BRPI0611021A2 - combinação de inibidores de hmg-coa redutase e inibidores de mtor - Google Patents

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BRPI0611021A2
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BR
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rapamycin
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mtor
hmg
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BRPI0611021-5A
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Richard Jean Dorent
Carole Anne Sips
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Novartis Ag
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Abstract

A presente invenção refere-se a uma combinação farmacêutica compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos e agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMBINAÇAO DE INIBIDORES DE HMG-COA REDUTASE E INIBIDORES DE MOTOR."
A presente invenção refere-se a uma combinação, tal como uma preparação ou composição farmacêutica combinadas, respectivamente, compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase (também chamado inibidor de β-^Γόχϊ-β-Γηβίΐΐ9ΐυί3πΙ-οο-βηζίιτΐ3-Α redutase) ou sais farmaceuti-camente aceitáveis destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina, opcionalmente na presença de um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, separado ou seqüencial, especialmente na prevenção, retardo da progressão ou tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como hipercolesterolemia, dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, aterosclerose e na prevenção, retardo da progressão ou tratamento de condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR, ao uso de tal combinação para a preparação de uma preparação farmacêutica para a prevenção, retardo da progressão ou tratamento de tais condições; um método de prevenção, retardo da progressão ou tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como hipercolesterolemia, dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose a seguir de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
A presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase ou saisfarmaceuticamente aceitáveis destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina, opcionalmente na presença de um veículo farmaceuticamente aceitável e seus usos no tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como hipercolesterolemia, dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, hipercolesterolemia semelhante à ate-rosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose a seguir de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições infla-matórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
A presente invenção além disso refere-se a combinações ou composições farmacêuticas que compreendem em combinação um inibidor de HMG-Co-A redutase selecionado da lista de atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina (antigamente itavastatina), pravastati-na, rosuvastatina, e sinvastatina, ou, em cada caso, um sal farmaceuticamente aceitável destes, (preferido é fluvastatina, atorvastatina, pitavastatina ou sinvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes) e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas que compreendem em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas que compreendem em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina selecionado do grupo de: 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-rapa-micina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hi-dróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0- (2-hidroxietil)-rapamicina, 32-desoxorapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas que compreendem em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em um aspecto a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hiper-colesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose que compreendem em combinação um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente pitavastatina ou fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina selecionado do grupo de: 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxorâpamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2- metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32-desoxorapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em um aspecto a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hiper-colesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças re-acionadas à aterosclerose que compreendem em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em um aspecto preferido a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose que compreendem em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em um outro aspecto a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angi-oplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados com tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplan-te, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reab-sorção óssea, que compreendem em combinação (i) fluvastatina, atorvasta-tina, pitavastatina ou sinvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e (ii) um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina selecionado do grupo de: 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-ra-pamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32-desoxorapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32 (S)-diidro-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
Em um aspecto preferido a presente invenção refere-se a combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença In-flamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplan-te, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reab-sorção óssea, que compreendem em combinação (i) fluvastatina ou pitavas-tatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e (ii) o agente de inibição de mTOR e 40-0-(2-hidroxietil) e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.Nestas composições, os componentes (i) e (ii) podem ser obtidos e administrados juntos, um depois do outro ou separadamente em uma forma de dose unitária combinada ou em duas formas de dose unitária separadas. A forma de dose unitária também pode ser uma combinação fixa.
Em uma outra modalidade, a invenção fornece o uso de uma combinação farmacêutica de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como hipercoleste-rolemia, dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Infiamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplasti-a, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições infla-matórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
Em uma outra modalidade, a invenção fornece o uso de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercoleste-rolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular e condições ou doenças relacionadas à aterosclerose.
Em uma outra modalidade, a invenção fornece o uso de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção para o tratamento ou prevenção e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Infiamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomasassociados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições infla-matórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
A presente invenção fornece um kit compreendendo em recipientes separados em um único pacote combinações ou composições farmacêuticas compreendendo em um recipiente uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente pitavas-tatina ou fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e em um segundo recipiente uma composição farmacêutica compreendendo um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina selecionado do grupo de: 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-iniló-xi-32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0-(2-hidroxi-etil)-rapamicina, 32-desoxorapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina.
A presente invenção fornece um kit compreendendo em recipientes separados em um único pacote combinações ou composições farmacêuticas compreendendo em um recipiente uma composição farmacêutica compreendendo fluvastatina ou pitavastatina, e em um segundo recipiente o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina.
A forma do kit é particularmente vantajosa quando os componentes separados devem ser administrados em formas de dosagem diferentes ou são administrados em intervalos de dosagem diferentes.
A presente invenção refere-se a um pacote compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina juntamente com instruções para o uso em combinação com um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicinaselecionado do grupo de: 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxo-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil) -2-metilpropanoato]-rapamicina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazo-lil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32-desoxorapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hi-percolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença In-flamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplan-te, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reab-sorção óssea.
Em uma modalidade preferida, o pacote de acordo com a invenção compreende em combinação fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina.
Em uma outra modalidade a presente invenção refere-se a métodos de prevenção ou tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à disIipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer composição farma-cêutica preferida de acordo com a invenção e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável a um mamífero em necessidade destes.
Em uma outra modalidade a presente invenção refere-se a métodos de prevenção ou tratamento de condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH)1 doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios prolife-rativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoría-se), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer composição farmacêutica preferida de acordo com a invenção e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável a um mamífero em necessidade destes.
Em uma modalidade preferida a presente invenção refere-se a métodos de prevenção ou tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e do agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável a um mamífero em necessidade destes.
Em uma modalidade preferida a presente invenção refere-se a métodos de prevenção ou tratamento de condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Reste-nose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividadede tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH)1 doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psorí-ase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e ini-bição da reabsorção óssea compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de fluvastatina ou pitavastatina ou um sal far-maceuticamente aceitável destes e do agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável a um mamífero em necessidade destes.
Inibidores de HMG-Co-A redutase (também chamados inibidores de 3-hidróxi-3-metilglutaril-co-enzima-A redutase) são entendidos serem a-queles agentes ativos que podem ser usados para diminuir os níveis de lipídeo incluindo colesterol no sangue.
A classe de inibidores de HMG-Co-A redutase compreende compostos tendo características estruturais diferentes. Por exemplo, menção pode ser feita aos compostos que são selecionados do grupo consistindo em atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina, lovastatina, pitavastatina (antigamente itavastatina), pravastatina, rosuvastatina, e sinvastatina, ou, em cada caso, um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Inibidores de HMG-Co-A redutase preferidos são aqueles agentes que foram comercializados, o mais preferido é fluvastatina, atorvastatina, pitavastatina ou sinvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes.
Métodos de fabricar os inibidores de HMG-CoA redutase são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica e tais agentes incluem aqueles comercialmente disponíveis.
Os inibidores de HMG-CoA redutase podem ser usados em suas formas de ácido livre, em suas formas de éster, ou como seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de sódio, sais de cálcio, e sais de éster.
Os inibidores de HMG-CoA redutase podem ser usados comomisturas racêmicas, ou como um estereoisômero mais ativo conforme apropriado.
Os inibidores de HMG-CoA redutase podem estar presentes em uma quantidade eficaz para inibir a biossíntese de colesterol em seres hu-manos. Em uma modalidade, as composições farmacêuticas compreendem de cerca de 5 a cerca de 50 por cento em peso do inibidor de HMG-CoA redutase, com base no peso total da composição. Mais preferivelmente, as composições compreendem de cerca de 20 a cerca de 40 por cento em peso do inibidor de HMG-CoA redutase, com base no peso total da composição.
Um inibidor de mTOR é um composto que alveja mTOR intracelular ("Alvo mamífero de Rapamicina"). mTOR é um membro da família de cinase relacionada à fosfatidilinositol 3-cinase (PI3-cinase). Rapamicina e derivados de rapamicina inibem a via de mTOR por intermédio de um complexo com seu receptor intracelular FKBP12 (proteína de ligação 12 de FK506).
