ES2342321T3 - Cepas mutantes de bacterias lacticas que poseen una lactosa permeasa no fosforilable. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de obtención de una cepa mutante de bacteria láctica que posee una postacidificación más débil que la cepa madre de la que procede, caracterizado porque se introduce en el ADN genómico de dicha cepa madre una mutación del codón que codifica la histidina fosforilable por HPr(His-P) del dominio IIA de la lactosa permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de dicha histidina por un aminoácido no fosforilable.
Description
Cepas mutantes de bacterias lácticas que poseen
una lactosa permeasa no fosforilable.
La presente invención se refiere al campo de la
fermentación láctica. Más precisamente, esta invención se basa en
nuevos mutantes de Streptococcus thermophilus que expresan
una lactosa permeasa mutante cuya actividad de transporte de
lactosa está modificada. Estas cepas, y los fermentos que la
comprenden, pueden usarse para la obtención de productos lácteos
fermentados que poseen buenas propiedades de conservación.
Los yogures se obtienen tradicionalmente
mediante fermentación de la leche con una asociación de diferentes
bacterias lácticas, elegidas entre las cepas de Streptococcus
thermophilus y de Lactobacillus bulgaricus. A lo largo
de de la fermentación, que se efectúa a una temperatura de
aproximadamente 40 a 45ºC, estas bacterias usan principalmente la
lactosa como sustrato energético y producen ácido láctico que
conlleva la coagulación de la leche; cuando el pH alcanza un valor
de aproximadamente 4,8 a 4,5, se pone fin a esta etapa de
fermentación (igualmente denominada "acidificación") enfriando
el producto. Se mantiene éste a continuación en frío durante la
continuación del proceso de fabricación y acondicionamiento y hasta
su consumo.
Sin embargo, el enfriamiento no detiene
completamente la fermentación láctica; incluso cuando el producto
se mantiene a 4ºC, se observa un aumento progresivo de su acidez a
lo largo del tiempo.
Este fenómeno, conocido con el nombre de
postacidificación, es responsable de una degradación de las
calidades organolépticas del producto durante su conservación.
La postacidificación es esencialmente el
resultado del uso, por las bacterias, de la lactosa restante en el
producto al término de la etapa de acidificación controlada. Para
evitarla, se ha propuesto usar cepas de bacterias lácticas que no
fermenten la lactosa o muy poco.
Las enzimas esenciales para la fermentación de
la lactosa en Streptococcus thermophilus y Latobacillus
bulgaricus están codificadas por el operón lactosa, que contiene
el gen lacS que codifica la lactosa permeasa y el gen
lacZ que codifica la \beta-galactosidasa.
Estas proteínas son responsables respectivamente del transporte y
de la hidrólisis de la lactosa. Por tanto, se ha propuesto, para
obtener cepas no postacidificantes de bacterias lácticas, producir
variantes artificiales o seleccionar mutantes naturales en los que
esté afectada la actividad de al menos una de estas enzimas.
La patente EP 1078074 (Compagnie Gervais Danone)
se refiere a mutantes de L. bulgaricus deficientes en
actividad de \beta-galactosidasa, que comprenden
una mutación no codificante en al menos uno de los genes del operón
lactosa. Esta patente describe más específicamente un mutante cuyo
análisis de secuencia exhibe dos mutaciones puntuales: una que
introduce un codón de terminación en el gen de
\beta-galactosidasa, que induce la incapacidad de
ese mutante de usar la lactosa; la otra mutación induce un cambio de
aminoácido al nivel del gen de permeasa (Lys \rightarrow Asn en
posición 122); el documento EP 1078074 no reseña ningún efecto de
esta mutación sobre el fenotipo del mutante.
El documento WO0188150 describe mutante de una
cepa de Lactobacillus. Estos mutantes son incapaces de usar
la lactosa, pero conservan la capacidad de expresar
\beta-galactosidasa. El documento WO0188150 no
precisa la naturaleza ni la posición de la mutación referida, e
indica simplemente que puede situarse en uno de los genes
estructurales del operón lactosa, por ejemplo la permeasa, o en una
región de regulación del operón lactosa, o en un gen que interviene
en el control de la expresión del operón lactosa.
Los mutantes descritos en los documentos citados
anteriormente tienen en común la propiedad de ser completamente
incapaces de usar la lactosa. Sólo pueden crecer en leche si ésta se
complementa con un azúcar distinto de lactosa, generalmente
glucosa. Las propiedades de acidificación y postacidificación de
estos mutantes están controladas por la cantidad de glucosa
añadida.
