BRPI0611528A2

BRPI0611528A2 - compostos úteis para tratamento de distúrbios neurodegenerativos

Info

Publication number: BRPI0611528A2
Application number: BRPI0611528-4A
Authority: BR
Inventors: Mark A Findeis; Kollol Pal; Frank Schroeder
Original assignee: Satori Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2005-05-17
Filing date: 2006-05-16
Publication date: 2010-11-23
Also published as: CN103122019A; EP1888616A4; RU2440367C2; AU2006247244A1; JP2013082718A; CA2609021C; CN101223185A; AU2006247244B2; CA2609021A1; US7851641B2; JP2008540668A; US20110136749A1; EP1888616A1; JP5184349B2; RU2007148081A; US20110136750A1; NZ563888A; IL187439A0; KR20080036552A; WO2006124956A1

Abstract

COMPOSTOS úTEIS PARA TRATAMENTO DE DISTúRBIOS NEURODEGENERATIVOS. A presente invenção refere-se a compostos úteis para tratamento ou diminuição da severidade de um distúrbio neurodegenerativo. A presente invenção também refere-se a métodos de tratamento ou diminuição da severidade de tais distúrbios em que o dito método compreende administrar a um paciente um composto da presente invenção ou sua composição. O dito método é útil para tratamento ou diminuição da severidade de, por exemplo, doença de Alzheimer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTOS ÚTEIS PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS NEURODEGENERATIVOS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS

O presente pedido de patente reivindica prioridade do Pedido depatente provisório U.S. número de série 60/681.662 depositado em 17 demaio de 2005, o qual é aqui incorporado em sua totalidade a título de refe-rencia.

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a compostos farmaceuticamenteativos úteis para tratamento, ou diminuição da severidade, de distúrbios neu-rodegenerativos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O papel central da forma longa do peptídeo beta-amilóide, emparticular Αβ(1-42), em doença de Alzheimer foi estabelecido através deuma variedade de estudos histopatológicos, genéticos e bioquímicos. VideSelkoe, D.J., Physiol. Rev. 2001, 81:741-766, AIzheimer1S disease: genes,proteins and therapy e Younkin, S.G., Physiol Paris. 1998, 92:289-92, Therole of beta 42 in AIzheimer1S disease. Especificamente, foi verificado que adeposição no cérebro de Αβ(1-42) é uma característica inicial e invariante detodas as formas de doença de Alzheimer. Na realidade, isto acontece antesde um diagnóstico de doença de Alzheimer ser possível e antes da deposi-ção da forma primária menor de Α-beta, Ap(1-40).Vide Parvathy, S. e outros,Arch. Neurol., 2001, 58:2025-32, Correlation between Abetax-40-, Abetax-42- e Abetax-43- containing amyloid plaques and cognitive decline. Implica-ção adicional de Αβ(1-42) em etiologia de doença vem da observação deque mutações em genes presenilina (gama secretase) associados com for-mas familiares de início precoce de doença de Alzheimer resultam unifor-memente em níveis altos de Αβ(1-42). Vide Ishii, K. e outros, Neurosci. Lett.,1997, 228:17-20, Increased A beta 42(43)-plaque deposition in early-onsetfamilial AIzheimer1S disease brains with the deletion of exon 9 and the mis-sense point mutation (H163R) in the PS-1 gene. Mutações adicionais na pro-teína precursora amilóide APP aumentam Αβ total e em alguns casos au-mentam Αβ(1-42) sozinha. Vide Kosaka1 T., e outros, Neurology, 48:741-5,The beta APP717 Alzheimer mutation increases the percentage of plasmaamyloid-beta protein ending at A beta42(43). Embora as várias mutações deAPP possam influenciar o tipo, quantidade e localização de Αβ depositada,foi verificado que a espécie predominante e inicial no parênquima cerebral éΑβ longa (Mann). Vide Mann, D.M. e outros, Am. J. Pathol., 1996, 148:1257-66, Mann DM, e outros, Am. J. PathoL 1996, 148:1257-66, Predominant de-position of amyloid-beta 42(43) in plaques in cases of AIzheimer1S diseaseand hereditary cerebral hemorrhage associated with mutations in the amyloidprecursor protein gene.

Nos primeiros depósitos de Αβ, quando a maior parte da proteí-na depositada está na forma de placas amorfas ou difusas, virtualmente todaa Αβ é de forma longa. Vide Gravina SA, e outros, J. Biol. Chem., 270:7013-6, Amyloid beta protein (A beta) in AIzheimer1S disease brain. Biochemicaland immunocytochemical analysis with antibodies specific for forms endingat A beta 40 or A beta 42(43)] Iwatsubo, T., e outros, Am. J. PathoL 1996,149:1823-30, Full-Iength amyloid-beta (1-42(43)) and amino-terminally modi-fied and truncated amyloid-beta 42(43) deposit in diffuse plaques; e Roher,A.E., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1993, 90:10836-40, beta-Amyloidf 1-42) is a major component of cerebrovascular amyloid deposits:implications for the pathology of Alzheimer disease. Esses depósitos iniciaisde Αβ(1-42) então são capazes de semear a deposição adicional de ambasformas longa e curta de Αβ. Vide Tamaoka A, e outros, Biochem BiophysRes Commun. 1994, 205:834-42, Biochemical evidence for the long-tail form(A beta 1-42/43) of amyloid beta protein as a seed molecule in cerebral de-posits of AIzheimer1S disease.

Em animais transgênicos expressando Αβ, depósitos foram as-sociados com níveis elevados de Αβ(1-42), e o padrão de deposição é simi-lar àquele visto em doença humana com Αβ(1-42) sendo depositada no iní-cio seguido por deposição de Αβ(1-40). Vide Rockenstein, E., e outros,J.Neurosci. Res. 2001, 66:573-82, Early formation of mature amyloid-betaprotein deposits in a mutant APP transgenic model depends on leveis ofAbeta(l-42'); e Terai1 K., e outros, Neuroscience 2001, 104:299-310, beta-Amyloid deposits in transgenic mice expressing human beta-amyloid precur-sor protein have the same characteristics as those in Alzheimer's disease.

Padrões e momento de deposição similares são vistos em pacientes comSíndrome de Down onde expressão de Αβ é elevada e deposição é acelera-da. Vide Iwatsubo, T. e outros, Ann. NeuroL 1995, 37:294-9, Amyloid betaprotein (A beta) deposition: A beta 42(43) precedes A beta 40 in Down syn-drome.

Deste modo, diminuição seletiva de Αβ(1-42) então emerge co-mo uma estratégia específica de doença para redução do potencial de for-mação de amilóide de todas as formas de Αβ, diminuindo ou parando a for-mação de novos depósitos de Αβ, inibindo a formação de oligômeros tóxicossolúveis de Αβ e então diminuindo ou parando a progressão de neurodege-ne ração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Conforme aqui descrito, a presente invenção provê compostosúteis para tratamento ou diminuição da severidade de um distúrbio neuropro-tetor. A presente invenção também provê métodos de tratamento ou diminui-ção da severidade de tais distúrbios onde o dito método compreende admi-nistração a um paciente de um composto da presente invenção ou sua com-posição. O dito método é útil para tratamento ou diminuição da severidadede, por exemplo, doença de Alzheimer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra os espectros de 1H RMN de frações cromato-gráficas sat14-9 e sat14-10.

A Figura 2 mostra os espectros de 1H RMN de frações cromato-gráficas sat14-11 esat14-12.

A Figura 3 mostra os espectros de 1H RMN de frações cromato-gráficas sat15-1 e sat15-2.

A Figura 4 mostra os espectros de 1H RMN de frações cromato-gráficas sat15-4e sat15-5.A Figura 5 mostra um aumento da separação de cromatogramade HPLC de fase reversa C-18 de sal15-5, onde números 1 a 5 correspon-dem à janela de tempo para as frações 16-1 a sat16-9.

A Figura 6 mostra os espectro de 1H RMN de fração sat16-3 cor-respondendo ao composto 6 como 98% puro.

A Figura 7 mostra um sumário de fluxograma de protocolo deisolamento 2.

A Figura 8 mostra um traço de HPLC de extrato de cohosh pretoapós HPLC semipreparativa.

A Figura 9 mostra um traço de HPLC de Composto 6 mostrandoum pico de acila menor.

A Figura 10 mostra um traço de HPLC de Composto 6.

A Figura 11 mostra um espectro de massa de Composto de acila 6.

A Figura 12 mostra um 1H RMN de Composto de acila 6.

A Figura 13 mostra um traço de HPLC de Composto 6.

A Figura 14 mostra um 1H RMN (CD3OD) de Composto 6.

A Figura 15 mostra um espectro de massa de Composto 6.

A Figura 16 mostra o traço de HPLC de Composto 6 detectado a250 nm isolado de acordo com o protocolo 2.

A Figura 17 mostra o traço de HPLC de Composto 6 detectado a230 nm isolado de acordo com o protocolo 2.

A Figura 18 mostra o HPLC de Composto 6 detectado em ELSD.

A Figura 19 mostra o espectro de 1H RMN de Composto 6 isola-do de acordo com o protocolo 2.

A Figura 20 mostra o espectro de massa de Composto 6 isoladode acordo com o protocolo 2.

A Figura 21 mostra o efeito determinado por IP-MS de Composto6 sobre as quantidades relativas de beta-amilóide (1-40), (1-42), (1-37), (1-38) e (1-39).

A Figura 22 mostra o efeito determinado por IP-MS de Composto6 sobre as quantidades de beta-amilóide (1-40), (1-42), (1-37), (1-38) e (1-39) em células do tipo selvagem e mutadas 717.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVENÇÃO

1. Descrição Geral de Compostos da Invenção:

De acordo com uma modalidade, a presente invenção provê umcomposto da fórmula I:

<formula>formula see original document page 6</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde:

cada um do Anel A, Anel B, Anel C, Anel D e Anel E é independentementesaturado, parcialmente insaturado ou aromático;

GéS, CH2, NR ou O;

R1 e R2 são cada um independentemente halogênio, R, OR, um

grupo hidroxila adequadamente protegido, SR, um grupo tiol adequadamen-te protegido, N(R)2 ou um grupo amino adequadamente protegido, ou R1 eR2 são tomados juntos para formarem um anel de 3-7 membros saturado,parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

cada R é independentemente hidrogênio, um grupo Cv-C6 alifáti-co opcionalmente substituído ou um anel de 3-8 membros saturado opcio-nalmente substituído, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-4 heteroáto-mos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre,onde:

dois R no mesmo átomo de nitrogênio são opcionalmente toma-dos juntos com o dito átomo de nitrogênio para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 1-4 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

η é 0-2;R31 R4, R7 e R8 são cada um independentemente selecionadosde halogênio, R1 OR1 um grupo hidroxila adequadamente protegido, SR, umgrupo tiol adequadamente protegido, SO2R, OSO2R, N(R)2, um grupo aminoadequadamente protegido, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2,NR(CO)OR1 (CO)OR, O(CO)R1 (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;

m é 0-2;

R5 é T-C(R1)3, T-C(R1)2C(Rm)3, R, OR, um grupo hidroxila ade-quadamente protegido, SR1 um grupo tiol adequadamente protegido, SO2R,OSO2R, N(R)2l um grupo amino adequadamente protegido, NR(CO)R1NR(CO)(CO)R1 NR(CO)N(R)2l NR(CO)OR, (CO)OR1 O(CO)R, (CO)N(R2) ouO(CO)N(R)2l ou;

quando R5 for T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(R11)3l então R6 e um grupoR1 em R5 são opcionalmente tomados juntos para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

cada T é independentemente uma ligação de valência ou umacadeia C1-6 alquilideno, saturada ou insaturada, opcionalmente substituídareta ou ramificada, onde até duas unidades metileno de T são opcionalmentee independentemente substituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-;

cada R1 e R" é independentemente selecionado de R1 OR1 SR,SO2R1 OSO2R1 N(R)2l NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR,(CO)OR1 O(CO)R1 (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;

R6 é halogênio, R, OR, SR1 SO2R1 OSO2R1 N(R)2l NR(CO)R1NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2l NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R)2 ouO(CO)N(R)2;

R9 e R9 são cada um independentemente selecionados de halo-gênio, R, OR, SR ou N(R)2 ou R1 e R2 são tomados juntos para formaremum anel de 3-7 membros, saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo0-2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênioou enxofre;

Q é uma ligação de valência ou uma cadeia Ci-6 alquilideno, sa-turada ou insaturada, opcionalmente substituída reta ou ramificada onde atéduas unidades metileno de Q são opcional e independentemente substituí-das por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-; e

R10 é R, um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupotiol adequadamente protegido, um grupo amino adequadamente protegido,um anel opcionalmente substituído de 3-8 membros saturado, parcialmenteinsaturado ou arila monocíclico tendo 0-4 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel opcionalmentesubstituído de 8-10 membros saturado, parcialmente insaturado ou arila bicí-clico tendo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogê-nio, oxigênio ou enxofre, uma porção detectável, um resíduo de polímero,um peptídeo ou uma porção contendo açúcar ou tipo açúcar.

De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção pro-ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde:

G é S, CH2, NR ou O;

R1 e R2 são cada um independentemente halogênio, R1 OR, umgrupo hidroxila adequadamente protegido, SR, um grupo tiol adequadamen-te protegido, N(R)2 ou um grupo amino adequadamente protegido, ou R1 e

R2 são tomados juntos para formarem um anel de 3-7 membros saturado,parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

cada R é independentemente hidrogênio, um grupo Ci-C6 alifáti-co opcionalmente substituído ou um anel de 3-8 membros saturado opcio-nalmente substituído, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-4 heteroáto-mos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre,onde:

dois R no mesmo átomo de nitrogênio são opcionalmente toma-dos juntos com o dito átomo de nitrogênio para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 1 -4 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

η é 0-2;

R3, R4, R7 e R8 são cada um independentemente selecionadosde halogênio, R, OR, um grupo hidroxila adequadamente protegido, SR, umgrupo tiol adequadamente protegido, SO2R1 OSO2R, N(R)2, um grupo aminoadequadamente protegido, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2,NR(CO)OR, (CO)OR1 O(CO)R, (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;

m é 0-2;

R5 é T-C(R1)3, T-C(R1)2C(Rn)3l R, OR, um grupo hidroxila ade-quadamente protegido, SR1 um grupo tiol adequadamente protegido, SO2R,OSO2R, N(R)2, um grupo amino adequadamente protegido, NR(CO)R,NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R2) ouO(CO)N(R)2, ou;

quando R5 for T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(R11)3, então R6 e um grupoR1 em R5 são opcionalmente tomados juntos para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;

cada T é independentemente uma ligação de valência ou umacadeia Ci-6 alquilideno, saturada ou insaturada, opcionalmente substituídareta ou ramificada, onde até duas unidades metileno de T são opcionalmentee independentemente substituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-;

cada R1 e R" é independentemente selecionado de R, OR, SR,SO2R, OSO2R1 N(R)2, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR,(CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;R6 é halogênio, R, OR, SR, SO2R, OSO2R, N(R)2, NR(CO)R,NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R)2 ouO(CO)N(R)2;

R9 e R9 são cada um independentemente selecionados de halo-gênio, R, OR1 SR ou N(R)2 ou R1 e R2 são tomados juntos para formaremum anel de 3-7 membros, saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo0-2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênioou enxofre;

R10 é R, um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupotiol adequadamente protegido, um grupo amino adequadamente protegido,um anel opcionalmente substituído de 3-8 membros saturado, parcialmenteinsaturado ou arila monocíclico tendo 0-4 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel opcionalmentesubstituído de 8-10 membros saturado, parcialmente insaturado ou arila bicí-clico tendo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogê-nio, oxigênio ou enxofre, uma porção detectável, um resíduo de polímero,um peptídeo ou uma porção contendo açúcar ou tipo açúcar,contanto que o dito composto seja outro que não:<formula>formula see original document page 11</formula>

2. Definições

Os compostos da presente invenção incluem aqueles descritosgeralmente acima e são ilustrados mais pelas modalidades, submodalidadese espécies descritas aqui. Conforme aqui usado, as definições que seguemdevem se aplicar a menos que de outro modo indicado. Para os propósitosda presente invenção, os elementos químicos são identificados de acordocom a Tabela Periódica de Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistryand Physics, 75a Ed. Adicionalmente, princípios gerais de química orgânicasão descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University ScienceBooks, Sausalito: 1999 e "March1S Advanced Organic Chemistry", 5a Ed.,Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001, cujosconteúdos são aqui incorporados a título de referência.

