BRPI0611504A2

BRPI0611504A2 - algodão inseticida ce43-67b

Info

Publication number: BRPI0611504A2
Application number: BRPI0611504-7A
Authority: BR
Inventors: Patricia Jane Cayley; David Vincent Negrotto; Jason Barnett
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2005-06-02
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2010-09-08
Also published as: US9131651B2; US20110020828A1; US7834254B2; AU2006254493B2; US20090217423A1; EP1917359A2; CN101184847B; WO2006128573A3; ZA200708596B; WO2006128573A2; CN101184847A; MX2007014833A; CR9525A; AR053501A1; AU2006254493A1

Abstract

A presente invenção refere-se a uma planta de algodão transgénico resistente a inseto. Em particular, a presente invenção refere-se a um evento especifico, designado CE43-67B. O pedido também se refere a poli- nucleotídeos que são característicos do evento CE43-67B, plantas compreendendo referidos polinucleotídeos, e métodos para detecção do evento CE43-67B.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALGODAOINSETICIDA CE43-67B".

A presente invenção refere-se a entre outros, polinucleotídeos emétodos de uso destes e, em particular, à plantas de algodão compreen-dendo referidos polinucleotídeos. Especificamente, a invenção refere-se aum evento de algodão designado CE43-67B que compreende um geneCryIAb. A invenção também refere-se a métodos de identificação de even-tos de algodão específicos que contêm um gene capaz de conferir resistên-cia a inseto nas referidas plantas de algodão.

As pestes de planta são um maior fator na perda das colheitasagrícolas importantes no mundo. Cerca de $8 bilhões é perdido todo ano nosEstados Unidos da América devido a infestação de plantas por pestes não-mamíferas, incluindo insetos. Em adição às perdas no campo das colheitas,as pestes de inseto são também um ônus para os cultivadores de verdura efruta, para produtores de flores ornamentais, e para jardineiros de residências.

As pestes de inseto são principalmente controladas por aplica-ções intensivas de pesticidas químicos, que são ativos através da inibição docrescimento do inseto, prevenção de alimentação do inseto ou reprodução,ou causam a morte. O bom controle de pestes de inseto pode, desse modo,ser alcançado, mas estes químicos podem, as vezes, também afetar outrosinsetos benéficos. Outro problema resultante a partir do uso amplo de pesti-cidas químicos é o aparecimento de variedades de inseto resistentes. Istotem sido parcialmente aliviado por várias práticas de controle resistentes,mas existe uma necessidade aumentada de agentes de controle de pestealternativos. Os agentes de controle de peste biológicos, tais como cepasBacillus thuringiensis expressando toxinas pesticidas similares a δ-endoto-xinas, têm também sido aplicados a grupo de plantas com resultados satisfa-tórios, oferecendo uma alternativa ou complemento aos pesticidas químicos.

Os genes que codificam para algumas destas δ-endotoxinas foram isolados,e sua expressão em hospedeiros heterólogos tem sido mostrada para pro-porcionar outra ferramenta para o controle de pestes de inseto economica-mente importantes. Em particular, a expressão da toxina inseticida CryIAcde Bacillus thuringiensis em plantas transgênicas tem proporcionado prote-ção eficiente contra pestes de inseto selecionadas, e plantas transgênicasexpressando esta toxina têm sido comercializadas, permitindo que os fazen-deiros reduzam as aplicações de agente de controle de inseto químicos.CryIAc é uma de uma grande família de toxinas inseticidas produzidas porcepas diferentes de Bacillus thuringiensis. Cada toxina na família tem umespectro único de atividade inseticida.

A família de algodão, gênero Gossypium, um membro da Malva-ceae, consiste em 39 espécies, da qual Gossypium hirsutum é a espéciemais comumente cultivada. Três outras espécies são também cultivadas: G.arboreum, G. barbadense, e G. herbaceum. Estas espécies cultivadas sãodesenvolvidas principalmente para pêlos de semente que são produzidos emtêxteis. O algodão é adequado como uma fibra têxtil porque os pêlos secosmaduros se entrelaçam de um modo que fios fortes finos podem ser puxa-dos a partir deste. Outros produtos, tais como óleo de semente de algodão,pedaço, e fiapos de algodão são subprodutos de produção de fibra.

Dano a colheitas de algodão por pestes de inseto através de to-do o mundo resulta em uma perda de produção significante cada ano. Ocontrole efetivo destas pestes para minimizar a perda de produção é degrande importância econômica. Exemplos de pestes de inseto de algodãoincluem Verme de beterraba (Spodoptera exigua), Cápsula de gorgulho (An-thonomus grandis grandis), Larva do repolho (Trichoplusia ni), Bicho de plan-ta obscura (Neurocolpus nubilus), Afídio de algodão (Aphis gossypii), Lagar-ta de algodão (Heliocoverpa zea), Bichas-amarelas (Feltia subterranea, Pe-ridroma saueia, Agrotis ipsilori), Perfurador de milho europeu (Ostrinia nubi-lalis), Verme de queda (Spodoptera frugiperdá), Verme de cápsula rosa(Peetinophera gossypiella), tripses de muda (Frankliniella spp.), Larvas desoja (Pseudoplusia ineludens), Bichos de mau cheiro (Nezara viridula, Aeros-ternum hilare, Euschistus servus), bicho de planta manchada (Lygus Iineola-ris), Verme de tabaco (Heliothis vireseens) e Moscas brancas (Trialeurodesabutilonea, Bemisia tabaei).A transformação e regeneração de plantas de algodão é agoraum procedimento bem estabelecido, tipicamente baseado na transferênciamediada por Agrobacterium tumefaciens de DNA estrangeiro em partes deplanta de algodão, e regeneração de referidas partes de planta em culturade tecido em plantas de algodão transgênico totalmente férteis.

Existe um requerimento para gerar uma nova planta de algodãoque seja resistente a inseto de modo que perda de produção através de da-no às colheitas de algodão por peste de inseto seja reduzida. Uma planta dealgodão resistente a inseto pode reduzir a necessidade de se aplicar pestici-das químicos, que pode ser prejudicial a outros insetos benéficos e ao ambi-ente. Em particular, é desejável proporcionar uma planta resistente a insetoalternativa compreendendo o gene CryIAc a partir de BaciHus thuringiensis.

A presente invenção proporciona, entre outros, um evento dealgodão específico (referido daqui por diante como "CE43-67B"), e métodospara identificação deste. Este evento específico foi selecionado baseado,entre outros, em seu desempenho agronômico, eficiência e característicasmoleculares. Acredita-se que as características deste evento são superioresaos transformantes similares baseados, entre outros, no local de integraçãodo transgene durante o processo de transformação.

O "evento CE43-67B", no contexto deste pedido, refere-se aplanta de algodão transgênica inseticida original aqui descrita e qualquermaterial de planta derivado desta, incluindo sementes. "Inseticida", conformeaqui usado, refere-se a qualquer efeito inibitório em um inseto, incluindomais não limitado a, alimentação reduzida, crescimento retardado, fecundi-dade reduzida, paralisia ou morte. "Fecundidade" compreende todos os as-pectos relacionados a reprodução, tais como capacidade reprodutiva, fre-qüência reprodutiva e número de descendência. Também envolvido por estainvenção é qualquer material de planta derivado a partir do evento CE43-67B, incluindo sementes.

O evento CE43-67B exibe um novo genótipo compreendendopelo menos um cassete de expressão. O cassete compreende um promotoradequado para expressão em plantas operavelmente ligado a um gene quecodifica uma toxina inseticida CryIAb1 útil no controle de um espectro amplode pestes de inseto lepidopteran, e um sinal de poliadenilação adequado.

Promotores adequados podem ser isolados de, entre outros, plantas. Nume-rosos promotores de plantas foram isolados e caracterizados, incluindo pro-motores constitutivos, alteráveis e/ou específicos de tecido. Os promotoresadequados podem ser selecionados a partir do seguinte grupo não-limitativo:CaMV35S, FMV35S, Ubiquitin, Act2, NOS, OCS, promoter de vírus de cachode folha amarela Cestrum, Patatin, E9, alterador alcA/alcR, alterador GST,alterador RMS, oleosin, Gelvin, subunidade pequena de ribulose bisfosfatocarboxilase-oxigenase, actin 7, promotor MR7 (milho), Gos 9 (arroz), promo-tores GOS2, MasOcs (ou superpromotor), promotor RoID (Agrobacteriumrhizogenes), promotor SuperMAS, e promotor Suc2 (Arabidopsis). Em umaconcretização da presente invenção, o promoter é o promotor Actin, ACT2,de Arabidopsis thaliana. Elementos adicionais, tais como seqüências intensi-ficadoras, podem também serem incorporadas no cassete de expressão demodo a propugnar níveis de expressão de gene, por exemplo, intensificado-res transcricional ou translacional, tais como ativador de translação de vírusde causticação de tabaco (TEV), intensificador CaMV35S, e intensificadorFMV35S. Alternativamente pode ser desejável incluir uma seqüência alvo,por exemplo, para transporte direto da toxina CryIAb para um compartimen-to celular particular. Por exemplo, é desejado proporcionar a proteína fora dacélula, em seguida uma seqüência alvo particular pode ser ligada ao polinu-cleotídeo que codifica a proteína CryIAb. Outros exemplos de alvo incluemalvo a uma organela intracelular específica ou compartimento, por exemplo,ao retículo endoplasmático usando uma seqüência de retenção 1KDEL'. Nu-merosos sinais de poliadenilação foram isolados e caracterizados. Exemplosde sinais de poliadenilação adequados funcionais em plantas incluem aque-les do gene de sintase napolina (nos) de Agrobacterium tumefaciens, a partirdo gene inibidor Il proteinase e do gene alfa-tubulin (EP-A 652.286). Em umaconcretização da presente invenção, o sinal de poliadenilação é aquele apartir do gene nos de Agrobacterium tumefaciens.

O polinucleotídeo que codifica a proteína CryIAb pode ser decódon otimizado ou, de outro modo, alterado para aumentar, por exemplo, atranslação, uma vez que é incorporado no material de planta. Tal otimizaçãode códon pode também ser usada para alterar a estrutura secundária prog-nosticada da reprodução de RNA produzida em qualquer célula transforma-da, ou para destruir os elementos de instabilidade de RNA ocultos presentesna reprodução inalterada, aumentando, desse modo, a estabilidade e/oudisponibilidade da reprodução na célula transformada (Abler and Green(1996) Plant Molecular Biology (32) pp.63-78). A otimização do códon podetambém ser empregada para alterar uma seqüência de codificação de DNAheteróloga de modo que se assemelha mais proximamente à seqüência decodificação de um gene do hospedeiro. Por exemplo, um gene bacterial po-de ser códon otimizado para aumentar a razão de bases de citosina e guani-na para bases de adenina e timina, de modo que se assemelha mais proxi-mamente a um gene de planta (por exemplo, algodão e milho), ainda codifi-ca a mesma proteína. Tal otimização de códon pode ser realizada de acordocom tabelas de uso de códon padrões.

Em um precursor ao evento CE43-67B, um segundo casseteestá presente, que compreende um gene que, quando expresso, pode serusado como um marcador selecionável. Numerosos marcadores selecioná-veis foram caracterizados, incluindo alguns que conferem tolerância a antibi-óticos e outros que conferem tolerância à herbicidas. Exemplos de genesmarcadores selecionáveis adequados incluem aqueles que conferem tole-rância à higromicin, kanamicin ou gentamicin. Marcadores selecionáveis a-dequados adicionais incluem genes que conferem resistência à herbicidas,tais como herbicidas baseados em glifosato, ou resistência à toxinas, taiscomo eutipina. Outras formas de seleção são também disponíveis, tais comosistemas de seleção baseados em hormônio, tais como o sistema Multi AutoTransformação (MAT) de Hiroyrasu Ebinuma et al. (1997) PNAS Vol. 94pp.2117-2121; sistemas de seleção visual que usam proteína de fluorescên-cia verde conhecida, β glucoronidase; e qualquer outro sistema de seleção,tais como manose isomerase (Positech™), xilose isomerase e 2-deoxiglicose (2-DOG). Em uma concretização da presente invenção, o genemarcador selecionável é um que confere tolerância à higromicin. Este se-gundo cassete de expressão é útil para seleção de transformantes durante eem seguida à transformação da planta. Opcionalmente, ele pode ser segre-gado a partir do precursor de evento CE43-67B após transformação paradeixar o próprio evento CE43-67B. O evento CE43-67B per se não compre-ende um cassete marcador selecionável. Cassetes de expressão adicionaissão opcionalmente compreendidos no evento CE43-67B. Por exemplo, estespodem proporcionar genes que codificam toxinas inseticidas diferentes, taiscomo VIP3A. Alternativamente, estes podem proporcionar outros benefíciostais como resistência à herbicida.

