BRPI0611332A2 - processo de obtencão de uma cepa mutante de bactéria láctica, referida cepa, fermento láctico, processo de preparacão de um produto de leite fermentado, e referido produto de leite fermentado - Google Patents

Abstract

PROCESSO DE OBTENcãO DE UMA CEPA MUTANTE DE BACTéRIA LáCTICA, REFERIDA CEPA, FERMENTO LáCTICO, PROCESSO DE PREPARAcãO DE UM PRODUTO DE LEITE FERMENTADO, E REFERIDO PRODUTO DE LEITE FERMENTADO. A presente invencao é relativa a cepas de bactérias lácticas nas quais a histidina fosforilável do domínio lIA da lactose permease é substituida por um ácido aminado nóo fosforilável. Essas cepas possue uma pos- acidificacao reduzida e sao utilizáveis notadamente para a preparacao de produtos do leite fermentados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE OB-TENÇÃO DE UMA CEPA MUTANTE DE BACTÉRIA LÁCTICA, REFERIDA CEPA,FERMENTO LÃCTICO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM PRODUTO DELEITE FERMENTADO, E REFERIDO PRODUTO DE LEITE FERMENTADO".

A presente invenção refere-se ao domínio da fermentação doleite. Mais precisamente, essa invenção se refere aos novos mutantes destreptococcus thermophilus expressando uma Iactose permease mutante,cuja atividade de transporte da Iactose é modificada. Essas cepas e fermen-tos que as compreendem podem ser utilizados para a obtenção de produtosdo leite fermentados, possuindo boas propriedades de conservação.

Os iogurtes (ou yoghourts) são tradicionalmente obtidos por fermen-tação do leite com uma associação de diferentes bactérias lácticas, escolhidasdentre as cepas de streptococcus thermophilus e de Lactobacillus bulgaricus. Nodecorrer da fermentação que é feita a uma temperatura de aproximadamente 40 a45°C, essas bactérias utilizam principalmente a lactose como substrato energético,e produzem o ácido láctico que acarreta a coagulação do leite; quando o pH atingeum valor de aproximadamente 4,8 a 4,5, coloca-se fim a essa etapa de fermenta-ção (também denominada "acidificação"), resfriando-se o produto. Este é em se-guida mantido no frio durante a seqüência do processo de fabricação e de acondi-cionamento, e até seu consumo.

Todavia, o resfriamento não pára completamente a fermentaçãoláctica; mesmo quando o produto é mantido a 4°C, observa-se um aumentoprogressivo de sua acidez no decorrer do tempo.

Esse fenômeno, conhecido pelo nome de pós-acidificação, éresponsável por uma degradação das qualidades organolépticas do produtodurante sua conservação.

A pós-acidificação resulta essencialmente da utilização, pelasbactérias, da Iactose restante no produto oriunda da etapa de acidificaçãocontrolada. Para evitá-la, foi proposta a utilização de cepas de bactérias lác-ticas que não fermentam, ou fermentam muito pouco, a lactose.

As enzimas essenciais para a fermentação da lactose no strep-tococcus thermophilus e Lactobacillus bulgaricus são codificadas pelo opé-ron lactose, que contém o gene IacS, codificando para a Iactose permease, eo gene LacZ, codificando pafa a β-galactosidase. Essas proteínas são res-pectivamente responsáveis pelo transporte e pela hídrólise da lactose. Foiportanto proposto, para serem obtidas cepas não pós-acidificantes de bacté-rias lácticas, produzir variantes artificiais, ou selecionar mutantes naturais,nos quais a atividade de pelo menos uma dessas enzimas era afetada.

A Patente EP 1078074 (Compagnie Gervais Danone) se refereaos mutantes de Lactobacillus bulgaricus deficientes em atividade β-galac-tosidase, compreendendo uma mutação non-sens em pelo menos um dosgenes do opéron lactose. Essa patente descreve mais especificamente ummutante, cuja análise faz aparecer duas mutações pontuais: uma, introdu-zindo um códon de terminação no gene da β-galactosidase, que induz a in-capacidade desse mutante a utilizar a lactose; a outra mutação induz umamudança de ácido aminado ao nível do gene da permease (Lys -> Asn emposição 122); EP 1078074 não relata nenhum efeito dessa mutação sobre ofenótipo do mutante.

W00188150 descreve mutantes de uma cepa de Lactobacillus.Esses mutantes são incapazes de utilizar a lactose, mas conserva, a capaci-dade de expressar a β-galactosidase. W00188150 não precisa a naturezaou a posição da mutação referida, e indica simplesmente que ela pode sesituar em um dos genes de estrutura do opéron lactose, por exemplo a per-mease, ou em uma região de regulagem do opéron lactose, ou em um geneque intervém no controle da expressão do opéron lactose.

Os mutantes descritos nos documentos citados acima têm emcomum a propriedade de serem completamente incapazes de utilizarem alactose. Eles só podem crescer sobre leite, se este for complementado comum açúcar diferente da lactose, geralmente glicose. As propriedades de aci-dificação e de pós-acidificação desses mutantes são controladas pela quan-tidade de glicose acrescentada.

A fim de fornecer uma alternativa a esses mutantes, os invento-res pesquisaram, se era possível obter cepas de bactérias lácticas tendo,por um lado, uma capacidade de utilizar a lactose durante seu crescimentocomparável àquele das cepas selvagens, e, por outro lado, uma aptidão res-trita à utilização de Iactose no decorrer da fase estacionária, de forma a di-minuir ou abolir o fenômeno de pós-acidificação. Com essa finalidade, elesse interessaram pela possibilidade de agir sobre a regulagem do transporteda lactose nas células de bactérias lácticas, e notadamente nas células destreptococcus thermophilus.

