BRPI0611049A2 - utilização de tfpi para tratar infecções bacterianas severas - Google Patents

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BRPI0611049A2
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Stephen F Hardy
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Novartis Ag
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Abstract

Métodos para tratar profilaticamente ou terapeuticamente um paciente em risco de desenvolver ou diagnosticado como possuindo uma infecção bacteriana severa envolvendo administração de inibidor da via do fator tecidual (TFPI) ou um análogo de TFPT a pacientes sofrendo de ou em risco de desenvolver esta condição. Os métodos envolvem a utilização de infusão intravenosa contínua de TFPI ou de um análogo de TFPI em baixas doses para evitar efeitos colaterais adversos.

Description

UTILIZAÇÃO DE TFPI PARA TRATAR INFECÇÕES BACTERIANASSEVERAS
FUNDAMENTO DA INVENÇÃO
Infecções bacterianas severas podem causar umavariedade de complicações, incluindo septicemia ameaçando avida. Há uma necessidade continua na arte por métodoseficazes para tratar infecções bacterianas severas e/oureduzindo o risco de mortalidade a partir das infecçõesbacterianas severas.
RESUMO DA INVENÇÃO
Uma modalidade da presente invenção é um método detratar um paciente em risco de desenvolver ou diagnosticadocomo possuindo uma infecção bacteriana severa,compreendendo administração de TFPI ou análogo de TFPI paraum paciente em necessidade deste. Em algumas modalidades, ainfecção bacteriana severa causa pneumonia, bacteremia,infecção profunda de tecido, infecção de pele, infecçãosuave de tecido, infecção periodontal, peritonite, infecçãocirúrgica ou meningite. Em modalidades adicionais, apneumonia é uma pneumonia adquirida na comunidade oupneumonia adquirida em hospital e pode ser causada por S.pneumoniae.
Outra modalidade é um método de reduzir o risco demortalidade a partir de uma infecção bacteriana severa,compreendendo administração de uma composição farmacêuticacompreendendo TFPI ou um análogo de TFPI para um pacienteem necessidade deste. Em algumas modalidades, a infecçãobacteriana severa causa pneumonia, bacteremia, infecçãoprofunda de tecido, infecção de pele, infecção suave detecido, infecção periodontal, peritonite, infecçãocirúrgica ou meningite. Em modalidades adicionais, apneumonia é uma pneumonia adquirida na comunidade oupneumonia adquirida em hospital e pode ser causada por S.pneumoniae.
Outras modalidades incluem quaisquer das modalidadesacima onde referido paciente encaixa em qualquer doscritérios seguintes: um nível de IL-6 no sangue abaixo de3.200 pg/mL; uma Taxa Internacional Normalizada (INR)abaixo de 2.5, uma pontuação de fisiologia aguda (APS)menor do que 26, uma pontuação de Avaliação de FisiologiaAguda e Saúde Crônica (APACHE II) menor do que 38 e umapontuação de MODS maior do que 18.
Outras modalidades incluem quaisquer das modalidadesacima onde dado TFPI ou análogo de TFPI é não glicosilado.
Outras modalidades incluem as modalidades acima onde menosde aproximadamente 12% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI são espécies modificadas, onde as espécies modificadasincluem uma ou mais do seguinte: uma molécula TFPI ouanáloga de TFPI, como detectado por cromatografia de fasereversa, uma molécula TFPI ou análoga de TFPI carbamilada,como detectado por cromatografia de troca de cátion, umamolécula TFPI ou análoga de TFPI desamidada, como detectadapor um kit ISOQUANT® da Promega, uma molécula TFPI ouanáloga de TFPI que compreende um aduto de cisteína, comodeterminado por análises de aminoácido, moléculas TFPI ouanálogas de TFPI agregadas, como detectado porcromatografia de exclusão por tamanho e uma molécula TFPIou análoga de TFPI desdobrada, como detectado por gel deeletroforese SDS-poliacrilamida não desnaturante.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 9% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI estão oxidadas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 3% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI estão carbamiladas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 9% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI estão desamidadas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 2% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI compreendem um aduto de cisteína.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 3% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI estão agregadas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde menos doque aproximadamente 3% das moléculas TFPI ou análogas deTFPI estão desdobradas.
Outras modalidades incluem aquelas onde TFPI ouanálogo de TFPI é preparado a partir de uma composiçãoliofilizada compreendendo TFPI ou análogo de TFPI. Outrasmodalidades incluem aquelas descritas acima onde TFPI ouanálogo de TFPI é administrado como uma formulaçãocompreendendo arginina. Outras modalidades incluem aquelasdescritas acima onde TFPI ou análogo de TFPI é administradocomo uma formulação compreendendo citrato.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde acomposição farmacêutica compreende 0,01 a 1,0 mg/mL de TFPIou análogo de TFPI. Outras modalidades incluem aquelasacima onde a composição farmacêutica compreende 150 - 450mM L-arginina. Outras modalidades incluem aquelas acimaonde a composição farmacêutica compreende 0,1 - 50 mM L-metionina. Outras modalidades incluem aquelas acima onde acomposição farmacêutica compreende 5-50 mM de tampãocitrato de sódio. Outras modalidades incluem aquelas acimaonde a composição farmacêutica possui um pH de 5,0 - 6,0.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,15 ± 15% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 15% de mM L-arginina, 5 ± 15% de mM L-metionina e 20± 15% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 15%.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,15 ± 10% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 10% de mM L-arginina, 5 ± 10% de mM L-metionina e 20± 10% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 10%.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,15 ± 5% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 5% de mM L-arginina, 5 ± 5% de mM L-metionina e 20 ±5% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 5%.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,45 ± 15% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 15% de mM L-arginina, 5 ± 15% de mM L-metionina e 20± 15% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 í 15%.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,45 ± 10% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 10% de mM L-arginina, 5 ± 10% de mM L-metionina e 20± 10% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 10%.Outras modalidades incluem aquelas acima onde o métodocompreende utilização de um formulação farmacêuticacompreendendo 0,4 5 ± 5% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI,300 ± 5% de mM L-arginina, 5 ± 5% de mM L-metionina e 20 ±5% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 5%.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o TFPIou análogo de TFPI é administrado por infusão intravenosacontínua a uma taxa de dose equivalente a administração deala-TFPI de referência a uma taxa de dose de menos de 0,66mg/kg/h.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde a taxade dose é equivalente a administração de ala-TFPI dereferência a uma taxa de dose de aproximadamente 0,00025 aaproximadamente 0,1 mg/kg/h e onde o TFPI ou análogo deTFPI é administrado por, pelo menos, 72 horas. Outrasmodalidades incluem aquelas acima onde a taxa de dose éequivalente a administração de ala-TFPI de referência a umataxa de dose de aproximadamente 0,010 a aproximadamente 0,1mg/kg/h. outras modalidades incluem aquelas acima onde oTFPI ou análogo de TFPI é administrado por, pelo menos, 96horas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o TFPIou análogo de TFPI é administrado por infusão intravenosacontínua para promover uma dose total equivalente aadministração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dosede aproximadamente 0,024 a aproximadamente 4,8 mg/kg.Outras modalidades incluem aquelas acima onde o TFPI ouanálogo de TFPI é administrado por infusão intravenosacontínua a uma taxa de dose equivalente a administração deala-TFPI de referência a uma taxa de dose entreaproximadamente 0,02 a aproximadamente 1 mg/kg/h. outrasmodalidades incluem aquelas acima onde o TFPI ou análogo deTFPI é administrado por infusão venosa contínua parafornecer uma dose diária equivalente a administração deala-TFPI de referência a uma dose diária de aproximadamente0,006 mg/kg a aproximadamente 1,2 mg/kg.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde o TFPIou análogo de TFPI é administrado por infusão por umperíodo de 10-200 horas, 10-150 horas ou 24-96 horas.
Outras modalidades incluem aquelas acima onde opaciente não recebeu tratamento com heparina por, pelomenos, 8 horas antes da administração do TFPI ou análogo deTFPI.
Outras modalidades incluem aquelas acimaadicionalmente compreendendo trato do paciente com proteínaC ativada.
Outras modalidades incluem aquelas onde o análogo deTFPI é um ala-TFPI.
DESCRIÇÃO DETALHADA
TFPI é um poderoso anticoagulante imaginado como
possuindo atividade antiinflamatória. Veja EP 0 643 585.TFPI pode ser utilizado para inibir angiogênese associadacom, por exemplo, tumores. Veja EP 0 914 83 0. Nósencontramos que TFPI também possui atividade anti-bacteriana através de seu controle de citocinasinflamatórias as quais controlam o sistema imune inato. Nóstambém encontramos que TFPI parece ser degradado como umresultado de infecção bacteriana severa e depleção de TFPIdurante uma infecção corrente comprometendo este sistema.
Desta maneira, enquanto TFPI tem uma função vital emcombater infecção, TFPI endógeno é alterado durante umainfecção severa, a qual depleta função terapêutica de TFPI.
Diversos fatores predizem mortalidade em grupos depacientes sépticos. Estes incluem o sistema de pontuaçãoAvaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (APACHE II)(Knaus et al. , Crit Care Med. 1985; 13:818-29), pontuaçãode fisiologia aguda (APS), Taxa Internacional Normalizada(INR) (R.S. Riley et al., J. Clin. Lab. Anal. 14:101-114,2000) e concentração de IL-6 no plasma. Em uma população depacientes com pneumonia adquirida na comunidade (CAP), nóspreviamente observamos que TFPI foi eficiente em reduzirmortalidade. A redução do risco relativo é determinada como(100 χ a redução do risco absoluto)/taxa de mortalidade doplacebo. Quando nós dividimos os pacientes CAP pelaseveridade utilizando pontuações APACHE II (Figura 20) ,pontuações de fisiologia aguda, INR, (Figura 22) ou níveisde IL-6 no plasma, (Figura 21) nós encontramos que obenefício do tratamento com TFPI incluía pacientes com asmenores taxas de mortalidade no placebo. Por exemplo, nosubgrupo CAP dividido pelas pontuações APACHE II, houve umadiminuição de 5% no risco de mortalidade na pontuação 16 doAPACHE II, o que significa uma redução de 32% na redução dorisco relativo. Figura 2 0 demonstra riscos de mortalidadereduzidos em pacientes com pontuações APACHE II médias de36 ou abaixo. Concentrações basais de TFPI séricas predizemtanto mortalidade como eficácia.
Pacientes em um subestudo com níveis de INR abaixo de1,2 possuem um risco de mortalidade mais baixo do queaqueles no estudo primário de alto INR (18% vs. 34% global)e ala-TFPI foi efetivo no subestudo com níveis de INRabaixo de 1,2 (FIG. 25). No subgrupo CAP de pacientes comníveis de INR abaixo de uma média de 2,1 beneficiados apartir de ala-TFPI (FIG. 21). Isto também é verdadeiro parapacientes tratados com ala-TFPI sem tratamento comheparina.
