BRPI0610824A2 - compostos derivados de purina, uso dos mesmos e composição contendo os referidos compostos - Google Patents

Abstract

COMPOSTOS DERIVADOS DE PURINA, USO DOS MESMOS E COMPOSIçãO CONTENDO OS REFERIDOS COMPOSTOS. Compostos úteis no tratamento de doença auto-imune são descritos pela seguinte fórmula geral: n = 0-2 m = 0-2 m não é necessariamente igual a n onde R~ 1~, R~ 3~ = NH~ 2~, F, CI, grupo C~ 1~-C~ 4~ alcóxi ou fenóxi, mas R~ 1~ é não necessariamente igual a R~ 3~; e R~ 2~ = H, F, Cl, NH~ 2~, ou NH-R-XH; ondeR=-(CH~ 2~)p- p = 2 a 4 X = CH~ 2~, NH, O, ou S.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "COMPOS-TOS DERIVADOS DE PURINA, USO DOS MESMOS E COMPOSIÇÃOCONTENDO OS REFERIDOS COMPOSTOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o benefício de Pedido dos Estados Unidosprovisório Ne 60/681.141, depositado em 16 de Maio de 2005.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção compreende novos compostos descritospela seguinte fórmula geral:

n = 0-2

m = 0-2

m não é necessariamente igual a n

onde R-i, R3 = NH2, F, Cl, grupo C1-C4 alcóxi ou fenóxi, mas Ri é não neces-sariamente igual a R3; e

R2 = H, F, Cl, NH2, ou NH-R-XH;

onde R = -(CH2)p- p = 2 a 4

<formula>formula see original document page 2</formula>

X = CH2, NH, O, ou S.

Estes compostos são úteis pelo fato de que eles podem serusados para o tratamento de doenças auto-imunes.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Doença auto-imune refere-se a qualquer de um grupo de doen-ças ou distúrbios nos quais lesão de tecido é associada com uma respostaimune humoral e/ou mediada por célula aos constituintes corporais ou, emum sentido mais amplo, uma resposta imune a própria pessoa. A respostaimune patológica pode ser sistêmica ou específica de órgão. Isto é, por e-xemplo, a resposta imune direcionada a própria pessoa pode afetar articula-ções, pele, a bainha de mielina que protege neurônios, rim, fígado, pân-creas, tiróide, adrenais, e ovários. De fato, a lista de doenças auto-imunes écomposta de mais do que oitenta distúrbios. Algumas doenças auto-imunestais como vitiligo, nas quais emplastros de pele perdem pigmentação, sãomeramente incômodo. Outros mais são debilitantes, freqüentemente pro-gressivo com o tempo e eventualmente fatal. Lúpus eritematoso sistêmico(SLE), por exemplo, é uma doença crônica na qual 10 a 15% de pacientesmorrem dentro de uma década de diagnose. Em todas, menos algumas do-enças auto-imunes, a relação de sexo desvia-se para as mulheres. Por e-xemplo, em SLE a relação de pacientes femininos para masculinos é novepara um. Em um caso particular, doença de Hashimoto na qual o sistemaimune ataca a glândula tiróide, a relação é cinqüenta para um.

Foi conhecido por muito tempo que formação de complexo imu-ne desempenha um papel na etiologia e progressão de doença auto-imune.Por exemplo, em Goodman e Gilman's The Pharmacological base of tera-pêuticos, 16§ Edition (1980), Macmillan Publishing Co., na página 683, infla-mação em pacientes com artrite é estabelecida a provavelmente envolverfagocitose por leucócitos de complexos de antígeno, anticorpo e comple-mento - complexos imunes. No entanto, apenas agora está sendo reconhe-cido que inflamação causada por complexos imunes nas articulações (artri-te), os rins (glomerulonefrite), e vasos sangüíneos (vasculite) é uma principalcausa de morbidez em doenças auto-imunes tal como notado por Hogarth,P.M., et ai, Annual Reports em Medicinal Chemistry 37:17-224 (2002). For-mação de complexo imune aumentada correlaciona-se com a presença deanticorpos direcionados a própria pessoa ou assim chamados auto-anticorpos, e a presença do segundo pode também contribuir para inflama-ção de tecido ou como parte de um complexo imune ou não ligado a antíge-no (anticorpo livre). Em algumas doenças auto-imunes, a presença de auto-anticorpo livre contribui significantemente para a patologia da doença. Isto foiclaramente demonstrado por exemplo, em SLE (anticorpos anti-DNA), ITP(resposta de anticorpo direcionada a plaquetas), e artrite reumatóide a umnível menor (fator reumatóide reativo a IgG). O importante papel de comple-xos imunes e auto-anticorpos livres é também demonstrado pelo fato de quetratamento bem-sucedido de certas doenças auto-imunes foi alcançado pelaremoção de complexos imunes e anticorpo livre por mecanismos de proce-dimentos de imunoadsorção específica. Por exemplo, o uso de um procedi-mento de aferese no qual complexos imunes e anticorpos são removidos porpassagem de um sangue de paciente através de uma coluna de imunoafini-dade (PROSORBA®) foi aprovado pelo FDA dos Estados Unidos em 1987para trombocitopenia imune (ITP) e em 1999 para artrite reumatóide. No en-tanto, correntemente não há nenhum método aprovado para o tratamento dedoenças auto-imunes o qual facilita a eliminação de complexos imunes eauto-anticorpos por administração de um fármaco.

Outro aspecto da etiologia e progressão de doença auto-imune éo papel de citocinas pró-inflamatórias. Sob circunstâncias normais, citocinaspró-inflamatórias tais como fator a de necrose de tumor (TNFa) e interleuci-na-1 (IL-1) desempenham um papel protetor na resposta a infecção e es-tresse celular. No entanto, as conseqüências patológicas as quais resultamde produção crônica e/ou excessiva de TNFa e IL-1 acredita-se sustentar aprogressão de muitas doenças auto-imunes tais como artrite reumatóide,doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, e psoríase. Outras citoci-nas pró-inflamatórias incluem interleucina-6, interleucina-8, interleucina-17, efator estimulante de colônia de granulócito-macrofago. No entanto, pareceque TNFa está no topo da cascata pró-inflamatória de citocina. Isto é, emtermos de bloqueio de uma citocina pró-inflamatória, o bloqueio de TNFaforneceria o efeito terapêutico máximo. A capacidade de TNFa para sub-regular outras citocinas pró-inflamatórias é revista por Feldmann, M., inPerspectives 2:364-371 (2002). Realmente, o impacto do antagonismo deTNFa como uma opção de tratamento para artrite, artrite psoriática, psoría-se, e doença de Crohn foi ilustrado pela aprovação da FDA dos Estados ti-nidos de REMICADE® (anticorpo monoclonal anti-TNFa quimérico), EN-BREL® (proteína de fusão de receptor de p75 de TNFa solúvel), e HUMIRA®(anticorpo monoclonal anti-TNFa humano).

Tal como pode ser inferido da descrição acima quanto à etiologiae progressão de doença auto-imune, sua patogênese é complexa e multifa-torial. Como tal, há uma multidão de terapias disponíveis. No entanto, a mai-oria das doenças auto-imunes é insuficientemente controlada por tratamen-tos convencionais. Tratamentos de técnica anterior não são uniformementeeficazes e são freqüentemente associados com toxicidade moderada a seve-ra. Não obstante, a descrição acima indica que há uma necessidade porcompostos orgânicos bem definidos simples os quais podem ajudar o corpoeliminar complexos imunes ou pelo menos prevenir a deposição de comple-xos imunes circulantes e/ou (simultaneamente) inibir a atividade de TNFa,enquanto ainda sendo bem tolerados pelo paciente. Em resumo, há umanecessidade por um tratamento ainda bem tolerado eficaz de doença auto-imune crônica.