Conforme definido geralmente acima, cada um de Anel A, AnelB, Anel C, Anel D e Anel E é independentemente saturado, parcialmenteinsaturado ou aromático. Será compreendido que compostos da presenteinvenção são compreendidos como compostos quimicamente viáveis. Destemodo, será compreendido por um versado comum na técnica que quandoqualquer um de Anel A, Anel B, Anel C, Anel D e Anel E é insaturado, entãocertos substituintes neste anel estarão ausentes a fim de satisfazer regrasde valência gerais. Por exemplo, se o Anel D for insaturado na ligação entreo Anel Deo Anel E, então R6 estará ausente. Alternativamente, se o Anel Dfor insaturado na ligação entre Anel D e Anel C, então R8 e R3 estarão au-sentes. Todas as combinações de saturação e insaturação de qualquer umde Anel A, Anel B, Anel C, Anel D e Anel E são compreendidas pela presen-te invenção. Deste modo, a fim de satisfazer regras gerais de valência, edependendo do grupo de saturação ou insaturação de qualquer um de AnelA, Anel B1 Anel C, Anel D e Anel E, a presença ou ausência requisitada decada um de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R9' e QR10 é compreendidaconsequentemente.

Conforme aqui descrito, os compostos da invenção podem op-cionalmente ser substituídos com um ou mais substituintes, tal como sãoilustrados geralmente acima, ou conforme exemplificado por classes, sub-classes e espécies particulares da invenção. Será compreendido que a ex-pressão "opcionalmente substituído" é usada intercomutavelmente com aexpressão "substituído ou não-substituído". Em geral, o termo "substituído",seja precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, refere-se à substituiçãodos radicais hidrogênio em uma dada estrutura com o radical de um substitu-inte especificado. A menos que de outro modo indicado, um grupo opcional-mente substituído pode ter um substituinte em cada posição substituível dogrupo, e quando mais de uma posição em qualquer dada estrutura puder sersubstituída com mais de um substituinte selecionado de um grupo especifi-cado, o substituinte pode ser ou o mesmo ou diferente em cada posição.

Combinações de substituintes pretendidas pela presente invenção são depreferência aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ouquimicamente possíveis.

O termo "estável", conforme aqui usado, refere-se a compostosque não são substancialmente alterados quando submetidos a condiçõespara permitir sua produção, detecção, e, de preferência, sua recuperação,purificação e uso para um ou mais dos propósitos descritos aqui. Em algu-mas modalidades, um composto estável ou quimicamente possível é um quenão substancialmente se alterou quando mantido em uma temperatura de40° C ou menos, na ausência de umidade ou outras condições quimicamen-te reativas, por pelo menos uma semana.

O termo "alifático" ou "grupo alifático", conforme aqui usado, sig-nifica uma cadeia hidrocarbono substituída ou não-substituída, de cadeiareta (isto é, não-ramifiçada) ou ramificada, que é completamente saturada ouque contém uma ou mais unidades de insaturação, ou um hidrocarbono mo-nocíclico ou hidrocarbono bicíclico que é completamente saturado ou quecontém uma ou mais unidades de insaturação, mas que é não-aromático(também referido aqui como "carbociclo" "cicloalifático" ou "cicloalquila"), quetem um ponto único de ligação com o resto da molécula. A menos que deoutro modo especificado, grupos alifáticos contêm 1 -20 átomos de carbonoalifáticos. Em algumas modalidades, grupos alifáticos contêm 1-6 átomos decarbono alifáticos. Em ainda outras modalidades, grupos alifáticos contêm 1 -4 átomos de carbono alifáticos. Em algumas modalidades, "cicloalifático" (ou"carbociclo" ou "cicloalquila") refere-se a um hidrocarbono C3-C8 monocíclicoou hidrocarbono C8-Ci2 bicíclico que é completamente saturado ou que con-tém uma ou mais unidades de insaturação, mas que é não-aromático, quetem um ponto de ligação único com o resto da molécula onde qualquer anelindividual no dito sistema de anel bicíclico tem 3-7 membros. Grupos alifáti-cos adequados incluem, mas não estão limitados a, grupos alquila, alqueni-la, alquinila substituídos ou não-substituídos, lineares ou ramificados, e seushíbridos tal como (cicloalquil)alquila, (cicloalquenil)alquila ou cicloal-quil(alquenila). Em outras modalidades, um grupo alifático pode ter dois á-tomos de hidrogênio geminais substituídos com oxo (um átomo de oxigêniocarbonila bivalente = O), ou um substituinte de formação de anel, tal como -0-(alquileno ou alquilideno reto ou ramificado)-0- para formar um acetal oucetal.

Em certas modalidades, grupos alifáticos exemplares incluem,mas não estão limitados a, etinila, 2-propinila, 1-propenila, 2-butenila, 1,3-butadienila, 2-pentenila, vinil (etenila), alila, isopropenila, metila, etila, propila,isopropila, butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, pentila, isopentila, sec-pentila, neo-pentila, terc-pentila, ciclopentila, hexila, isoexila, sec-hexila, ci-cloexila, 2-metilpentila, terc-hexila, 2,3-dimetilbutila, 3,3-dimetilbutila, 1,3-dimetilbutila e 2,3-dimetilbut-2-ila.

Os termos "haloalquila", "haloalquenila" e "haloalcóxi" significamalquila, alquenila ou alcóxi, conforme for o caso, substituídos com um oumais átomos de halogênio. O termo "halogênio" significa F, Cl, Br ou I. Taisgrupos "haloalquila", "haloalquenila" ou "haloalcóxi" podem ter dois ou maissubstituintes que podem ou não ser o mesmo halogênio e podem ou nãoestar no mesmo átomo de carbono. Exemplos incluem clorometila, periodo-metila, 3,3-dicloropropila, 1,3-difluorbutila, trifluormetila e 1-bromo-2-cloropropila.

O termo "heterociclo", "heterociclila", "heterocicloalifático" ou"heterocíclico" conforme aqui usado significa sistemas de anel não-aromáticos, monocíclicos, bicíclicos ou tricíclicos onde um ou mais membrosno anel são um heteroátomo independentemente selecionado. Em algumasmodalidades, o grupo "heterociclo", "heterociclila", "heterocicloalifático" ou"heterocíclico" tem três a quatorze membros no anel onde um ou mais mem-bros no anel são um heteroátomo independentemente selecionado de oxi-gênio, enxofre, nitrogênio ou fósforos, e cada anel no sistema contém 3 a 7membros no anel.

O termo "heteroátomo" significa um ou mais de oxigênio, enxo-fre, nitrogênio, fósforo ou silício (incluindo qualquer forma oxidada de nitro-gênio, enxofre, fósforo ou silício; a forma quaternizada de qualquer nitrogê-nio básico ou; um hidrogênio substituível de um anel heterocíclico, por e-xemplo, N (como em 3,4-diidro-2H-pirrolil), NH (como em pirrolidinila) ou NR+(como em pirrolidinila N-substituída).

O termo "insaturado", conforme aqui usado, significa que umaporção tem uma ou mais unidades de insaturação.

O termo "alcóxi" ou "tioalquila", conforme aqui usado, refere-se aum grupo alquila, conforme anteriormente definido, ligado à cadeia carbonoprincipal através de um átomo de oxigênio ("alcóxi") ou enxofre ("tioalquila").

O termo "arila" usado sozinho ou como parte de uma porçãomaior como em "aralquila, "aralcóxi" ou "ariloxialquila" refere-se a sistemasde anel monocíclico, bicíclico e tricíclico tendo um total de cinco a quatorzemembros no anel, onde pelo menos um anel no sistema é aromático e ondecada anel no sistema contém 3 a 7 membros no anel. O termo "arila" podeser intercomutável com o termo "anel arila". O termo "arila" também refere-se a sistemas de anel heteroarila conforme definido abaixo.

O termo "heteroarila", usado sozinho ou como parte de uma por-ção maior como em "heteroaralquila" ou "heteroarilalcóxi" refere-se a siste-mas de anel monocíclico, bicíclico e tricíclico tendo um total de cinco a qua-torze membros no anel, onde pelo menos um anel no sistema é aromático,pelo menos um anel no sistema contém um ou mais heteroátomos, e ondecada anel no sistema contém 3 a 7 membros no anel. O termo "heteroarila"pode ser usado intercomutavelmente com o termo "anel heteroarila" ou otermo "heteroaromático".

Um grupo arila (incluindo aralquila, aralcóxi, ariloxialquila e simi-lar) ou heteroarila (incluindo heteroaralquila e heteroarilalcóxi e similar) podeconter um ou mais substituintes. Substituintes adequados no átomo de car-bono insaturado de um grupo arila ou heteroarila são selecionados de halo-gênio; N3, CN1 R0; 0R°; SR°; 1,2-metileno-dióxi; 1,2- etilenodióxi; fenila (Ph)opcionalmente substituída com R0; -O(Ph) opcionalmente substituída comR0; (CH2)U(Ph)1 opcionalmente substituída com R0; CH=CH(Ph)1 opcional-mente substituída com R0; NO2; CN; N(R0)2; NR0C(O)R0; NR0C(O)N(R0)2NR0CO2R0; -NR0NR0C(O)R0; NR0NR0C(O)N(R0)2; NR0NR0CO2R0C(O)C(O)R0; C(O)CH2C(O)R0; CO2R0; C(O)R0; C(O)N(R0)2; OC(O)N(R0)2S(O)2R0; SO2N(R0)2; S(O)R0; NR0SO2N(R0)2; NR0SO2R0; C(=S)N(R°)2C(=NH)-N(R°)2; ou (CH2)o-2NHC(0)R° onde cada ocorrência independentede R0 é selecionada de hidrogênio, C1-C6 alifático opcionalmente substituído,um anel heteroarila ou heterocíclico de 5-6 membros não-substituído, fenila,O(Ph) ou CH2(Ph) ou, não obstante a definição acima, duas ocorrências in-dependentes de R01 no mesmo substituinte ou substituinte diferentes, toma-dos junto com o(s) átomos aos quais cada grupo R0 está ligado, formam umanel cicloalquila, heterociclila, arila ou heteroarila de 3-8 membros tendo 0-4heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ouenxofre. Substituintes opcionais no grupo alifático de RO são selecionadosde N3l CN1 NH2i NH(Ci-4 alifático), N(Ci-4 alifático)2, halogênio, C1-4 alifático,OH1 0(Ci-4 alifático), NO2l CN1 CO2H1 C02(Ci-4 alifático), OíhaloC^ alifático)ou haloCi-4 alifático, onde cada um dos grupos C1-4 alifático acima de R0 énão-substituído.

Um grupo alifático ou heteroalifático ou um anel heterocícliconão-aromático pode conter um ou mais substituintes. Substituintes adequa-dos no carbono saturado de um grupo alifático ou heteroalifático, ou de umanel heterocíclico não-aromático, são selecionados daqueles listados acimapara o carbono insaturado de um grupo arila ou heteroarila e incluem adicio-nalmente o que segue: O, =S1 =NNHR*, =NN(R)2, =NNHC(O)R*,=NNHC02(alquila), =NNHS02(alquila) ou =NR*, onde cada R* é independen-temente selecionado de hidrogênio ou um C1-6 alifático opcionalmente subs-tituído. Substituintes opcionais no grupo alifático de R* são selecionados deNH2, NH(Ci-4 alifático), N(Ci-4 alifático)2, halogênio, C-m alifático, OH, 0(Ci-4alifático), NO2, CN, CO2H, C02(Ci-4 alifático), 0(halo C1-4 alifático) ou ha-lo(Ci-4 alifático), onde cada um dos grupos Ci-4 alifáticos acima de R* é não-substituído.

Substituintes opcionais no nitrogênio de um anel heterocícliconão-aromático são selecionados de R+, N(R+)2, C(O)R+, CO2R+, C(O)C(O)R+,C(O)CH2C(O)R+, SO2R+, S02N(R+)2, C(=S)N(R+)2, C(=NH)-N(R+)2 ouNR+SO2R+; onde R+ é hidrogênio, um C1-6 alifático opcionalmente substituí-do, fenila opcionalmente substituída, O(Ph) opcionalmente substituída,CH2(Ph) opcionalmente substituída, (CH2)1^(Ph) opcionalmente substituída;CH=CH(Ph) opcionalmente substituída; ou um anel heteroarila ou heterocí-clico de 5-6 membros não-substituído tendo um a quatro heteroátomos inde-pendentemente selecionados de oxigênio, nitrogênio ou enxofre, ou, nãoobstante a definição acima, duas ocorrências independentes de R+, nomesmo substituinte ou em substituintes diferentes, tomadas junto com o(s)átomo(s) ao(s) qual(ais) cada grupo R+ está ligado, formam um anel cicloal-quila, heterociclila, arila ou heteroarila de 3-8 membros tendo 0-4 heteroáto-mos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.Substituintes opcionais no grupo alifático ou no anel fenila de R+ são sele-cionados de NH2, NH(Ci-4 alifático), N(Ci-4 alifático)2, halogênio, Ci-4 alifáti-co, OH, 0(Ci-4 alifático), NO2, CN, CO2H, C02(C1.4 alifático), 0(halo Ci-4 alifá-tico) ou halo(Ci-4 alifático), onde cada um dos grupos Ci-4 alifáticos acima deR+ é não-substituído.

Conforme acima detalhado, em algumas modalidades, duas o-corrências independentes de R0 (ou R+, ou qualquer outra variável similar-mente aqui definida), são tomadas junto com o(s) átomo(s) ao(s) qual(ais)cada variável é ligada para formarem um anel cicloalquila, heterociclila, arilaou heteroarila de 3-8 membros tendo 0-4 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Anéis exemplares que sãoformados quando duas ocorrências independentes de R0 (ou R+, ou qualqueroutra variável similarmente definida aqui) são tomadas junto com o(s) áto-mo(s) ao(s) qual(ais) cada variável é ligada incluem, mas não são limitadosao que segue: a) duas ocorrências independentes de R0 (ou R+, ou qualqueroutra variável similarmente definida aqui) que são ligadas ao mesmo átomoe são tomadas junto com esse átomo para formarem um anel, por exemplo,N(R0)2, onde ambas ocorrências de R0 são tomadas junto com o átomo denitrogênio para formarem um grupo piperidin-1-ila, piperazin-1-ila ou morfo-lin-4-ila; e b) duas ocorrências independentes de R0 (ou R+' ou qualquer ou-tra variável similarmente aqui definida) que são ligadas a átomos diferentese são tomadas junto com ambos esses átomos para formarem um anel, porexemplo, onde um

grupo fenila é substituído com duas ocorrências de

<formula>formula see original document page 17</formula>

essas duas ocorrências de R são tomadas junto com osátomos de oxigênio aos quais estão ligadas para formarem um anel conten-do oxigênio de 6 membros fundido:

<formula>formula see original document page 17</formula>

Será compreendido queuma variedade de outros anéis pode ser formada quando duas ocorrênciasindependentes de R0 (ou R+, ou qualquer outra variável similarmente defini-da aqui) são tomadas junto com o(s) átomo(s) ao(s) qual(ais) cada variávelestá ligada e que os exemplos detalhados acima não pretendem ser Iimitantes.

Conforme aqui usado, o termo "porção detectável" é usado in-tercomutavelmente como termo "marcador" e refere-se a qualquer porçãocapaz de ser detectada, por exemplo, marcadores primários e marcadoressecundários. Marcadores primários, tal como radioisótopos (por exemplo,32p 33p( 35g ou Uq^ mass.fags e marcadores fluorescentes são grupos re-pórter de geração de sinal que podem ser detectados sem modificações adi-cionais.O termo "marcador secundário" conforme aqui usado refere-se aporções tal como biotina e vários antígenos de proteína que requerem a pre-sença de um segundo intermediário para produção de um sinal detectável.Para biotina, o intermediário secundário pode incluir conjugados de estrepta-vidina-enzima. Para marcadores de antígeno, intermediários secundáriospodem incluir conjugados de anticorpo-enzima. Alguns grupos fluorescentesagem como marcadores secundários porque eles transferem energia paraum outro grupo no processo de transferência de energia de ressonância fluo-rescente não-radioativa (FRET), e o segundo grupo produz o sinal detectado.