FIG. 2 0 mostra as correlações esperadas entre APACHEII e mortalidade nos grupos de pneumonia global e adquiridana comunidade (CAP) e placebo (FIG. 20). Quando CAP cortouem quartis de APACHE II, nós observamos que houve eficáciaem todos os quartis de APACHE II. Similarmente, APS, INR eIL-6 foram todos positivamente correlacionados commortalidade. Em cada caso, ala-TFPI melhorou sobrevivêncianos grupos de risco mais baixo como medido por estesparâmetros (FIGS. 21, 22, 23). TFPI possuiu eficácia nospacientes que possuíam culturas bacterianas positivas apartir de se sangue (FIG. 24) . Novamente TFPI foiamplamente ativo nos primeiros 3 quartis quando ospacientes foram segregados por pontuações APACHE.
Desta maneira, tratamento com TFPI exógeno tevebenefício terapêutico para pacientes os quais estavam emrisco de desenvolver ou diagnosticados como possuindo umainfecção bacteriana severa e é útil para diminuir o riscode mortalidade a partir de tais infecções. Infecçõesbacterianas severas são aquelas infecções que geralmenterequerem cuidados médicos agudos, especialmentehospitalização. Infecções bacterianas severas geralmentenecessitam tratamento antiinfectivo e cuidado médico desuporte ou intervenção médica ativa. Infecções bacterianasseveras comuns incluem, mas não se limitam a, pneumonia(incluindo pneumonia adquirida no hospital e pneumoniaadquirida na comunidade), bacteremia, infecção de tecidoprofundo, infecção de pele, infecção de tecido branda,infecção periodontal, peritonite, infecção cirúrgica emeningite.
Pacientes os quais podem ser tratados de acordo com ainvenção se encaixam em um ou mais dos seguintes critérios:(a) um nivel de IL-6 no sangue abaixo de 3.200 pg/mL (porexemplo, níveis de IL-6 no sangue abaixo de 3.000, 2.500,2.000, 1.500, 1.000, 500, 250, 100 ou 10); (b) uma TaxaInternacional Normalizada (INR) abaixo de 2,5 (por exemplo,uma INR abaixo de 2,4; 2,3; 2,1; 1,9; 1,8; 1,7; 1,6; 1,5;1,4; 1,3; 1,2 ou 1,1); (c) uma pontuação de fisiologiaaguda (APS) menor do que 26 (por exemplo, uma pontuação APSmenor do que 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17 ou 16 ouentre 16-19 ou entre 20-23); (d) uma pontuação de Avaliaçãode Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (APACHE II) menor doque 38 (por exemplo, pontuação APACHE II menor do que 37,36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22,21, 20, 19, 18, 17 ou 16) e (e) uma pontuação de DisfunçãoMúltipla dos Órgãos (MODS) maior do que 18 (por exemplo,pontuação MODS maior do que 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 ou1entre 20-21 ou entre 22-23).
Em uma modalidade, o paciente possui um nível de IL-6no sangue abaixo de 3.2 00 pg/mL. Em outra modalidade, opaciente possui uma Taxa Internacional Normalizada (INR)abaixo de 2.5. Ainda em outra modalidade, o paciente possuiuma pontuação fisiologia aguda (APS) menor do que 26. Emainda outra modalidade, o paciente possui uma pontuação deAvaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (APACHE II)menor do que 38. Ainda em outra modalidade, o pacientepossui uma pontuação MODS maior do que 18.
TFPI e Análogos de TFPI
TFPI foi inicialmente isolado como um anticoagulantede ocorrência natural. A proteína possui diversos domíniosprincipais (FIG. 1) : três domínios inibidores de serinaprotease do tipo Kunitz (Kl, K2 e K3) , um domínio N-terminal e um domínio C-terminal (CTD) . 0 domínio Kl inibeo fator de coagulação VIIa - complexo de fator de tecido(TF) . 0 domínio K2 inibe fator Xa. Desta maneira, aindanenhuma serina protease foi associada com K3, entretanto,experimentos recentes sugerem que K3 funciona na ligação deTFPI a um receptor ancorado a GPI em superfícies celulares.Piro & Broze, Circulation. 2004 Dec 7;110 (23) :3567-72. 0CTD também está envolvido na associação celular, ligação aheparina e inibição ótima de Xa.
TFPI é naturalmente produzido em múltiplos tiposcelulares no sangue e em outros tecidos. Acredita-se que amaioria do TFPI é feita em células endoteliais formando osvasos sangüíneos. Uma fração de TFPI é encontrada nosangue. A maioria deste TFPI do plasma está covalentementemodificado por troca de dissulfeto com outras proteínas doplasma ou clivagem removendo o CTD. Estas formas de TFPIpossuem menos atividade em ensaios bioquímicos e não seligam eficientemente a células sugerindo que TFPI do plasmaé inativo. De acordo com estes estudos estes mostraram quea meia vida do TFPI do plasma é muito curta e que este éeficientemente removido pelo fígado.
As diversas formas de TFPI associadas a célula são asproteínas monoméricas completas associadas com atividademáxima in vitro. Em células endoteliais há uma pequenafração de TFPI que pode ser removida por tratamento comheparina. Outro agrupamento parece situar-se em vesículasabaixo da superfície apical e é liberada quando as célulassão eliminadas com trombina. A maioria do TFPI dasuperfície celular é encontrada em caveolae, uma organelaassociada com sinalização em outros sistemas. Lupu et al.,JBC Paper in Press, publicado em 6 de abril, 2 005 comoManuscrito M503333200. O TFPI em caveolae parece ser o TFPIque une TF em células endoteliais. Quando uma célulaendotelial é exposta à bactéria, esta induz TF geralmentesobre sua superfície. O TF se liga a VIIa gerando Xa.TF:VIIa rapidamente realoca para caveolae onde este se ligaa TFPI. Em células endoteliais normais hã um excesso deTFPI, garantindo que células endoteliais expressando TF nãoinduzam níveis patológicos de enzimas de coagulação.Curiosamente, uma vez translocado TF para caveolae este setorna estável, sugerindo que este possui uma função aexercer após ser neutralizado por TFPI.
"TFPI" como utilizado aqui, refere-se à glicoproteínamadura do soro possuindo 276 resíduos de aminoácido naseqüência mostrada na SEQ ID NO: 1 e um peso molecular deaproximadamente 3 8.000 Daltons. Veja Patente E.U.A. No.5,106,833. A clonagem do cDNA de TFPI está descrita em Wunet al., Patente E.U.A. No. 7,966,852. TFPI utilizado nainvenção pode ser não glicosilado ou glicosilado.
Um "análogo de TFPI" é um derivado de TFPI modificadocom adição ou substituição de um ou mais aminoácidos(geralmente conservativa na natureza e preferencialmente emdomínios não-Kunitz ou na porção C terminal da proteína),ou uma ou mais deleções nos aminoácidos (por exemplo,fragmentos de TFPI) , ou a adição de uma ou mais porçõesquímicas a um ou mais aminoácidos, desde que asmodificações não destruam a atividade biológica de TFPI.Preferencialmente, análogos de TFPI compreendem todos ostrês domínios Kunitz. TFPI e análogos de TFPI podem sertanto glicosilados como não-glicosilados.
Um análogo TFPI preferido é um N-L-alanil-TFPI (ala-TFPI), cuja seqüência de aminoácido está mostrada na SEQ IDNO: 2. Ala-TFPI é também conhecido sob o nome internacionalda droga "tifacogina". 0 resíduo de amino terminal alaninade ala-TFPI foi engenheirado na seqüência do TFPI paramelhorar a expressão em E.coli e para afetar a clivagem daqual poderia ser um resíduo amino terminal de metionina.Veja Patente E.U.A. 5,212,091. Outros análogos de TFPIestão descritos na Patente E.U.A. 5,106,833. Análogos deTFPI possuem alguma medida de atividade de TFPI comodeterminado por um ensaio de bioatividade como descritoabaixo. Um ensaio de bioatividade preferido para TFPI eanálogos é o ensaio de tempo da protrombina (PT) (vejaabaixo).
Análogos TFPI possuem substituições de aminoácido asquais são conservativas em natureza, ou seja, substituiçõesas quais tomam lugar dentro de uma família de amioácidos osquais estão relacionados em suas cadeias laterais.Especificamente, aminoácidos são geralmente divididos emquatro famílias: (1) ácidos - aspartato e glutamato; (2)básicos - lisina, arginina, histidina; (3) não polares -alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina,fenilalanina, metionina, triptofano e (4) polares nãocarregados - glicina, asparagina, glutamina, cisteína,serina, treonina e tirosina. Fenilalanina, triptofano etirosina são algumas vezes classificados como aminoácidosaromáticos. Por exemplo, é razoavelmente previsível que umatroca isolada de leucina por isoleucina ou valina, de umaspartato por um glutamato, de uma treonina por uma serinaou uma troca conservativa similar de um aminoácido por umaminoácido estruturalmente relacionado não produza umefeito maior na atividade biológica. Por exemplo, opolipeptídeo de interesse pode incluir mais deaproximadamente 1-15 substituições de aminoácidoconservativas ou não conservativas (por exemplo, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15), desde que afunção desejada da molécula permaneça intacta. Formaspreferidas de TFPI incluem análogos de TFPI onde osdomínios Kunitz 1, Kunitz 2 ou Kunitz 2 correspondemexatamente aos domínios de TFPI Kunitz nativos de humanose, mais preferencialmente, onde cada domínio Kunitzcorresponde exatamente a cada do domínio TFPI Kunitznativos de humano.
Preferencialmente, análogos TFPI possuem seqüências deaminoácidos as quais são, pelo menos, ou 95% ou maisidênticas ao TFPI como mostrado na SEQ ID NO: 1. Maispreferencialmente, as moléculas são 96%, 97%, 98% ou 99%idênticas.
A atividade biológica de TFPI ou de análogos de TFPIpode ser determinada pelo ensaio de protrombina. Ensaios deprotrombina apropriados estão descritos na Patente E.U.A.5,888,968 e na WO 96/40784. Resumidamente, tempo deprotrombina pode ser determinado utilizando um coagulômetro(por exemplo, Coag-A-Mate MTX II da Organon Teknika) . Umtampão de ensaio apropriado é 100 mM de NaCl, 50 mM de Trisajustado para pH 7,5, contendo 1 mg/mL de albumina séricabovina. Reagentes adicionais requeridos são plasma humanonormal (por exemplo, "Verify 1" da Organon Teknika),reagente tromboplastina (por exemplo, "Simplastina Excel"da Organon Teknika) e solução padrão de TFPI (por exemplo,20 pg de ala-TFPI 100% pura (ou equivalente desta) por mLdo tampão do ensaio). Uma curva padrão é obtida analisandoo tempo de coagulação de uma série de diluições da soluçãopadrão de TFPI, por exemplo, a concentrações finaisvariando de 1 a 5 pg/mL.
