BRPI0611540A2

BRPI0611540A2 - terapia de gene para distúrbios de espinha dorsal

Info

Publication number: BRPI0611540A2
Application number: BRPI0611540-3A
Authority: BR
Inventors: James Dodge; Lamya Shihabuddin; Marco A Passini; Seng H Cheng
Original assignee: Genzyme Corp
Priority date: 2005-05-02
Filing date: 2006-05-02
Publication date: 2010-09-21
Also published as: IL187023A0; JP6887008B2; PT1879623E; EP1879623A2; MX2007013734A; WO2006119341A2; CA2606490C; PL1879623T3; JP5766389B2; DK1879623T3; ES2394482T3; IL237658A0; JP2020050660A; JP2013082731A; WO2006119341A3; JP2015163613A; EP1879623B1; CA2606490A1; JP2008540435A; AU2006242129A1

Abstract

TERAPIA DE GENE PARA DISTúRBIOS DE ESPINHA DORSAL. A presente invenção refere-se a métodos e composições para tratar distúrbios ou lesões que afetam a função motora e controle em um indivíduo. Em um aspecto, a invenção fornece um método para liberar um transgene à espinha dorsal de um indivíduo administrando um vetor viral neurotrópico recombinante contendo o transgene. O vetor viral libera o transgene a uma região da região dos núcleos cerebelares profundos do cérebro. Também fornecidos são composições e métodos para liberar um transgene à espinha dorsal de um indivíduo administrando um vetor viral neurotrópico recombinante contendo o transgene à região do córtex motor do cérebro do indivíduo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TERAPIA DEGENE PARA DISTÚRBIOS DE ESPINHA DORSAL".

Este pedido de patente reivindica prioridade sob 35 U. S. C. §119(e) para o Pedido Provisório US N2 60/677.213, depositado em 2 de maiode 2005, e Pedido de patente Provisório US Ne 60/790.217, depositado em 8de abril de 2006, os conteúdos dos quais são aqui incorporados por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se às composições e métodos paratratar distúrbios que afetam a função motora de um sujeito e em particular,função motora afetada por doença ou lesão ao cérebro e/ou espinha dorsal.

Antecedentes da Invenção

Terapia de gene é uma modalidade de tratamento emergentepara distúrbios que afetam o sistema nervoso central (CNS). Terapia de ge-ne do CNS foi facilitada pelo desenvolvimento de vetores virais capazes deinfetar eficazmente neurônios pós-mitóticos. O sistema nervoso central écomposto da espinha dorsal e do cérebro. A espinha dorsal leva informaçãosensória do sistema nervoso periférico para o cérebro e leva informação mo-tora do cérebro para vários efetores. Para uma revisão de vetores virais paraliberação de gene para o sistema nervoso central, vide Davidson et al. (2003)Nature Rev. 4:353-364.

Vetores associados a adenovírus (AAV) são considerados úteispara terapia de gene do CNS porque eles têm um perfil de toxicidade e deimunogenicidade favorável, são capazes de transduzir células neuronais esão capazes de mediar expressão a longo prazo no CNS (Kaplitt et al. (1994)Nat. Genet. 8:148-154; Bartlett et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1181-1186; ePassini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6446).

Uma propriedade útil dos vetores de AAV encontra-se na habili-dade de alguns vetores de AAV de sofrer transporte retrógrado e/ou anteró-grado em células neuronais. Neurônios em uma região do cérebro são inter-conectados por axônios às regiões do cérebro distais assim provendo umsistema de transporte para liberação de vetor. Por exemplo, um vetor de AAVpode ser administrado no ou próximos dos terminais dos axônios dos neurô-nios. Os neurônios interiorizam o vetor de AAV e o transportam de uma ma-neira retrógrada ao longo do axônio para o corpo celular. Propriedades simi-lares de adenovírus, HSV1 e vírus de pseudorraivas foram demonstradasliberar genes para as estruturas distais dentro do cérebro (Soudas et al.(2001) FASEB J. 15:2283-2285; Breakefield et al. (1991) New BioL 3:203-218; e deFalco et al. (2001) Science, 291 :2608-2613).

Vários grupos relataram que a transdução do cérebro por soroti-po de AAV 2 (AAV2) é limitado ao sítio de injeção intracraniano (Kaplitt et al.(1994) Nat. Genet. 8:148-154; Passini et al. (2002) J. Neurosci. 22:6437-6446; e Chamberlin et al. (1998) Brain fíes. 793:169-175). Recentes relató-rios sugerem que transporte axonal retrógrado dos vetores virais neurotrópi-cos pode também ocorrer em circuitos seletos do cérebro de rato normal(Kaspar et al. (2002) Mol. Ther. 5:50-56 (vetor de AAV); Kasper et al. (2003)Science 301:839-842 (vetor lentiviral) e Azzouz et al. (2004) Nature 429:413-417 (vetor lentiviral). Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph etal. (2005) Nat. Med. 11(4):429-433 relatam que injeção intramuscular de Ien-tivírus expressam RNA de interferência de superóxido dismutase de Cu/Znhumano (SOD1) retardou o princípio da doença de esclerose lateral amiotró-fica (ALS) em um modelo roedor terapeuticamente relevante de ALS.

Células transduzidas por vetores de AAV podem expressar umproduto de transgene terapêutico, como uma enzima ou um fator neurotrófi-co, para mediar os efeitos benéficos intracelularmente. Estas células podemtambém segregar o produto de transgene terapêutico, que pode ser subse-qüentemente absorvido por células distais onde podem mediar seus efeitosbenéficos. Este processo foi descrito como correção cruzada (Neufeld et al.(1970) Science 169:141-146).

Porém, uma necessidade ainda existe por composições e méto-dos para tratar disfunção da espinha dorsal que resulta em perda da funçãomotora em pacientes humanos. Esta invenção satisfaz esta necessidade efornece vantagens relacionadas também.

Sumário da Invenção

Esta invenção fornece métodos e composições para liberar umtransgene à espinha dorsal e / ou à região do tronco cerebral de um sujeitoadministrando um vetor viral neurotrópico recombinante contendo o transge-ne a pelo menos uma região da região dos núcleos cerebelares profundos(DCN) do cérebro do sujeito. A liberação viral está sob condições que favo-recem expressão do transgene na espinha dorsal e / ou na região do troncocerebral.

Em outro aspecto, a invenção fornece métodos e composiçõespara liberar um transgene à espinha dorsal de um sujeito administrando umvetor viral neurotrópico recombinante contendo o transgene à região do cór-tex motor do cérebro do sujeito. A liberação do vetor viral está sob condiçõesque favorecem expressão do transgene na espinha dorsal. Vetores viraisadministrados à região do córtex motor são interiorizados através de neurôniosmotores por meio de sua região do corpo celular e o transgene é expressado.

O transgene expresso pode depois sofrer transporte anterógrado para a por-ção terminal de axônio do neurônio motor, que está presente na espinhadorsal. Devido à natureza do córtex motor, vetores virais administrados aesta região do cérebro podem também ser interiorizados por terminais dosaxônios de neurônios motores. O vetor viral também pode sofrer transporteretrógrado ao longo do axônio do neurônio motor e ser expressado no corpocelular do neurônio motor.

Também fornecidos são composições e métodos para liberar umtransgene a um neurônio motor em um sujeito administrando um vetor viralneurotrópico recombinante contendo o transgene a pelo menos uma regiãoda região dos núcleos cerebelares profundos do cérebro do sujeito. A Iibera-ção do vetor está sob condições que favorecem expressão do transgene emum neurônio motor distai para o sítio de administração.

Também fornecidos são métodos e composições para liberar umtransgene a um neurônio motor em um sujeito administrando um vetor viralneurotrópico contendo o transgene à região do córtex motor do cérebro dosujeito e em que a administração está sob condições que favorecem expres-são do transgene em um neurônio motor distai ao sítio de administração.

Em um aspecto alternado, a invenção fornece composições emétodos para tratar um distúrbio de neurônio motor em um sujeito adminis-trando um vetor viral neurotrópico recombinante contendo um transgene te-rapêutico a pelo menos uma região da região dos núcleos cerebelares pro-fundos do cérebro do sujeito. Administração é feita sob condições que favo-recem expressão do transgene em uma quantidade terapeuticamente eficazem pelo menos uma subdivisão da espinha dorsal e / ou na região do troncocerebral.

Em ainda um aspecto adicional, a invenção fornece composi-ções e método para melhorar os sintomas de um distúrbio de neurônio motorem um sujeito administrando um vetor viral neurotrópico recombinante con-tendo o transgene terapêutico à região do córtex motor do cérebro do sujeitoe sob condições que favorecem expressão do transgene em uma quantidadeterapeuticamente eficaz em pelo menos uma subdivisão da espinha dorsal eou da região do tronco cerebral.

É para ser entendido que tanto a descrição geral anterior como adescrição detalhada a seguir são exemplares e explicativas apenas e nãosão restritivas da invenção como reivindicada.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um esquemático de como o DCN poderia ser usadopara transportar vírus terapêutico à espinha dorsal. Linhagens que originamdentro da caixa preta que esboça o DCN representam terminais dos axôniosque originam de corpos celulares (pontas da flecha) localizados dentro daespinha dorsal.

A figura 2 é uma reprodução de uma seção transversal histológi-ca através da junção de ponto-medular e cerebelo, mostrando as três regi-ões do DCN.

A figura 3 é uma vista esquemática do cerebelo que foi cortadoao longo da linhagem do verme (seção sagital) e depois aplainado, comotambém uma seção horizontal através da espinha dorsal e uma representaçãoda musculatura esquelética. Ela mostra as vias aferentes principais (entrada).

A figura 4 é um diagrama mostrando as vias eferentes principais(saídas) do DCN.A figura 5 esquematicamente mostra os circuitos neurais no cór-tex cerebral, ligando as entradas às saídas. As fibras trepadeiras originamna oliva inferior que recebe as entradas do córtex cerebral, espinha dorsal esentidos especiais (visuais e audíveis). Entradas de fibra musgosa originamde todos os outros aferentes como aferentes vestibulares, aferentes espi-nhais, fusos musculares, órgãos de tendão de golgi, receptores de articula-ção, receptores de pele e o córtex cerebral. Há também três tipos de inter-neurônios inibidores no sistema intrínseco, incluindo células de cesta, célu-las de golgi e células estreladas. Estes estão envolvidos na inibição lateral ena sintonia fina da função dos neurônios motores.

As figuras 2 a 5 são reproduzidas de Williams et al. (2005) TheHuman Brain: Capítulo 3: The Cerebellum, disponível no sítio de rede:www.vh.org/adult/provider/anatomy/BrainAnatomy/Ch3Text/Section07.html.

As figuras 6A a 6E mostram tingimento imunopositivos de esfin-gomielina de ácido humano ("hASM") em seções cerebelares sagitais se-guindo injeção de vetores de sorotipo de AAV diferentes [(A)2/1, (B)2/2,(C)2/5, (D)2/7 e (E)2/8] codificando para ASM humana nos núcleos cerebela-res profundos de camuhdongos de ASMKO.

As figuras 7A a 7E demonstram transporte de proteína de esfin-gomielina de ácido humano ("hASM") para a espinha dorsal dos núcleos ce-rebelares profundos. Este efeito foi observado em camundongos tratadoscom AAV2/2-ASM, AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM & AAV2/8-ASM (A) amplia-ção de 10X de hASM; (B) ampliação de 40X de hASM; (C) hASM confocal;

(D) ChAT confocal; e (E) hASM confocal & ChAT.

A figura 8 graficamente mostra níveis de homogeneizado de te-cido cerebelar seguindo injeção de vetores de sorotipo de AAV diferentes(2/1, 2/2, 2/5, 2/7 e 2/8) codificando para ASM humana nos núcleos cerebe-lares profundos (n=5/grupo). Grupos não conectados pela mesma letra sãosignificativamente (p < 0,0001) diferentes.

As figuras 9A a 9G mostram tingimento imunopositivos de cal-bindina em seções cerebelares sagitais seguindo injeção de vetores de soro-tipo de AAV diferentes [(A)2/1, (B)2/2, (C)2/5, (D)2/7 e (E)2/8] codificandopara ASM humana nos núcleos cerebelares profundos de camundongos de ASMKO.

As figuras 10A e 10B mostram desempenho de rotarod de acele-ramento e de oscilação (em 14 semanas de idade) em camundongos deASMKO (injetados com AAV-Pgal), WT e de ASMKO tratado com AAV-ASM(n=8/grupo). Grupos não conectados pela mesma letra são significativamen-te diferentes. Camundongos injetados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASMdemonstraram uma latência significativamente mais longa (p < 0,0009) paracair que os camundongos de ASMKO injetados com AAV2/1-PgaI no testede rotarod de aceleração. Para o teste de rotarod de oscilação, camundon-gos injetados com AA2/1-ASM demonstraram uma latência significativamen-te mais longa (p < 0,0001) para cair que os camundongos injetados comAA V2/1-PgaI.

