BRPI0611795A2

BRPI0611795A2 - imunoterapêutica arrastar-e-amplificar multivalente para carcinoma

Info

Publication number: BRPI0611795A2
Application number: BRPI0611795-3A
Authority: BR
Inventors: Adrian Bot; Chih-Sheng Chiang; Jian Gong; Kent Andrew Smith; Liping Liu; Xiping Liu; Zhiyong Qiu; David C Diamond
Original assignee: Mannkind Corp
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2010-09-28
Also published as: US8084592B2; SG162818A1; IL188107A; US20120148613A1; CN101687020A; KR20080033271A; AU2006259221B8; MX2007015950A; IL188107A0; JP2008543869A; EP2465530A1; US20070003563A1; WO2006138568A2; EP1901774A2; AU2006259221A1; NZ564360A; AU2006259221B2; CA2612518A1; EP1901774B1; WO2006138568A3

Abstract

IMUNOTERAPêUTICA DE ARRASTAR-E-AMPLIFICAR MULTIVALENTE PARA CARCINOMA. A presente invenção provê um método de tratar uma doença de proliferação de células como câncer pela provisão a um sujeito necessitando da mesma, de uma composição imunogênica que compreende plasmideo e peptideo(s) ou análogos dos mesmos. Em modalidades da presente invenção são fornecidos métodos e composições para induzir, arrastar e/ou amplificar a resposta imune a epítopos restritos a MHC classe 1 de antígenos de carcinoma para gerar uma resposta imune anti-câncer eficaz.

Description

IMUNOTERAPÊUTICA DE ARRASTAR-E-AMPLIFICAR MULTIVALENTE PARA CARCINOMA

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O presente pedido reivindica o beneficio da datade depósito do pedido de patente provisional US no. desérie 60/691.581, depositado em 17 de junho de 2005, que éincorporado aqui a titulo de referência na integra semrenúncia.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção revelada aqui se refere a métodos ecomposições para induzir uma resposta imune restrita a MHCclasse-I, controlar a natureza e -magnitude da resposta,particularmente uma resposta multivalente, e promoverintervenção imunológica eficaz em processos patogênicos.São revelados aqui métodos e composições para induzir umaresposta imune contra várias combinações de antigenosassociados a tumor, que podem promover intervençãoimunológica eficaz em processos patogênicos.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA

A American Câncer Society estimou que mais de ummilhão de pessoas têm câncer anualmente, e queaproximadamente um de cada dois homens americanos e uma decada três mulheres americanas terão algum tipo de câncer emalgum ponto durante seu tempo de vida.

As células do corpo normal crescem, dividem emorrem em um modo ordenado. Em doenças proliferativas decélulas como câncer, as células, em vez de morrer,continuam a crescer fora de controle e dividir. Embora hajamuitos tipos de câncer, eles normalmente têm inicio devidoao crescimento fora de controle de células anormais.

Opções usuais de tratamento para câncer incluemcirurgia, terapia de radiação, e quimioterapia. Uma quartaramificação de tratamento, que é mencionado comoimunoterapia, se tornou mais recentemente estabilizado.Imunoterapias são elaboradas para ajudar o sistema imune areconhecer células cancerosas, e/ou reforçar uma respostacontra as células cancerosas para destruir o câncer.Imunoterapias incluem imunoterapias ativa e passiva.Imunoterapias ativas tentam estimular o próprio sistemaimune do corpo a combater a doença. Imunoterapias passivasnão se baseiam, genericamente, no sistema imune do pacientepara atacar a doença; em vez disso, utilizam componentes dosistema imune (como anticorpos), criados fora do corpo dopaciente.

O sistema imune pode ser categorizado em doisbraços efetores discretos, imunidade adaptativa e inata.Imunidade inata envolve numerosos componentes celulares efatores solúveis que respondem imediatamente, porémgenericamente a estímulos estranhos. Imunidade adaptativa écustomizada para responder especificamente a epítoposprecisos a partir de agentes estranhos. A resposta imuneadaptativa é adicionalmente dividida em dois braçosefetores conhecidos como os sistemas imunes humoral ecelular. 0 braço humoral é centrado na produção deanticorpos por B-linfócitos enquanto o braço celularenvolve a atividade citolítica de linfócitos T citotóxicos.

Linfócitos T citotóxicos (CTL) não reconhecemepítopos nos próprios agentes infecciosos. Em vez disso,CTL detecta fragmentos de antígenos que são exibidos nasuperfície de células. Como resultado antígenos sãovisíveis a CTL somente após os mesmos terem sidoprocessados pela célula infectada e desse modo exibidos nasuperfície da célula. 0 sistema de processamento e exibiçãode antígeno na superfície de células foi bem estabelecido.CTL reconhece antígenos de peptídeo curtos, os quais sãoexibidos na superfície em associação não covalente amoléculas de complexo de histocompatibilidade principalclasse I (MHC) . Esses peptídeos de classe I são, por suavez, derivados da degradação de proteínas citosólicas.

Apesar de vários tipos de tratamentos de câncer,existe uma necessidade contínua de alternativas detratamento adicionais e mais eficazes. Uma tal alternativaabrange metodologias de tratamento médico que exigem ou sebeneficiam de uma capacidade de iniciar, estimular e/ouaumentar uma resposta imune por imunização. Essasmetodologias incluem aqueles dependendo da criação de umaresposta imune contra um polipeptídeo antigênico desejado eaquelas que dependem da iniciação ou modulação de umaresposta imune inata. Desse modo, uma abordagem notratamento de câncer é a manipulação do sistema imune pelouso de uma vacina anticâncer terapêutica.

Para gerar uma vacina ou outra composiçãoimunogênica, um antígeno ou epítopo contra o qual umaresposta imune . pode ser montada, é introduzido em umsujeito. Embora células neoplásicas de câncer sejamderivadas de e, portanto, sejam substancialmente idênticasa células normais em um nível genético, muitas célulasneoplásicas são conhecidas por apresentarem antígenosassociados a tumor (TuAAs). Esses antígenos podem serutilizados pelo sistema imune de um sujeito para reconhecere atacar as células neoplásicas como estranhas.Infelizmente, células neoplásicas parecem genericamente serignoradas pelo sistema imune do hospedeiro.

Diversas estratégias diferentes foramdesenvolvidas na técnica em uma tentativa para gerarvacinas com atividade contra células neoplásicas;entretanto, um produto eficaz e comercializável não surgiu.

A presente invenção serve, portanto, para superar asdeficiências na técnica e provê uma pluralidade decomposições imunogênicas, reveladas aqui, para alvejarcélulas de tumor ou câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a métodos ecomposições para induzir, arrastar e/ou amplificar aresposta imune a epitopos restritos à MHC classe I deantigenos de carcinoma para gerar uma resposta imune anti-câncer eficaz.

As modalidades da presente invenção são dirigidasao uso de combinações de antigenos associados a tumor(TuAAs) para a imunoterapia de pacientes com vários tiposde câncer. Em modalidades preferidas, os TuAAs sãoantigenos expressos pela própria célula de câncer. Osexemplos de tais TuAAs são Melan-A, tirosinase, SSX-2, NY-ESO-1, e PRAME. Em modalidades alternativas, os TuAAs sãoantigenos associados a componentes não cancerosos do tumor,como neovasculatura associada a tumor ou outro estroma. Umexemplo de um tal antigeno é PSMA - embora em câncer depróstata PSMA seja expresso por células cancerosas. Emmodalidades particularmente preferidas os dois tipos deantigeno são alvejados. Aspectos diferentes da invençãoincluem as composições imunogênicas, sua coleção emprodutos definidos e métodos para seu uso.

Algumas modalidades especificas se referem a umproduto imunogênico compreendendo uma pluralidade decomposições que compreendem uma ou mais composições deácido nucléico e uma ou mais composições de peptídeo; ondeuma ou mais composições de ácido nucléico são capazes deexpressar um ou mais epitopos restritos a MHC classe I, ouum análogo dos mesmos, selecionados do grupo que consisteem um epitopo SSX-1, um epitopo NY-ES0-1, um epitopo PRAME,um epitopo PSMA, um epitopo de tirosina, e um epitopo deMelan-A; onde uma ou mais composições de peptideo consistemessencialmente em um ou mais epitopos restritos a MHCclasse I, ou um análogo dos mesmos, selecionados do grupoque consiste em um epitopo SSX-1, um epitopo NY-ESO-1, umepitopo PRAME, um epitopo PSMA, um epitopo de tirosina, eum epitopo de Melan-A; e onde um ou mais peptideoscorresponde aos epitopos expressos pelos ácidos nucléicosselecionados.

Em algumas modalidades do produto imunogênico,uma ou mais composições de ácido nucléico compreendem umplasmideo selecionado do grupo que consistem pSEM, pBPL epRP12. Em algumas modalidades, as composições de peptideocompreendem um peptideo selecionado do grupo que consisteem SSX-24;l-49 (SEQ ID NO. 1), seu análogo KVSEKIFYV (SEQ IDNO. 50: NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO. 2), seu análogoSNvaLMWITQV (SEQ ID NO. 6); PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3), seuanálogo S(Nva)LQHLIG(Nle) (SEQ ID NO. 7); PSMA288-297 (SEQ IDNO. 4), seu análogo GLPSIPVHPV (SEQ ID NO. 8); Melan-A26-35(SEQ ID NO. 9), seu análogo ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO. 11);tirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10), e seu análogo yMdgtmsqNva(SEQ ID NO. 12) . Em algumas modalidades a pluralidade decomposições compreende: uma molécula de ácido nucléicocapaz de expressar um epitopo restrito a MHC classe SSX-2ou análogo do mesmo; uma molécula de ácido nucléico capazde expressar um epitopo restrito a MHC classe I NY-ESO-1,ou análogo do mesmo; uma molécula de ácido nucléico capazde expressar um epitopo restrito a MHC classe I PRAME ouanálogo do mesmo; uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PSMA; ouanálogo do mesmo; um peptideo consistindo essencialmente noepitopo SSX-2, ou análogo do mesmo; um peptideo consistindoessencialmente no epitopo PRAME, ou análogo do mesmo; e umpeptideo consistindo essencialmente no epitopo PSMA, ouanálogo do mesmo.

Em algumas modalidades do produto imunogênico asmoléculas de ácido nucléico incluídas fazem parte da mesmacomposição. Em algumas modalidades as moléculas de ácidonucléico são iguais. Em algumas modalidades a molécula deácido nucléico compreende uma seqüência que codifica aseqüência de liberação de pBPL (SEQ ID NO. 13). Em algumasmodalidades o ácido nucléico compreende uma seqüência quecodifica o polipeptídeo imunogênico de pBPL (SEQ ID NO.16). Em algumas modalidades a molécula de ácido nucléico épBPL (SEQ ID NO. 20). Em algumas modalidades a molécula deácido nucléico compreende uma seqüência que codifica aseqüência de liberação de pRP12 (SEQ ID NO. 14). Em algumasmodalidades o ácido nucléico compreende uma seqüência quecodifica o polipeptídeo imunogênico de pRP12 (SEQ ID NO.17). Em algumas modalidades a molécula de ácido nucléico épRPl2 (SEQ ID NO. 21) . Em algumas modalidades o epítopoSSX-2 é SSX-241-49 (SEQ ID NO. 1) . Em algumas modalidades, oepítopo NY-ESO-I é NY-ESO-I157-165 (SEQ ID NO. 2) . Em algumasmodalidades o epítopo PRAME é PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3) . Emalgumas modalidades o epítopo PSMA é PSMA288-297 (SEQ ID NO.4). Em algumas modalidades o análogo SSX-2 é KVSEKIFYV (SEQID. NO. 5) . Em algumas modalidades o análogo NY-ESO-I éSNvaLMWITQV (SEQ ID NO. 6). Em algumas modalidades oanálogo PRAME é S(Nva)LQHLIG(Nle) (SEQ ID NO. 7). Emalgumas modalidades, o análogo PSMA é GLPSIPVHPV (SEQ IDNO. 8).

Em algumas modalidades do produto imunogênico apluralidade de composições compreende: uma molécula deácido nucléico capaz de expressar um epítopo restrito a MHCclasse I Melan-A, ou análogo do mesmo; uma molécula deácido nucléico capaz de expressar um epítopo restrito a MHCclasse I tirosinase, ou análogo do mesmo; um peptídeoconsistindo essencialmente do epitopo Melan-A, ou análogodo mesmo; e um peptideo consistindo essencialmente noepitopo de tirosinase, ou análogo do mesmo. Em algumasmodalidades as moléculas de ácido nucléico fazem parte damesma composição. Em algumas modalidades as moléculas deácido nucléico são iguais. Em algumas modalidades amolécula de ácido nucléico compreende uma seqüência quecodifica a seqüência de liberação de pSEM (SEQ ID NO. 15).

Em algumas modalidades o ácido nucléico compreende umaseqüência codificando o polipeptideo imunogênico de pSEM(SEQ ID NO. 18). Em algumas modalidades a molécula de ácidonucléico é pSEM (SEQ ID NO. 19) . Em algumas modalidades oepitopo Melan-A é Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) . Em algumasmodalidades o epitopo de tirosinase é Tirosinase36g-377 (SEQID NO. 10) . Em algumas modalidades o produto imunogênicocompreende ainda: uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I SSX-2, ouanálogo do mesmo; e uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I NY-ESO-I ouanálogo do mesmo. Em algumas modalidades o produtoimunogênico também compreende um peptideo consistindoessencialmente em um epitopo NY-ESO-I. Em algumasmodalidades o produto imunogênico também compreende umpeptideo consistindo essencialmente em um epitopo SSX-2.

As modalidades da presente invenção se referem acomposições e métodos para arrastar e amplificar umaresposta de célula T. Tais métodos incluem uma etapa dearrastar onde uma composição compreendendo um imunógenocodificado com ácido nucléico é fornecida a um animal. Acomposição pode ser fornecida em vários locais no animal,porém preferivelmente a composição é fornecida ao sistemalinfático (por exemplo, a um linfonodo). A etapa de arrastepode incluir um ou mais fornecimentos daquela composiçãç,por exemplo, espalhamento durante um período de tempo ou emum modo contínuo durante um período de tempo. Os métodospodem incluir ainda, uma etapa de amplificação quecompreende administrar uma composição compreendendo umimunógeno de peptídeo, como SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1), NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO. 2), PRAME425^33 (SEQ ID NO. 3),PS MA2 8 8-2 97 (SEQ ID NO. 4), Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9),tirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10), e seus análogo (comorepresentado pelas SEQ ID NOS. 5, 6, 7, 8, 11 e 12) tendosimilaridade substancial aos epítopos TuAA correspondentescodificados pela composição de ácido nucléico. A etapa deamplificação pode ser executada uma ou mais vezes, porexemplo, em intervalos durante um período de tempo, em umbolo, ou continuamente durante um período de tempo. Emboranão exigido em todas as modalidades, algumas modalidadespodem incluir o uso de composições que incluem umimunopotenciador ou adjuvante.

Modalidades adicionais incluem aquelas nas quaisos plasmídeos revelados são utilizados individualmente ouem combinação. As composições de peptídeo correspondendo aesses epítopos e parte da porção de amplificação daestratégia de imunização podem ser seqüências nativas ouanálogos de peptídeo substancialmente similares à seqüênciade epítopo nativo. Os peptídeos podem ser incorporados noprotocolo de amplificação individualmente ou em combinaçõesde 2, 3, 4 ou mais dos imunógenos.

Ainda outras modalidades podem incluir epítoposalternativos (como aqueles descritos no pedido de patenteUS no. de série 10/117.937, intitulado "Epitope sequences",depositado em 4 de abril de 2002 (publicação no.20030220239 Al) , que é pela presente expressamenteincorporada a título de referência) substituídos emcombinação similar aos epítopos expressos nos plasmídeospSEM (SEQ ID NO. 19), pBPL (SEQ ID NO. 20) e pRP12 (SEQ IDNO. 21) e imunógenos de peptídeo correspondentesadministrados como a porção de amplificação da estratégiade imunização.

As modalidades da invenção podem abranger, porexemplo, dois plasmideos monovalentes que expressamimunógenos únicos no lugar de um plasmideo bivalente queexpressa os dois imunógenos; um plasmideo trivalente queexpressa três imunógenos no lugar de um bivalente e umplasmideo monovalente; um plasmideo trivalente e umplasmideo monovalente no lugar de um plasmideotetravalente; ou dois plasmideos bivalentes no lugar de umplasmideo tetravalente. As modalidades também podemabranger o uso das várias combinações de plasmideo comoparte da etapa de arrastar da estratégia de imunização dearrastar-e-amplificar.

As modalidades da invenção podem abranger umpolipeptideo ou peptideo de outro modo conjugado que podeser clivado em peptideos individuais na linfa e seu uso naetapa de amplificação da estratégia de imunização dearrastar-e-amplificar.

As modalidades da presente invenção se referem amétodos de imunização que incluem administrar uma série dedoses imunogênicas diretamente no sistema linfático de ummamífero onde a série pode incluir pelo menos 1 dose dearraste e pelo menos 1 dose de amplificação, e onde a dosede arraste pode incluir um ácido nucléico codificando umimunógeno e onde a dose de amplificação pode estar livre dequalquer vírus, vetor viral ou vetor competente dereplicação. Os métodos podem incluir ainda obter umaresposta imune específica de antígeno. Os métodos podemincluir, em um exemplo não limitador 1-2 doses de arraste.O método pode incluir administrar uma pluralidade de dosesde arraste, onde as doses são administradas durante umcurso de um a aproximadamente 7 dias. As doses de arraste,doses de amplificação ou doses de arraste e amplificaçãopodem ser fornecidas em múltiplos pares de injeções, ondeum primeiro elemento de um par pode ser administrado emaproximadamente 4 dias de um segundo elemento do par, eonde um intervalo entre os primeiros membros de paresdiferentes pode ser pelo menos aproximadamente 14 dias. Umintervalo entre uma última dose de arraste e uma primeiradose de amplificação pode estar entre aproximadamente 7 eaproximadamente 100 dias, por exemplo, porém não é limitadoa tal.

Outras modalidades se referem a um método detratar carcinoma compreendendo uma etapa de administrar aum paciente necessitando do mesmo, uma pluralidade decomposições incluindo uma molécula de ácido nucléico capazde expressar um epitopo restrito a MHC classe I SSX-2, ouanálogo do mesmo; uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I de NY-ESO-I ouanálogo do mesmo; uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PRAME ouanálogo do mesmo; e uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PSMA, ouanálogo do mesmo. Outra modalidade se refere ao métodoacima compreendendo ainda uma etapa de administrar um oumais peptideos selecionados dos epitopos de grupo ouanálogos consistindo essencialmente em SSX-2, NY-ESO-1,PRAME e PSMA.