Para a determinação do tempo de coagulação, a amostraou TFPI padrão é primeiro diluído no tampão do ensaio.Então plasma humano normal é adicionado. A reação decoagulação é iniciada pela adição de reagentetromboplastina. 0 instrumento então grava o tempo decaoagulação. Uma curva linear padrão de TFPI é obtida apartir de plotagem de tempo de caogulação em Iog vs. Iog daconcentração de TFPI. A curva padrão é ajustada baseada napureza do TFPI padrão para corresponder a concentração deTFPI equivalente a um padrão 100% puro. Por exemplo, se opadrão é uma preparação de ala-TFPI que está 97%biologicamente pura (ou seja, esta contém 3% em peso deespécies moleculares sem atividade biológica de TFPI),então a concentração de cada diluição do padrão émultiplicado por 0,97 para resultar na concentração atualde TFPI. Desta maneira, um TFPI padrão é 1,0 pg/mL baseadono peso atual por mL de uma preparação que está 97% puraserá equivalente a, e tratada como, uma concentração de 1,0X 0,97 ou 0,97 pg/mL.Obtendo TFPI e análogos de TFPI
TFPI e análogos de TFPI utilizados nos métodos dainvenção podem ser isolados e purificados a partir detecidos ou células, sintetizados quimicamente ou produzidosrecombinantemente tanto em células eucarióticas comoprocarióticas.
TFPI pode ser isolado por diversos métodos. Porexemplo, células que secretam TFPI incluem célulasendoteliais antigas, células endoteliais jovens que foramtratadas com TNF por aproximadamente 3 a 4 dias,hepatócitos e células de hepatoma. TFPI pode ser purificadopor métodos convencionais, incluindo métodoscromatográficos de Pedersen et al., 1990, J. Biol. Chem.265, 16786-93, Novotny et al. , 1989, J. Biol. Chem. 264,18832-37, Novotony et al., 1991, Blood 78, 394-400, Wun etal., 1990, J. Biol. Chem. 265, 16096-101 e Broze et al. ,1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84, 1886-90. TFPI aparecena corrente sangüínea e pode ser purificado a partir dosangue, veja Pedersen et al., 1990.
Um TFPI ou variante de TFPI pode ser produzidoutilizando métodos químicos para sintetizar sua seqüênciade aminoácidos, tal como por síntese direta de peptídeoutilizando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am.Chem. Soe. 85, 2149-2154, 1963; Roberge et al. , Science269, 202-204, 1995). Síntese de proteína pode ser realizadautilizando técnicas manuais ou por automação. Sínteseautomática pode ser realizada, por exemplo, utilizandoSintetizador de Peptídeo 431A da Applied Biosystems (PerkinElmer). Opcionalmente, fragmentos de TFPI ou variantes deTFPI podem ser sintetizados separadamente e combinadosutilizando métodos químicos para produzir uma moléculacompleta.
TFPI e análogos de TFPI podem ser produzidosrercombinantemente como mostrado na Patente E.U.A. No.4,966,852. Por exemplo, o cDNA da proteína desejada podeser incorporado em um plasmídeo para expressão emprocariotos ou eucariotos. Patente E.U.A. No. 4,847,201fornece detalhes para transformar microorganismos comseqüências específicas de DNA e expressá-las. Existemmuitas outras referências conhecidas daqueles de habilidadeordinária na arte que fornecem detalhes sobre expressão deproteínas utilizando microorganismos. Muitas destas estãocitadas na Patente E.U.A. No. 4,847,201 como Maniatis etal., 1982, Molecular Cloning, Editora Cold Spring Harbor.
Uma variedade de técnicas está disponível paratransformar microorganismos e utilizá-los para expressarTFPI ou análogos de TFPI. As seguintes são meramenteexemplos de abordagens possíveis. Seqüências de DNA TFPIdevem ser isoladas e conectadas as seqüências controleapropriadas. Seqüências de DNA de TFPI estão mostradas na
Patente E.U.A. No. 4,966,852 e podem ser incorporadas em umplasmídeo, tal como pUNC13 ou pBR3822, os quais estãodisponíveis comercialmente a partir de companhias tais comoBoehringer-Mannheim. Uma vez que DNA de TFPI estejainserido no vetor, este pode ser clonado em um hospedeiroapropriado. 0 DNA pode ser amplificado por técnicas taiscomo aquelas mostradas na Patente E.U.A. No. 4,683,202 paraMullis e Patente E.U.A. No. 4,683,195 para Mullis et al.cDNA de TFPI pode ser obtido por células induzidas, taiscomo células de hepatoma (tais como HepG2 e SKHep) parafazer mRNA de TFPI, então identificando e isolando o mRNA etranscrevendo reversamente este para obter cDNA de TFPI.Após o vetor de expressão ser transformado em um hospedeirotal como E. coli, as bactérias podem ser fermentadas e aproteína expressa. Bactérias são microorganismosprocarióticos preferidos e E. coli é especialmentepreferida. Um microorganismo preferido útil na presenteinvenção é E. coli K 12, linhagem MM2 94 depositada com oATCC em 14 de fevereiro de 1984 (Número de acesso 3 9607) ,sob o fornecimento de Budapest Treaty.
É também, claro, possível expressar genes codificandopolipeptídeos em culturas de células eucarióticas derivadasde organismos multicelulares. Veja, por exemplo, TissueCulture, 1973, Cruz e Patterson, Eds., Editora Academic.Linhagens de mamíferos úteis incluem mielomas murinos N51,VERO, células HeLa, células de ovário de hamster chinês(CHO) , COS, C127, Hep G2 e SK Hep. TFPI e análogos de TFPIpodem também ser expressos em células de inseto infectadaspor baculovírus (veja também Patente E.U.A. No. 4,847,201,referida acima). Veja também Pederson et al. , 1990, J. ofBiological Chemistry, 265:16786-16793. Vetores de expressãopara células eucarióticas ordinariamente incluem promotorese seqüências controle compatíveis com células de mamíferotais como, por exemplo, os promotores iniciais e tardioscomumente utilizados do Vírus de Símios 40 (SV40) (Fiers,et al., 1978, Nature, 273:113) ou outros promotores viraistais como aqueles derivados a partir de polioma, Adenovírus2, víruso do papiloma bovino ou vírus de sarcoma aviãrio oupromotores de imunoglobulina e promotores de choquetérmico.Aspectos gerais do sistema de transformações em célulade mamífero hospedeira foram descritos por Axel, PatenteE.U.A. No. 4,399,216. Agora parece também que regiões"acentuadoras" são importantes em otimizar expressão; estassão, geralmente, seqüências encontradas à montante daregião promotora. Origens de replicação podem ser obtidas,se necessário, a partir de fontes virais. Entretanto,integração ao cromossomo é um mecanismo comum parareplicação do DNA em eucariotos. Células vegetais estãotambém agora disponíveis como hospedeiras e seqüênciascontroles compatíveis com células vegetais tais comopromotor da nopalina sintase e seqüências sinais depoliadenilação (Depicker, A., et al. , 1982, J. Mol. Appl.Gen., 1:561) estão disponíveis. Métodos e vetores paratransformação de células vegetais estão divulgados na WO85/04899.
Métodos os quais podem ser utilizados para purificaçãode TFPI e análogos de TFPI expressos em células demamíferos incluem aplicação seqüencial de heparina-Sefarose, MonoQ, MonoS e cromatografia de fase reversaHPLC. Veja Pedersen et al., supra, Novotny et al. , 1989, J.Biol. Chem. 264, 18832-37, Novotny et al., 1991, Blood, 78,394-400, Wun et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 16096-16101;Broze et al. , 1987, PNAS (USA) 84, 1886-1890; PatenteE.U.A. No. 5,106,833 e Patente E.U.A. No. 5,466,783. Estasreferências descrevem diversos métodos para purificação deTFPI produzido por mamífero.
Um método preferido de preparo de moléculas de TFPI oude TFPI análogas está divulgado na WO 05/019265. Estemétodo produz preparações de moléculas de TFPI ou análogasde TFPI nas quais menos de aproximadamente 12, 11, 10, 9,8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5% da preparação consiste de"espécies modificadas". "Espécies modificadas" incluem umaou mais do seguinte: uma molécula de TFPI ou análoga deTFPI oxidada, como detectado por cromatografia de fasereversa; uma molécula de TFPI ou análoga de TFPIcarbamilada, como detectado por cromatografia de troca decátion; uma molécula de TFPI ou análoga de TFPI desamidada,como detectado por um Kit ISOQUANT® da Promega; umamolécula de TFPI ou análoga de TFPI que compreende um adutode cisteína, como determinado por análise de aminoácido;moléculas de TFPI ou análogas de TFPI agregadas, comodetectada por cromatografia de exclusão e uma molécula deTFPI ou análoga de TFPI desdobrada, como detectado por umgel de eletroforese SDS-PAGE não desnaturante. Utilizando ométodo divulgado na WO 05/019265, preparações de moléculasde TFPI ou análogas de TFPI podem ser produzidas nas quaismenos de aproximadamente 9% das moléculas de TFPI ouanálogas de TFPI estão oxidadas, menos de aproximadamente3% das moléculas de TFPI ou análogas de TFPI estãocarbamiladas, menos de aproximadamente 9% das moléculas deTFPI ou análogas de TFPI estão desamidadas, menos deaproximadamente 2% das moléculas de TFPI ou análogas deTFPI compreendem um aduto de cisteína, menos deaproximadamente 3% das moléculas de TFPI ou análogas deTFPI estão agregadas e menos de aproximadamente 3% dasmoléculas de TFPI ou análogas de TFPI estão desdobradas.
TFPI também pode ser expresso como uma proteínaglicosilada recombinante utilizando células de mamíferoscomo hospedeiras, tais como células de camundongo C127 (Dayet al., Blood 76, 1538-45, 1990), células de rim de hamsterneonato (Pedersen et al. , 1990), células de ovário dehamster chinês e células SK de hepatoma humano. TFPI C127foi utilizado em estudos animais e mostraram ser efetivosna inibição de fator de tecido induzido por coagulaçãointravascular (Day et al., supra), na prevenção dareoclusão arterial após trombólise em cães (Haskel et al.,Circulation 84:821-827) ((1991)) e na redução damortalidade em um modelo de septicemia de E. coli embabuínos (Craesey et al., J. Clin. Invest. 91:2850 (1993)).
Ala-TFPI pode ser expresso como uma proteína recombinantenão glicosilada utilizando células hospedeiras de E. coli.
Métodos foram descritos os quais produziram um ala-TFPIaltamente ativo por redobrar in vitro a proteínarecombinante produzida em E. coli. Veja, por exemplo, WO96/40784 .
TFPI e análogos de TFPI podem também ser produzidos embactéria ou levedura e subseqüentemente purificados.Geralmente, os procedimentos mostrados nas Patentes E.U.A.Nos. 5,212,091; 6,063,764 e 6,103,500 ou WO 96/40784 podemser aplicadas. Ala-TFPI e outros análogos de TFPI podem serpurificados, solubilizados e redobrados de acordo com a WO96/40784 e Gustafson et al. , Prot. Express. Pur. 5:233(1994), as quais estão incorporadas aqui por referência.