O transporte da Iactose extracelular em células de streptococcusthermophilus é feito por intermédio da Iactose permease LacS. Esse trans-porte da Iactose é feito em symport com um próton, ou em antiporo com agalactose intracelular resultante da degradação da lactose.

O transporte da lactose é dependente de dois fenômenos: porum lado, o estado de fosforilação da lactose permease e, por outro lado, aexpressão do gene LacS, codificando para essa lactose permease. Essesdois aspectos são detalhados abaixo.

Fosforilação da lactose permease

A proteína LacS é composta de um domínio de translocação ede um domínio de regulagem (IIA). Esses domínios contêm diferentes resí-duos histidina, cuja fosforilação intervém na regulagem do transporte de lac-tose. Notadamente, o domínio IIA é fosforilável sobre a histidina 552. Essafosforilação é feita pela proteína HPr (histidina-containing phosphocarrierprotein), ela própria previamente fosforilada.

HPr pode ser fosforilada:

- sobre uma serina por uma proteína quinase ATP dependente; areação inversa de hidrólise de HPr(Ser-P) é catalisada por uma atividadefosfatase (HPr(Ser-P) fosfatase);

- sobre uma histidina HPr(His-P)1 por um grupamento fosforilaproveniente do fosfenolpiruvato, e por intermédio da enzima I (El).

Só a forma de HPr fosforilada sobre a histidina permite a fosfori-lação da lactose permease sobre a histidina 552.

Foi observado, sobre um modelo in vitro de proteolipossomasreconstituindo o meio ambiente membranário da proteína LacS e sua fosfori-lação por HPr(His-P), que essa fosforilação não tem efeito sobre o transpor-te da Iactose em symport com um próton (Gunnewijk and Poolman, 2000a),mas aumenta de um fator 2 aproximadamente, o fluxo da troca Iacto-se/galactose.

Transcrição do gene IacS

A transcrição do opéron Iactose é induzida pelo crescimento emmeio lactosado. O promotor dos genes IacS e Z contém um portal cre (cata-bolite responsive element) que permite uma regulagem por CcpA : CcpA re-prime a expressão de IacS e de IacZ. CcpA tem, ao contrário, um efeito ati-vador sobre a transcrição do gene codificando para a Iactato desidrogenase(vanden Bogaardetal., 2000).

A forma HPr(Ser-P) é capaz de interagir com CcpA. Essas prote-ínas juntas irão permitir formar um complexo com cre, o que acarreta umarepressão da transcrição do gene LacS (Jones et a\., 1997).

Foi observado (Gunnewijk and Poolman, 2000b) que a formaHPr(Ser-P) é dominante no começo da fase exponencial de crescimento dasculturas de streptococcus thermophilus e diminui no decorrer desta, enquan-to que a forma HPr(His ~P) aparece no decorrer da fase exponencial e émáxima à entrada em fase estacionária. A passagem de HPr(Ser-P) a H-Pr(His-P) é feita em paralelo da diminuição da Iactose do aumento da galac-tose no meio de cultura, e um aumento muito grande da expressão da Iacto-se permease.

Assim, o estado de fosforilação da proteína HPr parece exercerum papel na regulagem do transporte da lactose, compensando a diminuiçãoda lactose no meio, através de, por um lado, o nível de expressão da proteí-na LacS e, por outro lado, a regulagem de sua atividade.

Com base nas observações relatadas acima, Gunnewijk e Pool-man propuseram o seguinte modelo: quando a lactose é abundante no meio,a expressão do gene IacS é reprimida pelo complexo HPr(Ser-P)/CcpA. Nodecorrer da fermentação, o acúmulo de galactose no meio e a diminuição dalactose disponível provocam uma diminuição da capacidade da bactéria afazer penetrar a lactose (e, portanto, uma diminuição da acidificação do meio).

Essa diminuição acarreta uma baixa da atividade glicolítica, e uma queda daconcentração em ATP, assim como uma alta da concentração em fosfatoinorgânico, acarretando uma baixa da atividade de HPr(Ser-P) quinase emproveito da atividade de HPr(Ser-P) fosfatase, o que teria por efeito a dimi-nuição da concentração em HPr(Ser-P). Essa diminuição da concentraçãoem HPr(Ser-P) permite levar a repressão catabólica do gene IacS e, porconseguinte, aumentar a produção de Iactose permease. Paralelamente, oaumento de HPr(His-P) permitiria aumentar a fosforilação da Iactose per-mease sobre a histidina 552 e, portanto, a capacidade de transporte da Iac-tose por antiport com a galactose.

Esse modelo, sugerindo que a fosforilação da Iactose permeasesobre a histidina 552 por HPr(His-P) aumenta o fluxo de Iactose nas células,quando a quantidade de substrato no meio diminui, permite supor que a aci-dificação em fim de fase exponencial poderia ser diminuída, caso se impe-disse essa fosforilação. Todavia, ele é baseado em parte em experiências invitro, e não permite pré-julgar a parte real in vivo do aumento da fosforilaçãoda Iactose permease, em relação ao aumento de sua expressão, na impor-tação da Iactose in vivo. Além disso, as observações referentes aos efeitosda concentração em HPr(Ser-P) e HPr(His-P) sobre o aumento da expres-são e da fosforilação de LacS foram feitas sobre bactérias em fase exponen-ciai ou em começo de fase estacionária; nenhuma indicação é fornecida noque se refere às concentrações dessas duas formas de HPr em estágiosmais avançados da fase é acionária.