Um método de tratar câncer compreendendoadministrar um produto imunogênico que compreende umapluralidade de composições compreendendo uma ou maiscomposições de ácido nucléico e uma ou mais composições depeptídeo; em que uma ou mais composições de ácido nucléicosão capazes de expressar um ou mais epitopos restritos aMHC classe I, ou um análogo do mesmo, selecionado do grupogue consiste em um epitopo SSX-1, um epitopo NY-ESO-1, umepitopo PRAME, um epitopo PSMA, um epitopo de tirosinase, eum epitopo Melan-A; onde uma ou mais composições depeptideo consistem essencialmente em um ou mais epitoposrestritos a MHC classe I, ou um análogo dos mesmos,selecionados do grupo gue consiste em um epitopo SSX-1, umepitopo NY-ESO-1, um epitopo PRAME, um epitopo PSMA, umepitopo de tirosinase, e um epitopo Melan-A; e em gue um oumais peptideos correspondem aos epitopos expressos pelosácidos nucléicos selecionados. Algumas modalidades sereferem ao uso do método acima em gue o câncer é um câncerde mama, um câncer de ovários, um câncer de pâncreas, umcâncer de próstata, um câncer de cólon, um câncer debexiga, um câncer de pulmão, um câncer de fígado, um câncerde estômago, um câncer de testículos, um câncer de útero,um câncer de cérebro, um câncer linfático, um câncer depele, um câncer de osso, um câncer de rim, um câncer retal,um melanoma, um gliobastoma ou um sarcoma.

Ainda outras modalidades se referem a um métodode tratar câncer compreendendo uma etapa de administrar aum paciente necessitando do mesmo uma pluralidade decomposições compreendendo: uma molécula de ácido nucléicocapaz de expressar um epitopo restrito a MHC classe IMelan-A, ou análogo do mesmo; uma molécula de ácidonucléico capaz de expressar um epitopo restrito a MHCclasse I Tirosinase, ou análogo do mesmo; um peptideoconsistindo essencialmente do epitopo Melan-A, ou análogodo mesmo; e um peptideo consistindo essencialmente doepitopo de Tirosinase, ou análogo do mesmo. Outrasmodalidades se referem ao uso do método onde o câncer a sertratado é gliobastoma ou melanoma. Ainda outras modalidadesincluem uma etapa adicional de administrar a um pacientenecessitando do mesmo uma composição compreendendo: umamolécula de ácido nucléico capaz de expressar um epitoporestrito a MHC classe I SSX-2, ou análogo do mesmo; e umamolécula de ácido nucléico capaz de expressar um epitoporestrito a MHC classe I NY-ESO-I ou análogo do mesmo; umpeptideo consistindo essencialmente do epitopo NY-ES0-1 ouanálogo do mesmo; e um peptideo consistindo essencialmenteno epitopo SSX-2 ou análogo do mesmo.

Outras modalidades se referem a conjuntos decomposições imunogênicas para induzir uma resposta imune emum mamífero incluindo, em um modo não limitador, 1-6 dosesde arraste e pelo menos uma dose de amplif icação. Em taismodalidades, as doses de arraste podem incluir um ácidonucléico codificando um imunógeno, e onde a dose deamplificação pode incluir um epitopo de peptideo, e onde oepitopo pode ser apresentado por um pAPC que expressa oácido nucléico. Uma dose pode incluir ainda um adjuvante,por exemplo, ΕΝΑ. As doses de arraste e amplificação podemestar em um veiculo apropriado para administração direta aosistema linfático (por exemplo, um linfonodo e similar). 0ácido nucléico pode ser um plasmídeo. O epitopo pode ser umepitopo HLA classe I. 0 imunógeno pode incluir um conjuntode epítopos, cujo conjunto pode incluir uma seqüência deliberação. 0 imunógeno pode consistir essencialmente em umantígeno associado a alvo. 0 antígeno associado a alvo podeser um antígeno associado a tumor porém não é limitado atal. 0 imunógeno pode incluir um fragmento de um antígenoassociado a alvo que pode incluir um grupo de epítopos.

Modalidades adicionais se referem ao método deuso das composições terapêuticas de arrastar-e-amplificar,plasmídeos tetravalentes, bivalentes e/ou monovalentes eimunógenos de peptideo correspondentes, no tratamento decarcinoma, incluindo melanoma, compreendendo aadministração via injeção no linfonodo (isto é, diretamentenos órgãos onde as respostas imunes são iniciadas eamplificadas) de acordo com um programa de imunizaçãootimizado.

Modalidades ainda adicionais se referem àfabricação de medicamentos compreendendo as composições dainvenção. Uma modalidade se refere à fabricação de ummedicamento apropriado para administração ao sistemalinfático de um sujeito. Outra modalidade se refere àfabricação de um medicamento apropriado para induzir umaresposta imune anti-câncer em um sujeito. Outra modalidadese refere à fabricação de um medicamento que arrasta eamplifica uma resposta de célula T em um sujeito. Outramodalidade se refere à fabricação de um medicamentoapropriado para tratar carcinoma em um sujeito. Outramodalidade se refere ao uso de uma ou mais composições deácido nucléico capazes de expressar um ou mais epitoposrestritos a MHC classe, ou um análogo dos mesmos, e uma oumais composições de peptideo correspondendo aos epitoposrestritos a MHC classe I ou análogos dos mesmos, nafabricação de um medicamento apropriado para induzir umaresposta imune anti-câncer em um sujeito.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Análise de tetrâmero de animaissensibilizados com pSEM/pBPL antes do reforço com peptideo.Os animais do grupo 1, 2 e 3 (n=60) foram sensibilizadoscom quatro injeções da mistura de plasmideo pSEM/pBPL nosdias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) em linfonodos inguinaisbilaterais. A análise de tetrâmero foi realizada no dia 25,10 dias após a injeção final de plasmideo e comparada comcontroles da mesma ninhada simples, sem tratamento (n=5).Os valores de tetrâmero (Melan A, Tirosinase, SSX-2, NY-ESO-I) representam a média +/- SEM.

Figura 2. Análise de tetrâmero Melan-A/Tirosinase, SSX-2/NY-ESO-I foi realizada no dia 39demonstrando uma resposta imune tetravalente em animaisindividuais. Os animais foram sensibilizados com umamistura de plasmideo de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18(100 em linfonodos inguinais bilaterais seguido porum reforço com peptideo consistindo em SSX24i-49 A42V (SEQID NO. 5) e linfonodo esquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva(SEQ ID NO. 12) no linfonodo direito nos dias 28 e 32 (25μg/dia). Os animais representativos (n=3) a partir do Grupo2 são mostrados e comparados com valores de tetrâmero paraum controle da mesma ninhada simples sem tratamento.

Figura 3. Análise de tetrâmero de animaisreforçados com SSX-2/tirosinase, sensibilizadas compSEM/pBPL. A análise de tetrâmero Melan-A/Tirosinase, SSX-2/NY-ES0-1 foi realizada no dia 39, 7 dias após a últimainjeção de peptideo. Animais do grupo 1 (n=10) foramsensibilizados com uma mistura de plasmideo de pBPL+pSEMnos dias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) seguido por um reforçocom uma mistura de plasmideo de pBPL+pSEM nos dias 28 e 32(100 μg/dia) . Os animais do grupo 2 e 3 (n=50) foramsensibilizados com uma mistura de plasmideo de pBPL+pSEMsimilar ao grupo 1 seguido por um reforço de peptideoconsistindo em SSX-24i-49 A42V (SEQ ID NO. 5) no linfonodoesquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO. 12) nolinfonodo direito nos dias 28 e 32 (25 μg/dia) . Os valoresde tetrâmero médios (Melan A, Tirosinase, SSX-2 e NY-ESO-1)foram comparados com controles da mesma ninhada simples nãotratados (n=5) e representam a média +/- SEM.

Figuras 4A-4B. Análise ELISpot IFN-γ após umprimeiro reforço com peptideo (figura 4A). A análiseELISPOT foi realizada no dia 41. Animais do grupo 1 (n=3sacrificados) foram sensibilizados com uma mistura deplasmideo de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100seguido por um reforço com uma mistura de plasmideo depBPL+pSEM nos dias 28 e 32 (100 μg/dia) . Os animais dogrupo 2 e 3 (n=6 sacrificados) foram sensibilizados com umamistura de plasmideo de pBPL+pSEM similar ao grupo 1seguido por um reforço de peptídeo consistindo em SSX-24i_49A42V (SEQ ID NO. 5) no linfonodo esquerdo e Tirosinase369-S77V377Nva (SEQ ID NO. 12) no linfonodo direito nos dias 28 e32 (25 μg/dia). Células de formação de ponto de interferon-γ especificas de antigeno (Melan A, Tirosinase, SSX-2, eNY-ESO-I) por baço foram comparadas com controles da mesmaninhada simples não tratados (n=3); figura 4A. A análiseELISpot IFN-γ foi realizada em triplicata, os valoresrepresentam média +/- Stdev. A concentração de estimulaçãode peptideo estava em 10 μς/πιΐ e incubada por 42 h. Figura4B. A análise ELISpot IFN-γ após o segundo reforço compeptideo. A análise ELISPOT foi realizada sacrificandoanimais representativos no dia 63. Os animais do grupo 1(n=3 sacrifiçados) receberam injeções de uma mistura depBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15, 18, 28, 32, 49 e 53 (100μ/dia). Os animais do grupo 2 (n=4 sacrificados) receberaminjeções de uma mistura de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18(100 μg/dia) seguido por um reforço de peptideo consistindoem SSX-24i_49 A42V (SEQ ID NO. 5) no linfonodo esquerdo eTirosinase 359-377 V377Nva (SEQ ID. NO. 12) no linfonododireito nos dias 28, 32, 49 e 53 (25 μg/dia). Os animais dogrupo 3 (n=7 sacrificados) receberam injeções de umamistura de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) emlinfonodos inguinais bilaterais seguido por um reforço compeptídeo consistindo em SSX-24i_49 A42V (SEQ ID NO. 5) nolinfonodo esquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO.12) no linfonodo direito nos dias 28 e 32 (25 μg/dia) e umsegundo reforço de peptideo consistindo em NY-ESO-I157-165L158Nva (SEQ ID No. 6), C165V (12,5 μς nos dias 49 e 53) nolinfonodo esquerdo e Melan A26-35 A27Nva (SEQ ID NO. 11) (25μg nos dias 49 e 53) no linfonodo direito. Células deformação de ponto interferon-γ especificas de antigeno(Melan A, Tirosinase, SSX-2, e NY-ESO-1) por baço foramcomparadas com um controle da mesma ninhada simples nãotratado (figura 4B) . A análise ELISpot IFN-γ foi realizadaem triplicata, os valores representam média +/- SEM. Aconcentração de estimular peptideo estava em 10 μς/ιηΐ eincubada por 42 h.

Figura 5. Representa niveis de tetrâmero, ELISPOTIFN-γ e diacetato de carbóxi-fluoresceina, histogramas deéster de succinimidil (CFSE) a partir de estudos in vivoonde os animais foram desafiados com células de tumor demelanoma humano expressando todos os quatro antigenosassociados a tumor. Controle simples (painel esquerdosuperior); dois animais com imunidade tetravalente (paineldireito superior e painel esquerdo inferior); e um animalcom uma resposta monovalente a Melan A (painel direitoinferior).

Figura 6. Análise de tetrâmero do protocolo"original" versus "expandido". Os animais foram injetadoscom base em um "protocolo original" (Grupos 1-3) ou um"protocolo expandido" (Grupos 4-6) com 4 injeções deplasmideo Dl (pRP12) (4 mg/ml) no linfonodo inguinaldireito e 4 injeções de plasmideo D2 (pBPL) (4 mg/ml) nolinfonodo inguinal esquerdo. Os animais foramsubseqüentemente reforçados com peptideos PSMA, SSX-2,PRAME e NY-ESO-I. Os animais foram sensibilizados complasmídeo Dl (pRP12) e plasmideo D2 (pBPL) (4 mg/ml) nosdias 1, 4, 15 e 18, seguido por reforço com peptideoPSMA288-297 (I297V) (RLN) (SEQ ID NO. 8) e peptideo de SSX-I41-49 (A42V) (LLN) (SEQ ID NO. 5) nos dias 29 e 31 para oprotocolo original; e reforço com peptideo PRAME425-433(L426Nva, L433Nle) (RLN) (SEQ ID NO. 7), e peptideo NY-ESO-1157-165 (L158Nva, C165V) (LLN) (SEQ ID NO. 6) nos dias 42,45 para o protocolo expandido (Grupos 4-6) . Os valoresrepresentam média +/- SEM a partir de animais individuaisapós reforço com peptideo e são comparados com controles damesma ninhada simples sem tratamento (n=5).

Figura 7. Resposta imune tetravalente a partir deum animal representativo no Grupo 1 (figura 6). Apóssensibilização com plasmideo, peptideo PSMA (25 μg) epeptideo PRAME (20 μg) foram injetados no linfonododireito. Vinte e cinco microgramas cada de peptideos SSX-2e NY-ESO-I foram injetados no linfonodo esquerdo. Os dadosmostrados medem resposta imune por ensaios tanto detetrâmetro como ELISpot.

Figura 8. Análise ELISPOT IFN-γ do protocolo"original" versus "expandido". Células de formação de pontode interferon-γ especificas de antigeno totais (SSX-2, NY-ES0-1, PRAME e PSMA) por baço são mostradas comparando osprotocolos "original" e "expandido" compreendidos dereforços com baixo, médio e alto teor de peptideo. Aanálise ELISpot IFN-γ foi realizada em triplicata, osvalores representam média +/- SEM após reforço compeptideo. Esplenócitos (3xl05 células por cavidade) foramestimulados, ex vivo em placas ELISpot de 96 cavidades, compeptideo (SSX-2, NY-ESO-1, PRAME e PSMA) em umaconcentração de 10 μg/ml por 72 h. Os valores sãoextrapolados a partir de esplenócitos nucleados totais enormalizados por baço a partir de cada animal.

Figura 9. Ensaios de citotoxicidade 51Cr. Afigura 9 representa resposta de CTL a PRAME425-433 (SEQ IDNO. 3), PSMA288-297 (SEQ ID NO. 4), NY-ESO-Ii57-I6S (SEQ ID NO.2) e SSX-241-49 (SEQ ID NO. 1) após sensibilização de DNA ereforço de peptideo e um turno de estimulação in vitro emcamundongos imunizados. Os dados são apresentados como aseguir: o eixo geométrico-x mostra a razão de efetor paraalvo; o eixo geométrico-y mostra a percentagem de Iiseespecifica correspondente.

Figura 10. Resposta imune eliciada por doisciclos de regimes terapêuticos do regime PP (PRAME e PSMA)e regime NS (NY-ESO-1 e SSX-2) mostrando dominância depeptideo de PRAME.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA

As modalidades da presente invenção se baseiam naindução de imunidade ativa (vacinação terapêutica)preferivelmente co-alvejada contra múltiplas moléculasexpressas por células de câncer e pela neovasculaturasubjacente. Essa abordagem envolve, preferivelmente, ofornecimento alvejado de DNA recombinante (plasmideo) epeptideos sintéticos diretamente nos linfonodos, desse modoeliciando uma resposta imune mediada por célula forte com opotencial de interferir finalmente na sobrevivência e/ouviabilidade de células de tumor em lesões primárias e commetástase.

A metodologia da presente invenção inclui o usocombinado de plasmideo de DNA recombinante e peptideossintéticos, preferivelmente administrados utilizando umaabordagem de sensibilizar (plasmideo) / reforçar (peptideo)através de injeção em linfonodo de acordo com um programade imunização otimizado. Em modalidades preferidas, ainjeção em linfonodo é diretamente no organismo onde asrespostas imunes são iniciadas e amplificadas. Asmodalidades da presente invenção podem ser administradas empacientes com tecido de tumor que expressam HLA-A2,particularmente HLA-A*0201. Foi observado que pelo usodesse protocolo de imunização que não somente pode oplasmideo iniciar uma resposta imune, como propende aresposta e sua amplificação subseqüente em direção a umefetor ao contrário de um caráter regulador. Sem essaimunização baseada em ácido nucléico anterior, aadministração repetida de peptideos leva a uma respostaainda mais dominada por células T reguladoras. A propensãode vida longa em direção a uma resposta efetora édenominada arraste.

As modalidades reveladas se referindo àterapêutica de arrastar-e-amplificar para carcinoma emelanoma podem ser utilizadas para obter um ataquemultivalente, oferecendo a vantagem de aumentar asensibilidade do tumor ao taque. Se mais de um antigenoúnico em uma célula de tumor for alvejado, a concentraçãoeficaz de agente antitumor é aumentada de acordo. O ataqueem estroma associado ao tumor, como vasculatura, tambémpode aumentar a acessibilidade das células de tumor ao(s)agente (s) que os alveja. Desse modo, mesmo um antigeno quetambém é expresso em algum tecido normal pode receber maiorconsideração como um antigeno alvo se os outros antigenos aserem alvejados em um ataque multivalente não forem tambémexpressos por aquele tecido.

A prática de tais protocolos de imunizaçãoenvolvendo formas disparadas de imunógeno requer o uso depelo menos duas composições diferentes e, especialmentequando há mais de um único antigeno alvo, pode envolvervárias composições a serem administradas juntas e/ou emtempos diferentes. Desse modo, modalidades da invençãoincluem conjuntos e subconjuntos de composiçõesimunogênicas e doses individuais das mesmas. Multivalênciapode ser obtida utilizando composições que compreendemimunógenos multivalentes, combinações de imunógenosmonovalentes, uso coordenado de composições compreendendoum ou mais imunógenos monovalentes ou várias combinaçõesdos mesmos. Múltiplas composições, fabricadas para uso emum regime ou protocolo de tratamento especifico de acordocom tais métodos, definem um produto imunoterapêutico.

Em algumas modalidades todas ou um subconjuntodas composições do produto são embaladas juntas em um kit.Em alguns casos, as composições de indução e amplificaçãoque alvejam um único epitopo, ou conjunto de epitopos,podem ser embaladas juntas. Em outros casos, múltiplascomposições de indução podem ser montadas em um kit e ascomposições de amplificação correspondentes montadas emoutro kit. Alternativamente, as composições podem serembaladas e vendidas individualmente juntamente cominstruções, em forma impressa ou em meios legíveis pormáquina, descrevendo como podem ser utilizadas emcombinação entre si para obter os resultados benéficos doprotocolo de imunização indicado. Variações adicionaisserão evidentes para uma pessoa versada na técnica. O usode vários esquemas de embalagem compreendendo umaquantidade menor do que todas as composições que poderiamser empregadas em um regime ou protocolo específico,facilita a personalização do tratamento, por exemplo, combase em expressão de antígeno de tumor, ou respostaobservada à imunoterapêutica ou seus vários componentes,como descrito no pedido provisional US no. de série60/580.969, depositado em 17 de junho de 2004; pedido depatente US no. de série 11/155.288 (publicação no.20060008468) depositado em 17 de junho de 2005, e pedido depatente US no. de série 11/323.964 depositado em 29 dedezembro de 2005, todos intitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OFCANCERS"; e pedido de patente provisional US no. de série60/580.964 e pedido de patente US no. de série 11/155.928(publicação no. 20050287068), ambos intitulados "IMPROVEDEFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATING DIAGNOSTICWITH THERAPEUTIC METHODS", cada um dos quais é pelopresente incorporado a titulo de referência na integra.