As figuras 11A e 11B mostram desempenho de rotarod em camun-dongos de ASMKO (n=8), WT (n=8) e bilateralmente tratados com AAV-ASM(n=5/grupo) (em 20 semanas de idade). Para teste tanto de aceleração co-mo de oscilação, camundongos tratados com AAV-ASM desempenharam-sesignificativamente melhor (p < 0,001) que camundongos de ASMKO tratadoscom AAV2/1-Pgal. Desempenho de camundongos injetados com AAV2/1-ASMfoi indistinguível de camundongos do tipo selvagem em ambos os testes deaceleração e oscilação.

Figura 12A ilustra as conexões entre as regiões dos núcleos ce-rebelares profundos (mediana, interposta e lateral) e as regiões da espinhadorsal (cervical, torácica, lombar, e sacra). Figura 12B ilustra as conexõesentre as regiões dos núcleos cerebelares profundos (mediana, interposta elateral) e as regiões do tronco cerebral (cérebro médio, pons e medula). Asconexões são representadas por setas que iniciam na região do corpo celu-lar de um neurônio e termina na região terminal de axônio do neurônio. Porexemplo, as três regiões do DCN cada uma tem neurônios com corpos celu-lares que enviam axônios que terminam na região cervical da espinha dorsalenquanto a região cervical da espinha dorsal tiver corpos celulares que envi-am axônios que terminam nas regiões mediais ou interpostas do DCN.A figura 13 ilustra distribuição de proteína fluorescente verde notronco cerebral, ou neurônios motores superiores, seguindo liberação deDCN de AAV que codifica para proteína fluorescente verde (GFP).

A figura 14 ilustra distribuição de proteína fluorescente verde nasregiões da espinha dorsal seguindo liberação de DCN de AAV que codificapara proteína fluorescente verde (GFP).

A figura 15 ilustra a redução no tingimento da proteína acídicafibrilar glial (GFAP) no tronco cerebral seguindo liberação de DCN de AAVque codifica para IGF-1 quando comparada à liberação de DCN de AAV quecodifica para GFP.

A figura 16 ilustra a redução no tingimento da proteína acídicafibrilar glial (GFAP) dentro dos núcleos oromotores (núcleo trigeminal, núcleohipoglossal e núcleo facial) seguindo liberação de DCN de AAV que codificapara IGF-1 quando comparada à liberação de DCN de AAV que codifica para GFP.

A figura 17 ilustra a redução no tingimento da proteína acídicafibrilar glial (GFAP) ao longo da espinha dorsal seguindo liberação de DCNde AAV que codifica pára IGF-1 quando comparada à liberação de DCN deAAV que codifica para GFP.

A figura 18 ilustra a distribuição de mRNA de IGF-1 dentro dosistema nervoso central (CNS) seguindo liberação de DCN de AAV que codi-fica para IGF-1 quando comparada à liberação de DCN de AAV que codificapara GFP. Beta-actina é usada como um controle positivo para compararníveis de mRNA total.

A figura 19 ilustra que liberação de DCN de AAV-IGF-1 promo-veu a sobrevivência dos neurônios motores. A diferença entre camundongostratados com AAV codificando para IGF-1 quando comparada à liberação deDCN de AAV que codifica para GFP é estatisticamente significativa para umvalor ρ = 0,01 como indicado pelo asterisco.

A figura 20 ilustra as melhorias funcionais no desempenho derotarod, resistência ao aperto de membro traseiro, e resistência ao aperto demembro dianteiro em camundongos tratados com liberação de DCN de AAVque codifica para IGF-1 quando comparada à liberação de DCN de AAV quecodifica para GFP.

A figura 21 ilustra o aumento na sobrevivência mediada por libe-ração de DCN de AAV que codifica para IGF-1 quando comparada à Iibera-ção de DCN de AAV que codifica para GFP.

A figura 22 mostra distribuição de GFP dentro do cérebro de ca-mundongo seguindo liberação bilateral de um vetor de expressão de GFP deAAV1 aos núcleos cerebelares profundos (DCN). Além do DCN, tingimentopositivo de GFP também foi observado nos bolbos olfatórios, córtex cerebral,tálamo, tronco cerebral, córtex cerebelares e espinha dorsal. Todas destasáreas ou recebem projeções e/ou enviaram projeções ao DCN.

Descrição Detalhada da Invenção

A fim de que a presente invenção possa ser entendida mais facil-mente, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são expos-tas ao longo da descrição detalhada.

A prática da presente invenção empregará, a menos que do contrá-rio indicado, técnicas convencionais de imunologia, biologia molecular, microbi-ologia, biologia celular e DNA recombinante que estão dentro da habilidade datécnica. Vide, por exemplo, Sambrook, Fritsch e Maniatis, MOLECULARCLONING: A LABORATORY MANUAL, 2â edição (1989); CURRENT PRO-TOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)); asérie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: APRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor,eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORYMANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R.l. Freshney, ed. (1987)).

Como usado no relatório descritivo e nas reivindicações, a formasingular "um", "uma" e "o/a" inclui referências plurais a menos que o contextodite claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui umapluralidade de células, incluindo suas misturas.

Como aqui usado, o termo "compreendendo" é intencionado signi-ficar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, masnão excluindo outros. "Consistindo essencialmente em" quando usado paradefinir composições e métodos, significará excluindo outros elementos dequalquer significação essencial à combinação. Desse modo, uma composi-ção consistindo essencialmente nos elementos como definidos aqui não ex-cluiria contaminantes de traço do método de isolamento e de purificação eveículos farmaceuticamente aceitáveis, como solução salina tamponada defosfato, conservantes, e similares. "Consistindo em" significará excluindomais que elementos de traço de similares ingredientes e etapas de métodosubstanciais para administrar as composições desta invenção. Modalidadesdefinidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopodesta invenção.

Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura,tempo, concentração, e peso molecular, incluindo faixas, são aproximaçõesque são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0,1. É para ser entendido,embora nem sempre explicitamente declarado, que todas as designaçõesnuméricas são precedidas pelo termo "cerca de". Isto é também para serentendido, embora nem sempre explicitamente declarado, que os reagentesdescritos aqui são meramente exemplares e que equivalentes de tais sãoconhecidos na técnica.

O termo "transgene" refere-se a um polinucleotídeo que é intro-duzido em uma célula e é capaz de ser transcrito no RNA e opcionalmente,transladado e/ou expresso sob condições apropriadas. Em um aspecto, eleconfere uma propriedade desejada a uma célula à qual foi introduzido, ou docontrário leva a um resultado terapêutico ou diagnóstico desejado. Em outroaspecto, pode ser transcrito em uma molécula que medeia interferência deRNA, como siRNA.

Os termos "partículas de genoma (gp)", ou "equivalentes de ge-noma", como usados em referência a uma titulação viral, referem-se ao nú-mero de vírions contendo o genoma de DNA de AAV recombinante, inde-pendente da infecciosidade ou funcionalidade. O número de partículas degenoma em uma preparação de vetor particular pode ser medido por proce-dimentos como descritos nos Exemplos aqui, ou, por exemplo, em Clark et ai.(1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther.,6:272-278.

Os termos "unidade de infecção (iu)", "partícula infecciosa" ou"unidade de replicação", como usados em referência a uma titulação viral,referem-se ao número de partículas infecciosas de vetor de AAV recombi-nante e competentes para replicação quando medidas pelo ensaio de centroinfeccioso, também conhecido como ensaio de centro de replicação, comodescrito, por exemplo, em McLaughIin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

O termo "unidade de transdução (tu)" como usado em referênciaa uma titulação viral, refere-se ao número de partículas infecciosas de vetor deAAV recombinante que resultam na produção de um produto de transgene fun-cional quando medidas em ensaios funcionais como descritos nos Exemplosaqui, ou por exemplo, em Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124; ouem Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (ensaio de LFU).

Os termos "terapêutico", "quantidade terapeuticamente eficaz" eseus cognatos referem-se àquela quantidade de um RNA, DNA ou produtode expressão de DNA e/ou RNA que resulta em prevenção ou retardo deprincípio ou melhora dos sintomas em um sujeito ou um conseguimento deum resultado biológico desejado, como correção de neuropatologia, por e-xemplo, patologia celular associada a uma doença neuronal motora comoALS. O termo "correção terapêutica" refere-se àquele grau de correção queresulta em prevenção ou retardo de princípio ou melhora dos sintomas emum sujeito. A quantidade eficaz pode ser determinada através de métodosempíricos conhecidos.

Uma "composição" é também intencionada abranger uma com-binação de agente ativo e similar veículo, por exemplo, composto ou compo-sição, inerte (por exemplo, um agente detectável ou marcação) ou ativo, co-mo um adjuvante, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solven-tes lipofílicos, conservante, adjuvante ou similares. Veículos também incluemexcipientes farmacêuticos e proteínas de aditivos, peptídeos, aminoácidos,lipídios e carboidratos (por exemplo, açúcares, incluindo monossacarídeos,di-, tri-, tetra- e oligossacarídeos; açúcares derivatizados como alditóis, áci-dos aldônicos, açúcares estereficados e similares; e polissacarídeos ou po-límeros de açúcar) que podem estar presentes isoladamente ou em combi-nação, compreendendo sozinho ou em combinação 1 -99,99 % em peso ouvolume. Excipientes de proteína exemplares incluem albumina de soro comoalbumina de soro humano (HSA), albumina humana recombinante (rHA),gelatina, caseína, e similares. Componentes de aminoácido/anticorpo repre-sentativos que podem também funcionar em uma capacidade de tampona-ção, incluem alanina, glicina, arginina, betaína, histidina, ácido glutâmico,ácido aspártico, cisteína, lisina, leucina, isoleucina, valina, metionina, fenila-lanina, aspartame, e similares. Excipientes de carboidrato são também in-tencionados dentro do escopo desta invenção, exemplos destes incluemmas não são limitados a monossacarídeos como frutose, maltose, galactose,glicose, D-manose, sorbose, e similares; dissacarídeos, como lactose, su-crose, trealose, celobiose, e similares; polissacarídeos, como rafinose, mele-zitose, maltodextrinas, dextranas, amidos, e similares; e alditóis, como mani-tol, xilitol, maltitol, lactitol, sorbitol de xilitol (glucitol) e mioinositol.

O termo veículo também inclui um tampão ou um agente de a-juste de pH; tipicamente, o tampão é um sal preparado de um ácido ou baseorgânicos. Tampões representativos incluem sais de ácido orgânico comosais de ácido cítrico, ácido ascórbico, ácido glucônico, ácido carbônico, ácidotartárico, ácido succínico, ácido acético, ou ácido ftálico; Tris, cloridrato de tro-metamina, ou tampões de fosfato. Veículos adicionais incluem excipien-tes/aditivos poliméricos como polivinilpirrolidonas, ficóis (um açúcar poliméri-co), dextratos (por exemplo, ciclodextrinas, como 2-hidroxipropila-.quadra-tura.-ciclodextrina), polietileno glicóis, agentes aromatizantes, agentes anti-microbianos, adoçantes, antioxidantes, agentes antiestáticos, tensoativos(por exemplo, polissorbatos como "TWEEN 20" e "TWEEN 80"), lipídios (porexemplo, fosfolipídeos, ácidos graxos), esteróides (por exemplo, colesterol),e agentes quelantes (por exemplo, EDTA).

Como aqui usado, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável"abrange quaisquer dos veículos farmacêuticos padrão, como uma soluçãosalina tamponada de fosfato, água, e emulsões, como um óleo/água ou e-mulsão de água/óleo, e vários tipos de agentes umectantes. As composiçõestambém podem incluir estabilizantes e conservantes e qualquer um dos veí-culos observados acima com a provisão adicional que eles são aceitáveispara o uso in vivo. Para exemplos de veículos, estabilizantes e adjuvantes,vide Martin REMINGTONS PHARM. SCI., ^5Ü Ed. (Mack Publ. Co., Easton(1975) e Williams & Williams, (1995), e ao nPHYSISICAN'S DESK REFE-RENCE', 52ã ed., Medicai Economics, Montvale, NJ. (1998).

Um "sujeito", "indivíduo" ou "paciente" é usado alternadamenteaqui que se refere a um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais pre-ferivelmente um humano. Mamíferos incluem, mas não são limitados a, mu-rinos, ratos, símios, seres humanos, animais de fazenda, animais desporti-vos, e animais de estimação.

Um "controle" é um sujeito ou amostra alternativa usada em umexperimento para propósito de comparação. Um controle pode ser "positivo"ou "negativo". Por exemplo, onde o propósito do experimento for determinaruma correlação de um nível de expressão alterado de um gene com um tipoparticular de patologia (vide ALS, por exemplo, infra), é em geral preferívelusar um controle positivo (um sujeito ou uma amostra de um sujeito, carre-gando tal alteração e exibindo característica de sintomas daquela doença), eum controle negativo (um sujeito ou uma amostra de um sujeito carecendoda expressão alterada e sintoma clínico daquela doença).