As únicas informações disponíveis quanto ao efeito da ausênciade fosforilação de LaeS sobre a histidina 552 são fornecidas em uma publi-cação de Poolman et al. (Poolman et al., 1992), que descreve diferentesplasmídeos contendo a seqüência codificando para a enzima LacS de strep-tococcus thermophilus, mutada sobre diferentes resíduos histidina. Essesplasmídeos são utilizados para transformar uma cepa de E.coli na qual ogene lacS endógeno foi previamente deletado. O transporte da Iactose nascepas transformadas pelos diferentes mutantes é avaliado em relação àque-le observado na mesma cepa de E.coli contendo um plasmídeo codificandopara a enzima LacS selvagem de streptococcus thermophilus. Nenhuma di-ferença significativa foi observada no que se refere ao mutante H552R, noqual a histidina

Nativa é substituída por um arginina. Poolman et al. atribuemesse resultado seja à ineficácia da fosforilação da enzima LacS selvagem destreptococcus thermophilus por HPr(His-P) de E.coli, seja ao fato de essafosforilação não exercer papel no transporte da lactose.

Os inventores pesquisaram, todavia, se uma mutação prevendoa fosforilação de LacS sobre o resíduo histidina poderia ter um efeito sobreas propriedades de acidificação e de pós-acidificação da bactéria mutante.

Eles escolheram para esse estudo uma cepa industrial de strep-tococcus thermophilus. Essa cepa, depositada na CNCM em 12 de dezem-bro de 2002, sob o número I-2967, permite obter produtos leiteiros fermenta-dos tendo uma textura interessante; todavia, essa cepa leva a uma pós aci-dificação importante.

Os inventores produziram e caracterizaram um mutante dessacepa, expressando, no local da lactose permease selvagem, uma lactosepermease mutada, não fosforilável sobre a histidina 552.

Constataram que essa cepa mutante possuía uma curva de aci-dificação diferente daquela da cepa mãe. A acidificação aciona mais Ienta-mente no caso do mutante que naquele da cepa mãe, e velocidade máximade acidificação do mutante é menos elevada. Todavia, um pH equivalente éalcançado ao cabo de 6 horas de fermentação para as duas cepas. É aonível da pós-acidificação que a diferença entre as duas cepas é a mais níti-da. Nas mesmas condições de conservação (28 dias de conservação a100C), o ΔρΗ (diferença entre o pH no DO e o pH no D28) é da ordem de 0,6no caso da cepa mãe, e da ordem de 0,4 no caso da cepa mutante. Essadiferença de pós-acidificação não provém de uma diferença a nível da so-brevida das bactérias. Esta é com efeito equivalente para as duas cepas.

Além disso, os produtos fermentados obtidos com o mutante apresentam asmesmas qualidades de textura que aqueles obtidos com a cepa mãe.

A presente invenção se refere, portanto, em primeiro lugar, a umprocesso de obtenção de uma cepa mutante de bactéria láctica, possuindouma pós-acidificação mais fraca do que a cepa mãe, da qual ela é oriunda,caracterizado pelo fato de se introduzir no ADN genômico, notadamente noADN cromossômico, dessa cepa mãe, uma mutação do códon codificandopara a histidina fosforilável por HPr(His-P) do domínio IIA da Iactose perme-ase, essa mutação induzindo a substituição dessa histidina por um ácidoaminado não fosforilável.

De acordo com um modo de realização preferido da presenteinvenção, essa cepa é uma cepa de streptococcus thermophilus, e essa mu-tação induz a substituição da histidina em posição 552 da Iactose permeasepor um ácido aminado não fosforilável.

Esse ácido aminado não fosforilável pode ser qualquer ácidoaminado, com exceção da serina, da tirosina, da histidina e da treonina. Depreferência, será escolhida a alanina.

Vantajosamente, o códon codificando para a histidina em posi-ção 552 da Iactose permease é substituído por um códon codificando parauma lanina. Essa mutação gera um local de restrição BstUI que facilita a cri-vação dos mutantes obtidos.

O processo, de acordo com a invenção, pode ser aplicado, apli-cando-se técnicas conhecidas do técnico.

O ADN mutado assim obtido é em seguida inserido em um vetorque permite a integração do gene no cromossoma bacteriano. Essa integra-ção é feita, de preferência, por recombinação do enxerto portado pelo vetorcom a região homóloga do cromossoma bacteriano.

Classicamente, se insere o ADN mutado em um vetor integrativoportanto um marcador de seção (por exemplo um gene de resistência a umantibiótico), e se introduz esse vetor nas bactérias nas quais se deseja efe-tuar a mutação. Estas são em seguida cultivadas sobre meio seletivo (porexemplo, se o marcador de seleção é um gene de resistência a um antibióti-co, em presença do antibiótico correspondente), e se recuperam as bacté-rias que são capazes de crescer nessas condições, que são aquelas queintegraram o vetor por recombinação homóloga entre o enxerto e a regiãohomóloga do cromossoma bacteriano. A estrutura integrada no cromossomaé constituída das seqüências do vetor flanqueadas, por um lado, pela se-qüência mutada proveniente do enxerto, e, por outro lado, pela seqüênciahomóloga da bactéria hospedeira.

As bactérias assim selecionadas são cultivadas sobre meio nãoseletivo, a fim de permitir a excisão das seqüências provenientes do vetor,que se efetua por recombinação homóloga entre as regiões flanqueandoessas seqüências. A metade das bactérias nas quais essa recombinaçãoocorreu contém a seqüência "selvagem" proveniente da bactéria hospedeira,e a outra metade contém a seqüência mutada proveniente do enxerto. Asbactérias que portam a mutação são em seguida selecionadas por qualquermeio apropriado. Por exemplo, se a mutação cria um local de restrição, aseleção pode ser feita com base na presença desse local de restrição emum produto de amplificação por PCR da região mutante.

