BRPI0610816B1 - Method of producing a transgenic maize plant with enhanced asparagin, corn flour with increased protein and food made from themselves - Google Patents

Abstract

semente e planta de milho transgênicas, método de produzir a referida planta, farinha de milho com proteína aumentada e alimento. a presente invenção refere-se a uma semente e planta de milho com níveis realçados de proteína e aminoácidos. a invenção da mesma forma se refere ao constructo de dna que fornece expressão em células de milho transgênicas de uma enzima de asparagina sintetase. os constructos de dna são empregados em um método para produzir sementes e plantas de milho transgênicas para selecionar plantas e sementes com níveis realçados de proteína e aminoácidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE PRODUZIR UMA PLANTA DE MILHO TRANSGÊNICA COM ASPARAGI-NA AUMENTADA, FARINHA DE MILHO COM PROTEÍNA AUMENTADA E ALIMENTO FEITO A PARTIR DA MESMA".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório dos Estados Unidos Série N° 60/681,348 depositado em 16 de maio de 2005, a descrição total do qual está aqui incorporada por referência, 1 Campo da Invenção A presente invenção refere-se de modo geral ao campo de biotecnologia de planta e mais especifica mente ao realce de asparagina e proteína em plantas e semente de milho. 2. Descrição da Técnica Relacionada Os fazendeiros e consumidores desejam plantas de colheita com características agronômicas melhoradas tal como produção aumentada, produção de proteína de semente aumentada, e composição nutricional melhorada. Os componentes nutricionais desejáveis de plantas de colheita incluem, entre outros, fibra, antioxidantes tal como Vitamina E, selênio, ferro, magnésio, zinco, vitaminas B, lignans, ácidos fenólicos, aminoácidos essenciais, e fitoestrogênios. Embora esforços consideráveis em reprodução de planta tenham fornecido alguns ganhos nestas características desejadas, a capacidade de introduzir DNA não hospedeiro específico em um genoma de planta fornece outras oportunidades de geração de plantas com estas características, Em particular, ao mesmo tempo em que a produção de milho convencional aumentou continuamente durante os anos, não houve um aumento similar na capacidade de plantas de milho assimilar nitrogênio mais eficazmente ou aumentar o teor de proteína da semente. A disponibilidade de nitrogênio tem um impacto positivo signifi-cante na produtividade de planta, biomassa, e produção de colheita incluindo a produção de proteína de semente. Nas plantas, o nitrogênio inorgânico é assimilado do solo, reduzido à amônia, e incorporado em nitrogênio orgânico na forma da asparagina de aminoácidos transportando nitrogênio, glutamina, ácido aspártíco e ácido glutâmico, A asparagina (Asn) é a molécula de transporte de a mi da preferida por causa de sua relação elevada de nitrogê- nio para carbono (2N:4C versus 2N:5C) e porque ela e relativamente inerte. Asn e outros aminoácidos também são empregados quando construindo blocos para síntese de proteína.

Em plantas, Asn é sintetizada de glutamina, aspartato e ATP, em uma reação catalisada pela enzima asparagina sintetase (AsnS). O glutama-to, AMP e pirofosfato são formados como subprodutos, Duas formas de AsnS foram descritas: uma forma dependente de glutamina e uma forma dependente de amônia. A AsnS dependente de glutamina pode catalisar ambas as reações dependentes de glutamine e dependentes de amônia embora a glutamina seja a fonte de nitrogênio preferida. A concentração elevada de proteína é considerada uma característica de qualidade importante para a maioria das colheitas principais, incluindo soja, milho, e trigo. As variedades de milho, trigo, e soja com alto teor de proteína, por exemplo, foram identificadas por reprodução tradicional. Entretanto, a maioria das linhagens de alto teor de proteína desenvolvida deste modo produziu retardamento ou outras desvantagens agronômicas. Seria desejável se o conteúdo de proteína de colheitas, especialmente milho, pudesse ser aumentado acima dos níveis atualmente disponíveis, tanto para consumo humano quanto para uso do produto em alimentos de animal. Isto oferecería o benefício de valor de nutriente grandemente realçado quando a colheita for empregada como comida e alimento para os seres humanos e animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um método e composições para tratamento de colheitas e outros produtos de planta para aumentar o conteúdo de proteína e aminoácido em plantas. O método e composições aumentam o nível de proteína e aminoácidos livres em tecidos de milho, particularmente em sementes. Mais especificamente, uma semente e planta de milho transgênica são fornecidas as quais contenham em seu genoma uma composição de DNA heterólogo que expresse um produto de gene envolvido em asparagina aumentada e biogênese de proteína aumentada. A expressão do produto realça o valor nutricional de fontes de milho de alimento e milho co- mestível e produtos processados derivados da semente de milho transgêni-ca ou partes desta.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para aumentar o conteúdo de proteína em uma planta de milho. Um constructo de DNA compreendendo uma sequência de poíinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1,3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, e 17 onde a molécula de poíinucleotídeo codifica um polipeptídeo de asparagina sinteta-se ou polipeptídeo tendo atividade de asparagina sintetase, também é incluída.

Em uma modalidade, a presente invenção compreende uma célula de planta de milho transformada com a composição de DNA heterólogo que codifica uma asparagina sintetase identificada como SEQ ID NO: 4. Mais especificamente, a expressão da molécula de poíinucleotídeo de AsnS2 de milho heterólogo (isozima 2 de asparagina sintetase) na planta de milho transgênica resulta em um nível elevado de asparagina e proteína na planta transgênica, por exemplo, nas sementes da planta de milho comparadas a uma planta de milho da mesma variedade que não expressa a molécula de poíinucleotídeo de AsnS2 de milho heterolólogo. A presente invenção também refere-se ao alimento de animal que compreende a semente acima mencionada com conteúdo de aminoáci-do ou proteína aumentado, ou um produto processado de tal semente, por exemplo, uma farinha. Consequentemente, a presente invenção também abrange uma semente de milho que contém uma enzima de asparagina sintetase produzida por expressão de um constructo de DNA heterólogo compreendendo uma molécula de DNA que codifica uma enzima de asparagina sintetase de milho. Uma modalidade de tal semente é grão colhido, a presente invenção também abrange farinha, glúten e outros produtos de milho feitos de tal grão. A presente invenção inclui seqüências iniciadoras de ácido nu-cléico que compreendem uma ou mais das SEQ ID NOs 18-45, ou o complemento disto. A presente invenção inclui um método para detectar ou identificar, no genoma de uma planta transformada ou progênie desta, uma mo- lécula de polinucleotídeo heteróloga que codifica um polipeptideo de AsnS de planta, ou um polipeptídeo de planta que tem atividade de AsnS da presente invenção, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ 1D NOs 18-45, onde a referida molécula de polinucleotídeo é empregada como um iniciador de DNA em um método de amplificação de DNA.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG. 1 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON79706. FIG. 2 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66229. FIG. 3 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66230. FIG. 4 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66231. FIG. 5 ilustra o mapa de plasmídeo de pMON66239. FIG. 6 é a expressão de transgene em eventos de pMON79706. As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança, com n=5 para eventos transgênicos e n=10 para controle congênito.

FIG. 7 é a expressão de transgene em eventos de pMON92870. As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança, com n>3 de plantas para eventos transgênicos e n=8 de planta para controle congênito. DESCRIÇÃO DO ÁCIDO NUCLÉICO E SEQÜÉNCIAS DE POLIPEPTÍDEO SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica . um AsnS1 de Zea mays. SEQ ID NO: 2 é um polipeptídeo de AsnS1 de Zea mays. SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS1 de Zea mays. SEQ ID NO: 4 é um polipeptídeo de AsnS2 de Zea mays. SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS3 de Zea mays. SEQ ID NO: 6 é um polipeptídeo de AsnS3 de Zea mays. SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Glycine max SEQ ID NO: 8 é um polipeptídeo de AsnS de Glycine max. SEQ ID NO: 9 é uma sequência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Xyleiia fastidiosa. SEQ ID NO: 10 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Xanthomonas campestrís. SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Bacilo halodurans. SEQ ID NO: 12 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Oryza sativa. SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Galdieria sulphuraria. SEQ ID NO: 14 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Galdieria sulphuraria. SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Galdieria sulphuraria. SEQ ID NO: 16 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS de Galdieria sulphuraria. SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de polinucleotídeo que codifica um AsnS CGPG3913 de Saccharomyces cerevisiae. SEQ ID NO: 18 é uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f) dianteira. SEQ ID NO: 19 é uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f) dianteira. SEQ ID NOs 20-43, são seqüências iniciadoras de PCR de AsnS ® reversas e (f) dianteiras primárias e secundárias empregadas em um procedimento de clonagem Gateway. SEQ ID NO: 44, uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f) dianteira. SEQ ID NO: 45, uma seqüência iniciadora de PCR de AsnS (f) dianteira. SEQ ID NO:46 iniciador de ZmAS de sentido. SEQ ID NO:47 iniciador de ZmAS de anti-sentido. SEQ ID NO: 48 iniciador dianteiro AsnS3 de milho. SEQ ID NO: 49 iniciador reverso de AsnS3 de milho.

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O seguinte é uma descrição detalhada da invenção fornecida para ajudar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo definido aqui, os termos devem ser considerados de acordo com uso convencional por aqueles de experiência ordinária na técnica relevante. As definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger e outros, 1991; e Lewin, 1994. A nomenclatura para bases de DNA apresentadas em 37 CFR § 1.822 é empregada. A nomenclatura de uma e três letras padrão para resíduos de ami-noácido é empregada. As modificações e variações nas modalidades descritas aqui podem ser feitas por aqueles de experiência ordinária na técnica sem afastar-se do espírito ou escopo da presente invenção. A presente invenção fornece um método para aumentar o conteúdo de proteína em uma planta de milho introduzindo-se no genoma de uma célula de planta de milho um polinucleotídeo heterólogo que expresse um polipeptídeo de AsnS na célula de planta transgênica. A presente invenção fornece constructos de DNA que compreendem (compreende significa "incluindo, porém não limitado a") moléculas de polinucleotídeo, ou segmentos de uma molécula de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo de AsnS, opcionalmente operavelmente ligados a um peptídeo de trânsito de cloro-plasto.

As moléculas de polinucleotídeo que codificam um polipeptídeo de AsnS ou analógico ou alelo deste, ou moléculas de polinucleotídeo que codificam um peptídeo de trânsito ou gene marcador/repórter são " isoladas" pelo fato de que elas foram pelo menos parcialmente preparadas in vitro, por exemplo, isoladas de seu estado nativo, de uma célula, purificada, e amplificada, por exemplo, elas estão em combinação com elementos genéticos heterólogos àqueles encontrados normalmente associados com eles em seu estado nativo. Como empregado aqui, um constructo de DNA heterólogo compreendendo uma molécula de polinucleotídeo codificando AsnS que foi introduzida em uma célula hospedeira, não é preferivelmente idêntica a qualquer molécula de polinucleotídeo presente na célula em seu estado natl· vo. não transformado e e isolada quanto as outras moléculas de DNA que ocorrem no genome da célula hospedeira.

Como empregado aqui, níveis "alterados ou aumentados" de asparagina em uma planta, tecido de planta, ou célula de planta transformada, são os níveis que são maiores do que os níveis encontrados na planta, tecido de planta, ou células de planta correspondentes que não contêm o constructo de DNA da presente invenção, Os agentes da presente invenção também podem ser recombi-nantes. Como empregado aqui, o termo recombinante significa qualquer a-gente (por exemplo, DNA, peptídeo, etc,), isto é, ou resulta, entretanto indiretamente, de manipulação humana de uma molécula de polinucleotídeo.

