BRPI0611218A2 - preparaÇço e uso de partÍculas da membrana de base - Google Patents

Abstract

Método para suporte do crescimento in vitro de um ou mais tipos de células eucarióticas, o método compreendendo: semeadura das células do(s) tipo(s) de célula sobre partículas compreendendo membrana de base ou um substrato semelhante à membrana de base e cultivo das células semeadas ín vitro sob condições apropriadas, para expansão das células semeadas, onde as partículas possuem tamanhos inferiores a cerca de 500 <109>m.

Description

PREPARAÇÃO E USO DE PARTÍCULAS DA MEMBRANA DE BASE

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere ao campo de cultura de célulasin vitro e, mais especificamente, aos materiais e métodospara crescimento de células de mamíferos, tais como,células tronco, in vitro. Em uma aplicação específica dainvenção, os materiais e métodos fornecem um meio para aexpansão in vitro das células tronco espermatogoniais. Emoutra aplicação específica, os materiais e métodos dainvenção fornecem um meio para a expansão in vitro dascélulas tronco hematopoiéticas.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A capacidade das células de crescerem na culturaconduziu a um aumento maior no entendimento dos processosda vida e o desenvolvimento de uma ampla variedade de novosprodutos e processos incluindo aqueles que foramdesenvolvidos por construção de tecido e transferência decélula. Tipicamente, as células de mamíferos se desenvolvemsobre superfícies planas, tais como, poliestireno decultura de tecido, que é o poliestireno que foi modificadopara permitir melhor anexação à célula. Essa superfíciepode ser adicionalmente modificada, por exemplo, porabsorção das proteínas de anexação tais como, colágenos,fibronectina, vitronectina, laminina e muitas outrasmoléculas. Em outros métodos de cultura, as células podemse desenvolver sobre microesferas ou partículas, tais como,microesferas de dextrano (por exemplo, microesferas deCitodex) que são aderentes às células e que, em uso, sãogeralmente agitadas brandamente para formar uma suspensãoque permita o crescimento da célula. Esses métodos possuemuma vantagem, pelo que, as microesferas ou partículasfornecem uma área de superfície grande para o crescimentocelular dentro de um recipiente de reação pequeno, emcomparação à necessidade de vários frascos ou placas decultura de tecido. As microesferas ou partículas empregadasnesses métodos podem também ser modificadas para melhorarou refinar sua capacidade de anexação à célula.

Tem havido uma quantidade significativa de trabalhono desenvolvimento de substratos sintéticos que permitamanexação celular e proliferação e é conhecido agora que otipo de substrato pode influenciar na capacidade de um tipode célula específico de anexação, divisão e migração. Umavariedade de substratos modelo foi desenvolvida paraestudar a anexação celular. Esses substratos modelo eramgeralmente compreendidos de vários componentes de matriz(por exemplo, colágeno do tipo I, III, IV, laminina,fibronectina, vitronectina, gel de fibrina, hialuronano,alginato e quitosano) ou peptídeos derivados dessasproteínas (por exemplo, RGD) que foram anexados ao plásticode cultura de tecido, uma variedade de polímeros sintéticosou microesferas.

A maioria das células, excetuando, por exemplo,aquelas na circulação sangüínea, são anexadas aoscomponentes da matriz extracelular, tais como, colágenos.Por exemplo, os fibroblastos na derme são aderentes aocolágeno tipo I, que forma feixes de fibras de tecidoconjuntivo principais que caracterizam esse tecido. Emmuitos casos, incluindo, por exemplo, as célulasendoteliais, células epiteliais e vários tipos de célulastronco, o componente preferido para adesão é uma estruturadenominada de membrana de base ou lâmina basal. Asmembranas de base são estruturas semelhantes a folha desuporte altamente organizadas e únicas na matrizextracelular (ECM) que são formadas na interface entre ascélulas (por exemplo, células parenquimais) e seus tecidoscircundantes. Existem diferentes tipos de membranas de baseno corpo. Algumas atuam como um limite de tecido ondedeterminadas células podem ser anexar, algumas podem atuarcomo filtros com permeabilidade seletiva, algumas suportamdiferenciação celular muito seletiva de vários tipos decélulas diferentes incluindo células tronco, enquantooutras podem atuar como reservatório para fatores decrescimento. As membranas de base compreendem uma faixa decomponentes de macromolécula específicos incluindo colágenotipo IV, que se acredita forme uma estrutura semelhante àrede dentro da membrana de base, e uma faixa de outroscomponentes incluindo laminina, nidogeno, entractina,agrina, bamacanana, proteoglicanos de sulfato e userina eheparina, tais como, perlecan, que se acredita tenhainteração de modo ordenado com a estrutura de colágeno TipoIV. Os componentes mais abundantes, a saber, colágeno tipoIV e lamina surgem em uma faixa de isoformas moleculares,assim, membranas de base específicas associadas aos tecidosespecíficos podem variar dependendo de quais isoformas ouproporções de isoformas estejam presentes. Colágeno tipoIV, como todos os colágenos, consiste em três cadeias alfaenroladas em uma conformação helicoidal tripla semelhante acorda, em carretei bobinado. 0 primeiro colágeno tipo IVconsistia em duas cadeias de colágeno αϊ[IV] e uma cadeiade colágeno α2[IV]. Subseqüentemente, outras cadeias foramobservadas, incluindo as cadeias α3 [IV] e α5 [IV] que podemsubstituir a cadeia αϊ [IV] e as cadeias α.4 [IV] e α6 [IV] ,que podem substituir a cadeia α2[IV]. Várias, porém nãotodas, as combinações dessas cadeias foram encontradas emmembranas de base diferentes. A laminina consiste em trêstipos de cadeia diferentes, uma cadeia a, uma β e uma γ.Várias formas de cada uma dessas cadeias foram observadasem combinações diferentes, de modo que pelo menos 14isoformas diferentes de lamina foram observadas.

Assim, a adição de um substrato, tal como umamembrana de base, a uma cultura de células eucarióticas(por exemplo, células tronco) pode ser especificamentevantajosa na sustentação do crescimento dessas células pormimetização do ambiente local de ocorrência natural("nicho") para as células eucarióticas especificas. Comrelação a isso, o presente depositante verificousurpreendentemente que as partículas da membrana de basepodem ser usadas eficazmente para expandir as célulaseucarióticas in vitro. Especificamente, o presentedepositante verificou que as partículas de uma membrana debase ou substrato semelhante a membrana de base selecionadodo grupo consistindo nas partículas da estrutura damembrana de base natural; partículas de uma estruturaanáloga produzida na cultura por células selecionadas; epartículas de uma estrutura ordenada reconstituída deconstituintes individuais; são apropriadas para ocrescimento in vitro de células eucarióticas.