Os termos "marcador fluorescente", "corante fluorescente" e "flu-óforo" conforme aqui usado referem-se a porções que absorvem energia deluz em um comprimento de onda de excitação definido e emitem energia deluz em comprimentos de onda diferentes. Exemplos de marcadores fluores-centes incluem, mas não estão limitados a: corantes Alexa Fluor (Alexa Fluor350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, A-Iexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660 e Alexa Fluor 680), AMCA,AMCA-S, corantes BODIPY (BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR,BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BO-DIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), Car-boxirodamina 6G, carboxi-X-rodamina (ROX), Cascade Blue, Cascade Yel-low, Coumarina 343, Corantes cianina (Cy3, Cy5, Cy3.5, Cy5.5), Dansila,Dapoxila, Dialquilaminocoumarina, 4',5'-Dicloro-2,,7'-dimetoxi-fluoresceína,DM-NERF, Eosina, Eritrosina, Fluoresceína, FAM, Hidroxicoumarina, Coran-tes IR (IRD40, IRD700, IRD800), JOE, Lissamine rodamina B, Marina Blue,Metoxicoumarina, Naftofluoresceína, Oregon Green 488, Oregon Green 500,Oregon Green 514, Pacific Blue, PyMPO, Pirene, Rodamina B, Rodamina6G, Rodamina Green, Rodamina Red, Rhodol Green, 2,,4,,5',7'-Tetra-bromossulfona-fIuoresceína, Tetrametil-rodamina (TMR), Carboxitetrametil-rodamina (TAMRA), Texas Red, Texas Red-X.

O termo "mass-taçf' conforme aqui usado refere-se a qualquerporção que seja capaz de ser unicamente detectada em virtude de sua mas-sa usando técnicas de detecção de espectrometria de massa (MS). Exem-plos de mass-tags incluem tags de liberação de eletroforo tal como ácido N-[3-[4'-[(p- metoxitetrafluorbenzil)oxi]fenil]-3-metilgliceronil]isonipecótico, 4'-[2,3,5,6- tetrafluor-4-(pentafluorenoxil)]metil acetofenona e seus derivados. Asíntese e utilidade dessas mass-tags são descritas nas Patentes U.S.4.650.750, 4.709.016, 5.360.8191, 5.516.931, 5.602.273, 5.604.104,5.610.020 e 5.650.270. Outros exemplos de mass-tags incluem, mas nãoestão limitados a, nucleotídeos, didesoxinucleotídeos, oligonucleotídeos decomprimento e composição de base variável, oligopeptídeos, oligossacarí-deos e outros polímeros sintéticos de comprimento e composição de monô-mero variáveis. Uma grande variedade de moléculas orgânicas, ambos natu-rais e carregadas (biomoléculas ou compostos sintéticos), de uma faixa demassa apropriada (100-2000 Daltons) pode ser também usada como mass-tags.

O termo "substrato", conforme aqui usado, refere-se a qualquermaterial ou complexo macromolecular ao qual um grupo de extremidadefuncionalizado de um composto da presente invenção pode ser ligado. E-xemplos de substratos geralmente usados incluem, mas não estão limitadosa, superfícies de vidro, superfícies de sílica, superfícies de plástico, superfí-cies de metal, superfícies contendo um revestimento metálico ou químico,membranas (por exemplo, náilon, polissulfona, sílica), microcontas (por e-xemplo, látex, poliestireno ou outro polímero), matrizes de polímero porosas(por exemplo, gel de poliacrilamida, polissacarídeo, polimetacrilato), comple-xos macromoleculares (por exemplo, proteínas, polissacarídeo).

A menos que de outro modo declarado, as estruturas mostradasaqui também pretendem incluir todas as formas isoméricas (por exemplo,enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) daestrutura; por exemplo, as configurações ReS para cada centro assimétri-co, isômeros de ligação dupla (Z) e (E) e isômeros conformacionais (Z) e (E).deste modo, isômeros estereoquímicos simples bem como misturas enanti-oméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) dos presen-tes compostos estão dentro do escopo da invenção.A menos que de outro modo declarado, todas as formas tauto-méricas dos compostos da invenção estão dentro do escopo da invenção.

Adicionalmente, a menos que de outro modo declarado, estrutu-ras descritas aqui pretendem também incluir compostos que diferem apenasna presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exem-plo, compostos tendo as presentes estruturas exceto pela substituição dehidrogênio por deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por umcarbono enriquecido por 13C ou 14C estão dentro do escopo da presente in-venção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas ou son-das analíticas em ensaios biológicos.

3. Descrição de Compostos Exemplares:

Conforme geralmente descrito acima, a porção G da fórmula I éS, CH2, NR ou O. Em certas modalidades, a porção G da fórmula I é O.

Conforme geralmente acima definido, R1 e R2 da fórmula I sãocada um independentemente halogênio, R, OR, um grupo hidroxila adequa-damente protegido, SR, um grupo tiol adequadamente protegido, N(R2) ouum grupo amino adequadamente protegido, ou R1 e R2 são tomados juntospara formarem um anel arila parcialmente insaturado, saturado de 3-7 mem-bros tendo 0-2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogê-nio, oxigênio ou enxofre. Em certas modalidades, R1 e R2 da fórmula I sãocada um independentemente R ou OR. Em outras modalidades, R1 e R2 dafórmula I são cada um independentemente R, onde R é hidrogênio ou umgrupo C1-6 alifático opcionalmente substituído. De acordo com um outro as-pecto da presente invenção, R1 e R2 da fórmula I são tomados juntos paraformarem um anel arila, parcialmente saturado, saturado de 3-6 membros,ou anel arila tendo 0-2 heteroátomos independentemente selecionados denitrogênio, oxigênio ou enxofre. Ainda um outro aspecto da presente inven-ção provê um composto da fórmula I onde R1 e R2 são tomados juntos paraformarem um anel carbocíclico de 3-6 membros saturado. Em outras moda-lidades, R1 e R2 da fórmula I são tomados juntos para formarem um anel ci-clopropila.

Em certas modalidades, a porção η da fórmula I é 0-1. Em ou-tras modalidades, a porção η da fórmula I é 1.

Conforme geralmente acima definido, o grupo R5 da fórmula I éR5 é T-C(R1)3, T-C(R1)2C(Rh)3, R, OR, a um grupo hidroxila adequadamenteprotegido, SR, um grupo tiol adequadamente protegido, SO2R, OSO2R,N(R)2, um grupo amino adequadamente protegido, NR(CO)R,NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R)2 ouO(CO)N(R)2, onde cada T é independentemente uma ligação de valência ouuma cadeia Ci-6 alquilideno saturada ou insaturada, reta ou ramificada op-cionalmente substituída, cadeia Ci-6 alquilideno onde até duas unidades me-tileno de T são opcionalmente e independentemente substituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-. Em certas modalidades, cada T é inde-pendentemente uma ligação de valência ou uma cadeia C1-4 alquilideno retaou ramificada onde uma unidade metileno de T é opcionalmente substituídapor -O-, -N(R)- ou - S-. Em outras modalidades, cada T é independentemen-te uma ligação de valência ou uma cadeia C1-4 alquilideno reta ou ramificada.

Em ainda outras modalidades, cada T é uma ligação de valência.

Quando um grupo R5 da fórmula I é T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(Rn)3,cada R1 e R" é independentemente selecionado de R, OR, SR, SO2R, O-SO2R, N(R)2, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR,(CO)OR, O(CO)R, (CO)N(R)2 ou O(CO)N(R)2. Em certas modalidades, cadaR1 e R" é independentemente R, OR, OC(O)R, SR ou N(R2). Em outras mo-dalidades, cada R1 e R" é independentemente R, OR ou OC(O)R. Grupos R1e R" exemplares incluem hidrogênio, CH3, OH e OC(O)CH3.

Conforme acima geralmente definido, quando R5 for T-C(R1)3 ouT-CH(R1)C(R11)3, então R6 e um grupo R1 em R5 são opcionalmente tomadosjuntos para formarem um anel parcialmente insaturado, saturado de 3-8membros ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentemente selecionadosde nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em certas modalidades, R5 é T-C(R1)3 ouT-C(R1)2C(R11)3 e R6 e um grupo R1 em R5 são tomados juntos para formaremum anel saturado de 5-7 membros tendo 1-2 heteroátomos independente-mente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em outras modalida-des, , R5 é T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(Rn)3 e R6 e um grupo R1 de R5 são tomadosjuntos para formarem um anel saturado de 6 membros tendo 1 átomo deoxigênio. Tais compostos, quando T é uma ligação de valência, são da fór-mula lia, quando R5 for T-C(R')3 e Ilb quando R5 for T-C(R1)2C(Rn)3:

<formula>formula see original document page 22</formula>

onde cada um de R', R", R1, R21 R31 R4, R7, R8, R91 R9', Q e R10 são conformeacima geralmente definido e em classes e subclasses definidas acima e aqui.

Conforme acima geralmente definido, o grupo R5 da fórmula I é,inter alia, um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupo tiol ade-quadamente protegido ou um grupo amino adequadamente protegido. Gru-pos de proteção hidroxila são bem-conhecidos na técnica e incluem aquelesdescritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W.Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição, John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidadeé aqui incorporada a título de referência. Exemplos de grupos hidroxila ade-quadamente protegidos do grupo R5 da fórmula I incluem, mas não estãolimitados a, ésteres, éteres de alila, éteres, éteres de silila, alquil éteres, ari-Ialquil éteres e alcoxialquil éteres. Exemplos de tais ésteres incluem forma-tos, acetatos, carbonatos e sulfonatos. Exemplos específicos incluem formia-to, formiato de benzoíla, cloroacetato, trifluoracetato, metoxiacetato, trifenil-metoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato, 4,4-(etilenoditio)pentanoato, pivaloato(trimetilacetila), crotonato, 4-metoxi-crotonato, benzoato, p-fenilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato, carbonatos talcomo metila, 9-fluorenilmetila, etila, 2,2,2-tricloroetila, 2-(trimetilsilil)etila, 2-(fenilsulfonil)etila, vinila, alila e p-nitrobenzila. Exemplos de éteres de sililaincluem trimetilsilila, trietilsilila, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila, triisopropil-silila e outros éteres de trialquilsilila. Éteres de alquila incluem metila, benzi-la, p-metoxibenzila, 3,4-dimetoxibenzila, tritila, t-butila, alila e éteres de alilo-xicarbonila ou derivados. Éteres de alcoxialquila incluem acetais tal comometoximetila, metiltiometila, (2-metoxietoxi)metila, benziloximetila, be-ta(trimetilsilil)etoximetila e éteres de tetraidropiranila. Exemplos de éteres dearilalquila incluem benzila, p-metoxibenzila (MPM), 3,4-dimetoxibenzila, O-nitrobenzila, p-nitrobenzila, p-halobenzila, 2,6-diclorobenzila, p-cianobenzila,2- e 4-picolila.

Grupos de proteção tiol são bem-conhecidos na técnica e inclu-em aqueles descritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthe-sis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição, John Wiley & Sons, 1999, cujatotalidade é aqui incorporada a título de referência. Grupos tiol adequada-mente protegidos da porção R5 da fórmula I incluem, mas não estão limita-dos a, dissulfetos, tioéteres, tioéteres de silila, tioésteres, tiocarbonatos, tio-carbamatos e similar. Exemplos de tais grupos incluem, mas não estão limi-tados a, tioéteres de alquila, tioéteres de benzila e benzila substituída, tioéte-res de trifenilmetila, tricloroetoxicarbonila, para mencionar alguns.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a por-ção R5 da fórmula I é um grupo de proteção tiol que é removível sob condi-ções neutras, por exemplo, com AgNO3, HgCI2 e similar. Outras condiçõesneutras incluem redução usando um agente de redução adequado. Agentesde redução adequados incluem ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, ditionita,glutationa reduzida, glutarredoxina reduzida, tiorredoxina reduzida, fosfinassubstituídas tal como tris carboxietil fosfina (TCEP) e qualquer outro peptí-deo ou agentes de redução de base orgânica ou outros reagentes conheci-dos daqueles versados na técnica. De acordo com ainda um outro aspectoda presente invenção, a porção R5 da fórmula I é um grupo de proteção tiolque é "fotoclivável". Tais grupos de proteção tiol são conhecidos na técnica eincluem, mas não estão limitados a, um grupo nitrobenzila, um grupo tetrai-dropiranila (THP), um grupo tritila, -CH2SCH3 (MTM), dimetilmetoxibenzila ou-CH2-S-S-piridin-2-ila. Um versado na técnica reconheceria que muitos dosgrupos de proteção hidroxila adequados, conforme descrito aqui, são tam-bém adequados como grupos de proteção tiol.

Em certas modalidades, o grupo R5 da fórmula I é um grupo a-mino adequadamente protegido. Grupos de proteção amino são bem-conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em Protec-ting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição,John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidade é aqui incorporada a título de refe-rência. Grupos amino adequadamente protegidos da dita porção R5 incluemainda, mas não estão limitados a, aralquilaminas, carbamatos, imidas cícli-cas, alil aminas, amidas e similar. Exemplos de tais grupos incluem t-butiloxicarbonila (BOC), etiloxicarbonila, metiloxicarbonila, tricloroetiloxicar-bonila, aliloxicarbonila (Alloc), benziloxocarbonila (CBZ), alila, ftalimida, ben-zila (Bn), fluorenilmetilcarbonila (Fmoc), formila, acetila, cloroacetila, dicloro-acetila, tricloroacetila, fenilacetila, trifluoracetila, benzoíla e similar. Em certasmodalidades, o grupo de proteção amino da porção R5 é ftalimido. Em aindaoutras modalidades, o grupo de proteção amino da porção R5 é um grupoterc-butiloxicarbonila (BOC).

Conforme geralmente acima definido, o grupo Q da fórmula I éuma ligação de valência ou uma cadeia C1-5 alquilideno saturada ou insatu-rada, reta ou ramificada, opcionalmente substituída onde até duas unidadesmetileno de Q são opcional e independentemente substituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-. Em certas modalidades, Q é uma ca-deia C-i-2 alquilideno, saturada ou insaturada, reta ou ramificada, opcional-mente substituída onde até uma unidade metileno de Q é opcionalmentesubstituída por -O-, -N(R)- ou -S-. Em outras modalidades, Q é -O-.

Conforme definido geralmente acima, o grupo R10 da fórmula I éR, um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupo tiol adequada-mente protegido, um grupo amino adequadamente protegido, um anel parci-almente insaturado, saturado de 3-8 membros opcionalmente substituído ouarila monocíclico tendo 0-4 heteroátomos independentemente selecionadosde nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel parcialmente insaturado, satura-do de 8-10 membros opcionalmente substituído ou arila bicíclico tendo 0-4heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ouenxofre, uma porção detectável, um resíduo de polímero, um peptídeo ouum grupo contendo açúcar ou um grupo do tipo açúcar.Em certas modalidades, o grupo R10 da fórmula I é um grupocontendo açúcar. Tais grupos contendo açúcar são bem-conhecidos de umversado na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em "Essentialsof Glycobiology" Editado por Varki, A. e outros, Cold Spring Harbor Labora-tory Press. Cold Spring Harbor, Ν. Y. 2002. Em certas modalidades, o grupoR10 da fórmula I é um glicosídeo. Grupos R10 exemplares incluem arabinopi-ranosídeos e xilopiranosídeos. Em certas modalidades, o grupo R10 da fór-mula I é um xilopiranosídeo. Em certas modalidades, o grupo R10 da fórmulaI é um arabinopiranosídeo.

Em ainda outras modalidades, o grupo R10 da fórmula I é

<formula>formula see original document page 25</formula>

De acordo com uma outra modalidade, o grupo R10 da fórmula I é

<formula>formula see original document page 25</formula>

Ainda uma outra modalidade provê um composto da fórmula I onde R10 e

<formula>formula see original document page 25</formula> .