Por exemplo, quando preparados de acordo com o Exemplo 9 daWO 96/4 0784, preparações de ala-TFPI podem ser obtidas talque contenham de aproximadamente 85% a 90% do total deproteína em peso como ala-TFPI maduro, dobradapropriamente, ativa biologicamente, aproximadamente 10% a15% das quais possuem um ou mais resíduos de metioninaoxidados. Estas formas oxidadas possuem atividade biológicaque é equivalente a atividade biológica de ala-TFPI nãoderivado, como determinado por ensaio de protrombina e sãoesperadas como sendo ativas na invenção divulgada aqui. 0material restante compreende diversas formas modificadas deala-TFPI, incluindo formas dimerizadas, agregadas eacetiladas.
TFPI e análogos de TFPI podem possuir um númerosignificante de resíduos de cisteína e o procedimentomostrado na Patente E.U.A. No. 4,929,700 é relevante pararedobramento de TFPI. TFPI e análogos podem ser purificadosa partir da solução de tampão por diversos métodoscromatográficos, tais como aqueles mencionados acima. Sedesejado, os métodos mostrados na Patente E.U.A. No.4,929,700 podem ser aplicados. Qualquer método pode serempregado para purificar TFPI e análogos de TFPI queresultam em um grau de pureza e um nível de atividadeapropriado para administração em humanos.
Métodos Terapêuticos e Composições
TFPI e análogos de TFPI são úteis para tratarpacientes em risco de desenvolver ou diagnosticados comopossuindo uma infecção bacteriana severa ou para diminuir orisco de mortalidade a partir da infecção bacteriana severapara um ou um grupo de pacientes.
Infecções bacterianas severas incluem, por exemplo,"pneumonia severa" como definida de acordo com asinstruções determinadas pela American Thoracic Society.
Especificamente, pneumonia severa requer um diagnóstico depneumonia e a existência de tanto a) um de dois critériosprincipais, b) dois de três critérios menores ou c) dois dequatro critérios a partir da British Thoracic Society(Thorax 2001; 56 [supl IV]:l-64). Os critérios principaissão necessidade de ventilação mecânica e 2) choque sépticoou necessidade de substância que eleve a pressão arterialpor > 4 horas. Os critérios menores são 1) pressãosangüínea sistólica s 90 mmHg, 2) pneumonia multi-lobar e3) critério de hipoxemia (Pa02/Fi02) < 250. Os critériospara British Thoracic Society são 1) taxa respiratória 2 30respirações/minuto, 2) pressão sangüínea diastólica < 60mmHg, 3) nitrogênio uréia no sangue (BUN) > 7,0 mM (>19,6mg/dL) e 4) confusão. Como é entendido na arte, o critériode hipoxemia (Pa02/Fi02) refere-se a pressão parcial dooxigênio arterial para a fração de oxigênio inspirado eindica o nível de desproporção de troca gasosa.
Muitos pacientes com pneumonia severa possuem umainfecção demonstravelmente por quaisquer meios conhecidasna arte. Estes métodos incluem, mas não se limitam a,detecção de um organismo patogênico em uma cultura desangue ou outro fluido corporal ou tecidual normalmenteestéril por, por exemplo, coloração de GRAM, cultura,coloração histoquímica, ensaio imunoquímico ou ensaios deácido nucléico. Uma infecção demonstrável pode também serevidenciada por uma radiografia peitoral consistente com umdiagnóstico de pneumonia que constitui a razão para terapiasistêmica antiinfectiva, assim como qualquer sintomaclínico de infecção, incluindo, mas não se limitando a, umaumento na taxa respiratória >/= 3O/min ou Pa02/Fi02 < 250,um decréscimo na pressão sangüínea e um aumento natemperatura corporal.
Formulações de TFPI e Análogos de TFPIFormulações de TFPI e análogos de TFPIpreferencialmente são administradas por infusõesintravenosas. Infusão intravenosa essencialmente continua épreferida. Métodos para alcançar esta administração sãoconhecidos daqueles de habilidade ordinária na arte.Infusão pode ser realizada via uma linha central ou linhaperiférica. Enquanto amplas flutuações na taxa de dose sãopara serem evitadas, desvios pequenos a partir das taxas dedose da invenção são aceitáveis dado que o nível de plasmaresultante do TFPI administrado está dentro de 2 0% doesperado a partir de uma infusão contínua em uma taxa dedose constante de acordo com as incorporações preferidas dainvenção.
Antes da administração a pacientes, formulantes podemser adicionados a TFPI e análogos de TFPI. Uma formulaçãolíquida é preferida. TFPI e análogos de TFPI podem serformulados a diferentes concentrações, utilizandoformulantes diferentes e a qualquer pH fisiologicamenteapropriado compatível com a rota de administração,solubilidade e estabilidade da proteína TFPI. Umaformulação preferida para infusão intravenosa inclui ala-TFPI acima de aproximadamente 0,6 mg/mL, hidrocloreto dearginina a acima de 300 mM e tampão citrato de sódio a pH5,0 - 6,0. Certos solutos tais como arginina, NaCl,sacarose e manitol servem para solubilizar e/ou estabilizarala-TFPI. Veja WO 96/40784.
Formulações farmacêuticas podem incluir, por exemplo,0,01 a 1,0 mg/mL, 0,01 a 0,8 mg/mL, 0,01 a 0,5 mg/mL, 0,01a 0,3 mg/mL, 0,01 a 0,2 mg/mL ou 0,01 a 0,1 mg/mL de ala-TFPI; 150-450 mM, 150-400 mM, 150-350 mM ou 150-300 mM deL-arginina; 0,1-50 mM, 0,1-40 mM, 0,1-30 mM, 0,l-25mM, 0,1-15 mM, 0,1-10 mM ou 0,1-5 mM de L-metionina; 5-50 mM, 5-45mM, 5-40 mM, 5-35 mM, 5-30 mM, 5-25 mM ou 5-20 mM de tampãocitrato de sódio. 0 pH da formulação pode variar desde 5,0-6; 5,0-5,8; 5,0-5,7; 5,0-5,6 ou 5,0-5,5. Formulaçõesfarmacêuticas preferidas incluem 0,15 mg/mL (± 15, 10 ou5%) ou 0,45 mg/mL (± 15, 10 ou 5%) de ala-TFPI recombinanteem 300 mM (± 15, 10 ou 5%) de L-arginina, 5 mM (± 15, 10 ou5%) de L-metionina, 20 mM (± 15, 10 ou 5%) de tampãocitrato de sódio, pH 5,5 (± 15, 10 ou 5%) com umaosmolaridade de 560+/-110 mOsm/kg (± 15, 10 ou 5%).
Uma formulação especialmente preferida para infusãointravenosa contém aproximadamente 0,15 mg/mL de ala-TFPI,300 mM de hidrocloreto de arginina e 20 mM de citrato desódio a pH 5,5. TFPI e análogos de TFPI podem serformulados em concentrações acima de aproximadamente 0,15mg/mL em 150 mM de NaCl e 20 mM de fosfato de sódio ououtro tampão a pH 5,5-7,2, opcionalmente com 0,005% ou0,01% (p/v) de polisorbato 80 (Tween 80). Outrasformulações contêm mais do que aproximadamente 0,5 mg/mL deTFPI ou análogo de TFPI em 10 mM de acetato de sódio a pH5,5 contendo tanto 150 mM de NaCl, 8% (p/v) de sacarose ou4,5% (p/v) de manitol. TFPI ou análogos de TFPI podemtambém ser formulados a altas concentrações acima dediversos mg/mL utilizando sal alto. Por exemplo, umaformulação contém mais do que aproximadamente 6,7 mg/mL deala-TFPI em 500 mM de NaCl e 20 mM de fosfato de sódio a pH 7,0.
Exemplos adicionais de formulantes para TFPI eanálogos TFPI incluem óleos, polímeros, vitaminas,carboidratos, aminoácidos, sais, tampões, albumina,surfactantes ou agentes doadores de volume.Preferencialmente, carboidratos incluem açúcar ou açúcar dealcoóis tais como mono-, di- ou polissacarídeos ou glucanassolúveis em água. Os sacarideos ou glucanas podem incluirfrutose, dextrose, lactose, glicose, manose, sorbose,xilose, maltose, sacarose, dextrana, pullulan, dextrina,alfa e beta ciclodextraina, amido solúvel, amidohidroxietil e carboximetilcelulose ou misturas destes.Sacarose é a mais preferida. Açúcar de álcool é definidocomo um hidrocarboneto C4 a C8 possuindo um grupo -OH einclui galactitol, inositol, manitol, xilitol, sorbitol,glicerol e arabitol. Manitol é o mais preferido. Estesaçúcares ou açúcares de álcool mencionados acima podem serutilizados individualmente ou em combinação. Não há umlimite fixo para a quantidade utilizada desde que o açúcarou açúcar de álcool seja solúvel na preparação aquosa.Preferencialmente, a concentração de açúcar ou açúcar deálcool está entre 1,0 p/v e 7,0 p/v %, maispreferencialmente 2,0 e 6,0 p/v %.
Preferencialmente, aminoácidos incluem formaslevógiras (L) de carnitina, arginina e betaina; entretanto,outros aminoácidos podem ser adicionados. É tambémpreferido utilizar um tampão na composição para minimizarmudanças de pH na solução antes da liofilização ou apósreconstituição. Quase qualquer tampão fisiológico pode serutilizado, mas tampões citrato, fosfato, succinato eglutamato ou misturas destes são preferidoas.Preferencialmente, a concentração do tampão é de 0,01 a 0,3molar. Surfactantes que podem ser adicionados à formulaçãoestão mostrados nas EP Nos. 270,799 e 268,110.
Após uma composição farmacêutica líquida de TFPI ouanálogo de TFPI ser preparada, esta pode ser liofilizadapara prevenir degradação e para preservar esterilmente.Métodos para liofilização de composições líquidas sãoconhecidos daqueles de habilidade ordinária na arte.Justamente antes da utilização, a composição pode serreconstituída com um diluente estéril (solução de Ringer,água destilada ou salina estéril, por exemplo) que podeincluir ingredientes adicionais. Após reconstituição, acomposição é preferencialmente administrada a indivíduospor infusão venosa contínua.
Dosagens de TFPI e Análogos de TFPI
TFPI e análogos de TFPI são administrados a umaconcentração que é terapeuticamente efetiva para tratar eprevenir infecção e bacterianas severas, incluindopneumonia severa. Tais doses também são efetivas paraoutras inflamações agudas ou crônicas e geralmente doençasnas quais citocinas regulam positivamente expressão defatores teciduais. Para alcançar esta meta, TFPI e análogosde TFPI preferencialmente são adicionados intravenosamente.Métodos para alcançar esta administração são conhecidosdaqueles de habilidade ordinária na arte. Geralmente, TFPIou análogos de TFPI são preferencialmente dados a uma doseentre 1 mg/kg e 20 mg/kg, mais preferencialmente entre 2mg/kg e 15 mg/kg, mais preferencialmente entre 2 e 10mg/kg.