Vetores integrativos estão disponíveis para numerosas bactériaslácticas. Classicamente, para uma espécie bacteriana determinada, um vetorintegrativo é um vetor que pode ser introduzido nas bactérias dessa espécie,mas que é incapaz de aí se replicar.

A título de exemplos de vetores utilizáveis como vetores integra-tivos nos streptococcus thermophilus, citar-se-ão Pgem5, Pucl 9 (Mollet etal., 1993), Pnd324 (Duan et al., 1999).

Vantajosamente, para aumentar a eficácia de transformação,pode-se utilizar como vetor integrativo um vetor de replicação condicional nabactéria escolhida. Nesse caso, as bactérias nas quais foi introduzido o vetorsão em uma primeira etapa cultivadas en condições permissivas para suareplicação, o que lhe permite se estabelecer nessas bactérias transforma-das; em uma segunda etapa as bactérias são cultivadas em condições nãopermissivas para a replicação do vetor, e pode-se, conforme no caso dosvetores integrativos clássicos, efetuar a seleção das bactérias nas quais ovetor foi integrado no cromossoma.

A título de exemplos de vetores de replicação condicional utilizá-veis como vetores integrativos em um grande número de bactérias lácticas,serão citados os vetores termoendurecíveis descritos por BISWAS et al. eMAGUIN et al (Biswas et al., 1993; Maguin et al., 1996), assim como no Pe-dido PCT WO 93/18164, ou os vetores pwv01 (Law et al., 1995) e PuCI22(Frere etal., 1998).

A invenção tem também por objeto uma cepa de bactéria lácticacapaz de ser obtida por um processo, de acordo com a invenção.

Essa cepa é caracterizada pelo fato de conter em seu ADN cro-mossômico, uma mutação do códon codificando para a histidina fosforilávelpor HPr(His-P) do domínio IIA da Iactose permease, essa mutação induzin-do a substituição dessa histidina por um ácido aminado não fosforilável.

De acordo com um modo de realização preferido da presenteinvenção, essa cepa é uma cepa de streptococcus thermophilus, na qual ogene da Iactose permease contém uma mutação, induzindo a substituiçãoda histidina em posição 552 da proteína por um ácido aminado não fosforilável.

Uma cepa de bactérias lácticas de acordo com a invenção foidepositada segundo o Tratado de Budapeste, em 10 de maio de 2004, juntoà CNCM (Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos), 25, rue duDocteur Roux, em Paris, sob o número 1-3213. Trata-se de uma cepa mutan-te de streptococcus thermophilus, derivada da cepa CNCM I-2967 (deposita-da na CNCM, em 12 de dezembro de 2002), pela introdução, por mutagêne-se dirigida, de uma mutação que substitui o códon histidina 552 por um có-don alanina.

As cepas de bactérias lácticas, de acordo com a invenção, têmdurante sua fase de crescimento uma atividade Iactose permease similaràquela da cepa mãe, da qual são oriundas. Elas possuem, portanto, capaci-dades de assimilação da Iactose e de acidificação, comparáveis àquela dacepa mãe da qual são oriundas. Ao contrário, sua atividade Iactose permea-se durante a fase estacionária é reduzida em relação àquela da cepa mãe, oque acarreta uma pós-acidificação reduzida.

Vantajosamente, as cepas de bactérias lácticas, de acordo coma invenção, são oriundas de bactérias lácticas possuindo uma atividade β-galactosidase, e conservam essa atividade. Elas podem crescer normalmen-te sobre o leite não suplementado com um açúcar diferente da lactose.

De preferência, as cepas de bactérias, de acordo com a inven-ção, são mutantes apropriados à indústria alimentícia (ou mutantes "food-grade"). Eles são vantajosamente derivados de cepas bacterianas caracteri-zadas pelo fato de apresentarem propriedades vantajosas de fermentaçãodos produtos leiteiros.

A presente invenção se refere também a um fermento láctico,compreendendo pelo menos uma cepa de bactérias, tal como descrita aci-ma. De acordo com um modo de realização particular, um fermento láctico,de acordo com a invenção, compreende pelo menos uma cepa mutanté destreptococcus thermophilus, expressando uma lactose permease, da qual ahistidina 552 foi substituída por um resíduo não fosforilável, associada a pelomenos uma outra cepa de bactéria láctica, por exemplo uma cepa de Lacto-bacillus bulgaricus, podendo eventualmente possuir também uma pós-acidificação reduzida (por exemplo resultando da mutação, de acordo com ainvenção, da lactose permease, ou resultante de uma mutação que inativa aβ-galactosidase).

Um processo de preparação de um produto leiteiro fermentado,compreendendo uma etapa no decorrer da qual se fermenta o leite com oauxílio de um fermento láctico, tal como descrito acima, faz também parteintegrante da presente invenção, assim como qualquer produto leiteiro fer-mentado, uma bebida fermentada, um quefir, um queijo ou um leite infantilfermentado.

Os exemplos experimentais que se seguem, ilustrados pelasfiguras, expõem mais em detalhes certos aspectos da presente invenção,sem, todavia, limitar-lhe o objeto.

Legenda das figuras

Figura 1: comparação da seqüência do gene IacSdo variante I-3213 com a seqüência do gene IacS da cepa mãe I-2967.

Figura 2: comparação das curvas de acidificação obtidas com omutante 1-3213 e a cepa mãe I-2967.

Figura 3: comparação das velocidades de acidificação do mutan-te 1-3213 e da cepa mãe Ι-2967.