A rapamicina é um antibiótico macrolídeo conhecido produzido por Streptomyces hygroscopicus. Por derivado de rapamicina é significado uma rapamicina substituída tendo propriedades de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina substituída na posição 40 e/ou 16 e/ou 32, por exempio um composto da fórmula I
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em que
R1 é CH3 ou C3-6alquinila,
R2 é H, -CH2-CH2-OH, 3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metil-propanoíla ou tetrazolila, e
X é=0, (H,H)ou (Η,ΟΗ)contanto que R2 é outro que não H quando X é =O e Ri é CH3, ou um pró-fármaco deste quando R2 é -CH2-CH2-OH, por exemplo, um éter fisiologicamente hidrolisável deste.
Derivados de rapamicina representativos da fórmula I são por exempio, 32-desoxorapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxorapamicina, 16-pent -2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropano-ato]-rapamicina (também chamado CCI779) ou 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578). Um composto preferido é por exemplo, 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina descrito no Exemplo 8 na WO 94/09010 (referido em seguida como Composto A), ou 32-desoxorapamicina ou 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina como descrito na WO 96/41807.
Derivados de rapamicina também podem incluir os assim chamados rapálogos, por exemplo, como descrito na WO 98/02441 e W001/14387, por exemplo, AP23573, AP23464, AP23675 ou AP23841.
Outros exemplos de um derivado de rapamicina são aqueles descritos sob o nome TAFA-93, biolimus-7 ou biolimus-9.
Foi surpreendentemente descoberto que as combinações ou composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser usadas para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipi-demia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose seguida de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados a tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios prolife-rativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoría-se), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibi-ção da reabsorção óssea.
Foi surpreendentemente descoberto que, uma combinação de um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina obtém maior efeito terapêutico (uma potenciação) do que a administração de fluvastatina ou pitavastatina ou do agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um agente de derivado de rapamicina sozinho.
Preferivelmente os estudos das partes experimentais abaixo são realizados com 1) uma combinação compreendendo pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 2) pitavastatina sozinho e 3) 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina sozinho.
Preferivelmente os estudos experimentais abaixo são realizados com 1) uma combinação compreendendo fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 2) fluvastatina sozinho e 3) 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina sozinho.
Por exemplo, estudos representativos são realizados com uma combinação de fluvastatina e everolimus, por exemplo, aplicando a metodIogia seguinte.
Foi avaliado o efeito antiaterotrombótico de everolimus (40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina) sozinho ou em combinação com fluvastatina ou pitavastatina com o objetivo final para dirigir-se aos benefícios aditivos ou sinérgicos potenciais desta combinação de medicamentos com mecanismo de ação diferente.
Lesão da artéria carótida de coelho: um modelo experimental de aterotrom-bose
De modo a investigar a modulação farmacológica potencial de aterotrombose é fundamental utilizar um modelo experimental que assemelha-se a muitos dos eventos que ocorrem durante a aterogênese e suas complicações tromboembólicas. Foi estabelecido um modelo in vivo de aterogênese com base na manipulação perivascular de artérias carótidas decoelho por inserção cirúrgica de um colar de silicona oco macio ("o modelo do colar"). Este método induz, dentro de duas semanas, uma lesão da íntima hiperplásica reproduzível caracterizada por migração e proliferação de SMCs que elevam na presença de um endotélio intacto. Em particular, foi possível detectar a adesão e infiltração de leucócito (linfócito Τ, PMN, mo-nócito) assim como a expressão de moléculas de adesão tais como ICAM-1 e VCAM-1. Neste modelo, por microscopia eletrônica de transmissão, foi também recentemente observada uma interação previamente desconhecida entre leucócitos polimorfonucleares medianos e SMC, referida como empe-ripolese, um fenômeno ativo de células absorvendo outras células diferente da fagocitose. A lesão previamente descrita é obtida independentemente da elevação de lipídeo; entretanto, a hipercolesterolemia tem um efeito prejudicial geral nos processos aterogênicos que ocorrem neste modelo, levando a um espessamento íntimo mais severo e complicado caracterizado por ECM abundante, deposição de lipídeo, e monócito carregado com colesterol/macró-fagos. Durante a última década, foi possível mostrar a capacidade de várias classes de medicamentos (por exemplo, estatinas, antagonistas de cálcio, apoproteína Al-Milano) para inibir a formação da placa que ocorre depois do posicionamento do colar em animais tanto normo- quanto hipercolesterolêmicos, assim como o mecanismo de ação dos compostos testados. Em particular, foi demostrado que fluvastatina ou pitavastatina são capazes de interferir com a formação de placa através de sua ação primária (isto é, inibi-ção de HMG-CoA redutase).
Foi também demostrado uma super-regulação da expressão de TF (fator tecidual) e MMPs (metaloproteinases de matriz) e taxa de esterifi-cação de colesterol aumentada na parede da carótida, a seguir da manipulação perivascular em coelhos hipercolesterolêmicos (manuscrito em preparação). A expressão de TF elevada confere um fenótipo pró-trombogênico à artéria carótida, entretanto, fluvastatina ou pitavastatina foram mostrados atenuar as propriedades inflamatórias e pró-trombogênicas das lesões ate-roscleróticas.Estatinas e aterosclerose
Experiências clínicas estabeleceram firmemente que inibidores de HMG-CoA redutase podem induzir à regressão de aterosclerose vascular assim como a redução de morbidez relacionada a problema cardiovascular e morte em pacientes com e sem doença da artéria coronária. Estes efeitos benéficos nos eventos coronários geralmente foram atribuídos às propriedades hipocolesterolêmicas das estatinas. Entretanto, como o mevalonato, o produto da reação enzimática, é o precursor não apenas de colesterol mas também de muitos compostos isoprenóides não esteroidais, a inibição de HMG-CoA redutase pode resultar em efeitos pleiotrópicos. De fato, a via de mevalonato produz uma série de isoprenóides que são vitais para funções celulares diversas. Várias proteínas pós-traducionalmente modificadas pela ligação covalente de grupos isoprenóides derivados de mevalonato, farnesil-ou geranilgeranil-pirofosfato, foram identificados. Estas proteínas devem ser preniladas como um pré-requisito para a associação de membrana, que é necessária para sua função. Membros desta família estão envolvidos em vários processos celulares incluindo sinalização celular, diferenciação e proliferação celulares, mielinação, dinâmica do citoesqueleto e transporte en-docitótico/exocitótico.
Uma variedade de dados experimentais, indicam que as estatinas, através da inibição de HMG-CoA redutase, pode afetar vários processos envolvidos na formação de lesões ateroscleróticas, independentemente de suas propriedades hipocolesterolêmicas.
O efeito benéfico das estatinas em eventos clínicos pode envolver mecanismos relacionados a não lipídeo que modificam a função endote-lial, respostas inflamatórias, modificação oxidativa de lipoproteínas circulantes, formação de célula espumosa, ativação de célula do músculo liso, angi-ogênese, estabilidade de placa e formação de trombo, o perfil pleiotrópico de estatinas provavelmente pode ser explicado pela modulação da via de mevalonato, porque a inanição de mevalonato (como um resultado da inibição de HMG-CoA redutase por estatinas) tem conseqüências para a função celular que estendem-se além de síntese de colesterol diminuída. Os dadosdisponíveis demonstram que os inibidores de HMG-CoA redutase, além de suas propriedades de redução de Iipideo1 exercem um efeito antiateroscleró-tico direto na parede arterial que pode prevenir significantemente a doença cardiovascular.
Agentes imunossupressores e aterosclerose
Rapamicina (sirolimus), um inibidor imunossupressor de macro-lídeo de mTOR (alvo mamífero de Rapamicina), inibe a proliferação dependente do fator de crescimento de células hematopoiéticas e não hematopoi-éticas por intermédio de interrupção do ciclo celular na fase G1 tardia. SiroIimus foi mostrado inibir a proliferação e migração in vitro de SMCs vasculares (células do músculo liso) e afetar o crescimento da neoíntima em artérias carótidas de rato e coronárias de suíno Iesionadas em balão. Mais recentemente, stents revestidos com sirolimus mostram inibir crescimento da neoíntima intra-stent em artérias coronárias de suíno em 28 dias, e resulta-dos iniciais impressivos com stents de eluição de sirolimus em seres humanos (O % de taxa de restenose em 210 dias) foram relatados.