Con el fin de proporcionar una alternativa a
estos mutantes, los inventores han investigado si era posible
obtener cepas de bacterias lácticas que tuvieran por una parte una
capacidad de usar la lactosa a lo largo de su crecimiento
comparable a la de las cepas salvajes, y por otra parte una aptitud
limitada de usar la lactosa a lo largo de la fase estacionaria, de
forma que se redujese o anulase el fenómeno de postacidificación.
Con este objetivo, se han interesado en la posibilidad de actuar
sobre la regulación del transporte de lactosa en las células de
bacterias lácticas, y especialmente en células de S.
thermophilus.
El transporte de lactosa extracelular en las
células de S. thermophilus se hace a través de la lactosa
permeasa LacS. Este transporte de lactosa se hace en simporte con un
protón o en antiporte con la galactosa intracelular resultante de
la degradación de lactosa.
El transporte de lactosa depende de dos
fenómenos: por una parte, el estado de fosforilación de la lactosa
permeasa y, por otra parte, la expresión del gen lacS, que
codifica esta lactosa permeasa. Se detallan estos dos aspectos a
continuación.
La proteínas LacS está compuesta por un dominio
de translocación y un dominio de regulación (IIA). Estos dominios
contienen diferentes residuos de histidina, cuya fosforilación
interviene en la regulación del transporte de lactosa.
Especialmente, el dominio IIA es fosforilable en la histidina 552.
Esta fosforilación se efectúa mediante la proteína HPr (proteína
vehículo fosforada que contiene histidina), ella misma previamente
fosforilada.
La HPr puede fosforilarse:
- -
- en una serina por una proteína cinasa dependiente de ATP; la reacción inversa de hidrólisis de HPr(Ser-P) está catalizada por una actividad fosfatasa (HPr(Ser-P) fosfatasa);
- -
- en una histidina HPr(His-P), por un agrupamiento fosforilo procedente de fosfoenolpiruvato, y a través de la enzima I (EI).
Sólo la forma de HPr fosforilada en histidina
permite la fosforilación de la lactosa permisa en la histidina
552.
Se ha observado en un modelo in vitro de
proteoliposomas que reproduce el entorno de membrana de la proteína
LacS y su fosforilación por HPr(His-P), que
esta fosforilación no tiene efecto sobre el transporte de lactosa
en simporte con un protón (Gunnewijk y Poolman, 2000a), pero aumenta
por un factor de aproximadamente 2 el flujo de intercambio
lactosa/galactosa.
La transcripción del operón lactosa está
inducida por el crecimiento en medio lactosado. El promotor de los
genes lacS y Z contiene un sitio cre (elemento
sensible a catabolito) que permite una regulación por CcpA: la CcpA
reprime la expresión de lacS y lacZ. La CcpA tiene al
contrario un efecto activador sobre la transcripción del gen que
codifica la lactato deshidrogenasa (van den Bogaard et al.,
2000).
La forma HPr(Ser-P) es
capaz de interaccionar con CcpA. Estas proteínas juntas van a
permitir formar un complejo con el sitio cre, lo que
conlleva una represión de la transcripción del gen lacS
(Jones et al., 1997).
Se ha observado (Gunnewijk y Poolman, 2000b) que
la forma HPr(Ser-P) es dominante al inicio de
la fase exponencial de crecimiento de los cultivos de S.
thermophilus y disminuye a lo largo de ésta, mientras que la
forma HPr(His-P) aparece a lo largo de la
fase exponencial y es máxima en la entrada en la fase estacionaria.
El paso de HPr(Ser-P) a
HPr(His-P) se realiza en paralelo a la
disminución de lactosa y al aumento de galactosa en el medio de
cultivo, y a un gran aumento de la expresión de lactosa
permeasa.
Así, el estado de fosforilación de la proteína
HPr parece desempeñar un papel en la regulación del transporte de
lactosa, compensando la disminución de lactosa en el medio, mediante
por una parte el nivel de expresión de la proteína LacS y por otra
parte la regulación de su actividad.
