BRPI0611414B1 - Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao tweak humano, composição farmacêutica e seus usos - Google Patents

Abstract

proteína ligante de tweak, composição farmaceutica compreendendo a referida proteína, método para produzir um anticorpo e uso da referida composição. a presente invenção refere-se a anticorpos anti-tweak.

Description

Este pedido de patente reivindica prioridade para o pedido de patente n^o de série US 60/685.149, depositado em 27 de maio de 2005, cujo teor é aqui incorporado como referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As citocinas relacionadas ao fator de necrose tumoral (TNF) são uma superfamília de proteínas que têm uma série de funções, incluindo aquelas implicadas na regulação imunológica e na regulação apoptótica. TWEAK (indutor fraco de apoptose semelhante a TNF) é um membro desta superfamília.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os anticorpos anti-TWEAK podem ser usados para tratar uma série de condições e distúrbios, como por exemplo, um distúrbio inflamatório, um distúrbio neuronal ou outro distúrbio aqui descrito. Quando usado para tratar um ser humano, o anticorpo é, de preferência, um anticorpo humano, humanizado ou de outra forma efetivamente humano.

Em um aspecto, a invenção refere-se a uma proteína que inclui uma primeira e uma segunda sequências do domínio variável da imunoglobulina, e que se liga a TWEAK, por exemplo, TWEAK humana. A proteína pode se ligar a TWEAK, por exemplo, com uma afinidade correspondente a uma KD menor do que 10^-7 M, por exemplo, 10^-8, 10^-9, 10^-10, 10^-11 M ou melhor. A proteína é aqui referida também como anticorpo anti-TWEAK. A primeira e a segunda sequências do domínio variável da imunoglobulina podem incluir pelo menos uma parte suficiente de um domínio variável da imunoglobulina para formar um sítio de ligação de antígeno que se liga a

TWEAK. Tipicamente, a primeira e a segunda sequências do domínio variável da imunoglobulina correspondem a sequências do domínio variável da imunoglobulina da cadeia pesada e leve, respectivamente, por exemplo,

Petição 870180146919, de 31/10/2018, pág. 15/20

uma cadeia pesada e leve emparelhada ou compatível de outra forma.

O anticorpo pode se ligar a um epitopo em TWEAK, que inclui pelo menos um, dois, três ou quatro resíduos de aminoácidos de um epitopo em TWEAK reconhecido por P2D10, a um peptídeo de TWEAK que está ligado por P2D10 (por exemplo, um peptídeo com um comprimento menor do que 25, 20, ou 15 aminoácidos) ou a uma região de TWEAK reconhecida por P2D10. Por exemplo, o anticorpo se liga especificamente a um epitopo, por exemplo, um epitopo linear ou conformactonal de TWEAK, particularmente TWEAK humano, por exemplo, a região solúvel de TWEAK. O anti10 corpo pode competir com P2D10 pela ligação a TWEAK, por exemplo, a TWEAK humano. O anticorpo pode inibir competitiva mente a ligação de P2D10 a TWEAK, por exemplo, TWEAK humano. Em uma modalidade, o anticorpo pode se ligar a um epitopo que se sobrepõe àquele de P2D10, que, por exemplo, inclui pelo menos um, dois, três ou quatro aminoácidos em comum com o epitopo de P2D10, ou um epitopo que, quando ligado de forma estérica, impede a interação de TWEAK com P2D10.

Por exemplo, o anticorpo anti-TWEAK pode se ligar a TWEAK e modular, por exemplo, inibir, uma interação (por exemplo, uma ligação) entre TWEAK e um receptor de TWEAK, por exemplo, Fn14 (por exemplo, Fn14 humano). O anticorpo pode também reduzir a atividade de sinalização de um receptor de TWEAK. O anticorpo pode visar TWEAK, sequestrar TWEAK, e/ou modular a estabilidade in vivo de TWEAK.

Em uma modalidade, o anticorpo se liga especificamente a pelo menos uma parte do sítio de interação em TWEAK, que entra em contato com Fn14 (por exemplo, Fn14 humano). O anticorpo pode competir com Fn14 pela ligação a TWEAK, por exemplo, TWEAK humano. O anticorpo pode inibir competitivamente a ligação de Fn14 a TWEAK. O anticorpo pode interagir com um epitopo em TWEAK, o qual, qundo ligado de forma estérica, impede a interação entre TWEAK e Fn14 (por exemplo, entre TWEAK humano e Fn14 humano).

Em uma modalidade, o anticorpo pode inibir uma ou mais atividades associadas a TWEAK com uma CI50 de cerca de 50 nM a 5 pM, tipi-

camente cerca de 100 a 250 pM ou menos. Por exemplo, o anticorpo pode inibir a capacidade de TWEAK para promover a proliferação ou neovascularização de células endoteliais. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TWEAK reduz pelo menos uma atividade associada a TWEAK, por exemplo, de tai modo que o anticorpo possa modular uma condição antiinflamatória quando administrado a um indivíduo.

Em outras modalidades, o anticorpo pode se associar a TWEAK com uma cinética na faixa entre 10³ e 10⁸ M‘¹s'¹, tipicamente 10⁴ a 10⁷ M’¹s' ¹. Em ainda outra modalidade, o anticorpo tem uma cinética de dissociação na faixa entre 10'² e 10'⁶ s‘¹, tipicamente 10'² a 10‘⁵ s'¹. Em uma modalidade, o anticorpo se liga a TWEAK, por exemplo, TWEAK humano, com uma afinidade e/ou cinética similar (por exemplo, dentro de um fator de cinco ou dez) ao anticorpo monoclonal P2D10, ou formas modificadas dele, por exemplo, formas quiméricas ou formas humanizadas dele (por exemplo, uma forma humanizada aqui descrita). A afinidade e a cinética de ligação do anticorpo anti-TWEAK podem ser testadas, por exemplo, usando a tecnologia de biossensores (BIACORE®).

Em uma modalidade, o anticorpo é um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo de comprimento inteiro, por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2, Fv ou Fv de cadeia única. Tipicamente, o anticorpo é um anticorpo de comprimento inteiro. O anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou um anticorpo monoespecífico. Por exemplo, o anticorpo está em uma composição que inclui menos do que 20 outras espécies de anticorpos anti-TWEAK, por exemplo, em uma composição que não incluí outra espécie de anticorpo anti-TWEAK.

O anticorpo pode ser efetivamente humano. Um anticorpo efetivamente humano é um anticorpo que inclui um número suficiente de posições de aminoácidos humanos, de tal modo que o anticorpo não provoque uma resposta imunogênica em um ser humano normal. De preferência, a proteína não provoca uma resposta neutralizadora do anticorpo, por exemplo, a resposta de anticorpo antimurino humano (HAMA). HAMA pode ser problemático em inúmeras circunstâncias, por exemplo, se os anticorpos são

desejados para serem administrados repetidamente, por exemplo, no tratamento de uma condição de doença crônica ou recorrente. Uma resposta HAMA pode tornar a administração repetida do anticorpo potenciaimente ineficaz por causa de uma depuração aumentada do anticorpo do soro (vide, por exemplo, Saleh etal., Cancer Immunoí. Immunother. 32:180-190 (1990)), e também por causa de reações alérgicas potenciais (vide, por exemplo, LoBuglio et al., Hybridoma, 5:5117-5123 (1986)).

Por exemplo, o anticorpo pode ser um anticorpo humano, humanizado, enxertado com CDR, quimérico, mutado, maturado por afinidade, desimunizado, sintético ou gerado in vitro de outra forma, e combinações deles. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TWEAK é um anticorpo humanizado.

As cadeias pesada e leve do anticorpo anti-TWEAK podem ser substancialmente de comprimento inteiro. A proteína pode incluir pelo menos uma, e de preferência duas cadeias pesadas completas, e pelo menos uma, e de preferência duas cadeias leves completas, ou pode incluir um fragmento ligante de antígeno (por exemplo, um fragment Fab, F(ab')2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia única). Em ainda outras modalidades, o anticorpo tem uma região constante com cadeia pesada escolhida entre, por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, lgA1, lgA2, IgD, e IgE; escolhida particularmente entre, por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, e lgG4,e mais particularmente, IgG 1 (por exemplo, lgG1 humana). Tipicamente, a região constante com cadeia pesada é humana ou uma forma modificada de uma região constante humana. Em outra modalidade, o anticorpo tem uma região constante de cadeia leve escolhida entre, por exemplo, kapa ou lambda, particularmente, kapa (por exemplo, kapa humana).

Em uma modalidade, a proteína inclui pelo menos uma, duas, e de preferência, três CDRs da região variável da cadeia leve ou pesada de um anticorpo aqui descrito, por exemplo, P2D10. Neste contexto, CDRs refe30 rem-se a CDRs como definidas por alças hipervariáveis de Chothia. Por exemplo, a proteína inclui, na sequência do domínio variável da cadeia pesada, pelo menos uma, duas ou três das seguintes sequências dentro de uma o

região CDR:

GFTFSRYAMS (CDR1) (SEQ ID NO: 1),

EISSGGSYPYYPDTVTG (CDR2) (SEQ ID NO: 2),

VLYYDYDGDRIEVMDY (CDR3) (SEQ ID NO: 3), ou uma CDR que tem uma sequência de aminoácidos que difere em não mais do que 4, 3, 2.5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções) para cada 10 aminoácidos (por exemplo, o número de diferenças sendo proporcional ao comprimento da CDR) em relação a uma sequência listada acima, por exemplo, pelo menos uma alteração, mas não mais do que duas, três ou quatro por CDR. A sequência do domínio variável da cadeia pesada pode incluir essas sequências de CDRs, particularmente em CDR3, ou em pelo menos duas CDRs, por exemplo, CDR1 e CDR3, CDR2 e CDR3, ou em todas três CDRs.

A proteína pode incluir, na sequência do domínio variável da cadeia pesada, pelo menos uma, duas ou três das seguintes sequências dentro de uma região CDR (os aminoácidos entre parênteses representam alternativas para a posição específica):

(i) G-(YF)-(NT)-F-(STDN)-(RY)-Y-A-(MIL)-(HS); (SEQ ID NO: 4), ou (ii) Y-Y-(PV)-D-(TS)-V-(TK)-G; (SEQ ID NO: 5) e (iii) (VL)-(IL)-(YF)-(YF)-D-(YF)-D; (SEQ ID NO: 6) ou (DE)-(RK)(ILVM)-(EQD)-(VAL)-M-(DE); (SEQ ID NO: 7).

A proteína pode incluir, na sequência do domínio variável da cadeia leve, pelo menos uma, duas ou três das seguintes sequências dentro de uma região CDR:

RSSQSLVSSKGNTYLH; (CDR1) (SEQ ID NO: 8),

KVSNRFS; (CDR2) (SEQ ID NO: 9), e

SQSTHFPRT; (CDR3) (SEQ ID NO: 10), ou uma CDR que tem uma sequência de aminoácidos que difere em não mais do que 4, 3, 2,5, 2, 1,5, 1, ou 0,5 alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções) para cada 10 aminoácidos (por exemplo, o número de diferenças sendo proporcional ao comprimento da CDR) em relação a uma sequência listada a30

cima, por exemplo, pelo menos uma alteração, mas não mais do que duas, três ou quadro por CDR. A sequência do domínio variável da cadeia leve pode incuir essas sequências de CDR particularmente em CDR3, ou em pelo menos duas CDRs, por exemplo, CDR1 e CDR3, CDR2 e CDR3, ou em todas três CDRs.

A proteína pode incluir, na sequência do domínio variável da cadeia leve, pelo menos uma, duas ou três das seguintes sequências dentro de uma região CDR (os aminoácidos entre parênteses representam alternativas para a posição específica):

(i) (RK)-S-S-Q-S-(LI)-(KV)-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-(EHDNQY); (SEQ ID NO: 11), ou (RK)-S-S-Q-S-(LI)-V-S-S-(KR)-G-N-(TN)-Y-L-H: (SEQ IDNO: 12) (ii) (KE)-(LVI)-S-(NYS)-(RW)-(FAD)-S; (SEQ ID NO: 13), ou K(LVI)-S-(NYS)-R-(FAD)-S; (SEQ ID NO: 14), e (iii) (SM)-Q-(GSA)-(ST)-(HEQ)-(FWL)-P; (SEQ ID NO: 15) ou S-Q-(GSA)-(SIT)-(HEQ)-F-P; (SEQ ID NO: 16).

Em uma modalidade preferida, a proteína inclui todas seis CDR's de P2D10 ou CDrs intimamente relacionadas, por exemplo, CDRs que são idênticas ou que têm pelo menos uma alteração de aminoácido, mas não mais do que duas, três ou quatro alterações (por exemplo, substituições, deleções, ou inserções), ou outra CDR aqui descrita.

Em ainda outro exemplo, a proteína inclui pelo menos uma, duas ou três regiões CDR que têm as mesmas estruturas canônicas e as regiões CDR Chothia correspondentes de P2D10, por exemplo, as mesmas estruturas canônicas que pelo menos CDR1 e/ou CDR2 dos domínios variáveis da cadeia pesada e/ou leve de P2D10.

A proteína pode incluir uma das seguintes sequências:

. DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK

PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 17) • DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV

GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 18) • DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQ RPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 19) • DWMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWFQQ RPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAED VGVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 20) • DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 21) • DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK PGQPPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 22) • DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 23) • DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQK PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 24) • DIVMTQTPLSSPVTLGQPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWLQQR PGQPPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGAGTDFTLKISRVEAEDV GVYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 25) • DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVSSKGNTYLHWYQQ KPGKAPKLLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCSQSTHFPRT (SEQ ID NO: 26) ou uma sequência que tem menos do que oito, sete, seis, cinco, quatro, três ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por exemplo, substituições conservativas ou uma substituição por um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em P2D10, huP2D10-L1, ou huP2D10-L2). As substituições exemplificativas são em uma das seguintes posições Kabat: 2, 4, 6, 35, 36, 38, 44, 47, 49, 62, 64-69, 85, 87, 98, 99, 101, e 102. As substituições podem, por exemplo, substituir um ou mais aminoá30

cidos de P2D10 em posições correspondentes em uma região do esqueleto, por exemplo, uma região humana do esqueleto, por exemplo, em FR2 (por exemplo, na posição 46 a Phe, de acordo com a numeração consecutiva) e em FR3 (por exemplo, na posição 87 a Phe).