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, o grupoR10 da fórmula I é um mimético de açúcar. Tais miméticos de açúcar sãoconhecidos de um versado na técnica e incluem aqueles descritos em deta-lhes em "Essentials of Glycobiology". Por exemplo, grupos miméticos de a-çúcar compreendidos pela presente invenção incluem ciclitóis e similar. Emcertas modalidades, R10 é uma porção ciclitol, onde o dito ciclitol é um ciclo-alcano contendo um grupo hidroxila em cada um dos três ou mais átomos noanel, conforme definido pela convenção da IUPAC. Em outras modalidades,tais porções ciclitol incluem inositóis tal como scilo-inositol.

Em adição, porções do tipo açúcar adequadas do grupo R10 dafórmula I incluem grupos de açúcar acíclicos. Tais grupos incluem alquitóis eeritritóis lineares, para mencionar alguns. Será compreendido que grupos deaçúcar podem existir em forma ou cíclica ou acíclica. Deste modo, formasacíclicas de um grupo de açúcar são compreendidas pela presente invençãocomo uma porção do tipo açúcar adequada do grupo R10 da fórmula I.

Em certas modalidades, o grupo R10 da fórmula I é uma porçãodetectável. Em outras modalidades, o grupo R10 da fórmula I é um marcadorfluorescente, corante fluorescente ou fluóforo conforme aqui definido, supra.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, o grupoR10 da fórmula I é um resíduo de polímero. Resíduos de polímero são bem-conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em "Che-mistry of Protein Conjugation and Cross-Linking" Shan S. Wong, CRC Press.Boca Raton, Flórida. 1991. Resíduos de polímero adequados do grupo R10da fórmula I incluem óxidos de poli(alquileno), tal como PEG1 poli(amino áci-dos) e outros resíduos de polímero capazes de conjugação a um compostoda presente invenção.

Conforme geralmente acima definido, o grupo R10 da fórmula I é,inter alia, um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupo tiol ade-quadamente protegido ou um grupo amino adequadamente protegido. Gru-pos de proteção hidroxila são bem-conhecidos na técnica e incluem aquelesdescritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthesis, T. W.Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição, John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidadeé aqui incorporada a título de referência. Exemplos de grupos de proteçãohidroxila adequados do grupo R10 da fórmula I incluem ainda, mas não estãolimitados a, ésteres, éteres de alila, éteres, éteres de silila, éteres de alquila,éteres de arilalquila e éteres de alcoxialquila. Exemplos de tais ésteres in-cluem formiatos, acetatos, carbonatos e sulfonatos. Exemplos específicosincluem formiato, formiato de benzoíla, cloroacetato, trifluoracetato, metoxia-cetato, trifenilmetoxiacetato, p-clorofenoxiacetato, 3-fenilpropionato, 4-oxopentanoato, 4,4-(etilenoditio)pentanoato, pivaloato (trimetilacetila), croto-nato, 4-metóxi-crotonato, benzoato, p-benzilbenzoato, 2,4,6-trimetilbenzoato,carbonatos tal como metila, 9-fluorenilmetila, etila, 2,2,2-tricloroetila, 2-(trimetilsilil)etila, 2-(fenilsulfonil)etila, vinila, alila e p-nitrobenzila. Exemplosde tais éteres de silila incluem trimetilsilila, trietilsilila, t-butildimetilsilila, t-butildifenilsilila, triisopropilsilila e outros éteres de trialquilsilila. Éteres de al-quila incluem éteres de metila, benzila, p-metoxibenzila, 3,4-dimetoxibenzila,tritila, t-butila, alila e aliloxicarbonila ou derivados. Éteres de alcoxialquilaincluem acetais tal como éteres de metoximetila, metiltiometila, (2-metoxietoxi)metila, benziloximetila, beta-(trimetilsilil)etoximetila e tetraidropi-ranila. Exemplos de éteres de arilalquila incluem benzila, p-metoxibenzila(MPM)1 3,4-dimetoxibenzila, O-nitrobenzila, p-nitrobenzila, p-halobenzila,2,6-diclorobenzila, p-cianobenzila, 2- e 4-picolila.

Grupos de proteção tiol são bem-conhecidos na técnica e inclu-em aqueles descritos em detalhes em Protecting Groups in Organic Synthe-sis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição, John Wiley & Sons, 1999, cujatotalidade é aqui incorporada a título de referência. Grupos de proteção tioladequados da porção R10 da fórmula I incluem, mas não estão limitados a,dissulfetos, tioéteres, tioéteres de silila, tioésteres, tiocarbonatos, tiocarba-matos e similar. Exemplos de tais grupos incluem, mas não estão limitadosa, tioéteres de alquila, tioéteres de benzila e benzila substituída, tioéteres detrifenilmetila, tricloroetoxicarbonila, para mencionar alguns.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, a por-ção R10 da formula I é um grupo de proteção tiol que é removível sob condi-ções neutras, por exemplo, com AgNO3, HgCI2 e similar. Outras condiçõesneutras incluem redução usando um agente de redução adequado. Agentesde redução adequados incluem ditiotreitol (DTT), mercaptoetanol, ditionita,glutationa reduzida, glutarredoxina reduzida, tiorredoxina reduzida, fosfinassubstituídas tal como tris carboxietil fosfina (TCEP) e qualquer outro peptí-deo ou agente de redução de base orgânica ou outros reagentes conhecidosdaqueles versados na técnica. De acordo ainda com um outro aspecto dapresente invenção, a porção R10 da fórmula I é um grupo de proteção tiolque é "fotoclivável". Tais grupos de proteção tiol são conhecidos na técnica eincluem, mas não estão limitados a, um grupo nitrobenzila, um grupo tetrai-dropiranila (THP), um grupo tritila, -CH2SCH3 (MTM), dimetilmetoximetila ou -CH2-S-S-piridin-2-ila. Um versado na técnica reconheceria que muitos dosgrupos de proteção hidroxila adequados, conforme descrito aqui, são tam-bém adequados como grupos de proteção tiol.

Em certas modalidades, o grupo R10 da fórmula I é um grupoamino adequadamente protegido. Grupos de proteção amino são bem-conhecidos na técnica e incluem aqueles descritos em detalhes em Protec-ting Groups in Organic Synthesis, T. W. Greene e P. G. M. Wuts, 3a edição,John Wiley & Sons, 1999, cuja totalidade é aqui incorporada a título de refe-rência. Grupos de proteção amino adequados da dita porção R10 incluemainda, mas não estão limitados a, aralquilaminas, carbamatos, imidas cícli-cas, alil aminas, amidas e similar. Exemplos de tais grupos incluem t-butoxicarbonila (BOC), etiloxicarbonila, metiloxicarbonila, tricloroetoxicarbo-nila, aliloxicarbonila (Alloc), benziloxicarbonila (CBZ), alila, ftalimida, benzila(Bn), fluorenilmetilcarbonila (Fmoc), formila, acetila, cloroacetila, dicloroaceti-la, tricloroacetila, fenilacetila, trifluoracetila, benzoíla e similar. Em certasmodalidades, o grupo de proteção amino da porção R10 é ftalimido. Em ain-da outras modalidades, o grupo de proteção amino da porção R10 é terc-butiloxicarbonila (BOC).

Em certas modalidades, a presente invenção prove um compos-to da fórmula I, onde o dito composto é outro que não qualquer um de, doisou, todos os três que seguem:

<formula>formula see original document page 28</formula>

Conforme geralmente acima descrito, a presente invenção provêum composto da fórmula I:<formula>formula see original document page 29</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui. Em certas modali-dades, a presente invenção provê um composto da fórmula I tendo a estere-oquímica conforme mostrado na Fórmula l-a:

<formula>formula see original document page 29</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui para compostos dafórmula I.

Em certas modalidades, os grupos R1 e R2 da fórmula I são to-mados juntos para formarem um anel parcialmente insaturado, saturado de3-7 membros ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentemente selecio-nados de nitrogênio, oxigênio e enxofre. Em outras modalidades, os gruposR1 e R2 da fórmula I são tomados juntos para formarem um anel saturado de3-6 membros tendo 0-2 heteroátomos independentemente selecionados denitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em ainda outras modalidades, os grupos R1e R2 da fórmula I são tomados juntos para formarem um anel carbocíclicosaturado de 3-6 membros. De acordo ainda com um outro aspecto da pre-sente invenção, um composto da fórmula l-b é provido:<formula>formula see original document page 30</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui para compostos dafórmula I. Em outras modalidades, a presente invenção provê um compostoda fórmula l-c:

<formula>formula see original document page 30</formula>

Conforme definido geralmente acima, cada um de Anel A, AnelB, Anel C, Anel D e Anel E é independentemente saturado, parcialmenteinsaturado ou aromático. Em certas modalidades, o Anel B é insaturado e R1e R2 estão ausentes, então formando um composto da fórmula II:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui para composto dafórmula I.

Em certas modalidades, o grupo η da fórmula Il é 0-1 e o grupoG da fórmula Il é oxigênio.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção provê umcomposto da fórmula ll-a:

<formula>formula see original document page 31</formula>

Em certas modalidades, o grupo η da fórmula ll-a é 0-1 e o gru-po G da fórmula ll-a é oxigênio.

Em outras modalidades, Anel B e Anel D são ambos insaturadose R1, R2 e R6 estão ausentes, deste modo formando um composto da fórmu-la III:

<formula>formula see original document page 31</formula>

Em certas modalidades, o grupo η da fórmula Ill é 0-1 e o grupoG da fórmula Ill é oxigênio.

De acordo com outras modalidades, a presente invenção provêum composto da fórmula IV:

<formula>formula see original document page 32</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui para compostos dafórmula I. Conforme aqui usado,.......designa uma ligação simples ou du-pia. Será compreendido de um versado na técnica que quando-------desig-nar uma ligação dupla, então R6 está ausente. Em contrate, quando-------designar uma ligação simples, então R6 está presente. Deste modo, em cer-tas modalidades,.......designa uma ligação dupla e R6 está ausente. Emoutras modalidades, .......designa uma ligação simples e R6 é conformeacima definido.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção provê umcomposto da fórmula IV-a:

<formula>formula see original document page 32</formula>

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, onde cada variável é definidaacima e em classes e subclasses descritas acima e aqui para composto daformulai.

Em certas modalidades, o grupo G da fórmula IV-a é oxigênio.Em outras modalidades, o grupo R4 da fórmula IV-a é R, OR ou um grupohidroxila adequadamente protegido. Em ainda outras modalidades, o grupoR4 da fórmula IV-a é R.Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se a umcomposto da fórmula IV-b:

<formula>formula see original document page 33</formula>

Em certas modalidades, os grupos R1 e R2 da fórmula IV-b sãotomados juntos para formarem um anel saturado de 3-7 membros, parcial-mente insaturado, ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentemente sele-cionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em outras modalidades, osgrupos R1 e R2 da fórmula IV-b são tomados juntos para formarem um anelsaturado de 3-6 membros tendo 0-2 heteroátomos independentemente sele-cionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre. Em ainda outras modalidades,os grupos R1 e R2 da fórmula IV-b são tomados juntos para formarem umanel carbocíclico saturado de 3-6 membros. De acordo ainda com um outroaspeto da presente invencao, um composto da formula IV-c e provido:

<formula>formula see original document page 33</formula>

Em certas modalidades, o grupo R7 da fórmula IV-c é -OH.De acordo com um ainda um outro aspecto da presente inven-cao, um composto da formula IV-d e provido:

<formula>formula see original document page 34</formula>

Em certas modalidades, o grupo R7 da fórmula IV-d é -OH.Compostos exemplares da presente invenção são mostrados naTabela 1, abaixo:

Tabela 1. Compostos Exemplares da Fórmula I

<formula>formula see original document page 34</formula><formula>formula see original document page 35</formula>

Compostos exemplares da fórmula IVa são mostrados na Tabela2, abaixo:<formula>formula see original document page 36</formula>

4. Métodos Gerais de Provisão dos Presentes Compostos:

Os compostos da presente invenção podem ser preparados ouisolados em geral através de métodos sintéticos e/ou semi-sintéticos conhe-cidos daqueles versados na técnica para compostos análogos e através demétodos descritos em detalhes nos Exemplos, abaixo.

Isolamento de Componentes Ativos

Certos compostos da presente invenção foram isolados da raizde cohosh preto, também conhecida como cimicifuga racemosa ou actaearacemosa, e a estrutura desses compostos elucidada. Extratos, pós e cápsu-Ias comerciais de raiz cohosh preta estão disponíveis para tratamento deuma variedade de distúrbios menopausais e ginecológicos. No entanto, foisurpreendentemente verificado que certos compostos presentes em raiz decohosh preto são úteis para modulação e/ou inibição de produção de peptí-deo beta-amilóide. Em particular, certos compostos foram isolados de raizcohosh preta e identificados, onde esses compostos são úteis para modula-ção e/ou inibição de produção de peptídeo beta-amilóide especialmente pep-tídeo beta-amilóide (1-42). Tais compostos são compreendidos pela fórmulaI. Esses compostos podem ser isolados e utilizados em uma forma substan-cialmente livre de outros compostos normalmente encontrados na raiz. Al-ternativamente, um extrato pode ser preparado a partir da raiz onde o ditoextrato é enriquecido em um composto da presente invenção.

Conforme acima descrito e aqui, certos compostos da presenteinvenção são isolados de extratos padrão de raízes e rizomas de cohoshpreta cultivadas ou selvagens. É também compreendido que os presentescompostos podem ser também isolados de tecido de raiz de planta cultivadaem cultura ou do meio de cultura do tecido da planta de cultura. Tais méto-dos de cultivo de tecido de raiz de planta em cultura são bem-conhecidos deum versado na técnica e incluem aqueles descritos em Hairy fíoots, Cultureand Applications, editado por Pauline M. Doran, publicado por Harwood A-cademic Publishers, Amsterdam, Países Baixos. Copiright 1997 OPA (Over-seas Publishers Association) Amsterdam Β. V. ISBN 90-5702- 117-X, cujatotalidade é aqui incorporada a título de referência.

Alternativamente, os compostos da presente invenção podemser preparados através de processos semi-sintéticos partindo de outroscompostos encontrados em extratos de cohosh preto e espécies cimicifugarelacionadas, seja de raízes ou rizoma ou partes aéreas dessas plantas. Istopode ser realizado ou através de transformação clínica ou biológica de umcomposto isolado ou uma fração de extrato ou mistura de compostos. Trans-formação química pode ser conseguida através de, por exemplo, mas nãolimitado a, manipulação de temperatura, pH e/ou tratamento com vários sol-ventes. Transformação biológica pode ser conseguida através de, mas nãolimitado a, tratamento de um composto isolado ou uma fração de extrato oumistura de compostos com tecido de planta, extratos de tecido de planta,outros organismos microbiológicos ou uma enzima isolada de qualquer or-ganismo.

Em certas modalidades, a presente invenção provê um extratode raiz cohosh preta onde o dito extrato compreende pelo menos 10% empeso de um composto da presente invenção. Em outras modalidades, a pre-sente invenção provê um extrato de raiz cohosh preta onde o dito extratocompreende de a partir de cerca de 10% em peso a cerca de 50% em pesode um composto da presente invenção. Em ainda outras modalidades, apresente invenção provê um extrato de raiz cohosh preta onde o dito extratocompreende de a partir de cerca de 10% em peso a cerca de 50% em pesode um composto da presente invenção, onde o dito extrato é substancial-mente livre de acteína.

De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção pro-vê um composto da fórmula I substancialmente livre de outros compostosencontrados em raiz cohosh preta. Conforme aqui usado, o termo "substan-cialmente livre" significa que o composto é formado de uma proporção signi-ficantemente maior de um composto da fórmula I conforme comparado como composto conforme encontrado em raiz cohosh preta ou seu extrato. Emalgumas modalidades, a presente invenção provê um composto da fórmula Iem uma quantidade de cerca de 1 por cento em peso a cerca de 99 por cen-to em peso. Em certas modalidades, o composto da fórmula I é provido emmais do que cerca de 80% de pureza química. Em outras modalidades, ocomposto da fórmula I é provido em mais do que cerca de 90% de purezaquímica. Em outras modalidades, o composto da fórmula I contém não maisdo que cerca de 10,0 por cento de área de HPLC de outros componentes deraiz cohosh preta com relação à área total do cromatograma de HPLC. Emoutras modalidades, o composto da fórmula I contém não mais do que cercade 8,0 por cento de área de HPLC de outros componentes da raiz cohoshcom relação á área total do cromatograma de HPLC, e em ainda outras mo-dalidades, não mais do que cerca de 3 por cento de área.

