BRPI0611347A2

BRPI0611347A2 - composicão farmacêutica, usos de uma proteìna de fusão mtb72f ou um fragmento imunogênico da mesma, e, de um ácido nucléico

Info

Publication number: BRPI0611347A2
Application number: BRPI0611347-8A
Authority: BR
Inventors: Rhea Coler; Steven Reed; Yves Lobet
Original assignee: Glaxosmithline Biolog S A; Infectious Disease Res Inst
Priority date: 2005-04-29
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2010-08-31
Also published as: PT2426141E; KR101352806B1; NO340766B1; IL186654A; US10105430B2; US20190030154A1; US8470338B2; WO2006117240A3; US20150231224A1; KR20120089475A; US20090123491A1; IL215112A0; CN101273055B; US20190307872A1; US20170196961A1; EP1877426A2; PL2426141T3; EP2426141A2; JP2012065650A; NO20141158L

Abstract

COMPOSIcãO FARMACêUTICA, USOS DE UMA PROTEìNA DE FUSãO Mtb72f OU UM FRAGMENTO IMUNOGêNICO D Má, E, DE UM áCIDO NUCLéICO A presente invencao refere-se a métodos d prevenir reativacao de infeccões ativas e latentes com M tuberculosis por meio de administracao de uma composicao farmaceutica compreendendo um ácido nueleico codificando para uma proteína de fusao Mtb72f, ou uma roteina de fusao Mtb72f ou um fragmento imunogenico do mesmo, por exemplo, em conjunto com um adjuvante. O ácido nucleico Mtb72f ou proteína de fusao pode ser administrado com um ou mais agentes quimioterápicos eficazes contra uma infeccao com M tuberculos is. Os métodos também pro orcionam o encurtamento do período de um regime quimioterápico contra uma infeccao com M tuberculosis.

Description

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS DE UMA PROTEÍNA DEFUSÃO Mtb72f OU UM FRAGMENTO IMUNOGÊNICO DA MESMA, E,DE UM ÁCIDO NUCLÉICO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos de prevenir ou tratarreativação de uma infecção com M. tuberculosis em um mamífero e amétodos de encurtar o decurso da quimioterapia contra uma infecção com Mtuberculosis.

ANTERIORIDADES DA INVENÇÃO

Tuberculose é uma doença infecciosa crônica causado porinfecção com M. tuberculosis e outras espécies de Mycobacterium. Ela é umadoença importante em países em desenvolvimento, e também é um problemacrescente em áreas desenvolvidas do mundo, com cerca de 8 milhões novoscasos a cada ano. Embora a infecção possa ser assintomática durante umperíodo considerável, a doença é manifestada mais comumente como umainflamação aguda dos pulmões, resultando em febre e numa tosse não-produtiva. Se não tratada, resultarão tipicamente sérias complicações e morte.

Embora a tuberculose possa ser geralmente controladaempregando-se terapia estendida com antibióticos, tal tratamento não ésuficiente para prevenir a disseminação da doença. Indivíduos infectadospodem ser assintomáticos, mas contagiosos, durante algum tempo.

Adicionalmente, embora a adesão com o regime de tratamento seja crítica, ocomportamento do paciente é difícil de monitorar. Alguns pacientes nãocompletam o curso de tratamento, o que pode levar a tratamento ineficaz e aodesenvolvimento de resistência à droga. Mesmo que o curso completo dotratamento seja completado, a infecção com M tuberculosis não é erradicadado indivíduo infectado, mas permanece como uma infecção latente que podeser reativada.Para controlar a disseminação da tuberculose, vacinação eficaze diagnóstico precoce preciso da doença são da maior importância.Correntemente, vacinação com bactérias vivas é o método mais eficiente parainduzir imunidade protetora. O Mycobacterium mais comum empregado paratal fim é o Bacillus Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de M. bovis.

No entanto, a segurança e eficácia do BCG é uma fonte de controvérsia, ealguns países, como os Estados Unidos, não vacinam o público em geral comeste agente.

O diagnóstico da tuberculose é obtido comumente usando-seum teste de pele, que envolve exposição intradérmica à tuberculina PPD(derivado purificado de proteína). Respostas de células T específicas paraantígeno resultam em endurecimento mensurável no sítio de injeção em tornode 48 a 72 horas após injeção, o que indica exposição a antígenosmicobacterianos. Sensibilidade e especificidade tem representado, contudo,um problema com este teste é que indivíduos vacinados com BCG não podemser diferenciados de indivíduos infectados.

Embora se tenha mostrado que macrófagos atuam como osprincipais efetoras da imunidade de Mycobacterium, células T são osindutores predominantes de referida imunidade. O papel essencial de célulasT na proteção contra infecção com Mycobacterium é ilustrado pela ocorrênciafreqüente de infecção com Mycobacterium em pacientes com AIDS, devido àdepleção de células T CD4+ associadas com infecção com vírus daimunodeficiência humana (HIV). Mostrou-se que células T CDA+ reativas aMycobacterium são produtores potentes de γ-interferon (IFN-γ), e que, porsua vez, disparam os efeitos anti-micobacterianos de macrófagos emcamundongos. Embora o papel do IFN-γ em humanos seja menos claro,estudos mostraram que 1,25-di-hidróxi-vitamina D3, seja sozinha ou emcombinação com IFN-γ ou fator de necrose de tumor alfa, ativa macrófagoshumanos para inibir infecção com M. tuberculosis. Adicionalmente, é deconhecimento geral que o IFN-γ estimula macrófagos humanos a produzir,25-di-hidróxi-vitamina D3. De forma análoga, mostrou-se que a interleucina-12(IL-12) desempenha um papel na estimulação da resistência a infecção comM. tuberculosis. Para uma revisão da imunologia da infecção com Mtuberculosis, ver Chan & Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protectionand Control (Bloom ed., 1994), Tuberculosis (2a ed., Rom e Garay, eds.,2003), e Harrison 's Principies of Internai Medicine, capítulo 150, pp. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al, eds., 2005).

Permanece uma necessidade de estratégias de tratamentoeficazes para prevenir a reativação de infecções com Mycobacteriumtuberculosis, tanto de infecções ativas como de infecções latentes. Estainvenção atende esta e outras necessidades.

Descrição das seqüências listadas

SEQ ID No: 1: Mtb72f com marcador 6 His N-terminal (DNA)

SEQ ID No:2: Mtb72f com marcador 6 His N-terminal(proteína)

SEQ ID No:3: M72 (variante de Mtb72f) com inserção de 2His N-terminal (DNA)

SEQ ID No:4: M72 (variante de Mtb72f) com inserção de 2-His N-terminal (proteína)

SEQ ID No:5: Mtb72f sem inserção de His N-terminal (DNA)

SEQ ID No:6: Mtb72f sem inserção de His N-terminal(proteína)

Breve resumo da invenção

A presente invenção proporciona composições farmacêuticascompreendendo uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênicoda mesma de uma espécie de um Mycobacterium do complexo de tuberculose,por exemplo, em conjunto com um ou mais adjuvantes, incluindo ASOlB eAS02A.A presente invenção baseia-se em parte na descoberta dosinventores de que a administração de uma proteína de fusão Mtb72f oufragmento imunogênico da mesma, p. ex., em conjunto com um ou maisadjuvantes ou um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Mtb72fou fragmento imunogênico da mesma, pode prevenir ou tratar reativação deuma infecção ativa ou inativa com M tuberculosis. Em uma concretizaçãopreferida, uma proteína de fusão Mtb72f ou ácido nucleico é administradacom um ou mais agentes quimioterápicos eficazes contra uma infecção comM. tuberculosis.

Em um aspecto, as composições são empregadas em métodospara prevenir ou tratar reativação de tuberculose em um sujeito, sendo que ométodo compreende a etapa de administrar a um mamífero já infectado comMycobacterium tuberculosis uma quantidade imunologicamente eficaz deuma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72fou um fragmento imunogênico da mesma de uma espécie de Mycobaeteriumdo complexo de tuberculose e um adjuvante, sendo que a proteína de fusãoMtb72f induz uma resposta imunológica contra M. tuberculosis, prevenindoou tratando com isto a reativação da tuberculose.

Em outro aspecto, as composições são empregadas emmétodos para prevenir reativação da tuberculose em um sujeito, sendo que ométodo compreende a etapa de administrar a um mamífero já infectado comMycobacterium tuberculosis uma quantidade imunologicamente eficaz deuma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico quecodifica uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico damesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, sendoque a proteína de fusão Mtb72f expressa induz uma resposta imunológicacontra M. tuberculosis, prevenindo ou tratando com isto a reativação datuberculose.

Em outro aspecto, as composições são empregadas emmétodos para reduzir o decurso da quimioterapia contra uma infecção com Mtuberculosis, sendo que o método compreende administrar a um mamífero jáinfectado com Mycobacterium tuberculosis um ou mais agentesquimioterápicos eficazes contra uma infecção com M. tuberculosis e umaquantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêuticacompreendendo uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênicoda mesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose eum adjuvante, sendo que referida proteína de fusão Mtb72f ou fragmentoimunogênico da mesma induz uma resposta imunológica contra Mtuberculosis, permitindo, com isto, reduzir o decurso da quimioterapia contrauma infecção com M. tuberculosis.

Encurtando o decurso da' quimioterapiacontra uma infecção com M. tuberculosis, os presentes métodos também sãoeficazes para incrementar a adesão de um indivíduo que está sendo tratadopara uma infecção com M. tuberculosis para completar um curso inteiro detratamento.

Breve descrição dos desenhos

Figura 1 mostra uma representação gráfica do modelo dereativação da M tuberculosis em camundongos Swiss Webster (SWR/J). Afigura mostra momentos determinados para infecção, tratamento comquimioterapia (50 mg de rifampina/85 mg de isoniazida por litro de águapotável), imunizações e enumeração de carga bacteriana/unidades formadorasde colônia (CFU).

Figura 2 mostra respostas imunológicas de anticorpos de IgGle IgG2a em camundongos SWR/J infectados com M. tuberculosis tratadoscom quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Camundongos foramdeixados não-tratados, tratados com quimioterapia (50 mg de rifampina/85mg de isoniazida por litro de água potável) ou tratados com quimioterapia eimunizados três vezes intra-muscularmente com 8 μg por dose de Mtb72fformulado sem adjuvante. Dez dias após a última imunização, oscamundongos foram sangrados e os soros testados quanto a resposta deanticorpos anti-Mtb72f para ambos os isótopos, IgGl (vermelho) e IgG2a(preto) por meio de ELISA.

Figura 3 mostra respostas imunológicas de anticorpos de IgGle IgG2a em camundongos SWR/J infectados com M tuberculosis tratadoscom quimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Camundongos foramdeixados não-tratados, tratados com quimioterapia (50 mg de rifampina/85mg de isoniazida por litro de água potável) ou tratados com quimioterapia eimunizados três vezes intra-muscularmente com 8 μg por dose de Mtb72fformulado com o adjuvante ASOIB. Dez dias após a última imunização, oscamundongos foram sangrados e os soros testados quanto à resposta deanticorpo anti-Mtb72f para ambos os isótopos, IgGl (vermelho) e IgG2a(preto), por meio de ELISA.

Figura 4 mostra respostas de interferon-gama (IFN-γ) emcamundongos SWR/J infectados com M. tuberculosis tratados comquimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Células de baço foramobtidas de camundongos em diversos momentos determinados e estimuladasin vitro durante três dias com 10 μg/ml de rMtb72f ou os componentes(Mtb32c e Mtb39) como indicado. Como controles, culturas de esplenócitostambém são estimuladas com PPD (3 μg/ml), lisado de BCG (10 μg/ml),conA (3 μg/ml) ou meio apenas. Infecção com IFN-γ foi medidasubseqüentemente por meio de ELISA.

Figura 5 mostra respostas de IFN-γ em camundongos SWR/Jinfectados com M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois,imunizados com Mtb72f. Células de baço foram obtidas de camundongos emdiversos momentos determinados e estimuladas in vitro durante três dias com10 μg/ml de rMtb72f ou os componentes (Mtb32c e Mtb39) como indicado.

Como controles, culturas de esplenócitos também foram estimuladas comPPD (3 μg/ml), lisado de BCG (10 μg/ml), conA (3 μg/ml) ou meio apenas. Aprodução de EFN-γ foi medida subseqüentemente por meio de ELISA.

Figura 6 mostra respostas de células T CD4+ e citocina IFN-γem camundongos SWR/J infectados com M. tuberculosis tratados comquimioterapia e, depois, imunizados com Mtb72f. Células de baço foramobtidas de camundongos em diversos momentos determinados e estimuladasin vitro de um dia para o outro com 10 μg/ml de rMtb72f. As células foramentão manchadas para CD4 e IFN-γ. Como um controle, culturas deesplenócitos também foram estimuladas com meio apenas. A produção deIFN-γ+ específica para células T CD4+ foi medida subseqüentemente pormeio de manchamento de citocina intracelular (ICS).

Figura 7 mostra um sumário tabulado dos valores de produçãode INF-γ+ específica para células T CD4+ e CD8+ no dia 120 após infecçãocom Mtb. Células de baço foram obtidas de grupos de camundongos deixadosnão-tratados, tratados com combinação quimioterapia durante 30, 60 ou 90dias, ou tratados com quimioterapia de combinação como um adjunto à vacinade Mtb72f. Esplenócitos foram estimulados in vitro de um dia para o outrocom 10 μ§/ηι1 de rMtb72f. As células foram então manchadas para CD4, CD8ou IFN-γ. Como um controle, culturas de esplenócitos também foramestimuladas com meio apenas. Produção de IFN-γ+ específica para células TCD4+ e CD8+ foi medida subseqüentemente por meio de manchamento decitocina intracelular.

Figura 8 mostra a sobre vida de camundongos SWR/Jinfectados com M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois,imunizados com Mtb72f. Camundongos foram infectados via aerossol com50-100 CFU de MtbH37Rv, e iniciou-se quimioterapia (50 mg derifampina/85 mg de isoniazida por litro de água potável) em um subconjuntode camundongos trinta dias mais tarde. Quimioterapia foi prosseguida durante60 dias. Metade daqueles camundongos que receberam quimioterapia foramimunizados três vezes intra-muscularmente com 8 μg por dose de Mtb72fformulado com o adjuvante ASl OB.

Figura 9 mostra a sobrevida de camundongos SWR/Jinfectados com M. tuberculosis tratados com quimioterapia e, depois,imunizados com Mtb72f. Camundongos foram infectados via aerossol com50-100 CFU de MtbH37Rv, e iniciou-se quimioterapia (50 mg derifampina/85 mg de isoniazida por litro de água potável) em um subconjuntode camundongos trinta dias mais tarde. Quimioterapia foi prosseguida durante30, 60 ou 90 dias em subconjuntos separados de camundongos. Metade destescamundongos que receberam quimioterapia foram imunizados três vezesintra-muscularmente com 8 μg por dose de Mtb72f formulado com oadjuvante ASl 0B.

Descrição detalhada de concretizações específicas

A presente invenção refere-se a composições compreendendoproteínas de fusão ou ácidos nucleicos de Mtb72f e um adjuvante úteis paratratar, prevenir, ou retardar a reativação de uma infecção ativa ou inativa (i.e.,latente) com Mycobacterium, e métodos para seu uso. Mais especificamente,as composições da presente invenção compreendem polipeptídeos de fusãoMtb72f ou fragmentos imunogênicos dos mesmos ou ácidos nucleicos quecodificam polipeptídeos de fusão Mtb72f ou fragmentos imunogênicos dosmesmos apresentando componentes de uma espécie de Mycobacterium docomplexo de tuberculose, p. ex., uma espécie, como M. tuberculosis, M.bovis, ou M. afrieanum, ou uma espécie de Mycobaeterium que é ambientalou oportunística e que causa infecções oportunísticas, como infecções dopulmão em hospedeiros imunocomprometidos (p. ex., pacientes com AIDS),p. ex., BCG, M avium, M. intraeellular, M. eelatum, M genavense, M.haemophilum, M. kansasii, M. simiae, M. vaeeae, M. fortuitum, e M.scrofulaceum (ver, p. ex., Harrison's Principies of Internai Medicine, capítulo150, pp. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al., eds., 2005). Os inventores dopresente pedido descobriram, com surpresa, que composições compreendendopolipeptídeos de fusão Mtb72f ou ácidos nucleicos que codificampolipeptídeos de fusão Mtb72f, ou fragmentos imunogênicos dos mesmos,situam-se úteis para tratar, prevenir ou retardar reativação de uma infecçãocom M tuberculosis. Em uma concretização preferida, um polipeptídeo defusão Mtb72f ou ácido nucleico é administrado com um ou mais agentesquimioterápicos. Portanto, estas composições, polipeptídeos, e os ácidosnucleicos que codificam os mesmos são úteis para elicitar uma respostaimunológica em mamíferos que é protetora contra reativação de sintomas dedoença.

Os polipeptídeos de fusão e ácidos nucleicos de Mtb72f dapresente invenção podem compreendem adicionalmente outros componentesprojetados para incrementar sua antigenicidade ou para aperfeiçoar estesantígenos em outros aspectos. Por exemplo, o isolamento aperfeiçoado dosantígenos de polipeptídeo de fusão pode ser facilitado por meio da adição deuma extensão de radicais histidina no sentido de uma extremidade doantígeno.

As composições, polipeptídeos, e ácidos nucleicos da invençãopodem compreender cópias adicionais de antígenos, ou polipeptídeosheterólogos adicionais de Mycobacterium sp., como antígeno MTB8.4,antígeno MTB9.8, antígeno MTB9.9, antígeno MTB40, antígeno MTB41,antígeno ESAT-6, antígeno de complexo MTB85, antígeno α-cristalino, ouantígeno NS1.

Alternativamente ou adicionalmente às composições,polipeptídeos, e ácidos nucleicos da invenção podem compreender cópiasadicionais de outros antígenos de Myeobaeterium sp., como Ag85B ouMTCC#2, as composições, polipeptídeos, e ácidos nucleicos da invençãotambém podem compreender polipeptídeos adicionais de outras fontes. Porexemplo, as composições e proteínas de fusão da invenção podem incluirpolipeptídeos ou ácidos nucleicos que codificam polipeptídeos, sendo que opolipeptídeo incrementa a expressão do antígeno, p. ex., NS1, uma proteínade vírus de influenza (ver, p. ex. W099/40188 e W093/04175). Os ácidosnucleicos da invenção podem ser manipulados com base na preferência decódon em uma espécie de escolha, p. ex., humanos.

As composições de proteína de fusão Mtb72f compreendemusualmente um ou mais adjuvantes, p. ex., ASlOB (lipídeo A demonosfosforila (MPL) e QS21 em uma formulação de lipossoma; ver,Publicação de Patente dos E.U.A. n° 2003/0143240); AS02A (3D-MPL eQS21 e uma emulsão óleo em água; ver, Bojang, et al, Lancet (2001)358:1927); ENHANZYN (Detox); 3D-MPL; saponinas incluindo Quil A eseus componentes, p. ex. QS21 e miméticos de saponina; CWS; TDM; AGP;olinucleopeptídeos imunoestimuladores, p. ex. CPG; Leif; e seus derivados.

Em uma concretização preferida, um polipeptídeo de fusão Mtb72f éadministrado com um ou mais adjuvantes selecionados do grupo que consistede 3D-MPL e QS21 em uma formulação de lipossoma, p. ex. AS10B e MPL eQS21 e uma emulsão óleo em água (p. ex., AS02A). Adjuvantes AS10B eAS02A são descritos adicionalmente em Pichyangkul, et al., Vaccine (2004)22:3831-40.

Quando se fornece o antígeno de Mtb72f como um ácidonucleico, este pode ser fornecido, por exemplo, em um vetor viral (i.e., umvetor de adenovírus), ou em uma célula hospedeira de bactéria mutante (i.e.,uma célula hospedeiro de Mycobaeterium, Lactobacillus ou Baeillus mutante,avirulenta incluindo Bacillus Calmette-Guerin (BCG) e Laetococeus laetis).

Em um aspecto, as composições são empregadas em métodospara prevenir ou tratar reativação da tuberculose em um sujeito, sendo que ométodo compreende a etapa de administrar a um mamífero já infectado comMycobaeterium tubereulosis uma quantidade imunologicamente eficaz deuma composição farmacêutica compreendendo uma proteína de fusão Mtb72fou um fragmento imunogênico da mesma de uma espécie de Myeobaeteriumdo complexo de tuberculose e um adjuvante, sendo que a proteína de fusãoMtb72f induz uma resposta imunológica contra M tuberculosis, prevenindocom isso reativação de tuberculose. Praticando-se os métodos da presenteinvenção, é possível retardar a reativação de uma infecção com Mtuberculosis (por exemplo, por um período de meses, anos ouindefinidamente).

Em um aspecto, as composições são empregadas em métodospara prevenir ou tratar reativação da tuberculose em um sujeito, sendo que ométodo compreende a etapa de administrar a um mamífero já infectado comMycobacterium tuberculosis uma quantidade imunologicamente eficaz deuma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico quecodifica uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico damesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, sendoque a proteína de fusão Mtb72f expressa induz uma resposta imunológicacontra M. tuberculosis, prevenindo, com isso, a reativação de tuberculose.

Em uma concretização, a proteína de fusão ou ácido nucleicode Mtb72f é administrada a um indivíduo com uma infecção ativa de M.tuberculosis. Em uma concretização, a proteína de fusão ou ácido nucleico deMtb72f é administrada a um indivíduo com uma infecção inativa ou latente deM tuberculosis. Em uma concretização, a proteína de fusão ou ácido nucleicode Mtb72f é administrada a um indivíduo infectado com uma cepa de Mtuberculosis resistentes a drogas múltiplas. Em uma concretização, a proteínade fusão ou ácido nucleico de Mtb72f é administrada a um indivíduo que foiimunizado previamente com Bacillus Calmette-Guerin (BCG).

Em algumas concretizações, a proteína de fusão ou ácidonucleico de Mtb72f é administrada com um ou mais agentes quimioterápicoseficazes contra uma infecção com M. tuberculosis. Exemplos de referidosagentes quimioterápicos incluem, embora sem limitação, amicacina, ácidoaminossacilíco, capreomicina, ciclosserina, etambutol, etionamida, isoniazida,canamicina, pirazinamida, rifamicinas (i.e., rifampina, rifapentina erifabutina), estreptomicina, ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina,azitromicina e fluoroquinolonas. Referida quimioterapia é determinada pelocritério do médico responsável usando combinações de drogas preferidas.

Agentes quimioterápicos de "primeira linha" usados para tratar uma infecçãocom M. tuberculosis que não é resistente a droga incluem isoniazida,rifampina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. Agentesquimioterápicos de "segunda linha" usados para tratar uma infecção com Mtuberculosis que demonstrou resistência-a-droga a uma ou mais drogas de"primeira linha" incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácidoaminossacilíco, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina.

A proteína de fusão ou ácido nucleico de Mtb72f pode seradministrada antes, concorrentemente com, ou após administração do um oumais agentes quimioterápicos eficazes contra uma infecção com Mtuberculosis. Em uma concretização, a proteína de fusão ou ácido nucleico deMtb72f é administrada cerca de 2 semanas após o início da administração deum ou mais agentes quimioterápicos. O um ou mais agentes quimioterápicossão administrados geralmente durante um determinado período, por exemplo,durante cerca de 1, 2, 3, ou 4 semanas, 2, 3, 4, 5, 6 ou 8 meses, 1 ano ou maistempo.

Em determinadas concretizações, o efeito de uma proteína defusão ou ácido nucleico de Mtb72f é incrementado pela administração comBacillus Calmette-Guerin (BCG).

Em algumas concretizações, uma preparação ou primeiraadministração de um polipeptídeo de fusão ou ácido nucleico de Mtb72f éseguida de uma ou mas administração de "reforço" ou subseqüentes de umpolipeptídeo de fusão ou ácido nucleico de Mtb72f (método de "iniciar ereforçar"). Por exemplo, uma primeira administração com um polipeptídeo defusão ou ácido nucleico de Mtb72f é seguida de uma ou mais administraçõessubseqüentes de uma proteína de fusão ou ácido nucleico de Mtb72f. Em umaconcretização, uma primeira administração com um polipeptídeo de fusão ouácido nucleico de Mtb72f é seguida de uma ou mais administraçõessubseqüentes de um polipeptídeo de fusão Mtb72f. Em uma concretização,uma primeira administração com um polipeptídeo de fusão ou ácido nucleicode Mtb72f é seguida de uma ou mais administrações subseqüentes de umácido nucleico Mtb72f. Usualmente, a primeira administração ouadministração de "iniciação" e a segunda administração ou administração de"reforço" são dadas com intervalo de cerca de 2-12 semanas, ou de até 4 a 6meses. Administrações de "reforço" subseqüentes são dadas com intervalos decerca de 6 meses, ou de até 1, 2, 3, 4 ou 5 anos. Tratamento de reforçoconvencional (p. ex., uma administração de início de proteína, seguida de umaadministração de reforço de proteína) também é útil para prevenir ou tratarcontra reativação de M. tuberculosis.

Em outro aspecto, as composições são empregadas emmétodos para reduzir ou encurtar o decurso da quimioterapia contra umainfecção com M. tuberculosis, sendo que o método compreende administrar aum mamífero já infectado com Mycobacterium tuberculosis um ou maisagentes quimioterápicos eficazes contra uma infecção com M tuberculosis euma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição farmacêuticacompreendendo um polipeptídeo de fusão Mtb72f ou um fragmentoimunogênico da mesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo detuberculose e um adjuvante, sendo que referido polipeptídeo de fusão Mtb72finduz uma resposta imunológica contra M tuberculosis, permitindo com istoreduzir ou encurtar o decurso da quimioterapia contra uma infecção com Mtuberculosis. Usualmente, a administração de um polipeptídeo de fusão ouácido nucleico de Mtb72f se seguirá a tratamento quimioterápico eficaz contrauma infecção com M tuberculosis dentro de 6 meses, 5 meses, 4 meses, 3meses, ou menos.

As composições de Mtb72f são administradas usualmente ahumanos, mas são eficazes em outros mamíferos, incluindo mamíferosdomésticos (i.e., cães, gatos, coelhos, ratos, camundongos, porquinhos-da-índia, hamsters, chinchilas) e mamíferos agrícolas (i.e., vacas, porcos, ovelha,cabras, cavalos).

Em seu aspecto mais geral, uma proteína de fusão Mtb72f deacordo com a invenção é uma proteína compreendendo pelo menos umfragmento imunogênico de cada um dos 3 antígenos Ral2-TbH9-Ra35.

Na nomenclatura da aplicação, Ra35 refere-se à extremidade Nde Mtb32A (Ra35FL), compreendendo pelo menos cerca dos primeiros 205aminoácidos de Mtb32A de M. tuberculosis, cuja seqüência de nucleotídeos eaminoácidos é revelada na Figura 4 do Pedido de Patente dos E.U.A.09/597.796, ou a região correspondente de outra espécie de Mycobacterium.

Da forma mais típica, Ra35 refere-se à porção da SEQ ID No: 2 revelada nopresente pedido correspondente aos radicais de 535 a 729. Alternativamenteisto refere-se a uma variante em Ra35 em que o aminoácido Sercorrespondente a 710 na SEQ ID No: 2 é substituído por Ala.

Ral2 refere-se à extremidade C de Mtb32A (Ra35FL),compreendendo pelo menos cerca dos últimos 132 aminoácidos de MTB32Ade M. tuberculosis, cuja seqüência é revelada como SEQ ID NO:4 (DNA) eSEQ ID NO:66 (seqüência de aminoácidos predita) no Pedido de Patente dosE.U.A. n° 09/072.967, ou a região correspondente de outra espécie deMycobacterium. Da forma mais típica, Ra 12 refere-se à porção da SEQ IDNo: 2 revelada no presente pedido correspondente aos radicais de 8 a 139.

Mtb39 (TbH9) refere-se a uma seqüência essencialmente []àquela divulgada como SEQ ID NO: 106 (cDNA de comprimento pleno) eSEQ ID NO: 107 (proteína de comprimento pleno) nos Pedidos de Patentesdos E.U.A. n° 08/658.800, n° 08/659.683, n° 08/818.112, e n° 08/818.111 enos pedidos W097/09428 e W097/09429. A seqüência também é divulgadacomo SEQ ID NO:33 (DNA) e SEQ ID NO:91 (aminoácido) no Pedido dePatente dos E.U.A. n° 09/056.559. Da forma mais típica, TbH9 refere-se àporção da SEQ ID No: 2 divulgada no presente pedido correspondente aosradicais de 143 a -532.

O texto a seguir proporciona seqüências de alguns antígenosindividuais usados nas composições e proteínas de fusão da invenção:

Mtb32A (TbRa35FL ou Ra35FL), cuja seqüência é divulgadacomo SEQ ID NO: 17 (cDNA) e SEQ ID NO:79 (proteína) nos Pedidos dePatentes dos E.U.A. nums. 08/523.436, 08/523.435, n° 08/658.800, n°08/659.683, n° 08/818.112, n° 09/056.556, e n° 08/818.111 e nos pedidosW097/09428 e W097/09429, ver também Skeiky et al, Infecction andImmunity 67:3998-4007 (1999);

O texto a seguir proporciona seqüências de algumas proteínasde fusão da invenção:

TbH9-Ra35 (Mtb59F), cuja seqüência é divulgada como SEQID NO:23 (cDNA) e SEQ ID NO:24 (proteína) no Pedido de Patente dosE.U.A. n° 09/287.849 e no Pedido PCT/US99/07717;

Ral2-TbH9-Ra35 (Mtb72f), cuja seqüência é divulgada comoSEQ ID NO:l ou SEQ ID NO: 5 (DNA) e SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:6(proteína) no presente pedido, e também no Pedido de Patente dos E.U.A. n°09/223.040, e no PCT/US99/07717. As seqüências da SEQ ID NO: 1 e SEQID NO:2 incluem um marcador His de radicais 6 His.