As dosagens acima são geralmente administradas duranteum período de, pelo menos, aproximadamente 1 dia eusualmente diversos dias, tal como a dose diária totaladministrada a um hospedeiro em uma dose única ou dosesdivididas pode ser em quantidades, por exemplo, deaproximadamente 2 a aproximadamente 15 mg/kg de pesocorporal diariamente e preferencialmente de aproximadamente4 a aproximadamente 10 mg/kg. Composições de unidade dedosagem podem conter tais quantidades ou submúltiplosdestas para formar a dose diária. Quantidades de dosagemdiárias mais baixas podem ser úteis para profilaxia eoutros propósitos, por exemplo, desde 1 pg/kg a 2 mg/kg. Aquantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado comos materiais carreadores para produzir uma forma de dosagemúnica variará dependendo do paciente tratado e do modoparticular de administração.
O regimento da dosagem é selecionado de acordo com avariedade de fatores, incluindo o tipo, idade, peso, sexo,dieta e condição médica do paciente, a severidade dacondição, a rota de administração, consideraçõesfarmacológicas tais como a atividade, eficácia, perfis defarmacocinética e toxicologia, se um sistema dedistribuição de droga é utilizado q se o composto éadministrado como parte de uma combinação de droga. Destamaneira, o regimento de dosagem atualmente empregado podevariar amplamente e, por conseguinte, pode desviar doregime de dosagem preferido determinado acima.Preferencialmente, doses de TFPI ou análogos de TFPI nãodevem exceder uma taxa de dose equivalente a uma taxa dedose de ala-TFPI de aproximadamente 0,66 mg/kg/hr. Emadição a taxa de dose, a duração da infusão de TFPI ou deum análogo de TFPI, a duração da infusão de TFPI ou de umanálogo de TFPI dependerá da severidade clínica de cadapaciente individual e determinação do período apropriadoestá bem dentro da habilidade ordinária da clínica. Infusãopode ser realizada, por exemplo, entre 10-200 horas, 10-150horas, 24-120 horas, 36-100 horas ou 24-96 horas. Um oumais cursos de tratamento, tipicamente dois, podem serrealizados, dependendo do julgamento do médico dotratamento.
Administração da Dose de TFPI
Quando TFPI ou análogo de TFPI é dado em uma taxad edose equivaletne para administração de ala-TFPI a uma taxade dose de, pelo menos, aproximadamente 0,00025 mg/kg/hr(0,00417 pg/kg/hr) e menos que aproximadamente 0,5 mg/kg/hr(8,33 pg/kg/hr), eficácia em tratar infecções bacterianasseveras é retida e efeitos colaterais adversos, tais comohemorragia, são minimizados. Para melhora combinada daeficácia e segurança, a taxa de dose preferencialmente éequivalente a uma taxa de dose de ala-TFPI de, pelo menos,aproximadamente, 0,010 mg/kg/hr (0,167 pg/kg/hr) e menos deaproximadamente 0,1 mg/kg/hr (1,67 pg/kg/hr) ou equivalentea uma taxa de dose de ala-TFPI de, pelo menos,aproximadamente 0,020 mg/kg/hr e menos que aproximadamente0,080 mg/kg/hr e, mais preferencialmente, equivalente a umataxa de dose de ala-TFPI de aproximadamente 0,025 mg/kg/hr(0,417 pg/kg/hr) a aproximadamente 0,075 mg/kg/hr (1,251pg/kg/hr) . A rota de administração é geralmente poradministração intravenosa, com infusão intravenosa contínuapreferida. Infusão pode ser administrada por, pelo menos,72, 96, 100, 120 ou 240 horas. Preferencialmente, infusãocontínua é administrada por 3 a 8 dias, maispreferencialmente 3 a 6 dias e, mais preferencialmente, poraproximadamente por 4 dias.
Para administrar "por infusão contínua" significa quea infusão é mantida a aproximadamente a taxa prescrita seminterrupção substancial para a maior parte da duração daprescrição. Alternativamente, infusão intravenosaintermitente pode ser utilizada. Se infusão intermitentefor utilizada, depois uma taxa de dose tempo-médio deve serutilizada a qual é equivalente às taxas de dose descritasacima para infusão contínua. Além disso, o programa defusão intermitente deve resultar em uma concentração séricamáxima não maior do que aproximadamente 20% acima daconcentração máxima obtida utilizando infusão contínua.Para evitar reações adversas no paciente, particularmenteefeitos colaterais envolvendo hemorragia, a taxa de dosedeve ser menor do que uma taxa de dose que é equivalente ainfusão intravenosa contínua de ala-TFPI a aproximadamente0,1 mg/kg/hr.
Todas as doses descritas aqui, incluindo as taxas dedose e doses totais, estão submetidas a variações de maisde 10% na prática devido a erros na determinação daconcentração de proteína e atividade biológica com o ensaiode protrombina. Desta maneira, qualquer dose atualmenteadministrada maior do que 10% ou menor do que 10% emrelação a dose determinada aqui é considerada como sendoequivalente a dose determinada. Por esta razão, todas asdoses foram determinadas como "aproximadamente" uma doseespecífica. Por exemplo, uma dose descrita como"aproximadamente 0,025 mg/kg/hr" é considerada equivalentea qualquer dose atual variando de 0,0225 a 0,0275 mg/kg/hr.
Regimes de dosagem preferidos incluem duas dosesintravenosas de 100 mL cada de 0,15 mg/mL ou 0,45 mg/mL de ala-TFPI recombinante em 300 mM de L-arginina, mM de L-metionina, 2 0 mM de tampão citrato de sódio, pH 5,5, com uma osmolaridade de 560+/-110 mOsm/kg.
Uma injeção bolus ou uma taxa de infusão levemente mais alta de TFPI ou de um análogo de TFPI pode também ser empregada na prática da presente invenção se seguida por baixa dose de administração de TFPI. Por exemplo, uma injeção bolus ou uma taxa de infusão mais alta pode ser utilizada para reduzir o tempo de equilíbrio de TFPI ou análogo de TFPI administrado na circulação de um paciente. Em fazendo isso, o eventual estado constante do nível de TFPI no plasma pode ser alcançado mais rapidamente e receptores para TFPI podem ser saturados mais rápido. Administração de ala-TFPI a humanos em aproximadamente ,0,025 mg/kg/hr por 2 horas aumenta os níveis de TFPI no plasma (mais ala-TFPI) a partir de 80 ng/mL a aproximadamente 12 5 ng/mL ou um aumento de aproximadamente 50%. O mesmo nível será alcançado mais rápido se a taxa de infusão for aumentada ou uma injeção bolus for utilizada. Taxas maiores de infusão resultarão em níveis mais altos se infusão for continuada até que o estado constante seja obtido. Estado de nível constante para administração de ala-TFPI a aproximadamente 0,050 mg/kg/hr foi encontrado como sendo aproximadamente 3 00 ng/mL e para administração de ala-TFPI a aproximadamente 0,33 ou aproximadamente 0,66 mg/kg/hr foi encontrada como sendo aproximadamente de, pelo menos, 2 pg/mL em pacientes sofrendo de infecções bacterianas severas.
Dose total diária administrada a um hospedeiro em umainfusão continua única ou em doses de infusão divididas pode ser em quantidades, por exemplo, equivalentes a administração de, pelo menos, aproximadamente 0,006 mg/kg/dia a menos de aproximadamente 1,2 mg/kg/dia de ala-TFPI, mais usualmente equivalente a administração de a partir de 0,24 mg/kg/dia a menos de aproximadamente 1,2 mg/kg/dia de ala-TFPI e preferencialmente equivalente a aproximadamente 0,6 mg/kg/dia de ala-TFPI. Quantidades mais baixas dentro desta faixa podem ser úteis para profilaxia e outros propósitos. Os protocolos de dosagem da invenção podem ser expressos como a dose total administrada ao paciente. A dose total é o produto matemático da taxa de infusão e do tempo total de infusão. Por exemplo, na taxa de dose preferida de aproximadamente 0,025 mg/kg/hr de ala-TFPI e o tempo de infusão preferido de 96 horas, a dose total é aproximadamente 2,4 mg de ala-TFPI por kg de peso corporal. A dose total de TFPI administrado de acordo com a invenção é equivalente a, pelo menos, aproximadamente 0,75 pg/kg e menor do que aproximadamente 4,8 mg/kg de ala-TFPI. Preferencialmente, a dose total é equivalente a, pelo menos, aproximadamente 4,8 mg/kg de ala-TFPI. Mais preferencialmente, a dose total é equivalente a aproximadamente 2,4 mg/kg de ala-TFPI.
Os regimentos de dosagem descritos acima, incluindo taxa de dosagem em uma base de mg/kg/hr e dose diária total, são expressos como uma dose "equivalente a administração de ala-TFPI de referência". Isto significa que elas são determinadas quantitativamente por normalização a uma dose de "ala-TFPI de referência" a qual é definida como madura, 100% pura (em uma base deproteína), dobrada propriamente, biologicamente ativa, ala-TFPI não glicosilada. ala-TFPI é um análogo de TFPI cuja seqüência de aminoácido está descrita na SEQ ID NO: 2. Outras formas de TFPI podem também ser utilizadas na invenção, incluindo maduro, TFPI completo e análogos destes. Para determinar a taxa de dosagem apropriada para praticar a invenção com formas de TFPI outras além da ala-TFPI e com preparações da ala-TFPI ou outro análogo de TFPI que seja menor do que 100% puro, as faixas de dosagem descritas aqui por ala-TFPI de referência podem ser ajustadas baseadas na atividade biológica intrínseca para a forma particular de TFPI e posteriormente ajustadas pela pureza bioquímica da preparação.
Atividade biológica intrínseca de TFPI ou de um análogo de TFPI refere-se a atividade específica, como definida pelo ensaio de protrombina, do TFPI ou análogo de TFPI maduro, propriamente dobrado. Desta maneira, a dose equivalente é calculada como (dose de ala-TFPI de referência)/((atividade intrínseca relativa) χ (pureza bioquímica)), onde atividade intrínseca relativa refere-se a (atividade intrínseca do análogo)/(atividade intrínseca de ala-TFPI de referência) . Por exemplo, se um análogo de TFPI particular possui uma atividade biológica intrínseca a qual é 80% da de ala-TFPI de referência, então a dose equivalente para o análogo de TFPI particular é obtida pela divisão dos valores de dose para ala-TFPI de referência por 0,8. Adicionalmente, se a formulação administrada a um paciente é, por exemplo, 90% bioquimicamente pura, ou seja, compreendendo 10% de espécies moleculares as quais não possuem atividade biológica de TFPI, então uma correçãoadicional dos valores da dose de referência para ala-TFPI é realizada pela divisão dos valores de dose por 0,9. Desta maneira, para um análogo de TFPI hipotético que possui 80% da atividade intrínseca de ala-TFPI e está 90% bioquimicamente puro quando administrado, uma taxa de dose equivalente a administração de ala-TFPI de referência a 0,025 mg/kg/hr seria 0,0347 mg/kg/hr (ou seja, 0,025/(0,8 χ 0,9) ) .