Métodos para determinar se os compostos da presente invençãoestão em uma forma substancialmente livre de outros compostos normal-mente encontrados em raiz cohosh preta são conhecidos de um versado decomum na técnica conforme descrito abaixo. Os compostos que foram ante-riormente isolados, e identificados, a partir de raiz cohosh preta incluem cer-tos triterpenos baseados em cicloartanol incluindo acteol, acetilacteol, 26-desoxiacteol, cimigenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugosida. Ácido(E)-isoferúlico e a isoflavona formononetin foram também isolados e identifi-cados. Representantes desses compostos têm as estruturas que seguem:

<formula>formula see original document page 39</formula>

Deste modo, uma outra modalidade da presente invenção provêum composto da fórmula I substancialmente livre de um ou mais acteol, ace-tilactetol, 26-desoxiacteol, cimigenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugo-sida. Em certas modalidades, a presente invenção provê um composto dafórmula I substancialmente livre de acteol, acetilacteol, 26-desoxiacteol, ci-migenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugosida.

De acordo com uma outra modalidade, a presente invenção pro-vê um extrato de raiz cohosh preta enriquecida em um composto da fórmulaI com uma quantidade pequena de um ou mais de acteol, acetilacteol, 26-desoxiacteol, cimigenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugosida. De a-cordo com ainda um outra modalidade, a presente invenção provê um extra-to de raiz cohosh preta enriquecida em um composto da fórmula I com umaquantidade pequena de cada um de acteoi, acetilactel, 26-desoxiacteol, ci-migenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugosida.

Uma variedade de técnicas é bem-conhecida no campo paraextração, isolamento e/ou purificação de componentes ativos individuais deraiz cohosh preta. A presente invenção compreende ambos a identificaçãode tais componentes ativos conforme aqui descrito e a incorporação de taiscomponentes às composições da presente invenção conforme descrito aqui.

Componentes ativos individuais de extratos de cohosh preta po-dem ser identificados conforme aqui descrito e podem ser isolados e/ou puri-ficados usando quaisquer técnicas conhecidas no campo. O componenteativo pode ser purificado da própria raiz em qualquer forma ou a decocçãode uma mistura de um extrato da presente invenção ou um extrato comerci-almente disponível, dentre outros. Várias técnicas que podem ser emprega-das na purificação incluem filtragem, precipitação seletiva, extração com sol-ventes orgânicos, extração com solventes aquosos, cromatografia de coluna(Sílica-gel), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e outros mé-todos conhecidos de um versado na técnica.

De acordo com certas modalidades, os presentes extratos sãoaqueles usando uma fração isolada de raiz cohosh preta. Uma fração isola-da significa uma quantidade subsidiária de substâncias de raiz que foi remo-vida, por exemplo, através de meios cromatográficos, destilação, precipita-ção, extração, filtragem ou em outros modos da própria raiz. Em outras mo-dalidades, os extratos e frações de raiz são removidos dela através de cro-matografia, destilação, precipitação ou extração. Tais técnicas de extração eisolamento são bem-conhecidas de um versado na técnica. Os detalhes dealgumas dessas técnicas são mostrados na seção de Exemplos abaixo.

De acordo com outras modalidades da presente invenção, apresença e pureza do composto ativo são avaliadas através de métodosquímicos incluindo espectroscopia magnética nuclear (RMN), espectroscopiade massa, espectroscopia infravermelha (IR), espectroscopia visível ultravio-leta, análise elementar e polarimetria, refractometria, para mencionar alguns.Tais métodos de análise são conhecidos de um versado na técnica. Em ou-tras modalidades, a estrutura química de compostos ativos isolados de raizcohosh preta é determinada através de métodos conhecidos de um versadona técnica, incluindo RMN, espectroscopia de massa, espectroscopia infra-vermelha (IR)1 espectroscopia visível ultravioleta, análise elementar, polari-metria, refractometria e cristalografia de raio X, para mencionar alguns.

Embora certas modalidades exemplares sejam descritas acima eaqui, será compreendido que os extratos de raiz da presente invenção po-dem ser preparados de acordo com os métodos descritos geralmente acimausando materiais de partida apropriados através dos métodos geralmentedisponíveis a um versado na técnica.

5. Usos, Formulação e Administração

Composições farmaceuticamente aceitáveis

De acordo com um outro aspecto da presente invenção, compo-sições farmaceuticamente aceitáveis são providas, onde essas composiçõescompreendem qualquer um dos compostos conforme aqui descrito, e opcio-nalmente compreendem um veículo, adjuvante ou veículo farmaceuticamen-te aceitável. Em certas modalidades, essas composições opcionalmentecompreendem ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

Será também compreendido que certos compostos da presenteinvenção podem existir em forma livre para tratamento, ou, onde apropriado,como um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Conforme aqui usado, o termo "sal farmaceuticamente aceitável"refere-se a sais que são, dentro do escopo de julgamento médico seguro,adequados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais infe-riores sem toxidez, irritação, resposta alérgica indevida e similar, e são pro-porcionados com uma razão de benefício/risco razoável. Um "sal farmaceu-ticamente aceitável" significa qualquer sal não-tóxico ou sal de um éster deum composto da presente invenção que, quando da administração a um re-cipiente, é capaz de prover, ou direta ou indiretamente, um composto dapresente invenção ou um seu metabólito ou resíduo farmaceuticamente ati-vo. Conforme usado aqui, o termo "seu metabólito ou resíduo farmaceutica-mente ativo" significa que um seu metabólito ou resíduo é também um com-posto farmaceuticamente ativo de acordo com a presente invenção.

Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem-conhecidos na téc-nica. Por exemplo, S.M. Berge e outros descrevem sais farmaceuticamenteaceitáveis em detalhes em J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19, in-corporado aqui a título de referência. Sais farmaceuticamente aceitáveis doscompostos da presente invenção incluem aqueles derivados de ácidos e ba-ses inorgânicos e orgânicos adequados. Exemplos de sais de adição ácidonão-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, são sais de um grupo aminoformado com ácidos inorgânicos tal como ácido clorídrico, ácido bromídrico,ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos talcomo ácido acético, ácido oxálico, ácido maléico, ácido tartárico, ácido cítri-co, ácido succínico ou ácido malônico ou através do uso de outros métodosusados na técnica tal como troca de íon. Outros sais farmaceuticamente a-ceitáveis incluem adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato,benzoato, bissulfatos, borato, butirato, canforato, canforsulfonato, citrato,ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, formia-to, fumarato, glucoeptonato, glicerofosfato, gluconato, hemissulfato, hepta-noato, hexanoato, hidroiodo, 2-hidroxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato,laurato, sulfato de laurila, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato,pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato,estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, unde-canoato, sais de valerato e similar. Sais derivados de bases apropriadas in-cluem sais de metal alcalino, metal alcalino-terroso, amônio e N+(Ci-4alquila)4. A presente invenção também prevê a quaternização de quaisquergrupos contendo nitrogênio dos compostos descritos aqui. Produtos solúveisou dispersáveis em água ou óleo podem ser obtidos através de tal quaterni-zação. Sais alcalinos ou alcalino-terrosos representativos incluem sais desódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similar. Sais farmaceuticamente a-ceitáveis adicionais incluem, quando apropriado, cátions de amônio, amônioquaternário e amina não-tóxicos formados usando contra-íons tal como hale-to, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquila inferiore sulfonato de arila.

As composições da presente invenção podem adicionalmentecompreender um veículo, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitávelque, conforme aqui usado, inclui qualquer um e todos os solventes, diluentesou outro veículo líquido, auxiliares de dispersão ou suspensão, agentes ten-soativos, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou emulsificantes,conservantes, Iigantes sólidos, lubrificantes e similar, conforme adequadopara a forma de dosagem particular desejada. Remington1S PharmaceuticalSciences, Décima Sexta Edição, E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton,Pa., 1980) descreve vários veículos usados em formulação de composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis e técnicas conhecidas para sua preparação.Exceto até o ponto que qualquer meio veículo convencional for incompatívelcom os compostos da invenção, tal como através da produção de qualquerefeito biológico indesejado ou de outro modo interagindo de uma maneiraprejudicial com qualquer outro componente(s) da composição farmaceutica-mente aceitável, seu uso é compreendido estar dentro do escopo da presen-te invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículosfarmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, trocado-res de íon, alumina, estearato de alumina, lecitina, proteínas do soro, tal co-mo albumina do soro humano, substâncias tampão tal como fosfatos, gliceri-na, ácido ascórbico, ou sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parcial deácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tal como sulfatode protamina, hidrogeno fosfato dissódico, hidrogeno fosfato de potássio,cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivi-nil pirrolidona, poliacrilatos, çeras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, lanolina, açúcares tal como lactose, glicose e sacarose; a-midos tal como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivadostal como carboximetilcelulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose;tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes tal como manteiga decacau e ceras de supositório; óleos tal como óleo de amendoim, óleo de se-mente de algodão; óleo de açafrão, óleo de sésamo; óleo de oliva, óleo demilho e óleo de soja; glicóis; tal como um propileno glicol ou polietileno glicol;ésteres tal como oleato de etila e Iaurato de etila; ágar; agentes de tampo-namento tal como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido al-gínico; água livre de pirogênio; solução salina isotônica; solução de Ringer;álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantescompatíveis não-tóxicos tal como Iauril sulfato de sódio e estearato de mag-nésio, bem como agentes de coloração, agentes de liberação, agentes derevestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e de perfume, conservantese antioxidantes podem também estar presentes na composição, de acordocom o julgamento do formulador.

As composições providas pela presente invenção podem serempregadas em terapias de combinação, isto é, as presentes composiçõespodem ser administradas concomitantemente com, antes da, ou subsequen-te a, um ou mais outros agentes terapêuticos ou procedimentos médicos. Acombinação particular de terapias (agentes ou procedimentos terapêuticos)para empregar em um regime de combinação vai levar em consideraçãocompatibilidade dos agentes e/ou procedimentos terapêuticos desejados e oefeito terapêutico desejado a ser obtido. Será também compreendido que asterapias empregadas podem obter um efeito desejado para o mesmo distúr-bio (por exemplo, um composto descrito aqui pode ser administrado conco-mitantemente com um outro agente terapêutico usado para tratar o mesmodistúrbio) ou elas podem obter efeitos diferentes (por exemplo, controle dequaisquer efeitos adversos).

Por exemplo, agentes conhecidos úteis para tratamento de dis-túrbios neurodegenerativos podem ser combinados com as composições dapresente invenção para tratar distúrbios neurodegenerativos, tal como doen-ça de Alzheimer. Exemplos de tais agentes conhecidos úteis para tratamentode distúrbios neurodegenerativos incluem, mas não estão limitados a, trata-mentos para doença de Alzheimer tal como inibidores de acetilcolinesterase,incluindo donepezil, memantina (e compostos relacionados tal como inibido-res de NMDA), Exelon®; tratamentos para doença de Parkinson tal como L-DOPA/carbidopa, entacapona, ropinrol, pramipexol, bromocriptina, pergolida,triexefendila e amantadina; agentes para tratamento de Esclerose Múltipla(MS) tal como beta interferon (por exemplo, Avonex® e Rebif®), Copaxone® emitoxantrona; riluzol e agentes anti-Parkinsonianos. Para uma discussãomais compreensiva de terapias atualizadas úteis para tratamentos neurode-generativos vide uma lista dos fármacos aprovados pela FDA nohttp://www.fda.gov e no The Merck Manual, Décima sétima Ed. 1999, cujosconteúdos são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Em outras modalidades, os compostos da presente invençãosão combinados com outros agentes úteis para tratamento de distúrbiosneurodegenerativos tal como doença de Alzheimer, onde tais agentes inclu-em inibidores de beta-secretase, inibidores de gama-secretase, inibidores deagregação, quelantes de metal, antioxidantes e neuroprotetores.

Conforme aqui usado, o termo "combinação", "combinado" etermos relacionados referem-se à administração simultânea ou seqüencialde agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção. Por exemplo,um composto da presente invenção pode ser administrado com qualqueroutro agente terapêutico simultânea ou seqüencialmente em formas de do-sagem unitárias separadas ou juntos em uma forma de dosagem unitáriaúnica. Deste modo, a presente invenção provê uma forma de dosagem uni-tária compreendendo um composto da fórmula I, um agente terapêutico adi-cional e um veículo, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Outros exemplos de agentes que os inibidores da presente in-venção podem ser combinados incluem, sem limitação: tratamentos paraasma tal como albuterol e Singulair®; agentes para tratamento de esquizo-frenia tal como zyprexa, risperdal, seroquel e haloperidol; agentes antiinfla-matórios tal como corticosteróides, bloqueadores de TNF, IL-1 RA, azatiopri-na, ciclofosfamida e sulfasalazina; agentes imunomoduladores e imunossu-pressivos tal como ciclosporin, tacrolimus, rapamicina, micofenolato de mo-fetila, interferons, corticosteróides, ciclofosfamida, azatioprina e sulfasalazi-na; fatores neutróficos tal como inibidores de acetilcolinesterase, inibidoresde ΜΑΟ, interferons, anticonvulsivos, bloqueadores de canal de íon, agentespara tratamento de doença cardiovascular tal como beta-bloqueadores, ini-bidores de ACE, diuréticos, nitratos, bloqueadores de canal de cálcio e esta-tinas; agentes para tratamento de doenças do fígado tal como corticosterói-des, colestiramina, interferons e agentes antivirais; agentes para tratamentode distúrbios do sangue tal como corticosteróides, agentes antileucêmicos efatores de crescimento; e agentes para tratamento de distúrbios de imunode-ficiência tal como gama globulina.

A quantidade de agente terapêutico adicional presente nas com-posições da presente invenção não será mais do que a quantidade que serianormalmente administrada em uma composição compreendendo esse agen-te terapêutico como o único agente ativo. Em certas modalidades, a quanti-dade de agente terapêutico adicional nas presentes composições vai variarde a partir de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presenteem uma composição compreendendo esses agentes como o único agenteterapeuticamente ativo.

Em uma modalidade alternativa, os métodos da presente inven-ção que utilizam composições que não contêm um agente terapêutico adi-cional compreendem a etapa adicional de separadamente administrar ao ditopaciente um agente terapêutico adicional. Quando esses agentes terapêuti-cos adicionais são administrados separadamente eles podem ser adminis-trados ao paciente antes da, seqüencialmente com ou seguindo administra-ção das composições da presente invenção.

As composições farmaceuticamente aceitáveis da presente in-venção podem ser administradas a seres humanos e outros animais oral,retal, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como a-través de pós, ungüentos ou gotas), ou bucalmente, como um spray oral ounasal, ou similar, dependendo da severidade do distúrbio sendo tratado. Emcertas modalidades, os compostos da invenção pode ser administrados o-ralmente ou parenteralmente em níveis de dosagem de cerca de 0,01 mg/kga cerca de 50 mg/kg, e de preferência de a partir de cerca de 1 mg/kg a cer-ca de 25 mg/kg, de peso do corpo do indivíduo por dia, uma ou mais vezespor dia, para se obter o efeito terapêutico desejado.

Formas de dosagem líquidas para administração oral incluem,mas não estão limitadas a, emulsões, microemulsões, soluções, suspen-sões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em adição aos com-postos ativos, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertesgeralmente usados na técnica tal como, por exemplo, água ou outros solven-tes, agentes de solubilização e emulsificantes tal como álcool etílico, álcoolisopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoatode benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (emparticular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva,rícino e sésamo), glicerol, álcool tetraidrofurfurílico, polietileno glicóis e éste-res de ácido graxo de sorbitano e suas misturas. Além dos diluentes inertes,as composições orais podem também incluir adjuvantes tal como agentesumectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, agentes adoçantes,aromatizantes e de perfume.

Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ouoleaginosas injetáveis, podem ser formuladas de acordo com a técnica co-nhecida usando agentes de dispersão ou umectantes e agentes de suspen-são adequados. A preparação injetável estéril pode ser também uma solu-ção, suspensão ou emulsão injetável estéril em um diluente ou solvente pa-renteralmente aceitável não-tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Dentre os veículos e solventes adequados que podem ser em-pregados estão água, solução de Ringer, solução U.S.P e de cloreto de só-dio isotônica. Em adição, óleos fixos, estéreis, são convencionalmente em-pregados como um meio solvente ou de suspensão. Para este propósito,qualquer óleo fixo suave pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerí-deos sintéticos. Em adição, ácidos graxos tal como ácido oléico são usadosna preparação de injetáveis.

As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo,através de filtragem através de um filtro de retenção bacteriana ou atravésda incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidasestéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outromeio injetável estéril antes do uso.

A fim de prolongar o efeito de um composto da presente inven-ção, é freqüentemente desejado deixar mais lenta a absorção do composto apartir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser realizado atra-vés do uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo comsolubilidade em água pobre. A taxa de absorção do composto então depen-de de sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender da tamanhodo cristal e forma cristalina. Alternativamente, absorção retardada de umaforma de composto parenteralmente administrado é conseguida através dedissolução ou suspensão do composto em um veículo oleoso. Formas dedepósito injetáveis são feitas através da formação de matrizes microencap-suladas do composto em polímeros biodegradáveis tal como polilactídeo-poliglicólido. Dependendo da razão de composto para polímero e da nature-za do polímero particular empregado, a taxa de liberação de composto podeser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem po-li(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis depósito são tambémpreparadas aprisionando o composto em Iipossomas ou microemulsões quesejam compatíveis com tecidos do corpo.

Composições para administração retal ou vaginal são de prefe-rência supositórios que podem ser preparados misturando os compostos dapresente invenção com excipientes ou veículos não-irritantes adequados talcomo manteiga de cacau, polietileno glicol ou uma cera de supositório quesão sólidos em temperatura ambiente mas líquidos em temperatura do corpoe então derretem na cavidade retal ou vaginal e liberam o composto ativo.

Formas de-dosagem sólidas para administração oral incluemcápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagemsólidas, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente ou ve-ículo farmaceuticamente aceitável, estéril, tal como citrato de sódio ou fosfa-to dicálcio e/ou a) cargas ou extensores tal como amidos, lactose, sacarose,glicose, manitol e ácido silícico, b) aglutinante tal como, por exemplo, carbo-ximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e acácia; c)umectantes tal como glicerol, d) agentes desintegrantes tal como ágar-ágar,carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silica-tos e carbonato de sódio, e) solução de agentes de retardo tal como parafi-na, f) aceleradores de absorção tal como compostos de amônio quaternário,g) agentes umectantes tal como, por exemplo, álcool cetílico e monoesteara-to glicerol, h) absorventes tal como caulim e argila bentonita e i) lubrificantestal como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóissólidos, Iauril sulfato de sódio e suas misturas. No caso de cápsulas, com-primidos e pílulas, a forma de dosagem pode também compreender agentesde tamponamento.

Composições sólidas de um tipo similar podem ser também em-pregadas como cargas em cápsulas de gelatina enchidas moles e duras u-sando tais excipientes tal como Iactose ou açúcar do leite bem como polieti-leno glicóis de alta peso molecular e similar. As formas de dosagem sólidasde comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser prepara-das com revestimentos e cascas tal como revestimentos entéricos e outrosrevestimentos bem-conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Elaspodem conter opcionalmente agentes opacificantes e podem ser também deuma composição que elas liberam o(s) ingrediente(a) ativo(s) apenas, ou depreferência, em uma certa parte do trato intestinal, opcionalmente, de umamaneira retardada. Exemplos de composições de embebimento que podemser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Composições sólidasde tipo similar podem ser também empregadas como cargas em cápsulas degelatina enchidas moles e duras usando excipientes tal como Iactose ou a-çúcar do leite bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similar.

Os compostos ativos podem também estar em forma microen-capsulada com um ou mais excipientes conforme acima mencionado. Asformas de dosagem sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas egrânulos podem ser preparadas com revestimentos e cascas tal como reves-timentos entéricos, revestimentos de controle de liberação e outros revesti-mentos bem-conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em taisformas de dosagem sólidas o composto ativo pode ser misturado com pelomenos um diluente inerte tal como sacarose, Iactose ou amido. Tais formasde dosagem podem também compreender, como é prática normal, substân-cias adicionais outras que não diluentes inertes, por exemplo, lubrificantesde formação de comprimido e outros auxiliares de formação de comprimidotal como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cáp-sulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem também com-preender agentes de tamponamento. Elas podem conter opcionalmente a-gentes e podem ser também de uma composição que elas liberam o(s) in-grediente(s) ativo(s) apenas, ou de preferência, em uma certa parte do tratointestinal, opcionalmente, de uma maneira retardada. Exemplos de composi-ções de embebimento que podem ser usadas incluem substâncias poliméri-cas e ceras.

Formas de dosagem para administração tópica ou transdermalde um composto da presente invenção incluem ungüentos, pastas, cremes,loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou emplastros. O componenteativo é misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamenteaceitavel e quaisquer conservantes ou tampões necessários que possam serrequeridos. Formulação oftálmica, gotas para o ouvido e gotas para o olhosão também compreendidas como estando dentro do escopo da presenteinvenção. Adicionalmente, a presente invenção compreende o uso de em-plastros transdermais, que têm a vantagem adicional de prover aplicaçãocontrolada de um composto ao corpo. Tais formas de dosagem podem serfeitas através da dissolução ou distribuição do composto no meio apropriado.Aumentadores de absorção podem ser também usados para aumentar ofluxo do composto através da pele. A taxa pode ser controlada ou provendouma membrana de controle de taxa ou dispersando o composto em umamatriz de polímero ou gel.

Em algumas modalidades, a presente invenção provê uma com-posição contendo um composto da fórmula I em uma quantidade de cercade 1 por cento em peso a cerca de 99 por cento em peso. Em outras moda-lidades, a composição contendo um composto da fórmula I contém não maisdo que cerca de 10,0 por cento de área de HPLC de outros componentes deraiz cohosh preta com relação á área total do cromatograma de HPLC. Emoutras modalidades, a composição contendo um composto da fórmula I con-tém não mais do que cerca de 8,0 por cento de área de HPLC de outroscomponentes de raiz cohosh preta com relação à área total do cromatogra-ma de HPLC, e em ainda outras modalidades, não mais do que cerca de 3por cento de área.

Usos de Compostos e Composições Farmaceuticamente Aceitáveis

Os compostos da presente invenção são úteis para modulaçãoe/ou inibição de produção de peptídeo beta-amilóide (1-42) em um paciente.Deste modo, os compostos da presente invenção são úteis para tratamento,ou diminuição da severidade, de distúrbios associados com produção depeptídeo beta-amilóide (1-42) em um paciente.

Os compostos, extratos e composições, de acordo com o méto-do da presente invenção, podem ser administrados usando qualquer quanti-dade e qualquer via de administração eficaz para tratar ou diminuir a severi-dade de um distúrbio neurodegenerativo. A quantidade exata requerida vaivariar de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e condiçãogeral do indivíduo, da severidade da infecção, do agente particular, seu mo-do de administração e similar.

Em certas modalidades, a presente invenção provê um métodopara modulação e/ou inibição de produção de peptídeo beta-amilóide (1-42)em um paciente, onde o dito método compreende administrar ao dito pacien-te um composto da fórmula I, ou uma composição farmaceuticamente acei-tável compreendendo o dito composto. Em outras modalidades, a presenteinvenção provê um método de seletivamente modular e/ou inibir a produçãode peptídeo beta-amilóide (1-42) em um paciente, onde o dito método com-preende administrar ao dito paciente um composto da fórmula I ou umacomposição farmaceuticamente aceitável dele. Em ainda outras modalida-des, a presente invenção provê um método de redução dos níveis de peptí-deo beta-amilóide (1-42) em um paciente, onde o dito método compreendeadministrar ao dito paciente um composto da fórmula I ou uma composiçãofarmaceuticamente aceitável dela. Em outras modalidades, a presente in-venção provê um método para redução dos níveis de peptídeo beta-amilóide(1-42) em uma célula, compreendendo contato da dita célula com um com-posto da fórmula I. Uma outra modalidade provê um método para reduçãode beta-amilóide (1-42) em uma célula sem substancialmente reduzir os ní-veis de peptídeo beta-amilóide (1-40) na célula, compreendendo contato dadita célula com um composto da fórmula I. Ainda uma outra modalidade pro-vê um método para redução de beta-amilóide (1-42) em uma célula e au-mento de pelo menos um beta-amilóide (1-37) e beta-amilóide (1-39) na cé-lula, compreendendo contato da dita célula com um composto da fórmula I.

Conforme aqui usado, o termo "redução" ou "reduz" refere-se àdiminuição relativa na quantidade de uma beta-amilóide conseguida atravésda administração de um composto da fórmula I conforme comparado com aquantidade deste beta-amilóide na ausência de administração de um com-posto da fórmula I. A título de exemplo, uma redução de beta-amilóide (1-42)significa que a quantidade de beta-amilóide (1-42) na presença de um com-posto da fórmula I é menor do que a quantidade de beta-amilóide (1-42) naausência de um composto da fórmula I.

Em ainda outras modalidades, a presente invenção provê ummétodo para seletivamente reduzir os níveis de peptídeo beta-amilóide (1-42) em um paciente, onde o dito método compreende administrar ao ditopaciente um composto da fórmula I ou uma composição farmaceuticamenteaceitável dele. Em certas modalidades, a presente invenção provê um méto-do para redução dos níveis de peptídeo beta-amilóide (1-42) em um pacientesem substancialmente reduzir os níveis de peptídeo beta-amilóide (1-40),onde o dito método compreende administrar ao dito paciente um compostoda fórmula I ou uma composição farmaceuticamente aceitável dele.

Em certas modalidades, a presente invenção provê um métodopara redução dos níveis de peptídeo beta-amilóide (1042) em um paciente eaumento de pelo menos um beta-amilóide (1-37) e beta-amilóide (1-39), on-de o dito método compreende administrar ao dito paciente um composto dafórmula I ou uma composição farmaceuticamente aceitável dele. -

O termo "aumentando" ou "aumento", conforme aqui usado emreferência a uma quantidade de um beta-amilóide, refere-se ao aumento re-lativo na quantidade de uma beta-amilóide conseguido através da adminis-tração de um composto da fórmula I (ou contato de uma célula com umcomposto da fórmula I) conforme comparado com a quantidade desta beta-amilóide na ausência de administração de um composto da fórmula I (oucontato da célula com um composto da fórmula I). A título de exemplo, umaumento de beta-amilóide (1-37) significa que a quantidade de beta-amilóide(1-37) na presença de um composto da fórmula I é maior do que a quantida-de de beta-amilóide (1-37) na ausência de um composto da fórmula I. Porexemplo, as quantidades relativas ou de beta-amilóide (1-37) e beta-amilóide(1-39) podem ser aumentadas ou através de uma produção maior ou de be-ta-amilóide (1-37) e beta-amilóide (1-39) ou através de uma produção menorde peptídeos beta-amilóide mais longos, por exemplo, beta-amilóide (1-40)e/ou beta-amilóide (1-42). Ainda, será compreendido que o termo "aumen-tando" ou "aumento", conforme aqui usado com referência a uma quantidadede uma beta-amilóide, refere-se ao aumento absoluto na quantidade de umabeta-amilóide conseguida através da administração de um composto da fórmula I.

Um versado na técnica vai compreender que razão geral de pep-tídeos beta-amilóide é significante onde redução seletiva de beta-amilóide(1-42) é especialmente vantajosa. Em certas modalidades, os presentescompostos reduzem a razão geral de peptídeo beta-amilóide (1-42) parapeptídeo beta-amilóide (1-40). Deste modo, um outro aspecto da presenteinvenção provê um método para redução da razão de peptídeo beta-amilóide(1-42) para peptídeo beta-amilóide (1-40) em um paciente, compreendendoadministrar ao dito paciente um composto da fórmula I ou uma composiçãofarmaceuticamente aceitável dele. Em certas modalidades, a razão de peptí-deo beta-amilóide (1-42) para peptídeo beta-amilóide (1-40) é reduzida deuma faixa de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 0,4 a uma faixa de cerca de0,05 a cerca de 0,08.

Em outras modalidades, a presente invenção provê um métodopara redução da razão de peptídeo beta-amilóide (1-42) para peptídeo beta-amilóide (1-40) em uma célula, compreendendo contato da célula com umcomposto da fórmula I. Em certas modalidades, a razão de peptídeo beta-amilóide (1-42) para peptídeo beta-amilóide (1-40) é reduzida de uma faixade cerca de 0,1 a cerca de 0,4 a uma faixa de cerca de 0,05 a cerca de 0,08.De acordo com um aspecto, a presente invenção provê um mé-todo para tratamento ou diminuição da severidade de um distúrbio associadocom peptídeo beta-amilóide (1-42), onde o dito método compreende admi-nistrar ao dito paciente um composto da fórmula I ou uma composição far-maceuticamente aceitável dela. Tais distúrbios incluem distúrbios neurode-generativos tal como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e síndromede Down.

Em outras modalidades, a presente invenção provê um métodopara tratamento ou diminuição da severidade de doença de Alzheimer emum paciente, onde o dito método compreende administrar ao dito pacienteum composto da fórmula I ou uma composição farmaceuticamente aceitáveldele.

Sem desejar ser limitado a nenhuma teoria particular, acredita-se que os presentes compostos sejam moduladores de gama-secretase queseletivamente reduz os níveis de beta-amilóide (1-42). Deste modo, umaoutra modalidade da presente invenção provê um método de modulação degama-secretase em um paciente, compreendendo administrar ao dito paci-ente um composto da fórmula I ou uma composição farmaceuticamente acei-tável dele. Em certas modalidades, os presentes compostos são inibidoresde gama-secretase. O dito método é útil para tratamento ou diminuição daseveridade de qualquer distúrbio associado com gama-secretase. Tais dis-túrbios incluem, sem limitação, distúrbios neurodegenerativos, por exemplo,doença de Alzheimer.

Os compostos da invenção são de preferência formulados emforma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformi-dade de dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem" conformeaqui usado refere-se a uma unidade fisicamente separada de agente apro-priada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, no entanto, que ouso diário total dos compostos e composições da presente invenção serádecidido pelo médico acompanhante dentro do escopo de julgamento médi-co seguro. O nível de dose eficaz específico para qualquer paciente ou or-ganismo particular vai depender de uma variedade de fatores incluindo odistúrbio sendo tratado e a severidade do distúrbio; a atividade do compostoespecífico empregado; a composição específica empregada; a idade, pesodo corpo, saúde geral, sexo e dieta do paciente; o momento de administra-ção, via de administração; e taxa de excreção do composto específico em-pregado; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou co-incidentes com o composto específico empregado e fatores similares bem-conhecidos na técnica médica. O termo "paciente", conforme aqui usado,significa um animal, de preferência um mamífero, e com mais preferência umser humano.

EXEMPLOS

O extrato de cohosh preto, utilizado no protocolo de separaçãodescrito abaixo, foi obtido como um pedido comum da Boehringer IngelheimNutriceuticals. Este extrato é substancialmente equivalente à preparaçãoUSP de extrato de cohosh preto, onde cerca de 50% de etanol aquoso sãousados para extrair raiz em pó e então concentrados até quase secarem

Conforme aqui usado, os números de compostos mencionadosabaixo correspondem aos compostos que seguem:

Composto 1: β-D-Xilopiranosídeo, (3, 12, 16, 23R,24R,25S,26S)-12-(acetiloxi)-16,23:23,26:24,25-triepoxi-26-hidroxi-9,19-ciclolanostan-3-ila.

Também conhecido como "acteína". C37H56011. Peso em Mol:

Composto 2: Cimigenol 3-p-D-xilopiranosídeo; C35H5609, Pesoem Mol: 620,81; Registro 27994-11-2.<formula>formula see original document page 56</formula>

Composto 3: Cimigenol 3-a-L-arabinosídeo. C35H5609, Pesoem Mol: 620,81; Registro 256925-92-5.

<formula>formula see original document page 56</formula>

Composto 4: 24-O-Acetilidroshengmanol 3-p-D-xilopiranosídeo.C37H60011, Peso em Mol: 680,86; Registro 78213-32-8.