A presente invenção fornece compostos que são úteis para otratamento de doença auto-imune crônica. Ainda que não inicialmente ame-açadora da vida, a maior parte das doenças auto-imunes são condições crô-nicas as quais lentamente progridem a um estado debilitante. Enquanto nu-merosas terapias são disponíveis, tratamentos convencionais não são roti-neiramente eficazes. Mais problemática é a toxicidade acompanhante a qualfreqüentemente proíbe o uso de longa duração necessário com uma doençacrônica. Tratamentos atuais para doença auto-imune podem ser amplamenteclassificados em dois grupos: aqueles fármacos os quais amortecem ou su-primem a resposta imune a própria pessoa e aqueles fármacos os quais con-trolam os sintomas que originam de inflamação crônica. De forma mais deta-lhada, tratamentos convencionais para doença auto-imune (por exemplo,primariamente artrite) são como segue:1. Fármacos Antiinflamatórios Não Esteroidais (NSAIDs): estesincluem aspirina, ibuprofeno, naproxeno, etodolac, e cetoprofeno. NSAIDsnão são relativamente fármacos potentes e desse modo são mais comumen-te usados como fármacos antiinflamatórios nos estágios iniciais da doença(por exemplo, aliviar a dor e tumefação as quais acompanham artrite). Noentanto, NSAIDs são associados com irritação gastrointestinal e toxicidadede fígado. A fim de controlar a ulceração gastrointestinal associada com ouso de muitos NSAIDs, fármacos NSAID mais seletivos foram recentementedesenvolvidos os quais seletivamente inibem (VIOXX®, CELEBREX®) oupreferencialmente inibem (MOBICOX®) ciclooxigenase-2 (isto é, inibidoresde COX-2). No entanto, inibidores de COX-2 exibem efeitos colaterais des-favoráveis os quais incluem irritação gastrointestinal, especialmente com usode duração mais longa.

2. Corticoesteróides: estes incluem prednisona e dexametasona.Corticoesteróides são os agentes antiinflamatórios mais amplamente usadospara o tratamento de artrite reumatóide. No entanto, eles significantementeaumentam o risco de osteoporose, toxicidade gastrointestinal, e infecçãooriginando de imunossupressão generalizada. Além disso, corticoesteróidestendem a ser usados para o tratamento de rubores de doença (por exemplo,SLE) e não como um tratamento crônico.

3. Fármacos Anti-Reumáticos Modificadores de Doença(DMARDs): estes incluem fármacos citotóxicos tais como metotrexato, azati-oprina, e ciclofosfamida; imunossupressores potentes tais como ciclosporinaA (SANDIMUNNE®, NEORAL®) e FK506 (tacrolimus); e uma variedade deoutros fármacos tais como hidrocloroquina e sais organoouro (por exemplo,aurotioglicose). DMARDs são fármacos potentes e desse modo podem exibirsignificante eficácia na redução de inflamação e retardamento da taxa deprogressão de doença. Como tal, médicos têm tradicionalmente usadoDMARDs como uma segunda linhagem de terapia depois de NSAIDs. Noentanto, como fármacos potentes, DMARDs têm significante toxicidade as-sociada com seu uso. Fármacos citotóxicos, por exemplo, interferem comreplicação de DNA a qual manifesta-se com vários efeitos tóxicos. O últimoinclui depressão de medula óssea e subseqüente risco de infecção e neo-plasia. O uso de ciclosporina A e FK506 é limitado por sérios efeitos colate-rais os quais incluem toxicidades renais e de fígado. Efeitos tóxicos associa-dos com o uso de hidrocloroquina incluem cegueira, neuromiopatia, e dificul-dade gastrointestinal. O efeito colateral mais comum originando de terapiacom sais de ouro é dermatite. No entanto, a toxicidade do ouro pode causarnefrite e depressão de medula óssea.

4. Biológicos: estes incluem as proteínas recombinantes REMI-CADE®, ENBREL®, e HUMIRA®, a totalidade das quais alvejam TNFa, Kl-NERET®, o qual alveja interleucina-1, Amevive o qual alveja células T (glico-proteína de superfície de CD2) e RAPTIVA® a qual também alveja células T(anticorpo anti-CD11a). No entanto, proteínas recombinantes e em particularanticorpos recombinantes são difíceis de produzir para uso bastante difundi-do e têm efeitos colaterais tóxicos associados com seu uso. Toxicidades in-cluem reações imunológicas potenciais, especialmente com o uso prolonga-do que pode ser requerido para condições crônicas. Além da resposta dobem conhecido HAMA (anticorpo anticamundongo humano) associada comanticorpos quiméricos ou humanizados, mecanismos de citotoxicidade medi-ada por anticorpo (ADCC e mediada por complemento) podem levar a efei-tos colaterais. Mais recentemente, foi descoberto que anticorpos, indepen-dente da fonte ou especificidade de antígeno, podem converter oxigênio mo-lecular em peróxido de hidrogênio e ozônio tal como descrito por Wentworth,P., era/. Science 293:1806-1811 (2001) e 298:2195-2199 (2002). Isto pode-ria levar a dano celular e de tecido o qual pode exacerbar tratamento de umacondição auto-imune com uso prolongado. Por exemplo, foi mostrado que aprodução de peróxido de hidrogênio e ozônio por anticorpos poderia ser li-gada a uma resposta inflamatória em ratos: a assim chamada reação de Ar-desta forma. A potente atividade anti-TNFa do anticorpo REMICADE® levoua risco aumentado de infecções oportunistas as quais incluem tuberculose,histoplasmose, listeriose, e pneumocitose.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

É um objetivo da presente invenção fornecer novos compostospara uso no tratamento de doença auto-imune. Uma doença auto-imune, emparticular condições crônicas como artrite e SLE, pode ser tratada por admi-nistração de um composto tal como descrito aqui a um mamífero, de prefe-rência um ser humano. Além disso, de acordo com esta invenção, purinas di-ou trissubstituídas e suas composições farmacêuticas são fornecidas asquais são capazes de facilitar a depuração de complexos imunes ou limitarsua deposição dentro de órgãos do corpo tais como rim e/ou inibir as açõespró-inflamatórias de TNFa.

Em uma modalidade da presente invenção, estes compostos depurina afetarão ambos os aspectos do processo de inflamação: complexosimunes e TNFa. O benefício terapêutico resultante deste mecanismo dual deação se manifestará em termos de um perfil de toxicidade melhorado. Isto é,os compostos de purina descritos nesta invenção não são inibidores poten-tes de TNFa nem eles completamente eliminarão complexos imunes. TNFadesempenha um papel na proteção contra infecção enquanto complexosimunes desempenham um papel em mecanismos de realimentação regulan-do resposta imune (assim chamados determinantes idiopáticos). Eficáciaterapêutica pode resultar do efeito aditivo dos dois mecanismos de ação.Além disso, toxicidade devido a tratamento crônico e/ou outros fármacosusados em combinação podem ser pelo menos reduzidos ou evitados.

Em outra modalidade da presente invenção, os compostos depurina afetarão apenas um aspecto do processo de inflamação. Isto é, estescompostos afetarão ou complexos imunes ou TNFa. No caso onde os com-postos de purina influenciam a eliminação de complexos imunes ou previ-nem sua deposição, tais compostos são esperados to ser particularmenteúteis para o tratamento de artrite, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), trom-bocitopenia imune (ITP), glomerulonefrite, e vasculite. No caso onde oscompostos de purina inibem TNFa, tais compostos são esperados ser parti-cularmente úteis para o tratamento de artrite reumatóide, artrite psoriática,psoríase, doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, espondilite an-cilosante, síndrome de Sjõgren, doença de Still (síndrome de ativação demacrófago), uveíte, escleroderma, miosite, síndrome de Reiter, e síndromede Wegener. Certamente, é possível que alguns compostos de purina destainvenção afetarão o processo de inflamação por um mecanismo bioquímicoo qual é além de e distinto de um efeito em complexos imunes e/ou TNFa.Um tal mecanismo alternativo possível, por exemplo, por virtude do andaimede purina, é um efeito nos receptores de adenosina. No entanto, indepen-dente do(s) mecanismo(s) pelos quais os compostos de purina afetam a do-ença auto-imune alvejada, é um importante aspecto desta invenção que osreferidos compostos não afetem potencialmente qualquer aspecto do pro-cesso de inflamação de modo que o tratamento é bem tolerado.

Aspectos adicionais da invenção serão aparentes a uma pessoaversada na técnica da seguinte descrição e reivindicações, e generalizaçõesa isto.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra o efeito de administração oral do composto 1quando comparado à hidrocortisona sobre hipersensibilidade do tipo prolon-gada (DTH).

A Figura 2 mostra o efeito de administração intravenosa docomposto 1 quando comparado a metotrexato em artrite induzida por adju-vante.