Como empregado aqui em um aspecto preferido, um aumento na qualidade nutricional de uma semente, por exemplo, conteúdo de proteína de semente aumentado, é determinado pela capacidade de uma planta de produzir uma semente que tenha uma produção mais elevada de proteína ou um componente nutricional do que uma semente sem tal aumento na qualidade de proteína ou nutricional. Em um aspecto particularmente preferido da presente invenção, o aumento na qualidade nutricional é medido relativo a uma planta com uma base genética similar à planta nutricionalmente realçada exceto que a planta da presente invenção expresse ou superex-presse uma proteína ou fragmento desta descrito nos constructos de DNA heterólogo aqui.

Moléculas de Polinucleotídeo A presente invenção inclui e fornece sementes e plantas de milho transgênicas que compreendem em seu genoma um transgene que compreende uma molécula de DNA heteróloga que codifica uma enzima de asparagina sintetase de milho (Zm.AsnS2), a molécula de DNA, por exemplo, que compreende SEO ID NO: 3 e seqüências que têm pelo menos 90%, 95%, ou 99% de identidade com tais seqüências com atividade de asparagina sintetase funcional.

Um outro aspecto da invenção é um método para aumenta a proteína em uma planta de milho introduzindo-se em uma célula de milho um constructo de DNA que fornece uma molécula de polinucleotideo heteróioga, por exemplo, SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17 que codificam uma enzima de asparagina sintetase. O polinucleotídeo pode diferir de quaisquer daqueles exemplos sem alterar o polipeptídeo para o qual codifica. Por exemplo, é compreendido que os códons capazes de codificar para tais substituições de aminoácido conservadoras são conhecidos na técnica. Adicionalmente, a invenção contempla que os polipeptídeos em que um ou mais aminoácidos foram deletados, substituídos, ou adicionados sem alterar a função de asparagina sintetase, podem ser empregados na invenção.

Em um aspecto da presente invenção, o polinucleotídeo da presente invenção é referido ser moléculas de polinucleotídeo introduzidas. Uma molécula de polinucleotídeo é dita ser "introduzida" se for inserida em uma célula ou organismo como um resultado de manipulação humana, de qualquer forma indireta. Os exemplos de moléculas de polinucleotídeo introduzidas incluem, sem limitação, polinucleotídeos que foram introduzidos em células por transformação, transfecção, injeção, e projeção, e aquelas que foram introduzidas em um organismo por conjugação, endocitose, fagocito-se, etc. Preferivelmente, o polinucleotídeo é inserido no genoma da célula.

Um subgrupo das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção são as moléculas de polinucleotídeo de fragmento. As moléculas de polinucleotídeo de fragmento podem consistir em porção(s) significante de, ou realmente a maioria das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção, tal como aquelas especificamente descritas. Alternativamente, os fragmentos podem compreender oligonucleotídeos menores (tendo de cerca de 15 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo e mais preferivelmente, cerca de 15 a cerca de 30 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 50 a cerca de 100 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 100 a cerca de 200 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 200 a cerca de 400 resíduos de nucleotídeo, ou cerca de 275 a cerca de 350 resíduos de nucleotídeo). Um fragmento de uma ou mais das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção pode ser uma sonda e especificamente uma molécula iniciadora de PCR. Um iniciador de PCR é uma molécula de polinucieotídeo capaz de iniciar uma atividade de polime-rase ao mesmo tempo em que em uma estrutura de filamento duplo com outro polinucieotídeo. Vários métodos por determinar a estrutura de sondas de PCR e técnicas de PCR existem na técnica.

Como empregado aqui, duas moléculas de polinucieotídeo são ditas ser capazes de especificamente hibridizar a uma outra se as duas moléculas são capazes de formar uma estrutura de polinucieotídeo antiparalela, de filamento duplo.

Uma molécula de polinucieotídeo é dita ser o "complemento" de outra molécula de polinucieotídeo se elas exibem complementaridade completa. Como empregado aqui, as moléculas são ditas exibir "complementaridade completa" quando todo nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas ser "minimamente complementar" se eles podem hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas a uma outra sob condições de "baixa-severidade" pelo menos convencionais. Similarmente, as moléculas são ditas serem "complementares" se elas podem hibridizar com uma outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam aneladas a uma outra sob condições de "alta-severidade" convencionais. As condições convencionais de severidade são descritas por Sambrook e outros, (2001), e por Haymes e outros, (1985). As retiradas de complementaridade completa são então permissíveis, contanto que tais retiradas não impeçam completamente a capacidade das moléculas de formar uma estrutura de filamento duplo. Desse modo, para uma molécula de poli-nucleotídeo servir como um iniciador ou sonda ela precisa somente ser suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob o solvente particular e concentrações de sal empregadas.

As condições de severidade apropriadas que promovem a hibri-dação de DNA são, por exemplo, 6,0 X de cloreto de sódio/ citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 X de SSC a 20 25°C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encon- tradas em Ausubel, e outros, eds. (1989), seção 6.3.1 6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma baixa severidade de cerca de 2,0 X de SSC a 50°C a uma severidade elevada de cerca de 0,2 X de SSC a 65°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de severidade baixa a temperatura ambiente, cerca de 22°C, a condições de severidade elevadas a cerca de 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou a temperatura ou a concentração de sal pode ser mantida constante tal que um ácido nucléico especificamente hibridize com uma ou mais das moléculas de polinucleotídeo fornecidas aqui, por exemplo, como apresentado nas: SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 e 18-45 e complementos destas, sob condições moderadamente severas, por exemplo em cerca de 2,0 X de SSC e cerca de 65°C.

Em uma modalidade de um método da presente invenção, quaisquer das sequências de polinucleotídeo ou sequências de polipeptídeo, ou fragmentos de qualquer uma das duas, da presente invenção podem ser empregadas para pesquisar quanto às seqüéncias relacionadas. Como empregado aqui, "pesquisa quanto às seqüéncias relacionadas" significa qualquer método para determinar a relação entre duas sequências, incluindo, porém não limitado a, pesquisas que comparam a homologia de seqüência: por exemplo, uma pesquisa de PBLAST de um banco de dados para relação com uma única seqüência de polipeptídeo. Outras pesquisas podem ser conduzidas empregando métodos com base no perfil, tal como o HMM (modelo Hidden Markov) META-MEME, que é mantido por South Dakota State University, SD, e PSI -BLAST que são mantidas pelo Centro Nacional para Informação de Biotecnologia, Biblioteca Nacional de Medicina, Institutos Nacionais de Saúde (NCBI).

Uma molécula de polinucleotídeo pode codificar para uma molécula de polipeptídeo substancialmente idêntica ou substancialmente homóloga. O grau de identidade ou homologia pode ser determinado por uso de software de computador tal como o Programa de Abertura WISCONSIN PACKAGE. O programa de Abertura na versão 10.0-UNIX de WISCONSIN PACOTE de Genetics Computer Group, Inc. é com base no método de Nee-dleman e Wunsch, 1970. Usando o programa TBLASTN no conjunto de software BLAST 2,2.1 (Altschul e outros, (1997, ou empregando matriz BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, 1992). Uma molécula de polinucleotídeo da presente invenção também pode codificar um poíipeptídeo homólogo. Como empregado aqui, uma molécula de poíipeptídeo homóloga ou fragmento desta é uma molécula de proteína de contraparte ou fragmento desta ou em uma segunda espécie (por exemplo, subunidade pequena de rubisco de milho é um homólogo da subunidade pequena de rubisco de Arabidopsis). Um homólogo também pode ser gerado por evolução molecular ou técnicas embaralhamento de DNA, de forma que a molécula retenha pelo menos uma característica de estrutura ou funcional do poíipeptídeo original (veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.811.238).

Em uma modalidade preferida, quaisquer das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser operaveimente unidas a uma região promotora que funciona em uma célula de planta para causar a produção de uma molécula de mRNA, onde a molécula de polinucleotídeo que é unida ao promotor é heteróloga com respeito àquele promotor. Como empregado aqui, DNA "heterólogo" é qualquer seqüência de DNA que não é naturalmente encontrada próximo ao DNA adjacente. "Nativo" se refere a uma seqüência de ácido nucléico de ocorrência natural. Seqüência "heteróloga" geralmente se origina de uma fonte estrangeira ou espécies ou, se da mesma fonte, é modificada de sua forma original e/ou local no genoma.

Como empregado aqui, os termos "proteína", "molécula de pep-tídeo", ou "poíipeptídeo" incluem qualquer molécula que compreenda cinco ou mais aminoácidos. Sabe-se na técnica que a proteína, peptídeo, ou moléculas de poíipeptídeo podem sofrer modificação, incluindo modificações pós-translacionais, tal como, porém não limitado a, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação, fosforilação ou oligomerização. Desse modo, como empregado aqui, os termos "proteína", "molécula de peptídeo" ou "polipeptí-deo" incluem qualquer proteína que seja modificada por qualquer processo biológico ou não biológico. Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" se refe- rem a todos os L-aminoácidos de ocorrência natural. Esta definição é significada incluir norleucina, norvalina, ornitina, homocisteína, e homosserina.

Um "fragmento de proteína" é uma molécula de polipeptídeo ou peptídeo cuja seqüência de aminoácido compreende um subgrupo da sequência de aminoácido daquela proteína. Uma proteína ou fragmento desta que compreende uma ou mais regiões de peptídeo adicionais não derivadas daquela proteína é uma proteína de "fusão". Tais moléculas podem ser derivadas para conter carboidrato ou outras porções (tal como hemocianina de lapa de buraco da fechadura). A proteína de fusão ou moléculas de peptídeo da presente invenção são preferivelmente produzidas por meios recombi-nantes.

Constructos de Planta e Transformantes de Planta Uma ou mais dos constructos de DNA da presente invenção que codificam para um asparagina sintetase podem ser empregadas na transformação ou transfecção de planta. O material genético exógeno pode ser transferido em uma célula de planta e a célula de planta regenerada em uma planta inteira, fértil, ou estéril. O material genético exógeno é qualquer material genético, quer de ocorrência natural ou de outro modo, de qualquer fonte que seja capaz de ser inserida em qualquer organismo.

Em um outro aspecto da presente invenção, as seqüências de . polinucleotídeo da presente invenção também codificam os peptídeos envolvidos na localização, exportação, ou modificação pós-translacional intracelular, por exemplo, os peptídeos de trânsito de cloroplasto.

Como usado nisto, o termo "gene" inclui uma molécula de ácido nucléico que fornece a regulação da transcrição que inclui um promotor que funciona em plantas, moléculas 5' não transladadas, por exemplo, íntrons e seqüências líderes, uma molécula de ácido nucléico transcrito e uma molécula de terminação transcricional 3'.

As moléculas de ácido polinucléico que codificam um polipeptídeo da presente invenção podem ser combinadas com outras seqüências heterólogas ou não nativas em uma variedade de modos. Por seqüências "heterólogas" é entendida qualquer seqüência que não seja naturalmente encontrada unida à seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo da presente invenção, incluindo, por exemplo, combinações de seqüências de nucleotídeo da mesma planta que não são naturalmente encontradas juntas, ou as duas seqüências originam de duas espécies diferentes. O termo "ope-ravelmente unidas", como empregado em referência à disposição da função e física de moléculas de polinucleotídeo reguladoras e estruturais que tornam a expressão regulada de uma molécula de polinucleotídeo estrutural operavelmente ligada. A expressão de um constructo de D NA ou transgene significa a transcrição e acumulação estável de RNA de sentido ou anti-sentido ou proteína derivada da molécula de polinucleotídeo da presente invenção ou translação desta. RNA de "sentido" significa transcrição de RNA que inclui o mRNA e assim pode ser transladado em polipeptídeo ou proteína pela cela. "RNA de anti-sentido" significa uma transcrição de RNA que é complementar a toda ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Patente dos Estados Unidos 5.107.065, incorporada aqui por referência). A complementaridade de um RNA de anti-sentido pode ser com qualquer parte da transcrição de gene específica, isto é, na seqüência de não codificação 5 '. seqüência não transladada 3', ín-trons, ou a seqüência de codificação. "Transcrição de RNA" significa o produto resultante de transcrição catalisada por RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quando a transcrição de RNA é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, ela é referida como a transcrição primária ou pode ser uma seqüência de RNA derivada de processamento pós-transcricional da transcrição primária e é referido como o RNA maduro.