<formula>formula see original document page 56</formula>

Composto 5: 24-O-Acetilidroshengmanol 3-a-L-arabinopiranosídeo. C37H60011, Peso em Mol: 680,87.

<formula>formula see original document page 56</formula>

Composto 6: 24-O-Acetilidroshengmanol 3-p-D-xilopiranosídeo(delta-16,17)-enol éter. C37H58010, Peso em Mol: 662,85.<formula>formula see original document page 57</formula>

Composto 7: 24-O-Acetilidroshengmanol 3-oc-L-arabinopiranosídeo (delta-16,17)-enol éter. C37H58010, Peso em Mol:662,85.

<formula>formula see original document page 57</formula>

Composto 8: 24-epi-24-0-Acetilidroshengmanol 3-β-ϋ-xilopiranosídeo. C37H60011, Peso em Mol: 680,87.

<formula>formula see original document page 57</formula>

Composto 9: 24-epi-24-0-Acetilidroshengmanol 3-β-ϋ-xilopiranosídeo(delta-16,17)-enol éter. C37H58010, Peso em Mol: 662,85.

<formula>formula see original document page 57</formula>

Protocolo de Isolamento 1

Cromatoqrafia de coluna flashExtrato de cohosh preto (15,6 g) foi suspenso em 150 ml de mis-tura 4 para 1 (v/v) de metanol-água a 25° C. Usando um agitador mecânico,a pasta fluida resultante foi vigorosamente agitada por 30 minutos nestatemperatura, o que resultou em uma emulsão marrom. A esta emulsão, 51 gde sílica-gel (sílica ICN 32063 60 Á) foram adicionados com agitação conti-nuada. A mistura foi concentrada 25° C in vácuo usando um evaporador gi-ratório, até que um pó bege-marrom bastante homogêneo foi obtido. Estematerial foi submetido à cromatografia de coluna em sílica-gel (sílica ICN 32-63 60 Á) usando uma coluna de vidro de 60 cm de comprimento com diâme-tro interno de 50 mm.

Na preparação para a cromatografia de coluna, sílica-gel foi ver-tida em 500 ml de uma mistura de diclorometano-metanol 20 para 1 e a pas-ta fluida resultante foi vertida em uma coluna de vidro. A sílica-gel foi deixa-da assentar por 30 minutos e coberta com uma camada fina de areia de 1cm. Subseqüentemente, o extrato absorvido na sílica foi vertido em misturade diclorometano-metanol 20 para 1, e a pasta fluida resultante foi vertida nacamada de areia no alto da coluna. A coluna de sílica foi então eluída comas misturas de solvente que seguem sob uma pressão de 40 kPa (0,4 bar)(argônio):

1,0 ml de diclorometano-metanol 20 para 1, seguido por

770 ml de diclorometano-metanol 10 para 1, seguido por

800 ml de diclorometano-metanol 7 para 1, seguido por

550 ml de diclorometano-metanol 5 para 1.

Oito frações de 200 ml (marcadas como sat14-0 a sat14-7) fo-ram coletadas, seguido por onze frações de 100 ml (marcadas como sat14-8a sat14-18). Todas as frações foram analisadas através de cromatografia decamada fina (TLC), usando placas de sílica Bakerflex, eluídas com misturasolvente de diclorometano-metanol 5 para 1. Após desenvolvimento, as pla-cas de sílica-gel foram tingidas com corante anisaldeído. Com base nos re-sultados das análises de TLC, frações sat14-9 a sat14-12 foram evaporadasaté secar in vácuo a 25° C e amostrar de 10 mg dessas frações foram anali-sadas através de espectroscopia 1H-RMN, usando CD3OD como solvente.Vide Figuras 1 e 2, respectivamente. Espectros foram analisados com rela-ção à presença de um multipleto amplo a 2,53 ppm e um dupleto de 2,2Hz a4,86 ppm, porque esses sinais são característicos para os compostos 7 e 6.

Espectros dqf-COSY adicionais dessas quatro amostras confirmaram que ossinais em 2,53 e 4,86 ppm na verdade pertencem aos compostos 7 e 6. Apartir dos espectros de 1H-RMN da fração salt14-10 foi concluído que estaamostra continha a concentração mais alta de compostos 7 e 6, enquantoquantidades ligeiramente menores desses compostos poderiam ser detecta-das na fração sat14-9. A fração sat14-11 parecia conter de 7 a 6, enquantoesses compostos não podiam ser detectados na fração sat14-12. Com basenesses resultados, a fração sat14-10 foi escolhida para purificação adicionalvia HPLC. Alternativamente, a fração sat14-9 poderia ser usada para se ob-ter quantidades adicionais de compostos 4 a 7 conforme necessário.

O componente principal da fração sat14-10 era acteína (1) (JNP2002, 65, 601-605), que cristalizou a partir de uma solução metanólica destafração. Acteína pura foi obtida através de recristalização. Componentes prin-cipais de fração sat14-11 eram cimigenol beta-D-xilopiranosídeo (2) e cimi-genol alfa-L-arabinosídeo (3), que cristalizou a partir desta fração como umamistura de aproximadamente 2:1 (JNP 2000, 65, 905-910 e 1391-1397).

Fracionamento de HPLC de fase reversa em coluna C18

A fração sat14-10 foi dissolvida em 3,5 ml de metanol. Esta so-lução foi fracionada através de HPLC usando uma coluna SUPELCO Disco-very RP-18 (25 cm de comprimento, 10 mm de diâmetro interno) e um sis-tema de HPLC AGILENT série 1100, incluindo autoinjetor e um detector dearranjo de diodo usado para detecção de comprimento de onda de 190-400nm. Um gradiente de solvente foi empregado, começando com 30% (v/v) deágua em metanol pelo primeiros dois minutos, seguido por uma diminuiçãolinear de teor de água atingindo 100% de metanol em 20 minutos. Após 2minutos em 100% de metanol, o teor de água foi aumentado para 30% emantido nesta concentração por mais 8 minutos. Para separação da amostrasat14-10 toda, 100 injeções de 35 μΙ cada foram requeridas. Nove fraçõesforam coletadas, que foram marcadas sat15-1 a sat15-9. Vide Figuras 3 e 4,respectivamente. Os compostos 4 a 7 foram eluídos em frações sat15-1, 15-2, 15-4 e 15-5: os espectros de 1H RMN de frações sat15-1, 15-2, 15-4 e 15-5 são mostrados nas Figuras 4a e 4b.

Fracionamento de HPLC de fase reversa em coluna C-8 para o isolamentode 6. 4 e 9

A fração sat15-5 foi dissolvida em 1,5 ml de metanol. Esta solu-ção foi fracionada através de HPLC usando coluna SUPELCO supelcosil LC-(25 cm de comprimento, 10 mm de diâmetro interno) e o sistema de HPLCAGILENT série 1100 descrito acima. Um gradiente de solvente foi emprega-do, começando com 40% (v/v) de água em metanol para os dois primeirosminutos, seguido por uma diminuição linear de teor de água atingindo 100%de metanol em 20 minutos. Após 2 minutos em 100% de metanol, o teor deágua foi aumentado para 40% e mantido nesta concentração por mais 8 mi-nutos. Para separação da amostra toda sat15-5, 50 injeções de 30 μΙ cadaforam requeridas. Cinco frações foram coletadas, as quais foram marcadassat16-1 a sat16-5 (Figura 5). O composto 6 foi eluído em fração sat16-3, en-quanto o composto 4 eluiu em fração sat16-1. Uma pequena quantidade de9 puro foi obtida em fração sat15-5. A Figura 6 mostra o espectro de 1HRMN dos 9,8 mg de 6 98% puro obtidos.

Fracionamento de HPLC de fase reversa em coluna C-8 para o isolamentode 8

A fração sat15-8 foi dissolvida em 0,65 ml de metanol. Esta so-lução foi fracionada através de HPLC usando uma coluna SUPELCO supel-cosil LC-8 (25 cm de comprimento, 10 mm de diâmetro interno) e o sistemade HPLC AGILENT série 1100. Um gradiente de solvente foi empregado,começando com 40% (v/v) de água em metanol para os dois primeiros minu-tos, seguido por uma diminuição linear de teor de água atingindo 100% demetanol em 20 minutos. Após 2 minutos a 100% de metanol, o teor de águafoi aumentado para 40% e mantido nesta concentração por mais 8 minutos.

Sete frações foram coletadas, as quais foram marcadas sat18-1 a sat18-7. Ocomposto 8 foi eluído em fração sat18-6. Análises de espectroscopia deRMN incluindo espectros NOESY mostraram que em solução metanólica ocomposto 8 interconverte com a cetona correspondente. Soluções metanóli-cas diluídas contêm cerca de 4% de cetona e 96% da forma hemiacetal.

Fracionamento de HPLC de fase reversa em coluna C-8 para o isolamentode 7 e 5

A fração sat15-2 foi dissolvida em 0,5 ml de metanol. Esta solu-ção foi fracionada através de HPLC usando uma coluna LC-8 supelcosilSULPECO (25 cm de comprimento, 10 mm de diâmetro interno) e o sistemade HPLC AGILENT série 1100 descrito acima. Um gradiente de solvente foiempregado, começando com 40% (v/v) de água em metanol pelos dois pri-meiros minutos, seguido por uma diminuição linear de teor de água atingindo100% de metanol em 20 minutos. Após 2 minutos a 100% de metanol, o teorde água foi aumentado para 40% e mantido nesta concentração por mais 8minutos. Cinco frações foram coletadas, as quais foram marcadas sat19-3 asat19-7. O composto 7 puro foi obtido em fração sat19-7, enquanto o com-posto 5 puro foi obtido em fração sat19-5.

Protocolo de Isolamento 2

Um protocolo de isolamento/purificação alternativo é mostradoabaixo para isolamento do composto 6. Um versado na técnica vai reconhe-cer que embora isolando o composto 6, outros compostos da presente in-venção são enriquecidos e/ou isolados através deste processo. O sumáriodeste processo de isolamento é mostrado na Figura 7.

Este protocolo de purificação utilizou o equipamento que segue:

(a) Sistema de HPLC Hitachi com detector de arranjo de diodo (DAD)

(b) HPLC SEMI-Preparativa NovaPrep® 8000 com ControladorPC Remoto usando Aplicativo LC ReSponder®

(c) Detector de UV Hitachi L-7400

(d) Detector de espalhamento de luz por evaporação Sedex 55 (ELSD)

(e) Coluna de sílica 75L Biotage (KP-Sil; P/N FKO-1107-19073;Lote 027075L)

(f) Coluna C18 75L Biotage (Bakerbond, 40 μ)(g) Coluna C18 75S Biotage (Vydac, 40 μ)

(h) Coluna de HPLC analítica: Phenomenex Luna C18, 3 μ, 4,6 χ IOOmm

(i) Coluna de HPLC Semipreparativa: Coluna de HPLC Pheno-menex Luna C8, 20 χ 250 mm

(j) Coluna de HPLC Semipreparativa: coluna de HPLC YMC AQC18, 21,2 χ 250 mm; e

(k) Coluna de HPLC preparativa: coluna de HPLC Preparativa

ES Industries C18; 5 χ 25 cm.

O método analítico utilizado para determinar a pureza do com-posto 6 é como segue:

<table>table see original document page 62</column></row><table>

Este método foi usado para a análise do extrato, frações e pro-duto final. O Composto 6 elui em cerca de 5,5 minutos sob essas condições.

50 g de extrato de cohosh preto bruto ("BCE") foram fracionadosem um cartucho de Sílica Biotage (7,5 χ 30 cm). Após carregamento, o car-tucho foi eluído com MeOH a 5%/DCM (10 L) e MeOH a 10%/DCM (5L) efrações de 500 mL foram coletadas. A taxa de fluxo era 150-200 ml/min. AHPLC (UV a 230 nm) revelou que o composto 6 estava presente em frações23 (2,6 g) e 24 (2,3 g). A fração 23 (F23) foi selecionada para purificaçãoadicional em uma coluna semi-prep C8.

Dez séries foram realizadas para se obter aproximadamente 10mg de composto 6. 50 mg de F23 em 0,3 ml de MeOH foram carregados emuma coluna semi-prep Phenomenex Luna C-8 (21,2 χ 125 mm, 10 μ, 100A).A coluna foi eluída em uma taxa de fluxo de 9,9 mL/min com MeOH a 70%em H2O com monitoramento com UV a 205 nm. Os picos eluindo em 35 mi-nutos e 38 minutos conforme mostrado em traço de HPLC semi-prep (Figura8) foram separadamente coletados.

As frações coletadas para o pico em 35 min das 10 séries foramagrupadas e solventes evaporados em temperatura ambiente. Os sólidosresultantes foram secos em um Iiofilizador para dar 10,3 mg de composto 6(2609-165-7). A HPLC (Figura 9) do produto 2609-165-7 revelou um pico deimpureza polar (11,3%) com tempo de retenção (RT) em 4,5 minutos, embo-ra o HPLC de frações individuais tenha mostrado apenas o pico principal(Figura 10). Aparentemente o composto 6 converteu lentamente durante oprocesso para um composto mais polar. Foi verificado que o composto maispolar era o derivado de desacetil de composto 6 conforme evidente a partirde SSI-MS que mostrou um pico de [M+Na]+ em m/z 643 (Figura 11) e RMNde próton (Figura 12) da impureza isolada em 4,5 minutos onde o singletopara a metil acetila estava ausente.

Alguns experimentos de estabilidade com o composto 6 indica-ram que desacetilação aconteceu em solução de MeOH que é levementebásica. No entanto, ela era estável em solução levemente ácida. Deste mo-do, 2609-165-7 foi reprocessado em uma coluna Luna C8 usando MeOH a70%/água a 30% contendo AcOH a 0,05% como eluente para dar 3,4 mg decomposto 6 (2609-172-11). Um cromatograma de HPLC de 2609-172-11 émostrado na Figura 13. O RMN de próton (em CD3OD) e SSI-MS são mos-trados nas Figuras 14 e 15.

Em um outro processo, 250 g de extrato de cohosh preto (BCE)foram agitados com 1250 mL de MeOH por 1 hora em temperatura ambienteem um béquer. Nem todos os sólidos dissolveram mas análise de HPLC deum filtrado indicou que todo o composto 6 no extrato de partida dissolveu(-250 mg). Não obstante a mistura não-filtrada foi adicionada a 750 g de síli-ca-gel (ICN, 60-200 μ) em um frasco de fundo redondo de 5 L. O MeOH foiremovido no rotovap com o auxílio de vácuo para um pó seco pesando 1100g com MeOH residual a 9%.

O BCE seco em preparação de sílica foi dividido em quatro par-tes de aproximadamente 270 g cada. A mistura foi carregada no SIM e pri-meiro lavada com 500-600 mL de cloreto de metileno para remover não-polares e MeOH residual. O SIM foi conectado para a coluna de sílica 75L(KP-Sil; P/N FK0-1107-19073; Lote 027075L; 7,5 χ 25 cm ou 1750 mL). Acoluna principal foi comprimida radial a 413,68 kPa (60 psi). O sistema foieluído com acetona em uma taxa de fluxo de quantidade de 100 mL/min efrações de 500-1000 mL foram coletadas. Após a eluição de composto 6 acoluna foi lavada com 1,0 L de MeOH e reequilibrada com 2 L de acetona. Ocomposto 6 foi observado eluir principalmente na Fração 3 (1000 mL) apósaproximadamente 900-1000 mL de acetona terem eluído da coluna nas Fra-ções 1 e 2. As primeiras quatro séries deram aproximadamente 224 mg decomposto 6. Uma segunda batelada de material de partida para a sílica Bio-tage foi preparada a partir de 100 g de BCE e 500 mL de MeOH e 300 g desílica. Duas séries de Biotage adicionais (5 e 6) foram feitas similar às pri-meiras quatro com este material de partida dando mais outros 93 mg decomposto 6. Os grupos de produto das seis séries foram combinados e eva-porados para um sólido seco sob pressão reduzida.