A Figura 3 mostra o efeito de administração oral do composto 1quando comparado à indometacina sobre artrite induzida por adjuvante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVENÇÃO

A presente invenção inclui compostos, ou derivados farmaceuti-camente aceitáveis dos mesmos, da seguinte fórmula geral:<formula>formula see original document page 10</formula>

n = 0-2

m = 0-2

m não é necessariamente igual a n

onde R-i, R3 = NH2, F, Cl, grupo de CrC4 alcóxi ou fenóxi, mas Ri não é ne-cessariamente igual a R3; e

R2 = H, F, Cl, NH2, ou NH-R-XH;onde R = -(CH2)p- p = 2 a 4

<formula>formula see original document page 10</formula>

É uma modalidade preferida da presente invenção que n ^ m(por exemplo, n = 0, m = 2), Ri = NH2, R3 = NH2, F ou Cl, ou qualquer com-binação destes. Mais preferida é quando Ri = meta-NH2, F ou Cl.

Particularmente preferidos são os seguintes compostos:

<formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula><table>table see original document page 14</column></row><table>

Compostos da presente invenção podem facilitar a depuração decomplexos imunes por fagocitose ou podem limitar a deposição de comple-xos dentro de órgãos do corpo e tecidos por sua capacidade para antagoni-zar a ligação de complexos imunes a superfícies de órgão e tecido. O meca-nismo por cujos complexos imunes ligam-se a várias superfícies pode envol-ver ligação a receptores Fc de superfície celular. Os receptores Fc são gli-coproteínas de leucócitos inflamatórios que ligam-se à porção de Fc (cauda)de imunoglobulinas. Os receptores Fc estão também presentes em numero-sos tecidos e fornecem um sítio para ligação e subseqüente deposição decomplexos imunes sobre superfícies de tecido. Por exemplo, a deposição notecido de rim de auto-anticorpo contendo complexos por ligação a receptoresde Fc acredita-se ativar uma resposta inflamatória típica de SLE a qual podelevar a glomerulonefrite. Receptores de Fc bem caracterizados incluem:FcyRI, FcyRII, e FC7RHI (receptores de IgG); FceRI (o receptor de IgE); eFcaRI (o receptor de IgA). Interessantemente, proteína A de Staphylococcalaureus é uma proteína bacteriana de superfície celular as qual pode li-gar-se à porção de Fc (cauda) da maior parte dos anticorpos. Por exemplo,proteína A se ligará às imunoglobulinas lgG1, lgG2, e lgG4 humanas. Maisimportantemente, foi conhecido por muitos anos que proteína A pode inibir aligação de complexos imunes contendo anticorpo de IgG a receptores de Fc.Por exemplo, Sulica, A., et ai Imunology 38:173-179 (1979) relatou que pro-teína A inibe complexo imune contendo IgG ligando-se a receptores de Fcmas a proteína A realça a ligação de IgG a linfócitos e macrófagos.

Mais recentemente, com a disponibilidade dos camundongosdeficientes de receptor de Fc (cadeia de y), torna-se possível estabilizar opapel primário dos receptores de Fc de IgG (FcyR) na mediação das respos-tas efetoras vistas em doenças auto-imunes tais como SLE e artrite reuma-tóide, tal como notado por Marino, M., et al. Nature Biotechnology 18:735-739 (2000). Mais especificamente, estes autores estabeleceram que agentesos quais podem interferir com a ligação de complexos imunes a FcyRdeveriam melhorar SLE. Eles forneceram suporte experimental para estadeclaração por tratamento de uma linhagem especial de camundongos{MRUIpi) que desenvolve uma síndrome a qual é similar a SLE humano comum peptídeo o qual liga-se à porção de Fc de IgG. A taxa de sobrevivênciade animais tratados (80%) foi significantemente maior do que animais nãotratados (10%). Em um recente artigo de revista por Hogarth, P.M., CurrentOpinion in Immunology 14:798-802 (2002), foi estabelecido que FcyRage precocemente no processo de inflamação e o comprometimento porcomplexos imunes é um sinal potente para a liberação de citocinas pró-inflamatórias tais como TNFa. Naqueles casos onde compostos da presenteinvenção afetam algum aspecto de depuração ou deposição de complexoimune, eles podem afetar desse modo por sua capacidade para imitar prote-ína A. Isto é, tais compostos podem ligar-se à porção de Fc de IgG humanatal como verificado por sua capacidade para inibir a ligação de proteína A aIgG humana, tal como determinado in vitro por ELISA competitivo. Por liga-ção à porção de Fc de IgG humana de um modo similar à proteína A, taiscompostos mímicos de proteína A podem romper a ligação de complexosimunes contendo IgG a FcyR. Subseqüentemente, isto deveria prevenir de-posição de complexos imunes e desse modo facilitar sua depuração assimcomo diminuir a liberação de citocinas pró-inflamatórias.

Adicionalmente, ou alternativamente, os compostos da presenteinvenção podem inibir a atividade pró-inflamatória de TNFa. Diferentes anti-corpos monoclonais anti-TNFa recombinantes correntemente aprovados(REMICADE®, HUMIRA®) ou receptor de TNFa solúvel (ENBREL®), compos-tos da presente invenção não inibem a ligação de TNFa ao receptor de TN-Fa de p55 (CD120a) ou ao receptor de TNFa de p75 (CD120b). Todavia,compostos da presente invenção podem inibir o efeito de TNFa tal comoverificado por sua capacidade para inibir apoptose/citotoxicidade induzidapor TNFa na linhagem celular de murino WEHI 164 (13var). Adicionalmente,os compostos da presente invenção podem inibir a produção de TNFa, talcomo verificado por sua capacidade para inibir produção induzida por LPSde TNFa na linhagem celular de murino J774A-1.

TNFa é produzido por muitos tipos de célula as quais incluemfibroblastos e numerosos subgrupos de célula imune. Exemplos do últimoincluem macrófagos, monócitos, células B e T, e mastócitos. Ele é uma mo-lécula pleiotrópica produzida em resposta a uma variedade de estímulos e aqual pode exercer efeitos na maior parte dos tipos de célula. Sob circunstân-cias normais, baixos níveis de TNFa de soro conferem proteção contra pató-genos, tumores, e dano de tecido. Além disso, em termos de uso crônico oucontinuado de compostos da presente invenção como agentes terapêuticos,é um aspecto desta invenção que estes compostos não sejam ini-bidores potentes dos efeitos ou produção de TNFa, nem eles potencialmen-te inibam a ligação de TNFa a seu receptor. O potencial para uso de longaduração de compostos desta invenção é demonstrado pelo tratamento decamundongos NZBW/F1 (outro modelo para SLE humano) com compostosdurante aproximadamente um ano sem observação de qualquer toxicidadesignificante.

Similar a biológicos descritos acima, outros inibidores de TNFaexibem toxicidade a qual limita o uso de longa duração ou crônico. Por e-xemplo, talidomida (N-ftalimido-glutarimida) é um fármaco antiinflamatóriosintético o qual inibe síntese de TNFa. No entanto, testes clínicos para paci-entes com artrite reumatóide foram principalmente mal-sucedidos por causada toxicidade inaceitável. Efeitos colaterais severos incluíam sonolência,neuropatia periférica, e brotoeja severa. Muitos fármacos que são comumen-te usados como imunossupressores tais como ciclosporina A e metotrexatomostram propriedade inibidora de TNFa, mas também não podem ser usa-dos em uma base crônica por causa de sua toxicidade.

Realmente, o papel fundamental desempenhado por TNFa emmuitas doenças auto-imunes, tal como comprovado pelo sucesso terapêuti-co de biológicos recentemente aprovados junto com a falta de fármacos não-tóxicos eficazes ainda disponíveis para tratamento crônico, levou à investi-gação de vários métodos para a inibição de TNFa. Métodos incluíram a bus-ca por inibidores de fosfodiesterase IV, agonistas de adenosina, inibidoresde metaloproteinase de matriz (por exemplo, inibidores de TACE), inibidoresde transdução de sinal (por exemplo, cinase de p38 MAP), e inibidores defatores de transcrição (por exemplo, NFkB). Claramente em seguida, umanecessidade existe por compostos os quais podem eficazmente inibir os e-feitos de TNFa mas os quais podem ser usados em uma base de longa du-ração para o tratamento de doenças auto-imunes crônicas.

