BRPI0611554A2 - usos do tripeptìdeo map e/ou do tripeptìdeo itp, produto alimentìcio funcional e processo para a preparação de um produto alimentìcio funcional - Google Patents

Abstract

USOS DO TRIPEPTIDEO MAP E/OU DO TRIPEPTIDEO ITP, PRODUTO ALIMENTìCIO FUNCIONAL E PROCESSO PARA A PREPARAçãO DE UM PRODUTO ALIMENTìCIO FUNCIONAL. A presente invenção refere-se ao tripeptideo MAP e/ou ao tripeptídeo ITP e/ou aos seus sais para o uso como um agente benéfico à saúde, em especial, em produtos alimentícios funcionais. Os tripeptideos possuem aplicações específicas nas áreas na prevenção da obesidade e controle do peso corpóreo e na manutenção da saúde cardiovascular, especialmente a inibição da enzima conversora da angiotensina e o controle do colesterol no sangue.Também são fornecidos produtos alimentícios funcionais que compreendem esses tripeptideos e que possuem benefícios à saúde nestas áreas e o processo para a fabricação destes produtos. Os tripeptídeos podem ser incorporados de maneira conveniente nos produtos alimentícios para fornecer os benefícios à saúde mencionados acima ao seu consumidor.

Description

"USOS DO TRIPEPTÍDEO MAP E/OU DO TRIPEPTÍDEO ITP, PRODUTOALIMENTÍCIO FUNCIONAL E PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMPRODUTO ALIMENTÍCIO FUNCIONAL"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a certos peptídeos para o usocomo agentes de beneficio à saúde. Ainda, a presente invenção refere-se acertos peptídeos para o uso nas áreas de prevenção da obesidade ou controledo peso corpóreo e manutenção da saúde cardiovascular, especialmente ainibição da enzima de conversão da angiotensina. A presente invenção refere-se ainda a produtos alimentícios que compreendem certos peptídeos e que sãoapropriados para fornecer os benefícios à saúde mencionados acima.

Antecedentes da Invenção

Em geral, as pessoas estão se tornando mais conscientes daimportância dos problemas de saúde e estão procurando maneiras maiseficazes e convenientes de manter e melhorar seu bem estar. Isto pode resultarna procura dos consumidores por maneiras de manter seu atual bem estar comrelação à saúde, ou na procura por melhorar um aspecto particular de sua saúde.

Entretanto, enquanto os consumidores freqüentementemanifestam um desejo de consumir uma dieta saudável e alimentos saudáveis,em geral, eles não dispensam as conveniências e o prazer para tal. Portanto,qualquer produto que geralmente pretende manter ou melhorar a saúde, quepossuirá grande aceitação entre os consumidores, deverá ser eficaz em termosde beneficio fornecido à saúde, ser conveniente para o consumidor utilizar etambém ser aceitável em termo de propriedades organolépticas. Idealmente, osconsumidores querem obter benefícios à saúde a partir dos ingredientespredominantemente naturais.

Conforme indicado acima, os consumidores se mostraram, emgeral, ser indispostos a comprometer o prazer que eles obtêm dos produtosalimentícios a fim de obter um benefício à saúde dos mesmos. Portanto,também é importante que os produtos alimentícios e os ingredientes que sãoutilizados para fornecer os benefícios da saúde sejam aceitáveis em termos depropriedades organolépticas.

A incidência da obesidade e do número de pessoas consideradasacima do peso em muitos países aumentou drasticamente ao longo da últimadécada. Uma vez que obesidade e estar acima do peso são geralmenteconhecidos por estarem associados com uma variedade de doenças tais comodoenças cardíacas, hipertensão, diabetes tipo 2 e arteriosclerose, esseaumento é uma grande preocupação da saúde para a comunidade médica eigualmente para os indivíduos. Além disso, estar acima do peso é consideradocomo não atraente pela maioria da população ocidental.

Isto levou a um aumento do interesse pelos consumidores namanutenção ou redução de seu peso corporal e criou uma demanda porprodutos que podem ser utilizados por consumidores para esses propósitos.São de interesse especial para os consumidores tais produtos alimentícios quepodem ser consumidos convenientemente como parte de sua dieta diária. Osexemplos de tais produtos incluem os produtos substituintes de refeição, taiscomo barras e bebidas que substituem refeição. Esses produtos substituintesde refeição são, em geral, pretendidos a serem consumidos como um produtoalimentício de porção única, tais como uma barra ou uma bebida, parasubstituir uma ou duas refeições por dia.

Entretanto, um problema geral com os alimentos pretendidos paraserem utilizados para manter ou reduzir o peso corporal é que enquanto elesfornecem um número controlado de calorias por porção, o consumidorfreqüentemente sente que o efeito da saciedade obtido a partir dessesprodutos não é ótimo. Isso pode resultar em sensações de fomeexperimentadas pelo consumidor em um tempo relativamente curto após aingestão dos produtos e/ou não se sentir completamente saciado após aingestão dos produtos. Ambos os cenários podem tornar mais difícil para umindivíduo seguir uma dieta de calorias controladas ou outro plano deadministração do peso.

A hipertensão ou pressão sangüínea alta é considerada comosendo um dos principais fatores de risco para as Doenças Cardio-Vasculares(DCV). Um dos mecanismos que regula a pressão sangüínea é o sistemarenina-angiotensina. Este é uma cascata de reações que levam à formação daangiotensina II, que possui um forte efeito de vasoconstrição e, portanto, deaumento da pressão sangüínea. A inibição de uma das enzimas chaves nestacascata: a Enzima de Conversão da Angiotensina I (ECA) reduz a formação daangiotensina Il e, assim, possui um efeito de redução da pressão sangüínea.

Os estudos de intervenção humana a longo prazo mostram que as ingestõesregulares de baixas quantidades de inibidores da ECA reduz a DCV em 25%(Gerstein et al. (2000), The Lancet 355, 253-259).

Os inibidores da ECA nos produtos alimentícios são bemconhecidos. Tais produtos alimentícios foram, por exemplo, preparados pelafermentação do leite ou de produtos lácteos. Nos estudos controlados complacebo, o efeito de redução da pressão sangüínea de VPP e IPP em soro deleite foi mostrado em humanos hipertensos (Hata1 Y et al. (1996), AmericanJournal of Clinicai Nutrition 64, 767-771).

Um produto lácteo fermentado disponível comercialmente, quealega ser "adequado para aqueles com hipertensão leve" é o soro de leiteCalpis, fermentado com Lactobacillus helveticus e Saccharomyces eervisiae,produzido pela Indústria Alimentícia Capis, Japão. Outro produto fermentadodisponível comercialmente é o Evolus, produzido pela Valio, Finlândia. Estesprodutos lácteos fermentados são fermentados com cepas de Lactobacillushelveticus (Lb. helveticus). Os produtos contêm peptídeos bioativos (VPP eIPP) que são produzidos por proteólise de caseínas e que mostraram a inibiçãode ECA in vitro.

Entretanto, apesar dos desenvolvimentos acima, ainda há umanecessidade de fornecer ingredientes naturais que podem, de maneira segura,tanto serem consumidos sozinhos, ou incorporados a diversos produtosalimentícios, e que fornecem um ou mais benefícios à saúde ao indivíduo queconsome o ingrediente ou produto alimentício. Além do mais, há umanecessidade em fornecer tais produtos alimentícios que não são afetadosadversamente pela inclusão de tais ingredientes, por exemplo, em termos deestabilidade e/ou propriedades organolépticas. Os consumidores nãomostraram até hoje uma boa vontade de comprometer o sabor e/ou aqualidade de seus alimentos enquanto desejam ainda obter os benefícios dasaúde a partir das suas dietas.

Portanto, é um objeto da presente invenção localizar um ou maisdos problemas acima.

É ainda outro objeto da presente invenção fornecer um materialcomestível que pode ser utilizado para fornecer os benefícios à saúde para umindivíduo que o consome. É ainda um outro objeto fornecer tal materialcomestível que pode ser convenientemente ingerido de forma isolada ouincorporada a um produto alimentício.

É um outro objeto da presente invenção fornecer um produtoalimentício ou ingrediente que pode ser incorporado no mesmo, que éapropriado para o uso nos programas de controle de peso corporal.

É ainda um objeto da presente invenção fornecer um produtoalimentício ou ingrediente que pode ser incorporado no mesmo que éapropriado para auxiliar a manter a saúde cardiovascular, por exemplo, atravésda inibição da ECA.É um outro objeto da presente invenção fornecer um produtoalimentício ou um ingrediente que pode ser incorporado no mesmo que possuiestabilidade e/ou propriedades organolépticas aceitáveis, em particular um bomsabor, tal como uma ausência ou um nível aceitável de amargura.

É um outro objeto fornecer um produto alimentício que possuiuma alta concentração de um ingrediente que fornece um beneficio à saúde, talcomo a uxiliar na prevenção da obesidade/ controle do peso corporal e/ouajudar a manter a saúde cardiovascular.

Descrição Resumida da Invenção

Surpreendentemente, um ou mais desses objetos é realizado deacordo com a presente invenção pelo uso do tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeoITP e/ou seus sais na forma isolada ou para a preparação de um produtoalimentício que fornece um beneficio à saúde no consumo.

De acordo com um primeiro aspecto, a presente invenção forneceo uso do tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeo ITP e/ou seus sais para a fabricaçãodo produto alimentício funcional para a prevenção da obesidade ou controle dopeso corporal.