Um composto imunossupressor e antiproliferativo oralmente ativo da mesma família como sirolimus, everolimus [40-0-(2-hidroxietil)-rapa-micina], também tem mostrado efeitos promissores em prevenir a rejeição em transplante renal e cardíaco. Everolimus exibe inibição potente de proliferação induzida por fator de crescimento de linfócitos, assim como outras células hematopoiéticas e não hematopoiéticas de origem mesenquimal. Similarmente ao sirolimus, a atividade biológica de everolimus depende de sua ligação à imunofilina- proteína de ligação 12 FK506 (FKBP12). O complexo everolimus-FKBP12 interage com mTOR, uma tirosina cinase essencial para a progressão do ciclo celular da fase G1 a S, mais tarde identificada como FRAP cinase.
Everolimus prolonga a sobrevivência do aloenxerto em vários modelos de transplante em animal experimentais, e dados mais recentes sugerem que ele pode ser benéfico em prevenir a vasculopatia associada à disfunção de aloenxerto crônica. A experiência usando everolimus no transplante cardíaco também tem fornecido percepções potencialmente importan-tes nas conseqüências de efeitos antiproliferativos em SMC vascular e fi-broblastos onde a redução da expansão da íntima foi identificada por exa-minação por ultra-som coronária intravascular entre aqueles pacientes que recebem everolimus. Tal efeito apresenta alvos terapêuticos adicionais de relevância potencial.
Em um modelo de coelho, everolimus oral em dosagens similares àquelas usadas para a imunossupressão preveniram a neoexpansão da íntima associada a stent. Talvez o mais promissor para o transplante foram resultados obtidos usando everolimus para a imunossupressão em receptores de primeira vez de transplantes cardíacos onde uma redução dramática da incidência de arteriosclerose coronariana de aloenxerto foi observada. Estudo in vivo
Quatro grupos de animais (10 animais por grupo) são usados:
• nenhum tratamento (controle) everolimus (dosagem proposta na faixa de 0,75 a 1,5 mg/kg/dia)
• fluvastatina ou pitavastatina (dosagem proposta de 5 mg/kg/dia)
• everolimus (dosagem proposta na faixa de 0,75 a 1,5 mg/kg/dia) mais fluvastatina ou pitavastatina (dosagem proposta de 5 mg/kg/dia).
Nestes animais foram medidos: perfil de lipídeo plasmático (colesterol total, colesterol HDL, triglicerídeos);
• acúmulo de lipídeo na artéria carótida;
• processos celulares envolvidos na formação de lesão, isto é acúmulo de SMCs, e infiltração de leucócito (particularmente monócitos/macrófagos, PMNs, linfócitos T);
expressão de moléculas de adesão (VCAM-1, ICAM-1, e oc1 integrina) em células endoteliais e SMCs;
• funções do macrófago críticas à complicação da lesão e estabilidade de placa, isto é, expressão e atividade de MMPs;
• expressão de fator tecidual em lesões arteriais;
deposição e remodelagem de colágeno;
Estudo in vitro
Para adquirir outra percepção no mecanismo molecular do efeitoantiaterotrombótico de everolimus sozinho ou em combinação com fluvasta-tina ou pitavastatina, SMCs arteriais vasculares de coelho e rato cultivadas, e macrófagos peritoneais de camundongo são utilizados. Além disso, fibro-blastos de pele humana (HSF) e a linhagem de célula de hepatoma humano Hep-G2, representando o modelo periférico e central de metabolismo de lipoproteína, são utilizados com o objetivo final de avaliar o efeito de everolimus no metabolismo de lipoproteína.
Em particular, será avaliado o efeito dos fármacos testados em:
• proliferação de SMC. Estes estudos in vitro nos permite avaliar o efeito aditivo ou sinérgico potencial da combinação de everolimus +/- fluvastatina ou pitavastatina. A análise do isobolograma será realizada para dirigir-se a este assunto como descrito previamente52;
• metabolismo de lipoproteína celular. Este método in vitro é muito útil para investigar mecanismo(s) possível(is) responsável(is) pelo efeito hiperlipidêmico de everolimus. Mais especificamente, foi explorado o efeito de everolimus no catabolismo de lipoproteína e metabolismo de colesterol em HSF e em Hep-G2;
• homeostase de colesterol celular. Foi estudada a síntese, esterificação e efluxo de colesterol para ter uma ilustração clara no efeito de everolimus, sozinho ou em combinação com fluvastatina ou pitavastatina, no metabolismo, homeostase e deposição de lipídeo em células vasculares;
• expressão e atividade de MMP. Esta investigação é muito informativa para explicar alguns dos efeitos anti-ateroscleróticos potenciais de everolimus sozinho ou em combinação com fluvastatina ou pitavastatina.
Materiais e Métodos Estudos in vivo
Projeto experimental - O efeito de medicamentos testados na lesão da carótida induzida pelo colar é avaliado em coelhos hipercolestero-lêmicos 14 dias depois do posicionamento do colar. Os coelhos recebem os medicamentos por alimentação por sonda esofágica (everolimus) ou misturado com a dieta (fluvastatina ou pitavastatina) iniciando no dia da manipulação perivascular. A hipercolesterolemia é induzida pela administração deuma dieta rica em colesterol (1 % de colesterol) iniciando 4 semanas antes da inserção do colar.
Avaliação de lipídeo plasmático - Amostras de sangue são tiradas da artéria central da orelha depois de jejum durante a noite na avaliação inicial, na cirurgia, e no sacrifício para realizar a análise de lipídeo. Níveis de colesterol total, HDL, e triglicerídeos são determinados enzimaticamente. Mudanças globais no lipídeo são calculadas pela Área Sob a Curva (AUC) da concentração de lipídeo vs. tempo, usando a regra trapezoidal.
Atividade de ACAT (atividade de acil-coenzima colesterol acil transferase)) e teor de colesterol na carótida - A atividade de ACAT é determinada essencialmente pelo método de Helgerud. Os anéis da carótida são homogeneizados em tampão de TRIS/sacarose contendo [14C]-oleoil coen-zima A (0,5 μΟι^ιηοε^) complexada com soro bovino, em tampão de fosfato de potássio 0,1 M, pH 7,4. Depois da incubação durante 2 h a 37° C, a reação é parada pela adição de 5 ml de clorofórmio/metanol (2:1 v/v), e os lipídeos extraídos. Depois da centrifugação, a camada de clorofórmio é seca sob fluxo de N2. Para a determinação do teor de colesterol no arco aórtico, o mesmo procedimento é seguido, mas omitindo a adição de [14C]-oleoil co-enzima A na mistura de reação. Os lipídeos extraídos são separados por cromatografia de camada fina (t.l.c.) (isooctano/éter dietílico/ácido acético, 75:25:2, v/v/v). A radioatividade do colesterol nas manchas é determinada por contagem por cintilação líquida (Insta-Fluor, Packard, Groningen, The Netherlands) enquanto o teor de massa de colesterol nas manchas é determinado por um método enzimático. Foi testada a linearidade deste método entre 1,5 e 50 μg de colesterol (r2 = 0,99). Em cada determinação, [3H]-colesterol foi adicionado como padrão interno com uma recuperação de mais do que 90 %.
Lesão da carótida - Coelhos brancos da Nova Zelândia machos (2,7 a 3,0 kg) são anestesiados por injeção intramuscular de xilazina (5 mg/kg) e cetamina (35 mg/kg). Os animais depois são colocados em decúbito dorsal e uma incisão no pescoço em linha mediana é feita para expor cirurgica-mente ambas as artérias carótidas. Um colar Silastic não oclusivo, biologi-camente inerte, macio, oco (SILICOLLAR®, MediGene Oy, Kuopio, Finland) é posicionado em torno de ambas as artérias carótidas. O colar é de 25 mm de comprimento e ele toca a circunferência arterial em dois pontos, 20 mm distante. Em cada animal, a artéria carótida controlateral é submetida à cirurgia simulada colocando-se o colar em torno da artéria mas removendo-o exatamente antes da sutura dos ferimentos. No final do estudo, os animais são mortos por administração de uma dose i.v. legal de uretano (10 ml, solução aquosa a 25 %) e amostras das artérias carótidas são coletadas e processadas de acordo com os procedimentos apropriados para os métodos diferentes de análise.