Basándose en las observaciones reseñadas
anteriormente, Gunnewijk y Poolman han propuesto el modelo
siguiente: cuando la lactosa es abundante en el medio, se reprime
la expresión del gen lacS por el complejo
HPr(Ser-P)/CcpA. A lo largo de la
fermentación, la acumulación de galactosa en el medio y la
disminución de la lactosa disponible causan una disminución de la
capacidad de la bacteria de hacer penetrar la lactosa (y por tanto
una disminución de la acidificación del medio). Esta disminución
conlleva una bajada de la actividad glucolítica y una caída de la
concentración de ATP, así como una subida de la concentración de
fosfato inorgánico, que conlleva una bajada de la actividad de
HPr(Ser-P) cinasa en provecho de la actividad
de HPr(Ser-P) fosfatasa, lo que tendría como
efecto la disminución de la concentración de
HPr(Ser-P). Esta disminución de la
concentración de HPr(Ser-P) permite elevar
la represión catabólica del gen lacS y en consecuencia
aumentar la producción de lactosa permeasa. Paralelamente, el
aumento de HPr(His-P) permitiría aumentar la
fosforilación de la lactosa permeasa en la histidina 552, y por
tanto la capacidad de transporte de lactosa por antiporte con
galactosa.
Este modelo, que sugiere que la fosforilación de
lactosa permeasa en la histidina 552 por
HPr(His-P) aumenta el flujo de lactosa en
las células cuando la cantidad de sustrato en el medio disminuye,
permite suponer que la acidificación al final de la fase
exponencial podría retardarse si se impide esta fosforilación. No
obstante, está basado en parte en experimentos in vitro, y
no permite prejuzgar la parte real in vivo de aumento de la
fosforilación de la lactosa permeasa con relación al aumento de su
expresión en la importación de lactosa in vivo. Además, las
observaciones referentes a los efectos de la concentración de
HPr(Ser-P) y
HPr(His-P) sobre el aumento de la expresión
y la fosforilación de LacS se han efectuado en bacterias en fase
exponencial o al inicio de la fase estacionaria; no se proporciona
ninguna indicación respecto a las concentraciones de estas dos
formas de HPr en los estados más avanzados de la fase
estacionaria.
Las únicas informaciones disponibles en cuanto
al efecto de la ausencia de fosforilación de LacS sobre la
histidina 552 están proporcionadas en una publicación de Poolman,
et al. (Poolman et al., 1992), que describe
diferentes plásmidos que contienen la secuencia que codifica la
enzima LacS de Streptococcus thermophilus, mutada en
diferentes residuos de histidina. Estos plásmidos se usan para
transformar una cepa de E. coli en la que el gen lacS
endógeno se ha eliminado previamente. Se evalúa el transporte de
lactosa en las cepas transformadas por los diferentes mutantes con
relación al observado en la misma cepa de E. coli que
contiene un plásmido que codifica la enzima LacS salvaje de
Streptococcus thermophilus. No se observó ninguna diferencia
significativa respecto al mutante H552R en el que la histidina
nativa está reemplazada por una arginina. Poolman et al.
atribuyen este resultado a la ineficacia de la fosforilación de la
enzima LacS salvaje de Streptococcus thermophilus por
HPr(His-P) de E. coli o al hecho de
que esta fosforilación no desempeñe un papel en el transporte de
lactosa.
Los inventores han investigado sin embargo si
una mutación que evite la fosforilación de LacS sobre el residuo de
histidina podría tener un efecto sobre las propiedades de
acidificación y postacidificación de la bacteria mutante.
Han elegido para este estudio una cepa
industrial de Streptococcus thermophilus. Esta cepa,
depositada en la CNCM el 12/12/2002 con el número
I-2967, permite obtener productos lácteos
fermentados que tienen una textura interesante; sin embargo, esta
cepa conduce a una postacidificación importante.
Los inventores han construido y caracterizado un
mutante de esta cepa que expresa, en lugar de la lactosa permeasa
salvaje, una lactosa permeasa mutada no fosforilable sobre la
histidina 552.
Han comprobado que esta cepa mutante poseía una
curva de acidificación diferente de la de la cepa madre. La
acidificación se inicia más lentamente en el caso del mutante que en
el de la cepa madre, y la velocidad máxima de acidificación del
mutante es menos elevada. Sin embargo, se alcanza un pH equivalente
al cabo de 6 horas de fermentación para las dos cepas. Es al nivel
de la postacidifación cuando la diferencia entre las dos cepas es
más clara. En las mismas condiciones de conservación (28 días de
conservación a 10ºC), la \DeltapH (diferencia entre el pH a d0 y
el pH a d28) es del orden de 0,6 en el caso de la cepa madre y del
orden de 0,4 en el caso de la cepa mutante. Esta diferencia de
postacidificación no proviene de una diferencia al nivel de
supervivencia de las bacterias. Éste es efectivamente equivalente
para las dos cepas. Además, los productos fermentados obtenidos con
el mutante presentan las mismas calidades de textura que los
obtenidos con la cepa madre.