"Diferencialmente expresso" como aplicado a um gene, refere-seà produção diferencial do mRNA transcrito do gene ou do produto de proteí-na codificado pelo gene. Um gene diferencialmente expresso pode ser so-bre-expressado ou subexpressado quando comparado ao nível de expres-são de uma célula normal ou de controle. Em um aspecto, isto se refere aum diferencial que é pelo menos 1,5 vez, ou pelo menos 2,5 vezes, ou alter-nativamente pelo menos 5 vezes, ou alternativamente pelo menos 10 vezesmais alto ou menor que o nível de expressão detectado em uma amostra decontrole. O termo "diferencialmente expresso" também se refere às seqüên-cias de nucleotídeo em uma célula ou tecido que são expressas onde silen-ciosas em uma célula de controle ou não expressas onde expressadas emuma célula de controle.Como aqui usado, o termo "modular" significa variar a quantida-de ou intensidade de um efeito ou resultado, por exemplo, intensificar, au-mentar, diminuir ou reduzir.

Como aqui usado o termo "melhorar" é sinônimo com "aliviar" esignifica reduzir ou iluminar. Por exemplo pode-se melhorar os sintomas deuma doença ou distúrbio os tornando mais suportáveis.

Em aspectos onde transferência de gene é mediada por um Ve-tor viral de DNA, como um adenovírus (Ad) ou adenovírus associado (AAV),um constructo de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compreende o ge-noma viral ou parte deste, e um transgene. Adenoviroses (Ads) são um gru-po de vírus relativamente bem-caracterizados, homogêneos incluindo maisde 50 sorotipos. Vide, por exemplo, Pedido de Patente de PCT InternacionalN- WO 95/27071. Ads são fáceis de crescer e não requerem integração nogenoma da célula hospedeira. Vetores derivados de Ads recombinantes,particularmente aqueles que reduzem o potencial para recombinação e ge-ração de vírus do tipo selvagem, foram também construídos. Vide, Pedidosde Patente de PCT Internacional Nos. WO 95/00655 e WO 95/11984. AAVdo tipo selvagem tem infecciosidade e especificidade altas que integram nogenoma da célula hospedeira. Vide, Hermonat e Muzyczka (1984) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 81 :6466-6470 e Lebkowski, et al. (1988) Mol. Cell. Bioi8:3988-3996.

A invenção fornece um método para liberar um transgene à es-pinha dorsal e / ou tronco cerebral em um sujeito administrando um vetorviral neurotrópico recombinante contendo um transgene a pelo menos umaregião da região dos núcleos cerebelares profundos do cérebro, em que aliberação está sob condições que favorecem expressão do transgene em umsítio distai ao sítio de administração. A liberação pode também resultar emexpressão do transgene no sítio de administração.

A menos que do contrário especificamente indicado, expressãodo transgene não é limitada à translação para um polipeptídeo ou proteínamas também inclui replicação e/ou transcrição do polinucleotídeo de transgene.Em outro aspecto, a invenção fornece um método de liberar umproduto de transgene terapêutico a uma célula alvo do CNS que é um neu-rônio ou uma célula glial em um mamífero afligido com um distúrbio neuronalmotor, por exemplo, ALS ou lesão de espinha dorsal traumática. O transge-ne pode codificar para IGF-1.

Em outro aspecto, a invenção é um método para liberar umtransgene à espinha dorsal em um sujeito administrando um vetor viral neu-rotrópico recombinante contendo o dito transgene à região do córtex motordo cérebro, em que a dita liberação está sob condições que favorecem ex-pressão do dito transgene em um sítio distai ao dito sítio de administração.

Em ainda um aspecto adicional, o vetor viral da invenção é admi-nistrado pelo menos a uma região da região dos núcleos cerebelares pro-fundos do cérebro onde o produto de transgene é expressado e liberado naespinha dorsal e / ou na região do tronco cerebral do sujeito.

Em outra modalidade, o vetor viral é administrado pelo menos auma região da região dos núcleos cerebelares profundos do cérebro que éinterconectada com o tronco cerebral e os neurônios motores espinhais. Es-tas regiões alvos têm conexões diretas com células (por exemplo, interneu-rônios e astrócitos) que compõem o ambiente celular do neurônio motor. Aadministração libera o produto de transgene ao ambiente celular do neurôniomotor onde o produto medeia um efeito benéfico nas células que o compõem.

Em uma modalidade, a invenção é um método para liberar umtransgene ou modular sua expressão, em um neurônio motor em um sujeitoadministrando um vetor viral neurotrópico contendo o transgene à região docórtex motor do cérebro do sujeito, em que o transgene é expressado emuma região do neurônio motor distai ao dito sítio de administração.

Em uma modalidade alternada, a invenção é um método paratratar um distúrbio de neurônio motor em um sujeito administrando um vetorviral neurotrópico recombinante contendo um transgene terapêutico a pelomenos uma região da região dos núcleos cerebelares profundos do cérebrodo sujeito, em que o transgene é expressado em uma quantidade terapeuti-camente eficaz em pelo menos uma subdivisão da espinha dorsal do sujeito.

Estas subdivisões incluem um ou mais de cervical, torácica, lombar ou sacra(vide figura 1, Figura 12A). O transgene podem também ser expressado emuma quantidade terapeuticamente eficaz em pelo menos uma região dotronco cerebral, como, por exemplo, o cérebro médio, pons, ou medula (videfigura 12B). Ele pode também ser expressado em uma quantidade terapeuti-camente eficaz tanto em pelo menos uma região do tronco cerebral comoem pelo menos uma subdivisão da espinha dorsal do sujeito.

Esta invenção é também um método para melhorar os sintomasde um distúrbio de neurônio motor em um sujeito administrando um vetorviral neurotrópico recombinante contendo um transgene terapêutico à regiãodo córtex motor do cérebro, em que o dito transgene é expressado em umaquantidade terapeuticamente eficaz em pelo menos uma subdivisão da espi-nha dorsal do sujeito. Estas subdivisões incluem uma ou mais de cervical,torácica, lombar ou sacra (vide figura 1, Figura 12A).

Vetores virais neurotrópicos adequados para a prática desta in-venção incluem, mas não são limitados a, vetores virais adeno-associados(AAV), vetores virais dé herpes simples (patente U. S. Ns 5.672.344) e veto-res lentivirais.

Nos métodos da invenção, AAV de qualquer sorotipo pode serusado. Em certas modalidades, AAV de qualquer sorotipo pode ser usadocontanto que o vetor seja capaz de sofrer transporte axonal retrógrado emum cérebro comprometido com a doença, ou transporte axonal em um cére-bro não-comprometido. O sorotipo do vetor viral usado em certas modalida-des da invenção é selecionado do grupo consistindo em AAV1, AAV2, AAV3,AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, e AAV8 (vide, por exemplo, Gao et al. (2002)PNAS, 99:11854-11859; e Viral Vectors for Gene Therapy. Methods and Pro-tocols, ed. Machida, Human Press, 2003). Outro sorotipo além daqueles lis-tados aqui pode ser usado. Além disso, vetores de AAV pseudotipados po-dem também ser utilizados nos métodos descritos aqui. Vetores de AAVpseudotipados são aqueles contendo o genoma de um sorotipo de AAV nocapsídeo de um segundo sorotipo de AAV; por exemplo, um vetor de AAVcontendo o capsídeo de AAV2 e o genoma de AAV1 ou um vetor de AAVcontendo o capsídeo de AAV5 e o genoma de AAV2 (Auricchio et al., (2001)Hum. Moi Genet, 10(26):3075-81).

Vetores de AAV são derivados de parvoviroses de DNA unifila-mentar (ss) que são não-patogênicos aos mamíferos (revisado em Muzyscka(1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129). Brevemente, vetores combase em AAV têm os genes virais rep e cap que respondem por 96 % dogenoma viral removido, deixando as duas repetições terminais invertidas(ITRs) de 145 pares de base (bp) de flanqueamento que são usadas parainiciar a replicação de DNA viral, embalagem e integração. Na ausência dovírus auxiliar, AAV do tipo selvagem integra no genoma da célula hospedeirahumana com especificidade de sítio preferencial no cromossomo 19q 13.3ou pode permanecer epissomalmente expresso. Uma partícula de AAV sim-ples pode acomodar até 5 kb de ssDNA, portanto deixando cerca de 4,5 kbpara um transgene e elementos reguladores, que é tipicamente suficiente.

Porém, sistemas de trans-junção como descrito, por exemplo, na Patentedos Estados Unidos N2 6.544.785, quase podem dobrar este limite.

Em uma modalidade ilustrativa, AAV é AAV2 ou AAV1. Adenoví-rus associado de muitos sorotipos, especialmente AAV2, foi extensivamenteestudado e caracterizado como vetores de terapia de gene. Aqueles versa-dos na técnica estarão familiarizados com a preparação de vetores de tera-pia de gene baseado em AAV funcionais. Numerosas referências para váriosmétodos de produção, purificação e preparação de AAV para administraçãoem sujeitos humanos podem ser encontradas no corpo extensivo da Iiteratu-ra publicada (vide, por exemplo, Viral Vectors for Gene Therapy: Methodsand Protocols, ed. Machida, Human Press, 2003). Adicionalmente, terapia degene com base em AAV alvejada para células do CNS foi descrita nas Pa-tentes dos Estados Unidos Nos. 6.180.613 e 6.503.888. Vetores de AAV e-xemplares adicionais são vetores recombinantes de sorotipos AAV2/1, A-AV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8 que codificam proteína humana.

Em certos métodos da invenção, o vetor compreende um trans-gene operavelmente ligado a um promotor. O transgene codifica uma molé-cuia biologicamente ativa, expressão desta no CNS resulta em pelo menoscorreção parcial de neuropatologia. As seqüências de cDNA genômicas efuncionais de ASM humana foram publicadas (vide, por exemplo, Patentedos Estados Unidos N2 5.773.278 e 6.541.218). O gene de fator de cresci-mento semelhante à insulina (IGF-1) tem uma estrutura complexa que ébem-conhecida na técnica. Ele tem pelo menos dois produtos de mRNA al-ternativamente juntados que surgem da transcrição de gene. Há um peptí-deo de 153 aminoácidos, conhecido por vários nomes incluindo IGF-1 A ouIGF-IEa, e um peptídeo de 195 aminoácidos, conhecido por vários nomesincluindo IGF-1B ou IGF-IEb. A forma madura de IGF-1 é um polipeptídeode 70 aminoácidos. Ambos IGF-IEa e IGF-IEb contêm o peptídeo de 70aminoácidos maduro, mas difere na seqüência e comprimento de suas ex-tensões terminais de carboxila. As seqüências de peptídeo de IGF-IEa eIGF-IEb são representadas pelas SEQ ID NOS: 1 e 2, respectivamente. OscDNAs genômico e funcional de IGF-1 humano, como também informaçãoadicional com relação ao gene de IGF-1 e seus produtos, estão disponíveisno Acesso de Unigene N2 NM_00618.

O nível de expressão de transgene em células eucarióticas égrandemente determinado pelo promotor transcripcional dentro do cassetede expressão de transgene. Promotores que mostram atividade a longo pra-zo e são específicos para tecido e até mesmo para célula são usados emalgumas modalidades. Exemplos não-limitativos de promotores incluem, masnão são limitados a, promotor de citomegalovírus (CMV) (Kaplitt et al. (1994)Nat. Genet. 8:148-154), promotor de CMV/p3-globina humana (Mandei et al.(1998) J. Neurosci. 18:4271-4284), promotor de GFAP (Xu et al. (2001) Ge-ne Ther. 8:1323-1332), promotor de enolase neurônio-específico de 1,8 kb(NSE) (Klein et al. (1998) Exp. Neurol. 150:183-194), promotor de beta actinade galinha (CBA) (Miyazaki (1989) Gene 79:269-277), promotor de β-glucuro-nidase (GUSB) (Shipley et al. (1991) Genetics 10:1009-1018), e promotoresde ubiquitina como aqueles isolados de ubiquitina humana A, ubiquitina hu-mana B, e ubiquitina humana C como descritos na patente US N2 6.667.174.

Para prolongar a expressão, outros elementos reguladores podem adicio-nalmente ser operavelmente ligados ao transgene, como, por exemplo, oElemento Pós-regulador do vírus de Hepatite de Woodchuck (WPRE) (Donelloet al. (1998) J. ViroL 72:5085-5092) ou o sítio de poliadenilação do hormôniode crescimento bovino (BGH).

Para algumas aplicações de terapia de gene do CNS1 pode sernecessário controlar a atividade transcripcional. Para este fim, regulaçãofarmacológica da expressão de gene com vetores virais pode ser obtida in-cluindo vários elementos reguladores e promotores responsivos aos fárma-cos como descritos, por exemplo, em Haberma et. al. (1998) Gene Ther.5:1604-16011;e Yeet al. (1995) Science 283:88-91.

