BRPI0611474A2 - biodetecção por quìmica modelada com ácido nucléico - Google Patents

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BRPI0611474A2
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Barbara S Fox
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Abstract

BIODETECçãO POR QUIMICA MODELADA COM áCIDO NUCLEICO. A invenção fornece composições e métodos para a detecção de alvos biológicos (e.g., ácidos nucleicos e proteínas) por química modelada com ácido nuclélco, por exemplo, pela geração de sinais florescentes, químíluminescentes e/ou cromofórico.

Description

"BIODETECÇÃO POR QUÍMICA MODELADA COM ÁCIDO NUCLÉICO"
PEDIDOS CORRELATOS
Esse pedido reivindica o beneficio e prioridadedos Pedidos de Patente US números de série 60/685.047, depo-sitado em 26 de maio de 2005; 60/701.165 depositado em 21 dejulho de 2005; 60/713.038 depositado em 31 de agosto de2005; 60/724.743 depositado em 7 de outubro de 2005;60/758.837 depositado em 13 de janeiro de 2006 e 60/786.247,depositado em 27 de março de 2006, a revelação total de cadaum sendo incorporada aqui como referência, para todas as fi-nalidades.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere, de modo geral, àssondas e seu uso na biodetecção e diagnósticos. Mais especi-ficamente, a invenção se refere às composições e métodos daquímica modelada com ácido nucléico (por síntese de compos-tos fluorescentes, quimioluminescentes e cromofóricos) nabiodetecção e diagnóstico (por exemplo, a detecção de ácidosnucléicos e proteínas).
ANTECEDENTES
Compostos fluorescentes e coloridos vêm sendo usa-dos nos campos de pesquisa biológica e medicina para detec-tar a presença, ausência, estado, quantidade e composição debiomoléculas. Os ensaios usando compostos fluorescentes ecoloridos podem ser realizados in vitro, in sítu ou in vivo.
Exemplos de uso comum nos ensaios in vitro para detecção deDNA e RNA são PCR em tempo real e de ponto final, sequencia-mento de DNA e tecnologias de microarray de DNA.
Detecção do Ácido Nucléico
O requisito de sondas de DNA e/ou iniciadores queportam marcadores fluorescentes é comum aos ensaios de de-tecção de DNA e RNA. Esses são tipicamente criados por sín-tese enzimática e/ou química. Outros exemplos de ensaiosfluorescentes in vitro incluem ensaios ELISA nos quais umanticorpo é marcado com um fluoroforo. Um exemplo de um en-saio fluorescente in situ é a marcação das células integrais(vivas ou mortas) com anticorpos fluorescentemente modifica-dos, de modo que eles podem ser detectados, imageados e iso-lados, por exemplo usando um classificador de fluxo. Maisrecentemente, vêm sendo feitos esforços para utilizar a flu-orescência como uma tecnologia de detecção minimamente inva-siva em animais intactos. Essencialmente um anticorpo ou al-guma outra molécula bioativa é marcada com um composto fluo-rescente infravermelho ou perto do infravermelho e, seguin-do-se a injeção ao animal; a localização da fluorescência édetectada usando iluminação apropriada e equipamento de ima-geamento. Dessa forma, cânceres e outras doenças podem serencontrados e monitorados sem a necessidade de cirurgia ex-ploratória. Os precedentes são apenas alguns exemplos queilustram a penetração da fluorescência como uma tecnologiapara biodetecção.
Tipicamente, para a maioria desses tipos de ensai-os, existe a necessidade de se remover sonda não ligada ouanticorpo por uma etapa de lavagem para obter sinal adequadoao ruído e sensibilidade. Isso adiciona etapas ao procedi-mento do ensaio que resultam em acréscimo de tempo e custo(reagentes e possivelmente equipamento). Para ensaios de am-plificação de DNA/RNA, tais como, RT-PCR, as etapas de lava-gem não são necessárias, uma vez que o alvo é ampliado, re-duzindo efetivamente a complexidade da amostra, enquantoprovendo abundância de analisado para o ensaio. Ainda, mesmoa PCR sofre de algumas limitações. Por exemplo, o número deanalisados que podem ser detectados em um ensaio simples élimitado a quatro ou menos e o ensaio requer equipamento ca-ro e consumidor de energia, o que limita a sua aplicabilida-de ao uso no laboratório e especificamente no campo. Seriavantajoso ter-se uma tecnologia de ensaio que fosse tão sen-sível e especifica quanto a PCR, ainda fosse mais robusta eportátil. No caso de um imageamento in vivo, uma etapa delavagem "biológica" é realizada, uma vez que um período detempo é necessário seguindo-se a injeção e antes do imagea-mento, de modo a permitir que o composto bioativo encontreseu alvo e permita que o excesso de reagente seja retiradodo corpo.
Detecção da Proteína
As proteínas desempenham um papel central em mui-tas reações biológicas, que são basicamente compostas de a-ção intermolecular e reconhecimento molecular envolvendo vá-rias proteínas. Um método comum empregado na identificação edeterminação quantitativa da proteína utiliza eletroforesebidimensional e espectrometria de massa. Outro método empre-ga cromatografia de líquido e espectrometria de massa. Paraa detecção da interação e a identificação das proteínas,chips de anticorpos vêm também sendo usados, os quais sãoprovidos com vários anticorpos manchados na superfície pla-na. Métodos convencionais empregando eletroforese possuemproblemas em termos de resolução e sensibilidade de detecção.
A Publicação de Patente US número 20020064779 deLandergren e outros descreve um ensaio de ligação de proxi-midade onde duas sondas que se ligam ao alvo a ser detectadosão enzimaticamente ligadas às extremidades de dois oligonu-cleotídeos que são anexados às duas sondas de ligação. Osoligos unidos são ampliados para determinar a presença damolécula alvo. A Publicação de Pedido de Patente US número2005/0009050 de Nadeau e outros descreve o princípio seme-lhante de formação de um amplicon.
A Publicação do Pedido de Patente US número20050095627 de Kolman e outros descreve um ensaio com basena proximidade onde os dois padrões de ligação unidos aosdois oligonucleotídeos formam uma estrutura de DNA híbrida,de fita parcialmente dupla, mediante ligação a um alvo. Aestrutura de fita parcialmente dupla pode então ser estendi-da com um DNA polimerase para produzir um produto que podeser adicionalmente ampliado pela PCR.
Existe a necessidade de novas tecnologias fluores-centes e colorimétricas que se apliquem as muitas desvanta-gens inerentes aos métodos de biodetecção mencionados acima.Muitos métodos de detecção existentes requerem ampliação.
Existe também a necessidade de serem descobertos novos com-postos fluorescentes.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção se baseia, em parte, na desco-berta de que a química modelada com ácido nucléico pode seraplicada na detecção de alvos biológicos, por exemplo, áci-dos nucléicos, proteínas, autoanticorpos, células, etc. Apresente invenção se baseia, em parte, na descoberta de queos compostos fluorescentes, quimioluminescentes e cromofóri-cos e reações gerando sinais fluorescentes, quimiolumines-centes e cromofóricos podem ser sintetizados por química mo-delada com ácido nucléico. Tais métodos, compostos, reaçõesquímicas e outras composições são úteis na detecção das mo-léculas biológicas, tais como, ácidos nucléicos e proteínas.Os ensaios dessa invenção usando compostos fluorescentes,quimioluminescentes e coloridos podem ser realizados in vi-tro, in situ ou in vivo.
Em um aspecto, a presente invenção se refere a ummétodo para detectar uma seqüência nucleotídica alvo. 0 mé-todo inclui: a) provisão 1) de uma primeira sonda compreen-dendo i) uma primeira seqüência oligonucleotídica e ii) umprimeiro grupo reativo ligado à primeira seqüência de oligo-nucleotídeo e 2) uma segunda sonda compreendendo i) uma se-gunda seqüência oligonucleotídica e ii) um segundo grupo re-ativo ligado à segunda seqüência oligonucleotídica, onde aprimeira seqüência oligonucleotídica e a segunda seqüênciaoligonucleotídica são complementares às duas regiões separa-das do nucleotídeo alvo; b) combinação da primeira sonda eda segunda sonda com uma amostra a ser testada quanto a pre-sença da seqüência de nucleotídeo alvo, sob condições onde aprimeira sonda e a segunda sonda hibridizam em suas respec-tivas regiões complementares da seqüência de nucleotideo al-vo caso presente na amostra, pelo que, colocando em proximi-dade reativa o primeiro grupo reativo e o segundo grupo rea-tivo; e c) detectando uma reação entre o primeiro grupo rea-tivo e o segundo grupo reativo pelo que, determinando a pre-sença da seqüência de nucleotideo alvo.
Em outro aspecto, a invenção se refere a um métodopara detectar uma seqüência de nucleotideo alvo. 0 métodoinclui: a) provisão de um conjunto de pares de sondas cadapar de sonda compreendendo 1) uma primeira sonda compreen-dendo i) uma primeira seqüência de nucleotideo e ii) um pri-meiro grupo reativo ligado à primeira seqüência oligonucleo-tidica e 2) uma segunda sonda compreendendo i) uma segundaseqüência oligonucleotidica compreendendo i) uma segunda se-qüência oligonucleotidica e ii) um segundo grupo reativocorrespondente ligado à segunda seqüência oligonucleotidica,onde a primeira seqüência oligonucleotidica e a segunda se-qüência oligonucleotidica são complementares às duas regiõesseparadas do nucleotideo alvo; b) combinação do conjunto depares de sonda com uma amostra a ser testada quanto a pre-sença da seqüência de nucleotideo alvo, sob condições, ondecada uma dentre primeira sonda e segunda sondas dos pares desonda hibridizam na respectiva região complementar da se-qüência de nucleotideo alvo, caso presente na amostra, peloque, colocando em proximidade reativa os pares corresponden-tes dos primeiro e segundo grupos de reação; e c) detecçãode uma ou mais reações entre os pares dos primeiros gruposde reação e os segundos grupos de reação correspondentes,pelo que, determinando a presença da seqüência de nucleotí-deo alvo.
Ainda em outro aspecto, a invenção se refere a ummétodo para realizar química modelada com ácido nucléico. 0método inclui realização das reações químicas modeladas comácido nucléico múltiplas por uma seqüência de nucleotídeomodelada simples, por exemplo, sob condições substancialmen-te semelhantes e/ou substancialmente simultâneas.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um métodopara detectar um alvo biológico. O método inclui o que sesegue. Uma primeira sonda é provida. A primeira sonda in-clui: 1) uma primeira fração de ligação possuindo afinidadede ligação com relação ao alvo biológico, 2) uma primeiraseqüência oligonucleotídica, e 3) um primeiro grupo reativoassociado à primeira seqüência oligonucleotídica. Uma segun-da sonda é provida incluindo: 1) uma segunda fração de liga-ção possuindo afinidade de ligação com relação ao alvo bio-lógico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotídica, e 3) umsegundo grupo reativo associado à segunda seqüência oligonu-cleotídica. 0 segundo oligonucleotídeo é capaz de hibridizarem relação à primeira seqüência oligonucleotídica. O segundogrupo reativo é reativo com o primeiro grupo reativo quandocolocados em proximidade reativa um com o outro. A primeirae a segunda sonda são combinadas com uma amostra a ser tes-tada quanto a presença do alvo biológico sob condições ondeas primeira e segunda frações de ligação se ligam ao alvobiológico. O segundo oligonucleotídeo é deixado hibridizarem relação à primeira seqüência oligonucleotidica para colo-car em proximidade de reação os primeiro e segundo gruposreativos. Uma reação entre o primeiro e o segundo grupos re-ativos é detectada, pelo que, determinando a presença do al-vo biológico. Em uma modalidade, a reação entre o primeiro eo segundo grupo reativo produz uma fração fluorescente. Emoutra modalidade, a reação entre o primeiro e o segundo gru-pos de reação produz uma fração quimioluminescente e/ou cro-mofórica.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um métodopara detectar um alvo biológico. 0 método inclui o que sesegue. Um complexo de ligação é provido do alvo biológicocom uma primeira sonda. A primeira sonda inclui: 1) uma pri-meira fração de ligação possuindo afinidade de ligação com oalvo biológico, 2) uma primeira seqüência de oligonucleotí-deo e 3) um primeiro grupo reativo associado à primeira se-qüência oligonucleotidica. 0 complexo de ligação é contatadocom uma segunda sonda. A segunda sonda inclui: 1) uma segun-da fração de ligação possuindo afinidade de ligação com oalvo biológico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotidica e3) um segundo grupo reativo associado à segunda seqüênciaoligonucleotidica. 0 segundo oligonucleotideo é capaz de hi-bridizar com relação à primeira seqüência oligonucleotidicae o segundo grupo reativo é reativo com o primeiro grupo re-ativo, quando colocados em proximidade reativa um com o ou-tro. 0 segundo oligonucleotideo é deixado hibridizar com re-lação ao primeiro oligonucleotideo para colocar em proximi-dade reativa o primeiro e o segundo grupos de reação. Umareação é detectada entre o primeiro e o segundo grupos dereação, pelo que, para determinar se o alvo biológico estápresente na amostra.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um métodopara detectar a presença de um alvo biológico. 0 método in-clui o que se segue. Uma primeira sonda e uma segunda sondasão ligadas ao alvo. A primeira sonda inclui: 1) uma primei-ra fração de ligação possuindo afinidade de ligação com oalvo biológico, 2) uma primeira seqüência oligonucleotidica,e 3) um primeiro grupo reativo associado com a primeira se-qüência oligonucleotidica. A segunda sonda inclui: 1) umasegunda fração de ligação possuindo afinidade de ligação como alvo biológico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotidicae 3) um segundo grupo reativo associado à segunda seqüênciaoligonucleotidica. O segundo oligonucleotideo é capaz de hi-bridizar com relação à primeira seqüência oligonucleotidica.0 segundo grupo reativo é reativo com o primeiro grupo rea-tivo quando colocados em proximidade reativa um com o outro.0 segundo oligonucleotideo hibridiza com a primeira seqüên-cia oligonucleotidica, pelo que, colocando em proximidadereativa os primeiro e segundo grupos de reação. A reação en-tre os primeiro e segundo grupos reativos é detectada paradeterminar se o alvo biológico está presente na amostra. Emuma modalidade, a reação entre os primeiro e segundo gruposde reação produz uma fração fluorescente. Em outra modalida-de, a reação entre os primeiro e segundo grupos de reaçãoproduz uma fração quimioluminescente e/ou cromofórica.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um métodopara detectar a presença de um alvo biológico. 0 método in-clui o que se segue. É provida uma primeira sonda, que in-clui: 1) uma primeira fração de ligação possuindo afinidadede ligação ao alvo biológico e 2) uma primeira seqüência o-ligonucléica de código zip. É provida uma segunda sonda queinclui: 1) uma segunda fração de ligação possuindo afinidadede ligação ao alvo biológico e 2) uma segunda seqüência oli-gonucléica de código zip. A primeira sonda é hibridizada emuma primeira sonda repórter que inclui: 1) uma seqüência o-ligonucleotidica de código anti-zip de complementar a pri-meira seqüência oligonucleotidica de código zip, 2) um pri-meiro oligonucleotideo repórter, e 3) um primeiro grupo rea-tivo. A segunda sonda é hibridizada a uma segunda sonda re-pórter que inclui: 1) uma seqüência oligonucleotidica de có-digo anti-zip complementar a uma segunda seqüência de códigozip, 2) um segundo oligonucleotideo repórter, e 3) um segun-do grupo reativo. 0 segundo oligonucleotideo repórter é ca-paz de se hibridizar a uma primeira seqüência oligonucleoti-dica repórter e o segundo grupo reativo é reativo com o pri-meiro grupo reativo quando colocado em proximidade reativade um outro. A primeira e a segunda sonda são colocadas emcontato com uma amostra a ser testada quanto à presença doalvo biológico. É permitido que a primeira e a segunda sondase liguem ao alvo biológico, caso presente na amostra, pormeio do que o segundo oligonucleotideo repórter hibridiza aprimeira seqüência oligonucleotidica repórter para colocarem proximidade reativa o primeiro e o segundo grupos reati-vos. A reação entre o primeiro e o segundo grupos reativos édetectada, pelo que, para determinar se o alvo biológico es-tá presente na amostra.
É importante frisar que os métodos da invenção nãorequerem ligação enzimática ou química das primeira e segun-da seqüência oligonucleotídica.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um kitútil para detecção de um analisado biológico. 0 kit incluiuma primeira sonda que inclui: 1) uma primeira fração de li-gação possuindo afinidade de ligação ao analisado biológico,2) uma primeira seqüência oligonucleotídica, e 3) um primei-ro grupo reativo associado à primeira seqüência oligonucleo-tídica; e b) uma segunda sonda que inclui 1) uma segundafração de ligação tendo afinidade de ligação ao analisadobiológico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotídica, e 3)um segundo grupo reativo associado à segunda seqüência oli-gonucleotídica. A segunda seqüência oligonucleotídica é ca-paz de hibridizar a primeira seqüência oligonucleotídica. Osegundo grupo reativo é reativo com o primeiro grupo reativoquando colocado em proximidade reativa um com o outro.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um kitútil para detecção de um analisado biológico. O kit incluiuma primeira sonda que inclui: 1) uma primeira fração de li-gação possuindo afinidade de ligação ao alvo biológico e 2)uma primeira seqüência de código zip de oligonucleotídeo; euma segunda sonda que inclui 1) uma segunda fração de liga-ção possuindo afinidade ao alvo biológico, e 2) uma segundaseqüência oligonucleotídica de código zip. A primeira sondaé hibridizável para a primeira sonda repórter compreendendo:1) uma seqüência de código anti-zip de oligonucleotideoscomplementares para a primeira seqüência oligonucleotidicade código zip, 2) um primeiro oligonucleotideo repórter e 3)um primeiro grupo reativo. A segunda sonda é hibridizável nasegunda sonda repórter compreendendo: 1) uma seqüência oli-gonucleotidica de código anti-zip complementar à segunda se-qüência oligonucleotidica de código zip, 2) um segundo oli-gonucleotideo repórter e 3) um segundo grupo reativo. 0 se-gundo oligonucleotideo repórter é capaz de hibridizar naprimeira seqüência oligonucleotidica repórter e o segundogrupo reativo é reativo com o primeiro grupo reativo, quandocolocados em proximidade reativa um do outro.
A invenção engloba um kit que provê, uma, duas oumais sondas descritas aqui. Mais especificamente, a invençãoengloba um kit que provê uma, duas ou mais sondas que utili-zam química modelada com ácido nucléico para a geração desinais detectáveis, como um modo para detectar a presença deum alvo ou alvos biológicos, por exemplo, um ou mais ácidosnucléicos, uma ou mais proteínas, um ou mais autoanticorpos,e/ou uma ou mais células.
Os aspectos precedentes e modalidades da invençãopodem ser melhor entendidos com referência às Figuras que seseguem, descrição detalhada e reivindicações.
DEFINIÇÕES
0 termo, "química programada de DNA" ou "PDC" con-forme usado aqui, se refere à química modelada com ácido nu-cléico, por exemplo, controle específico da seqüência de re-agentes químicos para render produtos específicos realizadopor: 1) provisão de um ou mais modelos, que possuem grupo(s)reativo(s) associado (s) ; 2) contato de um ou mais grupos detransferência (reagentes) possuindo um anti-códon (por exem-plo, seqüência complementar com um ou mais modelos) e gru-po (s) reativo(s) sob condições que permitem a hibridizaçãonos modelos e 3) reação de grupos reativos para render pro-dutos. Por exemplo, em uma reação modelada com ácido nucléi-co de uma etapa, a hibridização de um oligonucleotideo "mo-delo" e um "complementar" coloca juntos grupos reativos se-guidos por uma reação química que resulta no produto desejado.
Estruturas dos reagentes e produtos não precisam ser re-lacionadas àquelas dos ácidos nucléicos compreendendo os o-ligonucleotideos modelo e de grupo de transferência. Vide,por exemplo, Publicações de Pedido de Patente US números2004/0180412 Al (USSN 10/643.752; 19 de agosto de 2003) porLiu e outros e 2003/0113738 Al (USSN 10/101.030, 19 de marçode 2002), por Liu e outros; Gartner e outros, 2004, Science,volume 305 pp. 1601-1605; Doyon e outros, 2003, JACS, volume125, páginas 12372-12373, todos os quais são expressamenteincorporados aqui como referência em sua totalidade. Videtambém, "Turn Over Probes and Use Thereof" por Coull e ou-tros, Pedido de Patente Internacional PCT PCT/US06/16999,depositado em 3 de maio de 2006.
Os termos, "ácido nucléico", "oligonucleotideo"(algumas vezes simplesmente referidos como "oligo") ou "po-linucleotídeo" ou conforme usados aqui se referem a um polí-mero de nucleotídeos. 0 polímero pode incluir, sem limita-ção, nucleotídeos naturais (isto é, adenosina, timidina,guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidi-na, desoxiguanosina e desoxicitidina), análogos de nucleosí-deo (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina,pirrol-pirimidina, 3-metil adesnosina, 5-metilcitidina, C5-bromouridina, C5-fluoridina, C5-iodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 7-deazaadenosina, 7-deazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, 0(6)-metilguanina e 2-tiocitidina), bases qui-micamente modificadas, bases biologicamente modificadas (porexemplo, bases metiladas), bases intercaladas, açúcares mo-dificados (por exemplo, 21-fluoribose, ribose, 2'-desoxiribose, arabiose e hexose) ou grupos fosfato modifica-dos (por exemplo, fosforotioatos e ligações 5'-N-fosforamidita). Ácidos nucléicos e oligonucleotideos podemtambém incluir outros polímeros de bases possuindo uma es-trutura modificada, tal como, um ácido nucléico travado(LNA), um ácido nucléico de peptídeo (PNA), um ácido nucléi-co de treose (TNA).
Através de toda a descrição, quando as composiçõesforem descritas como possuindo, incluindo ou compreendendocomponentes específicos, ou onde os processos são descritoscomo possuindo, incluindo ou compreendendo etapas de proces-so específicas, é contemplado que as composições da presenteinvenção também consistem essencialmente ou consistem noscompostos citados e que os processos da invenção também con-sistem essencialmente ou consistem nas etapas de processocitadas. Adicionalmente, deve ser entendido que a ordem dasetapas ou a ordem para realização de determinadas ações nãoé importante à medida que a invenção permaneça operável. A-lém disso, duas ou mais etapas ou ações podem ser conduzidassimultaneamente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A invenção pode ser adicionalmente entendida apartir das Figuras que se seguem, onde:
A Figura 1 é uma representação esquemática de ummétodo para detecção dos alvos de ácido nucléico de acordocom uma modalidade da invenção.
A Figura 2 é uma representação esquemática de umexemplo de detecção de genes numéricos de cópia inferior a-través da pintura do gene.
A Figura 3 é uma representação esquemática de umexemplo de detecção de alvos de ácido nucléico por um ensaiode liberação de cofator.
A Figura 4 é uma representação esquemática de ummétodo para a detecção de um alvo biológico de acordo comuma modalidade da presente invenção.
A Figura 5 é uma representação esquemática de ummétodo para a detecção de um alvo biológico de acordo comuma modalidade da presente invenção.
A Figura 6 mostra exemplos de hibridização comoafetados pela concentração, temperatura e presença ou ausên-cia de uma não combinação de par de base simples.
A Figura 7 mostra oligonucleotideos exemplares u-sados em determinados experimentos de curva de fusão.
A Figura 8 é uma representação esquemática de ummétodo para detecção de um alvo biológico de acordo com umamodalidade da presente invenção.
A Figura 9 é uma representação esquemática de ummétodo para detecção do fator de crescimento derivado deplaquetas (PDGF) de acordo com uma modalidade da presenteinvenção.
A Figura 10 mostra a modalidade exemplar de umsistema de detecção codificado zip, fragmentado, com aptâme-ros como frações de ligação alvo.
A Figura 11 mostra uma modalidade exemplar de umsistema de detecção codificado zip, fragmentado, com anti-corpos como as frações de ligação alvo.
A Figura 12 é uma representação esquemática de ummétodo para detecção de um alvo de proteína de acordo com amodalidade da presente invenção.
A Figura 13 mostra estruturas gerais de corantesde polimetina, cianinas e hemicianinas.
A Figura 14 mostra um exemplo da geração de sinalfluorescente e detecção de alvo biológico através da químicarepórter de trifenilfosfina (TPP) e azidocoumarina (AzC).
A Figura 15 mostra um exemplo da geração de sinalfluorescente e detecção de alvo biológico através da químicarepórter de TPP e AzC.
A Figura 16 mostra determinados exemplos de curvasde fusão ilustrando o efeito da concentração de oligonucleo-tídeo em Tm.
A Figura 17 mostra determinados exemplos com cur-vas de fusão de. hibridização de DNA dos oligonucleotídeosbiotinilados com e sem avidina.A Figura 18 mostra determinados exemplos de alte-rações de Tm de oligos biotinilados complementares medianteligação à avidina.
A Figura 19 mostra determinados exemplos do efeitodas concentrações de sal e magnésio mediante Tm de oligonu-cleotideos +/- biotina.
A Figura 20 mostra determinados exemplos do com-portamento da temperatura de fusão dos oligonucleotideos bi-otinilados em razões diferentes de oligonucleotideos paraavidina.
A Figura 21 mostra determinados exemplos de curvasde fusão de oligos de fita-biotina 5' e 3' (-) duplexadoscom oligo e fita biotina-51(+) na ausência e presença de a-vidina.
A Figura 22 mostra determinados exemplos de curvasde fusão de dimeros oligo biotinilados enriquecidos com ATcom e sem avidina.
A Figura 23 é uma representação esquemática de ummétodo para detecção de um alvo biológico de acordo com umamodalidade da presente invenção.