As modalidades da presente invenção abrangempeptideos incorporados no protocolo de amplificaçãoindividualmente ou em combinações de 2, 3, 4 ou mais dosimunógenos. Os motivos para utilizar uma quantidade menordo que todos os epitopos de peptideo incluem porém não sãolimitados aos seguintes: 1) expressão sub-ótima dequaisquer dos antígenos; 2) o paciente não expressa, ou nãomais expressa, o antigeno correspondente; 3) uma respostamenos robusta está sendo gerada para um ou outro dosepitopos, em cujo caso tal(tais) peptideo(s) podem serfornecidos na ausência dos outros para obter uma respostamais equilibrada; 4) e um peptideo pode ser descontinuadose estiver gerando algum tipo de imunotoxicidade.

I. Plasmideos e peptideos terapêuticos dapresente invenção

A. Peptideos terapêuticos e análogos dos mesmos.

A presente invenção considera o uso de múltiplasmoléculas expressas por células de câncer e pelaneovasculatura como terapêutica no tratamento de câncer.Tais moléculas incluem antigenos associados a tumor (TuAAs)que são antigenos expressos pela própria célula de câncerou associados a componentes não cancerosos do tumor, comoneovasculatura associada a tumor ou outro estroma. TuAAsajudam a casar a condição ou tipo de câncer de um pacientecom. um regime ou agente imunoterapêutico apropriado.Exemplos não limitadores de TuAAs considerados na presenteinvenção incluem SSX-2, NY-ESO-I, PRAME, PSMA (antigeno demembrana especifico de próstata), Melan-A e tirosinase.Portanto, em modalidades especificas da presente invenção,são fornecidos peptideos, análogos de peptideos ou epitoposde TuAAs (Tabela 1) como terapêutica de câncer. Emmodalidades alternativas da presente invenção, os peptideospodem compreender a seqüência nativa ou serem análogos deNY-ESO-I, SSX-2, Melan-A, tirosinase, PRAME e PSMA, comoaqueles revelados no pedido provisional US nos. De série60/581.001, 60/580.962, e 60/691.889 e seus pedidos depatentes correspondentes nos. De série 11/156.253(publicação no. 20060057673), _/_ (No. do dossiê doprocurador MANNK.052A depositado na mesma data que opresente pedido), _/_ (No. do dossiê do procuradormannk.052A2 depositado na mesma data que o presente pedido)e _/_ (No. do dossiê do procurador MANNK.052A3depositado na mesma data que o presente pedido); e pedidode patente US no. de série 11/156.369 (publicação no.20060057673); e 11/156.253 (publicação no. 20060063913);cada um dos quais é pelo presente incorporado a titulo dereferência na integra.

Tirosinase, uma enzima biossintética de melanina,é predominantemente expressa em melanócitos com níveiselevados freqüentemente observados em melanomas. Portanto,tirosinase é considerado um dos marcadores mais específicosde diferenciação melanocítica. Também é expresso em célulasgliais, as quais como melanócitos, se desenvolvem a partirde neuroectoderma. Tirosinase é desse modo também um TuAAútil para glioblastomas, incluindo gliobastoma multiforme.Detalhes adicionais de tirosinase como TuAA é revelado napatente US no. 5.747.271 incorporado aqui a titulo dereferência na integra. Em modalidades especificas dapresente invenção é fornecido o epitopo de tirosinase369-377representado aqui por SEQ. ID NO. 10 (Tabela 1).

Outro TuAA empregado na presente invenção éMelan-A, também conhecido como MART-I (Antigeno de melanomareconhecido por células T) . Melan-A/MART-1 é uma proteínabiossintética de melanina também expressa em níveiselevados em melanomas. Melan-A/MART-1 é revelado como TuAAnas patentes US nos. 5.994.523; 5.874.560; e 5.620.886,cada uma das quais é incorporada aqui a título dereferência na íntegra. Em modalidades preferidas dapresente invenção é fornecido o Melan-A TuAA, Melan-A26-35^representado aqui pela SEQ ID NO. 9 (Tabela 1).

SSX-2, também conhecido como Hom-Mel-40, é ummembro de uma família de antígenos de câncer em testículos(CT) altamente conservado (Gure, A.O. e outros, Int. J.Câncer 72:965-971, 1997, que é incorporado aqui a título dereferência na íntegra). Antígenos de câncer de testículosão encontrados em uma variedade de tumores, porém sãogenericamente ausentes a partir de tecidos em adultosnormais exceto nos testículos. A expressão de membrosdiferentes da família SSX foi encontrada em váriaslinhagens de células de tumor. SSX-2 como um TuAA érevelado na patente US no. 6.025.191, que é pela presenteincorporado a título de referência na íntegra. Emmodalidades específicas da presente invenção é fornecidoSSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1) e um análogo do mesmo, AnálogoSSX-2 (SEQ ID NO. 5), Tabela 1.

NY-ESO-I, também conhecido como CTAG-I (Antigenode câncer no testículo-1) e CAG-3 (Antigeno de câncer-3), éum antigeno de câncer no testículo encontrado em uma amplavariedade de tumores. NY-ESO-I como TuAA é revelado napatente US no. 5.804.381, que é incorporada aqui a titulode referência na integra. Em modalidades preferidas, apresente invenção provê epítopos de NY-ESO-I e análogos dosmesmos, como representado pela SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO. 6,respectivamente (Tabela 1).

Outro TuAA considerado na presente invenção éPRAME, também conhecido como MAPE, DAGE e 0IP4. PRAME éconhecido na técnica como um antigeno de câncer detestículos (CT) . Entretanto, ao contrário de muitosantígenos CT, como: MAGE, GAGE e BAGE, é expresso emleucemias de mielóide agudas. PRAME como TuAA é revelado napatente US no. 5.830.753, incorporada aqui a título dereferência na íntegra. Em modalidades preferidas, apresente invenção provê epítopos de PRAME e seus análogos,como representado pela SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 7respectivamente (Tabela 1).

Outro TuAA empregado na presente invenção é oantigeno de membrana específico de próstata (PSMA).Verifica-se que PSMA é altamente expresso em células decâncer de próstata. Entretanto, a expressão de PSMA tambémé observada em epitélio normal de próstata e naneovasculatura de tumores não prostáticos. PSMA como umapreparação anti-neovasculatura é revelado no pedido depatente provisional US no. 60/274.063, e pedido de patenteUS nos. 10/094.699 (publicação 20030046714) e 11/073.347(publicação no. 20050206234); cada um dos quais éincorporado aqui a título de referência na íntegra. PSMAcomo um TuAA é descrito na patente US no. 5.538.866incorporada aqui a título de referência na íntegra. Emmodalidades preferidas, a presente invenção provê epítoposde PSMA e análogos dos mesmos, como representado pela SEQID NO. 4 e SEQ ID NO: 8 respectivamente (Tabela 1).

TABELA 1. LISTAGEM PARCIAL DE SEQ. ID. NOS.<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table><table>table see original document page 28</column></row><table>

Os antigenos da invenção, como discutidos acima,podem ser empregados em vários regimes terapêuticos notratamento de uma doença como, porém não limitado a,câncer.

B. Composições imunogênicas que compreendemplasmideos em combinação com peptideos

Como discutido acima, a presente invenção provêcomposições imunogênicas para o tratamento de câncercompreendendo plasmideo(s) utilizado(s) em combinação compeptideo(s) sintético (s) . Tal protocolo imunogênico eliciauma resposta imune mediada por célula forte para alvejar umcâncer especifico desse modo eliminando, erradicando oumelhorando o câncer em um sujeito. Plasmideos preferidosempregados na presente invenção são o plasmideo pRPl2 (SEQID NO. 21) (pedido de patente provisional US no. 60/691.579e o pedido de patente US correspondente no. de série(no. do dossiê do procurador MANNK.053A depositado na mesmadata que o presente pedido) ambos intitulados "METHODS ANDCOMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINSTDOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CÂNCER CELLSAND TUMOR STROMA"), o plasmideo pBPL (SEQ ID NO. 20), e oplasmideo pSEM (SEQ ID NO. 19), revelados no pedido depatente provisional US no. 60/691.579, e pedido de patenteUS no. de série 10/292.413 (publicação no. 20030228634)respectivamente; cada uma das quais é incorporada aqui atitulo de referência na integra (observe que nessesdocumentos pSEM é referido como pMA2M). Plasmideosadicionais que podem ser utilizados, são revelados nessasreferências e no pedido de patente US no. de série10/225.568 (publicação no. 20030138808).

Desse modo, em várias modalidades produtosimunoterapêuticos compreendem grupos de composiçõesimunogênicas. Tais grupos podem compreender 1, 2 ou 3plasmideos como um conjunto de composições individuais oucomo composição única podem compreender dois ou maisplasmideos. Tais grupos também podem compreender múltiplospeptideos correspondendo aos epitopos expressos pelosplasmideos. Similarmente, podem ser fornecidos comocomposições que compreendem peptideos individuais oumúltiplos. Em algumas modalidades, um plasmideo ouplasmideos de arraste serão vendidos juntamente com ospeptideos de amplificação correspondentes. Em outrasmodalidades, os múltiplos plasmideos serão vendidos juntos,porém sem peptideos correspondentes. Ainda em outrasmodalidades conjuntos de peptideos correspondentes serãovendidos juntos sem o plasmideo, por exemplo, para roundssubseqüentes de amplificação da resposta arrastada.

Portanto, em uma modalidade especifica dapresente invenção é fornecida um grupo compreendendo oplasmideo pBPL (descrito em detalhe no pedido US no. desérie 10/292.413 (publicação no. 20030228634), intitulado"EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN", que é pelo presenteexpressamente incorporado a titulo de referência naintegra) expressando os epitopos NY-ESO-Ii57-I65 (SEQ ID NO.2) e SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1) e o plasmideo pRP12 (descritono pedido provisional US no. 60/691.579, pedido de patenteUS no. de série _(No. do dossiê do procuradorMANNK.053A depositado na mesma data que o presente pedido)ambos intitulados "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICITMULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT ANDSUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CÂNCER CELLS AND TUMORSTROMA", os quais são pelo presente expressamenteincorporados a titulo de referência na integra) expressandoos epitopos PRAME425-433 (SEQ ID No. 3) e PSMA288-297 (SEQ IDNO. 4). A seqüência de liberação para os plasmideos pBPL epRP12 são representadas aqui como SEQ ID NO. 13 e 14,respectivamente, e são também reveladas no pedido depatente US no. 10/212.413 (publicação no. 20030228634),incorporado aqui a titulo de referência. Os plasmideoscodificam os epitopos de tal modo que eles podem serexpressos e apresentados por pAPC.

Em outra modalidade especifica da presenteinvenção é fornecida um grupo compreendendo o plasmideopSEM (descrito em detalhe e mencionado como pMA2M no pedidode patente US no. de série 10/292.413 (publicação no.20030228634) incorporado aqui a titulo de referência_expressando os epitopos Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) etirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10). Os análogos de peptideoMelan-A2S-35 A27Nva (SEQ ID NO. 11) e tIrosinase369-B77 V377Nva(SEQ ID NO. 12) são revelados no pedido de patente US no.de série 11/156.369, e pedido de patente provisional US no.de série 60/691.889, ambos intitulados "EPITOPE ANALOGS",cada um dos quais é pela presente incorporado a titulo dereferência na integra. A seqüência de liberação desseplasmideo é representada aqui como SEQ ID NO. 15 e também érevelada no pedido de patente provisional US no.60/691.579, depositado em 17 de junho de 2005; e pedido depatente US _/_, (No. do dossiê do procurador MANNK.053Adepositado na mesma data que o presente pedido, ambosintitulados "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICIT MULTIVALENTIMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT AND SUBDOMINANT EPITOPESEXPRESSED ON CÂNCER CELLS AND TUMOR STROMA". 0 plasmideopSEM codifica os epitopos Melan-A e tirosinase em um modoque permite sua expressão e apresentação por pAPCs.

Em uma modalidade especifica adicional dapresente invenção é fornecida um grupo compreendendo oplasmideo pBPL (descrito acima) expressando os epitopos NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO. 2) e SSX-24i_49 (SEQ ID NO. 1), e oplasmideo pSEM (descrito acima) (SEQ ID NO. 19) expressandoos epitopos Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) e tirosinase369-377(SEQ ID NO. 10) . Os análogos de peptideo Melan-A26-35 A27Nva(SEQ ID NO. 11), tirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO. 12),SSX-241_49 A42V (SEQ ID NO. 5), e NY-ESO-Ii57-I65 L158Nva,C165V (SEQ ID NO. 6) são descritos no pedido provisional USno. 60/580.962; pedido de patente US no. de série11/155.929; pedido provisional US no. de série 60/581.001;pedido de patente US no. de série 11/156.253; pedido depatente US no. 11/156.369 e pedido de patente provisionalUS no. de série 60/691.889, cada um dos quais é pelapresente incorporado a titulo de referência na integra. Osplasmideos, pSEM (SEQ ID NO. 19) e pBPL (SEQ ID NO. 20),codificam os respectivos epitopos (Melan-A, tirosinase, NY-ESO-1, e SSX-2) em um modo que eles podem ser expressos eapresentados por pAPCs.

Outra modalidade especifica da presente invençãorefère-se ao grupo compreendendo o plasmideo pRP12(descrito acima) expressando os epitopos PSMA288-297 (SEQ IDNO. 4) e PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3) e o plasmideo pSEM(descrito acima) expressando os epitopos Melan-A26-35 (SEQID NO. 9) e tirosinase369_377 (SEQ ID NO. 10) . Os análogos depeptideo Melan-A26-35 A27Nva (SEQ ID NO. 11), tirosinase369-377V377Nva (SEQ ID NO. 12), PRAME425-433 L426Nva, I433Nle (SEQID NO. 7), e PSMA288-297 I297V (SEQ ID NO. 8) são descritosno pedido provisional US no. 60/580.962; pedido de patenteUS no. de série 11/155.929; pedido provisional US no. desérie 60/581.001; pedido de patente US no. de série11/156.253; pedido de patente US no. 11/156.369 e pedido depatente provisional US no. de série 60/691.889, cada um dosquais é pela presente incorporado a titulo de referência naintegra. Dois Os plasmideos codificam seus respectivosepitopos (Melan-A, tirosinase, PRAME e PSMA) em um modo queeles podem ser expressos e apresentados por pAPCs.

Em modalidades adicionais, cada um dos gruposacima inclui os peptideos correspondendo (que é capaz deamplificar a resposta a) aos epitopos expressos por aquelesplasmideos. Outras modalidades especificas compreendem umplasmideo individual e um ou ambos os peptideoscorrespondentes. (Embora os plasmideos específicosmencionados aqui sejam descritos como bivalentes, elespodem ser também amplificados em um modo monovalente).

Como mencionado aqui, um regime terapêutico PPabrange a administração de plasmideo e peptídeo paraalvejar os antígenos PRAME e PSMA. Similarmente, um regimeMT alveja antígenos Melan-A/tirosinase e um regimeterapêutico NS alveja antígenos NY-ESO-I e SSX-2.

II. Doenças de proliferação de células e métodosde classificação

As composições imunogênicas da presente invenção,compreendendo um plasmideo e um ou mais peptideos ouanálogos dos mesmos, podem ser administradas no tratamentode uma doença de proliferação de células como câncer, em umsujeito. Cânceres que podem ser tratados utilizando acomposição imunogênica da presente invenção incluem, porexemplo, melanoma, câncer de pulmão incluindo: câncer depulmão de célula não pequena (NSCLC) ou câncer de pulmão decélula pequena (SCLC), hepatocarcinoma, retinoblastoma,astrocitoma, gliobastoma, leucemia, neuroblastoma, câncerde cabeça e pescoço, câncer de mama, câncer do pâncreas,câncer renal, câncer dos ossos, câncer testicular, câncerdo ovário, mesotelioma, câncer cervical, câncergastrointestinal, linfoma, câncer de cólon, câncer debexiga e/ou cânceres do sangue, cérebro, pele, olhos,língua, gengiva. Prevê-se também que as composiçõesimunogênicas da presente invenção podem ser utilizadas paratratar doenças proliferativas de células diferentes decâncer. Outras doenças proliferativas de célulasconsideradas na presente invenção, podem incluir, porexemplo, displasias, lesões pré-neoplásicas (por exemplo,hiperplasia adenomatosa, neoplasia intraepitelial depróstata, displasia cervical, polipose de cólon), oucarcinoma in situ, porém não é limitada a tal.

As células ou tecido obtido a partir de pacientespredispostos a, ou tendo câncer, podem ser classificadaspara melhor determinar o regime imunoterapêutico apropriadopara administrar ao paciente. Tal classificação podeincluir as etapas de ensaiar o tecido de tumor do pacienteem relação a dois ou mais antígenos associados a tumorexpresso (TuAAs) em um painel pré-selecionado de antígenospara desenvolver um perfil de antígeno para o tumor. Umregime imunoterapêutico pode ser desse modo selecionado combase no perfil de antígeno obtido. O regime selecionadopode compreender administrar pelo menos um agenteimunoterapêutico que alveja dois, três, quatro ou mais dosantígenos expressos. O agente imunoterapêutico podecompreender ou codificar um epítopo restrito pelo tipo MHCde classe I do paciente, para cada um de dois ou maisantígenos expressos pelo tumor. A expressão de antígenopode ser detectada em células neoplásicas, ou célulasestromais associadas a tumor, ou ambas.

Regimes imunoterapêuticos fornecidos na presenteinvenção incluem: o regime PP onde os antígenos alvo sãoPRAME e PSMA; esse regime co-alveja a vasculatura e umantígeno de câncer de testículo. Outro regime fornecidopela presente invenção é o regime MT onde os antígenos alvosão Melan-A e tirosinase; esse regime alveja antígenosespecíficos de tecido associados a melanoma e gliobastoma.

0 regime NS da invenção se refere a antígenos alvo NY-ESO-Ie SSX-2 que são antígenos de câncer de testículo encontradocom freqüência variável em uma ampla variedade de cânceres.

Em outras modalidades específicas da invenção, os regimes:PPNS (co-alvej ando PRAME, PSMA, NYESO-1, SSX2),'NSMT (co-alvejando NYESO-1, SSX2, Melan A e tirosinase) ou PPMT (co-alve jando PRAME, PSMA, Melan A, Tirosinase) são fornecidos.

Um método de classificação empregado na presenteinvenção pode incluir as etapas de: ensaiar um tecido detumor de paciente para detectar um ou mais polipeptídeosexpressos em um painel pré-selecionado, onde o painelcompreende dois, ou três ou quatro ou mais TuAAs e pelomenos um marcador específico de linhagem; e confirmar odiagnóstico de câncer com base no ensaio. 0 painel podecompreender pelo menos 2, 3, 4 ou mais TuAAs selecionados apartir do grupo que consiste em NY-ESO-I, PRAME, PSMA,tirosinase, melan-A/MART-1, e proteína SSX. Em algunscasos, o marcador específico de linhagem pode ser um TuAA;alternativamente, o marcador específico de linhagem não éum TuAA. Por exemplo, no caso de melanoma e/ou gliobastoma,o marcador específico de linhagem pode ser tirosinase,melan-A/MART-1 ou gplOO; no caso de câncer de próstata, omarcador específico de linhagem pode ser PSA ou PSMA.