Figura 4: seqüência da acidez Dornic no decorrer da conserva-ção dos produtos. Comparação do mutante 1-3213 e da cepa mãe I-2967.

Figura 5: princípio da medida da viscosidade η de um produto.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Produção do mutante

A cepa de partida é a cepa de streptococcus thermophilus I-2967, depositada na CNCM em 12 de dezembro de 2002.

Na seqüência do gene IacS1 o códon para a histidina 552 (a his-tidina que é fosforilável) foi substituído por um códon alanina, por dupla re-combinação. Além disso, a mutação feita (substituição do segundo nucleotí-deo do códon 522 por uma citosina, ao invés de uma adenina) criou no geneum local de restrição BstUI. Isto permitiu selecionar os clones que integra-ram a mutação desejada no gene LacS.

A estabilidade da mutação foi verificada a partir de um dos clo-nes obtidos (depositado na CNCM em 10 de maio de 2004 sob o número I-3213), por 6 repicágens sucessivas, seguidas da seqüenciação do geneLacS. A figura 1 mostra a comparação da seqüência do gene IacS do varian-te 1-3213 (SEQ ID NO: 2) com aquela do gene IacS da cepa mãe I-2967(SEQ ID NO:1). A mutação está bem presente: o códon para a histidina 552codifica daqui para a frente para uma alanina. Não há mutação indesejável,além disso, no gene IacS.

O mutante 1-3213 é apropriado à utilização agroalimentar, poisnão contém nenhuma seqüência residual do plasmídeo utilizado para inte-grar a mutação do gene IacS.

EXEMPLO 2: testes fisiológicos feitos sobre o mutante 1-3213

A fim de verificar que o mutante 1-3213 é menos pós-acidificanteque a cepa mãe I-2967, produtos são fabricados em cepa pura e são acom-panhados até J+28: acidificação, pós-acidificação, sobrevida, textura.

2.A - Protocolo

- revivificação das cepas por 2 transplantes

- preparação de fermentos sobre leite estéril adicionado de ex-tratos de lêvedo com incubação a 44 0C1 até uma acidez de 85°D seja atin-gida (correspondendo a 108 a 109 UFC/ml)

- inseminação de uma mistura de 120 g de pó de leite cremoso +930 ml de água + 1 g de peptona de gelatina N3 (Organotechnia), pasteuri-zado 10 minutos a 95 0C, com 1 % (v.v) de fermento

- incubação em potes em uma estufa a 44°C, até que um pH de4,65 seja atingido

- parada da fermentação, colocando os potes durante 30 minu-tos na água gelada

- conservação dos produtos durante 28 dias em câmara fria a10°C.

2.B - seqüência - Comparação da acidificação pelos mutantes em relação àcepa I-2967

2.B.1. Curvas de acidificação

Graças ao sistema CINAC (CINética de Acidificação, AllianceInstruments), o pH é medido em contínuo no decorrer do tempo. Podem-seassim obter:

- a curva de acidificação de cada cepa

- a derivada primeira em relação ao tempo, que dá a velocidadede acidificação.

2.B.2. Medida do pH

O acompanhamento da evolução do pH no decorrer da conser-vação dos produtos é feito graças a um pH-metro MP220 de Mettler Toledo.2.B.3. Medida da acidez Dornic

A medida da acidez Dornic (D°) permite titular a concentraçãomolar em íons H3O+. O número de graus Dornic corresponde ao número, emdécimos de mililitros, de solução hidróxido de sódio, à concentração 0,1 Nque são necessários para neutralizar 10,32 g de leite. A neutralidade é vi-sualizada, utilizando um indicador colorido, a fenolftaleína. Nos arredores desua zona de curva (pH 8,2), a fenolftaleína passa do incolor ao rosa. Umgrau Dornic representa 100 mg de ácido láctico por litro de leite.2.B.4. Preparação do mix para os testes produzidosÓ meio leite é reconstituído a partir de 120 g de leite em pó cre-moso (Milex 240, Arla Food Ingredients) + 930 ml de água permutada + 1 gde peptídeo N3 (Vital Armor 950, Armor 950, Armor Proteínas). O mix é mis-turado até completa homogeneização. O meio é em seguida reidratado du-rante 30 minutos à temperatura ambiente, depois pasteurizado a 95°C du-rante 10 minutos.

2.B.5. Sobrevida das cepas

As medidas de sobrevida são realizadas sobre meio gelosadoM17 sacarosado. Isolamento na superfície via um inseminador espiral(WASP de AES). Incubação a 37°C sob H2C02. Leitura após 72 horas deincubação.

As curvas de acidificação em cepas puras foram feitas em duplicata

2.B.6. Interpretação

Os resultados, apresentados nas figuras 2 e 3, mostram que omutante 1-3213 tem uma curva de acidificação mais lenta do que a cepamãe, com um efeito uréia mais pronunciada e uma velocidade máxima deacidificação mais baixa. Todavia, o pH 4,50 é atingido em 6 horas para asduas cepas.

2.C- seqüência - Comparação da pós-acidificacão do mutante 1-3213 emrelação à cepa I-2967

A figura 4 mostra os resultados do acompanhamento da acidezDornic durante a conservação dos produtos, comparando os produtos obti-dos por fermentação pelo mutante 1-3213 e pela cepa mãe I-2967.

Os resultados referentes à medida do pH imediatamente apósparada da fermentação (DO) e após 28 dias de conservação a 10°C, são a-presentados na tabela 1 abaixo.

<table>table see original document page 14</column></row><table>TABELA 1

O conjunto desses resultados confirmam que o mutante é menospós-acidificante que a cepa mãe.