M72 que é um mutante de Mtb72f em que o radical serina noaminoácido correspondente à posição 710 na SEQ ID No: 2 foi substituídopor Ala, (e também radicais 4 His removidos do marcador His na extremidadeN) cuja seqüência é divulgada como SEQ ID No: 3 (DNA) e SEQ ID No: 4(proteína) no presente pedido. Uma variante destas seqüências em que aproteína apresenta um marcador His de radicais 6 His é divulgada no Pedidode Patente dos E.U.A. n° 09/597.796 e no PCT/US01/19959. Devido àsubstituição de Ser710 por Ala, acredita-se que M72 é mais resistente aautólise do que Mtb72f.

O texto a seguir proporciona seqüências de alguns antígenosadicionais usados nas composições e proteínas de fusão da invenção:

Mtb8.4 (DPV), cuja seqüência é divulgada como SEQ ID NO:101 (cDNA) e SEQ ID NO: 102 (proteína) nos Pedidos de Patentes dos E.U.A.nums. 08/658.800, n° 08/659.683, n° 08/818.112 e n° 08/818.111 e nosPedidos W097/09428 e W097/09429;

Mtb9.8 (MSL), cuja seqüência é divulgada como SEQ ID NO:12 (DNA), SEQ ID NO: 109 (seqüência de aminoácidos predita) e SEQ IDNO: de 110 a 124 (peptídeos) nos Pedidos de Patentes dos E.U.A. n°08/859.381, n° 08/858.998, n° 09/073.009 e n° 09/073.010 e nos PedidosPCT/US98/10407 e PCT/US98/10514;

Mtb9.9A (MTI, também conhecido como MTI-A), cujaseqüência é divulgada como SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4 (DNA) e SEQ IDNO:29 e SEQ ID NO: de 51 a 66 (peptídeo de matriz de leitura aberta paraMTI) nos Pedidos de Patentes dos E.U.A. n° 08/859.381, n° 08/858.998, n°09/073.009 e n° 09/073.010 e nos Pedidos PCT/US98/10407 ePCT/US98/10514. Também existem duas outras variantes de MTI,denominadas MTI-B e MTI-C;

Mtb40 (HTCC#1), cuja seqüência é divulgada como SEQ IDNO: 137 (cDNA) e 138 (seqüência de aminoácidos predita) nos Pedidos dePatentes dos E.U.A. n° 09/073.009 e n° 09/073.010 e nos PedidosPCT/US98/10407 e PCT/US98/10514:

Mtb41 (MTCC#2), cuja seqüência é divulgada como SEQ IDNO: 140 (cDNA) e SEQ ID NO: 142 (seqüência de aminoácidos predita) nosPedidos de Patentes dos E.U.A. n° 09/073,009 e n° 09/073,010 e nos PedidosPCT/US98/10407 e PCT/US98/10514;

ESAT-6, cuja seqüência é divulgada como SEQ ID NO: 103(DNA) e SEQ ID NO: 104 (seqüência de aminoácidos predita) no Pedido dePatente dos E.U.A. n° 09/072.967. A seqüência de ESAT-6 também édivulgada na Patente dos Estados Unidos n° 5.955.077;

Antigeno α-cristalino, cuja seqüência é divulgada em Verbonet al, J. Bact. 174:1352- 1359(1992);

antígeno de complexo 85, cuja seqüência é divulgada emContent et al, Infect. & Immunol. 59:3205-3212 (1991).

Cada uma das seqüências acima também é divulgada em Coleet al. Nature 393:537 (1998) e podem ser encontradas, por exemplo, emhttp://www.sanger.ac.uk e http:/www.pasteur.fr/mycdb/.

As seqüências acima são divulgadas nos Pedidos de Patentesdos E.U.A. n° 08/523.435, 08/523.436, 08/658.800, 08/659.683, 08/818.111,08/818.112, 08/942.341, 08/942.578, 08/858.998, 08/859.381, 09/056.556,09/072.596, 09/072.967, 09/073.009, 09/073.010, 09/223.040, 09/287.849 enos Pedidos de Patentes PCT PCT/US98/10407, PCT/US98/10514,PCT/US99/03265, PCT/US99/03268, PCT/US99/07717, W097/09428 eW097/09429, W098/16645, W098/16646, sendo que cada um é incorporadoaqui por referência.

Os antígenos aqui descritos incluem variantes polimórficas evariações modificadas conservativamente, e também homólogos deMycobacterium inter-cepas e inter-espécies. Adicionalmente, os antígenosaqui descritos incluem subseqüências ou seqüências truncadas. As proteínasde fusão também podem conter polipeptídeos adicionais, opcionalmentepeptídeos heterólogos de Myeobacterium ou outras fontes. Estes antígenospodem ser modificados, por exemplo, por meio de adição de seqüências depeptídeos ligantes como descrito abaixo. Estes peptídeos ligantes podem serinseridos entre um ou mais componentes que constituem cada uma dasproteínas de fusão.

Definições

O termo "reativação de tuberculose" refere-se à manifestaçãotardia de sintomas de doenças em um indivíduo que se testou positivo em umteste de tuberculina, mas que não apresenta sintomas de doença aparentes. Oindivíduo é infectado com M. tuberculosis, e pode ou não apresentar sintomasde doença ativa previamente manifestada que foi tratada suficientemente paratrazer a tuberculose a um estado inativo ou latente. No entanto, é possíveliniciar métodos para a prevenção ou tratamento de reativação da tuberculoseem um indivíduo que manifesta sintomas ativos de doença.

"Tuberculose primária" refere-se a doença clínica(manifestação de sintomas de doença) diretamente após infecção com Mtuberculosis. Ver, Harrison 's Principies of Internai Medicine, capítulo 150,pp. 953-966 (16a ed., Braunwald, et al, eds., 2005).

"Tuberculose secundária" ou "tuberculose pós-primária"refere-se à reativação de infecção dormente, inativa ou latente com Mtuberculosis. Ver, Harrison 's Principies of Internai Medicine, supra.

Uma "infecção ativa de M. tuberculosis" refere-se a umainfecção com M. tuberculosis com sintomas de doença manifestados.

Uma "infecção inativa, dormente ou latente de Mtuberculosis" refere-se a uma infecção com M. tuberculosis sem sintomas dedoença manifestados.

Uma infecção de M. tuberculosis "resistente a droga" refere-sea uma infecção com M. tuberculosis sendo que a cepa infectante não émantida estática ou morta (é resistente a) um ou mais assim-chamadosagentes quimioterápicos eficazes "de primeira linha" para tratar uma infecçãocom M. tuberculosis (p. ex., isoniazida, rifampina, etambutol, estreptomicinae pirazinamida).

Uma infecção de M. tuberculosis "resistente a múltiplasdrogas" refere-se a uma infecção com M. tuberculosis, sendo que a cepainfectante é resistente a dois ou mais agentes quimioterápicos eficazes de"linha de frente" para tratar uma infecção de M. tuberculosis.Um "agente quimioterápico eficaz para tratar uma infecçãocom M. tuberculosis" refere-se a agentes farmacológicos conhecidos e usadosna arte para tratar infecções com M. tuberculosis. Agentes farmacológicosexemplificados usados para tratar infecções com M. tuberculosis incluem,embora sem limitação, amicacina, ácido aminossacilíco, capreomicina,ciclosserina, etambutol, etionamida, isoniazida, canamicina, pirazinamida,rifamicinas (i.e., rifampina, rifapentina e rifabutina), estreptomicina,ofloxacina, ciprofloxacina, claritromicina, azitromicina e fluoroquinolonas.Agentes quimioterápicos de "primeira linha" usados para tratar uma infecçãocom M. tuberculosis que não é resistente a droga incluem isoniazida,rifampina, etambutol, estreptomicina e pirazinamida. Agentesquimioterápicos de "segunda linha" usados para tratar uma infecção com Mtuberculosis que demonstrou resistência-a-droga a uma ou mais drogas de"primeira linha" incluem ofloxacina, ciprofloxacina, etionamida, ácidoaminossacilíco, ciclosserina, amicacina, canamicina e capreomicina.Referidos agentes farmacológicos são revistos no capítulo 48 de Goodman eGilman1S The Pharmacological Basis of Therapeutics, Hardman e Limbirdeds., 2001.

"FL" refere-se a full-length [comprimento total], i.e., umpolipeptídeo que tem o mesmo comprimento do polipeptídeo de tiposelvagem.

"Marcador His [.His tag]" refere-se a um seqüência de radicaisHis, tipicamente 6 radicais que são inseridos na extremidade N, usualmente eimediatamente após o início do radical Met ou, então, na extremidade C. Elessão usualmente heterólogos com relação à seqüência nativa, mas sãoincorporados porque facilitam o isolamento por meio de aperfeiçoamento daligação da proteína sobre resinas de cromatografia de afinidade de metalimobilizadas (IMAC). De uma forma geral, a presença ou ausência de ummarcador His não é significativa do ponto de vista de causar uma respostaimunológica útil contra a proteína antigênica a ser elicitada. No caso de umareação imune adversa contra o próprio marcador His ser elicitada, éconsiderado a melhor opção minimizar o comprimento do marcador His, p.ex., a 4 ou menos radicais, em particular dois radicais.

O termo "fragmento imunogênico do mesmo" refere-se a umpolipeptídeo compreendendo um epitopo que é reconhecido por linfócitos Tcitotóxicos, linfócitos T auxiliares ou células B. Tipicamente um fragmentoimunogênico de Mtb72f será um polipeptídeo contendo 500 ou maisaminoácidos, p. ex. 600 ou mais aminoácidos, p. ex. 700 ou maisaminoácidos. A invenção também abrange uma pluralidade de fragmentos, p.ex. superpondo fragmentos que, em conjunto, cobrem toda ousubstancialmente toda a seqüência (p. ex. 500 ou mais aminoácidos, p. ex.600 ou mais aminoácidos, p. ex. 700 ou mais aminoácidos) de uma proteínade fusão Mtb72F.

O termo "espécie de Mycobacterium do complexo detuberculose" inclui aquelas espécies consideradas tradicionalmente comocausando a doença tuberculose, e também espécies ambientais eoportunísticas de Myeobaeterium que causam tuberculose e doença dopulmão em pacientes imunocomprometidos, como pacientes com AIDS, p.ex., M. tubereulosis, M. bovis, ou M. africanum, BCG, M. avium, M.intraeellular, M. eelatum, M. genavense, M. haemophilum, M. kansasii, M.simiae, M. vaeeae, M. fortuitum, e M. serofulaceum (ver, p. ex., Harrison 'sPrincipies of Internai Medicine, capítulo 150, pp. 953-966 (16a ed.,Braunwald, et al, eds., 2005).

Um adjuvante refere-se aos componentes em uma vacina oucomposição terapêutica que incrementa a resposta imunológica específica aoantígeno (ver, p. ex., Edelman, AIDS Res. Hum Retroviruses 8:1409-1411(1992)). Adjuvantes induzem respostas imunológicas da resposta de tipo Thle de tipo Th-2. As citocinas de tipo Thl (p. ex., IFN-γ, IL-2, e IL-12) tendema favorecer a indução de resposta imunológica mediada com células a umantígeno administrado, enquanto que citocinas de tipo Th-2 (p. ex., IL-4, IL-5,11-6, IL-IO e TNF-β) tendem a favorecer a indução de respostas imunológicashumorais. Adjuvantes capazes de estimulação preferencial de uma respostaimunológica mediada com célula Th-I encontram-se descritos no WO94/00153 e WO 95/17209.

"Ácido nucleico" refere-se a desoxirribonucleotídeos ouribonucleotídeos e polímeros dos mesmos em forma de filamento simples ouduplo. O termo compreende ácidos nucleicos contendo análogos denucleotídeos conhecidos ou radicais de estrutura modificada ou ligações, quesão sintéticas, naturalmente ocorrentes, e não-naturalmente ocorrentes, queapresentam propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência,e que são metabolizadas de maneira similar aos nucleotídeos de referência.Exemplos de referidos análogos incluem, sem limitação, fosforotioatos,fosforamidatos, fosfonatos de metila, fosfonatos de metila quirais,ribonucleotídeos de 2-O-metila, ácidos nucleicos de peptídeos (PNAs).

Exceto se indicado de outra forma, uma seqüência de ácidonucleico particular também compreende implicitamente suas variantesmodificadas conservativamente (p. ex., substituições de códons degenerados)e seqüências complementares, e também a seqüência indicada explicitamente.Especificamente, é possível obter substituições de códons degenerados pormeio de geração de seqüências em que a terceira posição de um ou maiscódons selecionados (ou de todos) é substituída por radicais de base mistae/ou desoxinosina (Batzer et al, Nucleic AeidRes. 19:5081 (1991); Ohtsuka etal, J. BioL Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al, Mol Cell. Probes8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é usado de forma intercambiávelcom gene, cDNA, mRNA, oligonucleotídeo, e polinucleotídeo.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usadosintercambiavelmente aqui para referir a um polímero de radicais deaminoácidos. Os termos aplicam-se a polímeros de aminoácidos em que umou mais radicais de aminoácidos é um mimético artificial de um aminoácidonaturalmente ocorrente correspondente, e também polímeros de aminoácidosnaturalmente ocorrentes e polímero de aminoácidos não-naturalmenteocorrentes.

O termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturalmenteocorrentes e sintéticos, e também análogos de aminoácidos e miméticos deaminoácido que funcionam de maneira similar aos aminoácidos naturalmenteocorrentes. Aminoácidos naturalmente ocorrentes são aqueles codificadospelo código genético, e também aqueles aminoácidos que são modificadosposteriormente, p. ex., hidroxiprolina, γ- carboxiglutamato, e O-fosfosserina.Análogos de aminoácidos refere-se a compostos que apresentam a mesmaestrutura química básica que um aminoácido naturalmente ocorrente, i.e., umα carbono que é ligado a um hidrogênio, um grupo carboxila, um grupoamino, e um grupo R, p. ex., homosserina, norleucina, sulfóxido demetionina, metil sulfônio de metionina. Referidos análogos apresentamgrupos R modificados (p. ex., norleucina) ou espinhas dorsais de peptídeosmodificadas, mas conservam a mesma estrutura química básica que oaminoácido naturalmente ocorrente. Miméticos de aminoácidos referem-se acompostos químicos que apresentam a estrutura que é diferente da estruturaquímica geral de um aminoácido, mas que funciona de maneira similar a umaminoácido naturalmente ocorrente.

Aminoácidos podem ser referidos aqui por seus símbolos detrês letras comumente conhecidos ou pelos símbolos de uma letra sórecomendados pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB.Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de umaletra só comumente aceitos.

"Variantes modificadas conservativamente" aplica-se aseqüências de aminoácidos e ácido nucleico. Com relação a seqüências deácido nucleico particulares, variantes modificadas conservativamentereferem-se àqueles ácidos nucleicos que codificam seqüências de aminoácidosidênticas ou substancialmente idênticas, ou em que o ácido nucleico nãocodifica uma seqüência de aminoácidos, a seqüências substancialmenteidênticas. Devido à degeneração do código genético, um grande número deácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína.Por exemplo, todos os códons GCA, GCC, GCG e GCU codificar oaminoácido alanina. Assim, em cada posição em que uma alanina éespecificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer um doscódons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado.Referidas variações de ácido nucleico são "variações silentes", que são umaespécie de variações modificadas conservativamente. Cada seqüência deácido nucleico aqui que codifica um polipeptídeo também descreve cadapossível variação silente do ácido nucleico. Alguém com prática na arte serácapaz de reconhecer que cada códon em um ácido nucleico (exceto AUG, queé ordinariamente o único códon para metionina, e TGG, que é ordinariamenteo único códon para triptofano) pode ser modificado para dar uma moléculafuncionalmente idêntica. Assim, cada variação silente de um ácido nucleicoque codifica um polipeptídeo está implícita em cada seqüência descrita.

Quanto às seqüências de aminoácidos, alguém com prática naarte reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais em umácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteína que alteram,adicionam, ou deletam um único aminoácido ou um pequeno percentual deaminoácidos na seqüência codificada é uma "variante modificadaconservativamente" sendo que a alteração resulta na substituição de umaminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Tabelas desubstituições conservativas que proporcionam aminoácidos funcionalmentesimilares são bem conhecidos na arte. Referidas variantes modificadasconservativamente são adicionais e não excluem variantes polimórficas,homólogos inter-espécies, e alelos da invenção.

Cada um dos oito grupos a seguir contém aminoácidos que sãosubstituições conservativas mútuas:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Acido aspártico (D), Acido glutâmico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleueina (I), Leueina (L), Metionina (M),Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); e

8) Cisteína (C), Metionina (M)(ver, p. ex., Creighton, Proteins (1984)).

O termo "heterólogo" quando usado com referência a porçõesde um ácido nucleico, indica que o ácido nucleico compreende duas ou maissubseqüências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza.Por exemplo, tipicamente, o ácido nucleico é produzido recombinantemente,apresentando duas ou mais seqüências de genes não-relacionados dispostaspara formar um ácido nucleico funcional novo, p. ex., um promotor de umafonte e uma região codificante de outra fonte. De maneira análoga, umaproteína heteróloga indica que a proteína compreende duas ou maissubseqüências que não são encontradas na mesma relação entre si na natureza(p. ex., uma proteína de fusão).

"Polipeptídeo de fusão" ou "proteína de fusão" refere-se a umaproteína apresentando pelo menos dois polipeptídeos heterólogos deMycobacterium sp. ligados covalentemente, seja diretamente ou via umligante de aminoácido. Os polipeptídeos que formam a proteína de fusão sãoligados tipicamente extremidade C à extremidade N, embora também possamser ligados extremidade C à extremidade C, extremidade N à extremidade N,ou extremidade N à extremidade C. Os polipeptídeos da proteína de fusãopodem ser em qualquer ordem. Este termo também se refere a variantesmodificadas conservativamente, variantes polimórficas, alelos, mutantes,subseqüências, e homólogos inter-espécies dos antígenos que formam aproteína de fusão. Antígenos de Mycobacterium tuberculosis são descritos emCole et al, Nature 393:537 (1998), que divulga todo o genoma deMyeobacterium tuberculosis. A seqüência completa de Mycobaeteriumtuberculosis também pode ser encontrada em http://www.sanger.ac.uk e athttp://www.pasteur.fr/mycdb/ (MycDB). Antígenos de outras espécies deMycobacterium que correspondem a antígenos de M. tuberculosis podem sermodificados, p. ex., usando-se algoritmos de comparação de seqüências,como descrito aqui, ou outros métodos conhecidos por aqueles com prática naarte, p. ex., ensaios de hibridização e ensaios de ligação de anticorpo.

Proteínas de fusão Mtb72f exemplares de uso na presenteinvenção incluem:

Proteínas compreendendo radicais de 8 a 729 da seqüência daSEQ ID No: 2;

Proteínas compreendendo ou consistindo da seqüência da SEQID No: 2 (=Mtb72f) opcionalmente sem os radicais de 2 a 7 formadores domarcador His de referida seqüência ou com um marcador His de comprimentodiferente;

Proteínas de fusão compreendendo a seqüência SEQ ID No: 2opcionalmente sem os radicais de 2 a 7 formadores de marcador His dereferidas seqüências ou com um marcador His de comprimento diferente (p.ex., uma proteína compreendendo radicais de 8 a 729 da seqüência da SEQ IDNo: 2) em conjunto com um ou mais antígenos de M. tuberculosis, porexemplo uma ou mais das proteínas listadas nos parágrafos de [0045] a [0052]acima, ou um fragmento imunogênico das mesmas;

Proteínas compreendendo radicais de 4 a 725 da seqüência daSEQ ID No: 4 (=M72);

Proteínas compreendendo ou consistindo da seqüência da SEQID No: 4 (=M72) opcionalmente sem os radicais de 2 a 3 formadores domarcador His de referida seqüência ou com um marcador His de comprimentodiferente; e

Proteínas de fusão compreendendo a seqüência SEQ ID No: 4opcionalmente sem os radicais de 2 a 3 formadores de marcador His dereferida seqüência ou com um marcador His de comprimento diferente (p. ex.uma proteína compreendendo radicais de 4 a 725 da seqüência da SEQ IDNo: 4) em conjunto com um ou mais antígenos de M. tuberculosis, porexemplo um ou mais das proteínas listadas nos parágrafos de [0045] a [0052]acima, ou um fragmento imunogênico de qualquer uma das mesmas;

Fragmentos imunogênicos exemplares de uma proteínas defusão Mtb72f de uso na presente invenção incluem:

Proteínas compreendendo ou consistindo da seqüência deTbH9-Ra35 (Mtb59F); ou TbH9; ou Ra35; ou Ral2; e

Proteínas de fusão compreendendo referidas seqüências emconjunto com um ou mais antígenos de M. tuberculosis, por exemplo uma oumais das proteínas listadas nos parágrafos [0045] a [0052] acima, ou umfragmento imunogênico de qualquer um dos mesmos.

Fragmentos imunogênicos exemplares adicionais de umaproteínas de fusão Mtb72f de uso na presente invenção incluem:

Proteínas compreendendo ou consistindo da seqüência deTbH9-Ra35 (Mtb59F) ou Ra35 em que a posição correspondente a Ser710 naSEQID No: 2 foi substituída por Ala; e

Proteínas de fusão compreendendo referidas seqüências emconjunto com um ou mais antígenos de M. tuberculosis, por exemplo uma oumais das proteínas listadas nos parágrafos de [0045] a [0052] acima, ou umfragmento imunogênico de qualquer um dos mesmos.Mais especificamente a Mtb72f é:

um polipeptídeo compreendendo radicais de 8 a 729 da SEQID NO:2; ou

um polipeptídeo que consiste de radicais 1 e de 8 a 729 daSEQ ID NO:2 opcionalmente com um marcador His inserido após o radicalMet inicial; ou

um polipeptídeo da SEQ ID NO:2; ou

um polipeptídeo compreendendo radicais de 4 a 725 da SEQID NO :4; ou

um polipeptídeo que consiste de radicais 1 e de 4 a 725 daSEQ ID NO:4 opcionalmente com um marcador His inserido após o radicalMet inicial; ou

um polipeptídeo da SEQ ID NO:4; ou

um polipeptídeo da SEQID N0:6.

Proteínas de fusão Mtb72f exemplares adicionais e fragmentosimunogênicos das mesmas incluem as proteínas indicadas acima em que asextremidades N e/ou C foram encurtadas em, por exemplo, 5 ou 4 ou 3 ou 2ou 1 radicais de aminoácidos.

Proteínas de fusão Mtb72f exemplares adicionais e fragmentosimunogênicos das mesmas incluem as proteínas mencionadas acima em queaté 10% dos aminoácidos, p. ex. até 5% dos aminoácidos (p. ex. até 10, p. ex.até 5) aminoácidos foram substituídos por substituições conservativas comodefinido aqui.

Ácidos nucleicos de Mtb72f exemplares de uso na presenteinvenção incluem ácidos nucleicos (p. ex., moléculas de DNA) codificando asproteínas de fusão Mtb72f exemplares previamente mencionadas efragmentos imunogênicos das mesmas. Um conjunto de moléculas de DNAespecíficas que pode ser mencionado compreende nucleotídeos de 63 a 2228da SEQ ID No: 1. Outro conjunto de moléculas de DNA específicas que podeser mencionado compreende nucleotídeos de 10 a 2175 da SEQ ID No: 3.Moléculas de DNA específicas que podem ser mencionadas compreendem ouconsistem da SEQ ID No: 1 ou SEQ ID No: 3 ou SEQID No: 5.

O termo "fundido" refere-se à ligação covalente entre doispolipeptídeos em uma proteína de fusão. Os polipeptídeos são conjugadostipicamente via uma ligação peptídica, seja diretamente entre si ou via umaligante de aminoácido. Opcionalmente, os peptídeos podem ser conjugadosvia ligações covalentes não-peptídicas conhecidas por aqueles com prática naarte.

A expressão "hibridiza seletivamente (ou especificamente)com" refere-se à ligação, duplexação, ou hibridização de uma moléculaapenas com uma seqüência de nucleotídeo particular em condições dehibridização estringentes quando a seqüência está presente em uma misturacomplexa (p. ex., RNA ou DNA celular total ou de biblioteca).

A expressão "condições de hibridização estringentes" refere-sea condições em que uma sonda hibridará com sua subseqüência-alvo,tipicamente em uma mistura complexa de ácido nucleico, mas não com outrasseqüências. Condições estringentes são dependentes da seqüência e serãodiferentes em circunstâncias diferentes. Seqüências mais longas hibridamespecificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo para ahibridização de ácidos nucleicos é encontrado em Tijssen, Techniques inBioehemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nueleic Probes,"Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acidassays" (1993). De uma forma geral, condições estringentes são selecionadascerca de 5 a 10°C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (Tm) para aseqüência específica a um pH definido de intensidade iônica. A Tm é atemperatura (sob intensidade iônica definida, pH, e concentração nucleica) àqual 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a seqüência-alvoem equilíbrio (como as seqüências-alvos estão presentes em excesso, à Tm,50% das sondas são ocupadas em equilíbrio). Condições estringentes serãoaquelas em que a concentração de sal é inferior a cerca de 1,0 M de íon sódio,tipicamente, uma concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íon sódio (ououtros sais) a pH de 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°Cpara sondas curtas (p. ex., de 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos cerca de60°C para sondas longas (p. ex., acima de 50 nucleotídeos). Condiçõesestringentes também podem ser obtidas com a adição de agentesdesestabilizantes, como formamida.

Para hibridização seletiva ou específica, um sinal positivo é depelo menos duas vezes o fundo, opcionalmente 10 vezes a hibridização defundo. Condições de hibridização estringentes exemplares podem ser asseguintes: 50% de formamida, 5x de SSC, e 1% de SDS, incubando a 42°C,ou, 5x SSC, 1% de SDS, incubando a 65°C, com lavagem em 0,2x de SSC, e0,1% de SDS a 65°C.

Ácidos nucleicos que não hibridam entre si em condiçõesestringentes ainda são substancialmente idênticas se os polipeptídeos que elascodificam forem substancialmente idênticos. Isto ocorre, por exemplo,quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando-se a máximadegeneração de códon permitida pelo código genético. Nesses casos, osácidos nucleicos hibridam tipicamente em condições de hibridizaçãomoderadamente estringentes. "Condições de hibridização moderadamenteestringentes" exemplares incluem uma hibridização em um tampão de 40% deformamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em IX SSC a45°C. Uma hibridização positiva é pelo menos duas vezes o fundo. Aquelescom prática ordinária reconhecerão facilmente que condições de lavagem ehibridização alternativas podem ser usadas para proporcionar condições deestringência similar.

"Anticorpo" refere-se a um polipeptídeo compreendendo umaregião de matriz de um gene de imunoglobulina ou fragmentos do mesmo quese ligam especificamente e reconhecem um antígeno. Os genes deimunoglublina reconhecidos incluem os genes de região constante mu, capa,lambda, alfa, gama, delta e epsílon, e também os muitos genes de regiãovariável de imunoglublina. Cadeias leves são classificadas como capa oulambda. Cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta, ouepsílon, que, por sua vez, definem as classes de imunoglublina, IgG, IgM,IgA, IgD e IgE, respectivamente.

Uma unidade estrutural de imunoglublina exemplar(anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é constituída de doispares idênticos de cadeias de polipeptídeos, cada par apresentando uma cadeia"leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50 a 70 kDa). Aextremidade N de cada cadeia define uma região variável de cerca de 100 a110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis para reconhecimentode antígeno. Os termos cadeia leve variável (Vl) e cadeia pesada variável(Vh) referem-se a estas cadeias leve e pesada, respectivamente.

Anticorpos existem, p. ex., como imunoglobulinas intactas oucomo uma variedade de fragmentos bem caracterizados produzidos por meiode digestão com várias peptidases. Assim, por exemplo, pepsina digere umanticorpo abaixo das ligações dissulfeto na região de dobradiça para produzirF(ab)'2, um dímero de Fab que, por si só, é uma cadeia leve conjugada a Vh-ChI por uma ligação dissulfeto. O F(ab)'2 pode ser reduzido em condiçõesbrandas para quebrar a ligação dissulfeto na região de dobradiça, convertendocom isso o dímero F(ab)'2 em um monômero Fab'. O monômero Fab1 éessencialmente Fab com parte da região de dobradiça (ver FundamentalImmunology (Paul ed., 3a ed. 1993). Embora vários fragmentos de anticorpossejam definidos em termos da digestão de um anticorpo intacto, alguém comprática perceberá que referidos fragmentos podem ser sintetizados de novo,seja quimicamente ou com o uso de metodologia de DNA recombinante.Assim, o termo anticorpo, como usado aqui, também inclui fragmentos deanticorpo, seja produzidos por meio da modificação de anticorpos inteiros, ouaqueles sintetizados de novo usando metodologias de RNA recombinantes (p.ex., Fv de cadeia simples) ou aqueles identificados usando bibliotecas deapresentação de fago (ver, p. ex., McCafferty et al, Nature 348:552-554(1990)).

Para a preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais, épossível usar qualquer técnica conhecida na arte (ver, p. ex., Kohler &Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al, pp. 77-96 em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy(1985)). Técnicas para a produção de anticorpos de cadeia simples (Patentedos Estados Unidos n° 4,946,778) podem ser adaptadas para produziranticorpos para polipeptídeos desta invenção. Também é possível usarcamundongos transgênicos, ou outros organismos, como outros mamíferos,para expressar anticorpos humanizados. Alternativamente, é possível usartecnologia de apresentação de fago para identificar anticorpos e fragmentosFab heteroméricos que se ligam especificamente a antígenos selecionados(ver, p. ex., McCafferty et al, Nature 348:552-554 (1990); Marks et al,Biotechnology 10:779-783 (1992)).

