BRPI0612666A2 - anticorpo monoclonal, fragmento de ligação, suporte sólido, composição, linhagem de células de hibridoma, imunoensaios e estojos de detecção dos mesmos - Google Patents

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL, FRAGMENTO DE LIGAçãO, SUPORTE SóLIDO, COMPOSIçãO, LINHAGEM DE CéLULAS DE HIBRIDOMA, IMUNOENSAIOS E ESTOJOS DE DETECçãO DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a área de imunologia e mais especificamente refere-se aos anticorpos monoclonais antifitase, métodos de imunoensalo, kits e reagentes, para a detecção de uma fitase de ou derivada da fitase de E. coli, em particular, a fitase Quantum(r). A invenção refere-se ainda a linhagens de células de hibridoma que produz anticorpos monoclonais antifitase.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOMONOCLONAL, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO, SUPORTE SÓLIDO, COM-POSIÇÃO, LINHAGEM DE CÉLULAS DE HIBRIDOMA, IMUNOENSAIOS EESTOJOS DE DETECÇÃO DOS MESMOS".

Este pedido reivindica o benefício da data de apresentação doPedido de Patente Provisória U.S. n° 60/693 818, apresentado em 24 deJunho de 2005, o qual é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se com à área de imunologia e maisespecificamente, refere-se a anticorpos monoclonais, métodos de imunoen-saio, incluindo ensaios ELISA e em tira imunológica, kits e reagentes, para adetecção de fitase. A presente invenção refere-se ainda com linhagens decélulas de hibridoma que produzem anticorpos monoclonais antifitase.

Antecedentes da Invenção

Existe uma necessidade significativa de um ensaio conveniente,relativamente fácil para detectar a presença de fitase em alimentação ani-mal. Existe também uma grande necessidade para determinar sé uma plantafoi geneticamente modificada ou se o grão ou gêneros alimentícios proces-sados contêm características de GMO. A necessidade requer métodos deensaio que possam detectar e quantificar o DNA ou proteína novos. A pre-sente invenção satisfaz esta necessidade ao proporcionar anticorpos mono-clonais, linhagens de células de hibridoma, métodos, reagentes e kits imuno-lógicos para detecção e quantificação de fitase.

Sumário da Invenção

São proporcionados métodos, kits e reagentes para detectar emedir fitase em uma amostra. Em particular, a fitase é uma fitase bacteriana,mais especificamente uma fitase de E. coli, e mais particularmente, uma fita-se Quantum®. A fitase é produzida em vários micro-organismos, incluindomas não se limitando a Esherichia coli, Schizosaccharomyces pombe e Pi-chia pastoris ou em vegetais, incluindo mas não se limitando, por exemplo, amilho, trigo, arroz, colza e luzerna. Em particular, a fitase é detectada emalimentos ou em plantas geneticamente modificadas contendo um gene quecodifica a proteína. Os alimentos são alimentos para animais. Os alimentospara animais podem ser para monogástricos ou ruminantes. Os alimentospodem ser alimentos em calda e/ou alimentos granulados.

Os reagentes incluem proteína purificada e anticorpos específi-cos para a fitase. A proteína fitase pode ser isolada de corpos de inclusão deE. coli e administrada em animais para produzir anticorpos policlonais oumonoclonais. Alternativamente, a proteína pode ser isolada de um extratocelular solúvel, tal como um extrato celular de E. coli.

Os anticorpos têm sensibilidade e especificidade elevadas paraa fitase e são úteis em métodos de imunoensaio para a detecção de fitaseenzimaticamente ativa em animais ou em organismos geneticamente modifi-cados.

Os métodos são imunoensaios que utilizam os anticorpos mono-clonais aqui descritos e são capazes de detectar concentrações baixas defitase. Os anticorpos são purificados e por esse motivo reagem muito poucocom outras proteínas que possam estar presentes na amostra. Os anticor-pos e/ou proteína estão reunidos em um kit com reagentes convencionais deimunoensaio para detecção da fitase.

Tendo em consideração o referido acima, existe uma necessida-de real para o desenvolvimento de tecnologia que permita a identificação defitases específicas em amostras.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um gráfico que mostra uma curva padrão para aatividade da fitase.

A Figura 2 é um gráfico que mostra a atividade relativa em per-centagem contra o tempo de incubação a 99°C da enzima fitase em um en-saio ELISA e em um ensaio de atividade da enzima. A detecção da enzimafitase na ELISA correlaciona diretamente com a quantidade de atividade de-tectada no ensaio de atividade da enzima.

A Figura 3 é uma reprodução digitalizada dos ensaios de tiraimunológica que mostram a detecção de fitase (seta) após incubação a 99°Cdurante até uma hora. Observa-se uma redução na detecção de fitase apóscerca de 20 minutos a 99°C.

A Figura 4 é uma representação de um kit de imunoensaio e-xemplificativo e o método de utilização do mesmo.

As Figuras 5A-C são uma série de três tiras imunológicas quemostram uma comparação do revestimento de anticorpos monoclonais antifi-tase e a sua capacidade para detectar a fitase em amostras de ensaio dealimentos à base de milho contendo fitase a concentrações de 0 (J/kg; 250U/kg; ou 500 U/kg. A Figura 5A mostra as três tiras imunológicas de nitroce-lulose revestida com anticorpos monoclonais PHY46 como o anticorpo derevestimento; a figura 5B mostra as três tiras imunológicas de nitroceluloserevestida com PHY36 monoclonal como o anticorpo de revestimento e a fi-gura 5C mostra as tiras imunológicas de nitrocelulose revestida com PHY37monoclonal como o anticorpo de revestimento. Utilizou-se PHY34 monoclo-nal conjugado com ouro para detecção em todas as tiras imunológicas.

A Figura 6 é uma comparação dos ensaios de tira imunológicapara a fitase utilizando anticorpos monoclonais antifitase (fila superior) ouanticorpos policlonais antifitase (fila do fundo). As amostras de enzima fitasenas pistas de amostra foram: Pista 9-Ronozyme®; pista 10-Phyzyme@; pista11-Natuphos®; e pista 12-fitase Quantum®.

A Figura 7 é uma curva padrão de fitase presente nas amostrastestadas utilizando um ELISA de anticorpo monoclonal.

As Figuras 8A-K mostram os passos para o ELISA de fitaseQuick Quantum®. Figura 8A-moer 300 g de alimentos em um moinho de ca-fé; 8B-adicionar 80 mL de tampão de extração a 20 g de amostra; 8C-agitarvigorosamente durante 1 minuto; 8D-deixar o recipiente em repouso durante30 minutos; 8E-preparar placa e reagentes e trazer até a temperatura ambi-ente; 8F-adicionar 50 uL de controles ou amostras aos poços; 8G-adicionar50 uL de conjugado aos poços e incubar durante 30 minutos; 8H-lavar poços5 vezes com água destilada; 8l-adicionar 100 uL de substrato aos poços eincubar 15 minutos; 8J-interpretar os resultados visualmente ou ler a 650 nmem um leitor de placas e 8K-mostra resultados representativos.

Descrição Detalhada das Modalidades DescritasSão aqui descritos métodos, kits e reagentes para a detecção defitase em uma amostra. São também descritas linhagens de células mono-clonais que produzem anticorpos monoclonais antifitase.

A metodologia da invenção pode ser utilizada para detectarqualquer enzima em amostras tais como alimentos para animais. Muitas en-zimas de alimentos são conhecidas pelos versados na técnica. Por exemplo,conhece-se um número de fitases, cuja detecção pode ser conseguida utili-zando a presente invenção. As fitases conhecidas incluem, mas não se limi-tam às descritas na WO 01/90333, intitulado "Recombinant Bacterial Phyta-ses and Uses Thereof;" WO 99/08539, intitulado "Novel Phytase;" Publica-ção de Pedido U.S. n° 20030157646, intitulada "Microbially ExpressedThermotolerant Phytase For Animal Feed", e Publicação de Pedido U.S. n°20030170293, intitulada "Thermotolerant Phytase For Animal Feed," cadaum dos quais e todos são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

Quando se prepara imunoensaios para detectar a fitase em plan-tas transgénicas e nos produtos produzidos a partir daquelas (incluindo fra-ções de gêneros alimentícios) é importante que o ensaio tenha a capacidadede detectar a proteína específica. Assim, são muito importantes anticorposextremamente específicos para o desenvolvimento de produtos comerciaiscom sucesso.

Os reagentes são fitase antigênica e anticorpos antifitase quesão extremamente específicos para a fitase. O método é um imunoensaiopara a detecção específica, sensível de fitase, especificamente para a de-tecção de fitase em alimentos para animais e em plantas geneticamentemanipuladas, tais como produtos agrícolas. O kit contém os anticorpos antifi-tase aqui descritos e outros reagentes, em particular os utilizados em umformato de ensaio em tira, para serem utilizados no imunoensaio descrito emmais pormenor a seguir.

Proteína Antigênica

Para a preparação de proteína recombinante, tal como fitase,após transformação de uma cepa hospedeira adequada e multiplicação dacepa hospedeira até uma densidade celular apropriada, por exemplo, umhospedeiro bacteriano, de inseto ou levedura, pode induzir-se um promotorselecionado por meios apropriados (por exemplo, alteração da temperaturaou indução química) e cultivar as células durante um período adicional paraproduzir enzima recombinante. As células são depois tipicamente colhidaspor centrifugação, rompidas por meios físicos ou químicos, e o extrato brutoresultante retido para purificação adicional.

As células microbianas utilizadas na expressão de proteínas po-dem ser rompidas por qualquer método conveniente, incluindo ciclos decongelação-descongelação, sonicação, ruptura mecânica ou utilização deagentes de Iise celular, sendo tais métodos bem conhecidos dos versadosna técnica.

A enzima fitase é recuperada e purificada a partir de culturas decélulas recombinantes por métodos incluindo precipitação com sulfato deamônio ou etanol, extração ácida, cromatografia de troca aniônica ou catiô-nica, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interacção hidrófoba,cromatografia de afinidade, cromatografia em hidroxiapatite e cromatografiaem lectina. Pode utilizar-se passos para redobragem da proteína, consoantenecessário, para completar a configuração da proteína madura. Finalmentepode utilizar-se cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) para ospassos de purificação final.