2.D - seqüência. Comparação da sobrevida dos mutantes em relação à I-2967

A tabela 2 abaixo indica o número de colônias bacterianas pre-sentes em 1 ml de produto, após 28 dias de estocagem a 10°C.

<table>table see original document page 15</column></row><table>

TABELA 2

Esses resultados mostram que a sobrevida do mutante é tão boaquanto aquela da cepa mãe, após 28 dias de estocagem, seguindo a paradada fermentação.

2.E - seqüência - Comparação da textura dos produtos obtidos a partir deum mutante em comparação com aqueles obtidos a partir da cepa mãe I-2967

As medidas de textura foram feitas sobre os produtos de uma úni-ca produção. Todas as medidas foram feitas em triplo (3 potes, por medida).

Três métodos de medida da textura foram feitos sobre os produ-tos em D+7:

- Medida de penetrometria com o TAXT2 (IO0C)

- Medida de escoamento após mistura manual sobre o Rhéomat260 (4°C)

- Medida de viscosidade sobre o soro, após centrifugação sobreo MCR300 (20°C).

Essas diferentes técnicas de medida da textura são detalhadasabaixo.

2.E.1 - Medida de viscosidade sobre o soro dos produtos firmes

O interesse por esse método consiste em analisar o soro dosprodutos firmes, a fim de confirmar as caracterizações reológicas dos leitesfermentados pelas cepas.

Esse método de análise permite em uma primeira etapa recupe-rar o soro dos produtos firmes. Para isso, uma quantidade de produto, apro-ximadamente 50 g, é centrifugada a 631 g durante 10 minutos à temperaturaambiente, o que permite coletar o soro presente no interior do gel dos leitesfermentados pelas cepas. O soro é então retirado e sofre a mesma centrifu-gação, a fim de eliminar a maioria dos resíduos do produto. O resto dessaspartículas se sedimenta para formar um resíduo frágil.

A viscosidade do soro é em seguida medida a 20°C e a um gra-diente de cisalhamento fixo de 100 s"1 durante um minuto. Três medidas sãotambém feitas sobre três potes de leite fermentado pela mesma cepa e nasmesmas condições. O aparelho utilizado para essa análise é um reômetroAnton Paar Physica® MCR 300 equipado com uma geometria coaxial comduplos entreferros de tipo DG 26.7/TEZ 150 p-c, assim como de um sistemade regulagem de temperatura com efeito Peltier. Esse sistema rotativo per-mite avaliar a viscosidade do soro a um gradiente de cisalhamento constantecom uma aquisição de um ponto por segundo.

Geralmente, os dois primeiros valores dessa medida são incoe-rentes e falseados pela inicialização do sistema rotativo. Dessa forma, a vis-cosidade de cada soro [Vs] é determinada pela média dos valores retidospelo aparelho, exceto as duas primeiras.

2.E.2- Medida de penetrometria (Fqel -DqeI -F15 mm)

O aparelho utilizado para essa medida é um penetrômetroThermo Rhéo TAXT2 (Anton Paar Physica, Áustria).

Um cilindro de aproximadamente 1 cm de diâmetro penetra nogel (temperado a 10°C) à velocidade constante sobre 15 mm de profundida-de. Quando da descida do móvel no produto, o gel opõe uma resistência, iráse deformar antes de romper. Mede-se a força que daí resulta.

Os parâmetros extraídos são os seguintes:

Fgel = Força de gel (g), corresponde ao valor da força aplicadapelo móvel no momento da ruptura do gel (primeiro pico da curva).

Dgel = Distância à força de gel (mm) corresponde à profundida-de à qual se acha o móvel no momento da ruptura do gel.

F15 = Força a 15 mm (g) corresponde à força medida, quando omóvel está em fim de curso.

2.E.3 - Medida de escoamento - Viscosidade escoamento

Esse método consiste em determinar a viscosidade dos produtosfirmes, após uma mistura manual e uma incubação de 30 minutos a 4°C.Três medidas são feitas a 4°C sobre três potes de leite fermentado pelamesma cepa e nas mesmas condições. O aparelho utilizado para essa aná-lise é um viscosímetro Mettler ® RM260 refrigerado e equipado com um sis-tema coaxial de tipo DIN 145. Esse sistema rotativo permite observar umadesestruturação do produto em função de um gradiente de cisalhamentolinear, seja um esforço com um gradiente determinado.

Os resultados são obtidos sob a forma de uma curva de escoa-mento em contínuo, rampa montante e descendente entre 0 e 20 s"1. O pro-duto sofre um gradiente de cisalhamento crescente de 0 a 20 s-1 durante 1minuto. Essa fase corresponde à rampa montante. Depois, ele sofre um gra-diente de cisalhamento decrescente de 20 a Os"1 durante 1 minuto, corres-pondendo à rampa descendente.

Cada curva descendente é em seguida modelizada segundo omodo de Casson:

λ/τ = λ/tõ -wrç* Dτ: esforço (Pa)

to: limite de escoamento do produto (Pa) [Limite 4]η: viscosidade do produto (Pa.s) [V4]D: Gradiente de cisalhamento (s-1)

Essa modelização por Casson, seguida de uma reta de regres-são linear sobre a parte descendente da curva, permite destacar um parâ-metro importante que é a viscosidade do produto η, correspondendo à incli-nação da reta de regressão.

A figura 5 ilustra o modo de cálculo da viscosidade segundo es-sa modelização.