Como empregado aqui, o termo cassetes de expressão de planta se refere a um constructo compreendendo as moléculas reguladoras de DNA necessárias operavelmente unidas à molécula alvo para fornecer expressão em uma célula de planta. O constructo de DNA da presente invenção pode, em uma modalidade, conter um promotor que causa a superexpressão do polipeptídeo da presente invenção onde "superexpressão" significa a expressão de um polipeptídeo ou não normalmente presente na célula hospedeira, ou presente na referida célula hospedeira a um nível mais elevado do que aquele normalmente expressado do gene endógeno codificando o referido polipeptídeo. Os promotores que podem causara superexpressão do polipeptídeo da presente invenção são geralmente conhecidos na técnica, os exemplos de tais que fornecem padrão de expressão constitutiva incluem promotor de vírus 19S mosaico de couve-flor e promotor de vírus 35S mosaico de couve-flor (Patente dos Estados Unidos ne 5.352.605), promotor de vírus 35S mosaico de escrofulária (Patente dos Estados Unidos ng 6.051.753), promotor de vírus em forma de bacilo de cana-de-açúcar (Patente dos Estados Unidos ne 5.994.123), promotor de vírus de commelina yellow mottle (Medberry e outros, 1992), subunidade pequena de promotor de ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase, promotor de triosefosfato citosólico isomerase de arroz, promotor de fosforibosiltransferase de adenina, promotor de actina 1 de arroz (Patente dos Estados Unidos 5.641.876), promotor de ubiquitina de milho, promotor de manopina sintase e promotor de octopina sintase.

Tais constructos genéticos podem ser transferidos em plantas monocotiledôneas ou dicotiledôneas incluindo, porém não limitado a alfafa, maçã, Arabidopsis, banana, Brassica campestrís, óleo de colza, feijão de rícino, café, milho, algodão, caroço de algodão, crisântemo, crambe, pepino, Dendrobium spp, Dioscorea spp., eucalipto, festuca, linho, gladíolo, liliacea, linhaça, milho miúdo, melão almiscarado, mostarda, aveia, dendezeiro, óleo de semente de colza, amendoim, azevém perene, Phaseolus, semente de colza, arroz, sorgo, feijão-soja, centeio, tritordeum, turfgrass, trigo, açafroa, gergelim, beterraba-doce, cana-de-açúcar, oxicoco, mamão, cártamo, e girassol (Christou, 1996). Em uma modalidade preferida, o material genético é transferido em uma célula de milho. A transferência de uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma proteína pode resultar na expressão ou superexpressão daquele polipeptídeo em uma célula transformada ou planta transgênica. Uma ou mais das proteínas ou fragmentos destas codificadas por moléculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser superexpressadas em uma célula transformada ou planta transformada.

Em uma modalidade, os constructos de DNA da presente invenção incluem uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma sequência de polipeptfdeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17. A invenção fornece células de milho transformadas onde, relativo a uma planta de milho não transformada sem tal constructo de DNA, a célula tem um nível de asparagina realçado.

Em outra modalidade, os constructos de DNA da presente invenção incluem uma molécula de DNA heteróloga operavelmente unida a uma asparagina sintetase de milho que codifica a seqüência, por exemplo, SEQ ID NOs 1,3, ou 5, e o constructo de DNA é transformado em célula de milho. Em uma modalidade preferida, os constructos de DNA da presente invenção compreendendo SEQ ID NO: 3 são fornecidas em uma célula de milho transformada, e a expressão do constructo de DNA fornece um tecido de planta de milho com asparagina aumentada ou uma semente de planta de milho com proteína aumentada relativo a uma planta de milho não transformada com o constructo de DNA.

Em algumas modalidades, os níveis de um ou mais produtos do AsnS podem ser aumentados em toda uma planta ou podem ser localizados em um ou mais órgãos ou tecidos da planta específicos, Sem limitar o escopo da presente invenção, várias seqüências promotoras são úteis para expressar o gene da enzima acima. Por exemplo, milho C4 tipo promotor de PPDK (Glackin e outros, 1990), milho C4 tipo promotor de PEPC (Hudspeth e Grula, 1989), promotor de subunidade pequena de arroz Rubisco (Kyozuka e outros, 1993), e promotor de proteína de ligação a/b de clorofila de colheita em luz (Sakamoto e outros, 1991), o promotor de P-FDA (US20040216189A1, a seqüência de polinucleotídeo da qual está aqui incorporada por referência), e promotor de P-RTBV (Patente dos Estados Unidos 5.824.857, a seqüência de polinucleotídeo da qual está aqui incorporada por referência). Por exemplo, os níveis de asparagina ou proteína podem ser aumentados em um ou mais dos tecidos e órgãos de uma planta que inclui sem limitação: raizes, tubérculos, talos, folhas, talos, fruta, bagas, nozes, cascas, casulos, sementes, e flores. Um órgão preferido é uma semente.

Com o propósito de expressão em tecidos de fonte da planta, tal como a folha, semente, raiz, ou talo, é preferido que os promotores utilizados tenham expressão relativamente elevada nestes tecidos específicos. Expressão específica de tecido de uma proteína da presente invenção é uma modalidade particularmente preferida.

Os constructos de DNA ou vetores também podem incluir, com a região de codificação de interesse, uma seqüência de polinucleotídeo que atua, em todo ou em parte, para terminar a transcrição daquela região. Várias tais sequências foram isoladas, incluindo a região T-NOS 3‘ (Ingelbrecht e outros, 1989; Bevan e outros, 1983). As regiões de terminação de transcrição reguladora podem ser fornecidas em constructos de expressão de planta desta presente invenção também. As regiões de terminação de transcrição podem ser fornecidas pela seqüência de DNA que codifica o gene de interesse ou uma região de terminação de transcrição conveniente derivada de uma fonte de gene diferente, por exemplo, a região de terminação de transcrição que é naturalmente associada com a região de iniciação de transcrição. O técnico versado reconhecerá que qualquer região de terminação de transcrição conveniente que é capaz de terminar a transcrição em uma célula de planta pode ser empregada nos constructos da presente invenção.

Um vetor ou constructo também pode incluir elementos reguladores, tal como íntrons. Os exemplos de tais incluem, o íntron 1 Adh (Callis e outros, 1987), o íntron de sacarose sintase (Vasil e outros, 1989), intron de hsp70 (Patente dos Estados Unidos 5.859.347), e o elemento de ômega TMV (Gallie e outros, 1989). Estes e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando apropriado.

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador sele-cionável. Os marcadores selecionávéis também podem ser empregados para selecionar quanto às plantas ou células de planta que contêm o material genético exógeno. Os exemplos de tais incluem, porém não estão limitados; um gene neo (Potrykus e outros, 1985), que codifica para resistência de ca- namicina e pode ser selecionado por empregar canamicina, nptll, G418, hpt, etc.; um gene de barra, que codifica para resistência de bialafos; um gene de EPSP sintase mutante (Hinchee e outros, 1988; Reynaerts e outros, 1988; Jones e outros, 1987) que codifica resistência de glifosato; um gene de nitri-lase que confere resistência à bromoxinila (Stalker e outros, 1988); um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistência à imidazolino-na ou sulfoniluréia (Patente dos Estados Unidos 4.761.373); D'Halluin e outros, 1992); e um gene DHFR resistente a metotrexato (Thillet e outros, 1988).

Transformação de Planta Os métodos mais geralmente empregados para transformação de células de planta é o processo de transferência de DNA mediado por A-grobacterium e o processo mediado por bombardeio biolístico ou de micro-projétil (isto é, pistola de gene). Tipicamente, a transformação nuclear é desejada, porém se é desejável especificamente transformar os plastídeos, tal como cloroplastos ou amiloplastos, os plastídeos de planta podem ser transformados utilizando uma liberação mediada por microprojétil do polinucleotí-deo desejado.

Os métodos para introduzir transgenes em plantas por transformação mediada por Agrobacterium utilizam um T-DNA (DNA de transferência) que incorpora os elementos genéticos do transgene e transfere esses elementos genéticos no genoma de uma planta. Geralmente, o transgene(s) limitado por uma molécula de DNA de borda direita (RB) e uma molécula de DNA de borda esquerda (LB) é transferido no genoma de planta em um único lugar. A "molécula de T-DNA" se refere a uma molécula de DNA que interage em um genoma de planta por um método de transformação mediado por Agrobacterium. As extremidades da molécula de T-DNA são definidas na presente invenção como sendo flanqueadas pelas regiões de borda do T-DNA de plasmídeos de Ti de Agrobacterium. Estas regiões de borda geralmente são referidas como as regiões de borda Direita (RB) e borda Esquerda (LB) e existem como variações em sequência de nucleotídeo e o comprimento dependendo se elas são derivadas de filamentos de produção de no- palma ou octopina de Agrobacterium. As regiões de borda geralmente empregadas em constructos de DNA designadas para transferir transgenes em plantas são freqüentemente várias centenas de polinucleotídeos em comprimento e compreendem um sítio de corte onde uma endonuclease digere o DNA para fornecer um sítio para inserção no genoma de uma planta. As moléculas de T-DNA geralmente contêm um ou mais cassetes de expressão de planta.

Com respeito ao bombardeio de microprojétil (Patentes dos Estados Unidos 5.550.318; 5.538.880; e 5.610.042; cada das quais especificamente está aqui incorporada por referência em sua totalidade), as partículas são revestidas com polinucleotídeos e liberadas em células por uma força propelente. As partículas exemplares incluem aquelas compreendidas de tungstênio, platina, e preferivelmente, ouro. Um método útil para liberar DNA em células de planta por aceleração de partícula é o Sistema de Liberação de Partícula Biolístico (BioRad, Hercules, Califórnia), que pode ser empregado para propelir as partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela, tal como uma tela de Nytex ou aço inoxidável, sobre uma superfície de filtro coberta com células de planta monocotiledôneas cultivadas em suspensão. As técnicas de bombardeio de microprojétil são amplamente a-plicáveis, e podem ser empregadas para transformar virtualmente qualquer espécie de planta. Os exemplos de espécies que foram transformadas por bombardeio de microprojétil incluem espécies monocotiledôneas tal como milho (Publicação PCT WO 95/06128), cevada, trigo (Patente dos Estados Unidos 5.563.055, incorporada aqui por referência em sua totalidade), arroz, aveia, centeio, cana-de-açúcar, e sorgo; bem como vários dicotilédones incluindo tabaco, soja (Patente dos estados Unidos 5.322.783, incorporada aqui por referência em sua totalidade), girassol, amendoim, algodão, tomate, e legumes em geral (Patente dos estados Unidos 5.563.055, incorporada aqui por referência em sua totalidade).

Para selecionar ou classificar quanto às células de planta transformadas independente da metodologia de transformação, o DNA introduzido na célula contém um gene que funciona em um tecido de planta regene- rável para produzir um composto que concede no tecido da planta resistência a um composto de outro modo tóxico. Os genes de interesse para uso como um marcador selecionáveí, avaliável ou classificável incluiriam, porém não se limitariam a GUS, proteína fluorescente verde (GFP), luciferase (LUX), e genes de tolerância antibiótico ou herbicida. Os exemplos de genes de resistência antibiótica incluem aqueles concedendo resistência a canami-cina (e neomicina, G418), e bleomicina. A regeneração, desenvolvimento, e cultivo de plantas de vários explantes transformados são bem documentados na técnica. Esta regenera* ção e processo de crescimento tipicamente incluem as etapas de selecionar as células transformadas e cultivar aquelas células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embrionário através do estágio de plantinha arraigada. As sementes e embriões transgênicos similarmente regenerados. Os brotos arraigados transgênicos resultantes são plantados depois disso em um meio de crescimento de planta apropriado tal como terra. As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser cultivadas em meios que suportam a regeneração de plantas. As plantinhas em desenvolvimento são transferidas para mistura de crescimento de planta com menos terra, e endurecidas, antes da transferência para uma estufa ou câmara de crescimento para maturação. A presente invenção pode ser empregada com qualquer célula ou tecido transformável. Por transformável como empregado aqui é significada uma célula ou tecido que seja capaz de outra propagação para dar origem a uma planta. Aqueles de experiência na técnica reconhecem que várias células ou tecidos de planta são transformáveis nos quais após a inserção de DNA exógeno e condições de cultura apropriadas, as células ou tecidos de planta podem se formar em uma planta diferenciada. O tecido adequado para estes propósitos pode incluir, porém não está limitado a embriões imaturos, tecido scuteüar, culturas de célula em suspensão, ínflorescên-cia imatura, meristem de disparo, explantes nodais, tecido de calo, tecido de hipocotilédone, cotilédones, raízes, e folhas.