De acordo com um segundo aspecto, a presente invenção forneceo uso do tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeo ITP e/ou seus sais para a fabricaçãodo produto alimentício funcional para a manutenção da saúde cardiovascular.

É especialmente preferido, de acordo com a presente invenção,que a manutenção da saúde cardiovascular compreenda a inibição da enzimaconversora de angiotensina (ECA) e/ou o controle dos níveis sangüíneos deglicose.

De acordo com um terceiro aspecto, a presente invenção forneceum produto alimentício funcional capaz de fornecer um beneficio à saúde paraseu consumidor, sendo que ditos benefícios à saúde são selecionados a partirda prevenção da obesidade, controle do peso corporal e manutenção da saúdecardiovascular e compreendem uma quantidade de 0,1 mg/ kg ou mais de MAPe/ou 1 mg/ kg ou mais do tripeptídeo ITP.

De acordo com um quarto aspecto a presente invenção forneceum processo para a preparação de um produto alimentício funcional, sendoque o processo compreende as etapas de:

(a) hidrólise enzimática de um substrato de proteína caseína quecompreende a β-caseína e/ou a a-s2-caseína resultando em um produto decaseína hidrolisado;

(b) separação do produto de caseína hidrolisada de uma fraçãorica em tripeptídeo MAP e/ou de tripeptídeo ITP; e,

(c) utilização da fração rica em tripeptídeo de MAP e/ou detripeptídeo ITP como ingrediente na preparação do produto alimentíciofuncional.

Descrição Detalhada da Invenção

É especialmente preferido que o tripeptídeo seja MAP.

Uma das vantagens dos tripeptídeos de acordo com a presenteinvenção é que eles foram descritos como sendo relativamente estáveis notrato gastrointestinal. Isto permite uma boa atividade dos tripeptídeos após oconsumo tal que os benefícios eficazes à saúde podem ser obtidos a partir dosmesmos após o consumo.

Uma vantagem adicional dos tripeptídeos de acordo com apresente invenção é que eles podem ser convenientemente incorporadosnos produtos alimentícios para produzir produtos alimentícios funcionais,sem afetar de maneira inaceitável sua estabilidade e/ou propriedadesorganolépticas.

De acordo com a presente invenção, o(s) "agente(s) de beneficioà saúde" são materiais que fornecem um benefício à saúde que possui umefeito positivo em um aspecto da saúde ou que auxilia a manter um aspecto deboa saúde, quando ingerido, estes aspectos de boa saúde sendo a prevençãoda obesidade, controle do peso corporal e manutenção da saúdecardiovascular. "Benefício à saúde" significa que possui um efeito positivo emum aspecto da saúde ou auxilia a manter um aspecto de boa saúde.

De acordo com a presente invenção "produtos alimentíciosfuncionais" são definidos como produtos alimentícios (incluindo, por precauçãoda dúvida, as bebidas), adequados para o consumo humano, em que MAPe/ou ITP são utilizados como um ingrediente em uma quantidade eficaz, tal queé obtido um benefício notável à saúde do consumidor do produto alimentício.

O termo "compreende" onde utilizado no presente não significaque é Iimitante a quaisquer elementos subseqüentemente citados, mas naverdade engloba elementos não especificados de maior ou menor importânciafuncional. Em outras palavras, as etapas listadas, elementos ou opções nãoprecisam ser exaustivos. Sempre que as palavras "incluindo" ou "possuindo"são utilizadas, esses termos têm a intenção de serem equivalentes a"compreendem", conforme definido acima.

Exceto nos exemplos funcionais e comparativos, ou onde indicadoexplicitamente o contrário, todos os números nessa descrição indicamquantidades de material ou condição de reação, propriedades físicas dosmateriais e/ou uso são entendidas como sendo modificadas pela palavra "cercade". Todas as quantidades estão em peso, com base no peso total do produtorelevante a menos que especificado de outra maneira.

Para uma explicação completa das características acima e deoutras, e d as vantagens da presente invenção deve ser feita referência àseguinte descrição das realizações preferidas. A menos que afirmado de outramaneira, as realizações preferidas se aplicam a todos os aspectos da presenteinvenção e podem ser utilizadas como apropriadas para cada aspecto.

MAP (Met-AIa-Pro) corresponde à posição da β-caseína 102-104,e ITP (IIe-Thr-Pro) à posição da a-s2-caseína 119-121.

De acordo com a presente invenção, os tripeptídeos MAP e/ouITP podem ser utilizado para fornecer uma gama de benefícios à saúde paraum indivíduo que os consome (na forma isolada ou incorporada em umproduto alimentício para fornecer um produto alimentício funcional). Emparticular, os benefícios à saúde que podem ser fornecidos pelo uso de MAPe/ou ITP incluem;

- a prevenção da obesidade/ controle do peso corporal,

- manutenção da saúde cardiovascular, especialmente através dainibição da enzima conversora de angiotensina e do controle dos níveissangüíneos de colesterol.

Produção de MAP/ ITP

Podem ser produzidos MAP e/ou ITP pela hidrólise oufermentação de qualquer substrato de proteína que contém as seqüências deaminoácidos MAP e/ou ITP. Vantajosamente, o substrato de proteína contémambas as seqüências de aminoácidos MAP e ITP.

Através da otimização das condições de fermentação ou hidrólise,a produção das moléculas biologicamente ativas MAP e/ou ITP pode sermaximizada. Um técnico no assunto que tentar maximizar a produção, irá sabercomo ajustar os parâmetros do processo, tais como tempo de hidrólise,temperatura de hidrólise, tipo de enzima e concentração, etc.

Para a otimização do hidrolisado, a identidade dos precursoresdos peptídeos ativos precisa ser conhecida. Entretanto, a detecção e aidentificação dos peptídeos biologicamente ativos nos hidrolisados oufermentos complexos é uma tarefa desafiadora. Tipicamente, apenas algunspeptídeos biologicamente ativos estão presentes em níveis relativamentebaixos em uma amostra complexa que contém centenas de peptídeos. Ométodo de identificação tradicional no emprego de ciclos repetidos dofracionamento cromatográfico líquido de alta eficiência (HPLC) e da avaliaçãobioquímica são, em geral, demorados e propensos à perda da atividade, e,portanto não são completamente satisfatórios.

No presente trabalho, um ensaio bioquímico de fluxo contínuo éintegrado em série a um sistema de fracionamento de HPLC. Para adeterminação das características de inibição da ECA de MAP e ITP, o efluenteda coluna de HPLC é dividido entre um bioensaio ECA de fluxo contínuo e umatécnica de análise química (espectrometria de massa). Os hidrolisados nãoretificados são separados por HPLC, após o qual a presença de compostosbiologicamente ativos é detectada por meios do ensaio bioquímico em série.

Os espectros de massa são registrados continuamente. Assim, a informaçãoestrutural é imediatamente disponível quando um peptídeo mostra um sinalpositivo no ensaio bioquímico. Outros ensaios bioquímicos de fluxo contínuopodem ser apropriados para serem utilizados na avaliação de outras atividadesbiológicas potenciais dos peptídeos.

Agentes de Benefício à Saúde

O MAP e o ITP podem ser utilizados diretamente, de formaisolada ou como parte de uma mistura de peptídeos, para fornecer osbenefícios à saúde descritos no presente aos seus consumidores. Entretanto, épreferido de acordo com a presente invenção que MAP e ITP sejamincorporados nos produtos alimentícios para fornecer produtos alimentíciosfuncionais que fornecem benefícios à saúde descritos no presente aosconsumidores de tais produtos alimentícios funcionais.

Produtos Alimentícios Funcionais: Produção

Os produtos alimentícios funcionais de acordo com a presenteinvenção fornecem um benefício notável à saúde para o consumidor do produtoalimentício. Em particular, o efeito notável à saúde é, de preferência, pelomenos, um dos seguintes; redução do peso corporal ou manutenção do pesocorporal, supressão do apetite ou a provisão da saciedade e/ou a manutençãoda saúde cardiovascular incluindo a inibição da enzima conversora deangiotensina.

Os termos "produto(s) alimentício(s) funcional(is)" e "produto(s)alimentício(s)" são utilizado intercambiavelmente no presente onde ambos sereferem aos produtos alimentícios que compreendem os tripeptídeos dapresente invenção.

Os produtos alimentícios de acordo com a presente invençãopodem ser feitos por qualquer processo apropriado. De preferência, eles sãofeitos a partir de um processo que compreende as seguintes etapas:

(a) hidrólise enzimática de um substrato de proteína caseína quecompreende a β-caseína e/ou a a-s2-caseína resultando em um produto decaseína hidrolisado;

(b) separação do produto de caseína hidrolisada de uma fraçãorica em tripeptídeo MAP e/ou de tripeptídeo ITP; e,

(c) utilização da fração rica em tripeptídeo de MAP e/ou detripeptídeo ITP como ingrediente na preparação do produto alimentíciofuncional.

É especialmente preferido que os produtos alimentícios funcionaissejam feitos de acordo com o processo que compreendem as seguintesetapas:

(a) hidrólise enzimática de um substrato de proteína quecompreende o produto de proteína hidrolisado;

(b) separação do produto de proteína hidrolisado de uma fraçãorica em tripeptídeo MAP e/ou em tripeptídeo ITP; e, opcionalmente,

(c) concentração e/ou secagem da fração da etapa (b) para obterum sólido rico em tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeo ITP; e

(d) utilização o sólido preparado na etapa (c) como um ingredientena preparação do produto alimentício.