Nos métodos desta invenção, o vetor viral pode ser administradocontatando uma terminação axonal terminal de um neurônio com uma com-posição contendo um vetor viral que carrega o transgene, permitindo a partí-cula viral ser endocitosada e transportado intracelularmente (de modo retró-grado) ao longo do axônio para o corpo celular do neurônio; permitindo ex-pressar o produto de transgene terapêutico, em que o produto de transgeneterapêutico assim alivia a patologia no sujeito. O efeito pode ser nos neurô-nios motores, em células que compõem o ambiente dos neurônios motores(como interneurônios e astrócitos), ou em ambos. Em certas modalidades, aconcentração do vetor na composição é pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3,10, 15, 20, 25, ou 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25,ou 50 (*109 tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml).

Em métodos adicionais desta invenção, o vetor viral pode seradministrado contatando o corpo celular de um neurônio com uma composi-ção contendo um vetor viral que carrega o transgene, permitindo a partículaviral ser endocitosada, permitindo expressar o produto de transgene terapêu-tico e transportado de modo anterógrado intracelularmente ao longo do axô-nio para o axônio terminal do neurônio, em que o produto de transgene tera-pêutico assim alivia a patologia no sujeito. O efeito pode ser nos neurôniosmotores, em células que compõem o ambiente dos neurônios motores (co-mo interneurônios e astrócitos), ou em ambos. Em certas modalidades, aconcentração do vetor na composição é pelo menos: (a) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3,10, 15, 20, 25, ou 50 (*1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25,ou 50 (x109 tu/ml); ou (C) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1010 iu/ml).

Em um aspecto, o transgene codifica uma molécula biologica-mente ativa, expressão desta no CNS resulta em pelo menos correção par-cial da neuropatologia. Em algumas modalidades, o produto de transgeneterapêutico é uma molécula de RNA que inibe expressão de SOD em umsujeito assim aliviando e impedindo os sintomas de ALS. Vide Roaul et al.(2005) Nat. Med. 11 (4):423 - 428 e Ralph et al. (2005) Nat. Med. 11 (4):429-433.

Em um aspecto ao executar estes métodos, o transgene expres-sa uma quantidade terapêutica de uma proteína selecionada do grupo con-sistindo em fator-1 de crescimento de insulina (IGF-1), calbindina D28, par-valbumina, HIF1-alfa, SIRT-2, VEGF, EPO (eritropoietina), CBP (proteína deligação da Iigadora proteína Iigadora de elemento de resposta de cAMP[CREB]), SMN-1, SMN-2, e CNTF (fator neurotrófico ciliar).

Alternativamente, o transgene inibe expressão de uma formamutante de uma proteína, por exemplo, SOD mutante que resulta em ALS.Roaul et al. (2005) supra e Ralph et al. (2005) supra.

Para identificação das estruturas no cérebro humano, vide, porexemplo, The Human Brain: Surface, Three-Dimensional Suctional AnatomyWith MRI, and Blood Supply, 2- ed., eds. Deuteron et al., Springer Vela,1999; Atlas ofthe Human Brain, eds. Mai et al., Academic Press; 1997; e Co-planar Sterotaxie Atlas of the Human Brain: 3-Dimensionai Proprotional System:An Approaeh to Cerebral lmaging, eds. Tamarack et al., Thyme Medicai Pub.,1988. Para identificação de estruturas no cérebro de camundongo, vide, porexemplo, The Mouse Brain in Sterotaxie Coordinates, 2- ed., AcademicPress, 2000. A figura 1 esquematicamente mostra a espinha dorsal e suasquatro subdivisões: cervical, torácica, lombar e sacra.

A invenção em questão fornece métodos para modular, corrigirou aumentar a função motora em um sujeito afligido com dano neuronal mo-tor. Para o propósito de ilustração apenas, o sujeito pode sofrer de um oumais de esclerose lateral amiotrófica (ALS), atrofia muscular bulbar espinhal,atrofia muscular espinhal, ataxia cerebelar espinhal, esclerose lateral primá-ria (PLS), ou lesão de espinha dorsal traumática.

Sem estar limitado pela teoria, a patologia associada ao dano deneurônio motor pode incluir degeneração dos neurônios motores, gliose, a-normalidades de neurofilamento, perda de fibras mielinadas em tratos corti-coespinhais e raízes ventrais. Por exemplo, dois tipos de princípio foram re-conhecidos: princípio bulbar, que afeta os neurônios motores superiores(córtex e neurônios motores do tronco cerebral), afeta os músculos faciais,fala e engolição; e princípio de membro, que afeta os neurônios motores in-feriores (neurônios motores da espinha dorsal), é refletido por espasticidade,fraqueza generalizada, atrofia muscular, paralisia, e insuficiência respiratória.

Em ALS, sujeitos têm princípio bulbar e de membro. Em PLS, sujeitos têmprincípio bulbar.

Sem estar limitado pela teoria, uma modalidade da invenção en-contra-se na habilidade para fornecer uma molécula terapêutica (por exem-plo, uma proteína ou peptídeo) para cada divisão da espinha dorsal. Isto po-de ser realizado injetando um vetor de AAV no DCN. Além disso, pode serimportante alvejar lâmina individual dentro de cada divisão da espinha dorsal.

Lâmina são sub-regiões específicas dentro das regiões do cérebro e espinhadorsal. Pode ser desejável em certas modalidades alvejar lâmina específicadentro de uma certa divisão da espinha dorsal. Considerando que o danodos neurônios motores pode ocorrer dentro dos neurônios motores superio-res também, pode também ser desejável fornecer uma molécula terapêutica(por exemplo, uma proteína ou peptídeo) às divisões do tronco cerebral. Emuma modalidade, pode ser desejável fornecer a molécula terapêutica tantopara a espinha dorsal, incluindo algumas ou todas as subdivisões comotambém para o tronco cerebral, incluindo algumas ou todas as subdivisões.

A invenção imediata usa a introdução de um vetor de AAV no DCN para rea-Iizar a liberação acima descrita de uma molécula terapêutica para a(s) regi-ão(ões) da espinha dorsal) e / ou tronco cerebral. A figura 12A ilustra as co-nexões entre as regiões dos núcleos cerebelares profundos e da espinhadorsal enquanto a Figura 12B ilustra as conexões entre as regiões dos nú-cleos cerebelares profundos e do tronco cerebral.

A habilidade para organizar e executar ações motoras comple-xas depende dos sinais das áreas motoras no córtex cerebral, isto é, do cór-tex motor. Comandos corticais motores descem em dois tratos. As fibras cor-ticobulares controlam os núcleos motores no tronco cerebral que move osmúsculos faciais e as fibras corticoespinhais controlam os neurônios motoresespinhais que inervam os músculos do tronco e do membro. O córtex cere-bral também indiretamente influencia a atividade motora espinhal agindo nasvias do tronco cerebral descendentes.

O córtex motor primário encontra-se ao longo do giro pré-centralna área de Broadmann (4). Os axônios dos neurônios corticais que projetamjunto à espinha dorsal correm no trato corticoespinhal, um fardo volumoso defibras contendo aproximadamente 1 milhão de axônios. Cerca de um terçodestes origina do giro pré-central do lóbulo frontal. Outro terço origina daárea 6. O restante origina nas áreas 3, 2, e 1 no córtex sensório somático eregula a transmissão de entrada aferente através do corno dorsal.

As fibras corticoespinhais correm junto com as fibras corticobul-bares através do membro traseiro da cápsula interna para alcançar a porçãoventral do cérebro médio. Elas separam no pons em fardos pequenos defibras que cursam entre os núcleos de pontina. Elas reagrupam-se na medu-la para formar a pirâmide medular. Cerca de três quartos das fibras cortico-espinhais cruzam a mediana na decussação piramidal na junção da medulae espinha dorsal. As fibras cruzadas descem na parte dorsal das colunaslaterais (coluna dorsolateral) da espinha dorsal, formando o trato corticoes-pinhal lateral. As fibras não-cruzadas descem nas colunas ventrais como otrato corticoespinhal ventral.

As divisões laterais e ventrais do trato corticoespinhal terminamquase nas mesmas regiões de massa cinzenta espinhal como os sistemaslaterais e medianos do tronco cerebral. O trato corticoespinhal lateral projeta-se primariamente para núcleos motores na parte lateral do corno ventral epara interneurônios na zona intermediária. O trato corticoespinhal ventralprojeta-se bilateralmente para a coluna de célula ventromedial e para por-ções adjacentes da zona intermediária contendo os neurônios motores queinervam os músculos axiais. A figura 3 esquematicamente mostra as viasaferentes principais (entrada).

Profundamente dentro do cerebelo está a substância cinzentachamada os núcleos cerebelares profundos denominados o núcleo mediai(fastigial), o núcleo interposto (proposto) e o núcleo lateral (dentado). Comoaqui usado, o termo "núcleos cerebelares profundos" coletivamente referem-se a estas três regiões. A figura 2 esquematicamente mostra as três regiõesdo DCN. A figura 4 esquematicamente mostra as vias eferentes principais(saída) do DCN. A figura 5 esquematicamente mostra os circuitos neurais nocórtex cerebral. As figuras 12A e 12B esquematicamente mostram as cone-xões entre o DCN e a espinha dorsal ou o tronco cerebral, respectivamente.

Se desejado, a estrutura do cérebro humano pode ser correlata-da às estruturas similares no cérebro de similar mamífero. Por exemplo, amaioria dos mamíferos, incluindo os humanos e roedores, mostra uma orga-nização topográfica similar das projeções entorrinais-hipocampais, com neu-rônios na parte lateral tanto do córtex entorrinal lateral e mediano que seprojeta para a parte dorsal ou pós septal do hipocampo, enquanto que a pro-jeção para o hipocampo ventral origina-se primariamente dos neurônios naspartes medianas do córtex entorrinal (Principies of Neural Science, A- ed.,eds Kandel et al., McGraw-HiII, 1991; The Rat Nervous System, 2ã ed., ed.Paxinos, Academic Press, 1995). Além disso, células da camada Il do córtexentorrinal projetam-se para o giro dentado, e elas terminam nos dois terçosexternos da camada molecular do giro dentado. Os axônios das células dacamada Ill projetam-se bilateralmente para as áreas do cornu ammonis CA1e CA3 do hipocampo, terminando na camada molecular stratum lacunose.

Em um aspecto, os métodos descritos incluem administrar aoCNS de um sujeito afligido um vetor viral neurotrópico que carrega um trans-gene codificando um produto terapêutico e permitindo expressar o transgenedentro do CNS distalmente do sítio de administração em um nível terapêuti-co. Além disso, o vetor pode compreender um polinucleotídeo que codificapara uma molécula biologicamente ativa eficaz para tratar o distúrbio deCNS. Tais moléculas biologicamente ativas podem compreender peptídeosincluindo mas não limitados às versões nativas ou mutadas de proteínas decomprimento total, versões nativas ou mutadas de fragmentos de proteína,polipeptídeos sintéticos, anticorpos, e fragmentos de anticorpo como as mo-léculas de Fab. Moléculas biologicamente ativas podem também compreen-der nucleotídeos incluindo polinucleotídeos de DNA unifilamentar ou bifila-mentar e polinucleotídeos de RNA unifilamentar ou bifilamentar. Para umarevisão das tecnologias de nucleotídeo exemplares que podem ser usadasna prática dos métodos descritos aqui, vide Kurreck, (2003) J. Eur. J. Bio-chem. 270, 1628-1644 [tecnologias antissenses]; Yu et al., (2002) PNAS99(9), 6047-6052 [tecnologias de interferência de RNA]; e Elbashir et al.,(2001) Genes Dev., 15(2): 188-200 [tecnologia de siRNA].

Em uma modalidade ilustrativa, a administração é realizada porinjeção direta de uma solução de vetor de titulação alta no DCN de um sujei-to ou paciente. Por exemplo, a administração é através de injeção direta emuma ou mais regiões dos núcleos cerebelares profundos do cérebro selecio-nadas do grupo consistindo na região mediai (fastigial), região interposta(proposto) e a região lateral (dentada). O DCN é um sítio atrativo para inje-ção devido a suas conexões eferentes e aferentes extensivas com o troncocerebral e espinha dorsal. Estas células fornecem um meio eficiente e mini-mamente invasivo para liberar vetor viral e transgene expresso para as regi-ões da espinha dorsal e as regiões do tronco cerebral. Sem estar limitadopela teoria, o vetor viral pode ser levado pelos terminais dos axônios e demodo retrógrado transportado ao longo do axônio para o corpo celular des-tes neurônios que se projetam ao longo na região da espinha dorsal e/outronco cerebral. Corpos de célula de neurônios estão também presentes noDCN que tem terminações terminais dos axônios que terminam, por exemplo,na região cervical da espinha dorsal. Vetor viral absorvido por estes corposcelulares, ou transgene expresso resultante do vetor viral ou ambos, podeser de modo anterógrado transportado para as terminações terminais dosaxônios na região espinhal cervical. Portanto, usando o DCN como um sítiode injeção, apenas um volume pequeno de vetor viral é injetado mas estemedeia a expressão de transgene significativa ao longo de uma ou mais re-giões na espinha dorsal e/ou no tronco cerebral.