A Figura 24 mostra exemplos de resultados experi-mentais na detecção de um alvo biológico de acordo com umamodalidade da presente invenção.
As Figuras 25A e Figura 25B mostram exemplos deresultados experimentais (o efeito da formamida na misturade reação) na detecção de um alvo biológico de acordo comuma modalidade da presente invenção.
A Figura 27 mostra exemplos de resultados experi-mentais (o efeito da formamida na mistura de reação) na de-tecção de um alvo biológico de acordo com uma modalidade dapresente invenção.
A Figura 28 mostra exemplos de resultados experi-mentais (o curso de tempo das misturas de reação) na detec-ção de um alvo biológico de acordo com uma modalidade dapresente invenção.
A Figura 29 mostra exemplos de resultados experi-mentais (o curso de tempo das misturas de reação) na detec-ção de um alvo biológico de acordo com uma modalidade dapresente invenção.
A Figura 30 mostra exemplos de resultados experi-mentais (razões de sonda) na detecção de um alvo biológicode acordo com uma modalidade da presente invenção.
A Figura 31 mostra um exemplo de detecção de PDGFpor um sistema de detecção codificado zip.
A Figura 32 mostra experimentos em razões de aptâ-meros e repórteres.
A Figura 33 ilustra uma modalidade de um sistemade detecção de "uma peça" para a detecção em PDGF.
A Figura 34 mostra a modalidade exemplar de umsistema de detecção codificado zip, fragmentado, com anti-corpos como frações de ligação alvo.
A Figura 35 mostra um espectro MALDI-MS de umamistura de reação.
A Figura 36 mostra absorção e espectros de emissãofluoresceinica de uma mistura de reação.
A Figura 37 mostra absorção e espectros de emissãofluoresceinica de uma hemicianina purificada.
A Figura 38 mostra um dado de massa de electros-pray de um composto.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em seu sentido mais simples, deve ser gerado umsinal detectável através de uma reação modelada com ácidonucléico que indica a presença de um analisado alvo, por e-xemplo, um ácido nucléico ou uma proteína. Mais especifica-mente, a presente invenção provê uma abordagem excitante comrelação à geração de compostos fluorescentes, quimiolumines-centes ou cromofóricos e sinais e para utilizar sua tecnolo-gia nas aplicações de biodetecção e/ou diagnóstico. A cria-ção e detecção de um composto colorido, fluorescente ou qui-mioluminescente ou precursor devido à formação ou clivagemde uma ligação química ou a transformação química de um gru-po funcional, diretamente como o resultado de uma reaçãoquímica modelada com ácido nucléico, provê uma única tecno-logia que pode ser aplicada a muitas áreas incluindo detec-ção de agente de bioterrorismo e diagnósticos de doença.
Assim, um evento de hibridização mesmo entre son-das é realizado por uma reação química que é mediada pormoldes de DNA (oligonucleotídeos) que aumentam substancial-mente a razão de uma reação química devido ao efeito de pro-ximidade e é capaz de mediar uma variedade de reações quími-cas. Portanto, a presença de uma biomolécula alvo (por exem-plo, ácido nucléico ou proteína) conduz ao início da reaçãoquímica detectável. Como resultado, a presente invenção pro-vê facilidade de uso e sinal alto para detecção de alvo bio-lógico por ruído.
Detecção do Ácido Nucléico
A Figura 1 ilustra uma modalidade de detecção deum ácido nucléico. Duas sondas de oligonucleotídeo se ligama um DNA ou RNA alvo (um analisado, por exemplo, em uma a-mostra que se acredita contenha agentes de bioterrorismo ououtros agentes infecciosos). As duas sondas são marcadas comespécies quimicamente reativas XeY. Mediante hibridização,XeY reagem para criar um composto Z de geração de sinal(por exemplo, composto fluorescente, quimioluminescente oucolorido) Z pode ou não ligar covalentemente as duas son-das, e se não, Z pode ser ligado a cada sonda. Z pode serliberado dos oligonucleotídeos quando da sua formação.
Se o fluoroforo ou cromoforo for liberado, ele po-de ser separado do complexo de hibridização e analisado se-paradamente, ou pode ser removido uma vez que for detectado,de modo que as etapas adicionais de interrogação da amostrapodem ser conduzidas (por exemplo, rotação das sondas). Se ofluoroforo ou cromoforo não for liberado, ele pode tambémser separado do restante da mistura de reação, por exemplo,migrando como uma estrutura de fita dupla que pode ser de-composta por eletroforese de gel, por exemplo. 0 fluoroforoanexado às sondas DNA no DNA ou RNA alvo pode ser anexado auma fase sólida, tal como, a superfície de uma microesfera,deslizamento em vidro (microarray), etc. ou estar na solu-ção, quando nesse caso a reação constitui um ensaio homogêneo.
Assim, em um aspecto, a presente invenção se refe-re a um método para detectar uma seqüência nucleotídica al-vo. 0 método inclui: a) provisão de 1) uma primeira sondacompreendendo i) uma primeira sonda compreendendo i) umaprimeira seqüência oligonucleotidica e ii) um grupo reativoligado à primeira seqüência oligonucleotidica e 2) uma se-gunda sonda compreendendo i) uma segunda seqüência oligonu-cleotidica e ii) um segundo grupo reativo ligado à segundaseqüência oligonucleotidica, onde a primeira seqüência oli-gonucleotidica e a segunda seqüência oligonucleotidica sãocomplementares à duas regiões separadas do nucleotideo alvo;b) combinando a primeira sonda e a segunda sonda com uma a-mostra a ser testada quanto a presença da seqüência nucleo-tídica alvo sob condições onde a primeira sonda e a segundasonda hibridizam nas suas respectivas regiões complementaresda seqüência nucleotídica alvo, se presente na amostra, peloque, colocando em relativa proximidade o primeiro grupo rea-tivo e o segundo grupo reativo; e c) detecção da reação en-tre o primeiro grupo reativo e o segundo grupo reativo, peloque, determinando a presença da seqüência nucleotídica alvo.
A Figura 2 ilustra um exemplo de detecção de umaseqüência de ácido nucléico por detecção química permitidamodelada com ácido nucléico dos genes de número de cópiabaixo. O gene de interesse é "marcado" com um conjunto depares de sonda (por exemplo, ~400/gene) . O número de paresde sonda pode estar entre, por exemplo, 2, 5, 10 e 1.000,5.000 ou 10.000. As reações químicas entre os pares de sonda(os primeiros grupos reativos e os segundos grupos reativoscorrespondentes) podem ser idênticas através de todos os pa-res de sonda e podem ser diferentes. Os grupos diferentes depares de sondas gerando fluoroforos diferentes podem ser al-vejados contra seqüências diferentes no alvo.
A modalidade ilustrada na Figura 2 também pode seraplicada às aplicações que não a biodetecção. 0 principiodas múltiplas reações modeladas de ácido nucléico que ocor-rem no modelo de DNA simples não está limitado à geração dosinal fluorescente.
Assim, em outro aspecto, a invenção se refere a ummétodo para detecção de uma seqüência nucleotidica alvo. 0método inclui: a) provisão de um conjunto de pares de sonda,cada par de sonda compreendendo 1) primeira sonda compreen-dendo i) uma primeira seqüência de nucleotideo e ii) um pri-meiro grupo reativo ligado à primeira seqüência oligonucleo-tidica, e 2) uma segunda sonda compreendendo i) uma segundaseqüência oligonucleotidica e ii) um segundo grupo reativocorrespondente ligado à segunda seqüência oligonucleotidica,onde a primeira seqüência oligonucleotidica e a segunda se-qüência oligonucleotidica são complementares às duas regiõesseparadas do nucleotideo alvo; b) combinação do conjunto depares de sonda com uma amostra a ser testada quanto a pre-sença da seqüência nucleotidica alvo em condições onde cadauma as primeiras sondas e segundas sondas do par de sondashibridizam em sua respectiva região complementar da seqüên-cia nucleotidica alvo, caso presente na amostra, pelo que,colocado em proximidade reativa os pares correspondentes dosprimeiro e segundo grupos reativos; e c) detecção de uma oumais reações entre os pares dos primeiros grupos reativos edos segundos grupos reativos correspondentes, pelo que, de-terminando a presença da seqüência nucleotidica alvo.
A Figura 3 ilustra um exemplo de outra modalidadeonde um esquema de detecção indireta envolve a reação mode-lada com ácido nucléico seguida por uma liberação de co-fator e uma reação subsequente detectável.
Detecção da Proteína
A Figura 4 e a Figura 5 ilustram uma modalidade dainvenção para a detecção de uma proteína alvo.
A Figura 4 mostra uma modalidade de detecção deuma proteína alvo pela presente invenção. Duas sondas contêmfrações de ligação alvo, oligonucleotídeos complementares, eespécies quimicamente reativas XeY, respectivamente. Medi-ante hibridização, XeY reagem para criar um composto degeração de sinal (por exemplo, fluorescente), que pode ounão ligar covalentemente ambas as sondas. 0 produto de rea-ção de X e Y pode também ser liberado como um composto solú-vel, não ligado na solução. A proteína alvo pode ser anexadaa uma fase sólida, tal como, a superfície de uma microesfe-ra, deslizamento por vidro (microarray), etc. ou estar nasolução. As frações de ligação alvo podem ser aptâmeros, an-ticorpos, fragmentos de anticorpo (isto é, Fab), proteínasreceptoras ou moléculas pequenas, por exemplo.
A Figura 5 ilustra, mais especificamente, um exem-plo de uma abordagem de sonda dupla com duas sondas, cadauma portando um precursor "pref luoroforo" (F1 e F2) e con-tendo uma fração de ligação a um alvo e uma seqüência oligo-nucleotídica que é projetada para recombinar uma com a ou-tra. Nessa modalidade, a detecção é realizada sob condições,tais que, os oligos de prefluorfIoro não recombinam um a ou-tro na ausência de um alvo. Essas condições são geralmenteselecionadas, tal que, a temperatura ambiente é maior que aTm dos pares oligonucleotidicos na ausência do alvo (de modoque os pares oligo não recombinarão na ausência do analisadoalvo destinado). Na presença do alvo pretendido, contudo, aalta concentração localizada dos oligos então comuta a Tm deseu complexo de fita dupla a montante, de modo que a hibri-dização ocorra, que é seguido por uma reação modelada comácido nucléico de geração de sinal (uma reação entre Fl e F2).
A reação modelada com ácido nucléico de geração de si-nal é acelerada devido a concentração maior localizada dosprefluoroforos, porém pode também ser facilitada pela proxi-midade e orientação dos grupos prefluoroforo um na direçãodo outro. Essa conFiguração de geração de sinal tem o poten-cial de permitir a criação de kits para a detecção de váriasbiomoléculas, células, superfícies e para o projeto dos en-saios in situ. A geração de sinal não requer enzimas e oformato homogêneo não requer manipulação da amostra.
A Figura 5 mostra dois oligonucleotídeos, cada umsendo ligado através de um braço espaçador opcional a um Ii-gante separado, conforme mostrado nesse caso sendo um anti-corpo, porém podendo ser outros ligantes, tais como, aptâme-ros ou moléculas pequenas. Cada anticorpo reconhece um epí-topo separado em um analisado alvo comum, tal como, proteí-na. Os braços espaçadores podem ser adicionados a um ou am-bos os oligonucleotídeos entre o oligo e o ligante. Em de-terminados casos, esse braço espaçador pode ser necessáriopara satisfazer os requisitos de proximidade de modo a obteruma reatividade desejada. Os braços espaçadores em princi-pio, podem ser quaisquer grupos apropriados, por exemplo,grupos de cadeias de carbono alifático lineares ou ramifica-dos C3 a C5, CIO, C15, C20, C25, C30, C35, C40 ou C100, umaseqüência de DNA de 1 a 10, 15, 20, 30, 50 ou 100 bases decomprimento ou oligômeros de polietileno glicol de compri-mento apropriado.
Os prefluoroforos podem residir em uma conFigura-ção de "extremidade da hélice" (Figura 5, superior), um ane-xado à extremidade 5' de um oligo e outro anexado à extremi-dade 3'. (Outras conFiguraçÕes podem ser aplicadas incluindocolocação de dois prefluoroforos dentro da seqüência ou comum oligo hibridizando em relação à estrutura de grampo par-cial (por exemplo, de 100 Angstroms de comprimento) , por e-xemplo). No primeiro exemplo, um oligonucleotideo é anexadoem 5' a um braço espaçador e um ligante alvo, e o outro ane-xado em 3' a um braço espaçador e ligante alvo separado. Osbraços espaçadores, que podem consistir em seqüências de DNAnão complementares ou braços espaçadores sintéticos, taiscomo, oligômeros de etileno glicol, podem ser adicionadospara satisfazer requisitos de proximidade. Tais braços espa-çadores podem ser muito flexíveis, o que possui a vantagemde superar qualquer impedimento estérico à ligação que possaocorrer com um espaçador rígido. Um braço espaçador de com-primento adequado pode permitir que ambos os oligonucleotí-deos sejam ligados em 5' aos seus ligantes (Figura 5 inferi-or) ou ambos ligados em 3' , à medida que os oligonucleoti-deos possam recombinar na conFiguração antiparalela e permi-tir que os grupos reativos reajam um com o outro. Um compri-mento de braço espaçador ótimo pode ser designado para cadaalvo. Os braços espaçadores que são excessivamente longosseriam evitados, uma vez que eles podem reduzir a especifi-cidade no sistema ou um efeito reduzido de Tm aumentada.
O efeito de proximidade fornecido por aprisiona-mento do par de oligonucleotideos pode afetar a cinética derecombinação de duas seqüências oligonucleotidicas comple-mentares em comparação aos dois oligonucleotideos livres nasolução. De forma mais importante, uma concentração locali-zada alta comuta a curva de fusão a montante, em comparaçãoao complexo livre, isto é, aumento da Tm do complexo. Em umasolução em volume, é conhecido que a Tm depende da concen-tração de oligonucleotideo total, conforme ilustrado na e-quação a seguir. Wetmur, Criti. Rev. In Biochem. and Mol.Biol. 26, 227-259 (1991).
Tm = (1000* ΔΗ) / (A + AS + R In (Ct/4)-273, 15 + 16, 6 Iog Na+)
onde ΔΗ e AS são a entalpia e entropia para forma-ção da hélice, R é a constante de gás molar, Ct é a concen-tração total de oligômeros, e Na+ é a concentração molar deion sódio na solução.
A Figura 6 mostra a inclinação de Tm versus a con-centração dentro da faixa de oligonucleotideos curtos em 0,1M de sal possuindo uma dependência de cerca de +70C por au-mento de dez vezes na concentração de oligonucleotideos (se-qüências na Figura 7) com base na equação acima. Assim, porexemplo, um aumento de 1.000 vezes na concentração local se-ria esperado que elevasse a Tm para cerca de +21°C.
Produtos de reação de Fl e F2 podem ser liberadosdo complexo de hibridização como resultado da transformaçãoquímica. Assim, o fluoroforo ou cromoforo pode ser separadodo complexo de hibridização e analisado independentemente ouo fluoroforo ou cromoforo e os oligonucleotídeos recombina-dos podem ser removidos uma vez detectados, de modo que eta-pas adicionais de interrogação da amostra possam ser condu-zidas. A reação entre Fl e F2 ode ou não ligar covalentemen-te as duas sondas, uma vez que o(s) produto(s) é(são) formado (s).
Assim, em um aspecto, a invenção provê um métodopara detectar um alvo biológico. 0 método inclui o que sesegue. Uma primeira sonda é provida. A primeira sonda in-clui: 1) uma primeira fração de ligação possuindo afinidadede ligação com o alvo biológico, 2) uma primeira seqüênciade oligonucleotideo e 3) um primeiro grupo reativo associadoà primeira seqüência oligonucleotidica. A segunda sonda éprovida incluindo: 1) uma segunda fração de ligação possuin-do afinidade de ligação ao alvo biológico, 2) uma segundaseqüência de oligonucleotideo, e 3) um segundo grupo reativoassociado à seqüência oligonucleotidica. 0 segundo oligonu-cleotideo é capaz de hibridizar para formar a primeira se-qüência de oligonucleotideo. 0 segundo grupo reativo é rea-tivo em relação ao primeiro grupo reativo quando colocado emproximidade de reação um com o outro. A primeira e a segundasonda são combinadas com uma amostra a ser testada, quanto apresença do alvo biológico sob condições onde as primeira esegunda frações de ligação se ligam ao alvo biológico. 0 se-gundo oligonucleotideo é deixado hibridizar na primeira se-qüência oligonucleotidica para colocar em proximidade reati-va os primeiro e segundo grupos reativos. Uma reação entre oprimeiro e o segundo grupos reativos é detectada, pelo que,determinando a presença do alvo biológico. Em uma modalida-de, a reação entre o primeiro grupo e o segundo grupo reati-vos produz uma fração fluorescente. Em outra modalidade, areação entre o primeiro e o segundo grupos reativos produzuma fração quimioluminescente e/ou cromofórica.
Em outro aspecto, a invenção provê um método paradetectar um alvo biológico. 0 método inclui o que se segue.Um complexo de ligação é provido do alvo biológico com umaprimeira sonda. A primeira sonda inclui: 1) uma primeirafração de ligação possuindo afinidade de ligação com o alvobiológico, 2) uma primeira seqüência de oligonucleotideo e3) um primeiro grupo reativo associado à primeira seqüênciaoligonucleotidica. O complexo de ligação é contatado com umasegunda sonda. A segunda sonda inclui: 1) uma segunda fraçãode ligação possuindo afinidade de ligação com o alvo bioló-gico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotidica e 3) um se-gundo grupo reativo associado à segunda seqüência oligonu-cleotidica. 0 segundo oligonucleotideo é capaz de hibridizarna primeira seqüência de oligonucleotideo e o segundo gruporeativo é reativo com relação ao primeiro grupo reativoquando colocado em proximidade reativa um com o outro. O se-gundo oligonucleotideo é deixado hibridizar no primeiro oli-gonucleotideo para colocar em proximidade reativa o primeiroe o segundo grupos reativos. Uma reação é detectada entre oprimeiro e o segundo grupos reativos, pelo que, para deter-minar se o alvo biológico está presente na amostra.
Ainda em outro aspecto, a invenção provê um métodopara detectar a presença de um alvo biológico. 0 método in-clui o que se segue. A primeira e a segunda sonda são liga-das ao alvo. A primeira sonda inclui: 1) uma primeira fraçãode ligação possuindo afinidade de ligação com o alvo bioló-gico, 2) uma primeira seqüência oligonucleotidica, e 3) umprimeiro grupo reativo associado à primeira seqüência oligo-nucleotidica. A segunda sonda inclui: 1) uma segunda fraçãode ligação possuindo afinidade de ligação com o alvo bioló-gico, 2) uma segunda seqüência oligonucleotidica e 3) um se-gundo grupo reativo associado à segunda seqüência oligonu-cleotidica. 0 segundo oligonucleotideo é capaz de hibridizarna primeira seqüência de oligonucleotideo. 0 segundo gruporeativo é reativo em relação ao primeiro grupo reativo quan-do colocado em proximidade de reação um com o outro. O se-gundo oligonucleotideo é deixado hibridizar em relação àprimeira seqüência oligonucleotidica, pelo que, colocando emproximidade reativa o primeiro e o segundo grupos reativos.
Uma reação entre o primeiro e o segundo grupos reativos édetectada para determinar se o alvo biológico está presentena amostra. Em uma modalidade, a reação entre o primeiro e osegundo grupos reativos produz uma fração fluorescente. Emoutra modalidade, a reação entre o primeiro e o segundo gru-po reativo produz uma fração quimioluminescente e/ou cromo-fórica.
A Figura 8 ilustra outra modalidade da invenção,que emprega uma arquitetura fendiad "codificada zip" parabiodetecção à base de molde com ácido nucléico. Nessa moda-lidade, ao invés das frações de ligação alvo serem direta-mente ligadas (opcionalmente através dos grupos espaçadores)aos oligonucleotideos complementares que hibridizam e esta-belecem as reações modeladas com ácido nucléico, as fraçõesde ligação alvo são ligadas a uma seqüência oligonucleotidi-ca de "código zip". Cada um dos oligonucleotideos repórtercorrespondentes possui uma seqüência de "código anti-zip"complementar (além da seqüência "repórter" que estabelece areação modelada com ácido nucléico). As reações químicas mo-deladas com ácido nucléico são estabelecidas por hibridiza-ção dos oligos alvos, que são ligados aos grupos reativosque reagem e geram sinais detectáveis. É importante que cadaseqüência oligonucleotídica das sondas seja complementar a-penas ao seu parceiro de hibridização pretendido e não com-plementar a outros oligonucleotideos no sistema de detecção.
A arquitetura codificada zip sustenta a criação deum conjugado de oligonucleotídeo-repórter simples que seriamontado com oligonucleotideos repórter através de uma se-qüência de código anti-zip. As bibliotecas de repórteres di-ferentes ligados a um único código anti-zip podem ser testa-das simplesmente por mistura de cada com quantidades este-quiométricas do conjugado de oligonucleotídeo de código zipdo ligante com seu código zip complementar.
A Figura 9 é uma ilustração de uma abordagem dearquitetura fendida codificada zip, onde as frações de liga-ção alvo são dois aptâmeros. Nesse exemplo para detecção dofator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF) com seqüên-cias de oligo ilustrativas e química de repórter (por exem-pio, trifenilfosfina, TPP, 7-azidocoumarina, AzC), os oligo-nucleotídeos repórter TPP se agrupam no oligonucleotideo ap-tâmero PDGF através da hibridização da seqüência de códigozip (NNN . . . ) na seqüência de código anti-zip complementar(N1,N1,N' ...) no oligonucleotídeo repórter de TPP. 0 oligo-nucleotídeo repórter termina com a seqüência repórter de ba-se 10 exemplar e um grupo 5'-TPP. Um segundo par de oligonu-cleotídeos, com códigos zip diferentes e códigos anti-zip(complementares a cada outro emparelhamento), também se a-grupam para prover a seqüência repórter AzC e um grupo 3'-AzC. Os oligonucleotideos AzC são complementares e antipara-lelos aos oligonucleotídeos TPP, de modo que os grupos TPP eAzC terminam extremidade-a-extremidade quando os oligonucle-otídeos TPP e AzC recombinam um com o outro.
A Figura 10 ilustra em mais detalhes a abordagemde arquitetura fendida codificada zip para detecção de PDGFcom seqüências oligo ilustrativas e química de repórter (TPPe AzC). Os pares de TTP incluem primeiro, um aptâmero dePDGF na extremidade 5', um espaçador com base em Cl8 polie-tileno glicol e uma seqüência de código zip de 18-mer. A se-qüência repórter TPP inclui uma seqüência de código anti-zipcomplementar em seu término 3!, um espaçador C18 PEG e umaseqüência repórter de dez pares de base terminando em umgrupo 5' TPP. O par AzC dos oligonucleotídeos inclui um 3'-aptâmero ligado através de um espaçador C18 PEG a um códigozip separado, e uma detecção de oligonucleotídeo ligada a umcódigo anti-zip 5', um espaçador C18 PEG e um oligonucleotí-deo repórter (complementar ao oligonucleotídeo TPP) termi-nando em um grupo 3' AzC.
A Figura 11 ilustra um exemplo da arquitetura cor-respondente, onde os anticorpos são empregados ao invés doaptâmeros como frações de ligação alvo.
Uma vantagem da abordagem "codificada zip" é a ca-pacidade de criar os oligonucleotídeos repórter separadamen-te e ter os mesmos agrupados com ligantes sob condições quemantém as atividades de ambos os ligantes e da química ati-vada modelada com ácido nucléico.
0 sistema codificado baseia-se em dois pares deoligonucleotídeos, onde cada par é mantido junto pelo empa-relhamento de base de um único código zip e um par de códigoanti-zip. "Códigos zip" são seqüências oligonucleotídicasque se ligam especificamente às suas seqüências complementa-res, e preferivelmente são designadas tal que não sejam com-plementares às seqüências genômicas conhecidas (relevante sea amostra puder conter DNA genômico), possuem valores de Tmsemelhantes, não possuem estrutura secundária significativae não recombinam em outras seqüências de código zip ou códi-go anti-zip no sistema de detecção.
Assim, outro aspecto da invenção provê um métodopara detecção da presença de um alvo biológico. 0 método in-clui o que se segue. É provida uma primeira sonda que in-clui: 1) uma primeira fração de ligação possuindo afinidadede ligação ao alvo biológico e 2) uma seqüência de códigozip de oligonucleotideo. É provida uma segunda sonda que in-clui: 1) uma segunda fração de ligação possuindo afinidadede ligação com o alvo biológico e 2) uma segunda seqüênciade código zip de nucleotideo. A primeira sonda é hibridizadaem uma primeira sonda repórter que inclui: 1) uma seqüênciade código anti-zip de oligonucleotideos complementar à pri-meira seqüência de código zip de oligonucleotideo, 2) umprimeiro oligonucleotideo repórter, e 3) um primeiro gruporeativo. A segunda sonda é hibridizada em uma segunda sondarepórter que inclui: 1) uma seqüência de código anti-zip deoligonucleotideos complementar à segunda seqüência de códigozip de oligonucleotideo, 2) um segundo oligonucleotideo re-pórter e 3) um segundo grupo reativo. 0 segundo oligonucleo-tideo repórter é capaz de hibridizar em relação à primeiraseqüência de oligonucleotideo repórter e o segundo grupo re-ativo é reativo em relação ao primeiro grupo reativo, quandocolocados em proximidade um com o outro. A primeira e a se-gunda sonda são contatadas com uma amostra a ser testadaquanto a presença do alvo biológico. A primeira e a segundasonda se ligam ao alvo biológico, se presente na amostra,pelo que, o segundo oligonucleotideo repórter hibridiza emrelação a primeira seqüência de oligonucleotideo repórterpara colocar em proximidade reativa o primeiro e o segundogrupos reativos. Uma reação entre o primeiro e o segundogrupos reativos é detectada, pelo que, para determinar se oalvo biológico está presente na amostra.