Os cassetes de expressão podem ser introduzidos na planta nosmesmos ou em plasmídeos diferentes. Se os cassetes de expressão estãopresentes no mesmo plasmídeo, e introduzidos na mesma planta, via ummétodo de transformação mediado por Agrobacterium, eles podem estarpresentes dentro das mesmas ou regiões diferentes de T-DNA. Em umaconcretização da presente invenção, dois cassetes de expressão estão pre-sentes em regiões diferentes de T-DNA dentro de plasmídeos diferentes.

De acordo com a presente invenção, é provido um polinucleotí-deo que compreende uma primeira região compreendendo a seqüência re-presentada como SEQ ID NO: 1, e uma região adicional que compreende aseqüência representada como SEQ ID NO: 2.

Em uma concretização adicional, referido polinucleotídeo com-preende uma região que pode ser amplificada por uma reação de amplifica-ção cuja reação usa os iniciadores representados como SEQ ID NO: 5 e 6ou SEQ ID NO: 11 e 12. Em uma concretização ainda adicional, referido po-linucleotídeo compreende uma região ainda adicional que codifica um geneCryIAb a partir de Bacillus thuringiensis. Em uma concretização ainda adi-cional, referido polinucleotídeo compreende uma região que proporciona opromotor de actin Arabidopsis operavelmente ligado ao referido geneCryIAb.

Em um aspecto adicional é provido um polinucleotídeo que com-preende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO: 3. Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo quecompreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência represen-tada como SEQ ID NO: 3. Ainda adicionalmente provido é um polinucleotí-deo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguos da seqüênciarepresentada como SEQ ID NO: 3. Ainda adicionalmente provido é um poli-nucleotídeo que compreende a seqüência representada como SEQ ID NO:3.

Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência representada co-mo nucleotídeos 246 a 305 de SEQ ID NO: 1. Ainda adicionalmente providoé um polinucleotídeo que compreende pelo menos 40 nucleotídeos contí-guos da seqüência representada como nucleotídeos 246 a 305 de SEQ IDNO: 1. Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compreendepelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüência representada comonucleotídeos 246 a 305 de SEQ ID NO: 1. Ainda adicionalmente provido éum polinucleotídeo que compreende a seqüência representada como nu-cleotídeos 246 a 305 de SEQ ID NO:1.

Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contíguosde SEQ ID NO: 1, referido nucleotídeo contendo a junção de nucleotídeoentre nucleotídfos 275 e 276 de SEQ ID NO:1. Ainda adicionalmente provi-do é um polinucleotídeo que compreende a seqüência representada comoSEQ ID NO: 1.

Ainda adicionalmente provida é uma seqüência que é o com-plemento de uma seqüência descrita acima.

Em um aspecto adicional da invenção é provido um polinucleotí-deo que compreende pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüênciarepresentada como SEQ ID NO: 4. Ainda adicionalmente provido é um poli-nucleotídeo que compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da se-qüência representada como SEQ ID NO: 4. Ainda adicionalmente provido éum polinucleotídeo que compreende pelo menos 25 nucleotídeos contíguosda seqüência representada como SEQ ID NO: 4. Ainda adicionalmente pro-vido é um polinucleotídeo que compreende a seqüência representada comoSEQ ID Ν0:4.

Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência representada co-mo nucleotídeos 104 a 163 de SEQ ID NO: 2. Ainda adicionalmente providoé um polinucleotídeo que compreende pelo menos 40 nucleotídeos contí-guos da seqüência representada como nucleotídeos 104 a 163 de SEQ IDNO: 2. Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compreendepelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüência representada comonucleotídeos 104 a 163 de SEQ ID NO: 2. Ainda adicionalmente provido éum polinucleotídeo que compreende a seqüência representada como nu-cleotídeos 104 a 163 de SEQ ID NO:2.

Ainda adicionalmente provido é um polinucleotídeo que compre-ende pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 polinucleotídeos contí-guos de SEQ ID NO: 2, referido nucleotídeo contendo a junção de nucleotí-deo entre nucleotídeos 133 e 134 de SEQ ID NO:2. Ainda adicionalmenteprovido é um polinucleotídeo que compreende a seqüência representadacomo SEQ ID NO: 2.

Em uma concretização adicional é provida uma planta de algo-dão que compreende um polinucleotídeo descrito acima. Em uma concreti-zação ainda adicional é provida uma semente de algodão que compreende opolinucleotídeo conforme descrito acima. Em uma concretização adicional,referida planta é uma planta de algodão inseticida que é uma precursora aoevento CE43-67B, ao evento CE43-67B per se, ou uma planta derivada apartir desta que ainda compreende um polinucleotídeo conforme descritoacima. Em uma concretização adicional, referida planta compreende um se-gundo cassete de expressão. Em uma concretização, referido segundo cas-sete de expressão codifica uma toxina inseticida VIP3A. Em outra concreti-zação, referido segundo cassete de expressão codifica uma proteína queproporciona resistência a um herbicida que compreende ácido glifosato ouum sal deste agriculturalmente aceitável.A pessoa versada na técnica é familiar aos métodos de trans-formação de planta. Em particular, duas técnicas principais têm sido caracte-rizadas através de uma ampla faixa de espécies de planta: transformaçãopor Agrobacterium e transformação por transferência direta de DNA.

A transformação mediada por Agrobacterium é um método co-mumente usado para transformação de plantas dicotiledôneas. O DNA es-tranho a ser introduzido nas plantas é clonado em um vetor binário entre se-qüências de consenso de limítrofe esquerdo e direito. Esta é a região T-DNA. O vetor binário é transferido em uma célula de Agrobacterium, que ésubseqüentemente usada para infectar tecido de planta. A região de T-DNAdo vetor compreendendo o DNA estranho é inserida no genoma da planta. Ocassete de gene marcador e o cassete de gene de traço pode estar presentena mesma região de T-DNA, em regiões de T-DNA diferentes no mesmovetor, ou mesmo regiões de T-DNA diferentes em vetores diferentes. Emuma concretização da presente invenção, os cassetes estão presentes emregiões de T-DNA diferentes em vetores diferentes.

Alternativamente, transferência direta de DNA pode ser usadapara introduzir o DNA diretamente em uma célula de planta. Um método a-dequado de transferência direta pode ser o bombardeio das células de plan-ta com um vetor compreendendo o DNA para inserção usando um canhãode partícula (transformação biolística mediada por partícula); outro métodoestabelecido, 'whiskers', envolve revestimento do DNA em fibras de carbetode silício nas quais as células são implantadas. Outros métodos para trans-formação de células de planta incluem transformação de protoplasma (op-cionalmente na presença de polietileno glicóis); sonicação de tecidos deplanta, células de protoplastos em um meio compreendendo o polinucleotí-deo ou vetor; microinserção do polinucleotídeo ou vetor em material de plan-ta (opcionalmente empregando a técnica de "whiskers" de carbeto de silícioconhecida), eletroporação e similares.

Em seguida à transformação, as plantas transgênicas são rege-neradas a partir do tecido de planta transformado, e progenia possuindo oDNA estranho selecionado usando um marcador apropriado, tal como resis-tência à hidromicin. A pessoa versada na técnica à composição de meio deregeneração adequado. O marcador selecionável pode ser segregado a par-tir de eventos transgênicos por métodos de geração de planta convencio-nais, resultando, desse modo, em, por exemplo, o evento CE43-67B.

Uma planta da invenção, conforme aqui descrito, tem um efeitoinseticida nos insetos de uma ou mais espécies a partir do grupo compreen-dendo sp. Heliothis e sp. Helicoverpa que pode infestá-la. "Infestar", confor-me aqui usado, refere-se a atacar, colonização, alimentação ou dano dequalquer modo por um ou mais insetos. Desse modo, por exemplo, a plantada presente invenção proporcionará um mecanismo de autodefesa contrainfecção por insetos pestes, tais como Helicoverpa zea (verme de cápsulade algodão). Como um resultado, um número reduzido de pulverizações deinseticidas são requeridas durante o cultivo de referida planta comparado auma planta de algodão não-transgênico da mesma variedade, e perda deprodução através de pestes de inseto é mantida em um nível mínimo.

A presente invenção não é limitada ao próprio evento CE43-67B,mas é adicionalmente estendida para incluir qualquer material de planta de-rivado a partir deste, incluindo sementes na medida em que elas contêm pe-lo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção. A presente inven-ção inclui, mas não está limitado a, plantas que são derivadas de uma gera-ção cruzada com o evento CE43-67B ou um derivado deste por geraçãoconvencional ou outros métodos. A invenção também inclui material de plan-ta derivado a partir do evento CE43-67B que pode compreender seqüênciasde polinucleotídeo adicionais, modificadas ou de menos, comparadas aoevento CE43-67B, ou exibir outras características fenotípicas. Por exemplo,pode ser desejável transformar material de planta derivado a partir do eventoCE43-67B para gerar um novo evento que possui um traço adicional, tal co-mo um segundo gene de resistência de inseto. Este processo é conhecidocomo empilhamento de gene. O segundo gene de resistência de inseto podecodificar, por exemplo, Iectins inseticidas, inibidores de protease inseticidase proteínas inseticidas a partir de espécies do Bacillus thuringiensis, Xeno-rhabdus nematophilus, ou Photorabdus luminescens. Em um aspecto, o se-gundo gene de resistência de inseto codifica como gene inseticida a partir deBacillus thuringiensis. Preferivelmente, o segundo gene de resistência deinseto codifica um gene VIP a partir da bactéria Bacillus thuringiensis, cujogene VIP produz uma toxina com um modo diferente de ação ou local deligação no intestino do inseto para CryIAb para o controle de espécies deinseto diferentes. O gene VIP pode, por exemplo, ser VIP3A.

A presente invenção proporciona adicionalmente um material deplanta derivado a partir do evento CE43-67B que possui um traço adicional,tal como resistência a herbicida, resistência a nematode, ou resistência fun-gai. Em uma concretização, referido traço adicional é resistência a herbicida.

O traço de resistência a herbicida pode ser provido, por exemplo, por umaenzima de degradação de herbicida, ou uma enzima resistente de local es-pecífico alvo. Em uma concretização adicional, referido traço de resistência aherbicida proporciona resistência a herbicida para um herbicida que compre-ende ácido glifosato, ou um sal agriculturalmente aceitável deste. Em umaoutra concretização ainda, referido traço de resistência a herbicida é providopor um gene que codifica EPSP sintase, ou um mutante deste.

A presente invenção proporciona adicionalmente um método decontrole de insetos compreendendo provisão do evento CE43-67B, ou mate-rial de planta derivado a partir do evento CE43-67B em um local onde referi-do inseto se alimenta. A invenção adicionalmente ainda proporciona um mé-todo de controle de insetos compreendendo provisão do evento CE43-67B,ou um material de planta derivado a partir do evento CE43-67B em um localonde referidos insetos se alimentam, e aplicação de outros agroquímicos aoreferido material de planta, tais como herbicidas, fungicidas e outros com-postos inseticidas incluindo outras proteínas inseticidas. Exemplos de com-postos inseticidas possíveis incluem Iectins inseticidas, inibidores de proteaseinseticidas e proteínas inseticidas derivadas a partir de espécies do Bacillusthuringiensis, Xenorhabdus nematophilus, ou Photorabdus luminescens. E-xemplos de químicos possíveis incluem piretróides, carbamatos, imidaclo-prid, organocloros, e macromoléculas, tais como spinosad, abamectin ouemamectin.A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de material de planta que é derivado a partir do evento CE43-67B, referido método compreendendo: (a) preparação de uma amostra con-tendo o DNA genômico do material de planta a ser testado; (b) obtenção deum par de iniciadores que são adequados para uso em uma reação de am-plificação para amplificar uma seqüência selecionada a partir do grupo con-sistindo em: (i) uma seqüência compreendendo pelo menos 18 nucleotídeoscontíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 3 e o complementodesta e, (ii) uma seqüência compreendendo pelo menos 18 nucleotídeoscontíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 4 e o complementodesta; (c) adição de referido par de iniciadores à referida amostra e aos mei-os para realizar uma reação de amplificação; (d) realização de uma reaçãode amplificação; e (e) visualização da seqüência desse modo amplificada.