Uma expressão de antígeno de tumor tende a serheterogênea, qualquer amostra de biópsia específicaprovavelmente não dará uma indicação completa de todos osantígenos expressos. Desse modo, não é necessário que umperfil de paciente contenha todos os antígenos paratratamento. Os métodos de classificação empregados napresente invenção podem incluir um ensaio de um tecido detumor do tipo presuntivo correspondente para expressão deum painel pré-selecionado de antigenos. Em alguns casos, umpainel de TuAAs montado para um tipo de tumor pode serutilizado para classificar outros tipos de tumor que podemexpressar pelo menos alguns dos mesmos antigenos e umperfil de expressão desenvolvido.

As composições imunogênicas da presente invençãopodem ser administradas a pacientes com tecido de tumor queexpressa HLA-A2, particularmente HLA-A*201.

A metodologia exemplar para obter um perfil deexpressão de antigeno de um tumor especifico que pode serutilizado para determinar qual antigeno ou combinação deantigenos é útil no tratamento de um câncer especifico podeser encontrada no pedido provisional US no. de série60/580.969, depositado em 17 de junho de 2004; pedido depatente US no. de série 11/155.288 (publicação no.20060008468), depositado em 17 de junho de 2005; e pedidode patente US no. de série 11/323.964, também depositado em17 de junho de 2005, todos intitulados "COMBINATIONS OFTUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPESOF CANCERS"; cada um incorporado aqui a titulo dereferência na integra. Combinações antigênicas especificasde beneficio especifico na orientação de uma resposta imunecontra cânceres específicos são reveladas no pedidoprovisional US no. 60/479.554, depositado em 17 de junho de2003, pedido de patente US no. de série 10/871.708(publicação no. 20050118186), depositado em 17 de junho de2004 (ambos intitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATEDANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS"); epublicação de pedido de patente PCT no. WO 2004/112825,depositado em 17 de junho de 2004; cada uma das quais éincorporada aqui a titulo de referência na integra.

III. Terapêutica de arrastar-e-amplificar paraadministração

Em uma modalidade preferida, a presente invençãoprovê uma composição compreendendo o uso combinado deplasmideo de DNA recombinante e peptideos sintéticos,administrados utilizando uma abordagem de sensibilizar(plasmideo)/reforçar (peptideo). Tal composição pode serfornecida através de injeção em linfonodo de acordo com umprograma de imunização otimizado. As modalidades dapresente invenção podem ser administradas a pacientes comtecido de tumor que expressa HLA-A2, particularmente HLA-A*0201. Portanto, as composições imunogênicas compreendendoum plasmideo e um ou mais peptideos ou análogos dos mesmospodem ser administradas no tratamento de um câncer em umsujeito. As modalidades reveladas da presente invenção sereferem à terapêutica de arrastar-e-amplificar paracarcinoma, incluindo melanoma, que pode ser utilizada paraobter um ataque multivalente, oferecendo a vantagem deaumentar a sensibilidade do tumor ao ataque.

Portanto, em modalidades especificas, a presenteinvenção provê terapêutica de arrastar-e-amplificarmultivalente para o tratamento de câncer. Tal terapêuticamultivalente pode alvejar mais de um antigeno em uma célulade tumor. Em instâncias onde mais de um único antigeno emuma célula de tumor é alvejada, a concentração eficaz deterapêutica anti-tumor é aumentada de acordo. O ataque emestroma associado ao tumor, como vasculatura, pode aumentara acessibilidade das células de tumor ao(s) agente (s) queas alveja. Desse modo, mesmo um antigeno que também éexpresso em algum tecido normal pode receber maiorconsideração como antigeno alvo se os outros antigenos aserem alvejados em um ataque multivalente, não forem tambémexpressos por aquele tecido.

A. Terapêutica de arrastar-e-amplificar bivalente

Uma modalidade da presente invenção se refere auma terapêutica de arrastar-e-amplificar bivalente paramelanoma. Portanto, na presente invenção é fornecida umgrupo compreendendo o plasmideo pSEM e peptideoscorrespondendo a epitopos Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) etirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10) administrados como o regimeMT contra melanoma. Em modalidades preferidas, os análogosde peptideo Melan-A27-33 A27Nva (SEQ ID NO. 11) e/outirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO. 12) são utilizados naetapa de amplificação. O protocolo de arrastar-e-amplificarempregado na presente invenção é como revelado acima.

O grupo de plasmideo pSEM pode ser fornecido emum modo similar àquele discutido acima para a terapêuticade arrastar-e-amplificar tetravalente para melanoma.

Pacientes com melanoma podem ser classificados de acordocom os métodos revelados aqui e o regime mT utilizado compacientes cujo perfil de antigeno de tumor inclua Melan-Ae/ou tirosinase. A administração do reforço de peptideopode envolver um ou ambos os antigenos expressos pelosplasmideos.

Similarmente os regimes PP e NS podem serutilizados para terapia bivalente utilizando gruposcompreendendo pRP12 e peptideos correspondendo aos epitoposP SMA2 8 8-2 97 (SEQ ID NO. 4) e PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3), epBPL e peptideos correspondendo aos epitopos NY-ESO-li57_165(SEQ ID NO. 2) e SSX-24i-4g (SEQ ID NO. 1), respectivamente.

Esses regimes bivalentes podem ser combinados para criartratamentos de valência mais elevada, cujas modalidadesselecionadas são descritas abaixo, e vários conjuntos decomposições imunogênicas montados para suportar os mesmos.

B. Terapêutica de arrastar-e-amplificartetravalente

Uma modalidade da presente invenção se refere auma terapêutica de arrastar-e-amplificar tetravalente paracarcinoma. Portanto, em uma modalidade específica dapresente invenção é fornecida um grupo compreendendo oplasmídeo pBPL que expressa os epítopos NY-ESO-Ii57-Ig5 (SEQID NO. 2) e SSX-241-49 (SEQ ID NO. 1) e o plasmídeo pRP12que expressa os epítopos PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3) ePSMA288 -297 (SEQ ID NO. 4) (mencionados aqui como o regimePP), cada um administrado como os imunógenos de arraste deuma estratégia de imunização. Um imunógeno de "arraste",como considerado na presente invenção, inclui em muitasmodalidades uma indução que confere estabilidade específicaao perfil imune da linhagem induzida de células T.

Adicionalmente, quatro composições de peptídeocorrespondendo aos epítopos NY-ESO-I, SSX-2, PRAME e PSMAsão administrados como a porção de amplificação da mesmaestratégia de imunização que aquele do imunógeno dearraste. Em uma modalidade preferida, os análogos depeptídeo NY-ESO-li57-i65 L158Nva, C165V (SEQ ID NO. 6); SSX-241-49 A42V (SEQ ID NO. 5); PSMA288-297 I297V (SEQ ID NO. 8);e/ou PRAME425-433 L426Nva, L433Nle (SEQ ID NO. 7) sãoutilizados na etapa de amplificação. Como considerado napresente invenção, o termo "amplificar ou amplificação",como de uma resposta de célula T, inclui em muitasmodalidades um processo para aumentar o número de células,o número de células ativadas, o nível de atividade, taxa deproliferação, ou parâmetro similar de células T envolvidasem uma resposta específica.

0 protocolo de arrastar-e-amplificar empregado napresente invenção é descrito em maior detalhe no pedidoprovisional US no. 60/640.402, pedido de patente US no. Desérie 10/871.707 (publicação no. 2005007 9152), e pedido depatente us no. de série 11/323.572, cada um intitulado"methods to elicit, enhance and sustain immune responsesagainst mhc class i-restricted epitopes, for prophylacticor therapeutic purposes," cada um dos quais é incorporadoaqui a titulo de referência na integra.

Em modalidades preferidas da presente invenção,os plasmideos são administrados por via intranodal como umimunógeno de arraste aos linfonodos inguinais, um no ladoesquerdo e um no lado direito. Subseqüentemente, ospeptideos são administrados seqüencialmente por viaintranodal como imunógenos de amplificação, dois em diasseparados no nodo esquerdo e os outros dois em diasseparados no nodo direto. Prefere-se, porém não é exigido,que os peptideos sejam administrados no mesmo linfonodo querecebeu o plasmideo codificando os epitoposcorrespondentes.

Pacientes com carcinoma, especialmente aquelescom carcinoma de célula no ovário, colorretal, pancreáticoou de renal, podem ser classificados de acordo com osmétodos revelados aqui e regimes terapêuticos PP e ou NSadministrados a pacientes cujo perfil de tumor incluaPRAME, PSMA, NY-ES0-1 e/ou SSX-2. Observa-se que o epitopoNY-ESO-I também é encontrado em LAGE la/s, de modo apresença desse antigeno em um perfil pode ser tambémconsiderada no perfil do tumor. Como a expressão deantigeno de tumor tende a ser heterogênea, qualquer amostrade biópsia especifica provavelmente não fornece umaindicação completa de todos os antigenos expressos. Dessemodo, não é necessário que o perfil de um paciente contenhatodos os quatro antigenos para aquele paciente ser umcandidato para tratamento com terapêutica da invenção.

Entretanto, prefere-se que o perfil contenha 2, 3 ou 4 dosantigenos.C. Terapêutica de arrastar-e-amplificartetravalente para melanoma

Uma modalidade da presente invenção se refere auma terapêutica de arrastar-e-amplificar tetravalente paramelanoma, compreendendo os plasmídeos pSEM e pBPL e ospeptideos correspondentes. 0 plasmideo pSEM codifica oanálogo A27L do epitopo Melan-A26-33 (SEQ ID NO. 9) e aseqüência de epitopo tirosinase nativo (t irosinase3e9-377(SEQ ID NO. 10) ) (mencionada aqui como o regime MT) . Oplasmideo pBPL codifica seqüências nativas NY-ESO-I1S7-ISS(SEQ ID NO. 2) e SSX-241_49 (SEQ ID NO. 1) . 0 grupocompreendendo o plasmideo é administrado como a porção dearraste de uma estratégia de imunização contra melanoma.

Adicionalmente, quatro composições de peptideocorrespondendo aos epítopos NY-ESO-l, SSX-2, Melan-A etirosinase são administradas como a porção de amplificaçãoda mesma estratégia de imunização. Em uma modalidadepreferida, os análogos de peptideo Melan-A26-3s A27Nva (SEQID NO. 11), tirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO. 12), SSX-2,31-49 A42V (SEQ ID NO. 5) e NY-ESO-l157-16s L158Nva, C165 (SEQID NO. 6) são utilizados na etapa de amplificação.

Para tratamento de um câncer como melanoma, osplasmideos são administrados por via intranodal aoslinfonodos inguinais como imunógenos de arraste.

Subseqüentemente os peptideos são administrados por viaintranodal, preferivelmente um no nodo esquerdo, o outro nodireito em qualquer dia especifico como imunógenos deamplificação. Pacientes com melanoma podem serclassificados de acordo com os métodos revelados aqui e osregimes apropriados administrados a pacientes cujo perfilde antigeno de tumor inclua Melan-A e/ou tirosinase. Aadministração do reforço de peptideo pode envolver 2, 3 ou4 dos antigenos expressos pelos plasmideos.D. Terapêutica de arrastar-e-amplificartetravalente para gliobastoma

Em uma modalidade especifica, adicional dapresente invenção, é fornecida uma terapêutica de arrastar-e-amplificar tetravalente aplicável a melanoma que éaplicada em outros cânceres como gliobastoma. Uma talmodalidade se refere ao plasmideo pRP12 compósito (descritoacima) expressando os epitopos PSMA288-297 (SEQ ID NO. 4) ePRAME425-433 (SEQ ID NO. 3) e o plasmideo pSEM (descritoacima) expressando os epitopos Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) etirosinase369_377 (SEQ ID NO. 10) administrados como a porçãode arraste de uma estratégia de imunização. Adicionalmente,quatro composições de peptideo correspondendo aos epitoposPSMA, PRAME, Melan-A e tirosinase são administradas como aporção de amplificação da mesma estratégia de imunização.

Em uma modalidade preferida, os análogos de peptideo Melan-A26-35 A27Nva (SEQ ID NO. 11), tirosinase369-377 V377Nva (SEQID NO. 12), PRAME425-433 L426Nva, I433Nle (SEQ ID NO. 7), ePSMA288-297 I297V (SEQ ID NO. 8) são utilizados na etapa deamplificação.

Pacientes com câncer podem ser classificados deacordo com os métodos revelados aqui e os regimes PP e/ouMT administrados aos pacientes cujo perfil de antigeno detumor inclua PRAME, PSMA, Melan-A e/ou tirosinase. Aadministração do reforço de peptideo pode envolver 2, 3 ou4 dos antigenos expressos pelos plasmideos.

IV. Métodos de fornecimento de composições dapresente invenção

Na presente invenção, a administração preferidada composição imunogênica compreendendo plasmideo de DNArecombinante como iniciador e peptideo(s) sintético(s) comoreforço, é através de injeção no linfonodo. O plasmideo(iniciador) pode ser administrado separadamente a partir dopeptídeo (reforço). As modalidades da presente invençãopodem abranger dois plasmideos monovalentes que expressamimunógenos únicos no lugar de um plasmídeo bivalente queexpressa os dois imunógenos. Em outras modalidades, umplasmideo trivalente que expressa três imunógenos no lugarde um bivalente e um plasmideo monovalente pode serempregado. Em alguns casos um plasmideo trivalente e umplasmideo monovalente no lugar de um plasmideotetravalente; ou dois plasmideos bivalentes no lugar de umplasmideo tetravalente pode ser empregado. Qualquer queseja a combinação das composições da invenção empregada, ainjeção de linfonodo é preferida, pois permite fornecimentodiretamente nos órgãos onde as respostas imunes sãoiniciadas e amplificadas de acordo com um programa deimunização otimizado.

Para introduzir a composição imunogênica nosistema linfático do paciente, a composição épreferivelmente dirigida a um vaso 1'infa, linfonodo, baçoou outra porção apropriada do sistema linfático. Em algumasmodalidades cada componente é administrado como um bolo. Emoutras modalidades, um ou mais componentes são fornecidospor infusão, genericamente através de várias horas a váriosdias. Preferivelmente, a composição é dirigida a umlinfonodo como um nodo inguinal ou axilar pela inserção deum cateter ou agulha no nodo e mantendo o cateter ou agulhadurante todo o fornecimento. Agulhas ou cateteresapropriados são disponíveis feitos de metal ou plástico(por exemplo, poliuretano, cloreto de polivinil (PVC),TEFLON, políetileno, e similares). Na inserção do cateterou agulha no nodo inguinal por exemplo, o nodo inguinal éperfurado sob controla ultra-sonográfico utilizando umacânula Vialon™ Insyte™ e cateter de 24G3/4 (BectonDickinson, USA) que é fixa utilizando curativo transparenteTegaderm™ (Tegaderm™, St. Paul, MN, EUA) . Esseprocedimento é' feito genericamente por um radiologistaexperiente. A localização da ponta do cateter dentro dolinfonodo inguinal é confirmada por injeção de um volumemínimo de solução salina, que aumenta imediata evisivelmente o tamanho do linfonodo. 0 procedimentomencionado por último permite confirmação de que a pontaestá dentro do nodo. Esse procedimento pode ser executadopara assegurar que a ponta não deslize para fora dolinfonodo e pode ser repetido em vários dias apósimplantação do cateter. No caso da ponta deslizar para forado local dentro do linfonodo, um novo cateter pode serimplantado.

A(s) composição(ões) terapêutica (s) da presenteinvenção pode(m) ser administrada(s) a um paciente em ummodo compatível com protocolos de fornecimento de vacinapadrão que são bem conhecidos por uma pessoa comconhecimentos comuns na técnica. Os métodos de administrarcomposições imunogênicas da presente invenção compreendendoplasmídeos e peptídeos ou análogos de peptídeo dos TuAAsincluem, sem limitação, administração transdérmica,intranodal, perinodal, oral, intravenosa, intradérmica,intramuscular, intraperitoneal e por mucosa, fornecimentopor injeção ou instilação ou inalação. Um métodoparticularmente útil de fornecimento de vacina para eliciaruma resposta CTL é revelado na patente australiana no.739189; patentes US nos. 6.994.851 e 6.977.074 ambasintituladas "A METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE".

Vários parâmetros podem ser levados emconsideração no fornecimento ou administração de umacomposição imunogênica a um sujeito. Além disso, um regimede dosagem e programa de imunização pode ser empregado.

Genericamente, a quantidade dos componentes na composiçãoterapêutica variará de paciente para paciente e de antigenopara antigeno, dependendo de tais fatores como: a atividadedo antigeno em induzir uma resposta; a taxa de fluxo dalinfa através do sistema do paciente; o peso e idade dosujeito; o tipo de doença e/ou condição sendo tratada; agravidade da doença ou condição; intervenções terapêuticasprévias ou simultâneas; a capacidade do sistema imune doindivíduo em sintetizar anticorpos; o grau de proteçãodesejado; o modo de administração e similares, todos osquais podem ser facilmente determinados pelo médico.

Em geral a composição terapêutica pode serfornecida em uma taxa de aproximadamente 1 aaproximadamente 500 microlitros/hora ou aproximadamente 24a aproximadamente 12000 microlitros/dia. A concentração doantigeno é tal que aproximadamente 0,1 microgramas aaproximadamente 10.000 microgramas do antigeno serãofornecidos durante 24 horas. A taxa de fluxo se baseia noconhecimento de que em cada minuto aproximadamente 100 aaproximadamente 1000 microlitros de fluido linfa fluiatravés de um linfonodo inguinal de adulto. 0 objetivo émaximizar concentração local de formulação de vacina nosistema linfa. Uma certa quantidade de investigaçãoempírica em pacientes será necessária para determinar onível mais eficaz de infusão para uma dada preparação devacina em seres humanos.

Em modalidades específicas, a composiçãoimunogênica da presente invenção pode ser administrada comouma pluralidade de doses seqüenciais. Tal pluralidade dedoses pode ser 2, 3, 4, 5 ou 6 ou mais doses conformenecessário. Em modalidades adicionais da presente invenção,considera-se que as doses da composição imunogênica seriamadministradas em aproximadamente segundos ou minutos entresi nos linfonodos inguinais direito ou esquerdo. Porexemplo, o plasmídeo (iniciador) pode ser primeiramenteinjetado no linfonodo direito seguido em segundos ouminutos por um segundo plasmídeo nos linfonodos inguinaisdireito ou esquerdo. Em outras instâncias a combinação deum ou mais plasmídeo expressando um ou mais imunógenos podeser administrada. Prefere-se que a injeção subseqüente apósa primeira injeção no linfonodo seja em aproximadamente 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais minutos porém não maisdo que aproximadamente 30, 40, 50 ou 60 minutos da primeirainjeção. Considerações similares se aplicam à administraçãode dois peptídeos individualmente aos linfonodos direito eesquerdo. Pode ser desejável administrar a pluralidade dedoses da composição imunogênica da invenção em um intervalode dias, onde vários dias (1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 ou maisdias) decorrem entre administrações subseqüentes. Em outrasinstâncias, pode ser desejável para administração(ões)subseqüente(s) das composições da invenção seremadministradas através de injeção bilateral de linfonodoinguinal em aproximadamente 1, 2, 3 ou mais semanas ou emaproximadamente 1, 2, 3 ou mais meses após a administraçãode dose inicial.

Δ administração pode estar em qualquer modocompatível com a formulação de dosagem e em tal quantidadecomo será terapeuticamente eficaz. Uma dose ou quantidadeeficaz de uma composição imunogênica da presente invenção éaquela quantidade necessária para fornecer uma respostadesejada no sujeito a ser tratado.

V. EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são incluídos parademonstrar modalidades preferidas da invenção. Deve serreconhecido por aqueles versados na técnica que ametodologia revelada nos exemplos que se seguem representammetodologias descobertas pelos inventores como funcionandobem na prática da invenção, e desse modo podem serconsideradas como constituindo modos preferidos para suaprática. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, àluz da presente revelação, apreciar que muitas mudançaspodem ser feitas nas modalidades especificas que sãoreveladas e ainda obter um resultado similar sem se afastardo espirito e escopo da invenção.

EXEMPLO 1

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

ANIMAIS

Uma vez que a resposta imune contra epitopos decélulas T humanas não pode ser estudada nos modelos nãoclínicos originais devido à restrição a MHC inerente, deimunidade, um modelo de camundongo geneticamente manipuladofoi escolhido que expressa o gene A*0201 humano (Pascolo eoutros, 1997), que é freqüentemente expresso na populaçãohumana. Ao contrário de camundongos imunodeficientes (abase para modelos de xenoenxerto), o modelo transgênicoA*0201 (HHD) é imune competente, desse modo permitindo aavaliação de estratégias imunoterapêuticas ativas.

Portanto, camundongos HHD transgênicas HLA-A2.1negativas-classe I H-2 fêmeas (nocaute), com 8-12 semanasde idade, foram utilizados nesses estudos. Os animais foramalojados sob condições livres de patógenos.

Metodologia

O plasmídeo pSEM bivalente (DNA recombinante nãode replicação) codificando para os antígenos associados atumor Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) e Tirosinase369-377 (SEQ IDNO. 10) e plasmídeo bivalente pBPL codificando paraantígenos associados a tumor SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1) e NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO. 2) foram avaliados em relação ácapacidade de sensibilizar uma resposta imune Tcl (produçãode interferon gama) nos Exemplos 2-6. O análogo de peptídeoMelan-A25-3S A27Nva ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO. 11), análogo depeptídeo tirosinase369-377 (V377Nva; YMDGTMSQNva (SEQ ID NO.12), o análogo de peptídeo NY-ESO-Ii57-I6S (L158Nva, C165V;S(Nva)LMTWITQV (SEQ ID NO. 6) e o análogo de peptídeo SSX-241-49 (A42V; KVSEKIFY (SEQ ID NO. 5) foram utilizados parareforço subseqüente.

Os plasmídeos foram formulados em tampão clínico(127 mM NaCl, 2. 5mM Na2HPO4, 0,88 mM KH2PO4, 0,25 mMNa2EDTA, 0,5% ETOH em H2O). 0 análogo Melan A26-35 (A27Nva)(SEQ ID NO. 11) foi formulado em PBS em concentração de 1,0mg/ml. Similarmente, o análogo de Tirosinase369-377 (V377Nva)(SEQ ID NO. 12) foi formulado em PBS em concentração de 1,0mg/ml. 0 análogo SSX-241_49 (A42V) (SEQ ID nO. 5) foiformulado em PBS em concentração de 1,0 mg/ml enquanto oanálogo de peptídeo NY-ESO-Ii57-I6S (L158Nva, C165V) (SEQ IDNO. 6) foi preparado para imunização em PBS contendo 5%DMSO em uma concentração de 0,5 mg/ml. Dados de citometriaforam coletados utilizado um citômetro de fluxo BD FACSCalibur e analisados utilizando software CellQest porgating na população de linfócitos.

Fornecimento intranodal de plasmídeos e peptídeos

As preparações de dose foram administradasatravés de injeção intranodal inguinal bilateral nos dias1, 4, 15, 18, 29, 32, 49 e 53 do estudo. Os camundongosforam anestesiados por inalação de isoflurano e ascirurgias foram realizadas sob condições assépticas. Após apreparação para cirurgia, uma incisão com 0,5 - 1 cm decomprimento foi feita na dobra inguinal expondo o linfonodoinguinal. Um volume máximo de 25 μL (25 μg em uma soluçãode 1 mg/ml) de plasmídeo ou peptídeo foi injetadodiretamente no linfonodo inguinal direito e esquerdoutilizando uma seringa de insulina de 0,5 mL. A incisão foifechada com suturas de pele de náilon 6,0 estéreis.Programa de imunização com plasmideo(sensibilizar)/peptideo (reforçar)

Três grupos de animais HHD fêmeas foramimunizados como descrito acima, com uma mistura depSEM/pBPL (100 μg/dia) nos linfonodos inguinais bilaterais.

O grupo 1 (n=10 camundongos) recebeu injeções de plasmideonos dias 1, 4, 15, 18, 28, 32, 49 e 53; o grupo 2 e o grupo3 (n=25 camundongos por grupo) receberam injeções deplasmideo nos dias 1, 4, 15, e 18 respectivamente comomostrado na tabela 2 (abaixo).

Os animais do grupo 2 foram reforçados nolinfonodo direito com peptideos de Tirosinase V377Nva (SEQID NO. 12) (25 μg/dia) e no linfonodo esquerdo com SSX-2A42V (SEQ ID NO. 5) (25 μg/dia) nos dias 28, 32, 49 e 53.

Os animais do grupo 3 foram reforçados no linfonodo direitocom peptideos Tirosinase V377Nva (SEQ ID NO. 12) (25μg/dia) e no linfonodo esquerdo com SSX-2 A42V (SEQ ID NO.5) (25 μg/dia) nos dias 28 e 32 então foram reforçados nolinfonodo direito com peptideos NY-ESO-I L158Nva, C165V(SEQ ID No. 6) (12,5 μg/dia) e no linfonodo esquerdo comMelan A A27Nva (SEQ ID NO. 11) (25 μg/dia) nos dias 49 e 53como também mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Programa de imunização

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Análise de tetrâmero

A enumeração de células T especificas de antigenoCD8+ requer reconhecimento cognato do receptor de célula T(TCR) por um complexo de peptídeo/MHC classe I. Isso podeser feito utilizando tetrâmetros MHC de classe I que sãocompostos de um complexo de quatro moléculas HLA MHC classeI cada uma ligada ao peptideo especifico e conjugada comuma proteína fluorescente. Desse modo, ensaios de tetrâmeropermitem quantificação da população total de células Tespecífica para um dado peptideo complexado em uma moléculaMHC específica. A citometria de fluxo é empregada naquantificação de ligação de células com o receptor decélula T apropriado aos tetrâmetros rotulados. Além disso,como a ligação não depende de vias funcionais, essapopulação inclui todas as células T CD8+ especificasindependente de estado funcional.

A resposta CTL em animais imunizados foi medidacomo descrito no programa de imunização depeptideo/plasmideo acima, 7 dias após as últimasimunizações com plasmideo (dia 25) e peptideo (dias 39 e60). Células mononucleares foram isoladas de sangueperiférico após centrifugação de densidade (LympholyteMammal, Cedarlane Labs) e coloridas com HLA-A*0201 SSX-2(KASEKIFYV (SEQ ID NO. 1))-PE MHC tetrâmero (BeckmanCoulter, T02001), HLA-A*0201 NY-ESO (SLLMWITQC (SEQ ID NO.2))-APC MHC tetrâmetro (Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 Melan A (ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 9))-PE MHC tetrâmero(Beckman Coulter, T02001), HLA-A*0201 Tirosinase (YMDGTMSQV(SEQ ID NO. 10))-APC MHC tetrâmero (Beckman Coulter,T02001). Essas células foram então coloridas em conjuntoutilizando anticorpo monoclonal de CD8a (Ly-2) anti-camundongo de rato conjugado com FITCC (BD Biosciences,553031). Os dados foram coletados utilizando um citômetrode fluxo BD FACS Calibur e analisados utilizando softwarecellquest por gating na população de linfócitos ecalculando a percentagem de células de tetrâmero+ napopulação CTL CD8+.

Ensaio ELISpot Interferon-γ (IFN-γ)

Em vez de medir citotoxicidade, a resposta CTLCD8+ pode ser avaliada medindo-se a produção de IFN-γ porcélulas efetoras especificas em um ensaio ELISP0T. Nesseensaio, células que apresentam antigeno (APC) sãoimobilizadas na superfície plástica de uma cavidade demicrotítulo e células efetoras são adicionadas em váriasrazões de efetor:alvo. A ligação de APCs por célulasefetoras específicas de antigeno desencadeia a produção decitocinas incluindo IFN-γ pelas células efetoras. Ascélulas podem ser coloridas para detectar a presença deIFN-yintracelular e o número de focos (pontos) de coloraçãopositiva contado sob um microscópio.

Baços foram isolados nos 27 e 62 a partir deanimais submetidos à eutanásia, submetidos ao programa deimunização de peptídeo/plasmídeo como descrito acima. Ascélulas mononucleares, após centrifugação de densidade(Lympholyte Mammal, Cedarlane Labs., Burlington, NC), foramsuspensas novamente em meio HL-I. Esplenócitos (5 χ IO5 ou3 χ IO5 células por cavidade) foram incubadas com 10 μg de,Melan-A-26-35 (SEQ ID NO. 9), tirosinase369-377 (SEQ ID NO. ),SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1), ou NY-ESO-Ii57-I6S (SEQ ID NO. 2)peptídeo natural em cavidades triplicata de uma placa demembrana de filtro com 96 cavidades (Multi-screen IPmembrana placa de 96 cavidades, Millipore, Boston, MA). Asamostras foram incubadas por 42 horas a 370C com CO2 a 5% e100% de umidade antes do desenvolvimento. Anticorpo derevestimento de IFN-γ de camundongo (par de anticorpo IFN-γ, U-CyTech Biosciences, Holanda) foi utilizado como umreagente de revestimento antes da incubação comesplenócitos, seguido pelo anticorpo de detecçãobiotinilado associado. Substratos de propriedade econjugado GABA a partir de U-CyTech foram utilizados paradesenvolvimento de ponto IFN-γ. A resposta CTL em animaisimunizados foi medida 24 horas após desenvolvimento naleitora de placa da AID International utilizando versão desoftware de Leitora ELISpot 3.2.3 calibrada para análise deponto IFN-γ.

Ensaio de liberação de 51Cromo

O ensaio de liberação de cromo, é um ensaio bemconhecido para avaliar atividade CTL. Em resumo, as célulasalvo que expressam antigeno em sua superfície são rotuladascom um isótopo radioativo de cromo (51Cromo). Células depacientes são então misturadas com a célula alvo eincubadas por várias horas. Lise de células que expressamantigeno libera 51Cr no meio. A Iise específica de célula écalculada comparando Iise de células alvo que expressamo(s) antigeno(s) de interesse ou antigeno(s) de controle napresença ou ausência de células efetoras do paciente, e énormalmente expresso como a % especifica de Iise.

EXEMPLO 2

IMUNIZAÇÃO COM PLASMÍDEOS PSEM E PBPL ANTES DOREFORÇO COM PEPTÍDEO

A finalidade desse estudo foi determinar se aimunização com os plasmídeos pSEM e pBPL poderia induziruma resposta tetravalente contra os quatro antígenosassociados a tumor SSX2-41-49 (SEQ ID NO. 1), NY-ESO-I157-I65(SEQ ID NO. 2), Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) e Tirosínase369-377(SEQ ID NO. 10).

Três grupos de animais HHD fêmeas (camundongosHHD transgênicos HLA-A2.1 negativos-classe I H-2 (nocaute),8-12 semanas de idade) foram imunizados com uma mistura depSEM/pBPL (100 μg/dia) nos linfonodos inguinais bilaterais.0 grupo 1 (n=10 camundongos) recebeu injeções de plasmídeonos dias 1, 4, 15, 18, 28, 32, 49 e 53; o grupo 2 e grupo 3(n=25 camundongos por grupo) receberam injeções deplasmídeo nos dias 1, 4, 15 e 18 respectivamente (Tabela 2;acima). No 25° dia, sangue foi coletado a partir dosanimais imunizados, e análise de célula T CD8+ foirealizada utilizando um ensaio de tetrâmetro como discutidoem outra parte na presente invenção. As respostas foramcomparadas com camundongos de controle da mesma ninhadasimples (n=5).

A figura 1 mostra dados de tetrâmetro a partir deanimais que foram sensibilizados com quatro injeções de umamistura dos plasmídeos bivalentes pSEM e pBPL (n=60), osquais foram elaborados para codificar para Melan-A26-35 (SEQID NO. 9)/tirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10), e NY-ESO-Ii57-I6S(SEQ ID NO. 2)/SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1) respectivamente,antes do reforço com peptideo. Animais sensibilizados comquatro injeções da mistura de plasmídeo pSEM/pBPL em umadose diária de 100 μg apresentaram uma resposta trivalenteSSX-2, NY-ESO-I e melan-A (grupos 1-3, n=60 total) porémfalharam em gerar qualquer CTLs especifica de tirosinasecomo medido por ensaio de tetrâmetro. Além disso, Melan-A eNY-ESO-I foram revelados como sendo os epitopos dominantesexpressos pelos plasmídeos bivalentes pSEM e pBPL,respectivamente, como mostrado na figura 1.

EXEMPLO 3

IMUNIZAÇÃO INDIVIDUAL COM TIROSINASE/SSX-2SENSIBILIZADO COM PLASMÍDEO

Foi avaliado se o reforço com peptideos deepitopo subdominantes individualmente após sensibilizaçãocom plasmídeo, foi suficiente para obter uma resposta imunetetravalente. Portanto, os animais do grupo 2 acima, foramreforçados com os epitopos subdominantes, análogos depeptideo tirosinase V377Nva (SEQ ID NO. 12) e SSX-2 A42V(SEQ ID NO. 5) e respostas imunes foram comparadas com umcontrole simples.

Os animais foram sensibilizados com uma misturade plasmídeo de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100μg/dia) em linfonodos inguinais bilaterais seguido por umreforço com peptídeo consistindo em SSX-241-49 A42V (SEQ IDNO. 1) no linfonodo esquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva (SEQID NO. 12) no linfonodo direito nos dias 28 e 32 (25No 39° dia, sete dias após a última injeção depeptídeo, o sangue foi coletado a partir dos animaisimunizados, e a análise de célula T CD8+ foi realizadautilizando um ensaio de tetrâmero como discutido em outraparte na presente invenção.

A figura 2 mostra as respostas tetravalentes apartir de sangue periférico no 39° dia após o reforço compeptídeo Tirosinase e SSX-2, gerado em três animaisimunizados representativos como comparado com um animal decontrole simples, selecionado, utilizando um ensaio decitometria de fluxo de tetrâmero. Por exemplo, o animal 2demonstrou respostas de tetrâmetro específicas a SSX-2(5,8%), NY-ESO-I (4,1%), tirosinase (8,7%) e Melan A(10,8%). Esses dados tomados juntos, representam respostasde CTL específicas compreendidas de 29,4% do repertóriototal de células T CD8+. Além disso, os resultados mostramque o reforço com os peptídeos de epítopo subdominanteindividuais, após sensibilização com plasmídeo, foisuficiente para obter uma resposta imune tetravalente.

EXEMPLO 4

IMUNIZAÇÃO COM TIR0SINASE/SSX-2 SENSIBILIZADO COMPLASMÍDEO

Para gerar uma resposta imune tetravalente maisequilibrada, os animais foram reforçados com os epítopos depeptídeo subdominante Tirosinase369-S77 (V377Nva) (SEQ ID NO.12) e SSX-24i-49 (A42V) (SEQ ID NO. 5) (grupos 2 e 3, n=50)e respostas imunes foram comparadas com animais reforçadoscom uma mistura de plasmídeo pSEM/pBPL (grupo 1, n=10) oucontroles simples (n=10).

A análise de tetrâmero Melan-A/Tirosinase,SSX2/NY-ESO-I (como descrito acima) foi realizada no 39°dia, sete dias após a última injeção de peptideo. Osanimais do grupo 1 (n=10) foram sensibilizados com umamistura de plasmideo de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15, e 18(100 μg/dia) seguido por um reforço com uma mistura deplasmideo de pBPL+pSEM nos dias 28 e 32 (100 μg/dia) emlinfonodos inguinais bilaterais. Os animais do grupo 2 e 3(n=50) foram sensibilizados com uma mistura de plasmideo depBPL + pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) emlinfonodos inguinais bilaterais seguido por um reforço depeptideo consistindo em SSX241_49 A42V (SEQ ID NO. 5) nolinfonodo esquerdo e Tirosinase3s9-B77 V377Nva (SEQ ID NO.12) no linfonodo direito nos dias 28 e 32 (25 ug/dia).

Os valores médios de tetrâmero para Melan A,Tirosinase, SSX2 e NY-ESO-I foram comparados com controlesda mesma ninhada simples, não tratados (n=5) e representama média +/- SEM. A figura 3 mostra as respostas imunesantes e após o reforço com tirosinase e SSX-2 para osGrupos 2 e 3 (n=50) em comparação com o grupo 1 (n=10;plasmideo sozinho).

Após o reforço com plasmideo, a reposta imunepredominante foi especifica a Melan-A e NY-ESO-I (Grupo 1),como observado na figura 1. Por outro lado, animaissensibilizados com a mistura de plasmideo e reforçados comos peptideos subdominantes reforçaram sua resposta detirosinase >2 vezes e resposta de SSX-2 >2,5 vezes, dessemodo estabelecendo uma resposta imune tetravalenteequilibrada, figura 3.

Desse modo os dados mostram que uma respostaimune tetravalente equilibrada foi obtida pelo reforço comos peptideos de epítopo subdominantes. Tirosinase369-377(V377Nva) (SEQ ID NO. 12), e SSX-24i_49 (A42V) (SEQ ID NO.5).

EXEMPLO 5

ANÁLISE ELISPOT IFN-γ DE PRIMEIRO E SEGUNDOREFORÇO DE PEPTÍDEO

Os dados de tetrâmero obtidos nos exemplos acimaforam confirmados pela medição da freqüência de células queproduzem interferon gama (IFNy) após o reforço de peptideoem animais selecionados do grupo 2. A análise ELISpot IFN-γfoi realizada após o primeiro reforço de peptideo (figura4A) e um segundo reforço de peptideo (figura 4B).

Análise ELISPOT, como descrito em outra parte napresente invenção, foi executada sacrificando animaisrepresentativos no 41° dia, nove dias após o último reforçocom peptideo. Os animais do grupo 1 (n=3 sacrificados)foram sensibilizados com uma mistura de plasmideo depBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) em linfonodosinguinais bilaterais. Os animais do grupo 2 (n=6sacrificados) foram sensibilizados com uma mistura deplasmideo de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100 pg/dia)em linfonodos inguinais bilaterais seguido por um reforçode peptideo consistindo em SSX2-4i-49 A42V (SEQ ID NO. 5) nolinfonodo esquerdo e Tirosinase369_377 V377Nva (SEQ ID NO.12) no linfonodo direito nos dias 28 e 32 (25 μg/dia).

Células que formam ponto de interferon-γ (Melan A,Tirosinase, SSX2 e NY-ES0-1) especificas de antigenos porbaço, foram comparadas com controles da mesma ninhadasimples não tratados (n=3), figura 4A.