Qualquer meto de cultura de planta adequado pode ser empregado. Os exemplos de meios adequados incluiríam, porém não estão limitados a meios com base em MS (Murashige e Skoog, 1962) ou meios com base em N6 {Chu e outros, 18:659, 1975) suplementados com reguladores de crescimento de planta adicionais que incluem, porém não limitados a au-xinas, citocininas, ABA, e giberelinas. Aqueles de experiência na técnica estão familiarizados com a variedade de meios de cultura de tecido, que quando suplementado adequadamente, suportam o crescimento e desenvolvimento de tecido de planta e são adequados para transformação e regeneração de planta. Estes meios de cultura de tecido podem ser comprados como uma preparação comercial, ou preparados e modificados como costume. Aqueles de experiência na técnica estão atentos que os meios e suplementos tal como nutrientes e reguladores de crescimento para uso na transformação e regeneração e outras condições de cultura tal como intensidade de luz durante a incubação, pH, e temperaturas de incubação que podem ser otimizados para a variedade particular de interesse.

Quaisquer das moléculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser introduzidas em uma célula de planta de uma maneira permanente ou transitória em combinação com outros elementos genéticos tal como vetores, promotores, realçadores, etc. Além disso, quaisquer das mo-, léculas de polinucleotídeo da presente invenção podem ser introduzidas em uma célula de planta de uma maneira que isso permita a expressão ou su-perexpressão da proteína ou fragmento desta codificados pela molécula de polinucleotídeo. A presente invenção também fornece partes das plantas, particularmente partes reprodutivas ou de armazenamento, da presente invenção. As partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvulo, pólen, ou tubérculos. Em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a parte de planta é uma semente de milho. Em uma modalidade a semente de milho (ou grão) é um componente de alimento animal.

Em uma modalidade preferida, o alimento de milho ou farinha de miiho ou proteína da semente de milho é designado para animais de gado ou seres humanos, ou ambos. Os métodos para produzir alimento, farinha e proteína, são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos 4.957.748; 5.100.679; 5.219.596; 5.936.069; 6.005.076; 6.146.669; e 6.156.227. Em uma modalidade preferida, a preparação de proteína é uma preparação de alto teor de proteína. Tal preparação de alto teor de proteína preferivelmente tem um conteúdo de proteína maior do que cerca de 5% (peso/volume), mais preferivelmente 10% (peso/volume), e até mesmo mais preferivelmente 15% (peso/volume).

As descrições de métodos de reprodução que são geralmente empregadas para colheitas e características diferentes podem ser encontradas em um dos vários livros de referência (por exemplo, Hayward, 1993; Ri-chards, 1997; Allard, 1999).

Outros Organismos Um polinucleotídeo da presente invenção pode ser introduzido em qualquer célula ou organismo tal como uma célula de mamífero, mamífero, célula de peixe, peixe, célula de pássaro, pássaro, célula de algas, algas, célula de fungos, fungos, ou células bacterianas. Uma proteína da presente invenção pode ser produzida em uma célula ou organismo apropriado. Os hospedeiros e transformantes preferidos incluem: células de fungos tal como Aspergillus, leveduras, mamíferos, particularmente bovina e porcina, insetos, bactérias, e algas. As bactérias particularmente preferidas são Agrobacteri-um tumefaciens e E. coli.

Em um aspecto da presente invenção, uma ou mais das moléculas de ácido nucléico da presente invenção são empregadas para determinar o nível de expressão (isto é, a concentração de mRNA em uma amostra, etc.) em uma planta (preferivelmente óleo de colza, milho, Brassica campes-tris, óleo de semente de colza. semente de colza. soja, crambe, mostarda, feijão de rícino, amendoim, gergelim, caroço de algodão, linhaça, açafroa, dendezeiro, linho ou girassol) ou padrão (isto é, os cinéticos de expressão, taxa de decomposição, perfil de estabilidade, etc.) da expressão de uma proteína codificada em parte ou inteira por uma ou mais das moléculas de poli- nucleotídeo da presente invenção. Vários métodos podem ser empregados para comparar a expressão entre duas ou mais amostras de células ou tecido. Estes métodos incluem ensaios de hibridação, tal como, ensaios de proteção de RNAase do norte, e hibridação in situ. Alternativamente, os métodos incluem ensaios tipo PCR. Em um método preferido, a expressão é avaliada hibridizando-se polinucleotídeos das duas ou mais amostras para uma disposição de polinucleotídeos. A disposição contém uma pluralidade de se-qüências suspeitadas conhecidas ou suspeitas de estarem presentes em células ou tecidos das amostras.

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar os aspectos da invenção, aqueles de experiência na técnica devem, levando em conta a presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nos aspectos específicos que são descritos e ainda obtêm um resultado igual ou semelhante sem afastar-se do espírito e escopo da invenção.

EXEMPLOS

Aqueles de experiência na técnica apreciarão as muitas vantagens dos métodos e composições fornecidos pela presente invenção. Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Deveria ser apreciado por aqueles de experiência na técnica que as técnicas descritas nos exemplos que seguem representam as técnicas descritas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, e desse modo podem ser consideradas constituir os modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles de experiência na técnica devem, levando em conta a presente descrição, apreciar que muitas alterações podem ser feitas nas modalidades específicas que são descritas e ainda obtêm um resultado igual ou similar sem afastar-se do espírito e escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui por referência na medida em que elas suplementam, explicam, fornecem um fundamento para, ou ensinam a metodologia, técnicas, ou composições empregadas aqui. Exemplo 1 Constructo de bibliotecas qenômicas e cDNA de planta milho e soja.

Este exemplo descreve a produção de bibliotecas de cDNA fei- tas de tecidos de planta de milho e soja dos quais as seqüências de AsnS de milho e polinucleotídeo de soja da presente invenção foram isoladas. As bibliotecas de cDNA foram geradas de tecido de Zea mays e Glycine max empregando técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, Alba, 2004. As bibliotecas de cDNA de milho foram feitas de dois tecidos diferentes. Uma biblioteca foi feita de caroços incipientes colhidos na fase demorada de linhagem congênita 90DDD5. Uma segunda biblioteca de cDNA de milho foi feita de tecido de seda no estágio de crescimento de seda de linha congênita de mi-iho H99 e germinação de pólen germinando de linhagem congênita de milho M017. Paro constructo de uma biblioteca de cDNA de soja {Glycine max), o tecido meristemático e parte do tecido de hipocotiledônea foram excisados de sementes de soja secas rehidratadas de variedade A3237 (Asgrow). Os explantes foram preparados primeiro germinando-se as sementes esterilizadas na superfície em meios de cultura de tecido de sólido durante 6 dias a 28 °Cem 18 horas de luz / dia, e em seguida transferindo as sementes germinadas a 4°C durante pelo menos 24 horas. Para o tecido empregado na preparação de biblioteca os cotiledôneas foram removidos para enriquecer para o tecido específico de interesse. 0,5 a 2 gramas de tecido foram empregados para a preparação de RNA total e poli A+ RNA. Para todas as bibliotecas de cDNA, os tecidos de planta foram colhidos e imediatamente congelados em nitrogênio líquido. O tecido colhido foi armazenado a -80°C até a preparação de RNA total. O RNA total foi purificado empregando rea-gente Trizol de Invitrogen Corporation (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia, E.U.A.), essencialmente como recomendado pelo fabricante. Poli A+ RNA (mRNA) foi purificado empregando contas de oligo dT magnéticas essencialmente como recomendado pelo fabricante (Dynabeads, Dynal Biote-ch, Oslo, Noruega). O constructo de bibliotecas de cDNA de planta é bem conhecida na técnica e várias estratégias de clonagem existem. Vários kits de constructo de biblioteca de cDNA são comercialmente disponíveis. As bibliotecas de cDNA eram preparadas empregando o Sistema de Plasmídeo Superscript® para síntese de cDNA e Clonagem de Plasmídeo (Invitrogen Corporation), como descrito no protocolo de síntese de biblioteca de cDNA de Sobrescrito II. As bibliotecas de cDNA foram verificadas para confirmar uma relação de inserçãorvetor apropriada.

Uma biblioteca de DNA genômico foi construída empregando DNA genômico isolado de Zea mays empregando um protocolo de isolamento de DNA genômico modificado descrito abaixo (Dellaporta e outros, 1983). As mudas de milho foram crescidas em solo ou em placas Petri, foram colhidas, e mantidas congeladas em nitrogênio líquido até extração. O tecido foi moído para um pó fino empregando um almofariz e pilão ao mesmo tempo em que mantendo o tecido congelado com nitrogênio líquido. O tecido em pó foi transferido para um liquidificador de Waring que contém 200 mL de tampão de extração de DNA frio (0°C) (350 mM de sorbitol; 100 mM de Tris; 5 mM de EDTA; pH a 7,5 com HCI; bissuifito de sódio, 3,8 mg/mL) que foi adicionado exatamente antes do uso, e homogeneizado em alta velocidade durante 30-60 segundos. O homogeneizado foi filtrado através de uma camada de tecido de algodão e coletado em uma garrafa centrífuga. As amostras foram então centrifugadas a 2500xg durante 20 minutos, e o sobrenadante e qualquer material verde solto, foi descartado. O pélete foi então ressuspenso em 1,25 mL de tampão de extração de DNA e transferido para um tubo de polipropileno de 50 mL. O tampão de lise de núcleos (1,75 mL contendo 200 . mM de Tris; 50 mM de EDTA; 2 M de NaCI; 2,0% (peso/volume) de CTAB; pH ajustado a 7,5 com HCI) foi então adicionado, seguido por adição de 0,6 mL de 5% (peso/volume) de sarcosila. Os tubos foram suavemente misturados, e as amostras foram incubadas a 65°C durante 20 minutos. Um volume igual de clorofórmioiálcool de isoamila (24:1) foi adicionado e os tubos foram novamente suavemente misturados. Os tubos foram então centrifugados a 2500xg durante 15 minutos, e o sobrenadante resultante foi transferido para um tubo limpo. Um volume igual de isopropanol resfriado em gelo foi derramado sobre a amostra, e a amostra foi invertida várias vezes até que um precipitado se formasse. O precipitado foi removido da solução empregando uma pipeta de vidro e o álcool residual removido permitindo-se o precipitado secar em ar durante 2-5 minutos. O precipitado era ressuspenso em 400 pL de tampão TE (10mM de Tris-HCi, 1 mM de EDTA, pH ajustado para 8,0). Exemplo 2 Isolamento de seqüências de polinucleotídeo de AsnS por ligação independente e métodos de clonagem de Gateway e transformação de milho.