Existem muitos métodos de amplificação que podem ser usadosde acordo com os métodos da invenção. O princípio fundamental, uma téc-nica conhecida aos versados na técnica, é a reação de cadeia de polimerase(PCR). O produto de amplificação de uma reação de PCR pode ser visuali-zado por manchamento com brometo de etídio e excitação com luz UV, tipi-camente após separação por tamanho usando eletroforese de gel de agaro-se. Em uma concretização particular da invenção, variações do princípio dePCR, tais como TaqMan™, podem ser usadas. Tais técnicas envolvem rotu-lação de pelo menos um dos iniciadores envolvidos no processo de amplifi-cação com um corante fluorescente. Quando não ligado, o iniciador adotauma conformação tal que nenhuma fluorescência pode ser detectada. Con-tudo, quando o iniciador é ligado a uma peça de DNA, a conformação muda,e a fluorescência pode ser detectada. Desse modo, o processo de amplifica-ção pode ser monitorado em tempo real, a intensidade de fluorescência cor-respondendo diretamente ao nível de amplificação.

A análise de TaqMan® pode ser útil, por exemplo, para detecçãoda presença do evento CE43-67B em uma prática de algodão tipo selvagem,ou para detecção da presença casual de CE43-67B em outro germeplasma.Concretizações adicionais da presente invenção incluem, mas não estãolimitados a, RACE PCR.

Uma concretização adicional da presente invenção envolve ouso de PCR multiplex para distinção entre material de planta CE43-67B ho-mozíguo e material de planta CE43-67B heterozíguo. Isto é conhecido àque-les versados no assunto como teste de zigosidade, e envolve o uso de trêsiniciadores de PCR que se ligam às partes específicas do genoma de algo-dão e/ou DNA inserido. A presença ou ausência de cada um dos dois produ-tos de amplificação de tamanhos particulares indica se a amostra teste éhemizígua ou homozígua para CE43-67B. Os iniciadores adequados parauso em tal teste de zigosidade são representados como SEQ ID NO: 5, 6 e8. Os iniciadores adequados alternativos para uso em tal teste de zigosidadesão representados como SEQ ID N2s 10, 11 e 12. Os testes de zigosidadepodem também serem designados usando iniciadores rotulados com sondasfluorescentes diferentes de modo que a cor de fluorescência dos produtos deamplificação indica se a amostra teste é hemizígua ou hemozígua paraCE43-67B.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID N0:1, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de um par de iniciadores que são adequados para uso em uma reaçãode amplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos18 nucleotídeos contíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 3 eo complemento desta; (c) adição de referido par de iniciadores à referidaamostra e aos meios para realização de uma reação de amplificação; (d)realização de uma reação de amplificação; e (e) visualização da seqüênciadesse modo amplificada.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodoconforme descrito acima no qual referidos iniciadores são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compre-endendo pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO: 3 e o complemento desta. Em uma concretização aindaadicional, referidos iniciadores são adequados para uso em uma reação deamplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos 25nucleotídeos contíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 3 e ocomplemento desta. Em ainda outra concretização adicional, referidos inici-adores são adequados para uso em uma reação de amplificação para ampli-ficar uma seqüência compreendendo a seqüência representada como SEQID NO: 3 e o complemento desta.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona um mé-todo conforme descrito acima no qual a seqüência a ser amplificada por refe-rida reação de amplificação compreende uma seqüência contendo a junçãode nucleotídeo de inserto de cassete de seqüência transgênica genômico (g-g) provida como nucleotídeos 275/276 de SEQ ID NO:1. A pessoa versadana técnica apreciará que esta junção pode ser usada para caracterizar e,desse modo, identificar o evento e, desse modo, está bem dentro do âmbitode referido técnico para designar e produzir seqüências de iniciador de oli-gonucleotídeo que são adequadas para uso em uma reação de amplificaçãopara amplificar a seqüência que compreende a junção antes mencionada. Apessoa versada na técnica também apreciará que as seqüências de iniciadoradequadas para uso em uma reação de amplificação podem ser designadasbaseadas na seqüência genômica que é 5', isto é, à montante do número denucleotídeo 1 de SEQ ID NO:1, e o inserto ou seqüência genômica que é 3',isto é, à jusante do número de nucleotídeo 545 de SEQ ID NO:1.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID NO:1, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de um par de iniciadores que são adequados para uso em uma reaçãode amplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos35 nucleotídeos contíguos da seqüência representada como nucleotídeos246 a 305 de SEQ ID NO: 1 e o complemento desta; (c) adição de referidopar de iniciadores à referida amostra e aos meios para realização de umareação de amplificação; (d) realização de uma reação de amplificação; e (e)visualização da seqüência desse modo amplificada. Em uma concretizaçãoadicional, referidos iniciadores são adequados para uso em uma reação deamplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos 40nucleotídeos contíguos da seqüência representada como nucleotídeos 246 a305 de SEQ ID NO: 1. Em uma concretização adicional, referidos iniciadoressão adequados para uso em uma reação de amplificação para amplificaruma seqüência compreendendo pelo menos 50 nucleotídeos contíguos daseqüência representada como nucleotídeos 246 a 305 de SEQ ID NO: 1. Emuma concretização adicional, referidos iniciadores são adequados para usoem uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compreen-dendo a seqüência representada como nucleotídeos 246 a 305 de SEQ ID NO: 1.

Em ainda uma outra concretização, referidos iniciadores são a -dequados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência compreendendo pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1, referida seqüência contendo ajunção de nucleotídeo entre nucleotídeos 275 e 276 de SEQ ID NO:1. Osiniciadores referidos acima são adequados para uso em uma reação de am-plificação para amplificar as seqüências acima mencionadas, e as seqüên-cias complerneptares destas.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona uma se-qüência que é o produto de amplificação do método acima descrito.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona uma se-qüência que é o complemento de uma seqüência descrita acima.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona um mé-todo conforme mencionado acima no qual o produto desse modo amplificadocompreende uma seqüência conforme representada acima.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona um mé-todo conforme descrito acima no qual referido par de iniciadores compreen-de um iniciador dianteiro que compreende uma seqüência que quando lidana direção 5'->3' é idêntica a uma região da seqüência representada comonucleotídeos 1 a 275 de SEQ ID NO:1, e o iniciador inverso compreendeuma seqüência que quando lida na direção 5'->3' é idêntica a uma região docomplemento inverso da seqüência representada como nucleotídeos 276 a545 de SEQ ID NO: 1. A pessoa versada na técnica reconhecerá que umnúmero de iniciadores adequados para uso nos métodos da invenção podeser criado baseado nas seqüências providas aqui e nas seqüências com-plementares destas. Em adição a isto, conforme mencionado acima, tais se-qüências de iniciador podem ser baseadas na seqüência 5' e 3' (montante ejusante) das seqüências representadas como SEQ ID NO:1, e está bem dentroda capacidade da pessoa versada na técnica identificar tal seqüência 5' e 3'.

Em uma concretização particular da invenção, referido par deiniciadores compreende seqüências representadas como SEQ ID NO: 5 e 6.

Em uma concretização adicional da invenção, referido par de iniciadorescompreende as seqüências representadas como SEQ ID NO: 9 e 10. Emuma concretização adicional da invenção, referido par de iniciadores com-preende as seqüências representadas como SEQ ID NO: 11 e 12.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID NO:2, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de um par de iniciadores que são adequados para uso em uma reaçãode amplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos18 nucleotídeos contíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 4 eo complemento desta; (c) adição de referido par de iniciadores à referidaamostra e aos meios para realização de uma reação de amplificação; (d)realização de uma reação de amplificação; e (e) visualização da seqüênciadesse modo amplificada.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodoconforme descrito acima no qual referidos iniciadores são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compre-endendo pelo menos 20 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO: 4 e o complemento desta. Em uma concretização aindaadicional, referidos iniciadores são adequados para uso em uma reação deamplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos 25nucleotídeos contíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 4 e ocomplemento desta. Em uma concretização ainda adicional, referidos inicia-dores são adequados para uso em uma reação de amplificação para amplifi-car uma seqüência compreendendo a seqüência representada como SEQ IDNO: 4 e o complemento desta.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona um mé-todo conforme descrito acima no qual a seqüência a ser amplificada por refe-rida reação de amplificação compreende uma seqüência contendo a junçãode nucleotídeo de inserto de cassete transgênico-seqüência genômica (t-a)provida como nucleotídeos 133/134 de SEQ ID NO:2. A pessoa versada natécnica apreciará que esta junção pode ser usada para caracterizar e, dessemodo, identificar o evento e, desse modo, está bem dentro do âmbito de re-ferido técnico para designar e produzir seqüências de iniciador de oligonu-cleotídeo que são adequadas para uso em uma reação de amplificação paraamplificar a seqüência que compreende a junção antes mencionada. A pes-soa versada na técnica também apreciará que as seqüências de iniciadoradequadas para uso em uma reação de amplificação podem ser designadasbaseadas no inserto ou seqüência genômica que é 5', isto é, à montante donúmero de nucleotídeo 1 de SEQ ID NO:2, e a seqüência genômica que é 3',isto é, à jusante do número de nucleotídeo de seqüência genômica 1198 deSEQ ID NO:2.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID NO:2, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de um par de iniciadores que são adequados para uso em uma reaçãode amplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos35 nucleotídeos contíguos da seqüência representada como nucleotídeos104 a 163 de SEQ ID NO: 2 e o complemento desta; (c) adição de referidopar de iniciadores à referida amostra e aos meios para realização de umareação de amplificação; (d) realização de uma reação de amplificação; e (e)visualização da seqüência desse modo amplificada. Em uma concretizaçãoadicional, referidos iniciadores são adequados para uso em uma reação deamplificação para amplificar uma seqüência compreendendo pelo menos 40nucleotídeos contíguos da seqüência representada como nucleotídeos 104 a163 de SEQ ID NO: 2. Em uma concretização adicional, referidos iniciadoressão adequados para uso em uma reação de amplificação para amplificaruma seqüência compreendendo pelo menos 50 nucleotídeos contíguos daseqüência representada como nucleotídeos 104 a 163 de SEQ ID NO: 2. Emuma concretização adicional, referidos iniciadores são adequados para usoem uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compreen-dendo a seqüência representada como nucleotídeos 104 a 163 de SEQ IDNO: 2.

Em ainda uma outra concretização, referidos iniciadores são a-dequados para uso em uma reação de amplificação para amplificar uma se-qüência compreendendo pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 2, referida seqüência contendo ajunção de nucleotídeo entre nucleotídeos 133 e 134 de SEQ ID NO:2. Osiniciadores referidos acima são adequados para uso em uma reação de am-plificação para amplificar as seqüências acima mencionadas, e as seqüên-cias complementares destas.

A presente invenção ainda adicionalmente proporciona um mé-todo conforme descrito acima no qual referido par de iniciadores compreen-de um iniciador dianteiro que compreende uma seqüência que quando lidana direção 5'->3' é idêntica a uma região da seqüência representada comonucleotídeos 1 a 133 de SEQ ID NO:2, e o iniciador inverso compreendeuma seqüência que quando lida na direção 5'->3' é idêntica a uma região docomplemento inverso da seqüência representada como nucleotídeos 134 a1198 de SEQ ID NO: 2. A pessoa versada na técnica reconhecerá que umnúmero de iniciadores adequados para uso nos métodos da invenção podeser criado baseado nas seqüências providas aqui e nas seqüências com-plementares destas. Em adição a isto, conforme mencionado acima, tais se-qüências de iniciador podem ser baseadas na seqüência 5' e 3' (montante ejusante) das seqüências representadas como SEQ ID NO:2, e está bem dentroda capacidade da pessoa versada na técnica identificar tal seqüência 5' e 3'.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de um material de planta derivado a partir do evento CE43-67B, referido método compreendendo: (a) preparação de uma amostra con-tendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obtenção de uma sondaque é capaz de hibridizar uma seqüência selecionada a partir do grupo con-sistindo em uma seqüência compreendendo pelo menos 18 nucleotídeoscontíguos da seqüência representada como SEQ ID NO: 3, e uma seqüênciacompreendendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como SEQ ID NO:4, (c) adição de pelo menos uma das sondas daetapa (b) à referida amostra sob condições que permitem que referida sondahibridize com um ácido nucléico complementar dentro de referida amostra;(d) remoção da sonda substancialmente não-hibridizada por lavagem; e (e)detecção da sonda desse modo hibridizada para identificar se a amostra é apartir do evento CE43-67B.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID NO:1, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de uma sonda que é capaz de hibridizar à uma seqüência compreen-dendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO: 3, (c) adição da sonda à referida amostra sob condiçõesque permitem que referida sonda hibridize com um ácido nucléico comple-mentar dentro de referida amostra; (d) remoção da sonda substancialmentenão-hibridizada por lavagem; e (e) detecção da sonda desse modo hibridiza-da para identificar se a amostra contém referido polinucleotídeo.