Em algumas modalidades, os métodos compreendem adminis-tração de um vetor neurotrópico de titulação alta que carrega um transgeneterapêutico de forma que o produto de transgene é expressado a um nívelterapêutico em um segundo sítio dentro do CNS distai do primeiro sítio. Emalgumas modalidades, a titulação viral da composição é pelo menos: (a) 5, 6,7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25, ou 50 (x1012 gp/ml); (b) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3,10, 15, 20, 25, ou 50 (x109 tu/ml); ou (c) 5, 6, 7, 8, 8,4, 9, 9,3, 10, 15, 20, 25,ou 50 (x1010 iu/ml). Em outras modalidades, a administração é realizada porinjeção intraparenquimal direta de uma solução de vetor neurotrópico de titu-lação alta no cérebro doente, depois disso o transgene é expressado distai,contralateral ou ipsilateralmente, para o sítio de administração a um nívelterapêutico pelo menos 2, 3, 5, 8 ,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 mmdo sítio de administração.

A distância entre os primeiro e segundo sítios é definida como aregião de distância mínima entre o sítio de administração (primeiro sítio) e olimite da transdução detectável do sítio distai (segundo sítio) quando medidausando procedimentos conhecidos na técnica ou como descrito nos Exem-plos, por exemplo, hibridação in situ. Alguns neurônios no CNS de mamífe-ros maiores podem atravessar distâncias grandes em virtude de suas proje-ções axonais. Por exemplo, em humanos, alguns axônios podem atravessaruma distância de 1000 mm ou mais. Desse modo, em vários métodos dainvenção, o vetor pode ser axonalmente transportado ao longo do compri-mento inteiro do axônio a uma tal distância a alcançar e transduzir o corpocelular de origem.

Um sítio de administração de vetor dentro do CNS é escolhidocom base na região alvo desejada de neuropatologia e a topologia dos cir-cuitos do cérebro envolvida desde que um sítio de administração e a regiãoalvo tenham conexões axonais. A região alvo pode ser definida, por exemplo,usando coordenadas 3-D esterotáxicas. Em algumas modalidades, o sítio deadministração é escolhido de forma que pelo menos 0,1, 0,5, 1, 5, ou 10 %da quantidade total de vetor injetados são liberados distalmente na regiãoalvo de pelo menos 1, 200, 500, ou 1000 mm3. Um sítio de administraçãopode ser localizado em uma região inervada por neurônios de projeção queconectam regiões distais do cérebro. Por exemplo, a substância negra e á-rea segmentária ventral enviam projeções densas ao caudado e putamen(coletivamente conhecidos como o estrato). Neurônios dentro da substâncianegra e tegmento ventral podem ser alvejados para transdução por transpor-te retrógrado de AAV seguindo injeção no estrato. Como outro exemplo, ohipocampo recebe projeções axonais bem-definidas, previsíveis de outrasregiões do cérebro. Outros sítios de administração podem ser localizados,por exemplo, na espinha dorsal, tronco cerebral (medula, cérebro médio epons), mesencéfalo, cerebelo (incluindo os núcleos cerebelares profundos),diencéfalo (tálamo, hipotálamo), telencéfalo (estrato de corpo, córtex cere-bral, ou, dentro do córtex, os lóbulos occipitais, temporais, parietais ou fron-tais), ou combinações destes.

O segundo sítio (alvo) pode ser localizado em qualquer região doCNS, incluindo o cérebro e a espinha dorsal contendo uns neurônios que seprojetam para o primeiro sítio (administração). Em algumas modalidades, osegundo sítio está em uma região do CNS selecionada da substância negra,a medula oblonga, o tronco cerebral, ou a espinha dorsal.

Para liberar o vetor especificamente para uma região particulardo sistema nervoso central, especialmente para uma região particular docérebro, ele pode ser administrado através de microinjeção estereotáxica.

Por exemplo, no dia da cirurgia, pacientes terão a base de estrutura estereo-táxica fixada no lugar (atarraxadas no crânio). O cérebro com base de estru-tura estereotáxica (MRI-compatível com marcações fiduciárias) será image-ado usando MRI de resolução alta. As imagens de MRI depois serão transfe-ridas para um computador que opera software estereotáxico. Uma série deimagens coronais, sagitais e axiais será usada para determinar o sítio alvode injeção de vetor, e trajetória. O software translada diretamente a trajetóriaem coordenadas 3-dimensionais apropriadas para a estrutura estereotáxica.Orifícios de trepanação são perfurados acima do sítio de entrada e do apare-lho estereotáxico localizado com a agulha implantada na profundidade dada.

O vetor em um veículo farmaceuticamente aceitável depois será injetado. Ovetor é depois administrado através de injeção direta ao sítio alvo primário ede modo retrógrado transportado para sítios alvos distais por meio de axô-nios. Rotas adicionais de administração podem ser usadas, por exemplo,aplicação cortical superficial sob visualização direta, ou outra aplicação não-estereotáxica.

Além disso porque cada região do DCN alveja regiões específi-cas do CNS (vide figura 1 e Figuras 12A e 12B), pode-se especificamentealvejar a região do CNS à qual o transgene é liberado pré-selecionando aregião do DCN para administração. Como é evidente para aqueles versadosna técnica, uma multidão de liberações de doseamento e alvejadas pode seralcançada variando a localização, seqüência e número de administrações detransgene. O volume total do material a ser administrado, e o número totalde partículas de vetor a ser administradas, serão determinados por aquelesversados na técnica com base em aspectos conhecidos da terapia de gene.

Eficácia terapêutica e segurança podem ser testadas em um modelo animalapropriado. Por exemplo, uma variedade de modelos animais bem-caracterizados existe para LSDs, por exemplo, como descrito aqui ou emWatson et al. (2001) Methods Mol. Med. 76:383-403; ou Jeyakumar et al.(2002) Neuropath. Appi Neurobiol., 28:343-357 e ALS (vide Tu et al. (1996)P.N.A.S. 93:3155-3160; Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralphet al. (2005) Nat. Med. 11 (4):429-433).

Em camundongos experimentais, o volume total de solução deAAV é injetado por exemplo, entre 1 a 5 μΙ. Para outros mamíferos, incluindoo cérebro humano, volumes e taxas de liberação são apropriadamente esca-lonados. Por exemplo, foi demonstrado que os volumes de 150 μΙ podem serinjetados seguramente no cérebro de primatas (Janson et al. (2002) Hum.Gene Ther. 13:1391-1412). Tratamento pode consistir em uma injeção sim-ples por sítio alvo, ou pode ser repetido ao longo do trato de injeção, se ne-cessário. Sítios de injeção múltiplos podem ser usados. Por exemplo, emalgumas modalidades, além do primeiro sítio de administração, uma compo-sição contendo um vetor viral que carrega um transgene é administrada a outrosítio que pode ser contralateral ou ipsolateral ao primeiro sítio de administração.

Injeções podem ser simples ou múltiplas, unilaterais ou bilaterais.

Preparações de AAV de titulação alta podem ser produzidas usan-do técnicas conhecidas na técnica, por exemplo, como descritas na Patentedos Estados Unidos N2 5.658.776 e Viral vectors for gene Terapy: Methodsand protocols, ed. Machida, Human Press, 2003.

Os exemplos a seguir fornecem modalidades ilustrativas da in-venção. Alguém versado na técnica reconhecerá as numerosas modifica-ções e variações que podem ser executadas sem alterar o espírito ou esco-po da presente invenção. Tais modificações e variações são abrangidasdentro do escopo da invenção. Os exemplos não limitam a invenção de for-ma alguma.

Exemplos

Titulação de Vetores Recombinantes

Titulações de vetor de AAV foram medidas de acordo com nú-mero de cópia de genòma (partículas de genoma por mililitro). Concentra-ções de partícula de genoma foram com base em Taqman® PCR do DNA devetor como previamente relatado (Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther.,10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Moi Ther., 6:272-278). Brevemente,AAV-ASM purificado foi tratado com tampão de digestão de capsídeo (50mM Tris-HCI pH 8,0, 1,0 mM EDTA, 0,5 % SDS, 1,0 mg/ml proteinase K) a50°C durante 1 hora para liberar DNA do vetor. Amostras de DNA foram pos-tas através de uma reação em cadeia de polimerase (PCR) com preparado-res que anelam as seqüências específicas no DNA do vetor, como a regiãode promotor, transgene, ou a seqüência de poli A. Os resultados de PCRforam depois quantificados por um software de Taqman® de Tempo Real,como aquele fornecido pelo Perkin Elmer-Applied Biosystems (Foster City,CA) Prism 7700 Sequence Detector System.

Vetores que carregam um gene de marcador ensaiável como ogene de β-galactosidase ou de proteína fluorescente verde (GFP) podem sertitulados usando um ensaio de infecciosidade. Células suscetíveis (por e-xemplo, células de HeLa ou COS) são transduzidas com o AAV e um ensaioé executado para determinar a expressão de gene como tingimento de célu-las transduzida de vetor de β-galactosidase com X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo) ou microscopia de fluorescência para célulastransduzidas de GFP. Por exemplo, o ensaio é executado como segue: 4 χ104 células de HeLa são banhadas em cada poço de uma placa de culturade 24 poços usando meios de crescimento normais. Após ligação, isto é,aproximadamente 24 horas depois, as células são infetadas com Ad tipo 5 auma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 e transduzidas com diluiçõesseriais do vetor empacotado e incubadas a 37°C. Um a três dias depois, an-tes dos efeitos citopáticos extensivos serem observados, o ensaio apropria-do é executado nas células (por exemplo, tingimento de X-gal ou microsco-pia de fluorescência). Se um gene repórter como β-galactosidase for usado,as células são fixas em 2 % de paraformaldeído, 0,5 % de glutaraldeído etingidas para atividade de β-galactosidase usando X-gal. As diluições de ve-tor que dão células bem separadas são separadas. Cada célula positiva re-presenta 1 unidade de transdução (tu) de vetor.

Expressão de Proteína Funcional Impede Prejuízo Motor em um Modelo de

Camundongo Terapeuticamente Relevante

Camundongos de ASMKO são um modelo aceito de doença deNiemann-Pick dos tipos AeB (Horinouchi et al. (1995) Nat. Genetics 10:288-293; Jin et al. (2002) J. Clin. Invest. 109:1183-1191; e Otterbach (1995) Cell81:1053-1061). Doença de Niemann-Pick (NPD) é classificado como umadoença de armazenamento Iisossomal e é um distúrbio neurometabólicoherdado caracterizado por uma deficiência genética em ácido esfingomieli-nase (ASM; esfingomielina colinofosfoidrolase, EC 3.1.3.12). A carência deproteína de ASM funcional resulta na acumulação de substrato de esfingo-mielina dentro dos Iisossomas de neurônios e glios ao longo do cérebro. Istoleva à formação de números grandes de Iisossomas expandidos no pericari-on que é uma característica conspícua e o fenótipo celular primário de NPDdo tipo A. A presença de Iisossomas expandidos correlata com a perda dafunção celular normal e um curso neurodegenerativo progressivo que leva àmorte do indivíduo afetado na infância prematura (The Metabolic and Mole-cular Bases of Iherited Diseases, eds. Scriver et al., McGraw-HiII, Nova Ior-que, 2001, págs. 3589-3610). Fenótipos celulares secundários (por exemplo,anormalidades metabólicas adicionais) estão também associados a esta do-ença, notavelmente à acumulação de nível alto de colesterol no comparti-mento lisossomal. Esfingomielina tem afinidade forte por colesterol que re-sulta no seqüestrando de quantidades grandes de colesterol nos Iisossomasde camundongos de ASMKO e pacientes humanos (Leventhal et al. (2001) J.Bioi Chem. 276:44976-44983; Slotte (1997) Subcell. Biochem. 28:277-293;e Viana et al. (1990) J. Med. Genet. 27:499-504.)

O experimento a seguir, avaliou a habilidade relativa dos vetoresde sorotipo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8 recombinantes quecodificam ASM humana (hASM) para expressar proteína de hASM, corrigirpatologia de armazenamento de colesterol, sofrer transporte, salvar célulasde Purkinje, e iniciar restabelecimento funcional no camundongo de ASMKOapós injeção unilateral dentro dos núcleos cerebelares profundos. Um grupoadicional de camundongos de ASMKO recebeu injeções bilaterais no DCNpara avaliar se propagação/expressão de proteína de transgene melhorari-am o restabelecimento funcional de comportamento.