A hidrólise enzimática da etapa (a) pode ser qualquer tratamentoenzimático de um substrato de proteína apropriado que leva à hidrólise daproteína resultando na liberação de MAP e/ou ITP.

De preferência, o substrato de proteína pode ser qualquermaterial que contém a seqüência de aminoácidos MAP e/ou ITP. Os substratosde proteínas conhecidos por englobar MAP são, por exemplo, a caseína, glútende trigo, isolado, proteína de ovo, proteína do arroz e proteína de girassol. Osexemplos de substratos especialmente apropriados incluem o leite integral,leite desnatado, caseína (ácida) ou caseinato, caseína renina, produtos do soroácido ou produtos do soro de queijo.

De maior preferência, o substrato de proteína é a caseína ou oleite. O leite, a caseína, o pó de caseína, os concentrados do pó de caseína, osisolados do pó de caseína, ou a β-caseína ou a a-s2-caseína. De preferência,um substrato que possui um alto teor de caseína, tal como o isolado daproteína de caseína (CPI) ou o caseinato.

A enzima utilizada na etapa (a) pode ser qualquer enzima que écapaz de hidrolisar a β-caseína e/ou alfa-s2-caseína resultando na liberação deum ou mais de MAP e/ou de ITP. Um hidrolisado apropriado contendo MAP eITP pode ser obtido pela hidrólise com uma endoprotease e um tripeptídeoconforme descrito no documento WO 03/102905.

A separação da etapa (b) (ou a concentração da etapa (b)) podeser realizada de qualquer maneira pelo técnico no assunto, por exemplo, porfiltração, centrifugação ou cromatografia e suas combinações. De preferência,a separação da etapa (b) é realizada utilizando uma técnica de uItrafiItração(UF) e/ou de nanofiltração (NF). O tamanho dos poros das membranasutilizadas na etapa de filtração, bem como a carga da membrana pode serutilizada para controlar a separação do tripeptídeo MAP e/ou do tripeptídeoITP. O fracionamento dos hidrolisados de proteína da caseína que utilizam asmembranas UF/NF carregadas é descrito em Y. Poilot et al, Journal ofMembrane Science 158 (1999) 105-114. A eletrodiálise é, por exemplo,descrita no documento WO 00/42066.

A etapa de secagem (c) envolve a secagem da fração da etapa

(b) para obter um sólido rico em tripeptídeo MAP e/ou em tripeptídeo ITP. Estaetapa pode ser realizada de modo convencional, por exemplo, pela secagempor aspersão ou secagem por congelamento.

A fração rica em peptídeos preparados na etapa (b) é, daqui pordiante designada como fração de benefício à saúde e o sólido preparado na etapa

(c) é, daqui por diante designado como sólido de benefício à saúde. A fração debenefício à saúde e/ou o sólido de benefício à saúde pode ser vantajosamenteutilizado como um ingrediente em um produto alimentício funcional.

Produtos Alimentícios Funcionais: Ingredientes

O produto alimentício de acordo com a presente invenção, ou osprodutos alimentícios derivados dos mesmos, podem ser pasteurizados ouesterilizados. Quando os tripeptídeos da presente invenção são adicionadosaos produtos alimentícios, um produto alimentício funcional é fornecido.

Os produtos alimentícios funcionais de acordo com a presenteinvenção podem ser de qualquer tipo de alimento, incluindo as bebidas. Elespodem compreender os ingredientes alimentícios comuns tais comoflavorizantes, açúcares, frutas, minerais, vitaminas, estabilizantes,espessantes, etc., em quantidades apropriadas dependendo do tipo do produtoalimentício.

Dependendo do benefício à saúde que pretende ser fornecido aoconsumidor do produto alimentício funcional, o produto alimentício funcional deacordo com a presente invenção compreende, de preferência, de 50 a 200mmol/ Kg de K+ e/ou de 15 a 60 mmol/ Kg de Ca2+ e/ou de 6 a 25 mmol/ Kg deMg2+. De maior preferência, o produto alimentício compreende de 100 a 150mmol/ Kg de K+ e/ou de 30 a 50 mmol/ Kg de Ca2+ e/ou de 10 a 25 mmol/ Kgde Mg2+, e de maior preferência, ainda, de 110 a 135 mmol/ Kg de K+ e/ou de35 a 45 mmol/ Kg de Ca2+ e/ou de 13 a 20 mmol/ Kg de Mg2+. Estes cátionspossuem um efeito à saúde benéfico, por exemplo, de redução adicional dapressão sangüínea quando incorporados nos produtos alimentícios de acordocom a presente invenção.

Vantajosamente, o produto alimentício funcional compreende umaou mais vitaminas B, em especial quando o produto alimentício pretendefornecer efeitos de inibição da ECA/ proteção contra doenças cardiovasculares.

A vitamina B é, de preferência, um ou mais do ácido fólico, Vitamina B2,Vitamina B6 e Vitamina B12. De preferência, a composição compreende todasas vitaminas B do ácido fólico, Vitamina B2, Vitamina B6 e Vitamina B12.

O ácido fólico é a forma estável e sintética dos folatos deocorrência natural. O ácido fólico é conhecido por participar no metabolismo dahomocisteína que é um aminoácido da dieta humana. Os altos níveis dehomocisteína foram correlacionados a um aumento no risco de doençascardiovasculares. Acredita-se que a diminuição da homocisteína pode reduziros riscos de doença cardiovascular. No presente, o termo ácido fólico tambéminclui os folatos.

As vitaminas B6 e B12 são também conhecidas por interferir nabiossíntese da purina e da tiamina, por participar na síntese do grupo metila noprocesso de metilação da homocisteína para a produção de metionina e emdiversos processos do crescimento. A Vitamina B6 (cloreto de piridoxina) é umsuplemento vitamínico conhecido. A Vitamina B12 (cianocobalamina) contribuipara a saúde do sistema nervoso e está envolvida na produção de célulasvermelhas sangüíneas. Também é conhecida como uma vitamina nossuplementos alimentares.Devido aos seus efeitos positivos combinados na redução do riscode doenças cardiovasculares, é preferível que os produtos alimentíciosfuncionais, de acordo com a presente invenção, em especial aqueles quepretendem fornecer benefícios à saúde contra doenças cardiovasculares,compreendam a Vitamina B6 e a Vitamina B12 e o ácido fólico.

A quantidade de vitaminas B no produto alimentício funcionalpode ser calculada pelo técnico no assunto, com base nas quantidades diáriasdestas vitaminas B dadas no presente: Ácido fólico: 200 a 800 pg/ dia, depreferência, 200 a 400 pg/ dia; Vitamina B6: 0,2 a 2 mg/ dia, de preferência, 0,5a 1 mg/ dia e Vitamina B12: 0,5 a 4 pg/ dia, de preferência, 1 a 2 pg/ dia.

De preferência, o produto alimentício compreende um ou maisfitosteróis, fitostanóis e/ou análogos ou seus derivados.

Tipicamente os fitosteróis, fitostanóis e/ou análogos ou seusderivados podem ser selecionados a partir de um ou mais dos fitosteróis, fitostanóis,análogos sintéticos de fitosteróis e fitostanóis e os derivados esterificados dequalquer dos precedentes, e as misturas de quaisquer destes. A quantidade total detais substâncias em um produto alimentício ou suplemento alimentar é, depreferência, de 0,01% a 20%, de maior preferência, de 0,1% a 15%, ainda de maiorpreferência, de 0,2% a 8%, e de maior preferência, ainda, de 0,3% a 8% em pesoda composição do produto alimentício.

De preferência, a ingestão diária de tais componentes do tipoesterol da combinação é de 0,1 a 3 g, de maior preferência, de 1,5 a 2,5 g, demaior preferência, ainda, de 2 g a 2,25 g por dia.

Os fitosteróis, também conhecidos como esteróis de plantasou esteróis vegetais, podem ser classificados nestes três grupos, 4-desmetilesteróis, 4-monometilesteróis e 4,4'-dimetilesteróis. Nestes óleoseles existem principalmente como esteróis livres e ésteres de esterol deácidos graxos embora os glicosídeos esteróis e os glicosídeos esteróisacilados também estejam presentes. Existem três principais fitosteróisdenominados β-sitosterol, stigmasterol e campesterol. Os desenhosesquemáticos dos componentes citados são dados em Influence ofProcessing on Sterols of Edible Vegetable Oils, S. P. Kochhar; Prog. LipidRes 22: pp. 161-188.

Os fitosteróis são os derivados respectivos de 5a-saturados defitosteróis tais como sitostanoi, campestanol e seus derivados.

Os análogos sintéticos de quaisquer dos fitosteróis e fitostanóis(que incluem os fitosteróis ou fitostanóis naturais, quimicamente modificados)podem ser utilizados.

De preferência, o fitosterol ou o fitostanol são selecionados apartir do grupo que compreende o éster de ácido graxo de β-sitosterol, β-sitostanol, campesterol, campestanol, stigmasterol, stigmastanol e suasmisturas.