A expressão "liga-se especificamente (ou seletivamente)" a umanticorpo ou "especificamente (ou seletivamente) imunorreativo com",quando referindo a uma proteína ou peptídeo, refere-se a uma reação deligação que é determinante da presença da proteína em uma populaçãoheterogênea de proteínas e outras biologias. Assim, em condiçõesdeterminadas de ensaio imunológico, os anticorpos especificados ligam-se auma proteína particular pelo menos duas vezes o fundo e não se ligamsubstancialmente numa quantidade significativa a outras proteínas presentesna amostra. Ligação específica a um anticorpo nessas condições pode exigirque um anticorpo seja selecionado por sua especificidade para uma proteínaparticular. Por exemplo, anticorpos policlonais desenvolvidos a proteínas defusão podem ser selecionados de forma a se obter apenas aqueles anticorpospoliclonais que são especificamente imunorreativos com proteína de fusão enão com componentes individuais das proteínas de fusão. Esta seleção podeser obtida subtraindo-se anticorpos que reagem de maneira cruzada comantígenos individuais. É possível usar uma variedade de formatos de ensaiosimunológicos para selecionar anticorpos especificamente imunorreativos comuma proteína particular. Por exemplo, ensaios imunológicos ELISA de fasesólida são usados rotineiramente para selecionar anticorpos especificamenteimunorreativos com uma proteína (ver, p. ex., Harlow & Lane, Antibodies, ALaboratory Manual (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998),para uma descrição de formatos e condições de ensaio imunológico quepodem ser usados para se determinar imunorreatividade específica).Tipicamente, uma reação específica ou seletiva será de pelo menos duas vezeso sinal ou ruído de fundo e, mais tipicamente, de 10 a 100 vezes o fundo.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa(i.e., uma seqüência endógena que codifica um antígeno individual ou porçãodo mesmo) ou podem compreender uma variante de uma seqüência do tiporeferido. Variantes de polinucleotídeos podem conter uma ou maissubstituições, adições, deleções e/ou inserções, de tal forma que a atividadebiológica o polipeptídeo de fusão codificado não seja diminuída,relativamente a um polipeptídeo de fusão compreendendo antígenos nativos.Variantes apresentam, de preferência, pelo menos cerca de 70% deidentidade, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 80% de identidade e,da forma mais preferível, pelo menos cerca de 90% de identidade comseqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo nativo ou umaporção do mesmo.

Os termos "idêntica" ou percentual de "identidade", nocontexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou seqüências de polipeptídeos,referem-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são iguais ou queapresentam um percentual especificado de radicais de aminoácidos ounucleotídeos que são iguais (i.e., 70% de identidade, opcionalmente 75%,80%, 85%, 90%, ou 95% de identidade relativamente a uma regiãoespecificada), quando comparado e alinhado para máxima correspondênciarelativamente a uma janela de comparação, ou região determinada conformemedido usando-se um dos algoritmos de comparação de seqüências ou pormeio de alinhamento manual e inspeção visual. Referidas seqüências sãoentão declaradas como sendo "substancialmente idênticas". Esta definiçãotambém se refere ao complemento de uma seqüência de teste. Opcionalmente,a identidade existe numa região que tem comprimento de pelo menos cerca de25 a cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos, ou, opcionalmente, numaregião que tem um comprimento de 75 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos.

Para comparação de seqüências, tipicamente uma seqüênciaatua como uma seqüência de referência com que seqüências de teste sãocomparadas. Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüências,seqüências de teste e de referência são introduzidas em um computador,determina-se coordenadas de subseqüências, se necessário, e determina-separâmetros de programa de algoritmos de seqüências. E possível usarparâmetros de programa default, ou é possível determinar parâmetrosalternativos. O algoritmo de comparação de seqüências calcula então opercentual de identidade de seqüências para as seqüências de testerelativamente à seqüência de referência, com base nos parâmetros deprograma.

Uma "janela de comparação", como usado aqui, incluireferência a um segmento de qualquer uma de várias posições contíguasselecionadas do grupo que consiste de 25 a 500, usualmente de cerca de 50 acerca de 200, mais comumente de cerca de 100 a cerca de 150 em que umaseqüência pode ser comparada com uma seqüência de referência com omesmo número de posições contíguas após as duas seqüências terem sidoalinhadas de maneira ótima. Métodos de alinhamento de seqüências paracomparação são bem conhecidos na arte. O alinhamento ótimo de seqüênciaspara comparação pode ser conduzido, p. ex., por meio do algoritmo dehomologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math 2:482 (1981), pormeio do algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J.Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo método de busca por similaridade de Pearson& Lipman, Proc. Natl Acad. Sei. USA 85:2444 (1988), por meio deimplementações computadorizadas destes algoritmos (ESPAÇO, BESTFIT,FASTA, e TFASTA no pacote de programas Wisconsin Genetics SoftwarePackage, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou pormeio de alinhamento manual e inspeção visual (ver, p. ex., Current Protocolsin Molecular Biology (Ausubel et al, eds., suplemento de 1995)).

Um exemplo de um algoritmo útil é PILEUP. PILEUP cria umalinhamento de seqüências múltiplas de um grupo de seqüências relacionadasusando-se alinhamentos pareados progressivos para mostrar relação epercentual de identidade de seqüências. Ele também plota uma árvore oudendograma mostrando as relações de aglomeração usadas para criar oalinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamentoprogressivo de Feng & Doolittle, J. Mol. Evol 35:351-360 (1987). O métodousado é semelhante ao método descrito por Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989). O programa pode alinhar até 300 seqüências, cada uma com umcomprimento máximo de 5.000 nucleotídeos ou aminoácidos. O procedimentode alinhamento múltiplo começa com o alinhamento pareado das duasseqüências mais similares, produzindo um aglomerado de duas seqüênciasalinhadas. Este aglomerado é então alinhado com a seqüência próxima maisrelacionada ou com aglomerado de seqüências mais alinhadas. Doisaglomerados de seqüências são alinhados por meio de uma extensão simplesdo alinhamento pareado de duas seqüências individuais. O alinhamento final éobtido por meio de uma série de alinhamentos pareados progressivos. Oprograma é operado determinando-se seqüências específicas e suascoordenadas de aminoácidos ou nucleotídeos para regiões de comparação deseqüência e determinando-se os parâmetros de programa. Usando PILEUP,compara-se uma seqüência de referência com outras seqüências de teste paradeterminar a relação de percentual de identidade de seqüências usando-se osparâmetros a seguir: peso espaço default (3,00), peso do comprimento doespaço default (0,10), e espaços de extremidade ponderai. PILEUP pode serobtido do pacote de programas de análise de seqüências GCG, p. ex., versão7.0 (Devereaux et al, Nuc. Acids Res. 12:387-395 (1984).

Outro exemplo de algoritmo que é vantajoso para determinar opercentual de percentual de identidade de seqüências e similaridade deseqüências são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos emAltschul et al, Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977) e Altschul et al, J. MolBiol. 215:403-410 (1990), respectivamente. Programa [software] para realizaranálises BLAST encontra-se disponível ao público através do National Centerfor Biotechnology Information [Centro Nacional de Informação deBiotecnologia] (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolveprimeiramente identificar pares de seqüências com alta classificação (HSPs,high seoring sequence pairs) por meio de identificação de palavras curtas decomprimento W na seqüência de busca, que ou se equiparam ou satisfazemalguma classificação de limiar T com valor positivo quando alinhada comuma palavra de mesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. Té referido como o limiar de classificação de palavra de vizinhança (Altschul etal, supra). Estes acertos de palavras de vizinhança iniciais atuam comosementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs mais longas contendo asmesmas. Os acertos de palavras são estendidos em ambas as direções aolongo de cada seqüência enquanto a classificação de alinhamento cumulativopode ser incrementada. Classificações cumulativas são calculadas usando,para seqüências de nucleotídeos, os parâmetros M (classificação derecompensa para um par de radicais de pareamento; sempre > 0) e N(classificação de penalidade para radicais malpareados; sempre < 0). Paraseqüências de aminoácidos, usa-se uma matriz de classificação para calcular aclassificação cumulativa. Extensão dos acertos de palavras em cada direçãosão interrompidas quando: a classificação cumulativa de alinhamento diminuipela quantidade X de seu valor máximo obtido; a classificação cumulativaatinge zero e até menos, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos deradicais de classificação negativa; ou atinge-se o fim de qualquer dasseqüências. Os parâmetros de algoritmo BLAST[:] W, T5 e X determinam asensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (paraseqüências de nucleotídeos) usa como defaults um comprimento de palavra(W) de 11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=-4 e uma comparação deambos os filamentos. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTPusa como defaults um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, ea matriz de classificação BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff, Proc. NatlAcad. Sei. USA 89:10915 (1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de10, M=5, N=-4, e uma comparação de ambos os filamentos.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística dasimilaridade entre duas seqüências (ver, p. ex., Karlin & Altschul, Proc. Nat'1.Acad. Sei. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida da similaridadeproporcionada pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma(P(N))5 que proporciona uma indicação da probabilidade com que poderiaocorrer, por mero acaso, uma equiparação entre duas seqüências denucleotídeos ou aminoácidos. Por exemplo, um ácido nucleico é consideradosimilar a uma seqüência de referência se a menor probabilidade de soma emuma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico dereferência é menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente, menor do quecerca de 0,01, e, da forma mais preferível, menor do que cerca de 0,001.

Composições de polinucleotídeosComo usado aqui, os termos "segmento de DNA" e"polinucleotídeo" referem-se a uma molécula de DNA que foi isolada livre deDNA genômico total de uma espécie particular. Portanto, um seqüência deDNA que codifica um polipeptídeo refere-se a um segmento de DNA quecontém uma ou mais seqüências codificantes embora seja possível isolarsubstancialmente, ou livrar por purificação, DNA genômico total das espéciesde que se obtém o segmento de DNA. Inclui-se nos termos "segmento deDNA" e "polinucleotídeo" segmentos de DNA e fragmentos menores dereferidos segmentos, e também vetores recombinantes, incluindo, porexemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, fago, vírus, e análogos.

Como o compreenderão aqueles versados na arte, ossegmentos de DNA desta invenção podem incluir seqüências genômicas,seqüências extra-genômicas e seqüências codificadas por plasmídeo esegmentos menores de genes manipulados que expressam, ou que podem seradaptadas para expressar, proteínas, polipeptídeos, peptídeos e análogos.Referidos segmentos podem ser naturalmente isolados, ou modificadossinteticamente pela mão humana.

"Isolado", como usado aqui, significa que um polinucleotídeoencontra-se substancialmente afastado de outras seqüências codificantes, eque o segmento de DNA não contém grandes porções de DNA codificantenão-relacionado, como grandes fragmentos cromossômicos ou outros genesfuncionais ou regiões codificadoras de polipeptídeo. Evidentemente, istorefere-se ao segmento de DNA como isolado originalmente, e não excluigenes ou regiões codificantes adicionadas mais tarde no segmento pela mãohumana.

Como o reconhecerá a pessoa versada na arte, polinucleotídeospodem ser de filamento simples (codificando ou anti-sentido) ou de filamentoduplo, e podem ser moléculas de DNA (genômico, cDNA ou sintético) ouRNA. Moléculas de RNA incluem moléculas de HnRNA, que contêm íntronse correspondem a uma mol molécula de DNA de uma maneira um-para-um, emoléculas de mRNA, que não contêm íntrons. Seqüências codificantes ounão-codificantes adicionais podem, embora não necessariamente, estarpresentes em um polinucleotídeo da presente invenção, e um polinucleotídeopode, embora não necessariamente, estar ligado a outras moléculas e/oumateriais de suporte.

Polinucleotídeos podem compreender uma seqüência nativa(i.e., uma seqüência endógena que codifica um antígeno de Mycobacteriumou uma porção do mesmo) ou podem compreendem uma variante, ou umequivalente funcional biológico ou antigênico de uma tal seqüência. Variantesde polinucleotídeos podem conter uma ou mais substituições, adições,deleções e/ou inserções, como descrito adicionalmente abaixo, de preferência,de tal forma que a imunogenicidade do polipeptídeo codificado não sejadiminuída relativamente a uma proteína de tumor nativa. O efeito sobre aimunogenicidade do polipeptídeo codificado pode ser avaliada geralmentecomo descrito aqui. O termo "variantes" também compreende geneshomólogos de origem xenogênica.

Em concretizações adicionais, a presente invenção proporcionapolinucleotídeos e polipeptídeos isolados compreendendo várioscomprimentos de extensões contíguas de seqüência idênticas, oucomplementares a uma ou mais das seqüências aqui divulgadas. Por exemplo,esta invenção proporciona polinucleotídeos que compreendem pelo menoscerca de 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 ou 1000 ou maisnucleotídeos contíguos de uma ou mais das seqüências aqui divulgadas etambém todos os comprimentos intermediários entre os mesmos. Há de secompreender com facilidade que "comprimentos intermediários", nestecontexto, significa qualquer comprimento entre os valores indicados, como16, 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100,101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluindo todos os númerosinteiros de 200 a 500; de 500 a 1.000, e análogos.

Os polinucleotídeos da presente invenção, ou fragmentos dosmesmos, independentemente do comprimento da própria seqüênciacodificante, podem ser combinados com outras seqüências de DNA5 comopromotores, sinais de poliadenilação, sítios adicionais de enzimas de restrição,múltiplos sítios de clonagem, outros segmentos codifícantes, e análogos, detal forma que seu comprimento global pode variar consideravelmente.Considera-se, portanto, que é possível empregar um fragmento de ácidonucleico de quase qualquer tamanho, sendo que o comprimento total élimitado, de preferência, pela facilidade de preparação e uso em um protocolode DNA recombinante intencionado. Por exemplo, segmentos de DNAilustrativos com comprimentos totais de cerca de 10.000, cerca de 5000, cercade 3000, cerca de 2.000, cerca de 1.000, cerca de 500, cerca de 200, cerca de100, cerca de 50 pares de bases de comprimento, e análogos, (incluindo todosos comprimentos intermediários) são considerados como sendo úteis emmuitas implementações desta invenção.

Além disso, aqueles com prática ordinária na arte haverão deconsiderar que, como um resultado da degeneração do código genético, hámuitas seqüências de nucleotídeos que codificar um polipeptídeo comodescrito aqui. Alguns destes polinucleotídeos portam homologia mínima paraa seqüência de nucleotídeos de qualquer gene nativo. No entanto,polinucleotídeos que variam devido a diferenças no uso de códon sãoconsiderados especificamente pela presente invenção, por exemplopolinucleotídeos que são otimizados para seleção de códon humano e/ouprimata. Adicionalmente, alelos dos genes que compreendem as seqüênciasde polinucleotídeos aqui proporcionadas encontram-se dentro do escopo dapresente invenção. Alelos são genes endógenos que são alterados como umresultado de uma ou mais mutações, como deleções, adições e/ousubstituições de nucleotídeos. A proteína e mRNA resultante pode, emboranão necessariamente, apresentar uma função ou estrutura alterada. Alelospodem ser identificados usando-se técnicas convencionais (comohibridização, amplificação e/ou comparação de seqüências de bancos dedados).

Identificação e caracterização de polinucleotídeos

Polinucleotídeos podem ser identificados, preparados e/oumanipulados usando-se qualquer uma de uma variedade de técnicas bemestabelecidas. Por exemplo, um polinucleotídeo pode ser identificado, comodescrito mais detalhadamente abaixo, por meio de seleção de um micro-conjunto de cDNAs para expressão associada com tumor (i.e., expressão queé pelo menos duas vezes maior em um tumor do que no tecido normal, comodeterminado usando-se um ensaio representativo proporcionado aqui).Referidos ensaios podem ser realizados, por exemplo, usando um micro-conjunto Synteni (Paio Alto, CA) de acordo com as instruções do fabricante(e essencialmente como descritas por Schena et al, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 93:10614-10619 (1996) e Heller et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:2150-2155 (1997)). Alternativamente, polinucleotídeos podem seramplificados de cDNA preparado de células que expressam as proteínas aquidescritas, como células de M. tuberculosis. Referidos polinucleotídeos podemser amplificados via reação em cadeia de polimerase (PCR). Para estaabordagem, é possível projetar iniciadores específicos para seqüência, combase nas seqüências aqui proporcionadas, e podem ser adquiridos ousintetizados.

Uma porção amplificada de um polinucleotídeo da presenteinvenção pode ser usada para isolar um gene de comprimento pleno de umabiblioteca vantajosa (p. ex., uma biblioteca de cDNA de M. tuberculosis)usando-se técnicas bem conhecidas. Entre estas técnicas, uma biblioteca (decDNA ou genômica) é selecionada usando-se uma ou mais sondas ouiniciadores de polinucleotídeo vantajosos para amplificação. De preferência,uma biblioteca é selecionado de acordo com o tamanho de forma a incluirmoléculas maiores. Bibliotecas iniciadas randomicamente também podem serpreferidas para identificar regiões a 5' e a montante dos genes. Bibliotecasgenômicas são preferidas para obtenção de íntrons e extensão de seqüências a 5'.

Para técnicas de hibridização, uma seqüência parcial pode sermarcada (p. ex., por meio de tradução de pequena abrangência [nick-translation] ou marcação terminal com P) usando-se técnicas bemconhecidas. Então, geralmente, uma biblioteca bacteriana ou de bacteriófagosé selecionada com filtros de hibridização contendo colônias bacterianasdesnaturadas (ou superfícies parecendo gramado contendo placas de fagos)com a sonda marcada (ver Sambrook et al, Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2000)). Placas ou colônias de hibridização são selecionadas eexpandidas, e o DNA é isolado para análise posterior. Clones de cDNApodem ser analisados para se determinar a quantidade de seqüência adicional,por exemplo, por meio de PCR usando um iniciador da seqüência parcial eum iniciador do vetor. Mapas de restrição e seqüências parciais podem sergeradas para se identificar um ou mais clones que se superpõem. Em seguida,é possível determinar a seqüência completa usando-se técnicas convencionais,que podem envolver gerar uma série de clones de deleção. As seqüênciassuperpostas resultantes podem, então, ser montadas formando uma únicaseqüência contígua. Uma molécula de cDNA de comprimento pleno pode sergerada ligando-se fragmentos vantajosos, empregando-se técnicas bemconhecidas.

Alternativamente, há numerosas técnicas de amplificação parase obter uma seqüência codificante de comprimento pleno a partir de umaseqüência de cDNA parcial. Entre estas técnicas, a amplificação é geralmenterealizada via PCR. É possível usar qualquer um de uma variedade de kitscomercialmente obteníveis para realizar a etapa de amplificação. Iniciadorespodem ser projetados usando-se, por exemplo, software bem conhecido naarte. Iniciadores têm comprimentos, de preferência, de 22 a 30 nucleotídeos,apresentam um teor de GC de pelo menos 50% e recombinam com aseqüência-alvo a temperaturas de cerca de 68°C a 72°C. A região amplificadapode ser seqüenciada como descrito acima, e seqüências que se superpõemsão montadas formando uma seqüência contígua.

Uma técnica de amplificação do tipo referido é PCR invertida(ver Triglia et al, Nucl. Aeids Res. 16:8186 (1988)), que usa enzimas derestrição para gerar um fragmento na região conhecida do gene. O fragmentoé então circularizado por meio de ligação intramolecular e usado como ummodelo para PCR com iniciadores divergentes derivados daquela regiãoconhecida. Em uma abordagem alternativa, seqüências adjacentes a umaseqüência parcial podem ser recuperadas por meio de amplificação com uminiciador a uma seqüência ligante e um iniciador específico para uma regiãoconhecida. As seqüências amplificadas são submetidas tipicamente a umasegunda operação de amplificação com o mesmo iniciador ligante e umsegundo iniciador específico para a região conhecida. Uma variação desteprocedimento, que emprega dois iniciadores que iniciam extensão emdireções opostas da seqüência conhecida, é descrita no WO 96/38591. Outratécnica do tipo referido é conhecida como "amplificação rápida deextremidades de cDNA" ou RACE. Esta técnica envolve o uso de uminiciador interno e um iniciador externo, que hibrida com uma região de poliAregião ou seqüência de vetor, para identificar seqüências que se encontram a5' e 3' de uma seqüência conhecida. Técnicas adicionais incluem PCR decaptura (Lagerstrom et al, PCR Methods Applie. 1:111-19(199 l))e percursode PCR (Parker et al, Nucl Aeids. Res. 19:3055-60 (1991)). Outros métodosque empregam amplificação também podem ser empregados para se obteruma seqüência de cDNA de comprimento pleno.

Em determinados casos, é possível obter uma seqüência decDNA de comprimento pleno por meio de análise de seqüênciasproporcionadas em um banco de dados de marcador de seqüência expresso(EST), como aquele obtenível junto ao GenBank. Buscas por ESTs que sesuperpõem podem ser realizadas geralmente usando-se programas bemconhecidos (p. ex., buscas NCBI BLAST), e referidos ESTs podem ser usadospara gerar uma seqüência contígua de comprimento pleno. Seqüências deDNA de comprimento pleno também podem ser obtidas por meio de análisede fragmentos genômicos.

Expressão de polinucleotídeo em células hospedeiras

Em outras concretizações da invenção, seqüências depolinucleotídeos ou fragmentos das mesmas que codificam polipeptídeos dainvenção, ou proteínas de fusão ou seus equivalentes funcionais, podem serusadas em moléculas de DNA recombinante para dirigir a expressão de umpolipeptídeo em células hospedeiras apropriadas. Devido à degeneraçãoinerente do código genético, é possível produzir outras seqüências de DNAque codificam substancialmente a mesma seqüência de aminoácidos ou umaseqüência de aminoácidos equivalente, e estas seqüências podem ser usadaspara clonar e expressar um dado polipeptídeo.

Como o compreenderão aqueles com prática na arte, pode servantajoso, em alguns casos, produzir seqüências de nucleotídeos quecodificam polipeptídeo apresentando códons não-naturalmente ocorrentes.

Por exemplo, códons preferidos por um hospedeiro eucariótico ouprocariótico particular podem ser selecionados de forma a incrementar a taxade expressão de proteína ou produzir uma transcrição de RNA recombinanteapresentando propriedades desejáveis, como uma meia-vida que é mais longado que aquela de uma transcrição gerada de uma seqüência naturalmenteocorrente.

Além disso, as seqüências de polinucleotídeos da presenteinvenção podem ser manipuladas usando-se métodos geralmente conhecidosna arte para alterar seqüências codificantes de polipeptídeo por diversasrazões, incluindo, embora sem limitação, alterações que modificam aclonagem, o processamento e/ou a expressão do produto gênico. Por exemplo,é possível usar embaralhamento de DNA por meio de fragmentaçãorandômica e remontagem de PCR de fragmentos de genes e oligonucleotídeossintéticos para manipular as seqüências de nucleotídeos. Adicionalmente, épossível usar mutagênese direcionada para sítio para inserir novos sítios derestrição, alterar padrões de glicosilação, alterar preferência de códon,produzir variantes de recomposição, ou introduzir mutações, e assim pordiante.

Em outra concretização da invenção, é possível ligarseqüências de ácido nucleico naturais, modificadas, ou recombinantes a umaseqüência heteróloga para codificar uma proteína de fusão. Por exemplo, paraselecionar bibliotecas de peptídeos quanto a inibidores da atividade depolipeptídeo, pode ser útil codificar uma proteína quimérica que pode serreconhecida por um anticorpo comercialmente obtenível. Uma proteína defusão também pode ser manipulada de forma a conter um sítio de clivagemlocalizado entre a seqüência codificante de polipeptídeo e a seqüência deproteína heteróloga, de tal forma que o polipeptídeo pode ser clivado epurificado sendo removido da porção heteróloga.

Seqüências que codificam um polipeptídeo desejado podemser sintetizadas, no todo ou em parte, usando-se métodos químicos bemconhecidos na arte (ver Caruthers, Μ. H. et al, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp.215-223 (1980), Horn et al, Nucl. Acids Res. Symp. Ser. pp. 225-232 (1980)).

Alternativamente, a proteína propriamente dita pode serproduzida usando-se métodos químicos para sintetizar a seqüência deaminoácidos de um polipeptídeo, ou uma porção do mesmo. Por exemplo, épossível realizar síntese de peptídeo empregando-se várias técnicas de estadosólido (Roberge et al., Science 269:202-204 (1995)), e é possível obter sínteseautomatizada, por exemplo, usando-se o sintetizador de peptídeo ABI 43IA(Perkin Elmer, Palo Alto, CA).

Um peptídeo recentemente sintetizado pode ser purificadosubstancialmente por meio de cromatografia líquida preparativa de altodesempenho (p. ex., Creighton, Proteins, Structures and Molecular Principies(1983)) ou outras técnicas comparáveis na arte. A composição dos peptídeossintéticos pode ser confirmada por meio de análise ou seqüenciamento deaminoácidos (p. ex., o procedimento de degradação de Edman).

Adicionalmente, a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo, ou qualquerparte da mesma, pode ser alterada durante síntese direta e/ou combinadausando-se métodos químicos com seqüências de outras proteínas, ou qualquerparte das mesmas, para produzir um polipeptídeo variante.

Para expressar um polipeptídeo desejado, as seqüências denucleotídeos que codificam o polipeptídeo, ou equivalentes funcionais, podemser inseridas em vetor de expressão apropriado, i.e., um vetor que contém oselementos necessários para a transcrição e tradução da seqüência codificanteinserida. Métodos que são bem conhecidos por aqueles com prática na artepodem ser usados para construir vetores de expressão contendo seqüênciasque codificam um polipeptídeo de interesse e elementos de controletranscricional e de tradução apropriados. Estes métodos incluem técnicas deDNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética invivo. Referidas técnicas são descritas em Sambrook et al, Molecular Cloning,A Laboratory Manual (2000), e Ausubel, et al., Current Protocols inMolecular Biology (atualizado anualmente).

Uma variedade de sistemas de hospedeiro/vetor de expressãopode ser usada para conter e expressar seqüências de polinucleotídeos. Estesincluem, embora sem limitação, microorganismos, como bactériastransformadas com vetores de expressão de DNA recombinante debacteriófago, plasmídeo, ou cosmídeo; levedura transformada com vetores deexpressão de levedura; sistemas de células de inseto com vetores de expressãode vírus (p. ex., baculovírus); sistemas de células de plantas com vetores deexpressão de vírus (p. ex., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus domosaico do tabaco, TMV) ou com vetores de expressão bacterianos (p. ex.,plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais.

Os "elementos de controle" ou "seqüências reguladoras"presentes em um vetor de expressão são aquelas regiões não-traduzidas dosacentuadores de vetor, promotores, regiões não traduzidas a 5' e 3' queinteragem com proteínas celulares do hospedeiro para realizar transcrição etradução. Referidos elementos podem variar quanto à intensidade eespecificidade. Dependendo do sistema de vetor e hospedeiro usado, épossível usar qualquer número de elementos de transcrição e traduçãovantajosos, incluindo promotores constitutivos e induzíveis. Por exemplo,quando se clona em sistemas bacterianos, é possível usar promotoresinduzíveis, como o promotor IacZ híbrido do fagomídeo PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla, Calif.) ou plasmídeo PSPORT1 (Gibco BRL,Gaithersburg, MD) e análogos. Em sistemas de células mamíferas, prefere-segeralmente promotores de genes mamíferos ou de vírus mamíferos. Enecessário gerar uma linha de células que contém múltiplas cópias daseqüência que codifica um polipeptídeo, vetores baseados em SV40 ou EBVpodem ser usados vantajosamente com um marcador selecionável apropriado.

Em sistemas bacterianos, é possível selecionar uma quantidadede vetores de expressão dependendo do uso intencionado para o polipeptídeoexpresso. Por exemplo, quando se necessita grandes quantidades, por exemplopara a indução de anticorpos, é possível usar vetores que dirigem a expressãode alto nível de proteínas de fusão que são facilmente purificadas. Referidosvetores incluem, embora sem limitação, os vetores de expressão e clonagemde E. coli multifuncional, como BLUESCRIPT (Stratagene), em que aseqüência que codifica o polipeptídeo de interesse pode ser ligada no vetordentro da matriz com seqüências para o Met amino-terminal e os 7 radicaissubseqüentes de β-galactosidase de forma a produzir uma proteína híbrida;vetores pIN (Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509 (1989)); eanálogos. Também é possível usar vetores pGEX (Promega, Madison, Wis.)para expressar polipeptídeos estranhos como proteínas de fusão comglutationa S-transferase (GST). De uma maneira geral, referidas proteínas defusão são solúveis e podem ser purificadas facilmente a partir de célulaslisadas por meio de adsorção em pérolas de glutationa-agarose, seguido deeluição na presença de glutationa livre. Proteínas preparadas nesses sistemaspodem ser projetadas de forma a incluir heparina, trombina, ou sítios declivagem de protease de fator XA de tal forma que o polipeptídeo clonado deinteresse possa ser liberado da porção GST conforme desejado.

Na levedura, Saccharomyces eerevisiae, é possível usar váriosdos vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis, como fator alfa,oxidase de álcool, e PGH. Para revisões, ver Ausubel et al (supra) e Grant etal, Methods Enzymol. 153:516-544 (1987).