La presente invención se basa por tanto en
primer lugar en un procedimiento de obtención de una cepa mutante
de bacteria láctica que posee una postacidificación más débil que la
cepa madre de la que procede, caracterizado porque se introduce en
el ADN genómico, especialmente el ADN cromosómico, de dicha cepa
madre una mutación del codón que codifica la histidina fosforialble
por HPr(His-P) del dominio IIA de la lactosa
permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de dicha histidina
por un aminoácido no fosforilable.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, dicha cepa es una cepa de Streptococcus
thermophilus, y dicha mutación induce el reemplazo de la
histidina en posición 552 de la lactosa permeasa por un aminoácido
no fosforilable.
Dicho aminoácido no fosforilable puede ser
cualquier aminoácido, con excepción de serina, tirosina, histidina
y treonina. Preferiblemente, se elegirá la alanina.
Ventajosamente, el codón que codifica la
histidina en posición 552 de la lactosa permeasa se reemplaza por
un codón que codifica una alanina. Esta mutación genera un sitio de
restricción BstUI que facilita el cribado de los mutantes
obtenidos.
El procedimiento según la invención puede
ponerse en práctica usando técnicas convencionales de mutagénesis
dirigida, especialmente de mutagénesis por PCR, bien conocidas por
el experto en la técnica.
Se inserta a continuación el ADN mutado así
obtenido en un vector que permita la integración del gen en el
cromosoma bacteriano. Esta integración se efectúa preferiblemente
mediante recombinación del inserto portado por el vector con la
región homóloga del cromosoma bacteriano.
De forma clásica, se inserta el ADN mutado en un
vector de integración que porta un marcador de selección (por
ejemplo un gen de resistencia a un antibiótico) y se introduce este
vector en las bacterias en las que se desea efectuar la mutación.
Estas se cultivan a continuación sobre medio selectivo (por ejemplo,
si el marcador de selección es un gen de resistencia a un
antibiótico, en presencia del antibiótico correspondiente), y se
recuperan las bacterias que son capaces de crecer en estas
condiciones, que son aquellas que han integrado el vector mediante
recombinación homóloga entre el inserto y la región homóloga del
cromosoma bacteriano. La estructura integrada en el cromosoma está
constituida por secuencias del vector flanqueadas por una parte por
la secuencia mutada que proviene del inserto y por otra parte por la
secuencia homóloga de la bacteria hospedadora.
Se cultivan las bacterias así seleccionadas en
medio no selectivo, con el fin de permitir la escisión de las
secuencias procedentes del vector, que se efectúa mediante
recombinación homóloga entre las regiones que flanquean estas
secuencias. La mitad de las bacterias en las que ha tenido lugar
esta recombinación contiene la secuencia "salvaje" procedente
de la bacteria hospedadora, y la otra mitad contiene la secuencia
mutada procedente del inserto. Las bacterias que portan la mutación
se seleccionan a continuación mediante cualquier medio apropiado.
Por ejemplo, si la mutación crea un sitio de restricción, puede
efectuarse la selección basándose en la presencia de este sitio de
restricción en un producto de amplificación por PCR de la región
mutante.
Los vectores de integración están disponibles
para numerosas bacterias lácticas. De forma clásica, para una
especie bacteriana dada, un vector de integración es un vector que
puede introducirse en las bacterias de esa especie pero que es
incapaz de replicarse allí.
Se citarán a modo de ejemplos de vectores
utilizables como vectores de integración en Streptococcus
thermophilus Pgem5, Puc19 (Mollet et al., 1993), Pnd324
(Duan et al., 1999).
Ventajosamente, para aumentar la eficacia de la
transformación, se puede usar como vector de integración un vector
de replicación condicional en la bacteria elegida. En este caso, las
bacterias en las que se introduce el vector se cultivan en un
primer momento en condiciones permisivas para su replicación, lo que
les permite establecerse en bacterias transformadas; en un segundo
momento, se cultivan las bacterias en condiciones no permisivas
para la replicación del vector, y se puede, como en el caso de
vectores de integración clásicos, efectuar la selección de
bacterias en las que se ha integrado el vector en el cromosoma.
Se citarán a modo de ejemplos de vectores de
replicación condicional utilizables como vectores de integración en
un gran número de bacterias lácticas los vectores termosensibles
descritos por BISWAS et al. y MAGUIN et al. (Biswas
et al., 1993; Maguin et al., 1996), así como en la
solicitud PCT WO 93/18164, o los vectores pwv01 (Law et al.,
1995) y Puc122 (Frere et al., 1998).