A presente invenção fornece novos compostos tal como definidopela fórmula geral acima os quais são úteis para o tratamento de doençaauto-imune crônica. Estes compostos podem facilitar a depuração de com-plexos imunes por fagocitose ou podem limitar a deposição de complexosimunes dentro de órgãos do corpo e tecidos por sua capacidade para anta-gonizar a ligação de complexos imunes a superfícies de órgão e tecido. Nes-te caso, tais compostos podem ser particularmente úteis para o tratamentodaquelas doenças auto-imunes onde complexos imunes desempenham umpapel importante na patologia de doença: por exemplo, artrite, SLE, ITP,glomerulonefrite, e vasculite. Adicionalmente, os compostos desta invençãopodem inibir as ações pró-inflamatórias de TNFa. Neste caso, tais compos-tos podem ser particularmente úteis para o tratamento de doenças auto-imunes onde inibição de atividade biológica de TNFa é importante para pa-tologia da doença: por exemplo, artrite, artrite psoriática, psoríase, doençade Crohn, doença inflamatória do intestino, espondilite ancilosante, síndro-me de Sjógren, doença de Still (síndrome de ativação de macrófago), uveíte,escleroderma, miosite, síndrome de Reiter, e síndrome de Wegener. É umamodalidade preferida desta invenção, estes compostos podem imitar a ativi-dade de proteína A bacteriana desse modo facilitando a depuração de com-plexos imunes. Em qualquer caso, não é pretendido que o escopo da pre-sente invenção seja limitado pelo mecanismo pelo qual uma melhora emqualquer condição inflamatória indicativa de uma doença auto-imune ocorre.

Realmente, uma melhora em uma condição auto-imune pode ocorrer poruso de compostos desta invenção por um mecanismo insuficientemente de-finido ou desconhecido, mas a referida melhora sendo determinada por ativi-dade in vivo exibida em um modelo animal apropriado. Além disso, o(s)mecanismo(s) pelos quais a eficácia de composto ocorre não é um aspectoimportante nem limitante desta invenção. Importante, no entanto, é o fatodos compostos desta invenção exibirem toxicidade limitada de modo queeles podem ser administrados desta maneira para o tratamento de doençaauto-imune crônica.

Compostos da presente invenção incluem todos os derivadosfarmaceuticamente aceitáveis, tais como sais e formas de pró-droga dosmesmos, e análogos assim como quaisquer isômeros ou enantiômeros ge-ométricos. Formulações do composto ativo podem ser preparadas a fim defornecer uma composição farmacêutica em uma forma adequada para admi-nistração entérica, mucosa (incluindo sublingual, pulmonar, e retal); parenté-rica (in-cluindo Jntramuscular, intradérmica, subcutânea, e intravenosa); outópica (incluindo ungüentos, cremes, e loções). Em particular, compostos dapresente invenção podem ser solubilizados em um solvente de álcool ou po-liol (por exemplo, solutol HS 15 (hidrôxiestearato de polietileno glicol 660 deBASF), glicerol, etanol, etc.) ou qualquer outro solvente biocompatível talcomo sulfoxido de dimetila (DMSO) ou Cremophor EL (também de BASF). Aformulação pode, onde apropriado, ser convenientemente apresentada emunidades de dosagem discretas e pode ser preparada por quaisquer dosmétodos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Todos osmétodos incluem a etapa de introdução junto do ingrediente farmacêuticoativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambostal como a necessidade dita. Quando apropriado, as formulaçõesacima descritas podem ser adaptadas a fim de fornecer liberação prolonga-da do ingrediente farmacêutico ativo. Formulações de liberação prolongadabem conhecidas à técnica incluem o uso de uma injeção de bolo, infusãocontínua, polímeros biocompatíveis, ou lipossomas.

Escolhas adequadas em quantidades e horário de doses, formu-lação, e rotinas de administração podem ser feitas com as metas de obten-ção de uma resposta favorável no mamífero (isto é, eficácia), e prevençãode toxicidade indevida ou outros danos a este (isto é, segurança). Além dis-so, "eficaz" refere-se a tais escolhas que envolvem manipulação de rotinade condições para obter um efeito desejado: por exemplo, redução ou deoutro modo melhorando lesão de tecido associado com uma resposta imunea constituintes corporais (órgãos e tecidos como adrenal, olho, articulação,rim, fígado, pulmão, pâncreas, sistema nervoso, pele, tireóide, etc); restau-rando o estado imunológico ou normalizando um distúrbio/condição patoló-gico do mamífero (título de anticorpo, subgrupos de célula imune, sinaliza-ção por citocinas ou quimiocinas, complexos imunes de anticorpo-antígeno,etc); remoção de anticorpos livres e/ou complexos imunes de anticorpo-antígeno da circulação; indícios de laboratório de doença auto-imune (con-centração ou quantidade absoluta de mediadores solúveis de inflamação,presença de auto-anticorpos, proliferação celular, etc); e combinações dosmesmos. Em particular, efeitos deletérios de tratamento anti-TNFa conven-cional podem ser evitados.

A quantidade de composto administrado é dependente de fato-res tais como, por exemplo, bioatividade e biodisponibilidade do composto(por exemplo, meia-vida no corpo, estabilidade, e metabolismo); propriedadequímica do composto (por exemplo, peso molecular, hidrofobicidade, e solu-bilidade); rotina e programação de administração; e outros mais. Tambémserá entendido que o nível de dose específica a ser alcançado para qual-quer paciente particular pode depender de uma variedade de fatores, inclu-indo idade, saúde, histórico médico, peso, combinação com um ou mais ou-tros fármacos, e severidade de doença.

O termo "tratamento" ou "tratando" refere-se a, entre outras coi-sas, redução ou alívio de um ou mais sintomas de doença auto-imune emum mamífero (por exemplo, ser humano) afetado por doença ou em risco dedesenvolvimento de doença. Para um dado paciente, melhora em um sinto-ma, sua piora, regressão, ou progressão pode ser determinada por umamedição objetiva ou subjetiva. Tratamento pode também envolver combina-ção com outros modos existentes de tratamento e agentes (por exemplo,fármacos antiinfiamatórios, agentes ligando TNFa como receptor de anticor-po ou solúvel, NSAIDs, corticoesteróides, DMARDs). Desta forma, tratamen-to de combinação pode ser praticado. Em tais modalidades, é preferido quetoxicidade de tratamento crônico ou o agente adicional seja pelo menos re-duzida ou evitada por redução da quantidade ou concentração do agenteadicional usado em comparação a tratamento sem um composto da presen-te invenção enquanto obtendo um efeito substancialmente equivalente nopaciente.

Será apreciado por aqueles versados na técnica que a referên-cia aqui a tratamento estende-se a profilaxia assim como terapia de doençaauto-imune estabilizada ou crônica. Será também apreciado que a quantida-de de um composto da invenção requerido para tratamento variará nãoapenas com o composto particular usado para tratamento, mas também coma rotina de administração, a natureza da condição auto-imune sendo tratadae a idade e saúde geral do paciente. A dose a ser administrada finalmenteserá à vontade do médico. Em geral, no entanto, a dose será na faixa decerca de 0,1 a cerca de 200 mg/kg de peso corporal por dia. De preferência,as doses variarão de cerca de 1 a cerca de 100 mg/kg por dia. Mais preferi-velmente, a faixa será entre 2 a 50 mg/kg por dia. A unidade de dosagempor dia pode ser 10 mg ou mais, 100 mg ou mais, 10 g ou menos, 40 g oumenos, ou qualquer faixa entre estas.

Finalmente, e onde apropriado, compostos da presente inven-ção podem ser usados em combinação com outros tratamentos para doen-ça auto-imune bem conhecidos à técnica. Outros tratamentos de técnicaanterior incluem aqueles descritos acima tal como reapresentado por fárma-cos antiinflamatórios não-esteroidais (NSAIDs) (por exemplo, ibuprofeno,aspirina, naproxeno, etodolac, e cetoprofeno); corticoesteróides (por exem-plo, hidrocortisona, pregnisona, e dexametasona); fármacos anti-reumáticosmodificadores de doença (DMARDs) (por exemplo, fármacos citotóxicoscomo metotrexato ou azatioprina, imunossupressores como ciclosporina ouFK506, hidrocloroquina, sais de organoouro) e biológicos. Os componentesindividuais de tais combinações podem ser administrados ou seqüencial-mente ou simultaneamente em formulações farmacêuticas separadas oucombinadas. Alternativamente, novas formulações farmacêuticas podem sercriadas para acomodar a combinação de compostos desta invenção comtratamentos convencionais para doença auto-imune.