Doses equivalentes podem também ser determinadas sem conhecimento tanto da atividade intrínseca quanto da pureza bioquímica pela determinação da atividade biológica relativa. Atividade biológica relativa pode ser determinada pela comparação de um análogo TFPI particular com uma atividade biológica padrão de TFPI utilizando o ensaio de tempo de protrombina. Por exemplo, ala-TFPI produzido de acordo com o método do Exemplo 9 da WO 96/40784, o qual contém aproximadamente 85% de espécies moleculares biologicamente ativas, pode ser utilizado como uma atividade biológica de TFPI padrão. Ala-TFPI produzido de acordo com o método do Exemplo 9 da WO 96/40784 possui aproximadamente 85% da atividade de ala-TFPI de referência no ensaio da protrombina. Na plotagem da curva padrão de tempo da protrombina, o Iog do tempo de caogulação é plotado contra o Iog da concentração de TFPI. Se a atividade biológica padrão de TFPI possui 85% da atividade de ala-TFPI de referência, então a curva padrão pode ser preparada a qual é equivalente a aquela por ala-TFPI de referência se as concentrações da atividade biológica padrão de TFPI forem multiplicadas por 0,85 antes da plotagem, tal que a atividade é equivalente a atividade de100% do ala-TFPI de referência puro. Quando o tempo de coagulação para um análogo TFPI particular é comparado a curva padrão, a concentração equivalente do ala-TFPI de referência pode ser lido fora da curva.
Alternativamente, se a inclinação da porção linear da curva padrão for obtida pela análise de regressão linear, então a inclinação pode ser corrigida baseada na atividade biológica padrão de TFPI relativa ao ala-TFPI padrão. A atividade biológica relativa de um análogo particular de TFPI é então igual a proporção de atividade de ala-TFPI para a atividade do análogo. Por exemplo, se um análogo particular requer 1,43 pg para produzir a mesma atividade de tempo da protrombina como 1,00 μg de ala-TFPI de referência, então a atividade biológica relativa do análogo é 1,00/1,43 ou 0,7. Para este análogo, a dose equivalente a dose de ala-TFPI de referência é obtida dividindo a dose de ala-TFPI de referência pela atividade biológica relativa do análogo. Por exemplo, uma dose de 0,025 mg/kg/hr para ala-TFPI de referência seria equivalente a 0,0357 mg/kg/hr do análogo (ou seja, 0,025/0,7).
Em algumas modalidades, TFPI ou análogos de TFPI são administrados a um paciente o qual havia sido tratado com tratamento de heparina previamente. Neste caso, o paciente preferencialmente não recebeu heparina por, pelo menos, 8 horas antes da administração de TFPI ou análogo de TFPI. Tratamento com heparina não fracionada pode requerer um longo período de "eliminação", por exemplo, 20, 21, 22, 23 ou 24 horas. Períodos de eliminação típicos para pacientes tratados com heparina de baixo peso molecular são 9, 10, 11 ou 12 horas.Enquanto TFPI ou um análogo de TFPI podem ser administrados como um agente farmacêutico anticoagulante ativo único, estas moléculas também podem ser utilizadas em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais para fornecer uma terapia combinada para o tratamento de pneumonia severa. Tais agentes terapêuticos adicionais incluem anticorpos tais como, por exemplo, antiendotoxina, anticorpos monoclonais (por exemplo, Mabs endotoxina-ligantes) e produtos anti-TNF tais como um Mab anti-TNF murino. TFPI e análogos de TFPI podem também ser combinados com antagonistas do receptor de interleucina-1, proteína bactericida/aumentadora de permeabilidade (BPI), imunoestimulante, compostos possuindo atividadeantiinflamatória tais como antagonistas de PAF e bloqueadores de adesão celular (por exemplo, agentes antiplaquetários tais como inibidores GPIIb/IIIa).
Pacientes com pontuações APACHE II menores do que 38, mas acima de 25 (por exemplo, entre 25 e 37 ou 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37 podem adicionalmente serem tratados com proteína C ativada (por exemplo, XIGRIS®). Proteína C ativada tipicamente é administrada a uma taxa de infusão de 24 pg/kg/hr por um total de 96 horas. Ajuste deste regime de dosagem pode ser ajustado pelo médico habilitado na arte de acordo com a apresentação clínica individual do paciente.
Quando administrados como uma combinação, os agentes terapêuticos podem ser formulados como composições separadas que são dadas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes. Preferencialmente, agentes terapêuticos adicionais são dados tanto ao mesmo tempo (ou seja, duranteo período de administração de TFPI ou de análogos de TFPI) ou dentro de 24 horas do período de administração de TFPI ou de análogos de TFPI (ou seja, dentro de 24 horas antes do início de, ou dentro de 24 horas após o final do período de administração de TFPI ou de análogos de TFPI) . Agentes terapêuticos adicionais podem também ser dados como uma composição única junto com os TFPI ou análogos de TFPI.
TFPI ou análogo de TFPI também pode ser dado em combinação com outros agentes que seriam efetivos para tratar algumas infecções bacterianas severas, particularmente pneumonia. Por exemplo, o seguinte pode ser administrado em combinação com TFPI ou análogo de TFPI: antibióticos que podem tratar a infecção bacteriana basal, anticorpos monoclonais que são direcionados contra componentes da parede celular bacteriana, receptores que podem se complexar a citocinas que estão envolvidas na via da pneumonia severa e geralmente qualquer agente ou proteína que pode interagir com citocinas ou outras vias fisiológicas ativadas ou amplificadas incluindo proteínas do complemento para atenuar pneumonia e/ou seus sintomas.
Antibióticos úteis incluem aqueles na categoria geral de: anéis beta-lactâmicos (penicilina), açúcares amino na ligação glicosídica (aminoglicosídeos), anéis macrocíclicos de lactona (macrolídeos), derivados policíclicos de naftacenocarboxanid(tetraciclinas),derivados nitrobenzeno de ácido dicloroacético, peptídeos (bacitracina, gramicidina e polimixina), anéis grandes com um sistema de dupla ligação conjugada (polienos), drogas de sulfa derivadas sulfanilamida (sulfonamidas) , grupos 5-nitro-2-furanil (nitrofuranos) , ácidos carboxílicosquinolona (ácido nalidíxico) e muitos outros. Outros antibióticos e mais versões dos antibióticos específicos acima podem ser encontrados em Encyclopedia o f Chemical Technology, 3a Edição, Kirk-Othymer (Ed.), Vol. 2, páginas 5 782-1036 (1978) e Vol. 3, páginas 1-78, Zinsser, MicroBiology, 17a Edição W. Joldik et al. (Eds.) páginas 235-277 (1980) ou Dorland's Illustrated Medicai Dictionary, 27a Edição, W. B. Saunders Company (1988).
Outros agentes que podem ser combinados com TFPI ou 10 com um análogo de TFPI incluem antagonistas de endotoxina tais como E5531 (um análogo de Lipídio A, veja Asai et al. , Biol. Pharm. Buli. 22:432 (1999)), análogos TF com atividade anticoagulante (veja, por exemplo, Kelley et al. , Blood 89:3219 (1997) e Lee & Kelley, J. Biol. Chem. 15 273:4149 (1998)), anticorpos monoclonais dirigidos a citocinas, tais como aqueles anticorpos monoclonais direcionados a IL-6 ou M-CSF, veja E.U.A. Ser. No. 07/451,218, arquivado em 15 de dezembro de 1989 e anticorpos monoclonais dirigidos a TNF (veja Cerami et al., 20 Patente E.U.A. No. 4,603,106), inibidores de proteína que cliva o pró hormônio TNF a partir da célula na qual este foi produzido (veja E.U.A. Ser. No. 07/395,253, arquivado em 16 de agosto de 1989), antagonistas de IL_1 (veja E.U.A. Ser. No. 07/517,276, arquivado em 1 de maio de 1990), 25 inibidores da expressão da citocina IL-6 tais como inibina (veja Patente E.U.A. No. 5,942,220) e inibidores baseados em receptor de diversas citocinas tais como IL-1. Anticorpos para complemento ou inibidores de proteínas, tais como CRI, DAF e MCP podem também ser utilizados. 3 0 Todas patentes, aplicações de patentes e referênciascitadas nesta divulgação estão incorporadas aqui por referência em suas totalidades.
A presente invenção será agora ilustrada por referência aos seguintes exemplos que determinam modalidades particularmente vantajosas. Entretanto, deve ser notado que estas modalidades são ilustrativas e não são para serem construídas como restringindo a invenção de qualquer forma.
EXEMPLO 1
Materiais
Anticorpos monoclonais para domínio 1 Kunitz (4 904) ou domínio 2 Kunitz (4903) de TFPI foram compradas da American Diagnostica Inc. (Greenwich, CT). Nós fizemos anticorpos monoclonais adicionais (2H8 contra domínio 1 Kunitz e 17 contra o C terminal) . A IgGl controle de camundongo foi comprada de Jackson ImmunoResearch Lab Inc. Células da veia endotelial umbilical humana (HUVEC) foram compradas da CLonetics (San Diego, CA) e cultivadas a 37°C em meio EBM-2 (Clonetics) . Lipopolissacarídeos de E. coli (LPS) foram comprados da Sigma (L-2654).
Nos exemplos que seguem, todo TFPI exógeno é ala-TFPI.
EXEMPLO 2
Ensaio de sangue total
Sangue foi obtido de doadores sadios na ausência de anticoagulantes e sob condições as quais minimizam a ativação de plaquetas. Seleção de doadores excluíram utilização de aspirina ou outros compostos para tornar o sangue mais fino, drogas diminuidoras de colesterol, agentes antiinflamatórios, anti-histamínicos eantibióticos. As misturas de reagentes contendo 10 ng/mLLPS e diferentes concentrações do mAbs com ou sem ala-TFPI foram pré-dispostas em placas de 96 poços. Sangue foi adicionado a proporção 1:10 em meio RPMI-1640 com ou sem 10% FBS de um volume total de 200 pL dentro de 10 min de doação. As amostras de sangue diluídas foram incubadas por 16 a 20 horas a 37 0C em uma incubadora de cultura celular e alíquotas do sobrenadante celular foram analisadas para secreção de citocinas inflamatórias utilizando um kit de ELISA IL-6 (Biosource) . Liberação de outras citocinas foi medida utilizando um kit de citocina LINCOPLEX® (LINCO Research).
EXEMPLO 3
Ensaio de sangue total mais HUVEC
Células HUVEC foram plaqueadas a 5000-7000 células/96 poços em meio EBM-2 com 10 ng/mL de LPS um dia antes do experimento. No dia do experimento, o meio foi removido e recolocado com uma mistura de reagentes pré-disposta contendo 10 ng/mL de LPS e diferentes concentrações do mAbs com ou sem ala-TFPI em meio RPMI-164 0 com ou sem 10% de SFB. Então o sangue foi adicionado a uma proporção de 1:10. 0 ensaio de sangue total foi realizado como descrito acima.