Vários tipos de preparações da membrana de baseforam previamente descritos para cultura e expansão dascélulas eucarióticas in vitro; contudo, essas diferem daspartículas da membrana de base ou substrato semelhante amembrana de base da presente invenção, pelo que a membranade base é provida em formas ou seções comparativamentegrandes (por exemplo, túbulos ou luvas da membrana de base)onde a arquitetura tridimensional bruta, natural damembrana de base é essencialmente mantida. Em contraste coma presente invenção, essas preparações da membrana de baseanteriores não são apropriadas (por exemplo, devido ao seutamanho maior ou flutuação inadequada) , para suporte daexpansão das células eucarióticas na cultura em suspensãoou outros sistemas bioreatores. Um exemplo específico deuma dessas preparações de membrana de base anteriores édescrito em Enders, GC e outros (1986) , onde as células deSertoli primárias foram aderidas in vitro a uma preparaçãode membrana de base do túbulo seminífero (STBM)compreendendo tubos ocos ou luvas ocas (isto é, umapreparação mantendo a arquitetura tridimensional bruta dotúbulo natural ou forma de luva da membrana de base) . Outroexemplo é provido por Van der Wee, K e Hofmann, MC (1999) ,que descreve o uso de uma preparação de componente damembrana de base solúvel (isto é, Matrigel(R)) revestidosobre placas de cultura de tecido para suportar ocrescimento de uma linhagem de célula de Sertoli.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um primeiro aspecto, a presente invenção provêum método para sustentar o crescimento in vitro de um oumais tipo(s) de célula, o método compreendendo:

semeadura de células do(s) tipo(s) de célula sobrepartículas compreendendo membrana de base ou um substratosemelhante a membrana de base, ecultura das células semeadas in vitro sob condiçõesapropriadas para expansão das células semeadas,

onde as partículas possuem tamanho inferior a cercade 500 μπι.

O método é útil para o crescimento in vitro decélulas eucarióticas, onde a manutenção do fenótipo dacélula ou de outra forma, a diferenciação celular (isto é,como pode ser induzido, por exemplo, por adição de fatoresapropriados) é necessária.

As partículas utilizadas no método podem serpartículas compreendendo membrana de base ou um substratosemelhante à membrana de base. As partículas compreendendoa membrana de base podem ser preparadas da membrana de basenatural derivada de uma amostra de tecido de uma fonteapropriada (por exemplo, por extração da membrana de basede uma amostra de tecido). As partículas compreendendosubstrato semelhante a membrana de base podem serpreparadas, por exemplo, por cultura de células desintetização da membrana de base sobre um suporte sólido(por exemplo, microesferas apropriadas).

Assim, o método pode compreender, adicionalmente,preparação das partículas nas quais as células sãosemeadas, por anexação sobre as microesferas apropriadas,células de sintetização da membrana de base e cultura dascélulas ligadas a microesfera sob condições apropriadaspara a expressão e secreção das proteínas da membrana debase para dessa forma produzir partículas compreendendomicroesferas revestidas, pelo menos parcialmente, em umsubstrato semelhante a membrana de base. Opcionalmente, ascélulas de sintetização da membrana de base podem após issoser destruídas ou removidas das partículas antes dasemeadura das células para crescimento.

Alternativamente, o método pode compreender,adicionalmente, a preparação das partículas, por anexaçãoàs micropartículas apropriadas, de ambas as células queserão desenvolvidas e as células de sintetização damembrana de base e cocultura das células ligadas àmicroesfera sob condições apropriadas para a expressão esecreção das proteínas da membrana de base pelas células desintetização da membrana de base. Dessa forma, as célulasque crescerão pelo método são semeadas sobre partículascompreendendo um substrato semelhante a membrana de baseconforme as microesferas se tornam revestidas, pelo menosparcialmente, no substrato semelhante a membrana de base.

Em um segundo aspecto, a presente invenção provêuma população de células eucarióticas que cresceram por ummétodo de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provêpartículas compreendendo microesferas revestidas, pelomenos parcialmente, em um substrato semelhante a membranade base, onde as partículas possuem um tamanho inferior acerca de 500 μπι.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1 provê uma fotografia das partículas deacordo com a presente invenção, preparadas da membrana debase isolada de túbulos seminíferos bovinos de acordo com oprocesso descrito no Exemplo 1.

A figura 2 provê uma fotografia das partículas deacordo com a presente invenção, a partir do material damembrana de base isolado de túbulos seminíferos bovinos deacordo com o processo descrito no Exemplo 1, seguido porfragmentação por ação mecânica conforme descrito no Exemplo9, antes do fracionamento.

A figura 3 provê uma fotografia das partículas damembrana de base preparadas de acordo com o processofornecido no Exemplo 1 e processadas em partículas pelaação mecânica conforme descrito no Exemplo 9. Essaspartículas foram usadas como substratos de cultura decélula para cultura de células tronco espermatogoniaisconforme descrito no Exemplo 14.

A figura 4 mostra a presença de substratosemelhante a membrana de base produzido de célulasendoteliais desenvolvidas sobre microesferas Cytodex 3. Osubstrato é mostrado por imunocoloração quanto a presençade colágeno tipo IV.

A figura 5 mostra a presença de um substratosemelhante à membrana de base produzido de células deSertoli desenvolvidas sobre microesferas Cultispher-S,mostrado por imunocoloração quanto a presença de colágenotipo IV.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O presente depositante verificou que as partículasda membrana de base ou um substrato semelhante a membranade base selecionado do grupo consistindo em:

(i) partículas da membrana de base natural para ascélulas eucarióticas específicas a serem desenvolvidas;

(ii) partículas de uma estrutura análoga produzidana cultura por células selecionadas, e

(iii) partículas de uma estrutura de rede ordenadareconstituída dos constituintes da membrana de baseindividual;

são apropriadas para o crescimento in vitro dascélulas eucarióticas, especificamente células de mamíferos.

As estruturas de rede análogas ou ordenadasreferidas em (ii) e (iii) podem ser consideradas comoexemplos específicos de um substrato semelhante à membranade base. Conforme usado aqui, o termo "substrato semelhanteà membrana de base" se refere a uma estrutura compreendendouma matriz consistindo em pelo menos colágeno tipo IV oufragmentos funcionais do mesmo. Contudo, preferivelmente, osubstrato semelhante à membrana de base usado na presenteinvenção compreende uma matriz consistindo em pelo menoscolágeno do tipo IV e laminina. Mais preferivelmente, osubstrato semelhante à membrana de base usado na presenteinvenção compreende uma rede de moléculas de interaçãoordenadas consistindo em pelo menos colágeno do tipo IV elaminina.

Foi verificado que as partículas de acordo com apresente invenção são especificamente eficazes parasuportar o crescimento e proliferação das célulaseucarióticas, tais como, células tronco, especificamente,células tronco espermatogoniais.