Anticorpos

Os anticorpos úteis na invenção podem ser preparados utilizan-do um coelho, galinha, camundongo ou uma cabra. O programa de inocula-ção não é crítico e pode ser qualquer um normalmente utilizado na técnicapara este efeito. Tais procedimentos são descritos, por exemplo, em Antibo-diesA Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988, páginas 92-115.

Os anticorpos preferidos para a detecção de fitase são os anti-corpos de coelho, anticorpos de galinha e anticorpos de cabra que são puri-ficados por imunoafinidade contra a fitase recombinante produzida em cor-pos de inclusão de E. coli ou anticorpos monoclonais de camundongo. Paradetectar e quantificar a fitase, os anticorpos são marcados, de um modo pre-ferido, diretamente utilizando etiquetas as quais incluem enzimas, radioisó-topos e partículas coloridas tais como esferas de látex ou ouro coloidal. Nou-tra modalidade, os anticorpos são marcados indiretamente, for exemplo, porreação com substâncias marcadas que se ligam ao anticorpo tais como anti-corpos secundários, proteína A ou proteína G.

Anticorpos Policlonais

Numa modalidade, os anticorpos são anticorpos policlonais. Osmétodos de preparação de anticorpos policlonais são conhecidos do especi-alista. Os anticorpos policlonais podem ser gerados em um animal, por e-xemplo, através de uma ou mais injeções de um agente de imunização e, sedesejado, um adjuvante. Tipicamente, o agente de imunização e/ou adjuvan-te será injetado no mamífero por injeções múltiplas subcutâneas ou intraperi-toneais. O agente de imunização inclui as enzimas alimentares ou suas pro-teínas de fusão. Por exemplo, o agente é o polipeptídio fitase ou as suasproteínas de fusão.

Os exemplos de adjuvantes incluem o adjuvante completo deFreund e o adjuvante MPL-TDM (monofosforilo Lípido A, trealose dicorino-micolato sintético). O protocolo de imunização pode ser selecionado por umversado na técnica sem experimentação excessiva. Os anticorpos preferidossão extremamente sensíveis para a detecção de proteínas fitase, por exem-plo proteínas fitase transgênicas a concentrações relevantes em amostrasem bruto de produtos à base de grão nos canais de distribuição. Preferenci-almente, os anticorpos detectam a proteína fitase a uma sensibilidade eleva-da de aproximadamente 0,059 ng/mL. Os anticorpos de elevada sensibilida-de são úteis para a detecção de concentrações baixas de proteínas fitasesem tecidos de culturas geneticamente manipuladas, tais como, mas não selimitando a, folhas, caules, sementes, talos, raízes e semelhantes, ou produ-tos derivados de tais culturas, tais como frações de alimentos ou alimentospara animais.

Anticorpos Monoclonais

Os anticorpos antifitase são anticorpos monoclonais. Os anticor-pos monoclonais foram preparados utilizando métodos de hibridoma, taiscomo os descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975). Num méto-do de hibridoma imuniza-se tipicamente um camundongo, hamster ou outrohospedeiro animal apropriado, com um agente de imunização para induzirlinfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligamespecificamente ao agente de imunização. Alternativamente, os linfócitospodem ser imunizados in vitro.

Os anticorpos monoclonais da invenção foram preparados se-gundo a descrição do Exemplo 6. As linhagens de células de hibridoma fo-ram depositadas em 3 de novembro de 2004 e 2 de fevereiro de 2005 (comose indica abaixo), de acordo com o Tratado de Budapeste no DSZM-Deutsche Sammlung von Mikrooranismen und Zellkuturen GmbH, Masche-roder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemanha. Foram atribuídos os se-guintes Números de Acesso às linhagens de células:

Cultura de células PHY34 DSM ACC2698 Depósito 3/11 /04

Cultura de células PHY36 DSM ACC2699 Depósito 3/11 /04

Cultura de células PHY37 DMS ACC2700 Depósito 3/11 /04

Cultura de células PHY46 DSM ACC2701 Depósito 3/11/04

Cultura de células fitase Mab 28 DSM ACC2715 Depósito 2/2/05.

As linhagens de células monoclonais da invenção foram prepa-radas segundo a descrição no Exemplo 6, infra.

O agente de imunização inclui tipicamente o polipeptídio deseja-do ou as suas proteínas de fusão. De uma maneira geral utiliza-se linfócitosde sangue periférico ("PBLs") se se desejar células de origem humana oucélulas de baço ou células de gânglios linfáticos se se desejar fontes mamí-feras não-humanas. Os linfócitos são depois fundidos com uma linhagem decélulas imortalizadas utilizando um agente de fusão adequado, tal como po-Iietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, MonoclonalAntibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pág. 59-103).

As linhagens de células imortalizadas são geralmente células de mamíferotransformadas, em particular células de mieloma de origem em roedores,bovinos e humanos. Geralmente utiliza-se linhagens de células de mielomade rato ou camundongo. As células de hibridoma são cultivadas em um meiode cultura adequado que contém preferencialmente uma ou mais substân-cias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células imortalizadasnão fundidas. Por exemplo, se as células parentais carecerem da enzimahipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio decultura para os hibridomas inclui tipicamente hipoxantina, aminopterina etimidina ("meio HAT"), substâncias essas que impedem o crescimento decélulas deficientes em HGPRT.

As linhagens de células imortalizadas preferidas são aquelasque fundem eficientemente, suportam uma expressão estável de um nívelelevado de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas esão sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens de células imorta-lizadas mais preferidas são as linhagens de mieloma murídeo, que podemser obtidas, por exemplo, de Salk Institute Cell Distribution Center, San Die-go, Calif. e de American Type Culture Collection, Manassas1 Va. As Iinha-gens de células de mieloma humano e heteromieloma camundongo-humanotambém foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais huma-nos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Anti-body Production Techniques and Applications, Mareei Dekker, Inc., NewYork, 1987, pág. 51-63).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma são cultivadasé depois analisado quanto à presença de anticorpos monoclonais dirigidoscontra a PRO. Preferencialmente, a especificidade de ligação dos anticorposmonoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinada por imu-noprecipitação ou por um ensaio de ligação in vitro, tal como um radioimu-noensaio (RIA) ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Tais técni-cas e ensaios são conhecidos na técnica. A afinidade de ligação do anticor-po monoclonal pode, por exemplo, ser determinada pela análise Scatchardde Munson e Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Depois de se ter identificado as células de hibridoma desejadas,os clones são subclonados por procedimentos de diluição Iimitante e cresci-mento por métodos correntes (Goding, supra). Os meios de cultura adequa-dos para este efeito incluem, por exemplo, Meio de Eagle Modificado porDulbecco e meio RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma sãomultiplicadas in vivo como ascites em um mamífero. Os anticorpos monoclo-nais segregados pelos subclones são isolados ou purificados a partir domeio de cultura ou do fluido ascítico por procedimentos convencionais depurificação de imunoglobulina tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose, cromatografia em hidroxiapatite, electroforese em gel, diálise oucromatografia de afinidade.

Os anticorpos monoclonais também podem ser preparados pormétodos de DNA recombinante, tais como os descritos na Pat. U.S. n°4 816 567. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais da invenção éfacilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais(por exemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos que são capazes de seligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve deanticorpos de murídeo). As células de hibridoma da invenção servem comouma fonte preferida desse DNA. Uma vez isolado, o DNA é colocado emvectores de expressão, os quais são depois transfectados em células hos-pedeiras tais como células COS de símio, células de ovário de hamster chi-nês (CHO) ou células de mieloma que não produzam de outro modo proteí-na de imunoglobulina, para se obter a síntese de anticorpos monoclonaisnas células hospedeiras recombinantes. O DNA também é modificado, porexemplo, substituindo a seqüência de codificação pelos domínios constantesdas cadeias pesada e leve humana em vez das seqüências homólogas demurídeo (Pat. U.S. n° 4 816 567; Morrison et al., supra), ou juntando cova-Ientemente a seqüência de codificação da imunoglobulina à totalidade ouparte da seqüência de codificação de um polipeptídio de não imunoglobulina.

Um tal polipeptídio de não imunoglobulina está substituído pelos domíniosconstantes de um anticorpo da invenção ou está substituído pelos domíniosvariáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo da inven-ção para criar um anticorpo quimérico bivalente.

Noutra modalidade, os anticorpos são anticorpos monovalentes.

Os métodos de preparação de anticorpos monovalentes são bem conheci-dos na técnica. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinanteda cadeia leve de imunoglobulina e da cadeia pesada modificada. A cadeiapesada está geralmente truncada em qualquer ponto da região Fc de modoa impedir a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos decisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou sãoeliminados de modo a evitar a reticulação. Os métodos in vitro são tambémadequados para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpospara produzir fragmentos destes, em particular, fragmentos Fab, pode serrealizada utilizando técnicas de rotina conhecidas na arte.

Outros métodos conhecidos na técnica incluem o método de Ke-amey, et al., J. Immunol. 123: 1548-1558 (1979), o qual é aqui incorporadopor referência. Abreviadamente, inocula-se animais tais como ratinhos oucoelhos com o imunogênio em adjuvante, e colhe-se as células de baço emistura-se com uma linhagem de células de mieloma. As células são induzi-das a fundir pela adição de polietileno glicol. Os hibridomas são quimicamen-te selecionados aplicando as células em um meio de selecção contendo hi-poxantina, aminopterina e timidina (HAT). Os hibridomas são subseqüente-mente rastreados em relação à capacidade para produzir anticorpos mono-clonais antifitase. Os hibridomas que produzam anticorpos são clonados,expandidos e armazenados congelados para produção futura.

Noutra modalidade, o anticorpo é marcado diretamente com umaetiqueta detectável para identificação e quantificação de uma proteína fitase.

As etiquetas para utilização em imunoensaios são geralmente conhecidasdos versados na técnica e incluem, mas não se limitam às enzimas, radioisó-topos e substâncias fluorescentes, Iuminescentes e cromogênicas incluindopartículas coloridas tais como ouro coloidal e esferas de látex.