EXEMPLO 4
TFPI basal do paciente correlaciona com mortalidade
Em uma ampla triagem de Fase clínica III para tratamento de septicemia severa de múltiplas causas com ala-TFPI, nós encontramos amplos subconjuntos de pacientes que aparentemente se beneficiaram do tratamento com ala-TFPI. Em particular, nós notamos que pacientes com CAP foram bem sucedidos. Entre as análises corridas nesta triagem nós medimos concentração basal no plasma de TFPIpor ELISA. Como mostrado na FIG. 2, TFPI basal de paciente correlaciona com mortalidade. Isto foi verdadeiro para tanto global quanto subconjunto CAP. Isto sugere que, a medida que septicemia piora, TFPI é inativado e liberado das células sangüíneas. Ala-TFPI exógeno aparentemente substitui perda de TFPI endógeno durante infecção.
EXEMPLO 5
Simulação de nt urnover" de TFPI e indução de degradação de TFPI em um modelo de septicemia de sangue total
Nós criamos um modelo de sangue com septicemia pela adição de soro a sangue normal. Isto causa rápida coagulação e induz uma secreção dependente de lipopolissacarídeo (LPS) de muitas citocinas, criando uma condição similar àquela que é observada no sangue de pacientes com septicemia.
Quando ala-TFPI foi adicionado a sangue total este permanece intacto no C-terminal. No nosso sistema séptico, entretanto, o domínio C-terminal foi clivado a partir de ala-TFPI adicionado. Os resultados estão mostrados na FIG. 3. Este dado indica que condições as quais ativam coagulação e induzem citocinas inflamatórias no sangue levam a remoção do domínio C-terminal do TFPI. Mais de 95% do TFPI normal do plasma possui uma deleção C-terminal. TFPI truncado C-terminalmente possui uma pequena atividade em ensaios em sangue.
EXEMPLO 6
Efeito de ala-TFPI adicionado na sobrevivência de pacientes com diversos níveis de TFPI endógeno
Ala-TFPI adicionado parece ser efetivo em pacientesnos quais TFPI basal era normal (FIG. 4). Quando pacientes CAP foram separados em subconjuntos por níveis de TFPI basais, nós encontramos que ala-TFPI era efetivo em pacientes com TFPI basal abaixo do normal e em pacientes com TFPI basal elevado. 0 fato que ala-TFPI adicionado melhora os pacientes com TFPI basal elevado é consistente com dados que mostram que TFPI é inativo e que droga ala-TFPI é a forma completamente ativa.
EXEMPLO 7
Nós exploramos atividade de TFPI em sangue totaldiluído a partir de doadores sadios. Nós vimos diversas atividades consistentes com TFPI sendo parte de complexos de sinalização que regulam atividade antibacteriana através de citocinas inflamatórias. Níveis de citocinas inflamatórias em sangue normal foram muito baixos e continuaram baixos quando ala-TFPI exógeno foi adicionado (FIG. 5) . Como esperado, adicionando LPS em sangue normal elevou citocinas inf lamatórias contendo IL-6, IL-1|3 e TNF-a. Esta reação é sensível a concentração de TFPI no plasma; qualquer perda de TFPI funcional diminuiria a resposta.
Inesperadamente, LPS também sensibilizou sangue para TFPI tal que ala-TFPi adicionado induziu interferon-γ (IFN-γ) , IL- 6, IL-1J3 e TNF-a (FIGS. 6, 7A) ; os aumentos em IL-6, IFN-γ, TNF-a e IL-foram todos revertidos por uma pequena dose de anti-TFPI (FIG. 7B) . 0 espectro de citocinas está associado com ativação de macrófagos para aumentar sua atividade antibacteriana.
No entendimento corrente da imunologia celular, imunidade celular é mediada por células ThI. Ativação de células ThI requer reconhecimento do antígeno e expansãoclonal das células T relevantes, um processo levando uma semana. 0 ala-TFPI dirige uma indução oacorrida após horas, sugerindo que esta forma de ativação pode exercer um importante papel nas fases iniciais críticas de uma infecção antes que o sistema imune adaptativo esteja completamente comprometido.
Estes resultados indicam que TFPI parece estar funcionando como um ligante em uma cascata de sinalização ao invés de um inibidor de protease na cascata de coagulação.
EXEMPLO 8
Pontos recentes na literatura para domínios 3 Kunitz (K3) como um domínio essencial para interação de TFPI com seus receptores, enquanto K3 parece não ser importante para inibição da coagulação. Piro & Bronze, circulation. 2004 Dec 7; 110 (23): 3567-72. Utilizando ensaios de sangue total nós mapeamos os domínios de TFPI requeridos para TFPI induzir citocinas. Os resultados estão mostrados na FIG. 8. Nós encontramos que TFPI deletado C-terminalmente ainda possui atividade; enquanto uma deleção mutante faltando ambos domínio C-termainal e K3 era inativo. Estes resultados são consistentes com a atividade de sinalização proposta de TFPI sendo ancorada a um receptor através de K3 .
EXEMPLO 9
Como notado acima, adicionando soro a sangue contendo LPS induz um espectro de citocinas; estas incluem IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, mas falta IFN-γ. Esta coleção combina com a saída de macrófagos ativados. Adicionados 3 a 10 nM de ala-TFPI exogenamente é capaz de inibir estascitocinas induzidas pelo soro (FIGS. 7 e 9). EXEMPLO 10
TFPI inibe produção de IL-6 dirigida pelo Fator Xa
A atividade inibitória de TFPI na produção de IL-6 parece ser através da habilidade do TFPI de inibir produção de Xa. FIG. 10 mostra os resultados dos ensaios de sangue completo medindo IL-6 desencadeadas por LPS e soro na presença de diversos inibidores (os inibidores DEGR-VIIa, DEGR-IXa e DEGR-Xa estão escritos: Viia, IXai e Xai). Quando nós testamos diversos inibidores, nós encontramos que VIIa sítio ativada não possui atividade, mostrando que as citocinas não foram dirigidas por ativação de coagulação mediada por fator de tecido (TF). Ao contrário das nossas expectativas, IXa sítio inativada foi aproximadamente tão potente quanto TFPI, mostyrando que a secreção de citocina envolvia formação de fator Xa dirigido através da cascata de coagulação intrínseca. De acordo com a literatura, Xa pode induzir citocinas através da sua habilidade de produzir trombina. Em contradição com isto, nós encontramos que Xa sítio-inativada não possui efeito.
Estes resultados mostram que citocinas podem ser dirigidas por Xa diretamente e que TFPI neste tipo de reação é efetiva através da sua habilidade de inibir produção de Xa.
EXEMPLO 11
TFPI e APC (proteína C ativada) possui efeitos muito similares na coagulação por causa de cada limite de produção de trombina (FIG. 11) . Entretanto, se indução de citocina é dirigida por fator Xa, então estas drogas devem possuir efeitos diferentes na indução de IL-6. APC inibeprodução de Xa pela destruição do fator VIIIa, mas não possui efeito na produção de Xa dirigida por TF. No nosso modelo de sangue séptico nós observamos exatamente este resultado quando nós adicionamos uma pequena quantidade de TF para a reação (FIG. 12) . Em uma reação onde IXa dirige IL-6, nós encontramos que ambas proteínas podem inibir infalamção dirigida pelo soro como refletido nos níveis de IL-6. Como esperado, APC inibe a produção de IL-6 induzida pela via intrínseca. Na presença de TF, entretanto, apenas TFPI pode inibir a produção de IL-6.
EXEMPLO 12
Células do sangue são conhecidas por possuírem TFPI em suas superfícies. Para determinar a atividade deste TFPI, nós inibimos esta função com anticorpos anti-TFPI e medimos citocinas (FIG. 13) . Em uma aparente contradição para a inibição vista com ala-TFPI adicionada, anti-TFPI também inibiu secreção de IL-6. Estes dados emparelham com o resultado de adição de ala-TFPI a sangue normal mais LPS. A partir destes dados, nós conluímos que TFPI é parte de um complexo de sinalização.
Um modelo de relocação de um complexo TF:VIIIa:Xa a caveolae, onde este combina com TFPI, é mostrado na FIG. 14. Este complexo é dependente de Xa para ativação para sua formação. Enquanto não conseguimos encontrar ligação por este mecanismo, nós supomos que a função do complexo é ativar secreção de citocina e aumentar os mecanismos de eliminação bacteriana. Por causa da formação do complexo é dependente de Xa, um excesso de TFPI previnirá formação do complexo, assim como formará anticorpo neutralizante.
De acordo com este modelo, nós encontramos queregulação de citocinas induzidas por receptor ativado por protease (PAR) depende da produção do factor Xa até mesmo quando PAR-I é ativada por um peptídeo agosnista (FIG. 15). PAR-I parece ser parte do sistema de sinalização induzindo secreção de IL-6 no nosso modelo de sangue séptico, porque um anticorpo que bloqueia ativação de PAR-I inibiu secreção de IL-6 (FIG. 16) . Adição posterior de agonista PAR-I aumentou secreção de IL-6. Ambas estas atividades estão de acordo com dados da literatura no PAP sendo responsável pela produção de citocina inflamatória. Uma vez que ativação de PAR é à jusante da cascata de coagulação, agonistas PAR devem ser dominantes neste sistema. Em lugar disso, nós encontramos que TFPI é capaz de ignorar agonista PAR no alinhamento sem nosso modelo de complexo TFPI Xa dependente regulando citocinas.
EXEMPLO 13
0 principal reservatório de TFPI no caovéolo é encontrado em células endoteliais. Estas células são propostas como servindo de sentinelas para infecção do sangue através de sua rápida indução de TF de superfície. Como mencionado acima, nós encontramos que sangue responde a LPS pela liberação de modesta explosão de IL-6 (FIG. 17). Similarmente, células endoteliais respondem a LPS com uma pequena quantidade de citocinas. Nós encontramos que combinação de sangue e células endoteliais leva a uma resposta sinergética ao LPS. Nós determinamos que a resposta sinergética foi restrita a IL-6 e IL-8; isto combina com a função da célula endotelial como um sistema de alarme.