Após o segundo reforço de peptideo, análiseELISPOT foi executada sacrificando animais representativosno 63° dia, dez dias após o segundo reforço de peptideo. Osanimais do grupo 1 (n=3 sacrificados) receberam injeções deuma mistura de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15, 18, 28, 32, 49e 53 (100 μς/άίβ) em linfonodos inguinais bilaterais. Osanimais do grupo 2 (n=4 sacrificados) receberam injeções deuma mistura de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100μg/dia) nos linfonodos inguinais bilaterais seguido por umreforço de peptideo consistindo em SSX241-49 A42V nolinfonodo esquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva no linfonododireito nos dias 28, 32, 49 e 53 (25 μg/dia) . Os animaisdo grupo 3 (n=4 sacrificados) receberam injeções de umamistura de pBPL+pSEM nos dias 1, 4, 15 e 18 (100 μg/dia) emlinfonodos inguinais bilaterais seguido por um reforço depeptideo consistindo em SSX24i_49 A42V (SEQ ID NO. 5) nolinfonodo esquerdo e Tirosinase369-377 V377Nva (SEQ ID NO.12) no linfonodo direito nos dias 28 e 35 (25 μg/dia) e umsegundo reforço de peptideo consistindo em NY-ESO-li57-i65LI158Nva, C165V (SEQ ID NO. 6) (12,5 μg nos dias 49 e 53)no linfonodo e melan A26-35 A27Nva (SEQ ID NO. 11) (25 μg nosdias 49 e 53) no linfonodo direito. Células de formação deponto de interferon-γ especificas de antigeno (Melan A,Tirosinase, SSX2, e NY-ESO-1) por baço foram comparadas com um controle da mesma ninhada simples, não tratado, figura 4B.

A figura 4A mostra que os animais sensibilizadoscom a mistura de plasmideo e reforçados com peptideos detirosinase e XXC-2 ((Grupo 2, n=6) demonstraram umaresposta tetravalente robusta de 2 a 8 vezes mais elevadade células que produzem IFNy do que animais tratados apenascom plasmideo (Grupo 1, n=3). Além disso, quando os animaisreceberam um segundo reforço dos peptideos de epitoposubdominante, SSX-2 e Tirosinase (Grupo 2), ou os peptideosde epitopo dominante, NY-ESO-1 e melan A (Grupo 3) , umaresposta tetravalente foi mantida como comparado comanimais que foram sensibilizados e reforçados com acombinação de plasmídeo pSEM e pBPL somente (grupo 1((figura 4B) . Uma resposta imune mais equilibrada contratodos os quatros antigenos foi obtida simplesmente porreforço com os análogos de epitopo subdominante SSX-2 eTirosinase.

No geral, os dados obtidos a partir dos Exemplos(2-5) acima, representam a geração bem sucedida de umaresposta imune tetravalente em animais imunizados com osregimes NS e/ou MT da presente invenção. Uma comparação dasrespostas imunes (tetrâmero e análise ELISPOT IFN-γ) emanimais simples ou animais reforçados com uma mistura deplasmídeo de pSEM/pBPL sozinho (grupo 1) com animaisreforçados com os epítopos de peptideo subdominantetirosinase e SSX-2 (Grupos 2 e 3) nos dias 28 e 32confirmou a geração bem sucedida de uma resposta imunetetravalente em animais imunizados com esse regime.

Resultados similares foram obtidos após o segundo reforçode peptideo nos dias 49 e 53 onde o Grupo 3 (n=25) foireforçado com os peptídeos de epitopo dominante, Melan Ά2β-35 (A27Nva) (SEQ ID NO. 11) e NY-ESO-I157-165 (L158Nva, C165V)(SEQ ID NO. 6) e Grupo 2 (n=25) foi reforçado novamente comos peptídeos de epitopo subdominante Tirosinase369-377(V377Nva) (SEQ ID NO. 12) e SSX-241-49 (A42V) (SEQ ID NO. 5).

EXEMPLO 6

GERAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNE A MELANOMA HUMANO

O ensaio de diacetato de carbóxi-fluoresceína,éster de succinimidil (CFSE) provê um meio simples esensível para rotular de forma fluorescente as células.

Esse método permite a análise de proliferação de célula Tespecífica e não específica de antígeno.

A metodologia CFSE foi empregada para avaliar aeficácia dos protocolos de imunização. Animais,selecionados com base em seus níveis de tetrâmero, foramanalisados em relação a sua capacidade de limpar células detumor de melanoma rotuladas CFSE humanas no pulmão.

No 61° dia, dois animais de cada grupo (Grupo 1,2 e 3) foram selecionados com base em níveis elevados detetrâmero, e injetados por via intravenosa com células detumor rotuladas com CFSE. Mais precisamente, células detumor de melanoma cultivadas 624.38 humanas (IOxlO6),expressando todos os quatro antígenos associados a tumorpara SSX-2, NY-ESO-1, Tirosinase e Melan A, foram coloridoscom CFSEhi (kit de traçador de células Vybrant CFDA SE,Molecular Probes) fluorescência (1.0 μΜ por 15 minutos) eco-injetadas por via intravenosa nos camundongos imunizadosdo Grupo 1, 2 ou 3 (N=2/grupo) ou em camundongos HHDsimples (N=2) com uma razão igual de 624.28 células decontrole negativas HLA-A2 coloridas com fluorescênciaCFSElo (0.1 μΜ) . Os animais receberam uma segunda injeçãode células alvo duas horas após.

A eliminação específica de células alvo humanasfoi medida no 62° dia, aproximadamente 14 horas após ainjeção de células alvo, por sacrificar os camundongos,remover o tecido do pulmão e medir CFSEhi em relação àfluorescência CFSElo (canal FLl) por citometria de fluxo. Afórmula utilizada para calcular a percentagem de Iiseespecífica é mostrada abaixo.

[(l-%CFSEhi / %CFSElo) em imunizados - (l-%CFSEhi/ %CFSElo) em simples] χ 100

A figura 5 mostra níveis de tetrâmero, resultadosELISPOT IFNy, e dois histogramas de CFSE de pico a partirde um controle simples (painel esquerdo superior), doisanimais com imunidade tetravalente (painel esquerdoinferior e direito superior) e um animal com uma respostamonovalente a Melan A (painel direito inferior). Comoesperado, o animal de controle simples foi incapaz delimpar as células alvo como demonstrado pela manutenção deuma razão igual dos picos de histograma como foi o caso noanimal que demonstra a resposta imune monovalente. Poroutro lado, os animais que apresentam uma resposta imune atodos os quatro antigenos eram muito mais capazes de limparas células alvo de tumor de melanoma humano com 71% e 95%de Iise especifica.

EXEMPLO 7

GERAÇÃO DE UMA RESPOSTA IMUNE POR UM PROTOCOLOORIGINAL VS. EXPANDIDO

Foi avaliado se a imunização com os plasmideos Dl(pRP12) e D2 (pBPL) poderia induzir uma respostatetravalente em camundongos HHD-I contra quatro antigenosassociados a tumor: PSMA288-297 (SEQ ID NO. 4), PRAME425-433(SEQ ID NO. 3), SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1), e NY-ESO-I157-I55(SEQ ID NO. 2).

Duas estratégias de reforço diferentes foramtestadas com relação a sua capacidade de aumentar asrespostas imunes desejadas. A primeira abordagem (oprotocolo "original") utilizou uma injeção única de cadapeptideo durante o procedimento de reforço. A segundaabordagem (o protocolo "expandido") testou duas injeções decada peptideo. Três níveis de dosagem de cada peptideo(baixo, médio e alto) foram testados em um esforço paradeterminar uma relação de dose-resposta e ajudar a definira concentração ótima de peptideo.

Seis grupos de 10 animais HHD-I fêmeas/grupoforam imunizados com plasmideos Dl e D2 injetadosdiretamente nos linfonodos inguinais bilaterais. Os animaisdos grupos 1-3 foram reforçados utilizando o protocolo"original", e os animais dos grupos 4-6 foram reforçadosutilizando o protocolo "expandido".Os animais no "protocolo original" (Grupos 1-3,n=10 por grupo) receberam 4 injeções de plasmideo Dl (pRP12(SEQ ID NO. 21) ) (100 μg por dose) no linfonodo inguinaldireito e 4 injeções plasmideo D2 (pBPL (SEQ ID NO. 20))(100 μg/dose) em linfonodo inguinal esquerdo nos dias 1, 4,15 e 18. Isso foi seguido por um reforço com PSMA299-297(I297V) (SEQ ID NO. 8) no linfonodo direito e SSX-24i-49(A42V) (SEQ ID NO. 5) no linfonodo esquerdo no 29° dia, ecom PRAME425-433 (L42 6Nva, L433Nle) (SEQ ID NO. 7) nolinfonodo direito e NY-ESO-Ii57-Ie5 (158Nva, C165V) (SEQ IDNO. 6) no linfonodo esquerdo no 32° dia.

Os animais no "protocolo expandido" (Grupos 4-6,n=10 por grupo) receberam 4 injeções de plasmideo Dl (pRP12(SEQ ID NO. 21)) (100 μg por dose) no linfonodo inguinaldireito e plasmideo D2 (pBPL (SEQ ID NO. 20)) (100 μg/dose)em linfonodo inguinal esquerdo nos dias 1, 4, 15 e 18. Osanimais foram subseqüentemente reforçados com PSMA299-297(I297V) (SEQ ID NO. 8) no linfonodo direito e SSX-241-49(A42V) (SEQ ID NO. 5) no linfonodo esquerdo nos dias 29 e32, e com PRAME425-433 (L426Nva, L433Nle) (SEQ ID NO. 7) nolinfonodo direito e NY-ESO-li57-i65 ( 158Nva, C165V) (SEQ IDNO. 6) no linfonodo esquerdo nos dias 43 e 46.

O sangue foi coletado de cada grupo nos doisprotocolos, 7 dias após o último reforço de peptideo, e aanálise de célula T CD8+ foi realizada utilizando um ensaiode tetrâmetro (figura 6). As respostas foram comparadas comcamundongos de controle da mesma ninhada simples (n=5).

Valores de tetrâmero SSX-2, NY-ESO-1, PRAME e PSMA sãomostrados comparando os protocolos original e expandidocompreendidos de reforços de peptideo baixo, médio eelevado na figura 6.

Os animais sensibilizados com quatro injeções deplasraídeo Dl e D2 e subseqüentemente reforçados com osanálogos de peptídeo PSMA, PRAME, NY-ESO-I e SSX-2demonstraram respostas imunes a todos os quatro antigenos,como avaliado por análise de tetrâmero (figura 6), que foidominada por respostas imunes a PRAME e PSMA. Além disso,as respostas imunes tetravalentes eliciadas por essaestratégia de imunização foram demonstradas em animaisindividuais (figura 7). As respostas foram observadas comosendo independentes de regime de reforço (original vs.Expandido). Além disso, nenhuma resposta de dose aparentefoi observada, embora o grupo de dose elevada (25 μg depeptideo) em cada protocolo terapêutico forneceu a taxa deresposta mais elevada. Além disso, os dados de tetrâmeroindicaram que PRAME e PSMA eram os epitopos dominantes apósimunização dos animais.

EXEMPLO 8

ELISPOT IFN-γ DE UMA RESPOSTA IMUNE POR UMPROTOCOLO ORIGINAL VS. EXPANDIDO

Para confirmar os resultados observados com oensaio de tetrâmero, um ensaio ELISpot interferon-γ (IFN-γ)foi conduzido. Os animais de cada grupo no Exemplo 7, foramsacrificados 22 dias após o último reforço de peptideo e osbaços foram removidos para análise ELISPOT IFN-γ.

Baços foram isolados no dia 68 a partir deanimais submetidos à eutanásia, e as células mononucleares,após centrifugação de densidade (Lympholyte Mammal,Cedarlane Labs., Burlington, NC), foram suspensas novamenteem meio HL-1. Esplenócitos (3 χ IO5 ou 1,5 χ IO5 célulaspor cavidade) foram incubadas com 10 μg de PSMA299-297 (SEQID NO. 4), PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3), SSX-24i-49 (SEQ ID NO.1), ou NY-ESO-I157-I65 (SEQ ID NO. 2) peptideo natural emcavidades triplicata de uma placa de membrana de filtro com96 cavidades (Multi-screen IP membrana placa de 96cavidades, Millipore, MA) . As amostras foram incubadas por72 horas a 37 0C com CO2 a 5% e 100% de umidade antes dodesenvolvimento. Anticorpo de revestimento de IFN-γ decamundongo (par de anticorpo IFN-γ, U-CyTech Biosciences,Holanda) foi utilizado como um reagente de revestimentoantes da incubação com esplenócitos, seguido pelo anticorpode detecção biotinilado associado. Substratos depropriedade e conjugado GABA a partir de U-CyTechBiosciences foram utilizados para desenvolvimento de pontoIFN-γ. A resposta CTL em animais imunizados foi medida 24horas após desenvolvimento na leitora de placa da AIDInternational utilizando versão de software de LeitoraELISpot 3.2.3 calibrada para análise de ponto IFN-γ.

Os resultados ELISPOT ΙΓΝγ mostrados na figura 7correlacionam bem com os dados de tetrâmero (figura 6) econfirmam uma resposta imune robusta a PRAME425-433 (SEQ IDNO. 3), PSMA288-433 (SEQ ID NO. 4), SSX-241_49 (SEQ ID NO. 1),e NY-ESO -115 7-155 (SEQ ID NO. 2) eliciada pelo protocoloterapêutico "original". 0 protocolo "expandido" não pareceuoferecer nenhuma vantagem aparente em relação ao protocolo"original" como medido por análise ELISPOT IFN-γ.

EXEMPLO 9

RESPOSTA IMUNE TETRAVALENTE GERADA PELO REGIMETERAPÊUTICO PP/NS

Foi avaliado se uma resposta imune tetravalentepode ser eliciada primeiramente reforçando com os epítopossubdominantes PSMA e SSX-2 seguido por reforço com osepitopos dominantes PRAME e NY-ESO-I. Um animalrepresentativo a partir do Grupo 1 ("protocolo original";dose elevada) recebeu 4 injeções de Dl (pRP12 (SEQ ID NO.21)) (100 μg por dose) no linfonodo inguinal direito e 4injeções plasmídeo D2 (pBPL (SEQ ID NO. 20)) (100 μς/άοεε)em linfonodo inguinal esquerdo nos dias 1, 4, 15 e 18. Issofoi seguido por um reforço com PSMA299-297 (I297V) (SEQ IDNO. 8) no linfonodo direito (25 μς) e SSX-241-49 (A42V) (SEQID NO. 5) no linfonodo esquerdo (25 μς) no 29° dia, e comPRAME425-433 (L426Nva, L433Nle) (SEQ ID NO. 7) no linfonododireito (20 μ9) e NY-ESO-I157-Ies (158Nva, C165V) (SEQ ID NO.6) no linfonodo esquerdo (25 μg) no 32° dia. Os dados(figura 8) mostram uma resposta imune tetravalente comomedido por dois ensaios separados, análises ELISpot etetrâmero.

EXEMPLO 10

ENSAIO DE LIBERAÇÃO DE 51CROMO MEDINDO ATIVIDADECTL PARA PRAME, PSMA, NY-ESO E SSX-2

A resposta de CTL a PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3),PSMA288-433 (SEQ ID NO. 4), NY-ESO-l157-i65 (SEQ ID NO. 2) eSSX-241_49 (SEQ ID NO. 1) utilizando ensaios decitotoxicidade 51Cr, após sensibilização de DNA e reforçode peptideo e um round de estimulação in vitro emcamundongos imunizados foi avaliada. Os CTLs foram geradospor estimulação ex vivo de esplenócitos colhidos a partirde camundongos imunizados (N=6) 22 dias após o término dosregimes de imunização.

Em resumo, os camundongos foram sacrificados e osbaços foram removidos. Os baços foram homogeneizados e asuspensão de células foi filtrada para fornecer umasuspensão de célula única. As quantidades de 5xl06células/cavidade foram revestidas em placas de cultura detecido de 24 cavidades e células B injetadas com LPS(Iipopossacarideo) e irradiadas com γ, pulsadas com epitopo1,5 χ IO6 foram adicionadas a cada cavidade. IL-2recombinante de camundongo foi também adicionado em umaconcentração de 1 ng/ml. As células foram incubadas por 4dias para o grupo PRAME e 6 dias para cada um dos gruposPSMA, SSX-2 e NY-ESO-I.

Após a estimulação ex vivo, CTLs foram coletadasa partir das placas, lavadas e revestidas em placas deensaio de microtítulo de fundo em U com 96 cavidades emconcentrações de IO6, 3, 3xl05 e 1,1 xlO células/cavidade emum total de 100 μία por cavidade. Para avaliar Iiseespecifica de peptideo, células T2 foram rotuladas com 51Cre pulsadas com 20 μg/ml de cada peptideo (SSX-2, NY-ESO-1,PSMA ou PRAME) a 370C por 1,5 hora. Após a incubação, ascélulas foram lavadas e suspensas novamente. Dez milcélulas T2 pulsadas com peptideo e rotuladas 51Cr foramadicionadas a cada cavidade. As células foram entãoincubadas a 37°C por 4 horas.

Após incubação, sobrenadantes foram colhidos e aatividade citolitica foi medida em amostras em triplicatautilizando um contador gama. A percentagem corrigida deIise foi calculada para cada concentração de célulasefetoras, utilizando o com médio para cada réplica decavidades (figura 8). A percentagem de Iise especifica foicalc ulada utilizando a seguinte fórmula: percentagem deliberação = 100 χ (liberação experimental-liberaçãoespontânea)/(liberação máxima - liberação espontânea). Osdados são apresentados como a seguir: o eixo geométrico χmostra a razão de efetor para alvo; o eixo geométrico ymostra a percentagem correspondente de Iise especifica.

Os resultados (figura 8) mostram dados de ensaiode liberação de 51Cromo (CRA) para CTL a partir de cadagrupo contra células T2 pulsadas com peptideos PRAME425-433(SEQ ID NO. 3) (painel 1), PSMA288-433 (SEQ ID NO. 4) (painel2), NY-ESO-I157-I65 (SEQ ID NO. 2) (painel 3) ou SSX-24i-49(SEQ ID NO. 1) (painel 4) como alvos. Valores de Iiseespecifica foram comparados com células de controle T2 nãopulsadas. Dado que a análise ELISA (dados não mostrados)indicou que a imunogenicidade do grupo PRAME é muito fortee para evitar mortes de células induzidas por antigeno, oCRA para o grupo PRAME foi buscado após um protocolo IVS de4 dias. 0 CRA foi feito após 6 dias IVS para os outrosgrupos de peptideos. Verificou-se que após estimulaçãonovamente in vitro, células T isoladas a partir de todos osgrupos imunizados exterminaram especificamente células T2pulsadas com peptideo ao contrário daquelas de animaissimples. As respostas de CTL a PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3),PSMA288-433 (SEQ ID NO. 4), SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1), e NY-ESO -1157-155 (SEQ ID NO. 2), foram induzidas em todos osgrupos, como avaliado por ensaios de citotoxicidade 51Cr.