A aplicação específica da presente invenção aocrescimento das células tronco espermatogoniais, oferecepromessa considerável no campo de reprodução de animais decriação (Brinster, RL e outros (1994) e Ogawa, T. e outros,(1999), tal como aperfeiçoamento de reprodução paraprodução de carne. Por exemplo, mecanismos que têmsustentação na reprodução natural do gado para propagar oreprodutor podem ser ineficazes, assim o isolamento e aampliação in vitro de células tronco espermatogoniaisbovinas do reprodutor de procriação masculino conhecidopara produzir uma carne de qualidade desejável, oferece apossibilidade de produzir pronta e convenientementequantidades suficientes de células tronco espermatogoniaisbovinas de doador apropriadas, por exemplo, para transferirpara outros animais hospedeiros de modo a permitir ainseminação de fêmeas do gado. De modo semelhante, apresente invenção pode ser de valor considerável napreparação de outras células tronco espermatogoniaisagricolamente valiosas para uso nos programas de reproduçãoou para ajudar na reconstrução das populações de espéciesameaçadas. A presença invenção pode também ser de valorconsiderável para a geração de animais transgênicos.

Também foi verificado que partículas de acordo coma presente invenção são especificamente eficazes no suportedo crescimento de outros tipos de células tronco que sãoencontradas no embrião, feto, placenta e cordão umbilicalnovos, bem como tecidos maduros e órgãos no corpo. Apresente invenção, portanto, engloba o uso de partículas deuma membrana de base natural (ou substrato semelhante àmembrana de base para o crescimento in vitro de váriostipos de células tronco.

Dependendo da fonte do tipo de células troncoespecíficas usadas (isto é, embriônicas, mesenquimais deadulto ou sangue de cordão), o espectro amplo dediferenciação celular variará. Por exemplo, as célulastronco de adulto podem ter uma capacidade mais limitada dediferenciar em uma faixa ampla de tipos de célulassomáticas (por exemplo, osteoblastos, condrócitos eadipócitos) em comparação com as células troncoembriônicas. Adicionalmente, as células tronco da veiaumbilical incluiriam células tronco do sangue de cordão,tecido conjuntivo ao redor de cada cordão (isto é, geleiade Wharton) , bem como regiões especializadas como as zonasperivasculares nesses tecidos. Independente da fonte, ascélulas tronco em geral são as células chave responsáveispelo crescimento e desenvolvimento normal e por natureza,têm a capacidade de auto renovação e regeneração dostecidos e órgãos dentro do corpo.

Uma questão fundamental no uso das células troncopara transplante à base de célula, construção de tecido oumedicina regenerativa é a capacidade primária de ampliar umpequeno número dessas células para permitir que as mesmassejam reimplantadas no hospedeiro para reparar ou regenerartecido lesionado. A presente invenção oferece materiais emétodos que permitem a expansão das células celulares parauso, por exemplo, na propagação celular somática egerminal.

A invenção, em um primeiro aspecto, portanto, provêum método para sustentação do crescimento in vitro de um oumais tipos de células eucarióticas, o método compreendendo:semeadura das células do(s) tipo(s) de célula empartículas compreendendo membrana de base ou um substratosemelhante a membrana de base, e

cultivo das células semeadas in vitro sob condiçõesapropriadas para expansão das células semeadas,

onde as partículas possuem tamanho inferior a cercade 500 μιη.

0 método é útil para o crescimento in vitro decélulas eucarióticas onde é necessária cada manutenção dofenótipo celular (por exemplo, para crescimento de célulastronco não diferenciadas) ou, de outra forma, diferenciaçãocelular (por exemplo, para crescimento de célulasdiferenciadas a partir de células tronco). A diferenciaçãocelular pode ser induzida por adição à cultura de fatoresde diferenciação apropriados e/ou a aplicação das condiçõesde cultura que encorajam a diferenciação celular.

As partículas utilizadas no método possuem tamanhoinferior a cerca de 500 μηι (isto é, a dimensão máxima daspartículas é inferior a um tamanho de cerca de 500 μτη) . Aspartículas podem ter a forma irregular ou podem ter umaforma substancialmente consistente (por exemplo, aspartículas podem ser substancialmente esferóides, onde odiâmetro é inferior a 500 μτη ou substancialmente ovais,onde a dimensão do eixo de comprimento é inferior a 500μπι) . Preferivelmente, as partículas possuem um tamanhomédio na faixa de cerca de 50 μπι a 4 00 μτη. Maispreferivelmente, as partículas possuem um tamanho médio decerca de 100 μπι.

As partículas podem ser partículas compreendendomembrana de base natural ou um substrato semelhante àmembrana de base.

Quando as partículas compreendem uma membrana debase natural, a membrana de base é preferivelmente derivadade uma amostra de tecido de uma fonte apropriada (porexemplo, tecido selecionado, porém não limitado ao grupoconsistindo de músculos, pele, rins, túbulos seminíferosdos testículos, pulmão, ' placenta, ossos, medula óssea,ossos/interface de medula óssea, vasos sangüíneos, tecidoperivascular e bexiga) , onde a amostra de tecido não éfixa. Contudo, também é possível usar membrana de basederivada de uma amostra de tecido estabelecida (isto é,fixa) de uma fonte apropriada (por exemplo, conforme fixadausando qualquer um dos agentes de fixação bem conhecidosdos versados na arte, incluindo, aldeido fórmico,glutaraldeído, outros dialdeídos, bisimidatos,carbodiimidas, ribose, bis ou poli-epóxidos, bis-isocianatos e azidas de acila). É preferível que quando amembrana de base for derivada de uma amostra de tecidofixo, a amostra de tecido tenha sido fixada comglutaraldeído ou ribose.

Preferivelmente, as partículas compreendendo umamembrana de bases natural são preparadas por extração damembrana de base de uma amostra de tecido de uma fonteapropriada por tratamento da amostra de tecido com umagente, tal como uma enzima (por exemplo, pepsina e/oudetergente, tal como, Triton X-IOO, desoxicolato de sódioou N-octil-glicosídeo). A membrana de base extraída é entãopreferivelmente tratada de modo a produzir partículas (istoé, fragmentos) da membrana de base intacta. Isso pode serobtido por vários dispositivos diferentes, por exemplo, otecido pode ser fragmentado por dispositivos mecânicos,tais como, por uso de um pilão ou um misturador mecânico(por exemplo, Polytron ou Ultra Turrax (IKA Werke,Alemanha), um dispositivo de cavitação de nitrogêniolíquido (por exemplo, Parr Instrument Company) ou porcompressão mecânica e então fracionada por tamanho (porexemplo, empregando uma peneira). Vários outrosdispositivos serão conhecidos dos versados na arte e tambémserão considerados como estando dentro do escopo dapresente invenção.