Em casos em que se usa vetores de expressão de planta, aexpressão de seqüências que codificam polipeptídeos pode ser impelida porqualquer um de uma variedade de promotores. Por exemplo, promotoresvirais, como os promotores 35S e 19S do CaMV, podem ser usados sozinhosou em combinação com a seqüência líder ômega do TMV (Takamatsu, EMBOJ. 6:307-311 (1987)). Alternativamente, é possível usar promotores de planta,como os promotores de choque com calor ou de pequena subunidade deRUBISCO (Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al,Science 224:838-843 (1984); e Winter et al, Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991)). Estas construções podem ser introduzidas em células de plantaspor meio de transformação direta de DNA ou transfecção mediada compatógeno. Referidas técnicas encontram-se descritas em uma variedade derevistas geralmente obteníveis (ver, p. ex., Hobbs em McGraw Hill Yearbookof Science e Technology, pp. 191-196 (1992)).

Também é possível usar um sistema de inseto para expressarum polipeptídeo de interesse. Por exemplo, em um sistema do tipo referido,usa-se vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) comoum vetor para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperdaou em larvas de Trichoplusia. As seqüências que codificam o polipeptídeopodem ser clonadas em uma região não-essencial do vírus, como o gene depoliedrina, e colocado sob o controle do promotor de poliedrina. A inserçãobem sucedida da seqüência codificante de polipeptídeo tornará o gene depoliedrina inativo e produzirá vírus recombinante que não apresenta proteínade revestimento. Os vírus recombinantes podem ser então usados parainfectar, por exemplo, células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia emque o polipeptídeo de interesse pode ser expresso (Engelhard et ai., Proc.Natl. Acad Sei. U.S.A. 91:3224-3227 (1994)).

Em células hospedeiras mamíferas, diversos sistemas deexpressão à base de vírus encontram-se geralmente disponíveis. Por exemplo,em casos em que se usa um adenovírus como um vetor de expressão,seqüências que codificam um polipeptídeo de interesse podem ser ligadas emum complexo de tradução/transcrição de adenovírus consistindo do promotortardio e seqüência líder tripartite. Inserção em uma região não-essencial El ouE3 do genoma viral pode ser usada para se obter um vírus viável que é capazde expressar o polipeptídeo em células hospedeiras infectadas (Logan &Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:3655-3659 (1984)). Adicionalmente,é possível usar acentuadores de transcrição, como o acentuador do vírus dosarcoma de Rous (RSV, Rous Sarcoma Virus), para incrementar a expressãoem células hospedeiras mamíferas. Métodos e protocolos para operar comvetores de adenovírus são revistos em Wold, Adenovírus Methods andProtocols, 1998. Referência adicional com relação ao uso de vetores deadenovírus pode ser encontrada em Adenovírus: A Medicai Dictionary,Bibliography, e Annotated Research Guide to Internet References, 2004.

Também é possível usar sinais de iniciação específicos paraobter tradução mais eficiente de seqüências codificando um polipeptídeo deinteresse. Referidos sinais incluem o códon de iniciação ATG e seqüênciasadjacentes. Em casos em que seqüências que codificam o polipeptídeo, seucódon de iniciação, e seqüências a montante são inseridos no vetor deexpressão apropriado, podem não ser necessários sinais de controle detranscrição ou tradução adicionais. No entanto, em casos em que apenas aseqüência codificante, ou uma porção da mesma, é inserida, deveria-seproporcionar sinais de controle de tradução exógenos incluindo o códon deiniciação ATG. Adicionalmente, o códon de iniciação deveria encontrar-se namatriz de leitura aberta para assegurar a tradução do inserto inteiro. Códonsde iniciação e elementos de tradução exógenos podem ser de várias origens,tanto naturais como sintéticas. A eficiência de expressão pode serincrementada por meio da inclusão dos acentuadores que são apropriados parao sistema de células particular usado, como aqueles descritos na literatura(Scharf. et al, Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994)).

Adicionalmente, é possível selecionar uma cepa de célulashospedeiras quanto a sua capacidade de modular a expressão das seqüênciasinseridas, ou de processar a proteína expressa da maneira desejada. Referidasmodificações do polipeptídeo incluem, embora sem limitação, acetilação,carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação, e acilação. Processamentopós-tradução que cliva uma forma "prepro" da proteína também pode serusado para facilitar a correta inserção, dobragem e/ou função. E possívelselecionar diferentes células hospedeiras, como CHO5 HeLa5 MDCK,HEK293, e WI38, que apresentam maquinaria celular específica emecanismos característicos para referidas atividades pós-tradução, paraassegurar a modificação e o processamento correto da proteína estranha.

Para a produção de longo prazo, alto desempenho de proteínasrecombinantes, prefere-se geralmente a expressão estável. Por exemplo,linhas de células que expressam de forma estável um polinucleotídeo deinteresse podem ser transformadas usando-se vetores de expressão que podemcontêm origens virais de replicação e/ou elementos de expressão endógenos eum gene marcador selecionável no mesmo vetor ou em um vetor separado.

Após a introdução do vetor, células podem ser deixadas desenvolver durantede 1 a 2 dias em um meio enriquecido antes de serem trocadas para meioseletivo. A finalidade do marcador selecionável consiste em conferirresistência à seleção, e sua presença permite o crescimento e a recuperação decélulas que expressam com êxito as seqüências introduzidas. Clonesresistentes de células transformadas de forma estável podem ser proliferadosusando-se técnicas de cultura de tecidos apropriadas para o tipo de célula.

E possível usar qualquer quantidade de sistemas de seleçãopara recuperar linhas de células transformadas. Estas incluem, embora semlimitação, genes da timidina quinase do vírus do herpes simplex (Wigler et al,Cell 11:223-32 (1977)) e adenina fosforribosiltransferase (Lowy et al, Cell22:817-23 (1990)) que podem ser empregados em células tk.sup. ou aprt.sup.,respectivamente. Da mesma forma, é possível usar a resistência a herbicidas,antibióticos ou antimetabólitos como a base para seleção; por exemplo, dhfrque confere resistência ao metotrexato (Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 77:3567-70 (1980)); npt, que confere resistência a aminoglicosídeos,neomicina e G-418 (Colbere-Garapin et al, J. Mol. Biol 150:1-14 (1981)); eais ou pat, que conferem resistência ap clorossulfuron e fosfinotricinaacetiltransferase, respectivamente (Murry, supra). Genes selecionáveisadicionais já foram descritos, por exemplo, trpB, que permite às células usarindol em lugar de triptofano, ou hisD, que permite às células usar histinol emlugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.85:8047-51 (1988)). Recentemente, o uso de marcadores visíveis ganhou empopularidade com marcadores, como antocianinas, β-glucuronidase e seusubstrato GUS, e luciferase e seu substrato luciferina, sendo amplamenteusados não só para identificar transformantes, mas também para quantificar aquantidade de expressão de proteína transiente ou estável atribuível a umsistema de vetor específico (Rhodes et al, Methods Mol. Biol. 55:121-131(1995)).

Embora a presença/ausência de expressão de gene marcadorsugira que o gene de interesse também esteja presente, sua presença eexpressão pode ainda precisar ser confirmada. Por exemplo, se a seqüênciaque codifica um polipeptídeo é inserida no interior de uma seqüência de genemarcador, células recombinantes contendo seqüências podem ser identificadasatravés da ausência de função de gene marcador. Alternativamente, um genemarcador pode ser colocado em tandem com uma seqüência codificante depolipeptídeo sob o controle de um único promotor. A expressão do genemarcador em resposta à indução ou seleção também indica usualmente aexpressão do gene em tandem.

Alternativamente, células hospedeiras que contêm e expressamuma seqüência de polinucleotídeos desejada podem ser identificadas por meiode uma variedade de procedimentos conhecidos por aqueles com prática naarte. Estes procedimentos incluem, embora sem limitação, hibridizaçõesDNA-DNA ou DNA-RNA e bio-ensaio de proteína ou técnicas de ensaioimunológico que incluem tecnologias baseadas em membrana, solução, ouchip para a detecção e/ou quantificação de ácido nucleico ou proteína.

Conhece-se na arte uma variedade de protocolos para detectare medir a expressão de produtos codificados por polinucleotídeos, usando-seanticorpos policlonais ou monoclonais específicos para o produto. Exemplosincluem ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), ensaio rádio-imunológico (RIA), e seleção de células ativada com fluorescência (FACS).

Um ensaio imunológico de dois sítios, em base monoclonal, empregandoanticorpos monoclonais reativos para dois epitopos não-interferentes em umdado polipeptídeo pode ser preferido para algumas aplicações, mas também épossível empregar um ensaio de ligação competitiva. Estes e outros ensaiosencontram-se descritos, entre outros locais, em Hampton et al, SerologicalMethods, a Laboratory Manual (1990) e Maddox et al, J. Exp. Med.158:1211-1216(1983).

Aqueles com prática na arte conhecem uma ampla variedadede marcadores e técnicas de conjugação que podem ser usadas em váriosensaios de ácido nucleico e aminoácidos. Meios para produzir hibridizaçãomarcada ou sondas de PCR para detectar seqüências relacionadas compolinucleotídeos incluem oligo- marcação, tradução de pequena abrangência[<nick-translation] tradução, marcação terminal ou amplificação com PCRusando-se um nucleotídeo marcado. Alternativamente, as seqüências, ouquaisquer porções das mesmas podem ser clonadas em um vetor para aprodução de uma sonda de mRNA. Referidos vetores são conhecidos na arte,são comercialmente obteníveis, e podem ser usados para sintetizar sondas deRNA in vitro por meio de adição de uma RNA polimerase apropriada, comoT7, T3, ou SP6 e nucleotídeos marcados. Estes procedimentos podem serconduzidos empregando-se uma variedade de kits comercialmente obteníveis.

Marcadores ou moléculas repórter vantajosas que podem ser usadas incluemradionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminescentes, oucromogênicos, e também substratos, co-fatores, inibidores, partículasmagnéticas, e análogos.

Células hospedeiras transformadas com uma seqüência depolinucleotídeos de interesse podem ser cultivadas em condições vantajosaspara a expressão e a recuperação da proteína de cultura de células. A proteínaproduzida por uma célula recombinante pode ser secretada ou contidaintracelularmente dependendo da seqüência e/ou do vetor usado. Como ocompreenderão aqueles com prática na arte, vetores de expressão contendopolinucleotídeos da invenção podem ser projetados de forma a contarseqüências-sinal que dirigem a secreção do polipeptídeo codificado através deuma membrana de células eucarióticas ou procarióticas. E possível usar outrasconstruções recombinantes para conjugar seqüências que codificam umpolipeptídeo de interesse a seqüência de nucleotídeos que codifica umdomínio de polipeptídeo que facilitará a purificação de proteínas solúveis.

Referidos domínios facilitadores de purificação incluem, embora semlimitação, peptídeos quelantes de metal, como módulos de histida-triptofanoque permitem purificação em metais imobilizados, domínios de proteína Aque permitem purificação em imunoglublina imobilizada, e o domínio usadono sistema de purificação por afinidade/extensão FLAGS (Immunex Corp.,Seattle, Wash.). A inclusão de seqüências de ligantes cliváveis, como aquelasespecíficas para Fator XA ou enteroquinase (Invitrogen. San Diego, Calif.)entre o domínio de purificação e o polipeptídeo codificado pode ser usadapara facilitar a purificação. Um vetor de expressão do tipo referidoproporciona a expressão de uma proteína de fusão contendo um polipeptídeode interesse e um ácido nucleico codificando 6 radicais histidina precedendouma tiorredoxina ou um sítio de clivagem de enteroquinase. Os radicaishistidina facilitam a purificação em EvIIAC (cromatografia de afinidade deíon de metal imobilizado) como descrito em Porath et al, Prot. Exp. Purif.3:263-281 (1992) enquanto que o sítio de clivagem de enteroquinaseproporciona um meio para purificar o polipeptídeo desejado da proteína defusão. Uma discussão de vetores que contêm proteínas de fusão éproporcionada em Kroll et al, DNA Cell Biol 12:441-453 (1993)).

Adicionalmente a métodos de produção recombinante,polipeptídeos da invenção, e fragmentos dos mesmos, podem ser produzidospor meio de síntese direta de peptídeos usando-se técnicas de fase sólida(Merrifield, J. Am. Chem. Soe. 85:2149-2154 (1963)). A síntese de proteínapode ser realizada empregando-se técnicas manuais ou automação. A sínteseautomatizada pode ser obtida, por exemplo, usando-se o sintetizador depeptídeos Applied Biosystems 43IA Peptide Synthesizer (Perkin Elmer).

Alternativamente, diversos fragmentos podem ser sintetizados separadamentepor via química e combinados usando-se métodos químicos para produzir amolécula de comprimento pleno.

Técnicas de fornecimento de polinucleotídeo in vivo

Em concretizações adicionais, introduz-se construçõesgenéticas compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos da invenção nascélulas in vivo. Isto pode ser obtido empregando-se qualquer uma de umavariedade de abordagens bem conhecidas, sendo que várias destas encontram-se delineadas abaixo com o objetivo de ilustração.

1. Adenovírus

Um dos métodos preferidos para fornecimento in vivo de umaou mais seqüências de ácido nucleico envolve o uso de um vetor de expressãode adenovírus. "Vetor de expressão de adenovírus" deve incluir aquelasconstruções contendo seqüências de adenovírus suficientes para (a) suportarempacotamento da construção e (b) expressar um polinucleotídeo que foiclonado ali em uma orientação no sentido ou anti-sentido. Evidentemente, nocontexto de uma construção anti-sentido, a expressão não exige que o produtogênico seja sintetizado.

O vetor de expressão compreende uma forma geneticamentemanipulada de um adenovírus. Conhecimento da organização genética deadenovírus, um vírus de DNA de filamento duplo, linear, de 36 kb, permite asubstituição de grandes peças de DNA adenoviral com seqüências estranhascom até 7 kb (Grunhaus & Horwitz, 1992). Em contraste ao retrovírus, ainfecção adenoviral de células hospedeiras não resulta em integraçãocromossômica porque DNA adenoviral pode replicar em integraçãocromossômica porque DNA adenoviral pode replicar de uma maneiraepissômica sem genotoxicidade potencial. Da mesma forma, adenovírus sãoestruturalmente estáveis, e não se detectou rearranjo do genoma apósamplificação extensiva. Adenovírus pode infectar virtualmente todas ascélulas epiteliais independentemente do seu estágio de ciclo celular. Até aqui,a infecção adenoviral parece estar relacionada apenas com doença branda,como doença respiratória aguda em humanos.

Adenovírus é particularmente vantajoso para uso como umvetor de transferência de gene devido a seu genoma de tamanho médio,facilidade de manipulação, alta titulação, ampla faixa de células-alvo eelevada infectividade. Ambas as extremidades do genoma viral contêmrepetições invertidas (ITRs) com de 100 a 200 pares de bases, que sãoelementos eis necessários para replicação e empacotamento de DNA viral. Asregiões precoce (E) e tardia (L) do genoma contêm diferentes unidades detranscrição que são divididas pelo início da replicação de DNA viral. A regiãoEl (ElAeElB) codifica proteínas responsáveis pela regulação de transcriçãodo genoma viral e alguns genes celulares. A expressão da região E2 (E2A eE2B) resulta na síntese das proteínas para replicação de DNA viral. Estasproteínas estão envolvidas em replicação de DNA, expressão tardia de gene edesativação da célula hospedeira (Renan, 1990). Os produtos dos genestardios, incluindo a maior parte das proteínas de capsídeo viral, são expressasapenas após processamento significativo de uma única transcrição primáriaprovocada pelo promotor tardio principal (MLP). O MLP, (localizado em16.8 m.u.) é particularmente eficiente durante a fase tardia da infecção, etodos os mRNAs provenientes deste promotor apresentam uma seqüêncialíder tripartite a 5' (TPL) que os torna mRNAs preferidos para tradução.

Em um sistema corrente, adenovírus recombinante é gerado apartir de recombinante homóloga entre vetor de transporte e vetor de pró-vírus. Devido à possível recombinação entre dois vetores pró-virais,adenovírus de tipo selvagem pode ser gerado com este processo. Portanto, écrítico isolar um único clone de vírus de uma placa individual e examinar suaestrutura genômica.A geração e propagação dos vetores de adenovírus correntes,que são deficientes de replicação, depende de uma única linha de célulasauxiliares, designada 293, que foi transformada de células de rim embrionáriohumano por meio de fragmentos de DNA Ad5 e expressa constitutivamenteproteínas El (Graham et al, 1977). Como a região E3 é dispensável dogenoma de adenovírus (Jones & Shenk, 1978), os correntes vetores deadenovírus, com o auxílio de células 293, carreiam DNA estranho na regiãoEl, na região D3 ou ambas as regiões (Graham & Prevec, 1991). Na natureza,o adenovírus pode empacotar aproximadamente 105% do genoma de tiposelvagem (Ghosh-Choudhury et al., 1987), fornecendo capacidade para cercade 2 kB extras de DNA. Combinada com os aproximadamente 5,5 kB deDNA que é substituível nas regiões El e E3, a capacidade máxima do vetorde adenovírus corrente é inferior a 7,5 kB, ou cerca de 15% do comprimentototal do vetor. Mais de 80% do genoma viral de adenovírus permanecem naespinha dorsal do vetor e é a fonte de citotoxicidade transmitida por vetor. Damesma forma, a deficiência de replicação do vírus apresentando deleção deEl é incompleta. Por exemplo, observou-se vazamento da expressão de geneviral com os vetores correntemente disponíveis com altas multiplicidades deinfecção (MOI) (Mulligan, 1993).

Linhas de células auxiliares podem ser derivadas de célulashumanas, como células de rim embrionário humano, células musculares,células hematopoiéticas ou outras células epiteliais ou mesenquimaisembrionárias humanas. Alternativamente, as células auxiliares podem serderivadas das células de outras espécies mamíferas que são permissivas paraadenovírus humano. Referidas células incluem, p. ex., células Vero ou outrascélulas epiteliais ou mesenquimais embrionárias de macaco. Como indicadoacima, a linha de células auxiliares correntemente preferida é 293.

Recentemente, Racher et al. (1995) divulgaram métodosaperfeiçoados para cultivar células 293 e propagar adenovírus. Em umformato, agregados de células naturais são desenvolvidos por meio deinoculação de células individuais em frascos de centrifugação siliconadoscom volume de 1 litro (Techne, Cambridge, UK) contendo de 100 a 200 ml demeio. Após agitação a 40 rpm, a viabilidade de células é estimada com azultripano. Em outro formato, emprega-se micro-veículos Fibra-Cel (BibbySterlin, Stone, UK) (5 g/l) como a seguir. Adiciona-se um inóculo de células,ressuspensas em 5 ml de meio, ao veículo (50 ml) em um frasco deErlenmeyer de 250 ml e deixados estacionários, com agitação ocasional,durante de 1 a 4 h. Em seguida, o meio é substituído por 50 ml de meio frescoe inicia-se a agitação. Para a produção de vírus, células são deixadasdesenvolver a cerca de 80% de confluência, sendo que após isto o meio ésubstituído (a 25% do volume final) e adiciona-se adenovírus a uma MOI de0,05. Culturas são deixadas estacionárias de um dia para o outro, após o que ovolume é incrementado a 100% e inicia-se a agitação durante mais 72 h.

Diferentemente da exigência de que o vetor de adenovírusvetor seja defectivo para replicação, ou pelo menos condicionalmentedefectivo, não se acredita que a natureza do vetor de adenovírus seja crucialpara a prática bem sucedida da invenção. O adenovírus pode ser qualquer umdos 42 diferentes sorotipos conhecidos ou subgrupos de A a F. Adenovírus detipo 5 de subgrupo C é o material de partida preferido para se obter um vetorde adenovírus de replicação defectiva condicional para uso na presenteinvenção, porque Adenovírus de tipo 5 é uma adenovírus humano sobre oqual se conhece grande quantidade de informação bioquímica e genética, etem sido usado historicamente para a maior parte das construções empregandoadenovírus como um vetor.

Como indicado acima, o vetor típico de acordo com a presenteinvenção é defectivo para replicação e não apresentará uma região deadenovírus El. Assim, será muito conveniente introduzir o polinucleotídeoque codifica o gene de interesse na posição de que se removeu as seqüênciascodificantes de El. No entanto, a posição de inserção da construção nointerior das seqüências de adenovírus não é crítica para a invenção. Opolinucleotídeo que codifica o gene de interesse também pode ser inserido emlugar da região E3 deletada nos vetores de substituição de E3 como descritopor Karlsson et al. (1986) ou na região E4 em que uma linha de célulasauxiliares ou vírus auxiliar complementa o defeito de E4.

Adenovírus é fácil de desenvolver e manipular e apresentaampla faixa de hospedeiros in vitro e in vivo. Este grupo de vírus pode serobtido com altas titulações, p. ex., de IO9 a IO11 unidades formadoras de placapor ml, e podem ser altamente infectivos. O ciclo de vida de adenovírus nãorequer integração no genoma da célula do hospedeiro. Os genes estranhosfornecidos por vetores de adenovírus são epissômicos e, portanto, apresentambaixa genotoxicidade com relação a células hospedeiras. Não se reportouefeitos colaterais em estudos de vacinação com adenovírus de tipo selvagem(Couch et al, 1963; Top et al, 1971), demonstrando sua segurança e potencialterapêutico como vetores de transferência de genes in vivo.

Usou-se vetores de adenovírus na expressão de geneseucarióticos (Levrero et al, 1991; Gomez-Foix et al, 1992) e desenvolvimentode vacina (Grunhaus & Horwitz, 1992; Graham & Prevec, 1992).

Recentemente, estudos animais sugeriram que seria possível usar adenovírusrecombinante para terapia gênica (Stratford-Perricaudet & Perricaudet, 1991;Stratford-Perricaudet et al, 1990; Rich et al, 1993). Estudos envolvendo aadministração de adenovírus recombinante para tecidos diferentes inclueminstilação na traquéia (Rosenfeld et al, 1991; Rosenfeld et al, 1992), injeçãomuscular (Ragot et al, 1993), injeções intravenosas periféricas (Herz &Gerard, 1993) e inoculação estereotáctica no cérebro (Le Gal La Salle et al, 1993).

Vetores de adenovírus podem originar-se de adenovírushumano. Alternativamente, eles podem originar-se de adenovírus de outrasespécies, ρ. ex. chimpanzés, que podem apresentar a vantagem de que osvetores virais não são neutralizados por anticorpos contra adenovírus humanocirculante em muitos sujeitos humanos (ver, p. ex.: Tatsis N et al (2005) GeneTher. Dec 1; [publicado eletronicamente enquanto ainda no prelo]).

2. Retrovírus

Os retrovírus são um grupo de vírus de RNA de filamentosimples caracterizados por uma capacidade de converter seu RNA em DNAde filamento simples em células infectadas por meio de um processo detranscrição invertida (Coffin, 1990). O DNA resultante integra-se então deforma estável em cromossomos celulares como um pró-vírus e direciona asíntese de proteínas virais. A integração resulta na retenção das seqüências degene viral na célula recipiente e seus descendentes. O genoma retroviralcontém três genes, gag, pol, e env que codificam para proteínas de capsídeo,enzima polimerase, e componentes de envelope, respectivamente. Umaseqüência encontrada a montante do gene gag contém um sinal paraempacotamento do genoma em vírions. Duas seqüências de repetição terminallongas (LTR) estão presentes nas extremidades 5' e 3' do genoma viral. Estascontêm seqüências acentuadora e promotora fortes e também são necessáriaspara integração no genoma da célula hospedeira (Coffin, 1990).

Para construir um vetor retroviral, um ácido nucleico quecodifica uma ou mais seqüências de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos deinteresse é inserido no genoma viral em lugar de determinadas seqüênciasvirais para produzir um vírus que é defectivo para replicação. Para produzirvírions, uma linha de células de empacotamento contendo os genes gag, pol, eenv, mas sem a LTR e componentes de empacotamento (Mann et al, 1983).

Quando um plasmídeo recombinante contendo um cDNA, juntamente com aLTR retroviral e seqüências de empacotamento é introduzido nesta linha decélulas (por exemplo, por meio de precipitação com fosfato de cálcio), aseqüência de empacotamento permite que a transcrição de RNA do plasmídeorecombinante seja empacotada em partículas virais, que então são secretadasno meio de cultura (Nicolas & Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al,1983). O meio contendo os retrovírus recombinantes é então coletado,opcionalmente concentrado, e usado para transferência de genes. Vetoresretrovirais são capazes de infectar uma ampla variedade de tipos de células.

No entanto, a integração e expressão estável exigem a divisão de célulashospedeiras (Paskind et al, 1975).

Desenvolveu-se recentemente uma abordagem inéditaprojetada para permitir objetivação específica de vetores retrovirais com basena modificação química de um retrovírus por meio da adição química deradicais lactose no envelope viral. Esta modificação poderia permitir ainfecção específica de hepatócitos via receptores de sialoglicoproteína.

Projetou-se uma abordagem diferente para a objetivação deretrovírus recombinantes em que se usa anticorpos biotinilados contra umaproteína de envelope retroviral e contra um receptor de células específico. Osanticorpos foram acoplados via os componentes de biotina por meio do uso deestreptavidina (Roux et al, 1989). Usando-se anticorpos contra antígenos decomplexo de histocompatibilidade principal de classe I e de classe II, elesdemonstraram a infecção de uma variedade de células humanas que portaramaqueles antígenos de superfície com um vírus ecotrópico in vitro (Roux et al, 1989).

3. Vírus adeno-associados

AAV (Ridgeway, 1988; Hermonat & Muzycska, 1984) é umparovírus, descoberto como uma contaminação de estoques adenovirais. E umvírus ubíquo (anticorpos estão presentes em 85% da população humana dosE.U.A.) que ainda não foi ligado a qualquer doença. Ele também éclassificado como um dependovírus, porque suas replicações são dependentesda presença de um vírus auxiliar, como adenovírus. Isolou-se cinco sorotipos,dos quais AAV-2 é o melhor caracterizado.AAV apresenta um DNA linear de filamento simples que éencapsidado em proteínas de capsídeo VP1, VP2 e VP3 para formar umvírion icosaédrico com de 20 a 24 nm de diâmetro (Muzyczka & McLaughlin, 1988).

O DNA de AAV tem um comprimento de aproximadamente4,7 kilobases. Ele contém duas matrizes de leitura aberta e é flanqueado porduas repetições invertidas (ITRs, inverted repeats). Há dois genes principaisno genoma do AAV: rep e cap. O gene rep codifica para proteínasresponsáveis por replicações virais, sendo que cap codifica para proteína decapsídeo VP 1-3. Cada ITR forma uma estrutura de grampo-de-cabelo emforma de T. Estas repetições terminais são os únicos componentes eisessenciais do AAV para integração cromossômica. Portanto, o AAV pode serusado como um vetor com todas as seqüências codificantes virais removidas esubstituídas pela cassete de genes para fornecimento. Três promotores viraisforam identificados e denominados p5, pl9, e p40, de acordo com sua posiçãomap. A transcrição de p5 e pl9 resulta na produção de proteínas rep, etranscrição de p40 produz as proteínas de capsídeo (Hermonat & Muzyczka, 1984).

Há vários fatores que instaram pesquisadores a estudarem apossibilidade de usar rAAV como um vetor de expressão. Uma é que asexigências para fornecimento de um gene para integrar no cromossomohospedeiro são surpreendentemente poucas. E necessário ter as ITRs com 145bp, que são apenas 6% do genoma de AAV. Isto deixa espaço no vetor paramontar uma inserção de DNA de 4,5 kb. Enquanto esta capacidade desuportar possa impedir o AAV de fornecer genes grandes, ele é amplamenteadequado para fornecer as construções anti-sentido da presente invenção.

AAV também é uma boa escolha de veículos de fornecimentoem virtude de sua segurança. Há um mecanismo de recuperação relativamentecomplicado: não só adenovírus de tipo selvagem, mas também genes de AAVsão necessários para mobilizar rAAV. Da mesma forma, AAV não épatogênico e não está associado com qualquer doença. A remoção deseqüências codificantes virais minimiza reações imunes à expressão de genesvirais, e, portanto, rAAV não evoca uma resposta inflamatória.

4. Outros vetores virais como construções de expressãoÉ possível empregar outros vetores virais como construções deexpressão na presente invenção para o fornecimento de seqüências deoligonucleotídeos e de polinucleotídeos a uma célula hospedeira. E possívelusar vetores derivados de vírus, como vírus vaccinia (Ridgeway, 1988;Coupar et al, 1988), lentivírus, pólio vírus e herpes vírus. Eles oferecemvárias características atraentes para várias células mamíferas (Friedmann,1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al, 1988; Horwich et al, 1990).

Com o recente reconhecimento de vírus de hepatite Bdefectivos, obteve-se nova compreensão sobre a relação estrutura-função dediferentes seqüências virais. Estudos in vitro mostraram que o vírus poderiaconservar a capacidade de empacotamento dependente de auxiliar e detranscrição reversa apesar da deleção de até 80% de seu genoma (Horwich etal, 1990). Isto sugeriu que grandes porções do genoma poderiam sersubstituídas por material genético estranho. O hepatotropismo e persistência(integração) constituíram propriedades particularmente atraentes paratransferência de gene direcionada para o fígado. Chang et al (1991)introduziram o gene da cloranfenicol acetil transferase (CAT) no genoma dovírus da hepatite B do pato no local das seqüências codificantes depolimerase, superfície e pré-superfície. Este foi co-transfectado com vírus detipo selvagem em uma linha de células de hepatoma aviário. Usou-se meio decultura contendo altas titulações do vírus recombinante para infectarhepatócitos primários de filhotes de pato. A expressão estável do gene deCAT foi detectada durante pelo menos 24 dias após a transfecção (Chang etal, 1991).5. Vetores não-virais

Para efetuar a expressão das seqüências de oligonucleotídeosou polinucleotídeos da presente invenção, a construção de expressão precisaser fornecida em uma célula. Este fornecimento pode ser realizado in vitro,como em procedimentos de laboratório para transformar linha de células, ouin vivo ou ex vivo, como no tratamento de determinados estados de doença.