É importante ressaltar que os métodos da invençãonão requerem ligação enzimática ou química da primeira e/ousegunda seqüências oligonucleotídicas.
Fatores que podem ser considerados na otimizaçãode um projeto de uma arquitetura codificada zip incluem, porexemplo: 1) grupos espaçadores (por exemplo, oligonucleotí-deos e/ou grupos diferentes de base) entre o aptâme-ro/anticorpo e códigos zip (espaçador 1), por exemplo, parapermitir que os parceiros de hibridização alcancem um ao ou-tro, para impedir qualquer impedimento estérico; 2) compri-mento de uma seqüência de código zip a fim de formar uma re-combinação suficientemente estável em relação à seqüência decódigo anti-zip para formar o complexo; e 3) grupos espaça-dores (espaçador 2) entre o código anti-zip e a seqüênciarepórter, por exemplo, para prevenir qualquer impedimentoestérico.
Os ligantes (frações de ligação do alvo) anexadosaos oligonucleotídeos podem ser frações químicas que se li-gam especificamente a uma molécula alvo e permitem que oprojeto da invenção funcione. Exemplos incluem uma ampla va-riedade de funcionalidades, tais como: 1) anticorpos: exem-plo, IgG, IgM, IgA, IgE, Fab's, Fab', F(ab)2, Dab, Fv oufragmentos ScFv; 2) ligantes de molécula pequena, tais comoinibidores, medicamentos, co-fatores; 3) receptores para de-tecção de proteína e vice-versa; 4) aptâmeros de DNA, RNA,PNA; 5) seqüências de DNA para ligação de DNA e proteínasreguladoras; 6) peptídeos representando motivos de ligaçãode proteína; 7) peptídeos descobertos através da mostra defago, síntese aleatória, mutagênese; 8) pares de proteína deligação natural e complexos; 9) antigenos (para detecção deanticorpo); e 10) um anticorpo policlonal simples anexadoseparadamente aos dois oligonucleotideos pode servir comodois ligantes separados de especificidade diferente.
As frações de ligação do alvo anexadas aos oligo-nucleotideos podem ser dos tipos heterogêneos direcionadoscontra sítios diferentes dentro do mesmo alvo. Por exemplo,os dois ligantes podem ser de dois anticorpos diferentes, umanticorpo e um receptor, um anticorpo e um ligante de molé-cuia pequena, um receptor e um peptídeo, um aptâmero e umco-fator ou qualquer outra combinação.
Os analisados alvo podem ser de qualquer tipo,contanto que suportem dois (ou mais) sítios de ligação. Osdois sítios de ligação podem ser idênticos ou não idênticos.No caso de sítios idênticos, os benefícios de especificidadeaumentada obtidos com dois ligantes não idênticos não serãoobtidos. As moléculas que existem em equilíbrio com uma for-ma monomérica e uma homodimérica ou fase de polimerizaçãosuperior podem ser detectadas por um par de sondas contendoo mesmo ligante, porém seqüências de DNA complementar dife-rentes. Alvos apropriados incluem proteínas, superfícies decélulas, anticorpos, antigenos, vírus, bactérias, superfí-cies orgânicas, membranas, organelas, análise in situ dascélulas fixas, complexos de proteína. A invenção pode serespecificamente apropriada para a detecção de proteínas defusão (por exemplo, BCR-ABL na presença de BCR e ABL) .
A Figura 12 mostra uma modalidade de como um en-saio de ligação de proteína ou molécula pequena pode ser re-portado usando a sintese de um fluoroforo ou cromoforo atra-vés de química modelada com ácido nucléico. Nesse exemplo,os ligantes de proteína, tais como, aptâmeros, um anticorpo,ou ligante de molécula pequena, representados por um pentá-gono são conjugados a um oligonucleotídeo (um "modelo") pos-suindo um grupo reativo X em seu término. A amostra é mistu-rada com modelo de ligante e se o analisado de interesse es-tiver presente (representado por um círculo), será formadoum complexo. Modelo de ligante em excesso é removido e umasonda portando um grupo reativo Y e um oligonucleotídeo com-plementar ao modelo acima é adicionado. A hibridização dosoligonucleotídeos estabelece uma reação entre XeY, criandouma molécula de sinal detectável (por exemplo, fluoroforo oucromoforo).
A molécula de sinal (representada por uma estrela)pode permanecer anexada ao híbrido de modelo-sonda ou podeser liberada do complexo. 0 analisado pode ser anexado a umafase sólida ou pode estar livre na solução, à medida que oexcesso de modelo-ligante seja removido antes da adição dasonda portando Y.
Uma vez que o modelo e a sonda codificam unicamen-te a síntese do repórter, e muitos repórteres diferentes po-dem ser previstos, um sistema multiplexo pode ser designado.
Por exemplo, uma faixa de fluoroforos com emissão espaçada(por exemplo, espaçada proporcionalmente) pode ser criada,permitindo que dois, três, quatro, cinco ou mais analisadossejam detectados simultaneamente. Além disso, um sistema po-de ser projetado, onde ambos os compostos fluorescente e co-lorido são criados simultaneamente.
No projeto das sondas, uma consideração é a Tm dasduas seqüências repórter transportando os grupos reativos.Uma vez que a Tm do duplexo estaria abaixo da temperaturaambiente, na ausência de um alvo, essa seqüência normalmenteseria curta, por exemplo, de 6-15 bases e/ou rica em A-T. Ocomprimento do repórter típico de 10 pares de base pode teruma Tm de cerca de 300C em uma concentração baixa de sal.Portanto, é freqüentemente necessário mesmo com uma seqüên-cia curta adicionar a 10% a 40% de formamida volume/volumepara adicionalmente abaixar a temperatura para menos da tem-peratura do ensaio ou para elevar a temperatura do ensaio.Oligonucleotideos repórter muito curtos podem sofrer da fal-ta de especificidade e exibem alguma ligação à seqüências decódigo zip (quando essas são empregadas) o que é indesejável.
Outro fator no projeto das sondas é o comprimentodo oligonucleotídeo entre a fração de ligação e a seqüênciarepórter, incluindo quaisquer seqüências de código zip. Es-sas devem ser longas o suficiente para que os oligonucleotí-deos repórter alcancem um ao outro e recombinem. As seqüên-cias podem ser entremeadas com ligantes de polietileno gli-col (PEG) que são flexíveis e podem fornecer proteção adi-cional contra qualquer impedimento estérico. Por exemplo,comprimentos totais dos oligonucleotídeos podem se ao redorde 35 bases de comprimento. Os oligonucleotídeos contendo 0,1 ou 2 espaçadores C18 PEG ou traços de homopolímero podemtambém ser utilizados (isto é, Ci0).Uma terceira consideração é o comprimento das se-qüências zip e anti-zip quando essas forem empregadas (istoé, Figura 9 e Figura 34) . Fora a necessidade de cada códigozip recombinar apenas em seu código anti-zip, e não qualqueroutro código zip, código anti-zip ou seqüência repórter, umparâmetro importante é a Tm do duplexo entre os códigos zipe códigos anti-zip. A Tm seria substancialmente maior que atemperatura mais alta que será usada no ensaio, de modo queos oligonucleotideos repórter permaneçam firmemente anexadosà fração de ligação. Na prática, os códigos zip de cerca deduas vezes o comprimento das seqüências repórter (isto é,comprimento total de 15-30 bases) são desejáveis e geralmen-te satisfazem esses critérios.
Com relação à geração de sinal, a química modeladacom ácido nucléico pode ser empregada para criar ou destruiruma marcação que afeta um sinal óptico, por exemplo, criandoou destruindo uma molécula fluorescente, quimioluminescenteou colorimétrica. Adicionalmente, uma reação de detecção po-de ser projetada para criar ou destruir um produto que dire-ta ou indiretamente cria uma marca detectável, por exemplo,um produto que catalisa uma reação que cria uma marcação óp-tica; inibe uma reação que cria uma marcação óptica; é umsaturador fluoresceínico; é uma molécula de transferência deenergia fluorescente; cria uma marca Ramen; cria uma marcaeletroquimioluminescente (isto é, rutênio bipiridila) ; pro-duz uma molécula de marcação de rotação do elétron.
Adicionalmente, uma reação de detecção pode serprojetada para envolver uma detecção "isenta de marca". Aquímica modelada com ácido nucléico pode ser usada para cri-ar ou destruir uma molécula discernível por uma propriedadenativa inerente da molécula, por exemplo, um produto quecria marca de difusão de luz ou agregação; é detectável pormicrocalorimetria; é detectável (por exemplo, um epítopo)por ressonância de plasmônio de superfície (isto é, ligaçãoa um anticorpo imobilizado); criação ou destruição de um e-pítopo reconhecido por um anticorpo (isto é, ELISA); commassa discernível, medida por espectrometria de massa; detamanho alterado, discernível por difusão da luz, eletrofo-rese de gel ou cromatografia de exclusão por tamanho; de hi-drofobicidade alterada ou teor iônico discernido por croma-tografia; separação de cromatografia de afinidade para afi-nidade alterada.
Outro aspecto da invenção provê um kit útil paradetecção de um analisado biológico. 0 kit inclui uma primei-ra sonda que inclui: 1) uma primeira fração de ligação pos-suindo afinidade de ligação para o analisado biológico, 2)uma primeira seqüência oligonucleotídica, e 3) um primeirogrupo de reação associado à primeira seqüência de oligonu-cleotídeo, e uma segunda sonda que inclui: 1) uma segundafração de ligação possuindo afinidade de ligação com o ana-lisado biológico, 2) uma segunda seqüência nucleotídica e 3)um segundo grupo reativo associado à segunda seqüência oli-gonucleotídica. 0 segundo nucleotídeo é capaz de hibridizarcom a primeira seqüência de oligonucleotídeo. 0 segundo gru-po reativo é reativo com o primeiro grupo reativo, quandocolocado em proximidade reativa um com o outro.Ainda em outro aspecto, a invenção provê um kitútil para detecção de um analisado biológico. 0 kit incluiuma primeira sonda que inclui: 1) uma primeira fração de li-gação possuindo afinidade de ligação com o alvo biológico, e2) uma primeira seqüência oligonucleotidica de código zip; euma segunda sonda que inclui 2) uma segunda fração de liga-ção possuindo afinidade de ligação ao alvo biológico e 2)segunda seqüência oligonucleotidica de código zip. A primei-ra sonda é hibridizável com uma primeira sonda repórter com-preendendo: 1) uma seqüência de código anti-zip de oligonu-cleotídeos complementares em relação à primeira seqüênciaoligonucleotidica de código zip, 2) um primeiro oligonucleo-tideo repórter, e 3) um primeiro grupo reativo. A segundasonda é hibridizável em relação a segunda sonda repórtercompreendendo 1) uma seqüência oligonucleotidica de códigoanti-zip complementar à seqüência oligonucleotidica de códi-go zip, um segundo oligonucleotideo repórter e 3) um segundogrupo reativo. O segundo oligonucleotideo repórter é capazde hibridizar na primeira seqüência de nucleotideo repórtere o segundo grupo reativo é reativo no primeiro grupo reati-vo quando colocado em proximidade reativa um do outro.
A invenção engloba um kit que provê uma, duas oumais sondas descritas aqui. Mais especificamente, a invençãoengloba um kit que fornece uma, duas, ou mais sondas que u-tilizam química modelada com ácido nucléico para a geraçãode sinais detectáveis como um modo de detectar a presença deum alvo biológico (por exemplo, ácido nucléico e proteínas).
Químicas RepórterCoumarinas
As coumarinas podem ser usadas na química repór-ter, especificamente coumarinas portando substituintes doa-dores de elétron na posição 7. O esquema abaixo ilustra comoa redução de uma 7-azidocoumarina (conhecida como sendo nãofluorescente) no derivado 7-amido (fluorescente) pode serrealizada usando química modelada com ácido nucléico.
<formula>formula see original document page 42</formula>
Seguindo com o uso de fosfinas para reduzir azidasem aminas, pode-se reagir a amina resultante com um reagentelivre (não anexado ao DNA) para formar um derivado de aminafluorescente. Um primeiro exemplo é fluorescamina que é in-trinsecamente não fluorescente, porém produz um produto flu-orescente verde azulado quando da reação com uma amina pri-mária ou secundária.<formula>formula see original document page 43</formula>
Derivados de Isoindol
A reação ou aprisionamento de dois grupos funcio-nais que estão em proximidade estreita com um reagente dederivatização também pode ser utilizada. Esses dois gruposfuncionais podem estar em dois oligos diferentes e serem co-locados juntos pelo evento de hibridização ou eles podem es-tar ambos em um primeiro oligo, pelo que, um segundo oligo éusado para desmascarar ou transformar um ou mais dos gruposem uma espécie que pode ser derivatizada. Isto é ilustrado aseguir para a formação de isoindóis de o-dialdeidos e ceto-nas que são geralmente usados como reagentes de detecção deamina. 0 limite de detecção para aminas derivatizadas 3 —(4 —carboxibenzoil)quinolina-2-carboxaldeido (CBQCA) é reportadocomo estando na faixa de attomol.<formula>formula see original document page 44</formula>
Criação de fluorescâncla por formação de derivados de Isolndol
Química Repórter de Corante PolimetinaO corante polimetina é caracterizado por uma cor-rente de grupos metina (-CH=) com um doador de elétron e umaceitador de elétron em extremidades opostas de sua cadeiade polieno (Figura 13, Zollinger, Color Chemistry: Synthe-ses, Properties and Applications of Organic Dyes and Pig-ments, 3a Edição, Verlag Helvetica Chimica Acta, Postfach,Suíça, 2003) . Terminais típicos AeD para corantes de poli-metina (conforme mostrado na Figura 13) incluem tiazóis, pi-razóis, pirrolinas, indóis, 1,3,3-trimetilindolinas, tetra-zóis, pirimidina, piridinas, quinolinas e heterociclos Nfundidos superiores ou quaisquer anéis benzila substituídos.Se os terminais forem ambos heterociclos contendo átomo Ν, ocomposto é denominado cianina. Se apenas um átomo N fizerparte do sistema do anel, o composto é denominado hemiciani-na. Alterando-se o número do grupo vinila na cadeia de poli-eno, o comprimento de onda de emissão fluoresceínica do co-rante polimetina pode ser sintonizado para perto do ultravi-oleta ou perto do infravermelho. O grupo terminal também po-de prover meios para sintonização mais fina.
Os corantes polimetina são geralmente sintetizadospor substituições nucleófilas e/ou eletrófilas, precedido ouseguido por desprotonação (Raue, Ullmann1S Encyclopedia ofIndustrial Chemistry, 5a edição, UCH, Weinheim 1990, volumeA16, p487). 0 esquema 1 a seguir é um exemplo de uma síntesede corante cianina assimétrico. Sal quaternário heterocicli-co de 2-metila reage com um equivalente do reagente de aco-plamento eletrófilo difenilformamidina para formar amidinaou hemicianina. A adição nucleófila escalonada do segundosal quaternário heterocíclico conduz ao corante de cianinaassimétrico. Hemicianina acilada N pode reagir com segundoheterociclo na fase sólida sob condição relativamente branda(Mason, e outros, J. Org. Chem. 2005, 70, 2939-2949).
Esquema 1: Rota sintética geral para corante decianina assimétrica
<formula>formula see original document page 45</formula>
Esquema 2: Geração de corante polimetina atravésde reação de Wittig e condensação de aldol
<formula>formula see original document page 45</formula><formula>formula see original document page 46</formula>
A = aceitador, D = doador
A condensação do aldol vem sendo freqüentementeusada para sintetizar corantes hemicianina (Hassner, e ou-tros, J. Org. Chem. 1984, 49, 2546-2551; Jedrzejewska, eoutros, Dyes and Pigments 2003, 58, 47-58; Sczepan, eoutros, Photochem. Photobiol. Sei. 2003, 2, 1264-1271). A-qui, o componente de hidrogênio ativo é um sal quaternárioembora o componente carbonila possua um substituinte aminono anel aromático. Esse tipo de condensação de aldol é ge-ralmente realizado sob condição de refluxo no álcool anidrocom quantidade catalitica de base, contudo, a condição aquo-sa foi também tentada para alguns aldeidos ativos (soluçãodiluída de carbonato de potássio, pH 8, 70°C, 24 horas; re-ferência: Wang, e outros, Dyes and Pigments 2003, 59, 163-172).
Quando se escolhe aldeído e sal quaternário por-tando hidrogênio ativo com atividades químicas otimizadas, acondensação do aldol pode ser usada para a síntese do coran-te polimetina sob condições de reação modelada com ácido nu-cléico. O aldeído conjugado com DNA e o sal quaternário por-tando hidrogênio ativo podem ser utilizados nos sistemas dedetecção da presente invenção. A abordagem geral descritaaqui pode também ser usada para anexar esses precursores aosoutros biopolímeros, tais como, açúcares, peptideos e prote-ínas. 0 método geral para síntese do corante polimetina porcondensação de aldol sob condição aquosa e a geração do co-rante de polimetina através da reação modelada com ácido nu-cléico são químicas repórter úteis.
A reação de Wittig permite a preparação de um al-ceno por reação de um aldeído ou cetona com o ilídio geradode um sal fosfônio. Assim existe pouca literatura com rela-ção à síntese da hemicianina através da reação de Wittig(Zhmurova, e outros, Zhurnal Organicheskoi Khimii, 1975, 11,2160-2162). Aqui, o aldeído e o ilídio foram refluxados nofenolato de sódio contendo benzeno por 9 horas.
Embora o reagente de Wittig seja conhecido comosendo capaz de reagir com o aldeído em condição básica bran-da através da química modelada com ácido nucléico (Gartner eoutros, J. Am. Chem. Soe. 2002, 124, 10304-10306), a estra-tégia geral da síntese do corante polimetina por reação deWittig modelada com ácido nucléico, bem com metodologias pa-ra sintetização dos precursores do reagente de Wittig aquisão químicas repórter úteis.
i) Síntese de corante polimetina por reação deWittig em solução aquosa
Comutação da condição de reação de Wittig do meioanidro para aquoso, reação rápida e alto rendimento a serobtido para a síntese de corantes polimetina. Os Esquemas 3e 4 a seguir fornecem dois exemplos separados para a síntesede cianinas e hemicianinas sob condição aquosa.Esquema 3: Síntese de Hemicianinas através de rea-ção de Wittig na condição aquosa
<formula>formula see original document page 48</formula>
Esquema 4: Síntese de Cianinas com reação de Wit-tig na condição aquosa
<formula>formula see original document page 48</formula>
ii) Anexação dos precursores ao DNA
O precursor para as reações de aldol e Wittig podeser facilmente conjugado ao DNA através da formação de liga-ção de amida. Primeiro, um heterocíclico ácido ou precursoraromático é sintetizado. O ácido é então convertido no ésterN-hidroxisucciimida ativo que prontamente reage com DNA por-tando funcionalidade de amina.
(iíi) Síntese dos precursores de aldeído para con-densação de aldol e reação de Wittig
A funcionalidade ácida nos precursores de aldeídoé introduzida tanto através da quaternização se um heteroci-clo contendo nitrogênio estiver envolvido (Esquema 5 e Es-quema 6) ou hidrólise de um grupo ciano por peróxido de hi-drogênio se um aldeido aromático substituído com ciano esti-ver envolvido, por exemplo. Reagentes de Wittig ou t-butilacetaldimina desililada podem ser usados repetidamentepara a homologação de dois carbonos dos aldeídos nos α,β-enais correspondentes, se o aldeido conjugado extensivamentefor necessário (Bellassoued e outros, J. Org. Chem. 1993,58, 2517-2522).
Esquema 5: Síntese dos precursores de aldeido he-terocíclico não quaternário para conjugação de biopolímero
<formula>formula see original document page 49</formula>
R = por exemplo, alquilas, alquilóxis, Ars, OHf X, NO2.
<formula>formula see original document page 49</formula>
ou reagente de Wittig: Ph3P=CHCHO RCHO
<formula>formula see original document page 49</formula>
Esquema 6: Síntese dos precursores de aldeido he-terocíclico quaternário para conjugação de biopolímero
<formula>formula see original document page 49</formula>
R= por exemplo, alquilas, alquilóxis, AlS1 OH1 X1 NO2t /^rXou
<formula>formula see original document page 49</formula>
X = a, I1 Br 2 CHO tosilado de piridínio, acetona,(iv) Síntese dos precursores para reação de Wittigou Horner
O precursor de trifenil fosfina heterocíclica podeser convenientemente ligado ao DNA através de um dos gruposfenila. 0 esquema 7 provê um método geral para sintetizaçãode fosforano do tipo benzilico (reagente de Wittig). 0 hale-to reativo é primeiro sintetizado do álcool benzilico cor-respondente e então reage com ácido 4-(difenilfosfino)benzóico para formar o sal de fosfônio. Parasintetização de algum sal de fosfônio aromático substituídoamino especial, um procedimento de um recipiente convenien-te, sem isolamento do reagente de haleto foi empregado (Es-quema 8, Porrès, e outros, Synthesis 2003, 10, 1541-1544).Contudo, existem alguns desafios para sintetização específi-ca dos reagentes de Wittig em cianina. Em primeiro lugar édifícil se obter o precursor do sal de fosfônio heterocícli-co. Em segundo lugar, pouco se sabe a cerca das reatividadesdesses reagentes na direção do aldeído.
O Esquema 9 descreve uma metodologia geral para asíntese de fosforano heterocíclico não quaternário. Alterna-tivamente, o regente de fosfonato é também proposto aqui pa-ra reação de Horner (Esquema 10).
Esquema 7: Síntese de fosforano do tipo benzilico<formula>formula see original document page 51</formula>
Esquema 8: Síntese de sal de fosfônio aromáticosubstituído
<formula>formula see original document page 51</formula>
Esquema 9: Síntese de reagente fosforano heterocí-clico não quaternário
<formula>formula see original document page 51</formula>
Esquema 10: Síntese de reagente fosfonato hetero-cíclico quaternário<formula>formula see original document page 52</formula>
Z = por exemplo, S1 O, P, CH=CH ou fosfonato (CH3)2CH2
R = por exemplo, alquilas, alquilóxis, Ars, OH, X, NO2,SO3Hf NH2
(v) Síntese de precursores heterocíclicos portantohidrogênio ativo para condensação de aldol
A maioria dos precursores heterocíclicos portandohidrogênio ativo, tais como, grupo metila está disponívelcomercialmente. A funcionalidade do ácido pode ser facilmen-te introduzida nesses compostos atarvés da quaternização deN (Esquema 11).
Esquema 11: Síntese de precursores heterocíclicosportando hidrogênio ativo
<formula>formula see original document page 52</formula>
R = por exemplo, alquilas, alquilóxis, AfS1 OH, X1 NO2,
<formula>formula see original document page 52</formula>
(vi) Geração de polimetina através da reação deWittig modelada com ácido nucléico
0 Esquema 12 e o Esquema 13 ilustram a síntese docorante de polimetina através das reações modeladas com áci-do nucléico incluindo reação de Witt e condensação do aldol.Para a reação de Wittig modelada com ácido nucléico, um DNAde fita simples conjugado com corante de polimetina fluores-ceinico é gerado com óxido de fosfina não fluoresceinicoconjugado com outra fita de DNA. Para condensação do aldol,o corante de polimetina é covalentemente ligado a ambas asfitas de DNA. Elas fornecem a química repórter útil e o mé-todo para o ensaio fluoresceinico homogêneo do sistema bio-lógico ambos in vitro e in vivo.
Esquema 12: Geração de corante de polimetina atra-vés da reação de Wittig modelada com ácido nucléico
<formula>formula see original document page 53</formula>
B = reagente de Wlttlg
grupos terminais típicos: tiazóls, plrróls, plrrollnas, Indóls, 1,3,3-trlmetlllndollnas, tetrazóls, plrlmldlna, plrldlnas, qulnollnas eN-heterocIclos fundidos superiores ou quaisquer anéis de benzlla substituídos
Esquema 13: Geração de corante de polimetina atra-vés da condensação de aldol modelada com ácido nucléico<formula>formula see original document page 54</formula>
Vários corantes polimetina podem ser gerados (fai-xa próxima a ultravioleta ou próxima ao infravermelho) atra-vés de reações modeladas com ácido nucléico. Uma vez que aquímica modelada com ácido nucléico se baseia no emparelha-mento de base Watson-Crick, um sistema de múltiplos corantespode ser estabelecido por emprego de múltiplas sondas de DNAcom diferentes precursores de corante polimetina.
Reações químicas úteis na biodetecção empregandoquímica modelada com ácido nucléico
i) Reações de Acoplamento
Os grupos de reação podem ser, por exemplo, ele-trófilos (por exemplo, acetila, amidas, cloretos ácidos, és-teres, nitrilas, iminas), nucleófilos (por exemplo, aminas,grupos hidroxila, tióis), catalisadores (por exemplo, cata-lisadores organometálicos) ou cadeias laterais.
ii) Transformações do Grupo Funcional
Química modelada com ácido nucléico pode ser usadapara efetuar as transformações do grupo funcional que tanto
i) não mascaram ou ii) interconvertem a funcionalidade usadanas reações de acoplamento, iii) interconversões dos gruposfuncionais presentes no grupo reativo.
iii) Condições de Reação
Reações modeladas com ácido nucléico podem ocorrernas soluções aquosas ou não aquosas (isto é, orgânicas) ouuma mistura de uma ou mais soluções não aquosas e aquosas.
Condições de reação preferivelmente são otimizadas para seadequar a natureza dos grupos reativos, oligonucleotideosusados e as condições de detecção da amostra.
