas. Por lo tanto, se calculó que la frecuencia de mutación de fondo esperada en los sitios 5’-CpG-3’ era de 6,44 x 1,2 = 7,73 mutaciones por millón de pb.
Frecuencias de mutación de fondo calculadas por millón de pb
5’-CpG-3’
5’-TpC-3’ A C G T INS/DEL/DUP
Colorrectal
7,73 0,96 0,56 0,95 0,85 0,51 0,55
Mama
2,99 2,48 0,76 1,38 1,07 0,30 0,55
Para cada gen y tipo tumoral, el número de sitios dinucleotídicos secuenciados con éxito 5’-CpG-3’ y 5’-TpC3’ (o 5’-GpA-3’ complementario) y mononucleótidos A, C, T y G se denominaron NcpG, NTpC, NA, Nc, NG y NT, respectivamente. Nc no incluyó las C en los dinucleótidos 5’-CpG o 5’-TpC y NG no incluyó las G en los dinucleótidos 5’-CpG-3’ o 5’GpA-3. Obsérvese que las mutaciones en los sitios 5’-TpC-3’ eran casi siempre en el resto C y las mutaciones en los sitios 5’-GpA-3’ complementarios eran casi siempre en el resto G, lo que explica porque los A y las T no necesitaban corregirse con respecto a su presencia en los dinucleótidos. Después, se calculó la probabilidad de un gen que tiene el número de mutaciones observadas en un sitio particular con una distribución binomial exacta. Por ejemplo, los parámetros para este cálculo para la categoría 5’-CpG-3’ usaron el número de mutaciones observadas en los sitios 5’-CpG-3’ como el número de acontecimientos positivos, NcpG como el número de ensayos independientes y las frecuencias de mutación de fondo para NcpG indicadas en la tabla anterior (7,73 x 10-6 para cánceres colorrectales) como la probabilidad de un resultado positivo en cada ensayo. Las probabilidades de un gen que tiene el número de mutaciones observadas en cada uno de los otros cinco dinucleótidos o mononucleótidos se calculó de manera similar. La probabilidad de que un gen contenga el número de inserciones, deleciones o duplicaciones (INS/DEL/DUP) observadas se calculó usando una distribución binomial con los siguientes parámetros: número de acontecimientos INS/DEL/DUP observados como el número de acontecimientos positivos, nucleótidos totales secuenciados con éxito dentro del gen como el número de ensayos independientes y 0,55 x 10-6 como la probabilidad del resultado positivo en cada ensayo. Obsérvese que cada uno de estas siete probabilidades se consideró que era dependiente. La probabilidad de un gen que tiene el número de mutaciones observadas en las posiciones observadas se calculó después que era el producto de las siete probabilidades específicas del contexto de nucleótidos.
Dado que se evaluaron 13.023 genes para mutaciones, fue necesario corregir estas probabilidades por comparaciones múltiples. Con este fin, se usó el algoritmo descrito por Benjamini y Hochberg (S16). Los genes se clasificaron en orden ascendiente, asignando un 1 al gen con la probabilidad más baja de tener el número de mutaciones observadas en el, un 2 al gen con la siguiente probabilidad más baja, etc. La puntuación CaMP para cada gen se definió después como -log10( 13,023 * PROB/RANK), en la que PROB es la probabilidad de tener el número de mutaciones observadas y RANK representa su posición numérica en la lista. Los autores disponen, a petición, de una hoja de cálculo de Microsoft Excel™ que calcula automáticamente las puntuaciones CaMP para genes individuales o múltiples.
Significado estadístico de los datos en las Figuras 5-6 (Tablas 1 y 2) y Figura 15 (fig. S1). Para determinar si el número de mutaciones observadas en todo el conjunto de cánceres de mama y colorrectales difería significativamente del número de mutaciones esperado (Fig. 5; Tabla 1), se usó un ensayo sencillo de distribución binomial, empleando una probabilidad de 1,2 x 10-6 como la tasa de fondo. El espectro de mutaciones se comparó en cánceres de mama y colorrectales (Fig. 6; Tabla 2) usando un ensayo de Chi al Cuadrado.
El espectro de codones afectados por mutación (Fig. 15; fig. S 1) también se analizó con un ensayo de Chi al Cuadrado.