A presente invenção proporciona adicionalmente um métodopara detecção de uma planta que contém o polinucleotídeo representadocomo SEQ ID NO:2, referido método compreendendo: (a) preparação deuma amostra contendo o DNA genômico da planta a ser testada; (b) obten-ção de uma sonda que é capaz de hibridizar à uma seqüência compreen-dendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO: 4, (c) adição da sonda à referida amostra sob condiçõesque permitem que referida sonda hibrídize com um ácido nucléico comple-mentar dentro de referida amostra; (d) remoção da sonda substancialmentenão-hibridizada por lavagem; e (e) detecção da sonda desse modo hibridiza-da para identificar se a amostra contém referido polinucleotídeo.

Em uma concretização particular dos métodos acima descritos,referida sonda compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos. Em umaconcretização ainda adicional, referida sonda compreende pelo menos 50,100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 1,referida sonda contendo a junção de nucleotídeo entre nucleotídeos 275 e276 de SEQ ID NO:1, ou pelo menos 50, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 2, referida sonda contendo a junçãode nucleotídeo entre nucleotídeos 133 e 134 de SEQ ID NO:2. Em uma con-cretização ainda adicional da invenção, referida sonda pode compreenderum fragmento de um polinucleotídeo relevante descrito dentro deste relató-rio. Em particular, referida sonda pode compreender uma seqüência de poli-nucleotídeo que é capaz de hibridizar com uma seqüência que caracteriza oevento descrito no presente pedido. Em uma concretização ainda adicionalde referido método, referida lavagem ocorre sob condições de alta escassez.Referida sonda pode ser gerada e rotulada usando técnicas bem conhecidasas pessoas versadas na técnica.

A sonda pode ser, por exemplo, um produto de PCR ou frag-mento de digestão de restrição. Em uma concretização adicional, a sondaconforme descrita aqui pode ser etiquetada com um rótulo fluorescente, ra-dioativo, enzimático ou outro rótulo adequado para capacitar que a hibridiza-ção seja detectada.

Em uma concretização ainda adicional da presente invenção, éprovido um método de hibridização de uma sonda ao ácido nucléico com-plementar dentro da amostra sob condições escassas, e detecção se a son-da tiver hibridizado. As condições de hibridização de alta escassez são bemconhecidas as pessoas versadas e compreendem, por exemplo: hibridizaçãoà uma temperatura de cerca de 65°C em uma solução contendo 6 χ SSC,0,01% de SDS, e 0,25% de leite em pó desnatado, seguido pelo enxagua-mento na mesma temperatura em uma solução contendo 0,2 χ SSC e 0,1%de SDS. A pessoa versada na técnica pode alternativamente selecionar asseguintes condições de hibridização, isto é, hibridização à uma temperaturade entre 60°C e 65°C em salina tamponada de citrate de resistência de 0,3contendo 0,1% de SDS, seguida pelo enxaguamento na mesma temperaturacom salina tamponada de citrato de resistência de 0,3 contendo 0,1% deSDS. A pessoa versada na técnica pode também selecionar condições adi-cionais de hibridização que são igualmente compreendidas para serem con-dições de "alta escassez". Técnicas adicionais para detecção de material deplanta derivado a partir do evento aqui descrito baseadas no princípio dehibridização incjuem, mas não estão limitadas a, Manchas do Sul, Manchasdo Norte e hibridização in-situ. A pessoa versada na técnica é familiar a es-tas técnicas. Tipicamente, elas envolvem incubação de uma sonda com umaamostra, lavagem para remover sonda não-ligada, e detecção se a sondativer hibridizado. Referido método de detecção é dependente do tipo de rótu-lo fixado à sonda - por exemplo, uma sonda radioativamente etiquetada po-de ser detectada pela exposição a e desenvolvendo um filme de raios X. Al-ternativamente, uma sonda enzimaticamente rotulada pode ser detectadapela conversão de um substrato para efetuar uma mudança de cor.

Em um aspecto ainda adicional, é provido um método para iden-tificação de uma planta compreendendo o evento CE43-67B, referido méto-do compreendendo (a) preparação de uma amostra contendo o DNA genô-mico da planta a ser testada; (b) digestão de referido DNA via uma enzimade restrição; (c) separação dos fragmentos de DNA digeridos e transferênciado fragmento desse modo separado para uma membrana; (d) investigaçãodos fragmentos desse modo ligados com uma sonda, designada conformedescrito acima, cuja sonda tem que ser rotulada para permitir sua visualiza-ção; (e) remoção da sonda substancialmente não-hibridizada; e (f) detecçãoda sonda desse modo hibridizada no qual referido evento pode ser caracteri-zado por referida sonda que hibridiza a fragmentos tendo um tamanho particular.

Em um aspecto adicional, é provido um evento de algodão que écapaz de ser identificado por um método de acordo com a invenção. Emuma concretização particular, referido método é o método de acordo com oparágrafo precedente.

A presente descrição também inclui um método para detecçãode uma planta que contém uma proteína capaz de ser codificada por um po-linucleotídeo representado como SEQ ID NO:7, referido método compreen-dendo (a) preparação de um extrato de proteína da planta a ser testada; (b)provisão de um anticorpo que é capaz de se ligar à uma proteína de CryIAbde Bacillus thuringiensis; (c) adição de referido anticorpo ao referido extratosob condições que permitem que referido anticorpo se ligue à referida prote-ína dentro de referido extrato; e (d) detecção do anticorpo desse modo liga-do para identificar se o extrato contém referida proteína.

A presente descrição também inclui um método para detecçãode uma planta que compreende um gene de CryAb a partir de Bacillus thu-ringiensis, referido método compreendendo (a) preparação de um extrato deproteína da planta a ser testada; (b) provisão de um anticorpo que é capaz dese ligar à uma proteína de CryIAb de Bacillus thuringiensis; (c) adição de refe-rido anticorpo ao referido extrato, ou referido extrato ao referido anticorpo, sobcondições que permitem que referido anticorpo se ligue à referida proteínade CryI Ab dentro de referido extrato; (d) detecção do anticorpo desse modoligado para identificar se o extrato contém referida proteína de Cry 1 Ab. Estemétodo é útil para distinção entre plantas expressando CryIAb, tais comoplantas compreendendo CE43-67B, e plantas não expressando Cryl Ab.Métodos adequados de detecção de material de planta derivadodo evento aqui descrito, cujos métodos são baseados na referida ligação deanticorpo, incluem, mas não estão limitados a, Manchas Ocidentais, EnsaiosImunossorventes Ligados por Enzima (ELISA) e espectrometria de massaSELDI. A pessoa versada na técnica é familiar a estas e outras técnicas i-munológicas. Etapas típicas incluem incubação de uma amostra com umanticorpo que se liga à referida proteína, lavagem para remover anticorponão-ligado, e detecção se o anticorpo tiver ligado. Muitos tais métodos dedetecção são baseados em reações enzimáticas - por exemplo, o anticorpopode ser etiquetado com uma enzima tal como peroxidase de rábano silves-tre, e na aplicação de um substrato adequado, uma mudança de cor detec-tada. Os anticorpos adequados podem ser monoclonais ou policlonais.

A presente invenção também inclui um método de detecção dematerial de planta derivado de um evento aqui descrito, referido métodocompreendendo obtenção de uma amostra para análise; produção de umextrato de proteína da amostra; provisão de uma tira de teste ou sonda de-signada para detectar a presença de uma referida proteína presente dentroda amostra; incubação da tira de teste ou sonda com a amostra; e detecçãose referida proteína está presente.

Estse método pode ser um método de detecção baseado em an-ticorpo para os eventos referidos aqui, e usa tiras de teste ou sondas. Asetapas típicas incluem incubação de uma tira de teste ou sonda com umaamostra e observação da presença ou ausência de faixas coloridas na tirade teste ou sonda. As faixas coloridas são indicativas da presença de umaproteína na amostra. Tal tira de teste ou teste de sonda são usualmente es-pecíficos de proteína, e podem ser usados para teste rápido de amostras nocampo.

Em uma concretização, o método imunológico ou sonda utilizaum anticorpo ou anticorpos, ou fragmento/fragmentos destes, específico pa-ra o gene de CryIAb de Bacillus thuringiensis conforme codificado por SEQID NO: 7. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a,Fab, Fab modificado, diFab, Fab', F(ab')2 ou fragmento de FV, cadeia levede imunoglobulina ou monômero de cadeia pesada, FV de cadeia simples(scFV) ou nanocorpo. O anticorpo ou fragmento deste pode ser monoclonalou policlonal. Em uma concretização particular, o anticorpo é um anticorposecretado por linhas de célula selecionadas a partir do grupo consistindo emDSM ACC2723 e DSM ACC2724 (ambos depositados em 12 de maio de2005 em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Alemanha), ou um anticorpoque é capaz de inibir a ligação ao CryIAb de um anticorpo secretado pelaslinhas de célula selecionadas a partir do grupo consistindo em DSMACC2723 e DSM ACC2724. É notado que métodos para produção de am-bos os anticorpos monoclonais e policlonais e fragmentos destes são bemconhecidos na técnica.

Tiras testes adequadas ou sondas e materiais para seu uso sãodescritos no pedido PCT WO 02/27322 e são, por exemplo, imunotiras defluxo lateral compreendendo uma membrana de detecção de acetato de ce-lulose, celulose, nitrocelulose ou náilon, suportada em um suporte plástico.Tal imunotira pode ser produzida usando-se membranas e filtros através dosquais uma amostra líquida é retirada por ação capilar. A proteína na amostrareage com os anticorpos contidos na imunotira a medida que ela se move nocomprimento da tira, e é capturada em uma linha que se torna visível. Meiosadequados de detecção são, por exemplo, ouro coloidal e gotas de látex co-loridas.

Em uma concretização particular, uma linha de anticorpo anti-CryIAb específico, conforme descrito acima, é pulverizada em uma tira deteste, que é adequadamente produzida de nitrocelulose suportada em umsuporte plástico. Uma linha de controle de reagente de anticorpo anticamun-dongo é pulverizada em paralelo acima da primeira linha de anticorpo. Amembrana é flanqueada no topo por uma almofada de absorção, e no fundopor uma almofada contendo ouro coloidal seco rotulado anticorpo anti-CryIAb. Em uma concretização preferida, o ouro coloidal rotulado anticorpoanti-Cry1Ab é diferente do primeiro anticorpo pulverizado como a linha deteste. Em uma concretização particular, o ouro coloidal rotulado anticorpoanti-Cry1Ab é o anticorpo secretado pela linha de célula DSM ACC2723, e oanticorpo pulverizado na linha de teste é o anticorpo secretado pela linha decélula DSM ACC2724. Uma almofada de aplicação de amostra flanqueia aalmofada de ouro coloidal. Em uso, a almofada de aplicação de amostra écolocada em uma amostra ou tecido extraído, ou esta amostra é aplicada àamostra em qualquer modo, por exemplo, por pipeta. A proteína de CryIAbcontida dentro da amostra escoa acima da tira, e se torna ligada pelo ourocoloidal rotulado anticorpo anti-Cryl Ab. A medida que ela continua acima datira, a proteína também se torna ligada pelo anticorpo anti-Cryl Ab na linhade teste. O excesso de conjugado de ouro é capturado na linha de controlede reagente. Em um teste positivo, isto é, se CryIAb está presente na amos-tra, uma linha vermelha dupla aparece: a linha inferior indica a presença deCry 1 Ab, enquanto a linha superior é a linha de controle sinalizando um dis-positivo de operação corretamente.

Em um aspecto ainda adicional da invenção, é provido um kit departes que compreende um par de iniciadores, conforme descrito acima, einstruções para realização do método conforme descrito acima, e meios pararealização de uma reação de amplificação e, opcionalmente, meios parapreparação da amostra ser testada. Em uma ainda outra concretização, éprovido um kit£de partes que compreende um anticorpo conforme descritoacima, e instruções para realização do método conforme descrito acima, emeios para realização do método conforme descrito acima e, opcionalmente,meios para preparação da amostra a ser testada. Em uma ainda outra con-cretização da presente invenção, referido kit de partes pode compreendertecnologia de detecção de amplificação de DNA tal como PCR ou Taq-Man™. Em uma ainda outra concretização da presente invenção, referido kitde partes pode compreender tecnologia de detecção de hibridização de son-da, tais como Manchas do Sul, Manchas do Norte, ou Hibridização in situ.Em outra concretização da presente invenção, referido kit de partes podecompreender tecnologia de detecção de ligação de anticorpo, tais comoManchas do Ocidente, ELISA's, espectrometria de massa SELDI, tiras deteste ou sondas. Em uma outra concretização da presente invenção, referidokit de partes pode compreender qualquer combinação das tecnologias dedetecção antes mencionadas. Em uma ainda outra concretização, referido kitde partes pode compreender na forma de instruções um ou mais métodosacima descritos.