Histologia - Segmentos das artérias carótidas são facilmente dissecados e excisados exatamente depois da eutanásia. As artérias são congeladas ou embutidas em parafina, e transversalmente cortadas de modo a obter seções seriais de 5 Dm. Os tecidos são tingidos com hematoxilina e eosina para identificar e quantificar estruturas vasculares por análise morfométrica. Os parâmetros seguintes são medidos por análise de imagem auxiliada por computador (OPTIMAS 6.2, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA): área de lúmen (L), área circundada pela lâmina elástica interna (IEL), e área circundada pela lâmina elástica externa (EEL). Os parâmetros seguintes depois são determinados: (a) área íntima = I = IEL-L; (b) área mediana = M = EEL-IEL; e (c) razão íntima para média = l/M. Seções adicionais são tingidas com corante vermelho de picrosirius para rotular o colágeno. Regiões positivas para vermelho de picrosirius dentro da lesão são medidas usando análise de imagem por cor auxiliada por computador.
Detecção imunoistoquímica da expressão de moléculas de adesão (VCAM-1, ICAM-1 e α1 integrina) em células endoteliais e SMC - Identificação das moléculas de adesão celular na lesão da carótida íntima é realizada usando anticorpos para ICAM-1, VCAM-1 (R&D system), e α1 integrina (Chemicon). De acordo com procedimentos padrão crioseções da carótida são incubadas com o anticorpo primário específico e depois com um anticorpo secundário específico de espécies biotiniladas (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA). A rotulagem é feita com um kit avidina-biotina-peroxidase (Vectastain ABC Elite, Vector Laboratories Inc.) seguido por 3,3-diaminobenzidina (Sigma). Para o controle negativo o anticorpo primário é omitido e as seções serão incubadas com soro de cavalo normal.
Regiões positivas para VCAM-1, ICAM-1 e α1 integrina dentro da lesão são medidas usando análise de imagem por cor auxiliada por computador.
Análise quantitativa de acúmulo de macrófagos derivados de monócito e linfócitos T dentro da lesão - Identificação dos subconjuntos de leucócito que infiltram a lesão da carótida íntima é realizada usando anticorpos para marcadores de todos os leucócitos (anti-CD18, Serotec), células polimorfonucleares (PMNs) (neutrófilos polinucleares) (MCA 805, Serotec), monócito/macrófagos (RAM11, DAKO) e linfócitos T (anti-CD5, Serotec), de acordo com procedimentos padrão: seções de tecido serão incubadas com o anticorpo primário específico e depois com um anticorpo secundário específico de espécies biotiniladas (Vector Laboratories Inc.). A rotulagem é feita com um kit de avidina-biotina-peroxidase (Vectastain ABC Elite, Vector Laboratories Inc.) seguido por 3,3-diaminobenzidina (Sigma). Para o controle negativo o anticorpo primário é omitido e seções serão incubadas com soro de cavalo normal.
A área total de leucócito, PMN, monócito/macrófago e linfócito T, identificados respectivamente como regiões positivas de CD18, MCA805, RAM11 e CD5 dentro da lesão são medidas usando análise de imagem por cor auxiliada por computador.
Detecção imunoistoquímica de fator tecidual e análise quantitativa da expressão de proteína de fator tecidual - Para a detecção imunoistoquímica do fator tecidual, seções de tecido pré-digeridas são incubadas com um anticorpo de fator tecidual anticoelho de camundongo específico (AP-1) e depois com um anticorpo secundário de IgG anticamundongo de cavalo biotinilado (Vector Laboratories Inc.). A rotulagem é feita com o kit de avidina-biotina-peroxidase (Vectastain ABC Elite, Vector Laboratories Inc.) seguido por 3,3-diaminobenzidina (Sigma), de acordo com o método ABC padrão (Vector). Para o controle negativo o anticorpo primário é omitido e se-ções serão incubadas com soro de cavalo normal. A extensão de áreas íntimas imunopositivas de fator tecidual é medida usando análise de imagem por cor auxiliada por computador.
Análise de expressão e atividade de MMPs - A distribuição de MMPs diferentes é avaliada por imunoistoquímica. Seções são incubadas com anticorpo monoclonal primário (Amersham-Pharmacia-Biotech, Reino Unido) e depois com anticorpo secundário específico de espécies biotinila-das (Vector Laboratories Inc.,). A rotulagem será realizada com extrAvidin conjugada com FITC. O imunomanchamento de seções seriais com anticorpos anti-MMPs e anticorpos específicos de célula (anti-aactina para SMC, anti-CD31 para células endoteliais e anti-CD18 para leucócitos) é realizado para identificar o(s) tipo(s) de célula predominante(s) responsáveis pela expressão das MMPs diferentes.
A atividade de MMP é medida em homogenato de carótida de coelho por zimografia em gel de gelatina.
Estudos in vitro
Isolamento e culturas celulares - Macrófagos peritoneais de ca-mundongo (MPM) são coletados por lavagem peritoneal com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) de camundongos fornecidos com uma injeção intraperitoneal de 3 ml de tioglicolato a 4 % em água. Os MPM são peletizados, lavados duas vezes com meio de Eagle Modificado por Dulbec-co (DME) isento de soro, e plaqueados em uma placa de densidade de 3 χ 106 células/35 mm, e deixados aderir às placas durante 2 h em meio DME contendo 10 % de soro bovino fetal (FBS). Depois as placas são lavadas três vezes com meio DME para remover as células não aderentes, e incubadas em meio DME contendo 10 % de FBS até o dia do experimento.
Fibroblastos de pele humana (HSF) são cultivados de explantes de biópsias da pele obtidas de indivíduos normolipidêmicos clinicamente saudáveis. Os fibroblastos são caracterizados em termos de ligação, incorporação e degradação de LDL medidas por receptor. As células são cultivadas em monocamadas e mantidas em frascos plásticos de 75 cm2 a 37° C em uma atmosfera umedecida de 95 % de ar, 5 % de CO2 em meio F-11suplementado com 10 % de FCS, solução de aminoácido não essencial (1 %, v:v), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 ug/ml), tampão de tricina (20 mM, pH 7,4), NaHCO3 (24 mM). Para todos os experimentos, as células dos frascos de estoque são dissociadas com 0,05 % de tripsina - 0,02 % de EDTA em confluência (cinco a quinze passagens), semeadas em placas de Petri plásticas de 35 mm (1 a 1,5 χ 105 células para o experimento de captação de ligação e degradação são usadas exatamente antes de alcançar a confluência, usualmente 6 dias depois do plaqueamento e o meio é mudado a cada 2 a 3 dias. Para a medição da síntese do colesterol e do ácido graxo as células são semeadas em placas de Petri plásticas de 35 mm (7,5 χ 105 células) e incubadas com MEM suplementado com 10 % de FCS. Vinte e quatro horas mais tarde o meio é mudado para um contendo 10 % de LPDS, e as culturas são incubadas durante 24 h. Neste tempo (tempo 0) o meio é substituído por um contendo 10 % de LPDS na presença ou ausência de concentrações conhecidas dos compostos testados e a incubação é continuada durante 72 h adicionais a 37° C. A síntese do colesterol é estimada medindo-se a incorporação de [14C] acetato em esteróis celulares 29.
A linhagem de célula de hepatoma humano, Hep-G2, representando o modelo central de metabolismo de lipoproteína, obtido da American Type Culture Collection, é cultivada em monocamadas e cultivada como descrito para HSF com a adição ao meio de 0,11 g/l de piruvato de sódio. Para todos os experimentos as células são semeadas em placas de 35 mm (3 a 5 χ 10 5 células) em 2 ml de meio contendo 10 % de FCS e usadas 6 dias depois do plaqueamento.