Cálculo de mutaciones no sinónimas en el genoma del cáncer. El número total de genes que contienen mutaciones no sinónimas en un cáncer típico colorrectal o de mama se calculó de la siguiente manera. Aunque el número real de genes codificantes de proteínas en el genoma humano continua siendo objeto de debate, hay 5180 genes para los cuales existen excelentes pruebas de refuerzo y que forman parte de RefSeq (S17) pero que aún no se incluyen en la base de datos CCOS. Se supone que la frecuencia de mutación en genes que aún no se han secuenciado es similar a los genes ya secuenciados. Adicionalmente, no se ha podido secuenciar con éxito -10 % de las bases dentro de las secuencias codificantes de los 13.023 genes CCOS (equivalente a 1.302 genes no secuenciados). Por lo tanto se calcula que se ha secuenciado con éxito el 64 % de los 18.203 genes codificantes de proteínas en el genoma humano (13023 - 1302)/(13023 + 5180). Dado que se ha identificado un promedio de 60 genes mutados por tumor en los genes ya secuenciados, podría esperarse que 93 genes (6010.64) estén mutados en todo el compendio de genes codificantes de proteínas en un cáncer típico.
Referencias
En el presente documento se incorpora la descripción de cada referencia citada.
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15 Jones, Sian Wood, Laura Parsons, D. Williams Lin, Jimmy Barber, Thomas Mandelker, Diana Vogelstein, Bert Kinzler, Kenneth W. Velculescu Bictor E.
25 <120> SECUENCIAS CONSENSO CODIFICANTES DE CÁNCERES DE MAMA Y COLORRECTALES
<130> 201107.00002
<140> PCTUS0717866
<141>
<150> 60/842363
<151>
35 <150> 60/836944
<151>
<160> 57
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 17
<212> ADN 45 <213> Homo sapiens
<400> 1 gtaaaacgac ggccagt 17
<210> 2
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
55 <400> 2 cgcctttacc cggtttcatt 20
<210> 3
<211> 20
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 3
ccaattgtct cccctccttg 20 65
5
<210> 4 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 4 ggaagggtgt gaga 15
10
<210> 5 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens
15
<400> 5 ggaagggtgt gaga
15
20
<210> 6 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 6 gaggaagaag ag
12
25
<210> 7 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
30
<400> 7 gaggaagaag ag 12
35
<210> 8 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens
40
<400> 8 ggcggccgcg gcggcagtgg cggcggcggc ggcggc 36
45
<210> 9 <211> 36 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 9 ggcggccgcg gcggcagtgg cggcggcggc ggcggc
36
50 55
<210> 10 <211> 16 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 agtgttccca acatat 16
60
<210> 11 <211> 16 <212> ADN <213> Homo sapiens
65
<400> 11 agtgttccca acatat 16
5
<210> 12 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 12 gacaaggaca 10
<210> 13 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens
15
<400> 13 gacaaggaca 10
<210> 14 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 14 caaaatccag
10
25
<210> 15 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 15 caaaatccag
10
35
<210> 16 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 16 tcagctcgtc aa
12
45
<210> 17 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 17 tcagctcgtc aa 12
<210> 18 <211> 14 <212> ADN <213> Homo sapiens
55
<400> 18 ttgtggtaag ttat 14
<210> 19 <211> 14 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 19 ttgtggtaag ttat
14
65
<210> 20 <211> 21
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 20 5 ttaacggtaa ggtgctgttg t 21
<210> 21
<211> 22
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 21 tttaacggta aggtgctgtt gt 22
15 <210> 22
<211> 23
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 22 gaggataaag ttttaactgt ggt 23
<210> 23
<211> 23 25 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 23 gaggataaag ttttaactgt ggt 23
<210> 24
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens 35
<400> 24 caacctgact tcccggggca tgga 24
<210> 25
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 25 45 caacctgact tcccggggca tgga 24
<210> 26
<211> 12
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 26 tatctgaact tg 12
55 <210> 27
<211> 12
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 27 tatctgaact tg 12
<210> 28
<211> 19 65 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 28 aagaaaaact tgtcatcag
19
5
<210> 29 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 29 aagaaaaact tgtcatcag
19
15
<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 30 ctttgtacag gagaatatta
20
<210> 31 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens
25
<400> 31 ctttgtacag gagaatatta 20
<210> 32 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens
35
<400> 32 tttttggata ggtattggtg gatttatggt gcggcaaaga <210> 33 <211> 40 <212> ADN <213> Homo sapiens 40
<400> 33 tttttggata ggtattggtg gatttatggt gcggcaaaga
40
45
<210> 34 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 34 cttgtacaat taatggcaca tgga