Compostos da presente invenção podem também ser usadoscomo agentes de afinidade para ligar-se a anticorpo (por exemplo, isótiposhumanos como IgM, IgD, lgA1, lgA2, IgE, lgG1, lgG2, lgG3, e/ou lgG4). An-ticorpo livre (isto é, não ligado ao antígeno) e/ou complexo imune de anti-corpo-antígeno pode ser especificamente ligado por tais agentes de afinida-des. Complexos de grande afinidade podem ser isolados por precipitaçãoseletiva ou centrifugação diferencial, ou identificados por ensaios de flocula-ção. Mas é preferido imobilizar um ou mais compostos a um material de su-porte insolúvel (por exemplo, agarose, dextrano, celulose, poliacrilamida,outros materiais poliméricos, sílica, e vidro) de preferência covalentementeligado diretamente ou indiretamente por um ligante. Um composto da pre-sente invenção pode ser sintetizado in situ no suporte ou através de um li-gante orgânico ativado. Opcionalmente, o ligante pode ser clivável (por e-xemplo, por um agente de redução ou protease específica de sítio) de modoque o composto (com ou sem anticorpo ligado) possa ser separado do su-porte. Por exemplo, um ou mais compostos da presente invenção podemser covalentemente ligados a um suporte na forma de uma lâmina de vidro,placa de multicavidade, fibra óptica, lasca de proteína ou tubo de teste paraensaios e análise; placa de cultura de tecido para incubação de células ouantígeno; e contas magnéticas, membrana porosa ou meios cromatográficospara separação. Anticorpo ou outro material contendo Fc pode ser ligado aum ou mais compostos da presente invenção (isto é, isolamento), e em se-guida opcionalmente separado de material não ligado (com ou sem lavageme rodadas múltiplas de ligação sob condições diferentes) para purificar ma-terial contendo Fc. Por exemplo, força iônica (por exemplo, concentração desal) ou pH pode mudar condições de ligação e ser usado para liberar mate-rial contendo Fc.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos também ilustram a prática desta inven-ção, mas não pretendem ser limitantes destes.

A seqüência sintética geral para preparação dos compostos Ci-teis na presente invenção é delineada nos esquemas 1 e 2. O esquema 1ilustra a rotina sintética empregada para os derivados de purina dissubstituí-dos, enquanto o esquema 2 ilustra o método sintético para os derivados depurina trisubstituídos descritos nesta invenção.

Esquema 1

<formula>formula see original document page 22</formula>

Reaaentes:

(a) álcool de aralquila, DEAD, Ph3P, THF;

(b) aralquilamina, DIEA, n-butanol.Esquema 2

<formula>formula see original document page 23</formula>

Reagentes:

(a) NaN02l HBF4 (48%);

(b) álcool de aralquila, DEAD, Ph3P, THF;

(c) aralquilamina, DIEA, n-butanol;

(d) álcool de amônia ou alquilamina ou alquila ou tiol de alquila, DIEA, n-butanol.

INSTRUMENTAÇÃO:

Todos os cromatogramas de HPLC e espectros de massa foramregistrados em um instrumento HP 1100 LC-MS Agilent usando um detectorde formação de diodo. Análise foi desempenhada por um dos quatro méto-dos seguintes: uma coluna C18 analítica (75 x 4,6 mm, 5 microns) com umgradiente de 1% a 40% de acetonitrila-água contendo 0,01% de TFA em 6minutos e um fluxo de 2 mL/min (método 1) ou uma coluna C18 analítica (75x 4,6 mm, 5 microns) com um gradiente de 10% a 99% de acetonitrila-águacontendo 0,01% de TFA em 6 minutos e um fluxo de 2 mL/min (método 2)ou uma coluna C18 analítica (75 x 4,6 mm, 5 microns) com um gradiente de15% a 99% de acetonitrila-água contendo 0,01% de TFA em 6 minutos e umfluxo de 2 mL/min (método 3), ou uma coluna C18 analítica (75 x 4,6 mm, 5microns) com um gradiente de 1% a 20% de acetonitrila-água contendo0,01% de TFA em 6 minutos e um fluxo de 2 mL/min (método 4).

Exemplo 1 (exemplo representativo de esquema 1): síntese dedicloridrato de N-{9-[2-(4-aminofenil)etil]-9H-purin-6-il}benzeno-1,3-diamina(composto 1)

<formula>formula see original document page 24</formula>

A uma solução de álcool de 4-aminofenetila (3,0 g, 21,8 mmols)em tetraidrofurano (100 ml_) em temperatura ambiente foram adicionados di-terc-butildicarbonato (5,2 g, 23,6 mmols) e trietilamina (4,7 ml_, 32,8 mmols).

A reação foi agitada durante 16 horas em temperatura ambiente. A soluçãofoi diluída com água (100 ml_) e acetato de etila (100 ml_). A camada aquosafoi extraída com acetato de etila (100 ml_). As camadas orgânicas foram se-cadas sobre sulfato de sódio e filtradas. A amina protegida foi obtida comoum sólido branco (4,3 g, 83%). Este composto (1,7 g, 7,4 mmols) e trifenil-fosfina (1,9 g, 7,4 mmols) foram adicionados a uma suspensão de 6-cloropurina (761 mg, 4,9 mmols) em tetraidrofurano seco (13 ml_) em tempe-ratura ambiente. A mistura resultante foi evaporada até a secura. Tetraidro-furano seco (13 ml_) foi adicionado e a suspensão foi resfriada a 0°C seguidopor adição em gotas de dietilazo-dicarboxilato (891 uL, 5,7 mmols). Depoisde reação de 16 horas em temperatura ambiente, a solução foi concentradasob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado em uma coluna Biota-ge® 25M (sílica, 95:5 a 65:35 de hexano/AcOEt) para produzir purina N-9alquilada como um sólido branco (1,8 g, quantitativa).

A uma suspensão de 1,3-fenilenodiamina (8,2 g; 75,4 mmols)em cloreto de metileno (21 ml_) em temperatura ambiente foi adicionada emgotas durante uma hora uma solução de di-íerc-butildicarbonato (2,7 g, 12,6mmols) em cloreto de metileno (130 ml_). A solução foi em seguida agitadadurante a noite em temperatura ambiente. Depois de reação de 18 horas, asolução foi evaporada até a secura sob pressão reduzida. O óleo residual foidissolvido em acetato de etila (50 ml_) e lavado com carbonato de sódio a2N (50 ml_). A camada aquosa foi extraída com acetato de etila (2 x 50 ml_).As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura (50 ml_),secadas sobre sulfato de sódio, filtradas, e evaporadas até a secura. O resí-duo bruto foi purificado em uma coluna BIOTAGE® 40S (sílica, 95:5 a 1:1 dehexano/AcOEt) para produzir A/-1-terc-butiloxicarbonil-1,3-fenileno-diaminacomo um sólido branco (2,4 g, 93%). Este composto (40 mg, 0,2 mmol) ediisopropiletilamina (50 uL, 0,3 mmol) foram adicionados a uma solução depurina 6-cloro-N-9-alquilada (35 mg, 0,1 mmol) em n-butanol (2,0 ml_) emtemperatura ambiente. Depois de reação de 48 horas em 90°C, a soluçãocastanha foi concentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purifica-do em uma coluna BIOTAGE® 12M (sílica, 6:4 de hexano/AcOEt a 8:2 deAcOEt/MeOH) para produzir a purina disubstituída como um sólido marron(32 mg, 63%). A uma solução deste material (32 mg, 0,06 mmol) em diclo-rometano (2,0 ml_) em temperatura ambiente foi adicionado uma solução deHcl a 4N em dioxano (2,0 ml_). Depois de reação de 3 horas em 25°C, a so-lução foi concentrada sob pressão reduzida e secada durante 16 horas sobvácuo para produzir composto 1 como um sólido marron pálido. Rendimentode produto: 23 mg (94%); R, = 0,4 (95:5 de AcOEt/MeOH); 1H RMN(400MHz, CD3OD): õ 8,50 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 8,17 (t, 1H), 8,80 a 8,70 (m,1H), 7,58 (t, 1H), 7,40 a 7,20 (m, 5H), 4,63 (t, 2H), 3,31 (t, 2H); LRMS (ESI):m/z 346 (MH+), 368 (M+ Na); HPLC (método 1): 2,5 minutos.Exemplo 2 (exemplo representativo de esquema 2): síntese deN6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-ciclopropilmetil-9H-purina-2,6-diamina (composto 3)