A proteína pode incluir uma das seguintes sequências do domínio variável da cadeia pesada:

• QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPG QGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRDTSISTAYMELSR LRSDDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 27) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPG QRLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDTSASTAYMELSSL RSEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 28) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQATG QGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRNTSISTAYMELSSL RSEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 29) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPG QGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTTDTSTSTAYMELRS LRSDDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 30) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTEDTSTDTAYMELSS LRSEDTAVYYCATVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 31) • QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPG QALEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDRSMSTAYMELSSL RSEDTAMYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 32) • QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQAPG QGLEWMGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTMTRDTSTSTVYMELSS LRSEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 33) • QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGFTFSRYAMSWVRQARG QRLEWIGEISSGGSYPYYPDTVTGRVTITRDMSTSTAYMELSSL RSEDTAVYYCAAVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 34) • EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL

>6,

RAEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ !D NO: 35) • EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RAEDTALYYCAKDVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 36) • QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWIRQAPGK GLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 37) • EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVGEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDDSKNTLYLQMNSL KTEDTAVYYCTTVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 38) • EVQLVESGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RAEDTALYHCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 39) • EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RAEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 40) • EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 41) • QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 42) • QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 43) • QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCAKVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 44) • QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVAEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL RAEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 45) • EVQLVESGGVWQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG

KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNSLYLQMNSL°*S<; - < RTEDTALYYCAKDVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 46) • EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEWVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLQMNSL RDEDTAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 47) • EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFSRYAMSWFRQAPG KGLEWVGEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDGSKSIAYLQMNSL KTEDTAVYYCTRVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 48) • EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPG KGLEYVSEISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNSKNTLYLQMGSL RAEDMAVYYCARVLYYDYDGDRIE (SEQ ID NO: 49) ou uma sequência que tem menos do que oito, sete, seis, cinco quatro, três ou duas alterações (por exemplo, substituições, inserções ou deleções, por exemplo, substituições conservativas ou uma substituição por um resíduo de aminoácido em uma posição correspondente em P2D10). As substituições exemplificativas são em uma das seguintes posições Kabat: 2, 4, 6, 25, 36,

37, 39, 47, 48, 93, 94, 103, 104, 106, e 107. As substituições podem, por exemplo, substituir um ou mais aminoácidos de P2D10 em posições correspondentes em uma região do esqueleto, por exemplo, uma região humana do esqueleto.

Em uma modalidade, o esqueleto com cadeia pesada (por exemplo, FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma sequência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas excluindo CDRs) inclui uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais, idêntica ao esqueleto da cadeia pesada de uma das sequências germinativas V: DP-25, DP-1, DP-12, DP-9, DP-7, DP-31, DP-32, DP-33, DP-58, DP-54, outra sequência germinativa do subgrupo VH I, outra sequência germinativa do subgrupo VH III, ou outro gene V que é compatível com a classe de estrutura canônica 1-3 (vide, por exemplo, Chothia et a!., J. Mol. Biol. 227:799817 (1992); Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798 (1992)). Outros esqueletos compatíveis com a classe de estrutura canônica 1-3 incluem esqueletos com um ou mais dos seguintes resíduos de acordo com a numeração

Kabat: Ala, Gly, Thr, or Vai na posição 26; Gly na posição 26; Tyr, Phe, ou Giy na posição 27; Phe, Vai, lie, ou Leu na posição 29; Met, Ile, Leu, Vai, Thr, Trp, ou He na posição 34; Arg, Thr, Ala, Lys na posição 94; Gly, Ser, Asn, ou Asp na posição 54; e Arg na posição 71.

Em uma modalidade, o esqueleto de cadeia leve (por exemplo,

FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma sequência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas que exclui CDRs) inclui uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais, idêntica ao esqueleto de cadeia leve de uma sequência germinativa do subgrupo Vk II ou uma das seguintes sequências germinativas com segmentos V: A17, A1, A18, A2, A19/A3, A23, uma sequência germinativa do subgrupo Vk I (por exemplo, uma sequência de DPK9), ou outro gene V que é compatível com a classe de estrutura canônica 4-1 (vide, por exemplo, Tomlinson et al., EMBO J. 14:4628 (1995)). Outros esqueletos compatíveis com a classe de βει 5 trutura canônica 4-1 incluem os esqueletos com um ou mais dos seguintes resíduos de acordo com a numeração Kabat: Vai ou Leu ou lie na posição 2; Ser ou Pro na posição 25; ile ou Leu na posição 27b; Gly na posição 29; Phe ou Leu na posição 33; e Phe na posição 71. Além disso, de acordo com a numeração Kabat, a posição 48 pode ser He ou Vai.

Em outra modalidade, o esqueleto de cadeia leve (por exemplo,

FR1, FR2, FR3, individualmente, ou uma sequência que engloba FR1, FR2, e FR3, mas que exclui CDRs) inclui uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais, idêntica ao esqueleto de cadeia leve de uma sequência germinativa do subgrupo Vk I, por exemplo, uma sequência de DPK9.

Em uma modalidade, o esqueleto variável de cadeia leve ou pesada (por exemplo, a região que engloba pelo menos FR1, FR2, FR3, e opcionalmente FR4) pode ser escolhido entre: (a) um esqueleto variável de cadeia leve ou pesada que inclui pelo menos 80%, 90%, 95%, ou de prefe30 rência, 100% dos resíduos de aminoácidos de um esqueleto variável de cadeia leve ou pesada, por exemplo, um resíduo de esqueleto variável de cadeia leve ou pesada de um anticorpo humano maduro, uma sequência ger-

minativa humana, uma sequência de consenso humana, ou um anticorpo humano aqui descrito, (b) um esqueleto variável da cadeia pesada, que inclui entre 20% a 80%, 40% a 60%, 60% a 90%, ou 70% a 95% dos resíduos de aminoácidos de um esqueleto variável da cadeia leve ou pesada, por exemplo, um resíduo de esqueleto com cadeia leve ou pesada de um anticorpo humano maduro, uma sequência germinativa humana, uma sequência de consenso humana; (c) um esqueleto não-humano (por exemplo, um esqueleto de roedor); ou (d) um esqueleto não-humano que foi modificado, por exemplo, para remover determinantes antigênicos ou citotóxicos, por exemplo, desimunizado, ou parcialmente humanizado. Em uma modalidade, a sequência do domínio variável da cadeia pesada inclui resíduos humanos ou resíduos de sequências de consenso humanas em uma ou mais das seguintes posições (de preferência, pelo menos cinco, dez, doze, ou todas): (na FR do domínio variável da cadeia leve) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, e/ou (na FR do domínio variável da cadeia pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, e/ou 103H (de acordo com a numeração Kabat).

Em uma modalidade, a proteína inclui pelo menos uma CDR não-humana, por exemplo, uma CDR murina, por exemplo, uma CDR de P2D10, ou uma mutante dela, e pelo meos um esqueleto que difere de um esqueleto de P2D10 em pelo menos um aminoácido, por exemplo, pelo menos 5, 8, 10, 12, 15, ou 18 aminoácidos. Por exemplo, as proteínas incluem uma, duas, três, quatro, cinco ou seis dessas CDR's não-humanas e inclui peio menos um diferença de aminoácido em pelo menos três entre HC FR1, HC FR2, HC FR3, LC FR1, LC FR2, e LC FR3.

Em uma modalidade, a sequência do domínio variável da cadeia pesada ou leve da proteína inclui uma sequência de aminoácidos, que é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou mais, idêntica a uma sequência do domínio variável de um anticorpo aqui descrito, por exemplo, P2D10, huP2D10-1, ou huP2D10-2; ou que difere em pelo menos 1 ou 5 resíduos, porém menos do que 40, 30, 20, ou 10 resíduos, de uma sequên30

cia do domínio variável de um anticorpo aqui descrito, por exemplo, P2ÜftÉ),'’^r huP2D10-1, ou huP2D10-2.

Em uma modalidade, um ou dois dos domínios variáveis incluem posições de aminoácidos na região do esqueleto, que são derivadas varia5 damente de um anticorpo murino (por exemplo, P2D10) e de um anticorpo humanizado (por exemplo, 56-84m e K107) ou sequência germinativa. Por exemplo, o domínio variável deve incluir inúmeras posições nas quais o aminoácido é idêntico ao anticorpo murino e também ao anticorpo humano (ou sequência germinativa) porque os dois são idênticos nessa posição. Dentre as posições remanescentes do esqueleto, nas quais o murino e o humano diferem, pelo menos 50, 60, 70, 80, ou 90% das posições do domínio variável são de preferência idênticas ao anticorpo humano (ou sequência germinativa) ao invés do murino. Nenhuma, ou pelo menos uma, duas, três ou quatro dessas posições remanescentes do esqueleto podem ser idênticas ao anticorpo murino ao invés do anticorpo humano. Por exemplo, em HC FR1, uma ou duas dessas posições podem ser murinas; em HC FR2, uma ou duas dessas posições podem ser murinas; em FR3, uma, duas, três ou quatro dessas posições podem ser murinas; em LC FR1, uma, duas três ou quatro dessas posições podem ser murinas; em LC FR2, uma ou duas dessas po20 sições podem ser murinas; em LC FR3, uma ou duas dessas posições podem ser murinas.

Em uma modalidade, a sequência do domínio variável da cadeia pesada ou leve da proteína inclui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência de ácidos nucléicos aqui descrita ou um ácido nucléico que hibridiza para uma sequência de ácidos nucléicos aqui descrita (por exemplo, uma sequência de ácidos nuléicos específica ou uma sequência de ácidos nucléicos que codifica uma sequência de aminoácidos aqui descrita) ou seu complemento, por exemplo, sob condições de baixa severidade, média severidade, alta severidade ou severidade muito alta.

O anticorpo anti-TWEAK pode ser transformado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo, proteína, ou composto.

Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado funcionalmente (por exemplo, por

Λ* acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente, ou de σϊιtra forma) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecífico ou multiespecífico), toxinas, radioisótopos, polímeros, agentes citotóxicos ou citostáticos, dentre outros.

Em outro aspecto, a invenção fornece composições, por exemplo, composições farmacêuticas, que incluem um veículo farmaceuticamente aceitável e um anticorpo anti-TWEAK, por exemplo, um anticorpo anti-Tweak aqui descrito.

Em ainda outra modalidade, o anticorpo anti-TWEAK (por exemplo, uma sua composição farmacêutica) é administrado a um indivíduo que necessita de terapia com anticorpo anti-TWEAK ou cuja condição seria melhorada pelo anticorpo. Por exemplo, o anticorpo anti-TWEAK pode ser administrado a um indivíduo que tem ou está em risco de adquirir um distúrbio inflamatório, distúrbio imunológico, distúrbio auto-imune, distúrbio neuronal, um distúrbio neoplástico, ou outro distúrbio aqui descrito. Em uma modalidade, um anticorpo anti-TWEAK aqui descrito é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio inflamatório, distúrbio imunológico, distúrbio auto-imune, distúrbio neuronal, um distúrbio neoplástico, ou outro distúrbio aqui descrito.

Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para tratar um distúrbio associado a TWEAK, em um indivíduo. O método inclui: administrar ao indivíduo um anticorpo anti-TWEAK, em uma quantidade suficiente para tratar (por exemplo, melhorar ou prevenir) o distúrbio associado a TWEAK. O anticorpo anti-TWEAK pode ser administrado ao indivíduo, isoladamente ou em combinação com outras modalidades terapêuticas como aqui descritas. Em uma modalidade, o indivíduo é um mamífero, por exemplo, um ser humano, por exemplo, um ser humano que tem um distúrbio associado a TWEAK, por exemplo, um distúrbio aqui descrito. O anticorpo pode ser usado para melhorar um ou mais sintomas desses distúrbios. O termo tratar refere-se a administrar uma terapia em uma quantidade, maneira e/ou modo eficaz para melhorar ou prevenir uma condição, sintoma, ou pa30

% rametro associado a um distúrbio (por exemplo, um distúrbio aqui descrito) ou para prevenir o início, a progressão ou a exacerbação do distúrbio até um grau estatisticamente significante ou até um grau detectável para os versados nessas técnicas. Consequentemente, o tratamento pode proporcionar benefícios terapêuticos e/ou profiláticos. Uma quantidade eficaz, uma maneira eficaz ou um modo eficaz pode variar dependendo do indivíduo e pode ser individualizado. Em uma modalidade, um anticorpo anti-TWEAK aqui descrito é usado para a preparação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio associado a TWEAK.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para modular a interação entre TWEAK e uma proteína receptora de TWEAK. Por exemplo, um anticorpo anti-TWEAK pode ser usado para reduzir ou inibir a ligação between TWEAK e um receptor de TWEAK, tal como Fn14. O método compreende colocar TWEAK ou um complexo que contém TWEAK em contato com o anticorpo. O método pode ser usado em células in vitro, por exemplo, em cultura, por exemplo in vitro ou ex vivo. Por exemplo, as células que expressam o receptor de TWEAK podem ser cultivadas in vitro em meio de cultura, e a etapa de colocação em contato pode ser efetuada adicionando um anticorpo anti-TWEAK ao meio de cultura. Alternativa mente, o método pode ser realizado em células presentes em um indivíduo, por exemplo, como parte de um protocolo in vivo (por exemplo, terapêutico ou profilático). Por exemplo, o anticorpo anti-TWEAK pode ser distribuído localmente ou por via sistêmica. Em uma modalidade, um anticorpo anti-TWEAK aqui descrito é usado para a preparação de um medicamento para modular a interação entre TWEAK e uma proteína receptora de TWEAK.