Alternativamente, os anticorpos são marcados indiretamente porreação com substâncias marcadas que têm uma afinidade para a imunoglo-bulina, tal como proteína A ou G ou anticorpos secundários. Os anticorpossão conjugados com uma segunda substância e detectados com uma tercei-ra substância marcada possuindo afinidade para a segunda substância con-jugada com o anticorpo. Por exemplo, o anticorpo está conjugado com bioti-na e o conjugado anticorpo-biotina é detectado utilizando avidina ou estre-pavidina marcada.

Noutra modalidade, o anticorpo é conjugado com um hapteno eo conjugado anticorpo-hapteno detectado utilizando anticorpo anti-haptenomarcado. Estes e outros métodos de marcação de anticorpos e análise deconjugados são bem conhecidos dos versados na técnica.

Imunoensaio

Os anticorpos são reunidos coletivamente em um kit com rea-gentes convencionais de imunoensaio para detecção da fitase utilizando oimunoensaio descrito abaixo. O kit pode conter opcionalmente anticorposmonoclonais e policlonais e um padrão para determinar a presença da fitaseem uma amostra. O kit contendo estes reagentes proporciona uma detecçãosimples, rápida e no local de uma proteína.

Os anticorpos descritos acima são utilizados como os reagentesbásicos de um número diferente de imunoensaios para determinar a presen-ça de fitase em uma amostra. Os anticorpos são utilizados em qualquer tipode imunoensaio, quer seja qualitativo ou quantitativo.

Num ensaio quantitativo em sanduíche típico, existem três par-tes básicas. Por exemplo, em um tal ensaio para a fitase, a proteína fitaseem um extrato vegetal geneticamente modificado ou em um extrato de ali-mentos, tais como alimentos para frangos, é capturada para a fase sólidautilizando um anticorpo primário. Numa modalidade, o anticorpo primário éum anticorpo antifitase de coelho. Em seguida forma-se uma "sanduíche"entre o anticorpo primário, a proteína fitase e o anticorpo secundário que foiadicionado ao poço. Numa modalidade, o anticorpo secundário é um anti-corpo antifitase de cabra. Depois de um passo de lavagem, no qual se elimi-nou o anticorpo secundário não-ligado, o anticorpo secundário ligado é de-tectado utilizando um anticorpo marcado. Numa modalidade particular, o an-ticorpo de detecção é um anticorpo anticabra de burro marcado com fosfata-se alcalina. O substrato para detecção da enzima, fosfatase alcalina, é adi-cionado e o desenvolvimento de cor determinado lendo a absorvância decada poço. A curva de calibração utiliza um ajuste de curva de quatro parâ-metros para representar as concentrações em função da absorvância.De uma maneira mais geral, o imunoensaio para a detecção defitase compreende os passos de: a) preparar um extrato da amostra; b) in-cubar uma porção do extrato com um anticorpo antifitase primário que seliga à fitase, encontrando-se o anticorpo primário ligado a um veículo sólido,e um anticorpo antifitase secundário que se liga à fitase para criar um com-plexo anticorpo-fitase-anticorpo, c) lavar o complexo anticorpo-fitase-anticorpo para eliminar o anticorpo secundário não-ligado; d) adicionar umanticorpo de detecção que reaja imunologicamente com o anticorpo secun-dário em que o anticorpo de detecção está marcado; e e) medir a quantidadede anticorpo marcado ligado para determinar a concentração da fitase.

Numa modalidade, a fitase é uma fitase bacteriana, mais particu-larmente, uma fitase de E. coli. Numa modalidade ainda mais particular, afitase é uma termoestável, tal como uma fitase Quantum®.

Noutra modalidade da invenção, a etiqueta detectável é umaenzima. Em modalidades mais preferidas, a enzima é fosfatase alcalina, pe-roxidase ou (3-galactosidase. Noutra modalidade, a enzima produz um produ-to reacional solúvel. A invenção também proporciona um kit para a detecçãoe quantificação pelo método do imunoensaio compreendendo: a) um meiode extrair a fitase de uma amostra; b) um suporte sólido compreendendo umanticorpo primário antienzimas alimentares ligado ao suporte sólido; c) umanticorpo antifitase secundário; e d) um anticorpo de detecção capaz de seligar imunologicamente ao anticorpo secundário e em que o anticorpo dedetecção está marcado com um meio de detecção.

Numa modalidade particular, o meio de detecção é uma enzima.

Em modalidades particulares, a enzima de detecção é fosfatase alcalina,peroxidase ou p-galactosidase. Noutra modalidade, a enzima produz umproduto reacional solúvel ou insolúvel. Noutra modalidade, o kit compreendeainda um substrato para uma enzima. Tais imunoensaios são também refe-ridos como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA).

Os anticorpos descritos acima são também utilizados em umimunoensaio qualitativo para a detecção de uma enzima alimentar, tal comoa fitase. Um desses ensaios é geralmente referido como uma tira imunológi-ca. Uma tira imunológica é produzida utilizando membranas e filtros atravésdos quais é absorvida uma amostra de líquido por ação capilar. A fitase naamostra reage com os anticorpos contidos na tira imunológica à medida queela se move ao longo do comprimento da tira. Para detectar proteína da fita-se em alimentos para frangos, os alimentos são lavados com um tampão,separados do material sólido e adicionados à tira imunológica. À medida quea amostra líquida migra para a extremidade oposta da tira imunológica, afitase reage com os anticorpos específicos e é capturada em uma linha quese torna visível. A detecção do sinal na linha de ensaio indica que existe fita-se na amostra.

Numa modalidade a invenção proporciona um imunoensaio paraa detecção de fitase em uma amostra compreendendo os passos de: a) pre-parar um extrato da amostra na presença de um anticorpo primário o qualreconhece imunologicamente a fitase no extrato pelo que se forma um com-plexo anticorpo primário-fitase; b) preparar um formato de fase sólida possu-indo um tamanho tridimensional significativo para formar um volume subs-tancial com uma multiplicidade de espaços intersticiais ligando àquela umanticorpo secundário desejado capaz de reconhecer imunologicamente afitase e em que o anticorpo secundário está conjugado com meios de detec-ção e em que o anticorpo secundário também reconhece imunologicamentea fitase; d) combinar o extrato do passo (a) com o formato preferido do pas-so (b) de acordo com o que o extrato é retirado através dos espaços intersti-ciais do formato de fase sólida preparado capturando o complexo anticorpoprimário-fitase; e) detectar a fitase pela presença do referido complexo deanticorpo primário-fitase capturado.

Numa modalidade a fitase é uma fitase bacteriana. Numa moda-lidade mais particular, a fitase é de E. coli. Noutra modalidade, a fitase éuma fitase termoestável, tal como mas não se limitando à fitase Quantum®.

Noutras modalidades, o formato de fase sólida é acetato de celu-lose, celulose, nitrocelulose ou náilon. Noutra modalidade, o formato de fasesólida é constituído por camadas múltiplas sobrepostas e contíguas em quecada camada é capaz de capturar uma enzima alimentar diferente. Numamodalidade preferida, o suporte de fase sólida compreende ainda uma almo-fada de absorção de amostra do formato de fase sólida. Numa modalidademais preferida, o imunoensaio compreende ainda uma tira compreendendoum anticorpo anti-enzimas alimentares marcado.

Numa modalidade particular, o meio de detecção é ouro coloidal.

É proporcionado um imunoensaio extremamente sensível queutiliza os anticorpos descritos acima. O ensaio é útil para a detecção de umaenzima fitase em uma amostra de alimentos. De igual modo, o ensaio é útilpara a detecção de organismos geneticamente modificados que foram mani-pulados para incluir um gene que codifica um gene da fitase. O imunoensaioé capaz de detectar concentrações baixas da proteína em amostras, taiscomo alimentos para animais e em amostras de culturas geneticamente me-lhoradas.

Como se descreveu acima, os anticorpos utilizados no imunoen-saio são imunorreativos com determinantes antigênicos ou com um determi-nante antigênico comum na proteína fitase, expressado por vários micro-organismos e reage de um modo mínimo com outras proteínas que possamestar presentes na amostra, proporcionando desse modo uma determinaçãoexata da presença de um organismo geneticamente modificado em umaamostra, tal como uma amostra de grãos.

O imunoensaio é útil para detectar a presença ou a quantidadede uma fitase, em uma diversidade de amostras, incluindo alimentos paraanimais e amostras agrícolas tal como material vegetal. A amostra pode serobtida de qualquer fonte na qual a proteína desejada esteja acessível aoanticorpo. Por exemplo, a amostra pode ser qualquer tecido vegetal ou ex-trato incluindo raízes, caules, talos, folhas ou sementes ou produtos deriva-dos de tais culturas, tais como frações de alimentos.

Um ou mais dos anticorpos descritos acima são utilizados emqualquer imunoensaio em sanduíche ou competitivo, heterogêneo ou homo-gêneo para a detecção de proteína fitase. O anticorpo está marcado comuma etiqueta detectável ou acoplado a uma fase sólida. Os métodos paraacoplamento de anticorpos a fases sólidas são bem conhecidos dos versa-dos na técnica. De acordo com o método de imunoensaio, a amostra con-tendo fitase é feita reagir com o anticorpo durante uma quantidade de temposuficiente em condições que promovem a ligação do anticorpo à proteínafitase na amostra. Os versados na técnica compreenderão que os reagentesde imunoensaio e a amostra podem ser feitos reagir em combinações e porordens diferentes. Utiliza-se um meio físico para separar reagentes ligados àfase sólida de reagentes não-ligados tal como filtração de partículas, decan-tação de soluções reacionais de tubos ou poços revestidos, separação mag-nética, ação capilar e outros meios conhecidos dos versados na técnica. En-tender-se-á também que se pode incluir no método uma lavagem separadada fase sólida.

A concentração de proteína fitase na amostra é determinadacomparando a intensidade da cor produzida pela amostra com um cartão decor, utilizando um reflectômetro, ou utilizando um espectrofotômetro ou leitorde placas microtítulo.

A mistura reacional resultante, ou combinação de anticorpo eamostra, é preparada em uma solução que otimiza a cinética de ligação an-ticorpo-fitase. Uma solução apropriada é uma solução aquosa ou tampão. Asolução é preferencialmente proporcionada em condições que promoverão aligação específica, minimizarão a ligação não-específica, solubilizarão asenzimas alimentares, estabilizarão e conservarão a reatividade do reagente,e pode conter tampões, detergentes, solventes, sais, quelantes, proteínas,polímeros, carbadratos, açúcares e outras substâncias conhecidas dos ver-sados na técnica.