<formula>formula see original document page 26</formula>

A 2-amino-6-cloropurina (5,0 g, 29,5 mmols) em uma solução deácido tetrafluorobórico em água (100 ml_) em -15°C foi adicionado em gotasnitrito de sódio (3,5 g, 50 mmols) em água (160 ml_) durante uma período de1,5 hora. Depois de 20 minutos em temperatura ambiente, o pH da soluçãofoi ajustado para 6 com hidróxido de sódio aquoso a 50%. A solução foiconcentrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado em umacoluna BIOTAGE® 40S (sílica, 9:1 de CH2CI2/MeOH) para produzir 2-fluoro-6-cloropurina (2,3 g, 52%). Este composto (1,5 g, 8,6 mmols) foi suspensoem tetraidrofurano seco (20 ml_) em 25°C. O álcool de 4-(/V-1-terc-butiloxicarbonil)-aminofenetila (3,4 g, 14,5 mmols) e trifenilfosfina (3,8 g, 14,5mmols) foram em seguida adicionados, e a mistura evaporada até a secura.Tetraidrofurano seco (20 ml_) foi adicionado e a suspensão foi resfriada a0°C antes de adição em gotas de dietilazodicarboxilato (1,5 ml_, 9,8 mmols).Depois de reação de 16 horas em temperatura ambiente, a solução foi con-centrada sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado em uma colu-na BIOTAGE® 25M (sílica, 95:5 a 75:25 de hexano/AcOEt) para produzir pu-rina N-9 alquilada como um sólido branco (2,9 g, 87%). A uma solução de 2-fluoro-6-cloropurina alquilada (3,0 g, 7,7 mmols) em n-butanol (15 mL) em25°C foi adicionado /V-1-terc-butiloxicarbonil-1,3-fenilenodiamina (1,8 g, 8,8mmols) e diisopropiletilamina (2,7 mL, 15,3 mmol). Depois de reação de 48horas em 65°C, a solução marron foi concentrada sob pressão reduzida.O resíduo bruto foi purificado em uma coluna BIOTAGE® 40M (sílica, 65:45 a0:1 de hexano/AcOEt) para produzir o derivado de fluoropurina como umsólido marron (2,8 g, 63%). A uma solução deste produto (2,8 g, 4,9 mmols)em n-butanol (15 mL) em temperatura ambiente foi adicionado aminometilciclopropano (1,2 g, 17,1 mmols) e diisopropiletilamina (1,7 mL, 9,8 mmols).Depois de reação de 48 horas em 110°C, a solução marron foi concentradasob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado em uma coluna BIOTA-GE® 40M (sílica, 60:40 de hexano/AcOEt a 98:2 de AcOEt/MeOH) para pro-duzir a purina trissubstituída protegida como um sólido branco (2,3 g, 73%).

A uma solução deste composto (2,08 g, 3,38 mmols) em diclorometano (10mL) em temperatura ambiente foi adicionado HCI a 4N em dioxano (10 mL).A reação foi agitada durante 5 horas em 25°C e a solução foi concentradasob pressão reduzida. O sólido foi em seguida secado durante 16 horas sobvácuo para produzir composto 3 como um sólido castanho. Rendimento deproduto: 1,4 g (quantitativa); Rf = 0,1 (98:2 de CH2CI2/MeOH); 1H RMN (400MHz, CD3OD): õ 8,24 (s, 1H), 8,20 a 7,60 (m, 2H), 7,60 a 7,00(m, 6H), 4,56 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,40 a 3,20 (m, 4H), 1,25 a 1,15 (m, 1H),0,60 a 0,50 (m, 2H), 0,40 a 0,20 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 415 (MH+), 437(M+ Na); HPLC (método 2): 1,6 minuto.

Exemplo 3: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-9H-puri-na-2,6-diamina (composto 2)

O composto acima foi preparado como no exemplo 1 iniciandocom 2-amino-6-cloropurina. Sólido castanho; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): õ7,92 (s, 2H), 7,63 (d, 1H, J = 8,8 Hz), 7,46 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,40 a 7,20 (m,4H), 7,00 (d, 1H, J= 8,2 Hz), 4,44 (t, 2H, J= 7,2 Hz), 3,24 (t, 2H, J= 6,8 Hz);LRMS (ESI): m/z 361 (MH+), 383 (M+Na); HPLC (método 3): 0,4 minuto.

Exemplo 4: 6-{6-(3-Amino-fenilamino)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-9H-purin-2-ilamino}-hexan-1-ol (composto 4)

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por 6-aminohexanol. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,00 a 7,60 (m, 3H), 7,46 (t, 1H, J= 8,2 Hz),7,40 a 7,20 (m, 4H), 7,10 a 7,00 (m, 1H), 4,46 (t, 2H, J= 7,0 Hz), 3,54 (t, 2H,J = 6,5 Hz), 3,48 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,26 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,80 a 1,50 (m,2H), 1,50 a 1,30 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 461 (MH+); HPLC (método 2): 1,4minuto.

Exemplo 5: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-ciclo-propil-9H-purina-2,6-diamina (composto 5).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por ciclopropilamina. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,00 a 7,90 (m, 1H), 7,90 a 7,80 (m, 2H), 7,50 a7,20 (m, 5H), 7,10 a 6,95 (m, 1H), 4,47 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,30 a 3,20 (m,2H), 2,90 a 2,80 (m, 1H), 0,90 a 0,80 (m, 2H), 0,70 a 0,50 (m, 2H); LRMS(ESI): m/z401 (MH+); HPLC (método 2): 1,3 minuto.

Exemplo 6: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-terc-butil-9H-purina-2,6-diamina (composto 6).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto poraminometilciclopropano substituído por terobutilamina. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 7,90 (s, 1H), 7,60 (s, 1H), 7,50 a 7,20 (m, 6H),7,00 (d, 1H, J = 7,0 Hz), 4,45 (t, 2H, J =7,0 Hz), 3,27 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 1,50(s, 9H); LRMS (ESI): m/z 417 (MH+), 439 (M+Na); HPLC (método 2): 1,8 mi-nuto.

Exemplo 7: N-[9-(4-Amino-benzil)-9H-purin-6-il]-benzeno-1,3-dia-mina (composto 7).

O composto acima foi preparado como no exemplo 1 exceto ál-cool de 4-(/V-1-ferc-butiloxicarbonil)-aminofenetila substituído por brometo de4-nitrobenzila e carbonato de potássio. A redução do grupo nitro foi empre-endida com Pd/C a 10% e formiato de amônio. Sólido castanho; 1H RMN(400 MHz, CD3OD): õ" 8,75 (s, 1H), 8,53 (s, 1H), 7,98 (s, 1H), 7,80 a 7,20 (m,7H), 5,66 (s, 2H); LRMS (ESI): m/z 332 (MH+), 354 (M+Na); HPLC (método4): 3,6 minutos.

Exemplo 8: 2-{6-(3-Amino-fenilamino)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-9H-purin-2-ilamino}-etanol (composto 8).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por 2-aminoetanol. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,02 (s, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,62 (d, 1H, J = 8,2Hz), 7,45 (t, 1H, J= 8,2 Hz), 7,40 a 7,20 (m, 4H), 7,02 (d, 1H, J= 6,3 Hz),4,44 (t,2H, J= 7,0 Hz), 3,78 (t, 2H, J= 6,1 Hz), 3,60 (t, 2H, J= 5,9 Hz), 3,25(t, 2H, J= 6,8 Hz); LRMS (ESI): m/z 405 (MH+); HPLC (método 1): 2,5 minutos.