Como descrito acima, um mecanismo preferido para fornecimento é viainfecção viral, sendo que a construção de expressão é encapsulada em umapartícula viral infecciosa.

Uma vez que a construção de expressão foi fornecida nacélula, o ácido nucleico codificando as desejadas seqüências deoligonucleotídeos ou polinucleotídeos podem ser posicionadas e expressas emsítios diferentes. Em determinadas concretizações, o ácido nucleicocodificando a construção pode ser integrada de forma estável no genoma dacélula. Esta integração pode ser no local e orientação específicas viarecombinação homóloga (substituição de gene) ou pode ser integrada em umlocal randômico, não específico (aumento do gene). Em outras concretizaçõesadicionais, o ácido nucleico pode ser mantido de forma estável na célulacomo um segmento de DNA separado, epissômico. Referidos segmentos deácido nucleico ou "epissomas" codificam seqüências suficientes para permitira manutenção e replicação independente ou sincronizada com o ciclo dacélula hospedeira. Como a construção de expressão é fornecida em umacélula, e onde, na célula, o ácido nucleico permanece depende do tipo deconstrução de expressão empregada.

Em determinadas concretizações da invenção, a construção deexpressão compreendendo uma ou mais seqüências de oligonucleotídeos oupolinucleotídeos pode consistir simplesmente de plasmídeos ou DNArecombinante nu. A transferência da construção pode ser realizada por meiode qualquer um dos métodos mencionados acima, que permeabilizamfisicamente ou quimicamente a membrana da célula. Isto é particularmenteaplicável para transformação in vitro, mas também pode ser aplicado no usoin vivo. Dubensky et al. (1984) injetaram com êxito DNA de poliomavírus naforma de precipitados de fosfato de cálcio no fígado e no baço decamundongos adultos e recém-nascido demonstrando replicação viral ativa einfecção aguda. Benvenisty & Reshef (1986) também demonstraram que ainjeção intraperitoneal direta de plasmídeos precipitados com fosfato decálcio resulta na expressão dos genes transfectados. Conjeturamos que o DNAque codifica um gene de interesse também pode ser transferido de maneirasimilar e expressar o produto gênico.

Outra concretização da invenção para transferir umaconstrução de expressão de DNA nu para células pode envolver bombardeiode partículas. Este método depende da capacidade de acelerar micro-projéteisrevestidos com DNA a uma alta velocidade, permitindo-lhes perfurarmembranas celulares e entrar nas células sem matá-las (Klein et al, 1987).

Vários dispositivos para acelerar partículas pequenas foram desenvolvidos.

Um dispositivo do tipo referido baseia-se numa descarga de alta voltagempara gerar uma corrente elétrica, que, por sua vez, proporciona a forçaimpulsionadora (Yang et al, 1990). Os micro-projéteis usados consistiram desubstâncias biologicamente inertes, como pérolas de tungstênio ou ouro.

Órgãos selecionados incluindo o fígado, pele, e tecidomuscular de ratos e camundongos foram bombardeados in vivo (Yang et al,1990; Zelenin et al, 1991). Isto pode exigir exposição cirúrgica do tecido oudas células, para eliminar qualquer tecido interveniente entre o canhão e oórgão-alvo, i.e., tratamento ex vivo. Novamente, o DNA codificando um geneparticular pode ser fornecido por meio deste método e ainda ser incorporadopela presente invenção.

Composições de polipeptídeos

Em outros aspectos, a presente invenção proporcionacomposições de polipeptídeo. De uma maneira geral, um polipeptídeo dainvenção será um polipeptídeo isolado (ou um epitopo, variante, ou fragmentoativo do mesmo) derivado de uma espécie mamífera. De preferência, opolipeptídeo é codificado por uma seqüência de polinucleotídeos reveladaaqui ou uma seqüência que híbrida sob condições moderadamenteestringentes a uma seqüência de polinucleotídeos revelada aqui.

Alternativamente, o polipeptídeo pode ser definido como um polipeptídeo quecompreende uma seqüência de aminoácidos contígua de uma seqüência deaminoácidos revelada aqui, ou cujo polipeptídeo compreende uma seqüênciade aminoácidos inteira aqui revelada.

Porções imunogênicas podem ser identificadas geralmenteusando-se técnicas bem conhecidas, como aquelas resumidas em Paul,Fundamental Immunology, 3a ed., 243-247 (1993) e referências ali indicadas.

Referidas técnicas incluem seleção de polipeptídeos quanto à capacidade dereagir com anticorpos específicos para antígeno, anti-soros e/ou linha decélulas T ou clones. Como usado aqui, anti-soros e anticorpos são"específicos para antígeno" se eles se ligarem especificamente a um antígeno(i.e., eles reagem com a proteína em um ELISA ou outro ensaio imunológico,e não reagem detectavelmente com proteínas não-relacionadas). Referidosanti-soros e anticorpos podem ser preparados como descrito aqui, e usando-setécnicas bem conhecidas. Uma porção imunogênica de uma proteína deMycobacterium sp. é uma porção que reage com referidos anti-soros e/oucélulas T em um nível que não é substancialmente inferior à reatividade dopolinucleotídeo de comprimento pleno (p. ex., em um ensaio ELISA e/ou dereatividade de células T). Referidas porções imunogênicas podem reagir emreferidos ensaios em um nível que é similar ou maior do que a reatividade dopolipeptídeo de comprimento pleno. Referidas seleções podem ser realizadasgeralmente usando-se métodos bem conhecidos por aqueles com práticaordinária na arte, como aqueles descritos em Harlow & Lane, Antibodies: ALaboratory Manual (1988) e Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998).Por exemplo, um polipeptídeo pode ser imobilizado sobre um suporte sólido econtatado com soros de pacientes de forma a permitir a ligação de anticorposnos soros do polipeptídeo imobilizado. Soros não-ligados podem então serremovidos e é possível detectar anticorpos ligados usando-se, por exemplo,proteína A marcada com 125I.

Polipeptídeos podem ser preparados usando-se qualquer umadentre várias técnicas bem conhecidas. Polipeptídeos recombinantescodificados por seqüências de DNA como descrito acima podem serpreparados facilmente a partir das seqüências de DNA usando-se qualquer umde uma variedade de vetores de expressão conhecidos por aqueles com práticaordinária na arte. Expressão pode ser obtida em qualquer célula hospedeiraapropriada que foi transformada ou transfectada com um vetor de expressãocontendo uma molécula de DNA que codifica um polipeptídeo recombinante.

Células hospedeiras vantajosas incluem procariontes, levedura, e célulasprocarióticas superiores, como células mamíferas e células de planta. Depreferência, as células hospedeiras empregadas são de E. coli, levedura ouuma linha de células mamífera, como COS ou CHO. Sobrenadantes desistemas de hospedeiro/vetor vantajosos que secretam polipeptídeo ouproteína recombinante em meio de cultura podem ser concentrados primeirousando-se um filtro comercialmente obtenível. Após a concentração, oconcentrado pode ser aplicado em uma matriz de purificação vantajosa, comouma matriz de afinidade ou uma resina de troca de íon. Finalmente, é possívelempregar uma ou mais etapas de HPLC de fase invertida para purificaradicionalmente um polipeptídeo recombinante.

Polipeptídeos da invenção, fragmentos imunogênicos dosmesmos, e outras variantes apresentando menos do que cerca de 100aminoácidos, e geralmente menos de cerca de 50 aminoácidos, tambémpodem ser gerados por meios sintéticos, usando-se técnicas bem conhecidapor aqueles com prática ordinária na arte. Por exemplo, referidospolipeptídeos podem ser sintetizados usando-se qualquer uma das técnicas defase sólida comercialmente obteníveis, como o método de síntese de fasesólida de Merrifield, em que aminoácidos são adicionados seqüencialmenteem uma cadeia de aminoácidos em desenvolvimento. Ver Merrifield, J. Am.Chem. Soe. 85:2149-2146 (1963). Equipamento para síntese automatizada depolipeptídeos é comercialmente obtenível de fornecedores, como PerkinElmer/ Applied BioSystems Division (Foster City, CA), e pode ser operadode acordo com as instruções do fabricante.

Em determinadas concretizações específicas, um polipeptídeopode ser uma proteína de fusão que compreende múltiplos polipeptídeoscomo descrito aqui, ou que compreende pelo menos um polipeptídeo comodescrito aqui e uma seqüência não-relacionada, como uma proteína de tumorconhecida. Por exemplo, um parceiro de fusão pode contribuir paraproporcionar epitopos auxiliares T (um parceiro de fusão imunológico), depreferência, epitopos de auxiliares T reconhecidos por humanos, ou podecontribuir para a expressão da proteína (um acentuador de expressão) comrendimentos maiores do que a proteína recombinante. Determinados parceirosde fusão preferidos são parceiros de fusão acentuadores de expressão eimunológicos. E possível selecionar outros parceiros de fusão de forma aincrementar a solubilidade da proteína ou permitir objetivar a proteína paracompartimentos intracelulares desejados. Outros parceiros de fusão adicionaisincluem marcadores de afinidade, que facilitam a purificação da proteína.

Proteínas de fusão podem ser preparadas geralmente usando-setécnicas convencionais, incluindo conjugação química. De preferência, umaproteína de fusão é expressa como uma proteína recombinante, permitindo aprodução de níveis incrementados, relativamente a uma proteína não-fiindida,em um sistema de expressão. Em resumo, seqüências de DNA codificando oscomponentes de polipeptídeo podem ser montadas separadamente, e ligadasem um vetor de expressão apropriado. A extremidade 3' da seqüência de DNAque codifica um componente de polipeptídeo é ligada, com ou sem um ligantede peptídeo, na extremidade 5' de uma seqüência de DNA codificando osegundo componente de polipeptídeo de tal forma que as matrizes de leituradas seqüências se encontrem em fase. Isto permite a tradução numa únicaproteína de fusão que conserva a atividade biológica de ambos oscomponentes de polipeptídeos.

E possível empregar uma seqüência de ligante de peptídeopara separar o primeiro e segundo componentes de polipeptídeo a umadistância suficiente para assegurar que cada polipeptídeo se dobre em suasestruturas secundárias e terciárias. Uma seqüência de ligante de peptídeo dotipo referido é incorporada na proteína de fusão usando-se técnicas padrãobem conhecidas na arte. Seqüências de ligante de peptídeo vantajosas podemser selecionadas com base nos seguintes fatores: (1) sua capacidade de adotaruma conformação estendida flexível; (2) sua incapacidade de adotar umaestrutura secundária que poderia interagir com epitopos funcionais noprimeiro e segundo polipeptídeos; e (3) a falta de radicais hidrofóbicos oucarregados que poderiam reagir com os epitopos funcionais de polipeptídeo.

Seqüências de ligante de peptídeo preferidas contêm radicais Gly, Asn e Ser.

Outros aminoácidos quase neutros, como Thr e Ala, também podem serusados na seqüência de ligante. Seqüências de aminoácidos que podem serempregadas de forma útil como ligantes incluem aquelas divulgadas emMaratea et al, Gene 40:39-46 (1985); Murphy et al, Proc. Natl Acad Sei.USA 83:8258-8262 (1986); Patente dos Estados Unidos n° 4.935.233 ePatente dos Estados Unidos n° 4.751.180. De uma maneira geral a seqüênciade ligante pode ter comprimento de 1 a cerca de 50 aminoácidos. Seqüênciasde ligante não são exigidas quando o primeiro e segundo polipeptídeosapresentam regiões de aminoácidos N-terminais não-essenciais que podem serusadas para separar os domínios funcionais e prevenir interferência estérica.As seqüências de DNA ligadas são ligadas operacionalmente aelementos reguladores de transcrição ou tradução vantajosos. Os elementosreguladores responsáveis pela expressão de DNA encontram-se localizadosapenas a 5' da seqüência de DNA que codifica os primeiros polipeptídeos. Demaneira análoga, são necessários códons de interrupção para parar os sinaisde terminação de tradução e transcrição estão presentes apenas a 3' daseqüência de DNA que codifica o segundo polipeptídeo.

Proporciona-se também proteínas de fusão. Referidas proteínascompreendem um polipeptídeo como descrito aqui em conjunto com umaproteína imunogênica não-relacionada. De preferência, a proteínaimunogênica é capaz de elicitar uma resposta de recuperação. Exemplos dereferidas proteínas incluem proteínas do tétano, tuberculose e hepatite (ver, p.ex., Stoute et al, New Engl J. Med. 336:86-91 (1997)).

Em concretizações preferidas, um parceiro de fusãoimunológico deriva-se da proteína D, uma proteína de superfície da bactériagram-negativa Haemophilus influenza B (WO 91/18926). De preferência, umderivado de proteína D compreende aproximadamente o primeiro terço daproteína (p. ex., os primeiros de 100 a 110 aminoácidos N-terminais), e umderivado de proteína D pode ser lipidado. Em determinadas concretizaçõespreferidas, os primeiros 109 radicais de um parceiro de fusão de lipoproteínaD são incluídos na extremidade N para dotar o polipeptídeo com epitopos decélulas T exógenos adicionais e incrementar o nível de expressão emEscherichia coli (desta forma funcionando como um acentuador deexpressão). A cauda de lipídeo assegura ótima apresentação do antígeno paracélulas apresentadoras de antígeno. Outros parceiros de fusão incluem aproteína não-estrutural do vírus da influenza, NSl (hemaglutinina).Tipicamente usa-se os 81 aminoácidos N-terminais, embora seja possível usardiferentes fragmentos que incluem epitopos de auxiliares T.

Em outra concretização, o parceiro de fusão imunológico é aproteína conhecida como LYTA, ou uma porção da mesma (de preferênciauma porção C-terminal). LYTA é derivada de Streptococcus pneumoniae, quesintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase conhecida como amidase LYTA(codificada pelo gene LytA; Gene 43:265-292 (1986)). LYTA é umaautolisina que degrada especificamente determinadas ligações na espinhadorsal de peptidoglicano. O domínio C-terminal da proteína LYTA éresponsável pela afinidade com a colina ou alguns análogos de colina, comoDEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de C-LYTAde Eseheriehia eoli expressando plasmídeos úteis para expressão de proteínasde fusão. A purificação de proteínas híbridas contendo fragmento de C-LYTAna extremidade amino já foi descrita (ver Biotechnology 10:795-798 (1992)).

Em uma concretização preferida, é possível incorporar uma porção derepetição de LYTA em uma proteína de fusão. Uma porção de repetição éencontrada na região C-terminal que começa no radical 178. Uma porção derepetição particularmente preferida incorpora radicais de 188 a 305.

De uma maneira geral, polipeptídeos (incluindo proteínas defusão) e polinucleotídeos como descrito aqui são isolados. Um polipeptídeoou polinucleotídeo "isolado" é um que é removido de seu ambiente original.

Por exemplo, uma proteína naturalmente ocorrente é isolada se ela forseparada de parte dos materiais coexistentes, ou todos os materiaiscoexistentes, no sistema natural. De preferência, referidos polipeptídeos sãopelo menos cerca de 90% puros, mais preferivelmente, pelo menos cerca de95% puros e, da forma mais preferível, pelo menos cerca de 99% puros. Umpolinucleotídeo é considerado como sendo isolado se, por exemplo, ele forclonado em um vetor que não é parte do ambiente natural.

Células T

Composições imunoterápicas também podem compreender,alternativamente, células T específicas para um antígeno de Myeobaeterium.Referidas células podem ser preparadas geralmente in vitro ou ex vivo,usando-se procedimentos convencionais. Por exemplo, células T podem serisoladas da medula óssea, sangue periférico, ou uma fração de medula ósseaou sangue periférico de um paciente, usando-se um sistema de separação decélulas comercialmente obtenível, como o sistema Isolex™, obtenível daNexell Therapeutics, Inc. (Irvine, CA; ver também Patente dos EstadosUnidos n° 5.240.856; Patente dos Estados Unidos n° 5.215.926; WO89/06280; WO 91/16116 e WO 92/07243). Alternativamente, células Tpodem ser derivadas de humanos relacionados ou não-relacionados,mamíferos não-humanos, linhas de células ou culturas.

Células T podem ser estimuladas com um polipeptídeo dainvenção, polinucleotídeo codificando um referido polipeptídeo, e/ou umacélula que apresenta antígeno (APC) que expressa um polipeptídeo do tiporeferido. Referida estimulação é realizada em condições e durante um temposuficiente para permitir a geração de células T que são específicas para opolipeptídeo. De preferência, o polipeptídeo ou polinucleotídeo está presenteem um veículo para fornecimento, como uma microesfera, para facilitar ageração de células T específicas.

Células T são consideradas específicas para um polipeptídeoda invenção se as células T especificamente proliferarem, secretaremcitocinas ou eliminarem células-alvo revestidas com o polipeptídeo ouexpressando um gene que codifica o polipeptídeo. A especificidade de célulasT pode ser avaliada usando-se qualquer uma dentre várias técnicasconvencionais. Por exemplo, em um ensaio de liberação de cromo ou ensaiode proliferação, um índice de estimulação maior que duas vezes o aumento daIise e/ou proliferação, em comparação com controles negativos, indicaespecificidade de células T. Referidos ensaios podem ser realizados, porexemplo, como descrito em Chen et ai., Câncer Res. 54:1065-1070 (1994)).

Alternativamente, a detecção da proliferação de células T pode ser realizadapor meio de uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, aproliferação de células T pode ser detectada medindo-se uma taxaincrementada de síntese de DNA (p. ex., por meio de marcação-com-pulso deculturas de células T com timidina tritiada e medindo-se a quantidade detimidina tritiada incorporada no DNA). Contato com um polipeptídeo dainvenção (de 100 ng/ml a 100 μ^πιΐ, de preferência, de 200 ng/ml a 25μ^ηιΐ) durante de 3 a 7 dias deveria resultar em um incremento de pelomenos duas vezes na proliferação das células T. Contato como descrito acimadurante de 2 a 3 horas deveria resultar na ativação das células T, conformemedido usando-se ensaios de citocina convencionais em que um incrementode duas vezes no nível de liberação de citocina (p. ex., TNF ou IFN-γ) éindicativo da ativação de células T (ver Coligan et al, Current Protocols inImmunology, vol. 1 (1998)). Células que foram ativadas em resposta a umaAPC expressando polipeptídeo, polinucleotídeo ou polipeptídeo pode serCD4+ e/ou CD8+. células T específicas para proteína podem ser expandidasusando-se técnicas convencionais. Em concretizações preferidas, as células Tsão derivadas de um paciente, um doador relacionado ou de um doador nãorelacionado, e são administradas ao paciente após estimulação e expansão.

Para fins terapêuticos, células T CD4+ ou CD8+ que proliferamem resposta a um polipeptídeo, polinucleotídeo ou APC podem serexpandidas em número, tanto in vitro ou in vivo. A proliferação de referidascélulas T in vitro pode ser realizada de diversas maneiras. Por exemplo, ascélulas T podem ser novamente expostas a um polipeptídeo, ou um peptídeocurto correspondendo a uma porção imunogênica de um referido polipeptídeo,com ou sem a adição de fatores de crescimento de células T, comointerleucina-2, e/ou células estimuladoras que sintetizam um polipeptídeo.

Alternativamente, uma ou mais células T que proliferam na presença de umaproteína podem ser expandidas em número por meio de clonagem. Métodospara clonagem de células são bem conhecidos na arte, e incluem diluiçãolimitante.Composições farmacêuticas

Em concretizações adicionais, a presente invenção refere-se àformulação de um ou mais do polinucleotídeo, polipeptídeo, célula T,anticorpo, e composições quimioterápicas aqui reveladas, em soluçõesfarmaceuticamente aceitáveis para administração em uma célula ou animal,quer sozinhas, ou em combinação com um ou mais outras modalidades deterapia.

Também se compreenderá que, se desejado, o segmento deácido nucleico (p. ex., RNA ou DNA) que expressa um polipeptídeo comodivulgado aqui, também pode ser administrado em combinação com outrosagentes, como, p. ex., outras proteínas ou polipeptídeos ou vários agentesfarmaceuticamente ativos, incluindo agentes quimioterápicos eficazes contrauma infecção com M. tuberculosis. Eficazmente, virtualmente não há limitepara outros componentes que também podem ser incluídos, dado que osagentes adicionais não causam um efeito adverso significativo quando docontato com as células-alvo ou tecidos hospedeiros. Assim, as composiçõespodem ser fornecidas juntamente com vários outros agentes conformenecessário no caso particular. Referidas composições podem ser purificadasde células hospedeiras ou outras fontes biológicas, ou, alternativamente,podem ser sintetizadas quimicamente como descrito aqui. Da mesma forma,referidas composições podem compreender composições de RNA ou DNAsubstituídos ou derivatizados.

Formulação de excipientes farmaceuticamente aceitáveis esoluções veículo farmaceuticamente aceitáveis é bem conhecida por bemconhecida por aqueles com prática na arte, como o é o desenvolvimento deregimes vantajosos de dosagem e tratamento para uso das composiçõesparticulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento,incluindo, p. ex., administração e formulação oral, parenteral, intravenosa,intranasal, e intramuscular. Tipicamente, formulações compreendendo umaquantidade terapeuticamente eficaz fornece cerca de 2 a cerca de 50 μg depolipeptídeo de Mtb72f por administração, mais tipicamente de cerca de 5a cerca de 40 de polipeptídeo de Mtb72f por administração.

1. Fornecimento oral

Em determinadas aplicações, as composições farmacêuticasreveladas aqui podem ser fornecidas via administração oral a um animal.Desta forma, estas composições podem ser formuladas com um diluenteinerte ou com um veículo comestível assimilável, ou elas podem serembutidas em cápsula de gelatina de capa dura ou de capa mole, ou elaspodem ser comprimidas em tabletes, ou elas podem ser incorporadadiretamente com o alimento da dieta.

Os compostos ativos podem ser incorporados com excipientese usados em forma de tabletes ingeríveis, tabletes bucais, pastilhas, cápsulas,elixires, suspensões, xaropes, wafers, e análogos (Matiowitz et al, 1997;Hwang et al, 1998; Patente dos Estados Unidos n° 5.641.515; Patente dosEstados Unidos n° 5.580.579 e Patente dos Estados Unidos n° 5.792.451, cadauma incorporada aqui especificamente e integralmente por referência). Ostabletes, pastilhas, pílulas, cápsulas e análogos também podem conter oseguinte: um aglutinante, como goma tragacanto, acácia, amido de milho, ougelatina; excipientes, como fosfato de dicálcio; um agente desintegrante,como amido de milho, amido de batata, ácido algínico e análogos; umlubrificante, como estearato de magnésio; e é possível adicionar um agenteadoçante, como sacarose, lactose ou sacarina, ou um agente aromatizante,como menta, óleo de gaultéria, ou aroma de cereja. Quando a forma dedosagem é uma cápsula, ela pode conter, adicionalmente a materiais do tipoacima, um veículo líquido. Diversos outros materiais podem estar presentescomo revestimentos ou, de outra forma, para modificar a forma física daunidade de dosagem. Por exemplo, tabletes, pílulas, ou cápsulas podem serrevestidos com shellac, açúcar, ou ambos. Um xarope de elixir pode conter ocomposto ativo sacarose como um agente adoçante, metil e propil parabenoscomo conservantes, um corante e aromatizante, como aroma de cereja oularanja. Evidentemente, qualquer material usado na preparação de qualquerforma de unidade de dosagem deveria ser farmaceuticamente puro esubstancialmente não-tóxico nas quantidades empregadas. Adicionalmente, oscompostos ativos podem ser incorporados em formulações e preparações deliberação sustentada.

Tipicamente, estas formulações contêm usualmente entre de 2μg a 50 μg de polipeptídeo de Mtb72f. Naturalmente, a quantidade decomposto(s) ativo(s) em cada composição terapeuticamente útil pode serpreparada de tal modo que seja possível obter uma dosagem vantajosa emqualquer dose unitária do composto. Fatores, como solubilidade,biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, vida-de-prateleira do produto, e também outras considerações farmacológicas serãoconsideradas por alguém com prática na arte da preparação de referidasformulações farmacêuticas, e como tais, pode ser desejável uma variedade dedosagens e regimes de tratamento.

Para administração oral, as composições da presente invençãopodem ser incorporadas alternativamente com um ou mais excipientes emforma de um líquido para limpeza bucal, dentifrício, tablete bucal, spray oral,ou formulação sublingual administrada oralmente. Por exemplo, um líquidopara limpeza bucal pode ser preparado incorporando-se o ingrediente ativo naquantidade requerida em um solvente apropriado, como uma solução deborato de sódio (solução de Dobell's). Alternativamente, o ingrediente ativopode ser incorporado em uma solução oral, como uma contendo borato desódio, glicerina e bicarbonato de potássio, ou dispersado em um dentifrício,ou adicionado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a uma composiçãoque pode incluir água, ligantes, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes deespumação, e umectantes. Alternativamente, as composições pode serconfiguradas em forma de tablete ou solução que pode ser colocada sob alíngua ou, de outra forma, dissolvida na boca.

2. Fornecimento injetável

Em determinados casos, será desejável fornecer ascomposições farmacêuticas aqui reveladas por via parenteral, intravenosa,intramuscular, ou mesmo intravenosa, como descrito na Patente dos EstadosUnidos n° 5.543.158; Patente dos Estados Unidos n° 5.641.515 e Patente dosEstados Unidos n° 5.399.363 (cada uma incorporada especificamente eintegralmente aqui por referência). Soluções dos compostos ativos como baselivre ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas em águamisturada vantajosamente com um tensoativo, como hidroxipropilcelulose.

Também é possível preparar dispersões em glicerol, polietileno glicóislíquidos, e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições ordinárias dearmazenamento e uso, estas preparações contêm um conservante paraprevenir o crescimento de microorganismos.

As formas farmacêuticas vantajosas para uso injetável incluemdispersões ou soluções aquosas estéreis e pós estéreis para a preparaçãoextemporânea de dispersões ou soluções injetáveis estéreis (Patente dosEstados Unidos n° 5.466.468, incorporada especificamente e integralmenteaqui por referência). Em todos os casos, a forma precisa ser estéril e precisaser fluida até o ponto de oferecer fácil seringabilidade. Ela precisa ser estávelnas condições de condições de fabricação e armazenamento e precisa serconservada contra a ação contaminadora de microorganismos, como bactériase fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, porexemplo, água, etanol, poliol (p. ex., glicerol, propileno glicol, e polietilenoglicol líquido, e análogos), misturas vantajosas dos mesmos, e/ou óleosvegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, com o uso deum revestimento, como lecitina, por meio da manutenção do tamanho departículas desejado no caso de dispersão, e por meio do uso de tensoativos. Aprevenção da ação de microorganismos pode ser facilitada por meio de váriosagentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol,fenol, ácido sórbico, timerosal, e análogos. Em muitos casos, será preferívelincluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Aabsorção prolongada das composições injetáveis pode ser proporcionada como uso, nas composições, de agentes retardadores de absorção, por exemplo,monoesterarato de alumínio e gelatina.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, porexemplo, de preferência, a solução deveria ser tamponada, se necessário, e odiluente líquido primeiramente tornado isotônico com suficiente soluçãosalina ou glicose. Estas soluções aquosas particulares são particularmentevantajosas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea eintraperitoneal. Com relação a isto, um meio aquoso estéril que pode serempregado será de conhecimento daqueles com prática na arte, à luz dapresente descrição. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 mlde solução isotônica de NaCl e, ou adicionada a 1000 ml de fluido dehipodermoclise ou injetada no sítio de infusão proposto (ver, p. ex.,Remington 's Pharmaceutical Sciences, 15a edição, pp. 1035-1038 e 1570-1580). Será necessário ocorrer alguma variação na dosagem, dependendo dacondição do sujeito que está sendo tratado. A pessoa responsável pelaadministração determinará, em qualquer caso, a dose apropriada para o sujeitoindividual. Além disso, para administração humana, preparações deveriamatender os padrões de esterilidade, pirogenicidade, e os padrões de pureza esegurança gerais conforme exigidos pelos padrões do departamento debiologias do FDA [administração de alimentos e drogas do governo norte-americano].

Soluções injetáveis estéreis são preparadas incorporando-se oscompostos ativos na quantidade requerida no solvente apropriado comnumerosos dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário,seguido de esterilização filtrada. De uma maneira geral, prepara-se dispersõesincorporando os diversos ingredientes ativos esterilizados em um veículoestéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientesexigidos dentre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para apreparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos depreparação são técnicas de secagem a vácuo e de secagem com congelamentoque proporcionam um pó do ingrediente ativo acrescido de qualqueringrediente adicional desejado a partir de uma solução do mesmo previamentefiltrada de forma estéril.

As composições aqui reveladas podem ser formuladas em umaforma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais deadição de ácido (formados com os grupos amino livres da proteína) e que sãoformados com ácidos inorgânicos, como, por exemplo, ácido clorídrico oufosfórico, ou ácidos orgânicos, como acético, oxálico, tartárico, mandélico, eanálogos. Sais formados com os grupos carboxila livres também podem serderivados de bases inorgânicas, como, por exemplo, hidróxidos de sódio,potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas como isopropilamina,trimetilamina, histidina, procaína e análogos. Quando da formulação, soluçõesserão administradas de uma maneira compatível com o formulação dedosagem e em tal quantidade que seja terapeuticamente eficaz. Asformulações são facilmente administradas em uma variedade de formas dedosagem, como soluções injetáveis, cápsulas de liberação de droga, eanálogos.