O método pode incluir colocar TWEAK em contato com o complexo receptor de TWEAK, ou uma subunidade dele, sob condições que permitem que uma interação entre TWEAK e o complex receptor de TWEAK, ou subunidade dele, ocorra, para desta forma formar uma mistura de TWEAK/receptor de TWEAK, Geralmente, o anticorpo anti-TWEAK é fornecido em uma quantidade eficaz, por exemplo, de tal modo que o contato da mistura de TWEAK/receptor de TWEAK com o anticorpo anti-TWEAK module,

por exemplo, interfira com (por exemplo, inhiba, bloqueie ou reduz^cf^bnt forma) a tnteraçao entre TWEAK e a proteína receptora ou pelo menbfc^er^^ fira com uma função de TWEAK, por exemplo, a sinalização mediada por TWEAK.

A invenção fornece também ácidos nucléicos que compreendem sequências de nucleotídeos, que codificam regiões variáveis de cadeia pesada e leve dos anticorpos anti-TWEAK, por exemplo, como aqui descritos. Por exemplo, a invenção fornece uma primeira e uma segunda regiões variáveis com cadeia pesada e leve que codificam ácidos nucléicos, respectivamente, de P2D10. Em outro aspecto, a invenção fornece células hospedeiras e vetores que contêm os ácidos nucléicos aqui descritos,

A invenção fornece também o epitopo de TWEAK, por exemplo, TWEAK humano, reconhecido por P2D10, e proteínas capazes de interagir com o epitopo. Por exemplo, as proteínas e peptídeos que incluem o epitopo podem ser usados para gerar ou triar outros compostos ligantes que interagem com o epitopo, por exemplo, proteínas tais como anticorpos ou moléculas pequenas. Por exemplo, um peptídeo que inclui o epitopo pode ser usado como um imunógeno ou como um alvo para triar uma biblioteca de expressão. É também possível avaliar compostos quanto à sua capacidade de interagir com o peptídeo, ou, por mapeamento ou determinação da estrutura, avaliar compostos quanto à sua capacidade de interagir com o epitopo, por exemplo, no contexto de um TWEAK maduro. Uma avaliação exemplificativa inclui determinar se o composto consegue interagir com TWEAK na presença de um anticorpo P2D10 competitivo.

Os métodos para distribuir ou visar um agente, por exemplo, um agente terapêutico (incluindo um agente genético) ou um agente citotóxico, com um anticorpo anti-TWEAK (por exemplo, P2D10 ou outro anticorpo aqui descrito) para uma célula ou estrutura que expressa TWEAK in vivo, também são descritos.

Como aqui utilizado, o termo anticorpo refere-se a uma proteína que inclui pelo menos uma região variável de imunoglobulina, por exemplo, uma sequência de aminoácidos que fornece um domínio variável de i30 z'“‘\

munoglobulina ou uma sequência do domínio variável de imunoglobulina. Por exemplo, um anticorpo pode incluir uma região variável da cadeia pesada (H) (aqui abreviada como VH), e uma região variável da cadeia leve (L) (aqui abreviada como VL). Em outro exemplo, um anticorpo inclui duas regi5 ões variáveis com cadeia pesada (H) e duas regiões variáveis com cadeia leve (L). O termo anticorpo engloba fragmentos ligantes de antígenos de anticorpos (por exemplo, anticorpos com cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')₂, fragmentos Fd, fragmentos Fv, e fragmentos dAb), bem como anticorpos de comprimento inteiro, por exemplo, imunoglobuinas de 10 comprimento inteiro dos tipos IgA, IgG (por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4), IgE, IgD, IgM (bem como seus subtipos). O termo anticorpo de comprimento inteiro refere-se a um anticorpo que tem pelo menos 96% do comprimento de um anticorpo natural que é processado para remover quaisquer sequências de sinais. Um anticorpo de comprimento inteiro pode incluir o 15 comprimento completo do anticorpo natural, por exemplo, resíduos a partir do resíduo do terminal amino de um anticorpo natural (por exemplo, a lgG1, lgG2, lgG3, lgG4) até seu resíduo do terminal carboxila.

Uma sequência do domínio variável de imunoglobulina referese a uma sequência de aminoácidos que pode formar a estrutura de um do20 mínio variável de imunoglobulina. Por exemplo, a sequência pode incluir a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de um domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a sequência pode ou não incluir um, dois ou mais aminoácidos do terminal N ou C, ou pode incluir outras alterações que são compatíveis com a formação da estrutura da proteína.

Uma composição isolada refere-se a uma composição da qual se removeu pelo menos 90% de pelo menos um componente de uma amostra natural a partir da qual a composição isolada pode ser obtida. As composições produzidas artificialmente ou naturalmente podem ser composições com pelo menos um certo grau de pureza se a espécie ou população da espécie de interesse é pelo menos 5, 10, 25, 50, 75, 80, 90, 95, 98, ou 99% pura em base ponderai.

Um epitopo refere-se ao sítio em um com posto-a I vo que está

ligado por um anticorpo, No caso em que o composto-alvo é uma por exempío, um epitopo pode se referir aos aminoácidos (particularmente cadeias laterais de aminoácidos) que são ligados pelo anticorpo. Epitopos sobrepostos incluem pelo menos um resíduo de aminoácido comum , por exemplo, em pelo menos 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos comuns.

Como aqui utilizado, o termo hibridiza sob condições de baixa severidade, média severidade, aita severidade, ou severidade muito alta descreve as condições para hibridização e lavagem. As orientações para realizar reações de hibridização podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Nesta publicação referida estão descritos métodos aquosos e não-aauosos e qualquer um deles pode ser usado. As condições específicas de hibridização aqui referidas são as seguintes: (1) condições de hibridização de baixa severidade em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, e em seguida, duas lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a pelo menos 50°C (a temperatura das lavagens pode ser aumentada para 55°C para condições de baixa severidade); (2) condições de hibridização de severidade média em 6X SSC a cerca de 45°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 60°C; (3) condições de hibridização de alta severidade em 6X SSC a cerca de 45°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65°C; e de preferência, (4) condições de hibridização de severidade muito alta são fosfato de sódio 0,5 M, 7% de SDS a 65°C, e em seguida, uma ou mais lavagens em 0.2X SSC, 1% de SDS a 65°C. As condições de alta severidade (3) são as condições preferidas e as que devem ser usadas, a menos que diferentemente especificado.

Um distúrbio associado a TWEAK é qualquer distúrbio no qual TWEAK contribui para a etiologia ou um distúrbio cuja condição, sintomas, ou risco de início são alterados pelo fornecimento de um agente bloqueador de TWEAK.

A menos que diferentemente definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que aquele entendido comumente pelos versados nessas técnicas às quais esta invenção perten-

ce. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou nos testes aqui descritos, os métodos e materiais apropriados estão descritos abaixo. Além disso, as modalidades da invenção descritas com relação a CDRs Chothia podem ser implementadas também usando CDRs Kabat.

Todas publicações, pedidos de patente, patentes, e outras referências aqui mencionadas são incorporadas como referência em sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos, e exemplos são ilustrativos e não pretendem ser limitativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

P2D10 é um anticorpo murino exemplificativo que se liga especificamente a TWEAK humano e inibe a função de TWEAK. Variantes do anticorpo P2D10 também estão descritas, incluindo variantes humanizadas exemplificativas. Estes anticorpos, outros anticorpos anti-TWEAK, e outros agentes bloqueadores de TWEAK podem ser usados para tratar ou prevenir distúrbios mediados por TWEAK, por exemplo, distúrbios inflamatórios e outros distúrbios aqui descritos.

Anticorpos Anti-TWEAK

Esta invenção inclui as sequências de exemplos específicos de anticorpos anti-TWEAK, tais como P2D10, huP2D10-1, e huP2D10-2. Os anticorpos específicos, tais com estes, podem ser fabricados, por exemplo, preparando e expressando genes sintéticos que codificam as sequências de aminoácidos enunciadas ou mutando genes germinativos humanos, para produzir um gene que codifica as sequências de aminoácidos enunciadas. Além disso, estes anticorpos e outros anticorpos anti-TWEAK podem ser produzidos, por exemplo, usando um ou mais dos métodos que se seguem.

Inúmeros métodos estão disponíveis para obter anticorpos, particularmente anticorpos humanos. Um método exemplificativo inclui triar bibliotecas de expressão de proteínas, por exemplo, bibliotecas de apresentação em fagos ou ribossomas. A apresentação de fagos está descrita, por exemplo, na patente n⁹ US 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317;

documentos n²¹ WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/1567 WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; e WO 90/02809. A apresentação de Fab's em fagos está descrita, por exemplo, nas patentes n~ US 5.658.727; 5.667.988; e 5.885.793.

Além do uso de bibliotecas de apresentação, outros métodos podem ser usados para obter um anticorpo ligante de TWEAK. Por exemplo, a proteína TWEAK ou um peptídeo dela pode ser usada como um antígeno em um animal não-humano, por exemplo, um roedor, por exemplo, um camundongo, hamster, ou rato.

Em uma modalidade, o animal não-humano inclui pelo menos uma parte de um gene de imunoglobulina humano. Por exemplo, é possível manipular cepas de camundongo deficientes na produção de anticorpos murinos com fragmentos grandes dos loci de ig humanos. Usando a tecnologia de hibridomas, podem ser produzidos e selecionados anticorpos monoclonais esecíficos de antígenos, derivados dos genes com a especificidade desejada. Vide, por exemplo, XENOMOUSE®, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; US 2003-0070185, WO 96/34096, e WO 96/33735.

Em outra modalidade, um anticorpo monoclonal é obtido a partir do animal não-humano, e depois modificado, por exemplo, humanizado ou desimunizado. Winter descreve um método exemplificativo para enxertar CDRs, que pode ser usado para preparar os anticorpos humanizados aqui descritos (patente n^s US 5.225.539). A totalidade ou parte das CDRs de um anticorpo humano específico pode ser substituída por pelo menos uma parte de um anticorpo não-humano. Pode ser necessário apenas substituir as CDRs necessárias para a ligação ou determinantes da ligação dessas CDRs, para chegar a um anticorpo humanizado útil que se liga a TWEAK.

Os anticorpos humanizados podem ser gerados substituindo sequências da região variável Fv, que não estão envolvidas diretamente na ligação de antígenos por sequências equivalentes de regiões variáveis Fv humanas. Os métodos genéricos para gerar anticorpos humanizados são fornecidos por Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; por Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; e por US 5.585.089; US 5.693.761; US

5.693.762; US 5.859.205; e US 6.407.213. Estes métodos incluem isolar, manipular, e expressar as sequências de ácidos nucléicos que codificam a totalidade ou parte das regiões variáveis Fv de imunoglobulina a partir de pelo menos uma cadeia pesada ou leve. As fontes desse ácido nucléico são bem-conhecidas pelos versados nessas técnicas e, por exemplo, podem ser obtidas a partir de hibridoma que produz um anticorpo contra um alvo predeterminado, como descrito acima, a partir de genes de imunoglobulina germinativos, ou a partir de construções sintéticas. O DNA recombinante que codifica o anticorpo humanizado pode ser então clonado em um vetor de expressão apropriado.

As sequências germinativas humanas estão descritas, por exemplo, em Tomlinson, I.A. et aí (1992) J. Mol. Bioí 227.776-788} Cook, G. P. et aí (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et aí (1992) J. Moí Βίο. 227:799-817; e Tomlinson et aí (1995) EMBO J 14:4628-4638. O guia V BASE fornece orientações abrangentes sobre sequências da região variável de imunoglobulina humana (compiladas por Tomlinson, I.A. et ai MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, Reino Unido). Estas sequências podem ser usadas como uma fonte de sequência humana, por exemplo, para regiões do esqueleto e CDRs. As regiões humanas de consenso do esqueleto podem ser usadas também, por exemplo, como descrito na patente n^s US 6.300.064.

Um anticorpo ligante de TWEAK não-humano pode ser também modificado por deleção específica de epitopos de células T humanas ou desimunização pelos métodos descritos em WO 98/52976 e WO 00/34317. Resumidamente, podem ser analisadas as regiões variáveis com cadeia pesada e leve de um anticorpo, que se ligam a MHC Classe ll; estes peptídeos representam epitopos de células T potenciais (como definido em WO 98/52976 e WO 00/34317). Para a detecção de epitopos de células T potenciais, uma abordagem de modelagem computadorizada denominada filamentação de peptídeos pode ser aplicada, e além disso, uma base de dados de peptídeos MHC ligantes humanos pode ser buscada para achar modelos presentes nas sequências V_H e V_L, como descrito em WO 98/52976 e

WO 00/34317. Estes modelos se ligam a qualquer um dos 18 alotipos pr pais de MHC classe ii DR, e assim sendo, constituem epitopos de céluias T potenciais. Os epitopos de células T potenciais detectados podem ser eliminados substituindo pequenos números de resíduos de aminoácidos nas re5 giões variáveis, ou de preferência, por substituiões de um único aminoácido. Tanto quanto possível, são feitas substituições conservativas. Frequentemente, porém não exclusivamente, um aminoácido comum a uma posição em sequências germinativas do anticorpo humano pode ser usado. Depois que as mudanças desimunizadoras são identificadas, os ácidos nucléicos 10 que codificam Vh e V_L podem ser construídos por mutagênese ou outros métodos sintéticos (por exemplo, síntese de novo, substituição de fita, e assim por diante). Uma sequência variável mutagenizada pode ser, opcionalmente, fundida a uma região constante humana, por exemplo, as regiões constantes de lgG1 ou kapa humanas.