Os materiais de fitosteróis e fitostanóis opcionais citados acimapodem opcionalmente ser fornecidos na forma de um ou mais de seus ésteresde ácido graxo. As misturas dos materiais esterificados e não esterificadostambém podem ser utilizadas.

Assim, quaisquer dos fitosteróis, fitostanóis e seus análogossintéticos utilizados na presente invenção são, de preferência, esterificadoscom um ácido graxo. De preferência, eles são esterificados com um ou maisácidos graxos C2-C22· Para os propósitos da presente invenção, o termo ácidograxo C2-C22 refere-se a qualquer molécula que compreende uma cadeiaprincipal de C2-C22 e pelo menos um grupo ácido. Embora não preferido dentrodo presente contexto, a cadeia principal C2-C22 pode conter de 1 a 6 ligaçõesduplas, ser parcialmente substituída ou podem estar presentes as cadeiaslaterais. Entretanto, os ácidos graxos C2-C22 são, de preferência, moléculaslineares que compreendem um ou dois grupos ácidos como grupos terminais.São de maior preferência, os ácidos graxos lineares C8-C22 como ocorrem nosóleos líquidos naturais.

Os exemplos apropriados de tais ácidos graxos são o ácidoacético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido capróico, ácido caprílico, ácidocáprico. Outros ácidos apropriados são, por exemplo, o ácido cítrico, ácidoláctico, ácido oxálico e ácido maléico. De maior preferência, são o ácidoláurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beênico, ácidooléico, ácido cetoléico, ácido erúcico, ácido eláidico, ácido linoléico e ácidolinolênico.

Quando desejado, uma mistura de ácidos graxos pode serutilizada para a esterificação dos esteróis. Por exemplo, é possível utilizar umagordura ou óleo de ocorrência natural como uma fonte de ácido graxo e pararealizar a esterificação por meio de uma reação de interesterificação. O uso deuma fonte natural quase sempre resulta em uma mistura de ácidos graxos.

Em uma realização particular, a mistura de ácido graxo contémuma alta quantidade (maior (>) que 50%, de preferência, maior que 70%, demaior preferência, maior que 80%) de insaturados, sendo os ácidos graxosmonoinsaturados (MUFA) e/ou os ácidos graxos poliinsaturados (PUFA). Istonão fornece apenas a vantagem de que, por exemplo, o PUFA em si possuaboa capacidade de redução do colesterol sangüíneo, mas também de ésteresde esterol preparados com tais ácidos graxos.

De preferência, são utilizadas as misturas de ácidos graxos degirassol, açafrão, colza, semente de linhaça, óleo de oliva, Iinola e/ou soja. Estassão as fontes típicas de alto teor de PUFA e/ou baixo teor de SAFA. As condiçõesde esterificação apropriadas estão, por exemplo, descritas no WO 92/19640.

Os ingredientes alimentícios descritos acima, que contribuem paramelhorar a saúde cardiovascular, K+, Ca2+ e Mg2+, vitaminas B (ácido fólico, B6,B12) e esteróis são coletivamente referidos no presente como ingredientes dasaúde cardíaca.

Produtos Alimentícios Funcionais: Formatos

Os produtos alimentícios de acordo com a presente invençãopodem ser as bebidas nem qualquer formato de produto apropriado. Osformatos de produtos apropriados incluem as bebidas, de maior preferência, asbebidas de suco de fruta ou bebidas lácteas, opcionalmente com suco de frutaadicionado, bebidas com base em soja opcionalmente com suco de frutaadicionado, produtos do tipo lácteos tais como iogurte, quark e queijo, pudim deovos, arroz ou outros pudins similares, pudins tais como musses e outrassobremesas incluindo os produtos de confeitos congelados, cremes/margarinas, produtos de massas e outros produtos cereais, produtossubstituintes de refeição e outras barras de nutrição, molhos e temperos, taiscomo temperos para saladas e maionese, recheios, molho cremoso e produtoscereais do tipo café da manha tais como mingau. Alguns destes tipos deprodutos alimentícios são descritos em alguns detalhes abaixo nos exemplos.

Produtos de Suco de Frutas

Os exemplos de produtos de suco de fruta de acordo com apresente invenção são sucos derivados de frutas cítricas como a laranja e atoronja, frutas tropicais, banana, pêssego, pêra, morango ao qual sãoadicionados o sólido de benefício à saúde e/ou a fração benefício à saúde e,opcionalmente, um ou mais dos ingredientes para a saúde cardíaca, ou outrosingredientes que fornecem benefício à saúde.

Produtos do Tipo Lácteo

Os exemplos de produtos lácteos de acordo com a presente invençãosão o leite, os cremes lácteos, o queijo cremoso, as bebidas do tipo lácteas eiogurtes, ao qual são adicionados o sólido de benefício à saúde e/ou a fração debenefício à saúde e, opcionalmente, um ou mais dos ingredientes para a saúdecardíaca ou outros ingredientes que possuem um benefício à saúde.O produto alimentício pode ser utilizado tal como uma bebida dotipo láctea. Alternativamente, o flavorizante ou outros aditivos podem seradicionados. Um produto do tipo lácteo também pode ser feito pela adição dosólido de benefício à saúde e/ou da fração de benefício à saúde à água ou aum produto lácteo.

Um exemplo de uma composição para um produto do tipo iogurteé cerca de 50 a 80% em peso de água, 0,1 a 15% em peso de sólido debenefício à saúde e, opcionalmente, um ou mais ingredientes para a saúdecardíaca ou outro agente de benefício à saúde, de 0 a 15% em peso de pó desoro, de 0 a 15% em peso de açúcar (por exemplo, sacarose), de 0,01 a 1%em peso de cultura de iogurte, de 0 a 20% em peso de fruta, de 0,05 a 5% empeso de vitaminas e minerais, de 0 a 2% em peso de flavorizante, de 0 a 5%em peso de estabilizante (agentes espessante ou geleificante). Pode seradicionada fruta ao iogurte.

Um tamanho típico de porção para um produto do tipo iogurtepode ser de 50 a 250 g, em geral, de 80 a 200 g.

Produtos de Confeitos Congelados

Para os propósitos da presente invenção, o termo produto deconfeito congelado inclui os confeitos congelados que contém leite tais comosorvetes, iogurte congelado, sorvete de frutas, sorvete de frutas de água,sorvete de leite e pudim congelado, geladinhos, sorvete de raspadinha e purêde frutas congelado.

De preferência, o nível de sólidos no confeito congelado (porexemplo, açúcar, gordura, flavorizante, etc) é mais do que 3% em peso, demaior preferência, de 10 a 70% em peso, por exemplo, de 40 a 70% em peso.

O sorvete conterá tipicamente de 0 a 20% em peso de gordura,de 0,1 a 20% em peso de sólido de benefício à saúde e, opcionalmente um oumais ingredientes para a saúde cardíaca ou outros de benefício à saúde,adoçantes, de 0 a 10% em peso de componentes de leite sem gordura e oscomponentes opcionais, tais como emulsificantes, estabilizantes, conservantes,ingredientes flavorizantes, vitaminas, minerais, etc., sendo o balanço de água.Tipicamente, o sorvete será aerado, por exemplo, a um excesso de 20 a 400%,mais especificamente, de 40 a 200% e congelado a uma temperatura de -2 a -200° C, mais especificamente de -10 a -30° C. O sorvete geralmentecompreende cálcio em um nível de cerca de 0,1% em peso.

Produtos Substituintes de Refeição

Os produtos substituintes de refeição são preferidos quando o(s)benefício(s) à saúde a ser(em) fornecido(s) inclui(em) a prevenção daobesidade ou o controle do peso corpóreo. Esse benefício à saúde pode, porexemplo, assumir a forma da redução do peso corpóreo ou da manutenção dopeso corpóreo, supressão do apetite ou provisão da saciedade. Tais produtossão geralmente utilizados como parte de um programa dietético para controlarou reduzir o peso corpóreo.

O termo "produtos substituintes da refeição" conforme utilizados nopresente incluem as composições que incluem os produtos que são destinados aserem ingeridos no lugar de uma refeição normal. As barras de nutrição e asbebidas que são destinadas a constituir um substituinte de refeição são tipos deprodutos substituintes de refeição. O termo também inclui os produtos que sãoingeridos como parte de um plano de controle de peso ou perda de pesosubstituindo a refeição, por exemplo, produtos de lanche que não são destinados asubstituir uma refeição inteira por eles, mas que são utilizados com outros produtospara substituir uma refeição ou que são destinados de outra maneira a seremutilizados no plano; estes últimos produtos possuem tipicamente um teor calórico nointervalo de 50 a 200 kcal por porção.

Conforme utilizado no presente "melhores sensações de saciedade"significa uma maior ou melhor sensação de saciedade (satisfação) após a ingestãoe/ou uma sensação mais duradoura de saciedade após a ingestão. Tais efeitosreduzem tipicamente as sensações de fome e/ou prolongam o tempo entre aingestão do alimento por um indivíduo e pode resultar em uma menor quantidadede alimento e/ou menos calorias consumidas em uma única refeição ousubseqüente. As referências no presente para a saciedade incluem ambos os quesão estritamente referidos como saciedade e satisfação, incluindo a saciedade aofim da refeição e a saciedade entre as refeições. A saciedade também pode serpercebida por um indivíduo como uma sensação de "satisfeito", fome reduzida e/ouapetite reduzido.