(iv) Classes de Reações Químicas
Reações químicas conhecidas podem ser consideradaspara uso nas reações modeladas com ácido nucléico, por exem-plo, reações, tais como aquelas listadas no March's AdvancedOrganic Chemistry, Organic Reactions, Organic Syntheses, li-vros textos de orgânica, jornais, tais como, Journal of theAmerican Chemical Society, Journal of Organic Chemistryr Te-trahedron, etc., e Carruther's Some Modern Methods of Orga-nic Chemistry. As reações escolhidas seriam compatíveis comácidos nucléicos, tais como, DNA ou RNA ou são compatíveiscom o ambiente da detecção.
As reações úteis na química modelada com ácido nu-cléico incluem, por exemplo, reações de substituição, rea-ções de formação de ligação carbono-carbono, reações de eli-minação, reações de acilação e reações de adição. Uma listailustrativa, porém não exaustiva de reações de substituiçãonucleófila alifática úteis na presente invenção inclui, porexemplo, reações SN2, reações SN1, reações SNi, redisposiçõesalílicas, substituição nucleófila, em um carbono trigonalalifático e subestação nucleófila em um carbono vinílico.Reações de substituição nucleófila alifática espe-cifica com nucleófilos de oxigênio incluem, por exemplo, hi-drólise de haletos de alquila de gen-dialetos, hidrólise de1, 1,1-trialetos, hidrólise de ésteres alquila ou ácidos i-norgânicos, hidrólise de diazo cetonas, hidrólise de éteresacetal e enol, hidrólise de epóxidos, hidrólise de haletosde acila, hidrólise de anidridos, hidrólise de ésteres car-boxilicos, hidrólise de amidas, alquilação com haletos dealquila (Reação de Williamson), formação de epóxido, alqui-lação com ésteres inorgânicos, alquilação com compostos dia-zo, desidratação de álcoois, transesterificação, alcoólisede epóxidos, alquilação com sais de ônio, hidroxilação desilanos, alcoólise de haletos de acila, alcoólise de anidri-dos, esterificação de ácidos carboxilicos, alcoólise de és-teres carboxilicos (transesterificação), alcoólise de ami-das, alquilação de sais de ácido carboxilico, clivagem deéter com anidrido acético, alquilação de ácidos carboxilicoscom compostos diazo, acilação de ácidos carboxilicos com ha-letos de acila, acilação de ácidos carboxilicos com ácidoscarboxilicos, formação de sais de oxônio, preparação de pe-róxidos e hidroperóxidos, preparação de ésteres inorgânicos(por exemplo, nitritos, nitratos, sulfonatos), preparação deálcoois de aminas e preparação de anidridos orgânicos-inorgânicos misturados.
Reações de substituição nucleófila alifática comnucleófilos de enxofre que tendem a ser nucleófilos melhoresque seus análogos de oxigênio, incluem, por exemplo, ataquepor SH em um carbono alquila para formar tióis, ataque por Sem um carbono alquila para formar tioésteres, ataque por SHou SR a um carbono acila, formação de dissulfetos, formaçãode sais de Bunte, alquilação de sais de ácido sulfinico eformação de tiocianatos de alquila.
Reações de substituição nucleófila alifática comnucleófilos de nitrogênio incluem, por exemplo, alquilaçãode aminas, N-arilação de aminas, substituição de um hidróxipor um grupo amino, transaminação, transamidação, alquilaçãode aminas com grupos diazo, aminação de epóxidos, aminaçãode oxetanos, aminação de aziridinas, aminação de alcanos,formação de isocianatos, acilação de aminas por haletos deacila, acilação de aminas por anidridos, acilação de aminaspor ácidos carboxilicos, acilação de aminas por ésteres car-boxilicos, acilação de aminas por amidas, acilação de aminaspor outros derivados de ácido, N-alquilação ou N-arilação deamidas e imidas, N-acilação de amidas e imidas, formação deaziridinas dos epóxidos, formação de compostos nitro, forma-ção de azidas, formação de isocianatos e isotiocianatos eformação de compostos azóxi.
As reações de substituição nucleófila alifáticacom nucleófilos de halogênio incluem, por exemplo, ataque emum carbono alquila, troca de haleto, formação de haletos dealquila de ésteres de ácidos sulfúrico e sulfona, formaçãode haletos de alquila dos álcoois, formação de haletos dealquila de éteres, formação de haloidrinas de epóxidos, cli-vagem de ésteres carboxilicos com iodeto de litio, conversãode diazo cetonas em α-halo cetonas, conversão de aminas emhaletos, conversão de aminas terciárias em cianamidas (a re-ação de von Braun), formação de haletos de acila de ácidoscarboxilicos e formação de haletos de acila de derivados deácido.
Reações de substituição nucleófila alifática usan-do hidrogênio como um nucleófilo incluem, por exemplo, redu-ção de haletos de alquila, redução de tosilatos, outros sul-fonatos e compostos semelhantes, hidrogenólise do álcool,hidrogenólise de ésteres (reação de Barton-McCombie), hidro-genólise de nitrilas, substituição de alcoxila por hidrogê-nio, redução dos epóxidos, clivagem redutiva dos ésterescarboxilicos, redução de uma ligação C-N, dessulfurização,redução de haletos de acila, redução de ácidos carboxilicos,ésteres e anidridos em aldeidos, e redução de amidas em al-deidos.
Embora determinados nucleófilos de carbono possamser muito nucleófilos e/ou básicos para o emprego em deter-minadas modalidades da invenção, as reações de substituiçãonucleófila alifática empregando necleófilos de carbono in-cluem, por exemplo, acoplamento com silanos, acoplamento dehaletos de alquila (a reação de Wurtz), a reação de haletosde alquila e ésteres de sulfonato com reagentes organometá-licos do Grupo I (I A) e II (II A), reação de haletos de al-quila e ésteres sulfonato com organocupratos, reação de ha-letos de alquila e ésteres sulfonato com outros reagentesorganometálicos, acoplamento alilico e propargilico com umsubstrato de haleto, acoplamento de reagentes organometáli-cos com ésteres de ácidos sulfúrico e sulfônico, sulfóxidose sulfonas, acoplamento envolvendo álcoois, acoplamento dereagentes organometálicos com ésteres carboxilicos, acopla-mento de reagentes organometálicos com compostos contendouma ligação éster, reação de reagentes organometálicos comepóxidos, reação de organometálicos com aziridina, alquila-ção em um carbono portando um hidrogênio ativo, alquilaçãode cetonas, nitrilas e ésteres carboxilicos, alquilação desais de ácido carboxilico, alquilação em uma posição α paraum heteroátomo (alquilação de 1,3-ditianas) , alquilação dediidro-1,3-oxazina (a síntese de Mayers dos aldeídos, ceto-nas, e ácidos carboxilicos), alquilação com trialquilbora-nos, alquilação em um carbono alquinila, preparação de ni-trilas, conversão direta de haletos alquila em aldeídos ecetonas, conversão de haletos de alquila, álcoois, ou alca-nos nos ácidos carboxilicos e seus derivados, a conversão dehaletos de acila em cetonas com compostos organometálicos, aconversão de anidridos, ésteres carboxilicos ou amidas emcetonas com compostos organometálicos, o acoplamento de ha-letos de acila, acilação em um carbono portando um hidrogê-nio ativo, acilação de ésteres carboxilicos por ésteres car-boxílicos (a condensação de Claisen e Dieckmann), acilaçãode cetonas e nitrilas com ésteres carboxilicos, acilação desais de ácido carboxilico, preparação de cianetos de acila epreparação de diazo cetonas, descarboxilação cetônica.
As reações que envolvem ataque nucleófilo no átomode enxofre sulfonila podem também ser usadas na presente in-venção e incluem, por exemplo, hidrólise de derivados do á-cido sulfônico (ataque por OH), formação de ésteres sulfôni-cos (ataque por OR), formação de sulfonamidas (ataque pornitrogênio), formação de haletos de sulfonila (ataque porhaletos), redução dos cloretos de sulfonila (ataque por hi-drogênio) e preparação de sulfonas (ataque por carbono).
Reações de substituição eletrófilas aromáticas po-dem também empregadas na química modelada com nucleotídeo.As reações de troca de hidrogênio são exemplos de reações desubstituição de eletrófilo aromáticas que utilizam hidrogê-nio como o eletrófilo. As reações de substituição de eletró-filo aromáticas que empregam eletrófilos de nitrogênio in-cluem, por exemplo, nitração e desidrogenação de nitro, ni-trosação de desidrogenação nitrosa, acoplamento de diazônio,introdução direta de grupo diazônio e aminação ou desidroge-nação de amino. As reações desse tipo com eletrófilos de en-xofre incluem, por exemplo, sulfonação, desidrogenação desulfa, halossulfonação, desidrogenação de halossulfa, sulfu-rização e sulfonilação. As reações usando eletrófilos de ha-logênio incluem, por exemplo, halogenação e desidrogenaçãode halo. As reações de substituição eletrófilas aromáticascom eletrófilos de carbono incluem, por exemplo, alquilaçãode Friedel-Crafts, alquilação, desidrogenação de alquila,arilação de Friedel-Crafts (a reação de Scholl), acilação deFriedel-Crafts, formilação com formamidas dissubstituídas,formilação com cianeto de zinco e HCl (a reação de Gatter-man), formilação com clorofórmio (a reação de Reimer-Tiemann), outras formilações, desidrogenação de formila,carboxilação com haletos de carbonila, carboxilação com dió-xido de carbono (a reação de Kolbe-Schmitt), amidação comisocianatos, desidrogenação de N-alquilcarbamoila, hidroxi-alquilação, desidrogenação de hidroxialquila, ciclodesidra-tação de aldeidos e cetonas, haloalquilação, desidrogenaçãode halo, aminoalquilação, amidoalquilação, dialquilaminoal-quilação, desidrogenação de dialquilamino, tioalquilação,acilação com nitrilas (a reação de Hoesch), cianação e desi-drogenação de ciano. As reações usando eletrófilos de oxigê-nio incluem, por exemplo, hidroxilação e desidrogenação dehidróxi.
Reações de redisposição incluem, por exemplo, aredisposição de Fries, migração de um grupo nitro, migraçãode um grupo nitroso (a Redisposição de Fischer-Hepp), migra-ção de um grupo arilazo, migração de um halogênio (a Redis-posição Orton), migração de um grupo alquila, etc. Outra re-ação em um anel aromático inclui a reversão de uma alquila-ção de Friedel-Crafts, descarboxilação de aldeidos aromáti-cos, descarboxilação de ácidos aromáticos, a reação de Ja-cobsen, desoxigenação, dessulfonação, desidrossulfonação,desalogenação, desidroalogenação e hidrólise dos compostosorganometálicos.
As reações de substituição de eletrófilo alifáticasão também úteis. As reações empregando SE1, SE2 (frente),Se2 (costas), SEi, adição-eliminação e mecanismos cíclicospodem ser usadas na presente invenção. Reações desse tipocom hidrogênio como o grupo abandonador incluem, por exem-pio, troca de hidrogênio (desidrogenação de deutério, deute-riação), migração de uma ligação dupla e tautomerização deceto-enol. As reações com eletrófilos de halogênio incluem,por exemplo, halogenação de aldeidos e cetonas, halogenaçãode ácidos carboxilicos e haletos de acila e halogenação desulfóxidos e sulfonas. As reações com eletrófilos de nitro-gênio incluem, por exemplo, acoplamento alifático de diazô-nio, nitrosação em um carbono portando um hidrogênio ativo,formação direta de compostos diazo, conversão de amidas emamidas α-azido, aminação direta em uma posição ativada e in-serção de nitrenos. Reações com eletrófilos de enxofre ouselênio incluem, por exemplo, sulfenilação, sulfonação e se-lenilação de cetonas e ésteres carboxilicos. Reações com e-letrófilos de carbono incluem, por exemplo, acilação em umcarbono alifático, conversão dos aldeidos em β-ceto ésteresou cetonas, cianação, desidrogenação de ciano, alquilação dealcanos, a reação de amina de Stork e inserção de carbenos.As reações com eletrófilos de metal incluem, por exemplo,metalação com compostos organometálicos, metalação com me-tais e bases fortes e conversão de enolatos em éteres enolsilila. As reações de substituição eletrófila alifática commetais e grupos de partida incluem, por exemplo, substitui-ção de metais por hidrogênio, reações entre reagentes orga-nometálicos e oxigênio, reações entre reagentes organometá-licos e peróxidos, oxidação de trialquilboratos em boratos,conversão de reagentes de Grignard em compostos de enxofre,desmetalação de halo, a conversão de compostos organometáli-cos em aminas, a conversão de compostos organometálicos emcetonas, aldeidos, ésteres carboxilicos e amidas, desmetala-ção de ciano, transmetalação com um metal, transmetalaçãocom um haleto de metal, transmetalação com um composto orga-nometálico, redução de haletos de alquila, desalogenação demetalo, substituição de um halogênio por um metal de um com-posto organometálico, descarboxilação de ácidos alifáticos,clivagem de alcóxidos, substituição de um grupo carboxilapor um grupo acila, clivagem básica de β-ceto ésteres e β-dicetonas, reação de haloforma, clivagem de cetonas não eno-lizáveis, a reação de Haller-Bauer, clivagem de alcanos,descianação e desidrocianação. Reações de substituição ele-trófila em nitrogênio incluem, por exemplo, diazotização,conversão de hidrazinas em azidas, N- nitrosação, desidroge-nação de N-nitroso, conversão de aminas em compostos azo, N-halogenação, desidrogenação de N-halo, reações de aminas commonóxido de carbono e reações de aminas com dióxido de car-bono.
As reações de substituição nucleófila aromáticapodem também ser usadas na presente invenção. As reaçõesprocessadas através do mecanismo SNAr, o mecanismo SN1, omecanismo benzina, o mecanismo SrnI, ou outro mecanismo, porexemplo, podem ser empregadas. As reações de substituiçãonucleófila aromática com nucleófilos de oxigênio incluem,por exemplo, desalogenação de hidróxi, fusão de alquila desais sulfonato e substituição de OR ou OAr. As reações comnucleófilos de enxofre incluem, por exemplo, substituiçãopor SH ou SR. As reações usando nucleófilos de nitrogênioincluem, por exemplo, substituição por NH2, NHR ou NR2 esubstituição de um grupo hidróxi por um grupo amino. As rea-ções com nucleófilos incluem, por exemplo, os halogênios deintrodução. Reações de substituição nucleófilas aromáticascom hidrogênio como o nucleófilo incluem, por exemplo, redu-ção de ésteres fenóis e fenólicos e éteres e redução de ha-letos e compostos nitro. As reações cora nucleófilos de car-bono incluem, por exemplo, a reação de Rosenmund-von Braun,acoplamento de compostos organometálicos com haletos de ari-la, éteres e ésteres carboxilicos, arilação em um carbonocontendo um hidrogênio ativo, conversões de substratos dearila em ácidos carboxilicos, seus derivados, aldeidos e ce-tonas e reação de Ullmann. As reações com hidrogênio como ogrupo abandonador incluem, por exemplo, alquilação, arilaçãoe aminação de heterociclos de nitrogênio. Reação com N2+ co-mo o grupo abandonador incluem, por exemplo, desdiazonizaçãode hidróxi, substituição por grupos contendo enxofre, desdi-azonização de iodo e a reação de Schiemman. As reações deredisposição incluem, por exemplo, a redisposição de Rich-ter, a redisposição de Sommelet-Hausser, a redisposição dehidroxilaminas de arila, e a redisposição de Smiles.
As reações envolvendo radicais livres também podemser usadas, embora as reações de radical livre empregadas naquímica modelada com nucléico possam ser escolhidas cuidado-samente para evitar modificação ou clivagem do modelo de nu-cleotídeo. Com aquela limitação, as reações de substituiçãode radical livre podem ser usadas na presente invenção. Rea-ções de substituição de radical livre específicas incluem,por exemplo, substituição por halogênio, halogenação em umcarbono alquila, halogenação alílica, halogenação benzílica,halogenação de aldeidos, hidroxilação em um carbono alifáti-co, hidroxilação em um carbono aromático, oxidação dos alde-idos em ácidos carboxilicos, formação de éteres cíclicos,formação de hidroperóxidos, formação de peróxidos, aciloxi-lação, desidrogenação de acilóxi, clorossulfonação, nitraçãode alcanos, conversão direta de aldeídos em amida, amidaçãoe aminação em um carbono alquila, acoplamento simples em umaposição suscetível, acoplamento de alcinas, arilação de com-postos aromáticos por sais de diazônio, arilação de alcenosativados por sais de diazônio (a arilação de Meerwein), ari-lação e alquilação de alcenos por compostos organopaládio (areação Heck), arilação e alquilação de alcenos por compostosvinilestanho (a reação de Stille), alquilação e arilação decompostos aromáticos por peróxidos, arilação fotoquímica decompostos aromáticos, alquilação, acilação e carboalcoxila-ção de heterociclos de nitrogênio. Reações específicas nasquais N2+ é o grupo abandonador incluem, por exemplo, subs-tituição do grupo diazônio por hidrogênio, substituição dogrupo diazônio por cloro ou bromo, desdiazonização de nitrodo grupo diazônio por grupos contendo enxofre, dimerizaçãode arila com sais diazônio, metilação de sais diazônio, vi-nilação de sais diazônio, arilação de sais diazônio e con-versão de sais diazônio em aldeídos, cetonas ou ácidos car-boxílicos. As reações de substituição de radical livre commetais como grupos abandonadores incluem, por exemplo, aco-plamento de reagentes de Grignard, acoplamento de boranos eacoplamento de outros reagentes organometálicos. A reaçãocom halogênio como o grupo abandonador está incluída. Outrasreações de substituição de radical livre com vários gruposabandonadores incluem, por exemplo, dessulfurização com ní-quel Raney, conversão de sulfetos em compostos organolítio,dimerização descarboxilativa (a reação de Kolbe), a reaçãode Hunsdiecker, alilação descarboxilativa e descarbonilaçãode aldeidos e haletos de acila.
As reações envolvendo adições de ligações múlti-pias de carbono-carbono são também usadas na química modela-da com nucleotideo. Qualquer mecanismo pode ser usado na re-ação de adição incluindo, por exemplo, adição de eletrófilo,adição de eletrófilo, adição de nucleófilo, adição de radi-cal livre e mecanismos cíclicos. As reações envolvendo adi-ções aos sistemas conjugados podem também ser usadas. Adiçãoaos anéis ciclopropano podem também ser utilizadas. Reaçõesespecíficas incluem, por exemplo, isomerização, adição dehaletos de hidrogênio, hidratação de ligações duplas, hidra-tação de ligações triplas, adição de álcoois, adição de áci-dos carboxílicos, adição de H2S e tióis, adição de amônia eaminas, adição de amidas, adição de ácido hidrazóico, hidro-genação de ligações duplas e triplas, outra redução de liga-ções duplas e triplas, redução de ligações duplas e triplasde sistemas conjugados, hidrogenação de anéis aromáticos,clivagem redutiva de ciclopropanos, hidroboração, outras hi-drometalações, adição de alcanos, adição de alcenos e/ou al-cinas aos alcenos e/ou alcinas (por exemplo, reações de ci-clização de pi-cátion, adição de hidro-alcenila) , reaçõeseno, a reação de Michael, adição de organometálicos às Iiga-ções duplas e triplas não conjugadas às carbonilas, a adiçãode dois grupos alquila a uma alcina, adição de 1,4 dos com-postos organometálicos às ligações duplas ativadas, adiçãode boranos às ligações duplas ativadas, adição de estanho ehidretos de mercúrio às ligações duplas ativadas, acilaçãode ligações duplas ativadas e de ligações triplas, adição deálcoois, aminas, ésteres carboxilicos, aldeidos, etc., car-bonilação de ligações duplas e triplas, hidrocarboxilação,hidroformilação, adição de aldeidos, adição de HCN, adiçãode silanos, adição de radical, ciclização de radical, halo-genação de ligações duplas e triplas (adição de halogênio,halogênio), halolactonização, halolactamização, adição deácidos hipoalosos e hipoaletos (adição de halogênio, oxigê-nio), adição de compostos de enxofre (adição de halogênio,enxofre), adição de halogênio e um grupo amino (adição dehalogênio, nitrogênio), adição de NOx e NO2X (adição de ha-logênio, nitrogênio), adição de XN3 (adição de halogênio,nitrogênio), adição de haletos de alquila (adição de halogê-nio, carbono), adição de haletos de acila (adição de halogê-nio, carbono), hidroxilação (adição de oxigênio, oxigênio)(por exemplo, reação de diidroxilação assimétrica com OsO4) ,diidroxilação de anéis aromáticos, epoxidação (adição de o-xigênio, oxigênio) (por exemplo, epoxidação assimétrica deSharpless), fotooxidação de dienos (adição de oxigênio, oxi-gênio) , hidroxissulfenilação (adição de oxigênio, enxofre),oxiaminação (adição de oxigênio, nitrogênio), diaminação (a-dição de nitrogênio, nitrogênio), formação de aziridinas (a-dição de nitrogênio) , aminossulfenilação (adição de nitrogê-nio, enxofre), acilaciloxilação e acilamidação (adição deoxigênio, carbono ou nitrogênio, carbono), adição de 1,3-dipolar (adição de oxigênio, nitrogênio, carbono), reação deDiels-Alder, reação de heteroátomo Diels-Alder, todas 3+2cicloadições de carbono, dimerização de alcenos e adição decarbenos e carbenóides às ligações duplas e triplas, trime-rização e tetramerização de alcinas e outras reações de ci-cloadição.
Além das reações envolvendo adições às ligaçõesmúltiplas de carbono-carbono, as reações de adição às múlti-plas ligações carbono-hetero podem ser usadas na química mo-delada com nucleotídeo. Reações exemplares incluem, por e-xemplo, a adição de água aos aldeídos e cetonas (formação dehidratos), hidrólise de ligação dupla de carbono-nitrogênio,hidrólise de compostos nitro alifáticos, hidrólise de nitri-las, adição de álcoois e tióis aos aldeídos e cetonas, al-quilação redutiva dos álcoois, adição de álcoois aos isocia-natos, alcoólise de nitrilas, formação de xantatos, adiçãode H2S e tióis aos compostos carbonila, formação de produtosde adição de bissulfeto, adição de aminas aos aldeídos e ce-tonas, adição de amidas aos aldeídos, alquilação redutiva deamônia ou aminas, a reação de Mannich, a adição de aminasaos isocianatos, adição de amônia ou aminas às nitrilas, a-dição de aminas ao dissulfeto de carbono e dióxido de carbo-no, adição de derivado de hidrazina aos compostos carbonila,formação de oximas, conversão de aldeídos em nitrilas, for-mação de gem-dialetos de aldeídos e cetonas, redução de al-deídos e cetonas nos álcoois, redução da ligação dupla decarbono-nitrogênio, redução de nitrilas em aminas, reduçãode nitrilas em aldeídos, adição de reagentes de Grignard ereagentes organolítio aos aldeídos e cetonas, adição de ou-tros organometálicos aos aldeídos e cetonas, adição de tri-alquilalilssilanos aos aldeídos e cetonas, adição de alcenosconjugados aos aldeidos (a reação de Baylis-Hillman), a rea-ção de Reformatsky, a conversão de sais de ácido carboxiliconas cetonas com compostos organometálicos, a adição de rea-gentes de Grignard aos derivados de ácido, a adição de com-postos organometálicos ao CO2 e CS2, adição de compostos or-ganometálicos aos compostos C=N, adição de carbenos e diazo-alcanos aos compostos C=N, adição de reagentes de Grignardàs nitrilas e isocianatos, a reação do Aldol, Aldol Mukaiya-ma e reações correlatas, reações do tipo Aldol entre ésterescarboxilicos ou amidas e aldeidos ou cetonas, a reação deKnoevenagel (por exemplo, a reação Nef, a reação Favorskii) ,a reação de alquenilação de Peterson, a adição de compostosde hidrogênio ativo ao CO2 e CS2, a reação de Perkin, a con-densação do éster glicidico Darzens, a reação de Tollen, areação de Wittig, a alquenilação de Tebbe, a alquenilação dePetasis, alquenilações alternativas, a reação de Thorpe, areação de Thorpe-Ziegler, adição de silanos, formação de ci-anoidrinas, adição de HCN a C=N e ligações C=N, a reação dePrins, a condensação de benzoina, adição de radicais aoscompostos C=O, C=S, C=N, a reação de Ritter, acilação de al-deidos e cetonas, adição de aldeidos em aldeidos, adição deisocianatos em isocianatos (formação de carbodiimidas), aconversão de sais de ácido carboxilico em nitrilas, a forma-ção de epóxidos de aldeidos e cetonas, a formação de epis-sulfetos e epissulfonas, a formação de β-lactonas e oxetanos(por exemplo, a reação de Paterno-Büchi), a formação de β-lactamas, etc. As reações envolvendo adição de isocianetosincluindo a adição de água aos isocianetos, a reação de Pas-serini, a reação de Ug e a formação de aldiminas metalizadas.