Quando as partículas compreendem um substratosemelhante à membrana de base, o substrato semelhante amembrana de base pode ser selecionado de estruturasanálogas à membrana de base produzida na cultura porcélulas de sintetização da membrana de base selecionadas(isto é, células que sintetizam naturalmente e secretam asproteínas encontradas na membrana de base, especificamentecolágeno tipo IV e laminina) e estruturas ordenadas"reconstituídas" dos constituintes da membrana de base. Porexemplo, membranas de base podem ser depositadas sobremicroesferas apropriadas (por exemplo, microesferas Cytodexou Cultispher) através da cultura de células desintetização da membrana de base, tais como, célulasendoteliais, ceratinócitos, células de Schwann, células deSertoli, osteoblastos e combinações das mesmas.

Assim7 o método pode compreender adicionalmente apreparação das partículas sobre as quais as células serãosemeadas, a preparação compreendendo anexação nas contasrevestidas com membrana de base apropriada (por exemplo,microesferas Cytodex, Cultispher, microesferas /partículasreabsorvíveis de polímero sintético) que, preferivelmente,possuem um tamanho médio na faixa de 5 0 μιη a 4 00 μιτι) ,células de sintetização da membrana de base e cultivo decélulas de ligação de microesfera sob condições apropriadaspara a expressão e secreção de constituintes da membrana debase para dessa forma produzir partículas compreendendomicroesferas revestidas, pelo menos parcialmente, em umsubstrato semelhante à membrana de base possuindo umaespessura que permite a adesão celular. Opcionalmente, ascélulas de sintetização da membrana de base podem serdestruídas após isso ou removidas das partículas (porexemplo, por destaque das células através do tratamento daspartículas com uma solução de amônia diluída) antes dasemeadura das células a serem desenvolvidas.

Alternativamente, o método pode compreenderadicionalmente a preparação das partículas, por anexação emmicroesferas apropriadas, ambas as células a seremdesenvolvidas e células de sintetização da membrana de basee cocultivo das células de ligação de microesferas sobcondições apropriadas para a expressão e secreção dasproteínas da membrana de base pelas células de sintetizaçãoda membrana de base. Dessa forma, as células a seremdesenvolvidas pelo método são semeadas sobre as partículascompreendendo um substrato semelhante à membrana de baseconforme as contas são revestidas, pelo menos parcialmente,no substrato semelhante a membrana de base.

Também, as partículas compreendendo um substratosemelhante à membrana de base podem ser produzidas porreconstituição individual dos constituintes da membrana debase, sob condições que permitem que as moléculas decolágeno do tipo IV e de laminina se agreguem, para formaruma estrutura de rede ordenada. Condições apropriadas paraprodução de partículas de uma estrutura semelhante amembrana de base dessa maneira podem ser geradas porexemplo, por fabricação de uma solução de laminina a 0,5mg/mL pelo menos 50 micromolar com relação ao cloreto decálcio, adição de uma solução de um peso equivalente docolágeno tipo IV, então adição de microesferas apropriadas(por exemplo, Cultispher G) e aquecendo a mistura a 370Ccom agitação.

As partículas compreendendo um substrato semelhantea membrana de base podem ser estabilizadas por tratamentocom um agente de fixação, tal como aqueles mencionadosacima, porém preferivelmente glutaraldeído ou ribose.

A membrana de base ou substrato semelhante amembrana de base compreendendo as partículas épreferivelmente "combinada" ao(s) tipo(s) de célula dascélulas a serem desenvolvidas pelo método. Por exemplo,para o crescimento das células tronco espermatogoniais, amembrana de base ou substrato semelhante à membrana de baseprovê preferivelmente um nicho que mimetiza o ambientelocal natural para as células tronco espermatogoniaisencontradas em túbulos seminíferos.

Preferivelmente, a etapa de cultivo das célulassemeadas é conduzida em um bioreator. Isso possui avantagem específica de permitir quê uma proporção maior decélulas a serem desenvolvidas uma vez que a área desuperfície de cultivo é menos restrita em comparação aossistemas de cultura de tecido de base "estática"convencionais (por exemplo, cultivo nos frascos de culturade tecido).

As células eucarióticas usadas no método dainvenção podem ser células de um fenótipo maduro (porexemplo, células endoteliais, fibroblastos de pele,mioblastos e cardiomioblastos) ou podem ser células de umfenótipo primitivo tais como células tronco (por exemplo,mesenquimal adulta ou sangue de cordão incluindo célulastronco hematopoiéticas).Em uma modalidade especificamente preferida, aspartículas compreendendo membrana de base ou um substratosemelhante à membrana de base são usadas para suportar ocrescimento in vitro das células tronco espermatogoniais.

Durante a espermatogênese, a matriz do túbuloseminífero desempenha um papel na orquestração dasobrevivência da célula tronco espermatogonial, propagaçãoe diferenciação. A célula primária nesse nicho é aespermatogonia, a célula tronco da população de célulasgerminais. As células tronco espermatogoniais (SCC) mantêmespermatogênese através de toda vida. A fim de obter isso,as SCC devem ser auto renováveis para produzir célulastronco adicionais, bem como se diferenciarem ao longo deuma via complexa dentro das células tronco maduras. Paramanter ou regenerar a estrutura do tecido normal e afunção, a renovação da célula tronco e a diferenciaçãodevem ser rigorosamente reguladas. Em geral, aespermatagonia As (A simples) é classificada como a célulatronco. Conforme se divide, ela se transformará em duasnovas células tronco independentes ou permanece como um parde células, conhecido como espermatagonia emparelhadaA(Apr) . Essas células podem se dividir adicionalmente emfileiras alinhadas de 4, 8 ou 16 células, conhecidas comoespermatagonia alinhada A (Aai) , que então se diferenciamem espermatagonia Al e após seis divisões produzirãoespermatagonia A2, A3, A4 e finalmente B o que conduziráaos espermatócitos. Dependendo das espécies, essasclassificações variarão. Por exemplo, nos bovinos,acredita-se que as SCC incluam os tipos de células As e Apr,enquanto as células A1-A4 são células precursorasespermatogoniais comprometidas. A natureza da célula troncoverdadeira é importante para o isolamento e ampliaçãodessas células para uso, por exemplo, em transplantes.

No mesmo nicho (isto é, matriz de túbulosseminiferos ocupada por SCC), as células de Sertoli seestendem da membrana de base na direção do lúmen do túbulo.