SMCs são isolados de camadas íntimas-médias de aortas de ratos Sprague Dawley machos ou das carótidas de coelhos brancos da Nova Zelândia machos. As células são cultivadas em MEM suplementado com 10 % (v/v) de soro de bezerro fetal (FCS), 100 U/ml de penicilina, 0,1 mg/ml de estreptomicina, 20 mM de tampão de tricina e 1 % (v/v) de solução de aminoácido não essencial. As células são usadas entre a 4â e 103 passagem. SMCs são identificados quanto ao comportamento de crescimento, morfologia e usando um anticorpo monoclonal específico para a-actina(Sigma1MO1USA).
Proliferação celular - SMCs de rato são semeadas em densidade de 2 χ 105 células por placa de petri (35 mm) e incubadas com MEM suplementado com 10 % de FCS. Vinte e quatro horas mais tarde, o meio é mudado com um contendo 0,4 % de FCS para parar o crescimento celular, e as culturas incubadas durante 72 h. Depois deste tempo (tempo 0) o meio é substituído com um contendo 10 % de FCS como estímulo mitogênico e várias concentrações dos compostos testados. No tempo zero, exatamente antes da adição de medicamentos, três placas de petri são usadas para a contagem celular. O número de célula é avaliado depois de 3 dias de incu-bação por um Contador Coulter. Em um grupo separado de placas de Petri análises de imunomancha de Ciclina D e PCNA são realizadas. Em um outro conjunto de experimentos, a sincronização de SMC à interfase G0/G1 do ciclo celular é realizada incubando-se culturas Iogaritmicamente crescentes (2,5 χ 105 células/placa) durante 96 a 120 h em um meio contendo 0,4 % de FCS. Células quiescentes são incubadas durante 20 h em um meio fresco com 10 % de FCS na presença dos medicamentos testados. A síntese de DNA depois é estimada por incorporação nuclear de [3H] timidina, incubada com células (meio de 1 μ.Οϊ/πΊΐ) durante duas horas. A radioatividade é medida com coquetel de cintilação Aquasol (Packard, Groningen, NL).
SMC de coelho são semeadas em uma densidade de 2 χ 105 células por placa de Petri (35 mm) e incubadas com MEM suplementado com 10 % de FCS. Dezoito horas mais tarde o meio é mudado com um contendo 0,4 % de FCS para parar o crescimento celular, e as culturas incuba-das durante 48 h. Depois deste tempo (tempo 0) o meio é substituído com um contendo 10 % de FCS e várias concentrações de compostos. No tempo zero, exatamente antes da adição do medicamento, alguns Petri são usados para a contagem celular. O crescimento celular é avaliado por contagem de célula depois de 1 a 7 dias de incubação. O número de célula é determinado por Contador Coulter depois da tripsinização das monocamadas.
. Curvas de isoefeito são esboçadas como descrito.
Monocamadas de célula de expressão de Ciclina D e PCNA sãoresfriadas, lavadas com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS), raspadas em PBS contendo um coquetel de inibidores de protease (Boe-hringer Mannheim) e centrifugados (2000 rpm, 10 min.). As péletes celulares depois são solubilizados em 80 μΙ de tampão de amostra (3 % de SDS, 62,5 μΜ de TRIS-HCI, pH = 6,8, 5 % de β-mercaptoetanol, 10 % de glicerol). 10 a 25 microgramas de proteína são submetidos à eletroforese em 12 % de po-Iiacrilamida ou em 5 a 20 % de gel de gradiente para PCNA e ciclina D, respectivamente. As amostras são eletroforeticamente transferidas à membrana de Fluoreto de Polivinilideno e incubadas com anticorpo policlonal de colho anti ciclina D ou com anticorpo monoclonal anti PCNA. Os anticorpos são detectados com um imunoglobina anticoelho de asno e anticamundongo de coelho rotulada com conjugado de peroxidase. A atividade de peroxidase é revelada com ECL plus (Amersham).
Modificações da expressão de ciclina D e PCNA são avaliadas por varredura densitométrica de Western Blots e expressadas como uma porcentagem média das condições de controle (10 % de FCS).
Expressão e atividade de MMP - A expressão de MMP é avaliada por análise de western blot dos meios condicionados por célula usando anticorpos específicos contra MMPs humanos. A atividade de MMP é medida por zimografia em gel de gelatina.
Zimografia em gel de gelatina - Proteínas com atividade protei-nolítica são identificadas por eletroforese em 7,5 % de géis de poliacrilamida contendo 10 % de SDS e gelatina (1 mg/ml) sob condições de não redução e sem ebulição. Depois que elas são incubadas durante a noite a 37° C com agitação suave em TRIS a 50 mMol/l pH 7,5 contendo NaCI a 150 mM, Ca-Cb a 10 mM, ZnCI2 a 1DM, para ativar a capacidade de metaloproteinase para digerir o substrato. No final da incubação, os géis são tingidos com A-zul de Coomassie. As zonas claras contra o fundo azul indicam a presença de atividade proteinolítica.
Análise de Western Blot - Alíquotas dos meios condicionados (40 μΙ por via) são conduzidas em 10 % de gel de poliacrilamida contendo SDS, sob condições de não redução (Bellosta et ai, 1998). As proteínas sãomanchadas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories, Milan, ltaly) e identificadas usando um anticorpo monoclonal de camundongo MMP-9 anticamundongo (R & D).
Lipoproteínas e soro deficiente de lipoproteína - Lipoproteínas foram preparadas do plasma de voluntários normolipidêmicos clinicamente saudáveis. LDL (d 1,019 a 1,063 g/ml) é isolado por ultracentrifugação preparativa seqüencial e iodado com 125I. LDL radioativo é usado dentro de três dias a partir da preparação e esterilizados por passagem através de um filtro Millipore (0,22 μιτι de tamanho de poro) imediatamente antes da incubação com as células.
Captação de ligação, e degradação de LDL - Células confluen-tes são pré-incubadas durante 48 h a 37° C em um meio contendo 10 % de LPDS humana. Depois do pré-tratamento de 24 h com meio deficiente de lipoproteína para supra-regular a atividade do receptor de LDL na presença ou ausência dos compostos testados, cada camada receberá 1 ml de meio fresco. LDL rotulado com 125I é adicionado nas concentrações finais de 7,5 μς/ιτιΙ, e as células incubadas a 37° C durante 4 h em meio deficiente de lipoproteína ou a 4o C em meio A (suplementado com 10 mM de tampão de Hepes) contendo 10 % de soro deficiente de lipoproteína. As células depois são colocadas em gelo e lavadas três vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada, pH 7,4, contendo 0,2 % de albumina sérica bovina, e três vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada.
Tratamento pré rastreamento a 4o C. As camadas celulares foram lavadas ainda por incubação a 4o C durante 30 min em meio A contendo 10 % de soro deficiente de lipoproteína. Em certos experimentos LDL ligado ao receptor é removido antes do rastreamento por exposição à hepa-rina sódica. (10 mg/ml de heparina sódica durante 60 min a 4o C). Uma alíquota deste meio é analisada quanto ao seu teor de I (heparina liberá-vel). Depois de todos os tratamentos pré rastreamento, as células são Iavadas duas vezes mais com solução salina tamponada com fosfato a 4o C.
Para o rastreamento a 37° C, as células recebem 2 ml de meio deficiente de lipoproteína. Para o rastreamento a 4o C, as células são expôs-tas a meio A gelado contendo 10 % de soro deficiente de lipoproteína e mantidas em gelo. Depois de um período de rastreamento de 2 h, o meio é removido e retido para a análise (ver abaixo). A camada celular é lavada três vezes com solução salina tamponada com fosfato e as células dissolvidas por incubação durante a noite a 37° C em NaOH 1 N. Uma alíquota da camada solubilizada é contada para determinar a radioatividade de 125I associada com células, e uma alíquota usada para a estimação da proteína celular de acordo com o método de Lowry.
Análise do meio - 0,3 ml de ácido tricloroacético a 100 % será adicionado a 2 ml de meio. Depois de repousar durante 30 min em gelo, o precipitado é coletado por centrifugação a 1000 X g durante 30 min e a péle-te contata quanto ao seu teor de material precipitável em ácido tricloroacético rotulado com 125I. Uma alíquota de 1 ml do sobrenadante ácido é contada para determinar a radioatividade solúvel em ácido tricloroacético total e depois é usada para a determinação de tricloroatividade que não iodo.