Em um ainda outro aspecto, é provida uma planta ou semente,de acordo com a invenção, que é usada em um método de geração. Por e-xemplo, as plantas podem ser usadas para transferir o traço que proporcionaa resistência de inseto em uma planta do mesmo gênero, mas tendo umgermeplasma de prática diferente. Tal geração em um germeplasma diferen-te pode ser desejada se a planta é para ser crescida sob condições onde umgermeplasma alternativo é favorável. Métodos para geração que podem serusados para transferir o traço em um germeplasma de prática diferente sãobem conhecidos na técnica.

Em um aspecto ainda adicional, é provido o uso de uma plantaou semente, de acordo com a invenção, para gerar material de explante parauso em um método de transformação de referido explante com um outro tra-ço genético. Uma vez provido com os eventos que podem ser identificadospelos métodos da presente invenção, está bem dentro das capacidades dapessoa versada na técnica gerar tal material de explante, e uso em procedi-mentos de transformação adicionais. Além disso, uma vez provido com oseventos que podem ser identificados pelos métodos da presente invenção,está bem dentro das capacidades da pessoa versada na técnica usar referi-dos eventos nos métodos de geração conforme aqui descritos.

De acordo com a presente invenção, é provido o uso de um oumais dos polinucleotídeos da invenção conforme descrito para detecção doevento CE43-67B. Em uma concretização, referidos polinucleotídeos podemser usados em um método para detecção do evento CE43-67B conformedescrito acima.

Exemplos

A invenção tornar-se-á adicionalmente aparente a partir dos se-guintes exemplos não Iimitativos com as listagens de seqüência associadasconforme descrito abaixo:SEQ ID NO 1: evento CE43-67B: Seqüência genônica- Inserto

SEQ ID NO 2: evento CE43-67B: Inserto - Seqüência genônica

SEQ ID NO 3: evento CE43-67B: Seqüência genônica- Junção de inserto

SEQ ID NO 4: evento CE43-67B: Inserto - Junção de seqüência genônica

SEQ ID Nos 5-6: evento CE43-67B: Iniciadores

SEQ ID NO 7: evento CE43-67B: Seqüência de gene CryIAb

SEQ ID NO 8: evento CE43-67B: Iniciadores

Exemplo 1: Clonagem e Transformação

1.1 Clonagem de vetor

Técnicas de clonagem de gene padrões de digestão de restriçãoe ligação de fragmentos a partir de vetores domésticos foram usadas paraconstruir os vetores de transformação pNOV1914 e pNOV4641. O vetorpNOV1914 inclui um cassete marcador selecionável compreendendo umpromotor de Ubiquitin (UBQ3), o UBQ3 íntron, uma seqüência de gene quecodifica uma proteína conferindo resistência à higromicin, e uma seqüênciade poliadenilação de nos. O vetor pNOV4641 inclui o cassete de expressãodo gene alvo, cujo cassete compreende promoter de Actin (ACT2), o ACT2íntron, uma seqüência que codifica o gene de CryIAb que tinha sido códonotimizado para expressão no milho, e uma seqüência de poliadenilação denos.

Os vetores foram transformados em Agrobacterium tumefacienscepa GV3101 usando técnicas de transformação de Agrobacterium padrões,e células transformadas via resistência à antibiótico.

1.2 Transformação de planta

O evento E43-67B foi produzido por transformação mediada porAgrobacterium de Gossypium hirsutum L. cv Coker 312.

Sementes de Coker 312 foram semeadas na estufa. Pecíolosmacios foram cortados de plantas de 3 a 5 semanas de idade, e esteriliza-dos por imersão em etanol 70%. Os pecíolos foram, em seguida, imersos emuma solução de 5% de Clorox + 2ml/l de Tween20 por 20 minutos. Os pecío-los foram lavados 3 vezes em ddH20. As extremidades dos pecíolos foramcortadas, e os pecíolos transferidos para meio de pré-cultura de pecíolo(4,3g/l de sais de MS, vitaminas B5 (100mg/l de myo-lnositol, 1mg/l de ácidonicotínico, 1mg/l de piridoxina HCI1 10mg/l de tiamina HCI), 30g/l de glicose,2,4g/l de fitogel, pH 7,0), e permitida pré-cultura na luz a 30°C por 3 dias.

2 ml de culturas de Agrobacterium contendo as construçõespNOV1914 e pNOV4641 foram desenvolvidas durante a noite em antibióti-cos apropriados e, em seguida, diluídas com meio de MMS1 líquido (4,3g/lde sais de MS, vitaminas B5 (100mg/l de myo-lnositol, 1mg/l de ácido nicotí-nico, 1mg/l de piridoxina HCI, 10mg/l de tiamina HCI), 0,05mg/l de 2,4-D,0.1 mg/l de kinetin, 30g/l de glicose, pH 6,5) para um OD66o de entre 0,1 e 0,2.

As extremidades foram cortadas dos pecíolos e colocadas em10 a 20ml de solução bacterial em uma placa de Petri estéril. Uma vez nasolução, os pecíolos foram cortados longitudinalmente e, em seguida, corta-dos em seções de 2 cm. Após os explantes de pecíolo serem embebidos emsolução bacterial por 5 a 10 minutos, eles foram transferidos para placas deco-cultura (mesma receita como líquido de MMS1 com a adição de 2,4g/l deFitagel), assentados com papéis de filtro estéreis, e permitida co-cultura a24°C por 48 a 72 horas sob baixa intensidade de luz. Os explantes na co-cultura foram transferidos para o meio de MMS1 (receita como para o meiolíquido de MMS1, adicionalmente com 2,4g/l de fitogel) contendo 500mg/l decefotaxima e 10mg/l de higromicin, e incubados a 30°C sob um ciclo de luzde 16 horas de luz e 8 horas de escuro. Os explantes foram transferidos pa-ra meio fresco após 2 semanas, e cada 4 a 6 semanas em seguida até quecalo foi formado.

Uma vez que os calos tivessem o tamanho de uma ervilha dejardim, eles foram removidos a partir dos explantes e transferidos para meiode MMS1 fresco contendo 500mg/l de cefotaxima e 10mg/l de higromicin, emantidos em cultura de tecido por sub-cultura cada 4 semanas conformeapropriado.

1,5 g de tecido de calo foi quebrado completamente e colocadoem um frasco Erlenmeyer de 50 ml contendo 10 ml de meio de MMS2 líqui-do (4,3g/l de sais de MS, vitaminas B5 (100mg/l de myo-lnositol, 1mg/l deácido nicotínico, 1mg/l de piridoxina HCI1 10mg/l de tiamina HCI), 1,9g/l deKNO3, 30 g/l de glicose, pH 6,5). O calo suspenso foi agitado a 100 rpm naluz a 30°C por duas semanas. As células de cultura de suspensão foramenxaguadas 3 vezes em meio líquido de MMS2, ressuspensas e colocadasem meio de MMS2 sólido (receita conforme para meio de MMS2 líquido, adi-cionalmente com 2,4g/L de fitogel). Uma vez colocado em placa, o meio deMMS2 líquido em excesso foi removido, e as placas incubadas a 30°C naluz. As placas foram verificadas em relação a desenvolvimento de embriãosomático cada semana. Os embriões somáticos se formaram dentro de 1 a 2meses. Esta etapa de suspensão líquida pode ser repetida múltiplas vezesaté que calo embriogênico ou embriões somáticos fossem formados.

Os embriões somáticos foram transferidos para o meio EG(germinação embrióide) (2,65g/l sais de MS modificação No. 4 (Duchefa),1,9g/l de KNO3, vitaminas B5 (como antes), 30g/l de glicose, 1 g/i de glutami-na e 0.5g/l de aspargina, pH 6,5), e subcultivados em meio EG fresco cada 3a 4 semanas.

Uma vez que os embriões somáticos ficarem verdes e se torna-ram maiores do que 2 cm, eles foram colocados com a raiz para baixo emum meio EG. Em todos os estágios de regeneração, o desenvolvimento deplantinhas foi impedido de alcançar as tampas ou laterais de seus recipien-tes para impedir queda de folha. Os embriões germinados com 1 a 2 folhasverdadeiras foram transferidos para o meio EG em recipientes Greiner de175 ml. As plantinhas fortes com folhas verdadeiras foram transferidas emturfa estéril com dH20 em Greiners de 175 ml, e transferidas para turfa empotes de 0,076 m (3 polegadas). As plantas foram aclimatadas em um pro-pagador de planta em alta umidade em uma cabine de crescimento sob con-dições de 14 horas em dia claro a 30°C e 10 horas na escuridão a 20°C.

Uma vez que as raízes foram vistas se desenvolvendo através dos furos dedrenagem do pote, elas foram transferidas para potes maiores contendo50% de John Innes No. 3 e 50% de turfa suplementada com Osmocote, ecolocadas na estufa.1.3 Identificação e seleção de transgênicos

As plantas transgênicas supostas foram classificadas por PCRpara a presence do gene de CryIAb. Os eventos positivos foram identifica-dos e classificados usando-se bioensaios de inseto para atividade inseticida.

A caracterização molecular de linhas inseticidas foi efetuada por análise deMancha do Ocidente. A semente T1 de vários eventos foi observada em umensaio de campo para resistência de inseto e qualidade agronômica. O e-vento CE43-67B foi escolhido baseado na caracterização molecular, níveisde expressão de proteína conforme identificados por ELISA, atividade inseti-cida contra Heliothis virescens e Spodoptera Iittoralis e desempenho decampo. O cassete marcador selecionável de higromicin foi segregado usan-do-se geração de planta comercial para resultar no evento CE43-67B.

1.4 Verificação de seqüência de CE43-67B

O DNA genômico foi isolado a partir do evento CE43-67B. Estefoi usado no seqüenciamento das junções do local de inserção de DNA como DNA genômico de algodão no evento CE43-67B (SEQ ID N2S: 1 e 2), u-sando-se técnicas de seqüenciamento de DNA padrões.

Exemplo 2: Detecção específica do evento CE43-67B via PCR2.1 Extração de DNA

O DNA foi extraído a partir do tecido de folha usando-se o Sis-tema de Planta Wizard® Magnetic 96 DNA (Promega, número FF3760), deacordo com as instruções do fabricante, com uma etapa adicional no come-ço do protocolo: seguindo moagem do material de folha, 0,9 ml de Tampãode Extração de Algodão (0,2M de Tris pH 8,0, 50mM de EDTA, 0,25M deNaCI, 0,1% v/v de 2-mercaptoetanol, 2,5% peso/v de polivinil-pirrolidona) foiadicionado a cada cavidade, o tecido de planta ressuspenso, e a placa cen-trifugada a 4.000 rpm (2755g) por 10 minutos. Após aspiração e descarre-gamento do sobrenadante, 300ul de Tampão Lysis A (Promega) foi adicio-nado, e o protocolo dos fabricantes foi seguido a partir deste ponto. Esteprocedimento resultou em aproximadamente 85ul de DNA genômico purifi-cado a uma concentração de aproximadamente 10ng/ul.2.2 Reações de Evento-specífico PCR

25ul de reações de PCR foram dispostas usando-se uma mistura de reaçãopadrão compreendendo:

IxJumpstart RED TaqPCR (Sigma, número P-1107)

0,5 uM de iniciador 1 (SEQ ID NO: 9)

0,5 uM de iniciador 2 (SEQ ID NO: 10)

10ng de DNA genômico

ddH20

As reações de PCR foram aquecidas em um termociclizador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos conforme segue: 94°C por 30 se-gundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 50 segundos. A reação foi comple-tada por aquecimento a 72°C por 5 minutos.

As reações de PCR foram efetuadas em um gel de agarose, efaixas de DNA visualizadas sob luz UV após manchamento com brometo deetidium. Uma faixa de 760 bp de tamanho foi obtida.

Alternativamente, 25ul de reações de PCR foram dispostas u-sando-se uma mistura de reação padrão compreendendo:

1 χ Jumpstart RED TaqPCR (Sigma, número P-1107)0,5 uM de iniciador 1 (SEQ ID NO: 11)0,5 uM de iniciador 2 (SEQ ID NO: 12)10ng de DNA genômicoddH20

As reações de PCR foram aquecidas em um termociclizador a94°C por 5 minutos, seguido por 35 ciclos conforme segue: 94°C por 30 se-gundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos. A reação foi comple-tada por aquecimento a 72°C por 5 minutos.

As reações de PCR foram efetuadas em um gel de agarose, efaixas de DNA visualizadas sob luz UV após manchamento com brometo deetidium. Uma faixa de 267 bp de tamanho foi obtida.

Exemplo 3: Detecção de CE43-67B via Teste de Zigosidade de PCR Multiplex3.1 Extração de DNA genômico

DNA genômico a partir de CE43-67B foi extraído conforme des-crito no Exemplo 2.1.