Como usado aqui, "veículo" inclui qualquer um e todos ossolventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentesantibacterianos e antifüngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção,tampões, soluções veículo, suspensões, colóides, e análogos. O uso de taismeios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido naarte. Exceto se, qualquer meio ou agente convencional for incompatível como ingrediente ativo, seu uso nas composições terapêuticas será considerado.

Também é possível incorporar ingredientes ativos suplementares nascomposições.

A expressão "farmaceuticamente aceitável" refere-se aentidades moleculares e composições que não produzem uma reação alérgicaou similar indesejável quando administradas a um humano. A preparação deuma composição aquosa que contém uma proteína como um ingrediente ativoé bem compreendida na arte. Tipicamente, referidas composições sãopreparadas como injetáveis, seja como soluções ou dispersões líquidas;também é possível preparar formas sólidas adequadas para dissolução oususpensão em líquido antes da injeção. A preparação também pode seremulsificada.

3. Fornecimento nasal e bucal

Em determinadas concretizações, as composiçõesfarmacêuticas podem ser fornecidas por meio de sprays intranasais, spraysbucais, inalação e/ou outros veículos de fornecimento de aerossol. Métodospara fornecimento de genes, ácidos nucleicos, e composições de peptídeosdiretamente nos pulmões, p. ex. via sprays de aerossol nasal e bucal, foramdescritos, p. ex., na Patente dos Estados Unidos n° 5.756.353 e Patente dosEstados Unidos n° 5.804.212 (cada uma incorporada especificamente eintegralmente aqui por referência). De maneira análoga, o fornecimento dedrogas usando resinas de micropartícuias intranasais (Takenaga et ah, 1998) ecompostos de lisofosfatidil-glicerol (Patente dos Estados Unidos n°5.725.871, incorporada especificamente e integralmente aqui por referência)também é bem conhecido nas artes farmacêuticas. Da mesma forma, ofornecimento de droga transmucosal em forma de uma matriz de suporte depolitetrafluoroetioleno encontra-se descrito na Patente dos Estados Unidos n°5.780.045 (incorporada especificamente e integralmente aqui por referência).

4. Fornecimento mediado com lipossomas, nanocápsulas e micropartículasEm determinadas concretizações, os inventores consideram ouso de lipossomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículaslipídicas, vesículas, e análogos, para a introdução das composições dapresente invenção em células hospedeiras vantajosas. Em particular, ascomposições da presente invenção podem ser formuladas para fornecimento,seja encapsuladas em uma partícula de lipídeo, um lipossoma, uma vesícula,uma nanoesfera, ou uma nanopartícula ou análogo.

Referidas formulações podem ser preferidas para a introduçãode formulações farmaceuticamente aceitáveis dos ácidos nucleicos ouconstruções aqui reveladas. A formação e uso de lipossomas é deconhecimento geral por parte daqueles com prática na arte (ver por exemplo,Couvreur et al, 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998; que descreve o uso delipossomas e nanocápsulas na terapia antibiótica objetivada para doenças einfecções bacterianas intracelulares). Recentemente desenvolveu-selipossomas com qualidades aperfeiçoadas de estabilidade no soro e meios-tempos de circulação (Gabizon & Papahadjopoulos, 1988; Allen e Choun,1987; Patente dos Estados Unidos n° 5.741.516, incorporada especificamentee integralmente aqui por referência). Adicionalmente, foram revistos váriosmétodos de lipossomas e preparações semelhantes a lipossoma como veículospotenciais para droga (Takakura, 1998; Chandran et al, 1997; Margalit, 1995;Patente dos Estados Unidos n° 5.567.434; Patente dos Estados Unidos n°5.552.157; Patente dos Estados Unidos n° 5.565.213; Patente dos EstadosUnidos n° 5.738.868 e Patente dos Estados Unidos n° 5.795.587, cada umaincorporada especificamente e integralmente aqui por referência).

Lipossomas foram usados com êxito numa variedade de tiposde células que normalmente são resistentes a transfecção por meio de outrosprocedimentos incluindo suspensões de células T, culturas de hepatócitosprimários e células PC 12 (Renneisen et al, 1990; Muller et al, 1990).

Adicionalmente, lipossomas são isentos de restrições de comprimento deDNA, que são típicas de sistemas de fornecimento à base de vírus.Lipossomas foram usados eficazmente para introduzir genes, drogas (Heath &Martin, 1986; Heath et al, 1986; Balazsovits et al, 1989; Fresta & Puglisi,1996), agentes radioterápicos (Pikul et al, 1987), enzimas (Imaizumi et al,1990a; Imaizumi et al, 1990b), vírus (Faller & Baltimore, 1984), fatores detranscrição e efetores alostéricos (Nicolau & Gersonde, 1979) em umavariedade de animais e linhas de células cultivadas. Adicionalmente,completou-se vários caminhos clínicos bem sucedidos que examinam aefetividade de fornecimento de droga mediada com lipossoma (Lopez-Berestein et al, 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al, 1988).

Adicionalmente, vários estudos sugerem que o uso de lipossomas não éassociado com respostas autoimunes, toxicicidade ou localização gonadalapós fornecimento sistêmico (Mori & Fukatsu, 1992).

Lipossomas são formados de fosfolipídeos que são dispersadosem um meio aquoso e formam esextremidadeneamente vesículas de camadadupla concêntricas multilamelares (também denominadas vesículasmultilamelares (MLVs). MLVs apresentam geralmente diâmetros de 25 nm a4 μηι. A sonificação de MLVs resulta na formação de pequenas vesículasunilamelares (SUVs) com diâmetros na faixa de 200 a 500 Â, contendo umasolução aquosa no núcleo.

Lipossomas apresentam similaridade com membranascelulares e são considerados para uso em conexão com a presente invençãocomo veículos para as composições peptídicas. Eles são amplamentevantajosos, porque substâncias solúveis em água e substâncias solúveis emlipídeos podem ser aprisionadas, i.e. nos espaços aquosos e no interior daprópria camada dupla, respectivamente. E possível que os lipossomasportadores de droga podem ser empregados para o fornecimento específico-para-sítio de agentes ativos por meio de modificação seletiva da formulaçãolipossômica.Adicionalmente aos ensinamentos de Couvreur et ai. (1977;1988), utilizar-se-á a informação a seguir para gerar formulaçõeslipossômicas. Fosfolipídeos podem formar uma variedade de estruturasdiferentes de lipossomas quando dispersas em água, dependendo da relaçãomolar de lipídeo e água. A baixas taxas, o lipossoma é a estrutura preferida.

As características físicas dos lipossomas dependem do pH, intensidade iônicae da presença de cátions divalentes. Lipossomas podem apresentar baixapermeabilidade para substâncias iônicas e polares, mas, a temperaturaselevadas, sofrem uma transição de fase que altera marcantemente suapermeabilidade. A transição de fase envolve uma alteração de uma estruturamenos ordenada, frouxamente empacotada, conhecida como o estado fluido.

Isto ocorre a uma temperatura de transição de fase característica e resulta emum aumento da permeabilidade a íons, açúcares e drogas.

Adicionalmente à temperatura, a exposição a proteínas podealterar a permeabilidade de lipossomas. determinadas proteínas solúveis,como citocromo c, ligam, deformam e penetram a camada dupla, causandocom isso alterações na permeabilidade. O colesterol inibe esta penetração deproteínas, aparentemente por meio de empacotamento dos fosfolipídeos demaneira mais apertada. Considera-se que as formações de lipossomas maisúteis para fornecimento de antibióticos e inibidores conterão colesterol.

A capacidade de aprisionar solutos varia entre diferentes tiposde lipossomas. Por exemplo, MLVs são moderadamente eficientes paraaprisionar solutos, mas SUVs são extremamente ineficientes. SUVs oferecema vantagem de homogeneidade e reprodutibilidade na distribuição detamanhos, no entanto, um equilíbrio entre tamanho e eficiência deaprisionamento é oferecido por grandes vesículas unilamelares (LUVs, largeunilamellar vesículas). Estas são preparadas por meio de evaporação de éter esão de três a quatro vezes mais eficientes no aprisionamento de soluto do queMLVs.Adicionalmente a características de lipossoma, uma importantedeterminante para aprisionar compostos compreende as propriedades físico-químicas do composto propriamente dito. Compostos polares sãoaprisionados nos espaços aquoso, e compostos não-polares ligam-se à camadadupla lipídica da vesícula. Compostos polares são liberados por meio depermeação ou quando a camada dupla é quebrada, mas compostos não-polares permanecem afiliados à camada dupla exceto quando são disrompidospor temperatura ou exposição a lipoproteínas. Ambos os tipos apresentamtaxas de efluxo máximas na temperatura de transição de fase.

Lipossomas interagem com células por meio de quatromecanismos diferentes: endocitose por células fagocíticas dos sistemareticuloendotelial, como macrófagos e neutrófilos; adsorção na superfície dacélula, seja por meio de forças eletrostáticas ou hidrofóbicas fracas não-específicas, ou por meio de interações específicas com componentes desuperfície celular; fusão com a membrana plasmática da célula por meio deinserção da camada dupla de lipídeo do lipossoma na membrana plasmática,com liberação simultânea de conteúdos lipossômicos no citoplasma; e pormeio de transferência dos lipídeos lipossômicos para membranas celulares ousubcelulares, ou vice versa, sem qualquer associação dos conteúdos dolipossoma. Freqüentemente é difícil determinar que organismo é operativo, emais do que um podem operar ao mesmo tempo.

O destino e a disposição de lipossomas injetadosintravenosamente dependem de suas atividades físicas, como tamanho,fluidez, e carga superficial. Eles podem persistir em tecidos durante horas oudias, dependendo de sua composição, e meias-vidas no sangue compreendemde minutos até várias horas. Lipossomas maiores, como MLVs e LUVs, sãorecolhidos rapidamente por células fagocíticas do sistema reticulo endotelial,porém a fisiológica do sistema circulatório restringe a saída de espécies tãograndes na maior parte dos sítios. Eles só podem sair em locais em queexistem grandes aberturas ou poros no endotélio capilar, como os sinusóidesdo fígado ou do baço. Assim, estes órgãos são o sítio de absorçãopredominante. Por outro lado, SUVs apresentam uma distribuição mais amplano tecido, mas ainda são seqüestradas em grau elevado no fígado e no baço.

De uma maneira geral, este comportamento in vivo limita a objetivaçãopotencial de lipossomas apenas naqueles órgãos e tecidos acessíveis a seugrande tamanho. Estes incluem o sangue, fígado, baço, medula óssea, eórgãos linfóides.

De uma maneira geral, a objetivação não é uma limitação emtermos da presente invenção. No entanto, desejando-se objetivação específica,estão disponíveis métodos para que isto seja realizado. Anticorpos podem serusados para ligar a superfície do lipossoma e dirigir o anticorpo e seuconteúdo de droga para receptores antigênicos específicos localizados emuma superfície de um tipo de célula particular. Também é possível usardeterminantes de carboidrato (componentes de superfície celular deglicoproteína ou glicolipídeo que desempenham um papel no reconhecimento,interação e adesão célula-a-célula) como sítios de reconhecimento porquepossuem o potencial de dirigir lipossomas para tipos de células particulares.

Em grande parte, considera-se a possibilidade de usar injeção intravenosa depreparações lipossômicas, mas também é possível considerar outras vias deadministração.

Alternativamente, a invenção proporciona formulações denanocápsulas farmaceuticamente aceitáveis das composições da presenteinvenção. De uma maneira geral nanocápsulas podem aprisionar compostosde uma maneira estável e reproduzível (Henry-Michelland et al, 1987;Quintanar-Guerrero et al, 1998; Douglas et al, 1987). Para evitar efeitoscolaterais devido a supercarregamento polimérico intracelular, referidaspartículas ultrafinas (com tamanhos em torno de 0,1 μηι) deveriam serprojetadas empregando-se polímeros que podem ser degradados in vivo.Considera-se para uso na presente invenção nanopartículas de polialquil-cianoacrilato biodegradáveis que atendem a estas exigências.

Referidas partículas podem ser preparadas com facilidade,como descrito (Couvreur et al, 1980; 1988; zur Muhlen et al, 1998; Zambauxet al. 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 e Patente dos Estados Unidos n°5.145.684, incorporada especificamente e integralmente aqui por referência).

Vacinas

Em determinadas concretizações preferidas da presenteinvenção proporciona-se vacinas. As vacinas compreendem geralmente umaou mais composições farmacêuticas, como aquelas discutidas acima, emcombinação com um imuno-estimulante. Um imuno-estimulante pode serqualquer substância que acentua ou potencializa uma resposta imunológica(mediada com anticorpo e/ou célula) para um antígeno exógeno. Exemplos deimuno-estimulantes incluem adjuvantes, microesferas biodegradáveis (p. ex.,galactídeo poliláctico) e lipossomas (nos quais o composto é incorporado; ver,p. ex., Fullerton, Patente dos Estados Unidos n° 4.235.877). Preparação devacina é descrita de uma maneira geral, por exemplo, em Vaccine Design (aabordagem de subunidade e adjuvante) por Powell & Newman, eds., (1995).

Composições farmacêuticas e vacinas que se enquadram no escopo dapresente invenção também podem conter outros compostos, que podem serbiologicamente ativos ou inativos. Por exemplo, uma ou mais porçõesimunogênicas de outros antígenos de tumor podem estar presentes, sejaincorporadas em um polipeptídeo de fusão ou como um composto separado,na composição ou vacina.

Vacinas ilustrativas podem conter DNA que codifica um oumais dos polipeptídeos como descrito acima, de tal forma que o polipeptídeoé gerado in situ. Como indicado acima, o DNA pode estar presente emqualquer um de uma variedade de sistemas de fornecimento conhecidos poraqueles com prática ordinária na arte, incluindo sistemas de expressão deácido nucleico, sistemas de expressão bacterianos e virais. Numerosastécnicas de fornecimento de gene são bem conhecidas na arte, como aquelasdescritas por Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198(1998), e referências ali indicadas. Sistemas de expressão de ácido nucleicoapropriados contêm as seqüências de DNA necessárias para expressão nopaciente (como um promotor e sinal de terminação vantajosos). Sistemas defornecimento bacterianos envolvem a administração de uma célula hospedeirade bactéria (por exemplo, uma cepa de Mycobacterium, Bacillus ouLactobacillus, incluindo Bacillus-Calmette-Guerrin ou Laetococeus laetis)que expressa uma porção imunogênica do polinucleotídeo sobre suasuperfície celular ou que secreta um epitopo do tipo referido (ver, porexemplo, Ferreira, et al., An Aead Bras Ciene (2005) 77:113-124; e Raha, etai, Appl Microbiol Bioteehnol (2005) PubMedID 15635459). Em umaconcretização preferida, o DNA pode ser introduzido usando-se um sistemade expressão viral (p. ex., vaccinia ou outro vírus da varíola, retrovírus, ouadenovírus), que podem envolver o uso de um vírus não-patogênico(defectivo), competente para replicação. Sistemas vantajosos são divulgados,por exemplo, por Fisher-Hoch et al, Proe. Natl. Aead. Sei. USA 86:317-321(1989); Flexner et al., Ann. N Y. Aead. Sei. 569:86-103 (1989); Flexner et al.,Vaeeine 8:17-21 (1990); Patentes dos Estados Unidos nums. 4.603.112,4.769.330, e 5.017.487; WO 89/01973; Patente dos Estados Unidos n°4.777.127; GB 2.200.651; EP 0.345.242; WO 91/02805; Berkner,Bioteehniques 6: 616-627 (1988); Rosenfeld et al., Science 252: 431-434(1991); Kolls et al, Proe. Natl. Aead. Sei. USA 91:215-219 (1994); Kass-Eisler et al., Proe. Natl. Aead. Sei. USA 90: 11498-11502 (1993); Guzman etal, Circulation 88: 2838-2848 (1993); e Guzman et al, Cir. Res. 73:1202-1207 (1993). Técnicas para incorporar DNA em sistemas de expressão do tiporeferido são bem conhecidos por aqueles com prática ordinária na arte. ODNA também pode ser "nu", como descrito, por exemplo, em Ulmer et al,Science 259: 1745-1749 (1993) e revisto por Cohen, Science 259: 1691-1692(1993). A absorção de DNA nu pode ser incrementada por meio derevestimento do DNA sobre pérolas biodegradáveis, que são transportadaseficientemente nas células. Perceber-se-á que uma vacina pode compreenderum componente de polinucleotídeo e um componente de polipeptídeo.

Referidas vacinas podem proporcionar uma resposta imunológica acentuada.

Perceber-se-á que uma vacina pode conter saisfarmaceuticamente aceitáveis dos polinucleotídeos e polipeptídeos aquiproporcionados. Referidos sais podem ser preparados a partir de bases não-tóxicas farmaceuticamente aceitáveis, incluindo bases orgânicas (p. ex., saisde aminas primárias, secundárias e terciárias e aminoácidos básicos) e basesinorgânicas (p. ex., sais de sódio, potássio, lítio, amônio, cálcio e magnésio).

Embora seja possível empregar qualquer veículo vantajosoconhecido por aqueles com prática ordinária na arte nas composições devacina desta invenção, o tipo de veículo variará dependendo do modo deadministração. Composições da presente invenção podem ser formuladas paraqualquer modo apropriado de administração, incluindo, por exemplo,administração tópica, oral, nasal, intravenosa, intracraniana, intraperitoneal,subcutânea ou intramuscular. Para administração parenteral, como injeçãosubcutânea, o veículo compreende, de preferência, água, solução salina,álcool, uma gordura, uma cera ou uma tampão. Para administração oral, épossível empregar qualquer um dos veículos acima ou um veículo sólido,como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, talco,celulose, glicose, sacarose, e carbonato de magnésio. Microesferasbiodegradáveis (p. ex., poliglicolato de polilactato) também podem serempregadas como veículos para as composições farmacêuticas destainvenção. Microesferas biodegradáveis vantajosas encontram-se descritas, porexemplo, nas Patentes dos Estados Unidos nums. 4.897.268; 5.075.109;5.928.647; 5.811.128; 5.820.883; 5.853.763; 5.814.344 e 5.942.252. Tambémé possível empregar um veículo compreendendo os complexos de proteína-particulado descritos na Patente dos Estados Unidos n° 5.928.647, que sãocapazes de induzir respostas de linfócitos T citotóxicos restritos a classe I emum hospedeiro.

Referidas composições também podem compreender tampões(p. ex., solução salina tamponada neutra ou solução salina tamponada comfosfato), carboidratos (p. ex., glicose, manose, sacarose ou dextranos),manitol, proteínas, polipeptídeos ou aminoácidos, como glicina,antioxidantes, bacteriostáticos, agentes quelantes, como EDTA ou glutationa,adjuvantes (p. ex., hidróxido de alumínio), solutos que tornam a formulaçãoisotônica, hipotônica ou fracamente hipertônica com o sangue de umrecipiente, agentes de suspensão, agentes espessantes e/ou conservantes.

Alternativamente, composições da presente invenção podem ser formuladascomo um liofilizado. Compostos também podem ser encapsulados emlipossomas com o uso de tecnologia bem conhecida.

É possível empregar qualquer um de uma variedade de imuno-estimulantes nas vacinas desta invenção. Por exemplo, um adjuvante pode serincluído. A maior parte dos adjuvantes contém uma substância projetada paraproteger o antígeno do catabolismo rápido, como hidróxido de alumínio ouóleo mineral, e um estimulador de respostas imunológicas, como lipídeo A,Bortadella pertussis ou espécies de Mycobacterium ou proteínas derivadas deMyeobacterium. Por exemplo, é possível usar M. vaeeae desglicolipidada,deslipidada, ("pVac"). Adjuvantes vantajosos são comercialmente obteníveiscomo, por exemplo, Adjuvante Incompleto de Freund e Adjuvante Completo(Difco Laboratories, Detroit, MI); Adjuvante Merck 65 (Merck e Company,Inc., Rahway, NJ); ASOIB, AS02A, AS15, AS-2 e derivados dos mesmos(GlaxoSmithKline, Philadelphia, PA); CWS, TDM, Leif, sais de alumínio,como gel de hidróxido de alumínio (alume) ou fosfato de alumínio; sais decálcio, ferro ou zinco; uma suspensão insolúvel de tirosina acilada; açúcaresacilados; polissacarídeos derivatizados cationicamente ou anionicamente;polifosfazenos; microesferas biodegradáveis; lipídeo A de monosfosforila equil A. Citocinas, como GM-CSF ou interleucina-2, -7, ou -12, tambémpodem ser usadas como adjuvantes.

Nas vacinas aqui proporcionadas, a composição de adjuvante éprojetada, de preferência, para induzir uma resposta imunológicapredominantemente do tipo Th 1. Níveis elevados de citocinas de tipo Thl (p.ex., IFN-γ, TNFa, IL-2 e IL- 12) tendem a favorecer a indução de respostasimunológicas mediadas com células a um antígeno administrado. Emcontraste, altos níveis de citocinas de tipo Th2 (p. ex., IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) tendem a favorecer a indução de respostas imunológicas humorais. Após aaplicação de uma vacina como proporcionada aqui, um paciente suportaráuma resposta imunológica que inclui respostas de tipo Thl e Th2. Em umaconcretização preferida, em que uma resposta é predominantemente do tipoTh 1, o nível de citocinas do tipo Thl aumentará em maior grau do que o nívelde citocinas do tipo Th2. Os níveis destas citocinas podem ser facilmenteavaliados com o uso de ensaios convencionais. Para uma revisão das famíliasde citocinas, ver Janeway, et al, Immunobiology, 5a edição, 2001.

Adjuvantes preferidos para uso na elicitação de um respostapredominantemente de tipo Thl incluem, por exemplo, uma combinação delipídeo A de monosfosforila, de preferência, lipídeo A 3-O-desacilado demonosfosforila (3D-MPL), opcionalmente com um sal de alumínio (ver, porexemplo, Ribi, et al, 1986, Immunology e Immunopharmacology of BacterialEndotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, pp. 407-419; GB 2122204B; GB2220211; e US 4.912.094). Uma forma preferida de 3D-MPL é a de umaemulsão apresentando um pequeno tamanho de partículas que é inferior a 0,2mm de diâmetro, e seu método de fabricação é divulgado no WO 94/21292.Formulações aquosas compreendendo lipídeo A de monosfosforila e umtensoativo foram descritas no WO 98/43670. Adjuvantes preferidosexemplificados incluem ASOlB (MPL e QS21 em uma formulação delipossoma), 3 D-MPL e QS21 em uma formulação de lipossoma, AS02A(MPL e QS21 e uma emulsão óleo em água), 3D-MPL e QS21 e uma emulsãoóleo em água, e AS 15, obtenível da GlaxoSmithKline. Adjuvantes de MPLsão obteníveis da GlaxoSmithKline, Seattle, WA (ver Patentes dos EstadosUnidos nums. 4.436.727; 4.877.611; 4.866.034 e 4.912.094).

Oligonucleotídeos contendo CpG (em que o dinucleotídeoCpG é não-metilado) também induzem um resposta predominantemente Th 1.CpG é uma abreviatura para unidades repetitivas de dinucleotídeo citosina-guanosina presentes no DNA. Referidos oligonucleotídeos são bemconhecidos e encontram-se descritos, por exemplo, no WO 96/02555, WO99/33488 e Patentes dos Estados Unidos nums. 6.008.200 e 5.856.462.

Seqüências de DNA imunoestimuladoras também são descritas, por exemplo,por Sato et al, Science 273:352 (1996). CpG quando formulado em vacinas, égeralmente administrado em solução livre juntamente com o antígeno livre(WO 96/02555; McCluskie e Davis, supra) ou conjugado covalentemente aum antígeno (WO 98/16247), ou formulado com um veículo, como hidróxidode alumínio ((antígeno de superfície da hepatite) Davis et al. supra; Brazolot-Millan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8). CpG éconhecido na arte como sendo um adjuvante que pode ser administrado porvias sistêmicas e mucosais (WO 96/02555, EP 468520, Davis et al, J.Immunol., 1998, 160(2):870-876; McCluskie e Davis, J. Immunol, 1998,161(9):4463-6).

Outro adjuvante preferido é uma saponina ou mimético desaponina ou derivados, de preferência, QS21 (Aquila BiopharmaceuticalsInc., Framingham, MA), que podem ser usados sozinhos ou combinação comoutros adjuvantes. Por exemplo, um sistema incrementado envolve acombinação de um lipídeo A de monosfosforila e derivado de saponina, comoa combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou umacomposição menos reatogênica em que o QS21 é extinto com colesterol,como descrito no WO 96/33739. Outras formulações preferidas compreendemuma emulsão óleo-em-água e tocoferol. Uma formulação adjuvanteparticularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em umaemulsão óleo-em-água é descrita no WO 95/17210. Adjuvantes de saponinaadicionais de uso na presente invenção incluem QS7 (descrito no WO96/33739 e WO 96/11711) e QS17 (descrito na Patente dos Estados Unidos n°5.057.540 e EP 0 362 279 BI).

Outros adjuvantes preferidos incluem Montanide ISA 720(Seppic, França), SAF (Chiron, Califórnia, Estados Unidos), ISCOMS (CSL),MF-59 (Chiron), as séries SBAS de adjuvantes (p. ex., SBAS-2, AS2\ AS2",SBAS-4, ou SBAS6, obteníveis da GlaxoSmithKline, Rixensart, Bélgica),Detox (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) e outrosaminoalquil glucosaminida 4-fosfatos (AGPs), como aqueles descritos nosPedidos de Patentes dos Estados Unidos com números de série 08/853.826 e09/074.720, cujas revelações são incorporadas aqui integralmente porreferência.

Adjuvantes exemplares adicionais incluem MPL sintético eadjuvantes à base de subunidade B de toxina Shiga (ver W02005/112991).

Qualquer vacina aqui proporcionada pode ser preparadausando-se métodos bem conhecidos que resultam numa combinação deantígeno, acentuador de resposta imunológica e um veículo ou excipientevantajoso. As composições aqui descritas podem ser administradas comoparte de uma formulação de liberação sustentada (i.e., uma formulação, comouma cápsula, esponja ou gel (constituído de polissacarídeos, por exemplo) queefetua uma baixa liberação de composto após a administração). Referidasformulações podem ser preparadas geralmente usando-se tecnologia bemconhecida (ver, p. ex., Coombes et al, Vaccine 14:1429-1438 (1996)) eadministradas, por exemplo, por meio de implantação oral, retal ousubcutânea, ou por meio de implante no sítio-alvo desejado. Formulações deliberação sustentada podem conter um polipeptídeo, polinucleotídeo ouanticorpo disperso em uma matriz de veículo e/ou contido em um reservatórioenvolvido por uma membrana controladora de taxa.

Veículos para uso em tais formulações são biocompatíveis, etambém podem ser biodegradáveis; de preferência, a formulação proporcionaum nível relativamente constante de liberação de composto ativo. Referidosveículos incluem micropartículas de poli(lactídio-co-glicolídio), poliAcrilato,látex, amido, celulose, dextrano e análogos. Outros veículos de liberaçãoretardada incluem biovetores supramoleculares, que compreendem um núcleohidrofílico não-líquido (p. ex., um oligossarídeo ou polissacarídeo reticulado)e, opcionalmente, uma camada externa compreendendo um compostoanfifílico, como um fosfolipídeo (ver, p. ex., Patente dos Estados Unidos n°5.151.254 e pedidos PCT WO 94/20078, WO/94/23701 e WO 96/06638). Aquantidade de composto ativo aqui contida, em uma formulação de liberaçãosustentada depende do sítio de implantação, da taxa e da duração esperada deliberação e da natureza da condição a ser tratada ou prevenida.

É possível empregar qualquer um de uma variedade deveículos de fornecimento nas composições farmacêuticas e vacinas parafacilitar a produção de uma resposta imunológica específica para antígeno queobjetiva células de tumor. Veículos de fornecimento incluem célulasapresentando antígeno (APCs), como células dendríticas, macrófagos, célulasB, monócitos e outras células que podem ser manipuladas para serem APCseficientes. Referidas células podem ser, embora não necessariamente,modificadas geneticamente para incrementar a capacidade de apresentar oantígeno, para aperfeiçoar a ativação e/ou manutenção da resposta de célulasT, para apresentar efeitos anti-tumor per se e/ou para seremimunologicamente compatíveis com o receptor (i.e., haplótipo de HLAequiparado). De uma maneira geral, APCs podem ser isolados de qualquer umde uma variedade de fluidos biológicos e órgãos, incluindo tecidos de tumor eperitumorais, e podem ser células autólogas, alogênicas, singênicas ouxenogênicas.

Determinadas concretizações preferidas da presente invençãousam células dendríticas ou progenitores das mesmas como célulasapresentadoras de antígeno. Células dendríticas são APCs altamente potentes(Banchereau & Steinman, Nature 392:245-251 (1998)) e mostrou-se que sãoeficazes como um adjuvante fisiológico para elicitar imunidade antitumorprofilática ou terapêutica (ver Timmerman & Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529 (1999)). De uma maneira geral, células dendríticas podem seridentificadas com base em sua forma típica (estrelada in situ, com processoscitoplasmáticos (dendritos) marcantes visíveis in vitro), sua capacidade deabsorver, processar e apresentar antígenos com alta eficiência, e suacapacidade de ativar respostas de células T não-tratadas. Evidentemente,células dendríticas podem ser manipuladas de forma a expressar ligantes oureceptores de superfície celular específicos que não são comumenteencontrados em células dendríticas in vivo ou ex vivo, e referidas célulasdendríticas modificadas são consideradas pela presente invenção. Como umaalternativa às células dendríticas, é possível usar células dendríticascarregadas com antígeno de vesículas secretadas (denominadas exossomas) navacina (ver Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600 (1998)).