Na membrana de base, as células de Sertoli estão em contatopróximo ou direto com as espermatagonias primárias,considerando-se que a uma distância essas células ou seusprocessos de célula alongam ao redor dos espermatócitos eespermátides precedentes. Nessa concretização da invenção,as partículas usadas para crescimento das células troncoespermatogoniais podem, portanto ser derivadas de umapreparação de túbulos seminiferos naturais ou porcrescimento de uma membrana de base ou um substratosemelhante à membrana de base, produzido por células quepodem "depositar" uma membrana de base (isto é, células desintetização da membrana de base), especificamente célulasde Sertoli.

Em uma concretização especificamente preferida dapresente invenção, as partículas compreendendo membrana debase ou substrato semelhante a membrana de base são usadaspara sustentar o crescimento in vitro das células troncohematopoiéticas.

Células tronco mesenquimais de adulto e sangue decordão incluem células tronco hematopoiéticas (HSC) que sãoassociadas a nichos separados na medula óssea. Essesnichos, onde HSC se desenvolve e a diferenciação éregulada, compreendem seios revestidos com endotélio, vasosalimentadores e adipócitos, bem como uma interfaceendosteal que compreende osteoblastos ou célulasosteoblásticas. Além da sinalização célula a célula, essascélulas nicho especializadas produzem proteínas de matrizenvolvidas nas interações de célula-matriz. Assim, nessaconcretização, as partículas usadas para crescimento dascélulas tronco hematopoiéticas podem ser derivadas de umapreparação da membrana de base natural da medula óssea oupor crescimento do substrato semelhante a membrana de baseproduzido por células de sintetização da membrana de base,especificamente osteoblastos.

Células desenvolvidas de acordo com o método dainvenção podem ser removidas das partículas por qualquer umdos métodos bem conhecidos dos versados na técnica (porexemplo, por tratamento com tripsina, verseno, dispase,colagenase, hialuronidase ou combinações dos mesmos).

Em um segundo aspecto, a presente invenção provêuma população de células eucarióticas desenvolvidas por ummétodo de açodo com o primeiro aspecto da invenção.

As células eucarióticas do segundo aspecto podemser de um fenótipo maduro (por exemplo, célulasendoteliais, fibroblastos da pele, mioblastos ecardiomioblastos), porém são preferivelmente células tronco(por exemplo, embriônicas, mesenquimais de adulto ou sanguede cordão incluindo células tronco espermatogoniais ecélulas tronco hematopoiéticas). Mais preferivelmente, ascélulas eucarióticas são células tronco espermatogoniais(por exemplo, células tronco espermatogoniais selecionadasdo grupo consistindo em células tronco espermatogoniais debovinos, ovinos, eqüinos, felinos, caninos e caprinos) oucélulas tronco hematopoiéticas (por exemplo, células troncohematopoiéticas de humanos, bovinos, ovinos, eqüinos,felinos, caninos e caprinos).

Em um terceiro aspecto, a presente invenção provêuma preparação de partículas compreendendo em microesferasrevestidas, pelo menos parcialmente, em um substratosemelhante a membrana de base, onde as partículas possuemum tamanho inferior a 500 μπι.

Em um quarto aspecto, a presente invenção provê umapreparação de partículas compreendendo uma membrana de basenatural, onde as partículas possuem um tamanho inferior acerca de 500 μτη.

De modo que a natureza da presente invenção possaser mais claramente entendida, formas preferidas da mesmaserão descritas agora com referência aos exemplos nãolimitantes que se seguem.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Isolamento da membrana de base dostestículos

Testículos bovinos frescos foram obtidos de umabatedouro. Após remoção das membranas externas, o tecidocompreendendo os túbulos seminíferos foi cortado em peçasde aproximadamente 5x5x5 mm. Pepsina (0,5 mg/mLconcentração final) foi adicionada ao tecido cortado em pH2,5 em 100 mM de ácido acético e o tecido digerido entre 1e 4 dias. O tecido digerido foi então coletado porcentrifugação rápida, e lavado várias vezes com salmouratamponada em fosfato (PBS) e coletado por centrifugaçãorápida ou por assentamento. As amostras lavadas foramexaminadas por histologia usando coloração com vermelhoSírio e por imunohistologia para examinar a presença decomponentes da membrana de base usando anticorpos paralaminina e colágeno tipo IV. Vide figura 1.

Exemplo 2 - Isolamento da membrana de base dos rins

Rim bovino fresco foi obtido de um abatedouro. Apósremoção das membranas externas, o tecido compreendendo osglomérulos foi dividido em peças de aproximadamente 5 χ 5 χmm e tratado de acordo com o procedimento fornecido noExemplo 1.

Exemplo 3 - Isolamento da membrana de base dopulmão

Pulmão bovino fresco foi obtido de um abatedouro.Após remoção dos tecidos estranhos incluindo os tubosbrônquicos principais, o tecido compreendendoprincipalmente o tecido alveolar foi dividido em peças deaproximadamente 5x5x5 mm e tratado para isolamento daspartículas da membrana de base de acordo com o procedimentofornecido no Exemplo 1.

Exemplo 4 - Isolamento alternativo da membrana debase dos testículos

Testículo bovino fresco foi obtido de umabatedouro. Após remoção das membranas externas, o tecidocompreendendo o túbulo seminífero foi dividido em peças deaproximadamente 5x5x5 mm e foi macerado em um crivo deaço inoxidável para romper o tecido e liberar as célulascom irrigação contínua com PBS, incluindo um coquetelinibidor da protease. Os túbulos foram retidos no crivo.

Amostras simples foram suspensas no coquetel inibidor daprotease contendo PBS em excesso e lavadas e coletadas porassentamento 3 vezes. As amostras lavadas foram examinadaspor histologia usando coloração com vermelho Sírio e porimunohistologia para examinar a presença de componentes damembrana de base usando anticorpos para laminina e colágenodo tipo IV.

Exemplo 5 - Isolamento alternativo da membrana debase do rim

Rim bovino fresco foi obtido de um abatedouro. Apósremoção das membranas externas, o tecido compreendendo oglomérulo foi dividido em peças de aproximadamente 5 χ 5 χ5 mm e tratado de acordo com o procedimento fornecido no

Exemplo 4.

Exemplo 6 - Isolamento alternativo da membrana debase do pulmão

Pulmão bovino fresco foi obtido de um abatedouro.Após remoção dos tecidos estranhos incluindo os tubosbrônquicos principais, o tecido compreendendo

principalmente o tecido alveolar foi dividido em peças deaproximadamente 5x5x5 mm e tratado para isolamento daspartículas da membrana de base de acordo com o procedimentofornecido no Exemplo 4.

Exemplo 7 - Isolamento da membrana de base dostecidos

Tecido de testículos, rim ou pulmão fresco foiobtido de um abatedouro e preparado em peças de 5 χ 5 χ 5mm conforme descrito nos exemplos 1,2,3. 0 tecido damembrana de base foi preparado conforme descrito no Exemplo4, exceto que 0,1% Triton X-IOO (ou desosicoloato de sódioa 1 ou 25 mM de glicosídeo de N-octila) foi adicionado àPBS e soluções de coquetel de protease. Nas duas lavagensfinais, o detergente foi omitido.