Síntese dos esteróis totais - A síntese de colesterol é determinada medindo-se a incorporação de acetato radioativo em esteróis celulares. As monocamadas celulares, depois da incubação com [2-14C]acetato (1 pCi/ml) durante 72 h, são lavadas com PBS e digeridas com NaOH 0,1 M.
As alíquotas são saponificadas a 60° C durante 1 h em NaOH alcoólico depois da adição de [1,2(n)-3H]colesterol como o padrão interno (0,04 pCi/amostra). O material não saponificado é extraído com éter de petróleo de ebulição baixa e contado quanto à radioatividade. Para avaliar a incorporação de acetato rotulado em esteróis celulares, estes são separados da fração não saponificada por cromatografia de camada fina com uso de éter de petróleo (ponto de ebulição, 40 a 60° C)/éter dietílico/ácido acético (70:30:1). A radioatividade é medida com coquetel cintilador Insta-Fluor (Packard, Milan, Italy).
Síntese de ácido graxo - As fases aquosas das extrações de éter de petróleo são misturadas entre si, acidificadas com HCI concentrado, e extraídas três vezes com éter de petróleo. As fases orgânicas mistas depois são evaporadas à secura, recolocadas em suspensão em clorofórmiocontendo 100 pg de ácido linoléico como veículo, e submetidas à cromato-grafia de camada fina em Sílica-gel G com um sistema de solvente consistindo em vapor de heptano/éter dietílico/ácido acético e quantificadas como previamente descrito para a medição de 14C-ésteres colesterílicos. Os dados são expressados como os picomoles de [14C]acetato incorporado em 14C-ácidos graxos por mg de proteína celular total.
Ensaio de esterificação de colesterol (atividade de ACAT): As células são incubadas com os medicamentos testados e AcLDL (50 pg/ml) como indicado. A esterificação do colesterol é medida depois da adição de [1-14C]ácido oléico (0,68 pCi/amostra) complexada com albumina sérica bovina durante as últimas 2 h de incubação e determinação subseqüente de radioatividade associada com ésteres colesterílicos celulares.
No final da incubação, as células são lavadas com PBS e lipí-deos extraídos com hexano/isopropanol (3:2). Os lipídeos extraídos são separados por TLC (isoctano/éter dietílico/ácido acético, 75:25:2, v/v/v). A radioatividade do colesterol nas manchas é determinada por contagem por cintilação líquida.
Efluxo de esterol e colesterol - As células são cultivadas em placas de 24 reservatórios até 80 % de confluência. As células são rotuladas adicionando-se 30 pg/ml [3H]-LDL Acetilado durante 24 horas ou, para ra-diorrotular o colesterol celular, adicionando-se 3 μΟΐ/ηιΙ [1,2-3H]colesterol com 30 pg/ml de LDL Acetilado durante 24 horas. As células depois são incubadas durante 18 h com meio contendo 0,2 % de BSA com ou sem HDL ou apoAI.
Estatística - Para garantir um resultado imparcial, dados morfométricos são coletados em uma forma cega. Os espécimes são designados a seu grupo de tratamento respectivo depois que todos os dados numéricos foram obtidos. Os dados são expressados como média ± SD. As diferenças entre os grupos é avaliada por ANOVA de 1 via seguido por teste t de Student não pareado. A significância estatística é determinada no nível de confiança de 95 % (P < 0,05).
Foi surpreendentemente descoberto que, a combinação de flu-vastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, e everolimus (40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina) obtém maior efeito terapêutico (uma poten-ciação) na prevenção ou no tratamento de aterotrombose.
Mais geralmente, também foi surpreendentemente descoberto que, uma combinação de um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina obtém maior efeito terapêutico (uma potenciação) na prevenção ou no tratamento de aterotrombose.
As combinações de acordo com a invenção também melhoram surpreendentemente os sintomas e melhora efeitos colaterais por exemplo miotoxicidade.
Maior eficácia também pode ser documentada como uma duração prolongada da ação. A duração da ação pode ser monitorada como o tempo para retornar à avaliação inicial antes da dose seguinte ou como a área sob a curva (AUC) e é expressa como o produto da mudança na pressão sangüínea em milímetros de mercúrio (mudança em mmHg) e a duração do efeito (minutos, horas ou dias).
Outros benefícios são que doses mais baixas dos medicamentos individuais a serem combinados de acordo com a presente invenção podem ser usadas para reduzir a dosagem, por exemplo, que as dosagens freqüentemente não precisam ser apenas menores mas também são aplicadas menos freqüentemente, ou podem ser usadas para diminuir a incidência de efeitos colaterais.
Preferida é a combinação de dose baixa de inibidor de HMG-Co-A redutase e agente de inibição de mTOR. A administração combinada de um inibidor de HMG-Co-A redutase especialmente fluvastatina ou pitavastatina, ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um rapamicina resulta em uma resposta significante em uma porcentagem maior de pacientes tratados, isto é, uma taxa de respondedor maior resulta, não obstante da etiologia subjacente da condição. Isto está de acordo com os desejos e necessidades dos pa-cientes a serem tratados.
Pode ser mostrado que a terapia de combinação com agente de fluvastatina ou pitavastatina e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina resulta em uma terapia mais eficaz de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterole-mia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR através da eficácia melhorada assim como uma taxa de respon-dedor maior.
Pode ser mostrado ainda que fluvastatina ou pitavastatina e um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina a terapia de combinação prova ser benéfica na redução do efeito colateral devido ao tratamento de inibidores de HMG-Co-A redutase, por exemplo, redução de toxicidade.
Assim na presente descrição os termos "tratamento" ou "tratar" referem-se tanto ao tratamento profilático quanto preventivo assim como tratamento curativo ou moderador de doença, incluindo tratamento de pacientes em risco de contrair a doença ou suspeitos de terem contraído a doença assim como pacientes que estão doentes ou foram diagnosticados como sofrendo de uma doença ou condição médica.
Os Agentes da Invenção, isto é, os inibidores de HMG-Co-A redutase ou agente de fibratos são preferivelmente usados na forma de preparações farmacêuticas que contêm a quantidade terapeuticamente eficaz relevante de cada ingrediente ativo (separadamente ou em combinação) opcionalmente junto com ou em mistura com veículos farmaceuticamente aceitáveis inorgânicos ou orgânicos, sólidos ou líquidos, que são adequados para a administração.
Os Agentes da Invenção podem estar presentes nas mesmas composições farmacêuticas, ainda que estejam preferivelmente em composições farmacêuticas separadas. Assim os ingredientes ativos podem ser administrados ao mesmo tempo (por exemplo, simultaneamente) ou emtempos diferentes (por exemplo, seqüencialmente) e durante períodos diferentes de tempo, que podem ser separados um do outro ou sobrepostos. A forma de dose unitária também pode ser uma combinação fixa.