24
55
<210> 35 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 35 cttgtacaat taatggcaca tgga
24
<210> 36 <211> 53 <212> ADN <213> Homo sapiens
65
<400> 36 agcacagctt gctttggggt caaacgtgga tcagcagcct cttggtcagt aaa 53
5
<210> 37 <211> 53 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 agcacagctt gctttggggt caaacgtgga tcagcagcct cttggtcagt aaa 53
<210> 38 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
15
<400> 38 cactgcatcc cc 12
<210> 39 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 39 cactgcatcc cc
12
25
<210> 40 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 40 ttcctaagtg ga
12
35
<210> 41 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 41 ttcctaagtg ga
12
45
<210> 42 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 42 tcctcctgct 10
<210> 43 <211> 10 <212> ADN <213> Homo sapiens
55
<400> 43 tcctcctgct 10
<210> 44 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 44 acagaatcct gaagg
15
65
<210> 45 <211> 15
<212> ADN <213> Homo sapiens
5
<400> 45 acagaatcct gaagg 15
<210> 46 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 46 agggcatcat ggaggaggat gaggcctgcg ggcgccagta ca
42
15
<210> 47 <211> 42 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 47 agggcatcat ggaggaggat gaggcctgcg ggcgccagta ca
42
25
<210> 48 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 48 gtgtttgtaa gc
12
35
<210> 49 <211> 12 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 gtgtttgtaa gc 12
<210> 50 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens
45
<400> 50 ccatgatcct gtctgcggt 19
<210> 51 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 51 ccatgatcct gtctgcggt
19
55
<210> 52 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 52 tgctggacta accct
15
65
<210> 53 <211> 15 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 53 tgctggacta accct 15
<210> 54 5 <211> 11
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 54 10 ttttaatagc t 11
<210> 55
<211> 11
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 55 ttttaatagc t 11
20 <210> 56
<211> 25
<212> ADN
<213> Homo sapiens
25 <400> 56 tgaacacgca ccctgataag ctgcg 25
<210> 57
<211> 25 30 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 57 tgaacacgca ccctgataag ctgcg 25 35

Claims (11)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un procedimiento de diagnóstico de cáncer de mama en un ser humano, que comprende las etapas de:
    determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática humana en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados; e identificar la muestra como cáncer de mama cuando se determina la mutación somática.
  2. 2.
    Un procedimiento para estratificar cánceres de mama para ensayar agentes terapéuticos anticancerosos candidatos o conocidos, que comprende las etapas de:
    determinar una firma mutacional de genes CAN para un cáncer de mama determinando al menos una mutación somática en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal de un ser humano, en el que la al menos una mutación somática está en un gen ABCA3; formar un primer grupo de cánceres de mama que tengan la firma mutacional de genes CAN; comparar la eficacia de un agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido sobre el primer grupo con la eficacia sobre un segundo grupo de cánceres de mama que tiene una firma mutacional de genes CAN diferente; identificar una firma mutacional de genes CAN que se correlacione con una eficacia aumentada o disminuida del agente terapéutico anticanceroso candidato o conocido con respecto a otros grupos.
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la firma mutacional de genes CAN comprende al menos 2 genes, seleccionados de la Figura 13 (Tabla S5).
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido mamario, y en el que la muestra normal es una muestra de tejido mamario.
  5. 5.
    Un procedimiento de caracterización de un cáncer de mama en un ser humano, que comprende las etapas de:
    determinar en una muestra de ensayo con respecto a una muestra normal del ser humano, una mutación somática en un gen ABCA3 o su ADNc o proteína codificados.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 5 en el que la muestra de ensayo es una muestra de tejido mamario o una metástasis de cáncer de mama sospechosa, y en el que la muestra normal es una muestra de tejido mamario.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en el que la mutación se selecciona de las mostradas en la Fig. 12 (Tabla S4).
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 2 en el que la al menos una mutación se selecciona de las mostradas en la Fig. 12 (Tabla S4).
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución L290M.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución H1069Q.
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 1, 2 o 5 en el que la mutación provoca una sustitución E801D.