Em alguns casos, um epitopo de células T potencial deve incluir resíduos bem-conhecidos ou previstos como sendo importantes para a função do anticorpo. Por exemplo, os epitopos de células T potenciais são usualmente desviados na direção das CDRs. Além disso, os epitopos de células T potenciais podem ocorrer em resíduos do esqueleto importantes para a estrutura e ligação do anticorpo. As mudanças para eliminar estes epitopos potenciais, em alguns casos, exigirão mais apuramento, por exemplo, produzindo e testando cadeias com e sem a mudança. Guando possível, os epitopos de células T potenciais que se sobrepõem às CDRs podem ser eliminados por substituições fora das CDRs. Em alguns casos, uma alteração dentro de uma CDR é a única opção, e assim sendo, as variantes com e sem esta substituição podem ser testadas. Em outros casos, a substituição necessária pare remover um epitopo de células T potencial é em uma posição do resíduo dentro do esqueleto, que poderia ser crítica para a ligação do anticorpo. Nestes casos, as variantes com e sem esta substituição são tes30 tadas. Assim sendo, em alguns casos, várias regiões variáveis com cadeia pesada e leve da variante desimunizada são desenhadas e várias combinações de cadeia peseda/leve são testadas para identificar o anticorpo desi-

munizado ideal. A escolha do anticorpo desimunizado final pode ser então*^!5 feita considerando a afinidade de ligação das diferentes variantes em conjunto com a extensão da desimunização, particularmente o número de epitopos de células T potenciais remanescentes na região variávef. A desimunização pode ser usada para modificar qualquer anticorpo, por exempio, um anticorpo que inclui uma sequência não-humana, por exemplo, um anticorpo sintético, um anticorpo murino que não um anticorpo monoclonal nãohumano, ou um anticorpo isolado a partir de uma biblioeca de apresentação.

Outros métodos para humanizar anticorpos também podem ser usados. Por exemplo, outros métodos podem ser responsáveis pela estrutura tridimensional do anticorpo, posições no esqueleto que estão na proximidade tridimensional de determinantes de ligação, e sequências peptídicas imunogênicas. Vide, por exemplo, WO 90/07861; patentes n— US 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; e 6.407.213; Tempest et al. (1991) Biotechnology 9:266-271. Ainda outro método é denominado engenharia de humanização e está descrito, por exemplo, em US 2005-008625.

O anticorpo pode incluir uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc do tipo selvagem ou uma região Fc que inclui uma ou mais alterações. Em uma modalidade, a região constante é alterada, por exemplo, mutada, para modificar as propriedades do anticorpo (por exemplo, para aumentar ou diminuir uma ou mais entre: ligação do receptor de Fc, glicosilação do anticorpo, o número de resíduos de cisteína, função de células efetoras, ou função de complementos). Por exemplo, a região constante humana de IgG 1 pode ser mutada em um ou mais resíduos, por exemplo, um ou mais dos resíduos 234 e 237. Os anticorpos podem ter mutações na região CH2 da cadeia pesada que reduzem ou alteram a função efetora, por exemplo, a ligação do receptor de Fc e a ativação de complementos. Por exemplo, os anticorpos podem ter mutações tais como aquelas descritas nas patentes n- US 5.624.821 e 5.648.260. Os anticorpos podem ter também mutações que estabilizam a ligação dissulfeto entre as duas cadeias pesadas de uma imunoglobulina, tais como mutações na região de articulação de )gG4, como decrito nessas técnicas (por exemplo, Angal et al. (1993) Mol.

Immunol, 30:105-08). Vide também, por exemplo, US 2005-0037000. Maturação da Afinidade

Em uma modalidade, um anticorpo anti-TWEAK é modificado, por exemplo, por mutagênese, para fornecer uma coleção de anticorpos modificados. Os anticorpos modificados são então avaliados para identificar um ou mais anticorpos que têm propriedades funcionais alteradas (por exemplo, melhor ligação, melhor estabilidade, antigenicidade reduzida, ou maior estabilidade in vivo). Em uma implementação, usa-se a tecnologia de biblioteca de apresentação para selecionar ou triar a coleção de anticorpos modificados. Anticorpos com afinidade mais alta são então identificados a partir da segunda biblioteca, por exemplo, usando severidade mais alta ou condições de ligação e lavagem mais competitivas. Outras técnicas de triagem também podem ser usadas.

Em algumas implementações, a mutagênese é visada para regiões conhecidas ou que possivelmente estão na interface da ligação. Caso, por exemplo, as proteínas ligantes identificadas sejam anticorpos, então a mutagênese pode ser direcionada para as regiões CDR das cadeias pesadas ou leves, como aqui descrito. Além disso, a mutagênese pode ser direcionada para regiões do esqueleto perto ou adjacentes às CDRs, por exemplo, regiões do esqueleto, particularmente dentro de 10, 5, ou 3 aminoácidos de uma junção de CDRs. No caso de anticorpos, a mutagênese pode ser também limitada a uma ou algumas das CDRs, por exemplo, para efetuar melhoras escalonadas.

Em uma modalidade, a mutagênese é usada para tomar um anticorpo mais similar a uma ou mais sequências germinativas. Um método germinativo exemplificativo pode incluir: identificar uma ou mais sequências germinativas que são similares (por exemplo, mais similares em uma base de dados específica) à sequência do anticorpo isolado. Depois, as mutações (no nível de aminoácidos) podem ser feitas no anticorpo isolado, seja incrementalmente, em combinação, ou ambos. Por exemplo, produz-se uma biblioteca de ácidos nucléicos que inclui sequências que codificam algumas ou todas mutações germinativas possíveis. Os anticorpos mutados são então

avaliados, por exemplo, para identificar um anticorpo que tem um ou mais resíduos germnativos adicionais em relação ao anticorpo isolado e que ainda é útil (por exemplo, tem uma atividade funcional). Em uma modalidade, são introduzidos resíduos germinativos em um anticorpo isolado em número tão grande quanto possível.

Em uma modalidade, a mutagênese é usada para substituir ou inserir um ou mais resíduos germinativos em uma região CDR. Por exemplo, o resíduo de CDR germinativo pode ser de uma sequência germinativa que é similar (por exemplo, mais similar) à região variável que está sendo modificada. Depois da mutagênese, a atividade (por exemplo, a atividade de ligação ou outra atividade funcional) do anticorpo pode ser avaliada para determinar se o resíduo ou resíduos germinativos são tolerados. Uma mutagênese similar pode ser realizada nas regiões do esqueleto.

A seleção de uma sequência germinativa pode ser realizada de diferentes maneiras. Por exemplo, uma sequência germinativa pode ser selecionada se ela atende a critérios predeterminados quanto à seletividade ou similaridade, por exemplo, em pelo menos uma certa identidade percentual, por exemplo, pelo menos 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 99,5% e identidade em relação ao anticorpo não-humano doador. A seleção pode ser realizada usando pelo menos 2, 3, 5, ou 10 sequências germinativas. No caso de CDR1 e CDR2, identificar uma sequência germinativa pode incluir selecionar essa sequência. No caso de CDR3, identificar uma sequência germinativa similar pode incluir selecionar essa sequência, mas pode incluir usar duas sequências germinativas que separadamente contribuem para a parte do terminal amino e da parte do terminal carboxila. Em outras implementações, são usadas mais do que uma ou duas sequências germinativas, por exemplo, para formar uma sequência de consenso.

Em outras modalidades, o anticorpo pode ser modificado para ter um padrão de glicosilação alterado (isto é, alterado em relação ao padrão de glicosilação original ou nativo). Como utilizado neste contexto, o termo alterado” significa ter um ou mais grupamentos carboidrato deletados, e/ou ter um ou mais sítios de glicosilação adicionados ao anticorpo original. A a30

dição de sítios de glicosiiaçâo aos anticorpos presentemente descritos pode ser realizada alterando a sequência de aminoácidos para conter sequências de consenso com sítios de glicosiiaçâo; tais técnicas são bem-conhecidas nessa técnica. Outro meio para aumentar o número de grupamentos carboidrato em anticorpos é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos aos resíduos de aminoácidos do anticorpo. Estes métodos estão descritos, por exemplo, em WO 87/05330; e Aplin e Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem. 22:259-306. A remoção de quaisquer grupamentos carboidrato presentes nos anticorpos pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente, como descrito nessas técnicas (Hakimuddin et ai. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52; Edge et ai. (1981) Anal. Biochem. 118:131; e Thotakura et ai. (1987) Meth. Enzymol. 138:350). Vide, por exemplo, patente n^Q US 5.869.046 para obter uma modificação que aumenta a meia-vida in vivo disponibilizando um epitopo ligante de receptor de recuperação.

Em uma modalidade, um anticorpo tem sequências de CDR que diferem apenas insubstancialmente daquelas de P2D10. As diferenças insubstanciais incluem pequenas mudanças de aminoácidos, tais como substituições de 1 ou 2 dentre qualquer um entre tipicamente 5-7 aminoácidos na sequência de uma CDR, por exemplo, uma CDR Chothia ou Kabat. Tipicamente, um aminoácido é substituído por um aminoácido afim que tem características de carga, hidrofóbicas ou estereoquímicas similares. Tais substituições seriam do conhecimento dos versados nessas técnicas. Diferentemente das CDRs, mudanças mais substanciais em regiões do esqueleto da estrutura (FRs) podem ser feitas sem afetar adversamente as propriedades de ligação de um anticorpo. As mudanças em FRs incluem, porém sem imitações, humanizar um esqueleto estrutural derivado de não-humano ou manipular certos resíduos do esqueleto que são importantes para contato com antígenos ou para estabilizar o sítio de ligação, por exemplo, mudando a classe ou subclasse da região constante, mudar resíduos de aminoácidos específicos que poderíam alterar uma função efetora, tal como a ligação do receptor de Fc (Lund et ai. (1991) J. lmmun. 147:2657-62; Morgan et al. (1995) Immunology 86:319-24), ou mudar a espécie da qual a região cons-

tante é derivada.

Os anticorpos anti-TWEAK podem estar na forma de anticorpos de comprimento inteiro, ou na forma de fragmentos de anticorpos, por exemplo, os fragmentos Fab, F(ab')₂, Fd, dAb, e scFv. As formas adicionais incluem uma proteína que inclui um único domínio variável, por exemplo, um domínio de camelo ou camelizado. Vide, por exemplo, US 2005-0079574 e Davies et al. (1996) Protein Eng. 9(6):531-7.

Produção de Anticorpos

Alguns anticorpos, por exemplo, Fab's, podem ser produzidos 10 em células baterianas, por exemplo, células de E. coli. Os anticorpos podem ser produzidos também em células eucarióticas. Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, scFv’s) são expressados em célula de levedura, tal como Pichia (vide, por exemplo, Powers et ai. (2001) J Immunol Methods.

251:123-35), Hanseula, or Saccharomyces.

Uma modalidade preferida, anticorpos são produzidos em células de mamíferos. As células hospedeiras de mamíferos exemplificativas para expressar um anticorpo incluem células do ovário do hamster chinês (células CHO) (incluindo células CHO dhfr~, descritas em Urlaub e Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador

DHFR selecionável por exemplo, como descrito em Kaufman e Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), linhagens de células linfocíticas, por exemplo, céulas de mieloma NSO e células SP2, células COS, e uma célula de um animal transgênico, por exemplo, um mamífero transgênico. Por exemplo, a célula é uma célula epitelial de mamífero.

Além da sequência de ácidos nucléicos que codifica o domínio de imunoglobulina diversificado, os vetores de expressão recombinante podem portar sequências adicionais, tais como sequências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável faci30 lita a seleção de células hospedeiras dentro das quais o vetor foi introduzido * (vide, por exemplo, patentes n— US 4.399,216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, tipicamente, o gene marcador selecionável confere resistência a

fármacos, tais como G418. higromicina, ou metotrexato, em uma célula hospedeira dentro da quaí o vetor foi introduzido.

Em um sistema exemplificativo para a expressão de anticorpos, um vetor de expressão recombinante que codifica a cadeia pesada do anti5 corpo e também a cadeia leve do anticorpo é introduzido dentro de células CHO dhfr por transfecção mediada com fosfato. Dentro do vetor de expressão recombinante, os genes das cadeias pesadas e leves do anticorpo estão, cada uma, ligadas operacionalmente a elementos reguladores intensificadores/promotores (por exemplo, derivados de SV40, CMV, adenovírus e similares, tal como o elemento regulador intensificador de CMV/promoter de AdMLP ou um elemento intensificador de SV40/promoter de AdMLP) para acionar altos níveis de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante porta também um gene de DHFR, que permite a seleção de células CHO que foram transfectadas com o vetor usando seleção/ampliação com metotrexato. As células hospedeiras transformantes selecionadas são cultivadas para permitir a expressão das cadeias pesada e leve do anticorpo, e o anticorpo é recuperado do meio de cultura. Técnicas de biologia molecular usuais são usadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfectar as células hospedeiras, selecionar os transformantes, cultivar as célu20 Ias e recuperar o anticorpo do meio de cultura. Por exemplo, alguns anticorpos podem ser isolados por cromatografia de afinidade com uma matriz acoplada à Proteína A ou Proteína G.

Para anticorpos que incluem um domínio Fc, o sistema de produção de anticorpos, de preferência, sintetiza anticorpos nos quais a região

Fc é glicosilada. Por exemplo, o domínio Fc de moléculas de IgG é glicosilado na asparagina 297 no domínio CH2. Estas asparagina é o sítio para modificação com oligossacarídeos do tipo biantenário (biantennary). Demonstrou-se que esta glicosilação é necessária para funções efetoras mediadas por receptores Fcy e complementam C1q (Burton e Woof (1992) Adv. Immu30 nol. 51:1-84; Jefferis et aí (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). Em uma modaφ lidade, o domínio Fc é produzido em um sistema de expressão mamífero que glicosila adequadamente o resíduo correspondente à asparagina 297. O

κ.

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domínio Fc ou outra região do anticorpo pode incluir também outras modificações eucarióticas pós-translacionais.