Preferivelmente, as composições farmacêuticas são adaptadas para a administração oral ou parenteral (especialmente oral). A administração intravenosa e oral, primeiramente oral é considerada ser de importância particular.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem ser preparadas em uma maneira conhecida por si e são aquelas adequadas para a administração enteral, tal como oral, retal, inalação por aerossol ou nasal, e parenteral tal como administração intravenosa ou subcu-tânea, ou composições para a administração transdérmica (por exemplo, passiva ou iontoforética) aos mamíferos (animais de sangue quente), incluindo o ser humano. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto farmacologicamente ativo, sozinho ou em combinação com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, especialmente adequados para a aplicação enteral ou parenteral. Formulações orais típicas incluem comprimidos, cápsulas, xaropes, elixires e suspensões. Formulações injetáveis típicas incluem soluções e suspensões. Os compri-midos pode ser revestidos com película ou revestidos entéricos de acordo com métodos conhecidos na técnica. Preferidos são comprimidos e cápsulas de gelatina compreendendo o ingrediente ativo juntamente com a) dilu-entes, por exemplo, lactose, dextrose, sacarose, manitol, sorbitol, celulose e/ou glicina; b) lubrificantes, por exemplo, sílica, talco, ácido esteárico, seu sal de magnésio ou cálcio e/ou polietilenoglicol; para comprimidos também c) aglutinantes por exemplo, alumino silicato de magnésio, pasta de amido, gelatina, tragacanto, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e ou polivi-nilpirrolidona; se desejado d) desintegrantes, por exemplo, amidos, ágar, ácido algínico ou seu sal de sódio, ou misturas efervescentes; e/ou e) absorventes, corantes, flavores e adoçantes. Composições injetáveis são preferivelmente soluções ou suspensões isotônicas aquosas, e supositórios são vantajosamente preparados de emulsões ou suspensões graxas. As ditascomposições podem ser esterilizados e/ou contêm adjuvantes, tais como agentes conservantes, estabilizantes, umectantes ou emulsificantes, promotores de solução, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões. Além disso, eles também podem conter outras substâncias terapeuticamente valiosas. As ditas composições são preparadas de acordo com métodos de mistura, granulação ou revestimento convencionais, respectivamente, e contêm de cerca de 0,1 a 85 %, preferivelmente cerca de 1 a 70 %, do ingrediente ativo.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis típicos para o uso nas formulações descritas acima são exemplificados por: açúcares tais como lactose, sacarose, manitol e sorbitol; amidos tais como amido de milho, amido de tapioca e amido de batata; celulose e derivados tais como carboxime-til celulose de sódio, etil celulose e metil celulose; fosfatos de cálcio tais como fosfato de dicálcio e fosfato de tricálcio; sulfato de sódio; sulfato de cálcio; polivinilpirrolidona; álcool polivinílico; ácido esteárico; estearatos de metal alcalino terroso tais como estearato de magnésio e estearato de cálcio; ácido esteárico; óleos vegetais tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de gergelim, óleo de oliva e óleo de milho; tensoati-vos não iônicos, catiônicos e aniônicos; polímeros de etileno glicol; betaci-clodextrina; álcoois graxos; e sólidos de cereal hidrolizado, assim como outros enchedores, aglutinantes, desintegrantes, tampões, conservantes, anti-oxidantes, lubrificantes, agentes flavorizantes compatíveis não tóxicos, e semelhantes comumente usados em formulações farmacêuticas.
Preparações farmacêuticas para a administração enteral e parenteral são, por exemplo, aquelas em formas unitárias de dosagem, tais como drágeas, comprimidos ou cápsulas e também ampolas. Elas são preparadas em uma maneira conhecida per si, por exemplo por meio de processos de mistura, granulação, confecção, dissolução ou liofilização convencionais. Por exemplo, preparações farmacêuticas para a administração oral podem ser obtidas combinando-se o ingrediente ativo com veículos sólidos, onde a granulação apropriada de uma mistura resultante, e processamento da mistura ou granulado, se desejado ou necessário depois da adi-ção de adjuntos adequados, em comprimidos ou núcleos de drágea.
Outras preparações farmacêuticas oralmente administráveis são cápsulas enchidas a seco fabricadas de gelatina, e também cápsulas moles, seladas fabricadas de gelatina e um plasticizador, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas enchidas a seco podem conter o ingrediente ativo na forma de um granulado, por exemplo em mistura com enchedores, tais como Iac-tose, aglutinantes, tais como amidos, e/ou deslizantes, tais como talco ou estearato de magnésio, e, onde apropriado, estabilizadores. Em cápsulas moles o ingrediente ativo é preferivelmente dissolvido ou colocado em suspensão em líquidos adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos, sendo possível também que estabilizadores sejam adicionados.
Formulações parenterais são especialmente fluido injetáveis que são eficazes em várias maneiras, tais como intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, intradérmica ou subcutaneamente. Tais fluidos são soluções ou suspensões aquosas preferivelmente isotônicas que podem ser preparadas antes do uso, por exemplo a partir de preparações Iiofilizadas que contêm o ingrediente ativo sozinho ou juntamente com um veículo far-maceuticamente aceitável. As preparações farmacêuticas podem ser esterIizadas e/ou contêm adjuntos, por exemplo conservantes, estabilizadores, agentes umectantes e/ou emulsificadores, solubilizadores, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões.
Formulações adequadas para a aplicação transdérmica incluem uma quantidade eficaz de um composto da invenção com veículo. Veículos vantajosos incluem solventes farmacologicamente aceitáveis absorvíveis para auxiliar a passagem através da pele do hospedeiro. Por exemplo, dispositivos transdérmicos estão na forma de uma bandagem compreendendo um membro de reforço, um reservatório contendo o composto opcionalmente com veículos, opcionalmente uma barreira controladora de taxa para Iiberar o composto da pele do hospedeiro em uma taxa controlada e predeterminada durante um período prolongado de tempo, e meios para firmar o dispositivo à pele.Formulações adequadas para a aplicação tópica, por exemplo, à pele e olhos, incluem soluções aquosas, suspensões, ungüentos, cremes, géis ou formulações pulverizáveis, por exemplo, para a liberação por aerossol ou semelhantes.
Por exemplo, as preparações farmacêuticas consistem em cerca de 0,1 a 90 %, preferivelmente em cerca de 1 % a cerca de 80 %, dos compostos ativos. Preparações farmacêuticas para a administração enteral ou parenteral estão, por exemplo, em formas de dose unitária, tais como comprimidos revestidos, comprimidos, cápsulas ou supositórios e também ampolas. Estas são preparadas em uma maneira que é conhecida por si, por exemplo usando processos de mistura, granulação, revestimento, solubuli-zação ou liofilização convencionais. Assim, preparações farmacêuticas para o uso oral podem ser obtidas combinando-se os compostos ativos com ex-cipientes sólidos, se desejado granulando-se uma mistura que foi obtida, e, se desejado ou necessário, processando a mistura ou granulado em comprimidos ou núcleos de comprimido revestido depois de ter adicionado substâncias auxiliares adequadas. A dosagem do composto ativo pode depender de uma variedade de fatores, tais como modo de administração, espécies homeotérmicas, idade e/ou condição individual.
Dosagens preferidas para os ingredientes ativos da combinação farmacêutica de acordo com a presente invenção são dosagens terapeuti-camente eficazes, especialmente aquelas que são comercialmente disponíveis.
Fluvastatina é fornecida na forma de forma unitária de dosagem adequada, por exemplo, uma cápsula ou comprimido, e compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, de cerca de 20 mg a cerca de 80 mg, que pode ser aplicada aos pacientes. A aplicação do ingrediente ativo pode ocorrer até três vezes por dia, partindo, por exemplo, com uma dose diária de 20 mg ou 40 mg por dia, aumentando por intermédio de 40 mg diariamente e ainda para 80 mg diariamente. Preferivelmente, a fluvastatina é aplicada uma vez por dia ou duas vezes por dia em pacientes com uma dose de 80 mg ou doses de 40 miligrama tomadas 2 vezes por dia, respectivamente, cada. Doses correspondentes podem ser tomadas,por exemplo, de manhã, ao meio-dia ou à noite.
Dosagens diárias para a fluvastatina, naturalmente, variarão dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo o composto escolhido, a condição particular a ser tratada e o efeito desejado. Em geral, entretanto, resultados satisfatórios são obtidos na administração de fluvastatina em taxas de dosagem diária da ordem de 20 a 80 mg/kg por dia. Uma faixa de dosagem diária preferida é em torno de 20 a 40 mg por dia como uma única dose ou em doses divididas. Fluvastatina, pode ser administrada por qualquer via convencional, em particular enteralmente, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos, cápsulas, soluções para beber ou parenteralmente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis. Formas de dosagem unitária adequadas para a administração oral compreendem de cerca de 20 mg de ingrediente ativo, usualmente 40 mg, por exemplo, de fluvastatina, juntamente com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis destes.