3.2 PCRI Multiplex

Iniciadores de PCR para uso no teste de zigosidade de PCRmultiplex foram designados. 20ul de reação de PCR foi disposta para cadaamostra a ser testada conforme segue:

IxJumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107)0,5 uM de iniciador 1 (SEQ ID NO: 5)0,5 uM de iniciador 2 (SEQ ID NO: 6)0,5 uM de iniciador 3 (SEQ ID NO: 8)10 ng de DNA genômicoddH20

As reações de PCR foram aquecidas em um termociclizador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos conforme segue: 94°C por 15 se-gundos, 55°C por 15 segundos, 72°C por 45 segundos. A reação foi comple-tada por aquecimento a 72°C por 5 minutos.

As reações de PCR foram efetuadas em um gel de agarose, efaixas de DNA visualizadas sob luz UV após manchamento com brometo deetidium. A presença de 2 faixas (561 bp e aproximadamente 1000 bp) indi-cou que a amostra era de uma planta heterozigótica de CE43-67B; 1 faixade 561 bp de tamanho indicou que a amostra era a partir de uma planta ho-mozigótica CE43-67B; e 1 faixa de aproximadamente 1000 bp de tamanhoindicou que a amostra era de uma planta de algodão tipo selvagem homozi-gótica.

3.3 PCR II Multiplex

1 χ JumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107)0,5 uM de iniciador 1 (SEQ ID NO: 11)0,5 uM de iniciador 2 (SEQ ID NO: 12)0,5 uM de iniciador 3 (SEQ ID NO: 13)10 ng de DNA genômicohdH2O

As reações de PCR foram aquecidas em um termociclizador a94°C por 3 minutos, seguido por 35 ciclos conforme segue: 94°C por 30 se-gundos, 60°C por 30 segundos, 72°C por 45 segundos. A reação foi comple-tada por aquecimento a 72°C por 5 minutos.

As reações de PCR foram efetuadas em um gel de agarose, efaixas de DNA visualizadas sob luz UV após manchamento com brometo deetidium. A presença de 2 faixas (267 bp e aproximadamente 1000 bp) indi-cou que a amostra era de uma planta heterozigótica de CE43-67B; 1 faixade 267 bp de tamanho indicou que a amostra era a partir de uma planta ho-mozigótica CE43-67B; e 1 faixa de aproximadamente 1000 bp de tamanhoindicou que a amostra era de uma planta de algodão tipo selvagem homozi-gótica.

Exemplo 4: Detecção de CE43-67B via Mancha do Ocidente4.1 Extração de DNA para uso em Manchamento do Ocidente

Aproximadamente 2 a 3 g de peso fresco de tecido de folha jo-vem congelado foi moído em um pilão frio a um pó fino, e adicionado a 15 mlde tampão de extração Nuclei frio (0,35 M de glicose, 0,1 M de Tris-HCI pH8,50mM de Na2EDTA, 2% de Polivinil-pirrolidona-10, 0,1% de ácido ascórbico,0,2% de B-merçaptoetanol) em um tubo rotulado. A amostra foi incubada emgelo por 15-20 minutos. O tubo foi misturado brandamente e centrifugado a2700 g por 20 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e 8 ml de tam-pão de Iise nuclear (0,14M de sorbitol, 0,22M de Tris-Cl pH8, 0,8M de NaCI,0,22M de Na2EDTA, 0,8% p/v de CTAB, 1% de Sarkosyl, 1% de Polivinil-pirrolidona-10, 0,1% de ácido ascórbico, 0,2% de B-mercaptoetanol, 5μg/mlde proteinase K) foi adicionado. Após mistura, os tubos foram incubados a65°C por 30 minutos. 10ml de clorofórmio foi adicionado, e o tubo misturadobrandamente por inversão até uma emulsão formada, seguida por centrifu-gação a 4600 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente.

A camada aquosa foi removida em um novo tubo contendo 10μΙde RNase A (10mg sigma R4642), e o tubo incubado por 30 minutos a 37°C.As etapas de clorofórmio e centrifugação foram repetidas uma vez. A cama-da aquosa foi removida em um novo tubo contendo 10ml de propan-2-ol.Após aproximadamente 15 minutos de incubação à temperatura ambiente,um precipitado gelatinoso foi observado na parte intermediária do tubo. Otubo foi misturado brandamente para precipitar o DNA. O DNA foi reunidousando-se um laço estéril em um tubo falcão contendo 70% de etanol. ODNA foi secado com ar para remover o etanol, e ressuspenso em 200-400μΙde TE.

4.2 Método alternativo para extração de DNA

2-3 folhas de algodão jovens (aproximadamente 1g de pesofresco) são moídas a uma pasta em um pilão à temperatura ambiente, com 2ml de tampão de moagem (100mM de NaOAc pH 4,8, 50mM de EDTA pH8,0, 500mM de NaCI1 2% de PVP (10.000 PM), 1,4 % de SDS), e um poucode areia. O tecido moído é transferido para um tubo falcão de 15 ml, e o res-tante no pilão enxaguado com 1 ml de tampão de moagem no tubo. A amos-tra é incubada a 65°C por 15 minutos, sacudindo-se ocasionalmente. 4ml deacetato de amônia 10M é adicionado, e a amostra misturada bem e incuba-da a 65°C por 10 minutos para precipitar proteínas. As amostras são centri-fugadas à temperatura ambiente a 4600 rpm por 10 minutos. A fase aquosaé transferida para um novo tubo de 15 ml.

0,6 volume de isopropanol frio são adicionados, e a amostra éincubada à temperatura ambiente de aproximadamente 30 minutos. Apósmistura por inversão vagarosamente, o DNA é reunido e dissolvido em 500ulde TE. 10ul de 10mg/ml RNAse são adicionados e incubados por 15 minutosà temperatura ambiente. Em seguida à extração com 500ul de fenol: cloro-fórmio: isoamil álcool (25:24:1), a amostra é misturada brandamente, e cen-trifugada a 13000 rpm por 5 minutos.

O sobrenadante é transferido para um tubo novo usando-se umapipeta de Pasteur fina, e reextraído com clorofórmio: isoamil álcool (24:1)conforme acima. O sobrenadante é transferido para novos tubos, 1/10 volu-me de NaOAc 3M (pH4,8) adicionado e misturado, e, em seguida, um volu-me de isopropanol frio é adicionado. A amostra pode ser incubada à tempe-ratura ambiente por até 30 minutos para precipitar o DNA. O DNA é reunidoe ressuspenso em 70% de etanol. O DNA é secado por ar para remover oetanol, e ressuspenso em 200ul de água.

4.3 Sínteses de enzima de restrição

O DNA foi quantificado usando-se um espectrofotômetro e ope-rando em um gel. As sínteses de enzima adequadas foram preparadas u-sando-se 5ug de DNA por síntese em um volume total de 40ul. As síntesesincluindo Ncol, Mscl, Hindlll/Kpnl e Nhel/Ascl foram usadas para detectarnúmero de cópia e integridade do inseto. As sínteses foram incubadas por 6horas na temperatura apropriada para cada enzima.

4.4 Eletroforese de gel

Corante de carregamento de bromofenol azul foi adicionado acada amostra a partir de 4.3 acima, e cada amostra carregada em um 0,8%de gel de agarose TBE. O gel foi operado em 50 volts durante toda a noite.

Após operação, o gel foi lavado em HCI 0,25M por 10 minutospara depurar o DNA, incubado em solução de desnaturação (0,5M NaOH,1,5M NaCI) com agitação branda por 30 minutos, enxaguado com água des-tilada e, em seguida, incubado em solução de neutralização (0,5M Tris, 1,5MNaCI) por 30 minutos.

Uma Mancha do Sul foi preparada conforme segue: uma placade vidro foi colocada sobre uma bandeja contendo 20X SSC e uma tira depapel 3M foi colocada na placa de vidro tal que ambas as extremidadesmergulhadas em solução de 20X SSC (para agir como um pavio). Uma peçade papel 3M do mesmo tamanho conforme o gel foi colocada no pavio, e ogel colocado neste. Tiras de nescofilm foram assentadas ao redor das bor-das do gel para formar uma vedação. Uma membrana Hybond foi colocadano topo do gel, seguidas por duas peças adicionais de papel 3M. Através detoda a montagem da mancha, cuidado foi tomado para assegurar que ne-nhuma bolha de ar ficasse presa entre a membrana, gel e papel 3M. Umapilha de 5 cm - 10 cm de toalhas de papel absorvente foi colocada no topodo papel 3M, e mantida no local com um peso.

O DNA foi permitido transferir para a membrana Hybond durantetoda a noite. Após transferência, a pilha de Mancha do Sul foi desmontada, eο DNA foi ligado à membrana, via reticulação de UV.4.5 Hibridizacão

Uma sonda de DNA adequada foi preparada por digestão derestrição de Hindlll/Kpnl de plasmídeo binário pNOV4641 e purificação dofragmento resultante. 25 ng de DNA de sonda em 4 ul de TE foi fervido áebulição por 5 minutos, colocado em gelo por 5 minutos, em seguida transfe-rido para um tubo de Rediprime Il (Amersham Pharmacia Biotech, númeroRPN1633). Após adição de 5 ul de dCTP rotulado 32P ao tubo Rediprime, asonda foi incubada a 37°C por 1 hora. A sonda foi purificada por centrifuga-ção através de uma coluna microspin G-50 (Amersham Pharmacia Biotech,número 27-5330-01) de acordo com as instruções do fabricante, para remo-ver dNTPs reincorporados. A atividade da sonda foi medida brutamente pelacomparação da quantidade de componente radioativo permanecendo nacoluna para a quantidade no tubo de amostra, com uma razão de pelo me-nos 50:50 sendo aceitável. A membrana Hybond foi pré-hibridizada por mo-Ihamento com 40 ml de tampão Rapid-Hyb pré-aquecido (Amersham-Pharmacia), a 65°C por 30 minutos. A sonda rotulada foi fervida à ebuliçãopor 5 minutos, e colocada no gelo por 5 minutos. Uma quantidade apropria-da de sonda (1 milhão contado por 1ml de tampão de pré-hibridização) foiadicionada ao tampão de pré-hibridização, e hibridização ocorreu a 65°Cdurante a noite. No dia seguinte, o tampão de hibridização foi descartado, e,em seguida ao enxaguamento com 50 ml de solução de 2xSSC/1% de SDS,a membrana foi lavada em 150 ml de solução de SDS de 2xSSC/1% de SDSa 65°C por 30-45 minutos. Este processo foi repetido duas vezes com solu-ção de 1xSSC/1% de SDS. A membrana foi exposta a uma tela de fosfor oufilme de rios X, para detectar onde a sonda se ligou.

Exemplo 5: Detecção de CE43-67B via ELISA

5.1 Extração de proteína

Tecido de algodão para análise foi colhido e congelado a -70°C.O tecido congelado foi mo ido a um pó fino e pesado em um tubo de polipro-pileno rotulado. Tampão de extração (100mM de Tris, 100mM de Borato deSódio, 5mM de MgCI, 0,05% de Tween 20, 0,2% de Ascorbato de Sódio,Água, pH 7,8, 1mM de AEBSF, O1OOImM de Leupeptin) foi adicionado à a-mostra em uma razão de 2:1 (volume de tampão de extração:peso de amos-tra fresca) para tecido congelado, ou 30:1 (volume de tampão de extra-ção:peso seco de amostra) para tecido liofilizado. A amostra foi turbilhonadae homogeneizada usando um Brinkman PT 10/35 Polytron equipado com umgerador de redução de espuma PTA 10TS até que a mistura tornou-se liqüe-feita. Os extratos foram centrifugados a 10.000 χ g por 15 minutos. O sobre-nadante de extrato de proteína foi armazenado a 2-8°C.

5.2 Protocolo ELISA

O procedimento ELISA usou técnicas padrões conforme segue.A placa com 96 cavidades foi embebida em etanol por 2 horas, e secadacom ar. A placa foi revestida com 50 ul de anticorpo anti-Cry1Ab de cabrapor cavidade, e incubada durante a noite a 2-8°C. Após lavagem três vezescom solução de lavagem 1X ELISA (100mM de Tris, 0,5% de Tween-20,75mM de NaCI, pH 8,5), a placa foi secada brevemente por colocação decabeça para baixo em uma toalha de papel. 150 ul de solução de bloqueio(10mM de NaPO4, 140mM de NaCI, 1% de BSA, 0,02% de Sódio Azida, titu-lada para pH 7,4 com NaH2PO4 e Na2HPO4) foi adicionada à cada cavidade,seguido por incubação à temperatura ambiente por 45 minutos. A placa foilavada 3 vezes^conforme descrito acima.