Exemplo 9: N-{9-[2-(4-Benziloxi-fenil)-etil]-2-fluoro-9H-purin-6-il}-benzeno-1,3-diamina (composto 9).

O composto acima foi preparado como no exemplo 1 iniciandocom 2-fluoro-6-cloropurina. Sólido marron; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): õ8,52 (s, 1H), 8,30 (t, 1H, J = 1,9 Hz), 7,90 a 7,70 (m, 1H), 7,57 (t, 1H, J = 8,0Hz), 7,40 a 7,15 (m, 6H), 7,03 (d, 2H, J= 8,8 Hz), 6,90 (d, 2H, J= 8,8 Hz),5,03 (s, 2H), 4,55 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,15 (t, 2H, J= 7,0 Hz); LRMS (ESI):m/z 455 (MH+), 477 (M+Na); HPLC (método 2): 3,5 minutos.

Exemplo 10: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-(2,2-dimetil-propil)-9H-purina-2,6-diamina (composto 10).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por neopentilamina. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,05 (s, 1H), 7,77 (s, 2H), 7,52 (t, 1H, J = 8,2Hz), 7,45 a 7,20 (m, 4H), 7,15 (d, 1H, J= 6,8 Hz), 4,50 (t, 2H, J= 7,0 Hz),3,40 a 3,20 (m, 4H), 0,99 (s, 9H); LRMS (ESI): m/z 431 (MH+), 453 (M+Na);HPLC (método 2): 1,9 minuto.

Exemplo 11: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-isobutil-9H-purina-2,6-diamina (composto 11).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por isobutilamina. Sólido marron; 1H RMN(400 MHz, CD3OD): õ 8,45 (s, 1H), 8,20 a 7,90 (m, 2H), 7,56 (t, 1H, J= 8,2Hz), 7,50 a 7,00 (m, 5H), 4,59 (t, 2H, J= 7,0 Hz), 3,40 a 3,20 (m, 2H), 2,00(h, 1H, J=6,8 Hz), 1,01 (d, 6H, J=6,6 Hz); LRMS (ESI): m/z417 (MH+), 439(M+Na); HPLC (método 2): 1,7 minuto.

Exemplo 12: N-{9-[2-(3-Amino-fenil)-etil]-9H-purin-6-il}-benzeno-1,3-diamina (composto 12).

O composto acima foi preparado como no exemplo 1 exceto ál-cool de 4-(A/-1-íerc-butiloxicarbonil)-aminofenetila substituído por álcool de3-nitrofenetila. A redução do grupo nitro foi empreendida usando Pd/C a10% e formiato de amônio. Sólido castanho; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): õ8,45 (s, 1H), 8,40 a 8,20 (m, 1H), 8,20 a 8,00 (m, 1H), 7,71 (d,1H, J = 8,2Hz), 7,51 (t, 1H, J= 8,0 Hz), 7,41 (t, 1H, J= 7,8 Hz), 7,35 a 7,00 (m, 4H),4,59 ( t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,40 a 3,20 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 346 (MH+),368 (M+Na); HPLC (método 2): 2,5 minutos.

Exemplo 13: N6-(3-Amino-fenil)-9-[2-(4-amino-fenil)-etil]-N2-ci-clopentil-9H-purina-2,6-diamina (composto 13).

O composto acima foi preparado como no exemplo 2 exceto a-minometilciclopropano substituído por ciclopentilamina. Sólido marron; 1HRMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,45 (s, 1H), 8,13 (s, 1H), 8,00 a 7,80 (m, 1H),7,57 (t, 1H, J= 8,2 Hz), 7,50 a 7,30 (m, 4H), 7,30 a 7,10 (m, 1H), 4,57 (t, 2H,J= 7,0 Hz), 4,35 (q, 1H, J= 6,6 Hz), 3,40 a 3,20 (m, 2H), 2,20 a 2,00 (m,2H), 1,90-1,60 (m, 6H); LRMS (ESI): m/z 429 (MH+), 451 (M+Na); HPLC(método 2): 1,7 minuto.

Exemplo 14: N-{9-[2-(4-Fluoro-fenil)-etil]-9H-purin-6-il}-benzeno-1,3-diamina (composto 14).

O composto acima foi preparado como no exemplo 1 exceto ál-cool de 4-(N-1-terc-butiloxicarbonil)fenetila substituído por álcool de 4-fluorofenetila. Sólido marron; 1H RMN (400 MHz, CD3OD): õ 8,47 (s, 1H),8,30 a 8,20 (m, 1H), 8,07 (s, 1H), 7,80 a 7,60 (m,1H), 7,51 (t, J= 7,54 Hz,1H), 7,20 a 7,00 (m, 3H), 7,00 a 6,80 (m, 2H), 4,53 (t, J= 6,85 Hz, 2H), 3,19(t, J= 7,04 Hz, 2H); LRMS (ESI): m/z 349 (MH+), 371 (M+Na); HPLC (méto-do 2): 2,2 minutos.

Exemplo 15: Capacidade de Compostos para Imitar Proteína Aquando Determinado por ELISA de ligação de Proteína A Competitivo.

Tal como descrito acima, este ensaio avalia a capacidade doscompostos exemplificados para imitar proteína A. Tais compostos podemligar-se à porção de Fc de IgG humana tal como verificado pela inibição deligação de proteína A a IgG humana. O ensaio ELISA de ligação de proteína

A competitivo foi desempenhado em uma superfície MAXISORP® de placade 96 cavidades para realçar a ligação de proteína A ao fundo da placa. Ascavidades foram cobertas com 100 uL de proteína A (0,8 ug) e incubadasdurante a noite em 4°C. Depois de incubação, proteína A não ligada foi re-movida por três lavagens com salina de tampão de fosfato (PBS). A placa foiem seguida incubada com 100 uL/cavidade de uma solução a 2% de albu-mina de soro bovino (BSA) durante 1 hora em 37°C para bloquear ligaçãode proteína não específica. Depois de incubação, a placa foi lavada três ve-zes com PBS. 50 uL de composto ou proteína A, diluídos em PBS ou DMSOa 20% de PBS em concentração apropriada, foram adicionados às cavida-des seguido por adição de 50 uL de IgG humana conjugada por peroxidase(HRP-lgG). Depois de incubação de 1 hora em 37°C, a placa foi lavada trêsvezes com PBS para remover HRP-lgG não ligado. HRP-lgG ligado foi de-tectado por incubação com 100 uL de solução de cristais de sal de 2,2'-azino-di[sulfonato de 3-etilbenztiazolina]diamônio (ABTS) durante 20 minu-tos no escuro em temperatura ambiente. A placa foi em seguida lida em 405nm em uma Leitora de Microplaca BIO-TEK® EL 800 Universal. Os dadosforam analisados em uma lâmina de propagação MICROSOFT® EXCEL® ea concentração do composto o qual inibe ligação a 50% de proteína A (IC50)foi calculada usando software PRISM®, tal como mostrado na Tabela 1.Tabela 1.

IC50 (uM) de compostos mímicos de proteína A tal como verificado por ELISA

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Exemplo 16: Efeito de compostos na produção de TNFa induzi-do por LPS em linhagem celular J774A-1 de camundongo.

O efeito de compostos em produção de TNFa foi medido porELISA usando células J774-1 estimuladas por lipopolissacarídeo (LPS). Cé-lulas J774-1 foram cultivadas na presença ou ausência de LPS e composto.

As células foram cultivadas em 37°C durante 24 horas e depois disso ossobrenadantes foram coletados para a determinação da concentração deTNFa por ELISA tal como recomendado pelo fabricante (BD Biosciences).Os dados foram analisados em uma folha de amplitude MICROSOFT® EX-CEL® e a concentração de composto o qual inibe 50% de produção de TNFa(IC50) foi calculada usando software PRISM®, tal como mostrado na Tabela2.

Tabela 2:

Efeito de Compostos na Inibição de TNFa Induzida por indução de LPS DeCélulas J774A-1

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Exemplo 17: Efeito do Composto 1 na Hipersensibilidade do Ti-po Prolongada induzida por Oxazolona (DTH).