Sessenta e seis camundongos (ASMKO) machos homozigotos (-/-) modificados para de ácido esfingomielinase foram criados e dezesseiscontroles machos de ninhada do tipo selvagem de junções de heterozigoto(+/-). Camundongos foram genotipados por PCR seguindo o procedimentodescrito em Gal et al. (1975) N Engl J Med:293:632-636. Camundongos dacolônia original foram retrocruzados com a cepa de C57/BI6. Os animais fo-ram alojados sob ciclo 12:12 horas de luz/escuridão e supridos ad Iibitumcom alimento e água. Todos os procedimentos foram executados sob umprotocolo aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee.

Após serem anestesiados com isoflurano, os camundongos (-7semanas de idade) foram unilateralmente injetados nos núcleos cerebelaresprofundos (A-P: -5,75 de bregma, M-L: -1,8 de bregma, D-V: -2,6 de dura,barra incisiva: 0,0) com um dos vetores de sorotipo de AAV a seguir(n=8/vetor): AAV1-CMV-pgal, AAV1-CMV-ASM1 AAV2-CMV-ASM, AAV5-CMV-ASM, AAV7-CMV-ASM, e AAV8-CMV-ASM. Os vetores foram libera-dos com uma seringa de 10 μΙ de Hamilton montada em uma bomba de se-ringa a uma taxa de 0,5 μΙ/minuto em um total de 1,86 χ 1010 partículas degenoma por cérebro. O volume de injeção final para cada vetor foi 4 μΙ. Umahora antes e vinte e quatro horas após a cirurgia, os camundongos foramdados cetoprofeno (5 mg/kg; SC) para analgesia.

Camundongos foram mortos 7 semanas pós-injeção (14 sema-nas de idade). Na hora do sacrifício, os camundongos foram sobre-dosadoscom eutasol (150 mg/kg; IP) e rapidamente decapitados (n=5/grupo) outranscardialmente perfurados (n=3/grupo). Cérebros dos camundongos de-capitados foram rapidamente removidos, congelados em nitrogênio líquido,dissecados em 3 seções (hemisfério cerebral direito, hemisfério cerebral es-querdo & cerebelo) homogeneizados, e analisados para hASM por ELISA.

Cérebros e espinhas dorsais dos camundongos perfundidos foram proces-sadas para expressão de proteína de ASM humana, acumulação de coleste-rol como detectado por tingimento de filipina e sobrevivência de célula dePurkinje com tingimento de calbindina em seções de vibratona de 50 μιτι.

Camundongos de ASMKO que receberam injeções bilaterais (~7 semanasde idade) de AAV2/1-Pgal (n=8), AAV2/1-ASM (n=5), e AAV2/2-ASM (n=5)foram sacrificados em 20 semanas de idade após sofrer testagem de rotarod.

Camundongos foram testados de rotarod de aceleração e de oscilação parafunção motora no Smartrod (AccuScan) usando métodos conhecidos na téc-nica. Métodos exemplares são reproduzidos em Sleat et al. (2004) J. Neu-rosci. 24:9117-9126. As figuras 10 e 11 mostram graficamente os resultadosdos testes de rotarod como uma medição de restabelecimento da funçãomotora.

O cDNA de ASM humana de comprimento total sob o controle dopromotor de citomegalovírus humano precocemente imediato (CMV), comuma seqüência de poliadenilação de SV40, e um íntron híbrido, foi clonadoem um plasmídeo contendo ITRs de sorotipo de AAV2 (ITR de AAV2). Jin etal. (2002) J Clin Invest. 109:1183-1191. Vetores híbridos foram produzidosatravés de transfecção tripla usando uma série de plasmídeos auxiliarescontendo domínios de codificação de capsídeo sorotipo-específicos alémdos genes de replicação do tipo de AAV2. Esta estratégia permite a embala-gem de vetores de ITR de AAV2 em cada virion sorotipo-específico Rabino-witz, et al. (2002) J ViroL 76:791-801. Com este método o genoma recombi-nante de hASM foi usado para gerar uma série de vetores de rAAV-hASM devários sorotipos incluindo AAV2/1, AAV2/2, AAV2/5, AAV2/7 e AAV2/8. Veto-res de AAV recombinantes foram purificados através de cromatografia depermuta iônica (Sorotipos 2/1, 2/2 e 2/5). 0'Riordan et al. (2000) J Gene Med2: 444-54 ou centrifugação de CsCI (sorotipos 2/8 e 2/7) Rabinowitz et al.(2002) J. Urroi 76:791-801. A titulação final de partículas de virion de AAV-ASM (partículas resistentes à DNase), foi determinada por PCR de TaqManda seqüência de CMV. Clark et al. (1999) Hum. Gene Therapy 10:1031-1039.

Anticorpos de ASM humano são humanos específico e não rea-gem cruzado com ASM de camundongo. Placas de Coster (Corning, NY)9018 revestidas (100 μΙ/poço) com anticorpo de ASM humana monoclonalrecombinante (rhASM) (2 pg/ml) diluído em 50 mM de tampão de carbonatode sódio (pH 9,6) foram incubadas durante a noite @ 2-8°C. Anticorpo derevestimento de excesso foi removido e diluente de bloqueio (KPL, Inc., MD)foi adicionado por 1 h @ 37°C. As placas foram lavadas com uma lavadorade microplaca (Molecular Devices, CA) durante dois ciclos. Padrões, contro-les e amostras diluídos em tampão de diluição padrão (PBS, 0,05 % Tween,1 % HP-BSA) foram pipetados em duplicata e deixados incubar por 1 h @37°C. As placas foram lavadas como descrito acima. Cem microlitros de an-ticorpo de ASM humana biotinilado recombinante (rhASM) (diluído 1:20K emtampão de diluição padrão) foram adicionados a cada poço, deixados incu-bar por 1 h @ 37°C, e depois removidos com uma lavadora de microplaca.

Estreptavidina - HRP (Pierce Biotechnology, Inc., IL) diluído 1:1 OK foi depoisadicionada (100 μΙ/poço) e deixada incubar por 30 min em temperatura am-biente. As placas foram lavadas como descrito acima e depois incubadascom SureBIue TMB (KPL, Inc., MD) durante 15 minutos @ 36-38°C. A rea-ção foi parada com solução de interrupção (KPL1 Inc., MD) e valores de ab-sorbância foram depois lidos a 450 nm com uma leitora de placa SpectraMax 340 (Molecular Devices, CA). Análise dos dados foi completada usandosoftware de Softmax Pro 4.3 (Molecular Devices, CA).

A concentração de proteína para cada amostra foi determinadacom um kit de ensaio de proteína de BCA (Pierce Biotechnology, Inc., IL)usando albumina de soro bovino como padrão.

Camundongos foram transcardialmente perfurados com fixadorcontendo 2 % paraformaldeído, 0,03 % glutaraldeído, 0,002 % CaCI2 em 0,1M tampão de acetato de sódio em pH 6,5, seguido por perfusão com omesmo fixador em pH 8,5. Cérebros e espinhas dorsais dos camundongosforam dissecados e pós-fixados durante a noite a 4°C em pH 8,5 fixadossem glutaraldeído. Os tecidos foram lavados em 0,1 M tampão de fosfato depotássio, pH 7,4, embebidos em 3,5 % ágar e cortados em seções sagitaisde 50 pm com um vibratome.

Cérebros e espinhas dorsais foram sagitalmente seccionadosem vibratome em intervalos de 50 μιτι. As seções foram processadas paraimunofluorescência com anticorpos primários contra ASM humana (1:200).

As seções foram incubadas em 10 % de soro de jumento, 0,3% Triton X-100em PBS durante 1 hora, seguido por incubação com ASM anti-humana de ca-mundongo biotinilado em 2 % soro de jumento, 0,2 % Triton X-100 em PBSdurante 72 horas. Após lavar, o sinal foi amplificado usando um kit de Amplifi-cação de Sinal Tyramide (PerkinElmer, Boston MA). Proteína de ASM hu-mana foi visualizada com um microscópio fluorescente de Nikon, e imagensforam capturadas com uma câmera SPOT e software Adobe Photoshop.

Complexo de Filipin (Sigma, St., Louis, MO) foi diluído primeiroem 100 % de metanol para uma concentração de matéria-prima de 1 mg/ml.

Solução de matéria-prima fica estável durante 4 semanas a -20°C. Após la-var com PBS1 as seções foram incubadas na escuridão por três horas emuma solução de filipin recentemente feita de 10 pg/ml em PBS. Seções fo-ram depois lavadas três vezes com PBS. Depósitos de colesterol foram vi-sualizados sob um filtro ultravioleta em um microscópio de fluorescência.Cérebros foram processados para imunofluorescência usandoanticorpos primários direcionados contra a proteína Iigadora de cálcio, cal-bindina. As seções foram lavadas com tampão de fosfato de potássio (KPB)e depois enxaguadas com solução salina tamponada de fosfato de potássio(KPBS). Seções foram depois bloqueadas em 5 % soro de jumento, 0,25 %Triton X-100 em KPBS para até 3 horas e depois incubadas em 5 % soro dejumento, 0,2 % Triton X-100 e anti-calbindina de camundongo (1:2500, Sig-ma, St., Louis, MO) em KPBS. As seções foram enxaguadas com KPBS com0,1 % Triton X-100 três vezes após 72 horas a 4°C. Anticorpo secundário,CY3 de camundongo de anti-jumento (1:333, Jackson Immunoresearch La-boratories, West Grove, PA) foi adicionado em KPBS + 0,1 % Triton X-100durante 90 minutos em temperatura ambiente. As seções foram lavadas comKPB e depois montadas sobre lâminas revestidas com gel. As células cal-bindina-positivas foram visualizadas sob epifluorescência. Para quantificarcélulas de Purkinje do cerebelo, quatro seções cerebelares de rosto cheio,medianas foram selecionadas de cada animal. Células de Purkinje calbindi-na-imunopositivas foram vistas sob um microscópio fluorescente e os corposcelulares foram contados em uma ampliação de 20X. Cada lóbulo foi conta-do separadamente. Dois planos focais separados foram contados por lóbulo.

Apenas células no foco foram contadas para assegurar que nenhuma célulafoi contada duas vezes.

Seções de vibratome de cinqüenta (50) pm foram processadasprimeiro para imunofluorescência com anticorpos direcionados contra ASMhumana, como descrito acima. As seções foram depois lavadas em PBS etingidas para colina acetiltransferase (ChAT; coelho policlonal, 1:500, Che-micon International, Temecula, CA) com o protocolo esboçado acima paracalbindina. Ao invés de usar um anticorpo secundário de CY3, porém, FITCde jumento-anticoelho (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, WestGrove, PA) foi usado. O tingimento foi visualizado primeiro sob epifluores-cência e imagens posteriores foram adquiridas com um microscópio confocal.

Tingimento de filipin foi quantificado como segue. Imagens em-parelhadas de exposição foram capturadas - usando um microscópio de epi-fluorescência vertical de campo amplo Nikon E600 equipado com uma câ-mera digital SPOT. O grupo de AAV2/1 - β-gal foi primeiro imageado, e a-quela exposição foi usada para adquirir todas as imagens adicionais. Cadaimagem analisada representa um plano sagital mediano através do compri-mento de cada meio-cérebro. Análise morfométrica foi executada com soft-ware Metamorph (Universal Imaging Corporation). As imagens de AAV2/1 -β-gal foram submetidas a limiares; uma vez estabelecido, o mesmo limiar foiusado em todas as imagens. As regiões a seguir foram selecionadas manu-almente pelo usuário e analisadas separadamente: cerebelo, pons, medula,cérebro médio, córtex cerebral, hipocampo, tálamo, hipotálamo e estrato.

Intensidade integrada foi medida em cada região, e todas as medições (n =3/grupo) de um grupo dado de animais foram usados para gerar médias. A re-dução em colesterol nos animais tratados foi depois calculada como o por centode diminuição da intensidade integrada comparada aos camundongos injeta-dos sedados de β-gal. Imunomanchação de hASM positiva foi observada aolongo do cerebelo (Tabela 1), pons, medula e espinha dorsal seguindo inje-ção unilateral de AAV-ASM dentro dos núcleos cerebelares profundos.

Tabela 1

Áreas com tingimento de hASM positiva como função de sorotipode AAV. * indica hASM positiva estava limite abaixo da detecção, mas corre-ção de patologia de colesterol ainda ocorreu.