Amostras de CryIAb padrões e extrato de proteína foram aplica-das às cavidades apropriadas da placa em triplicata, 50 ul de volume totalpor cavidade. A placa foi incubada a 2-8°C por 1 hora e 30 minutos, seguidopor temperatura ambiente por outros 30 minutos. A placa foi lavada três ve-zes com solução de lavagem ELISA, e, em seguida, incubada a 35-39°C por1 hora com 50 ul de anticorpo anti-Cry1Ab de coelho por cavidade. A placafoi lavada três vezes com solução de lavagem ELISA, e incubada à tempera-tura ambiente por 30 minutos com 50 ul de anticorpo de burro anticoelhoconjugado com fosfatase alcalina por cavidade. Em seguida a lavagem trêsvezes com solução ELISA, 50 ul de solução de substrato de fosfatase foiadicionado por cavidade, e a placa incubada por 30 minutos à temperaturaambiente. A reação foi cessada pela adição de 50 ul de NaOH por cavidade.A absorvância da solução em cada cavidade foi medida a 405 nm usandouma leitora de placa de cavidades múltiplas Ceres 900C, e os resultadosanalisados usando software de ajuste de Curva KC3 (Bio-Tek Instrumentslnc). A concentração de CryIAb nas amostras foi calculada por referênciaaos padrões de proteína de CryIAb.

Exemplo 6: Detecção de CE43-67B via Sonda

6.1 Extração de proteína

Uma peça de tecido de folha aproximadamente de 0,2 cm2 foicolocada em um tubo contendo tampão de extração. Um agitador de plásticofoi usado para extrair proteína a partir do tecido, pelo corte e maceração do tecido.

6.2 Teste de sonda

Uma tira de teste foi colocada no tubo, e incubada por 5 a 10minutos para o resultado desenvolver. A tira de teste compreende uma pri-meira faixa na qual o anticorpo anti-CrylAb foi ligado, e uma segunda faixana qual um anticorpo de controle foi ligado. Após incubação, uma linha ver-melha dupla na janela resultante da tira de teste indicou que CryIAb estavapresente. A linha inferior indicou a presença de proteína de Cryl Ab, enquan-to a linha superior foi um controle indicando que o ensaio estava operandocorretamente.

Exemplo 7: Detecção de CE43-67B via Teste de Zigosidade de TaqMan dePonto Terminal

7.1 Extração de DNA Genômico

DNA genômico de CE43-67B foi extraído conforme descrito noExemplo 2.1.

7.2 TagMan PCR de Ponto Terminal

Iniciadores de PCR para uso em um teste de zigosidade deTaqMan PCR de ponto terminal foram designados. 20 ul de reação de PCRfoi disposta para cada amostra a ser testada conforme segue:

1 χ JumpStart ReadyMix REDTaq PCR (Sigma P-1107)0,5 uM de mistura de iniciador 1 (concentrações equimolares de SEQ IDNOs: 14, 15 e 16)0,5 uM de mistura de iniciador 2 (concentrações equimolares de SEQ IDNOs: 17, 18 e 19)10 ng de DNA genômicoddH20

As reações de PCR foram aquecidas em um termociclizador a94°C por 5 minutos, seguido por 40 ciclos conforme segue: 95°C por 15 se-gundos, 60°C por 1 minuto.

7.3 Análise

Os valores de fluorescência foram lidos no ABI 7900HT, e o cur-so de análise de ponto terminal usando programa de Discriminação Alélicano software SDS provido. A detecção de fluorescência de FAM indicou que aamostra era de planta homozigótica CE43-67B.

A detecção da fluorescência de TET indicou que a amostra erade uma planta de algodão tipo selvagem homozigótica. A detecção de FAMe fluorescência de TET indicaram que a amostra era de uma planta hetero-zigótica CE43-67B.

Exemplo 8: Eficiência Inseticida de CE43-67B8.1 Ensaio de campo I - desenho

Ensaios de campo foram assentados em 6 localizações nos Es-tados Unidos pgra testar a resistência do inseto de CE43-67B. Em cada lo-calização, ensaios duplicatas foram plantados em um desenho de blococompleto aleatório, cada um compreendendo 4 réplicas. Cada ensaio consis-tiu em um plano compreendendo séries de 1,21 χ 12,2 m (4 χ 40 pés), plan-tadas em 3 plantas por 0,30 m (pé).

Em cada localização, um ensaio foi artificialmente infestado comlarvas de Heliothis virescens (verme de tabaco), e o outro com larvas de He-Iicoverpa zea (lagarta de algodão) quando as plantas foram ativamente divi-didas em quadrado. Os ensaios foram subseqüentemente acessados paradanos de percentagem para cápsulas e quadrados. As infestações artificiaisforam efetuadas por pulverização de ovos em uma solução de goma xantananas plantas de modo que as larvas neonato chocaram diretamente nas plantas.As infestações foram designadas para dar aproximadamente 3 ovos por planta.8.2 Ensaio de campo I - resultados

Os dados apresentados na tabela abaixo são a média de todosos acessos tomados durante os ensaios: classificação de dano de quadradomúltiplo e dano de cápsula foram calculados juntos para dar uma classifica-ção de dano do órgão para produção de esporos média, e os dados de todasas 6 localizações foram classificados juntos.

<formula>formula see original document page 41</formula>

Os dados mostram claramente que CE43-67B tem excelenteresistência a ambos Heliothis virescens e Helicoverpa zea quando compara-do ao controle não-transgênico designado Coker312.

8.3 Ensaio de campo Il - desenho

As plantas de CE43-67B foram artificialmente infestadas comovos de verme de tabaco (Heliothis virescens), que foram obtidos a partir deSouthern Insect Management Laboratory in Stoneville, MS 24 a 36 horasantes da infestação artificial. Os ovos foram misturados em uma solução degoma xantana e pulverizados na área terminal das plantas de algodão utili-zando um pulverizador de CO2 convencional. Os ovos foram pulverizadosatravés de um bocal 8006 de ventoinha plana a aproximadamente 69 KPa(10 psi). O ensaio foi efetuado em 2 localizações, Syngenta's Southern Regio-nal Technical Centre at Leland, MS e Vero Beach Research Centre at Vero Be-ach, FL. Em ambas as localizações, blocos sólidos não-replicados de aproxi-madamente 2240 plantas de CE43-67B, bem como blocos menores de aproxi-madamente 224 plantas de Coker 312 não-transgênicos, foram utilizados paraa infestação. Se populações de inimigos naturais fossem julgadas serem sufici-entemente alta para interferir com a infestação, a área de estudo foi pulverizadacom acefato (Orthene®) a 0,45 kg de Í.A./A (0,5 Ib de ai/A) 24 a 48 horas an-tes da infestação tabelada. O bloco de algodão de Coker 312 não-transgê-nico foi usado para estimar a eficiência da técnica de infestação, e para de-terminar conveniência de campo da cepa de verme de tabaco utilizada nes-tes estudos. Em cada localização, quarto infestações artificiais foram feitaspara CE43-67B e algodão de Coker 312 com um quarto das plantas disponí-veis sendo infestadas cada vez. As infestações foram efetuadas entre quadra-gem média e cápsula prematura. A taxa de ovo chocado foi estimada pela cole-ta de várias folhas contendo ovos a partir de plantas de Coker 312, e colocan-do-as em placas de Petri. Os ovos nas folhas coletadas foram contados, e doisa três dias depois, eclosão de larva bem-sucedida foi acessada. Os acessosforam efetuados 7 dias após infestação. Metade de todas as plantas infesta-das foi acessada na localização Leland MS, pelo que três quartos de todasas plantas infestadas foram acessados na localização Vero Beach, FL. Emcada caso, o acesso envolveu uma pesquisa de planta total para sobrevi-vência de larvas. Classificações de dano de quadrado foram também toma-das a partir do ensaio Leland. Onde a sobrevivência das larvas foi encontra-da nas plantas de CE43-67B, as estruturas do órgão de produção de espo-ros contendo as larvas foram rotuladas. Para 7 dias depois, estas estruturasde órgão de produção de esporos, mais todas as estruturas adjacentes, foramcompletamente acessadas novamente para avaliar se as larvas estavam aindasobrevivendo. Acessos similares mais tarde não foram efetuados nos planos deCoker 312 porque por este estágio muitas das larvas que estavam nestas plan-tas tinham começado a procurar locais de pupação no solo.

8.4 Ensaio de campo Il - resultados

A tabela abaixo é um resumo dos dados coletados.

<formula>formula see original document page 42</formula>

* Estimados baseados no número de ovos aplicados e a taxa de cria obser-vada

ND = não determinado

A sobrevivência das larvas nas plantas de CE43-67B 7 dias a-pós infestação em ambas as localizações foi muito pequena, variando a par-tir do primeiro ao terceiro instar. As estruturas do órgão de produção de es-poros que contêm larvas vivas 7 dias após infestação foram rotuladas e a-cessadas novamente 4 a 7 dias mais tarde. No segundo acesso, nenhumalarva viva pode ser recuperada nas estruturas de órgão de produção de es-poros rotuladas ou circundantes. Além disso, todas as estruturas de órgãode produção de esporos rotuladas permanecem nas plantas e estavam sedesenvolvendo normalmente. Isto sugere fortemente que as poucas larvaspequenas que estavam ainda vivas nas plantas de CE43-67B 7 após infes-tação não sobreviveram ao segundo acesso.

Os níveis de dano de quadrado observados nas plantas deCE43-67B foram extremamente baixos em comparação ao controle Coker-312 não-transgênico, confirmando que as larvas de verme de tabaco eramvigorosas e capazes de estabelecerem uma infestação robusta.

Os dados a partir deste ensaio de infestação artificial mostraramque CE43-67B tem excelente resistência a verme de tabaco quando compa-rado ao controle não-transgênico designado Coker 312.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> PARTICIPAÇÕES SYNGENTA AG<120> ALGODÃO INSETICIDA CE43-67B

<130> 70690<160> 19

<170> PatentIn versão 3.1<210> 1<211> 545<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 1

attcattaga gccttctaca agttgaagga agagctagtt cgagcttttg gttttctgtg 60

aaagttgata ttttgttagt gttttggaat cactgctcgt agatgattca tggtgtaatt 120

gggaatttag atgtagccta aacccctact ctatattctc aaagtaagtg ttcttatgcc 180

tatgattaaa tgtgatatat gtatgcttgt gaaattatga aattatgagc atatatgaga 240

tgctatgaca tatgctataa gcatttgata acttggacaa cttaataaca cattgcggat 300

acggccatgc tggccgcccg ggcaccggta aatttcctgc agggctagca gatctctcga 360

ggtttaaacg ggcccacgcg tgcggccgct ccggattcga attaattaac gtacgaagct 420

tgcatgcctg caggtcgaca aaatttagaa cgaacttaat tatgatctca aatacattga 480

tacatatctc atctagatct aggttatcat tatgtaagaa agttttgacg aatatggcac 540

gacaa 545

<210> 2

<211> 1198

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 2

ttgcggttct gtcagttcca aacgtaaaac ggcttgtccc gcgtcatcgg cgggggtcat 60aacgtgactc ccttaattct ccgctcatga tcagattgtc gtttcccgcc ttcagtttaa 120actatcagtg tttataatgt gctaatgatg tgaatatgca gtgcttatgt gcggaaaatc 180aataagtaaa tatgtgataa caatgtggat attttggcct tgtgctatta tgagaccgtt 240ggatatagtt ggcatgccat agggttgtga gtactcatct ttgtgatgtt gtttatgggg 300cgttggggcc caaggacaat ttttggaaag ataagggaat gtgagctaag cttaattcac 360cgggatatgt gtgtttggtg tgctggagag tgttaactat atgcttcact tatgggacat 420gtacgacact atgagtcaat attggtctgt tggtgatcca tgtattcgat gtgtggtgat 480agggtccaca ttatatttca tatcctcaag agccaaacta tcataaaaca tgactgaaag 540tgactaaatg tgattaaaat gtgttgtagt atatgcttaa atattcatgt gattaatgtg 600taaatattca tgaaagatga taaaatgtgt taaacatgac ataggagtag aagatgttat 660gattatattg catgtttgct ttgttgatgc ataatgattt gtttgcgtag tggttgtttt 720caccattcac tgagcttgtt aagctcacgc actccttttt aatcattaca gataattagt 780gccggtgtga gtggtatggt ctcgaggggt gatccaagcc agacatttag ttgctattag 840taggtgtttt ttctattatt tgtgtttttg agactttaag gcaatgtggt agactttata 900tcagctttgt taagttattt tggggctatt tgcatgttat ttacgtttgg aagcttgtag 960attttgaata tgatattttg attgttgttt ggttattcag aagcttattt atctaggtga 1020ataaatcatg ttatttaggg atgagtttaa atgatctaat tgttgatata tgctaaaatt 1080tggtagtttg gagcaaggta ttgataatag gattactaaa atgatatcga aagtgcagca 1140aaacagaata tagaattgtt attgatacct tggcccgagt atcaatactc gaggtaaa 1198