La invención tiene igualmente como objetivo una
cepa de bacteria láctica apta para obtenerse mediante un
procedimiento según la invención.
Esta cepa se caracteriza porque contiene en su
ADN cromosómico una mutación del codón que codifica la histidina
fosforilable por HPr(His-P) del dominio IIA
de la lactosa permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de
dicha histidina por un aminoácido no fosforilable.
Según un modo de realización preferido de la
presente invención, dicha cepa es una cepa de Streptococcus
thermophilus en la que el gen de la lactosa permeasa contiene
una mutación que induce el reemplazo de la histidina en posición
552 de la proteína por un aminoácido no fosforilable.
Se ha depositado una cepa de bacterias lácticas
según la invención según el Tratado de Budapest el 10 de mayo de
2004 en la CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes), 25 rue du Docteur Roux, París, con el número
I-3213. Se trata de una cepa mutante de S.
thermophilus, derivada de la cepa CNCM I-2967
(depositada en la CNCM el 12 de diciembre de 2002) mediante la
introducción, por mutagénesis dirigida, de una mutación que
reemplaza al codón de histidina 552 por un codón de alanina.
Las cepas de bacterias lácticas según la
invención tienen a lo largo de su fase de crecimiento una actividad
de lactosa permeasa similar a la de la cepa madre de la que
proceden. Poseen por tanto capacidades de asimilación de lactosa y
de acidificación comparables a las de la cepa madre de la que
proceden. En contraposición, su actividad lactosa permeasa durante
la fase estacionaria se reduce con respecto a la de la cepa madre,
lo que conlleva una postacidificación reducida.
Ventajosamente, las cepas de bacterias lácticas
según la invención provienen de bacterias lácticas que poseen una
actividad de \beta-galactosidasa y conservan esta
actividad. Pueden crecer normalmente en leche no suplementada con
un azúcar distinto de lactosa.
Preferiblemente, las cepas de bacterias según la
invención son mutantes apropiados para la industria alimentaria (o
mutantes "de pureza alimentaria"). Derivan ventajosamente de
cepas bacterianas caracterizadas porque presentan propiedades
ventajosas de fermentación de productos lácteos.
La presente invención se refiere igualmente a un
fermento láctico que comprende al menos una cepa de bacterias tal
como se describe anteriormente. Según un modo de realización
particular, un fermento láctico según la invención comprende al
menos una cepa mutante de S. thermophilus que expresa una
lactosa permeasa cuya histidina 552 se ha remplazado por un residuo
no fosforilable, asociada al menos a otra cepa de bacteria láctica,
por ejemplo una cepa de L. bulgaricus, que puede igualmente
poseer eventualmente una postacidificación reducida (por ejemplo,
resultante de la mutación, según la invención, de la lactosa
permeasa, o bien resultante de una mutación inactivante de la
\beta-galactosidasa).
Un procedimiento de preparación de un producto
lácteo fermentado, que comprende una etapa a lo largo de la cual se
fermenta leche con la ayuda de un fermento láctico tal como se
describe anteriormente, forma igualmente parte integrante de la
presente invención, así como cualquier producto lácteo fermentado
apto para obtenerse mediante dicho procedimiento, tal como un
yogur, una leche fermentada, una bebida fermentada, un kéfir, un
queso o una leche infantil fermentada.
Los ejemplos experimentales siguientes,
ilustrados por las figuras, exponen más detalladamente ciertos
aspectos de la presente invención, sin limitar sin embargo su
objetivo.
\global\parskip0.950000\baselineskip
Figura 1: Comparación de la secuencia del gen
lacS de la variante I-3213 con la secuencia
del gen lacS de la cepa madre I-2967.
Figura 2: Comparación de las curvas de
acidificación obtenidas con el mutante I-3213 y la
cepa madre I-2967.
Figura 3: Comparación de las velocidades de
acidificación del mutante I-3213 y de la cepa madre
I-2967.
Figura 4: Seguimiento de la acidez Dolic a lo
largo de la conservación de los productos. Comparación del mutante
I-3213 y de la cepa madre
I-2967.
Figura 5: Principio de medida de la viscosidad
\eta de un producto.
La cepa de partida es la cepa de S.
thermophilus I-2967, depositada en la CNCM el 12
de diciembre de 2002.
En la secuencia del gen lacS, se ha
reemplazado el codón de la histidina 552 (la histidina que es
fosforilable) por un codón de alanita por doble recombinación.