A solução da mistura reacional é feita reagir durante um períodode tempo suficiente para permitir que o anticorpo reaja e se ligue à proteínafitase para formar um complexo anticorpo-fitase. É desejado o período detempo reacional mais curto que resulte em ligação para minimizar o temponecessário para completar o ensaio. Um período de tempo reacional apro-priado para um ensaio em tira imunológica é menor ou igual a 10 minutos ouentre aproximadamente um minuto e 10 minutos. É preferido um tempo dereação menor do que cinco minutos. Muito preferencialmente, o tempo dereação é menor do que três minutos. Otimizando os reagentes, a ligaçãopode ser consideravelmente completa à medida que os reagentes são com-binados.

A reação é realizada a qualquer temperatura à qual os reagentesnão se degradem ou se tornem inativos. É preferida uma temperatura entreaproximadamente 18°C e 30°C, e a temperatura de reação muito preferida éa temperatura ambiente (aproximadamente 22°C).

Um formato de fase sólida tal como uma tira imunológica é ide-almente adequada para este imunoensaio. As tiras de ensaio são constituí-das por componentes porosos múltiplos, membranas e filtros, através dosquais a amostra líquida é absorvida por ação capilar. A fitase na amostrareage com os reagentes de ensaio contidos na tira de ensaio à medida queela atravessa o comprimento da tira. Para detectar a proteína no grão ousemente, o grão é moído em um pó e a proteína extraída do pó com um Ii-quido que é depois separado do material sólido e analisado utilizando o tes-te. O líquido é aplicado à tira imunológica, e a proteína fitase migra em dire-ção da extremidade distai da tira. À medida que migra ao longo da tira, afitase reage com reagentes aplicados ou imobilizados na tira provocando umproduto com sinal detectável. A detecção do sinal indica a presença de fitasena amostra.

Numa modalidade o formato de fase sólida é acetato de celulo-se, celulose, nitrocelulose ou náilon. Numa modalidade preferida, o formatode fase sólida é nitrocelulose.

Noutra modalidade, o formato de fase sólida compreende umaalmofada de absorção da amostra, uma tira de nitrocelulose e uma aímofadade fundo compreendendo um anticorpo antifitase marcado.

Ensaio de Imunoabsorção Enzimática (ELISA)

Os métodos serológicos que são utilizados baseiam-se em téc-nicas de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) descritas, por exem-pio, em Harlow, E., pista D., Antibodies: a Laboratory Manual. 1998. ColdSpring Harbor Laboratory. pág. 553-612. O método de ELISA utilizado napresente invenção é descrito no Exemplo 1.Estoio de Imunoensaio

Um kit de imunoensaio para a detecção de proteína de enzimasalimentares em uma amostra contém um ou mais dos anticorpos descritosacima. O kit pode conter adicionalmente equipamento para obter a amostra,um recipiente para conter os reagentes, um meio de cronometragem, umtampão para diluir a amostra e um calorímetro, reflectômetro ou padrão con-tra o qual se pode medir uma mudança de cor. O kit pode incluir os reagen-tes na forma de uma tira imunológica como se descreveu acima.

Numa modalidade preferida, os reagentes, incluindo o anticorpoestão secos. A adição de amostra aquosa ao frasquinho ou tira resulta nasolubilização do reagente seco, levando-o a reagir.

Os reagentes, métodos de imunoensaio e kits descritos acimaserão melhor compreendidos por referência aos seguintes exemplos não-restritivos. Os exemplos abaixo mostram protocolos experimentais e reagen-tes típicos que podem ser utilizados na detecção de fitase em amostras taiscomo alimentos ou outros materiais vegetais. Tais exemplos são proporcio-nados a título de ilustração e não de restrição.

Outros objetos, particularidades e vantagens da presente inven-ção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição pormenorizada que se se-gue. No entanto entender-se-á que a descrição pormenorizada e os exem-plos específicos, apesar de indicarem modalidades preferidas da invenção,são dados apenas a título de ilustração, uma vez que tornar-se-ão evidentesaos versado na técnica várias alterações e modificações dentro do espírito eâmbito da invenção a partir desta descrição pormenorizada.

As várias referências citadas acima são aqui todas incorporadasnas suas totalidades.

EXEMPLOS

Estes métodos e materiais descrevem o procedimento geral parapreparar as amostras de milho ou alimentos e de produção dos anticorpospoliclonais e monoclonais utilizados nos exemplos descritos abaixo.

Materiais e Métodos

Amostra de milho: O extrato de milho era proveniente de semen-tes Hi Il ou sementes A188 (não-transgênicas) ou sementes fitase genetica-mente modificadas. Pulverizou-se cinco grãos de milho utilizando um tritura-dor de tecidos KLECO. Suspendeu-se a farinha de milho resultante em 5 mLde água destilada para solubilizar as proteínas. Testou-se o sobrenadanteem ELISA ou com as tira imunológicas.

Produção de Anticorpos Policlonais

Para imunização: Depois da injeção inicial, o animal (coelho oucabra) recebeu um reforço após 28 dias. Cada reforço subsequente daí emdiante foi dado de 21 dias. Os animais foram sangrados 10 dias após cadareforço.

Para as galinhas, o primeiro reforço é efetuado 7 dias depois dainjeção inicial, seguido de reforços de 28 em 28 dias. As galinhas foram san-gradas 10 dias após cada reforço, e se for detectado um bom título de anti-corpos, recolhe-se os ovos depositados após o reforço.

O agente de imunização foi toda a proteína fitase purificada deum sistema de expressão de E. coli. Com a primeira injeção no animal, aproteína é emulsionada em adjuvante completo de Freund. Os reforços sãoem adjuvante incompleto de Freund. Os animais utilizados para produzir osanticorpos policlonais são coelhos, galinhas e cabras.

Purificação da fitase (Nov9X):

Submeteu-se à diálise fitase (Nov9X) formulada com 10% desorbitol, 10% de NaCI e pH 4,2 dum dia para o outro contra Tris-HCI a 25mM, pH 8,0 a 4°C utilizando um tubo de diálise SnakeSkin 10K MWCO (Pi-erce, Rockford, IL.). Após diálise adicionou-se (NH4)2SO4 sólido à mistura defitase, inicialmente até 25% de saturação, depois até 50% e finalmente 75%de saturação a 0°C. Após a adição de (NH4)2SO4 até 25% de saturação, agi-tou-se a mistura durante 30 minutos a 0°C, centrifugou-se em seguida a20.000 rpm durante 20 minutos. Ao sobrenadante decantado, adicionou-se(NH4)2SO4 até 50% de saturação enquanto se ressuspendia o sedimento emTris-HCI a 25 mM, pH 9,0. Este procedimento foi realizado 3 vezes para pro-duzir sedimentos de Nov9X (NH4)2SO4 de 0-25%, 25-50% e 50-75% de satu-ração. A análise por SDS-PAGE demonstrou a presença de Nov9X na fração50-75%. Esta fração foi sujeita a diálise contra Tris-HCI a 25 mM, pH 9,0 epreparada para purificação por cromatografia em coluna.

Carregou-se Nov9X TAM em bruto da fração de 50-75% de(NH4)2S04 em uma coluna de troca aniônica HiTrapQ (Amersham Bioscien-ces, Piscataway, NJ) utilizando um caudal de 5,0 mL/min. Utilizou-se umgradiente de NaCI a 0-0,4 M em Tris-HCI a 25 mM, pH 9,0 desenvolvido aolongo de 30 minutos para eluir o Nov9X. Utilizou-se as medições da absor-vância a 280 nm para seguir o progresso do ensaio cromatográfico. Apósanálise por SDS-PAGE as frações mais puras contendo Nov9X foram mistu-radas, concentradas com um concentrador centrífugo Centricon Plus-20 (Mil-lipore, Bedford, MA), e carregadas em uma coluna de exclusão molecular26/60 Sephacryl S100 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) a correr a 1mL/min. O tampão eluente foi Tris-HCI a 25 mM, pH 9,0. As frações conten-do Nov9X puro foram reunidas, concentradas, submetidas a diálise contraTris-HCI a 25 mM, pH 8,0, e utilizadas nos estudos descritos a seguir.

EXEMPLO 1: ELISA da fitase

Este exemplo descreve a detecção e determinação quantitativada enzima fitase em uma amostra de milho utilizando a técnica imunológicade ELISA.

Procedimento

Revestiu-se as placas de poços múltiplos (Nunc, Maxisorp) a4°C dum dia para o outro com o anticorpo antifitase de coelho a uma con-centração de 2 (ag/mL, diluído em borato de sódio/ácido bórico a 50 mM,NaCI a 75 mM, pH 8,5. Lavou-se as placas cinco vezes com Tris a 10 mMcontendo 0,05% de Tween-20 e 0,03% de azida de sódio pH 8 (tampão delavagem). Nota: o mesmo passo de lavagem foi realizado após cada períodode incubação para eliminar anticorpos/amostras não-ligados. Bloqueou-seentão as placas durante 45 min. à temperatura ambiente com albumina desoro bovino a 1%, 0,05% de Tween-20, 0,03% de azida de sódio, NaCI a150 mM em fosfato de sódio a 100 mM, pH 7,4 diluente. Adicionou-se cin-qüenta microlitros de cada amostra à placa e incubou-se durante 1,5 h àtemperatura ambiente. Adicionou-se o anticorpo antifitase de cabra (diluídoaté 2 ng/mL em diluente) às placas e incubou-se durante 1 h a 37°C. Adicio-nou-se o anticorpo de detecção (anticorpo anticabra de burro marcado comfosfatase alcalina foi diluído até 1 jjg/ml_ em diluente) às placas e incubou-sedurante 1 h a 37°C. Adicionou-se o substrato, fosfato de para-nitrofenilo(pNPP) e deixou-se desenvolver durante 30 min à temperatura ambiente.Mediu-se a absorvância a 405 nm com 492 nm como uma referência.