Compostos foram testados quanto a sua capacidade para tratarhipersensibilidade do tipo prolongada induzida por oxazolona (DTH) em ca-mundongos. No dia 0, camundongos foram sensibilizados com 100 uL deoxazolona em acetona a 5%. No dia 0, 1 e 2, camundongos foram tratadospor administração intravenosa do veículo (controle) ou metotrexato (MTX;controle positivo) ou o composto em 50 mg/kg. Camundongos foram desafi-ados com uma aplicação de 50 uL de oxazolona na superfície da orelha di-reita (primeiro desafio, dia 3; segundo desafio, dia 10). A espessura da ore-lha foi medida nos dias 4 a dia 7, e nos dias 11 a 14. Formação de vermelhi-dão e crosta foi também observada. Camundongos foram sacrificados no dia14. Células Tdth (CD4) desempenham um papel importante na regula-ção da intensidade da resposta de DTH.

Tal como mostrado na Tabela 3, composto 1 induz a reduçãosignificante da inflamação tal como visto pela espessura de orelha mais re-duzida. O composto 1 sozinho é equipotente a metotrexato. O composto 1também reduz vermelhidão, formação de crosta, e tumefação de orelha.

Tabela 3:

Efeito de administração intravenosa de composto 1 em DTH

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O efeito de administração oral de composto 1 foi determinadoseguindo o protocolo descrito acima com a exceção de que o composto 1 foioralmente administrado em 50 ou 150 mg/kg do dia 0 ao dia 13. O controlepositivo foi hidrocortisona. A Figura 1 mostra o efeito do composto 1 emDTH. O composto 1 induz uma redução significante da inflamação tal comovisto pela espessura de orelha mais reduzida em ambos os desafios 1 e 2.

Exemplo 18: Efeito de composto 1 na Artrite Induzida por Adju-vante (AIA) de Freund.

AIA foi induzida em ratos de Lewis fêmeas pela injeção de My-cobacterium butyricum liofilizado suspenso em óleo mineral na almofada dopé. O desenvolvimento de artrite foi monitorado durante um período de 3semanas pós-injeção adjuvante. Picos de inflamação no dia 3 seguinte àadministração adjuvante. A ativação imune aparece em torno do dia 14. Oscompostos foram injetados i.v. Dia 3, 2 e 1 injeção pré-adjuvante e no dia 10,11 e 12 injeção pós-adjuvante. O peso corporal foi registrado. O índice deartrite, o qual é uma medição de inflamação (edema), vermelhidão, e durezadas articulações, foi usado para monitorar o desenvolvimento da doença. Ograu de artrite foi determinado por medição dos dois diâmetros perpendicula-res dos tornozelos nos planos mediolateral e dorsoventral usando um com-passo de calibre. A circunferência de articulação em milímetros éem seguida calculada usando uma fórmula geométrica. Tanto incidênciaquanto severidade da artrite foram avaliados. A incidência é definida como onúmero de ratos com evidência clínica de inflamação de articulação duranteo período de estudo.

Tal como mostrado na Fig. 2, 100% dos animais rapidamentedesenvolveram uma sinovite. Uma redução significante (20%) na severidadede artrite (índice inflamatório) foi observada por injeção intravenosa de me-totrexato (controle positivo) do dia 13 e além. Uma redução significante (até25%) do índice inflamatório foi também observada com composto 1 do dia 1ao dia 21.

O efeito de administração oral de composto 1 foi determinadoseguindo o protocolo descrito acima com a exceção de que o composto 1 foioralmente administrado em 50 mg/kg do dia 3 ao dia 19. O controle positivofoi indometacina. Tal como mostrado na Figura 3, uma redução significante(10 a 40%) na severidade de artrite (índice inflamatório) foi observada poradministração oral de indometacina (controle positivo) do dia 1 e além. Umaredução significante (10 a 30%) do índice inflamatório foi também observadacom composto 1 do dia 1 ao dia 20.

Patentes, pedidos de patente, e outras publicações citadas aquisão incorporados por referência em sua totalidade.

Todas as modificações e substituições que chegam dentro dosignificado das reivindicações e a faixa de seus equivalentes legais devemser abrangidos dentro de seu escopo. Uma reivindicação usando a transição"compreendendo" permite a inclusão de outros elementos estarem dentro doescopo da reivindicação; a invenção é também descrita por tais reivindica-ções usando a frase transicional "consistindo essencialmente em" (isto é,permitindo a inclusão de outros elementos estarem dentro do escopo dareivindicação se eles não materialmente afetarem a operação da invenção)e a transição "consistindo" (isto é, permitindo apenas os elementos listadosna reivindicação exceto impurezas ou atividades inconseqüentes as quaissão ordinariamente associadas com a invenção) em vez do termo "compre-endendo". Quaisquer das três transições podem ser usadas para reivindicara invenção.

Deve ser entendido que um elemento descrito neste relatórionão deve ser interpretado como uma limitação da invenção reivindicada anão ser que ele seja explicitamente recitado nas reivindicações. Desta for-ma, as reivindicações são a base para determinação do escopo de proteçãolegal concedida em vez de uma limitação da relatório o qual é lido nas rei-vindicações. Em contradição, a técnica anterior é explicitamente excluída dainvenção ao nível de modalidades específicas que antecipariam a invençãoreivindicada ou destruiriam a novidade.

Além disso, nenhuma ligação particular entre ou dentre as limi-tações de uma reivindicação é pretendida a não ser que tal ligação seja ex-plicitamente recitada na reivindicação (por exemplo, o arranjo de componen-tes em uma reivindicação ou ordem de produto de etapas em uma reivindi-cação de método não é uma limitação da reivindicação a não ser que expli-citamente estabelecido ser assim). Todas as possíveis combinações e trocasdos elementos individuais descritos aqui são consideradas ser aspectos dainvenção; similarmente, generalizações da descrição da invenção são consi-deradas serem parte da invenção.

Do antecedente, seria aparente a uma pessoa de versada nestatécnica que a invenção possa ser incorporada em outras formas es-pecíficassem afastamento de seu espírito ou características essenciais. As modalida-des descritas deveriam ser consideradas apenas como ilustrativas, não res-tritivas, porque o escopo da proteção legal fornecida pela invenção será indi-cado pelas reivindicações anexadas em vez de por este relatório.

Claims (14)

1. Composto, caracterizado pelo fato de que apresenta a seguin-te fórmula:n = 0-2m = 0-2m não é necessariamente igual a n<formula>formula see original document page 37</formula>onde R1, R3 = NH2) F, Cl, grupo C1-C4 alcóxi ou fenóxi, mas Ri é não neces-sariamente igual a R3; eR2 = H, F, Cl, NH2, ou NH-R-XH;onde R = -(CH2)p- p = 2 a 4<formula>formula see original document page 37</formula>X = CH2, NH, O, ou S.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que Ri = R3 = NH2, F ou Cl, n = 0, e m = 2.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que R1 = R2 = meta-NH2, F ou Cl, R2 = H, n = 0 e m = 2.

4. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado dogrupo que consiste em:<formula>formula see original document page 3</formula><formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>

5. Composto de acordo com qualquer uma das reinvindicacaoes 1a 4, caracterizado pelo fato de que pode não covalentemente ligar-se a umanticorpo.

6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende pelomenos um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-5, em que o referido composto é combinado com um veículo farmaceutica-mente aceitável.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que também é compreendida de uma proteína recombinante aqual é capaz de ligar-se a TNFa humano.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizadapelo fato de que também é compreendida de metotrexato, um corticoesterói-de antiinflamatório, um fármaco antiinflamatório não-esteroidal, ou umacombinação dos mesmos.

9. Método de uso de um composto como definido na reivindica-ção 5, como um agente de afinidade, caracterizado pelo fato de que com-preende a ligação do referido composto a pelo menos anticorpo ou complexoimune de anticorpo-antígeno e separação de material não ligado para isolaro referido anticorpo ou complexo imune de anticorpo-antígeno.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que um ou mais compostos são imobilizados a um suporte insolúvel.

11. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação deum medicamento para tratamento de doença auto-imune.

12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de que a referida doença auto-imune é selecionada do grupo consistin-do em lúpus eritematoso sistêmico, artrite, glomerulonefrite, imune tromboci-topenia, e vasculite.

13. Uso de um composto como definido na reivindicação 5, ca-racterizado pelo fato de que é para ligação in vitro a pelo menos anticorpo oucomplexo imune de anticorpo-antígeno.

14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelofato de que um ou mais compostos são imobilizados a um suporte insolúvel.