Mais uma vez, para provar a função de TFPI nestareação, nós adicionamos anticorpo neutralizante anti-TFPI (FIG. 18). Nós encontramos que uma alta concentração de anti-TFPI inibe a produção de IL-6. Para confirmar que a inibição foi devida a TFPI, nós pré-incubamos o anti-TFPI com pequenas concentrações de ala-TFPI e encontramos 10 que nM de ala-TFPI parcialmente revertem o efeito de 600 nM de anti-TFPI (FIG. 19).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110>YúminDaí
Steven Uardy
<120> UIILIZAÇÃ.0 DE' IFPI rPAEA IRAIAS IHFECÇÕE5 BACIERIANAS SEtZERAS
<130> PP028089.0004Í
<140> PCT/ÜS2006/
fíAl*.; 08^05-2005
<150> S0/678465 <151> 06-05-2006
<160> 2
<17O> FastSEQ,para Windows. Versào 4.0
<210> 1
<211> 276
<212> PRT
<213> Komo sapiens
<400> 1
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu Leu1 5 10 15 Pro Pro Leu Lys 20 Leu Het HiS Ser Phe 25 Cys Ala Phe Lys Ala 30 Asp AspGly Pro Cys Lys Ala Ile Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn Ile Phe Thr 35 40 45 Arg Gln Cys Glu Glu Phe Ilo Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln Asn 50 55 60 Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn65 70 75 80Ala Asn Arg Ile Ile 85 Lys Thr Thr Leu Gln 90 Gln Glu Lys Pfo Asp 95 PheCys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly Ile Cys Arg Gly Tyr Ile Thr Arg 100 105 110 Tyr Phe Tyr 115 A 911 Asn Gln Thr Lys 120 Gln Cys Glu Arg Phe 125 Lys Tyr GlyGly Cys 130 Leu Gly Asn Met Asn 135 Asn Phe Gly Thr Leu 140 Glu Glu Cys LysAsn rle Cys Glu Aso Gly Pro Asn Gly Phe Gln Val Asp Asn Tyr .Gly 145 150 155 160Thr Gln Leu Asn Ala 165 Val Asn Asn Ser Leu 170 Thr Pro Gln Ser Thr 175 LysVal Pro Ser Leu Phe Glu Pho His Gly Pro Scr Trp Cys Leu Tbr Pro 180 185 190 AXa Asp Arg 135 Gly Leu Cys Arg Ala 200 Asn Glu Asn Arg Pne 205 Tyr Tyr AsnSer Val 210 Ile Gly Lys Cys Arg 215 Pro Phe Lys Tyr Ser 220 C-Iy Cys Gly GlyAsn GXu Asn'Asn pfie Thr "Ser Lys 225 230
Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile Ser 245
Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg Val 260
Val Lys Asn Met 275
Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lye 235 240Lys Gly Gly Leu Zle ID a Thr Lys 250 2SS Lys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile Phe265 270
<210> 2
<211> 277
<212> PRT
<223> Homo sapiens
<400> 2 Ala Asp Ser GlU Glu Asp Glu Glu 1 5 Leu Pro Pro Leu 20 Lys Leu Met HiSAsp Gly Pro 35 Cys Lys Ala Ile Met 40Thr Arg 50 Gln Cys Glu Glu Phe 55 IleAsn Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu65 70 Asn Ala Asn Arg Ile 85 Ile ^ys ThrPhe Cys Fhe Leu 100 Glu Glu Asp ProArg Tyr Phe 115 Tyr Asn Asn Gln Thr 120Gly Gly 130 Cys Leu Gly Asn Met 135 AsnLys ASIl lie Cys Glu Asp Gly Pro145 150 Gly Thr Gln Leu Asn 165 Ala Val AsnLys Val Pro Ser Leu Phe Glu PhePro Ala Asp 195 Arg Gly Leu Cys Arg 200Asn Ser 210 Vai Ile Gly Lys Cys 215 ArgGly Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser225 230 Lys Lys Gly Phe Ile Gln Arg Ile 245 Lys Arg Lys Arg Lys Lys Gln Arg 260 Phe Val Lys 275 Asn Met
HiS Thr Ile Ile Thr Asp Thr Glu 10 15 Ser Phe Cys Ala Phe ^ys Ala Asp25 30. Lys Arg Phe Phe Phe Asa Ile Phe 45 Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gln 60 Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp 75 80Thr Leu Gln Gln Glu i-ys Pro ASP 90 95 Gly lie Cys Arg Gly Tyr Ile Thr105 110 Lys Gln Cys Glu Arg Phe Lys Tyr 125 Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys 140 Asn Gly Fhe Gln vai ASP Asn Tyr 155 160Asn Ser Leu Thr Pro Gla Ser Thr 170 • 175 His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr185 190 Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr 205 Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly 220 Lys Gln Glu Cys Leu Arg Ala Cys 235 240Ser Lys Gly Gly Leu lie Lys Thr 250 255 Val £>ys Ile Ala Tyr Glu Glu Ile265 270

Claims (39)

1. Método para tratar um paciente em risco de desenvolver ou diagnosticado como possuindo uma infecção bacteriana severa caracterizado pelo fato de compreender administração de TFPI ou de um análogo de TFPI a um paciente em necessidade deste o qual se encaixa em um ou mais dos seguintes critérios:(a) Um nível de IL-6 no sangue abaixo de 3.200 pg/mL;(b) Uma Taxa Internacional Normalizada (INR) abaixo de 2,5;(c) Uma pontuação de fisiologia aguda (APS) de menos de 26;(d) Uma pontuação na Avaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (APACHE II) menor do que 38; e(e) Uma pontuação MODS maior do que 18.
2. Método de redução do risco de mortalidade a partir de uma infecção bacteriana severa caracterizado pelo fato de compreender a administração de uma composição farmacêutica compreendendo TFPI ou análogo de TFPI a um paciente em necessidade deste o qual se encaixa em um ou mais dos seguintes critérios:(a) Um nível de IL-6 no sangue abaixo de 3.200 pg/mL;(b) Uma Taxa Internacional Normalizada (INR) abaixo de 2,5;(c) Uma pontuação de fisiologia aguda (APS) de menos de 26;(d) Uma pontuação na Avaliação de Fisiologia Aguda e Saúde Crônica (APACHE II) menor do que 38; e(e) Uma pontuação MODS maior do que 18.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato da infecção bacteriana severa causar pneumonia, bacteremia, infecção de tecido profundo, infecção de pele, infecção de tecido macio, infecção periodontal, peritonite, infecção cirúrgica ou meningite.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato da infecção bacteriana severa causar pneumonia e a pneumonia ser uma pneumonia adquirida na comunidade ou pneumonia adquirida no hospital.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da pneumonia ser causada pelo S. pneumoniae.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser não glicosilado.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de menos de cerca de 12% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI serem espécies modificadas, onde as espécies modificadas incluem um ou mais dos seguintes:i. Uma molécula de TFPI ou análogo de TFPI oxidada, como detectada por cromatografia de fase reversa;ii. Uma molécula de TFPI ou análogo de TFPI carbamilada, como detectado por cromatografia de troca de cátion;iii. Uma molécula de TFPI ou análogo de TFPI desamidada, como detectado pelo kit Promega ISOQUANT®;iv. Uma molécula de TFPI ou análogo de TFPI que compreende uma ponte de cisteina, como determinado por análises de ácido nucléico;v. Moléculas de TFPI ou análogo de TFPI agregadas,como detectado por cromatografia de exclusão de tamanho; evi. Uma molécula de TFPI ou análogo de TFPI sem conformação, como detectado por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida não desnaturante.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 9% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI serem oxidadas.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 3% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI serem carbamiladas.
10. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 9% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI serem desamidadas.
11. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 2% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI compreenderem uma ponte de cisteína.
12. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 3% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI serem agregadas.
13. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de menos que aproximadamente 3% das moléculas de TFPI ou análogo de TFPI estarem sem conformação.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de TFPI ou análogo de TFPI ser preparado a partir de uma composição liofilizada compreendendo TFPI ou análogo de TFPI.
15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de TFPI ou análogo de TFPI ser administrado como uma formulação compreendendo arginina.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,caracterizado pelo fato de TFPI ou análogo de TFPI ser administrado como uma formulação compreendendo citrato.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,01 a 1,0 mg/mL, 0,01 a 0,8 mg/mL, 0,01 a 0,5 mg/mL, 0,01 a 0,3 mg/mL, 0,01 a 0,2 mg/mL ou 0,01 a 0,1 mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 150-450 mM, 150-400 mM, 150-350 mM ou 150-300 mM de L-arginina.
19. Método, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,1-50 mM, 0,1-40 mM, 0,1-30 mM, 0,1-25 mM, 0,1-15 mM, 0,1-10 mM ou 0,1-5 mM de L-metionina.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 5-50 mM, 5-45 mM, 5-40 mM, 5-35 mM, 5-3 0 mM, 5-25 mM ou 5-20 mM de tampão citrato de sódio.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica possuir um pH de 5,0-6; 5,0-5,8; 5,0-5,7; 5,0-5,6 ou 5,0-5,5.
22. Método, de acordo com qualquer uma das 5 reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,15 ± 15% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI, 300 ± 15% de mM de L-arginina, 5 ± 15% de mM L-metionina e 20 ± 15% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 15%.
23. Método, de acordo com qualquer das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou --21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,15 ± 10% mg/mL de TFPI ouanálogo de TFPI, 300 ± 10% de mM de L-arginina, 5 ± 10% de mM L-metionina e 20 ± 10% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 10%.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,15 ± 5% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI, 300 + 51 de mM de L-arginina, 5 ± 5% de mM L-metionina e 20 ± 5% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 5%.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,45 ± 15% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI, 3 00 ± 15% de mM de L-arginina, 5 ± 15% de mM L-metionina e 20 ± 15% de tampão citrato de sódioa pH 5,5 ± 15%.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,45 ± 10% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI, 300 ± 10% de mM de L-arginina, 5 ± 10% de mM de L-metionina e 20 ± 10% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 10%.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20 ou 21, caracterizado pelo fato da composição farmacêutica compreender 0,45 ± 5% mg/mL de TFPI ou análogo de TFPI, 300 + 51 de mM de L-arginina, 5 ± 5% de mM de L-metionina e 20 ± 5% de tampão citrato de sódio a pH 5,5 ± 5%.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por infusão intravenosa contínua a uma taxa de dose equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dose de menos que aproximadamente 0,66 mg/kg/h.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato da taxa de dose ser equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dose de aproximadamente 0,00025 a aproximadamente 0,1 mg/kg/hr e o TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por, pelo menos,aproximadamente 72 horas.
30. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato da taxa de dose ser equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dose de aproximadamente 0,010 a aproximadamente 0,1 mg/kg/hr.
31. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 OU 27, caracterizado pelo fato da taxa de dose ser equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dose de aproximadamente 0,02 a 0,1 mg/kg/hr.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por, pelo menos, aproximadamente 96 horas.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 OU 27, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por infusão intravenosa contínua para fornecer uma dose total equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma dose total de, aproximadamente, 0,024 a aproximadamente 4,8 mg/kg.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI seradministrado por infusão intravenosa contínua a uma taxa de dose equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma taxa de dose entre, aproximadamente, 0,02 a aproximadamente 1 mg/kg/hr.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 ou 27, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por infusão intravenosa contínua para fornecer uma dose diária equivalente a administração de ala-TFPI de referência a uma dose diária de, aproximadamente, 0,006 mg/kg a aproximadamente 1,2 mg/kg.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 ou 35, caracterizado pelo fato do TFPI ou análogo de TFPI ser administrado por infusão por um período de 10-200 horas, 10-150 horas ou 24-96 horas.
37. Método, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ----19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato do paciente não ter recebido tratamento com heparina por, pelo menos, 8 horas antes da administração do TFPI ou análogo de TFPI.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ---19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender tratamento do pacientecom proteína C ativada.
39. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, -21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 5 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ou 38, caracterizado pelo fato do análogo de TFPI ser um ala-TFPI.
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