Además, la mutación efectuada (reemplazo del segundo nucleótido del
codón 522 por una citosina, en lugar de una adenina) ha creado en el
gen un sitio de restricción BstU1. Esto ha permitido seleccionar a
clones que han integrado la mutación deseada en el gen
lacS.
Se ha verificado la estabilidad de la mutación a
partir de uno de los clones obtenidos (depositado en la CNCM el 10
de mayo de 2004 con el número I-3213), mediante 6
subcultivos sucesivos, seguidos de secuenciación del gen
LacS. La figura 1 muestra la comparación de la secuencia del
gen lacS de variante I-3213 (SEC ID Nº 2)
con la del gen lacS de la cepa madre I-2967
(SEC ID Nº 1). La mutación está bien presente: el codón de
histidina 552 codifica en lo sucesivo una alanina. No hay ninguna
mutación indeseable en otra parte del gen lacS.
El mutante I-3213 es apropiado
para uso agroalimentario, puesto que no contiene ninguna secuencia
residual del plásmido usado para integrar la mutación del gen
lacS.
Con el fin de verificar que el mutante
I-3213 es menos postacidificante que la cepa madre
I-2967, se han fabricado productos en cepa pura y
se han seguido hasta d+28: acidificación, postacidificación,
supervivencia, textura.
- -
- Revivificación de las cepas mediante 2 subcultivos.
- -
- Preparación de fermentos en leche estéril con extractos de levadura añadidos con incubación a 44ºC hasta alcanzar una acidez de 85ºD (correspondiente a 10^{8} a 10^{9} UFC/ml).
- -
- Siembra de una mezcla de 120 g de leche en polvo desnatada + 930 ml de agua + 1 g de peptona de gelatina N3 (Organotechnie), pasteurizada durante 10 min a 95ºC, con 1% (v/v) de fermento.
- -
- Incubación en recipientes en una estufa a 44ºC, hasta alcanzar un pH de 4,65.
- -
- Detención de la fermentación disponiendo los recipientes durante 30 minutos en agua con hielo.
- -
- Conservación de los productos durante 28 días en cámara fría a 10ºC.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Gracias al sistema CINAC (CINética de
ACidificación, Alliance Instruments), se mide el pH continuamente a
lo largo del tiempo. Se pueden obtener así:
- -
- la curva de acidificación de cada cepa,
- -
- la derivada primera con relación al tiempo, que da la velocidad de acidificación.
Se hace el seguimiento de la evolución del pH a
lo largo de la conservación de los productos gracias a un
peachímetro MP220 de Mettler Toledo.
La medida de la acidez Dornic (Dº) permite
valorar la concentración molar en iones H_{3}O^{+}. El número
de grados Dornic corresponde al número, en decenas de mililitros, de
disolución de hidróxido de sodio a concentración 0,1 N, que son
necesarios para neutralizar 10,32 g de leche. Se visualiza la
neutralidad usando un indicador coloreado, la fenolftaleína. En los
alrededores de su zona de viraje (pH 8,2), la fenolftaleína pasa de
incolora a rosa. Un grado Dornic representa 100 mg de ácido láctico
por litro de leche.
Se reconstituye el medio de leche a partir de
120 g de leche en polvo desnatada (Milex 240, Arla Food Ingredients)
+ 930 ml de agua permutada + 1 g de péptido N3 (Vital Armor 950,
Armor Protéines). Se mezcla la mezcla hasta homogeneización
completa. Se rehidrata a continuación el medio durante 30 min a
temperatura ambiente, se pasteuriza después a 95ºC durante 10
minutos.
Se realizan las medidas de supervivencia en
medio gelosado M17 con sacarosa. Aislamiento en superficie mediante
un sembrador en espiral (WASP de AES). Incubación a 37ºC en
H_{2}CO_{2}. Lectura después de 72 horas de incuba-
ción.
ción.
Se han realizado las curvas de acidificación en
cepas puras por duplicado.
Los resultados, presentados en las figuras 2 y
3, muestran que el mutante I-3213 tiene una curva de
acidificación más lenta que la cepa madre, con un efecto de urea
más pronunciado y una velocidad máxima de acidificación más débil.
No obstante, se alcanza el pH 4,50 en 6 horas para las dos
cepas.
La figura 4 muestra los resultados del
seguimiento de la acidez Dornic a lo largo de la conservación de los
productos, comparando los productos obtenidos por fermentación por
el mutante I-3213 y por la cepa madre
I-2967.
Se presentan en la Tabla 1 siguiente los
resultados referentes a la medida del pH inmediatamente después de
la detención de la fermentación (d0), y después de 28 días de
conservación a 10ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El conjunto de estos resultados confirma que el
mutante es menos postacidificante que la cepa madre.