O produto substituinte da refeição pode estar na forma de umabarra de nutrição. As barras podem ser uma barra do estilo granola e pode serbaseada em qualquer tipo de cereal. Tipicamente, as barras serão fortificadascom vitaminas e minerais.

O produto substituinte da refeição pode estar na forma de produtode bebida. Os tipos preferidos de bebidas incluem as bebidas em pó, bebidasprontas para beber e sopas. Tais bebidas podem ser de base láctea, tais comobebidas lácteas e iogurtes, ou podem ser bebidas com base em soja.

Outros Produtos Alimentícios Funcionais

Outro produto alimentício funcional de acordo com a presenteinvenção pode ser preparado pelo técnico no assunto com base nosconhecimentos gerais comuns, que compreendem MAP e/ou ITP como tal ou emum hidrolisado de proteína e, opcionalmente, um ou mais ingredientes, para asaúde cardíaca os outros ingredientes de benefício à saúde em quantidadesapropriadas. Os exemplos de tais produtos alimentícios são os produtos assados,tais como bolos, biscoitos e brioches, alimentos de tipo lácteo, lanches, etc.

As bebidas de acordo com a presente invenção também podemser bebidas que não contêm proteína, tais como bebidas do tipo esportivas,bebidas com base em chá, bebidas com base em café ou bebidas com baseem vegetais.

Vantajosamente o produto alimentício funcional pode ser umaemulsão contendo óleo ou água, por exemplo, um creme. A emulsão oleosa ouaquosa é no presente definida como uma emulsão que compreende óleo eágua e inclui emulsão óleo-em-água (o/a) e emulsão água-em-óleo (a/o) e asemulsões mais complexas, por exemplo, as emulsões água-em-óleo-em-água(a/o/a). O óleo é definido no presente como incluindo a gordura. Depreferência, o produto alimentício em um espalhável, confeito congelado oumolho. De preferência, um creme de acordo com a presente invençãocompreende de 30 a 90% em peso de óleo vegetal. Vantajosamente um cremepossui um pH de 4,2 a 6,0.

Prevenção da Obesidade/ Controle do Peso Corpóreo

Foi revelado que os tripeptídeos MAP e ITP são estáveis no tratointestinal humano e, portanto, isso fornece a possibilidade desses tripeptídeosfornecerem uma gama de valores de benefício à saúde ao seu consumidor.

Certos peptídeos derivados do soro de leite são conhecidos por exibir bonsefeitos na prevenção da obesidade e/ou no controle do peso corpóreo e pareceagir ao regular o apetite/saciedade. A obesidade é geralmente conhecida comosendo representada por um índice de massa corpórea de 30 ou mais. Acredita-se que os tripeptídeos MAP e ITP e/ou seus sais sejam, portanto, bastanteapropriados para o uso na prevenção da obesidade e/ou no controle do pesocorpóreo, em especial, na supressão do apetite e na prevenção da saciedade.

A maior saciedade leva, em geral, a uma menor ingestão dealimento em um indivíduo e pode auxiliar a fornecer de um ou mais dosseguintes benefícios. Estes benefícios são, em geral, associados à prevençãoda obesidade/ controle do peso; para perder ou manter o peso corpóreo, paramanter/ construir a massa corpórea magra, para reduzir a massa de gordura,para reduzir a massa visceral, para reduzir a massa subcutânea, para melhoraro tônus/ aparência muscular, para manter os níveis saudáveis de açúcar nosangue, para tratar/ prevenir a síndrome metabólica, para melhorar o fluxosangüíneo (por exemplo, para o cérebro) e/ou para melhorar a circulaçãosangüínea.

O técnico no assunto está bem ciente de como determinar taispropriedades para um material. Por exemplo, um teste apropriado para asupressão/ saciedade do apetite é dado no documento WO 2004/ 002241.

Manutenção da Saúde Cardiovascular

Um problema de saúde que é associado ao impacto negativo namanutenção da saúde cardiovascular é a alta pressão sangüínea (hipertensão)que leva ao dano do órgão alvo e podem ser afetados diferentes órgãos. Nocérebro, a hipertensão prolongada predispõe o indivíduo para a ocorrência dederrame seja por oclusão (infarto isquêmico) ou por sangramento (infartohemorrágico). Em adição, a hipertensão está relacionada ao risco do ataqueIsquêmico Transiente (TIA) e a demência. Outras conseqüências no nível docérebro incluem: dor de cabeça, náuseas/ vômitos, ansiedade, palidez, ataqueepiléptico, fraqueza, reflexo assimétricos, paralisia facial.

A hipertensão aumenta o trabalho necessário a ser realizado pelocoração para atender as demandas do corpo. Este aumento prolongado nacarga de trabalho do coração resulta eventualmente no alargamento docoração (em particular no ventrículo esquerdo) e predispõe um indivíduoafetado à ocorrência da parada cardíaca e do ataque cardíaco/ enfarto domiocárdio. Adicionalmente aos efeitos no coração todas as artérias sãoafetadas pela alta pressão sangüínea que levam à "doença arterial periférica".

A hipertensão prolongada também pode resultar na parada dorim/ lesão renal, (relacionada a proteinúria, hematúria, edema e ascite) que noestado final pode necessitar do tratamento de diálise. Finalmente, os olhos sãoparticularmente sensíveis à hipertensão. Os distúrbios visuais resultam naretinopatia, menor reflexo leve pupilar, papiloedema, atrofia ótica, hemorragiasno fundo e exudatos.

De acordo com a presente invenção, foi relatado que ostripeptídeos MAP e ITP possuem um alto efeito inibidor de ECA,correspondendo a um baixo valor IC50, respectivamente, 0,4 para MAP e 10para ITP (em μΜ) conforme determinado na parte experimental do presente.Além disso, conforme citado acima, foi relatado que ambos os tripeptídeosMAP e ITP são estáveis no trato intestinal humano. O tripeptídeo MAP e otripeptídeo ITP e seus sais são, portanto, bastante apropriados como uminibidor de enzima conversora de angiotensina, em particular, in vivo noshumanos. De preferência, o inibidor de enzima conversora de angiotensina éum produto alimentício funcional.

A presente invenção fornece um produto alimentício apropriadopara o inibidor da enzima conversora de angiotensina que compreende umaquantidade de 0,5 mg/ kg ou mais de MAP e/ou 3mg/kg ou mais do tripeptídeoITP. Devido ao seu efeito inibidor de ECA, o produto alimentício de acordo coma presente invenção, em geral, é capaz de diminuir a pressão sangüínea dehumanos que possuem pressão sangüínea elevada e é particularmenteapropriado para diminuir a pressão sangüínea em hu manos que possuempressão sangüínea moderadamente elevada. De preferência, o produtoalimentício compreende uma quantidade de 1 mg/ kg ou mais de MAP e/ouuma quantidade de 6 mg/ kg ou mais de tripeptídeo ITP. De maior preferência,o produto alimentício compreende 2 mg/ kg ou mais de MAP e/ou 12 mg/ kg oumais de ITP, de maior preferência, ainda, de 5 mg/ kg a 20 mg/ kg ou mais deMAP e/ou de 25 a 100 mg/kg de ITP. O MAP é especialmente preferido porcausa de seu valor IC50 excepcionalmente baixo.

Os maiores níveis de colesterol sangüíneo levam aarteriosclerose, que resulta no estreitamento das artérias em diversos órgãos.O órgão mais afetado é o coração e, portanto, o controle dos níveis decolesterol sangüíneo forma uma parte da manutenção da boa saúdecardiovascular. As artérias coronárias estreitadas causam a doença coronáriacardíaca com sintomas tais como angina ou ataque cardíaco. No cérebro, umacarótida arteriosclerótica ou artéria cerebral (cérebro) resulta em um derrame.Nas pernas, uma artéria arteriosclerótica leva a dores na perna ou pernasagudamente isquêmicas. Em outros órgãos (tais como rim), uma artériaarteriosclerótica leva a sintomas isquêmicos relevantes (parada renal).

De acordo com uma realização particular da presente invenção, éfornecido o uso de MAP e/ou para o controle dos níveis de colesterolsangüíneo conforme ele desempenha um papel na manutenção da saúdecardiovascular.

A presente invenção será agora descrita com referência aosseguintes exemplos. As modificações adicionais dentro do escopo da presenteinvenção serão aparentes aos técnicos no assunto.

Exemplos

Técnicas de Análise: Efeito Inibidor de ECAEspectrometria de Massa de Varredura de Alta Resolução (HRS-MS)

O MAP e o ITP como novos peptídeos inibidores da ECA foramidentificados nas amostras ao utilizar a separação cromatográfica bidimensionalcombinada com um ensaio de atividade de ECA em linha e espectrometria demassa para a identificação. Na primeira análise, a mistura de peptídeo éseparada em uma coluna de cromatografia líquida (LC) ODS3. Um perfil deatividade é criado a partir de frações coletadas a partir da análise utilizando umensaio Matsui levemente modificado. Em segunda análise, as frações daprimeira coluna que mostram uma alta atividade são ainda separadas em umacoluna Biosuite LC utilizando um diferente perfil de gradiente. As fraçõescoletadas a partir desta segunda coluna são divididas em duas partes, uma parteé utilizada para a medida da atividade enquanto o MS e o MS-MS é aplicado naoutra parte para a identificação dos peptídeos presentes.