Dosagens diárias para o inibidor de mTOR, naturalmente, variarão dependendo de uma variedade de fatores, por exemplo o composto escolhido, a condição particular a ser tratada e o efeito desejado. Em geral, entretanto, resultados satisfatórios são obtidos na administração do inibidor de mTOR em taxas de dosagem diária da ordem de cerca de 0,01 a 5 mg/kg por dia, particularmente 0,5 a 5 mg/kg por dia, como uma única dose ou em doses divididas. Uma faixa de dosagem diária preferida é em torno de 0,1 a 30 mg como uma única dose ou em doses divididas. O inibidor de mTOR, por exemplo, Composto A, pode ser administrado por qualquer via convencional, em particular enteralmente, por exemplo, oralmente, por exemplo, na forma de comprimidos, cápsulas, soluções para beber ou parenteralmente, por exemplo, na forma de soluções ou suspensões injetáveis. Formas de dosagem unitária adequadas para a administração oral compreendem de cerca de 0,05 a 15 mg de ingrediente ativo, usualmente 0,25 a 10 mg, por exemplo, de Composto A, juntamente com um ou mais diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis destes.
Rapamicina ou derivados desta são bem tolerados em dosagensnecessárias para o uso de acordo com a presente invenção. Por exemplo, o NTEL para o Composto A em um estudo de toxicidade de 4 semanas é de 0,5 mg/kg/dia em ratos e 1,5 mg/kg/dia em macacos.
A pessoa versada na técnica pertinente é completamente capacitada para selecionar um modelo de teste relevante para provar a eficácia de uma combinação da presente invenção nas indicações terapêuticas indicadas mais acima e em seguida.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção descrita acima; entretanto, não é intencionado restringir o escopo desta invenção de nenhum modo.
Exemplos
A) Exemplos de formulação de fluvastatina Tabela 1 Composição de um comprimido revestido com película de 80 mg Lescol XL
<table>table see original document page 37</column></row><table>Tabela 2 Composição de uma cápsula de 20 mg de Iescol
<table>table see original document page 38</column></row><table>
Exemplos de formulação de Pitavastatina (Exemplos 1 a 7)
Exemplo 1
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo):4,18 mg (5,225 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 42,82 mg (53,525 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 25 mg (31,25 % em peso) de HPMC(100 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol.
Exemplo 2
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo): 8,36 mg (10,45 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 38,64 mg (48,3 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 25 mg (31,25 % em peso) de HPMC (100 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso dorevestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol.
Exemplo 3
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo): 16,72 mg (20,9 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 30,28 mg (37,85 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 25 mg (31,25 % em peso) de HPMC(100 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol.
Exemplo 4
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo):3,135 mg (3,92 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 43,865 mg (54,83 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 12,50 mg (15,625 % em peso) de HPMC (100 cps), 12,50 mg (15,625 %) de HPMC (100 000 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol.
Exemplo 5
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo): 6,27 mg (7,84 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 40,73 mg (50,91 % em peso) de celulose microcristalina, 4mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 16,64 mg (20,8 % em peso) de HPMC (100 cps), 8,36 mg (10,45 %) de HPMC (100 000 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol. Exemplo 6
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo): 12,54 mg (15,675 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 34,46 mg (43,075 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 18,75 mg (23,4375 % em peso) de HPMC (100 cps), 6,25 mg (7,8125 % em peso) de HPMC (100 000 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magnésio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol.
Exemplo 7
Núcleo (porcentagem relacionada ao peso do núcleo): 16,72 mg(20,9 % em peso) de substância medicamentosa, por exemplo sais de Ca de pitavastatina, 30,28 mg (37,85 % em peso) de celulose microcristalina, 4 mg (5 % em peso) de HPMC (3 cps), 20 mg (25 % em peso) de HPMC (100 cps), 5 mg (6,25 % em peso) de HPMC (100 000 cps), 3,2 mg (4 % em peso) de Neusilin, a fase externa compreendendo 0,4 mg (0,5 % em peso) de dióxido de silício coloidal e 0,4 mg (0,5 % em peso) de estearato de magné-sio.
Subrevestimento de HPMC (revestimento não funcional) (porcentagem relacionada ao peso do subrevestimento): 2,856 mg (71,4 % em peso) de Hidroxipropilmetilcelulose 3 cps, 0,286 mg (7,15 % em peso) de polietilenoglicol, 0,286 mg (7,15 % em peso) de talco e 0,572 mg (14,3 % em peso) de dióxido de titânio.
Revestimento entérico (porcentagem relacionada ao peso do revestimento entérico): 5 mg (83,34 % em peso) de Eudragit L30D, 0,5 mg (8,33 % em peso) de talco e 0,5 mg (8,33 % em peso) de polietilenoglicol

Claims (15)

1. Combinação farmacêutica compreendendo um inibidor de HMG-Co-A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável destes e um agente de inibição de mTOR.
2. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de HMG-Co-A redutase é fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
3. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de HMG-Co-A redutase é pitavastatina ou um sal farma-ceuticamente aceitável do mesmo.
4. Combinação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o agente de inibição de mTOR é selecionado de rapamicina ou um derivado de rapamicina selecionado do grupo de: 32-desoxorrapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32-desoxorrapamicina, 16-pent-2-ini-lóxi-32(S ou R)-diidro-rapamicina, 16-pent-2-inilóxi-32(S ou R)-diidro-40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 40-[3-hidróxi-2-(hidroximetil)-2-metilpropanoato]-rapa-micina (também chamado CCI779), 40-epi-(tetrazolil)-rapamicina (também chamado ABT578), 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina, 32-desoxorrapamicina e 16-pent-2-inilóxi-32(S)-diidro-rapamicina, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
5. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo pitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo e 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
6. Combinação farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste e 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina para o uso simultâneo, seqüencial ou separado.
7. Combinação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovas-cular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD)1 rejeição a enxerto crônica, Restenose a seguir de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados com tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus erite-matoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedi-camentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
8. Uso de uma combinação farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6 para a preparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dis-Iipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Res-tenose a seguir de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados com tal crescimento tumoral, rejeição a xenotransplante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reabsorção óssea.
9. Kit compreendendo em recipientes separados em um único pacote composições farmacêuticas compreendendo em um recipiente uma composição farmacêutica compreendendo pitavastatina, e em um segundo recipiente uma composição farmacêutica compreendendo um agente deinibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina.
10. Kit compreendendo em recipientes separados em um único pacote composições farmacêuticas compreendendo em um recipiente uma composição farmacêutica compreendendo fluvastatina, e em um segundo recipiente uma composição farmacêutica compreendendo um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina.
11. Kit de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 ou 10 em que o agente de inibição de mTOR é 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina.
12. Pacote compreendendo empacotar um inibidor de HMG-Co- A redutase, especialmente fluvastatina ou pitavastatina juntamente com instruções para o uso em combinação com um agente de inibição de mTOR, por exemplo, rapamicina ou um derivado de rapamicina para o tratamento ou prevenção de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hiper- colesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascular, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR tais como transplante, artrite reumatóide, Doença In-flamatória Intestinal (IBD), rejeição a enxerto crônica, Restenose a seguir de angioplastia, tumores sólidos, especialmente invasividade de tumor sólido ou sintomas associados com tal crescimento tumoral, rejeição a xenotrans-plante, doença do enxerto versus hospedeiro (GvH), doenças auto-imunes e condições inflamatórias (lúpus eritematoso sistêmico (SLE), diabetes tipo I etc.), asma, resistência multimedicamentosa, distúrbios proliferativos (tumores, distúrbios de pele hiperproliferativos, por exemplo, psoríase), uveíte, ceratoconjuntivite seca, infecções fúngicas, angiogênese e inibição da reab-sorção óssea.
13. Pacote de acordo com a reivindicação 12, compreendendo fluvastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo juntamente com instruções para o uso em combinação com o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina.
14. Pacote de acordo com a reivindicação 9, compreendendopitavastatina ou um sal farmaceuticamente aceitável deste juntamente com instruções para o uso em combinação com o agente de inibição de mTOR 40-0-(2-hidroxietil)-rapamicina.
15. Método de prevenção ou tratamento de condições ou doenças relacionadas aos inibidores de HMG-Co-A redutase tais como condições ou doenças relacionadas à hipercolesterolemia, condições ou doenças relacionadas à dislipidemia mista, prevenção secundária de evento cardiovascu-lar, condições ou doenças relacionadas à aterosclerose e condições ou doenças relacionadas ao agente de inibição de mTOR compreendendo a administração de uma combinação de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, e opcionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável a um mamífero em necessidade do mesmo.
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