Este exemplo ilustra o isolamento de moléculas de polinucleotídeo que codificam AsnS empregando a ligação independente e métodos de clonagem de Gateway® e a construção de constructos de DNA da presente invenção que compreende as moléculas de polinucleotídeo que codificam os polipeptídeos de AsnS isolados de várias plantas e fontes de microorganismos como descrito na Tabela 1. As moléculas promotoras empregadas para direcionar a expressão das moléculas de polinucleotídeo de codificação de AsnS unidas é o promotor de actina 1 de arroz, P-Os.Act1 (Patente dos Estados Unidos nfi 5.641.876, aqui incorporada por referência); o PPDK de Zea mays (Matsuoka e outros, 1993), P-RTBV-1 (Patente dos Estados Unidos 5.824.857, aqui incorporada por referência), e o P-Zm.NAS (molécula promotora da região genômica que codifica para um polipeptídeo de nicotiana-mina sintase 2 de milho).

Tabela 1. Fonte de seqüência de codificação de AsnS, promotor e constructos de DNA A clonagem independente de ligação foi desenvolvida para cio-nar os produtos de PCR e com base no anelamento de extremidades de filamento único não palindrômicas. LIC é um método de clonagem eficiente, que não está limitado por sítios de restrição ou pela necessidade de reações de ligação ou digestão de enzima de restrição e deixa junções sem costura (Aslanidis e de Jong, 1990).

Os segmentos de DNA de filamento único terminais são produ- zidos no vetor através do uso de uma "endonuclease de corte" e endonucle-ase de restrição. Uma endonuclease de corte é uma endonuclease que corta um filamento do dúplex de polinucleotídeo para criar filas de filamento único no vetor de clonagem. O vetor é primeiro linearizado com uma endonuclease de restrição padrão. Isto é seguido então por digestão com uma endonuclease de corte. Após tratamento térmico, segmentos de DNA de filamento único terminais são produzidos no vetor. Um conteúdo de GC de asperamente 55% é recomendado para amplificação de PCR a jusante e anelamento eficiente. O promotor, rótulo, ou outro elemento de seqüência, podem ser adicionados às extremidades de 5' e 3' do produto amplificado por PCR para criar um constructo linear que pode ser empregada em aplicações a jusante. O pMON92870 de constructo de DNA foi montado do vetor de base, pMON82060, e uma molécula de polinucleotídeo de AsnS3 de milho que codifica um polipeptídeo de AsnS fornecido como SEQ ID NO 5. O pMON82060 de cadeia principal de plasmídeo foi linearizado empregando a endonuclease de restrição, Hpal. A cadeia principal de plasmídeo foi então tratada com a endonuclease de corte, N.BbvC IA (New England Biolabs, Be-verly, MA). Após a digestão, a reação foi aquecida a 65°C. Isto faz com que os filamentos cortados de DNA se desassociem dos seus filamentos de DNA complementares. A cadeia principal de plasmídeo linearizada resultante foi . deixada com dois segmentos de DNA de filamento único terminais disponíveis para montagem. A reação em cadeia de polimerase foi empregada para produzir os segmentos de DNA de filamento único terminais no AsnS de codificação de molécula de DNA. A seqüência de polinucleotídeo de AsnS3 de milho (SEQ ID NO: 5) codificando o polipeptídeo de AsnS foi empregada para o desígnio do iniciador de PCR dianteiro (SEQ ID NO: 48) e do iniciador de PCR reverso (SEQ ID NO: 49) : SEQ ID NO:48: GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATC SEQ ID NO:49: GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCA-GACCGCG A amplificação de reação em cadeia de polimerase foi realizada empregando a polimerase térmica de alta fidelidade, a polimerase de DNA de começo quente KOD (Novagen, Madison, Wl). A reação em cadeia de polimerase foi realizada em um volume de 25 pL contendo, 1X de tampão de polimerase de DNA de começo quente de KOD, 1M de betaína (Sigma, St., Louis, MO), 1mM de MgS04, 250 μΜ de dNTPs, 5 pmols de cada iniciador e 1 unidade de polimerase de DNA de começo quente de KOD. A reação em cadeia de polimerase foi realizada em uma circuiador térmico PTC-225 DNA Engine Tetrad™(MJ Researcho Inc., Waltham, MA) empregando os seguintes parâmetros do circuiador: I. 94°C durante 2 minutos 2. 94°C durante 15 segundos 3. 70°C durante 30 segundos (-1°C por ciclo) 4. 72°C durante 5 minutos 5. Ir para a etapa 2, 9 vezes, 6. 94°C durante 15 segundos 7. 60°C durante 30 segundos 8. 72°C durante 5 minutos 9. Ir para a etapa 6, 24 vezes, 10. 72°C durante 10 minutos II. 10°C mantido 12. fim Uma segunda rodada de reação em cadeia de polimerase foi realizada para introduzir os resíduos de uridína na região onde os segmentos de DNA de filamento único terminais foram produzidos. Muitas polimera-ses de DNA são incapazes de ler os resíduos de uridina no filamento modelo de DNA ou são incapazes de polimerizar os filamentos empregando os resíduos de uridina. A reação em cadeia de polimerase foi, portanto realizada empregando uma enzima capaz de incorporar e ler as uridinas (Expand High Fidelity0 mais PCR System; Roche, Indianapolis, IN). A modificação deste método e uso de outros métodos que fornecem o resultado esperado é conhecido por aqueles versados na técnica. O constructo de DNA montado foi transformado em células com- peterttes de E. coli DH10B ElectroMAX" (Invitrogen, Carlsbad, CA). Uma alíquota de 0,5pL (microlitro) da reação de montagem foi misturada com 20 μΙ_ de células competentes DH10B ElectroMAX® em gelo e carregada em uma cubeta de eletroporação de 0,2 mm MicroPulser {Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules CA) para eletroporação. As células foram submetidas a eletroporação em 1,8 kV empregando um Eletroporador 165-2100 MicroPulser {Bio-Rad Laboratories Inc.). As células eletroporadas foram incubadas em 180 pL de meio SOC (Invitrogen Inc.) a 37°C durante 1 hora. As células foram então semeadas em placas ágar LB chapeia contendo espectinomicina (75 mg/L) e desenvolvidas durante a noite a 37°C. As colônias foram selecionadas e crescidas durante a noite em meio LB a 37°C. O constructo de DNA de plasmídeo foi isolado empregando o kit QIAprep® Spin Miniprep (QIAgen Science, Valencia, CA). O seqüenciamento de DNA foi realizado em um Analisador de DNA ABI 3730x1, empregando terminador BigDye® (Applied Biosystems, Foster City, CA). A clonagem de AsnS2 de milho, AsnS de soja, e AsnS1 de fermento seqüências de polinucleotídeo de codificação de AsnS foi concluída empregando o "método de clonagem Gateway®" como descrito pelo fabricante (Invitrogen Corp.). O objetivo do método de clonagem Gateway® é fazer um clone de expressão. Este processo de duas etapas envolve primeiro, a clonagem do gene de interesse em um vetor de entrada, seguido por subclonagem do gene de interesse do vetor de entrada em um vetor de destino para produzir um vetor de expressão. A tecnologia de clonagem é com base no sistema de recombinação de sítio específico empregado por fago lambda para integrar seu DNA no cromossoma de E. coli.

Os constructos de DNA para uso em clonagem de recombinação subseqüente, duas seqüências de recombinação de attR ou attB foram clo-nados em um vetor recombinante que flanqueia um gene de resistência de epectinomicina/Etreptomicina (SPC/STR) e uma sequência de polinucleotídeo de codificação de AsnS. As seqüências de polinucleotídeo de codificação de AsnS foram isoladas de bibliotecas genômicas ou de cDNA feitas das suas respectivas espécies empregando as seqüências iniciadoras primárias e secundárias (SEQ ID NOs 20-43). As seqüências contíguas afíBi/Rl, gene de SPC/STR, gene de AsnS, e seqüências de afíB2/R2 foram movidas como uma única molécula de polinucleotídeo a um constructo recombinante para a expressão em células de planta, os plasmídeos de DNA de filamento duplo designados pMON79706 (AsnS1 de Zea mays), pMON79700 (AsnS de Glycine max) ou pMON79653 (AsnS de Saccharomyces cerevisiaé). Estes constructos de DNA compreendem as regiões da borda direita de Agro-bacterium (O-OTH. - RB) e regiões da borda esquerda (LB), e outras descritas por Herrera-Estrella e outros, 1983; Bevan, 1984; Klee e outros, 1985, o promotor e35S (P-CAMV.35S, realçador duplicado em série Patente dos Estados Unidos 5.322.938), o elemento genético attB1/R1 (0-Lam.aflB1/R1), o gene de SPC/STR, a região de codificação de AsnS respectiva (CR), o elemento genético de aí/B2/R2 (0-Lam.attB2/R2), o terminador de inibidor II de protease de batata (St.Pis), o promotor de NOS de Agrobacterium (P-AGRtu.. nos, Fraley e outros, 1983), a borda esquerda de Agrobacterium (0-OTH. - LB), o gene de resistência de canamicina (CR-OTH. - Kan, Patente dos Estados Unidos 6.255.560), e a origem de E. coli de replication (Ec.ori, ColE).

Os constructos de DNA foram ampliados em células de Library Efftciency® DB3.1™ (Invitrogen Corporation) sob seleção de cloranfenicol (25 pg/mL) e seleção de canamicina (50 pg/mL) para pMON79706, pMON79700 ou pMON79653. O DNA de vetor foi purificado a partir de culturas bacterianas empregando-se um kit de Plasmídeo QIAGEN (QIAGEN Inc.). DNA para pMON79700, pMON79706, e pMON79653 foi introduzido nos embriões de milho como descrito na Patente US Ng 5.015.580, empregando-se o dispositivo de liberação de gene de aceleração de partícula de descarga elétrica. Para bombardeio de microprojétil de embriões imaturos pré-cultivados de LH59, 35% a 45% de voltagem máxima foi preferivelmente empregada. Seguindo o bombardeio de microprojétil, o tecido de milho foi cultivado no escuro a 27°C. Métodos de transformação e materiais para preparar plantas transgênicas desta invenção, por exemplo, vários meios e cé- lulas alvo de recipiente, transformação de embriões imaturos e regeneração subseqüente de plantas transgênicas férteis são descritos nas Patentes U.S. 6.194.636 e 6.232.526 e Publicação de Pedido de Patente U.S. 20040216189, que estão incorporados aqui por referência.

Plantas de milho transgênicas férteis foram produzidas a partir de células de milho transformadas cultivando-se calo transformado nos meios de regeneração apropriados para iniciar o desenvolvimento do broto e formação de plantinha. As plantinhas foram transferidas para o solo quando elas estavam com o talo em torno de 7,62 cm e possuíam raízes (cerca de quatro a 6 semanas depois da transferência para o meio). As plantas foram mantidas durante duas semanas em uma câmara de crescimento a 26°C, seguido por duas semanas em uma bancada de névoa em uma estufa. As plantas foram subsequentemente transplantadas em potes de 18,93 litros (5 galões) e cultivadas até a maturidade na estufa. Polinizações recíprocas foram feitas com a linhagem congênita de LH59 de milho. Semente foi coletada a partir de plantas de milho e empregada para análise de proteína e outras atividades de procriação.

Exemplo 3 Construção de vetor e transformação de milho com seqüências de polinucle-otídeo de AsnS O AsnS2 de milho (SEQ ID NO: 3, pMON79706, FIG. 1) foi ampliado por uso de PCR (reação em cadeia de polimerase). As condições de reação para a reação de PCR seguiram o protocolo do fabricante (PE Applied Biossistems, Foster City, CA). Aproximadamente 100 ng de DNA de milho, preparado como descrito acima, foram ampliados empregando-se 30 nmols cada qual do iniciador dianteiro (f) (SEC ID NO: 32) e iniciador reverso (r) (SEQ ID NO: 33) e 10 micromols cada de dATP, dCTP, dGTP e TTP, 2,5 unidades de TaKaRaLA Taq em 1X de Tampão de LA PCR II (Takara Bio INC, Shiga, o Japan). Depois da incubação inicial a 94°C durante 1 minuto, 35 ciclos de PCR foram realizados a 94°C durante 45 segundos, seguido por recozimento a 60°C durante 45 segundos, 72ÜC durante 1 minuto e 15 segundos, seguido, por 1 ciclo de 72°C durante 7 minutos.