<table>table see original document page 35</column></row><table>Dentro do cerebelo camundongos tratados com AAV2/1-ASMtiveram o nível mais difundido (isto é, propagação entre lóbulos dentro damesma seção sagital) de expressão de hASM, enquanto que os camundon-gos tratados com AAV2/2-ASM tiveram o nível mais restringido de expressãode proteína de ASM humana. Expressão de proteína de ASM humana emcamundongos tratados com AAV2/5-ASM, AAV2/7-ASM, e AAV2/8-ASM foiintermediária entre estes dois grupos. Expansão mediana - lateral entre asseções sagitais foram máximas em camundongos tratados com sorotipos 1& 8 e mínimas são camundongos injetados com sorotipo 2. Sorotipos 5 & 7iniciaram padrões de propagação mediana - intermediária entre os sorotipos1 e 2. Cada camada do cerebelo (isto é, molecular, Purkinje e granular) foitransduzida para cada sorotipo de AAV; porém, uma afinidade aumentadapara a camada molecular foi evidente para todos os sorotipos. Transduçãode célula de Purkinje foi máxima em camundongos tratados com sorotipos 1e 5. Camundongos injetados com sorotipo 7 tiveram o menor número de cé-lulas de Purkinje transduzidas. Camundongos tratados com sorotipo 8 tam-bém tiveram poucas células de Purkinje transduzidas, mas tiveram menosexpressão de ASM dentro da camada granular quando comparada aos soro-tipos 1, 2, 5 & 7. Células de Purkinje transduzidas com ASM pareciam teruma citoestrutura saudável. Análise quantitativa de Expressão mediada porAAV de proteína de hASM por ELISA em homogeneizados de tecido cerebe-Iar que suporta estes achados imunoistoquímicos. Camundongos injetadoscom sorotipos 1 e 8 demonstraram significativamente (p < 0,0001) níveis deproteína de hASM de cerebelo mais altos quando comparados a todos osoutros camundongos. Níveis de hASM cerebelar de camundongos injetadoscom sorotipos 2, 5, & 7 não estavam acima dos níveis de WT (isto é base).

Como ASM humana esperada não foi detectada em camundongos do tiposelvagem - o anticorpo de hASM usado no ELISA é humano específico.

Uma ausência de proteína de ASM funcional resulta em acumu-lação Iisossomal de esfingomielina, e defeitos metabólicos secundários sub-seqüentes como tráfico de colesterol anormal. Sarna et al. Eur. J. Neurosci.13:1873-1880 e Leventhal et al. (2001) J. BioL Chem. 276:44976-4498. A-cúmulo de colesterol livre no cérebro de camundongo de ASMKO é visuali-zado processando filipin, uma molécula autofluorescente isolada de strep-tomyces filipinensis. Cérebros de camundongo do tipo selvagem não tingempositivamente para filipin. Em todos camundongos tratados com AAV (comexceção para AAV2/1^gal) liberação de tingimento de filipin (Tabela 2) so-breposta com áreas que foram positivas para imunomanchação de hASMindicando que cada vetor de sorotipo é capaz de gerar um produto de trans-gene funcional.

Tabela 2

Por cento de Redução em liberação de Filipin (isto é, colesterol)quando comparado aos camundongos de ASMKO tratados com AAV-3galem regiões do cérebro selecionadas seguindo injeção intracerebelar de soro-tipos de AAV diferentes (n=3/sorotipo; 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, e 2/8) codificandopara ASM humana nos núcleos cerebelares profundos de camundongos deASMKO.

<table>table see original document page 37</column></row><table>Como previamente demonstrado por (Passini et al. (2003) em"Society for Neuroscience" New Orleans1 LA), liberação de filipin tambémocorreu em áreas anatomicamente conectadas com o sítio de injeção, masesta não tinja positivamente para hASM. Análise de MetaMorph indicou queuma redução de tingimento de filipin ocorreu ao longo do eixo geométricocaudal rostral inteiro. No cerebelo e tronco cerebral e filipin foi maximamentereduzida em camundongos tratados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM, en-quanto que nos camundongos de diencéfalo e de córtex cerebral injetadoscom AAV2/8-ASM teve o melhor nível geral de liberação de filipin (Tabela 2).Não obstante, estes resultados indicam que o nível de hASM requerido paracorrigir patologia de armazenamento de colesterol é o camundongo deASMKO CNS é mínimo (isto é, abaixo do limite de detecção de imunofluo-rescência de hASM).

Estudos histológicos indicam que o cerebelo de camundongo deASMKO sofre deterioração rápida. Mais especificamente, células de Purkinjeprogressivamente morrem entre 8 e 20 semanas de idade (Sarna et al.(2001) Eur. J. Neurosci. 13:1813-1880 e Stewart et al. (2002) em "Society forNeuroscience", Orland, FL). Calbindina é um fabricante de célula de Purkinjeamplamente aceito. Tingimento positivo de calbindina em camundongos tra-tados com AAV-ASM sugeriu que expressão medida por AAV de hASM éterapêutica. No geral, nossos resultados indicam que expressão mediadapor AAV de hASM no cerebelo impede morte de células de Purkinje no ca-mundongo de ASMKO (Tabela 3). Como sobrevivência de célula de Purkinjeesperada não ocorreu nos lóbulos IVA/; camundongos foram injetados em 7semanas de idade e antes de 8 semanas a maior parte destas células já ti-nham morrido. Sobrevivência de célula de Purkinje nos lóbulos IWV foi má-xima em camundongos tratados com sorotipo 1. No lóbulo Vl nenhuma so-brevivência de célula de Purkinje significativa foi observada em camundon-gos tratados com AAV. No lóbulo Vll apenas camundongos tratados comsorotipo 5 mostraram sobrevivência de célula de Purkinje significativa. Nolóbulo Vlll novamente camundongos tratados com sorotipo 5 como tambémsorotipo 2 mostraram sobrevivência de célula de Purkinje significativa. Noslóbulos IX e X não houve nenhuma diferença significativa entre os camun-dongos de WT e de KO (ou entre camundongos tratados com AAV) em con-tagens de célula de Purkinje. Isto foi esperado, porque em 14 semanas deidade (isto é, idade de sacrifício) células de Purkinje nestes lóbulos aindasão viáveis em camundongos de ASMKO. Ao longo de todos os lóbulos, so-brevivência de célula de Purkinje foi máxima em camundongos tratados comsorotipos 1, 2, & 5 e mínima em camundongos tratados com sorotipos 7 & 8.

Tabela 3

Contagem de célula de Purkinje nos lóbulos cerebelares I-X emcamundongos WT e de ASMKO seguindo injeção intracerebelar de sorotiposde AAV diferentes (n=3/sorotipo; 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, e 2/8) codificando paraASM humana nos núcleos cerebelares profundos de camundongos deASMKO. Números que aparecem em itálico são significativamente diferentesdos camundongos de KO (isto é, camundongos tratados com AAV2/1-Pgal)ρ <0,01.

<table>table see original document page 39</column></row><table>No teste de rotarod de aceleração camundongos unilateralmenteinjetados com AAV2/1-ASM e AAV2/8-ASM demonstraram uma latência sig-nificativamente mais longa (p < 0,0009) para cair que os camundongos deASMKO injetados com AAV2/1-3gal. Camundongos injetados com sorotipoAA2/1-ASM não foram significativamente diferentes dos camundongos dotipo selvagem. Camundongos injetados com AAV2/2-ASM e AAV2/5-ASMmostraram uma tendência para uma latência mais longa de cair que os ca-mundongos de ASMKO injetados com AAV2/1-Pgal; enquanto que, camun-dongos injetados com AAV2/7-ASM não. Para o teste de rotarod de oscila-ção, apenas camundongos injetados com AA2/1-ASM demonstraram umalatência significativamente mais longa (p < 0,0001) para cair que os camun-dongos injetados com M2/1-pgal. Neste caso aqueles camundongos do tiposelvagem desempenharam-se significativamente melhores que os camun-dongos injetados com AA2/1-ASM. Camundongos de ASMKO que recebe-ram injeção bilateral ou AAV2/1-ASM ou AAV2/2-ASM desempenharam-sesignificativamente melhores (p < 0,001) que os camundongos de ASMKOtratados com AAV2/1-pgal pelos testes de aceleração e oscilação. Camun-dongos bilateralmente injetados de AAV2/1-ASM desempenharam-se com-paravelmente aos camundongos do tipo selvagem para ambos os testes.

Um modo para determinar se hASM gerado por AAV é funcio-nalmente ativo dentro do ASMKO CNS é para avaliar sua influência em pato-logia de armazenamento de colesterol - um defeito metabólico secundário dedoença de NPA. Em todos os camundongos tratados com AAV (com exce-ção para AAV2/1 -Pgal) correção de patologia de armazenamento de coleste-rol sobreposta com áreas que foram positivas para imunotingimento dehASM indicando que cada vetor de sorotipo é capaz de gerar um produto detransgene funcional. Como previamente demonstrado, correção de correçãode metabolismo de colesterol anormal também ocorreu em áreas anatomi-camente conectadas com o sítio de injeção, mas também em regiões quenão tingiram positivamente para hASM, sugerindo que o nível de hASM re-querido para correção de patologia de armazenamento de colesterol é míni-mo. Consistente com estes resultados histoquímicos e bioquímicos de hASM,os camundongos tratados com sorotipos 1 e 8 demonstraram uma reduçãonotável em patologia de armazenamento de colesterol. Camundongos trata-dos com sorotipos 2, 5, & 7 também mostraram uma redução em patologiade armazenamento de colesterol, mas não na mesma proporção que os ca-mundongos tratados com sorotipos 1 & 8.

Modelo Terapeuticamente Relevante de Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS).

Esclerose lateral amiotrófica (ALS) é uma doença neurodegene-rativa fatal que é caracterizada por uma perda seletiva dos neurônios moto-res no córtex, tronco cerebral e espinha dorsal. Progressão da doença podeconduzir à atrofia de membros, músculos axiais e respiratórios. Morte celulardos neurônios motores é acompanhada por gliose reativa, anormalidades deneurofilamento, e uma perda significativa de fibras mielinadas grandes nostratos corticoespinhais e raízes ventrais 1'6. Embora a etiologia de ALS sejamuito pouco entendida, evidências cumulativas indicam que ALS esporádico(SALS) e familial (FALS) compartilham muitas características patológicassimilares; desse modo, fornecendo uma esperança que o estudo de qual-quer forma conduzirá a um tratamento comum 7. FALS responde por apro-ximadamente 10 % dos casos diagnosticados destes 20 % são dominante-mente associados às mutações herdadas em Cu/Zn superóxido dismutase(SOD1) 8. Camundongos transgênicos que expressam proteína de SOD1humana mutante (por exemplo, camundongos de SOD1G93A) recapitulam mui-tas características patológicas de ALS e são um modelo animal disponível paraestudo ALS 9. Para SALS, uma miríade de mecanismos patológicos foi impli-cada como a causa subjacente, incluindo excitotoxicidade induzida por glu-tamato, exposição a toxinas, disfunção de proteassoma, dano mitocondrial,desorganização neurofilamentar e perda de suporte neurotrófico 10,11.

Até agora não há nenhuma terapia eficaz para o tratamento deALS. Fatores neurotróficos como fator-1 de crescimento de insulina (IGF-1)foi investigado extensivamente por sua utilidade potencial no tratamento deALS. Liberação intracraniana de vetores virais (que são capazes de trans-porte axonal) às regiões do CNS, que é interconectada com o tronco cere-bral e neurônios motores espinhais, fornece um meio de administrar terapêu-ticas potenciais, como IGF-1, às áreas que seriam do contrário difíceis dealvejar através de meios da técnica anterior.

Sem estar limitado pela teoria, pode ser que estas regiões alve-jadas não necessariamente necessitarão ter conexões diretas com neurô-nios motores; ou seja, pode ser suficiente para estas regiões alvejadas terconexões diretas com as células (por exemplo, interneurônios e astrócitos)que meramente compõem o ambiente celular do neurônio motor. Esta supo-sição é suportada por estudos em camundongos quiméricos que são mistu-ras de células normais e expressando mutante de SOD1. Estes experimen-tos mostraram que as células não-neuronais que não expressaram SOD1mutante tardaram a degeneração e significativamente estendem a sobrevi-vência dos neurônios motores de expressão de mutante 13. Além disso, ex-perimentos adicionais demonstraram que as células que compõem o ambi-ente celular de um neurônio motor (por exemplo, astrócitos e micróglia) sãofontes importantes de fatores neurotróficos, e dano a estas células (comoocorre patologicamente em ALS) foi sugerido ser um dos fatores subjacentesque contribuem para a degeneração dos neurônios motores 11.

Uma região do CNS que é provável suportar o transporte de umvetor viral terapêutico e/ou proteína expressa para o ambiente celular dosneurônios motores são os núcleos cerebelares profundos (DCN) do cerebelo.O DCN tem conexões aferentes e eferentes extensivas tanto com o troncocerebral como com a espinha dorsal (vide figura 1) 14"19. Alvejamento doDCN em um modelo de camundongo de doença neurometabólica com veto-res virais capazes de transporte axonal resultou na detecção da proteína detransgene no tronco cerebral e espinha dorsal 20. De forma interessante aproteína de transgene foi detectada em células que foram tanto positivascomo negativas para colina acetiltransferase (ChaT), um marcador de neu-rônio motor.