Exemplo 8 - Isolamento da membrana de base domúsculo

Músculo esqueletal bovino fresco foi obtido de umabatedouro. Após remoção de qualquer tecido adiposo efibroso, o tecido foi dividido em peças de aproximadamente8x8 mm e tratado por imersão em glutaraldeído a 25% em100 mM de tampão fosfato neutro, pH 7,3 por 80 horas. 0tecido fixo foi então encharcado com agitação em NaOH a 10%peso/volume. 0 tecido fixado, tratado com álcali foi entãoimerso em água em excesso que foi trocada a cada 24 horaspor 1 semana, enquanto evitando qualquer tratamentomecânico áspero. 0 tecido da membrana de base ligado porcruzado, intacto, que formou um material semelhante aesponja aberto foi examinado por microscopia de varredurade elétron e histologia.

Exemplo 9 - Derivação das partículas da membrana debase

Amostras da membrana de base, isoladas, porexemplo, por um dos métodos fornecidos nos Exemplos 1-8,foram fragmentadas adicionalmente usando ação mecânica poremprego de um misturador Ultra Turrax (IKA Werke,Alemanha). A suspensão resultante foi examinada pormicroscopia para determinar o tamanho da partícula queestava presente. Foi observado que as partículas possuemuma dimensão máxima de 500 μιη. Vide figura 2.

Exemplo 10 - Derivação alternativa das partículasda membrana de base

Amostras da membrana de base isoladas, por exemplo,pelos métodos fornecidos nos Exemplos 1-8 foramfragmentadas adicionalmente por congelamento em nitrogêniolíquido e pulverizadas por ação mecânica, tal como, ouequivalente a um pilão. Após evaporação do nitrogêniolíquido, as partículas foram trazidas para temperaturaambiente em um ambiente seco e foram examinadas pormicroscopia para determinar qual o tamanho de partícula queestava presente. Foi observado que as partículas tivessemuma dimensão máxima de 500 μπι.

Exemplo 11 - Derivação alternativa adicional daspartículas da membrana de base

Amostras da membrana de base, isoladas, porexemplo, por um dos métodos fornecidos nos Exemplos 1-8,foram fragmentadas adicionalmente usando ação mecânica poremprego de um dispositivo de cavitação de gás (nitrogêniolíquido). As partículas resultantes foram examinadas pormicroscopia para determinar o tamanho das partículas. Foiobservado que as partículas tivessem uma dimensão máxima de500 μπι.

Exemplo 12 - Fracionamento das partículas damembrana de base

As partículas da membrana de base, produzidas pelosmétodos, tais como são descritos nos Exemplos 9-11, podemser fracionadas para fornecer partículas do tamanhodesejado por uso de crivos de malha de tamanho apropriado.

Por exemplo, a produção de partículas possuindo umadimensão máxima média de cerca de 100 μπι, as partículaspodem ser fracionadas por passagem em série através de umcrivo de 14 0 μπι e a retenção de partículas por um crivo de70 pm. A consistência do produto pode ser examinada pormicroscopia.

Exemplo 13 - Fracionamento alternativo daspartículas da membrana de baseAs partículas da membrana de base, produzidas pelosmétodos, tais como são descritos nos Exemplos 9-11, podemser fracionadas para fornecer partículas do tamanhodesejado deixando que as partículas assentem da PBS emexcesso e seleção das frações aquosas durante oassentamento. As partículas podem então ser coletadas porcentrifugação rápida. A consistência do produto pode serexaminada por microscopia.

Exemplo 14 - Cultivo das células troncoespermatogoniais sobre partículas da membrana de base

Partículas da membrana de base, preparadas deacordo com os métodos fornecidos nos exemplos 12-13 foramusadas como substratos de cultivo de célula. A dimensãomáxima, média das partículas foi de 100 μπι. A preparação,enriquecida nas células tronco espermatogoniais a partir detestículos bovinos frescos em DMEM/Fl2-soro fetal debezerro a 10% (Gibco, USA; JRH Biosciences, USA) contendopenicilina a 1% (Gibco, USA) e estreptomicina (Gibco, USA)foi adicionada às partículas e as células foram deixadasanexar por 4 horas, com agitação intermitente. Aspartículas semeadas foram então cultivadas em um sistema decultura giratório contínuo (Techne, USA), usando umadensidade inicial de partículas de 5 χ IO5 células/150 mgem meio de 50 mL. Vide figura 3.

Exemplo 15 - Cultivo das células de Sertoli sobrepartículas da membrana de base

Partículas da membrana de base, preparadas deacordo com os métodos fornecidos nos exemplos 12-13 foramusadas como substratos de cultivo de célula. A dimensãomáxima, média das partículas foi de 100 μπι. A preparação decélulas de Sertoli a partir de testículos bovinos frescosou uma linhagem de célula TM4 (American Culture Collection;CRL-1715) em DMEM/F12-soro fetal de bezerro a 10% contendopenicilina a 1% (Gibco, USA) e estreptomicina (Gibco, USA)foi adicionada às partículas e as células foram deixadasanexar por 4 horas, com agitação intermitente. Aspartículas semeadas foram então cultivadas em um sistema decultura giratório contínuo descrito no Exemplo 14.

Exemplo 16 - Cultivo de células endoteliais sobrepartículas da membrana de base

Partículas da membrana de base, preparadas deacordo com os métodos fornecidos nos exemplos 12-13 foramusadas como substratos de cultivo de célula. A dimensãomáxima, média das partículas foi de 100 pm. A preparação decélulas endoteliais isoladas da veia umbilical humana emmeio M199 (Gibco, USA) e soro fetal de bezerro a 10% (JRHBiosciences, USA) contendo penicilina a 1% e estreptomicinacom ECGS (suplemento de crescimento celular endotelial, 60pg/mL) (ECGS; Sigma, USA) (Gibco, USA) foi adicionada àspartículas e as células foram deixadas anexar por 4 horas,com agitação intermitente. As partículas semeadas foramentão cultivadas em um sistema de cultura giratóriocontínuo, conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 17 - Cultivo das células mesenquimais sobrepartículas da membrana de base

Partículas da membrana de base, preparadas deacordo com os métodos fornecidos nos exemplos 12-13 foramusadas como substratos de cultivo de célula. A dimensãomáxima, média das partículas foi de 100 μπι. A preparaçãodas células tronco mesenquimais em DMEM/F12-soro fetal debezerro a 10% contendo penicilina a 1% e estreptomicina foiadicionada às partículas e as células foram deixadas anexarpor 4 horas, com agitação intermitente. As partículassemeadas foram então cultivadas em um sistema de culturagiratório contínuo, conforme descrito no Exemplo 14.