Cinco constructos de DNA de AsnS2 foram feitos. O primeiro constructo de AsnS2 de milho foi feita isolando-se um fragmento de Asn$2 de 1821 pares de base de pMON79706 por PCR, como descrito acima, seguido por digestão de restrição com enzimas de restrição de Xbal e EcoRI. O gene de AsnS2 resultante foi ligado em pMON61560, que foi da mesma forma digerido por Xbal e EcoRI. O vetor de transporte (pMON66246) foi digerido por Notl e a inserção contendo o gene de AsnS2, em ligação operá-vel com o promotor de PPDK e terminador de RGLUT1, foi ligada em pMON30167, que foi da mesma forma digerida por Notl. O plasmídeo pMON30167, que contém o gene de EPSPS, fornece seleção com glifosato. O plasmídeo final resultante foi designado pMON66230 (FIG. 3).

Um segundo constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o gene de AsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O constructo foi feito por inserção do gene AsnS2 digerido por Xbal/EcoRI em pMON61562, que da mesma forma foi digerido por Xbal e EcoRI, resultando no gene AsnS2 sendo em ligação operável com o promotor de NAS e o terminador de R-GLUT1. O plasmídeo resultante foi digerido por Notl e ligado no pMON30167 digerido por Notl. O plasmídeo resultante foi designado pMON66229 (FIG. 2).

Um terceiro constructo de Asn£2foi feito empregando-se o gene AsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O promotor de P-FDA empregado neste constructo foi isolado a partir de pMON78810 por digestão com enzimas de restrição de Notl e Xbal. O promotor de P-FDA foi em seguida ligado em pMON66246, que foi previamente digerido por Notl e Xbal para remover seu promotor de PPDK. O plasmídeo resultante foi digerido por Notl e ligado no pMON30167 digerido por Notl. O plasmídeo resultante foi designado pMON66231 (FIG. 4).

Um quarto constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o gene AsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). O promotor de P-RTBV a ser empregado neste constructo foi gerado por PCR de pMON74576. O fragmento de 721 bp foi digerido por Notl e Xbal e ligado em pMON66246, que previamente foi digerido por Notl e Xbal. O plasmídeo resultante, con- tendo o gene AsnS2 em ligação operável com o promotor de P-RTBV e ter-minador de RGLUT1 foi digerido por Notl e ligado no pMON30167 digerido por Notl. O plasmídeo resultante foi designado pMON66239 (FIG. 5).

Um quinto constructo de AsnS2 foi feito empregando-se o gene AsnS2 anteriormente mencionado (pMON79706). Um par de iniciador de ZmASsense, 5TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG31 (SEQ ID NO:46) e ZmASanti-sense, 5'TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG; (SEQ ID NO:47), foi empregado para ampliar AsnS2 de milho de pMON66240. A organização de PCP. foi como segue: em um volume total de 50 ul de reação de PCR, 1 μΙ de 10 mM de cada iniciador de ZmASsense e ZmASantisense, 0,2 a 0,5 pg (1 μΙ) de DNA de plasmídeo de pMON66240, 5 μΙ de Mistura de Reação de 10X AccuPrime® Pfx, 1 μΙ de DNA Polimerase ACCuPrime® Pfx (Invitro-gen), e 41 μΙ de água destilada. A reação de PCR foi realizada com os seguintes parâmetros de ciclo: 94°C durante 1 minuto, seguido por 30 ciclos de 94°C durante 15 segundos para desnaturação; 58°C durante 15 segundos de recozimento, e 68°C durante 4 minutos; seguido por 10 minutos de extensão a 68°C. O produto de PCR foi purificado empregando-se um kit de purificação de PCR de QIAGEN (QIAGEN Inc.). Uma alíquota do produto de AsnS2 de milho de PCR foi digerida com enzima de restrição de Ncol e E-coRI e outra alíquota do produto de PCR foi digerida com Afllll e Ncol. O fragmento de Ncol e EcoRI foi em seguida clonado em sítios de Ncol e Eco-Rl de pMON94901. O fragmento de extremidade 5' de Afllll e Ncol de AsnS2 de milho foi clonado no Ncol e EcoRI do fragmento de AsnS2 de milho no sítio de Ncol. O plasmídeo resultante (pMON74940), contendo A$nS2 de milho em ligação operável com o promotor de e35S e o terminador de Hsp17, foi digerido por Notl e ligado em pMON53616 digerido por Notl para construir pMON74946.

Cado constructo descrito acima continha um cassete de expressão para expressão de um EPSPS Tipo II insensível a glifosato como um meio para selecionar eventos transgênicos (Patente U.S. 5.633.435). A se- qüência de ácido nucléico de cado construclo foi determinada empregando-se metodologia padrão como mencionado por terminador v.3.0 PE Applied Biossistems (PE Applied Biossistems, Foster City, CA) e a integridade das junções de cloneagem confirmada. Os vetores pMON66229, pMON66230, pMON66231, pMON66239, e pMON74946 foram empregados na transformação subseqüente de células de milho e regeneração destas células em plantas de milho intactas. Os constructos de interesse foram introduzidas em embriões imaturos de linhagem de milho LH244 por um método de transformação mediado por Agrobacterium, por exemplo, como descrito no Pedido de Patente Publicado U.S. 20050048624.

Exemplo 4 Análise de proteína e aminoácído de amostras de semente de milho.

Este exemplo apresenta um método de análise de proteína e aminoácido para selecionar semente da presente invenção com proteína e asparagina aumentada empregando-se HPLC e medidas de infravermelho próximas. Para análise de proteína de semente, amostras de volume pequenas consistindo em 50 - 100 sementes para cada tratamento foram medidas empregando-se espectroscopia de transmitância de infravermelho próxima (Infratec modelo 1221, Tecator, Hoganas Sweden). Este procedimento foi baseado na observação que uma relação linear existe entre a absorção de radiação infravermelha próxima e a quantidade de componentes químicos compreendida em uma amostra de semente típica. Antes de analisar amostras desconhecidas, dados espectrais foram coletados com amostras de calibre que foram subseqüentemente analisadas empregando-se uma técnica de análise primária. A técnica primária empregada foi combustão de nitrogênio (Murray e Williams, 1987). Um modelo multivariado foi desenvolvido empregando-se os dados espectrais do espectrõmetro e os dados primários. No presente caso, um modelo multivariado PLS 1 (Partial Least Squares Re-gression Type I) foi construído empregando-se 152 amostras de calibre. Cada amostra desconhecida foi varrida no espectrõmetro pelo menos cinco vezes e seu teor de proteína pré-dito com cada varredura. Cada tempo que a amostra foi varrida, foi adicionado outra vez a cubeta de amostra para for- necer uma representação exata da amostra testada. Os valores de proteína pré-ditos foram calculados para as varreduras múltiplas e em seguida relatados para cada amostra.

Análise de aminoácido livre foi realizada em tecidos de milho por HPLC. Para cada amostra, 20 - 50 mg de tecido de liofiiizado foi extraído com 1,5 ml_ de 10% de ácido tricloroacético em tubos de micrófogo de 2 mL. Amostras foram extraídas em temperatura ambiente durante a noite com agitação suave. Amostras extraídas foram clareadas por centrifugação e o sobrenadante foi removido durante outra análise. Análise de aminoácido livre foi realizada por HPLC em uma HPLC Agilent Serie 1100 com um detector de fluorescência e autoamostrador de placa de 96 cavidades equipado com uma coluna Zorbax Eclipse AAA C18 (4,6 x 75 mm, 3,5 mícrons, Agilent Technologies, Paio Alto, CA) e coluna protetora analítica Zorbax Eclipse AAA (4,6 x 12,5 mm, 5 mícrons). Amostras foram pré-derivatizadas com o-ftalaldeído imediatamente antes da separação. Aminoácidos livres foram resolvidos com um tampão de fosfato de 40 mM, pH 7,6 / gradiente de Me-tanol/Acetonitrilo seguido por detecção de fluorescência a 340 nm / 450 nm (excitação / emissão). Aminoácidos livres foram quantificados com base em padrões de aminoácido externos e picos foram integrados com software ChemStation (Agilent). Desvios padrão relativos foram tipicamente menores do que 8%.

Exemplo 5 Avaliação de campo de níveis de asparaqina e teor de proteína de grão em plantas de milho transqênicas.

Este exemplo apresenta os resultados de uma avaliação de campo dos efeitos do constructo de AsnS de milho (pMON79706 e pMON92870) em asparagina e níveis de proteína em semente e plantas de milho transformadas; e os efeitos dos constructos de AsnS de milho (pMON79700 e pMON79653) sobre o teor de proteína de grão. A concentração relativa de asparagina livre em tecidos de milho foi obtida a partir de linhagens inatas derivadas de plantas de milho R0 transformadas com pMON79706 ou pMON92870. Para pMON79706, transformantes de R0 fo- ram cruzados reversivelmente ao inato origem, LH59, para criar semente de BC-,. A semente de BCi que segrega com o transgene, foi plantada em uma sementeira de campo e plantas individuais foram marcadas quanto à presença do gene marcador de NPTII. O tecido da folha foi coletado para análise de aminoácido livre de plantas positivas de transgene e negativas de transgene para cada evento transgênico para análise de aminoácido livre. Aminoácidos livres de folha de plantas transgênicas de pMON79706 foram comparados às plantas de isolina negativa dentro de cada evento e analisados estatisticamente pelo teste T de Student com o software JMP 5.1 (SAS Institute, Cary, NC). Para pMON92870, transformantes de Ro foram cruzados reversivelmente ao inato de origem, LH244, para criar semente de BCt. A semente de BC1 foi plantada em uma sementeira de campo e autopolini-zada para criar a semente de BCiSt, que subseqüentemente foi plantada em uma segunda sementeira congênita. Plantas positivas de transgene foram identificadas para cada evento transgênico seguindo marcação quanto à presença do gene marcador de NPTII. Tecido de folha foi coletado a partir de plantas de BC1S1 positivas de transgene e lotes inatos parentais plantados em intervalos regulares na sementeira. Aminoácidos livres de folha para pMON92870 foram analisados estatisticamente realizando-se análise de variação e comparando entradas transgênicas ao controle parenteral conduzindo-se teste T Student empregando-se software SAS 9.1. Para análises de aminoácido livre para ambos os constructos, tecido de folha foi coletado por remoção de uma folha totalmente expandida superior em um ântese seguido por congelamento em gelo seco. Amostras de folha foram moídas congeladas, liofilizadas, e medidas quanto ao teor de aminoácido livre por HPLC.

Eventos transgênicos múltiplos de pMON79706 e pMON92870 foram observados para mostrar aumentos significativos no teor de asparagi-na na folha (Tabela 2). Quatro de sete eventos de pMON79706 testados mostraram aumentos significantes na concentração de asparagina na folha, como indicado por um valor de p de 0,05 ou menor. Em eventos transgênicos de pMON92870, expressando um segundo gene de asparagina sinteta-se de milho, quatro de cinco eventos mostraram aumentos significantes em níveis de asparagina na folha ^Tabela 2). Estes dados mostram que expressão transgénica de AsnS2 de milho e AsnS3 de milho sob promotor de acti-na de arroz em pMON79706 e pMON92870, respectivamente, pode resultar em um aumento específico em asparagina livre, que é consistente com a superexpressão de asparagina sintetase ativa. A concentração relativa de proteína em semente de milho foi obtida a partir de linhagens inatas derivadas a partir de plantas de milho Ro transformadas com pMON79706 ou pMON92870. Plantas transgênicas de BCi de pMON79706 (descritas acima) foram autopolinizadas e o grão de BC1S1 resultante foi cultivado até a maturidade e medido quanto ao teor de proteína por espigas únicas. Proteína foi medida como uma porcentagem em peso seco a 0% de umidade. Proteína de grão para plantas transgênicas de pMON79706 foi comparada para plantas de isolina negativas dentro de cada evento e estatisticamente analisadas pelo teste T de Student com software SAS 9.1. Para pMON98270, plantas de BC1S1 foram autopolinizadas e cultivadas até a maturidade e medidas quanto ao teor de proteína por únicas espigas. Proteína de grão para pMON92870 foi estatisticamente analisada com um método espacial desenvolvido de costume conduzindo-se uma análise por localização. A análise por localização é um processo de duas etapas. A primeira etapa na análise envolveu estimar a autocorrelação espacial no campo ajustando-se um modelo de semivariograma esférico anisotrópico empregando-se todos os lotes de teste espaciais que foram colocados sistematicamente no campo (cada 6e lote). O segundo estágio de análise envolveu ajustar os valores das entradas transgênicas para a variabilidade espacial empregando-se a estrutura de autocorrelação espacial estimada no primeiro estágio da análise. Seguindo o ajuste para autocorrelação espacial, comparação média foi realizada onde o valor médio de uma entrada trans-gênica foi comparado ao controle parental para testar a significação estatística da diferença entre um transgene e a média de controle.