Características do Ensaio

A curva padrão da fitase foi um ajuste de curva de 4 parâmetros4 (ver Figura 1). A curva foi representada linear contra Iog em uma gama de0,04 até 16 ng/mL. Para representar a curva padrão de 4 parâmetros em umeixo dos X logarítmico deverá introduzir-se o padrão de 0 ng/mL no progra-ma de análise a 0,01 ng/mL em vez de 0 ng/mL. O programa de análise utili-zado foi o software WinSelect® para o leitor de microplacas Tecan Sunrise®,embora se possa utilizar qualquer programa de ajuste de curvas de quatroparâmetros.

A dose mínima detectável (MDD) foi o nível mais baixo de prote-ína fitase que se distinguia estatisticamente do padrão zero. A dose mínimadetectável foi determinada através da análise de 24 replicados de controlenegativo de extrato de grão de milho a 1 mg/mL de proteína total. Adicionou-se dois desvios padrão da O.D. média do padrão zero (limites de confiançade 95%) à média, e determinou-se a dose deste valor total de O.D. utilizandouma curva padrão. A dose detectável mínima foi de 0,044 ng/mL.

A precisão entre ensaios foi determinada analisando 4 amostrasde controle diferentes em 21 ensaios diferentes. As amostras eram de fitasepurificada adicionada a diluente de ELISA. Os resultados são indicados a -baixo no Tabela 1. A precisão é boa, inferior a 15%, para concentrações deamostras que são medidas na parte linear da curva padrão.

Tabela 1: Ensaio de Precisão Entre Ensaios

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A precisão no ensaio foi determinada analisando 20-24 replica-

dos das amostras seguintes. As amostras foram fitase adicionada a diluentede ELISA. Os resultados são indicados no Tabela 2 abaixo. Todas as amos-tras originaram uma precisão muito boa, indicando boa reprodutibilidadedentro de um único ensaio.

Tabela 2: Ensaio de Precisão Entre Ensaios

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Diluiu-se quatro extratos de grão de milho com diluente de ELI-SA para testar a linearidade do ensaio. O extrato de milho foi proveniente desementes Hi Il ou sementes A188 (não-transgênicas) ou sementes produto-ras de fitase geneticamente modificadas. Pulverizou-se cinco grãos de milhoutilizando um triturador de tecido KLECO (Visalia, CA). Suspendeu-se a fari-nha de milho resultante em 5 mL de água destilada para solubilizar as prote-ínas. Testou-se o sobrenadante em ELISA ou com as tiras. A percentagemde recuperação da fitase das amostras diluídas foi aceitável.

Tabela 3: Linearidade do Ensaio de Doseamento

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Exemplo 2: Tiras imunológicas para a fitase

Este exemplo descreve a utilização dos ensaios de tiras imuno-lógicas para testar quanto à presença de fitase em uma amostra.

Procedimento

Preparou-se extratos de alimentos para frangos em calda adi-cionado os alimentos a um tubo de centrífuga de 50 ml_ até à marca de 15ml. Adicionou-se esta quantidade de alimentos a um dos lados da rede nointerior do saco de extração. Adicionou-se tampão de extração (25 ml_ deborato a 0,1 M, pH 7,5 contendo 0,5% de Tween-20) e pressionou-se sua-vemente o tampão sobre os alimentos para garantir que a totalidade dos a -Iimentos estava umidificada. Incubou-se o extrato à temperatura ambientedurante pelo menos 10 min antes de se aplicar 3-5 gotas à tira imunológicapara ensaio.

Tira Imunológica

Abreviadamente, a tira imunológica de fluxo lateral compreendiauma membrana de detecção de nitrocelulose (2,5 x 18 cm), sobre um supor-te de plástico (G&L Precision Die Cutting, lnc, San Jose, CA), no qual sepulverizou uma linha de 1 mm de anticorpo policlonal antifitase de coelho(também se pode utilizar anticorpos de galinha) específico. Pulverizou-seuma linha de controle de reagente de anticorpo anticabra de burro em umparalelo acima da linha do primeiro anticorpo. A extremidade do fundo da tirade nitrocelulose é tapada com um pedaço de tira de poliéster. A tira de poli-éster é tratada em primeiro lugar com 0,5% de BSA, 0,5% de poli(álcool viní-lico) e 0,1% de Triton X-100; tampão de fosfato a 50 mM, pH 7,4 e o anticor-po antifitase de cabra conjugado com ouro coloidal. Deixa-se secar a tira depoliéster. A tira de poliéster é depois coberta com uma almofada de aplica-ção de amostra em algodão. A almofada de aplicação da amostra tambémfoi pré-tratada com 0,1% de Triton X-100 em tampão de borato a 0,1 M, pH8,5 e deixada secar. Flanqueando a outra extremidade ou extremidade supe-rior da tira de nitrocelulose está uma outra almofada de algodão para absor-ver a solução da amostra depois desta ter passado as áreas do anticorpo deensaio e do anticorpo controle na nitrocelulose. Esta placa completada foidepois cortada em tiras de ensaio de 4 mm para caber em um cassete deplástico com um poço oval de aplicação de amostra posicionado acima daalmofada de amostra e uma janela retangular de detecção posicionada aci-ma da área de detecção da membrana de nitrocelulose.

O ensaio foi realizado adicionando 150 jiL (3-5 gotas) de extratoao poço da amostra. Depois de esperar aproximadamente 5-10 minutos, osresultados surgiram na janela de resultados. Se houvesse fitase na amostra,surgia uma linha vermelha dupla na janela de resultados. A linha inferior in-dica a presença de fitase enquanto a linha superior é a linha de controle quedemonstra um dispositivo a funcionando adequadamente. Se a fitase estiverausente, surge apenas uma única linha de controle vermelha na janela deresultados. Ver Figuras 3 e 4 para tiras imunológicas de amostras. A Figura3 mostra a detecção da presença de fitase. A detecção de fitase diminui a-pós 20 minutos como indicado pela seta, porque é quando a fitase começa aperder atividade.

Preparação Pormenorizada da Tira Imunolóqica

Tiras de Fitase de 2a Geracão-Revestimento de Materiais da Membrana

Revestimento da linha de ensaio: Placas de material absorvente,2,25 polegadas x 180 mm com membrana AE100 são revestidas com IAPantifitase de galinha a 0,1 mg/mL em PBS utilizando um pulverizador Ca-mag® com o volume ajustado para 18 (1 ^L/cm). Coloca-se a placa em umaplataforma e a porção da placa com os e pedaços de papel é colocada maispróxima da frente do instrumento. A placa é fixada com magnetes. Encher aseringa com 1,0 mg/mL de IAP antifitase de galinha.

Revestimento da linha de controle: Utiliza-se uma linha de con-trole de anticorpo anticabra de burro como uma linha de controle na tira imu-nológica. Pulveriza-se a linha de controle nas placas utilizando um pulveri-zador Camag® com o volume ajustado para 18 (1 jaL/cm). Seca-se as placasa 33°C dum dia para o outro, transfere-se em seguida para a temperaturaambiente e conserva-se seco à temperatura ambiente.

Tiras de Fitase-Revestimento do Conjugado no Poliéster

Procedimento

Diluiu-se o conjugado de ouro até OD = 50 utilizando soluçãodiluente de ouro. Adicionou-se 20% de sacarose e 5% de trealose ao conju-gado de ouro para estabilizar o anticorpo antifitase Nov9X de cabra (0,2 g desacarose e 50 mg de trealose por 1 ml_ de conjugado de ouro) e misturou-seaté estar completamente dissolvido. Pulverizou-se uma lâmina de poliéstercom o anticorpo antifitase conjugado com ouro utilizando um volume Ca-mag® de 27 (1,5 ^L/cm). Colocou-se a lâmina de poliéster na plataforma esegurou-se com os magnetes. Pulverizou-se a lâmina com o conjugado, des-locando 9 mm em cada ensaio, até a lâmina de poliéster estar toda cheia.

Oito linhas de conjugado encherão uma lâmina. Secou-se a lâmina a 37°Cdurante 1 h. Cortar em seguida a lâmina em tiras de 6,35 m (Ya") de modo aque a linha de conjugado de ouro atravesse o topo de cada tira. Armazenarseco à T.A.

Tiras de Fitase-Montaqem

Materiais

1. Placas revestidas com anticorpo IAP antifitase de galinha a 1,0 mg/ml_e 1 (iL/cm.

2. Tiras de 15,875 mm (5/8") x 180 mm de papel absorvente n°40 (almo-fada superior)

3. Tiras de 19,05 mm (3A") x 180 mm de papel n°903 tratado com soluçãoC, pH 8,6 (almofada inferior).

4. Tiras 6,35 mm (%") x 180 mm de conjugado de outro pulverizado (anti-NOV9X de cabra, OD = 50 a 1,5 nL/cm).

Procedimento

Nota: as tiras são montadas em condições de umidade inferior a40%. Usar luvas para aplicar os componentes. Retira-se os dois revestimen-tos das tiras de cola no fundo da placa. Posicionou-se a tira de ouro com alinha de conjugado de ouro ao longo da parte superior e sobrepondo amembrana em 1-1,5 mm. Colocou-se a almofada inferior ao longo do limiteinferior da placa, tendo o cuidado de deixar a tira de ouro exposta. Retirou-se os revestimentos das tiras de cola ao longo da parte superior da placa.Colocar a almofada superior ao longo do topo da placa sobrepondo a mem-brana em 1-1,5 mm. As placas acabadas foram conservadas secas à T.A.até estarem prontas para serem cortadas em tiras.

Cortou-se as tiras em comprimentos de 4 mm. Uma placa pro-duzirá 40 tiras. Conservar as tiras secas à temperatura ambiente.

EXEMPLO 3: Detecção de fitase Enzimaticamente Activa

Procedimento

Fitase purificada produzida por Pichia foi inactivada aquecendo a99°C durante até 60 minutos. A fitase foi depois avaliada em relação à ativi-dade enzimática e comparada com a reatividade no ELISA da fitase (Figura2) e a reatividade com as tiras imunológicas para a fitase (Figura 3).

Comparação de ELISA: a figura 2 mostra um gráfico da atividaderesidual de Nov9X após incubação a 99°C 04-28-03,de TAM purificado porFPLC Lote n° PHY-PP9XR-PB200L. Comparação da Atividade contra Dadosde ELISA. Isto demonstra que o ensaio ELISA e as tiras imunológicas pare-cem detectar apenas a fitase ativa. A fitase inativada termicamente não édetectada em qualquer um dos ensaios.