Células dendríticas e progenitores podem ser obtidos dosangue periférico, medula óssea, células infiltradoras de tumor, célulasinfiltradoras de tecidos peritumorosos, nódulos linfáticos, baço, pele, sanguedo cordão umbilical e qualquer outro fluido ou tecido apropriado. Porexemplo, células dendríticas podem ser diferenciadas ex vivo por meio deadição de uma combinação de citocinas, como GM-CSF, IL-4, IL- 13 e/ouTNFa, a culturas de monócitos colhidas de sangue periférico.

Alternativamente, células positivas para CD34 colhidas de sangue periférico,sangue do cordão umbilical ou medula óssea podem ser diferenciadas emcélulas dendríticas por meio de adição no meio de cultura de combinações deGM-CSFj IL-3, TNFa, ligante de CD40, LPS, ligante de flt3 e/ou outro(s)composto(s) que induz(em) diferenciação, maturação e proliferação de célulasdendríticas.

Células dendríticas são categorizadas de maneira vantajosacomo células "imaturas" e "maduras", o que fornece uma via simples paradiscriminar entre dois fenótipos bem caracterizados. No entanto, estanomenclatura não deveria ser interpretada de forma a excluir todos ospossíveis estágios intermediários de diferenciação. Células dendríticasimaturas são caracterizadas como APC com uma grande capacidade deabsorção de antígeno e de processamento, o que se correlaciona com a altaexpressão de receptor de Fcy e receptor de manose. O fenótipo maduro écaracterizado tipicamente por uma menor expressão destes marcadores,porém a elevada expressão de moléculas de superfície celular responsáveispela ativação de células T, como MHC de classe I e classe II, moléculas deadesão (p. ex., CD54 e CDl 1) e moléculas co-estimuladoras (p. ex., CD40,CD80, CD86 e 4- IBB).

De uma maneira, APCs podem ser transfectadas com umpolinucleotídeo codificando uma proteína (ou porção ou outra variante damesma) de tal forma que o polipeptídeo, ou uma porção imunogênica domesmo, é expresso sobre a superfície da célula. Referida transfecção podeocorrer ex vivo, e, então, é possível usar uma composição ou vacinacompreendendo referidas células transfectadas para fins terapêuticos, comodescrito aqui. Alternativamente, um veículo de fornecimento de genes queobjetiva uma célula dendrítica ou outra célula apresentadora de antígeno podeser administrada a um paciente, resultando em transfecção que ocorre in vivo.

Transfecção in vivo e ex vivo de células dendríticas, por exemplo, pode serrealizada geralmente usando-se métodos conhecidos na arte, como aquelesdescritos no WO 97/24447, ou a abordagem de canhão de genes descrita porMahvi et al, Immunology and Cell Biology 75:456-460 (1997). Ocarregamento de antígeno de células dendríticas pode ser obtido por meio deincubação de células dendríticas ou células progenitoras com o polipeptídeo,DNA (nu ou com um vetor de plasmídeo) ou RNA; ou com vírus ou bactériarecombinante expressando antígeno (p. ex., vetores de vaccinia, varíola dasaves, adenovírus ou lentivírus). Antes do carregamento, o polipeptídeo podeser conjugado covalentemente com um parceiro imunológico que proporcionaauxílio de células T (p. ex., uma molécula de veículo). Alternativamente, umacélula dendrítica pode ser pulsada com um parceiro imunológico não-conjugado, separadamente ou na presença do polipeptídeo.

Vacinas e composições farmacêuticas podem ser apresentadasem recipientes de dose unitária ou de doses múltiplas, como frascos ouampolas fechadas hermeticamente. De preferência, referidos recipientes sãofechados hermeticamente para preservar a esterilidade da formulação até ouso. De uma maneira geral, formulações podem ser armazenadas comosuspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos.

Alternativamente, uma vacina ou composição farmacêutica pode serarmazenada em uma condição secada com congelamento requerendo apenas aadição de um veículo líquido estéril imediatamente antes do uso.

Todas as publicações e pedidos de patentes citados nestadescrição são incorporados aqui por referência, como se cada publicaçãoindividual ou pedido de patente fosse indicado especificamente eindividualmente como sendo incorporado por referência.

Embora a invenção precedente houvesse sido descrita emalgum detalhe a título de ilustração e de exemplo objetivando maior clareza ecompreensão, alguém com prática ordinária na arte perceberá com facilidade,à luz dos ensinamentos desta invenção, que é possível realizar determinadasalterações e modificações na mesma sem afastar-se do espírito ou escopo dasreivindicações anexas.

Exemplos

Os exemplos a seguir são fornecidos apenas a título deilustração e não como limitação. Aqueles com prática na arte reconhecerãofacilmente uma variedade de parâmetros não-críticos que poderiam seralterados ou modificados para fornecer resultados essencialmente similares.

Exemplo 1: Preparação de Mtb72f (sem marcador His) (SEOID No: 6)Construção do vetor de expressão de Mtb72f

Mtb72f é uma proteína de fusão formada de 2 proteínas deMycobacterium tuberculosis Mtb32 e Mtb39. Mtb72f é construída fundindo-se Mtb39 e as porções NeC terminais de Mtb32 como a seguir: Mtb32extremidade C-terminal - Mtb39 - Mtb32 extremidade N-terminal.

Particularmente, a proteína Mtb72f foi gerada por meio da ligação seqüencial,em tandem, das matrizes de leitura aberta (ORFs) codificando o fragmento Ο-terminal com -14 kDa de Mtb32 (radicais de 192 a 323; 132 aminoácidos) atéa ORF de comprimento pleno de Mtb39 seguido, na extremidade C, da porçãoN-terminal com ~20 (radicais de 1 a 195) de Mtb32. Isto foi realizado usando-se oligonucleotídeos específicos para seqüência contendo sítios de restriçãoúnicos (EcoRI e EcoRV) e isentos dos códons de interrupção nasextremidades C-terminais (no caso de Mtb32-C e Mtb39) para reação emcadeia de polimerase (PCR) fora do DNA genômico da cepa H37Rv de M.tuberculosis. Os detalhes do processo são como a seguir:

Primeiramente, o DNA que codifica a porção C-terminal deMtb32 (Mtb32C) foi clonado de H37Rv usando-se PCR com os seguintesoligonucleotídeos: 5' (5 '-CAA-TTA-CAT-ATG-CAT-CAC-CAT- CAC-CAT-CAC-ACG-GCC-GCG-TCC-GAT-AAC-TTC-3') e 3' (5'-CTA-ATC-GAA-TCC- GGC-CGG-GGG-TCC-CTC-GGC-CAA-3'). O oligonucleotídeoa 5' contido no sítio de restrição NdeI (sublinhado) compreendendo o códonde iniciação ATG. O oligonucleotídeo 3' contido no sítio de restrição EcoRI(sublinhado). Estes oligonucleotídeos foram usados para amplificar Mtb32C,uma porção de 396 nucleotídeos de Mtb32 e o produto resultante foisubclonado nos sítios NdeI e EcoRl de um vetor de expressão. Digestãorealizada com EcoRI e EcoRV linearizou subseqüentemente o plasmídeo deMtb32C.

Para Mtb39, usou-se os seguintes oligonucleotídeos paraamplificação com PCR e clonagem: 5'- (5'-CTA-ATC-GAA-TTC-ATG-GTG-GAT-TTC-GGG-GCG-TTA-3') e 3' (5'-CTA- ATC-GAT-ATC-GCC-GGC-TGC-CGG-AGA-ATG-CGG-3')· O oligonucleotídeo a 5' continha umsítio de restrição EcoRI (sublinhado) enquanto que o oligonucleotídeo a 3'continha um sítio de restrição EcoRV (sublinhado). A seqüência codificantede comprimento pleno de Mtb39 foi amplificada, digerida, e subclonada namatriz a jusante de Mtb32c usando-se o plasmídeo pré-digerido da primeiraetapa.

Os oligonucleotídeos a 5' e 3' do fragmento N-terminal deMtb32 foram projetados como a seguir: 5'- (5'-CTA-ATC-GAT-ATC-GCC-CCG-CCG-GCC-TTG-TCG-CAG-GAC-3') e 3' (5'- CTA-ATC-GAT-ATC-CTA-GGA-CGC-GGC-CGT-GTT-CAT-AC-3'). Ambos os conjuntos deoligonucleotídeos continham um sítio de restrição EcoRV (sublinhado)enquanto que o oligonucleotídeo a 3' também incluía um códon de interrupção(itálico). Os oligonucleotídeos foram projetados para amplificar uma porçãode Mtb32 com 585 bp [pares de bases] codificando o domínio N-terminalpredito desta proteína. O produto de PCR resultante foi subclonado noplasmídeo de fusão de Mtb32c-Mtb39. A orientação apropriada de insertos e aausência de mutações foi então verificada por meio de seqüenciamento deDNA. Para a construção final, usada para realizar o Banco de Células Mestre[Master Cell Bank] e o Banco de Células de Trabalho do Fabricante[Manufacturer's Working Cell Bank], o marcador de afinidade 6xHis foiremovido por meio de PCR, e a matriz de leitura aberta (ORF) para Mtb72ffoi subclonada em pPDM, um vetor de expressão derivado de pET. A ORFcodifica para uma poliproteína com cerca de 72 kDa (Mtb72f), com domíniosorganizados na ordem linear: Mtb32C-Mtb39-Mtb32N. Este DNA foi entãotransformado na cepa HMS174 pLysS de Escherichia coli e usado para testes,criação de bancos de células, e fabricação.

Produção de substância de droga volumétrica de Mtb72f

O processo de fabricação para a produção de Mtb72f éresumido como a seguir:

- Fermentação seguida de colheita por centrifugação,disrupção de células (microfluidizador) e centrifugação dando um pellet decorpos de inclusão;

- Purificação do pellet de corpos de inclusão por meio deextração em uréia 8M, seguido de cromatografia Q Sepharose Fast Flow(QFF), cromatografia de Hidroxiapatita Cerâmica (sigla em inglês: CHT),diafiltração, e filtração esterilizante dando a substância de droga volumétricapurificada.

Fermentação

Fermentações são realizadas a um volume de trabalho de 10 1.O fermentador é inoculado com 300 ml de uma cultura de frascos agitadosdas células de semeadura de trabalho desenvolvidas a 37°C de um dia para ooutro. Ambos, o inóculo e a fermentação, usam um meio semi-definido comglicerol derivado de planta como a fonte primária de carbono. A composiçãodo meio é mostrada na tabela abaixo. Todos os componentes do meio sãoesterilizados por meio de aquecimento a 121°C durante 20 minutos ou pormeio de filtração esterilizante. Durante a fermentação o fermentador émantido a uma temperatura de 37°C. Asperge-se ar a uma taxa de 5 litrospadrão por minuto (SLPM). O pH do meio é mantido a 7,0 por meio deadição automática de ácido (H2SO4) ou base (NaOH). O fermentador éprogramado para controlar o oxigênio dissolvido a 30% por meio de ajusteautomática da agitação, enquanto se mantinha uma agitação mínima de 200rpm. O controle da espuma no fermentador é obtido por meio da adiçãoautomática de 1,05% de antiespumante de silicone SAG-471 (Witco Corp.).

Quando a densidade da célula atinge uma densidade óptica (600 nm) deaproximadamente 3,5, adiciona-se isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo(IPTG) é no fermentador até uma concentração de 1,0 mM. O IPTG induzexpressão do gene recombinante que codifica a proteína Mtb72f. Após 3,0horas da indução, o fermentador é resfriado e as células são colhidas por meiode centrifugação em frascos de centrifugação de 1 litro.

Composição do meio de fermentação

<table>table see original document page 100</column></row><table>

Isolamento de corpos de inclusão

As pelotas de células são suspensas e combinadas em 2,3 1 detampão de Iise (50 mM de NaCl, 10 mM de Tris pH 8,0), e usa-se ummicrofluidizador M-I 10Y Microfluidizer® para disromper as células. Ascélulas são passadas através do Microfluidizador cinco vezes a uma pressãode 11.000 ± 1.000 psi [75900 kPa ± 6900 kPa]). A suspensão é centrifugada a8000 χ g em frascos de 500 ml. Nestas condições, os corpos de inclusão (IB,inclusion bodies) contendo a proteína Mtb72f são pelotizados, enquanto que amaior parte dos fragmentos de células permanece no sobrenadante. As pelotasde IB são ressupensas em tampão de lavagem (uréia 2 M, 50 mM de NaCl, 10mM de Tris pH 8,0), seguido de centrifugação a 8.000 g. As frações desobrenadante são descarregadas e as pelotas de IB são armazenados a de -70°C a -80°C até necessário para purificação adicional.

Purificação de poliproteína

As preparações de IB congeladas são orvalhadas a 37°Cdurante 15 minutos e, depois, ressuspensas em uréia 8 M, 50 mM de NaCl, 20mM de Bis-tris propano, pH 7,0 (tampão A) usando-se agitação mecânicadelicada. Os IBs ressuspensos são então agitados à temperatura ambiente comuma barra de agitação magnética a 300 rpm durante 2 horas. O extrato de IB éentão centrifugado a alta velocidade, e a fração de sobrenadante resultante éfiltrada através de um filtro de 0,45 uM (Pall, Supor) antes do fracionamentocromatográfico.

O extrato de IB é aplicado numa coluna contendo resina detroca de ânion Q Sepharose Fast Flow (QFF) (10 χ 12,5 cm daAmersham/Pharmacia BPG; leito empacotado de 1 litro) previamentesanitizado com NaOH INe então equilibrado com tampão A. A coluna érevelada a uma taxa de fluxo linear de 60 cm/hora com tampão Aeo fluxopassante contendo predominantemente menos contaminantes em massa écoletado por referência. O volume da Mtb72f é eluído em uma única etapausando uréia 8 M, 90 mM de NaCl, 20 mM de Bis-tris propano, pH 7,0 e écoletado como um único pico volumétrico com base na absorbância.

Resinas QFF são resinas de agarose altamente reticuladas comum grupo funcional de amina quaternária que é carregado positivamente nascondições usadas durante a purificação. A matriz carregada permite a ligaçãodos vários ânions que, então, podem ser eluídos seletivamente usando-se umgradiente de sal. Esta cromatografia de troca de ânion é usada para separarácidos nucleicos e endotoxina, que se ligam estreitamente à resina, a partir daproteína, que é ligado mais fracamente e elui antes destes contaminantes.

Adicionalmente, esta etapa remove contaminantes não-carregados e umagrande parte das impurezas de proteína.

O pico de eluído de 90 mM de NaCl é da coluna QFF éaplicado numa coluna (2,6 χ 12 cm Amersham/Pharmacia XK26/20; 63 ml deleito empacotado) contendo hidroxiapatita cerâmica (CHT) MacroPrep® (tipoI, 40 uM, BioRad) previamente sanitizada usando-se NaOH 1 N e, então,equilibrada com tampão C (uréia 8 M, 250 mM de NaCl, e 20 mM de Bis-trispropano, pH 7,0). O material de fluxo passante (FTl) contendo a maior parteda Mtb72f, livre de contaminantes, é recolhido. A coluna é lavada comtampão C e qualquer material absorvente de UV resultante é recolhido. Porfim, a coluna é eluída em tampão D (8 M de uréia, 200 mM de fosfato desódio, pH 7,4).

CHT MacroPrep® é uma forma macroporosa esférica dehidroxiapatita [Ca5(P04)S0H]2. Cromatografia CHT pode ser um métodoaltamente seletivo de purificação se as condições apropriadas de ligação eeluição forem encontradas. Os modos de ligação incluem ligação de tipo trocade íon com íons carregados de cálcio e fosfato e também quelação demoléculas. DNA se ligará a esta resina e é possível obter alta seletividade paraproteínas individuais. As condições usadas para a purificação de Mtb72fservem como uma etapa de polimento permitindo remoção virtualmentecompleta de contaminantes de células hospedeiras detectáveis.

Durante separações cromatográficas, monitora-se e registra-seabsorbância ultravioleta (UV)5 condutividade, pressão, pH, taxa reduzida, etemperatura ambiente. Usa-se o material inicial de fluxo passante de CHT(FTl) para processamento adicional a jusante.Diafiltração e filtração estéril

Diafiltração é realizada no combinado de CHT FTl pararemover a uréia e substituir o tampão por 20 mM de Tris, pH 7,5. Adiafiltração é realizada usando-se um sistema Pall Minim™ com umdispositivo de filtração de fluxo tangencial LV-Centramate™ com umamembrana de ultrafiltração com corte de peso molecular de 30 kDa (sigla eminglês: MWCO). A solução de Mtb72f em 20 mM de Tris, pH 7,5, éesterilizada por meio de filtração usando-se um filtro esterilizante de 0,2 um(Millipak 40). Cinqüenta ml da solução são distribuídos em frascos de 60 mlde meio de PETG estéril (copolímero de polietileno tereftalato), depoiscongelados e armazenados a -70°C. Este material é a substância de drogavolumétrica purificada Mtb72f.

Exemplo 2: Preparação de Mtb72f (marcador 6 His) (SEO ID No: 2)

O método do Exemplo 1 pode ser seguido, exceto pelo fato deque a etapa de subclonagem em pPDM para remover o marcador His éomitida.

Exemplo 3: Preparação de M72 (marcador 2 His) (SEO ID No: 4)Construção do vetor de expressão M72

Material de partida para a construção do antígeno M72 foi oplasmídeo recombinante 6His-Mtb72fmut. 6His-Mtb72fmut foi preparado pormeio de mutagênese direcionada para sítio usando-se o plasmídeorecombinante 6his-Mtb72f (ver Exemplo 1) como modelo. Mutagênesedirecionada para sítio envolveu substituir o códon para Ser na posição 710 naSEQ ID No: 1 por um códon para Ala.

A deleção de quatro histidinas N-terminais presentes naconstrução 6His-Mtb72fmut (plasmídeo Corixa) foi obtida com "Gene TailorSite-Directed Mutagenesis System" (Invitrogen), levando à esperadaconstrução 2His-Mtb72Fmut. Após verificação de seqüência, a seqüênciacodificante de 2His-Mtb72fmut foi excisada do plasmídeo (por meio derestrição enzimática), purificada em gel e ligada no vetor de expressãopET29a resultando no plasmídeo recombinante final pET29a/ 2His-Mtb72fmut. Após verificação de seqüência, o plasmídeo recombinanterecebeu a designação oficial pRIT 15497 e usado para transformar célulashospedeiras HMS174(DE3). pRIT 15497 codifica para uma proteína com 725aminoácidos denominada M72.

Produção de proteína M72É possível empregar o mesmo processo de produção comodescrito para Mtb72f (ver Exemplo 1), exceto que, para a produção de M72,cloranfenicol está ausente no meio de fermentação.

Exemplo Biológico 1: Um modelo de camundongo de um estadoinativo/latente de infecção com M. tuberculosis

Para estabelecer um modelo de mouse de infecção latente comM. tuberculosis usou-se a cepa SWR. Camundongos SWR não sãoimunocomprometidos, mas são deficiente para secreção de componente decomplemento C5 (ver, Ooi e Colten, Nature (1979) 282:207-8).

Camundongos SWR são incapazes de estabelecer um estado crônico deinfecção com Mtb, mas desenvolvem pneumonia granulomatosa difusacaracterizada por grandes macrófagos espumosos e epitelióides com inclusõescristalóides (grânulos derivados de eosinófilos ou neutrófilos que foramsubmetidos a fagocitose), necrose multifocal, acúmulo escasso de neutrófilose linfócitos (ver, Turner, et ai., J Submicrosc Cytol Pathol. (2001) 33(1-2):217-9; e Turner, et al, Infect Immun. (2003) 71(9):5266-72). A seguirencontra-se o protocolo para uso da cepa de camundongo Swiss Webster(SWR/J) em um modelo de infecção latente com M. tuberculosis para seavaliar a eficácia terapêutica de Mtb72f (SEQ ID No:6) formulada comadjuvante de AS01B. ASOlB de intensidade dupla é preparado por meio deadição de QS21 (5 μg) a vesículas unilamelares pequenas (SUV, smallunilamellar vesicules) de fosfatidilcolina de dioleíla (100 μg) contendocolesterol (25 μg) (WO 96/33739) e lipídeo A de monosfosforila (MPL) (5μg) na membrana (ver, Publicação de Patente dos E.U.A. n° 2003/0143240).

Prepara-se uma fração para injeção (50 μΐ) por meio de misturação de 4 μg deproteína em tampão (PBS pH 6,8) com 50 μΐ de ASOlB de dupla intensidade.Cada camundongo recebeu duas injeções de 50 μΐ (i.e. 8 μg de proteína).

Uma linha-do-tempo representativa para estabelecer ummodelo de uma infecção latente de M. tuberculosis é ilustradaesquematicamente na Figura 1.

Dia 1: Infectar via aerossol com de 50 a 100 unidadesformadoras de colônia (CFU) de organismos de M tuberculosis

Dias de 30 a 90: Tratar um subconjunto de camundongos com50 mg de rifampina/85 mg de isoniazida por litro de água potável

Dia 61: Todos os camundongos que receberam a vacinacandidata 5 deveriam ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 82: Todos os camundongos que receberam a vacinacandidata deveriam ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 103: Todos os camundongos que receberam a vacinacandidata deveriam ser imunizados com rMtb72f + AS01B

Dia 113: Sangramento para ensaios de IgG

Em vários momentos: Retirar baços e pulmões paraenumeração de CFU e imunogenicidade

Variação 1 —> Tratar com quimioterapia durante 60 dias.Começando no dia 30 —» Descansar durante 3, 4, 5 meses —» CFU em 2camundongos em cada momento e deixar de 4 a 7 camundongos para estudosde sobrevida

Variação 2 —> Tratar com quimioterapia durante 90 dias.Começando no dia 30 —» Descansar durante 4, 5 meses —» CFU em 2camundongos em cada momento e deixar 7 camundongos para estudos desobrevida

Variação 3 —» Descansar durante 4, 5, 6 meses —>· CFU em 2camundongos em cada momento e deixar 4 camundongos para estudos desobrevida

Variação 4 —> Tratar com quimioterapia durante 60 dias.

Começando no dia 30 —> 3 imunizações com r72F+AS01Bintramuscularmente (i.m.) começando no Dia 60 —> Descansar durante 3, 4, 5meses —> CFU em 2 camundongos em cada momento e deixar de 4 a 7camundongos para estudos de sobrevida

Variação 5 —» Tratar com quimioterapia durante 90 dias.Começando no dia 30 3 imunizações com r72F+AS01B i.m começando noDia 60 -» Descansar durante 4, 5 meses -> CFU em 2 camundongos em cadamomento e deixar de 4 a 7 camundongos par estudos de sobrevida

Análise de respostas de anticorpos após infecção usandorMtb72f para revestir as placas de ELISA revelou que aqueles grupos quereceberam uma combinação de quimioterapia e imunização comMtb72f+AS01B apresentaram uma maior resposta de anticorpos (OD de até2,0) do que camundongos que não foram tratados ou que receberamtratamento com quimioterapia apenas (OD inferior a 0,5) (Figura 2).Camundongos imunizados com Mtb72f apresentaram uma respostamensurável de anticorpos específicos para Mtb72f (OD entre 1,5 e 2,5) quertenham recebido quimioterapia durante 60 ou 90 dias (Figura 3).

Células de baço foram retiradas de camundongos em diversosintervalos após os camundongos terem sido infectados com M. tuberculosis.

Os esplenócitos foram reestimulados in vitro com antígenos recombinantespara medir a secreção de IFN-γ. Níveis de IFN-γ produzidos por estas célulasforam uniformemente negligenciáveis nos grupos 1 (não-tratado) e 2(quimioterapia apenas) no dia 60, com exceção de Mtb39. Estimulações decontrole positivo com lisado de conA, PPD e BCG demonstraram que ascélulas foram capazes de sintetizar e secretar IFN-γ em resposta a outrasmoléculas estimuladoras (Figura 4). Níveis de IFN-γ foram elevados emgrupos que receberam Mtb72f+AS01B, mas foram baixos ou negligenciáveisem grupos que não foram imunizados com Mtb72f+AS01B, quer tenhamrecebido quimioterapia ou não (Figura 5).

Durante o curso da infecção de tuberculose e o tratamentosubseqüente, células T específicas respondem. Usando-se manchamento decitocina intracelular para IFN-γ mediu-se o percentual de respostas a Mtb72fpor parte de células CD4+ específicas (Figura 6). Pareceu não haver alteraçãonas respostas de células T CD4+ IFN γ+ específicas para Mtb72F durante ocurso de aplicação de quimioterapia apenas em qualquer momento, conformemedido por meio deste ensaio (Figura 7). No dia 120 após infecção com Mtb,uma tendência de reposta CD4+ IFNy+ a Mtb72F em grupos que receberam avacina de Mtb72f mais ASOlB pareceu aumentar com a prolongação dotempo em quimioterapia (Figura 7).

Os resultados de nossos experimentos demonstram quecamundongos SWR são suscetíveis a infecção com M. tuberculosis. Sedeixados não-tratados, camundongos SWR morrem em torno de 115 dias apósa infecção com Mtb (Figuras 8 e 9). O tempo médio de sobrevida paracamundongos que receberam 60 dias de quimioterapia de combinação foi de170 dias (Figuras 8 e 9). O tempo médio de sobrevida para camundongos quereceberam 60 dias de quimioterapia de combinação e 3 imunizações deMtb72f/AS01B foi de 215 dias (Figuras 8 e 9). A sobrevida para o grupo decamundongos que recebeu quimioterapia é significativamente diferente (95%de intervalo de confiança (p=0,0067) daqueles que receberam quimioterapia ea vacina Mtb72ffAS01B.LISTAGEM DA SEQÜÊNCIA

<110> Coler, Rhea NReed, Steven GLobet, Yves

<120>MÉTODO INÉDITO PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃO

COM M TUBERCULOSIS<130> VB61507<160> 6

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 2287

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: proteína de tri-fusão Mtb72F(Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39)

<220> <221> caract . misc. <222> (30) . . (30) <223> η é a, c, g, OU<220> <221> caract . misc. <222> (33) . . (33) <223> η é a, c, g, OU<220> <221> CDs <222> (42) . . (2228) <220> <221> caract . misc. <222> (2270) ..(2270) <223> η é a, c, g, OU<4 00> 1

tctagaaata afctttgttta ctttaagaan. ganatataca t Stg cat cac cat cacSS

Met His His His His1 5

cat cac acg gcc gcg tcc gat aac ttc cag ctg tcc cag ggt ggg cag104

His His Thr Ala Ala Ser Asp Asri Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln10 15 20gga ttc gcc att ccg ate ggg eag gcg atg geg ate gcg ggc cag ate252

Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Ket Ala lie Ala Gly Gln Ile25 30 35

cga tcg ggt ggg ggg tca çeç acc get cat ate ggg cct acc gcc ttc200

Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Xhr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe40 45 SO

ctç ggc ttg ggt gtt gtc gac aac aac ggc aac ggc gcã cga gtc caa240

Leu Gly Leu Gly VaI Val Rsp Aen Aan QIy Asn Gly Ala Arg Val Oln55 60 65

cgc gtg gtc ggg age gct ccg gcg gea agt çtc ggc ate tcc acç ggc296

Arg Val Val Gly &er Ma Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Tbr Gly70 75 βΟ 85

gac gtg ate acc gcg gtc gac ggc gct Ccg ate aac tcg gcc acc gcg344.