Os anticorpos podem ser produzidos também por um animal transgênico. Por exemplo, a patente U.S. n^s 5.849.992 descreve um método para expressar um anticorpo na glândula mamária de um mamífero transgênico. É construído um transgene que inclui um promoter específico do leite e ácidos nucléicos que codificam o anticorpo de interesse e uma sequência de sinais para secreção. O leite produzido pelas fêmeas de tais mamíferos transgênícos inclui, secretado dentro dele, o anticorpo de interesse. O anti10 corpo pode ser purificado a partir do leite, ou, para algumas aplicações, usado diretamente.

Caracterização

As propriedades ligantes de um anticorpo podem ser medidas por qualquer método-padrão, por exemplo, um dos seguintes métodos: aná15 lise BIACORE®, Ensaio Imunoabsorvente Ligado a Enzima (ELISA), Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência (FRET), cristalografia de raios X, análise de sequências e mutagênese de varredura. A capacidade de uma proteína inibir uma ou mais atividades de TWEAK pode ser avaliada in vitro ou em um modelo animal de um distúrbio, por exemplo, um distúrbio aqui descrito. De preferência, o anticorpo tem um efeito estatisticamente significante que indica que o anticorpo inibe uma ou mais atividades de TWEAK.

Em uma modalidade, um anticorpo é avaliado quanto à inibição da capacidade de TWEAK estimular a produção de IL-8, MMP-1, PGE2, IL-6,

IP-10 e RANTES em fibroblastos dérmicos. Vide Chicheportiche et ai. (2002)

Arthritis Res. 4(2):126-133 para obter as condições apropriados do ensaio.

Em outra modalidade, um anticorpo é avaliado quanto à sua capacidade de inibir TWEAK em estimular a proliferação de uma célula endotelial. Vide, por exemplo, US 2003-0211993 que descreve um ensaio de proli30 feração (bem como outros ensaios úteis) do seguinte modo: HVEC são plaqueadas em placas de microtitulação de 96 cavidades em subconfluência (4.000 células por cavidades) e cultivadas de um dia para o outro em Meio

CS-C sem adição de suplementos de crescimento. O meio é substituído por meio completo ou por meio basal. As células são cultivas em meio basal com ou sem TWEAK (100 ng/mL), bFGF usando uma diluição 1/500 até 1/1.000 de suplemento de crescimento bFGF (Clonetics) ou 1 ng/mL (R&D Systems), VEGF (10 ng/mL) ou combinações destes fatores. Quando indicado, 10 pg/mL do anticorpo que está sendo testado ou um anticorpo de controle também é adicionado. As células são incubadas a 37°C com 5% de CO2 por três dias e a proliferação foi medida por pulsação com ³H-Timidina durante as últimas 10 horas da cultura. A radioatividade ligada às células pode ser medida com um BETAPLATE® (EG&G Wallac, Gaithersburg, MD, EUA). Uma diminuição na proliferação mediada por TWEAK ou a combinação de TWEAK e bFGF pode indicar que 0 anticorpo é eficaz para bloquear a atividade de TWEAK.

Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR)

A interação da ligação de uma proteína de interesse e um alvo (por exemplo, TWEAK) pode ser analisada usando SPR. SPR ou Análise de Interação Biomolecular (BIA) detecta interações bioespecíficas em tempo real, sem marcar qualquer um dos interagentes. As mudanças na massa na superfície de ligação (indicativas de um evento de ligação) do chip da BIA em alterações do índice de refração da luz perto da superfície (o fenômeno óptico de ressonância plasmônica de superfície (SPR)). As mudanças na refratividade geram um sinal detectável, que é medido como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas. Os métodos para usar SPR estão descritos, por exemplo, na patente US n² 5.641.640; Raether (1988), Surface Plasmons, Springer Verlag; Sjolander e Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 e recursos on-line fornecidos por BIAcore International AB (Uppsala, Suécia). As informações da SPR podem ser usadas para fornecer uma medida precisa e quantitativa da constante de dissociação no equilíbrio (K<j), e parâmetros cinéticos que incluem Ko_n e Kofr, para a ligação de uma biomolécula a um alvo.

Os epitopos podem também ser mapeados diretamente avalian-

do a capacidade de diferentes anticorpos competirem entre si pela ligação a TWEAK (por exemplo, TWEAK humano, particularmente TWEAK humano solúvel), usando técnicas cromatográficas BIAcore (Pharmacia BIAtechnology Handbook, Epttope Mapping”, Seção 6.3.2, (maio de 1994); vide também Johne et aL (1993) J. Immunol. Methods, 160:191-198). Orientações gerais adicionais para avaliar anticorpos, por exemplo, em Western blots e ensaios de imunoprecipitação, podem ser encontradas em Antibodies: A Laboratory Manual”, editado por Harlow e Lane, Cold Spring Harbor Press (1988)).

Distúrbios Associados a TWEAK

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar uma série de distúrbios, tal como um distúrbio associado a TWEAK. Por exemplo, o anticorpo pode ser usado para tratar distúrbios inflamatórios, imunológicos, ou auto-imunes em pacientes, bem como distúrbios neoplásicos. Os exemplos de distúrbios inflamatórios associados a TWEAK incluem artrite reumatóide, artrite psoriática, espondilite ancilosante, doença inflamatória do intestino (incluindo colite ulcerativa e doença de Crohn), psoríase, ou miosite inflamatória. Ainda outros exemplos de distúrbios inflamatórios que podem ser tratados incluem histiocitose de células de Langerhans, síndrome da angústia respiratória do adulto/bronquilite oblíterante, granulomatose de Wegener, vasculite, caquexia, estomatite, fibrose pulmonar idiopática, dermatomiosite ou polimiosites, esclerite não-infecciosa, sarcoidose crônica com envolvimento pulmonar, síndromes mielodisplásicas/anemia refratária com excesso de blastos, colite ulcerativa, doença pulmonar obstrutiva crônica moderada a grave, e arterite de células gigantes.

Um indivíduo em risco de contrair um desses distúrbios, ou que foi diagnosticado como estando com esses distúrbios, ou que tem um desses dstúrbios pode receber administração de um anticorpo anti-TWEAK em uma quantidade e por um tempo para proporcionar um efeito terapêutico global. O anticorpo anti-TWEAK pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, o documento n- USSN

60/679.518 descreve métodos para administrar um agente bloqueador de TWEAK em combinação com um agente bloqueador de TNF-α. No caso de uma terapia combinada, as quantidades e tempos de administração podem ser aqueles que proporcionam, por exemplo, um efeito terapêutico sinérgico.

Além disso, a administração do agente bloqueador de TWEAK (com ou sem o segundo agente) pode ser usada como um tratamento primário, por exemplo, de primeira linha, ou como um tratamento secundário, por exemplo, para indivíduos que têm uma resposta inadequada a uma terapia administrada anteriormente (isto é, uma terapia diferente daquela com um agente bloque10 adorde TWEAK).

Artrite Reumatóide (RA)

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar artrite reumatóide e distúrbios afins. A artrite reumatóide (RA) é uma doença inflamatória crônica que causa dor, incha15 ço, rigidez, e perda de função, principalmente nas articulações. A artrite reumatóide começa frequentemente na sinóvia, a membrana que circunda uma articulação, criando um saco protetor. Em muitos indivíduos que sofrem de artrite reumatóide, os leucócitos se infiltram a partir da circulação para dentro da sinóvia, causando uma inflamação anormal contínua (por exemplo, sinovite). Consequentemente, a sinóvia fica inflamada, causando quentura, vermelhidão, inchaço e dor. O colágeno na cartilagem é destruído gradualmente, estreitando o espaço articular e eventualmente danificando o osso. A inflamação causa dano erosivo do osso na área afetada. Durante este processo, as células da sinóvia crescem e se dividem anormalmente, tomando espessa a sinóvia normalmente fina, e resultando em uma articulação inchada e tírgido ao toque.

À medida que a artrite reumatóide progride, as células sinoviais anormais podem invadir e destruir a cartilagem e o osso dentro da articulação. Os músculos, ligamentos e tendões circundantes que sustentam e es30 tabilizam a articulação podem ficar fracos e incapazes de funcionar normalmente. A artrite reumatóide pode causar também perda óssea mais generalizada que pode levar à osteoporose, tomando os ossos frágeis e mais sus33

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J Μ. ¹⁰

Ο JCS cetíveis a fraturas. Todos esses efeitos causam dor, enfraquecimento e de- formidades associadas com a artrite reumatóide. As regiões que podem ser afetadas incluem os pulsos, as articulações metacarpofalangianas, joelhos e a bola do pé. Frequentemente, muitas articulações podem estar envolvidas, e mesmo a espinha pode ser afetada. Em cerca de 25% das pessoas com artrite reumatóide, a inflamação de pequenos vasos sanguíneos pode causar nódutos reumatóides, ou protuberâncias, sob a pele, que frequentemente se formam perto das articulações. À medida que a doença progride, fluido também pode se acumular, particularmente nos tornozelos. Muitos pacientes com artrite reumatóide desenvolvem também anemia, ou um decréscimo no número normal de hemácias.

A artrite reumatóide engloba inúmeros subtipos da doença, tais como síndrome de Felty, artrite reumatóide soronegativa, artrite reumatóide clássica, artrite reumatóide progressiva e/ou artrite reumatóide recorrente, e artrite reumatóide com vasculite. Alguns especialistas classificam a doença em tipo 1 ou tipo 2. O tipo 1, a forma menos comum, dura poucos meses no máximo e não deixa incapacitação permanente. O tipo 2 é crônico e dura anos, algumas vezes a vida inteira. A artrite reumatóide pode se manisfestar também como nódulos reumatóides subcutâneos, nódulos viscerais, vasculi20 te causadora de úlceras nas pernas ou mononeurite múltipla, efusões pleurais ou pericárdicas, limfadenopatia, síndrome de Felty, síndrome de Sjogren, e episclerite. Estes subtipos da doença e também os indivíduos que apresentam um ou mais dos sintomas acima podem ser tratados usando os anticorpos aqui descritos.

A artrite reumatóide pode ser avaliada por uma série de medidas clínicas. Alguns indícios exemplificativos incluem o escore total de Sharp (TSS), escore de erosão de Sharp, e o índice de incapacitação HAQ. Os métodos neste caso podem ser usados para conseguir uma melhora de pelos menos um desses indícios. As propriedades terapêuticas de um anticorpo anti-TWEAK para tratar artrite reumatóide podem ser avaliadas em um modelo animal, por exemplo, usando o modelo de artrite induzida por colágeno no camundongo (mCIA) (vide, por exemplo, Stuart et aL, J. Clin. tnvest.

69:673-683(1982).

Escierose Múltipla

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar escierose múltipla (MS) e distúrbios afins. A escierose múltipla é uma doença do sistema nervoso central que se caracteriza por inflamação e perda de bainhas de mielina.

Os pacientes que têm escierose múltipla podem ser identificados por critérios que estabelecem um diagnóstico de escierose múltipla clincamente definitivo, como definido no seminário sobre diagnóstico de escierose mútipla (Poser etal., Ann. Neurol. (1983) 13:227). Resumidamente, um indivíduo com escierose múltipla clinicamente definitiva teve dois ataques e comprovação clínica de duas lesões ou comprovação clínica de uma lesão e comprovação paraclínica de outra lesão separada. A escierose mútipla definitiva pode ser diagnosticada também por comprovação de dois ataques e bandas otigoclonais de IgG no líquido cerebrospinal ou por combinação de um ataque, comprovação clínica de duas lesões e banda oligoclonal de IgG no líquido cerebrospinal.

O tratamento eficaz de escierose múltipla pode ser examinado de várias maneiras diferentes. Os parâmetros que se seguem podem ser avaliados para calibrar a eficácia do tratamento. Três critérios principais são usados: EDSS (escala do estado de incapacitação prolongado), aparência de exarcebações ou MRI (reprodução de imagens por ressonância magnética). A EDSS é um meio para graduar o enfraquecimento clínico em virtude da escierose mútipla (Kurtzke (1983) Neurology 33:1444). Oito sistemas funcionais são avaliados quanto ao tipo e gravidade da degradação neurológica. Resumidamente, antes do tratamento, os pacientes são avaliados quanto ao enfraquecimento nos seguintes sistemas: piramidal, cerebelar, tronco cerebral, sensório, intestino e bexiga, visual, cerebral, e outros. Acompanhamentos são conduzidos em intervalos definidos. As escalas ficam na faixa entre 0 (normal) e 10 (morte em virtude de escierose múltipla). Uma diminuição na EDSS indica um tratamento eficaz (Kurtzke (1994) Ann. Neurol. 36:573-79).

Um modelo animal exemplificativo para esclerose múltipla é o modelo de encefalite auto-imune experimental no camundongo (EAE), como descrito, por exemplo, em Tuohy et al. (J. Immunol. (1988) 141: 1126-1130); Sobel et al. (J. Immunol. (1984) 132: 2393-2401): e Traugott {Cell Immunol.

(1989) 119: 114-129). Os camundongos podem receber administração de um anticorpo aqui descrito antes da indução da EAE. Os camundongos são avaliados quanto a critérios característicos para determinar a eficácia do anticorpo.

Acidente Vascular Cerebral

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar um indivíduo que experimentou um acidente vascular cerebral, por exemplo, um aciente vascular cerebral tromboembólico ou hemorrágico (por exemplo, dentro das últimas 48, 24, 12, 8, ou 2 horas), ou para prevenir um acidente vascular cerebral, por exemplo, em um indivíduo em risco de ter um acidente vascular cerebral. Os métodos exemplificativos estão descritos no documento n^Q USSN 60/653.811. O acidente vascular cerebral é um termo genérico para lesão aguda do cérebro resultante de doença de vasos sanguíneos. O acidente vascular cerebral pode ser classificado em pelo menos duas categorias principais: acidente vascular cerebral hemorrágico (resultante de vazamento de sangue fora dos vasos sanguíneos normais) e acidente vascular cerebral isquêmico (isquemia cerebral em virtude de falta de suprimento de sangue). Alguns episódios que podem causar acidente vascular cerebral isquêmico incluem trombose, embolia, e hipoperfusão sistêmica (com isquemia e hipoxia resultantes).