    Tránsito intracelular
    Cuando los registros CCDS múltiples derivan del mismo gen, los cebadores de exones compartidos se enumeran con el registro CCDS con el número ordinal más bajo. Los exones codificantes mayores de 350 pb se amplificaron y se secuenciaron con pares de cebadores múltiples. Posición del extremo 5' del cebador PCR directo con respecto a la primera base del exón. indica el cebador de secuenciación universal 5'-GTAAAACGACGGCCAGT3'. Los números sin firma indican la posición del extremo 3' del cebador PCR inverso con respecto a la primera base del exón. Los signos positivos indican la posición el extremo 3' del cebador PCR inverso con respecto a la última base de este exón. El primer cebador no cumplió el criterio de calidad de que 90 % de bases en la región diana tenga una puntuación de calidad Phred de al menos 20 en tres cuartas partes de las muestra tumorales analizadas en la Exploración de Descubrimiento.
    Fig. 9. Tabla S2A Características de las muestras de cáncer colorrectal
    ID
    Edad Sexo Procedencia Localización del tumor Estado Tipo de muestra Exploración
    del paciente
    del tejido original clinico
    (años)
    Co74
    35 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Línea celular Descubrimiento
    Co92
    46 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Línea celular Descubrimiento
    Co108
    77 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Línea celular Descubrimiento
    Mx22
    66 F Metástasis hepática Desconocida IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx27
    74 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx30
    62 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx32
    56 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx3B
    67 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx41
    57 M Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx42
    72 M Metástasis hepática Colon del lado izquierdo IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Mx43
    72 M Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Descubrimiento
    Co79
    81 M Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho IV Línea celular Validación
    Co82
    80 F Tumor colorrectal primario Colon del lado derecho IV Línea celular Validación
    Co84
    40 M Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho III Línea celular Validación
    Co94
    46 M Metástasis de nodulo linfático Recto IV Línea celular Validación
    Mx3
    64 M Tumor colorrectal primario Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación
    Mx8
    65 M Tumor colorrectal primario Rectal IV Xenoinjerto Validación
    Mx26
    45 F Metástasis hepática Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación
    Mx29
    51 M Metástasis hepática Colon del lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación
    Mx31
    50 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación
    Mx34
    82 F Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho IV Xenoinjerto Validación
    Mx35
    57 F Metástasis pulmonar Recto IV Xenoinjerto Validación
    Mx40
    75 F Metástasis de nodulo linfático Colon del lado derecho III Xenoinjerto Validación
    Mx45
    67 F Metástasis hepática Colon transverso IV Xenoinjerto Validación
    HxO05
    62 F Metástasis hepática Flexura esplénica IV Xenoinjerto Validación
    Hx169
    68 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación
    Hx172
    69 F Metástasis hepática Desconocida IV Xenoinjerto- Validación
    HX174
    73 F Metástasis hepática Colon sigmoide IV Xenoinjerto Validación
    Hx185
    39 F Metástasis hepática Recto Colon sigmoide IV Xenoinjerto Validación
    Hx188
    60 M Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación
    Hx189
    72 M Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación
    Hx190
    73 M Metástasis hepática Lado derecho IV Xenoinjerto Validación
    Hx206
    54 M Metástasis hepática Recto IV Xenoinjerto Validación
    Hx218
    56 F Metástasis hepática Lado izquierdo IV Xenoinjerto Validación
    Hx219
    69 M Metástasis hepática Ciego IV Xenoinjerto Validación
    Hx220
    83 F Metástasis hepática Lado derecho IV Xenoinjerto Validación
    Hx223
    45 F Metástasis hepática Recto sigmoide IV Xenoinjerto Validación
    Fig. 10.Tabla S2B. Caracerísticas de las muestras de cancer de mama
    ID
    Edad del paciente Tipo de Procedencia Estado Estado Estado Estado Tipo de muestra Exploración
    (años)
    adenocarcinoma del tejido RE* RP* Mer-2/neu*
    HCC1008
    67 Ductal Nódulo linfáticoe IIA - - +++ Línea celular Descubrimiento
    HCC1BS4
    61 Ductal Tumor mamario primario IIA - - N/D Línea celular Descubrimiento
    HCC38
    SO Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC1143
    52 Ductal Tumor mamario primario IIA - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC1187
    41 Ductal Tumor mamario primario IIA - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC139S
    43 Ductal Tumor mamario primario 1 - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC1S99
    44 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC1837
    24 Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Línea celular Descubrimiento
    HCC21S7
    48 Ductal Tumor mamario primario IIIA - + ++ Línea celular Descubrimiento
    HCC2218
    38 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - +++ Línea celular Descubrimiento
    Hs57BT