Sobre-expressão das mutações de gene de superóxido dismuta-se-1 (SOD1) em camundongos e ratos recapitulam as características clíni-cas e patológicas de ALS em humanos. Compostos ativos em retardar ossintomas neste modelo foram mostrados ser predicativos para eficácia clíni-ca em pacientes com ALS1 e são portanto um modelo terapeuticamente rele-vante desta doença. Tais modelos de camundongo foram previamente des-critos em Tu et al. (1996) P.N.A.S. 93:3155-3160; Kaspar et al. (2003) Sci-ence 301 :839-842; Roaul et al. (2005) Nat. Med. 11(4):423-428 e Ralph et al.(2005) Nat. Med. 11 (4):429-433.

Portanto, os experimentos atuais buscaram investigar a influên-cia de liberação de DCN bilateral de AAV-IGF-1 na progressão de doençaem camundongos de SOD1G93A sintomáticos (isto é, 90 dias de idade).Especificamente, as metas primárias foram determinar se a liberação deAAV-IGF-1 resultou em (1) liberação de vetor e/ou proteína para o troncocerebral e espinha dorsal; (2) uma redução em neuropatologia no tronco ce-rebral e espinha dorsal; (3) melhoria na função de comportamento motor; e(4) uma extensão significativa de período de vida. Os resultados indicam quea injeção de vetores virais para regiões do CNS que são interconectadascom o tronco cerebral e espinha dorsal é um método viável para liberartransgenes terapêuticos potenciais ao tronco cerebral e à espinha dorsal.Além disso, nossos resultados suportam o desenvolvimento de terapias quesão projetadas para tratar degeneração de neurônio motor através de modi-ficação de seu ambiente celular.

Dois estudos foram executados no SOD1 de G93A (camundon-go de SOD1G93A mutante, referido aqui ao camundongo de SOD1). Estemodelo mimetiza exatamente ALS humana. Há degeneração de neurôniomotor progressiva com déficits motores dos membros traseiros que apare-cem por volta de 90 dias de idade no camundongo. Morte ocorre por volta de120 - 122 dias. Cada estudo teve quatro grupos de tratamento: 1) camun-dongos receberam sorotipo de AAV 1 codificando para IGF-1 (AAV1-IGF-1);2) camundongos receberam sorotipo de AAV 1 codificando para proteínafluorescente verde (AAV1-GFP); 3) camundongos receberam sorotipo deAAV 2 codificando para IGF-1 (AAV2-IGF-1); e 4) camundongos receberamsorotipo de AAV 2 codificando para proteína fluorescente verde (AAV2-GFP).

Sem estar limitado pela teoria, IGF-1 é uma proteína terapêuticapara o tratamento de ALS devido a suas muitas ações em níveis diferentesde neuraxia (vide Dire et al., Tends Neurosci, 1997, 20:326-331). No cérebro:é suposto reduzir apoptose neuronal e glial, proteger neurônios contra toxici-dade induzida por ferro, colquicina, desestabilizantes de cálcio, peróxidos ecitocinas. Isto é também suposto modular a liberação de acetilcolina de neu-rotransmissores e glutamato. É também suposto induzir a expressão de neu-rofilamento, tublina e proteína básica de mielina. Na espinha dorsal: IGF-1 ésuposto modular atividade de ChaT e atenuar perda de fenótipo colinérgico,intensificar brotamento de neurônios motores, aumentar mielinação, inibirdesmielinação, estimular proliferação de neurônios motores e diferenciaçãode células precursoras, e promover divisão, maturação, e crescimento decélulas de Schwann. No músculo: IGF-1 é suposto induzir formação de a-grupamento de receptor de acetilcolina na junção neuromuscular e aumentarfunção neuromuscular e resistência muscular. Neste experimento, a formade IGF-1 Ea da proteína foi utilizada.

Proteína fluorescente verde foi utilizada como uma proteína decontrole que também permitiu a visualização de expressão mediada pelainjeção dos vetores de AAV.

Noventa dias após nascimento, camundongos de SOD1 forambilateralmente injetados no DCN com os vetores de AAV recombinantes. Emum estudo, a dose foi aproximadamente 2,0 e 10 gc/ml injetados por sítio.Certos camundongos foram sacrificados aproximadamente 110 dias apósnascimento e seus cérebro e espinha dorsal foram analisados por tingimentode GFP, expressão de IGF-1 por meio de imunoistoquímica, expressão deIGF-1 por meio de ELISA, expressão de IGF-1 por meio de TA-PCR, Iocali-zação de ChaT por meio de imunoistoquímica, expressão de proteína acídi-ca fibrilar glial (GFAP), contagem de neurônios motores, testagem funcional(oscilação e aceleração) no rotarod como descrito acima, resistência ao a-perto dos membros dianteiros e membros traseiros usando um medidor deresistência ao aperto, e sobrevivência.

Um "evento de morte" foi entrado quando os animais não pude-ram mais "endireita-se" dentro de 30 segundos após o animal ter sido deita-do de costas, ou os animais foram encontrados mortos pelos técnicos decuidado do animal. Classificação de "evento de morte" foi executada por 2indivíduos com o grupo do animal (GFP vs. IGF-1 que é cego) no tempo deavaliação.

GFP foi detectado no tronco cerebral e ao longo de cada divisãoda espinha dorsal seguindo liberação bilateral de um vetor de expressão deGFP de AAV para os núcleos cerebelares profundos (DCN) (vide figuras 13e 14). A figura 22 mostra distribuição de GFP dentro do cérebro do camun-dongo. Além do DCN1 tingimento positivo de GFP foi também observado nosbolbos olfatórios, córtex cerebral, tálamo, tronco cerebral, córtex cerebelarese espinha dorsal. Todas estas áreas ou recebem projeções e/ou enviaramprojeções ao DCN. Além disso, fibras e/ou células positivas de GFP foramobservadas em proximidade às células positivas de ChaT.

MRNA de IGF-1 foi detectado no tronco cerebral e em cada divi-são da espinha dorsal em camundongos tratados com AAV1-IGF-1 ou A-AV2-IGF-1 que demonstram que o vetor sofreu transporte retrógrado (videfigura 18). Proteína de IGF-1 foi detectada no tronco cerebral e na espinhadorsal em camundongos tratados com AAV1 -IGF-1 ou AAV2-IGF-1. Umaredução no tingimento de GFAP nos núcleos oromotores (por exemplo, onúcleo motor trigeminal, núcleo facial e núcleo hipoglossal) e em cada divi-são da espinha dorsal foi observada em camundongos tratados com AAV1-IGF-1 ou AAV2-IGF-1 (vide figuras 15-17). GFAP é um marcador de glioseque é uma marca patológica de ALS. Liberação de AAV1-IGF-1 ou AAV2-IGF1 conduziram à melhoria funcional significativa nas tarefas de rotarod ede resistência ao aperto (vide figura 20). Liberação de AAV-IGF-1 AAV2-IGF1 também significativamente estenderam o período de vida do camun-dongo de SOD1 (vide figura 21 onde sobrevivência mediana aumentou para133,5 ou 134 dias em camundongos tratados com AAV-IGF-1 quando com-parado a 121 ou 120 dias em camundongos tratados com AAV-GFP). Figura19 ilustra que liberação de DCN de AAV-IGF-1 promoveu a sobrevivência deneurônios motores. A diferença entre os camundongos tratados com AAVque codifica para IGF-1 quando comparada à liberação de DCN de AAV quecodifica para GFP é estatisticamente significativa para um valor ρ = 0,01como indicado pelo asterisco.

Independente do sorotipo, tratamento de AAV-IGF-1 significati-vamente promoveu sobrevivência de neurônio motor, desempenho motormelhorado em testes de rotarod e resistência ao aperto, e período de vidasignificativamente estendido. Expressão de IGF-1 foi detectada ao longo dotronco cerebral e da espinha dorsal usando PCR e ELISA.

O relatório descritivo é completamente entendido levando emconta os ensinamentos das referências citadas dentro do relatório descritivo.As modalidades dentro do relatório descritivo fornecem uma ilustração dasmodalidades da invenção e não deveriam ser interpretadas para limitar oescopo da invenção. O artesão versado reconhece facilmente que muitasoutras modalidades são abrangidas pela invenção. Todas as publicações,patentes, e seqüências biológicas citadas nesta descrição são incorporadaspor referência em sua totalidade. À medida que o material incorporado porreferência contradiz ou é incompatível com o presente relatório descritivo, opresente relatório descritivo substituirá qualquer tal material. A citação dequalquer referência aqui não é uma admissão que tais referências sejamtécnica anterior à presente invenção.

A menos que do contrário indicado, todos os números que ex-pressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tra-tamento, e assim sucessivamente usados no relatório descritivo, incluindoreivindicações, são para ser entendidos como sendo modificados em todasas circunstâncias pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a menos quediferentemente indicado ao contrário, os parâmetros numéricos são aproxi-mações e podem muito dependendo das propriedades desejadas buscadasser obtidos pela presente invenção. A menos que do contrário indicado, otermo "pelo menos" precedendo uma série de elementos é para ser entendi-do para referir a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica reco-nhecerão, ou serão capazes de averiguar usando experimentação mais querotineiras, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção des-critas aqui. Tais equivalentes são intencionados ser abrangidos pelas reivin-dicações a seguir.Listagem de Referências

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Claims

1. Método compreendendo administrar um vetor viral neurotrópi-co recombinante compreendendo um transgene a pelo menos uma região daregião dos núcleos cerebelares profundos do cérebro, em que a dita admi-nistração está sob condições que favorecem a liberação do produto detransgene à espinha dorsal e/ou tronco cerebral.

2. Método compreendendo administrar um vetor viral neurotrópi-co recombinante compreendendo um transgene à região do córtex motor docérebro, em que a dita administração está sob condições que favorecem aliberação do produto de transgene à espinha dorsal.

3. Método para liberar um transgene a um neurônio motor emum indivíduo, compreendendo administrar um vetor viral neurotrópico re-combinante compreendendo o dito transgene a pelo menos uma região daregião dos núcleos cerebelares profundos do cérebro, em que o dito trans-gene é expressado ou liberado em um neurônio motor distai ao dito sítio deadministração.

4. Método para liberar um transgene a um neurônio motor emum indivíduo, compreendendo administrar um vetor viral neurotrópico com-preendendo o dito transgene à região do córtex motor do cérebro, em que odito transgene é expressado ou liberado a um neurônio motor distai ao ditosítio de administração.

5. Método para tratar um distúrbio de neurônio motor em um in-divíduo, compreendendo administrar um vetor viral neurotrópico recombinan-te compreendendo um transgene terapêutico a pelo menos uma região daregião dos núcleos cerebelares profundos do cérebro, em que o produto detransgene é liberado em uma quantidade terapeuticamente eficaz a pelomenos uma subdivisão da espinha dorsal e/ou pelo menos uma divisão dotronco cerebral.

6. Método para melhorar os sintomas de um distúrbio de neurô-nio motor em um indivíduo, compreendendo administrar um vetor viral neuro-trópico recombinante compreendendo um transgene terapêutico à região docórtex motor do cérebro, em que o produto de transgene é liberado em umaquantidade terapeuticamente eficaz a pelo menos uma subdivisão da espi-nha dorsal.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,em que o dito vetor viral neurotrópico é um vetor viral adeno-associado (AAV).

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6,em que o dito vetor viral neurotrópico é um vetor viral adeno-associado, se-lecionado de um grupo que consiste em AAV1, AAV2, AAV3, AA V4, AAV5,AAV6, AAV7, e AAV8.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3ou 5, em que a dita região da região dos núcleos cerebelares profundos docérebro é selecionada do grupo que consiste na região mediana, região in-terposta e na região lateral.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que a dita liberação é bilateral.

11. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que a ditasubdivisão de espinha dorsal é selecionada do grupo que consiste na subdi-visão cervical, na subdivisão torácica, na subdivisão lombar, e na subdivisãosacra.

12. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, em que o ditotransgene é liberado a todas as subdivisões da espinha dorsal.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que pelo me-nos uma das ditas múltiplas administrações é bilateral.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito transgene é selecionado do grupo que consiste em fator-1de crescimento de insulina (IGF-1), calbindina D28, paralbumina, HIF1 -alfa,SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2 e CNTF (Fator neurotrófico ciliar).

15. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a expres-são do dito transgene alivia os sintomas de um distúrbio neuronal motor se-lecionado do grupo que consiste em esclerose lateral amiotrófica (ALS), es-clerose lateral primária (PLS), atrofia muscular bulbar espinhal, ataxia cere-belar espinhal, atrofia muscular espinhal, e lesão traumática de espinha dor-sal.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito indivíduo é um paciente humano.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o dito transgene expressa uma quantidade terapêutica de umaproteína selecionada do grupo que consiste em fator-1 de crescimento deinsulina (IGF-1), EPO (eritropoietina), CBP (proteína de ligação de proteínaIigadora de elemento de resposta de cAMP [CREB]), calbindina D28, paral-bumina, HIF1-alfa, SIRT-2, VEGF, SMN-1, SMN-2 e CNTF (fator neurotróficoCiliar).