EXEMPLO 4: Estojo de Imunoensaio da fitase

Este ensaio de diagnóstico (ver Figura 4) foi concebido para adetecção rápida (10 min) de fitase em alimentos. O kit contém todos os rea-gentes e equipamento necessários para realizar o teste. O kit pode ser con-servado a temperaturas ambientes que não excedam 38°C (100°F). Os tes-tes são embalados em um saco de folha metálica à prova de umidade sela-do com um dessecante de sílica capaz de absorver alguma umidade. Mantero teste na sua embalagem até à sua utilização. Evitar colocar o teste em umlocal úmido.

Procedimento de Ensaio1. Encher o tubo grande com alimentos até à marca 15. Adicionar estaquantidade de alimentos a um dos lados da rede no interior do saco deextração.

2. Retirar um recipiente plástico de tampão de extração (25 ml_) do kit everter para o saco de extração.

3. Fechar o saco e deslocar suavemente o tampão sobre os alimentospara assegurar que a totalidade dos alimentos é umidificada. Esperarpelo menos 10 minutos.

4. Retirar um Teste de Campo do saco de película metalizada e colocarem uma superfície seca plana. Verificar o dessecante. Deverá ser azul.

Se estiver rosa, os testes já não são válidos e deverão ser rejeitados.

5. Utilizando a pipeta de transferência, transferir 3-5 gotas do extrato dealimentos para encher o poço de amostra do teste de campo.

6. Esperar aproximadamente 5 minutos para que os resultados surjam najanela acima do poço da amostra.

Resultados

Se houver fitase presente na amostra surge uma linha vermelhadupla na janela de resultados do teste de campo. A linha inferior indica apresença de fitase, enquanto a linha superior é a linha de controle que sina-Iiza um dispositivo funcionando adequadamente. A linha de teste não serátão forte quanto a linha de controle. Qualquer reação observada na linha deteste é considerada positiva.

Se não houver fitase presente, surge apenas uma única linha decontrole vermelha na janela de resultados.

EXEMPLO 5: Detecção de fitase em Alimentos Granulados

Este exemplo demonstra a utilização dos ensaios de tira imuno-lógica para detectar fitase em alimentos granulados para animais.

Os métodos e reagentes são como descritos acima no Exemplo4, com a exceção de que os alimentos granulados para animais são tritura-dos até uma consistência granulosa ou em pó com qualquer dispositivo me-cânico, e de que o tampão de extração foi 5% de metanol com 0,5% deTween-20 em água em vez do tampão de borato. De igual modo, o anticorpoantifitase foi de galinha em vez de coelho. Os resultados são indicados aseguir nas Tabelas 4 e 5. As Tabelas 4 e 5 mostram que a fitase Quantum®era detectável tanto nas dietas em calda ou iniciais (antes da transformaçãoem granulado) como nas dietas granuladas ou esfareladas utilizando o en-saio ELISA. Na Tabela 5, a atividade foi também confirmada com um ensaiode atividade enzimática. Os resultados de ambas as Tabelas 4 e 5 foramtambém confirmados pelo ensaio de tira imunológica (resultados não apre-sentados).

Tabela 4: Detecção de fitase em Alimentos Granulados ou em Calda

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Tabela 5: Atividade da fitase e quantificação por ELISA da fitase em DietasIniciais e Esfareladas

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EXEMPLO 6: Produção de Anticorpos Monoclonais contra a fitase

Os anticorpos monoclonais contra a fitase foram gerados utili-zando um método baseado no inicialmente descrito por Kohler G., MilsteinC. Nature 256, 495-497 (1975). Imunizou-se ratinhos (raça Alderley Park)com a proteína fitase (Ref. Pichia pastoris NOV 9X 10/13/03). Administrou-setrês doses de 20 ^ig por injeção subcutânea em intervalos de duas semanas.

A primeira dose incluiu adjuvante completo de Freund; a segunda e terceiradoses incluíram adjuvante incompleto de Freund. Pelo menos seis semanasdepois da terceira dose administrou-se aos ratinhos um reforço com dosesde 20 ^g de fitase administrada por via intravenosa sem adjuvante. Colheu-se os baços quatro dias depois do reforço intravenoso. Lavou-se os linfócitosdos baços com Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) administra-do através de seringas com agulhas de calibre 20.

Obteve-se células NSO de mieloma (HGPRT-) da Coleção Euro-péia de Culturas de Células. Cultivou-se as células de mieloma em DMEMcontendo 584 mg/L de L-glutamina, 13,6 mg/L de hipoxantina, 3,88 mg/L detimidina e soro fetal bovino (FBS) a 10%, a 37°C em CO2 a 5%. As célulasde mieloma foram selecionadas para fusão quando estavam a uma densida-de de cerca de 5 x 105/mL.

Misturou-se os linfócitos de um único baço (aproximadamente2x108) com 2x107 células NSO de mieloma. Sedimentou-se a mistura de cé-lulas por centrifugação e rejeitou-se o sobrenadante. Ressuspendeu-se sua-vemente o sedimento de células e fundiu-se em seguida através da adiçãogota a gota de 1 mL de um polietileno glicol (1500) a 50% em tampão deHEPES pH8 ao longo de um minuto. Adicionou-se então lentamente meio decultura completo (DMEM contendo L-glutamina, hipoxantina, timidina e FBS)ao longo de vários minutos até um volume final de 50 ml. Aplicou-se em se-guida a fusão resultante em placas de cultura de tecido de 96 poços. Váriashoras depois, adicionou-se por cima aos poços de fusão um volume igual demeio completo contendo também hipoxantina, timidina e 0,352 mg/L de ami-nopterina.

Aproximadamente duas semanas após fusão os sobrenadantesda cultura foram analisados quanto à presença de anticorpos específicoscontra a fitase utilizando um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)de captura de anticorpo com base no método descrito por Engvall E., e Per-Imann P. Immunochemistry 8, 871-874 (1971); e Harlow E. et al., Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988) pág. 182-183.

Adicionalmente, os sobrenadantes da cultura foram tambémanalisados por Biacore®, uma técnica de análise de interação biomolecularutilizando tecnologia de ressonância de plasmônio superficial, para seleccio-nar anticorpos capazes de capturar fitase da solução e também para detec-tar pares de anticorpos capazes de se ligar simultaneamente à fitase. O mé-todo foi desenvolvido a partir do descrito por Fàgerstam L. et al., J. Mol. Re-cognition 3, 208-214 (1991).

As células de hibridoma selecionadas foram depois passadasatravés de pelo menos dois ciclos de clonagem por diluição Iimitante segui-dos de reanálise, para garantir tanto a clonabilidade como a estabilidade doshibridomas. Preparou-se bancos de hibridomas congelados.

A produção de anticorpos monoclonais selecionados foi conse-guida aumentando a escala da cultura de tecido. Os anticorpos foram purifi-cados dos sobrenadantes das culturas por cromatografia de afinidade utili-zando proteína G Sepharose com um método corrente como descrito emAntibody Purification Handbook publicado por Amersham Biosciences (partof GE Healthcare).

EXEMPLO 7: Tira Imunológica de Anticorpo Monoclonal

A tira imunológica de fluxo lateral compreendia uma membranade detecção de nitrocelulose (2,5 x 18 cm), aplicada em um suporte de plás-tico, na qual se pulverizou uma linha de 1 mm de anticorpo monoclonal antifi-tase de uma das linhagens de células n°PHY36 (ACC2699), n°PHY37(ACC2700) ou n°PHY46 (ACC2701). Pulverizou-se uma linha de controlereagente de anticorpo anticamundongo de burro em paralelo acima da linhado primeiro anticorpo. A porção da extremidade inferior da tira de nitrocelulo-se é coberta com um pedaço de tira de poliéster. A tira de poliéster é primei-ramente tratada com 0,5% de BSA, 0,5% de poli(álcool vinílico) e 0,1% deTriton X-100; tampão de fosfato a 50 mM, pH 7,4 e o anticorpo monoclonalantifitase de n°PHY34 (ACC2698) conjugado com ouro coloidal (anticorpoconjugado com ouro coloidal de 40 nm da Capricorn Products, Inc., Portland,ME). Deixa-se secar a tira de poliéster. A tira de poliéster é depois cobertacom uma almofada de aplicação de amostra em algodão. A almofada de a-plicação da amostra também foi pré-tratada com 0,1% de Triton X-100 etampão de borato a 0,1 M, pH 8,5 e deixou-se secar. Flanqueando a outraextremidade ou extremidade superior da tira de nitrocelulose encontra-seoutra almofada de algodão para absorver a solução da amostra depois de terpassado sobre as áreas de anticorpo de ensaio e anticorpo de controle nanitrocelulose. Esta placa completada foi depois cortada em tiras de ensaiode 4 mm para caber em um cassete de plástico com um poço de aplicaçãode amostra oval posicionado acima da almofada de amostra e uma janela dedetecção retangular posicionada acima da área de detecção da membranade nitrocelulose.

A Figura 5 demonstra que todas as três linhas de anticorposmonoclonais, PHY46, PHY36 e PHY37 foram capazes de detectar a enzimafitase em amostras de alimentos à base de milho contendo fitase. O anticor-po monoclonal antifitase PHYMAb 28 não funcionou no ensaio de tira imuno-lógica (dados não apresentados).

Exemplo 8: Reatividade do Anticorpo Monoclonal Para Várias Proteínas Fitases

Este exemplo demonstra a diferença na reatividade do anticorpomonoclonal antifitase para várias enzimas fitase de fontes bacterianas e fún-gicas. As tiras imunológicas foram preparadas e utilizadas como se descre-veu acima no Exemplo 7. Utilizou-se anticorpo monoclonal antifitase PHY37como anticorpo de revestimento e utilizou-se PHY34 como anticorpo marca-do (marcado com ouro coloidal). Utilizou-se amostras de outras enzimas fita-se comerciais como amostras incluindo: Ronozyme®, Phyzyme® e Natu-phos®.

Os resultados na Figura 6 demonstram que as tiras imunológicaspreparadas com anticorpos policlonais antifitase detectam a fitase Quantum®e a Phyzyme® as quais são enzimas fitase provenientes de E. coli, mas nãodetectaram as enzimas fitase provenientes de fungos tais como Ronozyme®e Natuphos®. As tiras imunológicas preparadas com anticorpos monoclonaisantifitase detectaram apenas a fitase Quantum®.