Exemplo 18 - Produção de um substrato semelhante amembrana de base sobre microesferas usando célulasendoteliais

Células endoteliais, derivadas da veia umbilicalhumana foram adicionadas a 3 microesferas Cytodex de 175 μιτι(Amersham Pharmacia Biotech, Suécia) e deixadas anexar porquatro horas com agitação intermitente. As células ligadasa microesfera foram então cultivadas em um sistema decultura giratório contínuo em meio M199 (Gibco, USA) e sorofetal de bezerro a 10% contendo penicilina a 1% eestreptomicina e ECGS (suplemento de crescimento celularendotelial, 60 μg/mL) (Sigma) com adição diária deascorbato de sódio a uma concentração final de 0,05 mg/mL.

Após cinco dias as microesferas, que estavam agorarevestidas em um substrato semelhante a membrana de baseforam isoladas e as células destacadas por tratamento comsolução de amônia diluída. Opcionalmente, o substratosemelhante a membrana de base foi estabilizado portratamento com glutaraldeído a 0,1% ou outro sistema defixação. Vide figura 4.

Exemplo 19 - Produção de um substrato semelhante amembrana de base sobre microesferas usando células deSertoli

Células de Sertoli, uma linha de células TM4(American Tissue Culture Collection; CRL-1715) foramadicionadas as microesferas Cultispher-S de 260 μπι (faixade 13 0 a 380 μπι) (Sigma, USA) e deixadas anexar por 4 horascom agitação intermitente. As células de ligação àmicroesfera foram então cultivadas em um sistema de culturagiratório continuo em DMEM-F12 contendo soro fetal debezerro a 10% contendo penicilina a 1% e estreptomicina comadição diária de ascorbato de sódio. Após 5 dias, asmicroesferas que estavam agora revestidas em um substratosemelhante a membrana de base, foram isoladas e as célulasdestacadas por tratamento com solução de amônia diluída.Opcionalmente, o substrato semelhante a membrana de basefoi estabilizado por tratamento com glutaraldeído a 0,1% ououtro sistema de fixação. Vide figura 5.

Exemplo 20 - Produção de vim substrato semelhante àmembrana de base sobre microesferas reabsorvíveis usandocélulas de Sertoli

Células de Sertoli, como linhagem de célula TM4(American Tissue Culture Collection; CRL-1715) foramadicionadas às microesferas PLGA. As microesferas PLGAforam fabricadas por um processo de emulsão. Isto é, umasolução a 10% (peso/volume) de PLGA em diclorometano foiemulsionada em uma solução aquosa contendo álcool(poli)vinilico a 1% (peso/volume) por agitação. Asmicroesferas de PLGA foram deixadas assentar e foramlavadas 5 vezes com água por decantação. As microesferastransparentes, de forma redonda, foram finalmentefracionadas usando crivos com um tamanho de 47 μτη e 210 μτη,respectivamente. A dimensão máxima média das microesferasde PLGA classificadas era de cerca de 125 μπι (faixa de 47 a210 μπι) . As células foram deixadas anexar por 4 horas comagitação intermitente. As células ligadas à microesferaforam então cultivadas em um sistema de cultura degiratório contínuo em DMEM-F12 contendo soro fetal debezerro a 10% contendo penicilina a 1% e estreptomicina comadição diária de ascorbato de sódio. Após 5 dias, asmicroesferas que estavam agora revestidas no substratosemelhante a membrana de base, foram isoladas e as célulasdestacadas por tratamento com solução de amônia diluída.

Opcionalmente, o substrato semelhante a membrana de basefoi estabilizado por tratamento com glutaraldeído a 0,1% ououtro sistema de fixação.

Exemplo 21 - Produção de um substrato semelhante amembrana de base sobre microesferas usando osteoblastos

Células osteoblasto, tanto como isolados primáriosda medula óssea quanto como uma linhagem de célulaestabelecida foram adicionadas às microesferas Cultispher-Sde 260 μπι (faixa de 130 a 380 μπι) (Sigma, USA) e deixadasanexar por 4 horas com agitação intermitente. As célulasligadas à microesfera foram então cultivadas em um sistemade cultura de giratório contínuo em DMEM-F12 contendo sorofetal de bezerro a 10% contendo penicilina a 1% eestreptomicina com adição diária de ascorbato de sódio.

Após 5 dias, as microesferas que estavam agora revestidasno substrato semelhante a membrana de base, foram isoladase as células destacadas por tratamento com solução deamônia diluída. Opcionalmente, o substrato semelhante amembrana de base foi estabilizado por tratamento comglutaraldeído a 0,1% ou outro sistema de fixação.

Exemplo 22 - Crescimento das células troncoespermatogoniais sobre microesferas revestidas com iamsubstrato semelhante a membrana de base

Células tronco espermatogoniais, isoladas detestículos bovinos frescos foram semeadas sobremicroesferas Cultispher com um substrato semelhante amembrana de base, preparado de acordo com o exemplo 19 ecultivados em um sistema de cultura giratório contínuo emDMEM-F12 contendo soro fetal de bezerro a 10% contendopenicilina a 1% e estreptomicina. O crescimento celular foimonitorado por microscopia.

Exemplo 23 - Crescimento de células troncohematopoiéticas sobre microesferas revestidas com umsubstrato semelhante a membrana de base

Células tronco hematopoiéticas (HSC) , isoladas demedula óssea humana fresca, foram semeadas sobremicroesferas Cultispher revestidas com substrato semelhantea membrana de base, preparado de acordo com o Exemplo 21, ecultivadas em um sistema de cultura giratório contínuo emDMEM-F12 contendo soro fetal de bezerro a 10% contendopenicilina a 1% e estreptomicina. O crescimento celular foimonitorado por microscopia.

Através de todo esse relatório descritivo a palavra"compreende" ou variações, tais como, "compreendendo" serãoentendidas como implicando na inclusão de um elementodeclarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos,inteiros ou etapas, porém não a exclusão de qualquer outroelemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteirosou etapas.

Todas as publicações mencionadas nesse relatóriodescritivo são incorporadas aqui como referência. Qualquerdiscussão dos documentos, normas, materiais, dispositivos,artigos ou semelhantes que foram incluídos no presenterelatório descritivo se destina ao fim de prover umcontexto para a presente invenção. Isso não deve ser tidocomo uma admissão de que quaisquer ou todas essas matériasfaçam parte da base da técnica anterior ou que fossem doconhecimento geral no campo relevante da presente invençãocomo já existindo na Austrália ou qualquer outro lugar,antes da data de prioridade de cada reivindicação dessepedido. Será apreciado pelos versados na arte que inúmerasvariações e/ou modificações podem ser feitas a invençãoconforme mostrado nas modalidades específicas, sem fugir doespírito ou escopo da invenção conforme descritaamplamente. As presentes modalidades devem ser, portanto,consideradas em todos os aspectos como ilustrativas e nãorestritivas.