2.E.4 - ResultadosOs resultados obtidos com cada uma das técnicas de medidasão apresentados na tabela 3 a seguir

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TABELA 3

Análises de variância (P < 0,05) são feitas sobre os resultadosdas medidas de textura (para cada parâmetros os valores são comparadospor teste de Student):

- os parâmetros Força de gel, Distância para a força de gel eForça a 15 mm mostram que as duas cepas não são significativamente dife-rentes;

- o parâmetro de viscosidade oriundo da medida de escoamentomostra que as duas cepas não são significativamente diferentes;

- a viscosidade do soro sendo muito reprodutível mostra umadiferença significativa entre as duas cepas, mas o mutante tendo uma visco-sidade mais considerável que a cepa I-2967, isto prova que não houve perdade textura.

2.E.5 - Interpretação

As medidas de textura feitas sobre os produtos fermentados ob-tidos como mutante e a cepa mãe permitem mostrar que não há perda detextura devido à mutação.

2.F- Conclusões

Um mutante Iactose permease não fosforilável da cepa I-2967 foiobtido por dupla ocorrência de recombinação.

Esse mutante, denominado 1-3213, apresenta:

- uma curva de acidificação diferente daquela da cepa mãe (ve-Iocidade diminuída);

- uma pós acidificação no D28 menos considerável;

- uma textura semelhante àquela da cepa mãe; e

- uma boa sobrevida no D28.LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

Biswas, 1., Gruss, A., Ehrlich, S.D and Maguin, E. (1993) High-efficiencygene inactivation and replacenient system for gram-positive bactéria. JBacteriolf 175, 3628-3635.

Duan, K., Liu, C.Q., Lius Y.J., Ren, J. and Dunn, N.W. (1999) Nucleotidesequence and thermostability of pND324, a 3.6-kb plasmid from Lacto-coccus lactis. Appl Microbiol Biotechnol, 53, 36-42.

Frere, J., Benachour, A., Giard, J.C., Laplace, J.M., Flahaut, S. and Auf-fray, Y. (1998) A new theta-type thermosensitive replicon from Lacto-coccus lactis as an integration vector for Enterococcus faecalis. FEMSMicrobiol Lett, 161,107-114.

Gunnewijk, M.G. and Poolman, B. (2000a) HPr(His approximately P)-mediated phosphorylation differently affects counterflow and protonmotive force-driven uptake via the Iactose transport protein of Strepto-coccus thermophilus. J Biol Chern, 275, 34080-34085.

Gunnewijk, M,G. and Poolman, B. (2000b) Phosphorylation state of HPrdetermines the levei of expression and the extent of phosphorylation ofthe Iactose transport protein of Streptococcus thermophilus. J. BlolChem, 275, 34073-34079.

Jones, B.E., Dossonnet, V, Kuster, E., Hillen, W., Deutscher, J. andKlevit, R.E. (1997) Binding of the catabolite repressor protein CcpA toits DNA target is regulated by phosphorylation of its corepressor HPr, JBiol Chem, 272, 26530-26535.

Law, J., Buist, O., Haandrikman, A., Kok, J., Venema, G. and Leenhouts,K. (1995) A system to generate chromosomal mutations in Lactococcuslactis which allows fast analysis of targeted genes. J Bacteriol, 177,7011-7018.

Maguin, E., Prevost, H, Ehrlich, S.D. and Gruss, A. (1996) Efficient inser-tional mutagenesis in Iactococci and other gram-positive bactéria. JBacteriol, 178, 931-935.

Mollet, B, Knol, J., Poolman, B., Marcisel, O. and Delley, M. (1993) Direc-ted genomic integration, gene replacement, and integrative gene ex-pression in Streptococcus thermophilus. J Bacteriol, 175, 4315-4324.Poolman, B., Modderman, R. and Reizer, J. (1992) Lactose transportsystem of Streptococcus thermophilus. The role of histidine residues. JBiol Chem, 267, 9150-9157.

Van den Bogaard, P.T., Kleerebezem, M., Kuipers, O.P. and de Vos, W.M.(2000) Control of Iaetose transport, beta-galactosidase activity, and gly-colysis by CepA in Streptococcus thermophilus: evidence for carboncatabolite repression by a nonphosphoenolpyruvate-dependent phos-photransferase system sugar. J Bacteriol, 182, 5982-5989.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> COMPAGNIE GERVAIS DANONEDRUESNE, AnneGARAULT, PeggyFAURIE, Jean-MichelLICAU, Nadine

<120> Cepas mutantes de bactérias lácticas possuindo uma lactose permeasenãofosforilável

<130> MJPmadSLPl91/213

<150> FR0505497

<151> 2005-05-31

<160> 2

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 1220

<212> DNA

<213> Streptococcus thermophilus

<220>

<221> misc_feature <222> (1) .. (1220) <223> Seqüência do gene IacS da cepa mãe 1-2967 <400> 1 tccacaacct cttgtgttcc ttgttgtctt tatgattatc tctgactcag tagaatatgg 60tcaatggaaa acgggacacc gtgatgaatc acttactttg tcagttcgtc cacttattga 120taaacttggt ggtgcgatgt caaactggct tgtttctaca tttgccgtag ctgccggtat 180gacaacaggt gcctcagcat caacaattac aacacatcaa cagtttatct ttaagcttgg 240catgtttgct ttcccagcag caacaatgct tatcggtgcc ttcattgttg ctcgtaaaat BOOcactttgact gaagcacgtc acgctaaaat tgttgaagaa ttggaacatc gctttagcgt 360agcaacttct gaaaatgaag ttaaagctaa cgtcgtatct cttgtaaccc ctacaactgg 420ttatttggtt gatctctcaa gtgttaatga tgaacacttt gcttcaggta gcatgggtaa 480aggtttcgcc attaaaccta ctgatggagc tgtctttgca ccaattagtg gtaccattcg 540tcaaattctt cctactcgcc atgcagttgg tattgaaagt gaagatggtg tcattgttct 600tatccacgtt ggcatcggaa cagttaaact taatggtgaa ggattcatta gttacgtaga 660acaaggtgat catgttgaag ttggacaaaa acttcttgag ttctggtcac caattattga 720gaaaaatggt cttgatgaca cagtacttgt cactgtaact aattcagaaa aattcagtgc 780tttccatctt gaacaaaaag ttggagaaaa ggtagaagct ttgtctgaag ttattacctt 840caaaaaagga gaataatcta tgaacatgac tgaaaaaatt caaacttatt taaacgatcc 900aaagattgtt agcgttaata ctgttgatgc tcactcagat cataagtatt ttgaatctct 960tgaagaattt tctgaagggg agatgaagtt aagacaatct cttaatggaa aatggaaaat 1020tcactatgct cagaatacaa atcaggtttt aaaagacttt tataaaacag aatttgatga 1080aactgatttg aatttcatca atgtaccagg tcatttagag cttcaaggtt ttggttctcc 1140acaatatgtg aatacccaat atccttggga tggtaaagaa ttccttcgtc cacctcaagt 1200tcctcaagaa tcaaatgctg 1220