Reações de eliminação, incluindo α, β e γ elimina-ções, bem como reações de extrusão, podem ser realizadas u-sando química modelada com nucleotídeo, embora a resistênciados reagentes e condições empregadas devam ser consideradas.As reações de eliminação preferidas incluem reações que sãorealizadas por mecanismos El, E2, ElcB ou E2C. Reações exem-plares incluem, por exemplo, reações onde o hidrogênio é re-movido de um lado (por exemplo, desidratação de álcoois,clivagem dos éteres em alcenos, a reação de Chugaev, decom-posição do éster, clivagem dos hidróxidos de amônio quater-nários, clivagem de sais de amônio quaternários com basesfortes, clivagem de óxidos de amina, pirólise de ceto-ilídeos, decomposição de tolueno-p-sulfonilidrazonas, cliva-gem de sulfóxidos, clivagem de selenóxidos, clivagem de sul-fonas, desidroalogenação de haletos de alquila, desidroalo-genação de haletos de acila, desidroalogenação de haletos desulfonila, eliminação de boranos, conversão de alcenos emalcinas, .descarbonilação de haletos de acila), reações nasquais nem o átomo abandonador é hidrogênio (por exemplo, de-soxigenação de dióis vicinais, clivagem de tionocarbonatoscíclicos, conversão de epóxidos em epissulfetos e alcenos, areação de Ramberg-Bãcklund, conversão de aziridinas em alce-nos, desalogenação de dialetos vicinais, desalogenação dehaletos α-halo acila e eliminação de um halogênio e um grupohetero), reações de fragmentação (isto é, reações nas quaiso carbono é o grupo abandonador positivo ou a eletrofuga,tal como, por exemplo, fragmentação de haletos γ-amino e γ-hidróxi, fragmentação de 1,3-dióis, descarboxilação de áci-dos carboxilicos β-hidróxi, descarboxilação de β-lactonas,fragmentação de α,β-epóxi hidrazonas, eliminação de CO doscompostos biciclicos ligados em ponte e eliminação de CO2dos compostos biciclicos ligados em ponte), reações nasquais as ligações CsN ou C=N são formadas (por exemplo, de-sidrogenação de aldoximas ou compostos semelhantes, conver-são de cetoximas em nitrilas, desidratação de amidas nãosubstituídas e conversão de N-alquilformamidas em isociane-tos), reações onde as ligações C=O são formadas (por exem-plo, pirólise de β-hidróxi alcenos) e reações onde a liga-ções N=N são formadas (por exemplo, eliminações para forne-cer os diazoalcenos). As reações de extrusão incluem, porexemplo, extrusão de N2 de pirazolinas, extrusão de N2 dospirazóis, extrusão de N2 das triazolinas, extrusão de CO,extrusão de CO2, extrusão de SO2, a síntese Story e síntesede alceno por extrusão dobrada.
Redisposições, incluindo, por exemplo, redisposi-ções nucleófilas, redisposições eletrófilas, redisposiçõesprototrópicas e redisposições de radical livre podem tambémser realizadas usando química modelada com nucleotídeo. Am-bas as redisposições 1,2 e redisposições não 1,2 podem serrealizadas. Reações exemplares incluem, por exemplo, migra-ções de carbono para carbono de R, He Ar (por exemplo, rea-ções de Wagner-Meerwein e correlata, a redisposição de Pina-col, reações de expansão de anel, reações de contração deanel, redisposições catalisadas por ácido de aldeidos e ce-tonas, a redisposição de dienona-fenol, a redisposição deFavorskii, a síntese de Arndt-Eistert, a homologação dos al-deidos e homologação das cetonas), migrações carbono paracarbono de outros grupos (por exemplo, migrações de halogê-nio, hidroxila, amino, etc.; migração de boro e a redisposi-ção de Neber), migrações carbono para nitrogênio de R e Ar(por exemplo, redisposição de Hofmann, a redisposição deCurtius, a redisposição de Lossen, a reação de Schmidt, aredisposição de Beckman, a redisposição de Stieglits e asredisposições correlata) , migrações de carbono para oxigêniode R e Ar (por exemplo, a redisposição de Baeyer-Villiger eredisposição de hidroperóxidos) , migração de nitrogênio paracarbono, oxigênio para carbono e enxofre para carbono (porexemplo, redisposição de Stevens e a redisposição de Wit-tig), migrações de boro para carbono (por exemplo, conversãode boranos em álcoois (primários ou de outra forma), con-versão de boranos em aldeidos, conversão de boranos em áci-dos carboxilicos, conversão de boranos vinílicos em alcenos,formação de alcinas de boranos e acetilidas), redisposiçõeseletrocíclicas (por exemplo, de ciclobutenos e 1,3-ciclohexadienos ou conversão de estilbenos em fenantrenos),redisposições sigmatrópicas (por exemplo, (IJ) migraçõessigmatrópicas de hidrogênio, (IJ) migrações sigmatrópicas decarbono, conversão de vinilciclopropanos em ciclopentenos, aredisposição Cope, a redisposição Claisen, a síntese de in-dol Fischer, (2,3) redisposições sigmatrópicas e a redispo-sição benzidina), outras redisposições cíclicas (por exem-pio, metátese de alcenos, o di-n-metano e redisposições cor-relatas, e as reações de Hofmann-Loffler e correlatas) , eredisposições não cíclicas (por exemplo, deslocamentos dehidreto, a redisposição de Chapman, a redisposição de Walla-ch e redisposições diotrópicas).
Reações oxidativas e redutivas pode também ser re-alizadas usando química modelada com nucleotídeo. Reaçõesexemplares podem envolver, por exemplo, transferência de e-létrons direta, transferência de hidreto, transferência deátomo de hidrogênio, formação de intermediários de éster,mecanismos de deslocamento ou mecanismos de eliminação deadição. Oxidações exemplares incluem, por exemplo, elimina-ções de hidrogênio (por exemplo, aromatização de anéis deseis elementos, desidrogenações rendendo ligações duplas decarbono-carbono, oxidação ou desidrogenação de álcoois emaldeídos e cetonas, oxidação de fenóis e aminas aromáticasem quinonas, clivagem oxidativa de cetonas, clivagem oxida-tiva de aldeídos, clivagem oxidativa de álcoois, ozonólise,clivagem oxidativa de ligações duplas e anéis aromáticos,oxidação de cadeias laterais aromáticas, descarboxilação o-xidativa e bisdescarboxilação), reações envolvendo substitu-ição de hidrogênio por oxigênio (por exemplo, oxidação demetileno em carbonila, oxidação de metileno em OH, CO2R ouOR, oxidação de arilmetanos, oxidação de éteres em ésterescarboxílicos e reações correlatas, oxidação de hidrocarbone-tos aromáticos em quinonas, oxidação de aminas ou compostosnitro em aldeídos, cetonas e dialetos, oxidação de álcooisprimários em ácidos carboxílicos ou ésteres carboxílicos,oxidação de alcenos em aldeídos ou cetonas, oxidação de ami-nas em compostos nitrosos e hidroxilaminas, oxidação de ami-nas primária, oximas, azidas, isocianatos ou compostos ni-trosos, em compostos nitro, oxidação de tióis e outros com-postos de enxofre em ácidos sulfônicos), reações onde o oxi-gênio é adicionado ao substrato (por exemplo, oxidação dealcinas em α-dicetonas, oxidação de aminas terciárias em ó-xidos de amina, oxidação de tioésteres em sulfóxidos e sul-fonas, e oxidação de ácidos carboxilicos em ácidos peróxi) ereações de acoplamento oxidativo (por exemplo, acoplamentoenvolvendo carbanoinas, dimerização de éteres silil enol deenolatos de litio e oxidação de tióis em dissulfetos).
Reações redutivas exemplares incluem, por exemplo,reações envolvendo substituição de oxigênio por hidrogênio(por exemplo, redução de carbonila no metileno em aldeidos ecetonas, redução de ácidos carboxilicos em álcoois, reduçãode amidas em aminas, redução de ésteres carboxilicos em éte-res, redução de anidridos cíclicos em lactonas e derivadosácidos em álcoois, redução de ésteres carboxilicos em álco-ois, redução de ácidos carboxilicos e ésteres em alcanos,redução completa de epóxidos, redução de compostos nitro emaminas, redução de compostos nitro em hidroxilaminas, redu-ção de compostos nitrosos e hidroxilaminas em aminas, redu-ção de oximas em aminas primárias ou aziridinas, redução deazidas em aminas primárias, redução de compostos nitrogênioe redução de haletos sulfonila e ácidos sulfônicos em ti-óis), remoção de oxigênio do substrato (por exemplo, reduçãode óxidos de amina e compostos azóxi, redução de sulfóxidose sulfonas, redução de hidroperóxidos e peróxidos e reduçãode compostos nitro alifáticos em oximas ou nitrilas) , redu-ções que incluem clivagem (por exemplo, desalquilação de a-minas e amidas, redução de azo, azóxi, e compostos hidrazoem aminas, e redução de dissulfetos em tióis), reações deacoplamento redutivas (por exemplo, redução bimolecular dealdeídos e cetonas em 1,2-dióis, redução bimolecular de al-deidos ou cetonas em alcenos, condensação do éster aciloina,redução de compostos nitro em azóxi e redução de compostosnitro em azo) e reduções onde um substrato orgânico é oxida-do e reduzido (por exemplo, a reação de Cannizzaro, a reaçãode Tishchenko, a redisposição de Pummerer e a reação de Wil-lgerodt).
Vários aspectos gerais da química modelada com á-cido nucléico são discutidos em detalhes a seguir. Informa-ções adicionais podem ser encontradas nas Publicações de Pe-dido de Patente US números 2004/0180412 Al (USSN 10/643.752)de Liu e outros e 2003/0113738 Al (USSN 10/101.030) de Liu eoutros.
Existem várias vantagens em relação aos métodos decriação de sinal englobados pela invenção revelada aqui. Porexemplo, em razão as frações reativas anexadas à sondas ini-cialmente não possuírem propriedades detectáveis até um e-vento de hibridização (ou no caso de alvos de ácido não nu-cléico, um evento de hibridização seguindo um evento de li-gação) e reação subsequente acontecerem, os ensaios empre-gando sondas e química de acordo com a invenção possuem pou-co ou nenhuma base e portanto razão de sinal alto para rui-do. Isso por sua vez provê vantagens práticas de ensaiospossuindo alta sensibilidade e uma ampla faixa dinâmica. As-sim, quantidades menores de analisados podem ser detectadascom o potencial para proceder assim, usando instrumentaçãode detecção que é mais simples e de custo mais abaixo. Mui-tos tipos diferentes de geração de sinal (geração fluoresce-inica, liberação de fluorescência, liberação de cofator,etc.) podem ser suportados através desse mecanismo.
Uma vantagem prática importante e adicional é queos ensaios devem ser construídos de modo a serem homogêneos.Ensaios homogêneos requerem pouca ou nenhuma preparação daamostra, ou não requerem tipicamente que os analisados sejamimobilizados sobre um suporte de sólido com a finalidade deremoção do reagente, redução de base, troca de solvente outampão e/ou detecção como é tipicamente necessário para en-saios heterogêneos. Uma vez que a formação de um DNA de fitadupla de Tm alta é uma reação homogênea, a colocação de pre-cursores de fluoroforo nos oligonucleotídeos suporta um en-saio de fase totalmente homogênea para ligação ao alvo. Aformação da estrutura de fita dupla propriamente é proxima-mente instantânea.
Outro benefício prático da invenção é que as sondas e reagentes podem ser adicionados diretamente à amostra,e a solução resultante pode ser monitorada para a geração desinal sem qualquer manipulação adicional, tal como, anexaçãoao suporte sólido, lavagem, etc. Como resultado, essa inven-ção provê ensaios muito simples que podem ser realizados fo-ra dos laboratórios, sem a necessidade de equipamento caro etrabalhoso.
Uma vez que a obtenção de DNA de fita dupla de Tmalta normalmente requer o uso de dois ligantes separados,localizados como distâncias compatíveis com os braços espa-çadores nos oligonucleotídeos, a especificidade muito altade ligação pode ser obtida.
Adicionalmente, o uso de dois ligantes que propri-amente se tornam associados através de DNAs recombinados,resulta em um efeito de afinidade melhorada (avidez). Por-tanto, dois ligantes fracos exibiriam uma avidez de ligaçãomelhorada. Dois ligantes, ambos podendo ser fracos, porémpossuindo especificidade diferente (ligação aos sítios dife-rentes) exibiriam avidez e especificidade melhoradas. Isso éaltamente vantajoso para detecção de baixo nível quando ape-nas ligantes fracos estão disponíveis.
Os exemplos que se seguem contêm informações adi-cionais importantes, exemplificação e diretrizes que podemser adaptadas à prática dessa invenção em suas várias moda-lidades e equivalentes da mesma. A prática da invenção serámais completamente entendida desses exemplos que se seguem,que são apresentados aqui apenas com fins ilustrativos, enão devem ser tidos como limitando a invenção de que forma for.
EXEMPLOS
Exemplo 1. Criação de fluorescência por redução deAzidocouramina induzida por hibridização
Cinco oligonucleotídeos foram preparados usandoquímica de fosforamidita padrão (Glen Research, Sterling VA,USA). Oligonucleotideos portando grupos 5'-amino (01igo2 e01igo6) foram preparados usando Modificador 5 de 5'-Amino eOligonucleotideos portando grupos 3'-amino (01igo4 e 01igo5)foram preparados usando Modificador C7CPG de 3'-Amino (GlenResearch, Sterling VA, USA).
Oligol 5'-GTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGA-3' (SEQ. ID.N0 19)
01igo2 5'-H2N-AGCTCCAACTACCAC-3' (SEQ. ID.N°20)
01igo4 5'-GTGGTAGTTGGAGCT-NH2-3' (SEQ. ID.N°21)
01igo5 5'-TCTTGCCTACGCCAC-NH2-3' (SEQ. ID.N0 22)
01igo6 5'-H2N-AGATCCCACTAGCAC-3' (SEQ. ID.N°23)
Oligol, 01igo4 e 01igo5 foram removidos do suportede síntese e purificados por HPLC de fase inversa. Os gruposamino de 01igo2 e 01igo6 foram convertidos, enquanto ligadosa resina aos seus derivados de trifenil fosfina e esses fo-ram purificados e isolados (Sakurai e outros J. Amer. Chem.Soe. (2005) Vol. 127, ppl660-1667) para fornecer os 01igo2-TPP e Oligo-βΤΡΡ, respectivamente.
O grupo amino portando 01igo4 e 01igo5 foi conver-tido em seus derivados de azidocoumarina (01igo4-AzC e Oli-go5-AzC, respectivamente) por reação de cada oligo com o és-ter N-hidroxisuccinimida do ácido 7-azido-4-metilcoumarin-3-acético (Thevenin e outros, Eur. J. Biochem (1992) Vol. 206,pp-471-477). A reação foi realizada por adição de 1 μΐ, deácido trifluoracético a 5 μΐ, de N-metilmorfolina para prepa-ração de um tampão ao qual foram adicionados 10 μΐί de águacontendo 6,6 nmol de Oligo 4 e Oligo 5, seguido por adiçãode 30 μΐ, de uma solução 0,16 M do éster NHS de coumarina emdimetilformamida. Cada reação foi deixada prosseguir por 2horas a temperatura ambiente, pelo que, 50 μΙ, de acetatotrietilamônio 0,1 M aquoso foram adicionados. As misturasforam aplicadas às colunas de desalinização NAP-5 (AmershamBiosciences, Piscataway NJ USA) eluiram de acordo com asinstruções do fabricante, o eluato foi purificado por RP-HPLC para prover 01igo4-AzC e 01igo5-AzC, em rendimentos de77% e 70%, respectivamente. A identidade do produto foi con-firmada por espectrometria de massa Maldi -ToF.
Para demonstrar a criação especifica de hibridiza-ção da fluorescência, várias combinações de oligonucleotí-deos complementares e não complementares portando frações deazido-coumarina e trifenil fosfina foram deixadas reagir atemperatura ambiente em um tampão compreendido de 30% deformamida aquosa, 50 mM de NaCl e 10 mM de fosfato de sódio,pH 7,2. 0 progresso da reação foi monitorado com o tempo u-sando um conjunto de fluorímetro Victor Multilabel (EG&GWallach, Turku Finlnad) para excitar a amostra a 360 nm emonitorar a emissão de luz a 455 nm.
A Figura 14 mostra que, quando 01igo4-AzC e Oli-go2-TPP são combinados para concentrações finais de 200 nM e400 nM respectivamente, um rápido aumento na fluorescência éobservado. Nessa Figura, 004 indica 01igo4-AzC, 002 indica01igo2-TPP e 006 indica 01igo6-TPP. A fluorescência não o-corre quando o 01igo6-TPP é substituído por 01igo2-TPP. Con-siderando-se que o 01igo2-TPP é perfeitamente complementarem sua capacidade de emparelhamento de base com relação aoOligo4-AzC, o 01igo6-TPP não é, uma vez que contém três nu-cleotídeos não combinados. Os resultados sustentam a conclu-são de que a criação da fluorescência se deve a capacidadedo 01igo2-TPP de hibridizar em 01igo4-AzC facilitando assima reação entre TPP e as frações de azidocoumarina no híbridoresultante. A falta de sinal no caso da reação de 01igo6-TPPcom 01igo4-AzC é consistente com a incapacidade desses doisoligonucleotídeos de formarem um duplexo, pelo que a reaçãonão é facilitada. As reações de controle contendo cada umaoligonucleotídeos simples foram realizadas para normalizarquaisquer efeitos não específicos.
Resultados dos experimentos adicionais envolvendocomplexos ternários são mostrados na Figura 15. Nesses expe-rimentos, Oligol é testado quanto a sua capacidade de colo-car juntos, por hibridização, dois oligonucleotídeos perfei-tamente complementares (01igo5-AzC e 01igo-2TPP) versus suacapacidade de colocar juntos um oligonucleotídeo perfeita-mente complementar (01igo5-AzC) e um oligonucleotídeo per-feitamente complementar (01igo6-TPP) . Oligol e 01igo5-AzCestavam em concentração final de 200 nM, considerando-se que0ligo2-TPP e 01igo6-TPP foram empregados em concentração fi-nal de 400 nM. Na Figura 15, 001 indica Oligol, 002 indica01igo2-TPP, 005 indica 01igo5-AzC e 006 indica 01igo6-TPP.Os resultados mostram que a fluorescência é gerada apenasquando a combinação de oligonucleotídeos completamente com-plementares está presente (Oligol, 01igo5-AzC e 01igo2-TPP).
Exemplo 2 - Marcação do Gene
A marcação do gene é um método de detecção de se-qüências com base no desenvolvimento de sinal em múltiplossítios dentro de um alvo. Os múltiplos sítios tipicamenterepousam dentro de uma seqüência gênica que se deseja mos-trar a presença, ausência ou quantidade. Dentro de uma se-qüência relativamente longa, por exemplo, uma seqüência de5.000 bases, pode-se alvejar seqüências menores, tipicamentede 40-50 bases, que são únicas àquela seqüência. Essas sãoalvejadas por pares de sondas de oligonucleotídeo, cada umatipicamente com 10-20 bases de comprimento. Se as sondas me-direm cerca de 12 bases de comprimento, cerca de 400 paresde sondas podem "marcar" uma seqüência de 5.000 bases decomprimento. Cada um desses pares de sonda é um par reativo(através da química modelada com ácido nucléico, conformedescrito na Figura 1) e produz um fluoroforo de precursoresde pré-fluoroforo. A fluorescência total gerada é a soma dageração de todos 400 fluoroforos. Para detectar, por exem-pio, uma seqüência gênica única de 5.000 bases de comprimen-to em uma amostra de DNA genômico de milho, é necessáriasimplesmente a preparação de uma amostra de DNA do milho esua adição uma mistura de 400 sondas de detecção de oligonu-cleotídeo em resistência iônica, temperatura e concentraçãode formamida apropriadas. Espera-se que a fluorescência to-tal gerada seja proporcional à quantidade dessa seqüênciagênica no DNA do milho. Os níveis de detecção calculados combase na sensibilidade conhecida dos instrumentos está dentroda faixa calculada para o rendimento de fluorescência espe-rado da técnica de marcação de gene com base na química mo-delada com ácido nucléico.
Exemplo de Projeto de Ensaio
Uma aplicação exemplar da invenção é detectar umacópia de um gene transgênico em uma planta transformada ge-neticamente, tal como, milho. 0 gene alvo pode ser, por e-xemplo, resistente a um herbicida. 0 gene poderia estar pre-sente em uma cópia simples ou múltipla cópias por genoma.Uma aplicação típica é determinar se uma batelada específicado milho continha esse gene ou não, e quantificar o númeromédio de cópias de genes por genoma.
Um exemplo de um ensaio para esse gene, de acordocom a presente invenção, primeiro envolve o isolamento decerca de 100 μg de DNA de milho total por homogeneização domilho em um misturador. 0 DNA do milho pode ser isolado em-pregando qualquer um dos vários kits para extração e purifi-cação do DNA da planta. O DNA é cisalhado a um tamanho médiopequeno, por exemplo, enviando o mesmo através de uma agulhahiperdérmica para tornar fácil a desnaturação em fitas sim-ples. O DNA então é aquecido brevemente a IOO0C e rapidamen-te resfriado para tornar o mesmo em fita simples. Uma mistu-ra de reação é então adicionada, contendo 400 partes de son-das de oligonucleotídeo, cada uma específica para uma se-qüência de DNA no gene alvo, e cada par contendo os doispré-fluoroforos reativos com DPC. Quando da incubação, tipi-camente em uma temperatura brandamente elevada (37°C) a flu-orescência gerada é medida em um leitor de microplaca fluo-rescente. A fluorescência gerada é calibrada usando amostrasde referência de DNA do milho com quantidades conhecidas dogene alvo. A quantidade esperada de fluoroforo gerado nesseexemplo é de cerca de 30 fentomols, que está bem dentro doslimites de detecção dos leitores de microplaca disponíveiscomercialmente.
Exemplo 3. Hibridização do Oligonucleotideo, Con-centração e Temperaturas de Fusão
Um sistema modelo foi preparado incluindo vinte edois mer-oligonucleotídeos com uma região complementar dedez bases e braços espaçadores em fita simples de dez bases,adicionalmente ligados a um braço espaçador de seis carbo-nos. Esses oligos foram sintetizados ambos com e sem uma 5'-biotina (com um braço espaçador de 6 carbonos). Conformemostrado abaixo, a região complementar é sublinhada. Um ter-ceiro oligo era idêntico ao oligo de fita (-) , porém com 4bases não combinadas (em itálico) em relação à fita ( + ).
Oligo 26 ( + ) fita 5' CTTCGGCCCAGATATCGT (SEQ.ID. N°24)
Oligo 27 (-) fita 3' GTCTATAGCATCGACATC (SEQ.ID. N°25)
Oligo 28 (-) não combinação 3' TACTATAGTGTCGACKIC (SEQ. ID.N°26)
As curvas de fusão do par de oligonucleotídeos de10 pares de base (oligo 26+oligo 27) foram examinadas pormedição da fluorescência de do corante SYBR ligando ao DNAde fita dupla em um Bio-Rad iCycler (Lipsky, e outros, Cli-nicai Chemistry 47 [4], 635-44. 2001). As curvas de ligaçãosão apresentadas como o primeiro derivado da inclinação dacurva de fusão, tal que, um valor máximo representa um pontode inflexão na curva (uma Tm, ou em uma população mista desítios em fita dupla, uma Tm "local"). As curvas de ligaçãopodem ser obtidas até pelo menos 70°C, como a avidina retématividade de ligação da biotina até essa temperatura e alémdela.
Para verificar a dependência desse par específicode oligonucleotídeos quando da concentração, as curvas defusão foram geradas para o par de oligonucleotídeos que va-riou na faixa de 500 a 20 nM (Figura 16) . (Vide, por exem-plo, Lipsky, e outros, Clinicai Chemistry 47 [4], 635-44.2001). A Tm observada caiu em uma faixa de cerca de 10°C pa-ra cada redução de dez vezes na concentração (onde RFU indi-ca as unidades de fluorescência relativas) do par de oligo-nucleotídeo, semelhante à previsão no gráfico da Figura 16.As curvas de fusão foram essencialmente idênticas para paresde oligonucleotídeo biotinilados e não biotinilados. Os qua-tro pares não combinados de base não mostraram essencialmen-te nenhuma estrutura de fita dupla.
De modo a testar se a ligação das fitas ( + ) e (-)a uma proteína alvo causaria um aumento na Tm, a versão bio-tinilada desses oligonucleotídeos foi incubada na presençada avidina. A avidina contém 4 sítios de ligação equivalen-tes, que são espaçados relativamente próximos e se ligam àbiotina muito apertadamente (Ka ~< IO"15 M) e não cooperati-vamente.
Apresentados com concentrações molares iguais deoligonucleotideos #26 e #27 na forma biotinilada, poderiaser esperado que cerca da metade dos sítios de ligação debiotina fossem ocupados por pares complementares de oligonu-cleotídeos, e cerca da metade com o mesmo oligonucleotídeo(pares não complementares). A previsão é que sejam observa-das duas máximas de curva de fusão na presença da avidina:Uma máxima seria o resultado de quaisquer pares de oligonu-cleotídeos que fossem tanto não ligados a avidina (livres nasolução) ou que tivessem apenas um parceiro dos dois ligadoa avidina, o que não exibiria um efeito de proximidade quan-do na Tm. Uma segunda máxima de Tm significativamente maiorrepresentaria um par de oligos biotinilados ambos ligados aavidina, que exibiriam um efeito de proximidade.
Tal experimento foi conduzido conforme mostrado naFigura 17. Os oligonucleotídeos foram adicionados a uma so-lução na presença ou ausência de uma avidina mantida a 60°C,uma assim denominada partida quente. Em uma "partida quen-te", os oligonucleotídeos se unem aos sítios de ligação debiotina a uma temperatura bem acima de sua Tm na solução,assegurando que eles sejam de fita simples. A solução foientão diminuída para IO0C e uma análise de curva de fusãofoi realizada ascendendo a 70°C. Conforme mostrado na Figura17, as curvas de fusão do par oligo não biotinilado na pre-sença ou ausência de avidina mostraram uma Tm de 30-32°C(onde RFU indica unidades de fluorescência relativa). Napresença da avidina, contudo, duas máximas de Tm bem separa-das foram geradas com valores de Tm de 33°C e 52°C. A máximade temperatura elevada (Tm elevada a quase 20°C) foi obser-vada apenas na presença de dois oligonucleotideos biotinila-dos complementares, na presença de avidina. A diferença naTm +/- biotina tendeu a ser maior em concentrações com teorde sal inferior (Figura 18) e ligeiramente maior na presençade cloreto de magnésio 10 mM (Figura 19) (onde RFU indicaunidades de fluorescência relativa). A razão molar ótima dosoligonucleotideos biotinilados para avidina foi verificadacomo sendo de cerca de 3,5:1 (com concentração total de oli-gos + avidina = 0,7 μΜ) consistente com a avidina possuindoquatro sítios de ligação equivalentes (Figura 20) (RFU indi-ca unidades de fluorescência relativa). Isso é importanteporque substancia que o requisito de que os oligonucleoti-deos se ligam à mesma molécula de avidina para o efeito Tmocorrer. A substituição de um oligo de fita (-) 3' biotini-lado por um oligonucleotídeo de fita 5' biotinilado mostroupouca diferença nos valores de Tm (Figura 21) (RFU indicaunidades de fluorescência relativa) com resultados anterio-res onde ambos oligonucleotideos eram 5' biotinilados.