Os sólidos secos (90 g) da sílica Biotage foram dissolvidos em720 mL de MeOH e 480 mL de H2O foram adicionados lentamente com agi-tação. Alguns sólidos tipo piche escuros precipitaram e foram removidos emum filtro. O filtrado nebuloso foi carregado em uma coluna C18 Biotage 40 μ,Bakerbond 60 Á, 75 L (7,5 χ 25 cm). Após o carregamento, que testou nega-tivo do composto 6, a coluna foi lavada com 5 L de Me0H/H20 a 60% (v/v)seguido por 4 L de MeOH a 70%/H2O e então composto 6 eluído usando 4 Lde MeOH a 80%/H20. Após a eluição a coluna foi lavada com 2 L de MeOH.

A taxa de fluxo era cerca de 60 mL/min o tempo todo e as fases móveis deMe0H/H20 continham ácido acético a 0,05% a fim de prevenir a degradaçãodo composto 6. O pool de produto (4L) foi concentrado sob pressão reduzidaaté essencialmente todo o MeOH ser removido e os sólidos precipitados re-sultantes coletados em um funil Buchner e secos como auxílio de vácuo altoem temperatura ambiente.

Os sólidos tipo piche removidos através de filtragem da primeirapreparação alimentada de C18 de grande escala e contendo cerca de 32 mgde composto 6 foram dissolvidos em 2 L de lavagem de MeOH a partir doexperimento de grande escala e que continha cerca de 22 mg de Composto6. A mistura foi evaporada para 1L e misturada com 0,67 L de água. Algunssólidos tipo piche precipitaram, os quais foram coletados em um filtro, dissol-vidos em 200 mL de MeOH e misturados com 134 mL de água. Esta misturafoi também filtrada para remover uma pequena quantidade de piche e o fil-trado combinado com o primeiro filtrado e carregado em uma coluna C18Biotage 40 μ, 300 Á, Vydac 72S (7,5 χ 9,0 cm; 400 mL). A coluna foi lavadacom 1L de MeOH a 60%/H20 e 2 L de MeOH a 70%/H20 e eluída com 1 Lde MeOH a 80%/H20 (fases móveis também continham ácido acético a0,05%). O pool de produto foi evaporado e os sólidos coletados através defiltragem similar ao experimento Biotage de grande escala.

O primeiro pool de produto (16,69 g) da coluna Biotage C18 foimisturado com 70 mL de MeOH. A mistura foi sonificada e o precipitado foiremovido através de filtragem. O filtrado foi cromatografado (cinco séries, 14mL cada) em uma coluna ES Industries Chromegabond WR C18 em umataxa de fluxo de 177 mL/min usando MeOH a 70%/água a 30% contendoAcOH a 0,05% como eluente. As frações dos 6-14 minutos de cada sérieforam combinadas e evaporadas para remover MeOH. O precipitado apósremoção de MeOH foi coletado através de centrifugação e seco em um Iiofi-Iizador para dar 6,6 g de sólidos secos 2609-173-16 (composto 6, 3,2%).

O segundo pool de produto (4,3 g) da coluna Biotage C18 foiprocessado de maneira similar para dar 2,0 g de sólidos secos 2609-173-27(composto 6, 3,06%). 2609-173-16 e 1609-176-27 foram combinados paradar 8,6 g de 2609-174-6.

2609-174-6 (400 mg) foi dissolvido em 1,3 mL de MeOH conten-do AcOH a 0,1%. A solução foi carregada em uma coluna Phenomenex Lu-na C8 que foi eluída em taxa de fluxo de 24 mL/min com MeOH a 68%/águaa 32% contendo AcOH a 0,05%.

Baseado em HPLC analítica, as frações de 15,8 e 19,8 minutosde cada série (total de 22 séries) foram combinadas, evaporadas para remo-ver MeOH e Iiofilizadas até secar para dar 2609-174-28 (1,4 contendo 12,6%de composto 6). 2609-174-28 foi usado para o isolamento final do composto6 em uma coluna C18 YMC-AQ. Um total de 28 séries foi realizado.

2609-174-28 (50 mg) foi dissolvido em 0,25 mL de MeOH con-tendo AcOH a 0,1%. A solução foi injetada na coluna C18 YMC AQ. A colu-na foi eluída a 9,9 mLVmin com MeOH a 70%/água a 3-% contendo AcOH a0,05%. Com base em perfis analíticos, frações selecionadas, tipicamenteentre 48,4-50,4 minutos, das 28 séries foram agrupadas, evaporadas e Iiofili-zadas para dar o composto 6 (2609-17-30, 85 mg).

As frações que foram coletadas imediatamente antes de 48,4minutos e continham principalmente composto 6 foram também combinadas,e secas para dar 2609-176-35 (50 mg). 2609-176-35 foi reprocessado (3 sé-ries) usando a mesma coluna e fase móvel para dar um outro lote de com-posto 6 que foi combinado com 2609-176-30 para dar 102 mg de produto(2609-177-10) com -95% de pureza de cromatografia. Cromatogramas deHPLC (UV a 205, 230 nm e ELSD) e espectro de RMN de próton do com-posto 6 (2609-176-10) são também mostrados nas Figuras 16, 17, 18 e 19,respectivamente. A RMN de próton de 2609-176-10 estava de acordo comaquela de uma amostra padrão do composto 6. A SSI-MS do composto 6(Figura 20) mostrou um pico de [M+Na]+ intenso em m/z 685 de acordo coma fórmula molecular C37H58O10 do composto 6.

Ensaios Biológicos

A. Ensaio para Determinar a Habilidade de um Composto da Fórmula I emInibidor Αβ-42

Compostos da presente invenção, e extratos compreendendo osditos compostos, podem ser ensaiados como inibidores de peptídeo beta-amilóide (1-42) in vitro ou in vivo. Tais métodos de ensaio são descritos emdetalhes na Patente U.S. 6.649.196, cuja totalidade é aqui incorporada atítulo de referência.

Os compostos da presente invenção foram verificados diminuirseletivamente o peptídeo beta-amilóide (1-42) de acordo com o ensaio ba-seado em célula realizado substancialmente da mesma maneira que a des-crita na US 6.649.196.

Β. Ensaio para Determinar a Habilidade de um Composto da Fórmula I emAfetar a Razão de AB Total

Os compostos da presente invenção foram ensaiados para de-terminar seu efeito sobre a razão total de peptídeo amilóide-β (1-42) in vitrousando um protocolo de ensaio substancialmente similar àquele descrito porWang e outros, J. BioL Chem., 50:31894-31902, The Perfil of Soluble Am-yloid β Protein in Cultured Cell Media, cuja totalidade é aqui incorporada atítulo de referência. Este ensaio quantifica proteína β-amilóide usando imu-noprecipitação e espectrometria de massa (IP-MS). Usando o composto 6para exemplificar, foi verificado que este composto reduziu o peptídeo β-amilóide (1-42), enquanto aumentando o peptídeo β-amilóide (1-37) e peptí-deo β-amilóide (1 -39). Esses resultados são mostrados na Figura 21.

O composto 6 foi também ensaiado de acordo com o métododescrito em Wang e outros, em células 7W (APPwt) e células 7PA2(APPV717f). As mutações em APP717 aumentam a quantidade relativa de pep-tídeo β-amilóide (1-42). Neste ensaio, foi mostrado que o composto 6 reduzo peptídeo β-amilóide (1-42) enquanto aumentando o peptídeo β-amilóide (1-39). Esses resultados são mostrados na Figura 22.

Embora tenham sido descritas várias modalidades da presenteinvenção, é aparente que os exemplos básicos da requerente podem seralterados para prover outras modalidades que utilizam os compostos e mé-todos da presente invenção. Deste modo, será compreendido que o escopoda presente invenção deve ser definido pelas reivindicações apensas ao in-vés das modalidades específicas que foram representadas a título de exemplo.

Claims

1.- Composto da fórmula I: <formula>formula see original document page 68</formula> ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que:cada um do Anel A, Anel B, Anel C, Anel D e Anel E é independentementesaturado, parcialmente insaturado ou aromático;G é S1 CH2, NR ou O;R1 e R2 são cada um independentemente halogênio, R, OR, umgrupo hidroxila adequadamente protegido, SR, um grupo tiol adequadamen-te protegido, N(R)2 ou um grupo amino adequadamente protegido, ou R1 eR2 são tomados juntos para formarem um anel de 3-7 membros saturado,parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;cada R é independentemente hidrogênio, um grupo CrC6 alifáti-co opcionalmente substituído ou um anel de 3-8 membros saturado opcio-nalmente substituído, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-4 heteroáto-mos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre,em que:dois R no mesmo átomo de nitrogênio são opcionalmente toma-dos juntos com o dito átomo de nitrogênio para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 1 -4 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;η é 0-2;R3, R4, R7 e R8 são cada um independentemente selecionadosde halogênio, R, OR, um grupo hidroxila adequadamente protegido, SR, umgrupo tiol adequadamente protegido, SO2R, OSO2R, N(R)2, um grupo aminoadequadamente protegido, NR(CO)R, NR(CO)(CO)R, NR(CO)N(R)2,NR(CO)OR, (CO)OR, O(CO)R1 (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;m é 0-2;R5 é T-C(R1)3, T-C(R1)2C(Rn)3, R1 OR, um grupo hidroxila ade-quadamente protegido, SR, um grupo tiol adequadamente protegido, SO2R1OSO2R, N(R)2, um grupo amino adequadamente protegido, NR(CO)R,NR(CO)(CO)R1 NR(CO)N(R)2, NR(CO)OR1 (CO)OR1 O(CO)R, (CO)N(R2) ouO(CO)N(R)2, ou;quando R5 for T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(R11)3, então R6 e um grupoR1 em R5 são opcionalmente tomados juntos para formarem um anel de 3-8membros saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomosindependentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre;cada T é independentemente uma ligação de valência ou umacadeia C1-6 alquilideno, saturada ou insaturada, opcionalmente substituídareta ou ramificada, em que até duas unidades metileno de T são opcional eindependentemente substituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou-S(O)2-;cada R1 e R" é independentemente selecionado de R, OR, SR1SO2R1 OSO2R1 N(R)2l NR(CO)R1 NR(CO)(CO)R1 NR(CO)N(R)2l NR(CO)OR1(CO)OR1 O(CO)R1 (CO)N(R2) ou O(CO)N(R)2;R6 é halogênio, R1 OR1 SR1 SO2R1 OSO2R, N(R)2l NR(CO)R1NR(CO)(CO)R1 NR(CO)N(R)2l NR(CO)OR1 (CO)OR1 O(CO)R1 (CO)N(R)2 ouO(CO)N(R)2;R9 e R9 são cada um independentemente selecionados de halo-gênio, R, OR, SR ou N(R)2 ou R1 e R2 são tomados juntos para formaremum anel de 3-7 membros, saturado, parcialmente insaturado ou arila tendo0-2 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênioou enxofre;Q é uma ligação de valência ou uma cadeia Ci-6 alquilideno, sa-turada ou insaturada, opcionalmente substituída reta ou ramificada em queaté duas unidades metileno de Q são opcionalmente e independentementesubstituídas por -O-, -N(R)-, -S-, -C(O)-, -S(O)- ou -S(O)2-; eR10 é R1 um grupo hidroxila adequadamente protegido, um grupotiol adequadamente protegido, um grupo amino adequadamente protegido,um anel opcionalmente substituído de 3-8 membros saturado, parcialmenteinsaturado ou arila monocíclico tendo 0-4 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, um anel opcionalmentesubstituído de 8-10 membros saturado, parcialmente insaturado ou arila bicí-clico tendo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogê-nio, oxigênio ou enxofre, uma porção detectável, um resíduo de polímero,um peptídeo ou uma porção contendo açúcar ou tipo açúcar,contanto que o dito composto seja outro que não:

2. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que:G é O; eR1 e R2 são cada um independentemente R ou OR.

3. - Composto de acordo com a reivindicação 2, em que R1 e R2são cada um independentemente R em que R é hidrogênio ou um grupo Ci-6alifático opcionalmente substituído.

4. - Composto de acordo com a reivindicação 2, em que R1 e R2são tomados juntos para formarem um anel de 3-6 membros saturado, par-cialmente insaturado ou arila tendo 0-2 heteroátomos independentementeselecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.

5. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que:R5 é T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(Ru)3;cada T é independentemente uma ligação de valência ou umacadeia Ci-4alquilideno reta ou ramificadaem que uma unidade metileno de T é opcionalmente substituídapor -O-, -N(R)- ou -S-; ecada R1 e R" é independentemente R, OR1 OC(O)R, SR ouN(R)2.

6.- Composto de acordo com a reivindicação 5, em que R5 é T-C(R1)3 ou T-C(R1)2C(R11)3 e R6 e um grupo R1 em R5 são tomados juntos paraformarem um anel de 5-7 membros saturado tendo 1 -2 heteroátomos inde-pendentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.

7.- Composto de acordo com a reivindicação 6, em que o ditocomposto é da fórmula Ita ou llb:

8.- Composto de acordo com a reivindicado 1, em que:Q é uma cadeia Ci.2 alquilideno, saturada ou insaturada, opcio-nalmente substituída reta ou ramificada em que até uma unidade metilenode Q é opcionalmente substituída por -O-, -N(R)- ou -S-; eR10 é um glicosídeo.

9.- Composto de acordo com a reivindicação 8, em que Q é -O- eR10 é um arabinopiranosídeo ou xilopiranosídeo.

10.- Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditoou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

11. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditocomposto é da fórmula l-b ou l-c:<formula>formula see original document page 72</formula>ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

12. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditocomposto é da fórmula Il ou ll-a:<formula>formula see original document page 72</formula>ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

13. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditocomposto é da fórmula IV:<formula>formula see original document page 72</formula>ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

14. - Composto de acordo com a reivindicação 13, em que o ditoou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

15.- Composto de acordo com a reivindicação 14, em que R1 eR2 são tomados juntos para formarem um anel carbocíclico saturado de 3-6membros e R7 é -OH.

16.- Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditocomposto é selecionado de: <formula>formula see original document page 73</formula>

17.- Composto de acordo com a reivindicação 13, em que o ditocomposto é selecionado de: <formula>formula see original document page 73</formula>

18. - Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o ditocomposto é substancialmente livre de outros compostos presentes em raizde cohosh preta.

19. - Composto de acordo com a reivindicação 18, em que o ditocomposto é substancialmente livre de um ou mais de acteol, acetilacteol, 26-desoxiacteol, cimigenol, acteína, 26-desoxiacteína e cimicifugosida.

20. - Composição compreendendo um composto como definidona reivindicação 1, e um veículo ou adjuvante ou farmaceuticamente aceitável.

21. - Composição compreendendo um composto como definidona reivindicação 18, e um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

22. - Extrato de raiz de cohosh preta em que o dito extrato com-preende pelo menos 10% em peso de um composto como definido na rei-vindicação 1.

23. - Extrato de acordo com a reivindicação 21, em que o dito ex-trato compreende de a partir de cerca de 10% em peso a cerca de 50% empeso de um composto como definido na reivindicação 1.

24. - Método para inibição de produção de peptídeo beta-amilóideem um paciente, em que o dito método compreende administração ao ditopaciente de uma composição como definida na reivindicação 20.

25. - Método para inibição de produção de peptídeo beta-amilóide(1-42) em um paciente, em que o dito método compreende administrar aodito paciente uma composição como definida na reivindicação 21.

26. - Método de acordo com a reivindicação 26, em que os níveisde peptídeo beta-amilóide (1-42) são reduzidos e os níveis do peptídeo beta-amilóide (1-40) não são substancialmente reduzidos.

27. - Método de acordo com a reivindicação 26, em que o nível depelo menos um de beta-amilóide (1-37) e beta-amilóide (1-39) é aumentado.

28. - Método para tratamento ou diminuição da severidade de umdistúrbio associado com peptídeo beta-amilóide (1-42), em que o dito méto-do compreende administrar a um paciente uma composição como definidana a reivindicação 20.

29.

30.- Método de acordo com a reivindicação 29, em que o dito dis-túrbio é doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou síndrome de Down.

31.- Método para redução dos níveis de peptídeo beta-amilóide(1-42) em um paciente, em que o dito método compreende administrar aodito paciente uma composição como definido na reivindicação 20.

32.- Método para redução dos níveis de peptídeo beta-amilóide(1-42) em uma célula compreendendo contato da dita célula com um com-posto como definido na reivindicação 1.