Exemplo 9: ELISA de Anticorpo Monoclonal

Este exemplo descreve a detecção e determinação quantitativada enzima fitase em uma amostra de milho utilizando anticorpos monoclo-nais em uma técnica imunológica de ELISA.

Revestiu-se as placas de poços múltiplos (Nunc, Maxisorp) a4°C dum dia para o outro com o anticorpo monoclonal n°46 (linhagem decélulas PHY46-ACC2701) antifitase a uma concentração de 1 ng/mL, diluídoem borato de sódio/ácido bórico a 50 mM, NaCI a 75 mM, pH 8,5. Lavou-seas placas cinco vezes com Tris a 10 mM contendo 0,05% de Tween-20 e0,03% de azida de sódio pH 8,0) (tampão de lavagem). Nota: efetuou-se omesmo passo de lavagem após cada período de incubação para eliminaranticorpos/amostras não-ligados. Bloqueou-se então as placas durante 45min. à temperatura ambiente com albumina de soro bovino a 1%, 0,05% deTween-20, 0,03% de azida de sódio, NaCI a 150 mM em fosfato de sódio100 mM, pH 7,4 (diluente). Adicionou-se à placa cem microlitros de cadaamostra e incubou-se durante 1,5 h à temperatura ambiente. Adicionou-seem seguida o anticorpo monoclonal PHY28 antifitase biotinilado (diluído a 1|ag/mL em diluente) às placas e incubou-se durante 1 h a 37°C. Adicionou-seo anticorpo de detecção (diluiu-se a estreptavidina marcada com fosfatasealcalina até 2 jag/mL em diluente) às placas e incubou-se durante 1 h a 37°C.

Adicionou-se o substrato, fosfato de para-nitrofenilo (pNPP) e deixou-se de-senvolver durante 30 min à temperatura ambiente. Mediu-se a absorvância a405 nm com 492 nm como referência.

A curva de calibração da fitase produziu a curva padrão sigmói-de esperada utilizando um ajuste de curva de 4 parâmetros (ver Figura 7). Acurva foi representada linear contra Iog com uma gama desde 0 até 64ng/mL. Para representar a curva de calibração de 4 parâmetros em um eixodos X logarítmico, o padrão de 0 ng/mL tem de ser introduzido no programade análise a 0,001 ng/mL em vez de 0 ng/mL. O programa de análise utiliza-do foi o Software WinSelect® para o leitor de placas Tecan Sunrise®, emborapossa ser utilizado qualquer programa de ajuste de curva de quatro parâmetros.

Exemplo 10: Reatividade Cruzada do Anticorpo Monoclonal com Outras En-zimas fitase

Os anticorpos monoclonais da presente invenção foram avalia-dos em relação à sua reatividade cruzada com a enzima fitase fúngica, Ro-nozyme®, e à sua especificidade para a fitase Quantum® (Nov9X) utilizandoos ensaios ELISA descritos acima no Exemplo 9.

Os resultados são indicados na Tabela 6. Os anticorpos mono-clonais n°36 e 37 reagiram de modo cruzado com a fitase de E. coli (Phyzy-me®). O Mab n°34 não tinha reatividade cruzada com a Phyzyme, mas rea-gia com a fitase Quantum® proveniente da enzima E. coli. Os anticorpos mo-noclonais n°46 e n°28 foram também específicos para a fitase Quantum®.Nenhum dos anticorpos, incluindo o anticorpo policlonal de cabra, reagiu demodo cruzado com as enzimas fitase fúngicas, Ronozyme® ou Natruphos®.

Para realizar reações imunológicas utilizando o Mab n°34, comoanticorpo marcado com ouro, ele tornaria o ensaio específico para a fitaseQuantum®. Os Mab n°46 e 28 também poderiam ser utilizados para prepararum imunoensaio específico para a fitase Quantum®.

Tabela 6: Percentagem de Reatividade Cruzada dos Anticorpos Monoclonaispara várias enzimas fitase

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Exemplo 11: ELISA da fitase Quick Quantum®

Este exemplo descreve a detecção e determinação semi-quantitativa da enzima fitase em uma amostra de alimentos utilizando anti-corpos monoclonais na técnica imunológica ELISA. O método e resultadostípicos são mostrados nas Figuras 8A-J.

As placas multipoço (Nunc, Maxisorp) foram revestidas a 4°Cdum dia para o outro com o anticorpo monoclonal antifitase n°46 (linhagemde células PHY46-ACC2701) a uma concentração de 1 iLig/mL, diluído emborato de sódio/ácido bórico a 50 mM, NaCI a 75 mM, soro fisiológico tam-ponado pH 8,5. Lavou-se as placas cinco vezes com um tampão de baseTris pH 8,0 (Tris a 10 mM contendo 0,05% de Tween-20 e 0,03% de azidade sódio pH 8,0). Bloqueou-se então as placas durante 1 h à temperaturaambiente com StabilCoat® (SurModics, Inc.) e secou-se durante 18-24 h a30°C e 18% de umidade. Adicionou-se cem microlitros de cada amostra àplaca e incubou-se durante 15 min à temperatura ambiente. Lavou-se a pla-ca cinco vezes com água destilada e transferiu-se para papel absorvente.

Adicionou-se anticorpo monoclonal antifitase PHY28 conjugado com peroxi-dase diluído a 1 ng/mL em albumina de soro bovino a 1%, 0,05% de Tween-20, 0,04% de Kathon CG® (Supelco, Inc.), NaCI a 150 mM em fosfato de só-dio a 100 mM, pH 7,4 às placas e incubou-se durante 15 min à temperaturaambiente. Adicionou-se o substrato, 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) edeixou-se desenvolver durante 15 min à temperatura ambiente. Mediu-se aabsorvância a 650 nm ou comparou-se visualmente com os controles.

Exemplo 12: Estojo de Extração de Fitase

Utilização Desejada

Este kit de extração contém materiais para a extração de 20 a-mostras de alimentos. É necessária, mas não fornecida, água destilada oudesionizada.

Requisitos de Armazenagem- Conservar o kit à temperatura ambiente.

Materiais Fornecidos

1. 20 recipientes de extração

2. 2 saquetas de tampão de borato.

3. 2 frascos de hidróxido de sódio a 10 N (NaOH)

4. 2 tubos de Tween-20 a 10%

5. 1 tubo de 50 mL

6. Instruções de utilização

Materiais Recomendados Mas Não Fornecidos

1. Moinho de Alimentos (Cuisinart CCM-16PC)2. Balança capaz de pesar 20 gramas

3. Proveta graduada de 100 mL

4. Recipiente de 1 litro

Cuidados

Manusear cuidadosamente a solução de hidróxido de sódio. U-sar luvas para evitar exposição potencial da pele.

Instruções

1. Encher um recipiente adequado com 1 litro de água destilada ou desio-nizada.

2. Adicionar o conteúdo de uma saqueta contendo tetraborato de sódio.

3. Adicionar todo o conteúdo de um frasco contendo hidróxido de sódio(usar luvas).

4. Adicionar todo o conteúdo de um tubo de Tween-20.

5. Misturar bem até todos os sólidos estarem completamente dissolvidos.

Extração da Amostra

1. Encher o moinho de café Cuisinart com uma amostra representativa de300 g e moer toda a amostra até se obter um tamanho de partículamuito fina tipo café instantâneo (regulação mais fina no moinho).

2. Medir 20 g de amostra de alimentos moídos e adicionar ao recipientede extração. Alternativamente, encher o tubo de 50 mL até a marca de35 mL, bater levemente o tubo em uma superfície plana para nivelar osalimentos no tubo, e adicionar ao recipiente de extração.

3. Adicionar 80 mL de tampão de extração ou encher o recipiente de ex-tração até a marca de 110 mL. Agitar bem durante 1 min. É muito im-portante agitar bem as amostras durante o minuto completo para se ob-ter extracções coerentes.

4. Deixar a amostra repousar durante 30 minutos antes de testar parapermitir a deposição das partículas insolúveis.

Exemplo 13: Estojo de Detecção Rápida de Enzima para a fitase Quantum®

Introdução

Este kit de diagnóstico é concebido para a detecção de fitase

Quantum® em alimentos. O ensaio é um método ELISA no formato de mi-croplaca corrente (8x12 poços). O ensaio é rápido (45 minutos) bem comoextremamente sensível. Ele permite a avaliação de 44 amostras em duplica-do ou de 88 amostras em determinações simples. O kit também tem flexibili-dade para testar tão poucas como 2-4 amostras em 12 ensaios separados.

O kit contém uma amostra de controle negativa e 3 positivas.

Princípio do Ensaio

Os poços da fase sólida estão revestidos com um anticorpo quereconhece especificamente a fitase Quantum®.

1a reação: a fitase Quantum® presente na amostra liga-se ao anticorpo i-mobilizado, formando o complexo antígeno-anticorpo. Um se-gundo anticorpo, dirigido para a fitase Quantum®, liga-se aocomplexo antígeno-anticorpo. Este anticorpo (o conjugado) estámarcado com peroxidase de rábano-silvestre.

2a reação: o complexo antígeno-anticorpo marcado com enzima converteum substrato em um produto azul. As amostras contendo a fita-

se Quantum® apresentam o desenvolvimento de uma cor azul,enquanto as amostras sem a fitase Quantum® permanecem in-colores.

Requisitos de Armazenagem

O kit é estável até a data limite de validade indicada na etiquetaquando mantido refrigerado a 2-8°C.

Materiais Fornecidos

7. 96 micropoços revestidos com anticorpo

8. 4 frascos de 0,7 mL cada de controles de 0, 200, 400 e 800 unida-des/kg de fitase Quantum®

9. 1 frasco de 6 mL de solução de conjugado de HRP

10. 1 frasco de 6 mL de solução de substrato TMB

Materiais Recomendados Mas Não Fornecidos

5. Estojo de Extração

6. Balança capaz de pesar 20 gramas

7. Proveta graduada de 100 mL

8. Moinho de Alimentos (Cuisinart CCM-16PC)9. Garrafa de esguicho para água destilada/desionizada

10. Pipetas de 1 e 8 canais para 50 e 100 (il

11. Pontas de pipetas

12. Fotômetro de microplaca munido com um filtro de 650 nm

Extração da Amostra

5. Encher o moinho de café Cuisinart com uma amostra representativa de300 g e moer toda a amostra até se obter um tamanho de partículamuito fina tipo café instantâneo (regulação mais fina no moinho).