Todas as análises são realizadas utilizando um sistema de HPLCAlliance 2795 (Waters, Etten-Leus, Holanda) equipado com um detector UV desinal duplo. Para a identificação dos peptídeos, o sistema HPLC foi acoplado aum espectrofotômetro de massa Q-TOF do mesmo fornecedor.

Foi injetado 20 pL de uma solução a 10% (p/v) de pH em água Milli-Q em uma coluna ODS3 150 χ 2,1 Inertsil 5 com um tamanho de partícula de 5μm (Varian, Middelburg, Holanda). A fase móvel A consistia de uma solução deácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% em água Milli-Q. A fase móvel B consistia deuma solução de TFA a 0,1 % em acetonitrila. A composição eluente inicial era de100% de A. O eluente foi mantido a 100% de A por 5 minutos. Então, umgradiente linear foi iniciado em 10 minutos a 5% de B, seguido por um gradientelinear em 10 minutos a 30% de Β. A coluna fluiu ao aumentar a concentração de Ba 70% em 5 minutos, e foi mantida a 70% de B por outros 5 minutos.Posteriormente, o eluente foi reduzido a 100% de A em 1 minuto e equilibrado por9 minutos. O tempo de corrida total era de 50 minutos. O efluente que fluiu era de0,2 mL min"1 e a temperatura da coluna foi fixada em 60° C. Um cromatograma UVfoi registrado a 215 nm. As frações do eluente foram coletadas em um prato de 96cavidades utilizando um intervalo de tempo de 1 minuto, resultando em volumesde fração de 200 pL. O efluente nas cavidades foi neutralizado pela adição de 80pL de uma solução a 0,05% de hidróxido de amônia aquosa (25%). O solvente foievaporado até a secura sob nitrogênio a 50° C. Subseqüentemente, o resíduo foireconstituído em 40 pL de água Milli-Q e misturado por 1 minuto. Então, 27 pL deuma solução de Enzima Conversora de Angiotensina (ECA) de 33,4 mU ml"1 emsolução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 com uma concentração decloreto de 260 mM foi adicionado e a mistura foi deixada para incubar por 5minutos em um misturador de prato de 96 cavidades a 700 rpm. Após o períodode incubação, 13 μL de uma solução de ácido hipúrico-histidina-leucina (HHL) a0,35 mM em tampão de PBS foi adicionado e misturado por 1 minuto a 700 rpm. Amistura foi deixada para reagir por 60 minutos a 50° C em um forno GC. Após areação, o prato foi resfriado em gelo derretido e analisado em uma coluna flash-HPLC. 30 pL da mistura reacional de cada cavidade foi injetada em uma colunade HPLC Chromlith Flash RP18e 25 χ 4,6 mm (Merck, Darmstadt, Alemanha)equipada com uma coluna guarda de 10 χ 4,6 mm de RP 18e do mesmofornecedor. A fase móvel isocrática consistia de uma solução a 0,1% de TFA emágua/ acetonitrila 79/ 21. O eluente que fluiu era de 2 mL min"1 e a temperatura dacoluna era de 25° C. As injeções foram realizadas com um tempo de intervalo de 1minuto. O ácido hipúrico (H) e o HHL foram monitorados a 280 nm. As alturas dopico de H e HHL foram medidas e o IECA de cada fração foi calculado de acordocom a equação:

<formula>formula see original document page 27</formula>

- IECAa: Porcentagem de inibição do analito

- DHw: Grau de hidrólise de HHL a H e HL em água

- DHa: Grau de hidrólise de HHL a H e HL para o analito

O grau de hidrólise (DH) foi calculado ao expressar o alto pico deH como uma fração da soma das alturas dos picos de H e HHL.

A maior atividade foi medida nas frações eluídas entre 18 e 26minutos. Esta região foi coletada e injetada novamente em uma coluna 150 χ 2,1mm Biosuite com um tamanho de partícula de 3 pm (Waters, Etten-Leur,Holanda). A fase móvel A consistia no presente de solução de ácido fórmico a0,1% (FA) em água Milli-Q. A fase móvel B consistia de uma solução de 0,1% deFA em metanol. A composição do eluente inicial era de 100% de A. O eluente foimantido a 100% de A por 5 minutos. Posteriormente, foi iniciado um gradientelinear em 15 minutos a 5% de B, seguido por um gradiente linear em 30 minutosa 60% de Β. O eluente foi mantido a 60% de B por outros 5 minutos. Finalmente,o eluente foi reduzido a 100% da fase móvel A em 1 minuto e equilibrado por 10minutos. O tempo total de corrida foi de 65 minutos. O fluxo de eluente era de0,2 mL min"1 e a temperatura da coluna foi fixada a 60° C. O traço de UV foiregistrado a 215 nm. As frações foram coletadas a partir da coluna Biosuite a 10segundos de tempo de intervalo. As frações foram divididas em duas partes,uma parte foi utilizada para a medida da atividade utilizando o método ECAdescrito anteriormente, enquanto a outra parte foi utilizada para a identificaçãodos peptídeos ativos utilizando o MS e o MS-MS.

Dois picos cromatográficos com íons moleculares de 326.2080 Dae dois outros picos com íons moleculares de 330.2029 Da e 318.1488 Dacorrespondiam com as maiores atividades medidas na área entre 18 e 26minutos. Utilizando o MS-MS, estes peptídeos foram identificados como osisômeros estruturais IPP e LPP (- 0,6 ppm), ITP (- 4,8 ppm) e MAP (+ 2,8)respectivamente. As fontes de proteínas dos peptídeos são o IPP β-caseína f74-76, LPP β-caseína f-151-153, ITP a-s2-caseína f119-121 e MAP β-caseína f102-104. O IPP e o LPP são relatados anteriormente como peptídeos IECA comvalores IC50 de 5 e 9,6 μΜ, respectivamente (Y. Nakamura, M. Yamamoto., K.Sakai., A. Okubo., S. Yamazaki, T. Takano, J. Dairy Sei. 78 (1995) 777-783; Y.Aryosh i, Trends in Food Science and Technol. 4 (1993) 139-144).

O ITP e o MAP não são, a título de conhecimento, relatadospreviamente como peptídeos IECA. Os peptídeos foram sintetizados e aatividade de cada peptídeo foi medida utilizando um ensaio Matsui modificadodescrito posteriormente. Os valores IC50 de ITP e MAP foram determinadoscomo sendo 10 μΜ e 0,4 μΜ, respectivamente.

A quantificação de MAP e ITP nas amostras foi realizada em uminstrumento Micromass Quattro Il MS operado no modo de monitoramento demúltiplas reações, eletrospray positivo. O método de HPLC utilizado era similaràquele descrito acima. As configurações MS (ESI+) foram conforme segue:voltagem do cone 37 V, voltagem do capilar de 4 kV, secagem do gásnitrogênio a 300 U h. Temperatura da fonte e do nebulizador: 100° C e 250° C,respectivamente. Os peptídeos sintetizados foram utilizados para preparar umalinha de calibração utilizando o íon precursor 318,1 e a soma dos íons produtos227,2 e 347,2 para MAP e utilizando o íon precursor 320,2 e a soma dos íonsprodutos 282,2 e 501,2 para ITP.

Medida da Atividade da ECA de MAP ε ITP Utilizando um Ensaio Matsui

Modificado

Esta atividade de inibição da ECA foi analisada de acordo com ométodo Matsui et al., (Matsui et al. (1992) Biosci. Biotech. Biochem. 56: 517-518) com as modificações descritas abaixo.

Tabela 1

Procedimento para o Ensaio de Inibição ECA Matsui

Os componentes foram adicionados em um tubo de 1,5 ml_ comum volume final de 120 μL.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Para cada amostra, 75 μΙ_ de Ieucina histidina hipurila a 3 mM (Hip-His-Leu, Sigma Chemical Co.; o produto químico foi dissolvido em 250 mM deBorate contendo NaCI a 200 mM, pH 8,3); 20 μΙ_ de ECA a 0,1 U/ mL (obtido pelaSigma) ou H2O1 e 25 μι. de amostra ou H2O foram misturados (vide Tabela 1). Asmisturas foram incubadas a 37° C e pararam após 30 minutos pela adição de 125μΙ_ de HCI a 0,5 M. Subseqüentemente, 225 μΙ_ de solução de bicine/ NaOH (1 Mde NaOH: 0,25 M de bicine (4:6)) foi adicionado, seguido por 25 μΙ_ de TNBS a 0,1M (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, Fluka1 Suíça; em Na2HPC>4 a 0,1 M).Após a incubação por 20 min a 37° C, 4 mL de Na2SO3 a 4 mM em NaH2PO4 0,2M foi adicionado e a absorbância a 416 nm foi medida com um espectrofotômetroUV/vis (Shimadzu UV-1601 com um controlador CPS, Holanda).

A quantidade de atividade inibitória de ECA (IECA) foi calculadacomo uma porcentagem da inibição comparada com a taxa de conversão deECA na ausência de um inibidor:

<formula>formula see original document page 30</formula>

em que:

- C1 = absorbância sem o componente inibitório de ECA (=atividade de ECA max.) [AU].

- C2 = absorbância sem o componente inibitório de ECA e semECA (secundário) [AU].

- S1 = absorbância na presença de ECA e do componenteinibitório de ECA [AU],

- S2 = absorbância na presença do componente inibitório de ECA,mas sem ECA [AU].