Eventos múltiplos de ambos pMON79706 e pMON92870 mostraram aumentos significantes no teor de proteína de grão inato (Tabela 3). Três de cinco eventos de pMON79706 que foram estatisticamente analisa- dos mostraram aumentos significantes no teor de proteína de grão (p < 0,05) e dois outros eventos mostraram tendências para aumentos significantes <p < 0,15). Dois eventos não devolveram números suficientes de espigas para uma análise estatística. Três de quatro eventos transgênicos de pMON92870 mostraram aumentos significantes em teor de proteína de grão {p < 0,1), com um evento não testado devido aos números insuficientes de espigas para análise. Estes dados confirmam que pMON79706 e pMON92870 produzem eventos transgênicos que aumentam teor de proteína de grão no milho além do teor de asparagina na folha crescente.

Tabela 2. Concentrações de asparaaina na folha relativas em milho inato transformado com gene AsnS2 de milho (pMON797Q6) ou gene AsnS3 de milho (PMON9287Q). a Asparagina na folha foi determinada em duas experiências separadas para pMON79706 e pMON92870. b Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidos livres totais no tecido da folha Tabela 3. Teor de proteína de qrao no milho inato transformado com gene AsnS2 de milho (pMON797Q6) ou gene AsnS3 de milho (PMON9287ÇQ. a Proteína de grão foi determinada em duas experiências separadas para pMON79706 e pMON92870. b Proteína de grão medida como uma porcentagem de composição de grão total em uma base de umidade a 0%. c nd; não determinado. A asparagina elevada e fenótípo de proteína de grão pMON79706 foram confirmados em tecidos múltiplos em uma segunda experiência. Depois da geração de BCi, cinco eventos de pMON79706 foram autopolinizados em duas sementeiras seguintes para gerar a semente de BC1S3 que foi homozigota para 0 transgene. A concentração relativa de asparagina que é 0 resultado da expressão do constructo de pMON79706 foi determinada em um estudo no estágio de crescimento V8 do milho comparando-se as plantas BC1S3 homozigotas e um controle de variedade de milho LH59 (Tabela 4). Controles e entradas transgênicos foram plantados em um projeto de bloco completo aleatorizado com 5 blocos reproduzidos em um lote de campo. As folhas completamente expandidas superiores e se- ções de caule de duas plantas foram experimentadas e agrupadas, colocadas em gelo seco, moídas, liofilizadas, e medidas quanto ao teor de aminoá-cido livre por HPLC. Os valores seguidos por " * " indicam uma diferença significante do controle de LH59 (teste de uma cauda de Dunnett; (SAS 9.1, Cary, NC). Medidas de asparagina tiradas tanto no estágio de crescimento V8 quanto na geração de Ri mostraram que plantas de cinco eventos de pMON79706 tiveram aumentos significantes em asparagina livre. Níveis de asparagina livre relativos em tecido de folha de V8 foram aumentados até 13,9% quando comparados a 3,4% no controle de variedade de LH59, e asparagina no talo foi aumentada até 39% quando comparada a 9,6 no controle (Tabela 4). Para análise de proteína de grão, 10 espigas foram experimentadas por lote, debulhadas e analisadas quanto a concentração de proteína de grão. Proteína de grão também foi aumentada significativamente nos cinco eventos de pMON79706 (Tabela 4). Os resultados mostram que, como uma tendência geral, eventos que produzem um aumento significante em asparagina também produzido como aumento significante na proteína da semente (Tabelas 2 a 4).

Tabela 4, Concentrações de asparagina relativas em estágio de crescimento V8 e concentração de proteína de grão na maturidade em plantas de milho BCiSrj transformadas com o gene AsnS2 de milho (pMON797Q6). * Significante em p<0,05 Aumentos significantes na proteína de grão híbrido foram observados por três constructos diferentes que expressam genes de asparagina sintetase sob o promotor de actina de arroz. Linhagens de milho inatas ho- mozigotas foram produzidas de eventos transgênicos de R0 de pMON79706 (AsnS2 de milho), pMON79700 (AsnS de soja), e pMON79653 (AsnS1 de levedura) primeiro por cruzamento reversível de eventos de Ro à origem repetida, LH59, seguido por autopolinizações de seleções positivas de trans-gene em duas sementeiras inatas subseqüentes empregando-se o marcador selecionável de NPTII para marcar quanto a zigosidade. Os eventos homo-zigotos para cado constructo foram, em seguida, empregados como um doador de pólen macho em um cruzamento com uma linhagem inata fêmea para criar o híbrido de A semente híbrida de F-ι foi plantada em uma experiência de múltiplas localizações e eventos transgênicos para cado constructo foram analisados quanto a proteína de grão final e comparados ao controle híbrido de origem repetida periódica seguindo uma análise de correção espacial com base na proteína de grão em híbridos de controle que foram plantados em intervalos regulares ao longo do campo. O grão foi colhido de cada lote, debulhado e analisado quanto ao teor de proteína. Os dados foram analisados empregando um método espacial desenvolvido de costume conduzindo-se uma análise por localização e uma de localização em cruz. A análise por localização é um processo de duas etapas. A primeira etapa na análise envolveu estimar a autocorrelação espacial no campo ajustando-se um modelo de semivariograma esférico anisotrópico empregando-se todos os lotes de teste espaciais que foram colocados sistematicamente no campo (cada 3e lote). O segundo estágio de análise envolveu ajustar os valores das entradas transgênicas para a variabilidade espacial empregando-se a estrutura de autocorrelação espacial estimada no primeiro estágio da análise. Seguindo o ajuste para autocorrelação espacial em cada localização separadamente, uma análise de localização em cruz foi conduzida onde o valor médio de uma entrada transgênica foi extraída comparado ao controle parental para testar a significação estatística (P=0,20) da diferença entre um transgene e o meio de controle. Todos os cinco eventos de pMON79706 mostraram aumentos significantes em proteína de grão na experiência híbrida, consistente com a observação que a proteína de grão foi aumentada nas linhagens inatas de eventos transgênicos desto constructo (Tabela 5). Dois outros constructos de asparagina sintetase, pMON79700 (AsnS de soja) e pMON79653 (AsnS de levedura), também mostraram aumentos significantes em níveis de proteína de grão em dois de cinco eventos e dois de dois eventos, respectivamente.

Tabela 5. Teor de proteína de grão em milho híbrido transformado com genes para asparagina sintetase de milho (Zea mavs), soía (Glvcine max), e levedura (Saccharomvces cerevisiae)3. a Proteína de grão medida como uma porcentagem de composição de grão total em uma base de umidade a 0%.

Exemplo 6 Avaliação de campo da expressão de transgene e atividade de enzima de asparagina sintetase devido à PMON79706 e pMON9287Q

Expressão de transgene foi confirmada em eventos transgênicos de pMON79706 e pMON92870. Para pMON79706, tecido empregado para a determinação do teor de asparagina na folha na experiência de campo com linhagens inatas homozigotas de BC1S3 foi, da mesma forma, empregado para determinação da expressão de transgene com base na medida da expressão da seqüência de terminador 3' (St.Pis4) de pMON79706 em ántese.

Duas amostras de folha foram colhidas e agrupadas de cada dentre 5 lotes de réplica (10 para controle inato) e congeladas em gelo seco. Amostras de folha foram, em seguida, moídas congeladas para análise de expressão. Para extração de RNA, 50 mg de tecido congelado foram aliquotadas em placas de 96 cavidades. Cada amostra foi extraída com 500 μΙ de tampão de lise contendo uma solução de 1:1 de solução de lise de ácido nucléico de ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) para 1X de PBS ph 7,4 (sem MgCI ou CaCI). RNA foi extraído de amostras de tecido congeladas frescas empregando-se placas de filtro para capturar ácidos nucléico de lisados crus, e 50 μΙ de tampão de eluição de ABI foram empregados para eluir RNA ligado. PCR quantitativa foi realizada empregando-se um padrão de RNA com 5 μΙ com 5 μΙ de reagente de RT-PCR de uma etapa de ABI. As reações foram realizadas durante 40 ciclos de PCR em um instrumento de PCR ABI Taq-man 7900, com parâmetros de ciclagem de 48°C durante 30 minutos, 95°C durante 10 minutos, 95°C durante 10 segundos, 60°C durante 1 minuto. Medidas fluorescentes foram tiradas de cada cavidade em cada dentre os 40 ciclos igualmente para a seqüência de terminator derivada do inibidor de pro-tease de batata II (St.Pis4) e o controle endógeno (ubiquitina). Um subgrupo de amostras foi conduzido sem transcriptase reversa para monitorar a contaminação de DNA. As amostras foram marcadas quanto a expressão relativa subtraindo-se os valores limiares de ciclo para St.Pis4 do valor limiar de ciclo do controle endógeno. O limiar de ciclo (Ct) foi determinado, e o Ct de delta foi calculado de St.Pis4 menos o valor de controle endógeno. Um tipo silvestre ín situ foi criado calculando-se os sinais de controle endógeno médio e fixando-se o valor de sinal de St.Pis4 em 40. O Ct de delta das amostras desconhecidas foi subtraído do Ct de delta do tipo silvestre in situ. Dados finais foi relatado como expressão de pinll (St.Pis4) relativos ao tipo silvestre. Análise de RT-PCR quantitativa confirmou a superexpressão do transgene de seis de seis eventos de pMON79706 (FIG. 6).