Os resultados seriam essencialmente idênticos se oexperimento fosse conduzido por adição de quantidades equi-molares de ambos oligonucleotideos a temperatura ambiente,elevando para 60°C e então obtendo as curvas de fusão. Nessemétodo (bem como no método de partida quente) curvas de fu-são apropriadas podem ser geradas por adição de um excessomolar de cada oligo em relação à avidina, caso desejado.(Grandes excessos de pares de oligos aumentam o tamanho damáxima Tm baixa, contudo, conforme previsto). Isso não foiprejudicial na formação de DNA híbrido de Tm alta, uma vezque os pares dos oligos competiam igualmente para sítios deligação de biotina, à medida que eles eram adicionados emconjunto em quantidades molares iguais. Se os oligos fossemadicionados de uma vez, seria importante adicionar uma razãomolar de cerca de 2:1 do primeiro oligo para avidina seguidopor uma razão de 2:1 do segundo oligo. Com adição seqüenci-al, a adição de uma quantidade molar em excesso de cada oli-go em relação à avidina ocupa todos os sítios de ligação daavidina com o primeiro oligo e impede a ocupação dos sítiosadjacentes com o segundo oligo complementar e exibe o efeitode Tm elevada. Essas observações são consistentes com o me-canismo sendo de ligação de pares adjacentes de oligos com-plementes aos dois sítios de ligação de biotina adjacentes,de modo a obter híbridos exibindo máximas de Tm elevadas.
Os experimentos foram também conduzidos com um o-ligonucletídeo auto complementar de 10 bases que era compos-to totalmente de A e T. (Oligo 31:51-biotina-braço espaça-dor-TTTTTTTTTTTTTAATTAAA) (SEQ. ID. NO. 27). Uma vez que es-se oligonucleotídeo era homogêneo na composição de base ecomposto totalmente de AT, ele fundiu a uma Tm inferior aosistema modelo descrito acima e produziu uma curva pouco a-centuada. Na presença de avidina, sua Tm foi aumentada de30, 50C para 61,5°C (Figura 22) (onde RFU indica unidades defluorescência relativa). Uma vez que esse oligonucleotídeoera auto complementar, todos os eventos de ligação levaramas fitas complementares, ao invés de apenas metade dos even-tos. Assim, apenas uma máxima simples de Tm aumentada foiobservada.Esses experimentos foram repetidos usando anticor-po anti-biotina como um alvo ao invés da avidina. Anticorpoanti-biotina contém dois sítios de ligação de biotina loca-lizados próximo às extremidades da porção Fab do anticorpo,porém os sítios de ligação são muito mais afastados que ossítios de ligação da biotina na avidina.
Exemplo 4. Detecção dos Alvos de Proteína - Aptâ-meros como Ligantes Alvo
Aqui, um sistema exemplar foi projetado para uti-lizar azidocoumarina modelada com ácido nucléico (AzC) -química de trifenilfosfina (TPP) para detectar um alvo deproteína mediante ligação e recombinação de aptâmero de duassondas de DNA complementares.
Materiais
PDGF-BB e PDGF-AA humanos foram combinados de Sis-temas R&D (220-BB e 200-AA respectivamente). Anticorpo mono-clonal de subunidade P DGF-B anti-humano foi obtido da R&DSystems (MAB2201). Os tampões incluíram tampão Tris/Mg, a 50mM Tris/HCl, pH 8,0 - 10 mM MgCl2. Os oligonucleotídeos usa-dos foram como se segue:
Seqüências de Oligonucleotídeos Empregadas nesse
Exemplo
<table>table see original document page 88</column></row><table>ro
201 CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGC
(28) CCCCCCCCCATATTTAAGC
202 GCTTAAATATCCCCCCCCCCCAGGCTACGGCACGTA
(29) GAGCATCACCATGATCCTG
203 GTGGGAATGGTGCCCCCCCCCCCAGGCTACGGCAC
(30) GTAGAGCATCACCTGATCCTG
204
(31)
205
(32)
206
(33)
207
(34)
TPP nen-huma
ne-nhuma
ne-nhuma
AZC
DPC-aptâmero
sonda
DPC-aptâmero
AZC sonda
DPC-aptâmero
sonda-não com-binada
GTGGTAGTTGGAGTCGTGGCGTAGGCAAG ne- ne- alvo
A nhuma nhuma
GTGGTAGTTGGAGTCACACGTGGCGTAGG ne- ne- alvo
CAAGA nhuma nhuma
GTGGTAGTTGGAGCTCACACCACACGTGGCGTAGG
CAAGA ne- ne- alvo
nhuma nhuma
ne- ne- alvo
nhuma nhuma208
(35)
209
(36)
210
(37)
211
(38)
212
(39)
213
(40)
214
(41)
215
(42)
Métodos
ne- ne-nhuma nhuma
ne-nhuma
TPP
TPP
ne-nhuma
alvo
ne- ne- alvo k-ras
nhuma nhuma fragmentado
ne- ne- voltadonhuma nhuma fora
TPP
ne-nhuma
AZC
ne- ne-nhuma nhuma
para
sonda TPP
sonda TPP
ne- TPP não combi-nhuma nado
Sonda AZC
aptâmero
Condições de Reação DPC. Exceto conforme observa-do, cada reação de 100 microlitros continha um volume totalde 100 μl, tampão 1 χ Tris/Mg, 40 picomols de TPP e sondasde reação de AzCf 40 picomols de oligonucleotideo alvo ou deproteína alvo e tipicamente 25-30% v/v de formamida. As a-mostras foram incubadas a 25°C em um espectrofotômetro Wal-lac Victor 1420 e o aumento na fluorescência foi monitoradocom excitação a 355 nm e emissão a 460 nm.
Resultados: Detecção de PDFG-BB por Aptâmero-Sondas PDC
Conforme ilustrado na Figura 23, uma seqüência deaptâmero direcionada contra fator de crescimento derivado desubunidades de plaqueta (PDGF)B foi selecionada (Fang, e ou-tros, Chem. BioChem. 4, 829-34. 2003). A mesma pertence auma família de aptâmeros com forte afinidade com a unidadePDGF B (~10~9M) e afinidade reduzida de cerca de 10 vezespara subunidade PDGF (Green, e outros, Biochemistry 35,14413-24. 1996). As seqüências da sonda foram sintetizadas,cada uma contendo uma seqüência de 10-mer DNA, uma seqüênciaespaçadora Cio, e a mesma seqüência 35-mer aptâmero. (Oligos#201, #202). Cada seqüência continha um grupo 5'-TPP ou 3'-AZC com o mesmo aptâmero ligado 3' ou 5', respectivamente.Uma segunda sonda AzC, oligo #203, era a mesma que a oligo#202, exceto que esta seqüência recombinante era inteiramen-te não combinada com TPP oligo (#201).
Conforme mostrado na Figura 24, na presença deformamida a 30% (volume), a reação das sondas TPP e AzC pro-priamente foi inteiramente dependente da presença de PDGF-BBe seqüências de DNA complementares nas sondas. A reação fa-lhou na presença de cada sonda.
A dependência de DNA da reação foi criticamentedependente da temperatura de fusão do DNA em relação à tem-peratura de ensaio. Na presença de formamida a 0% (com a Tm> Tensaio calculada e observada, a reação aconteceu na presen-ça ou ausência da proteína alvo PDGF-BB (Figura 25A). De fa-to, sob essas condições, a adição de PDGF-BB não aumentou,porém reduziu a razão de reação em cerca de 50%. Na formami-da a 10%, PDGF-BB foi menos inibidora (Figura 25B). Na for-mamida a 20% (Figura 25A), a situação foi completamente in-vertida - a razão de ração era agora fraca, exceto na pre-sença de PDGF-BB. Na formamida a 30% (Figura 26B), a reaçãofoi completamente dependente da presença de PDGF-BB. Na for-mamida a 40%, a reação era agora lenta com qualquer conjuntode reagentes (Figura 27). Em todos os casos, as sondas nãocombinadas produziram pouca ou nenhuma reação.
Experimentos de fusão de DNA com as seqüênciascomplementares, monitorados com SYBR Green haviam indicadouma Tm da seqüência de cerca de 300C no tampão Tris/Mg naausência de formamida e cerca de 70C menor a cada 10% de au-mento na formamida. A Tm na concentração de formamida ótimapara o ensaio de detecção, 30%, foi de 10°C.
Na formamida a 0%, os oligonucleotídeos podem for-mar pelo menos um duplexo parcial, mesmo na ausência dePDGF-BB (Tm ligeiramente superior a TenSaio) · A dependência doDNA alvo das reações em formamida a 20% e 30% é explicadapelo ensaio sendo conduzido a uma temperatura superior a Tmna ausência da proteína alvo. Nenhuma reação ocorre a menosque a Tm do complexo seja aumentada por ligação das duassondas ao PDGF-BB alvo. Em formamida a 40%, a reação não o-corre com qualquer conjunto de reações. A explicação prová-vel é que tanto a Tm tenha sido reduzida a tão pouco que aligação ao PDGF-BB não pudesse aumentar a mesma acima da Ten-saio, ou que a formamida havia inibido a ligação de PDGF-BBaos aptâmeros. Uma situação mais complexa é a inibição ob-servada da razão de reação quando da adição de PDGF-BB naausência da formamida. Uma vez que a metade dos duplexosformados por PDGF-BB não são produtivos (50% serão homodu-plexos) a redução na razão é provavelmente devida a ligaçãode PDGF-BB impedindo esses homoduplexos de diassociação eentão reassociação na solução com pares complementares paraformar heteroduplexos. Essa situação não ocorreria usandopares de sondas especificamente direcionadas contra sitiosde ligação diferentes em um alvo heterodimérico.
A sensibilidade do ensaio (Figura 28) foi calcula-da por medição das razões de reação geradas de uma série dediluição de concentrações de PDGF-BB. 0 nivel de detecçãomínimo no instrumento Wallac foi estimado em 0,8 picomols emum ensaio de 100 microlitros de volume, com base no valorcalculado de três vezes o desvio padrão do ruído de fundo doensaio.
A sensibilidade do ensaio foi também determinadausando PDGF-AA como o alvo. Espera-se que o monômero aptâme-ro tenha uma afinidade para PDGF-AA cerca de dez vezes maisfraca que PDGF-BB. Contudo, esse ensaio envolve a formaçãode um complexo de dois aptâmero-dímeros para cada tipo dePDGF, espera-se que a avidez da ligação do dímero seja maisforte que a afinidade do monômero, e sua afinidade seriasubstancialmente mais forte (Ki inferior) que as concentra-ções testadas dos PDGFs alvo (para baixo, para cerca de 1nanomolar). Conforme mostrado na Figura 29, as razões de re-ação das sondas DPC de aptâmero para PDGF-AA em concentra-ções baias ou altas (0, 1,25, 2, 5, 5, 10, 20 e 40 pmol dePDGF-AA) não eram substancialmente diferentes das razões dereação com PDGF-BB. Isso é consistente com o modelo de umaligação de par de aptâmero como um dimero e exibindo avidezaumentada.
Razões de Sondas TPP para AzC. Para confirmar omodelo do mecanismo de reação (Figura 4, a razão ótima desondas TPP para AzC seria esperada como sendo de 1:1), a Fi-gura 30 representa um experimento onde a quantidade total deduas sondas foi mantida constante, em 800 nMols son-das/reação, enquanto a razão das duas sondas variou. A taxaproduzindo a razão de reação mais alta foi de aproximadamen-te 1:1, consistente com o mecanismo esperado.
Assim, nesse sistema modelo, a fluorescência nãofoi gerada a menos que os aptâmeros ligados e seqüênciascomplementares nas duas sondas recombinassem propriamente.
Exemplo 5. Arquitetura Codificada Zip para QuímicaModelada com Ácido Nucléico com Base na Biodetecção com Li-gantes de Aptâmero
A Figura 10 ilustra em mais detalhes uma arquite-tura de código zip exemplar. O par TPP continha, primeiro,um PDGF-aptâmero na extremidade 5', um espaçador à base deC18 polietileno-glicol e uma 18-mer seqüência de código zip.A seqüência repórter de TPP continha uma seqüência de códigoanti-zip complementar em seu término 3', um espaçador C18PEG, e uma seqüência repórter de dez pares de base terminan-do em um grupo 5' TPP. 0 par de oligonucleotideos compreen-dendo a sonda de detecção AzC continha um aptâmero 3' ligadoatravés de um espaçador C18 PEG para um código zip separadoe um oligonucleotideo de detecção ligado a um código anti-zip 5', um espaçador C18 PEG, e um oligonucleotideo repórter(complementar ao oligonucleotideo TPP) terminando em um gru-po 3' AzC.
A reação, em uma formamida a 35% a 220C, era de-pendente da presença de ambos os oligonucleotideos repórte-res, ambos os oligonucleotideos de aptâmero e o alvo, PDGF-BB (Figura 31) . A 22 0C na ausência de formamida, a reaçãoprosseguiu independentemente da presença de PDGF. Isso éconsistente com o comportamento da arquitetura de "uma peça"descrita acima, e reflete que o mecanismo de geração fluo-resceinica em formamida a 35% depende da estabilidade térmi-ca aumentada do duplexo da seqüência repórter na formamida,quando da adição de PDGF. Na ausência de formamida a 22°C, oduplexo de oligonucleotideo repórter é estável ambos na pre-sença e ausência de PDGF.
A confirmação da exatidão do modelo foi obtidacom experimentos variando a razão de TPP e aptâmero oligosAzC (Figura 32). Esses experimentos indicaram que a razãoótima do aptâmero oligos era a razão esperada 1:1 (isto é,TPP oligo a 50% com uma concentração total de PDGF e aptâme-ro oligos de 0,4 μΜ). A razão ótima de oligonucleotideos re-pórter total para aptâmero oligos total foi de 1:1. Nenhumareação dependente de PDGF ocorreu na ausência completa dosoligonucleotideos repórter ou aptâmero. Em concentrações deoligonucleotideos repórter superiores à estequiométrica, osinal independente de PDGF aumentou (base), porém o sinaldependente de PDGF permaneceu constante. Ambas observaçõessão consistenes com o modelo de que o complexo é montado narazão de 1:1:1 para cada um dos aptâmero oligos, cada um dosoligos repórter e PDGF.
Esses experimentos indicam que o complexo pode serauto montado na solução, tal que, cada código zip e seu có-digo anti-zip recombinam um no outro com interferência míni-ma com a seqüência de aptâmero ou seqüências repórter.
Também foram realizados experimentos para determi-nar se a ordem de adição e assim o conjunto da sondas aptâ-mero e repórter, foi de qualquer importância. Razões de rea-ção ligeiramente mais lentas foram obtidas se os oligonucle-otídeos de aptâmero fossem primeiro incubados com PDGF antesda adição dos oligonucleotídeos repórter, em comparação coma adição de todas as sondas em conjunto como uma mistura.Razões de reação pouco maiores foram obtidas se cada par deoligonucleotídeos aptâmero e oligonucleotídeos repórter fos-sem primeiro incubados e deixados montar propriamente antesdos dois conjuntos serem misturados e incubados com PDGF. Arazão para isso pode ser que exista algum impedimento esté-rico para código zip e anti-zip recombinando com a sonda deaptâmero, se a sonda de aptâmero já estiver ligada ao alvo.
Como um controle, foi comparado um conjunto de TPPde uma peça e sondas AzC, o qual continha apenas as seqüên-cias de código zip e seqüências diferentes de código zip eanti-zip (Figura 33) . As razões de reação desse sistema deuma peça foram semelhantes aquelas do sistema de duas peças,exceto que a razão melhorou devido a adição de PDGF que foiligeiramente melhor que aquela do sistema de duas peças.
A seqüência das sondas AzC e TPP contendo aptâmerotambém variou sistematicamente para determinar qualquer con-tenção no projeto. TPP contendo aptâmero e AzC oligos foramsintetizadas, ambas possuindo as mesmas seqüências conformedescrito na Figura 10, porém com as seguintes alterações:(1) omissão do espaçador C18-PEG. (Oligos 119 & 122); (2)substituição do espaçador C18-PEG pela seqüência Ci0. (Oli-gos 120 & 123); (3) substituição do espaçador C18-PEG com aseqüência C2o- (Oligos 121 & 124); (4) Omissão do espaçadorC18-PEG e omissão de 3 bases 3' na região de código zip (re-dução para 15 bases de comprimento). (Oligos 127 & 129) ;a e(5) omissão do espaçador C18-PEG e omissão de 6 bases 3' naregião de código zip (redução para 12 bases de comprimento).(Oligos 128 & 130).
Os oligonucleotideos usados nesse exemplo incluí am:
<table>table see original document page 97</column></row><table>5'-TPP
( SEQ. ID N0 45)
112 CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-X-GCTGCCATCGATGGTCAG X= Cl8 PEG
( SEQ. ID N° 46)
113 GTATTGGTGCTCGAGTCC-X-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG X= Cl8 PEG
( SEQ. ID N0 47)
119 GTATTGGTGCTCGAGTCCCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG( SEQ. ID N0 48)
12 0
GTATTGGTGCTCGAGTCCCCCCCCCCCCCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG
( SEQ. ID N0 49)
121
GTATTGGTGCTCGAGTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG
( SEQ. ID N0 50)
122 CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGCTGCCATCGATGGTCAG( SEQ. ID N0 51)
123
CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGCCCCCCCCCCGCTGCCATCGATGGTCAG
( SEQ. ID N0 52)
124
CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCTGCCATCGATGGTCAG
( SEQ. ID N0 53)12 7 CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGCTGCCATCGATGGT( SEQ. ID N0 54)
12 8 CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTGGCTGCCATCGAT( SEQ. ID N0 55)
12 9 TTGGTGCTCGAGTCCCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG( SEQ. ID N0 56)
130 GTGCTCGAGTCCCAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG
Nenhuma dessas alterações resultou em uma diferen-ça significativa no desenvolvimento do sistema. Experimentos4) e 5) também resultaram em uma estrutura de fita simplesde 3 e 6 bases (não recombinadas para código zip) imediata-mente a montante do espaçador C18 nos oligonucleotideos re-pórter.
Os resultados desses experimentos indicam que osistema de detecção de PDGF à base de aptâmero pode ser mon-tado separando a ligação e as funções de DPC em dois oligo-nucleotideos separados. Através da seleção das seqüências decódigo zip apropriado, o formato de detecção descrito na Fi-gura 9 foi montado propriamente em pares de oligonucleoti-deos recombinados que funcionarão similarmente em relaçãoaos oligonucleotideos em uma peça simples. Os oligonucleoti-deos repórter e aptâmero podem ser montados separadamentepara introdução do alvo, ou todas as espécies podem ser adi-cionadas em conjunto quase que em qualquer ordem. Esse pro-cesso pode ser estendido ao conjunto de solução-fase de maisde um par de oligos de detecção recombinados, por exemplo,para detectar múltiplos alvos. A detecção de alvos múltiplospode requerer o uso de diferentes oligonucleotideos repórterque geram sinais separadamente discerniveis (por exemplo,diferentes comprimentos de onda de luz emitida).
Esses resultados indicam que uma abordagem de re-pórter codificada zip pode ser efetivamente projetada, porexemplo, usando oligômeros contendo aptâmero.
Embora os resultados com o sistema aptâmero indi-quem que um complexo estável entre seqüências de ligação erepórter possa ser formado, simplesmente por recombinação deregiões de código zip e anti-zip, deve ser observado que e-xistem tecnologias para ligar covalente e irreversivelmenteos dois oligonucleotideos, com uma alta probabilidade de re-ter atividade dos grupos de reação repórter. Por exemplo, osoligonucleotideos podem ser incubados em pares (um oligonu-cleotideo ligante e um oligonucleotideo reativo para químicamodelada com ácido nucléico) a uma temperatura na qual oscódigos zip e códigos anti-zip são em sua maior parte de fi-ta dupla, porém o restante das seqüências são de fita dupla.Adição de um reticulador fotoativável, de intercalação, talcomo, Trioxaleno, seguido por irradiação de UV, pode reticu-lar irreversivelmente as duas fitas. De modo semelhante, airradiação de UV pode introduzir dímeros de timidina entrefitas separadas de seqüências recombinadas. Alternativamen-te, uma seqüência pode ser introduzida complementarmente aum DNA de alvo curto (junção), adjacente 3' e 5', que podeentão ser ligado com DNA ligase. 0 oligonucleotideo em jun-ção pode alternativamente ser composto de RNA, e removidoapós ligação com RNAse H, que hidrolisa RNA recombinado paraDNA. Isso pode resultar na conversão dos dois oligonucleoti-deos em uma peça simples de DNA de filamento simples. Essesmétodos podem conduzir à produção de custo-beneficio de rea-gentes de oligonucleotideo nos kits de detecção contra alvosespecíficos.
Referências relevantes para esse exemplo incluemCapaldi, e outros, Nucleic Acid Res. 28 [7], e21. 2000; Cas-tiglioni, e outros, Appl. and Exper. Microbio. 2004, 7161-72. 2004; Fang, e outros, Chem. BioChem. 4, 829-34. 2003;Gerry, e outros, J. Mol. Biol. 292, 251-62. 1999.
Exemplo 6. Arquitetura Codificada Zip para Biode-tecçâo com Base em PDC - Ligantes de Anticorpo
Em outra concretização, as seqüências de aptâmerosão substituídas com ligantes não DNA, tais como, anticor-pos. Para PDGF e outras proteínas alvo, as seqüências de ap-tâmero são substituídas com grupos quimicamente ativos, taiscomo, aldeídos, e reagidos com seqüências de ligante nãoDNA, tais como, anticorpos ou receptores para as proteínasalvo (Figura 34). 0 projeto ótimo para os oligonucleotídeosde ligante e repórter podem ser obtidos com considerações notamanho e geometria do ligante e tamanho e geometria dos sí-tios de ligação do alvo. Braços espaçadores mais longos oumais curtos, por exemplo, podem ser usados para transpor adistância entre os sítios de ligação no alvo e evitar impe-dimento estérico devido aos ligantes propriamente.
Com referência à Figura 34, o oligonucleotideo co-dificado zip projetado para hibridizar na molécula repórterTPP foi sintetizado contendo um grupo 5'-amino. 0 oligonu-cleotideo codificado zip projetado para hibridizar na molé-cuia repórter AzC continha um grupo 3'-amino. A síntese dosconjugados entre os oligonucleotideos e anticorpo anti-PDGF-BB foi realizada pela SoluLink Biosciences (San Diego, CA).
A tecnologia SoluLink para conjugação do anticorpoe oligonucleotideos requer primeiro a modificação dos gruposamino primários de anticorpo com succinimidil 2-hidrazinonicotinato acetona hidrazona) para incorporar umaacetona hidrozona no anticorpo. As aminas primárias dos oli-gonucleotideos são ativadas separadamente com succinimidil4-formilbenzoato. As duas moléculas ativadas são misturadasna razão desejada (tipicamente 6:1) e reagidas em um pHbrandamente ácido para formar uma ligação de hidrozona está-vel. Os detalhes dessa química são disponíveis nowww.SoluLink.com. Dois conjugados foram preparados: um con-tendo o código zip para recombinar o oligonucleotídeo repór-ter contendo AzC, e o outro contendo o código zip para re-combinar no oligonucleotídeo repórter contendo TPP.
Os conjugados de oligonucleotídeo-anticorpo rece-bidos da SoluLink foram adicionalmente purificados por cro-matografia de gel em uma coluna 1,6 χ 60 cm de Superdex S-200 (Amersham Biosciences) em tampão PBS (0,01 M de fosfatode potássio, pH 7,4 - 0,138M de cloreto de sódio). A máximade anticorpo, eluindo a cerca de 0,6 vezes o volume da colu-na, foi coletada e uma máxima de eluição adicional posteriorde oliognucleotídeo não conjugado de contaminação foi des-cartada. 0 conjugado de anticorpo foi concentrado por diáli-se inversa com um Slide-A-Lyzer de corte de peso molecularde 30 K Pierce usando Solução de Concentração Pierce. 0 teorda proteína foi determinado usando o kit de reagente Bio-RadMicro BCA e o teor de oligonucleotideo determinado usandocorante de ligante de DNA SYBR Gold (Molecular Probes (Euge-ne, OR) . Os conjugados foram ambos determinados para conteruma média de cerca de 3 oligonucleotídeos por molécula deproteína.
PDGF-BB humano recombinante (220-BB) e anti-PGF-BBmonoclonal de camundongo foram obtidos da R&D Systems (Mii-neapolis, MN).