Análise de HRS-MS das Amostras Hidrolisadas

Como um resultado, a importância dos peptídeos inibitórios deECA encontrados no pH onde MAP (β-caseína, pós 102-104), e ITP (a-s2-caseína, pós 119-121) em uma concentração de 2,85 e 1,41 mg/ g,respectivamente (Tabela 1). O IC5o de MAP e ITP foram determinados comosendo 0,4 e 10 μΜ, respectivamente.

As proteínas do leite e os hidrolisados de proteína do leite sãogeralmente conhecidos como precursores de uma ampla gama de peptídeosinibitórios de ECA. Após o consumo, as proteínas e os peptídeos sãosubmetidos a diversos processos enzimáticos digestivos no trato gastro-intestinal humano, o que resulta na liberação de peptídeos inibitórios de ECA invivo. A fim de avaliar a fragmentação dos peptídeos bioativos identificados e aformação dos novos peptídeos ativos após o consumo humano, o pH foiprocessado por um trato gastro-intestinal artificial, que simula as condiçõestipicamente encontradas no corpo humano. Em certos tempos, as amostrasforam retiradas do sistema modelo TGI. Estes também foram analisadosutilizando o sistema on-line HPLC-Bioassay-MS ou o HRS-MS.

Isto mostrou que ambos o MAP e o ITP são de importânciaparticular por causa de suas altas resistências contra a digestão TGI e suasaltas atividades possuem, portanto, potenciais muito altos para serem umpeptídeo de redução da pressão sangüínea.

Exemplo 1

Identificação dos Novos ε Potentes Tripeptídeos MAP ε ITP de Inibição deECA em Hidrolisados de Caseína Concentrada

Para facilitar uma análise mais completa dos peptídeos bioativospresentes, o hidrolisado de caseína obtido pela digestão da endoproteaseespecífica de prolina derivada de A. niger puro e purificado pela precipitaçãoacida foi preparado em uma escala preparativa. Para esta finalidade, 3.000gramas de caseinato de potássio foram suspensos em 25 litros de água a 75° C.Após uma homogeneização completa, o pH foi lentamente ajustado a 6,0utilizando o ácido fosfórico diluído. Após o resfriamento a 55° C, asendoproteases específicas de prolinas derivada de A. niger foram adicionadasem uma concentração de 4 unidades de enzimas/ grama de caseinato (vide aseção Materiais e Métodos para a definição de unidade). Após uma incubação(com agitação) por 3 horas a 55° C, o pH foi diminuído a 4,5 ao adicionarlentamente o ácido fosfórico concentrado. Nesta maior escala de preparação, aetapa de tratamento a quente para inativar a endoprotease específica de prolinanesta parte do processo foi omitida. Então, a suspensão foi rapidamenteresfriada a 4° C e mantida durante a noite (sem agitação) nesta temperatura. Namanha seguinte, a camada clara superior foi decantada e evaporada para obtero nível de 40% de matéria seca. Este último líquido concentrado foi submetido aum tratamento de UHT de 4 segundos a 140° C e então, ultrafiltrado a 50° C.

Após filtração inicial, o líquido foi seco por aspersão. Este material é referido aseguir no presente como Peptídeo Bioativo Derivado de Caseína (CDBAP).

Utilizando os procedimentos LC/ MS esquematizados na seção Materiais eMétodos, o teor de IPP, LPP e VPP do produto em pó foi determinado. Deacordo com seu teor de nitrogênio, o produto em pó possui um teor de proteínade cerca de 60% (utilizando um fator de conversão de 6,38). Os teores de IPP,LPP e VPP do pó são fornecidos na Tabela 6. A composição de aminoácido doproduto CDBAP é fornecida na Tabela 7. É bastante notável o aumento do teormolar de prolina do material seco por pulverização obtido após a precipitaçãoácida: a partir de um inicial de 12% a cerca de 24%.

Tabela 2

<table>table see original document page 32</column></row><table>

Tabela 3

Composição de Aminoácido do Material de Partida do Caseinato dePotássio ε CDBAP (Teores de Aminoácidos após a Hidrólise do Ácido εMostrado como Porcentagens do Teor de Aminoácidos Molar)

<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table>

Exemplo 2

Digestão Gastrointestinal Estimulada in vitro de um Isolado de Proteínade Caseína Hidrolisada Obtida a partir de DSM (Delft. Holanda)

A digestão do hidrolisado de proteína (a partir deste momentoPH), um isolado de proteína de caseína hidrolisada obtida pela DSM (Delft,Holanda). O hidrolisado de proteína (PH) foi preparado pela incubação de 10%em peso de caseinato de potássio com a endoprotease superproduzida eessencialmente pura a partir de Aspergillus niger conforme descrito nodocumento WO 02/45524.

O procedimento de digestão foi realizado utilizando um modelo dedissolução (VankeI) com um frasco de 100 mL. A temperatura do banho deágua foi fixada a 37,5° Cea velocidade da espátula foram selecionadas tal quea amostra foi mantida em suspensão (100 rpm).Cerca de 3,4 gramas de PH (nível de proteína de 59%) foidissolvido/ suspenso em 100 mL de água Milli-Q. Durante a simulaçãogástrica, HCI a 5 M foi utilizado para diminuir o pH, no final da simulaçãogástrica e durante a fase duodenal, NaOH 5 M foi utilizada para aumentar o pH.

A suspensão do hidrolisado de proteína foi pré-aquecida a37,5° C. Em t = 0 minuto, 0,31 grama de pepsina (Fluka No do pedido77161) foi suspensa separadamente em 5 mL da amostra e foi diretamenteadicionada.

O pH foi ajustado lentamente e manualmente utilizando umpHmetro separado, de acordo com o seguinte esquema;

t = 20 min pH reduzido a 3,5

t = 40 min pH a 3,0

t = 50 min pH a 2,3

t = 60 min pHa1,8

t = 65 min pH aumentado a 2,7

t = 75 min pH a 3,7

t = 80 min pH a 5,3

Em t = 90 min, 0,139 g de pancreatina USP 8 vezes (Sigma No dopedido P7545) foi suspensa separadamente em 5 mL da amostra e foidiretamente adicionada;

t = 93 min pH a 5,5

t = 95 min pH a 6,3

t= 100 min pH a 7,1

O experimento foi interrompido a t = 125 min e o pH foi verificado(ainda era um pH de 7).

As amostras foram transferidas para um béquer e foramaquecidas em um microondas até a fervura. Subseqüentemente, asamostras foram transferidas em tubos de vidro e incubadas a 95° C por 60min. Isto é necessário para inativar toda a atividade da protease. Após oresfriamento, as amostras foram colocadas em tubos Falcon e centrifugadaspor 10 minutos a 3.000 χ g. O sobrenadante era seco por congelamento. Aconcentração N total foi determinada e convertida ao nível de proteínautilizando o fator Kjeldahl de caseína (6,38). O nível de proteína do PHdigerido era de 48,4%.

Tabela 4

Resultados do Exemplo 1

Concentração de MAP ε ITP em PH ε no Produto da Digestão no Trato

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Tabela 5

Inibição de ECA (valores 1C50) de MAP, ITP ε IPP. os valores determinadospelo ensaio ECA da linha e o ensaio matsui modificado

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Exemplo 3

Digestão Gastrointestinal Estimulada in vitro de um MAP ε ITP Sintético

A fim de medir a estabilidade dos peptídeos no tratogastrointestinal (GI) foi utilizada a micro-dissolução. Este teste seguinte foiutilizado para testar a estabilidade no Gl do MAP e do ITP.Componentes

Para a dissolução as seguintes soluções foram utilizadas:-HCIaO1I mol/L

- NaHCO3 a 1 mol/ L

Fluido gástrico simulado;

- 1 g de cloreto de sódio em 3,5 mL de HCI a 0,1 mol/ L em 500mL de água (desgaseificada em banho de sonificação, 10 min)

Condições gástricas das enzimas (quantidades necessárias em 1mL do volume total):

- 2,9 mg de pepsina em 0,45 mg de Amano Lipase-FAPI5 em 50pL de fluido gástrico simulado

Condições intestinais das enzimas (quantidades necessárias em 1mL de volume total):

- 9 mg de pancreatina (Sigma P8096) em 0,125 mg de extrato debile em 50 pL de NaHCO3 a 1,0 mol/ L

Procedimento

Condições Gástricas:

- Cada frasco foi preenchido com:

- 0,82 mL de fluído gástrico simulado + 70 pL de Milli-Q + 10 pg(10 vezes diluído) de Mistura 1,

- pegar a amostra quando T = 37,5° C (t = 0), adicionar 50 mL demistura de pepsina/ Iipase (agitar).

- O pH é medido e ajustado a 3,5 com HCI a 0,1 mol/ L

- Incubação por 60 minutos, após 60 minutos a amostra é retirada.

Condições intestinais:

- 50 pL de mistura de pancreatina é adicionado, o pH é medido eajustado a 6,8 com:

- HCI.- As amostras são retiradas a 5 min, 30 min e 60 min após aadição da pancreatina (agitar).

- Todas as amostras são mantidas a 98° C por 60 minutos parainterromper a enzima de sua atividade.

- Após o resfriamento, as amostras foram armazenadas a -20° Caté a análise.

- As amostras foram centrifugadas e analisadas com HPLC-MRM-MS. (Para VAVWVMY, foi necessário muito mais energia para a sua fragmentação,para a finalidade de medida. Isto foi necessário devido à grandeza do peptídeo.)