<210> 2

<211> 1278

<212> DNA

<213> Streptococcus thermophilus<22 0>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1278)

<223> Seqüência do gene IacS da variante 1-3213

<400> 2 cttccaataa tcttgactgc agctgaactc ttcttcattc cacaacctct tgtgttcctt 60gttgtcttta tgattatctc tgactcagta gaatatggtc aatggaaaac gggacaccgt 120gatgaatcac ttactttgtc agttcgtcca cttattgata aacttggtgg tgcgatgtca 180aactggcttg tttctacatt tgccgtagct gccggtatga caacaggtgc ctcagcatca 240acaattacaa cacatcaaca gtttatcttt aagcttggca tgtttgcttt cccagcagca 300acaatgctta tcggtgcctt cattgttgct cgtaaaatca ctttgactga agcacgtcac 360gctaaaattg ttgaagaatt ggaacatcgc tttagcgtag caacttctga aaatgaagtt 420aaagctaacg tcgtatctct tgtaacccct acaactggtt atttggttga tctctcaagt 480gttaatgatg aacactttgc ttcaggtagc atgggtaaag gtttcgccat taaacctact 540gatggagctg tctttgcacc aattagtggt accattcgtc aaattcttcc tactcgccat 600gcagttggta ttgaaagtga agatggtgtc attgttctta tcgcggttgg catcggaaca 660gttaaactta atggtgaagg attcattagt tacgtagaac aaggtgatca tgttgaagtt 720ggacaaaaac ttcttgagtt ctggtcacca attattgaga aaaatggtct tgatgacaca 780gtacttgtca ctgtaactaa ttcagaaaaa ttcagtgctt tccatcttga acaaaaagtt 840ggagaaaagg tagaagcttt gtctgaagttaacatgactg aaaaaattca aacttatttagttgatgctc actcagatca taagtattttatgaagttaa gacaatctct taatggaaaacaggttttaa aagactttta taaaacagaagtaccaggtc atttagagct tcaaggttttccttgggatg gtaaagaatt ccttcgtccagcatcatacg ttaaacat

attaccttca aaaaaggaga ataatctatg 900aacgatccaa agattgttag cgttaatact 960gaatctcttg aagaattttc tgaaggggag 1020tggaaaattc actatgctca gaatacaaat 1080tttgatgaaa ctgatttgaa tttcatcaat 1140ggttctccac aatatgtgaa tacccaatat 1200cctcaagttc ctcaagaatc aaatgctgtt 1260 1278

Claims (10)

1. Processo de obtenção de uma cepa mutante de bactéria lácti-ca possuindo uma pós-acidificação mais fraca que a cepa mãe da qual ela éoriunda, caracterizado pelo fato de se introduzir no ADN genômico da referi-da cepa mãe uma mutação do códon codificando para a histidina fosforilávelpor HPr(His-P) do domínio IIA da Iactose permeável, a referida mutação in-duzindo a substituição da referida histidina por um ácido aminado não fosfo-rilável.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de a cepa mãe ser uma cepa de Streptococcus thermophilus e emque essa mutação introduzir um códon alanina no lugar do códon histidina 552.

3. Cepa de bactéria láctica, caracterizada pelo fato de ser capazde ser obtida por um processo, como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Cepa de bactéria láctica, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de possuir uma atividade β-galactosidase.

5. Cepa de bactéria láctica, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de se tratar da cepa mutante de S. thermophilus, de-positada em 10 de maio de 2004 na CNCM sob o número 1-3213.

6. Fermento láctico, caracterizado pelo fato de que compreendepelo menos uma cepa de bactérias, como definida em qualquer uma dasreivindicações 3 a 5.

7. Fermento láctico, de acordo com a reivindicação 6, caracteri-zado pelo fato de compreender pelo menos uma cepa mutante de S. ther-mophilus, como definida em qualquer uma das reivindicações 3 a 5, associ-ada a pelo menos uma cepa de L bulgaricus.

8. Processo de preparação de um produto de leite fermentado,caracterizado pelo fato de que compreende uma etapa no decorrer da qualse fermenta leite com o auxílio de um fermento láctico, como definido na rei-vindicação 6 ou 7.

9. Produto de leite fermentado, caracterizado pelo fato de sercapaz de ser obtido pelo processo, como definido na reivindicação 8.

10. Produto de leite fermentado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de esse produto ser escolhido dentre os iogurtes,os leites fermentados, as bebidas fermentadas, os quefires, os queijos e osleites infantis fermentados.