O acidente vascular cerebral causa, geralmente morte e lesão neuronal no cérebro por privação de oxigênio e episódios secundários. A área do cérebro que morre como resultado da falta de suprimento de sangue ou outra lesão é denominada um infarto. Em alguns casos, os tratamentos aqui descritos podem ser usados para reduzir ou minimizar o tamanho de um infarto, por exemplo, reduzindo episódios secundários que causam morte ou lesão neuronal.

A obstrução de uma artéria cerebral resultante de um trombo

que se acumulou sobre a parede de uma artéria do cérebro é denominada geralmente trombose cerebral. Na embolia cerebral, o material oclusivo que bloqueia a artéria cerebral aparece a jusante na circulação (por exemplo, um êmbolo é transportado para a artéria cerebral a partir do coração). Devido ao fato de que é difícil discernir se um acidente vascular cerebral é causado por trombose ou embolia, o termo tromboembolia é utilizado para cobrir ambos tipos de acidente vascular cerebral. A hipoperfusão sistêmica pode advir como uma consequência de níveis sanguíneos diminuídos, hematócritos reduzidos, baixa pressão sanguínea ou incapacidade do coração bombear sangue adequadamente.

Além disso, um anticorpo anti-TWEAK pode ser administrado como uma terapia profilática para acidente vascular cerebral, ou como um seu componente, por exemplo, para um indivíduo que experimentou um ataque isquêmico transiente (TIA) ou está apresentando sintomas de ataque ísquêmico transiente (TIA).

Distúrbios Neuronais

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar ou prevenir distúrbios neuronais tais como traumatismos neuronais mecânicos e distúrbios neurodegenerativos. Os exemplos de tramatismos neuronais mecânicos incluem lesão do cordão espinhal (SCI) e lesão cerebral traumatica (TBI). Os exemplos de distúrbios neurodegenerativos incluem esclerose lateral amiotrófica (ALS), paralisia bulbar progressiva (PBP), esclerose lateral primária (PLS), atrofia muscular progressiva (PMA), Doença de Parkinson, Doença de Huntington (HD), e Doença de Alzheimer. Vide, por exemplo, documento n^e USSN 60/653,813. Em uma modalidade,o distúrbio neuronal caracteriza-se principalmente por destruição ou morte de células nervosas, por exemplo, de neurônios motores (por exemplo, esclerose lateral amiotrófica (ALS)), de neurônios do corpo estriado de gânglios basais e/ou neurônios corticais (por exemplo, doença de Huntington), de neurônios da substância negra (por exemplo, doença de Parkinson). Câncer

TWEAK e seus receptores podem estar envolvidos no desenvol30

J?3 , Pxjfr>: ~Gr«~ '? — «c' vimento de pelo menos alguns tipos de câncer, por exemplo, um câncer ' ' pancreático. Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser usado para tratar ou prevenir cânceres (por exemplo, adenocarcinomas) e outros distúrbios neoplásicos. Vide, por exemplo, TREATMENT OF CÂNCER, USSN 60/685,465, depoitado em 27 de maio de 2005.

Composições Farmacêuticas

Um anticorpo anti-TWEAK (tal como um anticorpo aqui descrito) pode ser formulado como uma composição farmacêutica para administração a um indivíduo, por exemplo, para tratar um distúrbio aqui descrito. Tipicalmente, uma composição farmacêutica inclui um carreador farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, o termo carreador farmaceuticamente aceitável inclui quaisquer e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes da absorção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis. A composição pode incluir um sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo, um sal de adição de ácido ou um sal de adição de base (vide, por exemplo, Berge,

S.M., etal. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19).

A formulação farmacêutica é uma técnica bem-estabelecida, e está descrita adicionalmente, por exemplo, em Gennaro (editor), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20- edição, Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et ai., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7- Edição, Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); e Kibbe (editor), Handbook of Pharmaceutical Excipients American Pharmaceutical Association, 3- edição (2000) (ISBN: 091733096X).

As composições farmacêuticas podem estar em uma série de formas. Elas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semisólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão), dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, lipossomas e supositórios. A forma preferida pode depender do modo de administração pretendido e da aplicação terapêutica. Tipicamente, as composições para os agentes aqui descritos estão na forma de soluções injeta30

veis ou para infusão.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-TWEAK é formulado com materiais excipientes, tais como cloreto de sódio, fosfato dibásico de sódio heptaidratado, fosfato monobásico de sódio, e um estabilizador. Ele pode ser fornecido, por exemplo, em uma solução tamponada em uma concentração apropriada e pode ser estocado a 2-8°C.

Tais composições podem ser administradas por um modo parenteral (por exemplo, injeção intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, ou intramuscular). As expressões administração parenteral e administrado por via parenteral, como aqui utilizadas, significam modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitações, injeção intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, suba15 racnóide, intra-espinhal, epidural e intra-estemal e infusão.

A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada apropriada para estocagem estável em alta concentração. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando um agente aqui descrito na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ingrediente ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, e em seguida, filtração em condições estéreis. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando um agente aqui descrito em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários escolhidos entre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo e secagem por congelamento que produzem um pó de um agente aqui descrito mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma sua solução previamente filtrada em condições estéreis. A fluidez apropriada de uma solução pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de uma dispersão, e pelo uso de tensoativos. A absorção <ΐ β

prolongada de composições injetáveis pode ser gerada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina.

Em certas modalidades, o anticorpo anti-TWEAK pode ser pre5 parado com um carreador que protegerá o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação com liberação controlada, incluindo implantes, e sistemas de distribição microencapsulados. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser usados, tais como copolímeros de etileno e acetato de vinila, poiianidridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poli(ortoésteres), e poli(ácido lático). Muitos métodos para a preparação dessas formulações são patenteados ou geralmente conhecidos. Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems'’, J.R. Robinson, editor, Marcei Dekker, Inc., New York (1978).

Um anticorpo anti-TWEAK pode ser modificado, por exemplo, com uma porção que melhora sua estabilização e/ou retenção na circulação, por exemplo, no sangue, soro, ou outros tecidos, por exemplo, em pelo menos 1,5, 2, 5, 10, ou 50 vezes. O anticorpo modificado pode ser avaliado para determinar se ele consegue alcançar os locais da inflamação, por exemplo, as articulações.

Por exemplo, o anticorpo anti-TWEAK pode ser associado com (por exemplo, conjugado a) um polímero, por exemplo, um polímero substancialmente não-antigênico, tal como um poli(óxido de alquileno) ou um poli(óxido de etileno). Os polímeros apropriados variarão substancialmente em peso. Os polímeros que têm pesos moleculares numéricos médios na faixa entre cerca de 200 e cerca de 35.000 dáltons (ou cerca de 1.000 a cerca de 15.000, e 2.000 a cerca de 12.500) podem ser usados.

Por exemplo, o anticorpo anti-TWEAK pode ser conjugado a um polímero solúvel em água, por exemplo, um polímero polivinílico hidrofílico, por exemplo, poli(álcool vinílico) ou poli(vinil-pirrolidona). Os exemplos de tais polímeros incluem homopolímeros de poli(óxidos de alquilenos), tais como polietilenogicol (PEG) ou polipropilenoglicóis, polióis polioxietilenados, seus copolímeros e copolímeros em bloco deles, desde que a solubilidade

A: *

em água dos copolímeros em bloco seja mantida. Os polímeros úteis adicionais incluem polioxialquilenos tais como polioxietileno, polioxipropileno, e copolímeros em bloco de polioxietileno e polioxipropileno; polimetacrilatos; carbômeros; e polissacarídeos ramificados ou não-ramificados.

Em algumas implementações, o anticorpo anti-TWEAK pode ser também acoplado ou associado de outra forma com um marcador ou outro agente, por exemplo, outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou citostático, embora em muitas modalidades esta configuração seja desnecessária. Os exemplos de agentes citotóxicos e quimioterápicos incluem taxoi, citocalasina B, gramicidina D, vinblastina, doxorrubicina, daunorrubicina, um maitansinóide (por exemplo, maitansinol ou o maitansinóide DM1, um derivado de maitansina que contém sulfidrila), mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, taxano, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e seus análogos ou homólogos.

Quando o anticorpo anti-TWEAK é usado em combinação com um segundo agente (por exemplo, um anticorpo anti-TNF-α ou outro agente), os dois agentes podem ser formulados separadamente ou conjuntamente. Os agentes podem ser formulados ou usados de outra forma em uma quantidade sinergicamente eficaz. É possível também usar um ou ambos agentes em quantidades menores do que aquelas que seriam usadas por monoterapia. Por exemplo, as respectivas composições farmacêuticas podem ser misturadas, por exemplo, momentos antes da administração, e administradas juntas ou podem ser administradas sepadamente, por exemplo, na mesma hora ou em horas diferentes.

É possível também usar outros agentes bloqueadores de TWEAK, por exemplo, os agentes descritos em USSN 60/679.518. O agente pode ser qualquer tipo de composto (por exemplo, molécula orgânica ou inorgânica pequena, ácido nucléico, proteína, ou peptidomimético) que pode ser administrado a um indivíduo. Em uma modalidade, o agente bloqueador é um composto biológico, por exemplo, uma proteína que tem um peso molecular entre 5 e 300 kDa. Por exemplo, um agente bloqueador de TWEAK pode inibir a ligação de TWEAK a um receptor de TWEAK. Os agentes blo<' *

queadores de TWEAK exemplificativos, que não os anticorpos que se ligam a TWEAK, incluem anticorpos que se ligam a TWEAK-R e formas solúveis de TWEAK-R (por exemplo, Fn14) que competem com TWEAK-R da superfície celular pela ligação a TWEAK. Outros agentes terapêuticos aqui descritos também podem ser fornecidos como uma composição farmacêutica, por exemplo, por métodos usuais ou pelo método aqui descrito.

Administração

O anticorpo anti-TWEAK pode ser administrado a um indivíduo, por exemplo, um ser humano, por uma série de métodos. Para muitas aplicações, a via de administração é uma entre: injeção ou infusão intravenosa (IV), injeção subcutânea (SC), por via intraperitoneal (IP), ou injeção intramuscular. É possível também usar distribuição intra-articular. Outros modos de administração parenteral também podem ser usados. Os exemplos desses modos incluem: injeção intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, transtraceal, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal, e epidural e intra-esternal. Em alguns casos, a administração pode ser diretamente a um local de inflamação, por exemplo, uma articulação ou outro local inflamado.

A via e/ou modo de administração do anticorpo pode ser também individualizado para o caso individual, por exemplo, monitorando o indivíduo, por exemplo, usando reprodução de imagens tomográficas, exame neurológico, e parâmetros usuais asssociados ao distúrbio específico, por exemplo, critérios para avaliar artrite reumatóide.

O anticorpo pode ser administrado como uma dose fixa, ou em uma dose de mg/kg. A dose pode ser também escolhida para reduzir ou evitar a produção de anticorpos contra o anticorpo anti-TWEAK. Os esquemas de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada, por exemplo, uma resposta terapêutica ou um efeito terapêutico combinatório. Geralmente, as doses do anticorpo anti-TWEAK (e, opcionalmente, de um segundo agente) podem ser usadas para fornecer para um indivíduo o agente em quantidades biodisponíveis. Por exemplo, as doses na faixa entre 0,1 100 mg/kg, 0,5-100 mg/kg, 1 mg/kg -100 mg/kg, 0,5-20 mg/kg, 0,1-10

mg/kg, ou 1-10 mg/kg podem ser administradas. Outras doses também podem ser usadas.

A forma de dosagem unitária ou dose fixa, como aqui utilizada, refere-se a unidades fisicamente distintas apropriadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados: cada unidade contém uma quantidade predeterminada do composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido e opcionalmente em associação com o outro agente. Uma única ou múltiplas dosagens podem ser dadas. Alternativamente, ou adicionalmente, o anticorpo pode ser administrado por intermédio de infusão contínua.

Uma dose do anticorpo anti-TWEAK pode ser administrada, por exemplo, em um intervalo periódico durante um período de tempo (um curso de tratamento) suficiente para englobar pelo menos 2 doses, 3 doses, 5 doses, 10 doses, ou mais, por exemplo, uma ou duas vezes ao dia, ou cerca de uma a quarto vezes por semana, ou de preferência semanalmente, quinzenalmente, mensalmente, por exemplo, durante entre cerca de 1 e 12 semanas, de preferência entre 2 e 8 semanas, mais preferivelmente entre cerca de 3 e 7 semanas, e ainda mais preferivelmente entre cerca de 4, 5, ou 6 semanas. Os fatores que podem influenciar a dosagem e o cronograma necessários para tratar eficazmente um indivíduo incluem, por exemplo, a gravidade da doença ou distúrbio, formulação, via de administração, tratamentos anteriores, saúde geral e/ou idade do indivíduo, e outras doenças presentes. Além disso, o tratamento de um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto pode incluir um único tratamento ou, de preferência, pode incluir uma série de tratamentos. Os modelos animais também podem ser usados para determinar uma dose útil, por exemplo, uma dose ou esquema inicial.

Caso um indivíduo esteja em risco de desenvolver um distúrbio inflamatório ou outro distúrbio aqui descrito, o anticorpo pode ser administrado antes do início pleno do distúrbio, por exemplo, como uma medida preventiva. A duração desse tratamento preventivo pode ser uma única dosagem do anticorpo ou o tratamento pode continuar (por exemplo, múltiplas

dosagens). Por exemplo, um indivíduo em risco de contrair o distúrbio ou que tem uma predisposição para o distúrbio pode ser tratado com o anticorpo por dias, semanas, meses, ou mesmo por anos, de modo a prevenir que o distúrbio ocorra ou fulmine.