\newpage
La tabla 2 siguiente indica el número de
colonias bacterianas presentes en 1 ml de producto después de 28
días de almacenamiento a 10ºC.
Estos resultados muestran que la supervivencia
del mutante es tan buena como la de la cepa madre después de 28
días de almacenamiento después de la detención de la
fermentación.
Se han realizado las medidas de textura en
productos de una sola fabricación. Se han efectuado todas las
medidas por triplicado (3 recipiente por medida).
Se han realizado tres procedimientos de medida
de la textura en los productos a d+7:
- -
- Medida de penetrometría con TAXT2 (10ºC)
- -
- Medida de flujo después de mezclado manual en Rhéomat 260 (4ºC)
- -
- Medida de v \eta iscosidad en el suero después de centrifugación en MCR300 (20ºC)
Se detallan a continuación estas diferentes
técnicas de medida de la textura.
El interés de este procedimiento consiste en
analizar el suero de productos de granja con el fin de confirmar
las caracterizaciones reológicas de las leches fermentadas por las
cepas.
Este procedimiento de análisis permite en un
primer momento recuperar el suero de productos de granja. Para
ello, se centrifuga una cantidad de producto, aproximadamente 50 g,
a 631 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, lo que permite
recoger el suero presente en el interior del gel de las leches
fermentadas por las cepas. Se extrae entonces el suero y se somete
a la misma centrifugación con el fin de eliminar la mayoría de
residuos del producto. El resto de estas partículas sedimenta
formando un sedimento frágil.
Se mide a continuación la viscosidad del suero a
20ºC y a un gradiente de cizalladura fijo de 100 s^{-1} durante
un minuto. Se efectúan igualmente tres medidas en tres recipientes
de leche fermentada por la misma cepa y en las mismas condiciones.
El dispositivo usado para este análisis es un reómetro Anton Paar
Physica® MCR 300 equipado con una geometría coaxial de doble
entrehierro de tipo DG 26.7/TEZ 150 p-c, así como un
sistema de regulación de la temperatura de efecto Peltier. Este
sistema rotativo permite evaluar la viscosidad del suero a un
gradiente de cizalladura constante con una adquisición de un punto
por segundo.
Generalmente, los dos primeros valores de esta
medida son incoherentes y falseados por la iniciación del sistema
rotativo. Por este hecho, se determina la viscosidad de cada suero
[V] por la media de los valores registrados en el dispositivo,
excepto los dos primeros.
El dispositivo usado para esta medida es un
penetrómetro Thermo Rhéo TAXT2 (Anton Paar Physica, Austria).
Un cilindro de aproximadamente 1 cm de diámetro
penetra en el gel (atemperado a 10ºC) a velocidad constante a 15 mm
de profundidad. Con el descenso del elemento móvil en el producto,
el gel opone una resistencia, va a deformarse antes de romperse. Se
mide la fuerza resultante.
Los parámetros extraídos son los siguientes:
Fgel = Fuerza del gel (g), corresponde al
valor de la fuerza aplicada por el elemento móvil en el momento de
ruptura del gel (primero pico de la curva).
Dgel = Distancia a la fuerza del gel
(mm), corresponde a la profundidad a la que se encuentra el elemento
móvil en el momento de la ruptura del gel.
F15 = Fuerza a 15 mm (g), corresponde a
la fuerza medida cuando el elemento móvil está al final del
recorrido.
Este procedimiento consiste en determinar la
viscosidad de productos de granja después de un mezclado manual y
una incubación de 30 minutos a 4ºC. Se efectúan tres medidas a 4ºC
en tres recipientes de leche fermentada por la misma cepa y en las
mismas condiciones. El dispositivo usado para este análisis es un
viscosímetro Mettler® RM 260 refrigerado y equipado con un sistema
coaxial de tipo DIN 145. Este sistema rotativo permite observar la
desestructuración del producto en función del gradiente de
cizalladura lineal, o sea la tensión a un gradiente dado.
Los resultados se obtienen en forma de una curva
de flujo continuo, con rampa ascendente y descendente entre 0 y 20
s^{-1}. El producto experimenta un gradiente de cizalladura
creciente de 0 a 20 s^{-1} durante 1 minuto. Esta fase
corresponde a la rampa ascendente. Después, experimenta un gradiente
de cizalladura descendente de 20 a 0 s^{-1} durante 1 minuto,
correspondiente a la rampa descendente.