REFERÊNCIAS

1. Brinster, RL e outros, Spermatogenesis followingmale germ-cell transplantation, The Proceedings of theNational Academy of Science USA, 91:11298-11302 (1994).

2. Enders, GC e outros, Sertoli Cell Binding toIsolated Testicular Basement Membrane, The Journal of CellBiology, 103:1109-1119 (1986).

3. Ogawa, T e outros, Transplantation of male germcell Iine stem cells restores fertility in infertile mice,Nature Medicine, 5:29-34 (1999).

4. van der Wee, K and Hofmann, MC, An in vitroTubule Assay Identifies HGF as a Morphogen for theFormation of Seminiferous Tubules in the Postnatal MouseTestis, Experimental Cell Research, 252:175-185 (1999).

Claims (37)

1. Método para suporte do crescimento in vitro deum ou mais tipos de células eucariõticas, o métodocaracterizado por compreende:semeadura das células do(s) tipo(s) de célulassobre partículas compreendendo membrana de base ou umsubstrato semelhante a membrana de base, ecultivo das células semeadas in vitro sob condiçõesapropriadas para expansão das células semeadas,onde as partículas são inferiores a um tamanho decerca de 5 00 μπι.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato das partículas possuírem um tamanhomédio na faixa de cerca de 50 μπι a 4 00 μπι.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato das partículas possuírem um tamanhomédio de cerca de 100 μπι.

4. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato daspartículas compreenderem uma membrana de base natural.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato da membrana de base natural serderivada de túbulos seminíferos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato da membrana de base natural serderivada de um tecido de massa óssea ou a interface demedula óssea/osso.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato da membrana de base natural serderivada de tecido selecionado do grupo consistindo emvasos sangüíneos, tecido perivascular, placenta, pulmão epele.

8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato daspartículas compreenderem um substrato semelhante a membranade base compreendendo uma rede de moléculas de interaçãoordenadas consistindo em pelo menos colágeno do tipo IV elaminina.

9. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 8, caracterizado por compreenderainda a preparação das partículas nas quais as células sãosemeadas, a preparação compreendendo anexação sobre asmicroesferas apropriadas, de células de sintetização damembrana e cultura das células ligadas as microesferas sobcondições apropriadas para a expressão e secreção dosconstituintes da membrana de base, para dessa formaproduzir partículas compreendendo microesferas revestidas,pelo menos parcialmente, em um substrato semelhante àmembrana de base.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato das células de sintetização damembrana de base serem destruídas ou removidas aspartículas antes das células serem semeadas.

11. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato dosubstrato semelhante a membrana de base ser estabilizado.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato do substrato semelhante a membranade base ser estabilizado por tratamento com um agente defixação selecionado de glutaraldeído e ribose.

13. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato dascélulas de sintetização da membrana de base serem co-cultivadas com as células a serem desenvolvidas.

14. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelofato das células de sintetização da membrana de base sãoselecionadas do grupo consistindo nas células endoteliais,ceratinócitos, células de Schawnn, células de Sertoli,osteoblastos e combinações das mesmas.

15. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou-14, caracterizado pelo fato do cultivo das células semeadasser conduzido em um bioreator.

16. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14 ou 15, caracterizado pelo fato das células semeadasserem de um fenótipo maduro.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato das células semeadas seremselecionadas do grupo consistindo nas células endoteliais,fibroblastos de pele, mioblastos e cardiomioblastos.

18. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14 ou 15, caracterizado pelo fato das células semeadasserem de um fenótipo primitivo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato das células semeadas seremselecionadas do grupo consistindo nas células troncoembriônicas, células tronco mesenquimais adultas e célulassangüíneas de cordão.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato das células semeadas serem célulastronco espermatogoniais.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato das células semeadas serem célulastronco hematopoiéticas.

22. Método de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fatodas células de sintetização da membrana de base seremcélulas de Sertoli e das células semeadas serem célulastronco espermatogoniais.

23. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fatodas células de sintetização da membrana de base seremosteoblastos e das células semeadas serem células troncohematopoiéticas.

24. População de células eucarióticas,caracterizada por ser desenvolvida por um método de acordocom qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,-9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23.

25. Preparação de partículas, caracterizada porcompreender microesferas revestidas, pelo menosparcialmente, em um substrato semelhante a membrana debase, onde as partículas possuem um tamanho inferior acerca de 500 μπι.

26. Preparação, de acordo com a reivindicação 25,caracterizada pelo fato das partículas possuírem um tamanhomédio na faixa de cerca de 50 μπι a 400 μτη.

27. Preparação, de acordo com a reivindicação 25 ou-26, caracterizada pelo fato das partículas possuírem umtamanho médio de cerca de 100 μτη.

28. Preparação, de qualquer uma das reivindicações-25, 26 ou 27, caracterizada pelo fato do substratosemelhante a membrana de base compreender uma rede demoléculas de interação ordenadas consistindo em pelo menoscolágeno do tipo IV e laminina.

29. Preparação, de qualquer uma das reivindicações-25, 26, 27 ou 28, caracterizada pelo fato das partículasserem preparadas por um processo compreendendo anexaçãosobre microesferas apropriadas, de células de sintetizaçãoda membrana de base e cultivo das células ligadas amicroesfera sob condições apropriadas para a expressão esecreção das proteínas da membrana de base.

30. Preparação, de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato das células de sintetização damembrana de base serem células de Sertoli.

31. Preparação, de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato das células de sintetização damembrana de base serem osteoblastos.

32. Preparação de partículas compreendendo umamembrana de base natural, caracterizada pelo fato daspartículas possuírem um tamanho inferior a cerca de 500 μτη.

33. Preparação, de acordo com a reivindicação 32,caracterizada pelo fato das partículas possuírem um tamanhomédio na faixa de cerca de 50 μτη a 4 00 μτη.

34. Preparação, de acordo com a reivindicação 32 ou-33, caracterizada pelo fato das partículas possuírem umtamanho médio de cerca de 100 μπι.

35. Preparação de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32, 33 ou 34, caracterizada pelo fato damembrana de base natural ser derivada de túbulosseminíferos.

36. Preparação de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32, 33 ou 34, caracterizada pelo fato damembrana de base natural ser derivada de tecido da medulaóssea ou a interface de medula óssea/osso.

37. Preparação de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32, 33 ou 34, caracterizada pelo fato damembrana de base natural ser derivada de um tecidoselecionado do grupo consistindo em vasos sangüíneos,tecido perivascular, placenta, pulmão e pele.