Uma composição farmacêutica pode incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente aqui descrito. Tais quantidades eficazes podem ser determinadas levando em conta o efeito do agente administrado, ou o efeito combinatório de agentes, caso mais do que um agente seja usado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente pode também variar de acordo com fatores, tais como o estado da doença, idade, sexe, e peso do indivíduo, e a capacidade do composto eliciar uma resposta desejada no indivíduo, por exemplo, uma melhora de pelo menos um parâmetro do distúrbio, ou uma melhora de pelo menos um sintoma do distúrbio, Uma quantidade terapeuticamente eficaz é também uma na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da composição são contrabalançados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Dispositivos e Kits para Terapia

As composições farmacêuticas que incluem o anticorpo antiTWEAK podem ser administradas com um dispositivo médico. O dispositivo pode ser projetado com características tais como portabilidade, estocagem à temperatura ambiente, e facilidade de uso, de tal modo que ele possa ser usado em situações emergenciais, por exemplo, por um indivíduo destreinado ou pelo pessoal de atendimento emergencial no campo, removido de instalações médicas e de outros equipamentos médicos. O dispositivo pode incluir, por exemplo, um ou mais alojamentos para armazenar as preparações farmacêuticas que incluem o anticorpo anti-TWEAK, e podem ser configurados para distribuir uma ou mais doses unitárias do anticorpo. O dispositivo pode ser ainda configurado para administrar um segudo agente, por exemplo, um anticorpo anti-TNF-α, seja como uma única composição farmacêutica que inclui também o anticorpo anti-TWEAK ou como duas composições farmacêuticas separadas.

Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada

com um dispositivo para injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos descritos em US 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Os exemplos de implantes e módulos bem-conhecidos incluem: US 4.487.603, que descreve uma bomba de microinfusão implantável para distribuir uma medicação em uma taxa controlada; US 4.486.194, que descreve um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; US 4.447.233, que descreve uma bomba para infusão de medicações para distribuir uma medicação em uma taxa de infusão precisa; US 4.447.224, que descreve um aparelho implantável para infusão com vazão variável, para distribição contínua de fármacos; US 4.439.196, que descreve um sistema de distribuição osmótica de fármacos, tendo uma câmara multicompartimentada; e US 4.475.196, que descreve um sistema de distribuição osmótica de fármacos. Muitos outros dispositivos, implantes, sistemas de distribuição, e módulos também são conhecidos.

Um anticorpo anti-TWEAK pode ser fornecido em um kit. Em uma modalidade, o kit inclui (a) um recipiente que contém uma composição que inclui o anticorpo anti-TWEAK, e opcionalmente, (b) material instrutivo. O material instrutivo pode ser um material descritivo, informativo, promocional, ou outro material que refere-se aos métodos aqui descritos e/ou ao uso dos agentes para benefício terapêutico.

Em uma modalidade, o kit inclui também um segundo agente para tratar um distúrbio inllamatório, por exemplo, um anticorpo anti- TNF-tx. Por exemplo, o kit inclui um primeiro recipiente que contém uma composição que inclui o anticorpo anti-TWEAK, e um segundo recipiente que inclui o segundo agente.

O material informativo dos kits não está limitado em sua forma. Em uma modalidade, o material informativo pode incluir informações sobre a produção do composto, peso molecular do composto, concentração, data de validade, lote, informações sobre o local de fabricação, e assim por diante. Em uma modalidade, o material informativo refere-se a métodos para administrar o anticorpo anti-TWEAK, por exemplo, em uma dose, forma de dosagem ou modo de administração apropriado (por exemplo, uma dose, forma

JXde dosagem, ou modo de administração aqui descrito), para tratar um indivíduo que teve ou que está em risco de contrair um distúrbio inflamatório, ou outro distúrbio aqui descrito. As informações podem ser fornecidas em uma série de formatos, incluindo um texto impresso, material legível por compu5 tador, gravação de vídeo, ou gravação de áudio, ou informações que fornecem um link ou endereço para obter material substantivo, por exemplo, na internet.

Além do anticorpo, a composição no kit pode incluir outros ingredientes, tais como um solvente ou tampão, um estabilizador, ou um con10 servante. O anticorpo pode ser fornecido em qualquer forma, por exemplo, na forma líquida, seca ou liofilizada, de preferência substancíalmente puro e/ou estéril. Quando os agentes são fornecidos em uma solução líquida, a solução líquida é, de preferência, uma solução aquosa. Quando os agentes são fornecidos em uma forma seca, a reconstituição é geralmente pela adi15 ção de um solvente apropriado. O solvente, por exemplo, água esterilizada ou tampão, pode ser opcionalmente fornecido no kit.

O kit pode incluir um ou mais recipientes para a composição ou composições que contêm os agentes. Em algumas modalidades, o kit contém recipientes, divisões ou compartimentos separados para a composição e para o material informativo. Por exemplo, a composição pode ficar contida em um vidro, frasco ou seringa, e o material informativo pode ficar contido em um envelope ou caixa de plástico. Em outras modalidades, os elementos separados do kit ficam contidos dentro de um único recipiente não dividido. Por exemplo, a composição fica contida em um vidro, frasco ou seringa que tem afixado a ele o material informativo na forma de um rótulo. Em algumas modalidades, o kit inclui uma pluralidade (por exemplo, um pacote) de recipientes individuais, cada um contendo uma ou mais formas de dosagem unitárias (por exemplo, uma forma de dosagem aqui descrita) dos agentes. Os recipientes podem incluir uma combinação de dosagem unitária, por exem30 pio, uma unidade que inclui o anticorpo anti-TWEAK e o segundo agente, por exemplo, em uma proporção desejada. Por exemplo, o kit inclui uma pluralidade de seringas, ampolas, carteias de folha de alumínio, embalagem de i

./ biister, ou dispositivos médicos, por exemplo, cada um contendo uma única dose unitária da combinação. Os recipientes dos kits podem ser herméticos, à prova d'água (por exemplo, impermeáveis a mudanças de umidade ou evaporação), e/ou impenetrável à luz.

O kit inclui opcionalmente um dispositivo apropriado para administração da composição, por exemplo, uma seringa ou outro dispositivo de distribuição apropriado. O dispositivo pode ser fornecido pré-carregado com um ou ambos agentes ou pode estar vazio, porém apropriado para ser carregado.

Assesto de Células que Expressam TWEAK

Os anticorpos anti-TWEAK aqui descritos podem ser usados para assestar uma carga útil contra uma célula que expressa TWEAK ou contra um tecido ou outra estrutura associada com TWEAK. Por exemplo, os anticorpos podem ser afixados a um vírus ou partícula semelhante a vírus que pode distribuir um gene exógeno (por exemplo, para terapia gênica) ou para um lipossoma, por exemplo, um lipossoma que encapsula um agente terapêutico ou gene exógeno. Um método exemplificativo para usar um anticorpo para assestar um vírus está descrito em Roux et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:9079-9083. Vide também, por exemplo, Curr. Gene Ther. (2005) 5:63-70; e Hum. Gene Ther. (2004) 15:1034-1044.

O Abs anti-TWEAK desta invenção pode ser anexado a lipossomas que contêm um agente terapêutico, tal como agentes quimioterápicos. A anexação de anticorpos a lipossomas pode ser realizada por qualquer agente reticulante conhecido, tais como agentes reticulantes heterobifuncionais que foram amplamente utilizados para acoplar toxinas ou agentes quimioterápicos a anticorpos para distribuição direcionada. Por exemplo, a conjugação a lipossomas pode ser realizada usando o reagente reticulante direcionado a carboidratos, hidrazida do ácido 4-(4-maleimidofenil)-butírico (MPBH) (Duzgunes et al. (1992) J. Cell. Biochem. Abst. Suplemento 16E 77). Os lipossomas que contêm anticorpos podem ser preparados também por métodos bem-conhecidos (Vide, por exemplo DE 3.218.121; Epstein et ai. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-92 ; Hwang et al. (1980) Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-34; US 4.485.045 e 4.544.545).

Usos Diagnósticos

Os anticorpos anti-TWEAK podem ser usados em um método diagnóstico para detectar a presença de um TWEAK, in vitro (por exemplo, uma amostra biológica, tal como um tecido, biópsia) ou in vivo (por exemplo, reprodução de imagens in vivo em um indivíduo). Por exemplo, os anticorpos anti-TWEAK humanos ou efetivamente humanos podem ser administrados a um indivíduo para detectar TWEAK dentro do indivíduo. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado, por exemplo, com um marcador detectável por MRI ou um marcador radioativo. O indivíduo pode ser avaliado usando um meio para detectar o marcador detectável. Por exemplo, o indivíduo pode ser escaneado para avaliar a localização do anticorpo dentro do indivíduo. Por exempio, o indivíduo é submetido a um exame de reprodução de imagens, por exemplo, por RMN ou outro meio tomográfico.

Os exemplos de marcadores úteis para reprodução de imagens diagnosticas incluem marcadores radioativos tais como ¹³¹l, ¹¹¹ In, ¹²³l, ^99mTc, ³²P, ³³P, ¹²⁵l, ³H, ¹⁴C, e ¹⁸⁸Rh, marcadores fluorescentes tais como fluoresceína e rodamina, marcadores ativos para ressonância magnética nuclear, isotopos emissores de pósitrons detectáveis por um escaneador de tomografia de emissão de pósitrons (PET”), quimioluminescentes tais como luciferina, e marcadores enzimáticos tais como peroxidase ou fosfatase. Os emissores de radiação de curto alcance, tais como isotopos detectáveis por sondas detectoras de curto alcance, também podem ser empregados. O ligante de proteína pode ser marcado com esses reagentes usando técnicas conhecidas. Por exemplo, vide Wensel e Meares (1983) Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy, Elsevier, New York para obter técnicas referentes à marcação radioativa de anticorpos, e Colcher et al. (1986) Meth. Enzymol. 121:802-816.

O indivíduo pode passar pelo exame de reprodução de imagens in vivo usando técnicas conhecidas tais como escaneamento (scanning) radionuclear, usando, por exemplo, uma câmera gama ou tomografia de emissão. Vide, por exemplo, A.R. Bradwell et al., Developments in Antibody

Imaging, Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, R.W. Baldwin et al., (editores), páginas 65-85 (Academic Press 1985). Alternativamente, pode ser usado um escaneador de tomografia transaxial de emissão de positrons, tal como aquele designado Pet VI, disponível no Brookhaven National Laboratory, onde o marcador radiativo emite positrons (por exemplo, ¹¹C, ¹⁸F, ¹⁵O, e ¹³N).

Agentes de Contraste para MRI

A Reprodução de Imagens por Ressonância Magnética (MRI) usa RMN para visualizar as características internas de indivíduos vivos, e é útil para prognóstico, diagnose, tratamento, e cirurgia. A MRI pode ser usada sem compostos rastreadores radioativos com benefícios óbvios. Algumas técnicas de MRI estão resumidas em EPO 502 814 A. Geralmente, as diferenças relacionadas às constantes tempo de relaxamento T1 e T2 de prótons de água em diferentes ambientes, são usadas para gerar uma imagem. Entretanto, estas diferenças podem ser insuficientes para fornecer imagens nítidas de alta resolução.

As diferenças nessas constantes de tempo de relaxamento podem ser intensificadas por agentes de contraste. Os exemplos desses agentes de contraste incluem inúmeros agentes magnéticos, agentes paramagnéticos (que alteram principalmente T1) e agentes ferromagnéticos ou superparamagnéticos (que alteram principalmente a resposta T2). Os quelantes (por exemplo, os quelantes EDTA, DTPA e NTA) podem ser usados para anexar (e reduzir a toxicidade) de algumas substâncias paramagnéticas (por exemplo, Fe³⁺, Mn²⁺, Gd³⁺). Outros agentes podem estar na forma de partículas, por exemplo, com um diâmetro menor do que 10 pm a cerca de 10 nm). As partículas podem ter propriedades ferromagnéticas, antiferromagnéticas ou superparamagnéticas. As partículas podem incluir, por exemplo, magnetita (Fe₃O₄), y-Fe₂O₃, ferritas, e outros compostos minerais magnéticos de elementos de transição. As partículas magnéticas podem incluir um ou mais cristais magnéticos com e sem material não-magnético. O material nãomagnético pode incluir polímeros sintéticos ou naturais (tais como sefarose, dextrano, dextrina, amido, e similares).

Os anticorpos anti-TWEAK podem ser marcados também com

um grupo indicador que contém o átomo de ¹⁹F ativo em RMN, ou uma pluralidade desses átomos, desde que (i) substancialmente a totalidade dos átomos de flúor abundantes na natureza sejam o isótopo ¹⁹F e assim sendo substanciamente todos compostos que contêm flúor sejam ativos em RMN; (ii) muitos compostos polifluorados quimicamente ativos, tais como anidrido trifluoracético, estejam disponíveis comercialmente a um custo relativamente baixo, e (iii) muitos compostos fluorados tenham se demonstrado medicamente aceitáveis para uso em humanos, tais como os poliéteres perfluora10 dos utilizados para transportar oxigênio como substitutos de hemoglobina. Depois de permitir algum tempo para incubação, uma MRI de corpo inteiro é conduzida usando um aparelho tal como aqueles descritos por Pykett (1982) Scientific American, 246:78-88, para localizar e reproduzir a imagem da distribuição de TWEAK.

Em outro aspecto, a invenção descreve um método para detectar a presença de TWEAK em uma amostra in vitro (por exemplo, uma amostra bilógica, tal como soro, plasma, tecido, biópsia). O método em questão pode ser usado para diagnosticar um distúrbio, por exemplo, um distúrbio associado a células imunes. O método inclui: (i) contactar a amostra ou uma amostra de controle em contato com o anticorpo anti-TWEAK; e (ii) avaliar a amostra quanto à presença de TWEAK, por exemplo, detectando a formação de um complexo entre o anticorpo anti-TWEAK e TWEAK, ou detectando a presence do anticorpo ou TWEAK. Por exemplo, o anticorpo pode ser imobilizado, por exemplo, sobre um suporte, e a retenção do antígeno sobre o suporte é detectada, e/ou vice-versa. Uma amostra de controle pode ser incluída. Uma mudança estatisticamente significante na formação do complexo na amostra em relação à amostra de controle pode ser indicativa da presença de TWEAK na amostra. Geralmente, um anticorpo anti-TWEAK pode ser usado em aplicações que incluem polarização por fluorescência, microscopia, ELISA, centrifugação, cromatografia, e seleção de células (por exemplo, seleção de células ativada por fluorescência).