<210> 3

<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 3

gcatttgata acttggacaa cttaataaca 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220><223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 4

aaactatcag tgtttataat gtgctaatga 30

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo

<400> 5

ttctcctgca gcctctgatt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 6

tgtcgtgcca tattcgtcaa a 21

<210> 7

<211> 3546<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 7

atggacaaca accccaacat caacgagtgc atcccctaca actgcctgag caaccccgag 60gtggaggtgc tgggcggcga gcgcatcgag accggctaca cccccatcga catcagcctg 120agcctgaccc agttcctgct gagcgagttc gtgcccggcg ccggcttcgt gctgggcctg 180gtggacatca tctggggcat cttcggcccc agccagtggg acgccttcct ggtgcagatc 240gagcagttga taaaccaacg catagaggaa ttcgcccgca accaggccat cagccgcctg 300gagggcctga gcaacctgta ccaaatctac gccgagagct tccgcgagtg ggaggccgac 3 60cccaccaacc ccgccctgcg cgaggagatgctgaccaccg ccatccccct gttcgccgtgtacgtgcagg ccgccaacct gcacctgagccgctggggct tcgacgccgc caccatcaacggcaactaca ccgaccacgc cgtgcgctggcccgacagcc gcgactggat caggtacaacctggacatcg tgagcctgtt ccccaactacagccagctga cccgcgagat ttacaccaaccgcggcagcg cccagggcat cgagggcagcaacagcatca ccatctacac cgacgcccacatcatggcca gccccgtcgg cttcagcggcatgggcaacg ctgcacctca gcagcgcatcaccctgagca gcaccctgta ccgtcgacctagcgtgctgg acggcaccga gttcgcctactaccgcaaga gcggcaccgt ggacagcctgccacctcgac agggcttcag ccaccgtctgagcaacagca gcgtgagcat catccgtgcagagttcaaca acatcatccc cagcagccagaacctgggca gcggcaccag cgtggtgaagcgccgcacca gccccggcca gatcagcacccagcgctacc gcgtccgcat ccgctacgccatcgacggcc gccccatcaa ccagggcaacctgcagagcg gcagcttccg caccgtgggcagcagcgtgt tcaccctgag cgcccacgtgcgcatcgagt tcgtgcccgc cgaggtgacccagaaggccg tgaacgagct gttcaccagcaccgactacc acatcgacca ggtgagcaacctggacgaga agaaggagct gagcgagaagcgcaacctgc tgcaggaccc caacttccgccgaggcagca ccgatatcac catccagggcaccctgctgg gcaccttcga cgagtgctacagcaagctga aggcctacac ccgctaccag

cgcatccagt tcaacgacat gaacagcgcc 420cagaactacc aggtgcccct gctgagcgtg 480gtgctgcgcg acgtcagcgt gttcggccag 540agccgctaca acgacctgac ccgcctgatc 600tacaacaccg gcctggagcg cgtgtggggt 660cagttccgcc gcgagctgac cctgaccgtg 720gacagccgca cctaccccat ccgcaccgtg 780cccgtgctgg agaacttcga cggcagcttc 840atccgcagcc cccacctgat ggacatcctg 900cgcggcgagt actactggag cggccaccag 960cccgagttca ccttccccct gtacggcacc 1020gtggcacagc tgggccaggg agtgtaccgc 1080ttcaacatcg gcatcaacaa ccagcagctg 1140ggcaccagca gcaacctgcc cagcgccgtg 1200gacgagatcc cccctcagaa caacaacgtg 12 60agccacgtga gcatgttccg cagtggcttc 1320cctatgttca gctggattca ccgcagtgcc 1380atcacccaga tccccctgac caagagcacc 1440ggccccggct tcaccggcgg cgacatcctg 1500ctgcgcgtga acatcaccgc ccccctgagc 1560agcaccacca acctgcagtt ccacaccagc 1620ttcagcgcca ccatgagcag cggcagcaac 1680ttcaccaccc ccttcaactt cagcaacggc 1740ttcaacagcg gcaacgaggt gtacatcgac 1800ttcgaggccg agtacgacct ggagagggct 1860agcaaccaga tcggcctgaa gaccgacgtg 1920ctggtggagt gcttaagcga cgagttctgc 1980gtgaagcacg ccaagcgcct gagcgacgag 2040ggcatcaacc gccagctgga ccgcggctgg 2100ggcgacgacg tgttcaagga gaactacgtg 2160cccacctacc tgtaccagaa gatcgacgag 2220ctgcgcggct acatcgagga cagccaggac 2280ctggaaatct acctgatccg ctacaacgcg aagcacgaga ccgtgaacgt gcccggcacc 2340

ggcagcctgt ggcccctgag cgcccccagc cccatcggca agtgcgggga gccgaatcga 2400

tgcgctccgc acctggagtg gaacccggac ctagactgca gctgcaggga cggggagaag 2460

tgcgcccacc acagccacca cttcagcctg gacatcgacg tgggctgcac cgacctgaac 2520

gaggacctgg gcgtgtgggt gatcttcaag atcaagaccc aggacggcca cgcccgcctg 2 580

ggcaatctag agttcctgga ggagaagccc ctggtgggcg aggccctggc ccgcgtgaag 2640

cgtgctgaga agaagtggcg cgacaagcgc gagaagctgg agtgggagac caacatcgtg 27 00

tacaaggagg ccaaggagag cgtggacgcc ctgttcgtga acagccagta cgaccgcctg 2760

caggccgaca ccaacatcgc catgatccac gccgccgaca agcgcgtgca cagcattcgc 2820

gaggcctacc tgcccgagct gagcgtgatc cccggtgtga acgccgccat cttcgaggaa 2880

ctcgagggcc gcatcttcac cgccttcagc ctgtacgacg cccgcaacgt gatcaagaac 2940

ggcgacttca acaacggcct gagctgctgg aacgtgaagg gccacgtgga cgtggaggag 3000

cagaacaacc accgcagcgt gctggtggtg cccgagtggg aggccgaggt gagccaggag 3060

gtgcgcgtgt gccccggccg cggctacatc ctgcgcgtga ccgcctacaa ggagggctac 3120

ggcgagggct gcgtgaccat ccacgagatc gagaacaaca ccgacgaact caagttcagc 3180

aactgcgtgg aggaggaggt ttaccccaac aacaccgtga cctgcaacga ctacaccgcg 3240

acccaggagg agtacgaagg cacctacacc tctcgcaaca ggggttacga cggcgcctac 3300

gagtccaaca gctccgtgcc agctgactac gccagcgcct acgaggagaa agcctacacc 3360

gacggtagac gcgacaaccc atgtgagagc aacagaggct acggcgacta cacccccctg 3420

cccgctggat acgfegaccaa ggagctggag tacttccccg agaccgacaa ggtgtggatc 3480

gagattggcg agaccgaggg caccttcatc gtggacagcg tggagctgct gctgatggag 3540

gagtag 3546

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 8

ccctcgagac cataccactc a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<400> 9

ccctcgagac cataccactc a<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo

<400> 10

gcggttctgt cagttccaaa cg

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<400> 11

gttcgagctt ttggttttct gtg<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<400> 12

ccgtatccgc aatgtgttat taag<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 13

ccctcgagac cataccactca<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 14

ctcccttaat tctccgctca tg<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<400> 15

tcacatcatt agcaêattat aaacactga<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotídeo<220>

<221> misc_característica<222> (1)..(1)

<223> Rótulo FAM no terminal 5'<220>

<221> misc_característica<222> (26)..(26)<223> rótulo TEMRA no terminal 3<400> 16

tcagattgtc gtttcccgcc ttcagt<210> 17

<211> 27<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<400> 17

tgcttgtgaa attatgaaat tatgagc<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<400> 18

taacataatg acatatttat tttcacatca gtt<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> CE43-67B motivo de nucleotideo<220>

<221> misc_característica<222> (1) . . (1)

<223> rótulo TET no terminal 5'<220>

<221> misc_característica<222> (23). . (23)<223> rótulo TEMRA no terminal 3

<400> 19

tatatgagat gctatgacat atg

Claims

1. Polinucleotídeo que compreende uma primeira região com-preendendo a seqüência representada como SEQ ID NO: 1 e uma regiãoadicional que compreende a seqüência representada como SEQ ID NO: 2.

2. Polinucleotídeo que compreende:a) pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como SEQ ID NO: 3;b) pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como nucleotídeos 246 a 305 de SEQ ID ΝΟ.Ί; ouc) pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como SEQ ID NO: 1; referido polinucleotídeo envolvendo os nucleo-tídeos 275 e 276 de SEQ ID NO:1.

3. Polinucleotídeo que compreende:a) pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como SEQ ID NO: 4;b) pelo menos 35 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como nucleotídeos 103 a 164 de SEQ ID NO:2; ouc) pelo menos 50 nucleotídeos contíguos da seqüência repre-sentada como SEQ ID NO: 2; referido polinucleotídeo envolvendo os nucleo-tídeos 133 e 134 de SEQ ID NO:2.

4. Planta de algodão compreendendo um polinucleotídeo de a-cordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.

5. Semente da planta de algodão, de acordo com a reivindicação 4, que compreende o polinucleotídeo de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1 a 3.

6. Método para detecção de uma planta que contém o polinucle-otídeo representado como SEQ ID NO:1, referido método compreendendo:a) preparação de uma amostra contendo o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obtenção de um par de iniciadores que são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compre-endendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO:3, e o complemento da mesma;c) adição de referido par de iniciadores à referida amostra e aosmeios para realizar uma reação de amplificação;d) realização de uma reação de amplificação; ee) visualização da seqüência assim amplificada.

7. Método para detecção de uma planta que contém o polinucle-otídeo representado como SEQ ID NO:2, referido método compreendendo:a) preparação de uma amostra contendo o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obtenção de um par de iniciadores que são adequados parauso em uma reação de amplificação para amplificar uma seqüência compre-endendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência representadacomo SEQ ID NO:4, e o complemento da mesma;c) adição de referido par de iniciadores à referida amostra e aosmeios para realizar uma reação de amplificação;d) realização de uma reação de amplificação; ee) visualização da seqüência assim amplificada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7,em que a referida seqüência compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos.

9. Método para detecção dè uma planta que contém o polinucle-otídeo representado como SEQ ID NO:1, e/ou o polinucleotídeo representa-do como SEQ ID NO:2, referido método compreendendo:a) preparação de uma amostra contendo o DNA genômico daplanta a ser testada;b) obtenção de uma sonda que é capaz de hibridizar a uma se-qüência selecionada a partir do grupo consistindo em uma seqüência com-preendendo pelo menos 18 nucleotídeos contíguos da seqüência represen-tada como SEQ ID NO:3, e uma seqüência compreendendo pelo menos 18nucleotídeos contíguos da seqüência representada como SEQ ID NO:4;c) adição de pelo menos uma das sondas da etapa (b) à referidaamostra sob condições que permitem que referida sonda hibridize com umácido nucléico complementar dentro de referida amostra;d) remoção da sonda substancialmente não-hibridizada; ee) detecção da sonda assim hibridizada para identificar se a a-mostra contém referido nucleotídeo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, em que a referidaseqüência compreende pelo menos 20 nucleotídeos contíguos.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, em que a referida sonda substancialmente não-hibridizada é removidapela lavagem da sonda sob condições de alta escassez.

12. Kit de partes que compreende um par de iniciadores comodefinido na reivindicação 6 ou reivindicação 7, instruções para realização dométodo como definido na reivindicação 6 ou reivindicação 7, meios para rea-lizar uma reação de amplificação, e opcionalmente meios para preparaçãodas amostras a serem testadas.

13. Anticorpo anti-Cry1Ab secretado pela linha de célula DSMACC2723 ou DSM ACC2724.

14. Sonda compreendendo:a) uma linha de teste de anticorpo anti-Cryl Ab específico;b) uma linha de controle de reagente de um anticorpo antica-mundongo;c) uma almofada contendo ouro coloidal seco rotulado anticorpoanti-Cryl Ab; ed) uma almofada de aplicação de amostra;em que o anticorpo anti-Cry1Ab e o ouro coloidal seco rotuladoanticorpo anti-Cry1Ab são independentemente selecionados a partir do gru-po consistindo em um anticorpo secretado pela linha de célula DSMACC2723 e um anticorpo secretado pela linha de célula DSM ACC2724.