    74 Carcinosarcoma Tumor mamario primario N/D - - + Línea celular Descubrimiento
    HCC2713
    35 Ductal Tumor mamario primario I - N/D ++ Línea celular Validación
    BB1T
    51 Ductal Tumor mamario primario IIIC - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB2T
    51 Ductal Tumor mamario primario IIA + - ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB3T
    56 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB4T
    52 Lobulillar Tumor mamario primario IIIA + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB5T
    42 Ductal Tumor mamario primario IIIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB7T
    59 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB9T
    47 Ductal Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BBIOT
    55 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB12T
    58 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB13T
    63 Ductal Tumor mamario primario IIIC - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB14T
    74 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB15T
    79 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB16T
    40 Ductal Tumor mamario primario IIB + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB18T
    53 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB20T
    83 Ductal Tumor mamario primario IIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB21T
    77 Ductal Tumor mamario primario IIIA + + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB22T
    SO Ductal Tumor mamario primario IIIC + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB23T
    46 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIIC + - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB24T
    66 Ductal Tumor mamario primario IIA - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB27T
    46 Ductal Tumor mamario primario IIIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB28T
    47 Ductal Tumor mamario primario IIIA - + - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB2BT
    54 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB30T
    60 Ductal Tumor mamario primario IIB - - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB31T
    56 Ductal Tumor mamario primario IIIA - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB32T
    52 Ductal Tumor mamario primario IIA + - + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB33T
    36 Ductal Tumor mamario primario IV + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB34T
    38 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    8B3ST
    67 Ductal Tumor mamario primario IV + + N/D Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB36T
    60 Ductal Tumor mamario primario IIB - - ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB37T
    47 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    B838T
    39 Ductal Tumor mamario primario IIB + + ++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB39T
    39 Lobulillar Tumor mamario primario IIB + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB40T
    43 Ductal Tumor mamario primario IIA + - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB42T
    56 Ductal Tumor mamario primario IIB - - - Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB43T
    54 Ductolobulillar Tumor mamario primario IIIA + + +++ Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    BB44T
    46 Ductolobulillar Tumor mamario primario I + + + Tejido tumoral microdiseccionado Validación
    *El estado del receptor de estrógenos (RE) y del receptor de progesterona (RP) se determina por inmunoestioquímica. -, negativo; +, positivo; *Estado Her-2/neu: -, negativo; +, poco positivo; ++ moderadamente positivo o +++ muy positivo; N/D, datos no disponibles
    ll ll
    ll ll
    (homocigoto)
    (homocigoto)
    Las posiciones genómicas son coordenadas en el documento de publicación del genoma humano 35.1UCSB de Santa Cruz mayo 2004, hg17. Las coordenadas se secuencian genómicas de las mutaciones están en la cadena codificante. Todos los cambios son heterocigotos salvo los indicados como homocigotos. g secuencia genómica; p secuencia de ADNc, s secuencia de proteína, del deleción, dup duplicación, ins. Inserción. chr cromosoma; las mutaciones en las secuencias no codificantes se anotan mediante un número intrónico precedido por IVS, comenzando con números positivos desde el sitio donante de corte y empalme G de GT y los números negativos comenzando desde el sitio aceptor de corte y empalme G del AG. FS mutación con desplazamiento de la fase de lectura; sp. Mutación en el sitio de corte y empalme; UTR, mutación en la región 5' o 3' no traducida; indel., insección en marco, deleción o cambio de duplicación que afectan a más de un solo codon. El cambio de aminoácido resultante de mutaciones en la metionina iniciadora de la traducción se indican como "desconocido".
    La fracción de los 35 tumores de mama evaluados en las exploraciones de descubrimiento y valoración contiene mutaciones de los genes dividido entre el número de bases secuenciadas con éxito en ese gen (es decir, bases con puntuación de calidad Phred ≥ 20).
    La fracción de los 35 tumores colorrectales evaluada en las exploraciones de descubrimiento y valoración contiene mutaciones de los genes dividido entre el número debases secuenciadas con éxito en ese gen (es decir, bases con puntuación de calidad Phred ≥ 20).
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