Exemplo 1

Λ** «Mbr

A sequência do domínio variável da cadeia pesada de P2DÍS murino, com CDRs sublinhadas, é;

EVQLVESGGG LVRPGGSLKL FCAASGFTFS RYAMSWVRQS PEKRLEWVAE

IS5GGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNTLY LEMSSLKSED TAMYYCARVL

101 YYDYDGDRIE VMDYWGQGTA VIVSS (SEQ ID NO: 50)

Este é um domínio variável da cadeia pesada murino subgrupo

3D.

A sequência do domínio variável da cadeia leve de P2D10 murino, com CDRs sublinhadas,é:

DWMTQSPLS LSVSLGDQAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPK 51 FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVAAEDLGV YFCSQSTHFP

101 RTFGGGTTLE IK (SEQ ID NO: 51)

Esta é uma cadeia leve murina do subgrupo 2 kapa.

Os seguintes esqueletos de aceptores humanos foram escolhidos para huP2D10: domínio variável da cadeia pesada humana de 56-84m subgrupo 3 (número de acesso da base de dados NCBI GL33318898, Scamurra et al., submisão direta). A sequência com CDRs sublinhadas é a seguinte:

EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMSWV RQA PGKGLEWVAN

IKQDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAE D TAVYYCARDP

101 MTTWKPSLA TNDYWGQGTL VTVSS (SEQ ID NO: 52)

A sequência do domínio variável da cadeia leve de K107 humano subgrupo 2 (número de acesso da base de dados NCBI Gl: 21669075, Akahori et al., submissão direta), com CDRs sublinhadas é:

DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLL HSNGYNYLDW YLQKPGQSPQ

LLIYLGSNRA SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCMQALQTP

101 LTFGGGTKVE IK (SEQ ID NO: 53)

Nas sequências do aceptor humano ilustradas, as CDRs (que estão sublinhadas) são do mesmo comprimento e classes canônicas que aquelas nos domínios variáveis de muP2D10.

Abaixo está ilustrado o alinhamento do murino P2D10 (topo) e aceptor humano 56-84 m (embaixo) domínio variável de cadeia pesada (68,8% idêntico):

EVQLVESGGGLVRPGGSLKLFCAASGFTFSRYAMSWVRQSPEKRLEWVAE I I 11 1111 11 f I. I 1111: f llllilill I INIIM I IIHI EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVAN

ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLKSEDTAMYYCARVL

100

IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP 100

101 YYDYDGDRIEVMDYWGQGTAVIVSS 125 (SEQ ID NO: 54) : IIIIHI I III

101 MTTWKPSLATNDYWGQGTLVTVSS 125 (SEQ ID NO: 55)

Abaixo está ilustrado o alinhamento do P2D10 murino (topo) e dos domínios variáveis com cadeia leve (embaixo) do aceptor humano K107 (75,9% idêntica):

DWMTQSPLSLSVSLGDQASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPK 50

ΙΠΙΙΙΙΙΗΙ I- H llllllll III· I I II llllllllll.

DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ 50

FLIYKVSNRFSGVPDRFSG5GSGTDFTLKISRVAAEDLGVYFCSQSTHFP 100

III III i 11 I 11 Η I; 1111J Η 111111 111-111:1 I- E

LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100

101 RTFGGGTTLEIK 112 (SEQ ID NO: 56) llllll -III

101 LTFGGGTKVEIK 112 (SEQ ID NO: 57)

Há duas versões da cadeia leve de huP2D10 (L1 e L2). O anticorpo huP2D10-1 refere-se a um anticorpo que inclui huP2D10 H1 e huP2D10 L1. O anticorpo huP2D10-2 refere-se a um anticorpo que inclui huP2D10H1 ehuP2D10L2.

Abaixo está ilustrado o alinhamento do aceptor humano de 5630

4a «t

A.

84m (topo) e o domínio variável da cadeia pesada de huP2D10 H1 (embaixo)^>£ ,

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVAN 50

I I I I I I I i I ί I I I I I i 1 I I ί i I ί Ε I I ! ! ! I I EEIEUUHEHIH

1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYAMSWVRQAPGKGLEWVAE 50

IKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDP 100

H Si M lllilllllllÍlllilliliillItllIliti

ISSGGSYPYYPDTVTGRFTISRDNAKNSLYLOMNSLRAEDTAVYYCARVL 100

101 rrrTWKPSLATNDYWGQGTLVTVSS 125 (SEQ ID NO: 58) : lllllllllllll

101 YYDYDGDRIEVMDYWGQGTLVTVSS 125 (SEQ ID NO: 59)

As CDRs estão sublinhadas. A cadeia pesada de huP2D10 é um enxerto de CDR linear (ito é, não há retromutações no esqueleto).

Abaixo está indicado o alinhamento do aceptor kappa humano

K107 (topo) e o domínio variável da cadeia leve de huP2D10 L1 (embaixo):

DWMTQ5PLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPO 50 lllllll lllllllliil lllllllliil- I I II illlillllll

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ 50

LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100

UI Eli 1111111111111111111111111111111:1 I- I fLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYfCSQSTHFP 100

101 LTFGGGTKVEIK 112 (SEQ ID NO:

lllllllliil

101 RTFGGGTKVEIK 112 (SEQ ID NO:

As CDRs estão sublinhadas

60)

61)

A cadeia leve de huP2D10 L1 tem duas retromutações que estão indicadas em letras minúsculas no esqueleto indicado acima: L46F em FR2 e Y87F em FR3.

fe fc.

Abaixo está ilustrado o alinhamento do aceptor humano K107 (topo; e o domínio variável da cadeia leve de huP2D10 L2 (embaixo):

DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQ 50 I 11 H 11 111III I Η i I 1111 ί 111 Η I - i 1 II IIIIHIHH 1 DWMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLVSSKGNTYLHWYLQKPGQSPQ 50

LLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP 100

INI III I 111 I Μ 11 i 1111 i 11 ί I i 11111111 111 11 I- I

LLIYKVSNRFSGVPPRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHFP 100

101 LTFGGGTKVEIK 112 (SEQ ID NO: 62) lllllllllll

101 RTFGGGTKVEIK 112 (SEQ ID NO: 63)

As CDRs estão sublinhadas. A cadeia leve de huP2D10 L2 é um enxerto de CDR linear (sem retromutações no esqueleto).

Esta é uma sequência de aminoácidos exemplificativos da cadeia pesada de lgG1 do huP2D10 H1 maduro:

1	EVQLVESGGG	LVQPGGSLRL	SCAASGFTFS	RYAMSWVRQA	PGKGLEWVAE
51	ISSGGSYPYY	PDTVTGRFTI	SRDNAKNSLY	LQMNSLRAED	TAVYYCARVL
101	YYDYDGDRIE	VMDYWGQGTL	VTVSSASTKG	PSVFPLAPSS	KSTSGGTAAL
151	GCLVKDYFPE	PVTVSWNSGA	LTSGVHTFPA	VLQSSGLYSL	SSWTVPSSS
201	LGTQTYICNV	NHKPSNTKVD	KKVEPKSCDK	THTCPPCPAP	ELLGGPSVFL
251	FPPKPKDTLM	ISRTPEVTCV	WDVSHEDPE	VKFNWYVDGV	EVHNAKTKPR
301	EEQYNSTYRV	VSVLTVLHQD	WLNGKEYKCK	VSNKALPAPI	EKTISKAKGQ
351	PREPQVYTLP	PSRDELTKNQ	VSLTCLVKGF	YPSDIAVEWE	SNGQPENNYK
401	TTPPVLDSDG	SFFLYSKLTV	DKSRWQQGNV	FSCSVMHEAL	HNHYTQKSLS

451 SPG (SEQ ID NO: 64)

A numeração Kabat para o segmento V_H do domínio variável da cadeia pesada (SED ID NO:65) está indicada abaixo:

Kabat N° 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 hP2DlO EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYAMSWVRQA PGKGLEWVAE

Kabat N° 12a3456789 0123456789 0123456789 012abc3456 78901234 hP2D10 ISSGGSYPYY PDTVTGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCAR

Esta é uma sequência de aminoácidos exemplificativa da cadeia leve de huP2D10 L1 maduro:

DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQ

FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFCSQSTHFP

101 RTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK 151 VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL S5TLTLSKAD YEKHKVYACE 201 VTHQGLSSPV TKSFNRGEC (SEQ ID NO: 66)

A numeração Kabat para este segmento V_L está indicada abaixo (SEQ ID NO: 67):

Kabat N° 1234567890 1234567890 1234567abc de89012345 6789012345 hP2DlO DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQ

Kabat N° 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345 6789012345 hP2DlO FLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YFCSQSTHFP

Esta é uma sequência de aminoácidos exemplificativa da cadeia leve de huP2D10 L2 maduro:

DWMTQSPLS LPVTPGEPAS ISCRSSQSLV SSKGNTYLHW YLQKPGQSPQ

LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDVGV YYCSQSTHFP

101 RTFGGGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASWCL LNNFYPREAK

151 VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACE

201 VTHQGLSSPV TKSFNRGEC (SEQ ID NO: 68)

A numeração Kabat para este segmento V_L está indicada abaixo (SEQ ID Ν' Kabat N° hP2Dl0 Kabat N° hP2D10 Exemplo 2 >: 69):

1234567890

DWMTQSPLS

6789012345

LLIYKVSNRF

1234567890

LPVTPGEPAS

6789012345

SGVPDRFSGS

1234567abc

ISCRSSQSLV

6789012345

GSGTDFTLKI de89012345

SSKGNTYLHW

6789012345

SRVEAEDVGV

6789012345

YLQKPGQSPQ

6789012345

YFCSQSTHFP

O anticorpo monoclonal bloqueador para TWEAK, mP2D10, reduziu significativamente a gravidade clínica em modelos de esclerose múlti-

pia, acidente vascular cerebral, e artrite reumatóide. As farmacocinéticái (PK) do anticorpo monoclonal anti-TWEAK, mP2D10, após administração intravenosa (IV) foram modeladas.

mP2D10 foi administrado a camundongos a 1, 10 ou 100 mg/kg por intermédio de injeção IV. As concentrações séricas de mP2D10 foram determinadas usando ELISA. O perfil de concentração versus tempo de PK foi analisado usando um modelo de dois compartimentos com eliminação de primeira ordem ou eliminação Michaelis-Menten a partir do compartimento central com um volume de V1. As constantes das taxas entre os dois compartimentos foram K12 (compartimento de saída 1 até 2) e K21 (compartimento de saída 2 até 1). Para o modelos de eliminação de primeira ordem, a constante da taxa de eliminação foi K10. Para o modelo de eliminação Michaelis-Menten, o fármaco foi depurado na taxa de Vm*C1/(Km+C1), onde, C1 era mP2D10 na concentração no compartimento central, Vm e Km foram constantes. Os dados foram adapatados ao software ADAPT II software (DArgenio, D.Z. e A. Schumitzky, ADAPT II Useris Guide: Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Systems Analysis Software, Biomedical Simulations Resource, Los Angeles, 1997), usando o procedimento de estimativa de possibilidade máxima (Maximum Likelihood).

No caso do modelo de eliminação linear com dois compartimentos, V1 foi 23,2 mL/kg, K10 foi 0,0096 h-1, K12 foi 2,501 e K21 foi 1,053. O valor da área sob a curva (AUC) foi 298 e o valor de Schwarz foi 304,2. No caso da eliminação linear com dois compartimentos, V1 foi 0,0235. Vm foi 9,22 mg/kg/hr, Km foi 484,2 pg/mL K12 foi 2,348 h-1, e K21 foi 0,966 h-1. O valor da AUC foi 269 e o valor de Schwarz foi 276. PK de mP2D10 foi mais bem previsto por um modelo não-linear do que um modelo linear.

Os perfis de concentração versus tempo de mP2D10 foram mais bem previstos por um modelo com dois compartimentos com eliminação Michaelis-Menten do que com eliminação de primeira ordem.

Os versados nessas técnicas devem avaliar, ou devem ser capazes de determinar, usando experimentação não mais do que rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas aqui descritas.

Claims (17)

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TWEAK (indutor fraco de apoptose semelhante a TNF) humano, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio variável da cadeia

5 pesada e um domínio variável da cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende regiões determinantes de complementaridade (CDR) 1-3 que possuem as sequências de aminoácidos apresentadas nas SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 3, respectivamente, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende CDR 1-3 que possuem as se10 quências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ

15 ID NO: 59.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 61.

20

4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 63.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com

25 a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 59, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 61.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com

30 a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ

ID NO: 59, e em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sePetição 870180146919, de 31/10/2018, pág. 16/20 quência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 63.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma região Fc humana.

5

8. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que é um Fab, F(ab')2, Fv ou scFv.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o an10 ticorpo é IgG1/capa.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TWEAK humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64, e em que a

15 cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 66.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao TWEAK humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesada compreen20 de a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 64, e em que a cadeia leve compreende a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 68.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que

25 é ligado a uma molécula funcional selecionada a partir do grupo consistindo em um outro anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, uma toxina, um radioisótopo, um polímero, um agente citotóxico e um agente citostático.

13. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno como definido

30 em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Uso da composição farmacêutica como definida na reivindiPetição 870180146919, de 31/10/2018, pág. 17/20 cação 13, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de um distúrbio autoimune.

15. Uso da composição farmacêutica como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medica5 mento para o tratamento de artrite reumatoide.

16. Uso da composição farmacêutica como definida na reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de esclerose múltipla.

17. Uso da composição farmacêutica como definida na reivindi10 cação 13, caracterizado pelo fato de que é para o preparo de um medicamento para o tratamento de acidente vascular cerebral.