Se modeliza cada curva descendiente a
continuación según el modelo de Casson:
\sqrt{\tau} =
\sqrt{\tau_{0}} + \sqrt{\eta \times
D}
\tau: tensión (Pa)
\tau_{0}: umbral de flujo del producto (Pa)
[umbral 4]
\eta: Viscosidad del producto (Pa.s) [V4]
D: Gradiente de cizalladura
(s-1)
Esta modelización por Casson, seguida de una
recta de regresión lineal en la parte descendente de la curva,
permite señalar un parámetro importante que es la viscosidad del
producto \eta, correspondiente a la pendiente de la recta de
regresión.
La figura 5 ilustra el modo de cálculo de la
viscosidad según esta modelización.
Los resultados obtenidos con cada una de las
técnicas de medida se presentan en la Tabla 3 siguiente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se hacen análisis de varianza (P<0,05) sobre
los resultados de las medidas de textura (para cada parámetro, se
comparan los valores por ensayo de Student):
- -
- Los parámetros fuerza de gel, distancia para la fuerza de gel y fuerza a 15 mm muestran que las dos cepas no son significativamente diferentes.
- -
- El parámetro de viscosidad procedente de la medida de flujo muestra que las dos cepas no son significativamente diferentes.
- -
- La viscosidad del suero, que es muy reproducible, muestra una diferencia significativa entre las dos cepas, pero el mutante tiene una viscosidad mayor que la cepa I-2967, esto prueba que no ha habido pérdida de textura.
Las medidas de textura efectuadas sobre
productos fermentados obtenidos con el mutante y la cepa madre
permiten mostrar que no hay pérdida de textura debido a la
mutación.
Se ha obtenido un mutante de lactosa permeasa no
fosforilable de la cepa I-2967 mediante un doble
evento de recombinación.
Este mutante, nombrado I-3213
presenta:
- -
- una curva de acidificación diferente de la de la cepa madre (velocidad retardada),
- -
- una postacidificación a d28 menor,
- -
- una textura parecida a la de la cepa madre, y
- -
- una buena supervivencia a d28.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> COMPAGNIE GERVAIS DANONE
\hskip1cmDRUESNE, Anne
\hskip1cmGARAULT, Peggy
\hskip1cmFAURIE, Jean-Michel
\hskip1cmLICAU, Nadine
\vskip0.400000\baselineskip
<120> CEPAS MUTANTES DE BACTERIAS
LACTICAS QUE POSEEN UNA LACTOSA PERMEASA NO FOSFORILABLE
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPmadSLP191/213
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR0505497
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
31-05-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patents versión 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1220
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
thermophilus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1220)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del gen lacs de la cepa
madre I-2967
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1278
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Streptococcus
thermophilus
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1278)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del gen lacs de la
variante I-3213
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (10)
1. Procedimiento de obtención de una cepa
mutante de bacteria láctica que posee una postacidificación más
débil que la cepa madre de la que procede, caracterizado
porque se introduce en el ADN genómico de dicha cepa madre una
mutación del codón que codifica la histidina fosforilable por
HPr(His-P) del dominio IIA de la lactosa
permeasa, induciendo dicha mutación el reemplazo de dicha histidina
por un aminoácido no fosforilable.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque la cepa madre es una cepa de
Streptococcus thermophilus y porque esta mutación introduce
un codón de alanina en lugar del codón de histidina 552.
3. Cepa de bacteria láctica apta para obtenerse
mediante un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2.
4. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 3, caracterizada porque posee una actividad de
\beta-galactosidasa.
5. Cepa de bacteria láctica según la
reivindicación 4, caracterizada porque se trata de la cepa
mutante de S. thermophilus depositada el 10 de mayo de 2004
en la CNCM con el número I-3213.
6. Fermento láctico que comprende al menos una
cepa de bacterias según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a
5.
7. Fermento láctico según la reivindicación 6,
caracterizado porque comprende al menos una cepa mutante de
S. thermophilus según una cualquiera de las reivindicaciones
3 a 5, asociada al menos a una cepa de L. bulgaricus.
8. Procedimiento de preparación de un producto
lácteo fermentado, que comprende una etapa a lo largo de la cual se
fermenta leche con la ayuda de un fermento láctico según la
reivindicación 6 o la reivindicación 7.
9. Producto lácteo fermentado apto para
obtenerse mediante un procedimiento según la reivindicación 8.
10. Producto lácteo fermentado según la
reivindicación 9, caracterizado porque dicho producto se
elige entre los yogures, las leches fermentadas, las bebidas
fermentadas, los kéfires, los quesos y las leches infantiles
fermentadas.
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