Esses CTLs não tiveram efeito sobre células de controle T2sem peptideo. Os resultados demonstraram que Iise de célulaalvo T2 pelos CTLs isolada de camundongos imunizados éespecifica a peptideo. Em comparação com o protocolo"original", o protocolo "expandido" não ofereceu aumentosignificativo da percentagem de lise, sugerindo ainda que oprotocolo "original" é suficiente para eliciar uma respostaimune substancial contra múltiplos antigenos. Além disso,devido à sensibilidade aumentada do ensaio de CRA, asrespostas de NY-ESO-I especificas de cada grupo eram maisprevalentes em comparação com os ensaios ELISPOT e detetrâmero.

EXEMPLO 11

EMPREGO DE MÚLTIPLOS CICLOS TERAPÊUTICOS

Foi avaliado se a imunização com os plasmideosDl (pRP12) (SEQ ID NO. 21)) e D2 (pBPL) (SEQ ID NO. 20))poderia manter respostas imunes robustas em camundongosHHD-I contra quatro antigenos associados a tumor: PSMA288-297(SEQ ID NO. 4), PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3), SSX-24i-49 (SEQ IDNO. 1), e NY - ESO -1157-165 (SEQ ID NO. 2) após mais de umciclo de um regime terapêutico da presente invenção.

Camundongos HHDl- machos e fêmeas foramimunizados com plasmideos Dl e D2 injetados diretamente noslinfonodos inguinais bilaterais seguido por reforço compeptideo com PSMA288-297 (SEQ ID NO. 4), PRAME425-433 (SEQ IDNO. 3), SSX-24i_49 (SEQ ID NO. 1), e NY-ESO-I157-Iss (SEQ IDNO. 2), Os animais receberam 4 injeções de plasmideo Dl(pRPl2 (SEQ ID NO. 21)) no linfonodo inguinal direito e 4injeções plasmideo D2 (pBPL (SEQ ID NO. 20)) em linfonodoinguinal esquerdo nos dias 1, 4, 15 e 18. Isso foi seguidopor um reforço com PSMA299-297 (I297V) (SEQ ID NO. 8) nolinfonodo direito e SSX-241_49 (A42V) (SEQ ID NO. 5) nolinfonodo esquerdo no 29° dia, e com PRAME425-433 (L426Nva,L433Nle) (SEQ ID NO. 7) no linfonodo direito e NY-ESO-Ii57-I55 (158Nva, C165V) (SEQ ID NO. 6) no linfonodo esquerdo no32° dia. 0 segundo ciclo terapêutico de sensibilização(plasmideo) / reforço (peptideo) foi repetido após umperíodo de descanso de 14 dias.

Os animais foram injetados com veículo deplasmideo (N=16 animais/grupo); veículo de peptideo (N=16animais/grupo); plasmideo (400 μg dose total) em doseelevada (N=16 animais/grupo); peptideo (25 μg dose total)em dose elevada (N=16 animais/grupo); plasmideo (400 μgdose total) em dose elevada + peptideo (5 μg dose total) emdose baixa (N=16 animais/grupo); plasmideo em dose baixa(100 μg dose total) + peptideo (25 μg dose total) em doseelevada (N=14 animais/grupo) ; ou plasmideo (400 μg dosetotal) em dose elevada + peptideo (25 μg dose total) emdose elevada (N=16 animais/grupo) e comparado com o grupode controle simples N=7 animais/grupo.

Os animais de cada grupo foram sacrificados 14dias após o último reforço de peptideo e os baços foramremovidos para análise ELISPOT IFN-γ (figura 9).

Os dados mostram que animais podem gerarrespostas imunes robustas após dois ciclos de regimesterapêuticos do regime PP (PRAME e PSMA) e do regime NS(NY-ES0-1 e SSX-2).

No geral, os dados obtidos nos exemplos 7-11mostram respostas significativas de célula T porém nãosignificativas de anticorpo, após o protocolo de imunizaçãoterapêutica de PP/NS. Nenhum anticorpo especifico depeptideo foi detectado no soro de camundongos imunizadosutilizando um ensaio ELISA após um ciclo terapêuticocompleto (dados não mostrados). Além disso, respostas decélula T especificas de antigeno abrangeram células T dememória e efetora (produção de citocina IFNy, ligação detetrâmero e citolitica) com PRAME e PSMA na frente e SSX-2e NY-ESO-I na traseira em magnitude. Além disso osresultados indicam que enquanto a expansão do protocoloterapêutico pode não obter imunidade de célula T maiselevada, a reordenação de peptideos subdominantes emrelação a dominantes em um ciclo terapêutico pode sernecessária para melhorar a imunidade contra NY-ESO-I ouqualquer outro epitopo subdominante.

Além daqueles pedidos já revelados nesse pedido,os seguintes pedidos são pela presente expressamenteincorporados a titulo de referência na integra. Métodosúteis para utilizar os análogos revelados na indução,arraste, manutenção, modulação e amplificação de respostasde célula T restrita a MHC classe I, e particularmenterespostas de CTL de memória e efetor a antigeno, sãodescritas nas patentes US nos. 6.994.851 (7/2/06) e6.977.074 (20/12/2005) ambas intituladas vvA method ofinducing a CTL response"; pedido provisional US no.60/479.393, depositado em 17 de junho de 2003, intitulado"METHODS TO CONTROL MHC CLASS I-RESTRICTED IMMUNERESPONSE"; e pedido de patente US no. 10/871.707 (pub. No.2005 0079152) e pedido de patente US provisional no.60/640.402 depositado em 29 de dezembro de 2004, ambosintitulados "METHODS TO ELICIT, ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNERESPONSES AGAINST MHC CLASS I-RESTRICTED EPITOPES, FORPROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSE". Os análogos tambémpodem ser utilizados na pesquisa para obter análogosotimizados adicionais. Inúmeros epitopos constitutivos sãofornecidos nos pedidos US nos. 10/117.937, depositado em 4de abril de 2002 (pub. No. 20030220239 Al), e 10/657.022(20040180354), e no pedido PCT no. PCT/US2003/027706 (pub.No. W004022709A2), depositado em 5 de setembro de 2003; epedido provisional US nos. 60/282.211, depositado em 6 deabril de 2001; 60/337.017, depositado em 7 de novembro de2001; 60/363.210 depositado em 7 de março de 2002; e60/409.123, depositado em 5 de setembro de 2002; cada umdos pedidos é intitulado "EPITOPE SEQUENCES." Os análogospodem ser utilizados adicionalmente em qualquer um dosvários modos descritos nesses pedidos. Grupos de epitopo,que podem compreender ou incluir os presentes análogos, sãorevelados e mais completamente definidos no pedido depatente US no. 09/561.571, depositado em 28 de abril de2000, intitulado EPITOPE CLUSTERS. A metodologia parautilizar e fornecer os presentes análogos é descrita nospedidos de patente US 09/380.534 e 6977074 (expedidos em 20de dezembro de 2005) e no pedido PCT no. PCTUS98/14289(pub. No. W09902183A2), cada um intitulado "METHOD OFINDUCING A CTL RESPONSE". Os princípios benéficos deseleção de epitopo para tal imunoterapêutica são reveladosnos pedidos de patente US nos. 09/560.465, depositado em 28de abril de 2000, 10/026.066 (pub. No. 20030215425 Al),depositado em 7 de dezembro de 2001, e 10/005.905depositado em 7 de novembro de 2001, todos intitulados"EPITOPE SYNCHRONIZATION IN ANTIGEN PRESENTING CELLS";6.861.234 (expedido em 01 de março de 2005; pedido no.09/561.074), intitulado "METHOD OF EPITOPE DISCOVERY";09/561.571, depositado em 28 de abril de 2000, intituladoEPITOPE CLUSTERS; 10/094.699 (pub. No. 20030046714 Al),depositado em 7 de março de 2002, intitulado "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONS FOR CÂNCER"; pedidos nos.10/117.937 (pub. No. 20030220239 Al) e PCTUS02/11101 (pub.No. W002081646A2), ambos depositados em 4 de abril de 2002,e ambos intitulados "EPITOPE SEQUENCES"; e pedidos nos.10/657.022 e Pedido PCT no. PCT/US2003/027706 (pub. No.W004022709A2), ambos depositados em 5 de setembro de 2003,e ambos intitulados "EPITOPE SEQUENCES". Os aspectos dodesenho geral de plasmideos de vacina são revelados nopedido de patente US nos. 09/561.572, depositado em 28 deabril de 2000, intitulado "EXPRESSION VECTORS ENCODINGEPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS" e 10/292.413 (pub.No. 20030228634 Al), depositado em 7 de novembro de 2002,intitulado "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATED ANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN";10/225.568 (pub. No. 2003-0138808), depositado em 20 deagosto de 2002, Pedido PCT no. PCT/US2003/026231 (pub. No.WO 2004/018666), depositado em 19 de agosto de 2003, ambosintitulados "EXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OFTARGET-ASSOCIATED ANTIGENS"; e patente US no. 6.709.844,intitulado "AVOIDANCE OF UNDESIRABLE REPLICATIONINTERMEDIATES IN PLASMID PROPAGATION". Combinaçõesantigênicas especificas de beneficio especifico naorientação de uma resposta imune contra cânceresespecíficos são reveladas no pedido de patente USprovisional no. 60/479.554, depositado em 17 de junho de2003 e pedido de patente US no. 10/871.708, depositado em17 de junho de 2004 e pedido de patente PCT no.PCT/US2004/019571 (pub. No. WO 2004/112825), todosintitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INVACCINES FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS". Antigenosassociados a neovasculatura de tumor (por exemplo, PSMA,VEGFR2, Tie-2) são também úteis com relação a doençascancerosas, como revelado no- pedido de patente US no.10/094.699 (pub. No. 2003046714 Al), depositado em 7 demarço de 2002, intitulado "ANTI-NEOVASCULATURE PREPARATIONSFOR CÂNCER". Métodos para desencadear, manter e manipularrespostas imunes por administração alvejada demodificadores de resposta biológica são revelados em pedidoprovisional US no. 60/640.727, depositado em 29 de dezembrode 2004. os métodos para desviar células CD4 + na indução deuma resposta imune são revelados no pedido provisional USno. 60/640.821, depositado em 29 de dezembro de 2004.

Doenças, organismos e antigenos e epitopos exemplaresassociados a organismos, células e doenças alvo sãodescritos no pedido US no. 6977074 (expedido em 20 dedezembro de 2005), depositado em 2 de fevereiro de 2001 eintitulado "METHOD OF INDUCING A CTL RESPONSE." Ametodologia exemplar é encontrada no pedido provisional USno. 60/580.969, depositado em 17 de junho de 2004, e pedidode patente US no. 2006-0008468-A1, publicado em 12 dejaneiro de 2006, ambos intitulados "COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OFCANCERS". A metodologia e composições são também reveladasno pedido provisional US no. 60/640.598, depositado em 29de dezembro de 2004, intitulado ^COMBINATIONS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN COMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OFCÂNCER." A integração de técnicas de diagnóstico paradeterminar e monitorar a capacidade de resposta imune commétodos de imunização incluindo a utilização dos presentesanálogos é discutida mais completamente no pedido depatente US provisional no. 60/580.964 depositado em 17 dejunho de 2004 e pedido de patente US no. US-2005-0287068-Al, publicado em 29 de dezembro de 2005, ambos intitulados"IMPROVED EFFICACY OF ACTIVE IMMUNOTHERAPY BY INTEGRATINGDIAGNOSTIC WITH THERAPEUTIC METHODS". Vetores decodificação de polipeptideo imunogênico são revelados nopedido de patente US no. 10/292.413 (pub. No. 20030228634Al) , depositado em 7 de novembro de 2002, intituladoEXPRESSION VECTORS ENCODING EPITOPES OF TARGET-ASSOCIATEDANTIGENS AND METHODS FOR THEIR DESIGN, e no pedidoprovisional US no. 60/691.579, depositado em 17 de junho de2005, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS TO ELICITMULTIVALENT IMMUNE RESPONSES AGAINST DOMINANT ANDSUBDOMINANT EPITOPES EXPRESSED ON CÂNCER CELLS AND TUMORSTROMA". A revelação útil adicional, incluindo métodos ecomposições de matéria, é encontrada no pedido provisionalUS no. 60/691.581, depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "MULTIVALENT ENTRAIN-AND-AMPLIFYIMMUNOTHERAPEUTICS FOR CARCINOMA." Metodologia adicional,composições, peptídeos, e análogos de peptideo sãorevelados nos pedidos provisionais US nos. 60/581.001 e60/580.962, ambos depositados em 17 de junho de 2004, erespectivamente intitulados "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS" e "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS." Cada um dos pedidos e patentesmencionados nos parágrafos acima é pela presenteincorporado a titulo de referência na integra por tudo querevela. Análogos, peptideos e métodos adicionais sãorevelados na publicação do pedido de patente US no.20060063913, intitulado "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS"; epublicação de patente US no. 2006-0057673 Al, publicado em16 de março de 2006, intitulado "EPITOPE ANALOGS"; ePublicação do pedido PCT no. W0/2006/009920, intitulado"EPITOPE ANALOGS"; todos depositados em 17 de junho de2005. Metodologia e composições adicionais são revelados nopedido provisional US 60/581.001, depositado em 17 de junhode 2005, intitulado "SSX-2 PEPTIDE ANALOGS", e ao pedidoprovisional US no. 60/580.962, depositado em 17 de junho de2004, intitulado "NY-ESO PEPTIDE ANALOGS"; cada um dosquais é incorporado aqui a titulo de referência na integra.

Como exemplo, sem ser limitado ao mesmo cada referência éincorporada a titulo de referência pelo que revela sobreepitopos restritos a MHC classe I, análogos, o desenho deanálogos, usos de epitopos e análogos, métodos de utilizare fazer epitopos, e o desenho e uso de vetores de ácidonucléico para sua expressão. Outros pedidos que sãoexpressamente incorporados aqui a titulo de referência são:pedido de patente US no. de série 11/156.253 (publicaçãono.20060063913), depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "SSEX-2 PEPTIDE ANALOGS"; pedido de patente USno. de série 11/155.929, depositado em 17 de junho de 2005,intitulado "NY-ESO-l PEPTIDE ANALOGS" (publicaçãono.20060094661); pedido de patente US no. 11/321.967,depositado em 29 de dezembro de 2005, intitulado "METHODSTO TRIGGER, MAINTAIN AND MANIPULATE IMMUNE RESPONSES BYTARGETED ADMINISTRATION OF BIOLOGICAL RESPONSE MODIFIERSINTO LYMPHOID ORGANS"; pedido de patente US no. de série11/323.572, depositado em 29 de dezembro de 2005,intitulado "METHODS TO ELICIT ENHANCE AND SUSTAIN IMMUNERESPONSES AGAINST MCH CLASS I RESTRICTED EPITOPES, FORPROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC PURPOSES"; pedido de patente USno. de série 11/323.520, depositado em 29 de dezembro de2005, intitulado "METHODS TO BYPASS CD4+ CELLS IN THEINDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE"; pedido de patente US no.de série 11/323.049, depositado em 29 de dezembro de 2005,intitulado ssCOMB INATION OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS INCOMPOSITIONS FOR VARIOUS TYPES OF CANCERS"; pedido depatente US no. de série 11.323.964, depositado em 29 dedezembro de 2005, intitulado uC0MBINATI0NS OF TUMOR-ASSOCIATED ANTIGENS IN DIAGNOSTICS FOR VARIOUS TYPES OFCANCERS"; pedido provisional US número de série60/691.889, depositado em 17 de junho de 2005 intitulado"EPIT0PE ANALOGS."LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Bot, Adrian

Chiang, Chih-ShengDiamond, DavidGong, JianSmith, KentLiu, LipingLiu, XipingQiu, Zhiyong

<120> IMUNOTERAPÊUTICA DE ARRAS TAR-E-AMPLIFICAR MULTIVALENTE PARACARCINOMA

<130> MANNK.O54VPC

<140> PCT/US2OO6/023499

<141> 2006-06-16

<150> 60/691,581

<151> 2005-06-17

<160> 21

<170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<4 00> 1

Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val1 5

<210> 2<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 2

Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 3

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu1 5

<210> 4<211> 10<212> PRT<213> Homo sapien

<400> 4

Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile1 5 10

<210> 5<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Homen fez peptideo<400> 5

Lys Val Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val1 5

<210> 6<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Análogo de NY-ESO-1, aminoácidos 157-165<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Norvalina<400> 6

Ser Xaa Leu Met Trp Ile Thr Gln Val1 5

<210> 7<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Análogo de PRAME, aminoácidos 425-433

<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Norvalina<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Norleucina<400> 7

Ser Xaa Leu Gln His Leu Ile Gly Xaa1 5

<210> 8<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> homen fez peptídeo<400> 8

Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val1 5 10

<210> 9<211> 10<212> PRT<213> Homo sapien

<400> 9

Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val15 10

<210> 10

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapien

<400> 10

Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210> 11<211> 10<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Análogo de Melan-A, aminoácidos 26-35<220>

<221> VARIANTE<222> 2

<223> Xaa = Norvalina<400> 11

Glu Xaa Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10

<210> 12<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Análogo de tirosinase, aminoácidos 369-377<220>

<221> VARIANTE<222> 9

<223> Xaa = Norvalina<4 00> 12

Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Xaa1 5

<210><211><212>

1329PRT<213> Seqüência artificial<220>

<223> homem fez peptideo<400> 13

Ile Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val Ser Leu Leu Met Trp Ile

1 5 10 15

Thr Gln Cys Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr Val Lys20 25

<210> 14<211> 62<212> PRT

<213> seqüência artificial<220>

<223> homem fez peptideo<4 00> 14

Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Gly Asp Ala Ala Tyr

15 10 15

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu

20 25 30

Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Lys Arg Pro

35 40 45

Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Val50 55 60

<210> 15<211> 28<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> homem fez peptideo<400> 15

Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys

1 5

Leu Thr Val Tyr Met Asp Gly Thr20

Leu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile

10 15

Met Ser Gln Val25

<210> 16<211> 179<212> PRT<213> Seqüência

<220>

<223> homem fez

<400> 16Met Ser Leu Leu1

Phe Tyr Val Gly20

Ser Ile Pro Val35

Ser Leu Leu Met50

Tyr Val Lys Ala65

Gly Pro Glu Ser

Thr Pro Met Glu100

Pro Pro Leu Pro115

Gly Asn Ile Leu130

Gln Leu Ser Ile145

Ile Thr Gln CysGln Arg Arg

artificial

peptideo

Met Trp Ile Thr5

Leu Pro Ser Ile

His Pro Ile Lys40

Trp Ile Thr Gln55

Ser Glu Lys Ile70

Arg Leu Leu Glu85

Ala Glu Leu Ala

Val Pro Gly Val120

Thr Ile Arg Leu135

Ser Ser Cys Leu150

Phe Leu Pro Val165

Gln Cys Lys Ala10

Pro Val His Pro25

Ala Ser Glu Lys

Cys Lys Ala Ser60

Phe Tyr Val Arg75

Phe Tyr Leu Ala90

Arg Arg Ser Leu105

Leu Leu Lys Glu

Thr Ala Ala Asp140

Gln Gln Leu Ser155

Phe Leu Ala Gln170

Ser Glu Lys Ile15

Ile Gly Leu Pro30

Ile Phe Tyr Val45

Glu Lys Ile Phe

Cys Gly Ala Arg80

Met Pro Phe Ala95

Ala Gln Asp Ala110

Phe Thr Val Ser125

His Arg Gln Leu

Leu Leu Met Trp160

Pro Pro Ser Gly175<210> 17<211> 275<212> PRT<213> Seqüência

<220>

<223> homem fez

artificial

peptideo

<400> 17

Met Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg Arg

1 5 10 15

Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe Phe

20 25 30

Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ala Gln Leu Ala

35 40 45

Gly Ala Lys Gly Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala

50 55 60

Pro Gly Val Lys Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly65 70 75 80