Asp Val lie Thr Ala Vã! Asp Gly Ala Pro He Asn seir Als Thr Ala90 95 100

atg geg gac gcg Ctt aac ggg cat cat eçe ggt gac çtc ate tcg gtg392

Met Alá Asp Ala Iifeu Asm Qly Hie His Paro Gly Asp Val Ile Ser Val105 110 115

acc tgg caa. acc aag t cg ggc ggc a cg cgt a ca ggg a.ac gtg aca ttg440

Thx Trp Gln Xhr Lys Ser Gly Gly fhr Arg iEhr Gly Asa Val Thr Leu120 12S 130

gcc gag gga ccc ccg gcc gaa ttc atg gtg gat ttc ggg gcg tta. cca468

Ala Glu Gly PM Pro Ala Gltt Filé Het ?«tl Aep Pbe Gly Ala Leu Pro135 140 145

ccg gag ate aac tcc gcg agg atg tac gcc ggc ccg ggt tcg gcc tcg536

Pro Glu Ile Asis Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser150 155 160 ISS

ctg gtg gcc gcg gct cag atg tgg gac age gtg gcg agt gac ctg ttc5Θ4

Ls-a Val Ala Ala AIa Glii Met Trp Asjj Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe170 175 180

tcg gcc gcg tcg gcg tfct cag tcg gtg gtc tgg ggt ctg acg gtg ggg632

Ser AIa AIa Ser AIa Phe Gln Ser Val Val Trp GIy Thx Val Gly185 190 195tcg tgg ata ggt tcg tcg gcg ggt ctg atg gtg gcg gcg gcc tcg ccg680

Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly teu Mefc UaX Ala Alâ Ala Ser Pro200 205 210

tat gtg gcg tgg atg age gsc acc gcg ggg cag gcc gag ctg acc gcc726

Tyr Val Ala Met Ser Val Tar Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala215 220 22S

gcc cag gtc cgg gtt gefc gcg gcg gcc tac gag acg gcg tat ggg ctg

Ala Oln Val Arg Val Ala Alá Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu23C 235 240 245

acg gtg ccc ccg ccg gtg ate gcc gag aac egt gct gaa ctg atg ate824

Thr Val tro fcro Fro Val Iie Ala Glu Asn Arg Alá Glu teu Met IXe250 25S 2

ctg ata gcg acc aac etc ttg ggg eaa aac acc ccg gcg ate gcg gtc872

Leu íle Ala Tbr Asn teu Leu Gly Sln Asn Thr í>r& Ala IIe Ala Val265 270 27

aac gag gcc gaa tac ggc gag atg tgg gcc eaa gac gcc gcc gcg atg920

Aan Glu Ala Glu Tyr Gly Glti Ket Trp Ala Gla Asp Ala Ala Ala Ket280 265 290

ttt ggc tac gcc gcg gcg acg gcg acg gcg acg gcg acg ttg ctg ccg9 SS

Phe Qly Tyr Ala Ala Ala Thx Ala Tta Ala Thr Ala Tfcr Leu leu Rro295 300 305

ttc gag gag gcg ccg gag atg aec age gcg ggt ggg ctc çte gag cag

loie

Phe Glu Gltí Ala Piro Gliu Met Thr Sér Alá Gly Gly Iieu Leu Glu Gl n.310 315 320 325

gcc gcc gcg gcc gag gag gcc ccc gac acc gcc gcg gcg aac cag ttgJ.0S4

Ala Ala Ala Val Glu GIu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Aea Gls Leu330 335 340

atg aac aac gtg ccc cag gcg ctg caa cag ctg gcc cag ccc acg cag1112

Met Abô Asix Val Pro Gln Ala Iieu Glu Gln teu Ala Gln Pro Thx Gln

345 350 353

ggc acc acg cct tet Ccc aag ctg ggt ggc ctg tgg aag acg gtc tcg1160

Gly Tftr TtJX Pxo Sér Ser Lys :&em Gly 61y I*eu Trp Lys Ttir- Val Ser360 365 375ccg cat cgg tcg ccg afcc age aa= atg gtg tcg atg gcc aae aae cac1208

Pro Kie Arg Ser Pre Tte Ser Asn Mec Val Ser Met Ala Asn Aea Kis37S 380 3BS

atg tcg atg acc aae tcg ggt gtg tcg atg aee aae acc ttg age ccg1256

HeC Ser Met Xhr Asrv Ser Gly Vai Ser Met Thr Aan Thr Leu Ser Ser390 3SS 400 405

atg ttg eag ggc -tt gct ccg gcg gcg gcc gcc cag gcc gtg caa acc2304

Met IiSM Iiyβ Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Ala Val Gla Thr410 415 420

gcg gcg çaa aaç ggg gtc çgg gcg atg age tcg ttg ggc age ccg ctg135

Ala Ala Giii Asb Gly Val Arg Ala Met Ser Sesr Leu Gly Ser Ser Leu425 43D 435

gct tet tcg ggt ctg ggc ggt ggg gtg gcc gcc aac ttg ggt cgg gcg1400

Gly Ser Ser Gly ieu Gly Gly Gly Val Ala Ala Aan Leu Gly Axg Ala.440 44S 450

gcc tcg gtc ggt tcg ttg teg gtg ccg eag gcc tgg gcc gcg gcc aac144Θ

Ala Sei Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala Aam455 4S0 465

Sag gea gtc acc ccg gcg gcg cjg gcg ctg cog ctg acc age ctg acc1496

Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leti Piro Leu Thr Ser Leu Thr

470 475 480 485

age gcc gcg gaa aga ggg ccc ggg cag atg ctg ggc ggg ctg ccg gtg2544

Ser Ala Ala Gla Arg Gly Pro Gly Gla Ket Leu Gly Gly Leu Pro Val490 495 SOO

593 cag atg ggc gcc agg gcc ggt ggt ggg ctc agt ggt gtg ctg egtIS 92

Gly Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Scr Gly Val Leu Arg505 510 515

gtt ccg ccg cga ccc tat gtg atg ccg cat, tet ccg gea gcc ggc gae1640

Val Pro Pro Arg Pro Tyr VaI Ket Pro Hia Ser Pro Ala Ala GIy Asp520 525 530

ate gcc ccg ccg gcc ttg tcg cag gac cgg Cte gcc gae tte ccc gcg

Ile Ala Pro Prg Als Iou Ser Glni Aap Axg Rie Ala Asp Fhe Pro Ala53 S 540 545ctg ccc etc gac ccg tcc gcg atg gtc gcc caa gtg ggg cca cag gtg1736

Leu Pto Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pxo Gln ValSSO 555 5$0 S6S

gtc aac ate aac acc aaa ctg gge fcac aac aac gcc gtg ggc gcc ggg17B4

Vai. Aan Ile Aan Xhr Lys Leu Gly Tyr AS» Asn Ala Val Gly Ala Gly570 575 580

acc ggc ate gtc ate gat ccc aac ggt gtc gtg ctg acc aac aac cac1832

Tfcr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Tfer Aan Asa Hia585 590 595

gtg ate gcg ggc gcc acc gac ate aat gcg Etc age gtc çge ccc ggc1080

Val Ile Ala Gly Ma Ttar Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly ser Gly600 «OS 610

caa acc tac ggc gtc gat gtg gtc ggg tafc gac cgc acc cag gat gte1928

Glii Thr Tyr Gly Val Asp Val VaX Gly Tyr Asp Arg Thr Cln Asp Val615 620 625

gcg gtg ctg cag etg cgc ggt gcc ggt ggc ctg ccg tcg gcg gcg ate1976

Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pxo Ser Ala Ala Ile

630 635 640 645

ggt ggc ggc gtc gcg gtt ggt gag ccc gtc gtc gcg atg ggc aac age2024

Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pm Val Val Ala Met Gly Aen SerSSO SSS SSO

SSt 9S9 cag ggc gge acg ccc cgt gcg gtg cct ggc agg gtf gtc gcg2072

Gly Gly ela Gly Oly fhr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala665 670 675

ctc ggc caa acc gtg cag geg tcg gat tcg ctg acc ggt gcc gaa gag2120

LftU Gly Gln Thr Val Gla Ala Ser Asp Ser Lem Thr OIy Ala Glu GluSBO SBS 690

aca ttg aac ggg ttg ate cag ttc gat gçe gcg ate cag ccc ggt gat268

Thr Leu Aan Gly Leu Ile Glll Phe Asp Ala Ala Ilc Gln Pro Gly Asp695 700 705

tcg ggc ggg ccc gte gtc aae ggc cta gga cag gtg gtc ggt atg aac22IS

ser GIy Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val vai Gly «et Aan710 715 72 0 725acg gcc gcg tcc taggatatcc atcacactgg cggccgctcg agcagatccg2368

Thr Ala Ala Ser

gntgtaacaa agcccgaaa2287

<210> 2<211> 729<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: proteína de tri-fusão Mtb72F(Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39)<400> 2

Met His His Kii Hts Hiâ Hi6 Thr Ala Ala Ser Aap Aea Phe Glm Léu1 5 10 15

Ser Gln Gly Gly Gin Gly Phe Alã Ile Pto Ile Gly Gla Alâ Hét Alâ20 25 30

He AIa GIy Cila lie Arg ser Gly Gly Gly ser Fro Thr vai Hts Ile35 40 45

Gly Pro Thr Ala She Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Aea50 55 60

Gly Ala Asg Val Gln Arg Val Val Gly Ssr Ala Pro Ala Ala Ser Leti65 70 75 SO

Giy ιIe ser Thr Gly Asp Val He Thr Ala vai Aep Giy Ala Pro IleBS 90 95

Asii Ser Ala Tte Ala Het Ala Asp Ala Leu Asat Gly Hls HiS PrO Gly100 105 11«

Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thx Arg Thr115 120 125

Gly Asn Val Thr teu Ala Gl,u Sly Pro Pro Ala Glu Phe Wet Val Asp130 135 140Phe Gly Ala Leu Pro Prc Slu Ile Asu Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly145 ISO 155 160

Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Aep ser vai165 170 175

Ala Ser Asp Lsa Pfee Ser Ala Ala ser Ala Phe Gla Ser Val Val Trp

180 185 190

Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val195 200 20S

Ala Ala Ala ser Pro Tyr Val Ala Trp Ket Ser Val Thr Ala Gly Gln200 215 220

Ala Glu Leu Thr Ala Ala Slit Val Rrg Val Ala Ala Ala Ala Tyr GliJ225 230 235 240

Thr Ala Tyx Qly Leu Thr Val Pro foro Pro Val Ile Ala Slu Aen Axg245 250 255

Ala GM tew Met Ile l&a. lie Ala Ttor Asa teu leu Gly Gla Asn Thr260 265 270

Pro Alá Ile Ala Val Aan Glu Ala Glti Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln275 Í8Q 285

Asp Ala Ala Ala Het Phe Gly Tyr Ma Ala Ala Tlsr Ala Thr Ala Thr253 255

Ala Thr Leui teu Pro Fhe Olti Glu Ala tro Glu Met Thr Ser Ala Gly365 310 315 326

Gly Leu teu Glu Glra Ala Ala Ala- Vai Glm Glu Ala Ser Asp Tter Ala325 330 335

Ala Ala Asn Gln Lew Mec Ase Asn Val *ro Gln Ala Leu Sln Gln Leu340 34 S 3S0

Ala Gla Pro Thr Gln Gly Thr Thr Prc Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leti355 360 365

Trp Lys Thr Val Ser ?ro His Arg Ser Pro Ile Ser Asn Met Val Ser37Ô 375 380

MiSC AlA Asn Asn His Met Ser Ket Thr Asn ser Gly Val ser Met Tkr365 390 395 400

Asn Thr Leu Ser Ser Het Leu Lys Gly Phe Ala Sro Ala Ala Ala Ala405 410 415

Sln Ala Val Oln Tfcr Ala Ala Gln. Asfi Gly Val Arg Ala Het Ser Ser420 425 430

Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala435 440 445

Aen Leu Gly Arg Ala Ala Ser vai Gly Ser Leu ser vai Pro Gla Ala450 455 45Θ

Trp Ala Ala Ala Asa Gln Ala Vel Thr Pro Ala Ala Arg AIa Leu Pro465 4?0 475 460

Leu fhr Ser Leu Thr Ser Ala Als Glu Arg Gly Prp Gly Gln Met Leu485 490 4SS

Sly Gly Lfcu Pró Val Gly Glft Met Gly Ala Arg Ala Gly Sly Gly Lcu500 505 510

Ser Gly Val Lett Arg Val Pro Pro Arg Pro ryr Val Ket Pro Hia Ser515 520 525

Pro Ala Ala Gly Aap Ile Ale Pro Pro Ala. Leu Ser Gln Asp Arg Phe530 535 540

Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pró Leu Asp Pro Ser Alá Met Val Ala Gln545 550 555 5S0

Val Gly Pro Gln Val Val Aan XXe Asn Thr Lye Leu Gly Tyr Asa Asa5βS 570 575Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly lie Val Ile Asp Fro Asn Cly Val Val580 585 590

Leu Thr Asn Asa Kis Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Aen Ala Phe595 600 605

Ser Val Qly Ser Gly Gln Thr fyr Oly Val Aap Val Val Gly Tyx Aap610 615 625

Arg Thr Gln Agp VaI Ala Val leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu625 630 635 640

Pro Ser Ala Ala Jle Sly Oly Gly Val Ala Val Gly Glm Pró Val Val615 650 SSS

Ala Het Oly Asn Ser Gly Gly Gln Oly Gly Thr Pro Arg Alâ Val Pro560 É65 57Ç

Gly Arg Val Val Ala Leu Gly Gla Thr Vai GlR Ala Ser Asp Ser Leu67S SBO 695

Thr Gly Ala Glu Glii Thr liéu Asa Gly Leu Ile Glri Phe Asp Ala Ala69 Q 695 70 Ó

Ile Gln Pro Gly Asp Ser Giy Gly Pro Val Val Aan Gly Leu Gly Gla7ÓS 71D 715 72D

VaI VSl Gly Net Asn Ihr Ala Aie Ser723

<210> 3<211> 2178<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: variante de proteína de tri-f u são

Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39)<220>

<221> caract. misc.<222> (4)..(9)

<223> cat cac' em lugar de 'cat cac cat cac cat cac'<220>

<221> caract. misc.<222> (2116)..(2118)<223> 'gcg' em lugar de 'tcg'<400> 3atgcatcaca cggccgcgtc60

attccgateg ggcaggegat120

accgttcata t-çgggeçtaçIBO

ggçgçacgag tcçaacgcgt240

ggcgacgtga tcaccgcggt300

gcgcttaacg ggcafccatcc360

ggcacgcgta cagggaacgt420

ttcggggcgt taccaccgga430

tcgetggtgg ccgcggctca540

tcggcgttte agtcggtggt600

ggtctgatgg tggoggcggc660

gccgagctga cegccgccca720

ccgacggtgc ccccgccget780

accaaectct tggggcaaaa840

afcgtgggçcç aagacgccgc900

gçgaegttgc tgecgttcga560

cgataacttc cagcfcgtcccggcgatçgcg ggccagatcccgccttcctc ggcttgggtgggtcgggagc gctccggcggcgacggcgct ccgatcaactcggtgacgtc atcfccggtgagacattggcc gagggaccccgatcaactcc gcgaggatgtgatgtgggac agcgtggcgactgaggtcfcg acggtggggtctcgccgtat gtggcgtggaggtccgggfct gctgcggcgggatcgccgag aacegtgctgcaccccggcg atcgcggtcacgegatgtct ggctacgccgggaggcgccg gagatgacca

agggtgggca gggattegccgatcgggtgg ggggtcacccttgtcgacaa caaoggcaaccaagtctcgg çatctcçaççcggccaccgc gatggcggaccctggcaaac caagtegggccggccgaact catggtggatacgccggccc gggtfccggccgtgacctgtt ctcggccgcgcgtggatagg cfccgtcggcgcgagcgtcac cgcggggcagcctacgagac ggcgtatgogaactgatgat tctgatagcg:acgaggccga atacggcgagcggcgacggc gacggcgacggegcgggtgg gctcctçgagcaggccgccg cggtcgagga ggçctccgac1020

gtgceccagg cgçCgcaaca gctggcccagIOBO

ctgggtggcc tgtggaagac ggtctcgccg1140

atggccaaca accacatgtc gatgaccasc1200

tcgatgttga acggctttgc tccggcggcg1260

aacggggtcc gggcgatgag ctcgctgggc1320

ggggtggccg ccaacttggg tcgggcggcc1380

tgggccgegg ccaaccaggc agtcaccccg1440

accagcgccg cggaaagagg gcccgggcag1500

ggcgccaggg ccggtggtgg gctcagtggt1560

atgccgcatt ctccggcagc cggcgatatc1620

gccgactfccc ccgcgctgcc cetcgacccg1680

gtggtcaaca tcaaeaccaa actgggctac1740

gtcatcgatc ccaacggtgt cgtgctgacc13 OO

atcaatgegt tcagcgtcgg ctccggccaa1S60

cgcacccagg atgtcgcggt gctgcagctg1920

ntcggtggcg gcgtcgcggt tggtgagcce1980

ggcagaacgc ecegtgcggt gcctggeagg2040

accgccgcgg cgaaccagtt gatgsacaatcccacgcagg geaccâogec ttcttccaagcatcggtcge cgatcagcaa catggfcgtcgtcgggtgtgt cgatgaccaa caccttgaccgccgcccagg ccgtgcaaac cgcggcgcaaágctçgçtgg gttçttçggg tctgggcggttcggteggtt cgttgccggt gecgeaggccgcggcgcggg ecctgccget gaccagccsgatgetgggcg ggctgccggt ggggcagatggtgctgcgcg tcccgccgcg accetacgtggccccgccgg ccttgtcgca ggaccggtcctccgcgatgg tcgcccaagt ggggccacagaacaacgccg tgggcgccgg gaccggcatcaacaaccacg tgatcgcggg çgccaccgacacctacggcg tcgâfcgtggt cgggtatgaccgcggtgccg gtggcctgcc gtcggcggcggtcgtcgcga tgggcaacag cggtgggcaggtggtcgcgc tcggccaaac cgtgcaggcgtcggattcgc tgaccggtgc cgaagagaea ttgaacggge tgatccagtC cgatgccgcg2100

acccagcccg gfcgatgcggg cgggcccgtc gtcaacggcc caggacaggt ggtcggtátg2160

aacacggccg cgtcccag2178

<210> 4<211> 725<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: variante de proteína de tri-fusão

Mtb72F (Ral2-TbH9-Ra35 ou Mtb32-Mtb39)<220>

<221> CARACT. MISC.<222> (2)..(3)

<223> 'His His1 em lugar de 'His His His His His His'<220>

<221> CARACT. MISC.<222> (706)..(706)<223> 'Ala' em lugar de 'Ser'<400> 4

Met His Hie Thr AIa Ala. Ser Asp As» Phe Gln Leu Ser GIb Gly GlyXS 10 IS

GIn Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln

20 25 30

Ile Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val Hia Ile Gly Pro Thr Ala35 40 45

Phe Lea Gly Leu Gly Val Val Asp Asa Aaa Gly Asn Gly Ala Arg Val50 55 60

01» Arg vai Val Gly Ser- Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser ThrSS 70 75 BO

Gly Asp Val tle Thr Ala Val Asp Gly Ala i>ro Ile Asa Ser Ala Thr85 90 95Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val lie Ser100 105 110

Val Thr Trp Oin Tbr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr115 120 125

Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Aâp Phe Gly Ala Leu130 135 140

Pro Pro Glu Ilè Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala145 ISO 155 160

Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu

165 no 175

Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val180 185 190

Gly ser TSCp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leti Met Val Ala Ala Ala Ser195 200 205

Pro Tyr vai Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Glu Leu Tto210 215 220

Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly225 220 235 240

Leu Thr Vai Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Het245 250 255

Ile Leu lie Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala260 26S 2:70

Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala275 280 23S

Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu290 295 300

Pra Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Tbr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu305 310 315 320

Gln Alá Alá Ala Vâl Glu Gltt AIa Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln325 330 335

Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr340 345 3S0

Gln GIy Thc Tte Pto Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val355 360 365

Ser Pro His Arg Ser Pro- Ile Ser Aaa Het Val Ser Het Ala Asn Asn370 375 380

Kis Met Ser Het Thr Asa Ser Gly Val Ser Met Thr Asa Thr Leu Ser385 390 395 400

ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Aia Ala Ala Gln Ala. Val Glrt405 410 415

Thr Ala Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser420 425 430

Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg435 440 445

Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu. Ser Val Pro Gla Ala Trp Ala Ala Ala45Ô 455 450

Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala. Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu4SS 470 475 430

Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gla Met Leu Gly Gly Leu Pro485 490 435

Val Gly Gln Net Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu500 SOS 510

Arg Val Pro Pro .Arg Pro Tyr Val Mfet Pro His Ser Pro Ala Ala Gly515 520 525Asp Ile Alá Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Aia Asp Phe Pro530 535 540

Alá Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Wet Val Ala Gln Val GIy Pro Gln54S 550 555 560

Val Vai Asn He Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly AlaSSS 570 575

Cly Tlir Gly Ile Val Ile Asp Pro Asil Gly VaI VaI Leu Thr ASft Astt580 565 S90

Hia vai Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala She Ser Val Gly SerS9S SOO 605

Gly Gln Thr Tyr Gly Vâl Aâp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gla Asp610 615 620

Val Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly LefU Pro Ser Ala Ala625 630 635 640

Ile Gly Gly Gly vai Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Het Gly Aao64S 650 655

Ser Gly GIy Gla Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro GIy Arg Vai Val660 665 670

Ala Leu Gly Gla Thr Vâl Gl:n Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu675 680 685

Glu Thr Leu Asn Gly Leu Ile Glai Phe Aep Ala Ala Ile Gln Pro Gly690 695 700

Asp Ala Gly Gly Pro Vâl Val Asn Gly Leu Gly Gln Val VaI Gly Mefc705 710 715 720

<210> 5<211> 2172<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Mtb72F-IND<220>

<221> caract. misc.<222> (4) . . (4)

<223> deleção de marcador 'cat cac cat cac cat cac'<400> 5gceeaagacg ccgececgat900

ttgctgccgc tcgagoaggc960

gccgcggtcg aggaggcctc1020

çaggcgctgc aacagctggc1080

ggcctgtgga agacggtctc

1140

aacaaçcaca tgtcgatgac1200

ttgaaggget ttgctcegge1260

gtccgggcga tgagetcgct1320

gççgççaact tgggtcgggc1380

gcggccaacc aggcagtcac1440

gccgcggaaa gagggcccgg1500

agggccggtg gtgggctcag1560

cattcfcccgg cagccggcga1620

ttcoccsgcgc tgcccctcga1680

aacatcaaca ccaaactggg1740

gatcccaacg gtgtcgtgct1800

gcgttoagcg tcggctccgg1860

caggatgtcg GggtgGtgca1920

gtttggctac gccgcggcgagccggagatg accagcgcggcgacacogcc gcggcgaaccccagcccacg cagggcaecagccgcatcgg tcgccgatcacaaçtçgggt gtgtcgatgaggcggccgcc caggccgtgcgggcagctcg ctgggttcttggcctcggtç ggttcgttgtcccggcggcg cgggcgctgcgcagatgctg ggcgggctgetggtgtgcíg cgtgttccgctatcgccccg ccggccttgteecgtccgeg atggfccgcccçtacaacaac gcçgtgggçggaccaacaac cacgtgatcgccaâacctac ggcgtegatggctgçgcggt. gccggtggcc

cggcgacggc gacggcgacggtgggctccfc cgagcaggccagttgatgaa caatgegccccgccttcttc caagctgggtgeaacatggt gtcgatggccccaacacctt gagctpgatgaaaCcgcggc gcaaaacgggcgggtctggg cggtggggtgcggtgccgca ggccCgggcccgctgaccag cctgaccagccggtggggca gatgggcgççcgcgacccta tgtgatgccgçgçaggaçcg gtfccgccgacaagtggggcc acaggtggtccçgggaccgg catcgtcatccgggcgccac çgaeatCãatEggtcgggta tgaccgcaeetgccgtcggc ggcgatcggtggcggcgtcg cggttggtga gcccgtcgtc gcgatgggca acagcggtgg gcagggcgga1980

acgccccgtg cggtgrcctgg cagggtggtc gcgctcggcc aaaccgtgca ggegtcggat2040

tcgctgaccg gCgccgaaga gacattgaac gggttgatcc agttcgatgc cgcgatccag2100

cccggtgatt cgggcgggce cgtcgtcaac ggcctaggac aggtggtcgg tatgaacacg2160

gccgcgtcct ga2172

<210> 6

<211> 723

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial; Mtb72F-IND<220>

<221> CARACT. MISC.<222> (2)..(2)

<223> deleção de marcador 'His His His His His His'<400> 6

Met Thr AIa Ala Ser Aap Asn Fhe Gln Leu Ser Glp Gly Gly Gln Gly1 5 10 15

Phe Ma lie Pro Ile Gly Gln Ala «et Ala Ile Ala Gly GIn Ile Arg20 25 30

Ser Gly Gly Gly Ser Pro Ttor vai His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu35 40 45

Gly Leu Gly Val vai Asp Asn Asa Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln ArgSO 55 60

Val Val Gly Ber Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly. AspSS 70 75 80

Val lie Tiir Ala vai Asp Gly Ala Pro Ile Aaa Ser Ala Thr Ala Met-as 90 95Ala Asp Ala Leu Asn Gly Kia His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr100 105 110

Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Tisr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu AlaIlS 120 125

Gla Gly Pro Pro Ala Glu Phe Ket Val Asp Phe Gly Ala LeB Pro Pro130 135 140

Glu Ile Asri Ser Ala Arg Met Tyr Alô Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu145 150 1S5 160

Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser165 170 175

Ma Aia Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly SerISO 185 190

Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly l<eu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr195 200 205

Val Ala Trp Met Sex Val Tfer Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Ala210 215 220

Qln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyx Gly Leu Hir225 230 235 240

Val tro Pro Pro Val lie Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu245 250 255

Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val Asn2$G 265 270

Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala Ket Phe275 280 2SS

Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe290 295 300

Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala305 310 315 320Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser ASp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leil Met325 330 335

Asn Aan Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr Gln Gly340 345 350

Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Prc355 360 365

His Arg Ser Pro Ile Ser Asn Met Val Ser Met Alat Asn Asn Hia Met370 375 360

Ser Mec Thr Asn Ser Gly Val Ser Mec Thr- Asn Thr Leu Ser Ser Met385 390 395 400

Leu Lys Gly Fhe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Thr Ala405 410 415

AXa Gla Asn Gly Val Arg Ala Mét Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly420 425 430

Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala43$ 440 445

Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln45O 455 460

Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser465 470 47S 480

Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly485 490 435

Gln Het Gly Ala Acg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Jfcrg Val500 505 510

Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met Pro Hia Ser Pro Ata Aia Gly Aep Ile515 520 525

Ala Pro Pro Ala Leu Ssr Gln Asp Arg Phe Alá Asp Phe Pro Ala Leu530 S3S 540

Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pró Gln Val Val545 550 5S5 560

Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr565 570 575

Gly Ile Val Ile Aso Pró Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His ValSSO SSS SSO

Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gin595 SOO 605

Thr Tyr Gly Val Aap Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr GJn Asp Vsl Ala610 615 620

Val Leu Gln fera Arg Gly Ala Gly Gly Ley Pro Ser Ala Ala Ile Gly625 630 635 640

Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala «et Gly Asn Ser Gly

64S 650 655

Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala Ley660 665 670

Gly Gln Thr Vsl Gln Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr67S 680 685

Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala lie Gla Pro Gly Asp Ser690 69S 700

Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met Asn Thr705 710 715 720

Ala Ala Ser

Claims

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico damesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose e umadjuvante, para uso no tratamento ou prevenção da reativação de tuberculoseem um mamífero já infectado com Myeobaeterium tubereulosis.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o mamífero apresenta uma infecção ativa de Mtubereulosis.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o mamífero apresenta uma infecção latente deM tubereulosis.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o mamífero é infectado com uma cepa de Mtubereulosis resistente a múltiplas drogas.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o mamífero foi imunizado previamente comBacillus Calmette-Guerin (BCG).

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é de Myeobaeterium tubereulosis.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo compreendendoradicais de 8 a 729 da SEQ ID NO:2.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo que consiste deradicais 1 e de 8 a 729 da SEQ ID NO:2 opcionalmente com um marcador Hisinserido após o radical Met inicial.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo da SEQID NO:2.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-7, caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo da SEQ IDNO:6.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo compreendendoradicais de 4 a 725 da SEQ ID NO:4.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-11, caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo que consiste deradicais 1 e de 4 a 725 da SEQ ID NO:4 opcionalmente com um marcador Hisinserido após o radical Met inicial.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação11, caracterizada pelo fato de que a Mtb72f é um polipeptídeo da SEQ IDNO :4.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o mamífero é um humano.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é selecionado do grupo queconsiste de 3D-MPL e QS21 em uma formulação de lipossoma e 3D-MPL eQS21 e uma emulsão óleo em água.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que é administrada juntamente com um ou maisagentes quimioterápicos eficazes para tratar uma infecção com M.tuberculosis.

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-16, caracterizada pelo fato de que o um ou mais agentes quimioterápicos éselecionado dentre isoniazida e rifampina.

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-16, caracterizada pelo fato de que o mamífero recebe administração inicial deum ou mais agentes quimioterápicos durante um determinado período e,depois, recebe a administração da composição farmacêutica como definida nareivindicação 1.

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-16, caracterizada pelo fato de que o mamífero recebe administração inicial dacomposição farmacêutica como definida na reivindicação 1, e, depois, recebea administração de um ou mais agentes quimioterápicos durante umdeterminado período.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-16, caracterizada pelo fato de que a administração do um ou mais agentesquimioterápicos e da composição farmacêutica como definida nareivindicação 1 é iniciada ao mesmo tempo.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que é administrada uma ou mais vezessubseqüentes.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que é administrada em um método de iniciar ereforçar mediante administração subseqüente um ácido nucleico que codificauma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico da mesma deuma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose.

23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um ácido nucleico que codifica uma proteína de fusão Mtb72fou um fragmento imunogênico da mesma de uma espécie de Myeobaeteriumdo complexo de tuberculose, para uso no tratamento ou prevenção dareativação de tuberculose em um mamífero já infectado com Myeobaeteriumtubereulosis.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é SEQ ID NO: 1.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende nucleotídeosde 63 a 2222 da SEQID NO: 1.

26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é SEQ ID NO:3.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende nucleotídeosde 10 a 2175 da SEQID NO:3.

28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é fornecido em um vetorde adenovírus.

29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico é fornecido em um vetorde célula hospedeira de Bacillus ou Mycobacterium mutante.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-23, caracterizada pelo fato de que é administrada em um método de iniciar ereforçar mediante administração subseqüente de uma proteína de fusãoMtb72f ou um fragmento imunogênico da mesma de uma espécie deMyeobacterium do complexo de tuberculose.

31. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico damesma com uma espécie de Myeobaeterium do complexo de tuberculose eum adjuvante, para reduzir o decurso da quimioterapia contra uma infecçãocom M. tubereulosis.

32. Uso de uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmentoimunogênico da mesma, caracterizado pelo fato de ser de uma espécie deMyeobacterium do complexo de tuberculose, para a preparação de ummedicamento para o tratamento ou prevenção da reativação de tuberculose emum mamífero já infectado com Mycobaeterium tubereulosis.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a Mtb72f é um polipeptídeo compreendendo radicais de 4 a 725da SEQ ID NO:4.

34. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a Mtb72f é um polipeptídeo compreendendo radicais de 4 a 725da SEQ ID NO:6.

35. Uso de um ácido nucléico, caracterizado pelo fato de quecodifica uma proteína de fusão Mtb72f ou um fragmento imunogênico damesma de uma espécie de Mycobacterium do complexo de tuberculose, para apreparação de um medicamento para o tratamento ou prevenção da reativaçãode tuberculose em um mamífero já infectado com Mycobaeteriumtubereulosis.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de que o ácido nucléico compreende nucleotídeos de 10 a 2175 da SEQID NO:3.

37. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de que o ácido nucléico compreende a SEQ ID NO:5.