Expressão de transgene também foi confirmada em eventos inatos que compreendem pMON92870. Expressão de RNA foi determinada do tecido de folha em ântese de plantas inatas cultivadas em uma sementeira de campo colhendo-se primeiro uma folha expandida superior de cada planta (4-8 plantas por evento) e congelando-se em gelo seco. Plantas positivas de transgene foram previamente identificadas com base na presença do gene marcador de NPTII. Tecido de folha foi moído enquanto congelado, e analisado quanto a expressão da sequência de terminador 3' (St.Pis4) de pMON92870. Análise de RT-PCR quantitativa mostrou que cinco de seis eventos que compreendem pMON92870 mostraram expressão de transgene aumentada quando comparados a um controle inato (FIG. 7). A baixa expressão de RNA no evento de pMON92870 ZMJM103316 é consistente com o baixo teor de asparagina na folha e teor de proteína de grão neste evento. O efeito de expressão de genes de asparagina sintetase sobre a atividade de asparagina sintetase foi medido em eventos transgênicos de pMON79706 e pMON92870. Tecido de folha moído, congelado foi aliquota-do (200 - 400 mg) em cavidades de uma placa de 96 cavidades profundas pré-resfriadas. Proteína foi extraída em Tampão A (100 mM de Hepes-OH, pH 8,0, 0,1 mM de EDTA, 10 mM de MgCI2, 2 mM de aspartato, 0,5 mM de DTT, 67 mM de mercaptoetanol, 20% (v/v) de glicerol, 0,1 mM de ATP, 1% (v/v) de P9599 (Sigma Company), 25 mM de KCI). Uma quantidade pequena de areia foi adicionada a cada cavidade. Tampão A foi, em seguida, adicionado ao tecido da folha nas cavidades em uma relação de 4:1 (tam-pão:tecido). As placas foram, em seguida, agitados em um agitador de pintura durante 2 minutos para misturar a amostra e, em seguida, centrifugadas em 5000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante (100 - 200 μΙ_) foi dessali-nizado em uma placa macro giratória de 96 cavidades (SNS S025L, The Nest Group Inc., Southboro, MA) equilibrada em tampão A. O sobrenadante foi, em seguida, analisado imediatamente ou congelado em nitrogênio líquido e mantido a -80°C até empregado. Para analisar a atividade de asparagina sintetase, extratos de proteína dessalinizados (10-50 μΙ_) foram adicionados às cavidades contendo 100 μ!_ de solução de ensaio (100 mM de He-pes, pH 8,0, 10 mM de MgCI2, 2 mM de aspartato, 5 mM de DTT, 10 mM de ATP, 1 mM de ácido amino(oxi)acético (inibidor de aspartato amino transfe-rase), 1 mM de semialdeído aspártico (inibidor de asparaginase). Para começar a reação, glutamina (concentração fina! de 2 mM para ensaio pa drão) foi adicionada à solução, que foi em seguida misturada. A mistura de ensaio foi, em seguida, incubada durante 1 a 2 horas. A reação foi, em seguida, interrompida pela adição de um volume igual de 20% (p/v) de ácido tricloroacético. A mistura foi, em seguida, filtrada para remover o precipitado e asparagina foi medido por HPLC. Tamanho da amostra foi aumentado de 0,5 μΐ_ para 2,5 μΐ_ para HPLC, comprimento de onda de excitação foi reduzido de 340 nm para 235 nm, e o ganho de fluorímetro foi aumentado de 10 para 13. Isto resulta em uma sensibilidade de detecção de 0,5 para 100 μΜ de asparagina e permite a medida de níveis de atividade nos 100s microuni-dades.

Para pMON79706, tecido empregado para a determinação da atividade de enzima de asparagina sintetase na folha foi de uma experiência de campo com linhagens inatas homozigotas de BC1S3 colhidas no estágio de crescimento de V7. Eventos de pMON79706 foram mostrados para exibir atividade de asparagina sintetase de folha aumentada (Tabela 6). A atividade de asparagina sintetase foi aumentada até 5 vezes sobre o controle de variedade inata. Atividade de enzima de asparagina sintetase também foi determinada para eventos transgênicos de pMON92870 em uma sementeira de campo inato no momento de ântese, Quatro de cinco eventos de pMON92870 também mostraram atividade de enzima aumentada (Tabela 6). A atividade de enzima de asparagina sintetase aumentada em plantas de milho que expressam o AsnS2 de milho (pMON79706) ou AsnS3 de milho (pMON92870) sob o promotor de actina de arroz é consistente com o aumento na expressão de gene e aumentos de asparagina de folha observados com estes constructos.

Tabeia 6. Atividade de asparagina smtetase em linhagens inatas de eventos transqênicos de PMON79706 e pMON9287Qa. 3 Atividades de enzima para pMON79706 e pMON92870 foram determinadas a partir de duas experiências de campo diferentes.

Exemplo 7 Avaliação de campo dos efeitos de pMON66231, PMQN66239, e PMON74946 sobre asparagina e teor de proteína de grão O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtido de linhagens híbridas derivadas de plantas de milho de R0 (base de LH244) transformadas com pMON66231 (FIG. 4), onde AsnS2 de milho está sob o controle do promotor de FDA de milho. Híbridos foram feitos cruzando as plantas de R0 à linhagem inata masculina LH59, que cria uma população de Fi segregadora (1:1). A semente Fi resultante foi plantada em três localizações do meio-oeste com duas replicações em cada localização. Lotes foram pulverizados com glifosato no estágio de crescimento V3 para eliminar se-gregantes nulos. Um controle híbrido foi semeado no perímetro e comparações foram feitas ao controle híbrido. Folhas superiores foram coletadas e agrupadas de três plantas dentro de cada lote no momento de ântese, duas horas depois do pôr-do-sol. em todos as três localizações. As folhas foram colocadas imediatamente sobre gelo seco e, em seguida, armazenadas a -80°C até o processo. As folhas foram moídas congeladas, e uma porção foi liofilizada para análise de aminoácido livre por HPLC. Os dados foram primeiro avaliados quanto aos valores discrepantes com o método de duas passagens para resíduos estudados deletados empregando-se valores de p ajustados por Bonferroni. Valores discrepantes foram identificados e removidos do grupo de dados antes que a análise dos cálculos de variação discrepância fosse iniciada. Os dados foram analisados de acordo com projeto de bloco completo aleatorizado de localizações em cruz. Combinações de cons-tructo-evento foram modeladas com efeitos fixos, e as localizações e reps dentro de localizações foram modelados com efeitos aleatórios. Comparações de tratamento foram feitas realizando-se contrastes dos meios de mínimos quadrados das combinações de constructo-evento. Asparagina de folha relativa foi aumentada significativamente em 11 de 12 eventos de pMON66231, com níveis de asparagina tão altos quanto 16% quando comparados a 3% no controle (Tabela 7). Proteína de grão madura foi da mesma forma medida depois da colheita de 10 espigas por lote seguido por debu-Ihamento e agrupamento da semente para cada lote, que foi em seguida medido quanto ao teor de proteína de grão. Nove de 12 eventos foram encontrados para significativamente aumentar o teor de proteína no grão maduro sobre o controle híbrido de LH244/LH59.

Tabela 7. Asparagina na folha relativa e teor de proteína de grão maduro em eventos transqênicos de PMON66231. β Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidos livres totais no tecido da folha b Comparado ao controle híhrído O teor relativo de asparagina livre em tecidos de milho foi obtido de linhagens híbridas derivadas de plantas de milho de Ro (base de LH244) transformadas com pMON66239 e pMON74946, onde AsnS2 de milho está sob o controle do promotor de RTBV ou e35S, respectivamente. Híbridos foram feitos cruzando-se as plantas de Ro à linhagem inata masculina, LH59, que cria uma população de Fi segregadora (1:1). A semente de resultante foi plantada em uma localização no Havaí com três replicações para cada evento transgênico. Os lotes foram pulverizados com glifosato no estágio de crescimento V3 para eliminar os segregantes nulos. Um controle híbrido que necessita do gene de AsnS2 de milho foi incluído para comparação. Folhas superiores foram coletadas e agrupadas de três plantas dentro de cada lote na hora de ântese, duas horas depois de pôr-do-sol. As folhas foram colocadas imediatamente sobre gelo seco e, em seguida, armazenadas a -80°C até o processo. As folhas foram moídas congeladas, e uma porção foi liofili-zada para análise de aminoácido livre por HPLC. Os dados foram primeiro avaliados quanto aos valores discrepantes com o método de duas passagens para resíduos estudados deletados empregando-se valores de p ajustados por Bonferroni, Valores discrepantes foram identificados e removidos do grupo de dados antes que a análise de cálculos de variação fosse iniciada. Os dados foram analisados de acordo com um projeto de bloco completo aleatorizado. Combinações de constructo-evento foram modeladas com efeitos fixos, e reps foram modelados com efeitos aleatórios. Comparações de tratamento foram feitos realizando-se contrastes dos meios de mínimos quadrados das combinações de constructo-evento. Asparagina na folha relativa foi aumentada significativamente em 10 de 13 eventos de pMON74946, com níveis de asparagina tão altos quanto 16% quando comparados a 2% no controle (Tabela 8). Proteína de grão maduro também foi medida depois da colheita de todas as espigas por lote seguida por debulhamento e agrupa-mento da semente para cada lote, que foi em seguida medida quanto ao teor de proteína de grão e analisada estatisticamente quanto à característica de asparagina na folha. Dez de treze eventos foram encontrados para possuir teor de proteína significativamente aumentado no grão maduro quando comparado ao controle híbrido, e os mesmos 10 eventos com asparagina na folha aumentada também mostraram proteína aumentada na experiência de híbrido. Para eventos transgênicos de pMON66239, 11 de 15 eventos mostraram aumentos no teor de asparagina na folha, e 3 de 15 eventos mostraram aumentos significantes na proteína de grão no nível alfa de 0,05, embora cinco eventos transgênicos adicionais mostraram proteína aumentada em p < 0,15, indicando que a expressão de AsnS2 de milho sob o promotor de RTBV (pMON66239) pode aumentar o teor de asparagina na folha e teor de proteína de semente, mas em uma extensão menor que sob o promotor de e35s (pMON74946) (Tabela 8).

Tabela 8. Asparagina na folha relativa e teor de proteína de grão maduro em pMON74946 e eventos transgênicos de PMON66239. a Asparagina livre relativa medida como uma porcentagem de aminoácidos livres totais no tecido da folha bComparado ao controle híbrido.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente estão aqui incorporados por referência a mesma extensão como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência.

REFERÊNCIAS

As referências seguintes, a medida que elas fornecem detalhes processuais exemplares ou outros adicionais àqueles mencionados aqui, sao especificamente incorporados aqui por referência: Patente U.S. 4.761.373 Patente U.S. 4.957.748 Patente U.S. 5.100.679 Patente U.S. 5.219.596 Patente U.S. 5.322.783 Patente U.S. 5.322.938 Patente U.S. 5.538.880 Patente U.S. 5.550.318 Patente U.S. 5.563.055 Patente U.S. 5.610.042 Patente U.S. 5.633.435 Patente U.S. 5.936.069 Patente U.S. 6.005.076 Patente U.S. 6.146.669 Patente U.S. 6.156.227 Patente U.S. 6.194.636 Patente U.S. 6.232.526 Publicação do Pedido de Patente U.S. 20040216189A1 Publicação do Pedido de Patente U.S. 20050048624A1 Alba, Plant J., 39(5): 681-808, 2004.

Allard, Em: Principies of Plant Breeding, 2a Ed., John Wiley & Sons, ISBN: 0471023094, 1999.

Altschul e outros, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997, Aslanidis e de Jong, Nucleic Acids Res., 18(20):6069-6074, 1990.

Ausubel e outros, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989.

Bevan, Nucleic Acids Res., 12:8711-8721,1984.

Chu e outros, Scientia Sinica, 18:659, 1975.

Dellaporta e outros, Plant Molecular Biology Repórter, 1:19-21, 1983.

REIVINDICAÇÕES

Claims (9)

1. Método de produzir uma planta de milho transgênica com as-paragina aumentada, caracterizado pelo fato de que compreende: a) transformar uma célula de milho com uma construção de DNA heteróloga compreendendo uma molécula de promotor funcional em uma célula de milho operavelmente ligada a uma molécula de DNA codificando um polipeptídeo de asparagina sintetase; b) regenerar a célula de milho em uma planta de milho intacta; c) selecionar uma planta de milho que tem asparagina aumentada em um tecido relativo a um tecido de planta de milho não transformado com a referida construção de DNA; d) cultivar a planta de milho até a maturidade; e e) colher uma semente da planta de milho, em que a referida molécula de DNA compreende uma sequência de ácido nucléico compreendendo uma sequência de SEQ ID NO:5.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sintetase compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:6.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida molécula de DNA compreende a sequência de ácido nucléico de SEQ ID NO:5.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreendendo a etapa de: f) selecionar uma semente com proteína aumentada.

5. Farinha de milho com proteína aumentada relativa a outras farinhas de milho, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA heteróloga compreendendo uma sequência de SEQ ID NO:5.

6. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo de asparagina sintetase de milho é um polipeptídeo de AsnS2 de milho.

7. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de DNA compreende a sequência de SEQ ID N0:5.

8. Farinha de milho de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de DNA codifica um polipeptídeo de SEQ ID NO:6.

9. Alimento, caracterizado pelo fato de que é feito a partir da farinha de milho como definida na reivindicação 5.