As seqüências usadas nesse estudo incluíram (ondeAzC indica azidocoumarina e TPP indica trifenilfosfina):
Nome Seqüência (5'-3')
Repórter TPP TPP-(modificador amino C6)-CGAATTTATA-C18PEG-
TCAGCATCGTACCTCAGC
(SEQ. ID N°: 9) (SEQ. ID N°: 58)
Repórter AzC GGACTCGAGCACCAATAC-C18 PEG-TATAAATTCG-(modificadoramino Cl)-AzC
(SEQ. ID N°: 14) (SEQ. ID N°: 10)
Código zip AzC TTGGTGCTCGAGTCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-(modificadoramino C7)
(SEQ. ID N°: 59)
Código zip TPP (modificador amino C6)-
CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCGCTGAGGTACGATGCTGA
(SEQ. ID N°: 60)
Além disso, o modificador 5' amino C6 foi obtidoda Glen Research (da Glen Research phosphoramidite 10-1906).O modifiacdor 3'-amino C7 foi obtido da Glen Research (daGlen Research CPG 20-2957). O C18 PEG foi obtido da Glen Re-search (da Glen Research phosphoramidite 10-1918).
Conjunto de Conjugados de Anticorpo-Oligo com Oli-gonucleotideos Repórter
Os dois conjugados anticorpo-oligo com seus repór-teres foram primeiro montados separadamente em um volume de10 μl. Cada conjunto continha 0,5 μΜ (5 picomols) de conju-gado de anticorpo-oligonucleotideo e 0,15 μΜ de (15 pmols)de oligonucleotideo repórter complementar em 0,05 M deTris/HCl pH 8, Ο,ΟΙΜ cloreto de magnésio. Cada um foi incu-bado por pelo menos 15 minutos a 40C antes do uso na detec-ção da mistura de reação.
Detecção da Reação de Conjugados anti-PDGF-BBDPC/Repórteres com PDGF-BB
Para conduzir a reação de detecção, cada reaçãopode conter em um volume de 50 μΐ;: 10 μΐ, de cada conjunto deconjugado, preparados conforme descrito acima, e quantidadesvariáveis de PDGF-BB, em um tampão de 0,05 M Tris/HCl pH 8,Ο,ΟΙΜ cloreto de magnésio-40% volume/volume de formamida. Osconjuntos estão presentes nessa mistura de reação a 0,2 μΜ.As amostras são incubadas nos poços de uma microplaca de 96poços preta em um Luminômero Wallac Victor a 25°C. A fluo-rescência pode ser seguida versus tempo com excitação a 355nm e emissão a 460 nm.
As reações podem tipicamente ser realizadas a25°C, monitorando a geração de fluorescência no comprimentode onda ótimo do produto de reação, 7-amino coumarina.
Exemplo 7. Desenvolvimento e Significado Clinicode um Ensaio de Proteína de Fusão BCR-ABL
Uma plataforma de ensaio modular pode ser desen-volvida provendo aplicações amplas para a detecção específi-ca in vitro e in vivo de proteínas nos meios biológicos com-plexos. Essa plataforma utiliza química modelada com ácidonucléico (ou Química Programada de DNA, "DPC") que permite oacoplamento de reconhecimento da proteína in situ para a ge-ração de sinal de novo.
Espera-se que essa abordagem tenha um impacto sig-nificativo para diagnóstico precoce e monitoramento terapêu-tico dos pacientes com câncer. Para determinadas aplicações,essa abordagem é vantajosa pela provisão de um formato deensaio homogêneo simples, para facilitar o desenvolvimentode ensaios de ponto de cuidado. Para outras aplicações, essaabordagem pode ser usada com citometria de fluxo, por exem-plo, ou adaptada para imageamento in vivo.
Um ensaio à base de citometria de fluxo pode serestabelecido para que a proteína de fusão BCR-ABL identifi-que subpopulação(ões) de células responsáveis por doença re-sidual mínima (MRD) em pacientes com CML. A heterogeneidadedentro do mesmo tumor provou ser um desafio maior à farmaco-terapia de sucesso. Mesmo naqueles casos, tais como, leuce-mia mielóide crônica CML (Goldman, e outros, N Engl J Med349 1451-1464 (2003) ; Sawyers, N Engl J Med 340 1330-1340(1999)), onde a causa foi elucidada no nível molecular (Ro-wley, Nature 243 290-293 (1973); Lugo, e outros, Science 2471079-1082 (1990)) e alvejamento específico (Druker, e ou-tros, Nat Med, 2, 561-566 (1996); Deininger, e outros, J.Blood, 105, 2640-2653 (2005)) resultaram em razões altas deremissão (Sawyers, e outros, Blood, 99, 3530-3539 (2002);Kantarj ian, e outros, N Engl J Med 346, 645-652, (2002);Talpaz, e outros, Blood 99, 1928-1937 (2002)), diversos me-canismos fundamentando resistência primária e secundária epersistência da doença (Deininger, e outros Blood, 105,2640- 2653 (2005); Bhatia, e outros Blood 101, 4701-4707(2003); Elrick, e outros Blood 105 1862-1866 (2005)) até a-gora, apresentaram altas razões de cura. Embora as aborda-gens à base de PCR sejam muito sensíveis para detecção deMRD (Cortes, e outros, Blood 102, 83-86 (2003)), elas sozi-nhas não fornecem informações com relação à base molecularpara MRD em um paciente individual. 0 ensaio à base de pro-teína descrito aqui pode permitir uma abordagem à base decélula específica, usando citometria de fluxo de múltiplosparâmetros (Irish, e outros, Cell 118, 217-228 (2004)) paradefinir as células que causam MRD (por exemplo, estado dasbombas de influxo e efluxo (Grossman, e outros, Blood 106,1133-1134 (2005); Thomas, e outros, Blood 104 3739-3745(2004); Mountford, e outros, Blood 104 Abstract 716 (ASH)(2004)), receptores de integrina (Bueno-da-Silva, e outros,Cell Death Differ. 10, 592-598 (2003)) e de citocina (Chu, eoutros, Blood 103 3167-3174 (2004)), moduladores de apoptose(Aichberger, e outros, Blood 106 Abstract 1987 (ASH) (2005);
Aichberger, e outros, Blood 105, 33003-3311 (2005)), e ati-vação de via de sinalização (Jamieson e outros, N Engl J Med351, 657-667 (2004)) em pacientes individuais. A posse dessainformação permite decisões clínicas mais conscientes e aju-da a definir um foco para o desenvolvimento de novas estra-tégias terapêuticas. Por analogia, os resultados desse obje-tivo especifico, focado na CML, podem ser estendidos paraidentificar as subpopulações de células responsáveis por MRDem pacientes com ALL e AML. A modulação inerente dessa abor-dagem de ensaio de proteína facilitaria o desenvolvimento deensaios à base de citometria de fluxo para proteínas de fu-são E2A-PBX1, TEL/AML1, ML/AF4 e PML/RARa, AML-ETO associa-das a ALL e AML, respectivamente.
Dentro do objetivo de estender as medições em es-cala para incluírem a medição das proteínas em seu contextofuncionalmente relevante e/ou (pato)fisiológico, essa abor-dagem é projetada para permitir a detecção específica de ho-modímeros, heterodímeros e interações proteína-proteína in-dicativas do conjunto de complexos de transdução de sinal,todos na presença de suas contrapartes monoméricas. Assim,essa abordagem pode não ter valor para identificação e vali-dação de novos biomarcadores bonafide, que são mecanicamenteligados à patofisiologia de tipos específicos de câncer. Is-so pode aperfeiçoar o projeto de experimento clínico permi-tindo um melhor tratamento para o paciente individual.
Os princípios fundamentais da química modelada comácido nucléico e sua especificidade inerente podem ser usa-dos nos ambientes biológicos complexos para biodetecção deacordo com condições onde a integridade estrutural e funcio-nal dos analisados alvos sejam preservadas. A anexação dosgrupos reativos a um elemento de reconhecimento de analisado(por exemplo, anticorpos, aptâmeros ou moléculas pequenas)direcionam a reação química para ocorrer especificamente na-queles sítios contendo o analisado de interesse. Onde os re-agentes são não fluorescentes e o produto de reação é fluo-rescente, então um sinal de fundo não específico ("zero")muito baixo pode ser obtido, permitindo a medição dos anali-sados nos ambientes complexos, sem comprometer a especifici-dade ou sensibilidade.
Conforme representado na Figura 4, um par de son-das é usado. Cada elemento do par se liga independentementeà proteína através de seu respectivo elemento de reconheci-mento não mutuamente exclusivo. Cada elemento do par contémuma região de desoxioligonucleotídeo complementar, projetadapara recombinar uma com a outra apenas em concentrações mui-to maiores que aquelas usadas no ensaio. Contudo, quando am-bas as sondas são ligadas à proteína simultaneamente, suasconcentrações efetivas são aumentadas através da proximida-de, permitindo a hibridização de DNA entre os elementos dopar. Esse evento de hibridização dependente de proteína per-mite que os reagentes não fluorescentes anexados reajam parasofrer uma reação modelada com ácido nucléico que gera oproduto fluorescente. Dessa forma, o reconhecimento do ana-lisado envolvendo dois eventos de ligação independentes dis-para a geração do sinal de novo. A hibridização dependentede proteína entre os elementos do par de sonda pode servircomo um ponto de avidez no complexo ternário resultante. Aespecificidade inerente e afinidade de cada elemento de re-conhecimento (por exemplo, anticorpo, aptâmero ou .Iigante depeso molecular baixo) sozinho é melhorada nesse formato deensaio de reconhecimento duplo, aperfeiçoando sua especifi-cidade e sensibilidade efetivas.
Um dos estudos iniciais empregou a forma BB homo-dimérica de PDGF como o analisado e empregou aptâmeros comoelementos de reconhecimento de proteína conjugados para de-soxoligonucleotídeos complementares. Esses, por sua vez, sãoanexados aos reagentes não fluorescentes de trifenilfosfina(ligados em 5') e 7-azido-coumarina (ligados em 31 ) · A gera-ção da fluorescência, estritamente dependente da presença dePDGF, foi observada (Figura 28). Os espectros de excitação eemissão foram indicativos de 7-amino-coumarina, o produtoesperado. O aumento das concentrações de PDGF sob condiçõesonde os conjugados de aptâmeros não eram limitantes, forne-ceu aumentos proporcionais ao sinal de fluorescência. 0 si-nal máximo ocorreu quando a razão de conjugados complementa-res foi de 1:1. Adicionalmente, a geração da fluorescênciadependeu estritamente do emparelhamento de base correto Wat-son-Crick dos conjugados complementares. A introdução de de-soxoligonucleotideos não combinados de base simples não con-duziu à geração de fluorescência dependente de PDGF.
Esses dados são consistentes com o modelo que sesegue: a porção de aptâmero dos conjugados se liga ao PDGFinduzindo, através da proximidade, altas molaridades efeti-vas. Isso conduz à formação de um duplexo de DNA entre o parcomplementar de conjugados que, por sua vez, sustenta a for-mação do produto de reação modelado com ácido nucléico. Issopermite que os precursores não fluorescentes reajam entre sipara gerar um sinal que é diretamente acoplado para reconhe-cimento do analisado. A geração de fluorescência pode serbloqueada usando aptâmeros não conjugados que competem comos conjugados de aptâmero-desoxoligonucleotideos para liga-ção de PDF. Um excesso molar de 25 vezes o aptâmero não con-jugado foi necessário para competir com o aptâmero conjugadode modo a reduzir a geração de sinal em 50%.
Ensaio para Identificar Populações de Células Po-sitivas para BCR-ABL em Pacientes com CML com Doença Residu-al Minima
Um ensaio de proteína aplicando a presente inven-ção que caracteriza reconhecimento duplo de um analisado de-sencadeando a geração do sinal de novo pode ser usado para amedição de BCR-ABL no contexto de uma célula. Utilizando acitometria de fluxo de múltiplos parâmetros, essa abordagempode identificar a população de células responsáveis pelaMRD. Essa seria a etapa crítica para definir o perfil da cé-lula causando MRD levando a uma determinação com base no me-canismo do melhor curso do tratamento para pacientes indivi-duais.
Preparação de Conjugados DPC Anti-BCR e Anti-ABLDesoxioliqonucleotideo-Anticorpo
Um protocolo geral foi desenvolvido para conjugartanto 5' quanto 3' desoxioligonucleotídeos aldeídicos paraanticorpos usando o reagente hetero-bifuncional succinimidilβ-hidrazinonicotinato acetona hidrazona (SANH) com base nosprotocolos publicados, por exemplo, (www.solulink.com). Osconjugados foram purificados usando cromatografia de exclu-são de gel seguido por cromatografia de troca de ânion e ograu de conjugação de oligonucleótideo por molécula de anti-corpo foi quantificado usando melhoramento de fluorescênciaSYRB Gold. Essa abordagem pode se aplicada para disposiçãocomercial de anticorpos anti-BCR e anti-ABL monoclonais.
Uma instalação de anticorpo monoclonal de altaqualidade pode também ajudar a gerar novos anticorpos paraBCR e ABL. As capacidades de modelagem molecular podem seraplicadas para prever epitopos que: 1) estão presentes emdois subtipos de proteína de fusão clinicamente relevante,B3/A2 e B2/A2, 2) topologicamente orientados para permitirque pares de anticorpos se liguem favoravelmente, 3) prova-velmente sendo insensíveis à dimerização da proteína de fu-são, ligação de Gleevec, mutações conferindo resistência co-nhecida e talvez ligação de substrato.
Detecção de Proteína de Fusão BCR-ABL Purificada
Os pares de sonda gerados podem ser usados paradesenvolver um ensaio para proteína de fusão BCR-ABL em umamaneira análoga ao ensaio PDGF descrito acima. Um elementodo par de sonda terá anticorpo anti-BCR como seu elemento dereconhecimento, enquanto o elemento complementar utilizaráanti-ABL como seu elemento de reconhecimento. A proteína defusão BCR-ABL (B3/B2) foi expressa a partir da construção deexpressão de baculovirus P210(bcr-abl) gerada por junção deDNAcs bcr e abi com um fragmento de junção bcr-abl de K562DNAc e colocando o mesmo em pDEST8. BCR e ABL de comprimentopleno podem ser usados para garantir que o ensaio seja espe-cífico para a proteína de fusão. 0 limite de detecção é de-terminado usando a proteína de fusão B3/A2 purificada e pro-teina de fusão derivada de lisados de célula positivos B2/A2e B3/A2. A extensão da interface de lisados de célula nega-tivos BCR-ABL pode também ser determinada.
Reações para Geração de Fluoroforo
A química repórter descrita aqui pode ser aplicadapara geração de fluoroforo. Preferivelmente, a química ren-derá fluoroforos com excitação máxima > 500 nm, emissão má-xima > 600 nm com rendimentos quantitativos superiores a 0,5de precursores á base de DPC relativamente estáveis não pos-suindo fluorescência própria apreciável.
Ensaio de Citometria de Fluxo para Identificar Po-pulações de Célula Positivas BCR-ABL de Pacientes com CML
Preparar conjugados desoxioligonucleotídeo anti-BCR e anti-ABC que possuem corantes fluorescentes padrão u-sados para citometria de fluxo ligada no lugar do compostoreativo modelado com ácido nucléico (reagentes). Esses podemser usados como controles positivos para otimizar as condi-ções de fixação e permeabilização para garantir o acesso in-tracelular dos pares de sonda de detecção. Linhagens de cé-lulas derivadas de paciente com mielóide humana podem serusadas. As condições iniciais podem ter como base protocolosimplementados por estudo de ativação das vias de transduçãode sinal intracelular (Jamieson, e outros, N Engl J Med 351,657-667 (2004)) usando anticorpos cinase específicos de es-tado de ativação (Irish, e outros, Cell 118, 217-228(2004)). Com base nesses resultados, um par de sonda otimi-zado para citometria de fluxo é designado e preparado.
Um ensaio de citometria de fluxo com base em pro-tótipo DPC pode ser desenvolvido. Inicialmente, várias li-nhagens de células derivadas de paciente B3/A2 e B2/A2 posi-tivas que incluíam células K562 podem ser usadas. A especi-ficidade e sensibilidade podem ser determinadas por diluiçãodessas células positivas com células negativas BCR-ABL. 0objetivo é detectar 10-30 células BCR-ABL positivas na pre-sença de 1 milhão de células BCR-ABL negativas. Uma vez queesse objetivo é encontrado, o ensaio pode ser adicionalmentevalidado com amostras de pacientes com CML e voluntáriossaudáveis. A especificidade e a sensibilidade desse ensaiopodem ser comparadas aos métodos validados que utilizam hi-bridização fluoresceinica in situ (FISH) (Schoch, e outros,Leukemia 1653-59 (2002)) e reação em cadeia da DNA/RNA poli-merase (PCR) (Elrick, e outros, Blood 105 1862-1866 (2005)).
Portanto, uma análise de classificação de células ativadaspor fluorescência (FACS) nas amostras dos vários pacientespode ser realizada.
Existe uma evidência considerável sugerindo quealguns dos mecanismos são responsáveis pela resistência pri-mária e secundária a Gleevec e persistência da doença em pa-cientes com CML. Além das mutações no domínio de base deBCR-ABL, bombas de influxo e efluxo, receptores de integrinae citocina, moduladores de apoptose e vias de sinalizaçãoenvolvendo MAPcinase e beta-catenina estão implicados. Tendoesses resultados como guia, seria possível estabelece perfisde células de causam a MRD em pacientes individuais por em-prego do ensaio de proteína BCR-ABL proposto em um formatode citometria de fluxo de múltiplos parâmetros. Essa aborda-gem seria análoga ao perfil celular de redes de fosfo-proteina potencializada em células cancerígenas. As "bioas-sinaturas" dessas células causando MRD poderiam então sercomparadas entre pacientes individuais antes e em respostaaos vários regimes terapêuticos. Em vista da diversidade demecanismos em potencial antecipando curas, o perfil celularprovaria não ter valor para assegurar que cada paciente in-dividual receba a farmacoterapia mais apropriada. Irish, eoutros, Cell 118, 217-228 (2004); Crossman, e outros, Blood106, 1 133-1 134 (2005); Thomas, e outros, Blood 104 3739-3745 (2004); Mountford, e outros, Blood 104 Abstract 716(ASH) (2004); Bueno-da-Silva, e outros, Cell Death Differ.10, 592-598 (2003); Chu, e outros, Blood 103 3167-3174(2004); Aichberger, e outros, Blood 106 Abstract 1987 (ASH)(2005); Aichberger, e outros, Blood 105, 33003-331 1 (2005);Jamieson, e outros, N Engl J Med 351, 657-667 (2004).
Aspectos variados e gerais da química modelada comácido nucléico são discutidos a seguir. Informações adicio-nais podem ser encontradas nas Publicações de Pedido de Pa-tente US números 2004/0180412 Al (USSN 10/643.752) por Liu eoutros e 2003/01 13738 Al (USSN 10/101 .030) por Liu e outros.
Exemplo 8. Geração de Vários Corantes Modeladoscom Ácido Nucléico
Três oligonucleotídeos foram preparados usandoquímica de fosforamidita padrão e purificados por C18 colunade fase inversa (Glen Research, Sterling VA, USA). Oligonu-cleotídeos, portanto grupo 5'-amino (EDC2 e EDC3) foram pre-parados usando grupos 5'-Amino-Modificador 5 e Oligonucleo-tideos portando 3'-amino )EDC1) foram preparados usando 3'-Amino-Modificador C7 GPC (Glen Research, Sterling VA, USA) .
A concentração de DNA e DNA conjugado heterociclico foi de-terminada pela absorvência de UV a 260 nm. A contribuição daabsorvência de UV a 260 nm da fração heterociclica no DNAconjugado heterociclico era insignificante e não foi consi-derada.
<table>table see original document page 115</column></row><table>
O Esquema 14 fornece dois exemplos de síntese deprecursores heterocíclicos conjugados com DNA para condensa-ção de aldol.
Esquema 14. Síntese dos Precursores HeterocíclicosConjugados com DNA 3 e 6
<formula>formula see original document page 115</formula>
Síntese do composto 1: Ao ácido 5-bromovalérico(2,435 g, 13,45 mmols) foi adicionada 2,3,3-trimetilindolenina (2,141 g, 13,45 mmols). A mistura de rea-ção foi aquecida com agitação vigorosa a IlO0C por toda noi-te. O óleo aglutinante vermelho escuro obtido foi transferi-do para um extrator Gregar e extraído com EtOAc por todanoite. Um sólido vermelho claro foi obtido. 0 sólido foi re-dissolvido em 30 mL de MeOH. MeOH foi removido sob pressãoreduzida e o resíduo remanescente foi tratado com 10 mL deEtOAc. 0 sólido amarronzado foi precipitado e filtrado. 0sólido foi lavado com 2 χ 50 mL de acetona e 2 χ 100 mL deEtOAc. No total foram obtidas 1.590 g de sólido amarronzadoclaro (35% de rendimento). 1HNMR (DMS0)ôppm: 7,98 (m, 1H) ,7,84 (m, 1H), 7,61 (m, 2H), 4,49 (t, 2H), 2,84 (s, 3H) , 2,30(t, 2H) , 1,84 (m, 2H), 1,63 (m, 2H), 1,53 (s, 6H), MALDI-MS(modo positivo): 260.2419.
Síntese do composto 2: 0 composto 1 (0,1 g, 0,294mmols), N-hidróxi succinimida (0,068 g, 0,588 mmols) e N,N'~dicicloexilcarbodiimida (DCC) (0,085 g, 0,11 mmols) foramprecipitados em 1,5 mL de DMF. A mistura de reação foi agi-tada a 37°C por 1 hora. A dicicloexiluréia precipitada (DCU)foi removida por filtração, e o filtrado foi tratado com 15mL de éter. 0 sólido laranja claro foi lavado três vezes com10 mL de éter e seco sob vácuo por várias horas. 0 sólidoobtido foi usado diretamente para a próxima reação. MALDI-MS(modo positivo): 357.1590.
Síntese do composto 3: A um frasco de centrifuga-ção de 1,5 mL contendo 20 nmols de DNA (EDCl) foram adicio-nados 41,6 μL de 0,1M tampão fosfato de sódio (NaPi) , pH8,6, 41,6 μl, do composto 2 em NMP (96 mM) e 41,6 μΐ, de NMP.0 frasco foi colocado em um agitador e agitado por 4 horas a37°C. A mistura de reação foi desalinizada por filtração emgel usando Sephadex G-25 e então purificada por coluna C18de fase inversa. Um total de 8,81 nmols do produto desejadoforam obtidos (44% de rendimento). LC-MS (modo negativo):calculado para C172H221N60O96P15 (monoisotópico) : 1024.4070 [M-5ΗΓ5; 1280.7473 [M-4H]"4 Encontrado: 1024.3986 [M-5H]5";1280. 7473 [M-4H] 4"
Síntese do composto 4 (procedimento semelhante docomposto de sintetização 1): 4-metilpiridina (1,245 g, 13,37mmols) e ácido 5-bromovalérico (2.4203 g, 13,37 mmols) aque-cida com agitação vigorosa a IlO0C por toda noite. Foram a-dicionados 50 mL de EtOAc ao óleo viscoso. Um sólido borgo-nha obtido foi rompido e lavado extensivamente com EtOAc eacetona. 0 sólido foi filtrado e seco sob vácuo para forne-cer 1, 886 g de 4 como um sólido branco (51% de rendimento) .1H NMR (CD3OD )ôppm: 8,84 (d, 1H) , 7,96 (d, 1H) , 4,6 (t, 2H) ,2,69 (s, 3H) 2,40 (t, 2H), 2,05 (t, 2H) 1,65 (m, 2H). MALDI-MS (modo positivo): 194.1457.
Síntese do composto 5: 0 composto 5 foi sintetiza-do seguindo-se o mesmo procedimento de síntese do composto 2e foi usado diretamente para conjugação de DNA sem precipi-tação de éter. MALDI-MS (modo positivo): 291.1605.
Síntese do composto 6: Seguindo-se o procedimentogeral de marcação do DNA, 20 nmol de DNA (EDCl) foram reagi-dos com o composto 5, por toda a noite, a 370C para fornecer9,05 nmol de DNA 6 conjugado com piridínio puro (45% de ren-dimento) . LC-MS (modo negativo) : calculado paraCi68H2IiN6OO96Pi5 (monoisotópico) : 1264.2385 [M-4H]4"; 1685.9872[M-3 ] 3~ Encontrado: 1264.2313 [M-4H]4"; 1685 . 9871 [M-3H] 3~
Síntese de Precursores de Aldeldo Conjugados comDNA para Condensação de Aldol e Reação de Wittig
O Esquema 15 e o Esquema 16 mostram dois exemplosde introdução da funcionalidade do ácido aos heterocíclicosatravés de quaternização de Ν. 0 Esquema 17 fornece um exem-plo de conversão de um grupo ciano em um grupo ácido paraconjugação com DNA.
Esquema 15: Síntese de aldeído heterocíclico nãoquaternário para conjugação de biopolímero
<formula>formula see original document page 118</formula>
Esquema 16: Síntese de Aldeídos HeterocíclicosQuaternários para Conjugação de Biopolímero<formula>formula see original document page 119</formula>
Esquema 17: Síntese de Aldeidos Aromáticos Substi-tuídos com Amino Conjugados com DNA
<formula>formula see original document page 119</formula>
Síntese do composto 7: Uma mistura de 1 (0,25 g,0,735 mmol) e hidróxido de sódio (0,039 g, 0,970 mmol) foidissolvida em 1,9 m de água e agitada vigorosamente a tempe-ratura ambiente. Após 3 horas, a mistura de reação foi car-regada diretamente em uma C18 coluna de fase inversa de 4,3g RediSep. A.coluna foi lavada primeiro com água para reti-rada do excesso de sal e então com acetonitrila para eluir oproduto. Um total de 0,178 g do produto foram obtidos (86%de rendimento). 1H NMR (DMSO) ôppm: 7,11 (dd, 1H) , 7,05 (dt,IH) , 6,66 (dt, 1Η) , 6,61 (dd, 1Η) , 3,85 (d, 2Η) , 3,45 (t,2Η) , 1,48 (m, 4Η), 1,88 (t, 2Η), 1,24 (s, 6Η) . (Wang, e ou-tros, Dyes and Pigments 2003, 57, 171-179).