6. Medir 20 g de amostra de alimentos moídos e adicionar ao recipientede extração.

7. Adicionar 80 mL de tampão de extração (Borato a 25 mM, pH 10,0 con-tendo 0,01% de Tween-20). Agitar bem durante 1 min. É muito impor-tante agitar bem as amostras durante o minuto completo para se obterextrações coerentes.

8. Deixar a amostra repousar durante 30 minutos antes de testar, parapermitir a deposição das partículas insolúveis.

Procedimento de Ensaio

Deixar todos os reagentes aquecer até a temperatura ambiente(18-30°C) antes de se utilizar (aproximadamente 30 min).

1. Retirar a placa microtítulo do saco de película metalizada. Retirar asfilas de poços que não são necessárias para o ensaio e recolocar nosaco de película metalizada. Selar o saco para manter os poços não u-tilizados secos.

2. Utilizando uma pipeta, transferir os controles e os extratos preparadospara os poços da placa; 50 ^il por poço. Utilizando uma pipeta de 8 ca-nais, fornecer a solução do conjugado de HRP a 50 ^il por poço a todosos poços da placa. Misturar o conteúdo dos poços sacudindo levemen-te a placa para a frente e para trás em uma superfície plana durante10-20 segundos sem salpicar reagentes dos poços. Incubar durante 30min à temperatura ambiente.

3. Esvaziar o conteúdo dos poços. Lavar todos os poços enchendo ospoços com água destilada/desionizada e eliminar o conteúdo sacudin-do. Repetir 5 vezes, e em seguida bater levemente a placa de modofirme em várias camadas de toalhas de papel para eliminar a água re-sidual.

4. Utilizando uma pipeta de 8 canais, dispensar a solução de substratoTMB (frasco âmbar) a todos os poços da placa a 100 ^il por poço. Incu-bar durante 15 min à temperatura ambiente.

5. Ler a densidade óptica a 650 nm ou comparar visualmente os poçosdas amostras com os poços de controle.

Análise de Resultados

O ensaio está a funcionar adequadamente se os controles (200,400 e 800 unidades/kg) apresentarem uma cor azul com intensidade "gradu-almente crescente e o controle negativo permanecer incolor. Contacte o seurepresentante Syngenta se tiver alguma dúvida sobre a realização do ensaio.

Modificações dos atuais reagentes, métodos e kits para detectarproteína de enzimas alimentares, em particular fitase, serão óbvias para osversados na técnica a partir da descrição pormenorizada precedente.

Embora a presente invenção tenha sido descrita relativamente amodalidades específicas daquela, entender-se-á que são possíveis numero-sas variações, modificações e outras modalidades, e por conseguinte, todasessas variações, modificações e modalidades são para ser entendidas comoestando dentro do âmbito da presente invenção.

Um grande número de patentes, pedidos e referências são dis-cutidos ou citados nesta especificação, e todos eles são aqui incorporadospor referência na sua totalidade.

Claims (36)

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que reageespecificamente com uma fitase de E. coli ou uma fitase derivada de umafitase de Escherichia coli.

2. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de ser produzido pela linhagem de células de hibridomaPHY36 depositada como DSM ACC2699; ou linhagem de células PHY37depositada como DSM ACC2700.

3. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado pelo fato de que a fitase é a fitase Quantum® (Nov9X).

4. Anticorpo monoclonal, de acordo com a reivindicação 3, ca-racterizado pelo fato de ser produzido pela linhagem de células de hibridomaPHY34 depositada como DSM ACC2698; linhagem de células PHY46 depo-sitada como DSM ACC2701 ou linhagem de células PHYTASE MAb28 de-positada como DSM ACC2715.

5. Fragmento de ligação, caracterizado pelo fato de ser ao antí-geno de um anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de ser marcado.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pe-lo fato de ser marcado com biotina, peroxidase, fosfatase alcalina, glucoami-Iase ou .beta.-galactosidase.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pe-lo fato de ser marcado com .sup.125 I, .sup.131 I ou trítio.

9. Suporte sólido, caracterizado pelo fato de ser ligado ao anti-corpo da reivindicação 1.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende oanticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1 e um tampão ou di-luente.

11. Linhagem de células de hibridoma, caracterizada pelo fatode que produz o anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 1.

12. Linhagem de células de hibridoma, de acordo com a reivindi-cação 11, caracterizada pelo fato de que a linhagem de células PHY36 de-positada como DSM ACC2699 ou linhagem de células PHY37 depositadacomo DSM ACC2700.

13. Linhagem de células de hibridoma, caracterizada pelo fatode que produz o anticorpo monoclonal, como definido na reivindicação 3.

14. Linhagem de células de hibridoma, de acordo com a reivindi-cação 13, caracterizada pelo fato de que a linhagem de células é a PHY34depositada como DSM ACC2698; linhagem de células PHY46 depositadacomo DSM ACC2701 ou linhagem de células PHYTASE MAb28 depositadacomo DSM ACC2715.

15. Imunoensaio para uma fitase de E. coli ou uma fitase deriva-da da fitase de E. coli, caracterizado pelo fato de que compreende:a) contatar o anticorpo monoclonal como definido na reivindica-ção 1 com uma amostra suspeita de conter a fitase durante um período detempo e em condições adequadas para ligação do anticorpo à fitase,b) determinar a ligação entre o anticorpo e a fitase, ec) relacionar a ligação com a presença ou quantidade da fitasena amostra.

16. Imunoensaio de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-do pelo fato de ser um RIA.

17. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 15, caracteriza-do pelo fato de ser um EIA.

18. Imunoensaio para a detecção de uma fitase de E. coli ouuma fitase derivada de uma fitase de E. coli em uma amostra, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas de:a) preparar um extrato da amostra na presença de um anticorpomonoclonal primário, como definido na reivindicação 1, o qual reconheceimunologicamente a fitase no extrato de modo a formar um complexo anti-corpo primário-fitase;b) preparar um formato de fase sólida possuindo uma dimensãotridimensional para formar um volume com uma multiplicidade de espaçosintersticiais ligando, ao formato de fase sólida, um anticorpo secundário de-sejado capaz de reconhecer imunologicamente a fitase e em que o anticorposecundário está conjugado com um meio de detecção e em que o anticorposecundário também reconhece, imunologicamente a fitase;c) combinar o extrato do passo (a) com o formato preparado nopasso (b) de acordo com o que o extrato é absorvido através dos espaçosintersticiais do formato de fase sólida preparado capturando o complexo an-ticorpo primário-fitase;d) detectar a fitase pela presença do referido complexo captura-do de anticorpo primário-fitase.

19. Imunoensaio de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-do pelo fato de que a fitase é a fitase Quantum®.

20. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 18, caracteriza-do pelo fato de que o formato de fase sólida é acetato de celulose, celulose,nitrocelulose ou náilon.

21. Imunoensaio de acordo com a reivindicação 20, caracteriza-do pelo fato de que o formato de fase sólida é constituído por camadas múl-tiplas sobrepostas e contíguas em que cada camada é capaz de capturaruma fitase diferente.

22. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 21, caracteriza-do pelo fato de que compreende ainda uma almofada de absorção de amos-tra do formato de fase sólida.

23. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do pelo fato de que compreende ainda uma tira compreendendo um anticor-po antifitase marcado.

24. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 23, caracteriza-do pelo fato de que o meio de detecção é ouro coloidal.

25. Estojo de detecção pelo imunoensaio, como definido na rei-vindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende:a) um meio de extração da fitase a partir de uma amostra; eb) um formato de fase sólida compreendendo um anticorpo mo-noclonal antifitase primário, como definido na reivindicação 1 e possuindouma dimensão tridimensional para formar um volume com uma multiplicida-de de espaços intersticiais ligando, ao formato de fase sólida, um anticorposecundário desejado capaz de reconhecer imunologicamente a fitase e emque o anticorpo secundário está conjugado com um meio de detecção e emque o anticorpo secundário também reconhece imunologicamente a fitase.

26. Estojo, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de que compreende ainda um recipiente contendo um tampão.

27. Estojo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de que compreende ainda um meio para fornecer a amostra ao formatode fase sólida.

28. Imunoensaio de detecção e quantificação de uma fitaseQuantum® (Nov9X) caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) preparar um extrato de uma amostra;b) incubar uma porção do extrato com um anticorpo monoclonalantifitase primário, como definido na reivindicação 1, que se liga à fitase, en-contrando-se o anticorpo primário ligado a um veículo sólido, e com um anti-corpo antifitase secundário que se liga à fitase para formar um complexoanticorpo-fitase-anticorpo,c) lavar o complexo anticorpo-fitase-anticorpo para eliminar oanticorpo secundário não-ligado;d) adicionar um anticorpo de detecção que reaja imunologica-mente com o anticorpo secundário em que o anticorpo de detecção estámarcado; ee) medir a quantidade de anticorpo marcado ligado ou não-ligado para determinar a concentração de fitase.

29. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 28, caracteriza-do pelo fato de que a etiqueta detectável é uma enzima.

30. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 29, caracteriza-do pelo fato de que a enzima é fosfatase alcalina, peroxidase ou p-galactosidase.

31. Imunoensaio, de acordo com a reivindicação 30, caracteriza-do pelo fato de que a enzima produz um produto reacional insolúvel.

32. Estojo de detecção e quantificação pelo imunoensaio, comodefinido na reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende:a) um meio de extrair a fitase Quantum® de uma amostra;b) um suporte sólido compreendendo um anticorpo antifitaseprimário ligado ao suporte sólido;c) um anticorpo antifitase secundário; ed) um anticorpo de detecção capaz de se ligar imunologicamenteao anticorpo secundário e em que o anticorpo de detecção está marcadocom uma etiqueta detectável.

33. Estojo1 de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que a etiqueta detectável é uma enzima.

34. Estojo, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de que a enzima de detecção é fosfatase alcalina, peroxidase ou p-galactosidase.

35. Estojo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelofato de que a enzima produz um produto reacional solúvel ou insolúvel.

36. Estojo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de que compreende ainda um substrato para a enzima.