Foi utilizado o Insel IS89 (com agitação suave a 0), que é umdispositivo de incubação com a finalidade para pratos de 96 cavidades.

Para as Tabelas de 6 a 9, a concentração medida do peptídeo édada em ng/ mL, calculada para a concentração relativa de MAP.

Tabela 6

Digestão Gastro-Intestinal Estimulada in vitro do MAP Sintético -1micrograma/ ml

<table>table see original document page 37</column></row><table>Onde - é indicado denota que as medidas não foram tomadas.

Tabela 7

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Onde - é indicado denota que as medidas não foram tomadas.

Tabela 8

Digestão Gastrointestinal Estimulada in vitro do ITP Sintético -1micrograma/ ml

<table>table see original document page 38</column></row><table>Onde - é indicado denota que as medidas não foram tomadas.

Tabela 9

Digestão Gastrointestinal Estimulada in vitro do ITP Sintético -10micrograma/ ml

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Onde - é indicado denota que as medidas não foram tomadas.

Esses resultados demonstram que o tripeptídeo MAP exibe umaestabilidade razoavelmente boa sob as condições gastrointestinaisespecialmente após 1 hora sob as condições estomacais. Entretanto, eles nãosofrem uma degradação adicional antes de atingir o fim do intestino. Acredita-se que MAP é protegido contra essa degradação na presença de outrospeptídeos dentro do hidrolisado de caseína; isto explica a aparente diferençana estabilidade de MAP mostrada nos Exemplos 2 e 3.

Os resultados também demonstram a excelente estabilidade sob ascondições gastrointestinais de ITP. Essa excelente estabilidade compensa umpouco a menor potência de ITP como um inibidor de ECA em comparação a MAP.

Exemplo 4

Preparação do Leite Fermentado Contendo MAP ε ITP

Preparação da Cultura Prévia

O leite desnatado estéril (Yopper, antiga Campina, Holanda) foiinoculado por 24 horas a 37° C com 2 a 4% de uma cultura de um Lactobacillusdelbruecki subespécie Lactis 05-14 (depositada na Central Bureau voorSchimmelculturen (CBS), Holanda, em 26/01/2001 e possuindo o número CBS109270) que foi armazenado a -80° C como uma cultura de crescimento totalno leite desnatado descrito acima, diluído com glicerol estéril a 10% a umaconcentração final de 6% de glicerol. O produto resultante é designado comocultura prévia.

A cepa foi caracterizada por uma lâmina API50CHL. A cepaera capaz de fermentar a D-glicose, D-frutose, D-manose, N-acetilglucosamina, maltose, lactose, sacarose e trealose. De acordo com obanco de dados APILAB Plus (versão 5.0), ela era subseqüentementeidentificada como Lactobacillus delbrueekii subespécie laetis. A lâminaAPI50CHL e o banco de dados estão disponíveis pela bioMerieux SA,69280 Marcy- TEtoiIe1 França.

Fermentação

O leite reconstituído de 4,2% de MPC-80 (Campina, Holanda),0,5% de lactose e 0,3% de Lacprodan 80 (Campina, Holanda), foi pasteurizadopor 2 minutos a 80 graus. O leite foi fermentado com 2% em peso da culturaprévia de Laetobaeillus delbruecki subespécie laetis 05-14. A fermentação foirealizada em jarras de 150 ml sob condições estáticas e realizada sem ocontrole do pH a 40° C.

Após 24 horas, uma amostra foi tomada e centrifugada por 10minutos a 14.000 gramas. O pH era de 5,3 e a concentração de MAP era de18,3 mg/L. O ITP não poderia ser encontrado no leite fermentado.

Exemplo 5

Brioche que Compreende o Hidrolisado da Proteína Redutora da PressãoSangüínea

O MAP e o ITP que contém as composições de acordo com apresente invenção podem ser incorporados em uma variedade de produtosincluindo os produtos alimentícios. Para ilustrar suas utilizações em um produto demassa popular, os peptídeos inibitórios de ECA foram incorporados em um brioche.

Uma massa de brioche foi preparada ao combinar em primeiro lugaros seguintes ingredientes: 500 gramas de farinha de trigo (Reiger da Meneba1Holanda), 141 gramas de pó de ovo inteiro, 4,7 gramas de pó de ovo branco, 35,2gramas de dextrose, 470 gramas de sacarose, 2,4 gramas de emulsificante (nestecaso o Admul 5306 da Quest, Holanda), 4,7 gramas de sal, 7 gramas debicarbonato de sódio, 9,4 gramas de pirofosfato, 1,6 gramas de ácido cítrico e 3,5gramas de ácido sórbico. A este, foi adicionado o pó de CDBAP contendo MAP eITP para obter a concentração final de 10 gramas de pó de CDBAP por kg demassa. Então, todos os ingredientes foram totalmente misturados.

A esta mistura seca, 475 gramas de água e 475 gramas de óleovegetal foi adicionado e o pó e os líquidos foram misturados por 7 minutos navelocidade 1 de um misturador Hobart. A massa resultante foi vertida emtravessas de brioche com cada molde de brioche individual contendo cerca de50 gramas de massa. As travessas foram assadas por 23 minutos a 195-200°C. As crostas dos brioches resultantes eram levemente mais escuras do que ascrostas dos brioches de referência assados sem o pó de CDBAP adicionado.Entretanto, as consistências de ambos os tipo de brioches eram idênticas.

Na base de seu teor de CDBAP, cada um dos brioches assimobtidos contém cerca de 0,5 grama de CDBAP representando cerca de metadeda dosagem diária desejada de peptídeos inibitórios de ECA para uma pessoacom hipertensão.

Claims (18)

1. USO DO TRIPEPTÍDEO MAP E/OU DO TRIPEPTÍDEOITP e/ou seus sais, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um produtoalimentício funcional para a prevenção da obesidade ou o controle do pesocorporal.

2. USO DO TRIPEPTÍDEO MAP E/OU DO TRIPEPTÍDEOITP e/ou seus sais, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um produtoalimentício funcional para a manutenção da saúde cardiovascular.

3. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a manutenção da saúde cardiovascular compreende a inibição daenzima conversora de angiotensina.

4. USO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a manutenção da saúde cardiovascular compreende o controle dosníveis de colesterol no sangue.

5. USO, de acordo com uma das reivindicações de 1 a 4,caracterizado pelo fato de que o tripeptídeo é o MAP.

6. PRODUTO ALIMENTÍCIO FUNCIONAL, caracterizadopelo fato de ser capaz de fornecer um beneficio à saúde para seuconsumidor, sendo que ditos benefícios à saúde são selecionados a partirda prevenção da obesidade, controle do peso corporal e manutenção dasaúde cardiovascular e compreendem uma quantidade de 0,1 mg/kg oumais de MAP e/ou 1 mg/ kg ou mais do tripeptídeo ITP.

7. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que o benefício da manutenção da saúde cardiovascularcompreende a inibição da enzima conversora de angiotensina e/ou o controledos níveis de colesterol no sangue.

8. PRODUTO, de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7,caracterizado pelo fato de que a quantidade de MAP é de 0,5 mg/kg ou maise/ou a quantidade de tripeptídeo ITP é de 3 mg/kg ou mais.

9. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a quantidade de MAP é de 1 mg/kg ou mais e/ou a quantidadede tripeptídeo ITP é de 6 mg/kg ou mais.

10. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que compreende uma quantidade de 2 mg/kg ou mais de MAPe/ou 12 mg ou mais de ITP.

11. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade de 5 mg/kg a 20mg/kg ou mais de MAP e/ou de 25 a 100 mg/kg de ITP.

12. PRODUTO, de acordo com as reivindicações 6 a 11,caracterizado pelo fato de que compreende de 50 a 200 mmol/Kg de K+ e/ou dea 60 mmol/Kg de Ca2+ e/ou de 6 a 25 mmol/Kg de Mg2+.

13. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que compreende de 110 a 135 mmol/ Kg de K+ e/oude 35 a 45 mmol/ Kg de Ca2+ e/ou de 13 a 20 mmol/ Kg de Mg2+.

14. PRODUTO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 13,caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais vitaminas B.

15. PRODUTO, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que compreende o ácido fólico, a Vitamina B6 e aVitamina B12.

16. PRODUTO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 15,caracterizado pelo fato de que compreende de 3 a 25% em peso de esterol, demaior preferência, de 7 a 15% em peso de esterol.

17. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM PRODUTOALIMENTÍCIO FUNCIONAL, caracterizado pelo fato de que compreende asetapas de:(a) hidrólise enzimática de um substrato de proteína caseína quecompreende a β-caseína e/ou a a-s2-caseína resultando em um produto decaseína hidrolisado;(b) separação do produto de caseína hidrolisada de uma fraçãorica em tripeptídeo MAP e/ou de tripeptídeo ITP; e,(c) utilização da fração rica em tripeptídeo de MAP e/ou emtripeptídeo ITP como ingrediente na preparação do produto alimentíciofuncional.

18. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a fração rica em tripeptídeo MAP e/outripeptídeo ITP da etapa (b) é seca para obter um sólido rico em tripeptídeoMAP e/ou em tripeptídeo ITP e o sólido é utilizado na etapa (c) como umingrediente na preparação do produto alimentício funcional.