Val Gln Arg Gly Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu

85 90 95

Thr Pro Gly Tyr Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala

100 105 110

Glu Ala Val Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Ala Leu Gln

115 120 125

Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu

130 135 140

Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His145 150 155 160

Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys

165 170 175

Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro

180 185 190

His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro

195 200 205

Cys Phe Met Pro Asn Lys Arg Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu210 215 220

Gly Asp Ala Ala Tyr Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly Leu Ile Ser225 230 235 240

Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Ser Leu Leu Gln His Leu Ile

245 250 255

Gly Leu Lys Arg Pro Ser Ile Lys Arg Gly Leu Pro Ser Ile Pro Val260 265 270

His Pro Val275

<210> 18<211> 94<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> homem fez peptideo<400> 18

Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys

1 5

Leu Thr Val Tyr Met Asp Gly Thr20

Val Ile Leu Gly Val Leu Leu Leu

35 40

Arg Asn Gly Tyr Arg Ala Leu Met

50 55

Gln Cys Ala Leu Thr Arg Arg Cys65 70

Asp Ser Lys Val Ser Leu Gln Glu85

Leu Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile

10 15

Met Ser Gln Val Gly Ile Leu Thr25 30

Ile Gly Cys Trp Tyr Cys Arg Arg45

Asp Lys Ser Leu His Val Gly Thr60

Pro Gln Glu Gly Phe Asp His Arg

75 80

Lys Asn Cys Glu Pro Val90

<210> 19<211> 3315<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Plasmideo

<400> 19

atatacgcgt tgacattgat tattgactagagttcatagc ccatatatgg agttccgcgtctgaccgccc aacgaccccc gcccattgacgccaataggg actttccatt gacgtcaatgggcagtacat caagtgtatc atatgccaagatggcccgcc tggcattatg cccagtacatcatctacgta ttagtcatcg ctattaccatgcgtggatag cggtttgact cacggggattgagtttgttt tggcaccaaa atcaacgggaattgacgcaa atgggcggta ggcgtgtacggctaactaga gaacccactg cttactggctgacccaagct ggctagcgtt taaacttaagtggaactagc agggatcggc atattgacaggaattctgac agtgatcctg ggagtcttacgaaatggata cagagccttg atggataaaacaagaagatg cccacaagaa gggtttgatcaaaactgtga acctgtgtag tgagcggccgtgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgcccttccttga ccctggaagg tgccactcccgcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattctaagggggagg attgggaaga caatagcaggtctactgggc ggttttatgg acagcaagcggtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaactggcgcagggg atcaagctct gatcaagagaaagatggatt gcacgcaggt tctccggccggggcacaaca gacaatcggc tgctctgatggcccggttct ttttgtcaag accgacctgtcagcgcggct atcgtggctg gccacgacggtcactgaagc gggaagggac tggctgctatcatctcacct tgctcctgcc gagaaagtatatacgcttga tccggctacc tgcccattcgcacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcgggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggctcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgcctggattcat cgactgtggc cggctgggtg

ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 60tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 120gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 180ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt 240tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 300gaccttatgg gactttccta cttggcagta 360ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg 420tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg 480ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc 540gtgggaggtc tatataagca gagctctctg 600tatcgaaatt aatacgactc actataggga 660ccaccatgtt actagctgtt ttgtactgcc 720tgtatatgga tggaacaatg tcccaggtag 780tgctcatcgg ctgttggtat tgtagaagac 840gtcttcatgt tggcactcaa tgtgccttaa 900atcgggacag caaagtgtct cttcaagaga 960ctcgagtcta gagggcccgt ttaaacccgc 1020cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 1080actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1140attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1200catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 1260aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg 1320ggatggcttt cttgccgcca aggatctgat 1380caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 1440cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 1500ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 1560ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg 1620gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 1680tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 1740ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 1800accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 1860atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 1920tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc 1980cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 2040tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 2100ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 2160acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 2220tctgaattat taacgcttac aatttcctga tgcggtattt tctccttacg catctgtgcg 2280gtatttcaca ccgcatcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt 2340ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg 2400cttcaataat agcacgtgct aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc 2460ctttttgata atctccggaa gagtcaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 2520gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 2580tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 2640ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 2700atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 2760gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 2820tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 2880cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 2940cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 3000tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 3060cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 3120cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 3180gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt ccggccggaa acgtttggtt gctgactaat 3240tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc tggggacttt ccacacctcg 3300cgatgtacgg gccag 3315

<210> 20<211> 3596<212> DNA

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Plasmideo<400> 20

gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata 60gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 120ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 180ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 240atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 300cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 360tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat 420agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt 480tttggcacca aaatcaacgg gactttccaaaaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagggagaacccac tgcttactgg cttatcgaaactggctagcg tttaaactta agccaccatggcttcggaga aaatcttcta tgtgggtcttccaagtattc ctgttcatcc aattaaagctatgtggatca cgcagtgcaa agcttcggagatcttctacg tacggtgcgg tgccaggggggccatgcctt tcgcgacacc catggaagcagccccaccgc ttcccgtgcc aggggtgcttctgactatcc gactgactgc tgcagaccacctccagcagc tttccctgtt gatgtggatccagcctccct cagggcagag gcgctagtgaccgctcgagt ctagagggcc cgtttaaacctgccagccat ctgttgtttg cccctccccccccactgtcc tttcctaata aaatgaggaatctattctgg ggggtggggt ggggcaggacaggcatgctg gggatgcggt gggctctatggcgaaccgga attgccagct ggggcgccctactggatggc tttcttgccg ccaaggatctagacaggatg aggatcgttt cgcatgattgccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatgatgccgccgt gttccggctg tcagcgcaggtgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacgcgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacgtattgggcga agtgccgggg caggatctcctatccatcat ggctgatgca atgcggcggctcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagctcgatcagga tgatctggac gaagagcatcggctcaaggc gagcatgccc gacggcgaggtgccgaatat catggtggaa aatggccgctgtgtggcgga ccgctateag gacatagcgtgcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgcgcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagttgatgcggta ttttctcctt acgcatctgttttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatttatccgctca tgagacaata accctgataacatttttaat ttaaaaggat ctaggtgaaggaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc 540tctatataag cagagctctc tggctaacta 600ttaatacgac tcactatagg gagacccaag 660tccctgttga tgtggatcac gcagtgcaaa 720ccaagtattc ctgttcatcc aattggtctt 780tcggagaaaa tcttctatgt gtccctgttg 840aaaatcttct atgtgaaagc ttcggagaaa 900ccggagagcc gcctgcttga gttctacctc 960gagctggccc gcaggagcct ggcccaggat 1020ctgaaggagt tcactgtgtc cggcaacata 1080cgccaactgc agctctccat cagctcctgt 1140acgcagtgct ttctgcccgt gtttttggct 1200gaattctgca gatatccatc acactggcgg 1260cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt 1320gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 1380attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 1440agcaaggggg aggattggga agacaatagc 1500gcttctactg ggcggtttta tggacagcaa 1560ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 1620gatggcgcag gggatcaagc tctgatcaag 1680aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 1740actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 1800ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 1860aggcagcgcg gçtatcgtgg ctggccacga 1920ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 1980tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 2040tgcatacgct tgatccggct acctgcccat 2100gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 2160aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 2220atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 2280tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 2340tggctacccg tgatattgct gaagagcttg 2400tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 2460tcttctgaat tattaacgct tacaatttcc 2520gcggtatttc acaccgcatc aggtggcact 2580tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 2640atgcttcaat aatagcacgt gctaaaactt 2700atcctttttg ataatctccg gaagagtcaa 2760caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2820gtttttccatgtggcgaaacgcgctctcctaagcgtggcgctccaagctgtaactatcgttggtaacagggcctaactactaccttcggatggttttttttttgatctttggtccggccgctgctgggga

<210> 21<211> 3884<212> DNA<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Plasmideo<400> 21

cgttgacatt gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat 60agcccatata tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg 120cccaacgacc cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata 180gggactttcc attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta 240catcaagtgt atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc 300gcctggcatt atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac 360gtattagtca tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga 420tagcggtttg actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg 480ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg 540caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact 600agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa 660gctggctagc gtttaaactt aagccaccat gaatctcctt cacgaaaccg actcggctgt 720ggccaccgcg cgccgcccgc gctggctgtg cgctggggcg ctggtgctgg cgggtggctt 780ctttctcctc ggcttcctct tcgggtggtt tataaaaagc gctcagctgg caggggccaa 840aggagtcatt ctctactccg accctgctga ctactttgct cctggggtga agtcctatcc 900agatggttgg aatcttcctg gaggtggtgt ccagcgtgga aatatcctaa atctgaatgg 960

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agcaaatgaa tatgcttata ggcgtggaat 1020tgttcatcct attgccctgc agagtctctt 1080ccacgtgctg tatcctgtcc ccctggagag 1140ggagaggctt gcctatctgc atgccaggct 1200cagcatggtc tggcttagtg ccaacccctg 1260cccggagccc atcctgtgcc cctgtttcat 1320catcgggctg ggggacgccg cctacagtct 1380ggagaaggaa gagcagtata tcgccagtct 1440aagtattaag aggggtcttc caagtattcc 1500atatccatca cactggcggc cgctcgagtc 1560ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 1620gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 1680ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 1740ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 1800gcggttttat ggacagcaag cgaaccggaa 1860gggaagccct gcaaagtaaa ctggatggct 1920ggatcaagct ctgatcaaga gacaggatga 1980ttgcacgcag gttctccggc cgcttgggtg 2040cagacaatcg gctgctctga tgccgccgtg 2100ctttttgtca agaccgacct gtccggtgcc 2160ctatcgtggc tggccacgac gggcgttcct 2220gcgggaaggg actggctgct attgggcgaa 2280cttgctcctg ccgagaaagt atccatcatg 2340gatccggcta cctgcccatt cgaccaccaa 2400cggatggaag ccggtcttgt cgatcaggat 2460ccagccgaac tgttcgccag gctcaaggcg 2520acccatggcg atgcctgctt gccgaatatc 2580atcgactgtg gccggctggg tgtggcggac 2640gatattgctg aagagcttgg cggcgaatgg 2700gccgctcccg attcgcagcg catcgccttc 2760attaacgctt acaatttcct gatgcggtat 2820caccgcatca ggtggcactt ttcggggaaa 2880ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 2940atagcacgtg ctaaaacttc atttttaatt 3000taatctccgg aagagtcaag aacatgtgag 3060aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 3120atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 3180cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 3240ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 3300tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 3360gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 3420ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 3480ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 3540gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 3600aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 3660tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 3720ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtccggccgg 3780aaacgtttgg ttgctgacta attgagatgc atgctttgca tacttctgcc tgctggggag 3840cctggggact ttccacacct cgcgatgtac gggccagata tacg 3884

Claims

1. Produto imunogênico compreendendo umapluralidade de composições que compreendem uma ou maiscomposições de ácido nucléico e uma ou mais composições depeptídeo; em que uma ou mais composições de ácido nucléicosão capazes de expressar um ou mais epitopos restritos aMHC classe I, ou um análogo dos mesmos, selecionados dogrupo que consiste em um epitopo SSX-1, um epitopo NY-ESO-1, um epitopo PRAME, um epitopo PSMA, um epitopo detirosinase e um epitopo de Melan-A; em que uma ou maiscomposições de peptideo consistem essencialmente em um oumais epitopos restritos a MHC classe I, ou um análogo dosmesmos, selecionados do grupo que consiste em um epitopoSSX-1, um epitopo NY-ES0-1, um epitopo PRAME, um epitopoPSMA, um epitopo de tirosinase, e um epitopo de Melan-A; eem que um ou mais peptideos correspondem aos epitoposexpressos pelos ácidos nucléicos selecionados.

2. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que uma Ou mais composições de ácidonucléico compreendem um plasmideo selecionado do grupo queconsiste em pSEM, pBPL e pRP12.

3. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que uma ou mais composições de peptideocompreendem um peptideo selecionado do grupo que consisteem SSX-241_49 (SEQ ID NO. 1), seu análogo KVSEKIFYV (SEQ IDNO. 5): NY-ESO-li57-i65 (SEQ ID NO. 2), seu análogoSNvaLMWITQV (SEQ ID NO. 6); PRAME425-433 (SEQ ID NO. 3) , seuanálogo S(Nva)LQHLIG(Nle) (SEQ ID NO. 7); PSMA288-297 (SEQ IDNO. 4), seu análogo GLPSIPVHPV (SEQ ID NO. 8); Melan-A26-35(SEQ ID NO. 9), seu análogo ENvaAGIGILTV (SEQ ID NO. 11);tirosinase369_377 (SEQ ID NO. 10), e seu análogo YMDGTMSQNva(SEQ ID NO. 12).

4. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que a pluralidade de composiçõescompreende:a) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe SSX-2 ou análogodo mesmo;b) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I NY-ESO-I ouanálogo do mesmo;c) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PRAME ouanálogo do mesmo;d) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PSMA ouanálogo do mesmo;e) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo SSX-2 ou análogo do mesmo;f) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo NY-ES0-1 ou análogo do mesmo;g) um peptideo consistindo essencialmente doepitopo de PRAME ou análogo do mesmo; eh) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo PSMA ou análogo do mesmo.

5. Produto, de acordo com a reivindicação 4, emque as moléculas de ácido nucléico de a) e b) fazem parteda mesma composição.

6. Produto, de acordo com a reivindicação 5, emque as moléculas de ácido nucléico são iguais.

7. Produto, de acordo com a reivindicação 6, emque a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüênciaque codifica a seqüência de liberação de pBPL (SEQ ID NO.13).

8. Produto, de acordo com a reivindicação 7, emque o ácido nucléico compreende uma seqüência que codificao polipeptideo imunogênico de pBPL (SEQ ID NO. 16) .

9. Produto, de acordo com a reivindicação 7, emque a molécula de ácido nucléico é pBPL (SEQ ID NO. 20) .

10. Produto, de acordo com a reivindicação 4, emque as moléculas de ácido nucléico de c) e d) fazem parteda mesma composição.

11. Produto, de acordo com a reivindicação 10, emque as moléculas de ácido nucléico são iguais.

12. Produto, de acordo com a reivindicação 10, emque a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüênciaque codifica a seqüência de liberação de pRP12 (SEQ ID NO. 14).

13. Produto, de acordo com a reivindicação 12, emque o ácido nucléico compreende uma seqüência que codificao polipeptideo imunogênico de pRP12 (SEQ ID NO. 17).

14. Produto, de acordo com a reivindicação 12, emque a molécula de ácido nucléico é pRP12 (SEQ ID NO. 21) .

15. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o epitopo SSX-2 é SSX-24i-49 (SEQ ID NO. 1) .

16. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o epitopo NY-ESO-I é NY-ESO-Ii57-Ies (SEQ ID NO. 2) .

17. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o epitopo PRAME é PRAME42s-433 (SEQ ID NO. 3) .

18. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o epitopo PSMA é PSMA288-297 (SEQ ID NO. 4) .

19. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o análogo S.SX-2 em e) é KVSEKIFYV (SEQ ID. NO. 5) .

20. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o análogo NY-ESO-I em f) é SNvaLMWITQV (SEQ ID NO. 6) .

21. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o análogo PRAME é em g) S(Nva)LQHLIG(Nle) (SEQ ID NO.7).

22. Produto, de acordo com a reivindicação 1, emque o análogo PSMA em h) é GLPSIPVHPV (SEQ ID NO. 8).

23. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que a pluralidade de composiçõescompreende:i) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I Melan-A ouanálogo do mesmo;ii) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I tirosinase ouanálogo do mesmo;iii) um peptideo consistindo essencialmente doepitopo Melan-A ou análogo do mesmo; eiv) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo de tirosinase ou análogo do mesmo.

24. Produto, de acordo com a reivindicação 23, emque as moléculas de ácido nucléico de i) e ii) fazem parteda mesma composição.

25. Produto, de acordo com a reivindicação 24, emque as moléculas de ácido nucléico são iguais.

26. Produto, de acordo com a reivindicação 25, emque a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüênciaque codifica a seqüência de liberação de pSEM (SEQ ID NO.15).

27. Produto, de acordo com a reivindicação 26, emque o ácido nucléico compreende uma seqüência codificando opolipeptideo imunogênico de pSEM (SEQ ID NO. 18).

28. Produto, de acordo com a reivindicação 27, emque a molécula de ácido nucléico é pSEM.

29. Produto, de acordo com a reivindicação 23, emque o epitopo Melan-A é Melan-A26-35 (SEQ ID NO. 9) .

30. Produto, de acordo com a reivindicação 23, emque o epitopo de tirosinase é Tirosinase369-377 (SEQ ID NO. 10).

31. Produto, de acordo com a reivindicação 23,compreendendo adicionalmente:i) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I SSX-2 ouanálogo do mesmo; eii) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I NY-ESO-I ouanálogo do mesmo.

32. Produto, de acordo com a reivindicação 31,compreendendo adicionalmente um peptideo consistindoessencialmente em um epitopo NY-ESO-I.

33. Produto, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31 ou 32, compreendendo adicionalmente umpeptideo consistindo essencialmente em um epitopo SSX-2.

34. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que a pluralidade de composiçõescompreende:a) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe SSX-2 ou análogodo mesmo;b) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I NY-ES0-1 ouanálogo do mesmo;c) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo SSX-2 ou análogo do mesmo; ed) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo NY-ES0-1, ou análogo do mesmo.

35. Produto imunogênico, de acordo com areivindicação 1, em que a pluralidade de composiçõescompreende:a) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epítopo restrito a MHC classe I PRAME ouanálogo do mesmo;b) uma molécula de ácido nucléico capaz deexpressar um epitopo restrito a MHC classe I PSMA ouanálogo do mesmo;c) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo PRAME ou análogo do mesmo; ed) um peptideo consistindo essencialmente noepitopo PSMA ou análogo do mesmo.

36. Uso do produto imunogênico conforme areivindicação 1 na fabricação de um medicamento apropriadopara administração ao sistema linfático de um indivíduo.

37. Uso do produto imunogênico conforme areivindicação 1 na fabricação de um medicamento apropriadopara induzir uma resposta · imune anti-câncer em umindivíduo.

38. Uso do produto imunogênico conforme areivindicação 1 na fabricação de um medicamento que arrastae amplifica uma resposta de célula T em um indivíduo.

39. Uso do produto imunogênico conforme areivindicação 1 na fabricação de um medicamento para tratarcarcinoma em um indivíduo.

40. Uso de uma ou mais composições de ácidonucléico capazes de expressar um ou mais epítopos restritosa MHC classe I ou um análogo do mesmo, e uma ou maiscomposições de peptideo correspondendo aos epítoposrestritos a MHC classe I ou análogos dos mesmos, nafabricação de um medicamento apropriado para induzir umaresposta imune anti-câncer em um indivíduo.