Síntese do composto 8: Em um frasco de vidro de 4mL com septo de PTFE/silicone sob Ar foram adicionados 300μl, de DMF anidro. O frasco e seu conteúdo foram resfriadosem um banho de gelo-sal por 10 minutos, então 84 μΐ, de oxi-cloreto de fósforo foram adicionados. Após mais 10 minutos,uma solução do composto 7 (0,15 g, 0, 533 mmol) em 300 μί deDMF foi adicionada lenatmente. A solução se tornou viscosa.O frasco foi transferido para um agitador pré-aquecido a370C e agitado por mais 45 minutos. 200 mg de gelo foram a-dicionados à mistura de reação com agitação cuidadosa, se-guido por 450 mg de NaOH em 1,2 mL de água. A suspensão re-sultante foi primeiro purificada por uma C18 coluna de faseinversa RediSep de 12 g em um sistema de Cromatografia Com-biFlash Companion (Teledyne ISCO) (acetonitrila/água) e en-tão por cromatografia de camada fina de semi-preparação(sistema solvente: 70:29:1 CH2Cl2 : MeOH: AcOH). Um total de26 mg de produto puro foram obtidos (16% de rendimento). 1HNMR (CD2OD) ôppm: 9,79 (d, 1H) , 7,35 (d, 1H) , 7,35 (d, 1H) ,7,31 (t, 1H), 7,11 (t, 2H), 5,51 (d, 1H) 3,85 (t, 2H), 2,25(t, 2H), 1,73 (m, 4H), 1,65 (s, 6H). (Wang, e outros., Dyesand Pigments 2003, 57, 171-179).
Síntese do composto 9: A uma solução de benzotia-zol-2-carbaldeído (102 mg, 0,623 mmol) e ZnBr2 (140 mg,0, 623 mmol) em 1,5 mL de THF foi adicionada uma solução de(E)-N-(2,2-bis(trimetilssilil)etilideno)-2-metilpropan-2-amina (167 mg, 0, 685 mmol) em THF (0,3 mL) gota a gota atemperatura ambiente. Após ser agitada por 2 horas, a mistu-ra resultante foi hidrolisada por adição de uma solução a-quosa de ZnC12 (297 mg em 2,2 mL de água) e éter (2,56 mL)(a extensão da hidrólise foi monitorada por análise deHPLC). THF foi removido por uma corrente de Ar. A camada a-quosa foi extraída com CH2Cl2. Após secagem sobre MgSO4, oproduto bruto foi purificado por uma coluna de gel de sílicaRediSep de 12 g em um sistema de cromatografia CombiFlashCompanion (EtOAc/hexanos). 97 mg do produto foram obtidos(82% de rendimento). 1H NMR (CD3Cl)ôppm: 9,8 (d, 1H) , 8,1 (d,1H), 7,9 (d, 1H), 7,7 (d, 1H), 7,6 (t, 1H), 7,5 (t, 1H), 6,9(dd, 1H) . (Bellassoued, e outros., A. J. Org. Chem. 1993,58, 2517-2522)
Síntese do composto 12: Em um frasco de forma re-donda de 50 mL contendo IV-metil-iV-cianoetil-4-aminobenzaldeído (1,024 g, 5,44 mmol) foram adicionados 27,2mL de solução 5N NaOH e 6,8 mL de H202 a 30%. A mistura dereação foi refluxada por 2 horas. Após resfriamento, a mis-tura de reação foi neutralizada por adição de HCl concentra-do (37%, peso), e extraída com 2 χ 100 mL de EtOAc e 1 χ 100mL de CH2Cl2. As camadas orgânicas foram combinadas e lava-das uma vez com 50 mL de salmoura e concentradas à secura. 0produto bruto foi purificado por uma coluna de gel de sílicaRediSep de 40 g em um sistema de cromatografia CombiFlashCompanion (EtOAc/MeOH). Um total de 0,702 g de sólido de corrosa claro foi obtido (62%). Electrospray MS: M+H 208,0735.(Brady, e outros, J. Biol. Chem. 2001, 276, 18812-18818).Síntese do composto 13: 0 composto 13 foi sinteti-zado, seguindo-se o mesmo procedimento de sintetização docomposto 2 e foi usado diretamente para conjugação de DNAsem precipitação de éter.
Síntese do composto 14: Seguindo-se o procedimentogeral de marcação com DNA, 20 nmol de DNA (EDC2) foram rea-gidos com o composto 13, por toda a noite, a 37°C, para for-necer 8,8 nmol de 14 (44%). LC-MS: Calculado paraC158H204N57OÇUP15 (monoisotópico) : 1203.9710 [M-4H]4-; 1605.6309[M-3H] 3~ Encontrado: 1203.9664 [M-4H]4"; 1605.6305 [M-3H]3"Síntese do composto 15: Seguindo-se o procedimentogeral de marcação com DNA, 20 nmol de DNA (EDC3) foram rea-gidos com o composto 13, por toda a noite, a 37°C, para for-necer 9,7 nmol de 15 (49%). ' LC-MS: Calculado paraCI59H204N59O91P15 (monoisotópico): 1213.9725 [M-4H]4";1618.9660 [M-3H]3" Encontrado: 1213.9620 [M-4H]4";1618.9590 [M-3H] 3~
Síntese de Precursores para Reação de Wittig eHorner
Um exemplo de sintetização de sal de fosfônio aro-mático substituído com amino foi apresentado (Esquema 18)aqui, empregando um procedimento conveniente de um recipien-te, sem isolamento do reagente haleto.
Esquema 18: Síntese do Sal de Fosfônio AromáticoSubstituído com Amino<formula>formula see original document page 123</formula>
Síntese do composto 16: A uma solução de julolidi-na (0,97 g, 5,60 mmol), ácido 4-(difenilfosfino)benzóico(1,715 g, 5,60 mmol) e aldeido parafórmico (0,168 g) em 8 mLde tolueno foram adicionados NaI (0,84 g, 5,60 mmol), água(0,397 mL) e HOAc (1,13 mL). A mistura foi refluxada por to-da noite. Após adição de 15 mL de água, a mistura de reaçãofoi extraída duas vezes com CfoCl2. A camada de CH2Cl2 combi-nada foi lavada duas vezes com NaHCC>3 saturado, então umavez com água e seca sobre Na2SO4. Após remoção do solvente,o resíduo foi purificado por uma coluna de gel de sílica Re-diSep de 40 g em um sistema de cromatograf ia CombiFlashCompanion (EtOAc/hexanos). Foram obtidos 1,77 g de sólidoamarelo (51% de rendimento). 1H NMR (CD3Cl)ôppm: 8,01 (dd,2H) , 7,86 (t, 2H), 7,77 (m, 4H), 7,62 (m,4H), 7,52 (m, 2H) ,6, 20 (s, 2H) , 4,77 (d,2H), 3,03 (t, 4H), 2,36 (t,4H), 1,75(m, 4H) , MS (modo positivo): 492,205
Geração de Polimetina Através da Condensação deAldol na Condição Aquosa
Embora a maior parte dos dados da literatura pre-cedente indiquem que a condensação do aldol apenas aconteceem condições severas (refluxo de etanol em condição básica),nós mostramos aqui dois exemplos onde o precursor heterocí-clico W-quaternário portando hidrogênio ativo participa dacondensação do aldol em condição aquosa branda. No Esquema19, após mistura do composto 1 e 12 no tampão aquoso porpoucos minutos, uma cor púrpura profunda foi observada. Aanálise da massa indica a formação do produto de condensaçãode Aldol (Figura 35) e a mistura de reação diluída mostra afluorescência do corante hemicianina característica (Figura36, Excitação: 543 nm e Emissão: 586 nm). O Esquema 20 ilus-tra outro exemplo de condensação de aldol em condições aquo-sas, onde o produto de hemicianina purificado exibe fluores-cência era 615 nm (Excitação a 540 nm, Figura 37).
Esquema 19. Condensação de Aldol dos Compostos 1 e12 na Condição Aquosa
<formula>formula see original document page 124</formula>
Esquema 20. Condensação de Aldol de Julolidina eBenzotiazólio em Condição Aquosa
<formula>formula see original document page 124</formula>
Geração de Polimetina Através da Reação Modeladacom Ácido Nucléico
0 Esquema 21 ilustra um exemplo da condensação dealdol modelada com ácido nucléico entre o composto 3 e ocomposto 14. Após incubação por toda noite a 37°C, análiseLC-MS do produto mostrou a formação do corante polimetina(Figura 38).
Esquema 21. Condensação de Aldol Programada comDNA Entre o Composto 2 e o Composto 14
<formula>formula see original document page 125</formula>
INCORPORAÇÃO COMO REFERÊNCIA
A revelação completa das publicações e documentosde patente referidos aqui é incorporada como referência, emsua totalidade, para todos os fins, do mesmo modo como secada publicação e documento de patente tivesse sido indicadoaqui individualmente.
EQUIVALENTES
A invenção pode ser concretizada em outras formasespecificas, sem com isto fugir do espirito ou característi-cas essenciais da mesma. As modalidades precedentes devem,portanto, ser consideradas e todos os aspectos como ilustra-tivas, não limitando a invenção descrita aqui. 0 escopo dainvenção é assim indicado pelas reivindicações apensas, aoinvés da descrição precedente e todas alterações que se en-contrem dentro do significado e faixa de equivalência dasreivindicações serão entendidas como sendo englobadas.

Claims (71)

1. Método para detecção de uma seqüência de nucle-otídeos alvo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) fornecer (1) uma primeira sonda compreendendo(i) uma primeira seqüência de nucleotideos e (ii) um primei-ro grupo reativo ligado à primeira seqüência de oligonucleo-tideos, e (2) uma segunda sonda compreendendo (i) uma segun-da seqüência de oligonucleotideos e (ii) um segundo gruporeativo ligado à segunda seqüência de oligonucleotideos, on-de a primeira seqüência de oligonucleotideos e a segunda se-qüência de oligonucleotideos são complementares a duas regi-ões separadas do nucleotideo alvo;(b) combinar a primeira sonda e a segunda sondacom uma amostra a ser testada quanto à presença da seqüênciade nucleotideos alvo sob condições em que a primeira sonda ea segunda sonda hibridizem para suas respectivas regiõescomplementares da seqüência de nucleotideos alvo, se presen-te na amostra, trazendo, desta forma, o primeiro grupo rea-tivo e o segundo grupo reativo a uma proximidade reativa; e(c) detectar uma reação entre o primeiro grupo re-ativo e o segundo grupo reativo, determinando, assim, a pre-sença da seqüência de nucleotideos alvo.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da reação do pri-meiro grupo reativo e do segundo grupo reativo compreendeuma fração cromófora ou fluorescente.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o produto da reação do pri-meiro grupo reativo e do segundo grupo reativo compreendeuma fração fluorescente.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração fluorescente é sele-cionada do grupo consistindo em corantes de cianina, coran-tes de hemocianina e corantes de coumarina.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração fluorescente é umcorante de polimetina.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação do primeiro gruporeativo e do segundo grupo reativo é pelo acoplamento quími-co do primeiro grupo reativo e do segundo grupo reativo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração cromófora ou fluo-rescente está covalentemente ligada a uma ou ambas primeirasonda e segunda sonda.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a fração cromófora ou fluo-rescente não está covalentemente ligada à primeira sonda,nem à segunda sonda.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação do primeiro gruporeativo e do segundo grupo reativo resulta na liberação deum co-fator de enzima.
10. Método para detecção de uma seqüência de nu-cleotídeos alvo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) fornecer um conjunto de pares de sondas, cadapar de sondas compreendendo (1) uma primeira sonda compreen-dendo (i) uma primeira seqüência de oligonucleotideos e (ii)um primeiro grupo reativo ligado à primeira seqüência de o-ligonucleotideos, e (2) uma segunda sonda compreendendo (i)uma segunda seqüência de oligonucleotideos e (ii) um segundogrupo reativo correspondente ligado à segunda seqüência deoligonucleotideos, onde a primeira seqüência de oligonucleo-tideos e a segunda seqüência de oligonucleotideos são com-plementares às duas regiões separadas do nucleotideo alvo;(b) combinar o conjunto de pares de sondas com umaamostra a ser testada quanto à presença da seqüência de nu-cleotideos alvo sob condições onde cada uma das primeirassondas e segundas sondas dos pares de sondas hibridizam parasüa respectiva região complementar da seqüência de nucleotí-deos alvo, se presente na amostra, trazendo, desta forma, ospares correspondentes dos primeiros e segundos grupos reati-vos a uma proximidade reativa; e(c) detectar uma ou mais reações entre os paresdos primeiros grupos reativos e dos segundos grupos reativoscorrespondentes, determinando, assim, a presença da seqüên-cia de nucleotideos alvo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o número de pares de sondasestá entre 2 e 10.000.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o número de pares de sondasestá entre 5 e 5.000.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o número de pares de sondasestá entre 10 e 1.000.
14. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que as reações entre os primeirosgrupos reativos e os segundos grupos reativos são idênticasao longo dos pares de sondas.
15. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que as reações entre os primeirosgrupos reativos e os segundos grupos reativos corresponden-tes não são todas idênticas ao longo dos pares de sondas.
16. Método, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a hibridização dos pares desondas para seqüência de nucleotideos alvo ocorre sob condi-ções substancialmente idênticas e simultaneamente.
17. Método para realizar uma quimica moldada comácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreenderealizar múltiplas reações químicas moldadas com ácido nu-cléico moldadas por uma única seqüência de nucleotideos.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas reações químicasmoldadas com ácido nucléico acontecem em condições substan-cialmente similares.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas reações químicasmoldadas com ácido nucléico acontecem substancialmente demodo simultâneo.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas reações químicasmoldadas com ácido nucléico são reações idênticas.
21. Método, de acordo com a reivindicação 17,CARACTERIZADO pelo fato de que as múltiplas reações químicasmoldadas com ácido nucléico não são reações idênticas.
22. Método para detecção de um alvo biológico,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma primeira sonda, a primeira sondacompreendendo (i) uma primeira fração de ligação tendo afi-nidade de ligação com o alvo biológico, (2) uma primeira se-qüência de oligonucleotideos, (3) um primeiro grupo reativoassociado à primeira seqüência de oligonucleotideos;(b) fornecer uma segunda sonda, a segunda sondacompreendendo (1) uma segunda fração de ligação tendo umaafinidade de ligação com o alvo biológico, (2) uma segundaseqüência de oligonucleotideos, e (3) um segundo grupo rea-tivo associado à segunda seqüência de oligonucleotideos, on-de o segundo oligonucleotídeo é capaz de hibridizar-se paraa primeira seqüência de oligonucleotideos e o segundo gruporeativo é reativo com o primeiro grupo reativo quando trazi-dos a uma proximidade reativa;(c) combinar a primeira sonda e a segunda sondacom uma amostra a ser testada quanto à presença do alvo bio-lógico sob condições onde as primeira e segunda frações deligação se ligam ao alvo biológico;(d) permitir que o segundo oligonucleotídeo hibri-dize para o primeiro oligonucleotídeo para trazer os primei-ro e segundo grupos reativos a uma proximidade reativa; e(e) detectar uma reação entre os primeiro e segun-do grupos, determinando, assim, a presença do alvo biológico.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira sonda compreendeainda um primeiro ligante entre a primeira fração de ligaçãoe a primeira seqüência de oligonucleotideos.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sonda compreendeainda um segundo ligante entre a segunda fração de ligação ea segunda seqüência de oligonucleotideos.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é uma proteína.
26. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é um autoan-ticorpo.
27. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é uma célula.
28. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma dentre as pri-meira e segunda frações de ligação é um anticorpo para o al-vo biológico.
29. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são anticorpos para o alvo biológico.
30. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma dentre as pri-meira e segunda frações de ligação não é um anticorpo para oalvo biológico.
31. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma dentre as pri-meira e segunda frações de ligação é um aptâmero que se ligaao alvo biológico.
32. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são aptâmeros que se ligam ao alvo bioló-gico.
33. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma dentre as pri-meira e segunda frações de ligação é um pequeno ligante demolécula.
34. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são pequenos ligantes de molécula.
35. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira seqüência de oli-gonucleotideos e a segunda seqüência de oligonucleotideoscompreendem uma região complementar com 6 a 30 bases.
36. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entre os primeiro esegundo grupos reativos produz uma fração fluorescente.
37. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entre os primeiro esegundo grupos reativos produz uma fração cromófora ou qui-mioluminescente.
38. Método, de acordo com a reivindicação 22,CARACTERIZADO pelo fato de que na ausência do alvo biológicona amostra, nenhuma reação substancialmente detectável ocor-re entre os primeiro e segundo grupos reativos.
39. Método para detecção de um alvo biológico,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) fornecer um complexo de ligação do alvo bioló-gico com uma primeira sonda compreendendo (1) uma primeirafração de ligação possuindo afinidade de ligação com o alvobilógico, (2) uma primeira seqüência de oligonucleotideos, e(3) um primeiro grupo reativo associado à primeira seqüênciade oligonucleotideos;(b) colocar o complexo de ligação de (a) em con-tato com uma segunda sonda, a segunda sonda compreendendo(1) uma segunda fração de ligação possuindo afinidade de li-gação com o alvo biológico, (2) uma segunda seqüência de o-ligonucleotideo, e (3) um segundo grupo reativo associado àsegunda seqüência de oligonucleotideo, onde o segundo oligo-nucleotideo é capaz de hibridizar para a primeira seqüênciade oligonucleotideo e o segundo grupo reativo é reativo como primeiro grupo reativo quando se traz para dentro da pro-ximidade reativa um do outro;(c) permitir que o segundo oligonucleotideo hibri-dize para o primeiro oligonucleotideo para trazer o primeiroe segundo grupos reativos a uma proximidade reativa; e(d) detectar uma reação entre os primeiro e segun-do grupos reativos, desse modo, determinando a presença doalvo biológico.
40. Método para detecção de um alvo biológico,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) ligar ao alvo biológico uma primeira e uma se-gunda sonda, onde(1) a primeira sonda compreende (i) uma primeirafração de ligação possuindo afinidade de ligação com o alvobiológico, (ii) uma primeira seqüência de oligonucleotideos,e (iii) um primeiro grupo reativo associado com a primeiraseqüência de oligonucleotideos e(2) a segunda sonda compreende (i) uma segundafração de ligação possuindo afinidade de ligação com o alvobiológico, (ii) uma segunda seqüência de oligonucleotideo, e(iii) um segundo grupo reativo associado à segunda seqüênciade oligonucleotideo, onde o segundo oligonucleotideo é capazde hibridizar para a primeira seqüência de oligonucleotideoe o segundo grupo reativo é reativo com o primeiro grupo re-ativo quando trazido para dentro da proximidade reativa umdo outro;(b) permitir que o segundo oligonucleotideo hibri-dize para a primeira seqüência de oligonucleotideo paratrazer os primeiro e segundo grupos reativos a uma proximi-dade reativa; e(c) detectar uma reação entre os primeiro e segun-do grupos reativos, desse modo, determinando a presença doalvo biológico.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira sonda compreendeum primeiro ligante entre a primeira fração de ligação e aprimeira seqüência de oligonucleotideo.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que a segunda sonda compreende umsegundo ligante entre a segunda fração de ligação e a segun-da seqüência de oligonucleotideo.
43. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é uma prote-ína.
44. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é um auto-anticorpo.
45. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o alvo biológico é uma célula.
46. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das primeira esegunda frações de ligação é um anticorpo para o alvo biológico.
47. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são anticorpos para o alvo biológico.
48. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das primeira esegunda frações de ligação não é um anticorpo para o alvobiológico.
49. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das primeira esegunda frações de ligação é um aptâmero que se liga ao alvobiológico.
50. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são aptâmeros que se ligam para o alvobiológico.
51. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das primeira esegunda frações de ligação é um pequeno ligante de molécula.
52. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que ambas as primeira e segundafrações de ligação são pequenos ligantes de moléculas.
53. Método, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que a primeira seqüência oligonu-cleotidica e a segunda seqüência oligonucleotidica compreen-dem uma região de complementaridade de 6 a 30 pares de base.
54. Método para detectar um alvo biológico,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) fornecer uma primeira sonda, a primeira sondacompreende (1) uma primeira fração de ligação tendo afinida-de de ligação ao alvo biológico, e (2) uma primeira seqüên-cia oligonucleotidica de código zip;(b) fornecer uma segunda sonda, a segunda sondacompreende (1) uma segunda fração de ligação tendo afinidadede ligação a um alvo biológico, e (2) uma segunda seqüênciaoligonucleotidica de código zip,onde a primeira sonda é hibridizada para uma pri-meira sonda repórter que compreende (1) um seqüência de có-digo anti-zip de oligonucleotideos complementares a primeiraseqüência oligonucleotidica de código zip (2) um primeirooligonucleotideo repórter, e (3) um primeiro grupo reativo;onde a segunda sonda é hibridizada para uma segun-da sonda repórter compreendendo (1) uma seqüência de códigoanti-zip de oligonucleotideos complementares a uma segundaseqüência de código zip zip de oligonucleotideos, (2) um se-gundo oligonucleotideo repórter, e (3) um segundo grupo reativo;onde o segundo oligonucleotideo repórter é capazde se hibridizar a uma primeira seqüência oligonucleotidicarepórter e o segundo grupo reativo é reativo com o primeirogrupo reativo quando colocado em proximidade reativa de umoutro;(c) colocar em contato as primeira e segunda son-das com a amostra a ser testada quanto à presença do alvobiológico;(d) permitir as primeira e segunda sondas a se li-garem ao alvo biológico, se presente na amostra, por meio doqual o segundo oligonucleotideo repórter hibridiza para aprimeira seqüência oligonucleotidica repórter para trazer oprimeiro e segundo grupos reativos a uma proximidade reativa; (e) detectar uma reação entre os primeiro e segun-do grupos reativos e, desse modo, determinar a presença doalvo biológico.
55. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que as primeira e segunda fraçõesde ligação são anticorpos.
56. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que as primeira e segunda fraçõesde ligação são aptâmeros.
57. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que as primeira e segunda fraçõesde ligação são pequenos ligantes de moléculas.
58. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que a química repórter entre osprimeiro e segundo grupos reativos gera uma polimetina ou umderivado da mesma.
59. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que a química repórter entre osprimeiro e segundo grupos reativos gera uma cianina ou umderivado da mesma.
60. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entre os primeiro esegundo grupos reativos é uma reação de Wittig.
61. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entre os primeiro esegundo grupos reativos é uma reação de condensação de aldol.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-61, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entreos primeiro e segundo grupos reativos produz uma fração defluorescente.
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-61, CARACTERIZADO pelo fato de que a reação entreos primeiro e segundo grupos reativos produz uma fração qui-mioluminescente ou cromófora.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-61, CARACTERIZADO pelo fato de que a o método nãoinclui ligação enzimática da primeira e/ou da segunda se-qüências oligonucleotidicas.
65. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1-61, CARACTERIZADO pelo fato de que o método nãoinclui ligação química da primeira e/ou da segunda seqüên-cias oligonucleotidicas.
66. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeuma ou mais sondas conforme definidas em qualquer um dos mé-todos conforme definidos nas reivindicações 1-65.
67. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreendeduas ou mais sondas conforme definidas em qualquer um dosmétodos conforme definidos nas reivindicações 1-65.
68. Kit útil para detecção de uma analito biológi-co, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) uma primeira sonda que compreende (1) uma pri-meira fração de ligação tendo afinidade de ligação ao anali-to biológico, (2) uma primeira seqüência oligonucleotídica,e (3) um primeiro grupo reativo associado com a primeira se-qüência oligonucleotídica; e(b) uma segunda sonda que compreende (1) uma se-gunda fração de ligação tendo afinidade de ligação a um ana-lito biológico, (2) uma segunda seqüência oligonucleotídica,e (3) um segundo grupo reativo associado com a segunda se-qüência oligonucleotíca, onde o segundo oligonucleotídeo écapaz de hibridizar para a primeira seqüência oligonucleotí-dica e o segundo grupo reativo é reativo com o primeiro gru-po reativo quando colocado em proximidade reativa um com ooutro.
69. Kit útil para detecção de um analito biológi-co, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) uma primeira sonda, a primeira sonda compreen-dendo (1) uma primeira fração de ligação possuindo afinidadede ligação ao alvo biológico, e (2) uma primeira seqüênciade código zip de oligonucleotídeo;(b) uma segunda sonda, a segunda sonda compreen-dendo (1) uma segunda fração de ligação possuindo afinidadede ligação ao alvo biológico, e (2) uma segunda seqüência decódigo zip de oligonucleotídeo, onde a primeira sonda é hi-bridizável para uma primeira sonda repórter compreendendo(1) uma seqüência de código anti-zip de oligonucleotídeoscomplementares para a primeira seqüência de códigos zip deoligonucleotídeo, (2) um primeiro oligonucleotídeo repórter,e (3) um primeiro grupo reativo;onde a segunda sonda é hibridizável a uma segundasonda repórter compreendendo (1) uma seqüência de código an-ti-zip de oligonucleotídeos complementares para a segundaseqüência de código zip de oligonucleotídeo, (2) um segundooligonucleotídeo repórter, e (3) um segundo grupo reativo;onde o segundo oligonucleotídeo repórter é capazde hibridizar para a primeira seqüência de oligonucleotídeorepórter e o segundo grupo reativo é reativo para o primeirogrupo reativo quendo trazido para dentro da proximidade rea-tiva um do outro.
70. Kit, de acordo com a reivindicação 68 ou 69,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito biológico a ser de-tectado compreende uma proteína de fusão.
71. Kit, de acordo com a reivindicação 68 ou 69,CARACTERIZADO pelo fato de que o analito biológico a ser de-tectado compreende interação proteína-proteína.
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